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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6018585
(24)【登録日】2016年10月7日
(45)【発行日】2016年11月2日
(54)【発明の名称】心血管イメージングに関連する材料および方法
(51)【国際特許分類】
A61K 49/00 20060101AFI20161020BHJP
【ＦＩ】
A61K49/00ZNA
A61K49/00 Z
【請求項の数】7
【全頁数】24
(21)【出願番号】特願2013-553019(P2013-553019)
(86)(22)【出願日】2012年2月8日
(65)【公表番号】特表2014-508147(P2014-508147A)
(43)【公表日】2014年4月3日
(86)【国際出願番号】GB2012000133
(87)【国際公開番号】WO2012107725
(87)【国際公開日】20120816
【審査請求日】2015年2月6日
(31)【優先権主張番号】1102189.6
(32)【優先日】2011年2月8日
(33)【優先権主張国】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】513200313
【氏名又は名称】キングス・カレッジ・ロンドン
(74)【代理人】
【識別番号】100140109
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 新次郎
(74)【代理人】
【識別番号】100075270
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 泰
(74)【代理人】
【識別番号】100101373
【弁理士】
【氏名又は名称】竹内 茂雄
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100107386
【弁理士】
【氏名又は名称】泉谷 玲子
(74)【代理人】
【識別番号】100163784
【弁理士】
【氏名又は名称】武田 健志
(72)【発明者】
【氏名】ボトナール，ルネ
(72)【発明者】
【氏名】フィニカリドー，アルキスティス
【審査官】
鳥居 福代
(56)【参考文献】
【文献】
特表２００８−５０９９２１（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２０１０／０７９１５６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２００９／０６３９９５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特表２００２−５２０４２１（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表昭６３−５０３０６２（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２０１１／００５３２２（ＷＯ，Ａ２）
【文献】
特表平０３−５０５０９４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表平０５−５０７２７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表平０１−５０１７９６（ＪＰ，Ａ）
【文献】
Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.，２００３年，Vol.23, No.4，p.582-587
【文献】
J. Vasc. Surg.，２００１年，Vol.33, No.3，p.614-620
【文献】
Circ. J.，２００９年，Vol.73, No.11，p.2154-2162
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ ４９／００−４９／２２
Ａ６１Ｋ ５１／００−５１／１２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
イメージングプローブに連結したトロポエラスチン特異的結合剤を含むコンジュゲートを含む、プラークをイメージングするための医薬組成物であって、該コンジュゲートによるプラークのイメージングは患者がプラークの破裂または不安定性により起きる状態を発現するリスクを判定するためのものであり、
該コンジュゲートが、
(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS、
(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS-K(DOTA-Gd)、
K(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS-K(DOTA-Gd)、
K(DOTA-Gd)K(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS、
K(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS、
K(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY-K(DOTA-Gd)、
(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY-K(DOTA-Gd)、
(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY、
K(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHYまたは
K(DOTA-Gd)K(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY
のうちの１つである、前記医薬組成物。
該コンジュゲートが、
(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS、
(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS-K(DOTA-Gd)、
K(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS-K(DOTA-Gd)、
K(DOTA-Gd)K(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS、
K(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS、
K(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY-K(DOTA-Gd)、
(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY-K(DOTA-Gd)、
(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY、
K(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHYまたは
K(DOTA-Gd)K(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY
のうちの１つである、前記医薬組成物。
【請求項2】
コンジュゲートがアミノ酸配列VGVAPGに結合することができる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
プラークが心血管プラークである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
心血管プラークがアテローム硬化プラークである、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項5】
状態が急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、発作または大動脈瘤である、請求項３または４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
コンジュゲートによるプラークイメージングを用いて、患者のための処置コースを決定し、患者を特定の療法のための患者クラスに配属し、プラークの負荷を評価し、疾患の進行をモニターし、および／またはある療法に対する患者の応答を判定する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
イメージングプローブに連結したトロポエラスチン特異的結合剤を含むコンジュゲートを用いるプラークイメージング方法に使用するための請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、該コンジュゲートによるプラークイメージングは患者がプラークの破裂または不安定性により起きる状態を発現するリスクを判定するためのものであり、該方法は下記を含むものである、医薬組成物：
