特許 6013717 液状保存可能なタンパク質溶液及びタンパク質溶液の液状での保存方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6013717

(24)【登録日】2016年9月30日

(45)【発行日】2016年10月25日

(54)【発明の名称】液状保存可能なタンパク質溶液及びタンパク質溶液の液状での保存方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/62 20060101AFI20161011BHJP

   C07K 1/02 20060101ALI20161011BHJP

   C07K 14/245 20060101ALI20161011BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/62

   C07K1/02

   C07K14/245

【請求項の数】9

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2011-218451(P2011-218451)

(22)【出願日】2011年9月30日

(65)【公開番号】特開2012-92095(P2012-92095A)

(43)【公開日】2012年5月17日

【審査請求日】2014年9月24日

(31)【優先権主張番号】特願2010-222421(P2010-222421)

(32)【優先日】2010年9月30日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】390037327

【氏名又は名称】積水メディカル株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000774

【氏名又は名称】特許業務法人 もえぎ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】金子 智恵

(72)【発明者】

【氏名】山本 光章

(72)【発明者】

【氏名】中山 真也

(72)【発明者】

【氏名】近藤 純一

【審査官】 田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００５／００３１５５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００３−３１０２５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５１５２３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 医療薬学，２００１年，vol.27,No.6，p.583-588

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ

インターネット

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

容器に充填され、インスリンおよび大腸菌由来熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列４１９番目から６０７番目のポリペプチド（ＢＰＦ）を含むことを特徴とする、インスリン保存用水溶液。

【請求項2】

インスリン保存用水溶液中のＢＰＦ濃度が０．０１〜５重量％である請求項１に記載のインスリン保存用水溶液。

【請求項3】

容器の材質が、ポリプロピレン、ポリスチレン又はガラスのいずれかである請求項１または２に記載のインスリン保存用水溶液。

【請求項4】

３７℃で２週間保存した後のインスリンの残存率が９０％以上である請求項１〜３のいずれかに記載のインスリン保存用水溶液。

【請求項5】

６０℃で１８時間保存した後のインスリンの残存率が５０％以上である請求項１〜４のいずれかに記載のインスリン保存用水溶液。

【請求項6】

１日凍結保存した後、融解し３７℃で１日保存した後のインスリンの残存率が９０％以上である請求項１〜５のいずれかに記載のインスリン保存用水溶液。

【請求項7】

１日凍結保存した後、融解し３７℃で１日保存する保存サイクルを３回繰り返した後のインスリンの残存率が８５％以上である請求項１〜６のいずれかに記載のインスリン保存用水溶液。

【請求項8】

容器に充填され、インスリンおよび大腸菌由来熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列４１９番目から６０７番目のポリペプチド（ＢＰＦ）を含むことを特徴とする、インスリン凍結保存用水溶液。

【請求項9】

インスリン含む水溶液の保存方法であって、インスリンを含む水溶液に大腸菌由来熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列４１９番目から６０７番目のポリペプチド（ＢＰＦ）を添加することを特徴とする前記保存方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、液状保存可能なタンパク質溶液及びタンパク質溶液の液状での保存方法に関する。

【背景技術】

【0002】

臨床検査や食品分析において、操作の簡便さなどから、保存対象タンパク質を、流動性のある溶液の状態（以下本明細書において「液状」ということがある）のまま長期間保存できる方法が要望されている。すなわち、保存対象タンパク質を含む溶液を凍結して固体状にしたり、該溶液を凍結乾燥して粉末固体とすることなく、液状で長期間保存できる方法が要望されている。

【0003】

しかし、多くのタンパク質は液状で不安定であり、溶液中で保存されている間に構造的分解およびその結果生じる活性の喪失を受けやすい。分解の速度は温度に比例する、すなわち、タンパク質は通常高温で変性しやすく低温で安定であることが知られている。
一方、タンパク質溶液が凍結するほど低温になった場合、凍結−解凍サイクルはタンパク質の分解や変性の原因となり得ることも知られており、タンパク質溶液を繰り返し凍結融解して使用することは通常避けられる。

【0004】

保存対象タンパク質を液状で長期間保存する場合に望まれる事項としては、生物学的活性（例えば、特異抗体に対する抗原性、抗体やレクチンなどが有する特異的結合相手に対する結合活性、ペプチドホルモンなどが有する生理活性、酵素活性、前記各活性を支持するためのタンパク質としての立体構造など）の維持、容器への吸着防止、防腐能力の維持などがあげられる。

