特許 6018237 マイクロ流路を備えるチップの製造方法及びそれにより製造されるチップ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6018237

(24)【登録日】2016年10月7日

(45)【発行日】2016年11月2日

(54)【発明の名称】マイクロ流路を備えるチップの製造方法及びそれにより製造されるチップ

(51)【国際特許分類】

   B81C 1/00 20060101AFI20161020BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20161020BHJP

   G01N 35/08 20060101ALI20161020BHJP

   G01N 27/26 20060101ALI20161020BHJP

   B81B 3/00 20060101ALI20161020BHJP

【ＦＩ】

   B81C1/00

   G01N37/00 101

   G01N35/08 A

   G01N27/26 U

   B81B3/00

【請求項の数】18

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2015-22461(P2015-22461)

(22)【出願日】2015年2月6日

(65)【公開番号】特開2015-166127(P2015-166127A)

(43)【公開日】2015年9月24日

【審査請求日】2015年2月6日

(31)【優先権主張番号】特願2014-26816(P2014-26816)

(32)【優先日】2014年2月14日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000141897

【氏名又は名称】アークレイ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000040

【氏名又は名称】特許業務法人池内・佐藤アンドパートナーズ

(72)【発明者】

【氏名】大沼 直嗣

【審査官】 塩治 雅也

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１２−１３２８９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−０８４４６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５２５７６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０２−２６９１３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−１４５２４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／０２９６８４（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｂ８１Ｃ １／００

Ｂ８１Ｂ ３／００

Ｇ０１Ｎ ２７／２６

Ｇ０１Ｎ ３５／０８

Ｇ０１Ｎ ３７／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

マイクロ流路を備えるチップの製造方法であって、
接合する一対の樹脂基板の接合面の両方の表面に、第４級オニウム基を有するカチオン性ポリマーを固定化すること、及び
前記カチオン性ポリマーを固定化した面を接合面として前記樹脂基板を接合することを含む、チップの製造方法。

【請求項2】

マイクロ流路を備えるチップの製造方法であって、
接合する一対の樹脂基板の接合面の両方の表面に、気相又は液相表面処理を行うこと、
前記処理面に、第４級オニウム基を有するカチオン性ポリマー溶液を接触させること、及び
前記接触させた面を接合面として前記樹脂基板を接合することを含む、チップの製造方法。

【請求項3】

前記樹脂基板の接合面の両方の表面に、アニオン性官能基を導入すること、及び
前記アニオン性官能基を導入した面に、前記カチオン性ポリマーの固定化を行うこと、を含む、請求項１記載の製造方法。

【請求項4】

前記アニオン性官能基の導入は、気相又は液相表面処理により行う、請求項３記載の製造方法。

【請求項5】

前記気相表面処理は、真空紫外線処理、プラズマ処理、コロナ放電処理、フレーム処理、及びオゾン処理からなる群から選択される、請求項２又は４に記載の製造方法。

【請求項6】

前記第４級オニウム基は、第４級アンモニウム基及び第４級ホスホニウム基からなる群から選択される、請求項１から５のいずれかに記載の製造方法。

【請求項7】

前記カチオン性ポリマーは、ポリクオタニウム、ジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１から６のいずれかに記載の製造方法。

【請求項8】

前記カチオン性ポリマーは、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、ジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つを含む、請求項１から７のいずれかに記載の製造方法。

【請求項9】

前記カチオン性ポリマーは、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、ジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー又はこれらの組み合わせである、請求項１から７のいずれかに記載の製造方法。

【請求項10】

前記カチオン性ポリマーは、塩化物及び／又は硫化物である、請求項１から９のいずれかに記載の製造方法。

【請求項11】

前記樹脂基板の接合により、マイクロ流路が形成される、請求項１から１０のいずれかに記載の製造方法。

【請求項12】

２枚の樹脂基板が接合してなるチップであって、
前記樹脂基板の少なくとも一方の接合面の凹部によって構成されるマイクロ流路を有し、
前記２枚の樹脂基板は、第４級オニウム基を有するカチオン性ポリマーを介して接合している、チップ。

【請求項13】

前記流路の内壁に、第４級オニウム基を有するカチオン性ポリマーが固定化されている、請求項１２記載のチップ。

【請求項14】

前記カチオン性ポリマーは、ポリクオタニウム、ジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３記載のチップ。

【請求項15】

前記チップは、検体分析用である、請求項１２から１４のいずれかに記載のチップ。

【請求項16】

検体分析用のキットであって、
請求項１２から１５のいずれかに記載のチップと、
分析用の溶液を備えたカートリッジとを含む、キット。

【請求項17】

ヘモグロビンの分析方法であって、
請求項１２から１５のいずれかに記載のチップを用いて試料中の分析対象を測定することを含む、分析方法。

【請求項18】

泳動液を前記チップのマイクロ流路に充填すること、
前記チップのマイクロ流路に、試料を導入すること、及び
前記マイクロ流路の全体又は一部に電圧を印加することを含む、請求項１７記載の分析方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、マイクロ流路を備えるチップの製造方法及びそれにより製造されるチップ
に関する。

【背景技術】

【0002】

キャピラリー電気泳動又はマイクロ流路チップ電気泳動に使用される一般的な材料としては、例えば、ガラスが挙げられる。しかし、ガラスで形成されたキャピラリー又はマイクロ流路チップは、コストの高さ、加工や化学修飾の煩雑さ、さらには慎重な取り扱いを要すること等から、臨床検査の現場においては未だ普及していない。このため、これらの問題を解決するために、樹脂によるマイクロ流路チップの製造が試みられている。マイクロ流路チップは、一般的には、接合面にマイクロ構造が設けられた樹脂部品に対して、別の樹脂部品で蓋をするように接合することで形成される。しかしながら、従来の接着剤や熱融着による接合では、マイクロ構造が埋まったり変形したりする問題がある。

