特許 6013883 微生物醗酵生産物の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6013883

(24)【登録日】2016年9月30日

(45)【発行日】2016年10月25日

(54)【発明の名称】微生物醗酵生産物の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/02 20060101AFI20161011BHJP

【ＦＩ】

   C12P7/02

【請求項の数】6

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2012-246363(P2012-246363)

(22)【出願日】2012年11月8日

(65)【公開番号】特開2014-93960(P2014-93960A)

(43)【公開日】2014年5月22日

【審査請求日】2015年9月24日

(73)【特許権者】

【識別番号】000000918

【氏名又は名称】花王株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】濱田 紗輝

(72)【発明者】

【氏名】小山 伸吾

(72)【発明者】

【氏名】渡邉 高明

【審査官】 宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１１−０４５２５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−２７９２７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０３−２２４４７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第０５９４５５４６（ＵＳ，Ａ）

【文献】 特開昭４８−０２８６２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０８−２０８６４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−２１３６８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−２５９３９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６２−０７４２８１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ １／００−７／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣｉＮｉｉ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

次の工程（１）、（２）及び（３）：
（１）消泡剤を含有する培地中で次の一般式（１ａ）及び／又は（１ｂ）

【化1】

で表される反応基質を微生物変換して得られる次の式（２）

【化2】

で表される微生物醗酵生産物を、疎水性溶媒にて抽出する工程、
（２）工程（１）で得られた微生物醗酵生産物を含む疎水性溶媒抽出液を、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムから選択される１つ以上のアルカリを含むアルカリ水溶液と混合した後、疎水性溶媒抽出液を前記アルカリ水溶液から分離する工程、
（３）工程（２）で前記アルカリ水溶液から分離して得られた疎水性溶媒抽出液を濾過する工程、
を含む微生物醗酵生産物の製造方法。

【請求項2】

アルカリ水溶液のアルカリの濃度が０．１〜１０ｍｏｌ／ｄｍ³である請求項１記載の微生物醗酵生産物の製造方法。

【請求項3】

消泡剤がシリコーン系消泡剤である請求項１又は２記載の微生物醗酵生産物の製造方法。

【請求項4】

消泡剤を培地中に０．５〜２質量％含む請求項１〜３のいずれか１項記載の微生物醗酵生産物の製造方法。

【請求項5】

疎水性溶媒がＳＰ値１４〜１９（ＭＰａ）^1/2の範囲内にある溶媒である請求項１〜４のいずれか１項記載の微生物醗酵生産物の製造方法。

【請求項6】

疎水性溶媒がシクロヘキサン、４−メチル−２−ペンタノン、キシレン、トルエン及び酢酸エチルから選ばれる１種又は２種以上である請求項１〜５のいずれか１項記載の微生物醗酵生産物の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、微生物醗酵生産物の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

医薬成分、香料、香料原料、油脂やそれらの中間体等の有用物質の中には酵素や微生物等の生体触媒を用いて製造されるものが数多く存在する。
例えば、３ａ,６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フラン（以下、「化合物Ａ」と表記する）は、抹香鯨の体内に生ずる病的分泌物アンバーグリースに含まれている香気成分で、アンバー系合成香料として欠かせない重要化合物であり、スクラレオールから微生物変換により３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルデカヒドロナフト[２,１−ｂ]フラン−２（１Ｈ）−オン（以下、「スクラレオリド」と表記する）及び１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オール（以下、「ジオール体」と表記する）を得、これを環化させて製造することができる（特許文献１及び２）。

【0003】

ジオール体のように微生物変換により菌体外に難水溶性や疎水性の微生物醗酵生産物が生産される場合には、作業効率を考慮して、微生物醗酵生産物を含む培養液に疎水性溶媒を加えて抽出により微生物醗酵生産物の回収が行われる。通常、培養液中には、微生物醗酵生産物の他に未反応の反応基質や微生物、培地成分等が混在していて、抽出の際にこれら微生物醗酵生産物以外の成分も同時に回収されてしまうため、微生物醗酵生産物の疎水性溶媒抽出液をフィルターで濾過し、微生物醗酵生産物以外の成分を濾別するのが好ましい。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開昭６２−７４２８１号公報

