特許 6018506 対立遺伝子多様体の選択的低減

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6018506

(24)【登録日】2016年10月7日

(45)【発行日】2016年11月2日

(54)【発明の名称】対立遺伝子多様体の選択的低減

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7088 20060101AFI20161020BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20161020BHJP

   A61K 31/7115 20060101ALI20161020BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20161020BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20161020BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20161020BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/7088

   A61K31/712

   A61K31/7115

   A61K31/7125

   A61K48/00

   A61P25/14

【請求項の数】26

【全頁数】158

(21)【出願番号】特願2012-552933(P2012-552933)

(86)(22)【出願日】2011年2月8日

(65)【公表番号】特表2013-518605(P2013-518605A)

(43)【公表日】2013年5月23日

(86)【国際出願番号】US2011024104

(87)【国際公開番号】WO2011097644

(87)【国際公開日】20110811

【審査請求日】2014年2月5日

(31)【優先権主張番号】61/371,640

(32)【優先日】2010年8月6日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/302,458

(32)【優先日】2010年2月8日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】595104323

【氏名又は名称】アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｉｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．

(73)【特許権者】

【識別番号】501060817

【氏名又は名称】ザ・ユニバーシテイ・オブ・ブリテイツシユ・コロンビア

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＢＲＩＴＩＳＨ ＣＯＬＵＭＢＩＡ

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100075270

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 泰

(74)【代理人】

【識別番号】100096013

【弁理士】

【氏名又は名称】富田 博行

(74)【代理人】

【識別番号】100092967

【弁理士】

【氏名又は名称】星野 修

(74)【代理人】

【識別番号】100117813

【弁理士】

【氏名又は名称】深澤 憲広

(72)【発明者】

【氏名】ベネット，シー・フランク

(72)【発明者】

【氏名】ヘイデン，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】フレアー，スーザン・エム

(72)【発明者】

【氏名】グリーンリー，サラ

(72)【発明者】

【氏名】キャロル，ジェフリー

(72)【発明者】

【氏名】ウォービー，サイモン

(72)【発明者】

【氏名】スウェイジ，エリック・イー

【審査官】 春田 由香

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／１３５３２２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００８−５１３５０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／００５５６２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Experimental Neurology，２００９年，Vol.217，pp.312-319

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００−３１／８０

Ａ６１Ｋ ４８／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣｉＮｉｉ

医中誌ＷＥＢ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞、組織又は動物の変異ハンチンチン対立遺伝子の発現を選択的に低減するための医薬組成物であって、変異ハンチンチン対立遺伝子の発現が選択的に低減される、rs7685686、rs362306、rs362331、rs2298969、rs4690072、rs2024115又はrs363088から選択される一塩基多型を含む位置にある変異ハンチンチン対立遺伝子に相補的な修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を含み、
ここで、前記修飾オリゴヌクレオチドがウイング-ギャップ-ウイングモチーフを含む一本鎖キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
前記ウイング-ギャップ-ウイングモチーフが、2-9-6、3-9-3、3-9-4、3-9-5、4-7-4、4-9-4、4-9-5、4-10-5、4-11-4、4-11-5、5-7-5、5-8-6、5-9-3、5-9-5、5-10-4、5-10-5、6-7-6、6-8-5、及び6-9-2から成る群のいずれかであり、
前記修飾オリゴヌクレオチドが、前記変異ハンチンチン対立遺伝子に対し100％相補的である、前記医薬組成物。

【請求項2】

ハンチントン病の治療、改善、又は発症若しくは進行の遅延のための医薬組成物であって、rs7685686、rs362306、rs362331、rs2298969、rs4690072、rs2024115又はrs363088から選択される一塩基多型を含む対立遺伝子のあるポジションに位置する変異ハンチンチン対立遺伝子に対して相補的な修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を含み、
ここで、前記修飾オリゴヌクレオチドがウイング-ギャップ-ウイングモチーフを含む一本鎖キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
前記ウイング-ギャップ-ウイングモチーフが、2-9-6、3-9-3、3-9-4、3-9-5、4-7-4、4-9-4、4-9-5、4-10-5、4-11-4、4-11-5、5-7-5、5-8-6、5-9-3、5-9-5、5-10-4、5-10-5、6-7-6、6-8-5、及び6-9-2から成る群のいずれかであり、
前記修飾オリゴヌクレオチドが、前記変異ハンチンチン対立遺伝子に対し100％相補的であり、
動物へ投与された化合物は変異ハンチンチン対立遺伝子を選択的に低減することにより、ハンチントン病を治療し、改善し、又は発症若しくは進行を遅らせる、前記医薬組成物。

【請求項3】

変異ハンチンチン対立遺伝子の発現が、野生型ハンチンチン対立遺伝子の発現と比較して、少なくとも40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％は選択的に低減される、請求項１または２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

rs7685686、rs362306、rs362331、rs2298969、rs4690072、rs2024115又はrs363088から選択される一塩基多型部位を含むポジションにおける変異ハンチンチン対立遺伝子に相補的な修飾オリゴヌクレオチドを含む、1又は複数の追加の化合物が投与される、請求項１または２に記載の医薬組成物。

【請求項5】

修飾オリゴヌクレオチドが15〜20連結ヌクレオシドから成り、修飾オリゴヌクレオチドの5'末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15が、一塩基多型と一致する、請求項１または２に記載の医薬組成物。

【請求項6】

修飾オリゴヌクレオチドが共役アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項7】

少なくとも1つのヌクレオシド間連結が修飾ヌクレオシド間連結である、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項8】

各ヌクレオシド間連結がホスホロチオ酸ヌクレオシド間連結である、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

少なくとも1つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含む、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項10】

少なくとも1つの修飾核酸塩基が5'-メチルシトシンである、請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項11】

少なくとも1つのヌクレオシドが修飾糖を含む、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項12】

修飾糖が高度親和性糖修飾である、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

高度親和性糖修飾が二環式糖である、請求項１２に記載の医薬組成物。

【請求項14】

各二環式糖に4'-CH（CH₃）-O-2'ブリッジが含まれる、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

少なくとも1つの修飾糖に2'-O-メトキシエチルが含まれる、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項16】

修飾オリゴヌクレオチドのウィングセグメントに位置する各ヌクレオシドに2'-O-メトキシエチル修飾が含まれる、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

修飾オリゴヌクレオチドは、リボザイム、二本鎖siRNA、又はshRNAではない、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項18】

修飾オリゴヌクレオチドが12〜20連結ヌクレオシドから成る、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項19】

修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが15〜19連結ヌクレオシドから成る、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項20】

ギャップ領域が7〜11ヌクレオシド長であり、5'ウィング領域が1〜6核酸塩基長であり、3'ウィング領域が1〜6核酸塩基長である、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項21】

少なくとも1つのウィング領域の少なくとも1つのヌクレオシドに修飾糖又は糖代用が含まれる、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項22】

各ウィング領域の各ヌクレオシドに修飾糖又は糖代用が含まれる、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項23】

糖又は糖代用が2'-O-メトキシエチル修飾糖である、請求項２２に記載の医薬組成物。

【請求項24】

ウィング領域の少なくとも1つに4'〜2'二環式ヌクレオシドが含まれ、残りのウィングヌクレオシドの少なくとも1つが非二環式2'-修飾ヌクレオシドである、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項25】

非二環式2'-修飾ヌクレオシドが2'-O-メトキシエチルヌクレオシドである、請求項２４に記載の医薬組成物。

【請求項26】

4'〜2'二環式ヌクレオシドが4'-CH（CH₃）-O-2'二環式ヌクレオシドである、請求項２４に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列リスト
本願は、電子様式の配列リストと共に出願される。配列リストは２０１１年２月７日に作成され、容量が３２２ＫｂのＢＩＯＬ０１２５ＷＯＳＥＱ．ｔｘｔと題したファイルとして提供される。電子様式による配列リストの本情報は、その全体を引用により本明細書に含めるものとする。

【0002】

本発明の実施形態は、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む対立遺伝子多様体の発現を選択的に低減するための方法、化合物、及び組成物を提供する。この方法、化合物、及び組成物は、ハンチントン病の治療、予防又は改善のために有益である。

【背景技術】

【0003】

遺伝病は、遺伝子又は染色体の異常により起こる。異常には、挿入、欠失、及び伸長が含まれる。ハンチントン病（ＨＤ）は、伸長に起因する遺伝病の一例である。ＨＤは、優性遺伝する進行性神経変性障害で、ハンチンチン遺伝子（ＨＴＴ）における多型トリヌクレオチド（ＣＡＧ）トラクトの伸長という突然変異の結果生じる。一般集団における平均的ＣＡＧトラクトのサイズは、１７〜２６リピート（野生型対立遺伝子）であるが、ＨＤ患者においては、ＣＡＧトラクトは３６又はそれ以上のリピートに伸長している（突然変異対立遺伝子）（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐ １９９３、Ｃｅｌｌ、７２（６）：９７１−８３）。ＨＴＴ遺伝子はＨＴＴタンパク質をコードし、ＣＡＧトラクト伸長の結果、タンパク質のＮ末端近接においてポリグルタミンリピート数が異常増加する。個体はＨＴＴ遺伝子を２つ保有するが、突然変異対立遺伝子が１つ存在するだけでＨＤを発症する。

【0004】

ＨＴＴタンパク質は、中枢神経系発達の期間ある役割を担い、細胞においては保護的役割を担っているようである。マウスモデルにおいて、ＨＴＴ遺伝子の構成的なノックアウトは胚発生中では致命的であり（Ｎａｓｉｒら、１９９５、Ｃｅｌｌ、８１（５）：８１１−２３）、一方、成体のＨＴＴ遺伝子不活性化は、脳及び精巣における進行性細胞死へと導く（Ｄｒａｇａｔｓｉｓら、２０００、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ、２６：３００−３０６）。よって、野生型対立遺伝子のハンチンチン発現を低減させることにより負の結果を生じる可能性がある。

【0005】

ＨＤ同様、突然変異対立遺伝子を選択的に低減させる戦略が有益となる疾患がいくつか存在する。よって、正常な細胞過程において必要であると思われる野生型多様体に対し、ＨＴＴの場合のように、疾患の原因となる突然変異対立遺伝子多様体が発現するのを選択的に低減させるというニーズは未だ満たされていない。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1】ＳＮＰ位置を示すｍＲＮＡ及びＨＴＴのゲノム配列を提供する。

【発明の概要】

【0007】

本明細書は、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む遺伝子の対立遺伝子多様体の発現を選択的に低減させるための方法、化合物及び組成物を提供する。この方法、化合物、及び組成物は、ハンチントン病の治療、予防又は改善に有益である。ＳＮＰは、その発現がＨＤの原因となる突然変異対立遺伝子に関連し得る。

【0008】

ある実施形態では、突然変異ハンチンチンのｍＲＮＡ及びタンパク質発現の選択的低減は、アンチセンス化合物で突然変異対立遺伝子に位置するＳＮＰを標的とすることにより達成される。ある実施形態では、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。

【0009】

ある実施形態では、ＳＮＰを含む遺伝子の対立遺伝子多様体を選択的に低減するよう設計されたアンチセンス化合物は、アンチセンス化合物の有効性及び選択性並びに集団遺伝子学に基づき作られている。

【0010】

発明の詳細な説明
前記の概要及び以下の詳細な説明は、単に典型例を示しかつ説明することのみを目的とするのであって、請求項に記載の本発明の範囲を制限するものではないと理解されるべきである。本明細書では、特段の記述がない限り、単数の使用には複数も含まれる。本明細書で使用される「又は」は、特段の記述がない限り「及び／又は」の意味である。さらに、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、並びに、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「に含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」等のその他の表現の利用は、制限を意味しない。また、「要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）」又は「コンポーネント（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」等の用語には、特段の記述がない限り、１つのユニットを含む要素及びコンポーネントと、２以上のサブユニットを含む要素及びコンポーネントの両方が包含される。

【0011】

本明細書のセクションの見出しは構成目的でのみ使用されており、本明細書に記載の主題項目を制限するものと解釈されるべきではない。特許文献、特許出願書類、学術論文、書籍、及び約定等を含むがこれに限定されない、本願で引用されたすべての文献、又は文献の一部は、本明細書で論じる文献の部分並びにその全体を、引用により明示的に本明細書に含めるものとする。

【0012】

定義
特定の定義が付与されない限り、本明細書に記載の分析化学、有機合成化学、及び医薬・製薬化学との関連で利用される命名法、及び手順と技法は、当業者に周知であり、また当技術分野で一般に使用されている。化学合成及び化学分析には、標準的技法が用いられ得る。可能であれば、全ての特許文献、特許出願書類、公開特許出願書類及びその他の刊行物、ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号及び国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）等のデータベースを通じて取得可能な関連する配列情報、並びに本明細書での開示全体にわたり言及されるその他のデータは、本明細書で論じる文献の部分並びにその全体を、引用により含めるものとする。

【0013】

特段の指示がない限り、以下の用語には以下の意味が含まれる。

【0014】

「２’−Ｏ−メトキシエチル」（２’−ＭＯＥ及び２’−Ｏ（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３とも称される）は、フロシル環の２’位のＯ−メトキシ−エチル修飾を指している。２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖とは、修飾された糖のことである。

【0015】

「２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド」は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖部分を含むヌクレオチドという意味である。

【0016】

「５−メチルシトシン」は、メチル基を５’位に結合させ修飾したシトシンを意味する。５−メチルシトシンは、修飾された核酸塩基である。

【0017】

「活性薬剤」は、個体への投与時に治療効果をもたらす医薬組成物における１つの物質又は複数の物質を意味する。例えば、ある実施形態では、対立遺伝子多様体を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、活性薬剤である。

【0018】

「活性標的領域」又は「標的領域」は、１又は複数の活性アンチセンス化合物が標的とする領域を意味する。「活性アンチセンス化合物」は、標的の核酸レベル又はタンパク質レベルを低減するアンチセンス化合物を意味する。

【0019】

「同時に投与される」とは、２つの薬剤の医薬効果が同時に患者に現れるよう２つの薬剤を同時に投与することを指している。同時投与においては、両方の薬剤を１つの医薬組成物で、同じ用量の剤形で、又は同じ投与経路により投与する必要はない。両方の薬剤の効果が同時に現れる必要もない。効果は一定期間重複する必要があるだけで、同延的である必要はない。

【0020】

「投与する」は、個体に対し医薬剤を提供するという意味であり、医療専門家による投与及び自己投与を含むが、これに限定されない。

【0021】

「対立遺伝子」は、遺伝子対の片方、又は、特定の染色体上の１つの遺伝子座又はマーカーに存在し得るＤＮＡ配列の、一連の異なる様式の１つのメンバーを意味する。二倍体生物若しくは細胞又は常染色体では、各対立遺伝子対は通常、一対の相同染色体上の対応する位置（遺伝子座）を占め、一つは母親から継承され、もう１つは父親から継承される。これらの対立遺伝子座が同じであれば、有機体又は細胞は、対立遺伝子に関して「ホモ接合的である」と称し、もし異なれば、有機体又は細胞は対立遺伝子に関して「ヘテロ接合的である」と称す。「メジャー対立遺伝子」は、ヒト集団のうち統計的に有意な割合の個体群に存在するヌクレオチドを含む対立遺伝子を指している。「マイナー対立遺伝子」は、ヒト集団のうち比較的少数の個体群に存在するヌクレオチドを含む対立遺伝子を指している。「野生型対立遺伝子」は、遺伝子産物の疾患又は機能障害に典型的には関連しない遺伝子型を指している。「突然変異対立遺伝子」は、遺伝子産物の疾患又は機能障害に関連する遺伝子型を指している。

【0022】

「対立遺伝子多様体」は、１つの遺伝子座に存在する遺伝子又はＤＮＡ配列のペアの片方を指している。例えば、対立遺伝子多様体は、メジャー対立遺伝子又はマイナー対立遺伝子のいずれかを指していることがある。

【0023】

「改善」は、関連する疾患、障害又は状態の少なくとも１つの兆し、兆候、症状を低下させることを指している。兆しの程度は、当業者に既知の主観的又は客観的測定により決定され得る。

【0024】

「動物」は、マウス、ラット、ラビット、犬、ネコ、豚、並びに、サル及びチンパンジーを含むがこれに限定されない非ヒト霊長類等のヒト又は非ヒト動物を指しているが、これに限定されない。

【0025】

「抗体」は、抗体と抗原が互いに相手に関して定められているという具合に、抗原と特異的に反応することにより特徴付けられる分子を指している。抗体は、重鎖、軽鎖、Ｆａｂ領域及びＦｃ領域等の完全な抗体分子又は任意の断片若しくはその領域を指す場合もある。

【0026】

「アンチセンス活性」は、アンチセンス化合物がその標的核酸にハイブリダイズすることに起因する、検出可能又は測定可能な任意の活性を意味する。ある実施形態では、アンチセンス活性とは、標的核酸又は標的核酸によりコードされるタンパク質の量又は発現を低下させることである。

【0027】

「アンチセンス化合物」は、水素結合により、標的核酸とハイブリダイズすることができるオリゴマー化合物を意味する。

【0028】

「アンチセンス阻害」は、アンチセンス化合物の不存在下における標的核酸のレベル又は標的タンパク質のレベルと比較して、標的核酸に対して相補的なアンチセンス化合物の存在下における標的核酸のレベル又は標的タンパク質のレベルを低減させることを意味する。

【0029】

「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸の対応する領域又はセグメントへのハイブリダイゼーションを可能にする核酸塩基配列を有する単鎖オリゴヌクレオチドを意味する。

【0030】

「二環式糖」は、２つの環原子の架橋により修飾されたフロシル環を意味する。二環式糖は、修飾された糖である。

【0031】

「二環式ヌクレオシド」は、糖環の２つの炭素原子を結合させて、二環式環系を形成するブリッジを含む糖部分を有するヌクレオシドのことである。ある実施形態では、ブリッジは、糖環の４’位炭素と２’位炭素を結合させる。

【0032】

「キャップ構造」又は「末端キャップ部分」は、アンチセンス化合物のいずれかの末端に組み込まれている化学的修飾を意味する。

【0033】

「ｃＥｔ」又は「拘束エチル」は、４’位炭素及び２’位炭素を結合し、化学式が４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’であるブリッジを含む糖部分を有する二環式ヌクレオシドのことである。

【0034】

「化学的に異なる領域」は、同じアンチセンス化合物の別の領域とは多少なりとも化学的に異なるアンチセンス化合物の領域を指している。例えば、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチドを有する領域は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾のないヌクレオチドを有する領域とは化学的に異なる。

【0035】

「キメラアンチセンス化合物」は、少なくとも２つの化学的に異なる領域を有するアンチセンス化合物を意味する。

【0036】

「共投与」は、個体に対し、２又はそれ以上の医薬剤を投与することを意味する。２又はそれ以上の医薬剤は、単一の医薬組成物でもよく、又は別々の医薬組成物であってもよい。２又はそれ以上の医薬剤は、同じ投与経路を通じて投与してもよく、又は異なる投与経路を通じて投与してもよい。併用又は連続投与も共投与に含まれる。

【0037】

「相補性」とは、第１の核酸と第２の核酸の核酸塩基対形成能を意味する。

【0038】

「近接する核酸塩基」とは、互いに直隣接である核酸塩基を意味する。

【0039】

「識別用多型」とは、核酸配列の野生型と突然変異対立遺伝子を識別できるヌクレオチド配列の多様性を意味する。識別用多型には、配列中の１若しくは小数のヌクレオチドの挿入若しくは欠失、又は配列中の１若しくは少数のヌクレオチドの変更が含まれ得る。識別用多型又は多型対立遺伝子は、１又は複数のその他の多型又は多型対立遺伝子と連鎖不平衡であり得る。

【0040】

「希釈剤」は、薬理活性を欠いているが、薬剤的に必要又は望ましい組成物の成分を意味する。例えば、注入された組成物の希釈剤は、生理食塩水等の液体であり得る。

【0041】

「用量」は、単回投与で、又は指定された期間の投与で提供される投薬量を意味する。ある実施形態では、用量は、１回、２回、又はそれ以上のボーラス、錠剤、又は注射により投与してもよい。例えば、皮下投与が望ましいある実施形態では、所望の投与量は、単回注射では容易に処置できない量であり、従って、所望の量を投与するために、２回又はそれ以上の注射投与を行ってもよい。ある実施形態では、長時間にわたり又は連続的に点滴注入により医薬剤を投入する。用量は、時間毎、日毎、週毎、又は月毎の投薬量としてもよい。

【0042】

「有効量」は、医薬剤を必要とする個体において所望の身体的効果を生じさせるのに十分な活性医薬剤の量を意味する。有効量は、治療対象である個体の健康及び身体的状態、治療対象である個体の分類学上のグループ、組成物の製剤、個体の医学的状態の評価、及びその他の関連する要因により、個体間で異なる。

【0043】

「完全に相補的である」又は「１００％相補的である」とは、第１の核酸の各核酸塩基が第２の核酸中に相補的核酸塩基を有することを意味する。ある実施形態では、第１の核酸はアンチセンス化合物であり、標的核酸は第２の核酸である。

【0044】

「ギャップマー（Ｇａｐｍｅｒ）」は、ＲＮａｓｅＨ切断をサポートする複数のヌクレオシドを有する内部領域が１又は複数のヌクレオシドを有する外部領域間に位置し、内部領域を構成するヌクレオシドは、外部領域を構成する１又は複数のヌクレオシドとは化学的に異なる、キメラアンチセンス化合物を意味する。内部領域は「ギャップ（ｇａｐ）」と称され、外部領域は、「ウィングス（ｗｉｎｇｓ）」と称される。

【0045】

「ギャップ拡大型（Ｇａｐ−ｗｉｄｅｎｅｄ）」とは、１〜６個のヌクレオシドを有する５’及び３’ウィングセグメントの間に、及び直隣接するよう位置づけられている、１２個又はそれ以上の近接２’−デオキシリボヌクレオシドのギャップセグメントを有するキメラアンチセンス化合物のことである。

【0046】

「遺伝子産物」は、遺伝子の発現の結果生じる、ＲＮＡ又はタンパク質等の生化学物質を指している。

【0047】

「ハプロタイプ」は、通常共に遺伝される、一染色体上の密接に関連する対立遺伝子群を意味する。例えば、染色体上の核酸配列の最初の部位にある多型対立遺伝子が、ランダムな相関（例えば、「連鎖均衡」）での予測とは異なる頻度で、同じ染色体上の２番目の部位の別の多型対立遺伝子と関連しているのが認められる場合がある。このような２つの多型対立遺伝子は、「連鎖不平衡」として記載され得る。ハプロタイプには、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上の対立遺伝子が含まれ得る。組み換えイベントが起こらない限り、染色体の所定のセグメント沿いのハプロタイプ中の対立遺伝子群は、一般的には共に子孫に継承される。

【0048】

「高度親和性糖修飾」は修飾された糖部分であり、糖部分がヌクレオシドに含まれ、ヌクレオシドがアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み入れられた場合、アンチセンスオリゴヌクレオチド：ＲＮＡ二本鎖の安定性（Ｔｍにより測定）が、ＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖の安定性に比べて増加する。

【0049】

「高度親和性糖修飾ヌクレオシド」は、修飾されたヌクレオシドを含むヌクレオシドであり、ヌクレオシドがアンチセンス化合物に組み入れられた場合、アンチセンス化合物の相補的ＲＮＡ分子に対する結合親和性（Ｔｍにより測定）が増加する、修飾された糖の部分を含むヌクレオシドである。本発明のある実施形態では、少なくとも１つの糖修飾高度親和性ヌクレオシドは、本明細書にその全体が引用により含まれるＦｒｅｉｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９７、２５、４４２９−４４４３）の記載による方法に従って決定される相補的ＲＮＡに対するヌクレオシド毎に少なくとも１〜４度の融解温度差ΔＴｍをもたらす。別の実施形態では、高度親和性糖修飾の少なくとも１つは、修飾毎に約２度若しくはそれ以上、３度若しくはそれ以上、又は４度若しくはそれ以上をもたらす。本発明のコンテキストにおいて、糖修飾高度親和性ヌクレオシドの実施例として、（ｉ）２’−置換及び４’〜２’二環式ヌクレオシドを含む、特定の２’−修飾ヌクレオシド、及び（ｉｉ）修飾されたテトラヒドロピラン及びトリシクロＤＮＡヌクレオシド等、修飾毎に結合親和性を増加させる他の特定の非リボフラノシルヌクレオシドが含まれるが、これらに限定されない。糖修飾高度親和性ヌクレオシドの他の修飾に関しては、Ｆｒｅｉｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９７、２５、４４２９−４４４３）を参照のこと。

【0050】

「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸分子のアニーリングを意味する。ある実施形態では、相補的核酸分子には、アンチセンス化合物及び標的核酸が含まれる。

【0051】

「直隣接の」とは、直接隣接する要素の間に介入するものが何も存在しないことである。

【0052】

「個体の」とは、治療又は療法のために選択されたヒト又は非ヒト動物のことである。

【0053】

「ヌクレオシド間連結」とは、ヌクレオシド間の化学結合のことである。

【0054】

「連結ヌクレオシド」とは、互いに結合する隣接のヌクレオシドのことである。

【0055】

「ミスマッチ」又は「非相補的核酸塩基」は、第１の核酸が第２の核酸又は標的核酸の対応する核酸塩基と対形成できないことを指している。

【0056】

「修飾ヌクレオシド間連結」は、自然発生するヌクレオシド間結合（すなわち、ホスホジエステルヌクレオシド間結合）の置換又は任意の変更を指している。

【0057】

「修飾核酸塩基」は、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、又はウラシル以外の任意の核酸塩基を指している。「非修飾核酸塩基」は、プリンベースのアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジンベースのチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を指している。

【0058】

「修飾ヌクレオチド」は、修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間連結、又は修飾核酸塩基を独立して有するヌクレオチドを意味する。「修飾ヌクレオシド」は、修飾糖部分又は修飾核酸塩基を独立して有するヌクレオシドを意味する。

【0059】

「修飾オリゴヌクレオチド」は、修飾ヌクレオシド間連結、修飾糖、又は修飾核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドを意味する。

【0060】

「修飾糖」は、天然の糖の置換又は変更を指している。

【0061】

「モチーフ」は、アンチセンス化合物の化学的に異なる領域のパターンを意味する。

【0062】

「自然に発生するヌクレオシド間連結」は、３’〜５’ホスホジエステル結合を意味する。

【0063】

「天然の糖部分」は、ＤＮＡ（２’−Ｈ）又はＲＮＡ（２’−ＯＨ）に認められる糖を意味する。

【0064】

「核酸分解酵素抵抗性修飾」は、オリゴヌクレオチドに組み入れられた場合、細胞核酸分解酵素（例えば、エキソ又はエンド核酸分解酵素）下でオリゴヌクレオチドがより安定的に分解されるようにする、糖修飾又は修飾ヌクレオシド間連結を意味する。核酸分解酵素抵抗性修飾の実施例として、ホスホロチオ酸ヌクレオシド間連結、二環式糖修飾、２’−修飾ヌクレオチド、又は中性のヌクレオシド間連結が含まれるが、これらに限定されない。

【0065】

「核酸」は、単量体のヌクレオチドで構成される分子を指している。核酸には、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、一本鎖核酸、二本鎖核酸、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれる。

【0066】

「核酸塩基」は、もう１つの核酸塩基と対形成できるヘテロ環式部分を意味する。

【0067】

「核酸塩基配列」は、任意の糖、連結、又は核酸塩基修飾から独立した隣接する核酸塩基の順序を意味する。

【0068】

「ヌクレオシド」は、糖に連結する核酸塩基を意味する。

【0069】

「模倣ヌクレオシド」は、糖又は糖と塩基を置換するために使用される構造を含み、例えばモルホリノ糖、シクロヘキセニル糖、シクロヘキシル糖、テトラヒドロピラニル糖、ビシクロ糖又はトリシクロ糖の模倣物、例えば、非フラノース糖ユニットを有するヌクレオシドの模倣物等のオリゴマー化合物の１又は複数の位置において必ずしも連結は認められない。模倣ヌクレオチドは、ヌクレオシドを置換するために使用される構造を含み、例えば、ペプチド核酸又はモルフォリノ類（−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は他の非ホスホジエステル連結に結合するモルフォリノ類）等のオリゴマー化合物の１又は複数の位置において連結が認められる。糖代用は、わずかに広義な模倣ヌクレオシドという用語と重複しているが、糖ユニット（フラノース環）の置換を示すことを意図したものである。本明細書で提供されるテトラヒドロピラニル環は、フラノース糖基がテトラヒドロピラニル環系で置換された糖代用の一例を示している。

【0070】

「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分と共有結合的に結合したリン酸基を有するヌクレオシドを意味する。

【0071】

「オリゴマー化合物」又は「オリゴマー」は、核酸分子の少なくとも１つの領域とハイブリダイズできる、連結された単量体サブユニットのポリマーを意味する。

【0072】

「オリゴヌクレオチド」は、それぞれが修飾又は非修飾であり得、互いに独立した、連結ヌクレオシドのポリマーを意味する。

【0073】

「非経口投与」は、注射又は注入による投与を意味する。非経口投与には、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は髄腔内若しくは脳室内投与等の頭蓋内投与が含まれる。