（ａ）患者に、コンジュゲートを含む組成物を投与し；
（ｂ）コンジュゲートを患者の血管系のプラーク中に存在するいずれかのトロポエラスチンに結合させ；
（ｃ）イメージングプローブを検出してプラークの存在を判定し；そして
（ｄ）心血管プラークをコンジュゲートでイメージングすることにより、患者がプラークの破裂または不安定性により起きる状態を発現するリスクを判定する。
（ａ）患者に、コンジュゲートを含む組成物を投与し；
（ｂ）コンジュゲートを患者の血管系のプラーク中に存在するいずれかのトロポエラスチンに結合させ；
（ｃ）イメージングプローブを検出してプラークの存在を判定し；そして
（ｄ）心血管プラークをコンジュゲートでイメージングすることにより、患者がプラークの破裂または不安定性により起きる状態を発現するリスクを判定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、プラーク（斑）のイメージング（画像化）に関連する材料および方法、より詳細には、プラークの負荷および不安定性、疾患の進行、ならびに療法に対する応答を評価するために、プラークをイメージングできる物質を用いて心血管プラークをイメージングすることに関する。
【背景技術】
【0002】
急性心筋梗塞（ＡＭＩ）および発作（脳卒中）は、西洋諸国において依然として死亡および罹病の主因である。ＡＭＩは、主に不安定／易損性アテローム硬化プラークの破裂または浸食により起きる。内皮機能障害、炎症、血管新生、外部リモデリング、および細胞外マトリックス組織崩壊を含めた複雑な一群の生物学的プロセスが、プラークの進行および脱安定と関連している。同様に、大動脈瘤の発生および破裂は炎症およびマトリックス分解の結果であると考えられている。
【0003】
破裂／浸食しやすいプラークを識別できることが望ましいので、プラークの負荷および不安定性、疾患の進行を評価し、療法に対する応答を評価することは、この領域における研究の主題であった。冠血管造影法、すなわち冠血管壁の間接的視覚化に限定された手法を用いる初期の研究により、疾患の程度、疾患の進行、および関連する心血管疾患死亡率の間の関係が確立された。血管壁を高い空間解像度でイメージングして正確なプラーク負荷の定量を可能にするために、血管内超音波（intravascular ultrasound）（ＩＶＵＳ）および光学コヒーレンス断層法が開発された。しかし、これらの手法の侵襲性のため、大きな患者集団のスクリーニングまたは追跡調査は実施できない。疾患の負荷と進行は、有害な転帰に対する独立した予測因子として確立された。ＦＤＧ−ＰＥＴは、プラークのマクロファージ含量と関連があること、またＩＶＵＳにおけるエコー透過性（echolucency）、ＭＲにおけるプラーク出血および脂質に富んだプラーク、ならびにマクロファージ特異的ＣＴ造影剤の取込みを含めた、易損性プラークのイメージング特徴と関連があることが示された。
【0004】
分子磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）は非侵襲的手法であり、インビボでの生物学的マーカーの視覚化を可能にする。他の臨床用分子イメージング様式と比較して有意に高い空間解像度を達成できるので、それは比較的薄い動脈血管壁の評価に好適である。たとえばWO 2007/05491には、プラークのイメージングのためにヒドラジドコンジュゲートをＭＲＩ剤として使用することが開示されている。しかし、緩和度（relaxivity）の高い造影剤の設計において前進はなされたが、感度は依然として陽電子放射断層撮影法、単光子放射コンピューター断層撮影法および光学イメージングと比較した分子ＭＲＩに対する主な制限因子である。
【0005】
動脈プラーク中のエラスチンおよびトロポエラスチンの存在は研究の主題であった。Krettek et al. (1)は、ヒトのアテロームおよび腹部大動脈瘤中に非罹患動脈と比較してトロポエラスチンが増加することを記載している。彼らは、マクロファージがトロポエラスチンの供給源の可能性があることも示している。Xu et al. (2)は、トロポエラスチン発現を泡沫細胞病変の発生と密接に関連したものとして記載している。Akima et al. (3)は、脂質に富んだプラークおよび破裂プラーク中のエラスチンｍＲＮＡのレベルは高いけれどもエラスチンのレベルは低いことを記載している。
【0006】
トロポエラスチンおよびエラスチンの視覚化が種々の方法で試みられた；Kozel et al. (4)は色素で標識した抗体を利用して細胞内のエラスチンを視覚化し、Starcher et al. (5)はエラスチンではなくトロポエラスチン上のエピトープに対する抗体を記載している。WO 2011/005322 (6)は、エラスチンに富んだ組織をイメージングするための化合物を記載している。
【0007】
他のコンジュゲートを用いて血管傷害が調べられた。US 5972890 (7)には、血管傷害の部位に結合させるためにペプチド標識コンジュゲートを用いることが示唆されている。US 4877599 (8)には、ヒト−エラスチンに対する抗体をＩ−１２５にコンジュゲートさせたものをウサギに使用することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】WO 2007/05491
【特許文献2】WO 2011/005322
【特許文献3】US 5972890
【特許文献4】US 4877599
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Krettek et al 'Elastogenesis in human arterial disease: A role for macrophages in disordered elastin synthesis' Arterioscl. Throm. Vas. 23 (2003) 582-587
【非特許文献2】Xu et al 'Hypercholesterolemia superimposed by experimental hypertension induces differential distribution of collagen and elastin' Arterioscl. Throm. Vas. 20 (2000) 2566-2572
【非特許文献3】Akima et al 'Soluble Elastin Decreases in the Progress of Atheroma Formation in Human Aorta' Circ. J. 73 (2009) 2154-2162
【非特許文献4】Kozel et al 'Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters' J. Cell. Physiol. 207 (2006) 87-96
【非特許文献5】Starcher et al 'Antibody raised to AKAAAKAAAKA sequence on tropoelastin recognizes tropoelastin but not mature crosslinked elastin: A new tool in metabolic and structural studies of elastogenesis' Connect. Tissue Res. 40 (1999) 273-282
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
したがって、当該技術分野では、プラークのイメージングのための、特にプラークが破裂／浸食しやすいかどうかを評価するための、さらに他の方法を提供することが依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【0011】
概して、本発明は、破裂または浸食のリスクをもつ易損性プラークは安定なプラークと比較してトロポエラスチン含量が高く、トロポエラスチンに特異的に結合することができるイメージング剤をプラークのイメージングのために、たとえばプラークの負荷および不安定性、疾患の進行、ならびに／あるいは療法に対する応答の評価のために使用できるという知見に基づく。あるいは、またはさらに、不安定プラーク中では安定なプラークと比較してリシルオキシダーゼ活性が低下することを示す本明細書に開示する結果に基づいて、本発明は不安定プラークのマーカーとしてのリシルオキシダーゼの使用を含む。如何なる特定の理論によっても拘束されることを望むものではないが、リシルオキシダーゼはトロポエラスチンを架橋して成熟エラスチンを生成するのに関与する酵素であるため、これらの知見は関連している。したがって、本発明は、リシルオキシダーゼの存在、量または活性を検出するための新規なトロポエラスチン特異的造影剤および／またはイメージング剤を用いて不安定な破裂しやすいプラークの検出を改善するための手段を提供し、こうしてこのハイリスク患者集団においてより良好な誘導処置を行なうことができる。