【特許文献2】特開平３−２２４４７８号公報

【特許文献3】特開平７−２２２９１７号公報

【特許文献4】特開２０１０−２５３３５７号公報

【特許文献5】特開２００９−１３５１７４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、微生物醗酵生産物の疎水性溶媒抽出液を濾過すると、濾過速度が低下してしまう場合があることが判明した。
すなわち、微生物培養の際に泡が発生し、この泡に反応基質が含まれてしまうため反応効率が低下したり、反応終了後の培養液中に基質が多く残存したりすることがある。とりわけ、反応を良好にするため、基質の分散性を向上させようと界面活性剤を用いると泡が発生し易い。そのため、培地に消泡剤を添加して発泡を抑えるが、微生物醗酵生産物の疎水性溶媒抽出液の濾過速度が大幅に低下するという課題が見出された。濾過速度が低下すると、微生物醗酵生産物の製造効率、作業効率が悪くなり、また、製造コストが多くかかる。濾過速度が低下する原因は明らかではないが、消泡剤に由来する物質、又は未反応の反応基質、微生物若しくは培地成分等と消泡剤に由来する物質の夾雑物が分離膜に何らかの作用を及ぼすためであると考えられる。

【0006】

従来、微生物や浮遊物、吸着性物質等が分離膜に捕捉されることで低下した濾過能力を回復させるために、熱水や酸、アルカリ等を用いて分離膜を洗浄し、目詰まり物質を除去する方法が知られているが（特許文献３〜５）、これらの技術は濾過工程終了後の分離膜に対して処理を行って分離膜を再生させるものであって、濾過工程における濾過速度の低下を抑えるものではない。
本発明は、斯かる実情に鑑み、濾過速度を低下させずに微生物醗酵生産物の疎水性溶媒抽出液を濾過させて、効率良く微生物醗酵生産物を製造することのできる方法を提供しようとするものである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者は、上記課題に鑑み鋭意検討したところ、予め微生物醗酵生産物の疎水性溶媒抽出液とアルカリ水溶液を混合し、アルカリ水溶液層を除去すれば、分離膜の閉塞が抑えられ、濾過速度を低下させずに疎水性溶媒抽出液を長時間にわたり安定して濾過させることができることを見出した。

【0008】

すなわち、本発明は、次の工程（１）、（２）及び（３）：
（１）消泡剤を含有する培地中で反応基質を微生物変換して得られる微生物醗酵生産物を、疎水性溶媒にて抽出する工程、
（２）工程（１）で得られた微生物醗酵生産物を含む疎水性溶媒抽出液とアルカリ水溶液を混合した後、疎水性溶媒抽出液をアルカリ水溶液から分離する工程、
（３）工程（２）でアルカリ水溶液から分離して得られた疎水性溶媒抽出液を濾過する工程、
を含む微生物醗酵生産物の製造方法を提供するものである。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、濾過速度を低下させることなく、疎水性溶媒中に含まれる微生物醗酵生産物以外の成分を濾別できるので、高品質の微生物醗酵生産物を効率良く得ることができる。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明の方法における工程（１）は、消泡剤を含有する培地中で反応基質を微生物変換して得られる微生物醗酵生産物を、疎水性溶媒にて抽出する工程である。
本発明の方法で製造される微生物醗酵生産物とは、香料、香料原料、油脂として使用される化合物又はその中間体であり、親水性、疎水性、両親媒性の何れの性質を有していてもよいが、培養液からの生産物の分離性の点から、水に溶解し難いものが好ましい。微生物醗酵生産物の水への溶解度（２５℃）は、０．１〜１００００ｍｇ／Ｌが好ましく、更に０．１〜５０００ｍｇ／Ｌが好ましい。
そして、反応基質、当該基質を変換する微生物、培養条件は、これら微生物醗酵生産物の種類に応じて適宜選択することができる。

【0011】

以下に、本発明の好ましい実施態様の一例として、次の一般式（１ａ）及び／又は（１ｂ）

【0012】

【化1】

【0013】

で表される化合物（スクラレオール）を反応基質として、微生物を用いて次の式（２）

【0014】

【化2】

【0015】

で表される１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オール（ジオール体）を製造する方法を説明する。