【0074】

「ペプチド」は、アミド結合により少なくとも２つのアミノ酸を連結することで形成される分子を意味する。ペプチドは、ポリペプチド及びタンパク質を指している。

【0075】

「医薬組成物」は、個体に投与するのに好適な物質の混合物を意味する。例えば、医薬組成物には、１又は複数の活性医薬剤及び滅菌水溶液が含まれ得る。

【0076】

「薬剤的に許容できる塩」は、生理的かつ薬剤的に許容できるアンチセンス化合物の塩、すなわち、親オリゴヌクレオチドの所望の生物活性を保有し、それに対し所望でない毒素学的効果を与えない塩を意味する。

【0077】

「ホスホロチオ酸連結」は、ホスホジエステル結合を、硫黄原子との非架橋酸素原子の１つと置き換えることにより修飾されたヌクレオシド間の連結を意味する。ホスホロチオ酸（Ｐ＝Ｓ）は、修飾ヌクレオシド間連結である。

【0078】

「部分」とは、核酸のうち定められた数の隣接（すなわち、連結）核酸塩基を意味する。ある実施形態では、１つの部分は、標的核酸のうち定められた数の隣接核酸塩基である。ある実施形態では、１つの部分は、アンチセンス化合物のうち定められた数の隣接核酸塩基である。

【0079】

「予防する」は、数分から無期限に至るまでの一定の期間における、疾患、障害、又は状態の発生又は発達を遅延又は未然に防ぐことを指している。予防はまた、疾患、障害又は状態の発達のリスクを低減することも意味する。

【0080】

「プロドラッグ」は、内在酵素若しくは他の化学物質の作用又は条件により、身体又はその細胞内で活性化する不活性な形態で調製された治療剤を意味する。

【0081】

「対立遺伝子多様体の発現を選択的に低減させる」とは、対立遺伝子群のうち他の異なる対立遺伝子よりも、ある対立遺伝子の発現を低減させることを意味する。例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む突然変異対立遺伝子を、ＳＮＰを含まない野生型対立遺伝子よりも多く低減され得る。

【0082】

「副作用」は、所望の効果以外の、治療に起因し得る身体的反応を意味する。ある実施形態では、副作用には、注射部位反応、肝機能検査の異常、腎機能異常、肝毒性、腎毒性、中枢神経系の異常、筋障害、及び倦怠感等が含まれる。例えば、血清アミノトランスフェラーゼ値の上昇は、肝臓毒性又は肝機能異常を示すことがある。例えば、ビリルビンの増加は、肝臓毒性又は肝機能異常を示している場合がある。

【0083】

「一塩基多型」又は「ＳＮＰ」は、同種の個体のゲノム間の一塩基の変動を意味する。いくつかの場合、ＳＮＰは一塩基の欠失又は挿入であり得る。一般に、ＳＮＰはゲノムで比較的頻繁に発生し、よって、遺伝的多様性に寄与している。ＳＮＰは、他の多型よりも突然変異としては安定しており、そのため、マーカーと未知の多様体間の連鎖不平衡を用いて疾患の原因となる突然変異をマッピングする関連研究に利用される。ＳＮＰの位置は、一般に、高度に保存された配列に隣接している。個体は、各ＳＮＰ部位の対立遺伝子に対してホモ接合的又はヘテロ接合的であり得る。ヘテロ接合的ＳＮＰ対立遺伝子は識別用多型となり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドでＳＮＰを標的対象とすることもできる。すなわち、ＳＮＰは、アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０とアニールする（又は、一致する）ということである。ハイブリダイゼーションを促進するためには、アンチセンスオリゴヌクレオチドの残りの塩基も、ＳＮＰ部位に対し十分な相補性を有していなければならない。

【0084】

「一塩基多型位置」又は「ＳＮＰ位置」は、参照配列上のＳＮＰのヌクレオチド位置を指している。

【0085】

「一塩基多型部位」又は「ＳＮＰ部位」は、アンチセンス化合物の標的対象である標的核酸に含まれるＳＮＰ周辺のヌクレオチドを指している。

【0086】

「一本鎖オリゴヌクレオチド」は、相補的鎖にハイブリダイズされないオリゴヌクレオチドを意味する。

【0087】

「特異的にハイブリダイズ可能な」とは、特異的結合が所望される条件下、すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ及び治療の場合は身体的条件下で、非標的核酸への効果が最小又は皆無であることを示しつつ、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸の間では所望の効果を導入するのに十分な度合いの相補性が存在するアンチセンス化合物を指している。

【0088】

「標的とする」又は「標的とされた」とは、標的核酸に特異的にハイブリダイズし、所望の効果を導入するアンチセンス化合物の設計及び選択の過程を意味する。

【0089】

「標的核酸」、「標的ＲＮＡ」、及び「標的ＲＮＡ転写」は全て、アンチセンス化合物の標的対象となり得る核酸を指している。

【0090】

「標的セグメント」は、アンチセンス化合物の標的対象となる標的核酸のヌクレオチド配列を意味する。例えば、本願の目的のためには、標的セグメントはＳＮＰ部位内に存在してもよい。「５’標的部位」は、標的セグメントの最も５’側ヌクレオチドを指している。「３’標的部位」は、標的セグメントの最も３’側ヌクレオチドを指している。

【0091】

「治療的有効量」は、個体に対し治療的有効性を与える医薬剤の量を意味する。

【0092】

「治療する」とは、疾患、障害、又は状態の変化又は改善を有効にする医薬組成物を投与することを指している。

【0093】

「非修飾ヌクレオチド」は、自然に発生する核酸塩基、糖部分、及びヌクレオシド間連結から成るヌクレオチドを意味する。ある実施形態では、非修飾ヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオチド（すなわち、β−Ｄ−リボヌクレオシド）又はＤＮＡヌクレオチド（すなわち、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド）である。

【発明を実施するための形態】

【0094】

本発明の実施形態は、遺伝子又はＤＮＡ配列の対立遺伝子多様体のｍＲＮＡ及びタンパク質発現を選択的に阻害するための方法、化合物、及び組成物を提供する。ある実施形態では、対立遺伝子多様体には、一塩基多型（ＳＮＰ）が含まれる。ある実施形態では、ＳＮＰは識別用多型である。ある実施形態では、ＳＮＰが突然変異対立遺伝子と関連している。ある実施形態では、ＳＮＰは、疾患と関連しているか、又は疾患の原因である別の多型と連鎖不平衡にある。ある実施形態では、突然変異対立遺伝子は疾患と関連している。ある実施形態では、突然変異対立遺伝子のｍＲＮＡ及びタンパク質発現が疾患と関連している。

【0095】

ある実施形態では、突然変異対立遺伝子の発現遺伝子産物は、疾患の原因である突然変異タンパク質凝集を生じさせる。ある実施形態では、突然変異対立遺伝子の発現遺伝子産物は、疾患の原因となる機能を獲得させる。

【0096】

ある実施形態では、突然変異対立遺伝子のｍＲＮＡ及びタンパク質発現の選択的低減は、アンチセンス化合物で突然変異対立遺伝子に位置するＳＮＰを標的とすることにより達成される。ある実施形態では、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。ある実施形態では、アンチセンス化合物は、リボザイム、二本鎖ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡではない。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１又は複数の修飾糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間連結を有してもよい。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＮＰ部位に対し相補的である。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＮＰ部位に対し相補的である。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＮＰ部位に対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相補的である。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＮＰ部位に対し１００％相補的である。ある実施形態では、ＳＮＰ部位は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０核酸塩基長である。ある実施形態では、ＳＮＰは、アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０とアニールする。

【0097】

ある実施形態では、ＳＮＰを含む遺伝子の対立遺伝子多様体を選択的に低減するよう設計されたアンチセンス化合物は、アンチセンス化合物の有効性及び選択性並びに集団遺伝学に基づいて作成される。

【0098】

ある実施形態では、ＳＮＰを含む遺伝子の対立遺伝子多様体のｍＲＮＡ及びタンパク質発現の選択的低減は、細胞又は組織で起こる。ある実施形態では、細胞又は組織は動物のである。ある実施形態では、動物はヒトである。

【0099】

ある実施形態では、突然変異ハンチンチン対立遺伝子の発現の選択的低減を必要とする動物において突然変異ハンチンチン対立遺伝子の発現を選択的に低減することを含むハンチントン病の治療法であって、１５〜２０の連結ヌクレオシドから成り、突然変異ハンチンチン対立遺伝子に対し完全に相補的である修飾オリゴヌクレオチドを含み、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５が、ｒｓ６４４６７２３、ｒｓ３８５６９７３、ｒｓ２２８５０８６、ｒｓ３６３０９２、ｒｓ９１６１７１、ｒｓ６８４４８５９、ｒｓ７６９１６２７、ｒｓ４６９００７３、ｒｓ２０２４１１５、ｒｓ１１７３１２３７、ｒｓ３６２２９６、ｒｓ１００１５９７９、ｒｓ７６５９１４４、ｒｓ３６３０９６、ｒｓ３６２２７３、ｒｓ１６８４３８０４、ｒｓ３６２２７１、ｒｓ３６２２７５、ｒｓ３１２１４１９、ｒｓ３６２２７２、ｒｓ３７７５０６１、ｒｓ３４３１５８０６、ｒｓ３６３０９９、ｒｓ２２９８９６７、ｒｓ３６３０８８、ｒｓ３６３０６４、ｒｓ３６３１０２、ｒｓ２７９８２３５、ｒｓ３６３０８０、ｒｓ３６３０７２、ｒｓ３６３１２５、ｒｓ３６２３０３、ｒｓ３６２３１０、ｒｓ１０４８８８４０、ｒｓ３６２３２５、ｒｓ３５８９２９１３、ｒｓ１９３６０３２、ｒｓ２２７６８８１、ｒｓ３６３０７０、ｒｓ１２５０２０４５、ｒｓ７６８５６８６、ｒｓ３７３３２１７、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ２８５７９３６、ｒｓ１２５０６２００、ｒｓ７６２８５５、ｒｓ４６９００７２、ｒｓ３６３０８１、ｒｓ３６３０７５、ｒｓ３０２５８４９、ｒｓ６８５５９８１、ｒｓ３６３１４４、ｒｓ３０２５８３８、ｒｓ２２９８９６９、ｒｓ３６２３２２、ｒｓ３６２３０７、ｒｓ３６２３０６、及びｒｓ１００６７９８から成る群における任意のＳＮＰ部位と一致する化合物を、動物に投与することを含むハンチントン病の治療法を記載する。

【0100】

ある実施形態では、１５〜２０連結ヌクレオシド長であり、ハンチンチンの一塩基多型を標的とし、配列番号６〜２８５のいずれか一つの核酸塩基配列の１２核酸塩基部分を含む修飾オリゴヌクレオチドを含み、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５が、ハンチンチンの一塩基多型と一致する化合物を記載する。

【0101】

ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、５−１０−５、２−９−６、３−９−３、３−９−４、３−９−５、４−７−４、４−９−３、４−９−４、４−９−５、４−１０−５、４−１１−４、４−１１−５、５−７−５、５−８−６、５−９−３、５−９−５、５−１０−４、５−１０−５、６−７−６、６−８−５、及び６−９−２から成る群の任意の１つのウイング−ギャップ−ウイングモチーフを含む。

【0102】

ある実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシド間連結が、修飾ヌクレオシド間連結である。ある実施形態では、各ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオ酸ヌクレオシド間連結である。

【0103】

ある実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシドには修飾核酸塩基が含まれる。ある実施形態では、修飾核酸塩基は、５’−メチルシトシンである。

【0104】

ある実施形態では、少なくとも１つのウィング領域の少なくとも１つのヌクレオシドには、修飾糖又は糖代用が含まれる。ある実施形態では、各ウィング領域の各ヌクレオシドには、修飾糖又は糖代用が含まれる。ある実施形態では、糖又は糖代用は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖である。ある実施形態では、少なくとも１つのウィング領域には、４’〜２’二環式ヌクレオシドが含まれ、残りのウィングヌクレオシドのうち少なくとも１つが、非二環式２’−修飾ヌクレオシドである。ある実施形態では、非二環式２’−修飾ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドである。ある実施形態では、４’〜２’二環式ヌクレオシドは、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’二環式ヌクレオシドである。

【0105】

ある実施形態では、１５〜２０の連結ヌクレオシド長であり、ハンチンチンの一塩基多型を標的とし、配列番号６〜２８５のいずれか一つの核酸塩基配列の１２核酸塩基部分を含む修飾オリゴヌクレオチドを含み、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５が、ハンチンチンの一塩基多型と一致する化合物を投与することを含む、突然変異ハンチンチンの選択的低減法を記載する。

【0106】

ある実施形態では、１５〜２０の連結ヌクレオシド長であり、ハンチンチンの一塩基多型を標的とし、配列番号６〜２８５のいずれか一つの核酸塩基配列の１２核酸塩基部分を含む修飾オリゴヌクレオチドを含み、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５が、ハンチントン病治療のためのハンチンチン一塩基多型と一致する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物の利用を記載する。

【0107】

一塩基多型（ＳＮＰ）
一塩基多型（ＳＮＰ）は、遺伝的異質性の主要なソースを表すＤＮＡ配列中における１塩基対の代替である（Ｇｅｎｅ．１９９９、２３４：１７７）。ＳＮＰ遺伝子型同定は、このような遺伝的多様体を調べるのに重要なツールである（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０００、１０：８９５；Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００、１８：７７）。ある実施形態では、ＳＮＰを含む遺伝子の対立遺伝子多様体を選択的に低減するよう設計されたアンチセンス化合物は、有用性、選択性、及び集団遺伝学の適用内容に基づき選択された。

【0108】

有効性
ある実施形態では、ＳＮＰを含む遺伝子の対立遺伝子多様体を選択的に低減するよう設計されたアンチセンス化合物は、アンチセンス化合物の有効性に基づいて作成される。有効性とは、一般に、標的配列領域のアンチセンス阻害に対する感受性を指している。ある実施形態では、特定のＳＮＰ部位は、アンチセンス阻害に特異的に敏感であり得る。そのような感受性の高い特定のＳＮＰ部位は、遺伝子の対立遺伝子多様体を選択的に低減するためのアンチセンス化合物の標的となり得る。有効性は、ベンチマークオリゴヌクレオチドによる突然変異体ｍＲＮＡの阻害度と比較した、ＳＮＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる突然変異体ｍＲＮＡの阻害度により示される。

【0109】

選択性
ある実施形態では、ＳＮＰを含む遺伝子の対立遺伝子多様体を選択的に低減するよう設計されたアンチセンス化合物は、アンチセンス化合物の選択性に基づき作成される。選択性とは、一般に、野生型ＨＴＴタンパク質をコードするＲＮＡと比べ、突然変異体ＨＴＴタンパク質をコードするＲＮＡ中の１又は複数の識別用多型（ＳＮＰ）を優先的に標的とする特定の配列、モチーフ、及び化学修飾を含むアンチセンス化合物を指している。ある実施形態では、特定の配列、モチーフ、及び化学修飾は、ＳＮＰを含む遺伝子の対立遺伝子多様体を低減するのに特異的に選択する。特定の配列、モチーフ、及び化学修飾は、遺伝子の対立遺伝子多様体を選択的に低減するのに利用される。選択性は、マイナー対立遺伝子又は野生型対立遺伝子と比較した、メジャー対立遺伝子又は突然変異対立遺伝子の発現を優先的に阻害するＳＮＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力により示される。

【0110】

集団遺伝学
ある実施形態では、ＳＮＰを含む遺伝子の対立遺伝子多様体を選択的に低減するよう設計されたアンチセンス化合物は、疾患を患う集団の集団遺伝学に基づき作成される。集団遺伝学とは、特定の疾患を患う患者の疾患染色体にＳＮＰが現れる頻度を意味する。ある実施形態では、疾患はハンチントン病である。アンチセンス化合物の有効性及び選択性が等しい場合、集団遺伝学的により関連性のあるＳＮＰ標的の方が、疾患染色体との関連が弱いＳＮＰよりも好ましい。

【0111】

アンチセンス化合物
オリゴマー化合物には、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、模倣オリゴヌクレオチド、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びｓｉＲＮＡｓが含まれてもよい。オリゴマー化合物は、標的核酸に対する「アンチセンス」でもよく、それはすなわち、水素結合により標的核酸をハイブリダイズできるということである。

【0112】

ある実施形態では、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。ある実施形態では、アンチセンス化合物は、リボザイム、二本鎖ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡではない。

【0113】

ある実施形態では、アンチセンス化合物は、５’から３’方向へ進む場合、標的対象である標的核酸の逆相補的標的セグメントを含む核酸塩基配列を有する。係る実施形態の特定の形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’から３’方向へ進む場合、標的対象である標的核酸の逆相補的標的セグメントを含む核酸塩基配列を有する。

【0114】

ある実施形態では、アンチセンス化合物は、１２〜３０サブユニット長である。言い換えれば、アンチセンス化合物は、１２〜３０連結サブユニットである。他の実施形態では、アンチセンス化合物は、８〜８０、１２〜５０、１５〜３０、１８〜２４、１９〜２２、又は２０連結サブユニットである。係る実施形態の特定の形態では、アンチセンス化合物は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、若しくは８０連結サブユニット長、又は上記の任意の２つの値により定められる範囲である。いくつかの実施形態では、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、連結サブユニットは、ヌクレオシドである。

【0115】

ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを短縮又は切断してもよい。例えば、単一サブユニットを、５’末端（５’トランケーション）、又は代わりに３’末端（３’トランケーション）から欠失させてもよい。核酸を標的とするアンチセンス化合物を短縮又は切断するのに、アンチセンス化合物の５’末端から２つのサブユニットを欠失させてもよく、又は代わりに、アンチセンス化合物の３’末端から２つのサブユニットをさせてもよい。その代替として、欠失ヌクレオシドをアンチセンス化合物内に分散させてもよく、例えば、１つのヌクレオシドを５’末端から欠失させ、もう１つのヌクレオシドを３’末端から欠失させたのでもよい。

【0116】

単一の追加サブユニットが、伸張されたアンチセンス化合物に存在する場合、追加サブユニットはアンチセンス化合物の５’末端又は３’末端に局在してもよい。２又はそれ以上の追加サブユニットが存在する場合、例えば、２つのサブユニットを５’末端に追加（５’末端挿入）するか、又は代わりに３’末端に追加（３’末端挿入）したアンチセンス化合物で、互いに隣接してもよい。その代替として、追加サブユニットをアンチセンス化合物内に分散させてもよく、例えば、１つのサブユニットを５’末端に挿入し、もう１つのサブユニットを３’末端に挿入したアンチセンス化合物でもよい。

【0117】

アンチセンスオリゴヌクレオチド等のアンチセンス化合物の長さを伸張若しくは短縮し、及び／又は活性を除去することなくミスマッチ塩基を導入することは可能である。例えば、Ｗｏｏｌｆら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：７３０５−７３０９、１９９２）は、一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドの１３〜２５核酸塩基長が、卵母細胞注入モデルで標的ＲＮＡの切断を誘導できるかどうかを試験した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの末端付近に８個又は１１個のミスマッチ塩基を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの２５核酸塩基長は、ミスマッチを含まないアンチセンスオリゴヌクレオチドと比べると程度では劣るが、標的ｍＲＮＡの特異的切断を導くことができた。同様に、１個又は３個のミスマッチを有するものを含め、１３核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、標的特異的切断が達成された。

【0118】

Ｇａｕｔｓｃｈｉら（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９３：４６３−４７１、３月号、２００１年）は、ｂｃｌ−２ｍＲＮＡに対し１００％相補性を有し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでｂｃｌ−２及びｂｃｌ−ｘＬ双方の発現を低減するｂｃｌ−ｘＬ ｍＲＮＡに対し３個ミスマッチを有するオリゴヌクレオチドの能力を示した。さらに、このオリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性である可能性を示した。

【0119】

ＭａｈｅｒとＤｏｌｎｉｃｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１６：３３４１−３３５８、１９８８）は、一連のタンデム型１４核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに、２個又は３個のタンデム型アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列から成る２８及び４２核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドそれぞれに対し、ウサギ網状赤血球アッセイにおいてヒトＤＨＦＲの翻訳を停止させる能力を試験した。３つの１４核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドはそれぞれ、２８又は４２核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドより程度は劣るが、単独で翻訳を阻害することができた。

【0120】

しかしながら、対立遺伝子多様体の発現の選択的低減は、標的核酸に含まれるＳＮＰが、アンチセンス化合物のミスマッチの塩基ではなく、相補的塩基とアニールする場合に最適となる。さらに、選択性は一般に、ＳＮＰ部位とアンチセンス化合物の間にほとんどミスマッチが存在しない場合に向上する。しかし、特定の数のミスマッチは許容範囲にあるといえる。

【0121】

アンチセンス化合物モチーフ
ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、阻害活性の強化、標的核酸への結合親和性の増加、又はｉｎ ｖｉｖｏ核酸分解酵素による分解への耐性等の特性をアンチセンス化合物に付与するために、パターンやモチーフを調整した化学修飾サブユニットを有する。

【0122】

キメラアンチセンス化合物には、典型的に、核酸分解酵素による分解への耐性の向上、細胞吸収の増加、標的核酸への結合性親和性の増加、及び／又は阻害活性の強化のために修飾された少なくとも１つの領域が含まれる。キメラアンチセンス化合物の第２領域は、任意選択的に、ＲＮＡ：ＤＮＡ複製のＲＮＡ鎖を切断する、細胞エンド核酸分解酵素ＲＮａｓｅＨの基質として機能し得る。

【0123】

ギャップマーモチーフを有するアンチセンス化合物は、キメラアンチセンス化合物と考えられる。ギャップマーでは、ＲＮａｓｅＨ切断をサポートする複数のヌクレオチドを有する内部領域が、内部領域のヌクレオシドとは化学的に異なる複数のヌクレオチドを有する外部領域の間に位置する。ギャップマーモチーフを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、ギャップセグメントは通常、エンド核酸分解酵素切断の基質として機能し、一方で、ウィングセグメントには修飾ヌクレオシドが含まれる。ＳＮＰを含む遺伝子の対立遺伝子多様体オリゴ発現を選択的に低減するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、ＳＮＰはギャップセグメント内で核酸塩基とアニールする。

【0124】

ある実施形態では、ＳＮＰは、アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４の核酸塩基とアニールするか、又はそれらに対し相補的である。この場合、ポジションとは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えた、アンチセンスオリゴヌクレオチド内の核酸塩基の定位を指している。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド内の最も５’末端側核酸塩基は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの最初のポジションにある。ある実施形態では、ＳＮＰは、（５’末端から数えて）アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション６、７、８、９、又は１０にある核酸塩基とアニールするか、又はそれらに対し相補的である。ある実施形態では、ＳＮＰは、（５’末端から数えて）アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション９又は１０にある核酸塩基とアニールするか、又はそれらに対し相補的である。

【0125】

ある実施形態では、ＳＮＰは、ギャップセグメントのポジション１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０にある核酸塩基とアニールする。この場合ポジションは、ギャップセグメントの５’末端から数えて、ギャップセグメント内の核酸塩基の定位を指している。例えば、ギャップセグメント内の最も５’末端側核酸塩基は、ギャップセグメントの最初のポジションにある。ある実施形態では、ＳＮＰは、ギャップセグメントの５’末端から数えてポジション４、５、６、又は７にある核酸塩基とアニールする。ある実施形態では、ＳＮＰは、ギャップセグメントの５’末端から数え始めて４又は５番目のポジションにある核酸塩基とアニールする。

【0126】

ある実施形態では、ギャップマーの領域は、それぞれ異なる領域を含む糖部分のタイプにより区別される。ある実施形態では、ギャップマーの領域を区別するために用いられる糖部分のタイプには、β−Ｄ−リボヌクレオシド、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド、２’−修飾ヌクレオシド（２’−修飾ヌクレオシドには、とりわけ、２’−ＭＯＥ及び２’−Ｏ−ＣＨ_３が含まれてもよい）、及び二環式糖修飾ヌクレオシド（二環式糖修飾ヌクレオシドには、４’−（ＣＨ_２）_ｎＯ−２’ブリッジを有するものが含まれてもよく、式中、ｎ＝１又はｎ＝２である）が含まれ得る。二環部分は、化学式４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’を有するｃＥｔであってもよい。

【0127】

ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、しばしば「Ｘ−Ｙ−Ｚ」と記述され、「Ｘ」は５’ウィング領域の長さを表し、「Ｙ」はギャップ領域の長さを表し、「Ｚ」は、３’ウィング領域の長さを表している。本明細書で使用される、「Ｘ−Ｙ−Ｚ」と記載されるギャップマーは、ギャップセグメントが５’ウィングセグメント及び３’ウィングセグメントそれぞれに直隣接するよう位置づけられた配置を有している。よって、５’ウィングセグメントとギャップセグメントの間に、又はギャップセグメントと３’ウィングセグメントの間に媒介ヌクレオチドは存在しない。本明細書に記載の任意のアンチセンス化合物は、ギャップマーモチーフを有し得る。いくつかの実施形態では、Ｘ及びＺは同じであり、他の実施形態では、それらは異なる。ある実施形態では、Ｙは８ヌクレオチドと１５ヌクレオチドの間である。ある実施形態では、Ｙはデオキシヌクレオチドから成る。Ｘ、Ｙ、又はＺは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、又はそれ以上のヌクレオチドのいずれかであり得る。よって、本発明のギャップマーには、例えば、１−１０−１、１−１８−１、２−８−２、２−９−６、２−１０−２、２−１３−５、２−１６−２、３−９−３、３−９−５、３−１０−３、３−１４−３、４−８−４、４−９−５、４−１０−５、４−１１−４、４−１２−３、４−１２−４、５−８−５、５−９−５、５−１０−４、５−１０−５、又は６−８−６が含まれるが、これらに限定されない。

【0128】

ある実施形態では、アンチセンス化合物には、ウィングギャップ又はギャップ−ウィング配置、すなわち、上記のギャップマー配置のＸ−Ｙ又はＹ−Ｚ配置を有する「ウィングマー」モチーフが存在する。よって、本発明のウィングマー配置には、例えば、５−１０、８−４、４−１２、１２−４、３−１４、１６−２、１８−１、１０−３、２−１０、１−１０、８−２、２−１３、５−１３、５−８、又は６−８が含まれるが、これらに限定されない。

【0129】

ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、２−９−６ギャップマーモチーフ又は６−９−２ギャップマーモチーフを有する。

【0130】

ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、３−９−３ギャップマーモチーフを有する。

【0131】

ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、３−９−５ギャップマーモチーフ又は５−９−３ギャップマーモチーフを有する。

【0132】

ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、４−９−５ギャップマーモチーフ又は５−９−４ギャップマーモチーフを有する。

【0133】

ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、４−１０−５ギャップマーモチーフ又は５−１０−４ギャップマーモチーフを有する。

【0134】

ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、４−１１−４ギャップマーモチーフを有する。

【0135】

ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、５−９−５ギャップマーモチーフを有する。

【0136】

ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、５−８−６ギャップマーモチーフ又は６−８−５ギャップマーモチーフを有する。

【0137】

ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、６−７−６ギャップマーモチーフを有する。

【0138】

ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、６−８−５ギャップマーモチーフ又は５−８−６ギャップマーモチーフを有する。

【0139】

ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、３−９−４ギャップマーモチーフ又は４−９−３ギャップマーモチーフを有する。

【0140】

ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、５−７−５ギャップマーモチーフを有する。

【0141】

ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、４−７−４ギャップマーモチーフを有する。

【0142】

ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、５−１０−５ギャップマーモチーフを有する。

【0143】

ある実施形態では、核酸を標的とするアンチセンス化合物は、ギャップ拡大型モチーフを有する。

【0144】

特定の混合ウィング
ある実施形態では、本発明は、１つのウィングの少なくとも１つのヌクレオシドに、同じウィングの少なくとも１つの他のヌクレオシドと比較して、異なる修飾が施されているギャップマー化合物を提供する。このアンチセンス化合物は、混合ウィングアンチセンス化合物と称される（国際公開第２００８／０４９０８５号を参照のこと）。ある実施形態では、３’ウィングの１又は複数のヌクレオシドの修飾（又は非修飾）は、３’ウィングの１又は複数の他のヌクレオシドの修飾（又は非修飾）とは異なる。このアンチセンス化合物は、３’混合ウィングギャップマーと称され得る。ある実施形態では、５’ウィングの１又は複数のヌクレオシドの修飾（又は非修飾）は、５’ウィングの１又は複数の他のヌクレオシドの修飾（又は非修飾）と異なる。このアンチセンス化合物は、５’混合ウィングギャップマーと称され得る。ある実施形態では、３’ウィングの１又は複数のヌクレオシドの修飾（又は非修飾）は、３’ウィングの１又は複数の他のヌクレオシドの修飾（又は非修飾）と異なり、５’ウィングの１又は複数のヌクレオシドの修飾（又は非修飾）は、５’ウィングの１又は複数の他のヌクレオシドの修飾（又は非修飾）とは異なる。このアンチセンス化合物は、３’、５’混合ウィングギャップマーと称され得る。係る実施形態では、３’ウィングと５’ウィングにおける修飾及び修飾の組み合わせは、同じであってもよく、又は異なってもよい。