【0005】

例えば溶液中の保存対象タンパク質がインスリンの場合、３７℃以上で急速に熱変性すること、および前記溶液を凍結することによっても構造変化が起きることが知られている。構造の変化は血糖降下といった生理活性や抗体に対する抗原性の喪失をもたらすため、高温あるいは凍結・融解条件での構造変化を防ぐための保存手段が必要である。

【0006】

免疫学的測定方法での使用を意図した保存対象タンパク質の液状での保存方法（抗体の結合活性の維持、特異抗体に対する抗原性の維持などを目的としている）としては、アルブミンを添加する方法が広く使用されている。
特許文献１（ＷＯ９２／０１８０８）には、抗体を液状で保存する方法として、抗体含有溶液にアルブミンを添加する方法が開示されている。
特許文献２（特開昭６１−０７６４２３）には、抗体を液状で保存する方法として、抗体含有溶液に加水分解された卵アルブミンを添加する方法が開示されている。
特許文献３（特開平０６−１８６２３０）には、抗体を液状で保存する方法として、抗体含有溶液にアルブミン及び構造中にナフタレンスルホン酸を含むアゾ系色素を添加する方法が開示されている。
特許文献４（特開２００７−５１４９５４）には、トロポニンＩやＢ型ナトリウム利尿ペプチドといった心臓マーカーポリペプチドを液状で保存する方法として、当該ポリペプチド含有溶液に塩基性側鎖を有する複数のアミノ酸及びアルブミンを添加する方法が開示されている。

【0007】

一方、大腸菌由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列４１９番目から６０７番目のポリペプチド（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔとも呼称される。以下「ＢＰＦ」ということがある。）は、免疫学的測定方法における新規なブロッキング用物質として特許文献５（ＷＯ２００５／００３１５５）および非特許文献１に開示され、市販もされている。
特許文献６では、ＢＰＦの配列を含むＤｎａＫのアミノ酸配列３８６番目から６３８番目のポリペプチドを用いて、液状でタンパク質を保存する臨床診断用酵素や抗体、研究用酵素などの保存安定性を向上させる用途への応用について指摘している。しかし、液状でヘキソキナーゼを４５℃、２４時間保存処理した試験では、ＤｎａＫのアミノ酸配列３８６番目から６３８番目のポリペプチドを添加した場合でも、未処理の（変性していない）ヘキソキナーゼに対する相対活性は５０％であり、ＢＳＡ添加または何も添加していないコントロールの４５％と大きな差はなかった。
しかし、保存対象タンパク質を液状で長期間保存する際のＢＰＦの効果（生物活性の維持ほか）について、実際に試験をした報告はない。また、高温や凍結、さらに凍結融解の繰り返しといった、厳しい温度条件でのタンパク質の保存に対するＢＰＦの効果についても報告はない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】ＷＯ９２／０１８０８号公報

【特許文献2】特開昭６１−０７６４２３号公報

【特許文献3】特開平０６−１８６２３０号公報

【特許文献4】特開２００７−５１４９５４号公報

【特許文献5】ＷＯ２００５／００３１５５号公報

【特許文献6】特開２００３−３１０２５８号公報

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】高分子学会予稿集:55巻2 Disk1号 5211-5212頁(2006年),Polymer Preprints, Japan Vol. 55, No.2, 5211-5212 (2006)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明の課題は、液状保存可能なタンパク質溶液及びタンパク質溶液の液状での保存方法を提供することにある。より詳細な課題のひとつとしては、溶液中の保存対象タンパク質を、保存対象タンパク質を含む溶液を凍結または凍結乾燥をすることなく、流動性のある溶液状態（液状）のまま長期間保存することができるタンパク質液状保存用水溶液と、該水溶液として保存対象タンパク質を長期間保存する方法を提供することが挙げられる。
また、もうひとつのより詳細な課題としては、保存対象タンパク質を含む溶液が高温や凍結といった一般的にタンパク質が変性するとされる条件に晒された場合でも、保存対象タンパク質を安定的に保存するための該タンパク質液状保存用水溶液の使用と該使用によるタンパク質の保存方法を提供することが挙げられる。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。

