特許第6019120号(P6019120)IP Force 特許公報掲載プロジェクト 2022.1.31 β版

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特許6019120光応答性核酸類を含むプローブを用いた光連結方法
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6019120
(24)【登録日】2016年10月7日
(45)【発行日】2016年11月2日
(54)【発明の名称】光応答性核酸類を含むプローブを用いた光連結方法
(51)【国際特許分類】
   C12N 15/09 20060101AFI20161020BHJP
   C12Q 1/68 20060101ALI20161020BHJP
【FI】
   C12N15/00 AZNA
   C12Q1/68 A
【請求項の数】19
【全頁数】46
(21)【出願番号】特願2014-525890(P2014-525890)
(86)(22)【出願日】2013年7月19日
(86)【国際出願番号】JP2013069694
(87)【国際公開番号】WO2014014106
(87)【国際公開日】20140123
【審査請求日】2015年1月29日
(31)【優先権主張番号】特願2012-161834(P2012-161834)
(32)【優先日】2012年7月20日
(33)【優先権主張国】JP
(31)【優先権主張番号】特願2012-270614(P2012-270614)
(32)【優先日】2012年12月11日
(33)【優先権主張国】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第30条第2項適用 第19回日本遺伝子診療学会大会抄録集(平成24年7月6日)日本遺伝子診療学会発行第81ページに発表
(73)【特許権者】
【識別番号】591122956
【氏名又は名称】株式会社LSIメディエンス
(74)【代理人】
【識別番号】100090251
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 憲一
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(72)【発明者】
【氏名】若松 宏武
(72)【発明者】
【氏名】柳原 玲
(72)【発明者】
【氏名】寺崎 浩司
(72)【発明者】
【氏名】畚野 信剛
(72)【発明者】
【氏名】島津 光伸
(72)【発明者】
【氏名】藤本 健造
【審査官】 竹内 祐樹
(56)【参考文献】
【文献】 特開2011−036150(JP,A)
【文献】 吉村嘉永, 外,光応答型核酸プローブを用いたイネゲノムSNPs解析,日本化学会講演予稿集,日本,2011年 3月11日,Vol.91st, No.4,P.1579(1 PC-091)
(58)【調査した分野】(Int.Cl.,DB名)
C12N 15/00−15/90
C12Q 1/68
CAplus/MEDLINE/BIOSIS/WPIDS(STN)
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸サンプル中に存在する標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有し、光応答性核酸類を含む第一のプローブと、を反応溶液中でハイブリダイゼーションし、光照射することにより光連結させる方法であって、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを共存させることで、該第一のプローブ内の該光応答性核酸類に起因する自己会合を抑制させ、前記第二プローブは、第一プローブ中の光応答性核酸類と光連結しないように設計されていることを特徴とする、光連結方法。
【請求項2】
前記高い相補性とは、前記第一のプローブと前記第二のプローブとが互いに相補的な関係にあり、所定の光連結条件下で該第一のプローブ中の該光応答性核酸類の自己内で光連結する塩基が、第二のプローブとハイブリダイゼーションしている、請求項1に記載の光連結方法。
【請求項3】
前記光連結させる方法が、前記核酸サンプル中に存在する標的部位が有する標的核酸と、前記第一のプローブの光応答性核酸類との間で光連結させる、請求項1又は2に記載の光連結方法。
【請求項4】
前記第二のプローブが光応答性核酸類を含む、請求項1乃至のいずれか一項に記載の光連結方法。
【請求項5】
前記第一のプローブ及び前記第二のプローブが光応答性核酸類を含み、該第一のプローブと該第二のプローブの非相補性領域において、該第一のプローブ及び/又は該第二のプローブ内に存在する光応答性核酸類が自己内で光連結できないように、該第一のプローブ及び/又は該第二のプローブに相補的な配列を有する第三のプローブを使用する、請求項1乃至のいずれか一項に記載の光連結方法。
【請求項6】
核酸サンプル中に存在する標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有し光応答性核酸類を含む第一のプローブと、該標的部位に対して相補的な配列を有し標的核酸を含む第四のプローブと、を反応溶液中で隣接して配置するようにハイブリダイゼーションさせ、光照射によって該第四のプローブに存在する標的核酸と該第一のプローブ中の該光応答性核酸類との間で光連結する方法において、
該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを共存させることで、該第一のプローブ内の該光応答性核酸類に起因する自己会合を抑制させ、前記第二プローブは、第一プローブ中の光応答性核酸類と光連結しないように設計されていることを特徴とする、光連結方法。
【請求項7】
前記第一のプローブ内において光応答性核酸類と自己会合する核酸を、該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換した該第一のプローブを使用することを特徴とする、該第一のプローブの自己内での光連結を抑制させることを特徴とする、請求項1乃至のいずれか一項に記載の光連結方法。
【請求項8】
前記光応答性核酸類と光連結しない核酸がプリン塩基である、請求項に記載の光連結方法。
【請求項9】
前記光応答性核酸類と光連結しない核酸が、ピリミジン環を人工的に変換した合成塩基である、請求項に記載の光連結方法。
【請求項10】
反応溶液中にアニオン性物質が存在する、請求項1乃至のいずれか一項に記載の光連結方法。
【請求項11】
少なくとも一種類の光連結プローブが、反応溶液中に0.1μmol/L以上の濃度で存在することを特徴とする、請求項1乃至10のいずれか一項に記載の光連結方法。