【0145】

ある実施形態では、混合ウィング化合物は所望の特性を有する。特定のヌクレオシド修飾は、アンチセンス化合物に所望の特性、例えば、標的ヘの親和性向上又は核酸分解酵素耐性を付与するだけでなく、毒素性の増加等の望ましくない特性ももたらす。特定の他のヌクレオシド修飾を組み入れる結果、異なる特性プロファイルを有するアンチセンス化合物となる。ある実施形態では、所望の特徴を最適化し、及び／又は望ましくない特徴を最小化するために、片方又は両方のウィングで修飾を組み合わせることもできる。ある実施形態では、混合ウィングアンチセンス化合物のウィングには、非修飾ヌクレオシドを含むアンチセンス化合物と比べて、標的核酸用アンチセンス化合物の親和性を増加させる第１の修飾を含む１又は複数のヌクレオシドが含まれ、また、全てに第１の修飾が含まれるヌクレオシドを含有するウィングを有するアンチセンス化合物と比べて、毒素性の低減をもたらす第２の修飾が含まれる１又は複数のヌクレオシドが含まれる。

【0146】

ある実施形態では、アンチセンス化合物には、少なくとも１つのＭＯＥ置換ヌクレオシド及び少なくとも１つの高度親和性修飾が含まれる少なくとも１つのウィングが含まれる。ある実施形態では、少なくとも１つのＭＯＥ置換ヌクレオシド及び少なくとも１つの高度親和性は、３’ウィングに存在する。係る実施形態の特定の形態では、少なくとも１つのＭＯＥ置換ヌクレオシド及び少なくとも１つの高度親和性は、５’ウィングに存在する。

【0147】

ある実施形態では、アンチセンス化合物は、５’ウィング及び／又は３’ウィングに、１、２、又は３個の高度親和性修飾を含む。

【0148】

標的核酸、標的領域及びヌクレオチド配列
ある実施形態では、ハンチンチンの対立遺伝子多様体は選択的に低減される。ハンチンチンをコードするヌクレオチド配列には、以下が含まれるが、これらに限定されない。すなわち、１５６６０００〜１７６８０００のヌクレオチドから切断され（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿００６０５１と置換）、配列番号１として本明細書に組み入れられたＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＴ＿００６０８１．１８、及び配列番号２として本明細書に組み入れられたＮＭ＿００２１１１．６である。

【0149】

本明細書に含まれる実施形態の各配列番号に記載の配列は、糖部分に対する任意の修飾、ヌクレオシド間連結、又は核酸塩基からは独立していると理解される。そのように、配列番号により定義されるアンチセンス化合物には、糖部分に対する１又は複数の修飾、ヌクレオシド間連結、又は核酸塩基が独立して含まれ得る。Ｉｓｉｓ番号（Ｉｓｉｓ Ｎｏ）により記載されるアンチセンス化合物は、核酸塩基配列及びモチーフの組み合わせを示す。

【0150】

ある実施形態では、標的領域は、構造的に定義される標的核酸の領域である。例えば、標的核酸には、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、エキソン、イントロン、エキソン／イントロン交差、コード領域、翻訳開始領域、翻訳終了領域、又はその他に定義される核酸領域が含まれ得る。構造的に定義されるハンチンチン領域は、ＮＣＢＩ等の配列データベースからアクセッション番号により入手可能であり、係る情報は、本明細書に引用により組み入れられる。ある実施形態では、標的領域には、標的領域内の１つの標的セグメントの５’標的部位から、同じ標的領域内の別の標的セグメントの３’標的部位までの配列が含まれ得る。

【0151】

標的決定には、所望の効果を生じるよう、アンチセンス化合物がハイブリダイズする少なくとも１つの標的セグメントの決定が含まれる。ある実施形態では、所望の効果は、特定の対立遺伝子多様体のｍＲＮＡ標的核酸レベルの低減である。ある実施形態では、所望の効果は、標的核酸によりコードされるタンパク質のレベル又は特定の対立遺伝子多様体に関連する表現型変異の低減である。

【0152】

標的領域には、１又は複数の標的セグメントが含まれる。標的領域内の複数の標的セグメントは、重複してもよい。それに代わり、標的領域内の複数の標的セグメントは、重複していなくてもよい。ある実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、約３００個以下のヌクレオチドで分離される。ある実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上の約２５０個、約２００個、約１５０個、約１００個、約９０個、約８０個、約７０個、約６０個、約５０個、約４０個、約３０個、約２０個、若しくは約１０個、又は各個数以下の、又はおよそ各個数以下の、又はこれら任意の２つの値により定められる範囲の個数のヌクレオチドで分離される。ある実施形態では標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上の５個以下又は約５個以下のヌクレオチドで分離される。ある実施形態では、標的セグメントは隣接している。本明細書に列記される任意の５’標的部位又は３’標的部位のいずれかが核酸の開始点となる範囲により定義される標的領域について考察が行われる。

【0153】

好適な標的セグメントは、５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、イントロン、エキソン、又はエキソン／イントロン交差内に認められる。開始コドン又は終止コドンを含む標的セグメントも好適な標的セグメントでもある。好適な標的セグメントは、開始コドン又は終止コドン等、構造的に定義される特定の領域を特異的に排除することもできる。

【0154】

好適な標的セグメントの決定には、ゲノム全体の中で、標的核酸配列とその他の配列を比較することが含まれる。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、異なる核酸間の類似領域を同定できる。この比較により、選択された標的核酸以外の配列（すなわち、非標的配列又は対象外配列）に非特異的にハイブリダイズできるアンチセンス化合物配列の選択を防ぐことができる。

【0155】

細胞株
ある実施形態では、以下に記載の実験において、ＧＭ０４２８１細胞株、ＧＭ０２１７１細胞株、及びＧＭ０２１７３Ｂ細胞株が使われる。ＧＭ０４２８１細胞株は、１７リピートを含む野生型ＨＴＴ対立遺伝子及び６９リピートを含む突然変異ＨＴＴ対立遺伝子を有する。細胞株は、両親もまた疾患を患う患者由来である。ＧＭ０２１７１細胞株は、ＧＭ０４２８１に対する対照群として選ばれた。この細胞株は、片親のみ疾患を有する娘由来である。この娘はＨＤを発症していないが、発症リスクありと考えられた。ＧＭ０２１７３Ｂ細胞株も患者由来であり、ハプロタイプ試験の対照として使用された。

【0156】

表１は、ＧＭ０４２８１細胞株、ＧＭ０２１７１細胞株、及びＧＭ０２１７３Ｂ細胞株で発見されたＳＮＰを示している。また、各ＳＮＰ位置で発見された対立遺伝子多様体、各細胞株の遺伝子型、及び特定の対立遺伝子多様体を有するＨＤ患者の割合も示している。例えば、ＳＮＰｒｓ６４４６７２３の２つの対立遺伝子多様体はＴとＣである。ＧＭ０２１７１細胞株は、ホモ接合型ＣＣであり、ＧＭ０２１７３細胞株は、ヘテロ接合型ＴＣであり、ＧＭ０４２８１細胞株は、ホモ接合型ＴＴである。ＨＤ患者の５０％が、ＳＮＰ位置ｒｓ６４４６７２３にＴを有している。

【0157】

【表1-1】

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【表1-2】

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【0158】

ハイブリダイゼーション
いくつかの実施形態では、本明細書で開示するアンチセンス化合物とＳＮＰ部位の間でハイブリダイゼーションが起こる。ハイブリダイゼーションの最も一般的なメカニズムは、核酸分子の相補的核酸塩基間の水素結合（例えば、ワトソン−クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合等）を含む。

【0159】

ハイブリダイゼーションは、様々な状況下で起こり得る。ストリンジェント条件は配列に依存し、ハイブリダイゼーション対象の核酸分子の性質及び構成により決定する。

【0160】

ある実施形態では、本明細書で提供するアンチセンス化合物は、特定の対立遺伝子多様体の核酸と特異的にハイブリダイズする。

【0161】

相補性
所望の効果（例えば、対立遺伝子多様体の遺伝子産物の選択的低減）を生じるよう相当数のアンチセンス化合物の核酸塩基が、標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合し得る場合、アンチセンス化合物及び標的核酸は互いに相補的である。

【0162】

アンチセンス化合物と標的核酸の間の非相補的核酸塩基は、アンチセンス化合物が標的核酸と特異的にハイブリダイズできる状態が維持される限り、許容され得る。さらに、アンチセンス化合物は、介入セグメント又は隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないよう（例えば、ループ構造、ミスマッチ又はヘアピン構造）、１又は複数の標的核酸のセグメントとハイブリダイズすることもできる。

【0163】

ある実施形態では、本明細書で提供するアンチセンス化合物、又はその特異的部分は、標的核酸、標的領域、標的セグメント、ＳＮＰ部位、又はその特異的部分に対し、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％相補的であるか、又は少なくともそうである。標的核酸を有するアンチセンス化合物の相補性割合は、通常の方法により決定し得る。例えば、アンチセンス化合物の２０個の核酸塩基のうち１８個が標的領域と相補的であり、よって特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物は、９０％の相補性を表す。本実施例において、残りの非相補的核酸塩基をクラスター化してもよく、又は相補的核酸塩基と共に分散させてもよく、互いに又は相補的核酸塩基と隣接する必要はない。そのように、標的核酸に対し完全に相補的である２つの領域と隣接する４つの非相補的核酸塩基を有する１８核酸塩基長であるアンチセンス化合物は、標的核酸に対し総じて７７．８％相補的であり、よって本発明の範囲内に該当する。標的核酸の領域を有するアンチセンス化合物の相補性割合は、通常用いられるＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局所的アラインメントサーチツール）及び当技術分野で既知のＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０、２１５、４０３−４１０；ＺｈａｎｇとＭａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７、７、６４９−６５６）により決定され得る。相同性割合、配列同一性又は相補性は、例えば、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１、２、４８２−４８９）のアルゴリズムを使用し、Ｇａｐプログラム（ウィスコンシン配列解析パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ）、Ｕｎｉｘ用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ社、ウィスコンシン州マジソン、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ）のデフォルト設定により決定し得る。

【0164】

ある実施形態では、本明細書で提供されるアンチセンス化合物、又はその特異的部分は、標的核酸、ＳＮＰ部位、標的領域、標的セグメント、又はその特異的部分に対して完全に相補的（すなわち、１００％相補的）である。本明細書で使用される「完全に相補的」は、アンチセンス化合物の各核酸塩基が、標的核酸の対応する核酸塩基と正確な塩基対を形成し得るという意味である。例えば、２０核酸塩基アンチセンス化合物は、アンチセンス化合物に対し完全に相補的である標的核酸の対応する２０核酸塩基部分が存在すれば、４００核酸塩基長である標的配列に対して完全に相補的である。完全に相補的であるという用語はまた、第１及び／又は第２の核酸の特異的部分に関連して用いられ得る。例えば、３０核酸塩基アンチセンス化合物の２０核酸塩基部分は、４００核酸塩基長である標的配列に対して「完全に相補的」であり得る。もし標的配列が対応する２０核酸塩基部分を有し、各核酸塩基がアンチセンス化合物の２０核酸塩基部分に対し相補的であるなら、３０核酸塩基オリゴヌクレオチドの２０核酸塩基部分は標的配列に対して完全に相補的である。同時に、３０核酸塩基アンチセンス化合物全体が標的配列に対して完全に相補的であってもなくてもよいが、それは、アンチセンス化合物の残りの１０核酸塩基も標的配列に対して相補的であるかどうかによる。

【0165】

非相補的核酸塩基の位置は、アンチセンス化合物の５’末端又は３’末端であり得る。その代わりとして、１又は複数の非相補的核酸塩基は、アンチセンス化合物内の位置であってもよい。２又はそれ以上の非相補的核酸塩基が存在する場合、隣接（すなわち、連結）又は非隣接であってもよい。１つの実施形態では、非相補的核酸塩基はギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドのウィングセグメントに局在する。

【0166】

ある実施形態では、核酸塩基長が１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０、又はそれ以下であるアンチセンス化合物には、標的核酸、ＳＮＰ部位、又はその特異的部分と関連する６以下、５以下、４以下、３以下、２以下又は１以下の非相補的核酸塩基が含まれる。

【0167】

ある実施形態では、核酸塩基長が１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０、又はそれ以下であるアンチセンスオリゴヌクレオチドには、標的核酸、ＳＮＰ部位、又はその特異的部分と関連する６以下、５以下、４以下、３以下、２以下又は１以下の非相補的核酸塩基が含まれる。

【0168】

本明細書で提供されるアンチセンス化合物にはまた、標的核酸の部分に対して相補的なものが含まれる。本明細書で使用される「部分」は、標的核酸の領域又はセグメント内の定められた数の隣接（すなわち、連結）核酸塩基を指している。「部分」はまた、アンチセンス化合物の定められた数の隣接核酸塩基を指し得る。ある実施形態では、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも８核酸塩基部分に対し相補的である。ある実施形態では、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも１２核酸塩基部分に対して相補的である。ある実施形態では、アンチセンス化合物は、標的セグメントの少なくとも１５核酸塩基部分に対し相補的である。標的セグメントの少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、若しくはそれ以上の核酸塩基部分、又はこれら数値の任意の２つの値により定められる範囲に対し相補的であるアンチセンス化合物についても考察が行われる。

【0169】

同一性
本明細書で提供されるアンチセンス化合物はまた、特定のヌクレオチド配列、配列番号、又は特定のＩｓｉｓ番号で表される化合物若しくはその部分により表される化合物に対し、定められた割合の同一性を有し得る。本明細書で使用されるように、アンチセンス化合物は、核酸塩基の対形成能が同じであれば、本明細書で開示する配列に対して同一である。例えば、開示されるＤＮＡ配列のチミジンの代わりにウラシルを含むＲＮＡは、ウラシルとチミジン双方ともアデニンと対形成するため、ＤＮＡ配列と同一であると考えられる。本明細書に記載のアンチセンス化合物の短縮版又は伸張版、並びに本明細書で提供されるアンチセンス化合物と関連する非同一塩基を有する化合物についても考察が行われる。非同一塩基は互いに隣接してもよく、又はアンチセンス化合物全体に分散してもよい。アンチセンス化合物の同一性割合は、比較対象の配列と関連する同一の塩基対形成を有する塩基数に従って算出される。

【0170】

ある実施形態では、アンチセンス化合物、又はその部分は、本明細書で開示される１又は複数のアンチセンス化合物又は配列番号、又はその部分に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である。

【0171】

ある実施形態では、アンチセンス化合物の部分は、標的核酸の等長部分と比較される。ある実施形態では、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５核酸塩基部分を、標的核酸の等長部分と比較する。

【0172】

ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの部分は、標的核酸の等長部分と比較される。ある実施形態では、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５核酸塩基部分を、標的核酸の等長部分と比較する。

【0173】

修飾
ヌクレオシドは、塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの核酸塩基（塩基ともいう）部分は、通常、ヘテロ環式塩基部分である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合的に連結するリン酸基をさらに含んだヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むこれらヌクレオシドでは、リン酸基は、糖の２’、３’又は５’ヒドロキシ部分と連結し得る。オリゴヌクレオチドは、互いに隣接するヌクレオシドを共有結合的に連結させて形成され、線状高分子オリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチド構造において、リン酸基は一般にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結を形成するものと称される。

【0174】

アンチセンス化合物の修飾には、ヌクレオシド間連結、糖部分、若しくは核酸塩基の置換又は変更が含まれる。例えば、細胞取込の向上、核酸標的への親和性向上、核酸分解酵素存在下での安定性向上、又は阻害活性の向上等の所望の特性の故に、修飾アンチセンス化合物は天然様式よりも好まれることが多い。

【0175】

化学的に修飾されたヌクレオシドはまた、標的核酸を対象とする短縮又は切断されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性を向上させるために用いられ得る。その結果、より短いアンチセンス化合物でも化学修飾ヌクレオシドを有するのであれば、同等の結果が得られ得る。

【0176】

化学修飾ヌクレオシドはまた、対立遺伝子多様体の遺伝子産物の発現低減における選択性を向上させるためにも用いられ得る。

【0177】

修飾ヌクレオシド間連結
ＲＮＡ及びＤＮＡの天然に発生するヌクレオシド間連結は、３’から５’へのホスホジエステル連結である。例えば、細胞取込みの向上、標的核酸への親和性向上、及び核酸分解酵素存在下での安定性向上等の所望の特性の故に、天然発生ヌクレオシド間連結を有するアンチセンス化合物よりも、１又は複数の修飾ヌクレオシド間連結、すなわち、非天然発生のヌクレオシド間連結を有するアンチセンス化合物が選ばれることが多い。

【0178】

修飾ヌクレオシド間連結を有するオリゴヌクレオチドには、リン原子を持つヌクレオシド間連結、並びにリン原子を持たないヌクレオシド間連結が含まれる。典型的なリン含有ヌクレオシド間連結には、ホスホジエステル類、ホスホトリエステル類、メチルホスホン酸類、ホスホロアミド酸、及びホスホロチオ酸が含まれるが、これらに限定されない。リン含有及び非リン含有連結の製造方法は周知である。

【0179】

ある実施形態では、アンチセンス化合物には、１又は複数の修飾ヌクレオシド間連結が含まれる。ある実施形態では、修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオ酸連結である。ある実施形態では、アンチセンス化合物の各ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオ酸ヌクレオシド間連結である。

【0180】

修飾糖部分
本発明のアンチセンス化合物には、糖基が修飾された、１又は複数のヌクレオシドが任意選択的に含まれ得る。糖修飾ヌクレオシドは、アンチセンス化合物に対し、核酸分解酵素安定性の向上、結合親和性の増加、対立遺伝子多様体の選択性の向上、又はその他いくつかの有益な生物特性をもたらす可能性がある。ある実施形態では、ヌクレオシドには、化学的に修飾されたリボフラノース環部分が含まれる。化学的に修飾されたリボフラノース環の実施例として、置換基（５’及び２’置換基、二環式核酸（ＢＮＡ）を形成する非ジェミナル環原子の架橋、リボシル環の酸素原子のＳ、Ｎ（Ｒ）又はＣ（Ｒ１）（Ｒ）２との置換（Ｒ＝Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル又は保護基）及びそれらの組み合わせを含む）の挿入が含まれるが、これらに限定されない。化学修飾糖の実施例には、２’−Ｆ−５’−メチル置換ヌクレオシド（その他の開示された５’、２’−ｂｉｓ置換ヌクレオシドに関しては、２００８年８月２１日に公開されたＰＣＴ国際出願の国際公開第２００８／１０１１５７号を参照のこと）又はリボシル環の酸素原子をＳと、さらに２’位置換（２００５年６月１６日に公開された米国特許出願公開第２００５−０１３０９２３号を参照のこと）又は、代替としてＢＮＡの５’位置換（２００７年１１月２２日に公開されたＰＣＴ国際出願の国際公開第２００７／１３４１８１号では、ＬＮＡが、例えば、５’−メチル又は５’−ビニル基で置換されている）が含まれる。

【0181】

修飾糖部分を有するヌクレオシドの実施例として、５’−ビニル、５’−メチル（Ｒ又はＳ）、４’−Ｓ、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３及び２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３置換基を含むヌクレオシドが含まれるが、これらに限定されない。２’位置換基はまた、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ＯＣＦ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、及びＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択され得、式中Ｒｍ及びＲｎはそれぞれ、独立して、水素又は置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルである。

【0182】

本明細書で使用される「二環式ヌクレオシド」は、二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドを指している。二環式ヌクレオシドの実施例には、４’と２’リボシル環原子間のブリッジを含有するヌクレオシドが含まれるが、これに限定されない。ある実施形態では、本明細書で提供されるアンチセンス化合物には、ブッリジに４’〜２’二環式ヌクレオシドが含まれる、１又は複数の二環式ヌクレオシドが含まれる。該４’〜２’二環式ヌクレオシドの実施例として、以下の化学式のうち１つが含まれるが、これらに限定されない。すなわち、４’−（ＣＨ_２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）；４’−（ＣＨ_２）−Ｓ−２’；４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）；４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’及び４’−Ｃ−Ｈ（ＣＨ_２ＯＣＨ_３）−Ｏ−２’（及びその類似体；２００８年７月１５日に発行された米国特許第７，３９９，８４５号を参照のこと）；４’−Ｃ（ＣＨ_３）（ＣＨ_３）−Ｏ−２’（及びその類似体；２００９年１月８日に公開された国際公開第２００９／００６４７８号を参照のこと）；４’−ＣＨ_２−Ｎ（ＯＣＨ_３）−２’（及びその類似体；２００８年１２月１１日に公開された国際公開第２００８／１５０７２９号を参照のこと）；４’−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−２’（２００４年９月２日に公開された米国特許出願公開第２００４−０１７１５７０号を参照のこと）；Ｒが水素、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、又は保護基である４’−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（２００８年９月２３日に発行された米国特許第７，４２７，６７２号を参照のこと）；４’−ＣＨ_２−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ_３）−２’（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００９、７４、１１８−１３４を参照のこと）；及び４’−ＣＨ_２−Ｃ（＝ＣＨ_２）−２’（及びその類似体；２００８年１２月８日に公開された国際公開第２００８／１５４４０１号を参照のこと）である。例えば、Ｓｉｎｇｈら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９８、４、４５５−４５６；Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９８、５４、３６０７−３６３０；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０００、９７、５６３３−５６３８；Ｋｕｍａｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９８、８、２２１９−２２２２；Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９８、６３、１００３５−１００３９；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２９（２６）８３６２−８３７９（２００７年７月４日）；米国特許第７，０５３，２０７号；第６，２６８，４９０号；第６，７７０，７４８号；第６，７９４，４９９号；第７，０３４，１３３号；及び第６，５２５，１９１号；Ｅｌａｙａｄｉら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｎｓ．Ｄｒｕｇｓ、２００１、２、５５８−５６１；Ｂｒａａｓｃｈら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２００１、８、１−７；及びＯｒｕｍら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２００１、３、２３９−２４３；及び米国特許第６，６７０，４６１号；国際公開第２００４／１０６３５６号；国際公開第９４／１４２２６号；国際公開第２００５／０２１５７０号；米国特許出願公開第２００４−０１７１５７０号；米国特許出願公開第２００７−０２８７８３１号；米国特許出願公開第２００８−００３９６１８号；米国特許第７，３９９，８４５号；米国特許出願第１２／１２９，１５４号；第６０／９８９，５７４号；第６１／０２６，９９５号；第６１／０２６，９９８号；第６１／０５６，５６４号；第６１／０８６，２３１号；第６１／０９７，７８７号；第６１／０９９，８４４号；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１号；ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６１５４号；ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８９２２号；及びＰＣＴ国際出願の国際公開第２００７／１３４１８１号を参照のこと。前記二環式ヌクレオシドは、例えば、α−Ｌ−リボフラノース及びβ−Ｄ−リボフラノース及びβ−Ｄ−リボフラノースを含む、１又は複数の立体化学糖配置を有するよう調製され得る（国際出願ＰＣＴ／ＤＫ９８／００３９３、１９９９年３月２５日に国際公開第９９／１４２２６号として公開）。

【0183】

ある実施形態では、ＢＮＡヌクレオシドの二環式糖部分には、ペントフラノシル糖部分の４’位と２’位の間に少なくとも１つのブリッジを有する化合物が含まれるがこれに限定されず、ブリッジは、−［Ｃ（Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）］_ｎ−、−Ｃ（Ｒ_ａ）＝Ｃ（Ｒ_ｂ）−、−Ｃ（Ｒ_ａ）＝Ｎ−、−Ｃ（＝ＮＲ_ａ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒ_ａ）_２−、−Ｓ（＝Ｏ）_ｘ−、及び−Ｎ（Ｒ_ａ）−から独立して選択される１又は２〜４連結基を独立して含み、
式中、
ｘは０、１、又は２；
ｎは１、２、３、又は４であり；
Ｒ_ａ及びＲ_ｂはそれぞれ、独立して、水素、保護基、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル、Ｃ_５〜Ｃ_２０アリール、置換Ｃ_５〜Ｃ_２０アリール、複素環基、置換複素環基、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ_５〜Ｃ_７脂環式基、置換Ｃ_５〜Ｃ_７脂環式基、ハロゲン、ＯＪ_１、ＮＪ_１Ｊ_２、ＳＪ_１、Ｎ_３、ＣＯＯＪ_１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）_２−Ｊ_１）、又はスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ_１）であり；並びに
Ｊ_１及びＪ_２はそれぞれ、独立して、水素、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル、Ｃ_５〜Ｃ_２０アリール、置換Ｃ_５〜Ｃ_２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、複素環基、置換複素環基、Ｃ_１〜Ｃ_１２アミノアルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アミノアルキル又は保護基である。

【0184】

ある実施形態では、二環式糖部分のブリッジは、−［Ｃ（Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）］_ｎ−、−［Ｃ（Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）］_ｎ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ_ａＲ_ｂ）−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−又は−Ｃ（Ｒ_ａＲ_ｂ）−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−である。ある実施形態では、該ブリッジは、４’−ＣＨ_２−２’、４’−（ＣＨ_２）_２−２’、４’−（ＣＨ_２）_３−２’、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’、４’−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’及び４’−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’−であり、式中Ｒは、独立して、水素、保護基、又はＣ_１〜Ｃ_１２アルキルである。

【0185】

ある実施形態では、二環式ヌクレオシドは、異性体配置によりさらに定義される。例えば、４’−２’メチレン−オキシブリッジを含むヌクレオシドは、α−Ｌ配置又はβ−Ｄ配置にあってもよい。先に、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＢＮＡ’ｓは、アンチセンス活性を示したアンチセンスオリゴヌクレオチドにすでに組み入れられた（Ｆｒｉｅｄｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３、２１、６３６５−６３７２）。

【0186】

ある実施形態では、二環式ヌクレオシドには、下記に示すように、
（Ａ）α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｂ）β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｃ）エチレンオキシ（４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｄ）アミノオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｅ）オキシアミノ（４’−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、及び（Ｆ）メチル（メチレンオキシ）（４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｇ）メチレン−チオ（４’−ＣＨ_２−Ｓ−２’）ＢＮＡ、（Ｈ）メチレン−アミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｉ）メチル炭素環（４’−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−２’）ＢＮＡ、（Ｊ）プロピレン炭素環（４’−（ＣＨ_２）_３−２’）ＢＮＡ、及び（Ｋ）エチレン炭素環（４’−ＣＨ_２−ＣＨ_２−２’）（カルバＬＮＡ又は“ｃＬＮＡ”）が含まれるが、これらに限定されない。

【0187】

【化1】

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式中、Ｂｘは塩基部分であり、Ｒは独立して水素、保護基又はＣ_１〜Ｃ_１２アルキルである。

【0188】

ある実施形態では、式Ｉを有する二環式ヌクレオシドは、

【化2】

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であり、式中、
Ｂｘは複素環塩基部分であり；
−Ｑ_ａ−Ｑ_ｂ−Ｑ_ｃ−は、−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ_ｃ）−ＣＨ_２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ_ｃ）−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ_ｃ）−、−ＣＨ_２−Ｎ（Ｒ_ｃ）−Ｏ−又は−Ｎ（Ｒ_ｃ）−Ｏ−ＣＨ_２であり；
Ｒ_ｃはＣ_１〜Ｃ_１２アルキル又はアミノ保護基であり；並びに
Ｔ_ａ及びＴ_ｂはそれぞれ、独立して、水素、ヒドロキシル保護基、結合基、反応性リン基、リン部分又は支持体への共有結合的付着である。

【0189】

ある実施形態では、式ＩＩを有する二環式ヌクレオシドは、

【化3】

[この文献は図面を表示できません]

であり、式中
Ｂｘは、複素環塩基部分であり；
Ｔ_ａ及びＴ_ｂはそれぞれ、独立して、水素、ヒドロキシル保護基、結合基、反応性リン基、リン部分又は支持体への共有結合的付着であり；
Ｚ_ａは、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニル、置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオール又は置換チオである。

【0190】

ある実施形態では、置換基はそれぞれ独立して、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪ_ｃ、ＮＪ_ｃＪ_ｄ、ＳＪ_ｃ、Ｎ_３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ_ｃ、及びＮＪ_ｅＣ（＝Ｘ）ＮＪ_ｃＪ_ｄから独立して選択される置換基を有する一置換又はポリ置換であり、式中、各Ｊ_ｃ、Ｊ_ｄ及びＪ_ｅは、独立して、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、又は置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルであり、Ｘは酸素又はＮＪ_ｃである。

【0191】

ある実施形態では、式ＩＩＩを有する二環式ヌクレオシドは、

【化4】

[この文献は図面を表示できません]

であり、式中、
Ｂｘは複素環塩基部分であり；
Ｔ_ａ及びＴ_ｂはそれぞれ、独立して、水素、ヒドロキシル保護基、結合基、反応性リン基、リン部分又は支持体への共有結合的付着であり；
Ｚ_ｂは、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニル、置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニル、又は置換アシル（Ｃ（＝Ｏ）−）である。

【0192】

ある実施形態では、式ＩＶを有する二環式ヌクレオシドは、

【化5】

[この文献は図面を表示できません]

であり、式中、
Ｂｘは複素環塩基部分であり；
Ｔ_ａ及びＴ_ｂはそれぞれ、独立して、水素、ヒドロキシル保護基、結合基、反応性リン基、リン部分又は支持体への共有結合的付着であり；
Ｒ_ｄは、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニル又は置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニルであり；
ｑ_ａ、ｑ_ｂ、ｑ_ｃ及びｑ_ｄはそれぞれ、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニル又は置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシル、置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ_１〜Ｃ_６アミノアルキル又は置換Ｃ_１〜Ｃ_６アミノアルキルである。

