特許 6018079 非天然ＭＩＣタンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6018079

(24)【登録日】2016年10月7日

(45)【発行日】2016年11月2日

(54)【発明の名称】非天然ＭＩＣタンパク質

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20161020BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20161020BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20161020BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20161020BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20161020BHJP

   C40B 40/10 20060101ALN20161020BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C07K14/705

   A61K37/02

   A61P31/12

   A61P35/00

   !C40B40/10

【請求項の数】7

【全頁数】39

(21)【出願番号】特願2013-547455(P2013-547455)

(86)(22)【出願日】2011年7月5日

(65)【公表番号】特表2014-504861(P2014-504861A)

(43)【公表日】2014年2月27日

(86)【国際出願番号】US2011042955

(87)【国際公開番号】WO2012091756

(87)【国際公開日】20120705

【審査請求日】2014年7月2日

(31)【優先権主張番号】12/982,827

(32)【優先日】2010年12月30日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】513164048

【氏名又は名称】アビッドバイオティクス コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本 積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀 哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100182730

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 浩明

(72)【発明者】

【氏名】デイビッド ダブリュ．マーティン

(72)【発明者】

【氏名】スティーブン アール．ウィリアムズ

【審査官】 田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／０１８３８９３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Immunity，１９９９年，Vol.10，p.577-584

【文献】 Targeted soluble MICA molecules to recruit innate immunity cells to kill specific，SBIR，[online],掲載日不明，[retrived on 2015-07-09].Retrived from the Internet:<https://www.sbir.gov/sbirsearch/detail/2301>.

【文献】 nature immunology，２００１年，Vol.2,No.5，p.443-451

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的モチーフに結合したα１−α２プラットフォームドメインを含む、非天然、単量体、及び可溶性の哺乳類ＭＨＣクラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）分子であって、
前記α１−α２プラットフォームドメインは、配列番号１〜６、および１３からなる群から選択されたものであるＭＩＣＡタンパク質、又は配列番号７〜１２からなる群から選択されたものであるＭＩＣＢタンパク質であるＭＩＣタンパク質の野生型α１−α２プラットフォームドメインと少なくとも９０％同一であり、前記α１−α２プラットフォームドメインは、ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合し、
前記標的モチーフは、ＭＩＣのα３ドメインおよび１つ以上の異種ペプチドを含み、前記異種ペプチドは、１つ以上の溶媒に暴露されたループ内でＭＩＣのα３ドメイン中に存在し、かつ、前記異種ペプチドは、前記標的モチーフの、１つ以上の標的細胞上の１つ以上の標的分子への結合を誘導し、それによって前記結合したα１−α２プラットフォームドメインを前記標的細胞に送達する、前記分子。

【請求項2】

前記α３ドメインは、前記挿入部位とは異なる部位に、欠失、挿入、アミノ酸置換、突然変異、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の分子。

【請求項3】

前記溶媒に暴露されたループは、配列番号１〜１３からなる群から選択されたものであるＭＩＣＡまたはＭＩＣＢタンパク質の前記α３ドメインのアミノ酸位置番号１９０〜１９９、２０８〜２１１、２２１〜２２８、２３１〜２４０、２５０〜２５８及び２６４〜２６６に対応する、請求項１に記載の分子。

【請求項4】

前記溶媒に暴露されたループの１つ以上の全て又は部分が前記異種ペプチドからなる、請求項１〜３のいずれかに記載の分子。

【請求項5】

前記標的細胞は悪性であり、前記標的分子は、インテグリン、ＥｒｂＢ２、ＦＧＦ１受容体、ＦＧＦ２受容体、ＦＧＦ３受容体、ＩＧＦ１受容体、ＩＧＦ２受容体、ＶＥＧＦ受容体１、ＶＥＧＦ受容体２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１１３、ＣＤ２７１、もしくは癌遺伝子によってコードされているタンパク質生成物、またはそれらの断片であり、又は前記標的細胞は、ウイルスに感染し、前記標的細胞上の前記標的分子は、ホスファチジルセリン、もしくはアクセサリータンパク質を含むホスファチジルセリン；またはウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、肝炎ウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニア、ロタウイルス、インフルエンザ、パルボウイルス、西ナイルウイルス、狂犬病、ポリオーマ、風疹、ジステンパー、もしくは日本脳炎ウイルスによってコードされている表面糖タンパク質である、請求項１に記載の分子。

【請求項6】

前記異種ペプチドは、抗体の１つ以上の相補性決定領域である、請求項１に記載の分子。

【請求項7】

請求項１〜６のいずれか１項に記載の哺乳類ＭＨＣクラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）分子をコードする核酸分子。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２００９年１２月３１日に出願された米国特許仮出願６１／２９１，７４９号の優先権を主張する２０１０年１２月３０日に出願された米国特許出願１２／９８２，８２７号の一部継続出願であり、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

政府支援の説明
本発明は、米国立アレルギー感染症研究所によって付与されたアメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）中小企業技術革新制度（ＳＢＩＲ）認可番号１Ｒ４３０８８９７９の下、一部、政府の支援によって実施された。政府は本発明において特定の権利を有する。

【0003】

本発明は、概して、ＮＫ細胞を動員および活性化することができる非天然タンパク質分子に関し、より具体的には、標的細胞上の標的分子に結合する異種ペプチドを含むようにα３ドメイン内で修飾される、非天然、単量体、可溶性の哺乳類ＭＨＣクラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）分子に関する。

【背景技術】

【0004】

免疫系のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および特定の（ＣＤ８＋αβおよびγδ）Ｔ細胞は、ヒトおよび他の哺乳動物において、新生細胞およびウイルス感染細胞に対する最前線の先天性防御としての重要な役割を有する（Ｃｅｒｗｅｎｋａ，Ａ．，ａｎｄ Ｌ．Ｌ．Ｌａｎｉｅｒ．２００１．ＮＫ ｃｅｌｌｓ，ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：４１−４９）。ＮＫ細胞および特定のＴ細胞は、それらの表面上に、標的細胞を認識して病的細胞に対する先天性防御を活性化させることに寄与する、優れたホモ二量体の表面免疫受容体であるＮＫＧ２Ｄを示す（Ｌａｎｉｅｒ，ＬＬ，１９９８．ＮＫ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：３５９−３９３；Ｈｏｕｃｈｉｎｓ ＪＰ ｅｔ ａｌ．１９９１．ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＮＫＧ２，ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｒｅｌａｔｅｄ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｙｐｅ ＩＩ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１０１７−１０２０；Ｂａｕｅｒ，Ｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＮＫＧ２Ｄ，ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＭＩＣＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：７２７−７３０）。ヒトＮＫＧ２Ｄ分子は、配列が８４％同一または相同な同族リガンドである単量体ＭＩＣＡ［配列番号１〜６、および１３に記載のＭＩＣＡの可溶性形態］およびＭＩＣＢ［配列番号７〜１２に記載のＭＩＣＢの全タンパク質］（主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ鎖関連糖タンパク質（ＭＩＣ）の多形類似体）に結合するＣ型レクチン様細胞外ドメインを有する（Ｗｅｉｓ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｔｈｅ Ｃ−ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６３：１９−３４；Ｂａｈｒａｍ ｅｔ ａｌ．１９９４．Ａ ｓｅｃｏｎｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｇｅｎｅｓ．ＰＮＡＳ ９１：６２５９−６２６３；Ｂａｈｒａｍ ｅｔ ａｌ．１９９６ａ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ＭＩＣＡ ｇｅｎｅ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｔｉｃｓ ４４：８０−８１；Ｂａｈｒａｍ ａｎｄ Ｓｐｉｅｓ ＴＡ．１９９６．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ＭＩＣＢ ｃＤＮＡ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４３：２３０−２３３）。ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢの非病的発現は、腸上皮、ケラチノサイト、内皮細胞、および単球に限定されているが、増殖、酸化、および心ショック等の多くの種類の細胞ストレスに応答して、これらのＭＩＣタンパク質の異常な表面発現が起こり、その細胞を病的であると特徴付ける（Ｇｒｏｈ ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｃｅｌｌ ｓｔｒｅｓｓ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ＧＩ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．ＰＮＡＳ ９３：１２４４５−１２４５０；Ｇｒｏｈ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＭＨＣ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ γδΤ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：１７３７−１７４０；Ｚｗｉｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＩＣＡ ｂｙ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６０：３２３−３３０）。また、ＭＩＣタンパク質の病的発現も、いくつかの自己免疫疾患に関与していると考えられる（Ｒａｖｅｔｃｈ，ＪＶ ａｎｄ Ｌａｎｉｅｒ ＬＬ．２０００．Ｉｍｍｕｎｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：８４−８９；Ｂｕｒｇｅｓｓ，ＳＪ．２００８．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．４０：１８−３４）。不要な攻撃から健康な細胞を保護する一方で、様々な緊急の合図を同定してそれに応答するための手段を免疫系に提供するために、ＮＫＧ２Ｄリガンド、多形ＭＩＣＡ（＞５０対立遺伝子、例えば、図６の配列番号１〜６、および１３を参照）およびＭＩＣＢ（＞１３対立遺伝子、例えば、図６の配列番号７〜１２を参照）の特異的制御は重要である（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ＨＡ，（２００１）ＭＩＣＡ ａｎｄ ＭＩＣＢ ｇｅｎｅｓ：ｃａｎ ｔｈｅ ｅｎｉｇｍａ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｂｅ ｒｅｓｏｌｖｅｄ？ Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：３７８−８５；Ｓｐｉｅｓ，Ｔ．２００８．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄｓ：ａ ｐｕｒｐｏｓｅｆｕｌ ｂｕｔ ｄｅｌｉｃａｔｅ ａｆｆａｉｒ．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１０１３−１０１５）。

【0005】

ウイルス感染は、ＭＩＣタンパク質の発現の一般的な誘導因子であり、ＮＫ細胞またはＴ細胞の攻撃のためにウイルスに感染した細胞を同定する（Ｇｒｏｈ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｇｒｏｈ ｅｔ ａｌ．２００１．Ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８＋αβΤ−ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＮＫＧ２Ｄ ｖｉａ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｂｙ ＭＩＣ ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｎ ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２５５−２６０；Ｃｅｒｗｅｎｋａ，Ａ．，ａｎｄ Ｌ．Ｌ．Ｌａｎｉｅｒ．２００１）。実際、宿主細胞に対するそのような攻撃を回避するために、サイトメガロウイルスおよび他のウイルスは、先天性免疫系の逆襲から逃れるために、それらが感染する細胞の表面上のＭＩＣタンパク質の発現を防止する機構を発達させた（Ｌｏｄｏｅｎ，Ｍ．，Ｋ．Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｊ．Ａ．Ｈａｍｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａｒａｓｅ，Ｊ．Ｐ．Ｈｏｕｃｈｉｎｓ，Ｅ．Ｓ．Ｍｏｃａｒｓｋｉ，ａｎｄ Ｌ．Ｌ．Ｌａｎｉｅｒ．２００３．ＮＫＧ２Ｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＮＫ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｓ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｂｙ ｇｐ４０ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＡＥ−１ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：１２４５−１２５３；Ｓｔｅｒｎ−Ｇｉｎｏｓｓａｒ ｅｔ ａｌ，（２００７）Ｈｏｓｔ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｂｙ ｖｉｒａｌ ｍｉＲＮＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１７：３７６−３８１；Ｓｔｅｒｎ−Ｇｉｎｏｓｓａｒ ｅｔ ａｌ，（２００８）Ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＫＧ２Ｄ．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９：１０６５−７３；Ｓｌａｖｕｌｊｉｃａ，Ｉ Ａ Ｂｕｓｃｈｅ，Ｍ Ｂａｂｉｃ，Ｍ Ｍｉｔｒｏｖｉｃ，Ｉ Ｇａｓｐａｒｏｖｉｃ，Ｄ Ｃｅｋｉｎｏｖｉｃ，Ｅ Ｍａｒｋｏｖａ Ｃａｒ，ＥＰ Ｐｕｇｅｌ，Ａ Ｃｉｋｏｖｉｃ，ＶＪ Ｌｉｓｎｉｃ，ＷＪ Ｂｒｉｔｔ，Ｕ Ｋｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉ，Ｍ Ｍｅｓｓｅｒｌｅ，Ａ Ｋｒｍｐｏｔｉｃ ａｎｄ Ｓ Ｊｏｎｊｉｃ．２０１０．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｕｓｅ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ＮＫＧ２Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｓ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ａｎｄ ｈａｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２０：４５３２−４５４５）。

【0006】

肺癌および神経膠芽腫脳腫瘍等の悪性細胞等の多くの悪性細胞も、それらのストレスにもかかわらず、ＭＩＣタンパク質の発現を回避し、その結果、それらも先天性免疫系を逃れるため、ことさら悪性度が高くなり得る（Ｂｕｓｃｈｅ，Ａ ｅｔ ａｌ．２００６，ＮＫ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｂｙ ｇｅｎｅｔｉｃ ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｃｈａｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ Ａ． Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：１３５−１４６；Ｄｏｕｂｒｏｖｉｎａ，ＥＳ，ＭＭ Ｄｏｕｂｒｏｖｉｎ，Ｅ Ｖｉｄｅｒ，ＲＢ Ｓｉｓｓｏｎ，ＲＪ Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｂ Ｄｕｐｏｎｔ，ａｎｄ ＹＭ Ｖｙａｓ，２００３．Ｅｖａｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｃｈａｉｎ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｃｏｌｏｎ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６８９１−９９；Ｆｒｉｅｓｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．２００３．ＭＩＣＡ／ＮＫＧ２Ｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｌｉｏｍａｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６３：８９９６−９００６；Ｆｕｅｒｔｅｓ，ＭＢ，ＭＶ Ｇｉｒａｒｔ，ＬＬ Ｍｏｌｉｎｅｒｏ，ＣＩ Ｄｏｍａｉｃａ，ＬＥ Ｒｏｓｓｉ，ＭＭ Ｂａｒｒｉｏ，Ｊ Ｍｏｒｄｏｈ，ＧＡ Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ ａｎｄ ＮＷ Ｚｗｉｒｎｅｒ．（２００８）Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＮＫＧ２Ｄ Ｌｉｇａｎｄ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｃｈａｉｎ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ａ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｌａｎｏｍａｓ Ｃｏｎｆｅｒｓ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｒｉｖｉｌｅｇｅ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｓ ＮＫ Ｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８０：４６０６−４６１４）。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、哺乳動物に投与した後、ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢタンパク質のＮＫＧ２Ｄ結合部分、すなわち、それらのα１−α２プラットフォームドメインを、本発明の非天然タンパク質分子の分子標的モチーフを介して意図する標的分子または細胞標的上の分子に特異的に付着させることによって、特異的な細胞の標的細胞を攻撃するためにＮＫ細胞および特定のＴ細胞を動員および活性化することができる、可溶性、単量体、非天然のタンパク質分子について記載する。