【請求項12】
請求項1〜11のいずれか一項に記載の光連結方法を使用する遺伝子解析方法。
【請求項13】
前記遺伝子解析方法が、遺伝子検出方法又は核酸増幅方法である、請求項12の遺伝子解析方法。
【請求項14】
請求項13に記載の核酸増幅方法が、変異型核酸の標的部位を含む増幅用ヌクレオチド配列を選択的に増幅させることで、該変異型核酸の有無を検出することを特徴とする、変異型核酸検出方法。
【請求項15】
核酸サンプル中の標的部位に対して相補的な配列を有する光応答性核酸類を含む第一のプローブ、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを含み、前記第二プローブは、第一プローブ中の光応答性核酸類と光連結しないように設計されていることを特徴とする、光連結キット。
【請求項16】
前記第一のプローブが、核酸サンプル中の標的部位の標的核酸と光連結するものである、請求項15に記載の光連結キット。
【請求項17】
更に、該第一のプローブの該光応答性核酸類と光連結する標的核酸を含む第四のプローブを含む、請求項15に記載の光連結キット
【請求項18】
前記第二のプローブが光応答性核酸類を含む、請求項15乃至17のいずれか一項に記載の光連結キット。
【請求項19】
前記第一のプローブが、該プローブ内において光応答性核酸類と自己会合する核酸を、該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換したものである、請求項15乃至18のいずれか一項に記載の光連結キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、光応答性核酸類を含むプローブを用いて光連結する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、個々の患者についてオーダーメイドの治療法である個別化医療を確立するために、該患者の特定の遺伝子多型と、薬剤感受性や薬剤応答性との関連を明らかにする研究が提案されている。
【0003】
特に、ゲノム科学の進歩により、薬物動態の解明、および薬物の反応性に関与する酵素、蛋白質等の遺伝子多型の解明が急速になされている。ヒトゲノム解析において、一塩基多型(Single nucleotide polymorphisms:SNPs)が、最も頻度の高い遺伝子多型マーカーとして注目されつつある。該SNPsは、種々の疾患や薬剤応答との関連を明らかにする上で有用であることが既に知られている。また、複数のSNPsを用いたハプロタイプ解析が、疾患感受性を解析する上で有用であることも知られている。
【0004】
特に医療現場においては、SNPsの検出結果を用いた病気罹患率の診断、効果的な投与薬剤の選択、副作用の予測などへの利用等が考えられ、治療効果の増大だけでなく患者のQOLの向上にもつながるものとして期待されている。
このようなSNPs部位の塩基を判別する、いわゆるタイピングについては多くの手法が報告されている。DNAの一塩基多型をタイピングする技術としては、TaqMan PCR法やInvader法などが、一塩基の置換を識別できるほどの高い配列選択性をもつ技術として知られている。
【0005】
しかし、悪性腫瘍のような後発変異の検出においては、検体材料の多くを占める正常細胞に由来する野生型の核酸分子がバックグラウンドとなることから、上記のような解析手法では一塩基置換等の変異を高感度に検出できない場合が多い。
【0006】
そのため、上記方法に代わる特に有効な解析手法として、光応答性核酸類の使用が開示されている。ハイブリダイゼーションした光応答性核酸類と標的核酸は、特定の波長の光照射を行うことによって、光連結を形成させることができる。この光連結は、人工塩基部分の光反応によって、光応答性核酸類分子と標的核酸分子との間に、分子間の共有結合が形成されて生じる。このように光連結された分子と分子は、単なる熱的な安定性のみで会合しているのではないので、相補的二重鎖が解離する条件におかれた場合でも、解離することなく結合している(特許文献1)。
【0007】
また、光応答性核酸類の性質として、光連結反応は1秒程度で極めて迅速に進行すること、完全にハイブリダイゼーションしないと光連結しないという知見に立脚して、光応答性核酸類を使用した変異型遺伝子を検出する解析手法が開示されている(特許文献2)。
【0008】
特許文献1および2では光応答性核酸類を使用したSNPsの特定について開示されているが、光応答性核酸類を含むプローブが、相補的な配列を持つ標的部位とハイブリダイゼーションしたときに光連結するという知見に基づいて、光応答性核酸類の使用が変異型遺伝子の選択的増幅に有用である例を開示しているのみである。
【0009】
従って、このような従来の技術常識を鑑みれば、光連結には光応答性核酸類を含むプローブとその相補的な配列をもつ標的部位とがハイブリダイゼーションする必要があり、更に、光連結は光応答性核酸類と標的部位又は標的部位近傍の標的核酸とが結合することによって形成されることから、光応答性核酸類は相補的な配列をもつ標的部位又は標的部位近傍の標的核酸配列としか結合しないと考えられていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】特開2009−254279号公報
【特許文献2】WO2012/033190号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明者らは、光応答性核酸類を含むプローブ(すなわち、光連結プローブ)が標的核酸に対して光連結する反応において、標的核酸の量に関係なく一定の割合までしか光連結できない、すなわち、光連結が停滞してしまうことを見出した。この事実を受け鋭意検討した結果、光連結が停滞してしまう要因として、光応答性核酸類を含むプローブが、標的核酸と光連結するための光照射によって、該プローブ自身が自己の配列内で光連結してしまう事を見出した。すなわち、プローブ内の光応答性核酸類と該光応答性核酸類と光連結する塩基が会合し光連結することから、標的部位とハイブリダイゼーション及び/又は標的核酸と光連結できないプローブが光照射の時間(エネルギー)依存的に蓄積され、その結果、標的核酸に対する光連結を停滞させているものと推察された。
【0012】
更に、従来の技術常識に基づいて考えると、野生型遺伝子を選択的に増幅抑制し、変異型遺伝子を選択的に増幅する場合において、特許文献2のような光応答性核酸類を使用した光連結方法の最大の優位性は、一度、光によって光連結した標的核酸はPCR反応工程における熱変性工程において開裂しない点、すなわち、一度、光によって光連結した標的核酸を非平衡系に持ち込むことができる点にあった。