【0193】

ある実施形態では、式Ｖを有する二環式ヌクレオシドは、

【化6】

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であり、式中、
Ｂｘは複素環塩基部分であり；
Ｔ_ａ及びＴ_ｂはそれぞれ、独立して、水素、ヒドロキシル保護基、結合基、反応性リン基、リン部分又は支持体への共有結合的付着であり；
ｑ_ａ、ｑ_ｂ、ｑ_ｅ及びｑ_ｆはそれぞれ、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、ＯＪ_ｊ、ＳＪ_ｊ、ＳＯＪ_ｊ、ＳＯ_２Ｊ_ｊ、ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｎ_３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪ_ｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊ_ｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ_ｊＪ_ｋ又はＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪ_ｊＪ_ｋであり；
又はｑ_ｅ及びｑ_ｆは共に＝Ｃ（ｑ_ｇ）（ｑ_ｈ）であり；
ｑ_ｇ及びｑ_ｈはそれぞれ、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル又は置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキルである。

【0194】

メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＢＮＡ単量体アデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミン及びウラシルの合成及び製造、並びにそれらのオリゴマー化、さらに核酸認識特性についてはすでに記載がある（Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９８、５４、３６０７−３６３０）。また、ＢＮＡ及びその製造も、国際公開第９８／３９３５２号及び第９９／１４２２６号）に記載されている。

【0195】

メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＢＮＡの類似体、メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）ＢＮＡ及び２’−チオ−ＢＮＡｓもすでに製造されている（Ｋｕｍａｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９８、８、２２１９−２２２２）。オリゴデオキシリボヌクレオチド二本鎖を核酸ポリメラーゼの基質として含むロックヌクレオシド類似体の製造に関する記載もある（Ｗｅｎｇｅｌら、国際公開第９９／１４２２６号）。さらに、２’−アミノ−ＢＮＡの合成、立体配置的制限のある新規の高度親和性オリゴヌクレオチド類似体についても、当技術分野ではすでに記載が存在する（Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９８、６３、１００３５−１００３９）。加えて、２’−アミノ−及び２’−メチルアミノ−ＢＮＡ’ｓはすでに製造されており、それらの相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ鎖との二本鎖の熱安定性も先に報告されている。

【0196】

ある実施形態では、式ＶＩを有する二環式ヌクレオシドは、

【化7】

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であり、式中、
Ｂｘは複素環塩基部分であり；
Ｔ_ａ及びＴ_ｂはそれぞれ、独立して、水素、ヒドロキシル保護基、結合基、反応性リン基、リン部分又は支持体への共有結合的付着であり；
ｑ_ｉ、ｑ_ｊ、ｑ_ｋ及びｑ_ｌはそれぞれ、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシル、置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシル、ＯＪ_ｊ、ＳＪ_ｊ、ＳＯＪ_ｊ、ＳＯ_２Ｊ_ｊ、ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｎ_３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪ_ｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊ_ｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ_ｊＪ_ｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ_ｊＪ_ｋ又はＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪ_ｊＪ_ｋ；並びに
ｑ_ｉ及びｑ_ｊ又はｑ_ｌ及びｑ_ｋは共にＣ（ｑ_ｇ）（ｑ_ｈ）であり、式中、ｑ_ｇ及びｑ_ｈはそれぞれ、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル又は置換Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキルである。

【0197】

４’−（ＣＨ_２）_３−２’ブリッジを有する、１つの炭素環二環式ヌクレオシド及びアルケニル類似体ブリッジ４’−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ_２−２’については記載がある（Ｆｒｉｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９７、２５（２２）、４４２９−４４４３；Ａｌｂａｅｋら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００６、７１、７７３１−７７４０）。炭素環二環式ヌクレオシドの合成及び製造、並びにそれらのオリゴマー化及び生化学研究についても、すでに記載されている（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７、１２９（２６）、８３６２−８３７９）。

【0198】

本明細書で使用されている「４’−２’二環式ヌクレオシド」又は「４’〜２’二環式ヌクレオシド」は、糖環の２’位炭素原子と４’位炭素原子を結合させるフラノース環の２個の炭素原子を結合するブリッジを構成するフラノース環を含む二環式ヌクレオシドを指している。

【0199】

本明細書で使用されている「単環式ヌクレオシド」は、二環式糖部分ではない修飾糖部分を含むヌクレオシドを指している。ある実施形態では、ヌクレオシドの糖部分、又は糖部分類似体は、任意の部位で修飾又は置換されてもよい。

【0200】

本明細書で使用されている「２’−修飾糖」は、２’位で修飾されたフラノシル糖を意味する。ある実施形態では、修飾には、置換及び非置換アルコキシ、置換及び非置換チオアルキル、置換及び非置換アミノアルキル、置換及び非置換アルキル、置換及び非置換アリル、並びに置換及び非置換アルキニル等のハロゲン化合物から選択される置換基を含むが、これらに限定されない。ある実施形態では、２’修飾は、ｎ及びｍが１〜約１０である、Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２、ＯＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＣＨ_３、及びＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３］_２を含む置換基から選択されるが、これらに限定されない。他の２’置換基もまた、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、薬物動態特性を改善するための基、又はアンチセンス化合物の薬力学的特性を改善するための基、及び類似の特性を有するその他の置換基から選択され得る。ある実施形態では、修飾ヌクレオシドには２’−ＭＯＥ側鎖が含まれる（Ｂａｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、２７２、１１９４４−１２０００）。２’−ＭＯＥ置換基は、非修飾ヌクレオシド、並びに、２’−Ｏ−メチル、Ｏ−プロピル、及びＯ−アミノプロピル等の他の修飾ヌクレオシドと比較して、結合親和性を改善したものとして記述されている。２’−ＭＯＥ置換基を有するオリゴヌクレオチドはまた、ｉｎ ｖｉｖｏ利用に有望な特徴を有する、遺伝子発現のアンチセンス阻害剤となることが示されている（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６−５０４；Ａｌｔｍａｎｎら、Ｃｈｉｍｉａ、１９９６、５０、１６８−１７６；Ａｌｔｍａｎｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．、１９９６、２４、６３０−６３７；及びＡｌｔｍａｎｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９７、１６、９１７−９２６）。

【0201】

本明細書で使用される「修飾テトラヒドロピランヌクレオシド」又は「修飾ＴＨＰヌクレオシド」は、６員環テトラヒドロピランの「糖」を、正常なヌクレオシドのペントフラノシル残基（糖代用物）と置換したヌクレオシドを意味する。修飾ＴＨＰヌクレオシドには、以下が含まれるがこれらに限定されない。すなわち、当技術分野でヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、アニトール核酸（ＡＮＡ）、マニトール核酸（ＭＮＡ）（Ｌｅｕｍａｎｎ、ＣＪ．Ｂｉｏｏｒｇ．＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２００２）１０：８４１−８５４を参照のこと）と称されているもの、フルオロＨＮＡ（Ｆ−ＨＮＡ）又は式Ｘを有する諸化合物、

【化8】

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式中、式Ｘの少なくとも１つのテトラヒドロピランヌクレオシド類似体それぞれは独立して、
Ｂｘは複素環塩基部分であり；
Ｔ_３及びＴ_４はそれぞれ、独立して、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結するヌクレオシド間連結基であるか、又はＴ_３及びＴ_４のうちいずれか一方が、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に連結するヌクレオシド間連結基であり、かつＴ_３及びＴ_４のもう片方は、水素、ヒドロキシル保護基、連結結合基、若しくは５’若しくは３’末端基であり；
ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｑ_６及びｑ_７はそれぞれ、独立して、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニル又は置換Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニルであり；並びに
Ｒ_１及びＲ_２のうちいずれか片方は水素であり、もう片方はハロゲン、置換又は非置換アルコキシ、式中ＸはＯ、Ｓ又はＮＪ_１であり、Ｊ_１、Ｊ_２及びＪ_３はそれぞれ独立して水素又はＣ_１〜Ｃ_６アルキルであるＮＪ_１Ｊ_２、ＳＪ_１、Ｎ_３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ_１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ_１Ｊ_２、ＮＪ_３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ_１Ｊ_２及びＣＮから選択される。

【0202】

ある実施形態では、式Ｘの修飾ＴＨＰヌクレオシドは、式中ｑ_ｍ、ｑ_ｎ、ｑ_ｐ、ｑ_ｒ、ｑ_ｓ、ｑ_ｔ及びｑ_ｕがそれぞれ水素であるものとして提供される。ある実施形態では、ｑ_ｍ、ｑ_ｎ、ｑ_ｐ、ｑ_ｒ、ｑ_ｓ、ｑ_ｔ及びｑ_ｕの少なくとも１つは、水素以外である。ある実施形態では、ｑ_ｍ、ｑ_ｎ、ｑ_ｐ、ｑ_ｒ、ｑ_ｓ、ｑ_ｔ及びｑ_ｕの少なくとも１つはメチルである。ある実施形態では、式ＸのＴＨＰヌクレオシドは、式中Ｒ_１及びＲ_２のうち片方をＦとして提供される。ある実施形態では、Ｒ_１はフルオロ、Ｒ_２は水素である；Ｒ_１はメトキシ、Ｒ_２は水素である；及びＲ_１はメトキシエトキシ、Ｒ_２は水素である。

【0203】

本明細書で使用される「２’−修飾」又は「２’−置換」は、２’位に水素又はＯＨ以外の置換基を含む糖を含有するヌクレオシドを指している。２’−修飾ヌクレオシドには、糖環の２つの炭素原子を結合させるブリッジが、糖環の２’炭素と別の炭素を結合させる二環式ヌクレオシド；及び、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ_１−Ｃ_１０アルキル、−ＯＣＦ_３、Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−ＣＨ_３、２’−Ｏ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_３、式中Ｒ_ｍ及びＲ_ｎはそれぞれ独立して水素又は置換若しくは非置換Ｃ_１−Ｃ_１０アルキルであるＯ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）又はＯ−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）等の非架橋２’置換基を有するヌクレオシドが含まれるが、これらに限定されない。２’修飾ヌクレオシドにはさらに、例えば、糖の他の部位及び／又は核酸塩基等にその他の修飾が含まれてもよい。

【0204】

本明細書で使用される「２’−Ｆ」は、２’位にフルオロ基を有する糖を含有するヌクレオシドを指している。

【0205】

本明細書で使用される「２’−ＯＭｅ」又は「２’−ＯＣＨ_３」又は「２’−Ｏ−メチル」はそれぞれ、糖環の２’位に−ＯＣＨ_３基を持つ糖を含有するヌクレオシドを指している。

【0206】

本明細書で使用される「ＭＯＥ」又は「２’−ＭＯＥ」又は「２’−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３」又は「２’−メトキシエチル」はそれぞれ、糖環の２’位に−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３基を含む糖を含有するヌクレオシドを指している。

【0207】

本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、複数の連結ヌクレオシドを含む化合物を指している。ある実施形態では、１又はそれ以上の複数ヌクレオシドは修飾されている。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドには、１又は複数のリボヌクレオシド（ＲＮＡ）及び／又はデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）が含まれる。

【0208】

その他のビシクロ及びトリシクロ糖代用環系の多くはまた、当技術分野において、アンチセンス化合物への組み入れのためヌクレオシドを修飾するために使用され得るとして既知である（例えば、レビュー記事：Ｌｅｕｍａｎｎ、Ｊ．Ｃ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２、１０、８４１−８５４を参照のこと）。環系は、活性向上のために様々な追加置換を行うことができる。

【0209】

修飾糖の製造方法は、当業者の周知である。

【0210】

修飾糖部分を有するヌクレオチドでは、核酸塩基部分（天然、修飾、又はそれらの組み合わせ）は、適切な核酸標的とのハイブリダイゼーションのために維持される。

【0211】

ある実施形態では、アンチセンス化合物には、修飾糖部分を有する１又は複数のヌクレオチドが含まれる。ある実施形態では、修飾糖部分は、２’−ＭＯＥである。ある実施形態では、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオチドは、ギャップマーモチーフで配列される。ある実施形態では、修飾糖部分は、ｃＥｔである。ある実施形態では、ｃＥｔ修飾ヌクレオチドは、ギャップマーモチーフのウィング全体に配列される。

【0212】

修飾核酸塩基
核酸塩基（又は塩基）の修飾又は置換は、天然発生又は合成未修飾の核酸塩基とは構造的に判別可能であるが、機能的には相互互換的である。天然及び修飾核酸塩基双方は、水素結合に関与し得る。核酸塩基修飾は、核酸分解酵素安定性、結合親和性、対立遺伝子多様体の選択性向上、又はアンチセンス化合物に対し有益なその他複数の生物特性を与えることができる。修飾核酸塩基には、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）等の合成及び天然核酸塩基が含まれる。５−メチルシトシン置換を含む特定の核酸塩基置換は、特に、標的核酸のアンチセンス化合物の結合親和性を向上させるのに有益である。例えば、５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃の差で、核酸二本鎖の安定性を向上させることはすでに示されている（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．及びＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編 Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、１９９３、２７６−２７８）。

【0213】

追加の修飾核酸塩基には、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンとグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニンとグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニル（−ＣoＣ−ＣＨ_３）ウラシルとシトシン及びピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン類とグアニン類、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル類とシトシン類、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニンと７−デアザアデニン及び３−デアザグアニンと３−デアザアデニンが含まれる。

【0214】

複素環塩基部分にはまた、プリン又はピリミジン塩基が、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドン等、他の複素環と置換されたものが含まれてもよい。アンチセンス化合物の結合親和性向上に特に有益な核酸塩基には、２アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシン等の、５−置換ピリミジン類、６−アザピリミジン類及びＮ−２，Ｎ−６及びＯ−６置換プリン類が含まれる。

【0215】

ある実施形態では、アンチセンス化合物には、１又は複数の修飾核酸塩基が含まれる。ある実施形態では、ギャップ拡大型アンチセンスオリゴヌクレオチドには、１又は複数の修飾核酸塩基が含まれる。ある実施形態では、修飾核酸塩基は、５−メチルシトシンである。ある実施形態では、各シトシンは５−メチルシトシンである。

【0216】

医薬組成物製剤のための組成物及び方法
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物の調製又は製剤のために薬剤的に許容できる活性又は不活性物質と混合してもよい。医薬組成物製剤のための組成物及び方法は、投与経路、疾患の度合い、又は投与量等、数多くの基準によるがこれらに限定されない。

【0217】

アンチセンス化合物は、アンチセンス化合物を薬剤的に許容できる好適な希釈剤又は担体と結合させることにより医薬組成物として利用可能となる。薬剤的に許容可能な希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。ＰＢＳは、非経口的に送達される組成物での利用に適した希釈剤である。従って、ある実施形態では、本明細書に記載の方法に使用されるのは、アンチセンス化合物及び薬剤的に許容できる希釈剤を含む医薬組成物である。ある実施形態では、薬剤的に許容できる希釈剤は、ＰＢＳである。ある実施形態では、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。

【0218】

アンチセンス化合物を含む医薬組成物には、任意の薬剤的に許容できる塩類、エステル類、若しくはエステル類の塩類、又は、ヒトを含む動物への投与で生物活性な代謝産物又はその残留物を（直接的又は間接的に）与えることができる任意の他のオリゴヌクレオチドが包含される。従って、例えば、本明細書の開示にはまた、アンチセンス化合物の薬剤的に許容できる塩類、プロドラッグ、プロドラッグの薬剤的に許容できる塩類、及びその他の生物学的同等物も含まれる。薬剤的に許容できる好適な塩類には、ナトリウム塩及びカリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。

【0219】

プロドラッグには、活性アンチセンス化合物を形成するために、体内の内在性核酸分解酵素により切断されたアンチセンス化合物の片方の端又は両端に、追加のヌクレオシドを組み入れることが含まれ得る。

【0220】

共役アンチセンス化合物
アンチセンス化合物を、活性、細胞分布、対立遺伝子多様体の選択性、又は結果として得られたアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞取込等を向上させる、１又は複数の部分又は共役体と共有結合的に連結させてもよい。典型的な共役基には、コレステロール部分及び脂質部分が含まれる。追加の共役基には、炭水化物、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び染料が含まれる。

【0221】

アンチセンス化合物に対し、例えば核酸分解酵素安定性等の特性を向上させるために、アンチセンス化合物の片方の端又は両末端に通常は付着している、１又は複数の安定化基を有するよう修飾することもできる。安定化基には、キャップ構造が含まれる。これら末端修飾は、末端核酸を有するアンチセンス化合物をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、送達及び／又は細胞内の局所化を支援することができる。キャップは、５’末端（５’−キャップ）、又は３’末端（３’−キャップ）、又は両末端に存在し得る。キャップ構造は、当技術分野において周知であり、例えば、逆位デオキシ脱塩基キャップが含まれる。さらに、核酸分解酵素安定性を供与するためにアンチセンス化合物の片方の端又は両端をキャップするのに使用され得る３’及び５’安定化基には、２００３年１月１６日に公開された国際公開第０３／００４６０２号に開示されたものも含まれる。

【0222】

細胞培養及びアンチセンス化合物処理
アンチセンス化合物が標的核酸のレベル、活性、又は発現に対してもたらす効果を、様々な種類の細胞でｉｎ ｖｉｔｒｏに試験することができる。解析に使用される細胞の種類は、市販の業者（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社、バージニア州マナッサス；Ｚｅｎ−Ｂｉｏ社、ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社、メリーランド州ウォーカーズビル）から入手可能であり、市販の試薬（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて、業者のマニュアルに従って培養する。細胞の種類には、例えば、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、及び初代肝細胞が含まれるが、これらに限定されない。細胞株の例として、ＧＭ０４２８１、ＧＭ０２１７１、及びＧＭ０２１７３Ｂ細胞が含まれる。

【0223】

アンチセンスオリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
本明細書に記載されるのは、他のアンチセンス化合物処理のために適切に修飾され得るアンチセンスオリゴヌクレオチドを有する細胞の処理方法である。

【0224】

細胞は、一般に、培養中で約６０〜８０％コンフルエントに達したときに、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理される。

【0225】

アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞に導入するために通常用いられる１つの試薬として、カチオン性脂質トランスフェクション試薬ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ１でＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）と混合し、所望のアンチセンスオリゴヌクレオチド最終濃度と、通常１００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドにつき２〜１２μｇ／ｍＬの範囲にあるＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ濃度を得る。

【0226】

アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞に導入するために用いられる別の試薬として、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ１血清使用量低減培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）でＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥと混合し、所望のアンチセンスオリゴヌクレオチド最終濃度と、通常１００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドにつき２〜１２μｇ／ｍＬの範囲にあるＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ濃度を得る。

【0227】

アンチセンスオリゴヌクレオチドを培養細胞に導入するために用いられる別の技法には、電気穿孔が含まれる。

【0228】

細胞は、通常の方法により、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理される。細胞は、典型的に、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理の１６〜２４時間後に収穫され、その時点で、標的核酸のＲＮＡ又はタンパク質レベルを、当技術分野で既知であり、本明細書に記載される方法で測定される。一般に、複数の複製物で処理を行う場合、データは複製物処理の平均として提示される。

【0229】

使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株により異なる。特定の細胞株に最適なアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を決定する方法は、当技術分野で周知である。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥで形質移入される場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的に、１ｎＭ〜３００ｎＭの範囲の濃度で使用される。電気穿孔を用いて形質移入される場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、６２５〜２０，０００ｎＭの範囲の高濃度で使用される。

【0230】

ＲＮＡ単離
ＲＮＡ解析は、全細胞ＲＮＡ又はポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで行うことができる。ＲＮＡ単離法は、当技術分野で周知である。ＲＮＡは、当技術分野で周知の方法、例えば、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて、製造者が推奨するプロトコルに従って調製される。

【0231】

標的レベル又は発現の阻害の解析
標的核酸の低減、阻害、又は発現を、当技術分野で既知の様々な方法でアッセイすることが可能である。例えば、標的核酸レベルを、ノーザンブロット解析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、又は定量的リアルタイムＰＣＲ等により定量化することができる。ＲＮＡ解析は全細胞ＲＮＡ又はポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで行うことができる。ＲＮＡ単離法は、当技術分野で周知である。ノーザンブロット解析もまた、当技術分野で日常的に行われている。定量的リアルタイムＰＣＲは、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（カリフォルニア州フォースター市）から購入可能なＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７６００、７７００、又は７９００配列検知システム（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、製造業者のマニュアルに従って従来通りに行うことができる。

【0232】

標的ＲＮＡレベルの定量的リアルタイムＰＣＲ解析
標的ＲＮＡレベルの定量は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７６００、７７００、又は７９００配列検知システム（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォースター市）を用いた定量的リアルタイムＰＣＲにより、製造業者のマニュアルに従って行うことができる。定量的リアルタイムＰＣＲ法は、当技術分野で周知である。

【0233】

リアルタイムＰＣＲの前に、単離されたＲＮＡに対し、相補的ＤＮＡを（ｃＤＮＡ）を生成し、その後リアルタイムＰＣＲ増幅用の基板として使用されている逆転写酵素（ＲＴ）反応を行う。ＲＴ及びリアルタイムＰＣＲ反応は、同じサンプルウェルで連続して行われる。ＲＴ及びリアルタイムＰＣＲ試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カリフォルニア州カールスバッド）から取得する。ＲＴリアルタイムＰＣＲ反応は、当業者に周知の方法で行われる。

【0234】

リアルタイムＰＣＲで得られる遺伝子（又は、ＲＮＡ）標的量は、シクロフィリンＡ等、発現が定常化している遺伝子の発現レベルを用いて、又はＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて全ＲＮＡを定量化するかのいずれかにより正規化される。シクロフィリンＡの発現は、リアルタイムＰＣＲにより、標的と同時に反応、増幅させることで、又は別々に行うことで定量化される。全ＲＮＡの定量化は、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ ＲＮＡ定量化試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、オレゴン州ユージーン）を用いて行う。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮによるＲＮＡの定量化の方法は、Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｊ．ら、（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９８、２６５、３６８−３７４）により教授されている。ＣＹＴＯＦＬＵＯＲ ４０００インスツルメント（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ蛍光を測定する。

【0235】

標的核酸にハイブリダイズするよう、プローブ及びプライマーを設計する。リアルタイムＰＣＲプローブ及びプライマーを設計する方法は、当技術分野で周知であり、ＰＲＩＭＥＲ ＥＸＰＲＥＳＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォースター市）等のソフトウェアの利用も含まれ得る。

【0236】

タンパク質レベルの解析
標的核酸の低減、阻害、又は発現は、標的タンパク質レベルを測定することによりアッセイ可能である。標的タンパク質レベルは、免疫沈降、ウェスタンブロット分析（免疫ブロット）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、定量タンパク質アッセイ、タンパク質活性アッセイ（例えば、カスパーゼ活性アッセイ）、免疫組織化学、免疫細胞化学又は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）等、当技術分野で周知の様々な方法で評価し又は定量化することができる。標的に向けられる抗体は、抗体のＭＳＲＳカタログ（Ａｅｒｉｅ社、ミシガン州バーミンガム）等、様々なソースで同定し、そこから取得することができ、或いは、当技術分野で周知の従来のモノクロナール又はポリクロナール抗体の生成方法を介して調製することもできる。マウス、ラット、サル、及びヒトタンパク質の検知に有益な抗体は、市販されている。

【0237】

アンチセンス化合物のｉｎ ｖｉｖｏ試験
アンチセンス化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子産物を選択的に低減又はその発現を阻害し、疾患症状の寛解等の表現型変異をもたらす能力を評価するために、動物で試験される。試験は、正常な動物、又は実験用疾患モデルで行ってもよい。動物への投与のために、リン酸緩衝生理食塩水等の薬剤的に許容できる希釈剤でアンチセンスオリゴヌクレオチドを調製する。投与には、腹腔内、静脈内、及び皮下投与等の非経口投与経路が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチド用量及び投与回数の算出は、当業者であれば可能であり、投与経路及び動物の体重等の要因により決められる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの処理期間終了後、ＲＮＡ又はタンパク質を組織から単離し、標的核酸又はタンパク質発現における変化を測定する。

【0238】

投与
ある実施形態では、本明細書に記載の化合物及び組成物の投与方法は多数存在し得るが、それは、局所的処理又は全身性処理が所望であるかどうか、また処理対象の領域次第である。投与は、局所的（眼部、膣部、直腸部、鼻腔内部を含む）、経口、肺（粉末の吸入若しくは吹込又はエアロゾルを含む、噴霧器、気管内、鼻腔内、表皮性、経皮性を含む）又は、点滴、静脈内注射、若しくは皮下、腹腔内、眼内、硝子体内や筋肉内注射等の非経口であり得る。

【0239】

ある実施形態では、本明細書に記載の化合物及び組成物は、非経口投与される。

【0240】

ある実施形態では、非経口投与は注入により行われる。注入は、長期若しくは連続、又は短期若しくは断続的であり得る。ある実施形態では、注入される医薬剤は、ポンプで送達される。ある実施形態では、非経口投与は注射により行われる。

【0241】

ある実施形態では、化合物及び組成物は中枢神経に送達される。ある実施形態では、化合物及び組成物は脳脊髄液に送達される。ある実施形態では、化合物及び組成物は脳実質に送達される。ある実施形態では、化合物及び組成物は、髄腔内投与又は脳室内投与により動物に送達される。実質内投与、髄腔内投与、脳室内投与により、本明細書に記載の化合物及び組成物を中枢神経系内に広汎に分布させることができる。

【0242】

ある実施形態では、非経口投与は注射により行われる。注射は、シリンジ又はポンプで送達されてもよい。ある実施形態では、注射はボーラス注射である。ある実施形態では、注射は、線条体、尾状核、大脳皮質、海馬、小脳等の組織に直接投与する。

【0243】

ある実施形態では、ボーラス注射等、医薬剤を特異的に局所化する方法は、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０の要因により、有効濃度中央値（ＥＣ５０）を低下させる。ある実施形態では、アンチセンス化合物の医薬剤は本明細書でさらに記載される。ある実施形態では、標的組織は脳組織である。ある実施形態では、標的組織は線条体組織である。ある実施形態では、ＥＣ５０を低下させることで、薬剤を必要とする患者に薬剤効果をもたらすのに必要な用量を低減するため、ＥＣ５０を低下させることは望ましい。

【0244】

ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、注射又は注入により、毎月、２ヶ月毎、９０日毎、３ヶ月毎、６ヶ月毎、１年に２回、又は１年に１回送達される。

【0245】

特定の化合物及び表示
本明細書で提供されるのは、突然変異対立遺伝子の阻害有効性及び選択性向上を提供する化合物及び方法である。有効性とは、ベンチマークオリゴヌクレオチドによる突然変異ｍＲＮＡの阻害度と比較した、ＳＮＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる突然変異ｍＲＮＡの阻害度で表される。選択性とは、マイナー対立遺伝子又は野生型対立遺伝子と比較して、メジャー対立遺伝子又は突然変異対立遺伝子の発現を優先的に阻害する、ＳＮＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力により示される。各ＳＮＰ位置に異なる遺伝子型を有する３つの細胞株を利用することで、アンチセンスオリゴヌクレオチドを標的とする有効かつ選択的ＳＮＰを提供する設計ルールの決定が促進された。

【0246】

ある実施形態では、化合物は、本明細書でさらに記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＮＰ又は識別用多型を優先的に標的とする。様々な長さのオリゴヌクレオチドを試験し、ＳＮＰを標的とするのに有益な特定の長さを決定した。

【0247】

ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２〜３０核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２〜２５核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２〜２１核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２〜２０核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１３〜２０核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１４〜２０核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５〜２０核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２〜１９核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１３〜１９核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１４〜１９核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５〜１９核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１６〜１９核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１７〜１９核酸塩基長である配列を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０核酸塩基長である配列を有する。

【0248】

様々な長さのオリゴヌクレオチドに関して、ＳＮＰ位置に対して相補的なヌクレオシドの位置をギャップ及びウィング内で移動させ、その効果を試験した。アンチセンスオリゴヌクレオチド内の特定の位置は、ＳＮＰを標的とするのに有益であることが示された。

【0249】

ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、又は少なくとも１９核酸塩基長であり、ＳＮＰは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて６〜１５番目のポジション、及び／又はギャップの５’末端から数えて１〜９番目のポジションに相補的である。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、又は少なくとも１９核酸塩基長であり、ＳＮＰは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて８〜１４番目のポジション、及び／又はギャップの５’末端から数えて１〜９番目のポジションに相補的である。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、又は少なくとも１９核酸塩基長であり、ＳＮＰは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて８〜１４番目のポジション、及び／又はギャップの５’末端から数えて４〜７番目のポジションに相補的である。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、又は少なくとも１９核酸塩基長であり、ＳＮＰは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて８〜１０番目のポジション、及び／又はギャップの５’末端から数えて４〜６番目のポジションに相補的である。

【0250】

ある実施形態では、ＳＮＰは、オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて８、９、又は１０番目のポジションに対し、又はギャップの５’末端から数えて４、５、又は６番目のポジションに対して相補的である。オリゴヌクレオチドの様々な長さに関して、ギャップ、５’ウィング、及び３’ウィングの長さの効果を試験した。