【0008】

したがって、本発明の一態様において、標的モチーフに付着したα１−α２プラットフォームドメインを含む、非天然、単量体、可溶性の哺乳類ＭＨＣクラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）分子であって、標的モチーフは、ＭＩＣのα３ドメインおよび１つ以上の異種ペプチドを含み、異種ペプチド（複数可）は、非カルボキシ末端部位でＭＩＣのα３ドメインの１つ以上のループに挿入され、異種ペプチドは、標的モチーフの、標的細胞上の標的分子への結合を誘導し、それによって、付着したα１−α２プラットフォームドメインを標的細胞に送達する、分子が提供される。好ましい実施形態において、異種ペプチド（一つまたは複数）は、ループ１、ループ２、およびループ３から選択される１つ以上の部位内でＭＩＣのα３ドメインに挿入される。具体的な実施形態において、ループ１は、配列番号１〜１３からなる群から選択されるＭＩＣタンパク質のα３ドメインのアミノ酸数１９０〜１９９に対応し、ループ２は、アミノ酸残基２２１〜２２８に対応し、ループ３は、アミノ酸残基２５０〜２５８に対応する。特定の実施形態において、ＭＩＣ分子はグリコシル化される。

【0009】

本発明のいくつかの実施形態において、非天然ＭＩＣタンパク質であるα１−α２プラットフォームドメインおよびα３ドメインは、ヒトＭＩＣタンパク質に由来する。具体的な実施形態において、α１−α２プラットフォームドメインおよびα３ドメインは、配列番号１〜６、および１３からなる群から選択されるヒトＭＩＣＡタンパク質に由来する。他の実施形態において、α１−α２プラットフォームドメインおよびα３ドメインは、配列番号７〜１２からなる群から選択されるヒトＭＩＣＢタンパク質に由来する。好ましい実施形態において、ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢタンパク質は、その膜貫通ドメインを欠損している。

【0010】

特定の実施形態において、非天然ＭＩＣ分子のα３ドメインは、欠失のない完全な野生型α３ドメインである。他の実施形態において、α３ドメインは、野生型α３ドメインであり、ドメインの一部が欠失されている。いくつかの実施形態において、α３ドメインから欠失した部分は、異種ペプチドの挿入部位に隣接している。具体的な実施形態において、欠失した部分は、挿入部位の１０アミノ酸残基内にある。他の実施形態において、欠失した部分は、挿入部位の９、８、７、６、５、４、３、２、または１アミノ酸残基内にある。他の実施形態において、α３ドメインは、挿入部位とは異なる部位に、欠失、挿入、アミノ酸置換、突然変異、またはそれらの組み合わせを含む。

【0011】

非天然ＭＩＣ分子の具体的な実施形態において、異種ペプチドの挿入は、α３ドメインの１つ以上の溶媒に暴露されたループ内である。特定の実施形態において、溶媒に暴露されたループは、配列番号１〜１３からなる群から選択されるＭＩＣタンパク質内のα３ドメインのアミノ酸数１９０〜１９９、２０８〜２１１、２２１〜２２８、２３１〜２４０、２５０〜２５８、または２６４〜２６６に対応する。好ましい実施形態において、挿入は、配列番号１〜１３からなる群から選択されるＭＩＣタンパク質内のα３ドメインのアミノ酸数１９０〜１９９、２２１〜２２８、または２５０〜２５８に対応する溶媒に暴露されたループ内である。具体的な実施形態において、ループ１、ループ２、またはループ３のうちの１つ以上の全体または一部が欠失し、異種ペプチドで置換される。好ましい実施形態において、ループ１、ループ２、またはループ３のうちの１つ以上の全体が欠失し、欠失したループの片側または両側に隣接するα３ドメインのさらに１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの追加のアミノ酸が欠失している。より好ましい実施形態において、ループ１、ループ２、またはループ３のうちの１つ以上の全体が欠失し、欠失したループの片側または両側に隣接するα３ドメインのさらに１つ、２つ、または３つの追加のアミノ酸が欠失している。いくつかの実施形態において、ループと、欠失したループの両側の２つの追加のアミノ酸とが欠失し、その結果、配列番号１〜１３からなる群から選択されるＭＩＣタンパク質のα３ドメインのアミノ酸残基１８８〜２０１、２１９〜２３０、または２４８から２６０に対応する欠失がもたらされる。具体的な態様において、ループ１が欠失し、欠失したループの両側の２つの追加のアミノ酸が欠失しており、配列番号１〜１３からなる群から選択されるＭＩＣタンパク質のα３ドメインのアミノ酸数１８８〜２０１に対応する。

【0012】

いくつかの実施形態において、ＭＩＣ分子のループ１、ループ２、またはループ３のうちの１つより多くが異種ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、異種ペプチドは、同じ標的分子に結合する。一態様において、異種ペプチドは、同じアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、異種ペプチドは、異なる標的分子に結合する。

【0013】

本発明のいくつかの実施形態において、標的分子は、細胞表面分子である。具体的な実施形態において、細胞表面分子は、悪性細胞またはウイルス感染細胞の表面上にある。標的細胞が悪性である具体的な実施形態において、標的分子は、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ＮＫ−１Ｒ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｅｒｂ２、もしくはメラノーマ抗原；ＬＮｃａＰおよびＰＣ−３癌細胞の抗原；増殖因子受容体、血管新生因子受容体、インテグリン、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１１３、ＣＤ２７１、もしくは癌遺伝子によってコードされるタンパク質生成物、またはそれらの断片である。好ましい実施形態において、標的分子は、インテグリン、ＥｒｂＢ２、ＦＧＦ１受容体、ＦＧＦ２受容体、ＦＧＦ３受容体、ＩＧＦ１受容体、ＩＧＦ２受容体、ＶＥＧＦ１受容体、ＶＥＧＦ２受容体、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１１３、ＣＤ２７１、もしくは癌遺伝子によってコードされるタンパク質生成物、またはそれらの断片からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、標的分子はインテグリンである。少なくとも２４個の別個のインテグリンへテロ二量体を形成する１８個の既知のα鎖および８個の既知のβ鎖が存在し、それらの多くは癌細胞等の病原性細胞に関与する（Ｋｏｉｓｔｉｎｅｎ ａｎｄ Ｈｅｉｎｏ，２０１１．Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＮＣＢＩ Ｂｏｏｋｓｈｅｌｆ ＩＤ ＮＢＫ６０７０）。そのようなインテグリンは、α１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α４β７、α５β１、α６β１、α６β４、α７β１、α８β１、α９β１、α１０β１、αＩＩｂβ１、αＩＩｂβ３、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ５、αＶβ６、およびαＶβ８を含む。好ましい実施形態において、インテグリンは、αＶβ３、αＶβ５、およびα５β１からなる群から選択される。他の実施形態において、標的分子は、増殖因子受容体または細胞決定基（ＣＤ）タンパク質である。好ましい実施形態において、増殖因子受容体またはＣＤタンパク質は、ＥｒｂＢ２、ＦＧＦ１〜３受容体、ＩＧＦ１受容体、ＩＧＦ２受容体、ＶＥＧＦ１受容体、ＶＥＧＦ２受容体、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１１３、およびＣＤ２７１からなる群から選択される。

【0014】

標的細胞がウイルスに感染している実施形態において、標的細胞上の標的分子は、ホスファチジルセリン、もしくはアクセサリータンパク質を含むホスファチジルセリン；またはウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、肝炎ウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニア、ロタウイルス、インフルエンザ、パルボウイルス、西ナイルウイルス、狂犬病、ポリオーマ、風疹、ジステンパー、もしくは日本脳炎ウイルスによってコードされる表面糖タンパク質である。

【0015】

本発明の別の態様において、本発明の非天然ＭＩＣ分子と、担体または賦形剤とを含む組成物が提供される。

【0016】

本発明のさらなる態様において、本発明の非天然、可溶性の単量体ＭＩＣ分子をコードする核酸分子が提供される。具体的な実施形態において、標的モチーフに付着したα１−α２プラットフォームドメインを含む、非天然、単量体、可溶性の哺乳類ＭＨＣクラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）分子であって、標的モチーフは、ＭＩＣのα３ドメインおよび１つ以上の異種ペプチドを含み、異種ペプチド（複数可）は、非カルボキシ末端部位でＭＩＣのα３ドメインの１つ以上のループに挿入され、異種ペプチドは、標的モチーフの、標的細胞上の標的分子への結合を誘導し、それによって、付着したα１−α２プラットフォームドメインを標的細胞に送達する分子をコードする核酸が提供される。非天然ＭＩＣ分子をコードする核酸分子の具体的な実施形態において、異種ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１〜１３からなる群から選択されるＭＩＣタンパク質内のα３ドメインのアミノ酸数１９０〜１９９、２０８〜２１１、２２１〜２２８、２３１〜２４０、２５０〜２５８、または２６４〜２６６に対応するα３ドメインの溶媒に暴露されたループをコードする核酸配列内に挿入される。非天然ＭＩＣ分子をコードする核酸分子の好ましい実施形態において、異種ペプチド（一つまたは複数）は、ループ１、ループ２、およびループ３から選択される１つ以上の部位内でＭＩＣのα３ドメインに挿入される。具体的な実施形態において、ループ１は、配列番号１〜１３からなる群から選択されるＭＩＣタンパク質のα３ドメインのアミノ酸数１９０〜１９９に対応し、ループ２は、アミノ酸残基２２１〜２２８に対応し、ループ３は、アミノ酸残基２５０〜２５８に対応する。

【0017】

本発明の別の態様において、本発明の非天然ＭＩＣ分子を含むライブラリーが提供され、ライブラリーのメンバーは多様な個々の標的結合特性を有する。

【0018】

本発明のさらに別の態様において、本発明の非天然ＭＩＣ分子をコードする遺伝子を含むライブラリーが提供され、ライブラリーのメンバーは多様な個々の標的結合特性を有する。

【0019】

本発明のさらに別の態様において、有効量の本発明の非天然ＭＩＣ分子を哺乳動物に投与することによって、悪性腫瘍またはウイルス感染を有することが疑われる哺乳動物を治療する方法であって、異種ペプチドが、標的モチーフの、悪性細胞またはウイルス感染細胞上の標的分子への結合を誘導する方法が提供される。特定の実施形態において、非天然ＭＩＣ分子は、ＮＫＧ２Ｄ保有細胞と悪性細胞、またはＮＫＧ２Ｄ保有細胞とウイルス感染細胞を結合し、その結果、ＮＫＧ２Ｄ保有細胞の、悪性細胞またはウイルス感染細胞への接着がもたらされる。具体的な実施形態において、ＮＫＧ２Ｄ保有細胞を接着することにより、悪性細胞またはウイルス感染細胞の生存能が破壊される。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】ヒトＭＩＣＡの可溶性形態の構造を示す。ヒトＭＩＣＡの構造は、Ｐｉｎｇｗｅｉ Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２，４４３−４５１，２００１）によって解決されたようにリボンとして表される。α１およびα２ドメインは、ＮＫＧ２Ｄホモ二量体のための結合部位を提供する。α３ドメインは、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーであり、この可溶性形態においてＣ末端を含む大腸菌において発現される。

【図2】クマシーブルー染色またはヒトＭＩＣＡに対する抗体を用いたウエスタンブロット法によって検出された、ｐＫＫ２９を内部に持つ大腸菌の誘導（「Ｂ」と表示されたレーン）または非誘導（「Ａ」と表示されたレーン）培養からの細胞質ゾル（「サイトゾル」）、細胞膜（「細胞膜」）、および外膜（「外膜」）タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真を示す。分子量が示されている。ＭＩＣＡのα３ドメインのインチミン（ＥａｅＡ）との融合は、アラビノースを用いて誘導した大腸菌細胞の外膜上に発現される。

【図3】哺乳類発現ベクターｐｃ５ＤＮＡ／ＦＲＴにおいて可溶性ＭＩＣＡアミノ酸１〜２７６をコードするＤＮＡの構造の図である。ＣＭＶプロモーター、分泌シグナル、Ｈｉｓ−六量体タグ（「Ｈｉｓ６」、配列番号１２７）、α３の「緊密な」ループ１（アミノ酸１８８〜２０１）およびループ３（アミノ酸２５０〜２５８）、ならびにｂｇｈのｐｏｌｙＡテールの位置を示す。

【図4】Ｍ１３ファージｐＩＩＩの一部をコードするＤＮＡに融合されたＭＩＣＡのα３をコードするＤＮＡの構成。ｌａｃプロモーター、Ｐ_ｌａｃ、ｐＩＩＩ分泌シグナル、ＦＬＡＧタグ、ならびにα３の「緊密な」ループ１（アミノ酸１８８〜２０１）およびループ３（アミノ酸２５０〜２５８）の位置を示す。

【図5】ヒトＭＩＣＡのα３ドメインを多様化するためのＤＧＲに基づくアプローチの略図を示す。

【図6】大腸菌の表面上に表示されたＥａｅＡおよびＥａｅＡ−α３融合タンパク質の構造の略図を示す。ＯＭは外膜、Ｄ１〜Ｄ３はＩｇスーパーファミリーモチーフ、Ｘａは第Ｘ因子の切断部位、そしてＨ６はヘキサヒスチジンである。

【図7-1】配列番号１〜１２６のアミノ酸または核酸配列を提供する。

【図7-2】配列番号１〜１２６のアミノ酸または核酸配列を提供する。

【図7-3】配列番号１〜１２６のアミノ酸または核酸配列を提供する。

【図7-4】配列番号１〜１２６のアミノ酸または核酸配列を提供する。

【図7-5】配列番号１〜１２６のアミノ酸または核酸配列を提供する。

【図7-6】配列番号１〜１２６のアミノ酸または核酸配列を提供する。

【図7-7】配列番号１〜１２６のアミノ酸または核酸配列を提供する。

【図7-8】配列番号１〜１２６のアミノ酸または核酸配列を提供する。

【図7-9】配列番号１〜１２６のアミノ酸または核酸配列を提供する。

【図7-10】配列番号１〜１２６のアミノ酸または核酸配列を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0021】