【0016】

ジオール体の製造において、微生物変換に利用できる微生物としては、前記式（１ａ）及び／又は（１ｂ）で表される化合物を基質として式（２）で表されるジオール体を生成し、菌体外に産出する能力を有する微生物であればよく、例えば子嚢菌綱（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する微生物、担子菌綱（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する微生物が挙げられる。
子嚢菌綱（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する微生物としては、ハイホジーマ（Ｈｙｐｈｏｚｙｍａ）属に属する微生物が挙げられる。また、担子菌綱（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する微生物としては、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物が挙げられる。なかでも、ジオール体の生成効率の点から、子嚢菌綱（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する微生物が好ましい。
ハイホジーマ（Ｈｙｐｈｏｚｙｍａ）属に属する具体的な微生物としては、例えばＡｓｃｏｍｙｃｅｔｅ ｓｐ．ＫＳＭ−ＪＬ２８４２と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）にＦＥＲＭ Ｐ−２０７５９として２００６年１月１２日に寄託された微生物、特許第２５４７７１３号明細書に記載のハイホジーマ ロセオニガー ＡＴＣＣ２０６２４株が挙げられる。

【0017】

また、ジオール体の製造において、微生物変換に利用できる微生物は、ジオール体の生成能を指標として土壌から単離することができる。当該ジオール体の生成能は、供試微生物を前記式（１ａ）及び／又は（１ｂ）で表される化合物を含有する培地にて培養し、培地中に含まれるジオール体を検出することで評価することができる。ジオール体の検出は、例えばガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、気液クロマトグラフィー（ＧＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、赤外スペクトル（ＩＲ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）等の従来公知の分析方法を用いることができる。

【0018】

本発明においては、微生物を培養する培地として消泡剤を含有する培地を用いる。
消泡剤は、醗酵時の発泡を抑制でき、醗酵阻害の少ないものであればよく、例えばシリコーン系消泡剤、動植物油系消泡剤、脂肪酸系消泡剤、脂肪酸エステル系消泡剤、又はアルコール系消泡剤等が挙げられる。なかでも、消泡性能が良好であり、醗酵阻害が少ない観点から、シリコーン系消泡剤が好ましい。シリコーン系消泡剤としては、例えばジメチルポリシロキサン、有機変性ポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、シリコーン処理粉末、シリコーンペースト、フッ素シリコーン等が挙げられる。

【0019】

培地中の消泡剤の含有量は、過剰な発泡を抑制する観点から、好ましくは０．５質量％（以下、単に「％」と記載する）以上、より好ましくは０．７５％以上である。また、消泡剤の含有量は、ジオール体生産性を良好にする観点から、好ましくは２％以下、より好ましくは１．５％以下である。また上記観点より、好ましくは０．５〜２％、より好ましくは０．７５〜２％、更に好ましくは０．７５〜１．５％である。
消泡剤は培養に先立って培地に添加してもよく、また培養中に添加してもよいが、培養中に添加することが好ましい。

【0020】

培地は、微生物が生育可能であればいかなる組成の培地をも使用することができる。使用可能な培地としては、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、有機酸塩等の炭素源；無機並びに有機アンモニウム塩、窒素含有有機物、アミノ酸等の窒素源；塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム等の金属ミネラル類及びビタミン類等を含有する液体培地を挙げることができる。
培地には、基質の分散性を良好として、ジオール体の生産性を良好とする観点から、界面活性剤を添加することが好ましい。界面活性剤は、醗酵阻害の少ないものであればよく、ノニオン性界面活性剤が好ましい。

【0021】

微生物を培養する際の培養条件としては、例えば通気培養、嫌気培養、撹拌培養、振盪培養、静置培養、発酵槽による培養の他、休止菌体反応及び固定化菌体反応を用いることができる。なかでも、微生物増殖性及びジオール体の生産性を良好にする観点から、通気培養が好ましい。通気培養での培養日数は、反応基質の添加から１〜１５日が好ましい。