【0251】

あるウィング−ギャップ−ウィング組み合わせが、ＳＮＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドにとって有益であることが示された。ある実施形態では、ギャップは７〜１１核酸塩基長であり、各ウィングは独立して１〜６核酸塩基長である。ある実施形態では、ギャップは、７〜１１核酸塩基長であり、各ウィングは独立して２〜６核酸塩基長である。ある実施形態では、ギャップは、８〜１１核酸塩基長であり、各ウィングは独立して２〜６核酸塩基長である。ある実施形態では、ギャップは、９〜１１核酸塩基長であり、各ウィングは独立して２〜６核酸塩基長である。ある実施形態では、ギャップは、９核酸塩基長であり、各ウィングは独立して２〜６核酸塩基長である。ある実施形態では、ギャップは、１０核酸塩基長であり、各ウィングは独立して２〜６、又は４〜５核酸塩基長である。ある実施形態では、ギャップは、１１核酸塩基長であり、各ウィングは独立して２〜６、又は４〜５核酸塩基長である。ある実施形態では、ウィング−ギャップ−ウィング配置は、４−７−４、５−８−６、６−８−５、６−７−６、５−７−５、６−８−５、５−８−６、３−９−４、４−９−３、２−９−６、６，９，２、３−９−３、３−９−５、５−９−３、５−９−４、４−９−５、５−９−５、４−１１−４、４−１０−５及び５−１０−４のうちいずれか１つである。

【0252】

様々な長さのオリゴヌクレオチドに関して、特定の化学物質の効果を試験した。特定の化学修飾は、ＳＮＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドにとって有益であることが示された。ある実施形態では、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ウィングの各ヌクレオシドは、２’−ＭＯＥ修飾を有する。ある実施形態では、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ウィングの各ヌクレオシドは、高度親和性修飾を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ウィングギャップマーと混合する。実施形態では、３’ウィング及び５’ウィングにおける修飾及び修飾の組み合わせは、同じであっても異なっていてもよい。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ウィングに１又は複数の２’−ＭＯＥ修飾を有し、及び／又はウィングに１又は複数の高度親和性修飾を有する。ある実施形態では、高度親和性修飾は、ｃＥｔ修飾である。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの（５’末端から数えて）２、３、１３、及び１４番目のポジションに高度親和性修飾を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのウィングに１、２、３、又は４の高度親和性修飾を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’ウィング及び３’ウィングにそれぞれ独立して、１、２、３、又は４の高度親和性修飾を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’ウィング及び３’ウィングのいずれか片方又は両方に、（５’ウィングの５’末端及び３’ウィングの３’末端から数えて）２及び３番目のポジションに高度親和性糖修飾を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’ウィング及び３’ウィングのいずれか片方又は両方に、（５’ウィングの５’末端及び３’ウィングの３’末端から数えて）２、３及び４番目のポジションに高度親和性糖修飾を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’ウィング及び／又は３’ウィングの（５’ウィングの５’末端及び３’ウィングの３’末端から数えて）１番目のポジションに高度親和性糖修飾を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’ウィング及び３’ウィングの（５’ウィングの５’末端及び３’ウィングの３’末端から数えて）１番目のポジション及びウィングの他のポジションの少なくとも１つに高度親和性糖修飾を有する。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’ウィング及び３’ウィングの少なくともいずれかにおいて、２’−ＭＯＥと高度親和性糖修飾が交互に現れる。

【0253】

ある実施形態では、化合物には、上記の１又は複数の設計ルールを取り入れたアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。

【0254】

ある実施形態では、化合物には、１２〜３０連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、一塩基多型が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて６〜１５番目のポジションのいずれか１つ、又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップの５’末端から数えて１〜９番目のポジションのいずれか１つと一致し、各ウィングの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、一塩基多型部位には、識別用多型が含まれる。ある実施形態では、一塩基多型部位は、突然変異対立遺伝子上にある。ある実施形態では、突然変異対立遺伝子は疾患と関連する。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、４−７−４、５−８−６、６−８−５、６−７−６、５−７−５、６−８−５、５−８−６、３−９−４、４−９−３、２−９−６、６，９，２、３−９−３、３−９−５、５−９−３、５−９−４、４−９−５、５−９−５、４−１１−４、４−１０−５及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。

【0255】

ある実施形態では、化合物には、１２〜２０連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、一塩基多型は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて６〜１５番目のポジションのいずれか１つ、又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップの５’末端から数えて１〜９番目のポジションのいずれか１つと一致し、各ウィングの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、４−７−４、５−８−６、６−８−５、６−７−６、５−７−５、６−８−５、５−８−６、３−９−４、４−９−３、２−９−６、６，９，２、３−９−３、３−９−５、５−９−３、５−９−４、４−９−５、５−９−５、４−１１−４、４−１０−５及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。

【0256】

ある実施形態では、化合物には、１２〜２０連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、一塩基多型が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて８〜１４番目のポジションのいずれか１つ、又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップの５’末端から数えて１〜９番目のポジションのいずれか１つと一致し、各ウィングの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、４−７−４、５−８−６、６−８−５、６−７−６、５−７−５、６−８−５、５−８−６、３−９−４、４−９−３、２−９−６、６，９，２、３−９−３、３−９−５、５−９−３、５−９−４、４−９−５、５−９−５、４−１１−４、４−１０−５及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。

【0257】

ある実施形態では、化合物には、１２〜２０連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、一塩基多型が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて８〜１４番目のポジションのいずれか１つ、又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップの５’末端から数えて４〜７番目のポジションのいずれか１つと一致し、各ウィングの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、４−７−４、５−８−６、６−８−５、６−７−６、５−７−５、６−８−５、５−８−６、３−９−４、４−９−３、２−９−６、６，９，２、３−９−３、３−９−５、５−９−３、５−９−４、４−９−５、５−９−５、４−１１−４、４−１０−５及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。

【0258】

ある実施形態では、化合物には、１２〜２０連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、一塩基多型が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて８〜１０番目のポジションのいずれか１つ、又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップの５’末端から数えて４〜６番目のポジションのいずれか１つと一致し、各ウィングの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、４−７−４、５−８−６、６−８−５、６−７−６、５−７−５、６−８−５、５−８−６、３−９−４、４−９−３、２−９−６、６，９，２、３−９−３、３−９−５、５−９−３、５−９−４、４−９−５、５−９−５、４−１１−４、４−１０−５及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。

【0259】

ある実施形態では、化合物には、１２〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、一塩基多型が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて８〜１０番目のポジションのいずれか１つ、又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップの５’末端から数えて４〜６番目のポジションのいずれか１つと一致し、各ウィングの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、４−７−４、５−８−６、６−８−５、６−７−６、５−７−５、６−８−５、５−８−６、３−９−４、４−９−３、２−９−６、６，９，２、３−９−３、３−９−５、５−９−３、５−９−４、４−９−５、５−９−５、４−１１−４、４−１０−５及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。

【0260】

ある実施形態では、化合物には、１３〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、一塩基多型が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて８〜１０番目のポジションのいずれか１つ、又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップの５’末端から数えて４〜６番目のポジションのいずれか１つと一致し、各ウィングの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、４−７−４、５−８−６、６−８−５、６−７−６、５−７−５、６−８−５、５−８−６、３−９−４、４−９−３、２−９−６、６，９，２、３−９−３、３−９−５、５−９−３、５−９−４、４−９−５、５−９−５、４−１１−４、４−１０−５及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。

【0261】

ある実施形態では、化合物には、１４〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、一塩基多型が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて８〜１０番目のポジションのいずれか１つ、又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップの５’末端から数えて４〜６番目のポジションのいずれか１つと一致し、各ウィングの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、４−７−４、５−８−６、６−８−５、６−７−６、５−７−５、６−８−５、５−８−６、３−９−４、４−９−３、２−９−６、６，９，２、３−９−３、３−９−５、５−９−３、５−９−４、４−９−５、５−９−５、４−１１−４、４−１０−５及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。

【0262】

ある実施形態では、化合物には、１５〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、一塩基多型が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて６〜１５番目のポジションのいずれか１つ、又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップの５’末端から数えて１〜９番目のポジションのいずれか１つと一致し、各ウィングの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、４−７−４、５−８−６、６−８−５、６−７−６、５−７−５、６−８−５、５−８−６、３−９−４、４−９−３、２−９−６、６，９，２、３−９−３、３−９−５、５−９−３、５−９−４、４−９−５、５−９−５、４−１１−４、４−１０−５及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。

【0263】

ある実施形態では、化合物には、１５〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、一塩基多型が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて８〜１０番目のポジションのいずれか１つ、又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップの５’末端から数えて４〜６番目のポジションのいずれか１つと一致し、各ウィングの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、４−７−４、５−８−６、６−８−５、６−７−６、５−７−５、６−８−５、５−８−６、３−９−４、４−９−３、２−９−６、６，９，２、３−９−３、３−９−５、５−９−３、５−９−４、４−９−５、５−９−５、４−１１−４、４−１０−５及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。

【0264】

ある実施形態では、化合物には、１５〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えてポジション６、８、９、１０、１１、又は１４が一塩基多型と一致し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。

【0265】

ある実施形態では、化合物には、１５〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、ギャップセグメントのポジション１、４、５、６、７、又は９が一塩基多型と一致し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。

【0266】

ある実施形態では、化合物には、１５〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション６、７、８、９、１０、１１、又は１２が一塩基多型と一致し、５’及び３’ウィングセグメントのポジション２及び３に、４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。

【0267】

ある実施形態では、化合物には、１５〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、ギャップセグメントのポジション３、４、５、６、７、８、又は９が一塩基多型と一致し、５’及び３’ウィングセグメントのポジション２及び３に、４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。

【0268】

化合物には、１５〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション６、７、８、９、１０、１１、又は１２が一塩基多型と並列し、アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション２、３、１３、及び１４に４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。

【0269】

化合物には、１５〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、ギャップセグメントのポジション３、４、５、６、７、８、又は９が一塩基多型と一致し、アンチセンスアンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション２、３、１３、及び１４に４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。

【0270】

ある実施形態では、化合物には、１７〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション８、９又は１０が一塩基多型と一致し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドに２’−Ｏ−メトキシエチル糖が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。

【0271】

ある実施形態では、化合物には、１７〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、ギャップセグメントのポジション５、６又は７が一塩基多型と一致し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドに２’−Ｏ−メトキシエチル糖が含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。

【0272】

ある実施形態では、化合物には、１７〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション８、９、又は１０が一塩基多型と一致し、５’及び３’ウィングセグメントのポジション２及び３に４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。

【0273】

ある実施形態では、化合物には、１７〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、ギャップセグメントのポジション５、６、又は７が一塩基多型と一致し、５’及び３’ウィングセグメントのポジション２及び３に４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。

【0274】

化合物には、１７〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、修飾オリゴヌクレオチドのポジション８、９、又は１０が一塩基多型と一致し、アンチセンスアンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション２、３、１３、及び１４に４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。

【0275】

化合物には、１７〜１９連結ヌクレオシドから成り、一塩基多型部位と完全に相補的である修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれ、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドにはウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれ、ギャップセグメントのポジション５、６、又は７が一塩基多型と一致し、アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション２、３、１３、及び１４に４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれている。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、２−９−６、３−９−３、３−９−５、４−９−５、４−１１−４、及び５−１０−４から成る群の任意の１つである。

【0276】

ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１１〜２０連結ヌクレオシド長であり、独立して、５’及び３’ウィングに２〜５連結ヌクレオシド、ギャップに７〜１１連結ヌクレオシドを有する。ＳＮＰは、（アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて）アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４に、又はギャップセグメントの５’末端から数えて、ポジション１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に相補的である。

【0277】

ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５〜１９ヌクレオシド長であり、独立して、５’及び３’ウィングに２〜５連結ヌクレオシド、ギャップに７〜１１連結ヌクレオシドを有する。ＳＮＰは、（アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて）アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション６、７、８、９、又は１０に、又はギャップセグメントの５’末端から数えてポジション４、５、６、又は７に相補的である。

【0278】

ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１７連結ヌクレオシド長であり、独立して、５’及び３’ウィングセグメントに２〜５連結ヌクレオシド、ギャップセグメントに９〜１１連結ヌクレオシドを有する。ＳＮＰ
は、（アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて）アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション８、９、若しくは１０に相補的であるか、又は（ギャップセグメントの５’末端から数えて）ポジション５、６、若しくは７に相補的である。

【0279】

ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１８連結ヌクレオシド長であり、独立して、５’及び３’ウィングセグメントに２〜５連結ヌクレオシド、ギャップセグメントに９〜１１連結ヌクレオシドを有する。ＳＮＰは、（アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて）アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション８、９、若しくは１０に相補的であるか、又は（ギャップセグメントの５’末端から数えて）ポジション５、６、若しくは７に相補的である。

【0280】

ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１９連結ヌクレオシド長であり、独立して、５’及び３’ウィングセグメントに２〜５連結ヌクレオシド、ギャップセグメントに９〜１１連結ヌクレオシドを有する。ＳＮＰは、（アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて）アンチセンスオリゴヌクレオチドのポジション８、９、若しくは１０に相補的であるか、又は（ギャップセグメントの５’末端から数えて）ポジション５、６、若しくは７に相補的である。

【0281】

ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、実施例に列記されたもののいずれかである。ある実施形態では、ＩＳＩＳ番号が示す配列及び化学作用により指定される。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、突然変異ハンチンチン対立遺伝子の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％を阻害するか、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％を阻害するか、約５０％超、約５５％超、約６０％超、約６５％超、約７０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、若しくは約９５％超を阻害するか、又は５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、若しくは９５％超を阻害するとして実施例に列記されたもののいずれかである。

【0282】

ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、野生型ハンチンチン対立遺伝子の発現に対し、突然変異ハンチンチン対立遺伝子の発現を少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、若しくは１０倍は選択的に阻害するか、約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍若しくは１０倍は選択的に阻害するか、約２倍超、約３倍超、約４倍超、約５倍超、約６倍超、約７倍超、約８倍超、約９倍超、若しくは約１０倍超は選択的に阻害するか、又は２倍超、３倍超、４倍超、５倍超、６倍超、７倍超、８倍超、９倍超、若しくは１０倍超は選択的に阻害するか、又は野生型ハンチンチン対立遺伝子の発現と比較して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％を選択的に阻害するとして実施例に列記されたもののいずれかである。

【0283】

ある実施形態では、本発明は、本明細書に記載の１又は複数の医薬組成物を投与することを含む、個体の治療方法を提供する。ある実施形態では、個体は、疾患又は障害と関連する対立遺伝子多様体を有する。本明細書で提供される医薬組成物は、優先的にＳＮＰを標的とする。ある実施形態では、ＳＮＰは識別用多型である。

【0284】

ＳＮＰが疾患関連対立遺伝子に特異的であるかどうか、またさらに具体的に、ヘテロ接合体の患者の対立遺伝子のＳＮＰ多様体が、遺伝子のｍＲＮＡの隔離領域にある疾患誘発性突然変異と同じ対立遺伝子上に存在するかどうかを決定する方法については、すでに記述がある（国際公開第２００８／１４７９３０号及び国際公開第２００８／１４３７７４号）。

【0285】

ある実施形態では、疾患は神経変性障害である、ある実施形態では、神経変性障害はハンチントン病である。ある実施形態では、標的ＳＮＰは、１又は複数のｒｓ６４４６７２３、ｒｓ３８５６９７３、ｒｓ２２８５０８６、ｒｓ３６３０９２、ｒｓ９１６１７１、ｒｓ６８４４８５９、ｒｓ７６９１６２７、ｒｓ４６９００７３、ｒｓ２０２４１１５、ｒｓ１１７３１２３７、ｒｓ３６２２９６、ｒｓ１００１５９７９、ｒｓ７６５９１４４、ｒｓ３６３０９６、ｒｓ３６２２７３、ｒｓ１６８４３８０４、ｒｓ３６２２７１、ｒｓ３６２２７５、ｒｓ３１２１４１９、ｒｓ３６２２７２、ｒｓ３７７５０６１、ｒｓ３４３１５８０６、ｒｓ３６３０９９、ｒｓ２２９８９６７、ｒｓ３６３０８８、ｒｓ３６３０６４、ｒｓ３６３１０２、ｒｓ２７９８２３５、ｒｓ３６３０８０、ｒｓ３６３０７２、ｒｓ３６３１２５、ｒｓ３６２３０３、ｒｓ３６２３１０、ｒｓ１０４８８８４０、ｒｓ３６２３２５、ｒｓ３５８９２９１３、ｒｓ３６３１０２、ｒｓ３６３０９６、ｒｓ１１７３１２３７、ｒｓ１００１５９７９、ｒｓ３６３０８０、ｒｓ２７９８２３５、ｒｓ１９３６０３２、ｒｓ２２７６８８１、ｒｓ３６３０７０、ｒｓ３５８９２９１３、ｒｓ１２５０２０４５、ｒｓ６４４６７２３、ｒｓ７６８５６８６、ｒｓ３７３３２１７、ｒｓ６８４４８５９、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ１１４３６４６、ｒｓ２２８５０８６、ｒｓ２２９８９６９、ｒｓ４６９００７２、ｒｓ９１６１７１、ｒｓ３０２５８４９、ｒｓ７６９１６２７、ｒｓ４６９００７３、ｒｓ３８５６９７３、ｒｓ３６３０９２、ｒｓ３６２３１０、ｒｓ３６２３２５、ｒｓ３６３１４４、ｒｓ３６２３０３、ｒｓ３４３１５８０６、ｒｓ３６３０９９、ｒｓ３６３０８１、ｒｓ３７７５０６１、ｒｓ２０２４１１５、ｒｓ１０４８８８４０、ｒｓ３６３１２５、ｒｓ３６２２９６、ｒｓ２２９８９６７、ｒｓ３６３０８８、ｒｓ３６３０６４、ｒｓ３６２２７５、ｒｓ３１２１４１９、ｒｓ３０２５８４９、ｒｓ３６３０７０、ｒｓ３６２２７３、ｒｓ３６２２７２、ｒｓ３６２３０６、ｒｓ３６２２７１、ｒｓ３６３０７２、ｒｓ１６８４３８０４、ｒｓ７６５９１４４、ｒｓ３６３１２０、及びｒｓ１２５０２０４５である。ある実施形態では、化合物は、ＩＳＩＳ４６００６５、ＩＳＩＳ４５９９７８、ＩＳＩＳ４６００２８、ＩＳＩＳ４６０２０９、ＩＳＩＳ４６０２０８、及びＩＳＩＳ４６０２０６である。

【0286】

ある実施形態では、本明細書に記載されるのは、本明細書に記載の化合物を細胞、組織、又は動物に投与することにより、細胞、組織又は動物の突然変異ハンチンチン対立遺伝子の発現を選択的に低減する方法である。ある実施形態では、化合物には、突然変異ハンチンチン対立遺伝子に相補的な修飾オリゴヌクレオチドが含まれる。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の一塩基多型を含む位置における突然変異ハンチンチン対立遺伝子に対し相補的である。ある実施形態では、一塩基多型は、本明細書に記載のものから選択される。ある実施形態では、一塩基多型は、ｒｓ３６２３０６、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ２２９８９６９、ｒｓ７６８５６８６、ｒｓ４６９００７２、ｒｓ２０２４１１５又はｒｓ３６３０８８から選択される。

【0287】

ある実施形態では、本明細書に記載されるのは、動物に本明細書に記載の化合物を投与することにより、ハンチントン病を治療し、改善し、又は発症若しくは進行を遅らせる方法である。ある実施形態では、化合物には、本明細書に記載の一塩基多型を含む対立遺伝子のあるポジションに位置する、突然遺伝子ハンチンチン対立遺伝子に対して相補的な修飾オリゴヌクレオチドが含まれる。ある実施形態では、一塩基多型は、ｒｓ３６２３０６、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ２２９８９６９、ｒｓ７６８５６８６、ｒｓ４６９００７２、ｒｓ２０２４１１５又はｒｓ３６３０８８から選択される。ある実施形態では、動物に投与される化合物は、突然変異ハンチンチン対立遺伝子を選択的に低減することにより、ハンチントン病を治療し、改善し、又は発症若しくは進行を遅らせる。

【0288】

ある実施形態では、突然変異ハンチンチン対立遺伝子の発現は、野生型ハンチンチン対立遺伝子の発現に対して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、若しくは１０倍は選択的に低減するか、約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、若しくは１０倍は選択的に低減するか、約２倍超、約３倍超、約４倍超、約５倍超、約６倍超、約７倍超、約８倍超、約９倍超、若しくは約１０倍超は選択的に低減するか、又は２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、若しくは１０倍超は選択的に低減するか、又は野生型ハンチンチン対立遺伝子の発現と比較して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％を選択的に低減する。

【0289】

ある実施形態では、ｒｓ３６２３０６、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ２２９８９６９、ｒｓ７６８５６８６、ｒｓ４６９００７２、ｒｓ２０２４１１５又はｒｓ３６３０８８から選択される一塩基多型部位を含むポジションに位置する突然変異ハンチンチン対立遺伝子に対して相補的な修飾オリゴヌクレオチドを含む、１又は複数の追加の化合物を投与する。

【0290】

ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、本明細書にさらに記載する特定の長さ、ギャップ、ウィング、化学作用及びＳＮＰ位置アラインメントを有する。ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、１５〜２０の連結ヌクレオシドから成り、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２，１３、１４、又は１５が一塩基多型と一致する。

【0291】

ある実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、突然変異ハンチンチン対立遺伝子に対して９０％相補的である。

【0292】

修飾オリゴヌクレオチドが、突然変異ハンチンチン対立遺伝子に対して９５％相補的である、請求項４０に記載の方法。

【0293】

修飾オリゴヌクレオチドが、突然変異ハンチンチン対立遺伝子に対して１００％相補的である、請求項４０に記載の方法。

【0294】

ある実施形態では、本明細書に記載されるのは、遺伝子の第１対立遺伝子多様体が遺伝子の第２対立遺伝子多様体に関連して発現するのを、薬剤が選択的に阻害するかどうかを判断する方法であって、第１の対立遺伝子多様体は、ＳＮＰ位置に第１のヌクレオチドを含み、第２の対立遺伝子多様体は、ＳＮＰ位置に第２のヌクレオチドを含み、
（ｉ）第１の細胞、組織又は動物を、１又は複数の濃度の薬剤と接触させ、第１の細胞、組織又は動物は、ＳＮＰ位置における第１のヌクレオチドにとってホモ接合であり；
（ｉｉ）第２の細胞、組織又は動物を、１又は複数の濃度の薬剤と接触させ、第２の細胞株がＳＮＰ位置における第２のヌクレオチドにとってホモ接合であるか、又はＳＮＰ位置における第１及び第２のヌクレオチドにとってヘテロ接合であり；
（ｉｉｉ）１又は複数の濃度の薬剤それぞれについて、各細胞、組織又は動物における対立遺伝子多様体の発現阻害度を測定し；及び
（ｉｖ）遺伝子の第１対立遺伝子多様体が遺伝子の第２対立遺伝子多様体に関連して発現するのを、薬剤が選択的に阻害するかどうかを判断するために、１又は複数の濃度の薬剤それぞれについて、各細胞、組織又は動物における発現の阻害度を比較する、
ことが含まれる。

【0295】

ある実施形態では、本明細書に記載の方法はさらに、第３の細胞、組織又は動物を、１又は複数の濃度の薬剤と接触させるステップを含み、第３の細胞、組織又は動物は、ＳＮＰ位置における第２のヌクレオチドにとってホモ接合であるか、又はＳＮＰ位置における第１及び第２のヌクレオチドにとってヘテロ接合であり、第１の細胞、組織又は動物及び第２の細胞、組織又は動物とは異なる遺伝子型を有する。

【0296】

ある実施形態では、細胞、組織又は動物はＹＡＣ１８の細胞、組織若しくはマウス、ＢＡＣＨＤの細胞、組織若しくはマウス、ヒトハンチントン病患者由来の細胞株、又はそれらの任意の組合せである。

【0297】

ある実施形態では、第１の対立遺伝子多様体は突然変異対立遺伝子であり、第２の対立遺伝子多様体は野生型対立遺伝子である。ある実施形態では、第１の対立遺伝子多様体は野生型対立遺伝子であり、第２の対立遺伝子多様体は突然変異対立遺伝子である。

【0298】

ある実施形態では、突然変異対立遺伝子多様体は疾患と関連する。ある実施形態では、疾患は毒性機能を獲得した結果生じたものである。ある実施形態では、疾患はハンチントン病である。

【0299】

ある実施形態では、第１のヌクレオチドは、疾患関連突然変異と連鎖不平衡である。ある実施形態では、第２のヌクレオチドは、疾患関連突然変異と連鎖不平衡である。ある実施形態では、疾患関連突然変異は、トリヌクレオチド反復拡大である。ある実施形態では、トリヌクレオチド反復拡大はＣＡＧ拡大である。ある実施形態では、ＣＡＧ拡大は、ＨＴＴ遺伝子においてである。

【0300】

ある実施形態では、第１のヌクレオチドはＡであり、第２のヌクレオチドはＣ、Ｇ又はＴのいずれかである。ある実施形態では、第１のヌクレオチドはＣであり、第２のヌクレオチドは、Ａ、Ｇ又はＴのいずれかである。ある実施形態では、第１のヌクレオチドはＧであり、第２のヌクレオチドは、Ａ、Ｃ又はＴのいずれかである。ある実施形態では、第１のヌクレオチドはＴであり、第２のヌクレオチドは、Ａ、Ｃ又はＧのいずれかである。ある実施形態では、第１のヌクレオチドは、疾患関連突然変異と連鎖不平衡である。ある実施形態では、疾患関連突然変異は、ＣＡＧの拡大である。ある実施形態では、ＣＡＧの拡大は、ＨＴＴ遺伝子においてである。

【0301】

ある実施形態では、薬剤はアンチセンス化合物である。ある実施形態では、アンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ある実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップマーである。ある実施形態では、ギャップマーはウイング−ギャップ−ウイングモチーフである。ある実施形態では、ウイング−ギャップ−ウイングモチーフは、５−１０−５、２−９−６、３−９−３、３−９−４、３−９−５、４−７−４、４−９−３、４−９−４、４−９−５、４−１０−５、４−１１−４、４−１１−５、５−７−５、５−８−６、５−９−３、５−９−５、５−１０−４、５−１０−５、６−７−６、６−８−５、及び６−９−２から成る群の任意の１つである。ある実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシド間連結は、修飾ヌクレオシド間連結である。ある実施形態では、各ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオ酸ヌクレオシド間連結である。ある実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシドに修飾核酸塩基が含まれる。ある実施形態では、修飾核酸塩基は５’−メチルシトシンである。ある実施形態では、少なくとも１つのウィング領域の少なくとも１つのヌクレオシドに、修飾糖又は糖代用が含まれる。ある実施形態では、各ウィング領域の各核酸塩基に、修飾糖又は糖代用が含まれる。ある実施形態では、糖又は糖代用は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖である。ある実施形態では、少なくとも１つのウィング領域に４’〜２’二環式ヌクレオシドが含まれ、かつ残りのウィングヌクレオシドの少なくとも１つが非二環式２’−修飾ヌクレオシドである。ある実施形態では、非二環式２’−修飾ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドである。ある実施形態では、４’〜２’二環式ヌクレオシドは、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’二環式ヌクレオシドである。

【0302】

ある実施形態では、第１の細胞株は、線維芽細胞株、神経細胞株、又はリンパ芽細胞株から成る群のいずれかである。ある実施形態では、第２の細胞株は、線維芽細胞株、神経細胞株、又はリンパ芽細胞株から成る群のいずれかである。ある実施形態では、第３の細胞株は、線維芽細胞株、神経細胞株、又はリンパ芽細胞株から成る群のいずれかである。ある実施形態では、繊維芽細胞株は、ＧＭ０４２８１、ＧＭ０２１７１、及びＧＭ０２１７３Ｂから成る群のいずれかである。ある実施形態では、神経細胞株は、ＹＡＣ１８マウス由来の細胞株、ＢＡＣＨＤマウス由来の細胞株、又はヒトハンチントン病患者由来の細胞株を含む。