本発明は、哺乳動物に投与した後、ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢタンパク質のＮＫＧ２Ｄ結合部分、すなわち、それらのα１−α２プラットフォームドメイン（α１ドメインおよびα２ドメインそれぞれにつき、アミノ酸１〜８５および８６〜１７８）を、α１−α２プラットフォームに付着した標的モチーフを介して意図する標的分子または細胞標的上の分子に特異的に結合させることによって、特異的な細胞の標的細胞を攻撃するためにＮＫ細胞および特定のＴ細胞を動員および活性化することができる可溶性、単量体、非天然のタンパク質分子について記載する。標的モチーフは、ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢタンパク質のα３ドメインを含み、挿入された異種ペプチド（一つまたは複数）が標的分子に結合する。

【0022】

「異種ペプチド」は、天然にはまたは通常はα３ドメイン内に存在しないペプチドである。いくつかの実施形態において、異種ペプチドは、可溶性ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢのα３ドメインの溶媒に暴露されたループのうちの１つに統合される。統合された異種ペプチドは、ＭＩＣのα３ドメインの非末端構成要素であってもよく、ＭＩＣα３ドメインの標的分子への結合を誘導する。異種ペプチドは、既存のループのいずれも欠失させることなく、ループの２つの隣接する残基の間でα３ドメインのループに挿入されてもよい。代替として、ループの全体または一部が欠失し、異種ペプチドで置換されてもよい。好ましい実施形態において、ループの全体が欠失し、インサートで置換される。さらなる実施形態において、ループの全体が欠失し、欠失部位の片側または両側に隣接するα３ドメインの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの追加のアミノ酸もまた欠失している。好ましい実施形態において、欠失部位の片側または両側の１つ、２つ、または３つの残基が欠失している。特定の態様において、配列番号１〜１３の１８８〜２０１に対応する残基および／または残基２５０〜２５８が欠失している。いくつかの実施形態において、１つ以上の残基を含むループの一部が欠失し、異種ペプチドで置換される。特定の実施形態において、欠失した部分は、ループの１つ〜３つの残基であるか、またはループの１つ〜５つのアミノ酸残基であるか、またはさらにはループの１つ〜７つの残基である。具体的な実施形態において、欠失した部分は、挿入部位の１０アミノ酸残基内にある。他の実施形態において、欠失した部分は、挿入部位の９、８、７、６、５、４、３、２、または１アミノ酸残基内にある。

【0023】

いくつかの実施形態において、異種ペプチドは、スペーサーおよび結合モチーフを含んでもよい。そのようなスペーサーは、その標的分子に結合できるように、または標的分子に結合する能力を向上させることができるように、異種ペプチドの結合モチーフを位置付けるために使用される、短い可撓性のリンカーペプチドであってもよい。

【0024】

具体的な実施形態において、異種ペプチドは、天然もしくは組換え抗体、別のタンパク質もしくはペプチド分子、または結合モチーフの補体決定領域の一部を含んでもよい。特定の実施形態において、異種ペプチドは、抗体の補体決定領域である。他の実施形態において、異種ペプチドは、付着した多糖または他の炭水化物、核酸分子のアプタマーまたは合成類似体等の核酸分子をさらに含む。異種ペプチド（一つまたは複数）を組み入れることによって、ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢタンパク質の非自然（または非天然）の、修飾または変換されたα３ドメインが生じ、それは、異種ペプチド（一つまたは複数）の結合特性（例えば、同族の結合パートナー）に基づいて、α１−α２プラットフォームの標的化を誘導する有用な機能を獲得する。本発明の非天然の一価分子は、一般的な提示表面に結合されないまたは限定されないという明確な利点を有し、それによって、修飾すること、製剤化すること、および従来の生物製剤として哺乳動物に投与することができる。

【0025】

好ましい実施形態において、本発明の非天然、可溶性の単量体ＭＩＣタンパク質のループ１、ループ２、またはループ３のうちの１つより多くが異種ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、異種ペプチドは、同じ標的分子に結合する。一態様において、異種ペプチドは、結合モチーフ内に同じアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、標的分子は、同じ細胞または同じ細胞型上にあってもよい。他の態様において、標的分子は、異なる細胞または細胞型上にあってもよい。他の実施形態において、異種ペプチドは、異なる標的分子に結合する。いくつかの態様において、標的分子は、同じ細胞または同じ細胞型上にあってもよい。他の態様において、標的分子は、異なる細胞または細胞型上にあってもよい。

【0026】

所望されるα３ドメインに対する修飾は、標的細胞（例えば、悪性細胞またはウイルス感染細胞）の表面上の分子等の標的分子に対するα３ドメインの結合の特異性または感受性を加えるかまたは増加させるものを含む。α１−α２プラットフォームドメインは、修飾された標的α３ドメインに繋ぎ止められ、哺乳動物の細胞間または血管内の空間において拡散性である。好ましくは、本発明の非天然ＭＩＣタンパク質のα１−α２プラットフォームドメインは、ヒトＭＩＣＡまたはＭＩＣＢタンパク質の野生型または天然のα１−α２ドメインと少なくとも８０％同一または相同であり、ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合する。いくつかの実施形態において、α１−α２プラットフォームドメインは、ヒトＭＩＣＡまたはＭＩＣＢタンパク質の野生型または天然のα１−α２プラットフォームドメインと８０％同一であり、ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合する。他の実施形態において、α１−α２プラットフォームドメインは、ヒトＭＩＣＡまたはＭＩＣＢタンパク質の野生型または天然のα１−α２プラットフォームドメインと９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合する。いくつかの実施形態において、α３ドメインは、ヒトＭＩＣＡまたはＭＩＣＢタンパク質の野生型または天然のα３ドメインと８５％同一（いずれの修飾されたループも含まずに）である。他の実施形態において、α３ドメインは、ヒトＭＩＣＡまたはＭＩＣＢタンパク質の野生型または天然のα３ドメインと９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一（いずれの修飾されたループも含まずに）である。例示的なヒトＭＩＣＡタンパク質（可溶性形態）は、配列番号１〜６、および１３を含む。例示的なヒトＭＩＣＢタンパク質（全タンパク質）は、配列番号７〜１２を含む。

【0027】

他の実施形態において、異種ペプチドタグは、可溶性ＭＩＣタンパク質の精製を補助するために、可溶性ＭＩＣタンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合されてもよい。タグ配列は、ポリヒスチジン、ｍｙｃ−ペプチド、またはＦＬＡＧタグ等のペプチドを含む。そのようなタグは、当業者に既知の方法によってＭＩＣ分子の単離後に除去されてもよい。

【0028】

本明細書で使用される場合、「可溶性ＭＩＣタンパク質」、「可溶性ＭＩＣＡ」、および「可溶性ＭＩＣＢ」は、ＭＩＣタンパク質のα１、α２、およびα３ドメインを含むが、貫通膜または細胞内ドメインを含まないＭＩＣタンパク質を指す。例示的な可溶性ＭＩＣタンパク質は、配列番号１〜１３のアミノ酸残基１〜２７４または１〜２７６を含む。

【0029】

本明細書で使用される場合、「完全なＭＩＣタンパク質」は、α１、α２、およびα３ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに細胞内ドメインを含むＭＩＣタンパク質を指す。完全なＭＩＣタンパク質の例は、配列番号７〜１２に記載される。

【0030】

本発明は、ＭＩＣ遺伝子のライブラリーまたはその結果生じる可溶性ＭＩＣタンパク質をさらに提供し、ライブラリーの各メンバーは、標的細胞に対するその結合特性等の異なる特性を有するかまたは示すため、多様な分子のライブラリーが生じる。例えば、ライブラリーは、１０以上の異なる結合特異性を表す多様な個々の標的結合特性を含むことができる。本明細書で使用される場合、「多様な個々の標的結合特性」とは、ライブラリーの個々のメンバーが、異なる標的分子に結合するか、または同じ標的分子に対して異なる親和性もしくは結合力を有する、ＭＩＣタンパク質のライブラリーを指す。いくつかのＭＩＣタンパク質のライブラリーにおいて、２つ以上のメンバーが同じ標的に結合してもよいが、異なる結合親和性または結合力を有してもよい。

【0031】

本発明のさらなる実施形態において、悪性腫瘍またはウイルス感染を有する哺乳動物は、悪性またはウイルス性の状態に影響を与えるように有効量の可溶性ＭＩＣタンパク質を投与することによって治療することができる。哺乳動物への分子の投与は、ＮＫＧ２Ｄ保有ＮＫ細胞またはＴ細胞の標的悪性細胞またはウイルス感染細胞への接着をもたらし得、ＮＫ細胞またはＴ細胞が、標的悪性細胞またはウイルス感染細胞を破壊的に攻撃するかまたは破壊する。本発明の方法に照らして本明細書で使用される場合の「破壊する」という用語は、標的細胞の生存能を破壊することを意味する。

【0032】

本明細書で使用される場合、「悪性」または「悪性の状態」は、癌、一群の細胞が制御されない増殖を示す疾患のクラス、隣接する組織に侵入して破壊する浸潤、および場合によっては転移（すなわち、リンパまたは血液を介して体内の他の場所に広がること）を指す。いくつかの実施形態において、悪性腫瘍は、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である。具体的な実施形態において、白血病は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病、または急性単球性白血病（ＡＭＯＬ）であり、リンパ腫は、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫であり、骨髄腫は多発性骨髄腫である。他の実施形態において、悪性腫瘍は、乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌、脳癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、結腸癌、食道癌、肝臓癌、胃癌、子宮癌、内分泌癌、腎癌、膀胱癌、または子宮頸癌を含む悪性固形腫瘍である。好ましい実施形態において、悪性腫瘍は、乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌、脳癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、または結腸癌である。より好ましい実施形態において、悪性腫瘍は乳癌である。

【0033】

また、本発明は、ＭＩＣタンパク質のα３ドメイン（たとえば、配列番号１〜１３のアミノ酸１８２〜２７４）を、ＮＫＧ２Ｄ保有ＮＫ細胞またはＴ細胞を誘引するか、動員するか、またはそれらに結合するために、その繋ぎ止められたα１−α２ドメインを細胞間空間から標的細胞表面に直接送達することができる特異的な標的ドメインに変換する手段も含む。

【0034】

これらの「受動ワクチン」の用途は、病的であるにもかかわらず、ＮＫ細胞または特定のＴ細胞を攻撃するために必要な適切なレベルのＭＩＣＡまたはＭＩＣＢ等のリガンドを発現しない病的細胞を破壊することである。例えば、ヒト肺癌のわずか３０％がＭＩＣＡを発現する（Ｂｕｓｃｈｅ， Ａ ｅｔ ａｌ．２００６）。神経膠芽腫細胞は、先天性の免疫攻撃を防止するＮＫ細胞阻害シグナルを過剰発現するが、実験動物の肺癌または神経膠芽腫細胞における天然ＭＩＣＡ遺伝子産物の過剰発現は、ＮＫ細胞の癌に対する効果的な攻撃を回復する（Ｆｒｉｅｓｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．２００３）。

【0035】

ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合したヒトＭＩＣＡの高分解能構造が解明されており、ＭＩＣＡのα３ドメインは、ＮＫＧ２Ｄ受容体と直接的には相互作用しないことが示されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２００１．Ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＫＧ２Ｄ ａｎｄ ｉｔｓ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ−ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ ＭＩＣＡ．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４４３−４５１；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｃｏｄｅ １ＨＹＲ）。ＭＩＣＡのα３ドメインは、ＭＩＣＢのα３ドメインと同様に、短い可撓性のリンカーペプチド、アミノ酸１７５〜１８２［配列番号１〜１３］によってα１−α２プラットフォームドメインに接続され、それ自体がプラットフォームと、ＭＩＣを発現する細胞の表面との間の「スペーサー」として天然に位置する。ヒトＭＩＣＡおよびＭＩＣＢのα３ドメインの三次元構造は、ほぼ同一であり（９４Ｃ−αα’ｓ上で平均二乗距離の平方根＜１Å）、機能的に交換可能である（Ｈｏｌｍｅｓ ｅｔ ａｌ．２００１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ａｌｌｅｌｉｃ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｈｏｍｏｌｏｇ ＭＩＣＢ， ａ Ｓｔｒｅｓｓ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＫＧ２Ｄ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１３９５−１４００）。

【0036】

さらに、ＭＩＣタンパク質のＩｇ様α３ドメインの三次元構造は、テンダミスタットの構造に類似し、また配列反転形態においては、１０番目のヒトフィブロネクチンドメインＩＩＩ型の構造に類似している：どちらの構造も、タンパク質結合モチーフを操作するための足場としての役割を果たしてきた（Ｐｆｌｕｇｒａｔｈ，ＪＷ，Ｇ Ｗｉｅｇａｎｄ，Ｒ Ｈｕｂｅｒ，Ｌ Ｖｅｒｔｅｓｙ（１９８６）Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｈｅ α−ａｍｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｈｏｅ−４６７Ａ．Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１８９：３８３−３８６；Ｋｏｉｄｅ Ａ，Ｂａｉｌｅｙ ＣＷ，Ｈｕａｎｇ Ｘ，Ｋｏｉｄｅ Ｓ．１９９８．Ｔｈｅ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｄｏｍａｉｎ ａｓ ａ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ ｎｏｖｅｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４：１１４１−１１５１；Ｌｉ，Ｒ，ＲＨ Ｈｏｅｓｓ，ＪＳ Ｂｅｎｎｅｔｔ ａｎｄ ＷＦ ＤｅＧｒａｄｏ（２００３）Ｕｓｅ ｏｆ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｏ ｐｒｏｂｅ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｉｎ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １６：６５−７２；Ｌｉｐｏｖｓｅｋ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｅｒ−ｌｏｏｐ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ ｉｎ ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｉｍｉｃｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ ｃａｍｅｌｉｄ ａｎｄ ｓｈａｒｋ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３６８：１０２４−１０４１；米国特許第７１５３６６１号；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｃｏｄｅ １ＴＴＧ）。