【0012】

すなわち本発明は、以下の構成からなる。
〔１〕容器に充填され、インスリンおよび大腸菌由来熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列４１９番目から６０７番目のポリペプチド（ＢＰＦ）を含むことを特徴とする、インスリン保存用水溶液。
〔２〕インスリン保存用水溶液中のＢＰＦ濃度が０．０１〜５重量％である前記〔１〕に記載のインスリン保存用水溶液。
〔３〕容器の材質が、ポリプロピレン、ポリスチレン又はガラスのいずれかである前記〔１〕または〔２〕に記載のインスリン保存用水溶液。
〔４〕３７℃で２週間保存した後のインスリンの残存率が９０％以上である前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のインスリン保存用水溶液。
〔５〕６０℃で１８時間保存した後のインスリンの残存率が５０％以上である前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のインスリン保存用水溶液。
〔６〕１日凍結保存した後、融解し３７℃で１日保存した後のインスリンの残存率が９０％以上である前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のインスリン保存用水溶液。
〔７〕１日凍結保存した後、融解し３７℃で１日保存する保存サイクルを３回繰り返した後のインスリンの残存率が８５％以上である前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のインスリン保存用水溶液。
〔８〕容器に充填され、インスリンおよび大腸菌由来熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列４１９番目から６０７番目のポリペプチド（ＢＰＦ）を含むことを特徴とする、インスリン凍結保存用水溶液。
〔９〕インスリン含む水溶液の保存方法であって、インスリンを含む水溶液にＢＰＦを添加することを特徴とする前記保存方法。
〔１０〕インスリンを含む水溶液中のインスリンの容器への吸着防止方法であって、ＢＰＦを添加することを特徴とする前記吸着防止方法。
〔１１〕インスリンを含む水溶液中のインスリンの容器への吸着防止剤であって、ＢＰＦを有効成分として含有する前記吸着防止剤。

【発明の効果】

【0013】

本発明により、従来技術では達成できなかった保存対象タンパク質の液状での長期間の保存が可能となった。
また、本発明のタンパク質液状保存用水溶液は、保存対象タンパク質を含む液体が高温や凍結といった一般的にタンパク質が変性するとされる条件に晒された場合でも、保存対象タンパク質の安定的な保存に使用することができる。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、本発明のタンパク質液状保存用水溶液（以下「液状保存液」ということがある）及び本発明の保存対象タンパク質を含む水溶液の保存方法（以下「液状保存方法」ということがある）の形態について、保存対象タンパク質が免疫学的測定方法に使用されるものである場合を例に説明する。なお、本発明の液状保存液及び本発明の液状保存方法を総称して「本発明方法等」ということがある。

【0015】

（ＢＰＦ）
本発明方法等に使用するＢＰＦは、特許文献５の記載に従い調製することができる。また、市販品（東洋紡社製、カタログ番号ＢＰＦ−３０１）を使用してもよい。本発明方法等における使用濃度としては、保存対象タンパク質を液状で保存しようとする溶液中の濃度として、０．０１〜５％が好適であり、より好適には０．０５〜３％、さらに好適には０．０８〜２％を例示することができる。なお、本明細書中では特に断らない限り％はｗ／ｖ％をしめすものとする。当業者であれば、保存対象タンパク質の性状や濃度（量）などを考慮し、実験的に最適なＢＰＦの濃度を決定することができる。

【0016】

（液状保存液の組成）
本発明方法等における液状保存液の組成は、ＢＰＦを有効成分として当該溶液中に含有させる以外、本発明方法等の効果を損なわないこと、保存対象タンパク質の用途に対して妨害的に作用しないことを限度として特に制限はない。保存対象タンパク質を免疫学的測定方法に使用するのであれば、本発明方法等の効果を損なわず、かつ、抗原抗体反応、ビオチン・アビジンによる検出のための標識反応、酵素免疫測定法である場合の酵素反応など、測定系を構成する反応の全部又は一部を妨害しなければよい。免疫学的測定方法において通常使用される各種成分、例えば、酢酸、クエン酸、リン酸、トリス、グリシン、ホウ酸、炭酸やグッドなどの各種緩衝液、イオン強度や浸透圧を調整するための成分（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ₂などの金属塩）、非特異的な反応を抑制するための成分（Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの非イオン性界面活性剤など）、抗原抗体反応を促進する成分（ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、リン脂質ポリマーなどの高分子など）、ＢＰＦ以外のタンパク質やペプチド（アルブミンやカゼインなど）、アミノ酸、糖類（ショ糖、シクロデキストリンなど）、防腐剤（アジ化ナトリウム、ＰｒｏＣｌｉｎ３００など）などを目的に応じ、適宜選択して使用することができる。