【0012】
エラスチンは血管壁において重要な構造的役割を果たすが、生物学的シグナル伝達機能も備えている。幾つかの病的刺激がアテローム硬化症におけるエラスチン形成（elastogenesis）を誘発してプラークの発生に際してエラスチン含量を顕著に増大させるのに関与している可能性がある。未熟な弾性線維は、炎症細胞を動員するためのアテローム形成刺激を生じる可能性がある。ヒトのアテローム硬化プラークはそれらの相対エラスチン含量に基づいて潜在的に線維サブタイプとアテロームサブタイプに区別できることが指摘されているので、プラーク内エラスチン含量の量的変化のイメージングは単独で特にプラークの負荷を評価するための補足情報を与えることができる。
【0013】
したがって、第１観点において本発明は、トロポエラスチン特異的結合剤またはリシルオキシダーゼ特異的結合剤を含むプラークイメージング用コンジュゲートであって、結合剤がイメージングプローブに連結したものを提供する。
【0014】
さらに他の観点において、本発明は、トロポエラスチン特異的結合剤またはリシルオキシダーゼ特異的結合剤を含む、プラークのイメージング方法に使用するためのコンジュゲートであって、結合剤がイメージングプローブに連結したものを提供する。
【0015】
さらに他の観点において、本発明は、プラークのイメージングのための医薬の調製におけるコンジュゲートの使用であって、該コンジュゲートがトロポエラスチン特異的結合剤およびイメージングプローブを含むものを提供する。
【0016】
本発明は、心血管プラークのイメージングに関するものであってもよい。場合により、本発明の観点のいずれか１つによれば、プラークは心血管プラークであってもよい。場合により、本発明の観点のいずれか１つによれば、プラークはアテローム硬化性の心血管プラークであってもよい。
【0017】
さらに他の観点において、本発明は、本発明のコンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。一般に、組成物は患者に静脈内投与するためのものであろう。
【0018】
さらに他の観点において、本発明は対象において心血管プラークをイメージングする方法を提供し、この方法は下記を含む：（ａ）対象に、トロポエラスチン特異的結合剤およびイメージングプローブを含む心血管プラークイメージング用コンジュゲートを含む組成物を投与し；
（ｂ）イメージング剤を対象の血管系のプラーク中に存在するいずれかのトロポエラスチンに結合させ；
（ｃ）イメージングプローブを検出してプラークの存在を判定する。
【0019】
したがって本発明の方法は、心血管プラーク、たとえばアテローム硬化プラークをコンジュゲートでイメージングすることにより、患者がプラークの破裂または不安定性により起きる状態、たとえば急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、発作または大動脈瘤を発現する可能性を判定するために使用できる。さらに、あるいはその代りに、本発明の方法は、コンジュゲートによる心血管プラーク、たとえばアテローム硬化プラークのイメージングを、下記のために使用することをさらに含んでもよい：（ｉ）患者のための処置コースを決定する；および／または（ｉｉ）患者を特定の療法のための患者クラスに配属する；および／または（ｉｉｉ）プラークの負荷を評価する；（ｉｖ）疾患の進行をモニターする；および／または（ｖ）ある療法に対する患者の応答を判定する。これらの方法のいずれかの一部として、段階（ｃ）はプラーク中に存在するトロポエラスチンの定量を含むことができる。
【0020】
本発明の態様をここで添付の図面および例を参照して記載するが、これらは例示であって限定ではない。
【0021】
本明細書中で用いる“および／または”は、２つの特定した特徴または成分それぞれの具体的開示であって他方を含むものまたは含まないものであると解釈すべきである。たとえば“Ａおよび／またはＢ”は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、および（ｉｉｉ）ＡとＢの具体的開示であって、それぞれを個別に本明細書に述べたと同様であると解釈すべきである。
【0022】
状況からそうではないことが指示されない限り、前記に述べた特徴の記載および定義は本発明のいずれか特定の観点または態様に限定されず、記載したすべての観点および態様に同等に適用される。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図2】図２は、ＩＨＣによるウサギの安定プラークおよび不安定プラークにおけるトロポエラスチン線維の定量であり、安定プラークと対比して不安定プラークではトロポエラスチンのアップレギュレーションがみられることを示す。
【図3】図３は、ウサギの安定プラークおよび易損性プラークにおける総エラスチン（トロポエラスチンおよび成熟エラスチン）線維の定量であり、安定プラークと比較して易損性プラークは総エラスチン（トロポエラスチン＋成熟エラスチン）含量が高いことを示す。
【図6】図６は、ガドリニウム標識(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLSによるＡｐｏＥ−／−マウスモデルにおけるプラークのインビボイメージングであり、このコンジュゲートはプラーク負荷された腕頭動脈および大動脈弓に優先的に取り込まれるが、プラークを含まない頚動脈には取り込まれないことを示す。
【図7】図７は、ガドリニウム標識K-(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHYによるＡｐｏＥ−／−マウスモデルにおけるインビボイメージングであり、このコンジュゲートはプラーク負荷された腕頭動脈および大動脈弓に優先的に取り込まれるが、プラークを含まない頚動脈には取り込まれないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0024】
トロポエラスチン特異的またはリシルオキシダーゼ特異的結合剤トロポエラスチンはマトリックスタンパク質であり、それは合成されて血管壁の一部を形成する。未熟なトロポエラスチンの発現後、それは酵素リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）により共有結合架橋して構造性の成熟エラスチンになり（図１）、これが血管壁に引張り強さを与える。したがって本発明は、デノボ合成されたトロポエラスチンと成熟した架橋エラスチンとを、特にインビボで識別できるコンジュゲートに関するものである；前者はプラークの不安定性および破裂のリスク増大と関連し、これがＡＭＩおよび／または発作および／または大動脈瘤を生じる。ヒトのトロポエラスチン、リシルオキシダーゼおよびエラスチンの配列は、ウサギなどの動物モデルにおける対応するポリペプチドの配列と共に配列データベースにおいて入手できる（後記の配列セクションも参照されたい）。特異的結合ペプチドを設計し、あるいは抗体に基づく結合剤をスクリーニングするために、他の種に由来するトロポエラスチンを用いることもできる。たとえば同じコンジュゲートを動物モデルとヒト患者においてプラークのイメージングに使用するために、１種より多いトロポエラスチンに特異的に結合できるペプチドまたは抗体を設計することが有利な場合がある。
【0025】
場合により、本発明の観点のいずれか１つによれば、トロポエラスチン特異的結合ペプチドはトロポエラスチンを特異的に結合することができる。場合により、本発明の観点のいずれか１つによれば、トロポエラスチン特異的結合ペプチドはエラスチンには実質的に結合しない。好ましい態様において、トロポエラスチン特異的結合剤は、インビボでトロポエラスチンを特異的に結合することができ、かつインビボでエラスチンには実質的に結合しない。
【0026】
場合により、本発明の観点のいずれか１つによれば、トロポエラスチン特異的結合ペプチドは、血管内の他の成分またはタンパク質と比較してトロポエラスチンに対して特異的である。好ましい態様において、トロポエラスチン特異的結合剤は、インビボで血管内の他の成分またはタンパク質と比較してトロポエラスチンに対して特異的である。
【0027】
一般に、トロポエラスチン特異的結合剤は、トロポエラスチンに特異的に結合することができるポリペプチドまたはペプチドであってもよく、あるいはトロポエラスチンに特異的に結合することができる抗体分子であってもよい。好ましい態様において、トロポエラスチン特異的結合剤は、インビボでトロポエラスチンに特異的に結合することができるポリペプチドまたはペプチドであってもよく、あるいはインビボでトロポエラスチンに特異的に結合することができる抗体分子であってもよい。同様に、リシル−オキシダーゼ特異的結合剤は、リシルオキシダーゼに特異的に結合することができるポリペプチドまたはペプチドであってもよく、あるいはリシルオキシダーゼに特異的に結合することができる抗体分子であってもよい。
【0028】