【0037】

本発明の一態様は、ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢのα３ドメインの溶媒に暴露された６つのループのうちの１つ以上に、遺伝子操作によって特異的結合特性を持たせることを企図し、哺乳動物への投与後、血管内または細胞間空間内に拡散し、続いて、意図する標的細胞上の標的分子に高い感受性および特異性で付着することができ、それによって、結合ならびにそれに続くＮＫＧ２Ｄ保有ＮＫおよび／またはＴ細胞による特定の標的細胞の破壊的攻撃を促進することができる、可溶性の非天然ＭＩＣ分子が形成される。標的悪性細胞上の表面接近性分子の例は、インテグリン、癌遺伝子産物またはそれらの断片、例えば、ＮＫ−１Ｒ、ヒト上皮増殖因子２（Ｈｅｒ２またはＥｒｂＢ２）、増殖因子受容体、例えば、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＦＧＦ受容体３、ＣＤ３０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、血管新生因子受容体（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体およびＶＥＧＦ関連分子のため等）、メラノーマ抗原、ならびにＬＮｃａＰおよびＰＣ−３前立腺癌細胞の抗原を含む。標的ウイルス感染細胞上の表面接近性分子は、アポリポタンパク質Ｈ、Ｇａｓ６、ＭＦＧ−Ｅ８等のアクセサリータンパク質を有するかまたは有しない「裏表が反転した」ホスファチジルセリン；ウイルスによってコードされる抗原、ウイルスによってコードされる肝炎ウイルスの抗原；アデノウイルス；サイトメガロウイルス；他のヘルペスウイルス；ＨＩＶ（特にｐＩ７）；ワクシニア；ポックスウイルス；ロタウイルス；インフルエンザ；パルボウイルス；西ナイルウイルス；狂犬病；ポリオーマ；パピローマウイルス；風疹；ジステンパー；および日本脳炎ウイルスを含む（Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｋ ａｎｄ Ｓｃｈｒｏｉｔ，ＡＪ．２００３．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６５：７０１−７３４；Ｓｏａｒｅｓ，ＭＭ，ＳＷ Ｋｉｎｇ＆ＰＥ Ｔｈｏｒｐｅ．（２００８）Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｖｉｒａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １４：１３５８−６２；Ｓｌａｖｕｌｊｉｃａ ｅｔ ａｌ，２０１０）。本発明の組成物は、合成ＤＮＡ、バクテリオファージディスプレイ、または酵母表面ディスプレイもしくは細菌表面ディスプレイ技術（これらのうちのいくつかは、テンダミスタットおよび１０番目のヒトフィブロネクチンドメインＩＩＩに特異的結合特性を形成するために展開されている）を展開して、ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢのα３ドメインに特異的な結合モチーフを導入することによって生成することができる（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，ＳＪ ａｎｄ ＲＨ Ｈｏｅｓｓ，（１９９５）Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔ ａｓ ａ Ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ｐｈａｇｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ ２５０：４６０−４７０；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）；Ｓｉｄｈｕ，Ｓ．Ｓ．＆Ｓ．Ｋｏｉｄｅ（２００７）Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｆｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１７：４８１−４８７；Ｌｉｐｏｖｓｅｋ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．２００７）。これらの方法は、溶媒に暴露されたループ内で高度に多様化され、選択、スクリーニング、またはパニング（全て当業者に既知である）によって、所望の表現型の結合特性を示すこれらのα３ドメインをコードする遺伝子型をそこから単離するための、α３ドメイン構造のライブラリーを作製することを伴う。

【0038】

Ｍｉｌｌｅｒらの多様性を生成するレトロエレメント（ＤＧＲ）は、ループ内の多様なアミノ酸位置に多様性を生成する方法の一例である（Ｍｅｄｈｅｋａｒ，Ｂ．＆Ｊ．Ｆ．Ｍｉｌｌｅｒ．２００７．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：３８８−３９５、および米国特許第７，５８５，９５７号）。ヒトＭＩＣＡおよびＭＩＣＢのα３ドメインは、２７６個のアミノ酸の水溶性形態うちの９５個のアミノ酸（１８２〜２７６）からなっているため、全ての溶媒に暴露されたループ、たとえば、配列番号１〜１３のアミノ酸１９０〜１９９、２０８〜２１１、２２１〜２２８、２３１〜２４０、２５０〜２５８、または２６４〜２６６が多様化されてもよく、またさらには、操作可能であることが分かっている長さである２００ヌクレオチドを超えない長さの合成鋳型反復配列（Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｒｅｐｅａｔ：ＴＲ）を展開して突然変異誘発をホーミングすることにより、挿入したアミノ酸によって伸長されてもよい（Ｇｕｏ，Ｈ ｅｔ ａｌ．２００８．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔ Ｈｏｍｉｎｇ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｓ Ｔａｒｇｅｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ Ｒｅｐｅａｔｅｄ Ｒｏｕｎｄｓ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ Ｒｅｗｒｉｔｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ３１，８１３−８２３）。

【0039】

いくつかの要因によって、α３ドメインの、多様化された、溶媒に暴露されたループのＤＧＲベースのライブラリの作成が誘導される。第１に、ＤＧＲは、可変反復配列（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｐｅａｔ：ＶＲ）と称される、タンパク質をコードするＤＮＡ配列の所定のセグメントに多様性を生成する。いくつかの異種配列は、ＶＲとして機能するために、それらの末端で変異原性ホーミングの開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｇｅｎｉｃ ｈｏｍｉｎｇ：ＩＭＨ）配列と隣接する。ＩＭＨ配列は、変異原性ホーミングを誘導し、配列の多様化の３’境界を決定する、シス作用部位としての役割を果たす。第２に、ＶＲの多様化の５’境界は、ＶＲとその同族ＴＲとの間の相同性の程度によって決定され得る。部分的な相同性のみが必要とされ、ミスマッチも許容される。第３に、多様化に供されるＶＲの特異的部位は、ＴＲにおけるアデニン残基の位置によって決定され得る。「合成」ＴＲの適切な位置にアデニン残基を挿入することによって、特異的なＶＲによってコードされるアミノ酸残基を多様化することができる。第４に、ａｔｄタンパク質、ＴＲによってコードされるＲＮＡ中間体、およびＲＴ逆転写酵素は、異種プロモーター、例えば、Ｐ_ｔｅｔＡまたはＰ_ｂａｄ−の制御下でプラスミドベクターｐＤＧＲ上に発現されたときに効率的にトランスで機能する。このことは、細菌細胞内の多様化を切り換えるための便利な手段、および多様化される正確な部位をプログラムするための合成ＴＲ配列への便利なアクセスを提供する。さらに、トランス作用構成要素の高レベルの発現は、高効率の多様化をもたらす。

【0040】

α３ドメインを多様化するためのＤＧＲベースのアプローチの一般的な概要を図５に示す。多様化される配列は、α３ドメインのループに対応する。ＩＭＨ配列は、α３ドメインをコードする遺伝子の停止コドン（約ＡＶ２７７）のすぐ下流に位置し、多様化に供される「合成ＶＲ」を作製する

【0041】

α３ドメインをコードする合成ＶＲは、プラスミドｐＤＧＲ上の合成ＴＲによって多様化される（図５）。このＴＲ要素は、ＩＭＨ＊と、ＶＲに相同な上流配列とを含む。突然変異誘発に供される特異的なＶＲ残基は、ＴＲにおけるアデニンの置換によって正確にプログラムされ、高密度のアデニン残基がシステムによって許容され得る。また、ｐＤＧＲは、ＡｔｄおよびＲＴ逆転写酵素をコードする座位も含む。Ａｔｄ、ＴＲ、およびｒｔは、厳重に抑制されたｔｅｔＡプロモーター／オペレーター（Ｐ_ｔｅｔＡ）から発現され、アンヒドロテトラサイクリンの添加または除去により、多様化プロセスの正確な制御を可能にする。

【0042】

標準的なファージディスプレイ形式において、ＤＧＲ機構を介してα３ドメインを多様化することを検討することは有益である。この場合、α３ドメインは、大腸菌においてファージミドベクター上でコードされる繊維状ファージコートタンパク質に融合される。ＶＲは、α３ドメインの溶媒に暴露されたループを含み、ｐＤＧＲは、それらのループ内の指定された場所で効率的にＶＲを多様化するように設計される（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．２００８）。ａｔｄ、ＴＲ、およびｒｔの発現を活性化することにより、ファージミドゲノム上に存在するＶＲ配列の突然変異が誘発される。この結果、ファージのライブラリーが作製され、それらの各々が、その表面上で多様化された結合タンパク質を表し、コード化ＤＮＡパッケージングする。所望の特異性は、固定化された標的分子、例えば、癌遺伝子Ｈｅｒ２の表面露出タンパク質生成物にファージを結合させ、非結合ファージを除去するために洗浄し、再増幅および濃縮することによって選択される。選択された表現型のさらなる最適化のラウンドは、単純に、ｐＤＧＲを含む大腸菌を選択またはパニングされたファージに感染させ、上述のステップを繰り返すことによって効率的に達成することができる。このシステムは、従来のアプローチによって達成されるものよりも数桁大きいライブラリーサイズを生成することができる。α３ドメイン骨格の完全性を犠牲にすることなく、累積的な改善を伴って連続ラウンドの最適化が達成され得る容易さも、等しく有利である。

【0043】

大腸菌等の細菌の表面上に多様化したタンパク質を表示することは、ファージディスプレイに優る潜在的な利点を提供する代替のアプローチである。例えば、いずれのファージも作製する必要なく、または選択されたファージの複数ラウンドの感染を繰り返す必要もなく、連続ラウンドの最適化を達成することができる。また、α３ドメインは、直接的な生化学的または物理的分析のために細菌の表面から切断されるように設計することができる。ＤＧＲは、４０を超える細菌種のゲノム内に天然に見られるが、いずれも大腸菌において同定されていない。しかしながら、最近、レジオネラ・ニューモフィラ由来のＤＧＲのシスおよびトランス作用構成要素が大腸菌において効率的に機能することがＭｉｌｌｅｒらによって示された。ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢの多様化されたα３ドメインは、非限定的な例として、腸管病原性大腸菌によってコードされたＥａｅＡインチミンタンパク質の外膜局在化およびアンカードメインから構成される融合タンパク質として、大腸菌の表面上で発現される（Ｌｕｏ Ｙ，Ｆｒｅｙ ＥＡ，Ｐｆｕｅｔｚｎｅｒ ＲＡ，Ｃｒｅａｇｈ ＡＬ，Ｋｎｏｅｃｈｅｌ ＤＧ，Ｈａｙｎｅｓ ＣＡ，Ｆｉｎｌａｙ ＢＢ，Ｓｔｒｙｎａｄｋａ ＮＣ．（２０００）Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎｔｉｍｉｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ．４０５：１０７３−７）。ＥａｅＡは、タンパク質を外膜にアンカリングする約５００アミノ酸のＮ末端セグメントからなり、転位を促進するポリン様構造を有する逆平行βバレルを形成すると考えられる（Ｔｏｕｚｅ Ｔ，Ｈａｙｗａｒｄ ＲＤ，Ｅｓｗａｒａｎ Ｊ，Ｌｅｏｎｇ ＪＭ，Ｋｏｒｏｎａｋｉｓ Ｖ．（２００４）Ｓｅｌｆ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＥＰＥＣ ｉｎｔｉｍｉｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｂｅｔａ−ｂａｒｒｅｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎｃｈｏｒ ｄｏｍａｉｎ：ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｉｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：７３−８７）。この転位ドメインの後には、一連のＩｇ様モチーフと、腸上皮表面への結合に寄与するＣ末端Ｃ型レクチンドメインとが続く（図６）。インチミンの細長い構造と、異種タンパク質ドメインを大腸菌外膜の外面に輸出してアンカリングするその能力は、それが、多様化されたα３タンパク質の表面ディスプレイのための理想的かつ用途の広い融合パートナーであることを示唆している（Ｗｅｎｔｚｅｌ Ａ，Ｃｈｒｉｓｔｍａｎｎ Ａ，Ａｄａｍｓ Ｔ，Ｋｏｌｍａｒ Ｈ．（２００１）．Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｂｙ ｔｈｅ ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ ｉｎｔｉｍｉｎ ＥａｅＡ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：７２７３−８４；ＡｄａｍｓＴＭ，Ａ Ｗｅｎｔｚｅｌ，ａｎｄ Ｈ Ｋｏｌｍａｒ（２００５）Ｉｎｔｉｍｉｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｅｘｐｏｒｔ ｏｆ Ｐａｓｓｅｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ａ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊ．ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８７：５２２−５３３）。

【0044】

ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢの天然の配向では、Ｃ末端が細胞膜にアンカリングされる（Ｉ型膜タンパク質）。α３ドメインは、Ｎ末端のα１−α２プラットフォームと細胞膜との間に存在する。しかしながら、これらのα３ドメインのループをα１−α２プラットフォームから離れて突出するように多様化するために、反対の配向（例えば、ＩＩ型膜タンパク質）が所望される、すなわち、配列番号１〜１３のアミノ酸位置１９０〜１９９、２２１〜２２８、２５０〜２５８に位置するループ等のループが標的分子の結合に容易に利用可能となるように、Ｎ末端で図１のα３ドメインのリンカー部分をＥａｅＡに付着させる。そのようなＩＩ型膜タンパク質の配向は、正に図６のＥａｅＡの配向である。さらに、α３ドメインは、ＥａｅＡと同様にＩｇ様モチーフを有するため、ＥａｅＡはα３ドメインを大腸菌表面に転位させる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｈｏｍｏｌｏｇ ＭＩＣＡ， ａ γδΤ ｃｅｌｌ ｌｉｇａｎｄ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：５７７−５８４）。実際、ＥａｅＡが異種パッセンジャーポリペプチドを転位させる能力は文献に記述されている（Ｗｅｎｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．２００１；Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ，２００５）。

【0045】

ＥａｅＡ−α３融合タンパク質は、ａｒａＢＡＤプロモーター（Ｐ_ｂａｄ）から発現され、増殖培地に加えられたアラビノースの濃度に用量依存性の様式で応答する。これにより、細菌細胞の表面上でα３ドメインの密度を正確に制御することができる。多様化システム、例えば、レジオネラ・ニューモフィラａｔｄ ＴＲ ｒｔ配列（ｐＤＧＲ、図２）は、マルチコピープラスミド上で厳重に制御されたｔｅｔＡプロモーター／オペレーターの制御下に置くことができる。ａｔｄ ＴＲ ｒｔ配列の発現は、増殖培地にアンヒドロテトラサイクリンを添加することによって誘発され、α３ ＶＲ配列の高頻度な多様化をもたらす。一旦、多様化が達成されると、増殖培地から誘発物質を除去することによりシステム（α３−ＶＲ）が安定状態に「ロック」される。