【0013】
しかしながら、本発明者らは、光連結可能な波長(365nm)の光を照射した場合においても、標的核酸に対して光連結されるだけでなく、該標的核酸に対して光連結したプローブが、本来生じることの無い光開裂反応により一部、外れてしまうことを見出した。つまり、光連結する反応と光連結を開裂させる反応とが並行して起こる光平衡の状態が、標的核酸に対する光連結を停滞させている要因と考えられた。
【0014】
本発明の目的は、光応答性核酸類を含むプローブを使用した標的核酸との光連結が停滞してしまうという問題を克服し、光連結効率を向上させる方法、キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0015】
本発明者らは、上記課題を解決する手段を鋭意検討した結果、光連結効率の停滞を回避するために、反応溶液中において、光応答性核酸類を含むプローブの自己配列内での光連結を抑制することにより、該プローブの有効濃度を保つこと、また、局所的に標的部位付近における光応答性核酸類を含むプローブの実質的な濃度を高めることでハイブリダイゼーションを促進し、光連結効率を向上させることができることを見出した。
【0016】
すなわち、本発明は以下の内容に関する。
[1]核酸サンプル中に存在する標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有し、光応答性核酸類を含む第一のプローブと、を反応溶液中でハイブリダイゼーションし、光照射することにより光連結させる方法であって、該第一のプローブ内の該光応答性核酸類に起因する自己会合を抑制させることを特徴とする、光連結方法。
[2]前記第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを共存させることにより、該第一のプローブ内の該光応答性核酸類に起因する自己会合を抑制させることを特徴とする、[1]の光連結方法。
[3]前記高い相補性とは、前記第一のプローブと前記第二のプローブとが互いに相補的な関係にあり、所定の光連結条件下で該第一のプローブ中の該光応答性核酸類の自己内で光連結する塩基が、第二のプローブとハイブリダイゼーションしている、[1]又は[2]の光連結方法。
[4]前記光連結させる方法が、前記核酸サンプル中に存在する標的部位が有する標的核酸と、前記第一のプローブの光応答性核酸類との間で光連結させる、[1]〜[3]のいずれかの光連結方法。
[5]前記第二のプローブが光応答性核酸類を含む、[1]〜[4]のいずれかの光連結方法。
[6]前記第一のプローブ及び前記第二のプローブが光応答性核酸類を含み、該第一のプローブと該第二のプローブの非相補性領域において、該第一のプローブ及び/又は該第二のプローブ内に存在する光応答性核酸類が自己内で光連結できないように、該第一のプローブ及び/又は該第二のプローブに相補的な配列を有する第三のプローブを使用する、[1]〜[5]のいずれかの光連結方法。
[7]核酸サンプル中に存在する標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有し光応答性核酸類を含む第一のプローブと、該標的部位に対して相補的な配列を有し標的核酸を含む第四のプローブと、を反応溶液中で隣接して配置するようにハイブリダイゼーションさせ、光照射によって該第四のプローブに存在する標的核酸と該第一のプローブ中の該光応答性核酸類との間で光連結する方法において、
該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを共存させることで、該第一のプローブの自己内での光連結を抑制させることを特徴とする、[1]の光連結方法。
[8]前記第一のプローブ内において光応答性核酸類と自己会合する核酸を、該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換した該第一のプローブを使用することを特徴とする、該第一のプローブの自己内での光連結を抑制させることを特徴とする、[1]〜[7]のいずれかの光連結方法。
[9]前記光応答性核酸類と光連結しない核酸がプリン塩基である、[8]の光連結方法。
[10]前記光応答性核酸類と光連結しない核酸が、ピリミジン環を人工的に変換した合成塩基である、[8]の光連結方法。
[11]反応溶液中にアニオン性物質が存在する、[1]〜[10]のいずれかの光連結方法。
[12]少なくとも一種類の光連結プローブが、反応溶液中に0.1μmol/L以上の濃度で存在することを特徴とする、[1]〜[11]のいずれかの光連結方法。
[13][1]〜[12]のいずれかの光連結方法を使用する遺伝子解析方法。
[14]前記遺伝子解析方法が、遺伝子検出方法又は核酸増幅方法である、[13]の遺伝子解析方法。
[15][14]の核酸増幅方法が、変異型核酸の標的部位を含む増幅用ヌクレオチド配列を選択的に増幅させることで、該変異型核酸の有無を検出することを特徴とする、変異型核酸検出方法。
[16]核酸サンプル中の標的部位に対して相補的な配列を有する光応答性核酸類を含む第一のプローブ、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを含むことを特徴とする、光連結キット。
[17]前記第一のプローブが、核酸サンプル中の標的部位の標的核酸と光連結するものである、[16]の光連結キット。
[18]更に、該第一のプローブの該光応答性核酸類と光連結する標的核酸を含む第四のプローブを含む、[16]の光連結キット
[19]前記第二のプローブが光応答性核酸類を含む、[16]〜[18]のいずれかの光連結キット。
[20]前記第一のプローブが、該プローブ内において光応答性核酸類と自己会合する核酸を、該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換したものである、[16]〜[19]のいずれかの光連結キット。
【発明の効果】
【0017】
本発明によれば、光応答性核酸類を使用した遺伝子の解析方法において、標的部位と光応答性核酸類を含むプローブ間の光連結効率を向上させることが可能である。すなわち、標的核酸に対して特異的かつ効率よく光連結できるため、高い感度と特異性を必要とする、対象とする遺伝子の解析方法において効果的である。
【図面の簡単な説明】
【0018】
図1図1は、光応答性核酸の一例である3−シアノビニルカルバゾール(CNVK)の構造式である。