【0003】

特許文献１には、樹脂表面に紫外光を照射し、照射した面同士を昇温圧着する方法（方法１）が記載されている。また、同文献には、樹脂表面に紫外光を照射した後、シランカップリング剤で処理し、処理した面同士を昇温圧着させる方法（方法２）が記載されている。
特許文献２には、マイクロ構造以外の接合面をマスキングしたうえで高分子膜を形成し、その後マスキングを外して接合する方法（方法３）が記載されている。
特許文献３には、予めマイクロ流路を形成した後に、カチオン性官能基を固定化する方法（方法４）が記載されている。
特許文献４には、架橋剤を介した共有結合により樹脂同士を接合し、マイクロ流路表面に架橋剤のカチオン性官能基を露出させる方法（方法５）が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２００８−１９３４８号公報

【特許文献2】特開２００５−２４９５７２号公報

【特許文献3】特開２００９−１４５２４５号公報

【特許文献4】特開２０１２−１３２８９４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、特許文献１〜４に記載の方法１〜５では以下の問題がある。
特許文献１に記載の方法１では、形成されたマイクロ流路の内壁は正電荷を持たない。
特許文献１に記載の方法２では、樹脂が耐えうる温度範囲ではシラノールの脱水縮合反応を短時間で完了することができず、マイクロ流路内壁の電荷状態を安定的に維持することが困難である。
特許文献２に記載の方法３では、精密なマスキングを別途実施する必要があり、かつ接合前にマスキングを除去する操作が必要であるため、製造方法が煩雑になる。
特許文献３に記載の方法４では、予め形成されたマイクロ流路に、コーティング液の通液及び乾燥を繰り返し行う必要があり操作が煩雑である。
特許文献４に記載の方法５で作製したマイクロ流路チップでは、ヘモグロビンの分析精度が十分でない。

【0006】

キャピラリー電気泳動においては、マイクロ流路内壁の電荷状態が極めて重要であり、分析に要する時間や、分離状態を大きく左右する。そこで、本開示は、チップ製造時における流路の変形が低減され、かつマイクロ流路の内壁に正電荷を導入可能で、かつ簡便な、マイクロ流路を備えるチップのさらなる製造方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本開示は、一又は複数の実施形態において、マイクロ流路を備えるチップの製造方法であって、一対の樹脂基板のそれぞれの少なくとも一方の表面に、第４級オニウム基を有するカチオン性ポリマーを固定化すること、及び前記カチオン性ポリマーを固定化した面を接合面として前記樹脂基板を接合することを含むチップの製造方法に関する。

【0008】

本開示は、一又は複数の実施形態において、マイクロ流路を備えるチップの製造方法であって、一対の樹脂基板のそれぞれの少なくとも一方の表面に、気相又は液相表面処理を行うこと、前記処理面に、第４級オニウム基を有するカチオン性ポリマー溶液を接触させること、及び前記接触させた面を接合面として前記樹脂基板を接合することを含むチップの製造方法に関する。

【0009】

本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の製造方法により製造される、マイクロ流路を備えるチップに関する。

【発明の効果】

【0010】

本開示によれば、チップ製造時における流路の変形が低減され、かつ、マイクロ流路の内壁に正電荷を導入可能な簡便なチップの製造方法を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１は、本開示のマイクロ流路チップを説明するための概略模式図である。

【図2】図２は、実施例１の結果の一例を示すグラフである。

【図3】図３は、実施例２の結果の一例を示すグラフである。

【図4】図４は、実施例３の結果の一例を示すグラフである。

【図5】図５は、実施例４の結果の一例を示すグラフである。

【図6】図６は、実施例５の結果の一例を示すグラフである。

【図7】図７は、比較例１の結果の一例を示すグラフである。

【図8】図８は、比較例２の結果の一例を示すグラフである。

【図9】図９は、比較例３の結果の一例を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本開示は、第４級オニウム基を有するカチオン性ポリマーを樹脂基板に固定化し、固定化された面を接合面として樹脂基板を接合することによって、チップ製造時におけるマイクロ流路の変形が低減でき、かつマイクロ流路内壁に正電荷を効率よく導入できる、との知見に基づく。本開示は、上記の製造方法により製造されたマイクロ流路チップによれば、ヘモグロビンの各分画を短時間で精度よく分離できる、との知見に基づく。本開示は、第４級オニウム基を有するカチオン性ポリマーをマイクロ流路の内壁に固定化すれば、ヘモグロビンの各分画を短時間で精度よく分離でき、その再現性に優れる、との知見に基づく。

【0013】

本開示の製造方法により得られたチップによって、ヘモグロビンの各分画を短時間で精度よく分離できるメカニズムは明らかではないが、以下のように推察される。固定化されたカチオン性ポリマーは、流路表面に立体的に層を形成することから、流路表面近傍のみならず、流路表面周辺に立体的に正電荷を付与することになる。これにより、形成された層の上部と流路表面近傍との間に、泳動液が流入できるようになる。これらの結果、ＥＯＦ(電気浸透流)が早くなり、分離速度が向上するとともに分離精度が向上すると考えられる。また、第４級オニウム基を有するカチオン性ポリマーによっては、正電荷の立体的な付与が長期間保持されることから、分離の再現性が優れるものと考えられる。但し、本開示はこれらのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。

【0014】

［チップの製造方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、マイクロ流路を備えるチップの製造方法に関する。
本開示の製造方法は、一又は複数の実施形態において、一対の樹脂基板のそれぞれの少なくとも一方の表面に、第４級オニウム基を有するカチオン性ポリマーを固定化すること、及び前記カチオン性ポリマーを固定化した面を接合面として前記樹脂基板を接合することを含む。
本開示の製造方法は、一又は複数の実施形態において、一対の樹脂基板のそれぞれの少なくとも一方の表面に、気相又は液相表面処理を行うこと、前記処理面に、第４級オニウム基を有するカチオン性ポリマー溶液を接触させること、及び前記接触させた面を接合面として前記樹脂基板を接合することを含む。