【0022】

培地の初発ｐＨ（２５℃）は、微生物増殖性及びジオール体生産性を良好にする観点から、好ましくは３以上、より好ましくは４以上、更に好ましくは５以上であり、また好ましくは８以下、より好ましくは７以下である。

【0023】

培養温度は、微生物増殖性及びジオール体生産性を良好にする観点から、好ましくは１０℃以上、より好ましくは１５℃以上、更に好ましくは２０℃以上であり、また好ましくは３５℃以下、より好ましくは３０℃以下である。

【0024】

反応基質として培地に添加する前記式（１ａ）及び／又は（１ｂ）で表される化合物の濃度は、ジオール体の生成効率の点から、培地中に０．１〜５０％とすることが好ましく、１〜１０％とすることがより好ましい。基質は培養に先立って培地に添加してもよく、培養途中で添加してもよい。

【0025】

（工程（１））
このような微生物変換により生産されるジオール体を培養液から疎水性溶媒にて抽出する。当該培養液には、ジオール体の他、未反応の反応基質、微生物、培地成分等が含まれていてもよい。
本発明においては、ジオール体を疎水性溶媒にて抽出する前に、製造されるジオール体の匂い・色相を良好なものとする観点から、培養液中の培地成分等の水分の一部を予め遠心分離等で除去してもよい。
遠心分離は、分離板型、円筒型、デカンター型等の一般的な遠心分離機を用いることができ、バッチ式、連続式のいずれを用いることもできる。遠心分離の条件は適宜調整することができる。

【0026】

本発明で「疎水性溶媒」とは、１００ｇの水中における２５℃での溶解度が１質量％以下の溶媒をいう。
本発明で用いられる疎水性溶媒のＳＰ値は、ジオール体の溶解性の観点から、好ましくは１４（ＭＰａ）^1/2以上、より好ましくは１５（ＭＰａ）^1/2以上、更に好ましくは１６（ＭＰａ）^1/2以上、更に好ましくは１７（ＭＰａ）^1/2以上である。また、疎水性溶媒のＳＰ値は、水との分層性の観点から、好ましくは１９（ＭＰａ）^1/2以下、より好ましくは１８．５（ＭＰａ）^1/2以下である。また上記観点より、好ましくは１４〜１９（ＭＰａ）^1/2、より好ましくは１５〜１９（ＭＰａ）^1/2、更に好ましくは１６〜１８．５（ＭＰａ）^1/2、更に好ましくは１７〜１８．５（ＭＰａ）^1/2である。
ここで、疎水性溶媒のＳＰ値とは、溶解度パラメーターを示し、液体分子凝集エネルギーＥと分子容Ｖから（Ｅ／Ｖ）^1/2（ＭＰａ）^1/2で与えられる物質定数である。各種方法で求められるが、本発明におけるＳＰ値は、Ｊ．ＢＲＡＮＤＲ ＵＰ著「ＰＯＬＹＭＥＲ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ４ｔｈ」（ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ＆ＳＯＮＳ，ＩＮＣ １９９９年発行）、ＶＩＩ６８８〜６９４項に示された値を用いることができ、そこに記載のないものについてはＦｅｄｏｒｓの方法に従い、Ｊ．ＢＲＡＮＤＲ ＵＰ著「ＰＯＬＹＭＥＲ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ４ｔｈ」、ＶＩＩ６８５〜６８６項に示されるパラメーターを用いて算出した値を用いることができる。
複数の溶媒を組み合わせて用いる場合は、各溶媒のＳＰ値の体積平均値を計算することにより求める。

【0027】

好ましい疎水性溶媒としては、例えばシクロヘキサン（ＳＰ値＝１６．８（ＭＰａ）^1/2）、４−メチル−２−ペンタノン（ＳＰ値＝１７．２（ＭＰａ）^1/2）、キシレン（ＳＰ値＝１８．０（ＭＰａ）^1/2）、トルエン（ＳＰ値＝１８．２（ＭＰａ）^1/2）、酢酸エチル（ＳＰ値＝１８．６（ＭＰａ）^1/2）等が挙げられる。