【0017】

（保存対象タンパク質）
本発明方法等が使用可能な保存対象タンパク質は、特に制限はない。インスリンなどのペプチド、シスタチンＣなどの低分子タンパク質、ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）、アディポネクチンなどの多量体タンパク質、抗ＣＣＰ（環状シトルリン化ペプチド）抗体、抗リン脂質抗体、抗梅毒抗体などの特異抗体類、酸化ＬＤＬ、ＩＶ型コラーゲン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、マイクロアルブミン、リウマチ因子（ＲＦ）、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＦＤＰ、Ｄダイマー、可溶性フィブリン（ＳＦ）、トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）、プラスミン−インヒビター複合体（ＰＩＣ）、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）、血液凝固第ＸＩＩＩ因子、ペプシノーゲンＩ・ＩＩ、インフルエンザ抗原などを例示できるが、これらに限定されない。
本発明方法等は、インスリンおよびインスリン類似体に対し特に有効である。インスリンとしては、ヒトインスリン以外に、ブタインスリン、ウサギインスリン、などのヒト以外の動物のインスリンも含まれる。インスリン類似体としては、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル、インスリングルリジンなどが挙げられる。

【0018】

（本発明方法等の具体的な用途）
本発明方法等は、免疫学的測定方法における標準品溶液（濃度較正用基準：キャリブレーター）、精度管理などに用いる管理試料溶液、標識抗体溶液などに好適に使用することができる。また、保存対象タンパク質を含有しない状態の溶液（以下、「ＢＰＦ溶液」ということがある）として調製し、測定試料の希釈液として使用（希釈された後の測定試料は、本発明の液状保存液に含まれる）したり、凍結乾燥されている標準品、管理試料、標識抗体を溶液状態に復元する際に使用（復元された後の標準品溶液、管理試料溶液、標識抗体溶液は、本発明の液状保存液に含まれる）することもできる。

【0019】

（本発明方法等に使用する容器）
本発明方法等は、生物学的活性の維持に加え、容器への吸着を防止・抑制する効果も有している。本発明方法等に好適な保存容器の材質としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ガラスを挙げることができる。保存容器の形態としては、ハードタイプまたはソフトタイプのいずれでもよく、アンプル、バイアル、ソフトバッグ、注射型容器などが例示される。

【0020】

（吸着防止方法／吸着防止剤）
本発明方法等は、上記のとおり、容器への吸着を防止・抑制する効果も有していることから、本発明の別の態様はタンパク質を含む水溶液中にＢＰＦを添加することによる、当該タンパク質の容器への吸着防止方法である。
また、本吸着防止方法において、ＢＰＦは、タンパク質を含む水溶液中の当該タンパク質の容器への吸着防止剤としての役割を担っている。

【0021】

（保存安定性／残存率）
本発明の液状保存液は、保存対象タンパク質を長期間安定して保存できることが望ましく、具体的には、インスリンを３７℃で２週間保存した場合、インスリンの残存率が９０％であることがより望ましい。
また、本発明の液状保存液は、高温における保存でも高い安定化効果を有することが望ましく、例えばインスリンを６０℃で１８時間保存した場合、インスリンの残存率が５０％以上であることがより望ましい。
また、本発明の液状保存液は、凍結状態の保存でも高い安定化効果を有することが望ましく、インスリンを凍結後さらに３７℃で保存した場合、インスリンの残存率は９０％以上であることがより望ましい。
さらにまた、本発明の液状保存液は凍結と融解のサイクルを繰り返した後の保存であっても高い安定化効果を有していることが望ましく、インスリンを１日凍結保存した後、融解し３７℃で１日保存する保存サイクルを３回繰り返した場合、インスリンの残存率８５％以上であることがより望ましい。

【0022】

（凍結保存用水溶液）
本発明のタンパク質液状保存用水溶液は、凍結保存溶液として使用することもできる。インスリンは凍結によって構造変化が起こることが知られているが、本発明の液状保存液で保存した場合、凍結・融解してもインスリンの残存率は非常に高く、本発明の液状保存液は、タンパク質の凍結保存用の水溶液としても有用であることがわかる。特にインスリンの凍結保存用水溶液としての用途が望ましい。また、本発明のタンパク質液状保存用水溶液は、保存対象タンパク質を凍結保存し、その後使用時に解凍して全部あるいは必要量を使用し、その後残余があればこれを凍結し、あるいは液状のまま保存することができる。