【0046】

多様化は、α３−ＶＲの多様化を誘発するために、ＥａｅＡ−α３融合タンパク質およびアンヒドロテトラサイクリンの発現を誘導するようにアラビノースの存在下で表面ディスプレイ大腸菌を増殖することによって最初に達成される。該当する結合特性を示す細菌細胞は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）または磁気ビーズ分離法等の標準的な方法を使用して濃縮することができる。選択された細菌細胞は、アラビノースの存在下およびアンヒドロテトラサイクリンの非存在下で成長させることによって増幅される。さらなる濃縮ステップが含まれてもよく、単純にプロトコルを繰り返すことによって追加ラウンドの最適化を達成することができる。重要なのは、ＮＫ細胞またはＴ細胞の攻撃のために望ましくない標的に結合するα３ドメインは、所望の結合特性の選択前に、例えば正常な組織に対してパニングすることによって、多様化ライブラリーから枯渇させることができるということである。選択されたα３タンパク質は、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａプロテアーゼの添加によって細菌細胞の表面から切断することができ、次いで、さらなる特徴付けおよび使用のために６ｘＨｉｓタグ化Ｃ末端ドメインの親和性精製によって精製される。これにより、選択されたα３ドメインの構造および機能に関する簡便な生化学的または物理的分析が可能となる。所望の非天然α３ドメインをコードする単離されたＤＮＡを、α１−α２プラットフォームドメインをコードするＭＩＣ遺伝子の一部に融合することにより、いずれの場合においても、リンカーまたはテザー（アミノ酸１７７−１８２）を介して所望の非天然α３ドメインを残りの可溶性ＭＩＣタンパク質に再導入し、単離されたα３ドメインの特異性および感受性を有する所望の受動的ＮＫ細胞ワクチンを作製することができる。

【0047】

選択された遺伝子型は、細菌、酵母、昆虫、または哺乳類細胞において非天然または非自然の、可溶性の同族ＭＩＣタンパク質を生成および単離するために使用することができる。生成されたＭＩＣＡは、要求される程度まで精製され、インビトロおよびインビボで安定化するための利用可能な方法によって製剤化され、ヒトまたは他の哺乳動物に非経口的にまたは他の経路によって投与されることができ、そこで、先天性免疫系の細胞構成要素による標的攻撃を促進することにより、悪性腫瘍またはウイルス性疾患を治療するために拡散することができる。

【0048】

いくつかの実施形態において、非天然ＭＩＣ分子は、「薬学的に許容される」賦形剤または担体とともに製剤化される。そのような構成要素は、過度の有害な副作用なくヒトまたは動物に使用するために好適な構成要素である。有害な副作用の非限定的な例は、毒性、刺激、および／またはアレルギー反応を含む。賦形剤または担体は、通常、妥当な利益／リスク比に見合ったものである。多くの実施形態において、担体または賦形剤は、局所または全身投与に好適である。非限定的な薬学的な担体は、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルションを含む。その例は、限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルション等のエマルション、および種々の種類の湿潤剤等の標準的な薬学的賦形剤を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、およびオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。水性担体は、食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、エマルション、または懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル、またはおよび固定油を含む。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補充剤、電解質補充剤（リンゲルデキストロースなどに基づくもの等）を含む。

【0049】

任意選択的に、本開示の非天然ＭＩＣ分子を含む組成物は、当該技術分野で周知の手段を使用して凍結乾燥または噴霧されてもよい。その後の再構成および使用は、当該技術分野で既知であるように実践することができる。

【0050】

経口的および局所的使用に好適な薬学的グレードの有機または無機担体および／または希釈剤が、治療的に活性な化合物を含む組成物を作製するために使用されてもよい。安定化剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、または適切なｐＨ値を確保するための緩衝液が含まれてもよい。

【0051】

非天然ＭＩＣ分子は、通常、「安全かつ有効な」量または濃度で使用され、それは、上述のような過度の有害な副作用なく所望の治療応答をもたらすのに十分な量を意味する。非天然ＭＩＣ分子は、そのインビボでの薬物動態特性を変化させるために生化学的に修飾されてもよい。循環タンパク質分子の半減期を増加させるための周知の方法は、ＭＩＣタンパク質の結合機能に影響を及ぼすことなく、基本構造にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を化学的に付着すること、または、遺伝子操作により、グリシンおよびセリン等の天然アミノ酸のポリマーをＮ末端、Ｃ末端、または内部（配列番号１〜１３のアミノ酸１７９〜１８２のα１−α２とα３ドメインとの間のテザー内等）に付加することである。非天然ＭＩＣ分子は、「治療的に有効な」量または濃度で使用されてもよく、それは、所望の治療応答を生じさせるための量を指し、例えば、限定されないが、標的細胞を死滅させるのに十分なＮＫ細胞またはＴ細胞を動員するために標的細胞に結合するために効果的な量である。安全かつ有効な量または治療的に有効な量は、種々の要因に伴って変化するが、過度の実験を行うことなく、熟練した医師によって容易に決定され得る。要因の非限定的な例は、治療される具体的な状態、対象の物理的状態、治療される対象の種類、治療の期間、（ある場合は）併用療法の性質、および用いられる特定の製剤を含む。

【0052】

「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、または「〜によって特徴付けられる」と交換可能に使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、包括的または開放型言語であり、追加の列挙されていない要素または方法ステップを除外しない。「〜からなる」という句は、特許請求の範囲に規定されていないあらゆる要素、ステップ、または成分を除外する。「〜から本質的になる」という句は、特許請求の範囲の範囲を、規定される材料またはステップ、および請求される発明の基盤および新規特徴に大きな影響を及ぼすことのないものに限定する。本発明の開示は、これらの句の各々の範囲に対応する本発明の実施形態、組成物、および方法を企図する。よって、列挙される要素またはステップを含む組成物または方法は、組成物または方法が、これらの要素またはステップから本質的になるかまたはなる具体的な実施形態を企図する。

【0053】

本明細書に列挙される全ての参考文献は、以前に明示的に組み込まれているかまはいないかにかかわらず、参照によって、それらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ａｎｙ」という用語は、各々、単数形および複数形の両方を含むことを意図する。

【0054】

本発明について十分に説明してきたが、当業者は、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく、また過度な実験を行うことなく、様々な同等のパラメータ、濃度、および条件においてそれを実施することができることを理解するであろう。本発明は、その特定の実施形態に関連して説明されてきたが、さらなる変更が可能であることを理解されたい。本出願は、一般に本発明の原理に従い、また本発明が関連する技術における既知のまたは一般的な慣行に属するような、本発明の開示からのそのような逸脱を含む、本発明のいかなる変形、使用、または改作も包含することを意図し、上文に記載される本質的な特徴に適用されてもよい。

【実施例】

【0055】

本明細書において提供される場合、所望の表現型をコードするＤＮＡを単離するために選択、スクリーニング、またはパニングを可能にするために、どちらも当業者に周知である２つの技術を使用して、ＭＩＣＡのα３ドメインの遺伝子型をその（結合）表現型に物理的に付着した。第１の技術は、α３ドメインをコードするＤＮＡを内部に持つ細菌の表面にα３ドメインが表示される、細菌表面ディスプレイである。第２の技術は、コードするＤＮＡ、遺伝子型がファージゲノム内にある、キメラファージのカプシドタンパク質としてのα３ドメインのバクテリオファージディスプレイである。表示されたα３ドメインの表現型を反映する結合表現型を有する可溶性の修飾されたヒトＭＩＣＡ分子を作製するためにα３ドメインの遺伝子型を使用する能力も、本明細書において証明される。

【0056】

１．大腸菌の表面上におけるＭＩＣ−α３ドメインタンパク質の表示
端的に述べると、α３ドメインをコードするＤＮＡを大腸菌ｅａｅＡ（インチミン）遺伝子の一部に融合し、その結果得られた融合タンパク質を、α３ドメインが細菌表面に遠位であるそのＣ末端部分と方向を合わせるような様式で、大腸菌の表面上で発現させた。

【0057】

オリゴヌクレオチドのＡＶ１４０１（配列番号１５）およびＡＶ１４０２（配列番号１６）をキナーゼ化し、アニーリングし、ＮｄｅＩおよびＮｃｏＩで消化したプラスミドｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のアリコートに連結して、ｐｅｌＢ分泌シグナル配列を含むｐＳＷ２４９を作製した。

【0058】

プラスミドｐＳＷ２４９をＮｃｏＩおよびＢｌｐＩで消化し、キナーゼ化およびアニーリングしたオリゴヌクレオチドＡＶ１４４５（配列番号１７）およびＡＶ１４４６（配列番号１８）に連結してｐＳＷ２６３を作製した。この構築物は、ｐｅｌＢ配列の次の６つのヒスチジン残基（配列番号１２７）をコードする配列を含んでいた。

【0059】

５’非翻訳配列の一部、シグナル配列、および成熟コード配列のコドン１〜２７６、続いて停止コドンを含むヒトＭＩＣＡのｃＤＮＡを、プライマーＡＶ１４６６（配列番号１９）およびＡＶ１４４８（配列番号２０）を使用して、ヒト脾臓一本鎖ｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより調達）からＰＣＲにより増幅した。

【0060】

ＰＣＲ断片をＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じくＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＣＤＮＡ５−ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結してｐＳＷ２６５を作製した。定方向突然変異誘発により３つの突然変異Ｇ１４Ｗ、Ａ２４Ｔ、およびＥ１２５ＫのＭＩＣＡコード化領域を修正してｐＳＷ２７１を作製した。

【0061】

プライマーＡＶ１４４７（配列番号２１）およびＡＶ１４４８（配列番号２０）を用いてｐＳＷ２７１の一部をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片は、ｔｅｖプロテアーゼ切断部位ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号１２８）、続いてヒトＭＩＣＡのコドン１〜２７６からなっていた。このＰＣＲ断片をＸｈｏＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じくＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＳＷ２６３のアリコートに連結してプラスミドｐＳＷ２８６を作製した。

【0062】

ＡＶ１４０８（配列番号２２）およびＡＶ１４０９（配列番号２３）プライマーを使用して大腸菌ＥＤＬ９３３ゲノムＤＮＡからｅａｅＡ遺伝子を増幅した。

【0063】

このＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じくＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ＋ＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結してｐＳＷ２８４を作製した。

【0064】

プライマーＡＶ１６０２（配列番号２４）およびＡＶ１６０３（配列番号２５）を使用してプラスミドｐＳＷ２８４の一部をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、同じくＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＳＷ２８６のアリコートに連結してＳＷ２８９を作製した。

【0065】

プライマーｋｋ４３（配列番号２６）およびｋｋ４４（配列番号２７）を用いてｐＳＷ２８９の一部をＰＣＲ増幅した。その結果得られた、ｔｅｖプロテアーゼ切断部位ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号１２８）、続いてＭＩＣＡの残基１８１〜２７６をコードする配列（注：連続する６Ｃ’ｓを分割するために、ＰＩ８３のコドンをＣＣＣからＣＣＡに変更した）を含むＰＣＲ断片をＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＳＷ２８９の別のアリコートの消化物からアガロースゲル上で精製された約７１８５ｂｐの断片に連結してｐＫＫ５を作製した。７１８５ｂｐの断片で、ＥａｅＡ１〜６５９、その後にＧＧ、次いでＦａｃｔｏｒ Ｘａによる切断部位ＩＥＧＲ（配列番号１２９）、６つのＨｉｓ残基（配列番号１２７）、次いで、ＸｈｏＩ部位を提供することの他は機能のないＬＥをコードするＸｈｏＩ部位をコードした。

【0066】

プライマーｋｋ５２（配列番号２８）およびｋｋ４５（配列番号２９）を用いてｐＫＫ５をＰＣＲ増幅した。ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでＰＣＲ断片を消化し、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＢＡＤ２４（ＡＴＣＣから）のアリコートに連結してｐＫＫ２９を作製した。製造業者の推奨に従って、クローン株である大腸菌「ＮＥＢ １０−β」（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓカタログ番号ＡＶ Ｃ３０１９Ｈ）にプラスミドｐＫＫ２９を形質転換し、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンに対する耐性のために選択した。

【0067】

ｐＫＫ２９で形質転換した大腸菌細胞のアラビノース誘導型および非誘導型の細胞質タンパク質、内膜タンパク質、および外膜タンパク質を各々単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをクマシーブルーで染色するか、またはヒトＭＩＣＡタンパク質に対すル抗体を用いてウエスタンブロットした。

【0068】

ＯＤ_６００が０．９１５に等しくなるまでＬＢ／Ｃａｒｂ１００中で細胞を増殖させた。１０ｍｌの細胞のアリコートを２本の５０ｍｌ円錐管の各々に加えた。一方の管は０．００２％アラビノースで誘導し、他方は誘導しないままにした。３７℃で１時間振盪しながらサンプルをインキュベートした。

【0069】

Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８１０Ｒ卓上型遠心機にて１０分間４０００ｒｐｍで細胞を遠心分離した。上清を廃棄し、６ｍｌのＦＰ緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１Ｍ ＫＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル）中に細胞ペレットを緩やかに再懸濁し、１５ｍｌ円錐管に移した。Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃの３００Ｖ／Ｔモデル超音波ホモジナイザーを使用して、６×１５秒のバーストで細胞を超音波処理した。バースト間に氷上でサンプルをインキュベートした。超音波処理後、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８１０Ｒ卓上型遠心機にて管を５分間４０００ｒｐｍで遠心分離にかけ、破損した細胞を全て除去した。

【0070】

上清をＢｅｃｋｍａｎポリカーボネート遠心管（カタログ番号ＡＶ３５５６３１）に移し、Ｔｙｐｅ ６０Ｔｉローターを使用して、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｌ８−８０Ｍ床置き型超遠心機にて１００，０００Ｘｇで１時間４℃で回転させた。細胞質タンパク質を含む上清を新しい管に移し、４℃で保存した。

【0071】

２ｍｌのＭＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中に細胞膜のペレットを再懸濁した。サンプルを２時間２５℃で緩やかに振盪し、次いで、Ｔｙｐｅ ６０Ｔｉローターを使用して、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｌ８−８０Ｍ床置き型超遠心機にて１００，０００Ｘｇで３０分間４℃で再度遠心分離した。細胞膜のＴｒｉｔｏｎ可溶性タンパク質を含む上清を新しい管に移し、４℃で保存した。外膜タンパク質を含む最終的なペレット（Ｓｃｈｎａｉｔｍａｎ，ＣＡ．１９７１．Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｂｙ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １０８：５４５−５５２）を０．１ｍｌの水に再懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析に供する前に同じく４℃で保存し、クマシーブルーで染色するか、またはヒトＭＩＣＡに対するヤギポリクローナル抗体を使用してウエスタンブロットした（図２）。