【0028】

疎水性溶媒の使用量は、使用する溶媒により適宜設定することが好ましい。本発明においては、ジオール体の回収率（歩留まり）の観点から、培養液１００ｍＬに対して１０〜２０００ｍＬとするのが好ましく、１００〜１５００ｍＬとするのがより好ましく、２００〜１２００ｍＬとするのがより好ましい。

【0029】

培養液と疎水性溶媒を混合した際の混合液の温度は、０〜８０℃であることが好ましく、２０〜６５℃であることがより好ましい。このときの混合時間は、ジオール体の溶解性及び製造されるジオール体の匂い・色相を良好なものとする観点から、好ましくは１分間以上、より好ましくは５分間以上であり、また好ましくは１２０分間以下、より好ましくは６０分間以下である。

【0030】

培養液と疎水性溶媒を混合した後、疎水性溶媒層と水層を分離させ、水層を除去して疎水性溶媒抽出液を得る。水層には、微生物や微生物由来の不純物等が含まれており、これにより不純物等を除去できる。疎水性溶媒層と水層を分離する手段としては、静置分離、遠心分離等が挙げられる。
分離条件は適宜調整することができるが、例えば静置分離は１０〜６０分間行い、疎水性溶媒層を分取することが好ましい。静置時の混合液の温度は特に規定されないが、０〜８０℃であることが好ましく、２０〜６５℃であることがより好ましい。

【0031】

（工程（２））
本発明の方法における工程（２）は、前記工程（１）で得られた微生物醗酵生産物を含む疎水性溶媒抽出液をアルカリ水溶液と混合した後、疎水性溶媒抽出液をアルカリ水溶液から分離する工程である。
予め微生物醗酵生産物を含む疎水性溶媒抽出液をアルカリ水溶液と混合することにより濾過能力の低下を抑えられる理由は必ずしも明らかではないが、疎水性溶媒抽出液に混入した消泡剤に由来する物質、又は未反応の反応基質、微生物若しくは培地成分等と消泡剤に由来する物質の夾雑物がアルカリ水溶液に移行又は溶解されるためと考えられる。

【0032】

本発明で用いられるアルカリとしては、例えばアルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物、アンモニア、アミン類等が挙げられる。これらは１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。なかでも、取り扱い性の点から、アルカリ金属の水酸化物が好ましく、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムがより好ましく、水酸化ナトリウムが更に好ましい。

【0033】

アルカリ水溶液中のアルカリの濃度は、濾過速度の低下を防ぐ観点から、好ましくは０．１ｍｏｌ／ｄｍ³以上、より好ましくは１ｍｏｌ／ｄｍ³以上である。また、アルカリ水溶液中のアルカリの濃度は、ジオール体の変性を防ぐ観点から、好ましくは１０ｍｏｌ／ｄｍ³以下、より好ましくは５ｍｏｌ／ｄｍ³以下である。また上記観点より、好ましくは０．１〜１０ｍｏｌ／ｄｍ³、より好ましくは０．１〜５ｍｏｌ／ｄｍ³、更に好ましくは１〜５ｍｏｌ／ｄｍ³である。

【0034】

また、アルカリ水溶液の使用量は、濾過速度の低下を防ぐ観点から、疎水性溶媒抽出液１００ｍＬに対して、好ましくは１ｍＬ以上、より好ましくは５ｍＬ以上である。また、アルカリ水溶液の使用量は、乳化を防ぐ観点から、疎水性溶媒抽出液１００ｍＬに対して、好ましくは１００ｍＬ以下、より好ましくは２０ｍＬ以下である。

【0035】

疎水性溶媒抽出液とアルカリ性水溶液を混合する際の温度は、ジオール体が混合液中で析出しない温度であればよく、０〜８０℃、更に２０〜６５℃が好ましい。また、混合時間は、１〜１２０分間であることが好ましく、５〜６０分であることがより好ましい。

【0036】

混合後、疎水性溶媒抽出液をアルカリ水溶液から分離する。疎水性溶媒抽出液を分離する手段としては、静置分離、遠心分離等が挙げられる。
分離条件は適宜調整することができるが、例えば静置分離は１〜１２０分間、より好ましくは１０〜６０分間行い、疎水性溶媒抽出液を分取することが好ましい。また、静置時の混合液の温度は、０〜８０℃であることが好ましく、２０〜６５℃であることがより好ましい。