図2図2は、EGFR遺伝子上のエクソン21(ex.21)領域の一部を光連結形成対象として、光応答性核酸であるCNVKの挿入位置を5’末端に近い位置に挿入して設計した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射と光連結開裂波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。
図3図3は、EGFR遺伝子上のエクソン21(ex.21)領域の一部を光連結形成対象として、光応答性核酸であるCNVKの挿入位置を5’末端よりも中心に近い位置に挿入して設計した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射と光連結開裂波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。
図4図4は、EGFR遺伝子上のエクソン21(ex.21)領域の一部を光連結形成対象として、光応答性核酸であるCNVKの挿入位置を3’末端よりも中心に近い位置に挿入して設計した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射と光連結開裂波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。
図5図5は、EGFR遺伝子上のエクソン21(ex.21)領域の一部を光連結形成対象として、光応答性核酸であるCNVKの挿入位置を3’末端に近い位置に挿入して設計した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射と光連結開裂波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。
図6図6は、CNVKの標的核酸とならないアデニン(A)のみで構成した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。
図7図7は、CNVKの標的核酸とならないグアニン(G)のみで構成した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。
図8図8は、CNVKの標的核酸とならないアデニン(A)、グアニン(G)のみで構成した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。
図9図9は、EGFR遺伝子の3箇所の変異を目的部位として設計した光連結プローブである。具体的には、(1)は861番目のロイシン(L861)をコードする核酸配列を目的部位として、(2)は790番目のスレオニン(T790)に該当する核酸配列を目的部位として、(3)は858番目のロイシン(L858)に該当する核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して設計した光連結プローブとその相補性について示した図である。
図10図10は、EGFR遺伝子の861番目のロイシン(L861)をコードする核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して光連結プローブを設計した場合に、光連結形成波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。
図11図11は、EGFR遺伝子の790番目のスレオニン(T790)をコードする核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して光連結プローブを設計した場合に、光連結形成波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。
図12図12は、EGFR遺伝子の858番目のロイシン(L858)をコードする核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して光連結プローブを設計した場合に、光連結形成波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。
図13図13は、EGFR遺伝子の790番目のスレオニン(T790)をコードする核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して光連結プローブを設計した場合に、ハイブリダイゼーション温度を変化させて光連結形成させた場合の光連結形成効率を表した図である。
図14図14は、EGFR遺伝子の790番目のスレオニン(T790)をコードする核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して光連結プローブを設計した場合に、ハイブリダイゼーション促進剤としてポリアクリル酸を添加して4℃でハイブリダイゼーションさせて光連結形成させた場合の光連結形成効率を表した図である。
図15図15は、EGFR遺伝子の790番目のスレオニン(T790)をコードする核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して光連結プローブを設計した場合に、ハイブリダイゼーション促進剤としてポリアクリル酸を添加して50℃でハイブリダイゼーションさせて光連結形成させた場合の光連結形成効率を表した図である。
図16図16は、EGFR遺伝子の790番目のスレオニン(T790)をコードする核酸配列を目的部位として、遺伝子変異検出を行った際の定量PCR測定結果を表した図である。
図17図17は、EGFR遺伝子上のエクソン21(ex.21)領域の一部を光連結形成対象として、光応答性核酸であるCNVKの挿入位置を5’末端に近い位置に挿入し、更にCNVKが光連結形成可能なピリミジン塩基をイノシンに置換した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。
図18図18は、EGFR遺伝子の実施例8−1.において設計した光連結プローブを光連結形成させた場合の光連結形成効率を表した図である。
図19図19は、EGFR遺伝子上のエクソン21(ex.21)領域の861番目のロイシン(L861)をコードする核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して設計した光連結プローブとその相補性について示した図である。
図20図20は、EGFR遺伝子の実施例10−1.において設計した光連結プローブを光連結形成させた場合の光連結形成効率を表した図である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
以下において、本発明の実施形態について適宜図面を参照しながら詳細に説明するが、利用方法やキットの態様についてはこれに限定されるものではない。