トロポエラスチン特異的結合ペプチドの例には、アミノ酸配列VVGSPSAQDEASPLS、EGFEPGまたはYPDHVQYTHYをもつペプチドが含まれる。場合により、本発明の観点のいずれか１つによれば、トロポエラスチン特異的結合ペプチドは、配列VVGSPSAQDEASPLS、EGFEPGまたはYPDHVQYTHYからなる。当業者は、トロポエラスチンおよび／またはリシルオキシダーゼに結合することが知られているポリペプチドの既知のアミノ酸配列を利用し、交差反応を避ける必要性を考慮して、たとえばトロポエラスチン特異的結合剤の場合には特にインビボで成熟エラスチンに有意な程度に結合しないように、別のペプチド配列を容易に設計することができるであろう。実施例において、用いたペプチドは設計された後にＰｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌｔｄ）により化学合成された。
【0029】
場合により、本発明の観点のいずれか１つによれば、トロポエラスチン特異的結合ペプチドは、アミノ酸配列VVGSPSAQDEASPLSからの少なくとも４、６、８、１０、１２または１４個のアミノ酸の配列を含む。場合により、本発明の観点のいずれか１つによれば、トロポエラスチン特異的結合ペプチドは、５０個を超えない、３０、２０、１８または１６個を超えないアミノ酸の長さである。場合により、本発明の観点のいずれか１つによれば、トロポエラスチン特異的結合ペプチドは、アミノ酸配列VVGSPSAQDEASPLSを含むか、あるいはそれからなる。
【0030】
場合により、本発明の観点のいずれか１つによれば、トロポエラスチン特異的結合ペプチドは、アミノ酸配列YPDHVQYTHYからの少なくとも４、６または８個のアミノ酸の配列を含む。場合により、本発明の観点のいずれか１つによれば、トロポエラスチン特異的結合ペプチドは、５０個を超えない、３０、２０、１８、１６、１４、１２または１０個を超えないアミノ酸の長さである。場合により、本発明の観点のいずれか１つによれば、トロポエラスチン特異的結合ペプチドは、アミノ酸配列YPDHVQYTHYを含むか、あるいはそれからなる。
【0031】
本発明において、トロポエラスチン特異的結合剤は、アミノ酸配列VGVAPGを特異的に結合することができるペプチドまたは抗体分子であってもよい。場合により、本発明の観点のいずれか１つによれば、トロポエラスチン特異的結合剤は、アミノ酸配列QDEAを含むペプチドであってもよい。場合により、本発明の観点のいずれか１つによれば、トロポエラスチン特異的結合ペプチドは、５０個を超えない、３０、２０、１８、１６、１４、１２または１０個を超えないアミノ酸の長さである。如何なる特定の理論によっても拘束されることを望むものではないが、トロポエラスチン特異的結合剤上のアミノ酸残基QDEAがトロポエラスチンのヘキサペプチドVGVAPGを結合すると考えられる（図５）。
【0032】
本発明において、トロポエラスチン特異的結合剤は、トロポエラスチンに特異的に結合することができるペプチドまたは抗体分子であってもよく、好ましくはエラスチンおよび／または血管系の他の成分に実質的に結合しない。好ましい態様において、トロポエラスチン特異的結合剤は、インビボでトロポエラスチンに特異的に結合することができ、かつ好ましくはエラスチンおよび／または血管系の他の成分に実質的に結合することができない、ペプチドまたは抗体分子であってもよい。トロポエラスチン特異的結合剤（たとえば、ペプチドまたは抗体分子）は、トロポエラスチンに対して５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、または１ｎＭ未満の解離定数をもつことができる。これに対し、好ましくは、トロポエラスチン特異的結合剤（たとえば、抗トロポエラスチン抗体またはペプチド）はエラスチンに対して１００μｍｏｌ／Ｌを超える解離定数をもつことができる。たとえば、トロポエラスチン特異的結合剤（たとえば、抗トロポエラスチン抗体またはペプチド）は、インビボでのエラスチン（たとえば、哺乳動物、たとえばヒト対象中に存在するか、またはそれに由来するエラスチン）に対して１、１０、１００または２００μｍｏｌ／Ｌを超える解離定数をもつことができる。
【0033】
本発明において、リシルオキシダーゼ特異的結合剤が、リシルオキシダーゼに特異的に結合することができかつ血管系の他の成分には結合しないペプチドまたは抗体分子である場合、このペプチドまたはリシルオキシダーゼ抗体は、リシルオキシダーゼに対して５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、または１ｎＭ未満の解離定数をもつことができる。
【0034】
トロポエラスチン特異的結合ペプチドまたは抗トロポエラスチン抗体分子の結合反応速度および親和性（平衡解離定数Ｋｄとして表わす）は、たとえばＢＩＡｃｏｒｅ分析を用いる表面プラズモン共鳴などの標準法を用いて測定できる。
【0035】
本明細書に記載する抗トロポエラスチン抗体分子または抗リシルオキシダーゼ抗体分子は、免疫グロブリンまたはそのフラグメントであってもよく、天然のもの、または部分もしくは完全合成により製造したもの、たとえば組換え分子であってもよい。抗トロポエラスチン抗体分子の一例は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入できる：Ｃａｔ Ｎｏ．３２４７５６。
【0036】
抗トロポエラスチン抗体分子または抗リシルオキシダーゼ抗体分子には、抗体の抗原結合部位を含むいずれかのポリペプチドまたはタンパク質を含めることができ、これにはいずれかのイソ型またはサブクラスのＦａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ディアボディー、トリアボディー、テトラボディー、ミニボディー、および単一ドメイン抗体、ならびに完全抗体が含まれる。抗体分子、ならびにそれらを構築および使用するための方法は、たとえばHolliger & Hudson, Nature Biotechnology 23(9): 1126-1136 (2005)に記載されている。
【0037】
ある好ましい態様において、抗トロポエラスチン抗体分子または抗リシルオキシダーゼ抗体分子は、完全抗体であってもよい。たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥもしくはＩｇＭ、またはいずれかのイソ型サブクラス、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ４。抗トロポエラスチン抗体分子はモノクローナル抗体であってもよい。
【0038】
抗トロポエラスチン抗体分子または抗リシルオキシダーゼ抗体分子は、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であってもよい。
【0039】
本明細書に記載する抗トロポエラスチン抗体分子または抗リシルオキシダーゼ抗体分子は、夾雑物、たとえば他のポリペプチドおよび／または血清成分を結合することができる抗体を含まないという意味で、単離されていてもよい。モノクローナル抗体はある目的に好ましいが、ポリクローナル抗体も使用できる。
【0040】
抗トロポエラスチン抗体分子または抗リシルオキシダーゼ抗体分子は、当該技術分野で標準的な手法を用いて得ることができる。抗体を産生する方法には、哺乳動物（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジまたはサル）をタンパク質またはそのフラグメントで免疫化することが含まれる。抗体は、免疫化した動物から当該技術分野で周知の多様な手法のいずれかを用いて採取し、好ましくは目的抗原に対する抗体の結合を利用してスクリーニングすることができる。たとえば、ウェスタンブロット法または免疫沈降法を使用できる（Armitage et al., 1992, Nature 357: 80-82）。動物からの抗体および／または抗体産生細胞の分離は、動物をと殺する段階を含む場合がある。
【0041】
ペプチドによる動物の免疫化の代替または補足として、あるタンパク質に対して特異的な抗体は、組換え製造した発現免疫グロブリン可変ドメインのライブラリーから、たとえばそれらの表面に機能性免疫グロブリン結合ドメインを提示するラムダバクテリオファージまたは繊維状バクテリオファージを用いて得ることができる；たとえば、WO92/01047を参照。ライブラリーは、ナイーブなもの、すなわちいかなるタンパク質（またはフラグメント）によっても免疫化されたことがない生物から得た配列から構築したものであってもよく、あるいは目的抗原に曝露された生物から得た配列を用いて構築したものであってもよい。
【0042】
ある態様において、抗トロポエラスチン抗体分子または抗リシルオキシダーゼ抗体分子を、いずれか好都合な手段、たとえば前記方法により調製し、次いでエラスチン（および／または血管壁の他の成分）と対比したトロポエラスチンへの差示結合についてスクリーニングすることができる。適切なスクリーニング方法は当該技術分野で周知であり、それらによりエラスチンなどの非トロポエラスチンタンパク質と対比してトロポエラスチンへの結合増大を示す抗体またはリシルオキシダーゼに結合することができる抗体を当業者が同定できる。