【0015】

本開示の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、マイクロ流路の形状の変化を低減できるという効果を奏しうる。本開示の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、マイクロ流路の内壁に十分な正電荷を導入可能であるという効果を奏しうる。本開示の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、強いカチオン性を示す第４級オニウム基を有するカチオン性ポリマーをマイクロ流路の内壁に簡便に固定化できる、という効果を奏しうる。

【0016】

本開示の製造方法は、一又は複数の実施形態において、樹脂基板の少なくとも一方の表面にアニオン性官能基を導入することを含む。アニオン性官能基は、一又は複数の実施形態において、気相表面処理又は液相表面処理を行うことにより導入することができる。本開示の製造方法は、一又は複数の実施形態において、樹脂基板の少なくとも一方の表面に気相表面処理又は液相表面処理を行うことを含む。アニオン性官能基としては、一又は複数の実施形態において、カルボン酸基、スルホン酸基、硫酸エステル基、リン酸エステル基、ホスホン酸基、水酸基、及びシラノール基等が挙げられ、導入が容易である点から、カルボン酸基が好ましい。気相表面処理としては、一又は複数の実施形態において、真空紫外線処理、プラズマ処理、コロナ放電処理、フレーム処理、及びオゾン処理等が挙げられる。液相表面処理としては、一又は複数の実施形態において、アルカリ溶液処理等が挙げられる。

【0017】

本開示の製造方法は、一又は複数の実施形態において、一対の樹脂基板のそれぞれの少なくとも一方の面に、第４級オニウム基を有するカチオン性ポリマーを固定化することを含む。カチオン性ポリマーの固定化は、一又は複数の実施形態において、アニオン性官能基の導入を行った面に行うことが好ましい。この態様によれば、樹脂基板表面に導入したアニオン性官能基とカチオン性ポリマーの第４級オニウム基とがイオン結合し、カチオン性ポリマーが樹脂基板表面により強固に固定化される。カチオン性ポリマーの固定化は、一又は複数の実施形態において、樹脂基板の被処理対象面にカチオン性ポリマー溶液を接触させることにより行うことができる。接触は、一又は複数の実施形態において、例えば、塗布、浸漬、滴下、及び噴霧等を含む。

【0018】

カチオン性ポリマーは、一又は複数の実施形態において、強いカチオン性を示し、チップの分離精度を向上できることから、第４級オニウム基を有する。本開示において「オニウム基」としては、一又は複数の実施形態において、基準結合数よりも１大きい結合を持つカチオンの塩からなる官能基をいう。また、本開示において「オニウム基」としては、一又は複数の実施形態において、非共有電子対をもつ元素を含んだ化合物に、Ｈ＋又は陽イオン型の原子団Ｒ＋が配位して生じるカチオンが挙げられる。第４級オニウム基としては、一又は複数の実施形態において、第４級アンモニウム基、及び第４級ホスホニウム基等が挙げられる。カチオン性ポリマーは、一又は複数の実施形態において、第４級オニウム基を有するモノマーに由来する構成単位を含むことが好ましい。カチオン性ポリマーは、一又は複数の実施形態において、ポリマー一分子中に第４級オニウム基を複数個有するポリカチオン性ポリマーである。カチオン性ポリマーの分子量や、ポリマーに含まれる第４級オニウム基の個数は、泳動条件や緩衝液組成に応じて、適宜、至適な分子量、及び至適な個数を選択することができる。

【0019】

カチオン性ポリマーとしては、一又は複数の実施形態において、ポリクオタニウム、及びジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー等が挙げられる。本開示において「ポリクオタニウム」とは、第４級アンモニウム基を有するモノマーに由来する構成単位を含むカチオン性ポリマーをいう。ポリクオタニウムは、INCI(International Nomenclature for Cosmetic Ingredients) directoryで確認できる。ポリクオタニウムとしては、一又は複数の実施形態において、ポリクオタニウム−６（poly(diallyldimethylammonium chloride）、ポリクオタニウム−７（copolymer of acrylamide and diallyldimethylammonium chloride）、ポリクオタニウム−４（Diallyldimethylammonium chloride-hydroxyethyl cellulose copolymer）、ポリクオタニウム−２２（copolymer of acrylic acid and diallyldimethylammonium chloride）等のポリジアリルジメチルアンモニウム塩、ポリクオタニウム−１（Ethanol, 2,2',2 ' ' -nitrilotris-, polymer with 1,4-dichloro-2-butene and N,N,N',N'-tetramethyl-2-butene-1,4-diamine）、ポリクオタニウム−１１（Copolymer of vinylpyrrolidone and quaternized dimethylaminoethyl methacrylate）及びポリクオタニウム−２（poly[bis(2-chloroethyl)eter-alt-1,3-bis[3-(dimethylamino)propyl]urea]）等が挙げられる。ジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマーとしては、一又は複数の実施形態において、ジメチルアミン−エピクロロヒドリン以外の構成単位を含んでいてもよく、例えばエチレンジアミン等を含んでいてもよい。カチオン性ポリマーは、入手が容易である点から、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、及び／又はジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマーを含むことが好ましく、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、及び／又はジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマーからなることがより好ましい。カチオン性ポリマーは、一又は複数の実施形態において、塩化物及び／又は硫化物である。カチオン性ポリマーは一種類で使用してもよいし、複数種類を組み合わせて使用してもよい。

【0020】

本開示の製造方法は、一又は複数の実施形態において、樹脂基板を接合することを含む。この接合により、マイクロ流路が形成される。樹脂基板の接合は、一又は複数の実施形態において、カチオン性ポリマーを固定化した面／カチオン性ポリマー溶液と接触させた面を接合面として行う。接合は、一又は複数の実施形態において、圧着、加熱圧着、及び超音波溶着等が挙げられる。加熱圧着の場合、その条件としては、一又は複数の実施形態において、４０〜２００℃又は６０〜１２０℃であり、１〜１００ｋｇｆ／ｃｍ²（０．０９８１ＭＰａ〜９．８１ＭＰａ）又は５〜５０ｋｇｆ／ｃｍ²（０．４９０５ＭＰａ〜４．９０５ＭＰａ）であり、１秒〜１０分又は１０秒〜３分である。