【0020】
本発明において、DNA、RNA、遺伝子発現、コード、鋳型、プロモーター、プライマー、PCR、配列等の用語の定義に関しては、現在、分子生物学、遺伝学、遺伝子工学等で広く一般的に使用されている用語と同じ意味である。
【0021】
本発明において、核酸とは、DNA、RNA又は、後述のヌクレオチドアナログであれば特に限定されるものではなく、天然のものであってもよく、合成されたものであってもよい。天然の核酸として、例えば、生物から回収されたゲノムDNA、mRNA、tRNA、rRNA、hnRNA等がある。また、合成された核酸として、β−シアノエチルホスフォロアミダイト法、DNA固相合成法等の公知の化学的合成法により合成されたDNAや、PCR等の公知の核酸増幅法により合成された核酸、逆転写反応により合成されたcDNA等がある。
【0022】
本発明において核酸サンプルとは、核酸を含有するサンプルであって、標的部位を含有する可能性のあるサンプルであれば、特に限定されるものではない。例えば、標的部位を含む野生型核酸又はその変異型核酸の少なくとも一方を含有する可能性のあるサンプル、好ましくは、その両方を含有する可能性のあるサンプルである。例えば、血液や組織等を試料として試料中の全細胞から得られるゲノムDNAやRNAが該当する。この核酸の抽出は、フェノール/クロロホルム法等の公知の手法により行うことができる。このとき、核酸サンプル中における変異型の存在率は問わない。例えば、100%が野生型であってもよいし、50%が野生型で残り50%が変異型であってもよい。また、当該核酸サンプルは、細胞から得られるゲノムDNAであってもよいし、細胞から調製されたmRNAであってもよいし、mRNAを鋳型にして逆転写反応を行って得られるcDNAであってもよい。さらにはクローン化された多数の遺伝子を人工的に混合したものであってもよいし、核酸増幅反応によって人工的に増幅させた核酸、又はそれらの混合物であってもよい。
【0023】
本発明において野生型核酸とは、変異を生じる前の核酸を意味するものとし、その典型的な例は、変異を生じておらず、本来の正常な機能を有する遺伝情報を含む核酸である。ここで言う遺伝情報とは、mRNA、tRNA、rRNA、snRNA等の情報をコードする転写領域だけでなく、プロモーター等の遺伝子発現上必要な調節領域を含むものとする。
【0024】
本発明において変異型核酸とは、変異を生じた核酸である。変異とはDNAやRNA等の核酸配列の変化であり、遺伝学等で使用される塩基置換、挿入、欠失、逆位、重複、転座等が該当する。当該変異型核酸において、変異の存在する領域は転写領域だけでなく、プロモーター等の遺伝子発現上必要な調節領域を含むものとする。なお、変異により変異型核酸が機能上の変化を有する必要はない。また、変異には、先天的なものも後天的なものも含まれる。
【0025】
本発明において標的部位とは、核酸サンプル中に存在する核酸配列において、プローブがハイブリダイゼーションする部位である。ハイブリダイゼーションするプローブが光応答性核酸類を含むことは必要とせず、該核酸配列とプローブ間のハイブリダイゼーションはその配列の全部又は一部とハイブリダイゼーションすることを意味する。また、標的核酸とは光応答性核酸類が結合して、光連結する核酸配列を有する部位を意味する。ここで光連結とは、光応答性核酸類を含むプローブと標的核酸とが共有結合することを意味する。形成される共有結合の型は、光応答性核酸類の種類によって複数存在することが既に公知であるが、そのいずれをも含むものとし、特に、クロスリンク型の共有結合を形成する場合と、ライゲーション型の共有結合を形成する場合の両方が含まれる。
【0026】
また光応答性核酸類としては、光に反応して他の核酸類と共有結合を形成して連結する性質を有すれば良く、例えば、後述する式I〜VIIによって示される核酸類を使用することができる。後述する式I〜VIIの光応答性核酸類はいずれもピリミジン塩基と共有結合する性質をもつが、該光応答性核酸類と共有結合するものであれば、特に限定されない。このような、炭素−炭素二重結合を形成する塩基としては、天然に存在するものである場合には、好ましくは、シトシン、チミン、ウラシルなどを含む配列が標的核酸となりうる。標的核酸は、標的部位中に存在していてもよいし、本発明において使用される光連結プローブ以外のプローブ中に存在するように設計されて使用してもよい。
【0027】
また、本発明において目的部位とは、変異型核酸において変異が見られる塩基が存在する部位であり、野生型核酸を含め、本発明における遺伝子解析方法の対象となる部位である。例えば、塩基置換があった場合には野生型核酸、変異型核酸共に当該塩基置換した塩基が該当する。また挿入があった場合には変異型核酸においては挿入された塩基が該当し、野生型遺伝子においては変異型核酸で塩基が挿入された部位が該当する。また欠失があった場合には変異型核酸においては欠失によって塩基が失われた部位が該当し、野生型核酸においては変異型核酸で失われた塩基が該当する。また、当該目的部位は、本発明において最終的な解析対象ともなりうる。例えば、遺伝情報をコードする配列を有する鎖(以下、センス鎖とする)を示すものであってもよいし、センス鎖に対して相補的な配列を有する鎖(以下、アンチセンス鎖とする)を示すものであってもよい。また、遺伝情報に直接関与しない配列における核酸配列の変化も含まれるものとする。
【0028】
当該光連結プローブの塩基配列及び光応答性核酸類の位置や数は標的部位の一部、又は全部と特異的にハイブリダイゼーションすることが可能であれば、特に限定はされない。
また、変異箇所や塩基の種類、光連結プローブの長さ等の状況に応じて、標的部位と目的部位とが一致するように光連結プローブを設計することもできるし、目的部位とは頃なる部位に標的部位を設定してプローブを設計することもできる。標的部位と目的部位とが一致する場合には、一部の部位のみを重複させることも可能であるし、全部を重複させて設計することも可能である。
【0029】
本発明に使用できる光応答性核酸類としては、標的核酸と光照射により連結可能であれば良い。
例えば、ソラレン誘導体(Chang, E. et al. Biochemistry 1991, 30, 8283)やアミノプリン誘導体(特開2001−206896)や4−チオウラシル等が使用できる。前記ソラレン誘導体は5’−AT−3’である塩基配列のチミン特異的に反応する性質があり、また、アミノプリン誘導体には配列依存性はないもののシチジン特異的であることから、適用範囲に一定の制約があるため、そのような制限のない下記の光応答性核酸類がより好ましい。
【0030】