【0072】

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、サンプルを等量のＮｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳ ２Ｘサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＶＬＣ２６７６）と混合し、４〜２０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＶＥＣ６０２８５ＢＯＸ）上で電気泳動した。ウエスタンブロット法では、スラブゲル中で電気泳動したサンプルのレーンをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＸＣｅｌｌ ＩＩ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅ（ＡＶＥＩ９０５１）を使用してニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐａｐｅｒ Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＡＶＬＣ２００１）に移した。５％牛乳−リン酸緩衝生理食塩水、Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）中、４℃で膜フィルターを一晩ブロックした。一次抗体（抗ヒトＭＩＣＡ抗体−Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＶＡＦ１３００）を、５％牛乳−ＰＢＳＴ中、１：５００の希釈率で使用した。その結果得られたフィルターの「ブロット」を緩やかに振動させながら２時間２５℃でインキュベートした。続いて、フィルターの「ブロット」をＰＢＳＴで２０分間２５℃で洗浄し、その後、５％牛乳−ＰＢＳＴ中、１：１０００の希釈率で二次抗体（抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体−Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＶＨＡＦ０１７）を加えた。フィルターの「ブロット」を２時間２５℃で振動させ、次いで、再びＰＢＳＴで２０分間洗浄した。Ｎｏｖｅｘ ＨＲＰ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ＴＭＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＶＷＰ２０００４）を用いてフィルターの「ブロット」を展開した。

【0073】

独立した方法によりα３ドメインの細菌表面ディスプレイを確認するために、インタクトな、アラビノース誘導型および非誘導型大腸菌の蛍光顕微鏡法により、誘導型培養由来のインタクトな細菌の表面にのみ、ＭＩＣＡのα３の染色を確認した。

【0074】

２．内部標的ドメインを有する可溶性の非天然ヒトＭＩＣタンパク質の生成
ヒトＭＩＣＡは天然にグリコシル化されているが、その非グリコシル化形態は、その受容体であるＮＫＧ２Ｄにインビトロで結合する（Ｌｉ ｅｔ ａｌ，２００１）。しかしながら、インビトロで、そして最終的にはインビボでヒト様グリコシル化形態を評価できるように、我々は、培養したヒト細胞においてＭＩＣＡを発現させた。発現のために、ヒトＣＭＶプロモーターおよびウシ成長ホルモン（ｂｇｈ）ポリアデニル化シグナルを有する一過性発現ベクターｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴに、２つの一般的なヒト対立遺伝子を挿入した（図３）。

【0075】

機能的なプラスミド構築物
プライマーＡＶ１４６６（配列番号３０）およびＡＶ１４４８（配列番号３１）を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりヒト脾臓一本鎖ｃＤＮＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手可能）から適切なＤＮＡ配列を増幅することによって、成熟ＨＵＭＭＨＣＲＥＰ（ヒトＭＨＣクラスＩ関連タンパク質ｍＲＮＡ）の分泌シグナル配列およびコドン１〜２７６を得た。

【0076】

増幅ＤＮＡ産物をＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化し、得られた産物をＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＣＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結してｐＳＷ２６５を作製した。

【0077】

ｐＳＷ２６５の挿入されたＰＣＲ産物のＤＮＡを配列決定し、ＮｈｅＩ部位の後にｂ５’非翻訳（ＵＴ）配列の２６塩基、その後に成熟ＨＵＭＭＨＣＲＥＰの分泌シグナル配列およびコドン１〜２７６、その後に終止コドン、その後にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むことを確認した。コード化配列が、翻訳された場合にアミノ酸の違いを生じるように意図する配列から逸脱した場合、アミノ酸配列が、配列番号１３のように記載される配列の関連部分（アミノ酸１〜２７６）と一致するように、部位特異的突然変異誘発によりコドンを変更した（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キットおよび適切なプライマーを使用）。

【0078】

修正されたプラスミドはｐＳＷ２７１と称され、５’ＵＴ配列の２６塩基をコードする修正されたＤＮＡ配列、その後に成熟ＨＵＭＭＨＣＲＥＰの分泌シグナル配列およびコドン１−２７６、その後に終止コドン、配列番号１４を含んでいた。

【0079】

プライマーＡＶ１４９０（配列番号３２）およびＡＶ１４８９（配列番号３３）ならびにｐＳＷ２７１を使用してＰＣＲ産物を生成し、続いてＢａｍＨＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ｐＳＷ２７１の約５２５９ｂｐのＢａｍＨＩ／ＢｓｍＢＩ断片に連結した。その結果得られた構築物ｐＳＷ２７５は、ＢｓｍＢＩ部位を欠損している。

【0080】

Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）の部位特異的突然変異誘発キットならびにプライマーＡＶ１４９３（配列番号３４）およびＡＶ１４９４（配列番号３５）を使用して、２つのＢｓｍＢＩ部位をｐＳＷ２７５のＭＩＣＡコード化領域に挿入してｐＳＷ２７６を作製した。

【0081】

ＭＩＣＡコドン１２５がＡＡＧ（Ｌｙｓ）の代わりにＧＡＧ （Ｇｌｕ）であることを除いて、プラスミドｐＳＷ２６７はｐＳＷ２７１と同じである。これは、部位特異的突然変異誘発によりｐＳＷ２６５から得た（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ ＰｈｕｓｉｏｎキットをプライマーＡＶ１４７８（配列番号３９）およびＡＶ１４７９（配列番号４０とともに使用）。この突然変異誘発により、ＧＧＧ（Ｇｌｙ）〜ＴＧＧ（Ｔｒｐ）のＭＩＣＡコドン１４およびＧＣＴ（Ａｌａ）〜ＡＣＴ （Ｔｈｒ）のコドン２４を変更した。

【0082】

プライマーＡＶ１４８６（配列番号４１）およびＡＶ１４８７（配列番号４２）を使用して、部位特異的突然変異誘発によりｐＳＷ２６７からプラスミドｐＳＷ２７３を作製した。ｐＳＷ２７３は、シグナルペプチドと成熟ペプチドの残基１との間に６つのヒスチジンコドンを含む。

【0083】

部分的ｈｐｈ（ハイグロマイシン耐性）遺伝子からＢｓｍＢＩ部位が欠失されていることを除いて、プラスミドｐＫＫ３３はプラスミドｐＳＷ２７３と同一である。プライマーＡＶ１４９０（配列番号３２）および１４８９（配列番号３３）を用いて増幅することによりプラスミドｐＳＷ２７３からＰＣＲ断片を得た。この約７２７ｂｐの断片をＢａｍＨＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ｐＳＷ２７３の約５２７７ｂｐのＢａｍＨＩ／ＢｓｍＢＩ消化断片に連結した。これにより、ＢｓｍＢＩ部位が除去され、ｐＫＫ３４が作製された。

【0084】

次に、ＭＩＣＡのα３ドメインのループ１に結合配列を挿入するためのｐＫＫ３４に由来する構築物について説明する。

【0085】

以下のループ１の構築物は、ＭＩＣＡのＴ１８９とＶ２００との間に指定された異種ペプチド「インサート」を挿入し、位置１９０〜１９９の残基を指定されたインサートで置換することによって生成した。

【0086】

ＭＩＣＡのＴ１８９とＶ２００との間に挿入されたＳＲＧＤＨＰＲＴＱ（配列番号４３、ループ３．１と称される）をコードする配列を有するｐＫＫ３６を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８３０（上の鎖）（配列番号４４）およびＡＶ１８３１（下の鎖）（配列番号４５）をＢｓｍＢＩで消化したｐＫＫ３４に連結した。

【0087】

ＭＩＣＡのＴ１８９とＶ２００との間に挿入されたＲＴＳＲＧＤＨＰＲＴＱ（配列番号４６、ループ３．２と称される）をコードする配列を有するｐＫＫ３７を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８３２（上の鎖）（配列番号４７）およびＡＶ１８３３（下の鎖）（配列番号４８）をＢｓｍＢＩで消化したｐＫＫ３４に連結した。

【0088】

ＭＩＣＡのＴ１８９とＶ２００との間に挿入されたＲＶＰＲＧＤＳＤＬＴ（配列番号４９、ループ３．３と称される）をコードする配列を有するｐＫＫ３８を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８３４（上の鎖）（配列番号５０）およびＡＶ１８３５（下の鎖）（配列番号５１）をＢｓｍＢＩで消化したｐＫＫ３４に連結した。

【0089】

ＭＩＣＡのＴ１８９とＶ２００との間に挿入されたＲＳＡＲＧＤＳＤＨＲ（配列番号５２、ループ３．４と称される）をコードする配列を有するｐＫＫ３９を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８３６（上の鎖）（配列番号５３）およびＡＶ１８３７（下の鎖）（配列番号５４）をＢｓｍＢＩで消化したｐＫＫ３４に連結した。

【0090】

ＭＩＣＡのＴ１８９とＶ２００との間に挿入されたＶＴＲＧＤＴＦＴＱＳ（配列番号５５、ループ５．１と称される）をコードする配列を有するｐＫＫ４０を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８３８（上の鎖）（配列番号５６）およびＡＶ１８３９（下の鎖）（配列番号５７）をＢｓｍＢＩで消化したｐＫＫ３４に連結した。

【0091】

ＭＩＣＡのＴ１８９とＶ２００との間に挿入されたＲＧＤＴＦＴＱＳ（配列番号５８、ループ５．２と称される）をコードする配列を有するｐＫＫ４１を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８４０（上の鎖）（配列番号５９）およびＡＶ１８４１（下の鎖）（配列番号６０）をＢｓｍＢＩで消化したｐＫＫ３４に連結した。

【0092】

ＭＩＣＡのＴ１８９とＶ２００との間に挿入されたＨＬＡＲＧＤＤＬＴＹ（配列番号６１、ループ５．３と称される）をコードする配列を有するｐＫＫ４２を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８４２（上の鎖）（配列番号６２）およびＡＶ１８４３（下の鎖）（配列番号６３）をＢｓｍＢＩで消化したｐＫＫ３４に連結した。

【0093】

ＭＩＣＡのＴ１８９とＶ２００との間に挿入されたＳＧＧＳＧＧＧＳＴＳＲＧＤＨＰＲＴＱＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号６４、伸長ループ３．２ｓｐと称される）をコードする配列を有するｐＫＫ４４を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８５４（上の鎖）（配列番号６５）およびＡＶ１８５５（下の鎖）（配列番号６６）をＢｓｍＢＩで消化したｐＫＫ３４に連結した。

【0094】

ＭＩＣＡのＴ１８９とＶ２００との間に挿入されたＳＧＧＳＧＧＧＳＲＶＰＲＧＤＳＤＬＴＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号６７、伸長ループ３．３ｓｐと称される）をコードする配列を有するｐＫＫ４５を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８５６（上の鎖）（配列番号６８）およびＡＶ１８５７（下の鎖）（配列番号６９）をＢｓｍＢＩで消化したｐＫＫ３４に連結した。

【0095】

ＭＩＣＡのＴ１８９とＶ２００との間に挿入されたＳＧＧＳＧＧＧＳＶＴＲＧＤＴＦＴＱＳＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号７０、伸長ループ５．１ｓｐと称される）をコードする配列を有するｐＫＫ４６を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８５８（上の鎖）（配列番号７１）およびＡＶ１８５９（下の鎖）（配列番号７２）をＢｓｍＢＩで消化したｐＫＫ３４に連結した。

【0096】

ＭＩＣＡのＴ１８９とＶ２００との間に挿入されたＳＧＧＳＧＧＧＳＨＬＡＲＧＤＤＬＴＹＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号７３、伸長ループ５．３ｓｐと称される）をコードする配列を有するｐＫＫ４７を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８６０（上の鎖）（配列番号７４）およびＡＶ１８６１（下の鎖）（配列番号７５）をＢｓｍＢＩで消化したｐＫＫ３４に連結した。

【0097】

次に、ループ３に結合配列を挿入するための構築物について説明する。

【0098】

以下のループ３の構築物は、ＭＩＣＡ残基イソロイシン２４９とシステイン２５９との間に指定された異種ペプチド「インサート」を挿入し、位置２５０〜２５８の残基を指定されたインサートで置換することによって生成した。

【0099】

プラスミドｐＳＷ２７６をＢｓｍＢＩで消化し、キナーゼ化およびアニーリングしたオリゴヌクレオチドＡＶ１８２６（配列番号３６）およびＡＶ１８２７（配列番号３７）に連結してｐＫＫ３５を作製した。このプラスミドは、ＭＩＣＡ残基イソロイシン２４９とシステイン２５９との間のＳＧＧＳＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号３８）をコードし、位置２５０〜２５８の残基を置換する配列を含んでいた。

【0100】

ＳＧＧＳＧＧＧＳＴＳＲＧＤＨＰＲＴＱＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号７６、伸長ループ３．２ｓｐと称される）をコードする配列を有するｐＫＫ４８を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８６４（上の鎖）（配列番号７７）およびＡＶ１８６５（下の鎖）（配列番号７８）をＢｓｍＢＩで消化したｐＳＷ２７６に連結した。

【0101】

ＭＩＣＡのＩ２４９とＣ２５９との間に挿入されたＳＧＧＳＧＧＧＳＲＶＰＲＧＤＳＤＬＴＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号７９、伸長ループ３．３ｓｐと称される）をコードする配列を有するｐＫＫ４９を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８６６（上の鎖）（配列番号８０）およびＡＶ１８６７（下の鎖）（配列番号８１）をＢｓｍＢＩで消化したｐＳＷ２７６に連結した。

【0102】

ＭＩＣＡのＩ２４９とＣ２５９との間に挿入されたＳＧＧＳＧＧＧＳＶＴＲＧＤＴＦＴＱＳＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号８２、伸長ループ５．１ｓｐと称される）をコードする配列を有するｐＫＫ５０を作製するために、

【0103】

リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８６８（上の鎖）配列番号８３）およびＡＶ１８６９（下の鎖）（配列番号８４）をＢｓｍＢＩで消化したｐＳＷ２７６に連結した。

【0104】

ＭＩＣＡのＩ２４９とＣ２５９との間に挿入されたＳＧＧＳＧＧＧＳＨＬＡＲＧＤＤＬＴＹＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号８５、伸長ループ５．３ｓｐと称される）をコードする配列を有するｐＫＫ５１を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８７０（上の鎖）（配列番号８６）およびＡＶ１８７１（下の鎖）（配列番号８７）をＢｓｍＢＩで消化したｐＳＷ２７６に挿入した。