【0303】

ある実施形態では、ＳＮＰ位置は、ｒｓ６４４６７２３、ｒｓ３８５６９７３、ｒｓ２２８５０８６、ｒｓ３６３０９２、ｒｓ９１６１７１、ｒｓ６８４４８５９、ｒｓ７６９１６２７、ｒｓ４６９００７３、ｒｓ２０２４１１５、ｒｓ１１７３１２３７、ｒｓ３６２２９６、ｒｓ１００１５９７９、ｒｓ７６５９１４４、ｒｓ３６３０９６、ｒｓ３６２２７３、ｒｓ１６８４３８０４、ｒｓ３６２２７１、ｒｓ３６２２７５、ｒｓ３１２１４１９、ｒｓ３６２２７２、ｒｓ３７７５０６１、ｒｓ３４３１５８０６、ｒｓ３６３０９９、ｒｓ２２９８９６７、ｒｓ３６３０８８、ｒｓ３６３０６４、ｒｓ３６３１０２、ｒｓ２７９８２３５、ｒｓ３６３０８０、ｒｓ３６３０７２、ｒｓ３６３１２５、ｒｓ３６２３０３、ｒｓ３６２３１０、ｒｓ１０４８８８４０、ｒｓ３６２３２５、ｒｓ３５８９２９１３、ｒｓ３６３１０２、ｒｓ３６３０９６、ｒｓ１１７３１２３７、ｒｓ１００１５９７９、ｒｓ３６３０８０、ｒｓ２７９８２３５、ｒｓ１９３６０３２、ｒｓ２２７６８８１、ｒｓ３６３０７０、ｒｓ３５８９２９１３、ｒｓ１２５０２０４５、ｒｓ６４４６７２３、ｒｓ７６８５６８６、ｒｓ３７３３２１７、ｒｓ６８４４８５９、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ１１４３６４６、ｒｓ２２８５０８６、ｒｓ２２９８９６９、ｒｓ４６９００７２、ｒｓ９１６１７１、ｒｓ３０２５８４９、ｒｓ７６９１６２７、ｒｓ４６９００７３、ｒｓ３８５６９７３、ｒｓ３６３０９２、ｒｓ３６２３１０、ｒｓ３６２３２５、ｒｓ３６３１４４、ｒｓ３６２３０３、ｒｓ３４３１５８０６、ｒｓ３６３０９９、ｒｓ３６３０８１、ｒｓ３７７５０６１、ｒｓ２０２４１１５、ｒｓ１０４８８８４０、ｒｓ３６３１２５、ｒｓ３６２２９６、ｒｓ２２９８９６７、ｒｓ３６３０８８、ｒｓ３６３０６４、ｒｓ３６２２７５、ｒｓ３１２１４１９、ｒｓ３０２５８４９、ｒｓ３６３０７０、ｒｓ３６２２７３、ｒｓ３６２２７２、ｒｓ３６２３０６、ｒｓ３６２２７１、ｒｓ３６３０７２、ｒｓ１６８４３８０４、ｒｓ７６５９１４４、ｒｓ３６３１２０、及びｒｓ１２５０２０４５から成る群のいずれかである。

【0304】

ある実施形態では、１又は複数の濃度は、２つの濃度、３つの濃度、４つの濃度、及び５つの濃度のいずれかである。

【0305】

ある実施形態では、選択性は、１つの細胞株における対立遺伝子多様体の阻害度が、別の細胞株と比較してどれだけ向上したかにより決定される。

【0306】

ある実施形態では、本明細書に記載されるのは、遺伝子の第１対立遺伝子多様体が、遺伝子の第２対立遺伝子多様体に関連して発現するのを、薬剤が選択的に阻害するかどうかを判断するための方法であって、第１の対立遺伝子多様体は、ＳＮＰ位置において第１のヌクレオチドを含み、第２の対立遺伝子多様体は、ＳＮＰ位置において第２のヌクレオチドを含み、
（ｉ）第１の細胞株を１又は複数の濃度の薬剤と接触させ、第１の細胞株はＳＮＰ位置における第１のヌクレオチドにとってホモ接合であり；
（ｉｉ）第２の細胞株を、１又は複数の濃度の薬剤と接触させ、第２の細胞株は、ＳＮＰ位置における第２のヌクレオチドにとってホモ接合であるか、又はＳＮＰ位置における第１及び第２のヌクレオチドにとってヘテロ接合であり；
（ｉｉｉ）１又は複数の濃度の薬剤それぞれについて、各細胞株における対立遺伝子多様体の発現阻害度を測定し；及び
（ｉｖ）遺伝子の第１対立遺伝子多様体が遺伝子の第２対立遺伝子多様体に関連して発現するのを、薬剤が選択的に阻害するかどうかを判断するために、１又は複数の濃度の薬剤それぞれについて、各細胞株における発現の阻害度を比較し、
（ｖ）第１の細胞株、第２の細胞株、及び第３の細胞株それぞれにおいて、薬剤のＩＣ５０値を計算し；及び
（ｖｉ）第１の対立遺伝子多様体又は突然変異対立遺伝子の発現を、薬剤が選択的に阻害するかどうかを判断するために、ＩＣ５０値を比較する、
ことが含まれる。

【0307】

ある実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドを標的とするハンチンチンＳＮＰは、突然変異対立遺伝子に対して選択的であり、ベンチマークＰＡＮ ＡＳＯ、ＩＳＩＳ３８７９１６の少なくとも１０倍、少なくとも９倍、少なくとも８倍、少なくとも７倍、少なくとも６倍、少なくとも５倍、少なくとも４倍、少なくとも３倍又は少なくとも２倍の有効性内で有効性を示す。ある実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドを標的とするＳＮＰは、突然変異対立遺伝子に対してホモ接合である細胞株において、わずか６．５、６、５．５、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１又は０．７５のＩＣ５０を有する。ある実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドを標的とするＳＮＰは、野生型対立遺伝子に対してホモ接合である細胞株において、突然変異対立遺伝子に対してホモ接合である細胞株におけるＩＣ５０より少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍少ないＩＣ５０を有する。ある実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドを標的とするＳＮＰは、突然変異対立遺伝子及び野生型対立遺伝子に対してヘテロ接合である細胞株において、突然変異対立遺伝子に対してホモ接合である細胞株におけるＩＣ５０よりも少なくとも１．４倍、１．７倍、２倍、２．２倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．８倍又は３倍少ないＩＣ５０を有する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドを標的とするＳＮＰは、ＩＳＩＳ番号４３５８６９、４６００６９、４６０２０６、４６００１９、４６００７１、４６０２０７、４６０２１２、４６０２１８、４６０２３１、４７４８９２、４６００１２、４６０２０８、４３５８７９、４６００６５、４６００８５、４６０２０９、４７４８７１、４７４８９１、４７４９１９、４７４９２３、４７６３３３、４７６３３７、４３５８９０、４６００２６、４６０２１０、４６３５７１、４７６４４４を含むか、又はこれらから選択される。

【0308】

治療的有効量
ある実施形態では、突然変異ハンチンチン対立遺伝子を標的とするアンチセンス化合物の治療的有効量投与には、アンチセンス化合物投与に対する個体反応を測定するため、個体の遺伝子産物の発現をモニタリングすることを伴う。ある実施形態では、遺伝子産物はハンチンチンｍＲＮＡ又はタンパク質である。アンチセンス化合物の投与に対する個体の反応により、医師は、治療的介入の量及び期間を決定する。

【0309】

ある実施形態では、突然変異核酸を標的とするアンチセンス化合物の投与により、ｍＲＮＡ又はタンパク質発現が、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は９９％、又はこれら値のうち任意の２つの値により定められる範囲の割合で低減する。ある実施形態では、突然変異核酸はハンチンチン核酸であり、ｍＲＮＡはハンチンチンｍＲＮＡであり、タンパク質はハンチンチンタンパク質である。

【0310】

ある実施形態では、突然変異対立遺伝子を標的とするアンチセンス化合物を含有する医薬組成物は、ハンチントン病を患っている、又はハンチントン病にかかりやすい患者を治療するための薬物を調製するのに使用される。

【0311】

特定の併用治療
ある実施形態では、本発明の１又は複数の医薬組成物は、１又は複数の他の医薬剤と共投与される。ある実施形態では、係る１又は複数の他の医薬剤は、本発明の１又は複数の医薬組成物と同様、同じ疾患、障害又は状態を治療するよう設計される。ある実施形態では、係る１又は複数の他の医薬剤は、本発明の１又は複数の医薬組成物とは異なる疾患、障害又は状態を治療するよう設計される。ある実施形態では、係る１又は複数の他の医薬剤は、本発明の１又は複数の医薬組成物の所望でない副作用を治療するよう設計される。ある実施形態では、本発明の１又は複数の医薬組成物は、他の医薬剤の所望でない作用を処置するために、別の医薬剤と共投与される。ある実施形態では、本発明の１又は複数の医薬組成物は、併用効果を生じさせるために、別の医薬剤と共投与される。ある実施形態では、本発明の１又は複数の医薬組成物は、相乗効果を生じさせるために、別の医薬剤と共投与される。

【0312】

ある実施形態では、本発明の１又は複数の医薬組成物及び１又は複数の他の医薬剤は、同時に投与される。ある実施形態では、本発明の１又は複数の医薬組成物及び１又は複数の他の医薬剤は、別々に投与される。ある実施形態では、本発明の１又は複数の医薬組成物及び１又は複数の他の医薬剤を併せて単剤として製剤する。ある実施形態では、本発明の１又は複数の医薬組成物及び１又は複数の他の医薬剤は、別々に製剤する。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］遺伝子の第１対立遺伝子多様体が前記遺伝子の第２対立遺伝子多様体に関連して発現するのを、薬剤が選択的に阻害するかどうかを判断する方法であって、前記第１対立遺伝子多様体は、ＳＮＰ位置に第１のヌクレオチドを含み、前記第２対立遺伝子多様体は、前記ＳＮＰ位置に第２のヌクレオチドを含み、
第１の細胞、組織又は動物を、１又は複数の濃度の前記薬剤と接触させ、前記の第１の細胞、組織又は動物は、前記ＳＮＰ位置における前記第１ヌクレオチドにとってホモ接合であり；
第２の細胞、組織又は動物を、１又は複数の濃度の前記薬剤と接触させ、前記の第２の細胞、組織又は動物が前記ＳＮＰ位置における前記第２ヌクレオチドにとってホモ接合であるか、又は前記ＳＮＰ位置における前記第１ヌクレオチド及び前記第２ヌクレオチドにとってヘテロ接合であり；
１又は複数の濃度の前記薬剤それぞれについて、前記の各細胞、組織又は動物における前記対立遺伝子多様体の発現阻害度を測定し；及び
前記遺伝子の前記第１対立遺伝子多様体が前記遺伝子の前記第２対立遺伝子多様体に関連して発現するのを、前記薬剤が選択的に阻害するかどうかを判断するために、１又は複数の濃度の前記薬剤それぞれについて、前記の各細胞、組織又は動物における発現の阻害度を比較する、
ことが含まれる方法。
［態様２］第３の細胞、組織又は動物を、１又は複数の濃度の前記薬剤と接触させるステップであって、前記の第３の細胞、組織又は動物は、前記ＳＮＰ位置における前記第２ヌクレオチドにとってホモ接合であるか、又は前記ＳＮＰ位置における前記第１ヌクレオチド及び前記第２ヌクレオチドにとってヘテロ接合であり、前記の第１の細胞、組織又は動物及び前記の第２の細胞、組織又は動物とは異なる遺伝子型を有するステップをさらに含む、態様１に記載の方法。
［態様３］前記の第１対立遺伝子多様体は突然変異対立遺伝子であり、前記の第２対立遺伝子多様体は野生型対立遺伝子である、態様１に記載の方法。
［態様４］前記の第１対立遺伝子多様体は野生型対立遺伝子であり、前記の第２対立遺伝子多様体は突然変異対立遺伝子である、態様１に記載の方法。
［態様５］前記突然変異対立遺伝子多様体が疾患と関連する、態様３及び４に記載の方法。
［態様６］前記疾患が毒性機能を獲得した結果生じたものである、態様５に記載の方法。
［態様７］前記疾患がハンチントン病である、態様５に記載の方法。
［態様８］前記の第１ヌクレオチドが疾患関連突然変異と連鎖不平衡である、態様１に記載の方法。
［態様９］前記の第２ヌクレオチドが疾患関連突然変異と連鎖不平衡である、態様１に記載の方法。
［態様１０］前記疾患関連突然変異がトリヌクレオチド反復拡大である、態様８及び９に記載の方法。
［態様１１］前記トリヌクレオチド反復拡大がＣＡＧ拡大である、態様１０に記載の方法。
［態様１２］前記ＣＡＧ拡大がＨＴＴ遺伝子においてである、態様１１に記載の方法。
［態様１３］前記の第１ヌクレオチドがＡである、態様１に記載の方法。
［態様１４］前記の第２ヌクレオチドがＣ、Ｇ又はＴのいずれかである、態様１３に記載の方法。
［態様１５］前記の第１ヌクレオチドがＣである、態様１に記載の方法。
［態様１６］前記の第２ヌクレオチドがＡ、Ｇ又はＴのいずれかである、態様１５に記載の方法。
［態様１７］前記の第１ヌクレオチドがＧである、態様１に記載の方法。
［態様１８］前記の第２ヌクレオチドがＡ、Ｃ又はＴである、態様１７に記載の方法。
［態様１９］前記の第１ヌクレオチドがＴである、態様１に記載の方法。
［態様２０］前記の第２ヌクレオチドがＡ、Ｃ又はＧである、態様１９に記載の方法。
［態様２１］前記の第１ヌクレオチドが疾患関連突然変異と連鎖不平衡である、態様１３、１５、１７及び１９に記載の方法。
［態様２２］前記疾患関連突然変異がトリヌクレオチド反復拡大である、態様２１に記載の方法。
［態様２３］前記トリヌクレオチド反復拡大がＣＡＧ拡大である、態様２２に記載の方法。
［態様２４］前記疾患関連突然変異がＣＡＧ拡大である、態様２３に記載の方法。
［態様２５］前記ＣＡＧ拡大がＨＴＴ遺伝子においてである、態様２４に記載の方法。
［態様２６］前記薬剤がアンチセンス化合物である、態様１に記載の方法。
［態様２７］前記アンチセンス化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、態様２６に記載の方法。
［態様２８］前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがキメラである、態様２７に記載の方法。
［態様２９］前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがギャップマーである、態様２７に記載の方法。
［態様３０］前記ギャップマーがウイング−ギャップ−ウイングモチーフを有する、態様２９に記載の方法。
［態様３１］ウイング−ギャップ−ウイングモチーフが、５−１０−５、２−９−６、３−９−３、３−９−４、３−９−５、４−７−４、４−９−３、４−９−４、４−９−５、４−１０−５、４−１１−４、４−１１−５、５−７−５、５−８−６、５−９−３、５−９−５、５−１０−４、５−１０−５、６−７−６、６−８−５、及び６−９−２から成る群の任意の１つである、態様３０に記載の方法。
［態様３２］少なくとも１つのヌクレオシド間連結が修飾ヌクレオシド間連結である、態様２６〜３１のいずれかに記載の方法。
［態様３３］各ヌクレオシド間連結がホスホロチオ酸ヌクレオシド間連結である、態様２９に記載の方法。
［態様３４］少なくとも１つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含む、態様２６〜３１のいずれかに記載の方法。
［態様３５］修飾核酸塩基が５’−メチルシトシンである、態様３４に記載の方法。
［態様３６］少なくとも１つのウィングの少なくとも１つのヌクレオシドに修飾糖又は糖代用が含まれる、態様３０に記載の方法。
［態様３７］各ウィングの各ヌクレオシドには修飾糖又は糖代用が含まれる、態様３６に記載の方法。
［態様３８］糖又は糖代用が２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖である、態様３６に記載の方法。
［態様３９］少なくとも１つウィングに４’〜２’二環式ヌクレオシドが含まれ、残りのウィングヌクレオシドの少なくとも１つが非二環式２’−修飾ヌクレオシドである、態様３６に記載の方法。
［態様４０］非二環式２’−修飾ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドである、態様３９に記載の方法。
［態様４１］４’〜２’二環式ヌクレオシドが４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’二環式ヌクレオシドである、態様３９に記載の方法。
［態様４２］前記の第１細胞が、線維芽細胞株、神経細胞株、又はリンパ芽細胞株から成る群のいずれかである、態様１に記載の方法。
［態様４３］前記の第２細胞が、線維芽細胞株、神経細胞株、又はリンパ芽細胞株から成る群のいずれかである、態様１に記載の方法。
［態様４４］前記の第３細胞が、線維芽細胞株、神経細胞株、又はリンパ芽細胞株から成る群のいずれかである、態様２に記載の方法。
［態様４５］前記繊維芽細胞株が、ＧＭ０４０２２、ＧＭ０４２８１、ＧＭ０２１７１、及びＧＭ０２１７３Ｂから成る群のいずれかである、態様４２、４３又は４４に記載の方法。
［態様４６］前記細胞、組織又は動物が、ＹＡＣ１８の細胞、組織若しくはマウス、ＢＡＣＨＤの細胞、組織若しくはマウス、ヒトハンチントン病患者由来の細胞株、又はそれらの任意の組合せである、態様１に記載の方法。
［態様４７］前記ＳＮＰ位置が、ｒｓ６４４６７２３、ｒｓ３８５６９７３、ｒｓ２２８５０８６、ｒｓ３６３０９２、ｒｓ９１６１７１、ｒｓ６８４４８５９、ｒｓ７６９１６２７、ｒｓ４６９００７３、ｒｓ２０２４１１５、ｒｓ１１７３１２３７、ｒｓ３６２２９６、ｒｓ１００１５９７９、ｒｓ７６５９１４４、ｒｓ３６３０９６、ｒｓ３６２２７３、ｒｓ１６８４３８０４、ｒｓ３６２２７１、ｒｓ３６２２７５、ｒｓ３１２１４１９、ｒｓ３６２２７２、ｒｓ３７７５０６１、ｒｓ３４３１５８０６、ｒｓ３６３０９９、ｒｓ２２９８９６７、ｒｓ３６３０８８、ｒｓ３６３０６４、ｒｓ３６３１０２、ｒｓ２７９８２３５、ｒｓ３６３０８０、ｒｓ３６３０７２、ｒｓ３６３１２５、ｒｓ３６２３０３、ｒｓ３６２３１０、ｒｓ１０４８８８４０、ｒｓ３６２３２５、ｒｓ３５８９２９１３、ｒｓ３６３１０２、ｒｓ３６３０９６、ｒｓ１１７３１２３７、ｒｓ１００１５９７９、ｒｓ３６３０８０、ｒｓ２７９８２３５、ｒｓ１９３６０３２、ｒｓ２２７６８８１、ｒｓ３６３０７０、ｒｓ３５８９２９１３、ｒｓ１２５０２０４５、ｒｓ６４４６７２３、ｒｓ７６８５６８６、ｒｓ３７３３２１７、ｒｓ６８４４８５９、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ１１４３６４６、ｒｓ２２８５０８６、ｒｓ２２９８９６９、ｒｓ４６９００７２、ｒｓ９１６１７１、ｒｓ３０２５８４９、ｒｓ７６９１６２７、ｒｓ４６９００７３、ｒｓ３８５６９７３、ｒｓ３６３０９２、ｒｓ３６２３１０、ｒｓ３６２３２５、ｒｓ３６３１４４、ｒｓ３６２３０３、ｒｓ３４３１５８０６、ｒｓ３６３０９９、ｒｓ３６３０８１、ｒｓ３７７５０６１、ｒｓ２０２４１１５、ｒｓ１０４８８８４０、ｒｓ３６３１２５、ｒｓ３６２２９６、ｒｓ２２９８９６７、ｒｓ３６３０８８、ｒｓ３６３０６４、ｒｓ３６２２７５、ｒｓ３１２１４１９、ｒｓ３０２５８４９、ｒｓ３６３０７０、ｒｓ３６２２７３、ｒｓ３６２２７２、ｒｓ３６２３０６、ｒｓ３６２２７１、ｒｓ３６３０７２、ｒｓ１６８４３８０４、ｒｓ７６５９１４４、ｒｓ３６３１２０、及びｒｓ１２５０２０４５から成る群のいずれかである、態様１に記載の方法。
［態様４８］前記１又は複数の濃度は、２つの濃度、３つの濃度、４つの濃度、及び５つの濃度から成る群のいずれかである、態様１に記載の方法。
［態様４９］１つの細胞、組織又は動物における前記対立遺伝子多様体の阻害度が、別の細胞、組織又は動物と比較してどれだけ向上したかにより選択性が決定される、態様１に記載の方法。
［態様５０］遺伝子の第１対立遺伝子多様体が、前記遺伝子の第２対立遺伝子多様体に関連して発現するのを、薬剤が選択的に阻害するかどうかを判断するための方法であって、前記の第１対立遺伝子多様体は、ＳＮＰ位置において第１のヌクレオチドを含み、前記の第２対立遺伝子多様体は、前記ＳＮＰ位置において第２のヌクレオチドを含み、
第１の細胞、組織又は動物を、１又は複数の濃度の前記薬剤と接触させ、前記の第１の細胞、組織又は動物は、前記ＳＮＰ位置における前記の第１ヌクレオチドにとってホモ接合であり；
第２の細胞、組織又は動物を、１又は複数の濃度の前記薬剤と接触させ、前記の第２の細胞、組織又は動物は、前記ＳＮＰ位置における前記の第２ヌクレオチドにとってホモ接合であるか、又は前記ＳＮＰ位置における前記の第１ヌクレオチド及び前記の第２ヌクレオチドにとってヘテロ接合であり；
前記遺伝子の前記第１対立遺伝子多様体が前記遺伝子の前記第２対立遺伝子多様体に関連して発現するのを、前記薬剤が選択的に阻害するかどうかを判断するために、１又は複数の濃度の前記薬剤それぞれについて、前記細胞、組織又は動物それぞれにおける前記の発現阻害度を比較し、前記の第１及び第２の細胞、組織又は動物それぞれにおいて、前記薬剤のＩＣ５０値を計算し；及び
前記の第１対立遺伝子多様体が前記の第２対立遺伝子多様体に関連して発現するのを、前記薬剤が選択的に阻害するかどうかを判断するために、前記ＩＣ５０値を比較する、
ことが含まれる方法。
［態様５１］突然変異ハンチンチン対立遺伝子の発現が選択的に低減される、ｒｓ３６２３０６、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ２２９８９６９、ｒｓ７６８５６８６、ｒｓ４６９００７２、ｒｓ２０２４１１５又はｒｓ３６３０８８から選択される一塩基多型を含む位置にある突然変異ハンチンチン対立遺伝子に相補的な修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物を、細胞、組織、又は動物に投与することを含む、細胞、組織又は動物の突然変異ハンチンチン対立遺伝子の発現を選択的に低減する方法。
［態様５２］ｒｓ３６２３０６、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ２２９８９６９、ｒｓ７６８５６８６、ｒｓ４６９００７２、ｒｓ２０２４１１５又はｒｓ３６３０８８から選択される一塩基多型を含む対立遺伝子のあるポジションに位置する突然変異ハンチンチン対立遺伝子に対して相補的な修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、動物への投与により突然変異ハンチンチン対立遺伝子を選択的に低減することにより、ハンチントン病を治療し、改善し、又は発症若しくは進行を遅らせる化合物を動物に投与することを含む、ハンチントン病の治療、改善、又は発症若しくは進行の遅延の方法。
［態様５３］突然変異ハンチンチン対立遺伝子の発現が、野生型ハンチンチン対立遺伝子の発現と比較して、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％は選択的に低減される、態様５１及び５２に記載の方法。
［態様５４］ｒｓ３６２３０６、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ２２９８９６９、ｒｓ７６８５６８６、ｒｓ４６９００７２、ｒｓ２０２４１１５又はｒｓ３６３０８８から選択される一塩基多型部位を含むポジションにおける突然変異ハンチンチン対立遺伝子に相補的な修飾オリゴヌクレオチドを含む、１又は複数の追加の化合物を投与する、態様５１及び５２に記載の方法。
［態様５５］修飾オリゴヌクレオチドが１５〜２０連結ヌクレオシドから成り、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３，１４、又は１５が、一塩基多型と一致する、態様５１及び５２に記載の方法。
［態様５６］修飾オリゴヌクレオチドが突然変異ハンチンチン対立遺伝子に対し９０％相補的である、態様５５に記載の方法。
［態様５７］修飾オリゴヌクレオチドが突然変異ハンチンチン対立遺伝子に対し９５％相補的である、態様５５に記載の方法。
［態様５８］修飾オリゴヌクレオチドが突然変異ハンチンチン対立遺伝子に対し１００％相補的である、態様５５に記載の方法。
［態様５９］修飾オリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドである、態様５５に記載の方法。
［態様６０］少なくとも１つのヌクレオシド間連結が修飾ヌクレオシド間連結である、態様５５に記載の方法。
［態様６１］各ヌクレオシド間連結がホスホロチオ酸ヌクレオシド間連結である、態様６０に記載の方法。
［態様６２］少なくとも１つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含む、態様５５に記載の方法。
［態様６３］少なくとも１つの修飾核酸塩基が５’−メチルシトシンである、態様６２に記載の方法。
［態様６４］少なくとも１つのヌクレオシドが修飾糖を含む、態様５５に記載の方法。
［態様６５］修飾糖が高度親和性糖修飾である、態様６４に記載の方法。
［態様６６］高度親和性糖修飾が二環式糖である、態様６５に記載の方法。
［態様６７］各二環式糖に４’−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−２’ブリッジが含まれる、態様６６に記載の方法。
［態様６８］少なくとも１つの修飾糖に２’−Ｏ−メトキシエチルが含まれる、態様６４に記載の方法。
［態様６９］修飾オリゴヌクレオチドにウイング−ギャップ−ウイングモチーフが含まれる、態様５５に記載の方法。
［態様７０］修飾オリゴヌクレオチドのウィングセグメントに位置する各ヌクレオシドに２’−Ｏ−メトキシエチル修飾が含まれる、態様６９に記載の方法。
［態様７１］ウイング−ギャップ−ウイングモチーフが、２−９−６、３−９−３、３−９−４、３−９−５、４−７−４、４−９−４、４−９−５、４−１０−５、４−１１−４、４−１１−５、５−７−５、５−８−６、５−９−３、５−９−５、５−１０−４、５−１０−５、６−７−６、６−８−５、及び６−９−２から成る群のいずれかである、態様６９に記載の方法。
［態様７２］修飾オリゴヌクレオチドは、リボザイム、二本鎖ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡではない、態様５５に記載の方法。
［態様７３］修飾オリゴヌクレオチドが１２〜２０連結ヌクレオシドから成る、態様６９に記載の方法。
［態様７４］修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが１５〜１９連結ヌクレオシドから成る、態様６９に記載の方法。
［態様７５］ギャップ領域が７〜１１ヌクレオシド長であり、５’ウィング領域が１〜６核酸塩基長であり、３’ウィング領域が１〜６核酸塩基長である、態様６９に記載の方法。
［態様７６］少なくとも１つのウィング領域の少なくとも１つのヌクレオシドに修飾糖又は糖代用が含まれる、態様６９に記載の方法。
［態様７７］各ウィング領域の各ヌクレオシドに修飾糖又は糖代用が含まれる、態様６９に記載の方法。
［態様７８］糖又は糖代用が２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖である、態様７７に記載の方法。
［態様７９］ウィング領域の少なくとも１つに４’〜２’二環式ヌクレオシドが含まれ、残りのウィングヌクレオシドの少なくとも１つが非二環式２’−修飾ヌクレオシドである、態様６９に記載の方法。
［態様８０］非二環式２’−修飾ヌクレオシドが２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドである、態様７９に記載の方法。
［態様８１］４’〜２’二環式ヌクレオシドが４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’二環式ヌクレオシドである、態様７９に記載の方法。
［態様８２］突然変異ハンチンチン対立遺伝子の発現の選択的低減を必要とする動物において突然変異ハンチンチン対立遺伝子の発現を選択的に低減することを含むハンチントン病の治療法であって、１５〜２０の連結ヌクレオシドから成り、突然変異ハンチンチン対立遺伝子に対し完全に相補的である修飾オリゴヌクレオチドを含み、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５が、ｒｓ６４４６７２３、ｒｓ３８５６９７３、ｒｓ２２８５０８６、ｒｓ３６３０９２、ｒｓ９１６１７１、ｒｓ６８４４８５９、ｒｓ７６９１６２７、ｒｓ４６９００７３、ｒｓ２０２４１１５、ｒｓ１１７３１２３７、ｒｓ３６２２９６、ｒｓ１００１５９７９、ｒｓ７６５９１４４、ｒｓ３６３０９６、ｒｓ３６２２７３、ｒｓ１６８４３８０４、ｒｓ３６２２７１、ｒｓ３６２２７５、ｒｓ３１２１４１９、ｒｓ３６２２７２、ｒｓ３７７５０６１、ｒｓ３４３１５８０６、ｒｓ３６３０９９、ｒｓ２２９８９６７、ｒｓ３６３０８８、ｒｓ３６３０６４、ｒｓ３６３１０２、ｒｓ２７９８２３５、ｒｓ３６３０８０、ｒｓ３６３０７２、ｒｓ３６３１２５、ｒｓ３６２３０３、ｒｓ３６２３１０、ｒｓ１０４８８８４０、ｒｓ３６２３２５、ｒｓ３５８９２９１３、ｒｓ１９３６０３２、ｒｓ２２７６８８１、ｒｓ３６３０７０、ｒｓ１２５０２０４５、ｒｓ７６８５６８６、ｒｓ３７３３２１７、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ２８５７９３６、ｒｓ１２５０６２００、ｒｓ７６２８５５、ｒｓ４６９００７２、ｒｓ３６３０８１、ｒｓ３６３０７５、ｒｓ３０２５８４９、ｒｓ６８５５９８１、ｒｓ３６３１４４、ｒｓ３０２５８３８、ｒｓ２２９８９６９、ｒｓ３６２３２２、ｒｓ３６２３０７、ｒｓ３６２３０６、及びｒｓ１００６７９８から成る群における任意のＳＮＰ部位と一致する化合物を、動物に投与することを含むハンチントン病の治療法。
［態様８３］修飾オリゴヌクレオチドが、ｒｓ７６２８５５、ｒｓ２２９８９６９、ｒｓ２７９８２９６、ｒｓ６４４６７２３、ｒｓ３８５６９７３、ｒｓ２２８５０８６、ｒｓ４６９００７２、ｒｓ１２６３３０９、ｒｓ３６３０９２、ｒｓ１０８８５０、ｒｓ９１６１７１、ｒｓ６８４４８５９、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ７６９１６２７、ｒｓ４６９００７３、ｒｓ７６８５６８６、ｒｓ３６２３０７、ｒｓ２０２４１１５、ｒｓ２８５７９３６、及びｒｓ１１７３１２３７から成る群における任意のＳＮＰ部位と一致する、態様８２に記載の方法。
［態様８４］１５〜２０連結ヌクレオシド長であり、ハンチンチンの一塩基多型を標的とし、配列番号６〜２８５のいずれか一つの核酸塩基配列の１２核酸塩基部分を含む修飾オリゴヌクレオチドを含み、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５が、ハンチンチンの一塩基多型と一致する化合物。
［態様８５］修飾オリゴヌクレオチドは、５−１０−５、２−９−６、３−９−３、３−９−４、３−９−５、４−７−４、４−９−３、４−９−４、４−９−５、４−１０−５、４−１１−４、４−１１−５、５−７−５、５−８−６、５−９−３、５−９−５、５−１０−４、５−１０−５、６−７−６、６−８−５、及び６−９−２から成る群の任意の１つのウイング−ギャップ−ウイングモチーフを含む、態様８４に記載の化合物。
［態様８６］少なくとも１つのヌクレオシド間連結は修飾ヌクレオシド間連結である、態様８５に記載の化合物。
［態様８７］各ヌクレオシド間連結がホスホロチオ酸ヌクレオシド間連結である、態様８６に記載の化合物。
［態様８８］少なくとも１つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含む、態様８５に記載の方法。
［態様８９］修飾核酸塩基が５’−メチルシトシンである、態様８８に記載の化合物。
［態様９０］少なくとも１つのウィング領域の少なくとも１つのヌクレオシドに修飾糖又は糖代用が含まれる、態様８４に記載の化合物。
［態様９１］各ウィング領域の各ヌクレオシドに修飾糖又は糖代用が含まれる、態様９０に記載の化合物。
［態様９２］糖又は糖代用が２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖である、態様９１に記載の化合物。
［態様９３］少なくとも１つのウィング領域には、４’〜２’二環式ヌクレオシドが含まれ、残りのウィングヌクレオシドのうち少なくとも１つが、非二環式２’−修飾ヌクレオシドである、態様８５に記載の化合物。
［態様９４］非二環式２’−修飾ヌクレオシドが、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドである、態様９３に記載の化合物。
［態様９５］４’〜２’二環式ヌクレオシドが４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’二環式ヌクレオシドである、態様９３に記載の化合物。
［態様９６］態様８４に記載の化合物を投与することを含む、突然変異ハンチンチンを選択的に低減する方法。
［態様９７］１５〜２０連結ヌクレオシド長であり、ハンチンチンの一塩基多型を標的とし、配列番号６〜２８５のいずれか一つの核酸塩基配列の１２核酸塩基部分を含む修飾オリゴヌクレオチドを含み、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端から数えて、修飾オリゴヌクレオチドのポジション５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５が、ハンチントン病治療のためのハンチンチン一塩基多型と一致する化合物の利用。