【0021】

少なくとも一方の樹脂基板は、一又は複数の実施形態において、接合面に凹部が形成されている。一又は複数の実施形態において、両方の樹脂基板の接合面に凹部が形成されていてもよい。凹部の断面の外接円の直径は、一又は複数の実施形態において、２８〜２８０μｍ又は３５〜１４０μｍである。一方の樹脂基板は、一又は複数の実施形態において、試料及び泳動液を導入するための貫通孔が形成されている。

【0022】

樹脂としては、一又は複数の実施形態において、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）等のアクリル樹脂、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニリデン、環状ポリオレフィン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、シクロオレフィン、ポリプロピレン、及びポリエチレン等が挙げられ、光透過性に優れる点から、ポリメタクリル酸メチルが好ましい。

【0023】

［マイクロ流路チップ］
本開示は、一又は複数の実施形態において、マイクロ流路を備えるチップに関する。本開示のマイクロ流路チップは、一又は複数の実施形態において、本開示の製造方法により製造されるチップである。本開示のチップによれば、一又は複数の実施形態において、ヘモグロビンの各分画を短時間で精度よく分離できるとの効果を奏しうる。本開示のチップによれば、一又は複数の実施形態において、分析の再現性に優れるとの効果を奏しうる。

【0024】

本開示のチップは、一又は複数の実施形態において、マイクロ流路の内壁に第４級オニウム基を有するカチオン性ポリマーが固定化されている。したがって、本開示のチップは、一又は複数の実施形態において、樹脂基板の接合によりマイクロ流路が形成されたチップであって、前記マイクロ流路の内壁に第４級オニウム基を有するカチオン性ポリマーが固定化されているチップに関する。カチオン性ポリマーは、一又は複数の実施形態において、アニオン性官能基を介してマイクロ流路に固定化されている。カチオン性ポリマーは、一又は複数の実施形態において、イオン結合によってマイクロ流路に固定化されている。本開示のチップは、一又は複数の実施形態において、樹脂基板の接合部分に第４級オニウム基を有するカチオン性ポリマーが固定化されている。本開示のチップは、一又は複数の実施形態において、第４級オニウム基を有するカチオン性ポリマーを介して樹脂基板が接合している。樹脂、及びカチオン性ポリマーは、上述の通りである。

【0025】

本開示のチップは、一又は複数の実施形態において、検体分析に用いることができる。本開示のチップは、一又は複数の実施形態において、電気泳動用、及びキャピラリー電気泳動等の分析に用いることができる。本開示のチップは、一又は複数の実施形態において、生体由来の検体の分析に行うことができる。生体由来の検体としては、一又は複数の実施形態において、血液成分を含む検体が挙げられ、例えば、血液、及び血液中の成分を含む血液由来物等が挙げられる。血液としては、生体から採取された血液が挙げられる。血液中の成分を含む血液由来物としては、例えば、全血、血清、血漿、及び血球が挙げられる。赤血球成分を含む血液由来物としては、血液から分離又は調製されたものであって赤血球成分を含むものが挙げられ、例えば、血漿が除かれた血球画分や、血球濃縮物、血液又は血球の凍結乾燥物、全血を溶血処理した溶血試料、遠心分離血液、自然沈降血液、洗浄血球などを含む。分析対象物としては、一又は複数の実施形態において、タンパク質等が挙げられ、中でもヘモグロビン、アルブミン、及びグロブリンが好ましい。ヘモグロビンとしては、一又は複数の実施形態において、糖化ヘモグロビン、修飾ヘモグロビン、及び異常ヘモグロビン等が挙げられる。糖化ヘモグロビンとしては、一又は複数の実施形態において、ヘモグロビンＡ１ｃ、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＡ１ｄ１、ヘモグロビンＡ１ｄ２、ヘモグロビンＡ１ｄ３、ヘモグロビンＡ１ｅ等が挙げられる。異常ヘモグロビンとしては、ヘモグロビンＦ、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣ、ヘモグロビンＤ、ヘモグロビンＥ、ヘモグロビンＪ、ヘモグロビンＡ２、メト化ヘモグロビン等が挙げられる。修飾ヘモグロビンとしては、一又は複数の実施形態において、カルバミル化ヘモグロビン、アルデヒド化ヘモグロビン、アセチル化ヘモグロビン等が挙げられる。アルブミンとしては、一又は複数の実施形態において、糖化アルブミンが挙げられる。グロブリンとしては、一又は複数の実施形態において、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）₂、及びこれらと抗原が結合した抗原抗体複合体等が挙げられる。グロブリンとしては、一又は複数の実施形態において、標識物が結合したグロブリンが挙げられる。標識物としては、色素、蛍光物質、発光物質、量子ドット、酵素、核酸等が挙げられる。

【0026】

本開示のチップは、一又は複数の実施形態において、マイクロ流路と、試料保持するための凹部と、泳動液保持するための凹部とを含む。試料を保持するための凹部と、泳動液を保持するための凹部とは、マイクロ流路を通じてそれぞれ連通している。本開示のチップは、一又は複数の実施形態において、２枚の樹脂基板が接合することによってマイクロ流路が形成されている。

【0027】

本開示のチップは、一又は複数の実施形態において、流路に泳動液が充填されていてもよい。泳動液としては後述のものが挙げられる。

【0028】

本開示のチップの限定されない実施形態を図１に示す。図１は、本開示のチップを説明するための概略模式図である。図１ａは樹脂基板１，２の上面図であり、図１ｂは樹脂基板１，２の下面図であり、図１ｃはチップの上側断面図及び側断面図である。図１に示すチップは、一対の樹脂基板１，２で形成され、内部にマイクロ流路１０を備える。マイクロ流路１０の両端にはそれぞれ試料保持槽１１及び泳動液保持槽１２が形成されている。試料保持槽１１と泳動液保持槽１２との間であって、マイクロ流路１０の上面には検出部１３が形成されている。