【0105】

次に、「緊密な」ループ１に結合配列を挿入するための構築物について説明する。

【0106】

以下の「緊密な」（Ｔ）ループ１の構築物は、ＭＩＣＡのＮ１８７とＣ２０２の間に指定された異種ペプチドの「インサート」を挿入することによって生成した、すなわち、ＭＩＣＡの残基１８８〜２０１を指定されたインサートで置換した。

【0107】

プラスミドｐＫＫ３４をプライマーＡＶ１８７３（配列番号８８）およびＡＶ１８７２（配列番号８９）で変異誘発し、ＭＩＣＡのＮ１８７とＣ２０２との間のインサートをクローン化するために好適である都合のよいＢｓｍＢＩ部位を含むｐＳＷ３２４を作製した。

【0108】

ＭＩＣＡのＮ１８７とＣ２０２との間に挿入されたＴＳＲＧＤＨＰＲＴＱ（配列番号９０、緊密Ｔ−３．１と称される）をコードする配列を有するｐＫＫ５２を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８７４（上の鎖）（配列番号９１）およびＡＶ１８７５（下の鎖）（配列番号９２）をＢｓｍＢＩで消化したｐＳＷ３２４に連結した。

【0109】

ＭＩＣＡのＮ１８７とＣ２０２との間に挿入されたＧＳＲＧＤＳＬＩＭＨ（配列番号９３、緊密Ｔ−３．５と称される）をコードする配列を有するｐＫＫ５３を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８７６（上の鎖）（配列番号９４）およびＡＶ１８７７（下の鎖）（配列番号９５）をＢｓｍＢＩで消化したｐＳＷ３２４に連結した。

【0110】

ＭＩＣＡのＮ１８７とＣ２０２との間に挿入されたＲＶＰＲＧＤＳＤＬＴ（配列番号９６、緊密Ｔ−３．３と称される）をコードする配列を有するｐＫＫ５４を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８７８（上の鎖）（配列番号９７）およびＡＶ１８７９（下の鎖）（配列番号９８）をＢｓｍＢＩで消化したｐＳＷ３２４に連結した。

【0111】

ＭＩＣＡのＮ１８７とＣ２０２との間に挿入されたＶＴＲＧＤＴＦＴＱＳ（配列番号９９、緊密Ｔ−５．１と称される）をコードする配列を有するｐＫＫ５５を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８８０（上の鎖）（配列番号１００）およびＡＶ１８８１（下の鎖）（配列番号１０１）をＢｓｍＢＩで消化したｐＳＷ３２４に連結した。

【0112】

ＭＩＣＡのＮ１８７とＣ２０２との間に挿入されたＨＬＡＲＧＤＤＬＴＹ（配列番号１０２、緊密Ｔ−５．３と称される）をコードする配列を有するｐＫＫ５６を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８８２（上の鎖）（配列番号１０３）およびＡＶ１８８３（下の鎖Ｘ、配列番号１０４）をＢｓｍＢＩで消化したｐＳＷ３２４に連結した。

【0113】

ＭＩＣＡのＮ１８７とＣ２０２との間に挿入されたＹＱＳＷＲＹＳＱ（配列番号１０５、テンダミスタット由来のループ１、緊密Ｔ−ＡＭＹと称される）をコードする配列を有するｐＫＫ８４を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１９０６（上の鎖）（配列番号１０６）およびＡＶ１９０７（下の鎖）（配列番号１０７）をＢｓｍＢＩで消化したｐＳＷ３２４に連結した。

【0114】

次に、同じ可溶性ＭＩＣＡ分子のループ１およびループ３の両方に結合配列を挿入するための構築物について説明する。

【0115】

ループ１およびループ３の両方に挿入された結合配列を有する可溶性ＭＩＣＡ分子をコードする構築物を作製するために、我々はｐＫＫ１１５を作製した。ベクターｐＫＫ１１５は、ループ１の伸長５．１ｓｐ（配列番号８２）と、他の配列をループ３にクローン化するのに好適である都合のよいＢｓｍＢＩ部位とを含む。ベクターｐＫＫ１１５は、プライマーＡＶ１４９３（配列番号１０８）およびＡＶ１４９４（配列番号１０９）を用いたｐＫＫ４６の部位特異的突然変異誘発によって作製した。

【0116】

ループ１の伸長５．１ｓｐと、ＭＩＣＡのＩ２４９とＣ２５９との間に挿入されたＳＧＧＳＧＧＧＳＴＳＲＧＤＨＰＲＴＱＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号７６）、伸長ループ３．２ｓｐと称される）をコードする配列とを有するｐＫＫ１２８を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８６４（上の鎖）（配列番号７７）およびＡＶ１８６５（下の鎖）（配列番号７８）をＢｓｍＢＩで消化したｐＫＫ１１５に連結した。

【0117】

ループ１の伸長５．１ｓｐと、ＭＩＣＡのＩ２４９とＣ２５９との間に挿入されたＳＧＧＳＧＧＧＳＶＴＲＧＤＴＦＴＱＳＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号８２、伸長ループ５．１ｓｐと称される）をコードする配列とを有するｐＫＫ１２９を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８６８（上の鎖Ｘ、配列番号８３）およびＡＶ１８６９（下の鎖）（配列番号８４）をＢｓｍＢＩで消化したｐＫＫ１１５に連結した。

【0118】

ループ１の伸長５．１ｓｐと、ＭＩＣＡのＩ２４９とＣ２５９との間に挿入されたＳＧＧＳＧＧＧＳＨＬＡＲＧＤＤＬＴＹＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号８５、伸長ループ５．３ｓｐと称される）をコードする配列とを有するｐＫＫ１３０を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１８７０（上の鎖）（配列番号８６）およびＡＶ１８７１（下の鎖）（配列番号８７）をＢｓｍＢＩで消化したｐＫＫ１１５に連結した。

【0119】

ループ１の伸長５．１ｓｐと、ＭＩＣＡのＩ２４９とＣ２５９との間に挿入されたＳＧＧＳＧＧＧＳＶＴＲＧＤＴＦＴＱＳＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号８２）、非相同伸長ループ５．１ｓｐＮＨと称される）をコードする配列とを有するｐＫＫ１３１を作製するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＡＶ１９０８（上の鎖）（配列番号１１０）およびＡＶ１９０９（下の鎖）（配列番号１１１）をＢｓｍＢＩで消化したｐＫＫ１１５に連結した。

【0120】

次に、内部結合インサートを有する可溶性ＭＩＣＡ分子をコードする上述の作製した構築物の培養ヒト細胞発現と、それらの標的結合のＥＬＩＳＡに基づく分析について説明する。

【0121】

プラスミド構築物ｐＫＫ３５−４２、ｐＫＫ４４−５６、およびｐＫＫ１２８−１３１の場合、１０ｃｍ組織培養皿中の培養密度９０％の２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）の培養物に、Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ遺伝子導入試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、１０μｇの各プラスミドＤＮＡを遺伝子導入した。３日後、各培養物の培養培地を回収し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８１０Ｒ卓上型遠心機にて４０００ｒｐｍで遠心分離することにより、浮遊している細胞を除去した。Ｐｉｅｒｃｅ濃縮機の７ｍｌ／９Ｋ（カタログ番号ＡＶ８９８８４Ａ）回転管を使用して、回収された約９．５ｍｌの各サンプルを濃縮した。回転機は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で予め洗浄した。各サンプルを濃縮機に加え、次いで、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８１０Ｒ卓上型遠心機にて３０分間４０００ｒｐｍで遠心分離した。６ｍｌのＰＢＳで各サンプルを３回洗浄し、濃縮した：各回ともＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８１０Ｒ卓上型遠心機にて３０分間４０００ｒｐｍ回転させた。可溶性ＭＩＣＡのためのＥＬＩＳＡによって、得られた各サンプル溶液中の可溶性ＭＩＣＡの濃度を推定した。捕捉剤は、マウス抗ヒトＭＩＣＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ 部品番号８４１６１２）、検出抗体は、ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＵｌｔｒａ ＴＭＢを用いて展開したビオチン化ヤギ抗ヒトＭＩＣＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ 部品番号８４１６１３）であった。

【0122】

意図する標的タンパク質であるインテグリンαＶβ３またはαＶβ５をＥＬＩＳＡプレート上の捕捉剤として使用して、ＥＬＩＳＡより、濃縮した上清の各々において可溶性ＭＩＣＡ分子が標的分子に結合する能力を測定した。それぞれのインテグリンがＥＬＩＳＡプレートのウェルの底に接着した後、ウェルを洗浄し、本分野で周知のようにブロックした。２９３Ｔ細胞によって生成および分泌された可溶性ＭＩＣＡの各サンプル（１００μｌ）を、αＶβ３またはαＶβ５を含むウェルに加え、インキュベートし、洗浄した。Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ基質を用いて展開したヒトＭＩＣＡに対するＨＲＰコンジュゲート抗体により、インテグリンによって捕捉された可溶性ＭＩＣＡ分子を検出し、光学密度を読み取った。ＭＩＣＡ特異的ＥＬＩＳＡにより、各サンプル中の可溶性ＭＩＣＡの量を決定した。結合した可溶性ＭＩＣＡ分子から特異的なインテグリンへのシグナル（全ＭＩＣＡのｎｇ当たり）が示される。非結合陰性対照ＭＩＣＡ（ｐＳＷ２７３によって生成した）からのＥＬＩＳＡシグナルを各インテグリン結合シグナルから差し引いた。対照とともに、ｐＫＫ３５〜４２およびｐＫＫ４４〜５６から生成された単一ペプチドインサートを有するＭＩＣＡ産物の結果を表１に示す。それらの特異的インサートのアミノ酸配列および配列番号を表２に表す。遺伝子操作によってそれらのループのうちの１つのみに挿入された結合ペプチドを有する可溶性ＭＩＣＡ分子は、インテグリン標的に結合する。
表１．可溶性ＭＩＣＡ中の単一インサートからのインテグリン結合ＥＬＩＳＡデータ

【表1】

表２．２９３細胞において発現されたプラスミドとファージプラスミドの相関関係、それらの慣用名、ループ１、ループ３、またはループ１および３の両方に挿入されたアミノ酸配列、ならびに対応するインサートの配列番号

【表2】

【0123】

対照とともに、ｐＫＫ１２８〜１３１から生成された１つより多くのループに挿入された結合ペプチドを有するＭＩＣＡの結果を表３に示す。ｐＫＫ１２８〜１３１から生成された可溶性ＭＩＣＡ分子のインテグリン標的結合についてのＥＬＩＳＡアッセイを以下のように行った。それぞれのインテグリンがＥＬＩＳＡプレートのウェルの底に接着した後、ウェルを洗浄し、ブロックした。培養上清の各サンプル（１００μｌ）をαＶβ３またはαＶβ５を含むウェルに加え、インキュベートし、洗浄した。Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ基質を用いて展開したヒトＭＩＣＡに対するＨＲＰコンジュゲート抗体により、インテグリンによって捕捉された可溶性ＭＩＣＡ分子を検出し、光学密度を読み取った。ＭＩＣＡ特異的ＥＬＩＳＡにより、各サンプル中の可溶性ＭＩＣＡの量を決定した。特異的インテグリンに結合した１つより多くのインサートを有する可溶性ＭＩＣＡ分子のシグナル（全ＭＩＣＡのｎｇ当たり）を表３に示す。それらの特異的インサートのアミノ酸配列および配列番号を表２に表す。１つより多くの内部ループに挿入された結合ペプチドを有するこれらの可溶性ＭＩＣＡ分子は、単一の内部結合ペプチドのみを有する分子よりも高い結合を示し、分子当たり１つより多くの結合モチーフの結合力効果が示唆された。さらに、可溶性ＭＩＣＡ分子がＭＩＣＡ分子当たり１つより多くのαＶβ５特異的な内部結合ぺプチドを有する場合に、可溶性ＭＩＣＡ分子の意図する標的、例えば、αＶβ５への特異性が、密接に関連する標的であるαＶβ３よりも高かった。その標的に対する結合力を示すＭＩＣＡ分子には、そのような結合および結合特異性の増加が期待された。よって、複製結合剤および異なる結合剤の両方である二価のＭＩＣＡ結合剤を作製し、二重特異性ＭＩＣＡ分子およびその標的に対する親和性を超える結合力を有するＭＩＣＡ分子を生成することができた。
表３．可溶性ＭＩＣＡにおける２つのインサートからのインテグリン結合ＥＬＩＳＡデータ

【表3】

【0124】

３．Ｍ１３ファージ上のＭＩＣＡ−α３ドメインタンパク質の表示
所望の標的結合表現型を有する遺伝子操作したＭＩＣＡ分子をコードする新しい遺伝子の単離のためのシステムを開発するために、α３ドメインのアミノ酸１８１〜２７６をコードするＤＮＡをコドン位置１９８でＭ１３ファージ（Ｍ１３ｍｐ１８、Ｓｍｉｔｈベクター型「３３」）のカプシド遺伝子ＩＩＩに融合し（図４）、混合された野生型（ｗｔ）およびα３−ｐＩＩＩキメラカプシドを用い、ヘルパーファージＭ１３ファージを用いずに生成した（Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。大腸菌からＰＥＧ精製したファージ調製物のタンパク質染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、集団における融合タンパク質およびｗｔ ｐＩＩＩタンパク質の両方の存在を確認した（データは示さず）。

【0125】

テンダミスタットは、ＭＩＣＡのα３ドメインの構造に類似した三次元構造を有する細菌タンパク質である（Ｐｆｌｕｇｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。ランダムペプチドをテンダミスタットに挿入し、ヒトインテグリンへの結合のためにＭ１３ファージディスプレイによって選択した（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ ａｎｄ Ｈｏｅｓｓ，１９９５；Ｌｉ ｅｔ ａｌ，２００３）。ＥＬＩＳＡアッセイのための陽性対照として、テンダミスタットをＭ１３のｐＩＩＩに融合した。平行して、ここで、ＭＩＣＡのα３ドメインのループ１または３に挿入された同じデカペプチドのうちのいくつかが、カプシドｐＩＩＩに融合されたα３ドメインを表示するＭ１３ファージを、ＥＬＩＳＡフォーマットにおいてインテグリンに結合するように同様に誘導することができるかどうかを判定した。

【0126】

次に、ループ１、ループ３、またはループ１およびループ３の両方に異なる結合ペプチドを有するＭＩＣＡのα３ドメインを表示するＭ１３ファージの構築、発現、およびアッセイについて説明する。

【0127】

Ｍ１３ファージＭ１３ＫＥ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓから得た）を、プライマーＡＶ１８８７（配列番号１１２）およびＡＶ１８８８（配列番号１１３）を用いたＰＣＲ増幅反応における鋳型として使用した。