使用が好ましい第1の光応答性核酸類として、塩基部分として、式I:
【化1】
(式中、Raは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2〜C7のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、R及びRは、それぞれ独立して、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2〜C7のアルコキシカルボニル基、又は水素である)
で表される基を有する核酸類(Org. Lett., Vol. 10, No. 15, 2008、特開2009−254279号公報)を挙げることができる。結合される核酸がDNAの場合、この式Iで表される置換カルバゾリル基は、式I(a):
【化2】
で示すように、2−デオキシリボースの1位の炭素原子(C)に、β位で結合している。具体的な例としては、3−シアノビニルカルバゾール−1’−β−デオキシリボシド〔3−cyanovinylcarbazole−1’−β−deoxyriboside(CNVK)〕が挙げられる。
【0031】
また、使用が好ましい第2の光応答性核酸類として、式II:
【化3】
(式中、Rは、−CN、−CONR、又は−COORであって、かかるR〜Rは、それぞれ独立して、水素原子又はアルキル基C2n+1(n≧1)である。ここでnの上限は特に限定されるものではないが、例えば、nは1〜7、好ましくは1〜5であることができる)
で表される基を有する核酸類(Organic & Biomolecular Chemistry 2007, 5, 2583、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15 (2005), 1299-1301、特開2005−348645)を挙げることができる。結合される核酸がDNAの場合、この式IIで表される置換フェノキシ基は、式II(a):
【化4】
で示すように、2−デオキシリボースの1位の炭素原子(C)に、α位で結合している。Rが−CN、−COOH、−COOMeであるものが好ましく、特には、−COOH又は−COOMeであるものが好ましい。
【0032】
これらの式Iや式IIで表される基を有することで光連結性を備えた核酸類となる。この光連結性の付与はDNAであってもRNAであっても、さらにはヌクレオチドアナログであっても可能である。これらの光応答性核酸類は通常の核酸の製造方法に準じて製造することができる。
【0033】
また、本発明の好ましい実施の態様において、光応答性核酸類は、塩基部分として次の式III:
【化5】
(ただし、式IIIにおいて、ZはO又はNHを示し、X及びYの少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基及びシアノ基からなる群より選択された電子吸引性基を示し、X及びYの残りの基は水素原子を示す)で表される基を有している。アルコキシカルボニル基におけるアルキル基としては、炭素数1から10、好ましくは1から5の低級アルキル基が挙げられる。置換基X、Yは、両方が同時に同一又は異なる電子吸引基であってもよく、また置換基X、Yの一方だけが電子吸引基であり、他方が水素原子であってもよい。式IIIにおいて、ZがOで、Xが水素原子で、Yがカルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基又はシアノ基であることが好ましい。特に好ましい塩基部分として、5−ビニル−2’−デオキシウリジン、及び5−カルボキシビニル−2’−デオキシウリジンをあげることができる。特に5−カルボキシビニル−2’−デオキシウリジンが好ましい。
【0034】
好ましい実施の別な態様において、光応答性核酸類は、塩基部分として次の式IV:
【化6】
(ただし、式IVにおいて、Rは、水素原子であり、R及びRの少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、R及びRの残りの基は水素原子又はシアノ基を示す)で表される基を有している。
【0035】
及びRの少なくとも一方として、カルボキシル基は好ましく、カルボキシル基と水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0036】
及びRの少なくとも一方として、低級アルコキシカルボニル基は好ましく、低級アルコキシカルボニル基におけるアルキル部分としては、炭素数1〜10、好ましくは1〜5、さらに好ましくは1〜3、さらに好ましくは1〜2、特に好ましくは炭素数1の低級アルキルが挙げられる。すなわち、好ましい低級アルコキシカルボニル基の例としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、及びブトキシカルボニル基等を挙げることができ、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基及びプロポキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基及びエトキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基が特に好ましい。低級アルコキシカルボニル基と水素原子の組み合わせ、特にメトキシカルボニル基と水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0037】
及びRの少なくとも一方として、低級アルケニル基は好ましく、低級アルケニル基としては、炭素数2〜10、好ましくは炭素数2〜5、さらに好ましくは炭素数2〜3、特に好ましくは炭素数2の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルケニル基と水素原子の組み合わせ、特にビニル基と水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0038】
及びRの少なくとも一方として、低級アルキニル基は好ましく、低級アルキニル基としては、炭素数2〜10、好ましくは炭素数2〜5、さらに好ましくは炭素数2〜3、特に好ましくは炭素数2の低級アルキニル基が挙げられる。低級アルキニル基と水素原子の組み合わせ、特にエチニル基と水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0039】