【0029】

［キット］
本開示は、一又は複数の実施形態において、検体分析用のキットであって、本開示のチップと、分析用の溶液を備えたカートリッジとを含むキットに関する。分析用の溶液としては、一又は複数の実施形態として、泳動液、及び試料調製用液等が挙げられる。

【0030】

泳動液は、従来公知の泳動液を使用できる。泳動液は、一又は複数の実施形態において、ｐＨ緩衝物質、非界面活性剤型の両イオン性物質、及び水を含み、さらに、必要に応じてイオン性の擬似固定相等を含む。イオン性擬似固定相としては、分析精度の向上と測定時間の短縮化の観点から、一又は複数の実施形態において、アニオン性基を有する多糖類等が挙げられる。アニオン性基を有する多糖類として、硫酸化多糖類、カルボン酸化多糖類、スルホン酸化多糖類、及びリン酸化多糖類が挙げられ、分析精度の向上と測定時間の短縮化の観点から、硫酸化多糖類及びカルボン酸化多糖類が好ましい。硫酸化多糖類としては、限定されない一又は複数の実施形態において、分析精度の向上と測定時間の短縮化の観点から、コンドロイチン硫酸、へパリン、へパラン、フコイダン、又はその塩等が挙げられ、中でもコンドロイチン硫酸又はその塩が好ましい。コンドロイチン硫酸としては、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、及びコンドロイチン硫酸Ｅ等が挙げられる。

【0031】

試料調製用液としては、一又は複数の実施形態において、泳動液と同様の組成のものが挙げられる。試料調製用液としては、一又は複数の実施形態において、泳動液と異なる組成のものであっても良い。

【0032】

［分析方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、ヘモグロビンの分析方法であって、本開示のチップを用いて試料中の分析対象を測定することを含む分析方法に関する。本開示の分析方法によれば、一又は複数の実施形態において、試料中の分析対象の測定精度を向上でき、好ましくは分析対象の分離精度の向上及び又は測定時間の短縮が可能となるという効果を奏しうる。

【0033】

分析は、一又は複数の実施形態において、分離分析法により試料中の分析対象を分離することにより行うことができる。分離分析法としては、一又は複数の実施形態において、電気泳動法が挙げられ、中でもキャピラリー電気泳動法が好ましい。

【0034】

本開示の分析方法は、一又は複数の実施形態において、チップのマイクロ流路の一端に試料を導入すること及びマイクロ流路の両端に電圧を印加することを含む。本開示の分析方法は、一又は複数の実施形態において、チップのマイクロ流路に試料を導入すること及びマイクロ流路の全体又は一部に電圧を印加することを含む。本開示の分析方法は、一又は複数の実施形態において、検体を希釈して試料を調製すること、泳動液をチップのマイクロ流路の一端に導入して、泳動液でマイクロ流路を充填すること、前記チップのマイクロ流路の一端に、試料を導入すること、及びマイクロ流路の両端に電圧を印加することを含む。泳動液は、上述の通りである。

【0035】

検体の希釈は、一又は複数の実施形態において、上述の試料調製用液を用いて行うことが好ましい。

【0036】

つぎに、図１に示すキャピラリー電気泳動チップを用いた試料の分析方法の一例について説明する。

【0037】

まず、キャピラリー電気泳動チップの泳動液保持槽１２に泳動液を充填し、毛細管現象により泳動液をキャピラリー流路１０に充填する。

【0038】

つぎに、キャピラリー流路１０に泳動液が充填された前記キャピラリー電気泳動チップの試料保持槽１１に試料を配置する。

【0039】

試料保持槽１１に配置する試料は、試料原料である全血を希釈することにより調製できる。試料原料の希釈率は、一又は複数の実施形態において、１．２〜２００倍であり、好ましくは２〜１００倍又は３〜８０倍である。

【0040】

ついで、キャピラリー流路１０の両端、すなわち、試料保持槽１１及び泳動液保持槽１２との間に電圧を印加する。これにより、試料保持槽１１からキャピラリー流路１０への試料の導入及びキャピラリー流路１０において分離が行われ、ヘモグロビンを含む試料が試料保持槽１１から泳動液保持槽１２に向かって移動する。キャピラリー流路１０の両端に印加する電圧は、一又は複数の実施形態において、０．５〜１０ｋＶであり、好ましくは０．５〜５ｋＶである。

【0041】

そして、所定の位置において測定を行う。測定は、一又は複数の実施形態において、吸光度測定等の光学的手法により行うことができる。分析対象物質がヘモグロビンの場合は、例えば、波長４１５ｎｍの吸光度の測定を行うことが好ましい。

【0042】

測定を行う位置、すなわち、分離に要する長さは、キャピラリー流路１０の長さ等に適宜決定できる。例えば、キャピラリー流路１０の長さが１０〜１５０ｍｍである場合、キャピラリー流路１０の試料保持槽１１側の端部から５〜１４０ｍｍ、１０〜１００ｍｍ又は１５〜５０ｍｍの位置である。

【0043】

上述のように分析を行うことによって、ヘモグロビンの測定を行うことができ、好ましくはＨｂＡ１ｃとその他のヘモグロビン成分、さらに好ましくは糖尿病診断の指標となる安定型ＨｂＡ１ｃとその他のヘモグロビン成分とを分離して測定することができる。その他のヘモグロビン成分としては、不安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ１ｄ１、ＨｂＳ、ＨｂＦ、ＨｂＡ２、ＨｂＣ等が挙げられる。さらに、得られたエレクトロフェログラムを解析することにより、例えば、ＨｂＡ１ｃの比率（％ＨｂＡ１ｃ）やＨｂＡ１ｃの量を測定することができる。このため、本開示の分析方法は、糖尿病の予防、診断及び治療等の用途に利用することができる。