【実施例】

【0313】

非限定開示及び引用により含める
本明細書に記載の特定の化合物、組成物及び方法は、特定の実施形態に従って具体的に記載したが、以下の実施例は、本明細書に記載の化合物を例示することのみを目的とし、それを制限することを意図しない。本明細書で言及する又は引用する特許、出願、刊行物、及びその他の公開文献は、その全体を引用により本明細書に含めるものとする。

【実施例1】

【0314】

ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子配列における一塩基多型（ＳＮＰ）
本明細書で配列番号１（ヌクレオチドの１５６６０００〜１７６８０００まで切断されたＮＴ＿００６０８１．１８）と指定したＨＴＴ遺伝子配列を、ＥＭＢＬ−ＥＢＩ配列データベース（ＣｌｕｓｔａｌＷ２、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いて、本明細書で配列番号２（ＮＭ＿００２１１１．６）と指定したＨＴＴｍＲＮＡと一致させ、その結果を図１に示した。ＨＴＴ遺伝子と関連するＳＮＰ位置（Ｈａｙｄｅｎら、国際公開第２００９／１３５３２２号により同定）を２本の配列にマップし、図１では、本明細書に引用により含まれる、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｓｎｐ）のＥｎｔｒｅｚ ＳＮＰデータベースから取得した参照ＳＮＰのＩＤ番号別に示した。表２では、各ＳＮＰのさらなる詳細を提供する。「参照ＳＮＰのＩＤ番号」又は「ＲＳ番号」は、本明細書に引用により含まれるＮＣＢＩのＥｎｔｒｅｚ ＳＮＰデータベースから取得した各ＳＮＰの指定番号である。「ＳＮＰ位置」は、配列番号１のＳＮＰのヌクレオチド位置を指している。「多型」は、ＳＮＰ位置のヌクレオチド多様体のことである。「メジャー対立遺伝子」とは、メジャー対立遺伝子と関連するヌクレオチド、又はヒト集団の中の統計的に有意な割合の個体集団に存在するヌクレオチドのことである。「マイナー対立遺伝子」は、マイナー対立遺伝子と関連するヌクレオチド、又はヒト集団の中の比較的少数の個体集団に存在するヌクレオチドのことである。

【0315】

【表2-1】

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【表2-2】

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【実施例2】

【0316】

ハンチンチン遺伝子ＳＮＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド及びＣｏｒｉｅｌｌ製繊維芽細胞株（ＧＭ０４２８１、ＧＭ０２１７１、及びＧＭ０２１７３Ｂ）のＨＴＴｍＲＮＡの阻害の設計
表１に提示されたＳＮＰ位置と重複するヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、Ｃｏｒｉｅｌｌ製の３つのハンチンチン患者由来繊維芽細胞株、ＧＭ０４２８１、ＧＭ０２１７１、及びＧＭ０２１７３Ｂ（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈより取得）における有効性を試験した。ウェルあたり２０，０００個の細胞密度のＧＭ０４２８１培養細胞又はＧＭ０２１７１培養細胞又はＧＭ０２１７３Ｂ培養細胞を、電気穿孔を用いて、１０，０００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約２４時間処理した後、ＲＮＡを細胞から単離し、プライマープローブセットＲＴＳ２６１７（配列番号３として指定されている順方向配列ＣＴＣＣＧＴＣＣＧＧＴＡＧＡＣＡＴＧＣＴ；配列番号４として指定されている逆方向配列ＧＧＡＡＡＴＣＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧ；配列番号５として指定されているプローブ配列ＴＧＡＧＣＡＣＴＧＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＧＡＴＡＴＣＧＧＧＡＸ）を用いて、定量リアルタイムＰＣＲによりＨＴＴｍＲＮＡレベルを測定した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って、ＨＴＴｍＲＮＡレベルを調整した。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡの阻害度として提示されている。

【0317】

各試験には、ＩＳＩＳ３８７９１６（ＴＣＴＣＴＡＴＴＧＣＡＣＡＴＴＣＣＡＡＧ、５−１０−５ＭＯＥ（配列番号６））及びＩＳＩＳ３８８８１６（ＧＣＣＧＴＡＧＣＣＴＧＧＧＡＣＣＣＧＣＣ、５−１０−５ＭＯＥ（配列番号７））が、各ＳＮＰ位置と重複するヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性の比較対象となり得るベンチマークオリゴヌクレオチドとして含まれた。

【0318】

表３及び表４のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−９−５ＭＯＥギャップマーとして設計された。ギャップマーは１９ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、その両端（５’末端及び３’末端）は、それぞれ５個のヌクレオチドを含むウィングと隣接している。５’ウィングセグメントの各ヌクレオチド及び３’ウィングセグメントの各ヌクレオチドは、２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマーの中ではすべて、ヌクレオシド間連結はホスホロチオ酸（Ｐ＝Ｓ）連結である。各ギャップマーの中ではすべて、全シトシン核酸塩基は５−メチルシトシンである。

【0319】

オリゴヌクレオチドについては、表３にさらに記載した。各細胞株のアンチセンスオリゴヌクレオチドによるＨＴＴｍＲＮＡの阻害度については、表４に示した。「標的対立遺伝子」は、ギャップマーが、ＳＮＰ位置のメジャー対立遺伝子を標的としているのか、又はマイナー対立遺伝子を標的としているのかを示している。括弧内の数字は、オリゴヌクレオチドの５’末端から数えた、ＳＮＰ位置と相対するギャップマーのヌクレオチド位置を示している。「開始部位」は、ギャップマーが標的とする最も５’末端側ヌクレオチドを示す。「終止部位」は、ギャップマーが標的とする最も３’末端側ヌクレオチドを示す。表３及び表４に列挙された各ギャップマーは、配列番号１であるヒトＨＴＴｐｒｅ−ｍＲＮＡを標的とする。

【0320】

【表3-1】

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【表3-2】

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【表3-3】

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【表3-4】

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【表3-5】

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【0321】

【表4-1】

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【表4-2】

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【表4-3】

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【表4-4】

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【表4-5】

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【実施例3】

【0322】

Ｃｏｒｉｅｌｌ製繊維芽細胞株のヒトハンチンチンｍＲＮＡレベルの用量依存的アンチセンス阻害
実施例２に記載の研究由来のギャップマーを選抜し、ＧＭ０４２８１細胞株、ＧＭ０２１７１細胞株、及びＧＭ０２１７３Ｂ細胞株において様々な用量で試験した。各細胞株を、ウェルあたり２５，０００個の細胞密度で播種し、電気穿孔を用いて、表５、表６、及び表７に記載したように、７５０ｎＭ、１，５００ｎＭ、３，０００ｎＭ、６，０００ｎＭ、及び１２，０００ｎＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約１６時間処理した後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＨＴＴｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトＨＴＴプライマープローブセットＲＴＳ２６１７を用いて、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＨＴＴｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って調整された。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡ阻害度として示した。ＩＣ_５０値も表５、表６、及び表７で提供されている。

【0323】

【表5】

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【0324】

【表6-1】

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【表6-2】

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【0325】

【表7】

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【実施例4】

【0326】

Ｃｏｒｉｅｌｌ製繊維芽細胞株におけるヒトハンチンチンｍＲＮＡレベルの用量依存的アンチセンス阻害
実施例２に記載の研究由来のギャップマーを選抜し、ＧＭ０４２８１細胞株、ＧＭ０２１７１細胞株、及びＧＭ０２１７３Ｂ細胞株において様々な用量で試験した。各細胞を、ウェルあたり２５，０００個の細胞密度で播種し、電気穿孔を用いて、表８、表９、及び表１０に記載されているように、７５０ｎＭ、１，５００ｎＭ、３，０００ｎＭ、６，０００ｎＭ、及び１２，０００ｎＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約１６時間処理した後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＨＴＴｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトＨＴＴプライマープローブセットＲＴＳ２６１７を用いて、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＨＴＴｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って調整された。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡ阻害度として示した。ＩＣ_５０値も表８、表９、及び表１０で提供されている。

【0327】

【表8】

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【0328】

【表9】

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【0329】

【表10】

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【実施例5】

【0330】

ＧＭ０４２８１細胞におけるヒトＨＴＴのアンチセンス阻害
追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、実施例４に記載の研究から選抜したギャップマーに基づき設計した。これらのオリゴヌクレオチドは、表８、表９、表１０に記載のオリジナルギャップマーの少し上流及び下流（すなわち「マイクロウォーク」）に移動させたギャップマーを作成することにより設計された。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ＭＯＥを共通とし、加えて様々なモチーフで、すなわち２−９−６ＭＯＥ、３−９−３ＭＯＥ、３−９−４ＭＯＥ、３−９−５ＭＯＥ、４−１０−５ＭＯＥ、４−１１−４ＭＯＥ、４−７−４ＭＯＥ、４−９−４ＭＯＥ、４−９−５ＭＯＥ、５−１０−４ＭＯＥ、５−７−５ＭＯＥ、５−８−６ＭＯＥ、５−９−３ＭＯＥ、５−９−５ＭＯＥ、６−７−６ＭＯＥ、６−９−２ＭＯＥ、及び６−８−５ＭＯＥで作成された。

【0331】

さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＮＰ ＲＳ番号がｒｓ２８５７９３６、ｒｓ１２５０６２００、ｒｓ７６２８５５、及びｒｓ１００６７９８であるものを標的とするよう設計された（表２を参照のこと）。オリゴヌクレオチドは、メジャー対立遺伝子又はマイナー対立遺伝子のいずれかを標的とし、ＳＮＰ位置がギャップマーのポジション８又は１０のいずれかと相対するよう設計された。

【0332】

これらギャップマーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。ウェルあたり２５，０００個の細胞密度のＧＭ０４２８１培養細胞を、電気穿孔を用いて、１０，０００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約２４時間処理した後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＨＴＴｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ＨＴＴｍＲＮＡレベルを、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って調整した。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡ阻害度として表１１〜１９に提示されている。

【0333】

ギャップマーＩＳＩＳ４３５８６９、ＩＳＩＳ４３５８７０、ＩＳＩＳ４３５８７４、ＩＳＩＳ４３５８７９、及びＩＳＩＳ４３５８９０には、表の中で＊印を付した。新たに設計されたギャップマーの一部は、これらを元に設計されている。ＩＳＩＳ３８７９１６は、各ＳＮＰ位置と重複するヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性の比較対象となり得るベンチマークオリゴヌクレオチドとして本研究に含まれた。

【0334】

共通のＭＯＥオリゴヌクレオチドは、１５ヌクレオチド長である。

【0335】

２−９−６ギャップマーは、１７ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、２個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向に隣接し、６個のヌクレオチドを含むウィングと３’方向に隣接している。

【0336】

３−９−３ギャップマーは、１５ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、それぞれ３個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向及び３’方向に隣接している。

【0337】

３−９−４ギャップマーは、１６ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、３個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向に、４個のヌクレオチドを含むウィングと３’方向に隣接している。

【0338】

３−９−５ギャップマーは、１７ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、３個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向に、５個のヌクレオチドを含むウィングと３’方向に隣接している。

【0339】

４−１０−５ギャップマーは、１９ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、１０個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、４個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向に、５個のヌクレオチドを含むウィングと３’方向に隣接している。

【0340】

４−１１−４ギャップマーは、１９ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、１１個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、それぞれ４個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向及び３’方向に隣接している。

【0341】

４−７−４ギャップマーは、１５ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、７個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、それぞれ４個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向及び３’方向に隣接している。

【0342】

４−９−４ギャップマーは、１７ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、それぞれ４個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向及び３’方向に隣接している。

【0343】

４−９−５ギャップマーは、１８ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、４個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向に、５個のヌクレオチドを含むウィングと３’方向に隣接している。

【0344】

５−１０−４ギャップマーは、１９ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、１０個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、５個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向に、４個のヌクレオチドを含むウィングと３’方向に隣接している。

【0345】

５−７−５ギャップマーは、１７ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、７個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、それぞれ５個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向及び３’方向に隣接している。

【0346】

５−８−６ギャップマーは、１９ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、８個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、５個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向に、６個のヌクレオチドを含むウィングと３’方向に隣接している。

【0347】

５−９−３ギャップマーは、１７ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、５個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向に、３個のヌクレオチドを含むウィングと３’方向に隣接している。

【0348】

５−９−５ギャップマーは、１９ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、それぞれ５個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向及び３’方向に隣接している。

【0349】

６−７−６ギャップマーは、１９ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、７個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、それぞれ６個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向及び３’方向に隣接している。

【0350】

６−９−２ギャップマーは、１７ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、６個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向に、２個のヌクレオチドを含むウィングと３’方向に隣接している。

【0351】

６−８−５ギャップマーは、１９ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、８個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、６個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向に、５個のヌクレオチドを含むウィングと３’方向に隣接している。

【0352】

各モチーフに関して、５’ウィングセグメントの各ヌクレオチド及び３’ウィングセグメントの各ヌクレオチドは２’−ＭＯＥ修飾を有する。ギャップマーの中ではすべて、ヌクレオシド間連結はホスホロチオ酸（Ｐ＝Ｓ）連結である。各ギャップマーの中ではすべて、全シトシン核酸塩基は５−メチルシトシンである。

【0353】

標的対象のＳＮＰに従って、オリゴヌクレオチドを表にまとめた。「開始部位」は、ギャップマーが標的とする最も５’末端側ヌクレオチドを示す。「終止部位」は、ギャップマーが標的とする最も３’末端側ヌクレオチドを示す。「標的対立遺伝子」は、ギャップマーがメジャー対立遺伝子を標的としているのか、又はマイナー対立遺伝子を標的としているかを示す。括弧内の数字は、ＳＮＰ位置と相対するオリゴヌクレオチドの位置を示している。

【0354】

【表11】

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【0355】

【表12】

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【0356】

【表13】

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【0357】

【表14-1】

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【表14-2】

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【0358】

【表15-1】

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【表15-2】

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【0359】

【表16】

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【0360】

【表17】

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【0361】

【表18-1】

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【表18-2】

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【0362】

【表19】

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【実施例6】

【0363】

Ｃｏｒｉｅｌｌ製繊維芽細胞株におけるヒトハンチンチンｍＲＮＡレベルの用量依存的アンチセンス阻害
実施例５に記載の研究由来のギャップマーを選抜し、ＧＭ０４２８１細胞株、ＧＭ０２１７１細胞株、及びＧＭ０２１７３Ｂ細胞株において様々な用量で試験した。各細胞株を、ウェルあたり２５，０００個の細胞密度で播種し、電気穿孔を用いて、表２０、表２１、及び表２２に記載されているように、７５０ｎＭ、１，５００ｎＭ、３，０００ｎＭ、６，０００ｎＭ、及び１２，０００ｎＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約１６時間処理した後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＨＴＴｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトＨＴＴプライマープローブセットＲＴＳ２６１７を用いて、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＨＴＴｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って調整された。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡ阻害度として示した。ＩＣ_５０値も表２０、表２１、及び表２２で提供されている。

【0364】

【表20-1】

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【表20-2】

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【0365】

【表21-1】

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【表21-2】

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【0366】

【表22-1】

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【表22-2】

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【実施例7】

【0367】

ＧＭ０４２８１細胞及びＧＭ０２１７１細胞におけるヒトＨＴＴのアンチセンス阻害
追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、実施例２に記載の研究から選抜されたギャップマーに基づき設計した。これらのオリゴヌクレオチドは、表４に記載のオリジナルギャップマーの少し上流及び下流（すなわち「マイクロウォーク」）に移動させたギャップマーを作成することにより設計された。

【0368】

ギャップマーは、ＧＭ０４２８１細胞株及びＧＭ０２１７１細胞株で試験された。ウェルあたり２５，０００個の細胞密度のＧＭ０４２８１培養細胞又はＧＭ０２１７１培養細胞を、電気穿孔を用いて、１０，０００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約２４時間処置した後ＲＮＡを細胞から単離し、プライマープローブセットＲＴＳ２６１７を用いて、定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ＨＴＴｍＲＮＡレベルを、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って調整した。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡ阻害度として提供されている。

【0369】

新たに設計されたオリゴヌクレオチドの由来元であるギャップマーもまたアッセイに含まれた。これらの親ギャップマー、すなわち、ＩＳＩＳ４３５２９４、ＩＳＩＳ４３５２９５、ＩＳＩＳ４３５３０１、ＩＳＩＳ４３５３０３、ＩＳＩＳ４３５３０４、ＩＳＩＳ４３５３０５、ＩＳＩＳ４３５３０８、ＩＳＩＳ４３５３３０、ＩＳＩＳ４３５３３１、ＩＳＩＳ４３５３３７、ＩＳＩＳ４３５３３９、ＩＳＩＳ４３５３４０、ＩＳＩＳ４３５３４１、ＩＳＩＳ４３５３４４、ＩＳＩＳ４３５８６２、ＩＳＩＳ４３５８６３、ＩＳＩＳ４３５８６４、ＩＳＩＳ４３５８６６、ＩＳＩＳ４３５８６７、ＩＳＩＳ４３５８６８、ＩＳＩＳ４３５８７１、ＩＳＩＳ４３５８７３、ＩＳＩＳ４３５８７５、ＩＳＩＳ４３５８７６、ＩＳＩＳ４３５８７８、ＩＳＩＳ４３５８８０、ＩＳＩＳ４３５８８１、ＩＳＩＳ４３５８８２、ＩＳＩＳ４３５８８４、ＩＳＩＳ４３５８９０、及びＩＳＩＳ４３５８９７には、表の中で＊印を付した。ＩＳＩＳ３８７９１６は、各ＳＮＰ位置と重複するヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性の比較対象となり得るベンチマークオリゴヌクレオチドとして本研究に含まれた。

【0370】

表２３〜４８のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−９−５ＭＯＥギャップマーとして設計された。５−９−５ギャップマーは、１９ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、それぞれ５個のヌクレオチドを含むウィングと５’方向及び３’方向に隣接している。５’ウィングセグメントの各ヌクレオチド及び３’ウィングセグメントの各ヌクレオチドは、２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマーの中ではすべて、ヌクレオシド間連結はホスホロチオ酸（Ｐ＝Ｓ）連結である。各ギャップマーの中ではすべて、全シトシン核酸塩基は５−メチルシトシンである。

【0371】

標的とするＳＮＰ部位に従って、ギャップマーを表２３〜４８にまとめた。「開始部位」は、ギャップマーが標的とする最も５’末端側ヌクレオチドを示す。「終止部位」は、ギャップマーが標的とする最も３’末端側ヌクレオチドを示す。「標的対立遺伝子」は、ギャップマーがメジャー対立遺伝子を標的としているのか、又はマイナー対立遺伝子を標的としているかを示す。括弧内の数字は、ＳＮＰ位置に相対するオリゴヌクレオチドの位置を示している。

【0372】

【表23】

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【0373】

【表24】

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【0374】

【表25】

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【0375】

【表26】

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【0376】

【表27】

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【0377】

【表28】

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【0378】

【表29-1】

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【表29-2】

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【0379】

【表30】

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【0380】

【表31】

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【0381】

【表32】

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【0382】

【表33】

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【0383】

【表34】

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【0384】

【表35】

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【0385】

【表36-1】

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【表36-2】

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【0386】

【表37】

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【0387】

【表38】

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【0388】

【表39】

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【0389】

【表40】

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【0390】

【表41】

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【0391】

【表42】

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【0392】

【表43-1】

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【表43-2】

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【0393】

【表44】

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【0394】

【表45】

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【0395】

【表46】

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【0396】

【表47】

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【0397】

【表48】

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【実施例8】

【0398】

Ｃｏｒｉｅｌｌ製繊維芽細胞株のヒトハンチンチンｍＲＮＡレベルの用量依存的アンチセンス阻害
実施例７に記載の研究由来のギャップマーを選抜し、ＧＭ０４２８１細胞株、ＧＭ０２１７１細胞株、及びＧＭ０２１７３Ｂ細胞株において様々な用量で試験した。各細胞株を、ウェルあたり２５，０００個の細胞密度で播種し、電気穿孔を用いて、表４９、表５０、及び表５１に記載されているように、７５０ｎＭ、１，５００ｎＭ、３，０００ｎＭ、６，０００ｎＭ、及び１２，０００ｎＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約１６時間処理した後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＨＴＴｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトＨＴＴプライマープローブセットＲＴＳ２６１７を用いて、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＨＴＴｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って調整された。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡ阻害度として示した。ＩＣ_５０値も表４９、表５０、及び表５１で提供されている。

【0399】

【表49】

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【0400】

【表50-1】

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【表50-2】

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【0401】

【表51】

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【実施例9】

【0402】

マイクロウォークにより設計されたオリゴヌクレオチドによるＧＭ０４２８１細胞のヒトＨＴＴのアンチセンス阻害
追加のギャップマーを、実施例４に記載の研究から選択されたギャップマーに基づき設計した。これらギャップマーは、表８、表９、表１０に記載のオリジナルギャップマーの少し上流及び下流（すなわち「マイクロウォーク」）に移動させたギャップマーを作成することにより設計された。ギャップマーはまた、３−９−３又は５−９−５モチーフで、及び様々なヌクレオシド位置の拘束６（Ｓ）−ＣＨ_３−二環式核酸（ＢＮＡ）分子で作成された。

【0403】

これらのギャップマーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験された。ウェルあたり２５，０００個の細胞密度のＧＭ０４２８１培養細胞を、電気穿孔を用いて、５，０００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約２４時間処置した後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＨＴＴｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ＨＴＴｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って調整された。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡ阻害度として示した。

【0404】

表５２〜５６のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、３−９−３又は５−９−５ギャップマーとして設計された。親ギャップマー、すなわちＩＳＩＳ４３５８６９、ＩＳＩＳ４３５８７０、ＩＳＩＳ４３５８７４、ＩＳＩＳ４３５８７９、及びＩＳＩＳ４３５８９０は、新たに設計されたギャップマーの由来元であるが、表の中で＊印を付した。ＩＳＩＳ３８７９１６は、各ＳＮＰ位置と重複するヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性の比較対象となり得るベンチマークオリゴヌクレオチドとして本研究に含まれた。

【0405】

３−９−３ギャップマーは、１５ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオシドから成り、それぞれ３個の糖修飾ヌクレオシドを含むウィングと、５’方向及び３’方向に隣接している。

【0406】

５−９−５ギャップマーは、１９ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオシドから成り、それぞれ５個の糖修飾ヌクレオシドを含むウィングと、５’方向及び３’方向に隣接している。

【0407】

各ギャップマーの中ではすべて、ヌクレオシド間連結はホスホロチオ酸（Ｐ＝Ｓ）連結である。各ギャップマーの中ではすべて、全シトシン核酸塩基は５−メチルシトシンである。表５２〜５６の中で太字及び下線を引いたヌクレオチドは、各ギャップマーにおける６（Ｓ）−ＣＨ_３−ＢＮＡ分子（例えば、ｃＥｔ分子）の位置を示している。イタリック体のヌクレオチドは、ＭＯＥサブユニットである。

【0408】

「開始部位」は、ギャップマーが標的とする最も５’末端側ヌクレオチドを示している。「終止部位」は、ギャップマーが標的とする最も３’末端側ヌクレオチドを示している。「標的対立遺伝子」は、ギャップマーがメジャー対立遺伝子を標的としているのか、又はマイナー対立遺伝子を標的としているかを示す。括弧内の数字は、ＳＮＰ位置に相対するオリゴヌクレオチドの位置を示している。

【0409】

【表52】

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【0410】

【表53】

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【0411】

【表54】

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【0412】

【表55-1】

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【表55-2】

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【0413】

【表56】

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【実施例10】

【0414】

Ｃｏｒｉｅｌｌ製繊維芽細胞株のヒトハンチンチンｍＲＮＡレベルの用量依存的アンチセンス阻害
実施例９に記載の研究由来のギャップマーを選抜し、ＧＭ０４２８１細胞株、ＧＭ０２１７１細胞株、及びＧＭ０２１７３Ｂ細胞株において様々な用量で試験した。各細胞株を、ウェルあたり２５，０００個の細胞密度で播種し、電気穿孔を用いて、表７５、表５８、及び表５９に記載されているように、３１２．５ｎＭ、６２５ｎＭ、１，２５０ｎＭ、２，５００ｎＭ、５，０００ｎＭ、及び１０，０００ｎＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約１６時間処理した後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＨＴＴｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトＨＴＴプライマープローブセットＲＴＳ２６１７を用いて、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＨＴＴｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って調整された。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡ阻害度として提示されている。ＩＣ_５０値も表５７、表５８、及び表５９で提供されている。

【0415】

【表57】

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【0416】

【表58-1】

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【表58-2】

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【0417】

【表59-1】

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【表59-2】

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【実施例11】

【0418】

マイクロウォークで設計されたオリゴヌクレオチドによるＧＭ０４２８１細胞及びＧＭ０２１７１細胞におけるヒトＨＴＴの用量依存的アンチセンス阻害
追加のギャップマーを、実施例１０に記載の研究から選抜されたギャップマーに基づき設計した。これらのギャップマーは、表５７，表５８、及び表５９に記載のオリジナルギャップマーの少し上流及び下流（すなわち「マイクロウォーク」）に移動させたギャップマーを作成することにより設計された。ギャップマーはまた、４−９−４ＭＯＥ又は５−９−５ＭＯＥモチーフで、及び様々なヌクレオチド位置の拘束６（Ｓ）−ＣＨ_３−二環式核酸（ＢＮＡ）分子で作成された。

【0419】

これらギャップマーは、ＧＭ０４２８１細胞株及びＧＭ０２１７１細胞株で試験された。ウェルあたり２５，０００個の細胞密度のＧＭ０４２８１培養細胞又はＧＭ０２１７１培養細胞を、電気穿孔を用いて２，５００ｎＭ又は５，０００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約２４時間処理した後、ＲＮＡを細胞から単離し、定量リアルタイムＰＣＲでＨＴＴｍＲＮＡレベルを測定した。ＨＴＴｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って調整された。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡ阻害度として示された。

【0420】

表６０、表６１、及び表６２のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、３−９−３、４−９−４、又は５−９−５ＭＯＥギャップマーとして設計された。親ギャップマー、すなわちＩＳＩＳ４３５８９０、ＩＳＩＳ４６０２１０、ＩＳＩＳ４３５８７９、ＩＳＩＳ４６０２０９、ＩＳＩＳ４３５８７０、及びＩＳＩＳ４６０２０７は、新たに設計されたギャップマーの由来元であるが、表の中では＊印を付した。ＩＳＩＳ３８７９１６は、各ＳＮＰ位置と重複するヌクレオチドを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性の比較対象となり得るベンチマークオリゴヌクレオチドとして本研究に含まれた。