【実施例】

【0023】

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明を限定するものではない。

【0024】

〔実施例１〕BPFの保存効果確認試験（１）−インスリン溶液の場合（37℃保存試験）−
インスリンを保存対象タンパク質とし、BPFの液状保存効果をBSAと比較した。

【0025】

１．試験材料
（１）BPF溶液A
1％ BPF（東洋紡社製、カタログ番号BPF-301）溶液（25mM HEPES緩衝液（pH8.2）、0.05(v/v)% ProClin300（SUPERCO社製））を使用した。
（２）インスリン液状保存液（実施例１）
インスリン（シグマ社製）濃度が、0pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1,000pg/mL、5,000pg/mL、10,000pg/mLになるようBPF溶液Aで希釈し、保存対象タンパク質をインスリンとする本発明の液状保存液を調製した。

【0026】

２．試験方法
（１）保存条件
各濃度のインスリン液状保存液を2.0mL凍結保存チューブ（アシスト社製、材質：ポリプロピレン）に、0.5mL分注した。ヒーター式インキュベーター（三洋電機社製）中で37℃、2週間保存した。
（２）インスリンの測定
2種類の抗体（国際寄託番号：FERM BP-11233及びFERM BP-11234）を使用するラテックス免疫比濁法（PCT/JP2010/062261、WO2011/010673）により測定した。
PCT/JP2010/062261の実施例１に記載の第一試薬と第二試薬を用い、日立7170形自動分析装置により測定した。具体的には、各濃度のインスリン液状保存液10μLに、第一試薬150μLを加えて37℃で5分間加温後、第二試薬50μLを加えて攪拌し、その後5分間の吸光度変化を、主波長570nm、副波長800nmにて測定した。測定された吸光度の変化量を濃度既知の標準物質を測定して得られる検量線を用いてインスリン濃度に換算した。
（３）インスリン残存率（%）の算出
37℃、2週間保存後の各インスリン液状保存液のインスリン濃度について、次式を用いて、インスリン残存率（%）を算出した。
インスリン残存率(%)＝37℃2週間保存後のインスリン液状保存液のインスリン濃度（pg/mL）/調製直後のインスリン液状保存液のインスリン濃度（pg/mL）×100

【0027】

３．比較例１
BPF溶液Aに代えて、1％ BSA（シグマ社製）溶液（25mM HEPES緩衝液（pH8.2）、0.05(v/v)% ProClin300（SUPERCO社製））を使用し従来の保存液Aとした以外は、実施例１と同様の操作を行った。

【0028】

４．試験結果
実施例１、比較例１の試験結果を表１に示した。
BSAを使用する従来の保存液Aで調製した比較例１の2週間経過後のインスリン残存率は、いずれのインスリン濃度においても20%以下の残存率しか示さなかった。一方、BPFを使用する本発明の液状保存液の場合、2週間経過後の残存率はいずれのインスリン濃度においても92%以上を維持しており、従来の保存液Aを使用した場合と比較してはるかに高い残存率を示した。
以上より、本発明の液状保存液は、37℃、2週間という保存対象タンパク質にとっての劣悪条件下での保存においてもインスリンの抗原性の喪失を防止していると考えられ、すぐれた液状保存効果を有していることが確認された。

【0029】

【表1】

【0030】

〔実施例２〕BPFの保存効果確認試験（２）−シスタチンC溶液の場合−
シスタチンCを保存対象タンパク質とし、BPFの液状保存効果をBSAと比較した。

【0031】

１．試験材料
（１）BPF溶液B
0.1％ BPF（東洋紡社製、カタログ番号BPF-301）溶液（リン酸緩衝液（137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na₂HPO₄、2mM KH₂PO₄ （pH7.4））、0.05(v/v)% ProClin300（SUPERCO社製））を使用した。
（２）シスタチンC液状保存液（実施例２）
組換えシスタチンC（オリエンタル酵母社製）粉末1mgに生理食塩液1mLを加えシスタチンC原液とした。シスタチンC原液を3mg/LになるようBPF溶液Bで希釈し、保存対象タンパク質をシスタチンCとする本発明の液状保存液を調製した。