【0044】

本開示は、以下の一又は複数の実施形態に関しうる。
〔１〕 マイクロ流路を備えるチップの製造方法であって、
一対の樹脂基板のそれぞれの少なくとも一方の表面に、第４級オニウム基を有するカチオン性ポリマーを固定化すること、及び
前記カチオン性ポリマーを固定化した面を接合面として前記樹脂基板を接合することを含む、チップの製造方法。
〔２〕 マイクロ流路を備えるチップの製造方法であって、
一対の樹脂基板のそれぞれの少なくとも一方の表面に、気相又は液相表面処理を行うこと、
前記処理面に、第４級オニウム基を有するカチオン性ポリマー溶液を接触させること、及び
前記接触させた面を接合面として樹脂基板を接合することを含む、チップの製造方法。
〔３〕 前記樹脂基板のそれぞれの少なくとも一方の表面に、アニオン性官能基を導入すること、及び
前記アニオン性官能基を導入した面に、前記カチオン性ポリマーの固定化を行うこと、を含む、〔１〕記載の製造方法。
〔４〕 前記アニオン性官能基の導入は、気相又は液相表面処理により行う、〔３〕記載の製造方法。
〔５〕 前記気相表面処理は、真空紫外線処理、プラズマ処理、コロナ放電処理、フレーム処理、及びオゾン処理からなる群から選択される、〔２〕又は〔４〕記載の製造方法。
〔６〕 前記第４級オニウム基は、第４級アンモニウム基及び第４級ホスホニウム基からなる群から選択される、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の製造方法。
〔７〕 前記カチオン性ポリマーは、ポリクオタニウム、ジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の製造方法。
〔８〕 前記カチオン性ポリマーは、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、ジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つを含む、〔１〕から〔７〕のいずれかに記載の製造方法。
〔９〕 前記カチオン性ポリマーは、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、ジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー及びこれらの組み合わせである、〔１〕から〔７〕のいずれかに記載の製造方法。
〔１０〕 前記カチオン性ポリマーは、塩化物及び／又は硫化物である、〔１〕から〔９〕のいずれかに記載の製造方法。
〔１１〕 前記樹脂基板の接合により、マイクロ流路が形成される、〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載の製造方法。
〔１２〕 〔１〕から〔１１〕のいずれかに記載の製造方法により製造される、マイクロ流路を備えるチップ。
〔１３〕 前記流路の内壁に、第４級オニウム基を有するカチオン性ポリマーが固定化されている、〔１２〕記載のチップ。
〔１４〕 樹脂基板の接合によりマイクロ流路が形成されたチップであって、
前記マイクロ流路の内壁に第４級オニウム基を有するカチオン性ポリマーが固定化されている、チップ。
〔１５〕 前記カチオン性ポリマーは、ポリクオタニウム、ジメチルアミン-エピクロロヒドリンコポリマー及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、〔１３〕又は〔１４〕に記載のチップ。
〔１６〕 前記チップは、検体分析用である、〔１２〕から〔１５〕のいずれかに記載のチップ。
〔１７〕 検体分析用のキットであって、
〔１２〕から〔１６〕のいずれかに記載のチップと、
分析用の溶液を備えたカートリッジとを含む、キット。
〔１８〕 ヘモグロビンの分析方法であって、
〔１２〕から〔１６〕のいずれかに記載のチップを用いて試料中の分析対象を測定することを含む、分析方法。
〔１９〕 検体を希釈して試料を調製すること、
泳動液を前記チップのマイクロ流路の一端に導入して、前記泳動液でマイクロ流路を充填すること、
前記チップのマイクロ流路の一端に、前記試料を導入すること、及び
前記マイクロ流路の両端に電圧を印加すること、を含む、〔１８〕記載の分析方法。
〔２０〕 泳動液を前記チップのマイクロ流路に充填すること、
前記チップのマイクロ流路に、試料を導入すること、及び
前記マイクロ流路の全体又は一部に電圧を印加することを含む、〔１８〕記載の分析方法。

【0045】

以下に、実施例及び比較例を用いて本開示をさらに説明する。但し、本開示は以下の実施例に限定して解釈されない。

【実施例】

【0046】

（実施例１）
［チップの作製］
図１に示すような部品を使用し、チップを作製した。
＜樹脂部品の準備＞
材料としてＰＭＭＡ（ポリメタクリル酸メチル）を使用し、成形によって樹脂部品Ａ（図１ａ）と、樹脂部品Ｂ（図１ｂ）との二つの樹脂部品を準備した。流路１０は０．０４ｍｍ×０．０４ｍｍ×３０ｍｍとし、試料保持槽１１及び泳動液保持槽１２の容量は１０μＬとした。また、検出部１３は、その中心が試料保持槽１１及び泳動液保持槽１２からそれぞれ２０ｍｍ及び１０ｍｍの位置となるようにした。
＜カチオン性ポリマーの固定化＞
樹脂部品Ａ及びＢの接合面に、エキシマランプによって大気圧下で紫外線を照射し、アニオン性官能基を導入した。その後、樹脂部品Ａ及びＢを下記処理液１に２４時間室温にて浸漬した。
（処理液１）
ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド（ＰＤＡＤＭＡＣ，ポリクオタニウム−６，シグマアルドリッチ社製、分子量１０００００以下）１％ｗ／ｖ，水酸化ナトリウム １００ｍＭ，水溶液
浸漬後、水にて十分に洗浄し、圧縮空気を噴射して樹脂部品Ａ及びＢを風乾した。この一連の工程により、カチオン性ポリマーが、樹脂部品の接合面上のアニオン性官能基と結合し、接合面に固定化される。
＜マイクロ流路チップの形成＞
接合面にカチオン性ポリマーが固定化された樹脂部品Ａ及びＢを、接合面同士を接触させて加熱圧着（温度８０℃、圧力１６ｋｇｆ／ｃｍ²（１．５７ＭＰａ）、１分間）し、図１ｃに示すマイクロ流路チップを得た。これにより、樹脂部品Ａ及びＢが接合され、かつ、流路内壁にカチオン性ポリマーが固定化されたチップが得られた。得られたチップは、マイクロ流路にほとんど変形が見られなかった。