及びRの少なくとも一方として、置換アミドは好ましく、置換アミドとしては、1置換のN−置換アミドを挙げることができ、好ましい例として、N−アルキルアミド、N−アミノアルキルアミドを挙げることができる。このようなN−アルキルアミド、N−アミノアルキルアミドとしては、炭素数1〜10、好ましくは炭素数1〜5、さらに好ましくは炭素数1〜3、特に好ましくは炭素数3のものであり、N−アミノアルキルアミドが特に好ましい。置換アミドと水素原子の組み合わせ、特にN−アミノ(C1〜C3アルキル)アミドと水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0040】
及びRの少なくとも一方として、アミド基は好ましく、アミド基と水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。R及びRの少なくとも一方として、シアノ基は好ましく、シアノ基とシアノ基の組み合わせ、及びシアノ基と水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0041】
及びRの少なくとも一方として、水素原子は好ましく、水素原子を少なくとも1個含む組み合わせ、及び水素原子と水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0042】
好ましい実施の別な態様において、光応答性核酸類は、塩基部分として次の式V:
【化7】
(ただし、式Vにおいて、Rは、水素原子又は低級アルキル基であり、R及びRの少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、R及びRの残りの基は水素原子又はシアノ基を示す)で表される基を有している。
【0043】
としては、水素原子は特に好ましい。
としては、低級アルキル基は好ましく、低級アルキル基としては、炭素数1〜5、好ましくは炭素数1〜3、さらに好ましくは炭素数1〜2、特に好ましくは炭素数1のものである。このような低級アルキル基としては、メチル基、エチル基及びプロピル基等を挙げることができ、メチル基及びエチル基は好ましく、特にメチル基が好ましい。
【0044】
及びRの少なくとも一方として、カルボキシル基は好ましく、カルボキシル基と水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0045】
及びRの少なくとも一方として、低級アルコキシカルボニル基は好ましく、低級アルコキシカルボニル基におけるアルキル部分としては、炭素数1〜10、好ましくは1〜5、さらに好ましくは1〜3、さらに好ましくは1〜2、特に好ましくは炭素数1の低級アルキルが挙げられる。すなわち、好ましい低級アルコキシカルボニル基の例としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、及びブトキシカルボニル基等を挙げることができ、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基及びプロポキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基及びエトキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基が特に好ましい。低級アルコキシカルボニル基と水素原子の組み合わせ、特にメトキシカルボニル基と水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0046】
及びRの少なくとも一方として、低級アルケニル基は好ましく、低級アルケニル基としては、炭素数2〜10、好ましくは炭素数2〜5、さらに好ましくは炭素数2〜3、特に好ましくは炭素数2の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルケニル基と水素原子の組み合わせ、特にビニル基と水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0047】
及びRの少なくとも一方として、低級アルキニル基は好ましく、低級アルキニル基としては、炭素数2〜10、好ましくは炭素数2〜5、さらに好ましくは炭素数2〜3、特に好ましくは炭素数2の低級アルキニル基が挙げられる。低級アルキニル基と水素原子の組み合わせ、特にエチニル基と水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0048】
及びRの少なくとも一方として、置換アミドは好ましく、置換アミドとしては、1置換のN−置換アミドを挙げることができ、好ましい例として、N−アルキルアミド、N−アミノアルキルアミドを挙げることができる。このようなN−アルキルアミド、N−アミノアルキルアミドとしては、炭素数1〜10、好ましくは炭素数1〜5、さらに好ましくは炭素数1〜3、特に好ましくは炭素数3のものであり、N−アミノアルキルアミドが特に好ましい。置換アミドと水素原子の組み合わせ、特にN−アミノ(C1〜C3アルキル)アミドと水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0049】
及びRの少なくとも一方として、アミド基は好ましく、アミド基と水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0050】
及びRの少なくとも一方として、シアノ基は好ましく、シアノ基とシアノ基の組み合わせ、及びシアノ基と水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0051】
及びRの少なくとも一方として、水素原子は好ましく、水素原子を少なくとも1個含む組み合わせ、及び水素原子と水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0052】
好ましい実施の別な態様において、光応答性核酸類は、塩基部分として次の式VI:
【化8】
(ただし、式VIにおいて、Rは、水素原子又は低級アルキル基であり、R及びRの少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、R及びRの残りの基は水素原子又はシアノ基を示す)で表される基を有している。
【0053】
としては、水素原子は特に好ましい。
としては、低級アルキル基は好ましく、低級アルキル基としては、炭素数1〜5、好ましくは炭素数1〜3、さらに好ましくは炭素数1〜2、特に好ましくは炭素数1のものである。このような低級アルキル基としては、メチル基、エチル基及びプロピル基等を挙げることができ、メチル基及びエチル基は好ましく、特にメチル基が好ましい。
【0054】
及びRの少なくとも一方として、カルボキシル基は好ましく、カルボキシル基と水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0055】