【0032】

２．試験方法
（１）保存条件
シスタチンC液状保存液2.0mLをガラス瓶V2（不二硝子社製）（以下、ガラス瓶という）に充填した。これを充填時シスタチンC溶液とした。充填時シスタチンC溶液0.2mLをサンプルカップ（EVER GREEN SCIENTIFIC社製、BMC/Hitachi/Olympus Sample Cups、材質：ポリスチレン）に移し、シスタチンC濃度を測定した。残りの1.8mLが入ったガラス瓶を封栓し、ウェイブローター WR-40（サーモニクス社製）にて、室温、60rpmの条件で15分間回転混和した後、新しいガラス瓶に移した。この操作を2回行い、操作後のシスタチンC液状保存液をガラス瓶保存後シスタチンC溶液とした。ガラス瓶保存後シスタチンC溶液0.2mLを、前記サンプルカップに移し、シスタチンC濃度を測定した。

【0033】

（２）シスタチンCの測定
2種類の抗体を使用するラテックス免疫比濁法（WO2010/064435）により測定した。
WO2010/064435の実施例に記載の第一試薬と第二試薬を用い、日立7170形自動分析装置により測定した。具体的には、充填時シスタチンC溶液あるいはガラス瓶保存後シスタチンC溶液2.4μLに、第一試薬120μLを加えて37℃で5分間加温後、第二試薬120μLを加えて攪拌し、その後5分間の吸光度変化を、主波長570nm、副波長800nmにて測定した。測定された吸光度の変化量を濃度既知の標準物質を測定して得られる検量線を用いてシスタチンC濃度に換算した。

【0034】

（３）シスタチンC残存率（%）の算出
ガラス瓶充填時及びガラス瓶保存後シスタチンC溶液の濃度から次式を用いて、シスタチンC残存率（％）を算出した。
シスタチンC残存率(%)＝ガラス瓶保存後シスタチンC溶液のシスタチンC濃度（mg/L）/充填時シスタチンC溶液のシスタチンC濃度（mg/L）×100

【0035】

３．比較例２
BPF溶液Bに代えて、0.1%BSA（デザートバイオロジカル社製）溶液（リン酸緩衝液（137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na₂HPO4、2mM KH₂PO₄ （pH7.4））、0.05(v/v)% ProClin300（SUPERCO社製））を使用し従来の保存液Bとした以外は、実施例２と同様の操作を行った。

【0036】

４．試験結果
実施例２、比較例２の試験結果を表２に示した。
BSAを使用する従来の保存液B（比較例２）の場合、ガラス瓶保存後のシスタチンCの残存率は87.6%であった。一方、BPFを使用する本発明の液状保存液（実施例２）のガラス瓶保存後の残存率は99.0%であり、従来の保存液Bを使用した場合に対して、きわめて高い残存率を確認することができた。
以上より、BPFは、液状保存時の抗原性の喪失防止効果に加え、容器への非特異吸着防止効果も有していることが確認された。

【0037】

【表2】

【0038】

〔実施例３〕BPFの保存効果確認試験（３） −カゼインとの比較−
インスリンを保存対象タンパク質とし、BPFの液状保存効果を、ブロッキング剤として汎用されているカゼインと比較した。

【0039】

１．試験材料
（１）BPF溶液A
実施例１に記載のBPF溶液Aを使用した。
（２）インスリン液状保存液（実施例３）
インスリン（シグマ社製）を、濃度が5,000pg/mLになるようBPF溶液Aで希釈し、保存対象タンパク質をインスリンとする本発明の液状保存液を調製した。

【0040】

２．試験方法
（１）保存条件
インスリン液状保存液を2.0mL凍結保存チューブ（アシスト社製、材質：ポリプロピレン）に、0.5mL小分け分注したあと、ヒーター式インキュベーター（三洋電機社製）中で37℃、9日間保存した。
（２）インスリンの測定およびインスリン残存率（％）の算出
実施例１と同様の測定を行った。また、次式を用いて残存率の算出を行った。
インスリン残存率(%)＝保存後のインスリン液状保存液のインスリン濃度（pg/mL）/調製直後のインスリン液状保存液のインスリン濃度（pg/mL）×100
なお、本試験では残存率９０％以上を保存安定性ありと判断した。

【0041】

３．比較例３
BPF溶液Aに代えて、1.0%カゼイン（VWR International Ltd.社製）溶液（25mM HEPES緩衝液（pH8.2）、0.05(v/v)% ProClin300（SUPERCO社製））を使用し従来の保存液（比較例３）とした以外は、実施例３と同様の測定および残存率の算出を行った。