【0421】

３−９−３ギャップマーは、１５ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、それぞれ３個のヌクレオチドを含むウィングと、５’方向及び３’方向に隣接している。

【0422】

４−９−４ギャップマーは、１７ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、それぞれ４個のヌクレオチドを含むウィングと、５’方向及び３’方向に隣接している。

【0423】

５−９−５ギャップマーは、１９ヌクレオチド長であり、中央ギャップセグメントは、９個の２’−デオキシヌクレオチドから成り、それぞれ５個のヌクレオチドを含むウィングと、５’方向及び３’方向に隣接している。

【0424】

各ギャップマーの中ではすべて、ヌクレオシド間連結はホスホロチオ酸（Ｐ＝Ｓ）連結である。各ギャップマーの中ではすべて、全シトシン核酸塩基は５−メチルシトシンである。表６０、表６１、及び表６２の中で、太字及び下線を引いたヌクレオチドは、各ギャップマーにおける６（Ｓ）−ＣＨ_３−ＢＮＡ分子（例えば、ｃＥｔ分子）の位置を示している。イタリック体のヌクレオチドは、ＭＯＥサブユニットである。

【0425】

標的とするＳＮＰ部位に従って、ギャップマーを表６０、表６１、及び表６２にまとめた。「開始部位」は、ギャップマーが標的とする最も５’末端側ヌクレオチドを示す。「終止部位」は、ギャップマーが標的とする最も３’末端側ヌクレオチドを示す。「標的対立遺伝子」は、ギャップマーがメジャー対立遺伝子を標的としているのか、又はマイナー対立遺伝子を標的としているかを示す。
括弧内の数字は、ＳＮＰ位置と相対するオリゴヌクレオチドの位置を示している。

【0426】

【表60】

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【0427】

【表61-1】

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【表61-2】

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【0428】

【表62-1】

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【表62-2】

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【実施例12】

【0429】

Ｃｏｒｉｅｌｌ製繊維芽細胞株のヒトハンチンチンｍＲＮＡレベルの用量依存的アンチセンス阻害
実施例１１に記載の研究由来のギャップマーを選抜し、ＧＭ０４２８１細胞株、ＧＭ０２１７１細胞株、及びＧＭ０２１７３Ｂ細胞株において様々な用量で試験した。各細胞株を、ウェルあたり２５，０００個の細胞密度で播種し、電気穿孔を用いて、表６３、表６４、及び表６５に記載されているように、６２５ｎＭ、１，２５０ｎＭ、２，５００ｎＭ、５，０００ｎＭ、及び１０，０００ｎＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約１６時間処理した後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＨＴＴｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトＨＴＴプライマープローブセットＲＴＳ２６１７を用いて、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＨＴＴｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って調整された。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡ阻害度として示した。ＩＣ_５０値も表６３、表６４、及び表６５で提供されている。

【0430】

【表63】

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【0431】

【表64-1】

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【表64-2】

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【0432】

【表65】

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【実施例13】

【0433】

有効性及び選択性に基づくアンチセンスオリゴヌクレオチドの選択戦略
上記の各研究由来のギャップマーを、有効性及び選択性に基づくさらなる解析のために選抜した。

【0434】

有効性は、ベンチマークオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ３８７９１６により達成されるＨＴＴｍＲＮＡの阻害度と比較した、ＳＮＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドにより達成されるＨＴＴｍＲＮＡの阻害度に基づいた。

【0435】

選択性は、マイナー対立遺伝子ではなく、メジャー対立遺伝子の発現を阻害するＳＮＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力に基づいた。各ＳＮＰ位置に異なる遺伝子型を有する３つの細胞株を利用することにより、このプロセスを促進させた。

【0436】

ＩＳＩＳ４６００６５（５’−ＡＴＡＡＡＴＴＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＧ−３’（配列番号１９９））は、オリゴヌクレオチドのポジション９のＳＮＰｒｓ７６８５６８６（メジャー対立遺伝子Ａ、マイナー対立遺伝子Ｇ）を標的とする４−９−５ＭＯＥギャップマーである。ＧＭ０４２８１細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ７６８５６８６でホモ接合ＡＡである。ＧＭ０２１７３Ｂ細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ７６８５６８６でヘテロ接合ＡＧである。ＧＭ０２１７１細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ７６８５６８６のホモ接合ＧＧである。よって、ＩＳＩＳ４６００６５は、ＧＭ０４２８１においてＨＴＴｍＲＮＡを阻害する可能性があり、ＧＭ０２１７３においてはＨＴＴｍＲＮＡ阻害の可能性は低く、ＧＭ０２１７１においては有意なＨＴＴｍＲＮＡ阻害はほとんど認められない若しくは皆無であれば、選択性が示されたことになる。表２０、２１、及び２２から引用し、また下記の表６６に示したＩＣ_５０値により、ホモ接合ＡＡ細胞株において発現が最も低減し、ヘテロ接合ＡＧ細胞株において適度に低減され、ホモ接合ＧＧ細胞株ではあまり低減されなかったという、３つの細胞株における阻害度の違いが確認された。ＩＣ_５０は、５０％阻害ＨＴＴｍＲＮＡに求められるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度である。ＩＣ_５０値の単位は、μＭである。

【0437】

【表66】

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【0438】

ＩＳＩＳ４５９９７８（５’−ＡＣＡＧＴＧＣＴＡＣＣＣＡＡＣＣＴ−３’(配列番号１７４))は、オリゴヌクレオチドのポジション９のＳＮＰｒｓ４６９００７２（メジャー対立遺伝子Ｔ、マイナー対立遺伝子Ｇ）を標的とする２−９−６ＭＯＥギャップマーである。ＧＭ０４２８１細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ４６９００７２でホモ接合ＴＴである。ＧＭ０２１７３Ｂ細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ４６９００７２でヘテロ接合ＴＧである。ＧＭ０２１７１細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ４６９００７２でホモ接合ＧＧである。よって、ＩＳＩＳ４５９９７８は、ＧＭ０４２８１においてＨＴＴｍＲＮＡを阻害する可能性があり、ＧＭ０２１７３においてはＨＴＴｍＲＮＡ阻害の可能性は低く、ＧＭ０２１７１においては有意なＨＴＴｍＲＮＡ阻害はほとんど認められない若しくは皆無であれば、選択性が示されたことになる。表２０、表２１、及び表２２から引用し、また下記の表６７に示したＩＣ_５０値により、ホモ接合ＴＴ細胞株において発現が最も低減し、ヘテロ接合ＴＧ細胞株において適度に低減され、ホモ接合ＧＧ細胞株ではあまり低減されなかったという、３つの細胞株における阻害度の違いが確認された。ＩＣ_５０は、５０％阻害ＨＴＴｍＲＮＡに求められるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度である。ＩＣ_５０値の単位は、μＭである。

【0439】

【表67】

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【0440】

ＩＳＩＳ４６００２８（５’−ＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＧＣＡ−３’（配列番号１４９））は、オリゴヌクレオチドのポジション１０のＳＮＰｒｓ３６２３０６（メジャー対立遺伝子Ｇ、マイナー対立遺伝子Ａ）を標的とする４−１１−４ＭＯＥギャップマーである。ＧＭ０４２８１細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ３６２３０６でホモ接合ＧＧである。ＧＭ０２１７３Ｂ細胞株及びＧＭ０２１７１細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ３６２３０６でヘテロ接合ＧＡである。よって、ＩＳＩＳ４６００２８は、ＧＭ０４２８１においてＨＴＴｍＲＮＡを阻害する可能性があり、ＧＭ０２１７３及びＧＭ０２１７１においてはＨＴＴｍＲＮＡ阻害の可能性は低くければ、選択性が示されたことになる。表２０、表２１、及び表２２から引用し、下記の表６８に示したＩＣ_５０値により、ホモ接合ＧＧ細胞株において発現が最も低減し、ヘテロ接合ＡＧ細胞株においてあまり低減されなかったという、ＧＭ０４２８１細胞株とＧＭ０２１７３Ｂ及びＧＭ０２１７１細胞株の阻害度の違いが確認された。ＩＣ_５０は、５０％阻害ＨＴＴｍＲＮＡに求められるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度である。ＩＣ_５０値の単位は、μＭである。

【0441】

【表68】

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【実施例14】

【0442】

有効性及び選択性に基づくｃＥｔモチーフを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの選択戦略
上記の各研究由来のギャップマーを、有効性及び選択性に基づくさらなる解析のために選抜した。

【0443】

有効性は、ベンチマークオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ３８７９１６により達成されるＨＴＴｍＲＮＡの阻害度と比較した、ＳＮＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドにより達成されるＨＴＴｍＲＮＡの阻害度を基にした。

【0444】

選択性は、マイナー対立遺伝子ではなく、メジャー対立遺伝子の発現を阻害するＳＮＰを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を基にした。各ＳＮＰ位置に異なる遺伝子型を有する３つの細胞株を利用することにより、このプロセスを促進させた。

【0445】

ＩＳＩＳ４６０２０９（５’−ＴＡＡＡＴＴＧＴＣＡＴＣＡＣＣ−３’（配列番号２０３））は、オリゴヌクレオチドのポジション８のＳＮＰｒｓ７６８５６８６（メジャー対立遺伝子Ａ、マイナー対立遺伝子Ｇ）を標的とし、ポジション２、３、１３、及び１４にｃＥｔサブユニットを有する３−９−３ギャップマーである。ＧＭ０４２８１細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ７６８５６８６でホモ接合ＡＡである。ＧＭ０２１７３Ｂ細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ７６８５６８６でヘテロ接合ＡＧである。ＧＭ０２１７１細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ７６８５６８６でホモ接合ＧＧである。よって、ＩＳＩＳ４６０２０９は、ＧＭ０４２８１においてＨＴＴｍＲＮＡを阻害する可能性があり、ＧＭ０２１７３においてはＨＴＴｍＲＮＡ阻害の可能性は低く、ＧＭ０２１７１においては有意なＨＴＴｍＲＮＡ阻害はほとんど認められない若しくは皆無であれば、選択性が示されたことになる。表５７、表５８、及び表５９から引用し、下記の表６９に示したＩＣ_５０値により、ホモ接合ＡＡ細胞株において発現が最も低減し、ヘテロ接合ＡＧ細胞株において適度に低減され、ホモ接合ＧＧ細胞株ではあまり低減されなかったという、３つの細胞株における阻害度の違いが確認された。ＩＣ_５０は、５０％阻害ＨＴＴｍＲＮＡに求められるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度である。ＩＣ_５０値の単位は、μＭである。

【0446】

【表69】

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【0447】

ＩＳＩＳ４６０２０８（５’−ＣＡＧＴＧＣＴＡＣＣＣＡＡＣＣ−３’（配列番号１７７））は、オリゴヌクレオチドのポジション８のＳＮＰｒｓ４６９００７２（メジャー対立遺伝子Ｔ、マイナー対立遺伝子Ｇ）を標的とし、ポジション２、３、１３、及び１４にｃＥｔサブユニットを有する３−９−３ギャップマーである。ＧＭ０４２８１細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ４６９００７２でホモ接合ＴＴである。ＧＭ０２１７３Ｂ細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ４６９００７２でヘテロ接合ＴＧである。ＧＭ０２１７１細胞株は、ＳＮＰｒｓ４６９００７２のホモ接合ＧＧである。よって、ＩＳＩＳ４６０２０８が、ＧＭ０４２８１においてＨＴＴｍＲＮＡを阻害する可能性があり、ＧＭ０２１７３においてはＨＴＴｍＲＮＡ阻害の可能性は低く、ＧＭ０２１７１においては有意なＨＴＴｍＲＮＡ阻害はほとんど認められない若しくは皆無であれば、選択性が示されたことになる。表５７、表５８、及び表５９から引用し、下記の表７０に示したＩＣ_５０値により、ホモ接合ＴＴ細胞株において発現が最も低減し、ヘテロ接合ＴＧ細胞株において適度に低減され、ホモ接合ＧＧ細胞株ではあまり低減されなかったという、３つの細胞株における阻害度の違いが確認された。ＩＣ_５０は、５０％阻害ＨＴＴｍＲＮＡに求められるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度である。ＩＣ_５０値の単位は、μＭである。

【0448】

【表70】

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【0449】

ＩＳＩＳ４６０２０６（５’−ＧＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＧ−３’（配列番号２３１））は、オリゴヌクレオチドのポジション８のＳＮＰｒｓ３６２３０６（メジャー対立遺伝子Ｇ、マイナー対立遺伝子Ａ）を標的とし、ポジション２、３、１３、及び１４にｃＥｔサブユニットを有する３−９−３ギャップマーである。ＧＭ０４２８１細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ３６２３０６でホモ接合ＧＧである。ＧＭ０２１７３Ｂ及びＧＭ０２１７１細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ３６２３０６でヘテロ接合ＧＡである。よって、ＩＳＩＳ４６０２０６が、ＧＭ０４２８１においてＨＴＴｍＲＮＡを阻害する可能性があり、ＧＭ０２１７３及びＧＭ０２１７１においてはＨＴＴｍＲＮＡ阻害の可能性は低くなれば、選択性が示されたことになる。表５７、表５８、及び表５９から引用し、下記の表７１に示したＩＣ_５０値により、ホモ接合ＧＧ細胞株において発現が最も低減し、ヘテロ接合ＡＧ細胞株においてはあまり低減されなかったという、ＧＭ０４２８１細胞株とＧＭ０２１７３Ｂ及びＧＭ０２１７１細胞株の阻害度の違いが確認された。ＩＣ_５０は、５０％阻害ＨＴＴｍＲＮＡに求められるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度である。ＩＣ_５０値の単位は、μＭである。

【0450】

【表71】

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【実施例15】

【0451】

ハンチントン病に関連する様々な細胞株とマウスモデルにおけるＳＮＰの比較
ハンチントン病と関連する様々なＳＮＰ位置の遺伝子型を、上記実施例で使用された３つのＣｏｒｉｅｌｌ製細胞株の間で、並びにＧＭ０４０２２繊維芽細胞、ＢＡＣＨＤマウスモデル及びＹＡＣ１８マウスモデルと比較した。

【0452】

ドナー患者のＧＭ０４０２２繊維芽細胞株は、ＳＮＰ位置ｒｓ３６３１２５（ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ ＳＮＰデータベース）でヘテロ接合であり、Ａ対立遺伝子（アデニン）及びＣ対立遺伝子（シトシン）を配列番号２のヌクレオチド５３１０に有していた（ｖａｎ Ｂｉｌｓｅｎ，Ｐ．Ｈ．Ｊ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１９：７１０−７１８、２００８）。ＹＡＣ１８マウスは、ヒトハンチンチン遺伝子を含有するＹＡＣ導入遺伝子で開発した（Ｈｏｄｇｓｏｎ，ら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：１８７５−８５、１９９６）。ＢＡＣＨＤマウスは、バクテリア人工染色体のコントロール下で、９７グルタミン反復で全長突然変異ハンチンチン遺伝子を発現させて開発した（Ｇｒａｙ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃ．２８：６１８２−９５、２００８）。４つの細胞株及びマウスモデルにおける指定ＳＮＰ位置の遺伝子型を比較できるよう表７２に示した。

【0453】

【表72-1】

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【表72-2】

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【実施例16】

【0454】

ＢａｃＨＤ皮質ニューロンで測定された対立遺伝子特異的阻害
ヒトＨＴＴのＳＮＰｒｓ７６８５６８６を標的とするＩＳＩＳ４６０２０９（５’−ＴＡＡＡＴＴＧＴＣＡＴＣＡＣＣ−３’（配列番号２０３））、及びＩＳＩＳ３８７９１６（ＴＣＴＣＴＡＴＴＧＣＡＣＡＴＴＣＣＡＡＧ（配列番号６））で、非ヒト又はマウスＳＮＰ標的部位を有しないアンチセンスオリゴヌクレオチドのＨｔｔタンパク質レベルに対する効果について、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。ＩＳＩＳ３８７９１６を、ミスマッチ１つを有する標的の開始部位５７６３で、ネズミＨｔｔｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＭ＿０１０４１４．１、本明細書で配列番号２８６と指定）と相互反応させる。ＩＳＩＳ４６０２０９を、３つのミスマッチを有する標的開始部位６８６６で、ネズミＨｔｔｍＲＮＡと相互反応させる。

【0455】

ヒトＨｔｔ及びマウスＨｔｔを発現する原発性ＢａｃＨＤ皮質ニューロンを、以下のように単離した。Ｅ１５．５〜Ｅ１７．５の妊娠マウスから胚を切除した。皮質を切除して、氷冷二価遊離ハンクス平衡塩類溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１４０２５−１３４）に浸した。皮質を細かく切り、３７℃で８分間、０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、２５３００−１２０）で消化させた。完全ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１０８８８−０２２）を追加し、消化を中断した。培地で細胞を再懸濁し、ＤＮＡｓｅＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１８０４７−０１９）で処理した。１００ｕｌのピペットチップを介して滴定した後、細胞をｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地の中でＢ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１７５０４−０４４）で再懸濁し、カウントした。ウェルあたり１．７×１０^５細胞をポリ−Ｄ−リジン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、３５４２１０）でプレコートしたウェルプレート２４枚に播種した。ニューロンは、２日目にｉｎ ｖｉｔｒｏで、Ｂ２７を使い、２００μｌのｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地で培養した。

【0456】

ＩＳＩＳ４６０２０９又はＩＳＩＳ３８７９１６を、０．７μＭ、１．４μＭ又は１．５μＭ最終濃度で、ｄｉｖｉｓｉｏｎ２でニューロンへと培養された補足培地に加えた。８日後に、セルスクレーパーを用いて１ｍＬの培地に細胞を収穫した。２，５００ｒｐｍで５分間４℃で細胞を遠心分離し、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ＝８．０、１５０ｍＭＮａｃｌ、１％Ｉｇｅｐａｌ、４０ｍＭβ−グリセロリン酸塩、１０ｍＭＮａＦ、１×ロッシュ完全プロテアーゼ阻害（Ｒｏｃｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、及び８００μＭ ＰＭＳＦの緩衝液でペレットを再懸濁した。１５分間インキュベートした後、ライセートを遠心分離し、タンパク質濃度をＤＣアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。

【0457】

タンパク質ライセートを低ビス濃度ゲルで電気泳動し、ハンチンチン対立遺伝子を分離した（分解ゲル−２００１：アクリルアミド：ＢＩＳ（１０％アクリルアミド、０．５％ＢＩＳ、３７５ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ８．８；濃縮用ゲル−４％アクリルアミド−ＢＩＳ（２９：１）、１５６ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ６．８；泳動用緩衝液−２５ｍＭＴｒｉｓ，１９０ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ＋１０μＭβ−メルカプトエタノール（用時調製））。電気泳動の後、ゲル中のタンパク質をニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ Ｅｘｔｒａ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ社）に９０Ｖで４０分間移動させ、試料を濃縮ゲルに浸透させ、その後１９０Ｖで２．５時間タンパク質を分解した。

【0458】

ヒトＨｔｔ及びマウスカルネキシンタンパク質に特異的な原発性抗体を１：１０，０００希釈で使用した。ＨＲＰ標識抗マウス二次抗体（１：１０，０００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ研究所）を使用して、スーパーシグナルウェストピコ化学発光基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてタンパク質を可視化した。ＩｍａｇｅＪのソフトウェアを用いてタンパク質のバンドを定量化し、カルネキシンのレベルに正規化した。タンパク質のバンドをＩｍａｇｅＪのソフトウェアを用いて定量化した。表７３では、陰性対照試料に対する阻害度の推定値を示した。また、ヒトＨｔｔタンパク質及びマウスＨｔｔのタンパク質の阻害度の比較を示した。

【0459】

【表73】

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【実施例17】

【0460】

Ｃｏｒｉｅｌｌ製の繊維芽細胞株におけるヒトハンチンチンｍＲＮＡレベルの用量依存的アンチセンス阻害
実施例３、４、１０，及び１２に記載の研究由来のギャップマーを選抜し、ＧＭ０４２８１細胞株、ＧＭ０２１７１細胞株、及びＧＭ０２１７３Ｂ細胞株において様々な用量で試験した。各細胞株を、ウェルあたり２５，０００個の細胞密度で播種し、電気穿孔を用いて、表７２、表７３、及び表７４に記載されているように、０．４７４７ｎＭ、１．５０１１ｎＭ、４．７４６３ｎＭ、１５．００７９ｎＭ、４５．４５５ｎＭ、１５０．０５２７ｎＭ、４７４．４６７３ｎＭ、１，５００．２７ｎＭ、４，７４３．８３３ｎＭ、及び１５，０００ｎＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。約１６時間処理した後、ＲＮＡを細胞から単離し、ＨＴＴｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトＨＴＴプライマープローブセットＲＴＳ２６１７を用いて、ｍＲＮＡレベルを測定した。ＨＴＴｍＲＮＡレベルは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したＲＮＡの全内容物に従って調整された。結果は、未処理対照細胞に対するＨＴＴｍＲＮＡ阻害度として提示されている。ＩＣ_５０値も表７２、表７３、及び表７４で提供されている。

【0461】

【表74】

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【0462】

【表75】

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【0463】

【表76】

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【実施例18】

【0464】

分子ビーコンアッセイによるヒトハンチンチンのＳＮＰを標的とするＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの特異性検証
実施例１７に記載の研究由来のギャップマーの一部をＧＭ０４０２２繊維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ製）で試験した。

【0465】

ＩＳＩＳ４３５８７９、ＩＳＩＳ４６０２０９、及びＩＳＩＳ４７６３３３により、ＧＭ０４０２２繊維芽細胞のＨＴＴｍＲＮＡの対立遺伝子特異的抑制を検証するために、ｖａｎ Ｂｉｌｓｅｎらによる文献（ｖａｎ Ｂｉｌｓｅｎ、Ｐ．Ｈ．Ｊ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１９：７１０−７１８、２００８）に記載の分子ビーコンアッセイを、蛍光体及び消光剤と連結した「分子ビーコン」合成オリゴヌクレオチドを用いて行った。ＧＭ０４０２２繊維芽細胞を電気穿孔で、表７５〜７７に記載されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を０．０６μＭ、０．１９μＭ、０．５６μＭ、１．６７μＭ、５μＭ及び１５μＭとし、ＩＳＩＳ４３５８７９、ＩＳＩＳ４６０２０９又はＩＳＩＳ４７６３３３で形質移入した。ベンチマークオリゴヌクレオチドとしてＩＳＩＳ３８７９１６をアッセイに含めた。アニーリング温度５６．５℃でＡ対立遺伝子用の分子ビーコンのｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを行った。アニーリング温度６２．０℃でＣ対立遺伝子用の分子ビーコンのｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを行った。プライマープローブセットＲＴＳ２６１７を用いて、ＨＴＴｍＲＮＡの総低減量を測定した。アッセイの結果は、表７７〜７９に、ＰＢＳ対照に対する阻害度として提示した。結果として、ＳＮＰ特異的ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、Ａ対立遺伝子と比べて、ｒｓ７６８５６８６のＣ対立遺伝子を特異的に標的とすることが示された（表８０）。

【0466】

【表77】

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【0467】

【表78】

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【0468】

【表79】

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【0469】

【表80】

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【実施例19】

【0470】

ＢＡＣＨＤマウス及びＹＡＣ１８マウス由来の皮質ニューロンで測定した対立遺伝子特異的阻害
ヒト対立遺伝子特異的ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドのスクリーニングに有望なＳＮＰを同定するために、ＹＡＣ１８マウス及びＢＡＣＨＤマウスのＨＴＴｍＲＮＡをＧｏｌｄｅｎｇａｔｅ９６ＳＮＰアッセイにより配列決定した。ＢＡＣマウス及びＹＡＣマウスは、いくつかの主要ＳＮＰ位置（表７２）に異なる対立遺伝子を擁し、よって、対立遺伝子特異的ノックダウンのスクリーニングツールとして用いられ得ると判断した。マウス種における標的に選ばれた各ＳＮＰ位置もヒトＨＤ染色体と比較した。各標的に関して、ヒトＨＤ集団の約５０％は、ＹＡＣ１８マウスではなく、ＢＡＣＨＤマウスで発現する標的に対しヘテロ接合である。

【0471】

ＩＳＩＳオリゴヌクレオチド（実施例２、９、１７及び１８に記載）の対立遺伝子特異性を検証するために、アンチセンスオリゴヌクレオチド類、すなわち、ＳＮＰｒｓ３６２３３１を標的とするＩＳＩＳ４６０２０７、ＳＮＰｒｓ７６８５６８６を標的とするＩＳＩＳ４６０２０９、ＳＮＰｒｓ７６８５６８６を標的とするＩＳＩＳ４３５８７９、ＳＮＰｒｓ７６８５６８６を標的とするＩＳＩＳ４７６３３３、ＳＮＰｒｓ２２９８９６９を標的とするＩＳＩＳ４６０２１０、ＳＮＰｒｓ４６９００７２を標的とするＩＳＩＳ４３５８７４、ＳＮＰｒｓ４６９００７２を標的とするＩＳＩＳ４６０２０８、ＳＮＰｒｓ２０２４１１５を標的とするＩＳＩＳ４３５３３１、及びＳＮＰｒｓ３６３０８８を標的とするＩＳＩＳ４３５８７１に対し、これらがＢＡＣＨＤ及びＹＡＣ１８皮質ニューロンのＨＴＴタンパク質レベルに及ぼす効果について試験した。ＩＳＩＳ３８７９１６は、ヒト又はマウスＳＮＰ標的部位を有さず、ベンチマークとして使用した。ＩＳＩＳ３８７９１６を、ミスマッチ１つを有する標的開始部位５７６３で、マウスＨＴＴｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＭ＿０１０４１４．１、本明細書において配列番号２８６と指定）と相互反応させた。対立遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドでの治療により、ＹＡＣ１８ニューロンにおいてではなく、ＢＡＣＨＤニューロンにおいてＨＴＴｍＲＮＡを有意に阻害することが予測された。また、ＩＳＩＳ３８７９１６での治療により両セットのニューロンにおいてＨＴＴｍＲＮＡを阻害することが予測された。

【0472】

ＹＡＣ１８培養物は、ＹＡＣ１８（ライン６０、＋／＋）の雄マウスで交配させたＥ１６．５の妊娠雌マウスＹＡＣ１８（ライン６０，＋／＋）から作成した。よって、子孫はすべてホモ接合型ＹＡＣ１８（ライン６０）であり、プールド皮質培養を促進する。ＢＡＣＨＤのＥ１６．５胚を、妊娠ＢＡＣＨＤ（＋／−）雄マウスと交配させた妊娠ＢＡＣＨＤ（＋／−）マウスから単離し、マウス胎仔単独培養して遺伝子型同定を行った。試料の相互汚染防止のため、単一皮質を単離した。分離された各皮質を用いて、６ウェルプレートの５つのウェルに播種した。遺伝子型同定後、ＡＳＯ処置にはＢＡＣＨＤ（＋／−）培養のみを用いた。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ｄｉｖｉｓｉｏｎ２でニューロンへと培養された補足培地に加えた。８日後に、セルスクレーパーを用いて１ｍＬの培地に細胞を収穫した。２，５００ｒｐｍで５分間４℃で細胞を遠心分離し、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ＝８．０、１５０ｍＭ Ｎａｃｌ、１％Ｉｇｅｐａｌ、４０ｍＭβ−グリセロリン酸塩、１０ｍＭ ＮａＦ、１×ロッシュ完全プロテアーゼ阻害（Ｒｏｃｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、及び８００μＭ ＰＭＳＦの緩衝液でペレットを再懸濁した。１５分間インキュベートした後、ライセートを遠心分離し、タンパク質濃度をＤＣアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。

【0473】

タンパク質ライセートを低ビス濃度ゲルで電気泳動し、ハンチンチン対立遺伝子を分離した（分解ゲル−２００１：アクリルアミド：ＢＩＳ（１０％アクリルアミド、０．５％ＢＩＳ、３７５ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ８．８；濃縮用ゲル−４％アクリルアミド−ＢＩＳ（２９：１）、１５６ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ６．８；泳動用緩衝液−２５ｍＭＴｒｉｓ、１９０ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ＋１０μＭβ−メルカプトエタノール（用時調製））。電気泳動の後、ゲル中のタンパク質をニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ−ＣＥｘｔｒａ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ社）に９０Ｖで４０分間移動させ、試料を濃縮ゲルに浸透させ、その後１９０Ｖで２．５時間タンパク質を分解した。

【0474】

ヒトＨＴＴ及びマウスカルネキシンタンパク質に特異的な原発性抗体を１：１０，０００希釈で使用した。ＨＲＰ標識抗マウス二次抗体（１：１０，０００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ研究所）を使用して、スーパーシグナルウェストピコ化学発光基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてタンパク質を可視化した。ＩｍａｇｅＪのソフトウェアを用いてタンパク質のバンドを定量化し、カルネキシンのレベルに正規化した。表８１〜９１では、未処理対照試料に対する阻害度を示した。また、ＢＡＣＨＤニューロン及びＹＡＣ１８ニューロンにおけるヒトＨＴＴタンパク質レベルの阻害度を提示した。

【0475】

【表81】

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【0476】

【表82】

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【0477】

【表83】

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【表84】

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【表85】

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【図1-1】

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【図1-160】

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【図1-161】

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【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]