【0043】
調製および／または単離した後、抗トロポエラスチン抗体分子または抗リシルオキシダーゼ抗体分子の生物活性を、たとえば前記の結合実験により、あるいはイメージング剤としてのコンジュゲートの特性を判定できるようにコンジュゲートの製造に際して、試験することができる。
【0044】
抗体分子は普通は免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗原結合ドメインを含むが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のみを含む抗原結合ドメインもありうる（たとえば、ラクダまたはサメの抗体）。
【0045】
この用語には、抗体の結合ドメインを含むいずれかのポリペプチドまたはタンパク質も含まれる。抗原結合ドメインを含む抗体フラグメントは、たとえばＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ；およびディアボディーである。モノクローナル抗体および他の抗体を採取すること、また組換えＤＮＡ技術の手法を用いて元の抗体の特異性を保持した他の抗体またはキメラ分子を作製することができる。そのような手法は、抗体の免疫グロブリン可変部または相補性決定領域（ＣＤＲ）を、異なる免疫グロブリンの定常部に、または定常部プラス枠組み構造領域に導入するのを伴うことができる。たとえばEP 0 184 187 A、GB 2,188,638 AまたはEP 0 239 400 Aを参照。
【0046】
トロポエラスチン特異的抗体および抗リシルオキシダーゼ抗体分子は当該技術分野で既知であり、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／Ａｂｃａｍなどの業者から市販されている。あるいは、当業者が前記に従って候補抗体を容易に調製およびスクリーニングすることができる。
【0047】
Ｃ：イメージングプローブ本発明のコンジュゲートは、トロポエラスチン特異的結合剤のほかに、イメージング法、たとえばＭＲＩ、ＰＥＴもしくはＳＰＥＣＴまたはその組合わせにより検出できる、イメージングプローブを含む。イメージングプローブのタイプの例には、放射性核種、光学標識または常磁性標識が含まれる。本発明は、たとえばマルチモードイメージングの実施が可能になるように、コンジュゲートと連結または会合できるさらに他の標識プローブの使用も伴うことができる。光学プローブならびに放射性核種およびＭＲＩ造影剤の取込みが可能であることにより、診断および検出を増強する様式を組み合わせるきっかけが得られる；たとえば、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴを用いる全身スキャンにより、全身レベルの疾患位置を同定することができる。同様に、ＰＥＴとＭＲイメージングの組合わせにより、高感度（ＰＥＴ、ＳＰＥＴ）、信号の定量（ＰＥＴ）、および解剖学的解像（ＭＲ）、ならびに微小環境の測定（ＭＲコントラスト増強）を得ることができる。
【0048】
本発明の好ましい一群のコンジュゲートは、トロポエラスチン特異的結合剤がガドリニウムなどのＭＲＩ活性原子に錯化しうる基に連結したものを含むＭＲＩ剤である。別のＭＲＩ信号素子は酸化鉄を含有することができる。さらに他の可能性は、ＮＭＲもしくはＭＲＩ標識としての１９Ｆ、および／またはたとえばＰＥＴもしくはＣＴイメージングのための標識としての１８Ｆの使用である。
【0049】
１態様において、ＭＲＩ活性原子に錯化しうる基はＤＯＴＡを含む。ある態様において、ＭＲＩ活性原子に錯化しうる基はＤＯＴＡ−リシンである。
【0050】
本発明に従って使用される放射性核種プローブは、それらのプローブが用いられる用途に応じて広範な種々の放射性核種を使用できる。本発明のプローブの一部を形成しうる放射性核種の例には、テクネチウム、レニウム、銅、コバルト、ガリウム、イットリウム、ルテチウム、インジウム、ジルコニウム、カーボン、ヨウ素、フッ素、およびアスタチン同位体、たとえばＴｃ−９９ｍ、Ｇａ−６７、Ｉｎ−１１１、Ｉ−１２３（ＳＰＥＣＴ）、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６０、Ｃｕ−６１、Ｃｕ−６２、Ｔｃ−９４ｍ、Ｇａ−６８、Ｃｏ−５５、Ｆ−１８、Ｃ−１１、Ｉ−１２４、Ｚｒ−８９（ＰＥＴ）、Ｃｕ−６７、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｙ−９０、Ｌｕ−１７７、Ｉ−１３１（放射性核種療法）が含まれる。本発明は、放射性核種を単独で、または組み合わせて使用できる。一般に、テクネチウム同位体はイメージング目的に、レニウム同位体は療法目的に、また銅およびハロゲン同位体はイメージングと療法の両方に用いられる。
【0051】
光学プローブの例には、蛍光体、たとえばフルオレセイン、発光分子、および錯体、たとえばランタニド錯体が含まれる。
【0052】
リンカーおよびコンジュゲーション化学ある態様において、コンジュゲートは、トロポエラスチン特異的結合剤とイメージングプローブを連結するためのリンカーまたは官能基を含むことができる。リンカーは短いペプチド配列であってもよく、あるいは化学物質リンカーであってもよい。ペプチドリンカー配列の使用は６〜２５個のアミノ酸の長さのものであり、より好ましくは９〜１６個のアミノ酸の長さが当該技術分野で知られている。リンカーは一般に結合剤およびイメージングプローブに連結するための反応性基、たとえば遊離システイン残基を含む。
【0053】
コンジュゲートある態様において、コンジュゲートは下記のうちのいずれかである：
(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS、
(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS-K(DOTA-Gd)、
K(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS-K(DOTA-Gd)、
K(DOTA-Gd)K(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS、
K(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS、
K(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY-K(DOTA-Gd)、
(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY-K(DOTA-Gd)、
(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY、
K(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHYまたは
K(DOTA-Gd)K(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY。
【0054】
使用１観点において、本発明は、対象の心血管系中のトロポエラスチンのイメージング方法に使用するための、特にプラークのイメージングのための、コンジュゲートを提供する。この方法は一般に下記の段階を伴う：
（ａ）対象に、トロポエラスチン特異的結合剤およびイメージングプローブを含む心血管プラークイメージング用コンジュゲートを含む組成物を投与し；
（ｂ）イメージング剤を対象の血管系のプラーク中に存在するいずれかのトロポエラスチンに結合させ；
（ｃ）イメージングプローブを検出してプラークの存在を判定する。
【0055】
プラーク中のトロポエラスチンと接触して結合させるために、一般に、前記コンジュゲートを含む組成物は対象に静脈内投与するためのものとなるであろう。結合が起きるのに適切な猶予後に、本明細書に記載するイメージング法を用いてイメージングプローブを検出することができる。検出段階の結果は、次いでプラーク中に存在するトロポエラスチンを定量するために使用でき、次いでプラークの負荷および／またはプラーク破裂の可能性を評価するために、ならびに／あるいは疾患の進行および／または療法に対する応答をモニターするために使用できる。これの目的は、特にＡＭＩ、発作および／または大動脈瘤のリスクに関して対象の予後を判定すること、ならびに／あるいは対象の状態の改善を意図とした療法介入を決定する補助とすることであろう。
【0056】