【0037】

本発明においては、濾過に先立ち、疎水性溶媒抽出液をアルカリ水溶液から分離した後、更に水と混合し、水を除去する処理を行ってもよい。
水の使用量は、濾過速度の低下を防ぐ観点から、疎水性溶媒抽出液１００ｍＬに対して、好ましくは１ｍＬ以上、より好ましくは５ｍＬ以上である。また、水の使用量は、乳化を防ぐ観点から、疎水性溶媒抽出液１００ｍＬに対して、好ましくは１００ｍＬ以下、より好ましくは２０ｍＬ以下である。また、水の温度は、０〜８０℃、更に２０〜６５℃が好ましい。また、混合時間は、１〜１２０分間であることが好ましく、５〜６０分であることがより好ましい。
このような処理は、１回でもよく、複数回（例えば２回、３回）繰り返してもよい。疎水性溶媒抽出液を水から分離する手段としては、上記同様、静置分離、遠心分離等が挙げられる。

【0038】

また、濾過に先立ち、吸着剤による吸着処理を行ってもよい。
吸着処理において用いられる吸着剤としては、例えば、白土、活性炭、珪藻土、セルロース又はこれらの組み合わせ等が挙げられる。
吸着剤の使用量は、濾過速度の低下を防ぐ観点から、疎水性溶媒抽出液１００ｍＬに対して、０．０１〜１０ｇが好ましく、更に０．１〜１ｇが好ましい。また、吸着処理時の疎水性溶媒抽出液と吸着剤の混合物の温度は、０〜８０℃が好ましく、更に２０〜６５℃が好ましい。疎水性溶媒抽出液と吸着剤の接触時間は、１〜１２０分間であることが好ましく、更に５〜６０分が好ましい。圧力は、減圧下でも常圧でもよいが、酸化抑制及び脱色性の点から減圧下が好ましい。

【0039】

（工程（３））
本発明の方法における工程（３）は、前記工程（２）でアルカリ水溶液から分離して得られた疎水性溶媒抽出液を濾過する工程である。
本発明における濾過は、吸引濾過、加圧濾過、遠心濾過、自然濾過等の一般的な方法を用いることができる。濾過に用いるフィルターの大きさは、微生物を除去する観点から、微生物の大きさよりも小さいものが好ましい。例えば、目開き０．１〜１０μｍ、更に０．２〜１μｍが好ましい。
濾過フィルターの材質は、抽出で用いる有機溶剤に対して耐性のあるものであればよく、例えば四フッ化エチレンやナイロン、セルロースアセテート等の樹脂が挙げられる。

【0040】

工程（３）によって得られた濾過液を、精製工程で通常行われる乾燥及び／又は晶析等することにより、高品質なジオール体を収率よく得ることができる。当該ジオール体は、粉末状、固体状、液体状等のいずれの形態であってもよい。
精製工程で乾燥を行う場合、その方法は特に制限されないが、乾燥温度は室温〜９０℃が好ましい。また、減圧乾燥を行ってもよい。
さらに、得られたジオール体は、酸性触媒、例えばｐ−トルエンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸クロリド、触媒量の硫酸又は酸性イオン交換体等を用いて、種々の溶媒中で脱水環化により化合物Ａに変換することができる。
上述のように、前記の工程（１）、（２）及び（３）によって、高品質の微生物醗酵生産物を効率良く得ることができる。

【0041】

本発明の態様及び好ましい実施態様を以下に示す。
＜１＞次の工程（１）、（２）及び（３）：
（１）消泡剤を含有する培地中で反応基質を微生物変換して得られる微生物醗酵生産物を、疎水性溶媒にて抽出する工程、
（２）工程（１）で得られた微生物醗酵生産物を含む疎水性溶媒抽出液とアルカリ水溶液を混合した後、疎水性溶媒抽出液をアルカリ水溶液から分離する工程、
（３）工程（２）でアルカリ水溶液から分離して得られた疎水性溶媒抽出液を濾過する工程、
を含む微生物醗酵生産物の製造方法。