【0042】

４．試験結果
結果を表３に示す。カゼインを使用する従来の保存液（比較例３）の場合、インスリンの抗原性はほぼ失われており、測定不能であった。これよりカゼインを使用する従来の保存液は37℃、9日間という長期間の過酷条件でのタンパク質液状保存に適さないことがわかった。これに対してBPFを使用する本発明の液状保存液（実施例３）では、残存率が90％以上であり、インスリンを安定的に保存できた。

【0043】

【表3】

【0044】

〔実施例４〕BPFの保存効果確認試験（４）−ガラス容器でのインスリンの保存安定性−
インスリンを保存対象タンパク質とし、ガラス容器におけるBPFの液状保存効果をBSA（比較例４−１）、カゼイン（比較例４−２）と比較した。

【0045】

１．試験材料
（１）BPF溶液
0.01、1.0、5.0％ BPF（東洋紡社製、カタログ番号BPF-301）溶液（25mM HEPES緩衝液（pH8.2）、0.05(v/v)% ProClin300（SUPERCO社製））を使用した。
（２）インスリン液状保存液（実施例４）
インスリン（シグマ社製）を、濃度が5,000pg/mLになるよう（１）のBPF溶液でそれぞれ希釈し、保存対象タンパク質をインスリンとする本発明の液状保存液を調製した。

【0046】

２．試験方法
インスリン液状保存液をガラス瓶V2（不二硝子社製）に保存した以外は実施例３と同様の試験および残存率の算出を行った。
なお、本試験では、残存率75％以上を保存安定性ありと判断した。

【0047】

３．比較例
（１）比較例４−１
BPF溶液に代えて、0.01,1.0,5.0％ BSA（シグマ社製）溶液（25mM HEPES緩衝液（pH8.2）、0.05（v/v)% ProClin300（SUPERCO社製））を使用し従来の保存液（比較例４−１）とした以外は実施例４と同様の試験および残存率の算出を行った。
（２）比較例４−２
BPF溶液に代えて、比較例３に記載の1.0%カゼイン（VWR International Ltd.）溶液を使用し従来の保存液（比較例４−２）とした以外は、実施例４と同様の試験および残存率の算出を行った。

【0048】

４．試験結果
結果を表４に示す。BSAを使用する従来の保存液（比較例４−１）の場合、ガラス瓶保存後のインスリンの残存率はいずれも75%以下であった。また、カゼインを使用する従来の保存液（比較例４−２）の場合、測定不能となり、ガラス容器での保存に適さないことが示された。一方、BPFを使用する本発明の液状保存液（実施例４）のガラス瓶保存後の残存率はいずれの濃度で用いた場合も75%以上であり、比較例４−１、比較例４−２に対して、きわめて高い残存率を示した。

【0049】

【表4】

【0050】

〔実施例５〕BPFの保存効果確認試験（５）−高温条件での保存安定性−
インスリンを保存対象タンパク質とし、高温条件におけるBPFの液状保存効果をBSA（比較例５）と比較した。

【0051】

１．試験材料
（１）BPF溶液
実施例４に記載のBPF溶液を使用した。
（２）インスリン液状保存液（実施例５）
インスリン（シグマ社製）濃度が、1,000pg/mL、5,000pg/mLになるよう（１）のBPF溶液でそれぞれ希釈し、保存対象タンパク質をインスリンとする本発明の液状保存液を調製した。

【0052】

２．試験方法
各濃度のインスリン液状保存液を2.0mL凍結保存チューブ（アシスト社製、材質：ポリプロピレン）に、0.5mL小分け分注したあと、ヒーター式インキュベーター（エスペック社製）中で60℃18時間保存した以外は実施例３と同様に測定および残存率の算出を行った。
なお、本試験では、残存率50％以上を保存安定性ありと判断した。

【0053】

３．比較例５
BPF溶液に代えて、比較例４−１に記載のBSAを使用する従来の保存液（比較例５）とした以外は、実施例５と同様の試験および残存率の算出を行った。

【0054】

４．試験結果
結果を表５に示す。インスリンは37℃以上では速やかに変性が進むことが知られているが、BPFを使用する本発明の液状保存液を用いた場合（実施例５）、いずれの濃度においてもインスリンの残存率は60％以上であり、BSAを使用する従来の保存液（比較例５）と比較して熱に対する高い安定化効果を有していることが示された。