前記コンジュゲートを用いるイメージングの主な手段はＭＲＩを利用するが、これを他の核医学イメージング法、たとえば単光子放射断層撮影法（ＳＰＥＴ）、すなわち放射性核種から放射されるガンマ線を検出して試料または対象における放射性核種の分布の三次元イメージを作成するイメージング法、および陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、すなわち試料または対象に導入した陽電子放射型の放射性核種によって間接的に放射されるガンマ線の対を検出することにより三次元イメージを提供するイメージング法と併用できる。たとえば、ＳＰＥＴ試験は９９ｍＴｃを用いて、またＰＥＴ試験は９４ｍＴｃを用いて実施できる。しかし、当業者には、本発明に利用できる他の適切なＳＰＥＴおよびＰＥＴ放射性核種を承知しているであろう。一般に本発明は、イメージングプローブの適切な選択により、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単光子放射断層撮影法（ＳＰＥＴ）、光学イメージング（ＯＩ）および／または磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）に利用できる。
【0057】
したがって、本発明のコンジュゲートは、マルチモードイメージングの方法、すなわち情報またはイメージが２つの異なる手法から得られるものに使用できる；２つの異なる手法を用いて検出できるイメージングプローブの検出によるもの、あるいは、生体系内でナノ粒子が局在化する部位に第２標識を付与することによるもの、最も簡便には第２標識を前記に詳細に説明したコンジュゲートと連結または会合させることによるもの。マルチモード試験は２つの様式で同時記録されて同時イメージングを行なうことができ、あるいは２段階で行なう必要があるが、２つの手法を用いて得た空間情報を比較できるように一般に同一試料を利用する。マルチモードイメージングの例には、ＰＥＴ／ＣＴ、ＳＰＥＴ／ＣＴ、ＰＥＴ／ＭＲおよびＳＰＥＴ／ＭＲが含まれる。
【0058】
たとえば、下記の例示プロトコルを本発明の方法によるイメージングに使用できる。冠動脈壁および大きな血管、たとえば大動脈における造影剤取込みを視覚化するためには、ナビゲーターゲーティッド、心電同期型、脂肪抑制Ｔ１−強調３Ｄグラディエントエコー反転回復法 ターゲティッドまたは全心臓シーケンス（navigator-gated, cardiac-triggered, fat-suppressed T1-weighted 3D gradient echo inversion recovery targeted or whole heart sequence）（３Ｄ ＩＲ ＴＦＥまたは３Ｄ ＩＲ ＳＳＦＰ）を使用できる。３Ｄ ＩＲ ＴＦＥシーケンスのイメージングパラメーターは、視野（field of view）＝３２０×３２０ｍｍ、行列（matrix）＝２５６×２５６、取得平面内解像度（acquired in-plane resolution）＝１．２５×１．２５ｍｍ、再構築切片厚さ（reconstructed slice thickness）＝１．５ｍｍ（取得（acquired）：３ｍｍ）、取得ウインドウ（acquisition window）＝８０〜１００ｍｓ、反復時間／エコー時間（repetition time/echo time）＝５．８ｍｓ／１．９ｍｓ、フリップ角（flip angle）＝３０°、始動サイクル数（startup cycles）＝５、および切片数（number of slices）＝２０を含むことができるが、全心臓およびＳＳＦＰプロトコルについては異なる場合がある。Ｌｏｏｋ Ｌｏｃｋｅｒシーケンスを用いて、患者特異的な反転時間（inversion time）（ＴＩ）をゼロ血液信号の血液に調整する。
【0059】
材料および方法トロポエラスチン特異的結合剤
３種類の異なるペプチド（VVGSPSAQDEASPLS、EGFEPGおよびYPDHVQYTHY）をトロポエラスチン結合剤として選択し、ガドリニウムおよびＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ標識のためのＤＯＴＡ−リシンとコンジュゲートさせた。
【0060】
実験設計コンジュゲートのインビボおよびエクスビボ試験について本明細書に記載する原理実験の証明には、マウスモデルおよびウサギモデルを用いた。
【0061】
結合試験トロポエラスチンおよびＴＮＦ−アルファでコートしたペトリ皿を用いる結合試験を実施して、結合剤の特異性を立証する。さらに、エラスチンおよびマクロファージの視覚化のために血管検体の透過型電子顕微鏡検査を実施し、一方で、プラーク負荷された血管壁試料におけるガドリニウム分布との共局在性判定（colocalization）のためにＸ線スペクトルを取得する。
【0062】
組織学的検査動物をＭＲＩ直後に安楽死させる。その後、腕頭動脈および腹部大動脈を切除して３ｍｍの断片に切断する。断片を、パラフィン包埋断片については３μｍ切片、ＯＣＴ包埋断片については６μｍに切断する。断片を、次いで細胞浸潤についてヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、エラスチンについてミラーのエラスチカ−ワンギーソン染色（Miller’s elastica van Gieson）（ＥＶＧ）、ならびにプラークの形態およびコラーゲン沈着についてマッソンの三重染色法（Masson’s trichrome）およびピクロシリウスレッド（Picrosirius Red）で染色する。さらに、トロポエラスチン、ＴＮＦ−アルファおよびＬＯＸに対して特異的な抗体による免疫染色を実施する。検査する血管検体中のＧｄのモル濃度を定量するために、質量分析（ＭＳ）を適用する。
【0063】
ＡｐｏＥマウスモデル進行性アテローム硬化症のマウスモデルにおいて高脂肪食開始後４、８および１２週目に、またアンギオテンシンＩＩ（Ａｎｇ−ＩＩ）誘発による大動脈瘤形成のモデルにおいてＡｎｇ−ＩＩ放出ミニポンプ埋込み後１、２、３および４週目に、ＭＲＩを実施する。トロポエラスチンまたはＴＮＦ−アルファ結合性の造影剤（contrast agent）（ＣＡ）のいずれかを投与した各時点で１０匹のマウスをスキャンする；それぞれ合計が６０匹および８０匹のマウスになる。動物に各時点で造影剤の前と後にＭＲＩセッションを受けさせ、その後、組織学的検査、免疫染色、電子分光法および質量分析による評価のためにと殺する。処置効果を立証するために、１０匹のマウスをスタチン類による１２週間の治療後にトロポエラスチン結合性造影剤でスキャンする。トロポエラスチン合成におけるＬＯＸの役割を立証するために、１０匹のマウスをＬＯＸ阻害剤処置の開始後１２週目にトロポエラスチン造影剤でスキャンする。
【0064】
プラーク破裂モデルニュージーランドシロウサギに高コレステロール食（Ｓｐｅｃｉａｌ Ｄｉｅｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）を２週間給餌し、次いで腹部大動脈のバルーン傷害を施す。その後、高脂肪食をさらに６週間続けた後、４週間の普通食を与える。このプロトコルを用いたプラークは、ＡＨＡ ＩＩ〜ＶＩ型病変と比較して類似の特徴を発現することが示されている（石灰化病変の存在を除外する）。ヒスタミンおよびラッセルクサリヘビ蛇毒（ＲＶＶ）を用いてプラーク破裂を誘発する前に、トロポエラスチン結合性ＭＲ造影剤を用いてＭＲＩを実施する。プラークの破裂／浸食を誘発した後４８時間目に、管腔内血栓の存在を検出して血栓の位置と誘発前トロポエラスチン−Ｇｄとの相関性を求めるためにＭＲＩを反復する。合計１６匹のウサギをスキャンして、プラーク破裂を伴うウサギまたは伴わないウサギは約８匹（５０％）となる。最終スキャンの直後に、動物を組織学的検査、免疫染色、質量分析および電子分光法による評価のためにと殺する。
【実施例】
【0065】
ウサギ大動脈断片を凍結保護し（３０％ショ糖）、組織凍結媒体中に包埋し、−８０℃で保存した。一連の１０μｍ厚さの横断切片（３００μｍ長さに及ぶ）を５００μｍ間隔で採集した。切片を、プラークの全般的な形態検査のためのマッソンの三重染色法、成熟および未熟エラスチン線維の検出のためのワンギーソンのエラスチン染色、ならびにトロポエラスチン線維、ＬＯＸおよびマクロファージの検出のための免疫組織化学的検査に用いた。破壊されたプラークはマッソンの三重染色法により分類され、ヒトのプラークについて定義されるように破裂したものと浸食されたものの両方を含んでいた。破壊されていないプラークには血栓が覆っていないものを含めた。
【0066】