【0042】

＜２＞アルカリ水溶液のアルカリの濃度が、好ましくは０．１ｍｏｌ／ｄｍ³以上、より好ましくは１ｍｏｌ／ｄｍ³以上であり、また、好ましくは１０ｍｏｌ／ｄｍ³以下、より好ましくは５ｍｏｌ／ｄｍ³以下である前記＜１＞に記載の微生物醗酵生産物の製造方法。
＜３＞アルカリが、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物、アンモニア及びアミン類から選ばれる１種又は２種以上であり、好ましくはアルカリ金属の水酸化物であり、より好ましくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はこれらの組み合わせであり、更に好ましくは水酸化ナトリウムである上記＜１＞又は＜２＞に記載の微生物醗酵生産物の製造方法。
＜４＞消泡剤が、シリコーン系消泡剤、動植物油系消泡剤、脂肪酸系消泡剤、脂肪酸エステル系消泡剤、又はアルコール系消泡剤であり、好ましくはシリコーン系消泡剤である上記＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の微生物醗酵生産物の製造方法。
＜５＞消泡剤を培地中に０．５質量％以上、好ましくは０．７５質量％以上、また２質量％以下、好ましくは１．５質量％以下含む上記＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の微生物醗酵生産物の製造方法。
＜６＞培地が、界面活性剤、好ましくはノニオン性界面活性剤を含む上記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の微生物醗酵生産物の製造方法。
＜７＞疎水性溶媒が、ＳＰ値１４（ＭＰａ）^1/2以上、好ましくは１５（ＭＰａ）^1/2以上、より好ましくは１６（ＭＰａ）^1/2以上、更に好ましくは１７（ＭＰａ）^1/2以上、また、ＳＰ値１９（ＭＰａ）^1/2以下、好ましくは１８．５（ＭＰａ）^1/2以下の範囲内にある溶媒である上記＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の微生物醗酵生産物の製造方法。
＜８＞疎水性溶媒が、シクロヘキサン、４−メチル−２−ペンタノン、キシレン、トルエン及び酢酸エチルから選ばれる１種又は２種以上であり、好ましくはトルエンである上記＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の微生物醗酵生産物の製造方法。
＜９＞反応基質が、次の一般式（１ａ）及び／又は（１ｂ）

【0043】

【化3】

【0044】

で表される化合物であり、製造される微生物醗酵生産物が次の式（２）

【0045】

【化4】

【0046】

で表される１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オールである上記＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の微生物醗酵生産物の製造方法。
＜１０＞微生物が、子嚢菌綱（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する微生物又は担子菌綱（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する微生物であり、好ましくは子嚢菌綱（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する微生物であり、より好ましくはハイホジーマ（Ｈｙｐｈｏｚｙｍａ）属に属する微生物である上記＜９＞に記載の微生物醗酵生産物の製造方法。

【実施例】

【0047】

＜ジオール体及びスクラレオールの分析方法＞
培養液５００μＬに酢酸エチル１０００μＬを添加し、室温で激しく撹拌後、遠心分離（１５０００ｒ／ｍｉｎ、２５℃、３分間）を行い、酢酸エチル層のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析でジオール体とスクラレオールの濃度を算出した。また、トルエン層のジオール体濃度をＧＣにて分析した。条件は下記のとおりである。
装置：Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７８９０Ａ
カラム：ＤＢ−ＷＡＸ（Ｊ＆Ｗ製）、１０ｍ×１００μｍ×０．１μｍ
注入口温度：２５０℃
オーブン温度：２００℃→（昇温１０℃／分）→２５０℃（５分間保持）
キャリアガス：Ｈｅ
注入法：スプリットモード（スプリット比１００：１）
圧力：５７．０９ｐｓｉ
トータルフロー：４３．４１ｍＬ／ｍｉｎ
カラム流量：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１μＬ
検出器：ＦＩＤ
検出器温度：２５０℃