【0047】

［チップの接合面の評価］
得られたチップについて、樹脂部品Ａと樹脂部品Ｂとの接合を評価した。評価は、接合強度と、接合面からの液体の漏れの有無とで行った。接合強度は、得られたチップを接合面で強制的に剥離し、接合面に残る剥離痕の深さを測定することにより確認した。液体の漏れの有無は、色素溶液をキャピラリーに通液し、顕微鏡にて観察することにより行った。その結果、得られたチップは、接合深さが２μｍ以上であり、十分な接合強度を有し、また接合面からの液体の漏れは見られなかった。つまり、樹脂部品Ａと樹脂部品Ｂとは十分に接合されていることが確認できた。

【0048】

［ヘモグロビンの分析］
得られたチップを用いて、キャピラリー電気泳動によるヘモグロビンの分析を行った。電気泳動溶液は、蒸留水に下記物質を下記濃度となるように添加することにより調製した。
（電気泳動溶液１）
４０ｍＭ クエン酸
１％ｗ／ｖコンドロイチン硫酸Ｃナトリウム
５００ｍＭ ＮＤＳＢ−２０１（品名、３−（１−Ｐｙｒｉｄｉｎｉｏ）−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ、Ａｎａｔｒａｖｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＬＬＣ製）
０．１％ｗ／ｖ エマルゲンＬＳ−１１０（製品名、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、花王製）
０．１％ アジ化ナトリウム
ジメチルアミノエタノール（ｐＨ調製用）
ｐＨ６．０
（電気泳動溶液２）
４０ｍＭ クエン酸
１．２５％ｗ／ｖ コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム
０．１％ｗ／ｖ エマルゲンＬＳ−１１０
０．１％ アジ化ナトリウム
ジメチルアミノエタノール（ｐＨ調製用）
ｐＨ５．０

【0049】

キャピラリー電気泳動は、以下の手順で行った。
１．マイクロ流路チップを、アークレイ製の電気泳動装置にセットした。
２．電気泳動溶液２をマイクロ流路チップの泳動液保持槽に９μＬ添加し、毛細管現象によりマイクロ流路を電気泳動溶液２で満たした。
３．ヒト全血を電気泳動溶液１で４１倍に希釈し、試料とした。
４．上記試料を、マイクロ流路チップの試料保持槽に９μＬ添加した。
５．試料保持槽に陽電極、泳動液保持槽に負電極を接触させ、１６００Ｖの電圧を印加して電気泳動を開始した。
６．検出部にて４１５ｎｍの吸光度を測定し、エレクトロフェログラムを得た。電気泳動は６０秒間行った。

【0050】

得られた分析結果を図２に示す。図２に示すように、ヘモグロビンの各分画は３０秒以内に検出され、かつ各分画は十分に分離された。具体的には、図２に示すように、不安定型ＨｂＡ１ｃ（図２の○）、安定型ＨｂＡ１ｃ（図２の△）及びＨｂＡ１ｄ１（図２の□）のそれぞれのピークを明確に確認することができた。つまり、実施例１のチップは、短時間でヘモグロビンの各分画を精度よく分離できることが確認できた。

【0051】

（実施例２）
樹脂部品Ａ及びＢの材料としてポリスチレンを使用し、かつ加熱圧着の温度を９０℃に変更したこと以外は、実施例１と同様にしてマイクロ流路チップを得た。得られたチップを用い、実施例１と同様に接合面の評価、及びヘモグロビンの分析を行った。得られたチップは、十分な接合強度を有しており、接合面の液体の漏れは見られなかった。また、得られたチップは、マイクロ流路にほとんど変形が見られなかった。

【0052】

得られた分析結果を図３に示す。図３に示すように、ヘモグロビンの各分画は３０秒以内に検出され、かつ不安定型ＨｂＡ１ｃ（図３の○）、安定型ＨｂＡ１ｃ（図３の△）及びＨｂＡ１ｄ１（図３の□）のそれぞれのピークを明確に確認することができた。つまり、実施例２のチップは、短時間でヘモグロビンの各分画を精度よく分離できることが確認できた。

【0053】

（実施例３）
樹脂部品Ａ及びＢの材料としてシクロオレフィンを使用し、かつ加熱圧着の温度を９０℃に変更したこと以外は、実施例１と同様にしてマイクロ流路チップを得た。得られたチップを用い、実施例１と同様に接合面の評価、及びヘモグロビンの分析を行った。得られたチップは、十分な接合強度を有しており、接合面の液体の漏れは見られなかった。また、得られたチップは、マイクロ流路にほとんど変形が見られなかった。

【0054】

得られた分析結果を図４に示す。図４に示すように、ヘモグロビンの各分画は３０秒以内に検出され、かつ不安定型ＨｂＡ１ｃ（図４の○）、安定型ＨｂＡ１ｃ（図４の△）及びＨｂＡ１ｄ１（図４の□）のそれぞれのピークを明確に確認することができた。つまり、実施例３のチップは、短時間でヘモグロビンの各分画を精度よく分離できることが確認できた。

【0055】

（実施例４）
処理液１を、下記の処理液２に変更したこと以外は、実施例１と同様にしてマイクロ流路チップを得た。
（処理液２）
ポリ[ビス(2-クロロエチル)エーテル-alt-1,3-ビス[3-(ジメチルアミノ)プロピル]尿素]、四級化体（ポリクオタニウム−２、CAS No.68555-36-2、シグマアルドリッチ社製)１％ｗ／ｖ，水酸化ナトリウム １００ｍＭ，水溶液
得られたチップを用い、実施例１と同様に接合面の評価、及びヘモグロビンの分析を行った。得られたチップは、十分な接合強度を有しており、接合面の液体の漏れは見られなかった。また、得られたチップは、マイクロ流路にほとんど変形が見られなかった。