免疫組織化学的検査をアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ法（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｏ．ＰＫ−６１０２）により実施した。下記に対する抗ウサギポリクローナル抗体：トロポエラスチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，＃ ３２４７５６）、ＬＯＸ（ＩＭＧＥＮＥＸ，＃ＩＭＧ−６４４２Ａ）およびマクロファージ（Ｄａｋｏ，クローンＲＡＭ１１，Ｎｏ．Ｍ０６３３）を用い、下記の段階を実施した：１）切片を１０％ホルマリン中、室温で２０分間インキュベートして、組織切片をスライドに付着させた；２）切片をクエン酸系溶液（１０ｍＭクエン酸、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０，ｐＨ６．０）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カリフォルニア州バーリンガム，Ｎｏ．Ｈ−３３００）中、１００℃で２０分間、加圧調理器を用いてインキュベートして、エピトープを回収した；３）１％過酸化水素中、室温で１０分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした；４）１０％ウマ血清中で６０分間インキュベートして、抗血清の非特異的結合を低下させた；５）一次抗体と共に室温で２時間インキュベートした。陰性対照切片を１０％ウマ血清のみと共にインキュベートした；６）ビオチニル化ウマ抗マウス免疫グロブリンＧ（希釈度１：２００）と共に室温で１時間インキュベートした；そして７）希釈度１：５０のアビジン−ビオチニル化西洋わさびペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｏ．ＰＫ−６１０２）と共に室温で１時間インキュベートした。免疫反応部位を希釈度１：５０の３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ基質色原体，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｏ．ＳＫ−４１００）と共に３〜５分間インキュベートすることにより視覚化した。トリス緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）を用いて各溶液を希釈し、かつ各段階の間で切片を３回洗浄した。最後に、組織切片をヘマトキシリンで対比染色した（１分間）。
【0067】
未熟（トロポ）エラスチンに結合すると思われる抗体、およびプラーク破壊が制御されたウサギモデルを用いて、本発明者らは下記のことを見出した：１．アテローム硬化症の進行中および易損性プラークにトロポエラスチン線維の沈着が増大する；
２．初期段階でトロポエラスチン線維が内膜全体に散乱し、その後期にそれらの密度が増大してそれらは外膜中にも見出される；
３．易損性プラーク中のエラスチン含量の増大は、そのような病変のインビボ検出のための分子イメージングに利用できる；
４．場合により、トロポエラスチン線維はＣＤ６８陽性マクロファージと共局在化すると思われ、これはマクロファージがエラスチンの供給源である可能性があることを指摘する；
５．しかし、マクロファージがエラスチン線維と共局在化しない場合もあり、これは異なる局所機能性をもつマクロファージ亜集団の多様性がある可能性を指摘する。
【0068】
さらに他の実験でトロポエラスチン特異的結合ペプチドを用いるイメージングを検討した。
【0069】
ペプチドVVGSPSAQDEASPLSおよびYPDHVQYTHYの潜在的開裂部位を調べた。主に消化器系中に存在する酵素のみがペプチドVVGSPSAQDEASPLSおよびYPDHVQYTHYを開裂することが見出された。これらの酵素はいずれも血液またはプラーク中に報告されておらず、したがってペプチドVVGSPSAQDEASPLSまたはYPDHVQYTHYは血管壁／プラーク特異的な標的トロポエラスチンに結合する前に開裂しないと思われる。
【0070】
タンパク質ＢＬＡＳＴを実施して相同性をスクリーニングした。アミノ酸配列VVGSPSAQDEASPLSおよびYPDHVQYTHYKは、トロポエラスチンと相互作用すると記載されているタンパク質（それぞれ、エラスチン結合タンパク質（ＥＢＰ）およびミクロフィブリル関連糖タンパク質−１（ＭＡＧＰ−１））中にのみ見出され、他のタンパク質中にはみられない。これらの結果は、これらの選択したペプチドが目的タンパク質であるトロポエラスチンに高特異的であることを示唆する。
【0071】
ガドリニウム標識(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLSを注射した高脂肪食（ＨＦＤ）給餌ＡｐｏＥ−／−マウスにおける１２週間のインビボ実験は、プラーク負荷された腕頭動脈（ＢＣＡ）および大動脈弓に優先的に取り込まれるがプラークを含まない頚動脈には取り込まれない好ましい生体内分布（図６）、ならびに造影剤注射の１時間後に既にイメージング可能となる迅速な腎クリアランスを示した。
【0072】
ＨＦＤ給餌ＡｐｏＥ−／−マウスにおけるガドリニウム標識K-(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHYを用いたインビボ実験は、プラーク負荷された腕頭動脈および大動脈弓に取り込まれかつプラークを含まない頚動脈には取り込まれないという有望な結果を示した（図７）。このペプチドは、迅速な腎クリアランスおよびＢＣＡへの優先的取込みを伴う好ましい生体内分布も示した（図９）。
【0073】
免疫組織化学的検査は、罹患ＢＣＡの新生内膜および外膜にトロポエラスチンが存在すること、ならびにプラーク負荷した（罹患）およびプラークを含まない（非罹患）ＢＣＡ血管壁の両方において中膜にはトロポエラスチンが存在しないことを証明した（図８）。
【0074】
３Ｔにおける結合緩和度は２０．８８ｍＭ−１ｓ−１と測定された。
【0075】
本明細書に述べたすべての文献の全体を本明細書に援用する。ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］トロポエラスチン特異的結合剤およびイメージングプローブを含む、斑のイメージング方法に使用するためのコンジュゲートであって、該コンジュゲートによるプラークのイメージングが、患者がプラークの破裂または不安定性により起きる状態を発現するリスクを判定するために用いられる、コンジュゲート。
［態様２］イメージングプローブに連結したトロポエラスチン特異的結合剤を含む、プラークをイメージングするためのコンジュゲートであって、該コンジュゲートによるプラークのイメージングが、患者がプラークの破裂または不安定性により起きる状態を発現するリスクを判定するために用いられる、コンジュゲート。
［態様３］プラークのイメージングのための医薬の調製におけるコンジュゲートの使用であって、該コンジュゲートがトロポエラスチン特異的結合剤およびイメージングプローブを含み、該コンジュゲートによるプラークのイメージングが、患者がプラークの破裂または不安定性により起きる状態を発現するリスクを判定するために用いられる、使用。
［態様４］プラークが心血管プラークである、前記態様のいずれか１に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様５］心血管プラークがアテローム硬化プラークである、態様４に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様６］状態が急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、発作または大動脈瘤である、態様４または態様５に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様７］コンジュゲートによるプラークのイメージングが、患者のための処置コースを決定すること、患者を特定の療法のための患者クラスに配属すること、プラークの負荷を評価すること、疾患の進行をモニターすること、および／または療法に対する患者の応答を判定することのために用いられる、前記態様のいずれか１に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様８］トロポエラスチン特異的結合剤がトロポエラスチンを特異的に結合することができる、前記態様のいずれか１に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様９］トロポエラスチン特異的結合剤がエラスチンに実質的に結合しない、態様７に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様１０］トロポエラスチン特異的結合剤がインビボでトロポエラスチンを特異的に結合することができ、かつインビボでエラスチンに実質的に結合しない、前記態様のいずれか１に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様１１］トロポエラスチン特異的結合剤が、血管内の他の成分またはタンパク質と比較してトロポエラスチンに対して特異的である、態様４〜６のいずれか１に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様１２］トロポエラスチン特異的結合剤が、インビボで、血管内の他の成分またはタンパク質と比較してトロポエラスチンに対して特異的である、態様４〜６のいずれか１に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様１３］トロポエラスチン特異的結合剤が、プラーク中に存在するトロポエラスチンに特異的に結合することができるペプチド、抗体分子、タンパク質、アプタマーまたは小分子リガンドである、前記態様のいずれか１に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様１４］トロポエラスチン特異的結合剤がペプチドまたは抗体分子