【0048】

[濾過速度の算出方法]
疎水性溶媒抽出液５０ｇを親水性ＰＴＦＥフィルター（アドバンテック製、直径４７ｍｍ、孔径１μｍ、品名：H100A047A）で、常圧にて濾過し、濾液が３０ｇ得られるまでの濾過時間を測定し、１分間あたりの濾液回収量を濾過速度とした。

【0049】

［ジオール体収量の算出方法］
濾液３０ｇに含まれるジオール体の量を測定し、濾過１分間あたりのジオール体の回収量を求めた。

【0050】

実施例１
Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ ｓｐ．ＫＳＭ−ＪＬ２８４２（ＦＥＲＭ Ｐ−２０７５９）株を２．１％ＹＭブロスに１白金耳植菌し、２５℃にて３日間振盪培養したものを種菌とした。次いで、２．１％ＹＭブロス、０．１％硫酸マグネシウムからなる培地に種菌を０．３％植菌し、三角フラスコにて液温２４℃、攪拌速度２００ｒ／ｍｉｎにて３日間通気培養を行った。その後、培地に、１０％Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）、２０％スクラレオールからなる基質を培地中のスクラレオール濃度が３．８７％になるように添加し、同条件で１１日間培養を行った。基質添加から７日後に消泡剤（ＫＭ−７２Ｆ、信越シリコーン製）を培地に対して１％添加した。ｐＨは成り行きとした。
得られた培養液を分析したところ、ジオール体２．７％、スクラレオール０．２４％、その他水分と固形分（菌体等）が含まれていた。

【0051】

前記培養液３０ｇにトルエン２６５ｇ（培養液１００ｍＬに対しトルエン１０２３ｍＬ）を加え、攪拌速度４００ｒ／ｍｉｎ、２５℃で６０分間混合した後、６０分間静置してトルエン層をと水相を分層させ、トルエン層を得た。

【0052】

次いで、トルエン層５０ｇに、０．１ｍｏｌ／ｄｍ³水酸化ナトリウム水溶液５．７ｍＬを添加し（トルエン層１００ｍＬに対し水酸化ナトリウム水溶液９．８ｍＬ）、攪拌速度４００ｒ／ｍｉｎ、２５℃で６０分間混合した後、２５℃で６０分間静置してトルエン層と水酸化ナトリウム水溶液層を分層させ、トルエン層を得た。

【0053】

分取したトルエン層５０ｇを親水性ＰＴＦＥフィルター（アドバンテック製、直径４７ｍｍ、孔径１μｍ）で濾過し、濾液３０ｇを回収した。

【0054】

実施例２〜５
培地に対して表１に示す量の消泡剤を添加し、また、表１に示す濃度のアルカリ水溶液を使用した以外は実施例１と同様にしてトルエン層を得た。分取したトルエン層５０ｇを実施例１と同様に濾過し、濾液３０ｇを回収した。

【0055】

参考例
微生物変換において培地に消泡剤を添加せず、また、アルカリ水溶液を使用しなかった以外は実施例１と同様にしてトルエン層を得た。トルエン層５０ｇを実施例１と同様に濾過し、濾液３０ｇを回収した。

【0056】

比較例１〜２
培地に対して表１に示す量の消泡剤を添加し、また、アルカリ水溶液を使用しなかった以外は実施例１と同様にしてトルエン層を得た。トルエン層５０ｇを実施例１と同様に濾過し、濾液３０ｇを回収した。

【0057】

比較例３
培地に対して表１に示す量の消泡剤を添加し、また、アルカリ水溶液に代えて水を使用した以外は実施例１と同様にしてトルエン層を得た。分取したトルエン層５０ｇを実施例１と同様に濾過し、濾液３０ｇを回収した。
各実施例及び比較例の条件と結果を表１に示す。

【0058】

【表1】

【0059】

表１から明らかなように、培地に消泡剤を添加して微生物変換を行うと濾過速度の低下が見られ、単位時間あたりのジオール体の収量は少なくなった。他方、本発明の方法によれば、濾過速度の低下を抑えられ、ジオール体を効率良く得ることができた。また、アルカリ水溶液を混合する前と混合した後で、トルエン層中のジオール体濃度に大きな変化は見られなかった。