【0128】

Ｍ１３ＫＥ遺伝子ＩＩＩのＣ末端部分からなるＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＭ１３ファージベクターＭ１３ｍｐ １８（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ０２５１３）に連結してファージベクターｐＳＷ３２６を作製した。

【0129】

ＥｃｏＲＩおよびＡｖｒＩＩで消化した合成配列ＴＥＮＤ（配列番号１１４）をＥｃｏＲＩ／ＡｖｒＩＩで消化したｐＳＷ３２６に挿入することにより、ファージベクターｐＫＫ５９を作製した。

【0130】

ＥｃｏＲＩおよびＡｖｒＩＩで消化した合成配列ＴＥＮＤ−３Ａ（配列番号 １１５）をＥｃｏＲＩ／ＡｖｒＩＩで消化したｐＳＷ３２６に挿入することにより、ファージベクターｐＫＫ６０を作製した。

【0131】

ＥｃｏＲＩおよびＡｖｒＩＩで消化した合成配列ＴＥＮＤ−３Ｂ（配列番号１１６）をＥｃｏＲＩ／ＡｖｒＩＩで消化したｐＳＷ３２６に挿入することにより、ファージベクターｐＫＫ６１を作製した。

【0132】

ＥｃｏＲＩおよびＡｖｒＩＩで消化した合成配列ＴＥＮＤ−５Ａ（配列番号１１７）をＥｃｏＲＩ／ＡｖｒＩＩで消化したｐＳＷ３２６に挿入することにより、ファージベクターｐＫＫ６３を作製した。

【0133】

ＥｃｏＲＩおよびＡｖｒＩＩで消化した合成配列ＴＥＮＤ−５Ｂ（配列番号１１８）をＥｃｏＲＩ／ＡｖｒＩＩで消化したｐＳＷ３２６に挿入することにより、ファージベクターｐＫＫ６４を作製した。

【0134】

ＥｃｏＲＩおよびＡｖｒＩＩで消化した合成配列ＴＥＮＤ−Ｈｉｓ８（配列番号１１９、Ｈｉｓ８は配列番号１３０）をＥｃｏＲＩ／ＡｖｒＩＩで消化したｐＳＷ３２６に挿入することにより、ファージベクターｐＫＫ６５を作製した。

【0135】

ファージベクターｐＫＫ１０６を作製するために、プライマーＡＶ１８９７（配列番号１２０）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ２９から約３２０ｂｐの断片を増幅した。次いで、野生型ＭＩＣＡのα３配列（配列番号１〜６、１３）を表すこの断片を、ＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0136】

ファージベクターｐＫＫ９１を作製するために、プライマーＡＶ１８９７（配列番号１２０）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ３５から約３５６ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0137】

ファージベクターｐＫＫ９２を作製するために、プライマーＡＶ１８９７（配列番号１２０）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ３６から約３０５ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0138】

ファージベクターｐＫＫ９３を作製するために、プライマーＡＶ１８９７（配列番号１２０）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ３７から約３１１の断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0139】

ファージベクターｐＫＫ９４を作製するために、プライマーＡＶ１８９７（配列番号１２０）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ３８から約３０８ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0140】

ファージベクターｐＫＫ９５を作製するために、プライマーＡＶ１８９７（配列番号１２０）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ３９から約３０８ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0141】

ファージベクターｐＫＫ９６を作製するために、プライマーＡＶ１８９７（配列番号１２０）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ４０から約３０８ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0142】

ファージベクターｐＫＫ９７を作製するために、プライマーＡＶ１８９７（配列番号１２０）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ４１から約３０２ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0143】

ファージベクターｐＫＫ９８を作製するために、プライマーＡＶ１８９７（配列番号１２０）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ４２から約３０８ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0144】

ファージベクターｐＫＫ１００を作製するために、プライマーＡＶ１８９７（配列番号１２０）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ４４から約３５３ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0145】

ファージベクターｐＫＫ１０１を作製するために、プライマーＡＶ１８９７（配列番号１２０）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ４５から約３５３ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0146】

ファージベクターｐＫＫ１０２を作製するために、プライマーＡＶ１８９７（配列番号１２０）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ４６から約３５３ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0147】

ファージベクターｐＫＫ１０３を作製するために、プライマーＡＶ１８９７（配列番号１２０）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ４７から約３５３ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0148】

ファージベクターｐＫＫ１０４を作製するために、プライマーＡＶ１８９７（配列番号１２０）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ４８から約３５６ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0149】

ファージベクターｐＫＫ１０５を作製するために、プライマーＡＶ１８９７（配列番号１２０）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ４９から約３５６ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0150】

ファージベクターｐＫＫ１０７を作製するために、プライマーＫＫ６９（配列番号１２２）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ５２から約３４４ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0151】

ファージベクターｐＫＫ１０８を作製するために、プライマーＫＫ７０（配列番号１２３）およびＡＶ１８９８配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ５３から約２８４ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0152】

ファージベクターｐＫＫ１０９を作製するために、プライマーＫＫ７１（配列番号１２４）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ５４から約２８４ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0153】

ファージベクターｐＫＫ１１０を作製するために、プライマーＫＫ７２（配列番号１２５）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ５５から約２８４ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0154】

ファージベクターｐＫＫ１１１を作製するために、プライマーＫＫ７３（配列番号１２６）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ５６から約２８４ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0155】

ファージベクターｐＫＫ１１２を作製するために、プライマーＡＶ１８９７（配列番号１２０）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ８４から約２７８ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0156】

ファージベクターｐＫＫ１３６を作製するために、プライマーＡＶ１８９７（配列番号１２０）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ１２８から約４１３ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0157】

ファージベクターｐＫＫ１３７を作製するために、プライマーＡＶ１８９７（配列番号１２０）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ１２９から約４１３ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0158】

ファージベクターｐＫＫ１３８を作製するために、プライマーＡＶ１８９７（配列番号１２０）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ１３０から約４１３ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0159】

ファージベクターｐＫＫ１３９を作製するために、プライマーＡＶ１８９７（配列番号１２０）およびＡＶ１８９８（配列番号１２１）を使用して、ＰＣＲによりｐＫＫ１３１から約４１３ｂｐの断片を増幅した。次いで、この断片をＥｃｏＲＩおよびＢｓｍＢＩで消化し、ＭｆｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化した約７９１１ｂｐのｐＫＫ５９の断片に連結した。

【0160】

ＮＥＢαＦ’ｔｅｔ形質転換受容性大腸菌細胞にファージベクターを独立して形質転換した。形質転換細胞によって生成されたファージを滴定し、それらの濃度を１ｍｌ当たり１０^１３に希釈して調製した。意図する標的タンパク質であるインテグリンαＶβ３またはαＶβ５をＥＬＩＳＡプレート上の捕捉剤として使用して、ＥＬＩＳＡによりファージ調製物の各々における可溶性ＭＩＣＡ分子の能力を測定した。それぞれのインテグリンがＥＬＩＳＡプレートのウェルの底に接着した後、ウェルを洗浄し、本分野で周知のようにブロックした。ファージ調製物の各サンプル（１００μｌ）を、αＶβ３またはαＶβ５を含むウェルに加え、インキュベートし、洗浄した。Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ基質を用いて展開したＭ１３ファージコートに対するＨＲＰコンジュゲート抗体により、インテグリンによって捕捉されたファージを検出し、光学密度を読み取った。Ｍ１３ファージの力価は、８Ｘ１０^１２〜１．１Ｘ１０^１３／ｍｌの範囲だった。ｐＫＫ９１〜９８および１００〜１１２から生成された単一ペプチドインサートを有するα３ドメインを表示するファージの結果を表４に示す。それらの特異的インサートのアミノ酸配列および配列番号を表２に表す。遺伝子操作によってそれらのループのうちの１つのみに挿入された結合ペプチドを有するα３ドメインを表示する、ｐＩＩＩカプシドタンパク質に融合されたファージは、インテグリン標的に結合する。
表４．ＭＩＣＡのα３−ＰＩＩＩバクテリオファージディスプレイにおける単一インサートからのインテグリン結合ＥＬＩＳＡデータ

【表4】

【0161】

対照とともに、ｐＫＫ１３６、１３８、および１３９から生成された１つより多くのループに挿入された結合ペプチドを有するα３ドメインを表示するファージの結果を表５に示す。結合ペプチドインサートが１つより多くのループに移植されたα３ドメインを表示するＭ１３ファージのインテグリン標的結合に関するＥＬＩＳＡアッセイを以下のように行った。それぞれのインテグリンがＥＬＩＳＡプレートのウェルの底に接着した後、ウェルを洗浄し、ブロックした。ファージ調製物の各サンプル（１００μｌ）をαＶβ３またはαＶβ５を含むウェルに加え、Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ基質を用いて展開したＭ１３ファージコートに対するＨＲＰコンジュゲート抗体により、インテグリンによって捕捉されたファージを検出し、光学密度を読み取った。Ｍ１３ファージの力価は、８Ｘ１０^１２〜１．１Ｘ１０^１３／ｍｌの範囲だった。ｐＫＫ１３６、１３８、および１３９から生成された１つより多くのペプチドインサートを有するα３ドメインを表示するファージ、ならびにｐＫＫ９３、１０２、もしくは１０３から生成された１つのインサートを有するか、またはインサートを含まない（ｐＫＫ１０６）α３ドメインを表示する対照の結果を示す。それらの特異的インサート（複数可）のアミノ酸配列および配列番号を表２に表す。１つより多くの内部ループに挿入された結合ペプチドを有するこれらのα３ドメインは、単一の内部結合ペプチドのみを有するドメインよりも高いファージの標的結合を伝達し、分子当たり１つより多くの結合モチーフの結合力効果が裏付けられた。さらに、α３ドメインが１つより多くのαＶβ５特異的な内部結合ペプチドを有する場合に、α３ドメインのその意図する標的、例えば、αＶβ５への特異性が、この場合も、密接に関連する標的であるαＶβ３よりも高かった（結合力効果）。
表５．ＭＩＣＡのα３−ＰＩＩＩバクテリオファージディスプレイにおける移植された２つのインサートからのインテグリン結合ＥＬＩＳＡデータ

【表5】

【0162】

４．可溶性の標的ＭＩＣＡは、標的細胞を死滅させるためにＮＫ細胞を動員するための特異的なアダプター分子として作用した。
ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）細胞生存率アッセイを、Ｃｈｒｏｍｙ ｅｔ ａｌ，２０００によって本質的に記載されるように、また、製造業者のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）従って行った。端的に述べると、９６ウェル平底培養プレートに、１ｘ１０^４細胞／ウェルの密度でヒト標的細胞（ＭＣＦ７およびＨｅＬａ）を播種したところ、２日で８０％の培養密度に達した。ｐＫＫ１３１を一過性に遺伝子導入した２９３Ｔ細胞の培養上清を、Ｐｉｅｒｃｅ ９Ｋ ＭＷＣＯ 回転機により約１００倍に濃縮し、ＭＩＣＡ特異的ＥＬＩＳＡによってＭＩＣＡの濃度を決定した。可溶性の標的ＭＩＣＡ分子が標的細胞を死滅させるためにヒトＮＫ細胞を動員する能力を証明するために、標的細胞を含む異なるウェルにおいて、異なる濃度の濃縮した可溶性ＭＩＣＡタンパク質を１６時間インキュベートした。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いてウェルを２回洗浄することにより、非結合タンパク質を除去した。次いで、可溶性ＭＩＣＡに暴露した標的細胞をカルセイン−ＡＭ（２μΜ）を用いて３０分間３７℃で処理し、全ての生存細胞において緑色蛍光を得た。インキュベーション後、再びＰＢＳを用いて細胞を２回洗浄し、次いで、標的細胞に対して１０：１および５：１の比率で生存ＮＫ−９２ＭＩ細胞に暴露した。ＮＫ−９２ＭＩ細胞を標的細胞とともに４時間インキュベートし、次いで、非結合ＮＫ−９２ＭＩ細胞を除去し、ＰＢＳを用いて標的細胞を２回洗浄した。次に、３０分間３７℃でエチジウムホモ二量体（２μΜ）を加え、ＮＫ細胞死滅の程度を判定した。細胞を洗浄し、蛍光プレートリーダー（ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ）上で分析した。ＮＫ細胞の非存在下において、また５：１および１０：１の比率ならびに０，６４ｐｇおよび１２８ｐｇで可溶性の標的ＭＩＣＡを加えたウェルからの赤色（エチジウム）および緑色（カルセイン−ＡＭ）の蛍光シグナルの平均を使用して、生存細胞および死滅細胞を定量した。

【0163】

標的ＭＩＣＡの非存在下において０、５：１、１０：１の比率でＮＫ細胞を加えたところ、（死滅した）ＭＣＦ細胞からの赤色蛍光シグナルは、１２．６±１．１から１２．９±２．９、そして１２．０±１．０へと変化した。６４ｐｇの標的ＭＩＣＡの存在下において、０、５：１、１０：１の比率でＮＫ細胞を加えたところ、（死滅した）ＭＣＦ細胞からの赤色蛍光シグナルは、１９．９±２．４から２７．０±１．０、そして３１．０±１．６へと変化した。標的ＭＩＣＡを１２８ｐｇで加えた場合、５：１、１０：１の比率でＮＫ細胞を加えたところ、（死滅した）ＭＣＦ細胞からの赤色蛍光シグナルは、２５．６±２．２から４１．０±６．７へと変化した。標的ＭＩＣＡの非存在下で、０、５：１、１０：１の比率でＮＫ細胞を加えたところ、同じウェル内の生存細胞からの対応する蛍光（緑色）シグナルは、５６２１±３７２、５５３５±２０５および５７２１±３３５であった。６４ｐｇの標的ＭＩＣＡの存在下において、０、５：１、１０：１の比率でＮＫ細胞を加えたところ、生存ＭＣＦ細胞からの緑色蛍光シグナルは、５０２８±１７７から５１８１±１０２、そして３６９７±５９１へと変化した。標的ＭＩＣＡを１２８ｐｇで加えた場合、５：１、１０：１の比率でＮＫ細胞を加えたところ、生存ＭＣＦ細胞からの緑色蛍光シグナルは、３４５９±３９４から２１９１±３３１へと変化した。

【0164】

徐々に増加する量の標的ＭＩＣＡをウェルに加えたところ、標的インテグリンを発現しないＨｅＬａ細胞からの蛍光シグナルは、ＮＫ−９２ＭＩ細胞による死滅の増加を示唆しなかった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図7-4】

【図7-5】

【図7-6】

【図7-7】

【図7-8】

【図7-9】

【図7-10】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]