である、態様１３に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様１５］ペプチドが、アミノ酸配列VVGSPSAQDEASPLSからの少なくとも４個のアミノ酸の配列を含む、態様１３または態様１４に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様１６］ペプチドがアミノ酸配列QDEAを含む、態様１３〜１５のいずれか１に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様１７］トロポエラスチン特異的結合分子がアミノ酸配列VGVAPGに結合することができる、態様１３〜１６のいずれか１に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様１８］ペプチドが、アミノ酸配列YPDHVQYTHYからの少なくとも４個のアミノ酸の配列を含む、態様１３または態様１４に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様１９］ペプチドが、配列VVGSPSAQDEASPLS、EGFEPGまたはYPDHVQYTHYを有する、態様１３または態様１４に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様２０］ペプチドが２０個のアミノ酸の長さを超えない、態様１３〜１９のいずれか１に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様２１］ペプチドが、配列VVGSPSAQDEASPLS、EGFEPGまたはYPDHVQYTHYからなる、態様１３または態様１４に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様２２］トロポエラスチン特異的結合剤が、ヒト−エラスチンと比較してヒト−トロポエラスチンに対して特異的である、態様８〜２１のいずれか１に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様２３］さらに、トロポエラスチン特異的結合剤が、プラークにより起きる状態の動物モデルにおいてエラスチンと比較してトロポエラスチンに対して特異的である、態様８〜２１のいずれか１に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様２４］コンジュゲートによるプラークのイメージングが、プラーク中に存在するリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）の量または活性を判定するためにさらに用いられる、前記態様のいずれか１に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様２５］イメージングプローブが、ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴまたはＰＥＴイメージングのためのものである、前記態様のいずれか１に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様２６］イメージングプローブが、ガドリニウムを錯化することができる基に連結しているＭＲＩ剤である、前記態様のいずれか１に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様２７］イメージングプローブが、ガドリニウムに基づくイメージングのためのＤＯＴＡ−リシンである、前記態様のいずれか１に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様２８］イメージングプローブが、ガドリニウムに基づくイメージングのためのＤＯＴＡ−リシン、または酸化鉄である、態様１〜２５のいずれか１に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様２９］イメージングプローブが、フッ素、テクネチウム、レニウム、銅、コバルト、ガリウム、イットリウム、ルテチウム、インジウム、ジルコニウム、カーボン、ヨウ素、フッ素またはアスタチン同位体である放射性核種を含む、態様１〜２４のいずれか１に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様３０］イメージングプローブが、蛍光特性または発光特性をもつ光学標識を含む、前記態様のいずれか１に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様３１］イメージングプローブが、ＭＲＩ造影剤として使用するための常磁性プローブを含む、前記態様のいずれか１に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様３２］コンジュゲートが、
(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS、
(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS-K(DOTA-Gd)、
K(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS-K(DOTA-Gd)、
K(DOTA-Gd)K(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS、
K(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS、
K(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY-K(DOTA-Gd)、
(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY-K(DOTA-Gd)、
(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY、
K(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHYまたは
K(DOTA-Gd)K(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY
のうちの１つである、態様１３または態様１４に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様３３］コンジュゲートが、(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS、またはK(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHYである、態様１３または態様１４に記載のコンジュゲートまたは使用。
［態様３４］前記態様のいずれか１に記載のコンジュゲートを含む組成物。
［態様３５］（ａ）対象に、トロポエラスチン特異的結合剤およびイメージングプローブを含む心血管プラークイメージング用コンジュゲートを含む態様３４に記載の組成物を投与し；
（ｂ）イメージング剤を対象の血管系のプラーク中に存在するいずれかのトロポエラスチンに結合させ；
（ｃ）イメージングプローブを検出してプラークの存在を判定する
ことを含む、対象において心血管プラークをイメージングする方法。
［態様３６］心血管プラークをコンジュゲートでイメージングすることにより、患者がプラークの破裂または不安定性により起きる状態を発現するリスクを判定することをさらに含む、態様３５に記載の方法。
［態様３７］状態が急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、発作または大動脈瘤である、態様３５に記載の方法。
［態様３８］コンジュゲートによる心血管プラークのイメージングを、（ｉ）患者のための処置コースを決定する；および／または（ｉｉ）患者を特定の療法のための患者クラスに配属する；および／または（ｉｉｉ）プラークの負荷を評価する；（ｉｖ）疾患の進行をモニターする；および／または（ｖ）療法に対する患者の応答を判定するために使用することをさらに含む、態様３５に記載の方法。
［態様３９］工程（ｃ）が、プラーク中に存在するトロポエラスチンを定量することを含む、態様３５〜３８のいずれか１に記載の方法。
［態様４０］組成物が対象に静脈内投与するためのものである、態様３５〜３９のいずれか１に記載の方法。
［態様４１］心血管プラークがアテローム硬化プラークである、態様３５〜４０のいずれか１に記載の方法。
配列
1.トロポエラスチン特異的結合ペプチド
【0076】
【化1】
【0077】
2.ヒト−トロポエラスチン
【0078】
【化2】
【0079】
3.マウストロポエラスチン
【0080】
【化3】
【0081】
4.ヒトリシルオキシダーゼ
【0082】
【化4】
【0083】
5.マウスリシルオキシダーゼ
【0084】
【化5】
【0085】
6.推定ウサギリシルオキシダーゼ
【0086】
【化6】
【0087】
参考文献
【0088】
【化7】