【0056】

得られた分析結果を図５に示す。図５に示すように、ヘモグロビンの各分画は３０秒以内に検出され、かつ不安定型ＨｂＡ１ｃ（図５の○）、安定型ＨｂＡ１ｃ（図５の△）及びＨｂＡ１ｄ１（図５の□）のそれぞれのピークを明確に確認することができた。つまり、実施例４のチップは、短時間でヘモグロビンの各分画を精度よく分離できることが確認できた。

【0057】

（実施例５）
処理液１を、下記の処理液３に変更したこと以外は、実施例１と同様にしてマイクロ流路チップを得た。
（処理液３）
ジメチルアミン−エピクロロヒドリンコポリマー（商品名：ユニセンスＫＨＥ１０５Ｌ、センカ社製)１％ｗ／ｖ，水酸化ナトリウム １００ｍＭ，水溶液
得られたチップを用い、実施例１と同様に接合面の評価、及びヘモグロビンの分析を行った。得られたチップは、十分な接合強度を有しており、接合面の液体の漏れは見られなかった。また、得られたチップは、マイクロ流路にほとんど変形が見られなかった。

【0058】

得られた分析結果を図６に示す。図６に示すように、ヘモグロビンの各分画は３０秒以内に検出され、かつ不安定型ＨｂＡ１ｃ（図６の○）、安定型ＨｂＡ１ｃ（図６の△）及びＨｂＡ１ｄ１（図６の□）のそれぞれのピークを明確に確認することができた。つまり、実施例５のチップは、短時間でヘモグロビンの各分画を精度よく分離できることが確認できた。

【0059】

（比較例１）
処理液１を、下記の処理液４に変更したこと以外は、実施例１と同様にしてマイクロ流路チップを得た。
（処理液４）
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、和光純薬工業社製)１％ｗ／ｖ，水溶液
得られたチップを用い、実施例１と同様に接合面の評価、及びヘモグロビンの分析を行った。得られたチップは、十分な接合強度を有しており、接合面の液体の漏れは見られなかった。得られた分析結果を図７に示す。図７に示すように、ヘモグロビンの各分画は３０秒以内に検出されるものの、各ピークが不明確であり、ヘモグロビンの各分画の分離が不十分であった。

【0060】

（比較例２）
処理液１を、下記の処理液５に変更したこと以外は、実施例１と同様にしてマイクロ流路チップを得た。
（処理液５）
ポリアリルアミン塩酸塩（ＰＡＡ，ニットーボーメディカル社製）１％ｗ／ｖ，水酸化ナトリウム １００ｍＭ，水溶液
得られたチップを用い、実施例１と同様に接合面の評価、及びヘモグロビンの分析を行った。得られたチップは、十分な接合強度を有しており、接合面の液体の漏れは見られなかった。得られた分析結果を図８に示す。図８に示すように、ヘモグロビンの各分画は３０秒以内に検出されるものの、安定型ＨｂＡ１ｃ分画（図８の△）及びＨｂＡ０分画（図８の×）の検出後に吸光度が低下する異常が見られた。

【0061】

（比較例３）
実施例１で準備した樹脂部品Ａ及びＢに、以下に示すように、紫外線照射によるアニオン性官能基の導入及びアミノシランの塗布を行い、マイクロ流路チップを得た。
＜アミノシランの塗布＞
樹脂部品Ａ及びＢの接合面に対し、エキシマランプによって大気圧下で紫外線を照射し、アニオン性官能基を導入した。その後、樹脂部品Ａ及びＢを下記処理液６に３時間３０℃にて浸漬した。
（処理液６）
アミノプロピルトリメトキシシラン（ＫＢＭ−９０３, 信越化学社製）５％ｗ／ｖ，水溶液
浸漬の後、水にて十分に洗浄し、圧縮空気を噴射して樹脂部品Ａ及びＢを風乾した。
＜マイクロ流路チップの形成＞
接合面にアミノシランが塗布された樹脂部品Ａ及びＢを、接合面同士を接触させて加熱圧着し、図１ｃに示すマイクロ流路チップを得た。加熱圧着は、温度７０℃、圧力１８．７ｋｇｆ／ｃｍ²（１．８３ＭＰａ）で５分間行った。
この一連の工程により、アミノシランと樹脂部品が共有結合し、かつアミノシラン同士が共有結合することで、樹脂部品が接合され、キャピラリー内壁にアミノシラン層が形成される。

【0062】

得られたチップを用い、実施例１と同様に接合面の評価、及びヘモグロビンの分析を行った。得られたチップは、十分な接合強度を有しており、接合面の液体の漏れは見られなかった。得られた分析結果を図９に示す。図９に示すように、ヘモグロビンの各分画は３０秒以内に検出されなかった。また、各分画のピークも不明確であり、各分画の分離は不十分であることが分かる。

【0063】

［再現性試験］
実施例１、４及び５並びに比較例１及び２で得られたマイクロ流路チップを用いて、日差再現性試験を実施した。再現性試験は、各チップを乾燥剤と共に密封し、５０℃条件下にて５日間保存し、保存前、保存２日後及び５日後に、各チップ２回ずつ測定することにより行った。測定は、実施例１のヘモグロビンの分析と同様に行い、下記式にて安定型ＨｂＡ１ｃ値を算出した。その結果を下表１に示す。
ＨｂＡ１ｃ（％）＝（ＨｂＡ１ｃ分画の吸光度／総ヘモグロビンの吸光度）Ｘ１００

【0064】

【表1】

【0065】

表１に示すように、再現性を示すＣＶ（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）値が、比較例１及び２のチップでは４％以上であるのに対し、実施例１、４、及び５のチップでは１％前後であった。つまり、実施例１、４、及び５のチップにおいて良好な再現性を得られることが分かった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】