【0055】

【表5】

【0056】

〔実施例６〕BPFの保存効果確認試験（６）−凍結融解条件に対する保存安定性−
インスリンを保存対象タンパク質とし温度変化に対するBPFの液状保存効果をBSA（比較例６）と比較した。

【0057】

１．試験材料
（１）BPF溶液
実施例４に記載のBPF溶液を使用した。
（２）インスリン液状保存液（実施例６）
実施例５に記載のインスリン液状保存液を使用した。

【0058】

２．試験方法
各濃度のインスリン液状保存液を2.0mL凍結保存チューブ（アシスト社製、材質：ポリプロピレン）に、0.5mL小分け分注したあと、バイオメディカルフリーザ（三洋電機社製）中で-30℃1日凍結保存したあと、ヒーター式インキュベーター（三洋電機社製）中で37℃1日保存した以外は実施例３と同様に測定および残存率の算出を行った。
なお、本試験では、残存率90％以上を保存安定性ありと判断した。

【0059】

３．比較例６
BPF溶液に代えて、比較例４−１に記載のBSAを使用する従来の保存液（比較例６）とした以外は、実施例６と同様に試験および残存率の算出を行った。

【0060】

４．試験結果
結果を表６に示す。インスリンは凍結によって構造変化が起こることが知られているが、BPFを使用する本発明の液状保存液（実施例６）では、凍結後さらに37℃で保存してもインスリンの残存率は90％以上であった。
BSAを使用する従来の保存液（比較例５）は、BSAの添加濃度によっては高い残存率を示したが、高濃度で用いた場合には残存率が著しく低下し、安定的な保存に適さないことがわかった。

【0061】

【表6】

【0062】

〔実施例７〕BPFの保存効果確認試験（７）−凍結融解に対する保存安定性−
インスリンを保存対象タンパク質とし、凍結融解に対するBPFの液状保存効果をBSA（比較例７）と比較した。

【0063】

１．試験材料
（１）BPF溶液
実施例４に記載のBPF溶液を使用した。
（２）インスリン液状保存液（実施例７）
実施例５に記載のインスリン液状保存液を使用した。

【0064】

２．試験方法
各濃度のインスリン液状保存液を2.0mL凍結保存チューブ（アシスト社製、材質：ポリプロピレン）に、0.5mL小分け分注したあと、バイオメディカルフリーザ（三洋電機社製）中で-30℃1日凍結保存したあと、ヒーター式インキュベーター（三洋電機社製）中で37℃1日保存した。このサイクルを3回おこなった以外は実施例３と同様に測定および残存率の算出を行った。
なお、本試験では、残存率85％以上を保存安定性ありと判断した。

【0065】

３．比較例７
BPF溶液に代えて、比較例４−１に記載のBSAを使用する従来の保存液（比較例７）とした以外は、実施例７と同様に試験および残存率の算出を行った。

【0066】

４．試験結果
結果を表7に示す。BPFを使用する本発明の液状保存液を用いた場合（実施例７）、凍結融解を３回繰り返す過酷試験後でも、残存率85％以上の高いインスリンの残存率を示した。一方、0.01％または1.0％BSAを使用する従来の保存液を用いた場合（比較例７）、凍結融解１回の条件（比較例６）ではインスリン残存率75.0％以上であったが、凍結融解を３回繰り返すより過酷な条件では残存率が低下した。BSAを使用する従来の保存液は分注したインスリンを凍結保存し、融解して使いきるような場合には適用可能であるが、１本の試薬を繰り返し凍結融解して使用するような場合には不適であると考えられる。本発明の液状保存液は、凍結と融解が長期に繰り返される条件下で用いた場合でも、タンパク質を安定的に保存可能である。

【0067】

【表7】

【産業上の利用可能性】

【0068】

本発明により、液状保存可能なタンパク質溶液及びタンパク質溶液の液状保存方法が提供される。
本発明により、保存対象タンパク質を含む溶液を凍結したり、凍結乾燥をすることなく、流動性のある溶液状態（液状）のまま長期間保存することが可能になる。
また、本発明により、保存対象タンパク質を高温や凍結状態に晒した後、または凍結・融解を繰り返した後であっても安定した保存対象タンパク質溶液を提供することが可能となる。
さらにまた、本発明の液状保存溶液は、凍結保存溶液としての使用も可能である。