及びRの少なくとも一方として、低級アルコキシカルボニル基は好ましく、低級アルコキシカルボニル基におけるアルキル部分としては、炭素数1〜10、好ましくは1〜5、さらに好ましくは1〜3、さらに好ましくは1〜2、特に好ましくは炭素数1の低級アルキルが挙げられる。すなわち、好ましい低級アルコキシカルボニル基の例としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、及びブトキシカルボニル基等を挙げることができ、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基及びプロポキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基及びエトキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基が特に好ましい。低級アルコキシカルボニル基と水素原子の組み合わせ、特にメトキシカルボニル基と水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0056】
及びRの少なくとも一方として、低級アルケニル基は好ましく、低級アルケニル基としては、炭素数2〜10、好ましくは炭素数2〜5、さらに好ましくは炭素数2〜3、特に好ましくは炭素数2の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルケニル基と水素原子の組み合わせ、特にビニル基と水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0057】
及びRの少なくとも一方として、低級アルキニル基は好ましく、低級アルキニル基としては、炭素数2〜10、好ましくは炭素数2〜5、さらに好ましくは炭素数2〜3、特に好ましくは炭素数2の低級アルキニル基が挙げられる。低級アルキニル基と水素原子の組み合わせ、特にエチニル基と水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0058】
及びRの少なくとも一方として、置換アミドは好ましく、置換アミドとしては、1置換のN−置換アミドを挙げることができ、好ましい例として、N−アルキルアミド、N−アミノアルキルアミドを挙げることができる。このようなN−アルキルアミド、N−アミノアルキルアミドとしては、炭素数1〜10、好ましくは炭素数1〜5、さらに好ましくは炭素数1〜3、特に好ましくは炭素数3のものであり、N−アミノアルキルアミドが特に好ましい。置換アミドと水素原子の組み合わせ、特にN−アミノ(C1〜C3アルキル)アミドと水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0059】
及びRの少なくとも一方として、アミド基は好ましく、アミド基と水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0060】
及びRの少なくとも一方として、シアノ基は好ましく、シアノ基とシアノ基の組み合わせ、及びシアノ基と水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0061】
及びRの少なくとも一方として、水素原子は好ましく、水素原子を少なくとも1個含む組み合わせ、及び水素原子と水素原子の組み合わせは、R及びRの組み合わせとして好ましい。
【0062】
好ましい実施の別な態様において、光応答性核酸類は、塩基部分として次の式VII:
【化9】
(ただし、式VIIにおいて、R10は、水素原子又は低級アルキル基であり、R11及びR12の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、R11及びR12の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す)で表される基を有している。
【0063】
10としては、水素原子は特に好ましい。
10としては、低級アルキル基は好ましく、低級アルキル基としては、炭素数1〜5、好ましくは炭素数1〜3、さらに好ましくは炭素数1〜2、特に好ましくは炭素数1のものである。このような低級アルキル基としては、メチル基、エチル基及びプロピル基等を挙げることができ、メチル基及びエチル基は好ましく、特にメチル基が好ましい。
【0064】
11及びR12の少なくとも一方として、カルボキシル基は好ましく、カルボキシル基と水素原子の組み合わせは、R11及びR12の組み合わせとして好ましい。
【0065】
11及びR12の少なくとも一方として、低級アルコキシカルボニル基は好ましく、低級アルコキシカルボニル基におけるアルキル部分としては、炭素数1〜10、好ましくは1〜5、さらに好ましくは1〜3、さらに好ましくは1〜2、特に好ましくは炭素数1の低級アルキルが挙げられる。すなわち、好ましい低級アルコキシカルボニル基の例としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、及びブトキシカルボニル基等を挙げることができ、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基及びプロポキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基及びエトキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基が特に好ましい。低級アルコキシカルボニル基と水素原子の組み合わせ、特にメトキシカルボニル基と水素原子の組み合わせは、R11及びR12の組み合わせとして好ましい。
【0066】
11及びR12の少なくとも一方として、低級アルケニル基は好ましく、低級アルケニル基としては、炭素数2〜10、好ましくは炭素数2〜5、さらに好ましくは炭素数2〜3、特に好ましくは炭素数2の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルケニル基と水素原子の組み合わせ、特にビニル基と水素原子の組み合わせは、R11及びR12の組み合わせとして好ましい。
【0067】
11及びR12の少なくとも一方として、低級アルキニル基は好ましく、低級アルキニル基としては、炭素数2〜10、好ましくは炭素数2〜5、さらに好ましくは炭素数2〜3、特に好ましくは炭素数2の低級アルキニル基が挙げられる。低級アルキニル基と水素原子の組み合わせ、特にエチニル基と水素原子の組み合わせは、R11及びR12の組み合わせとして好ましい。
【0068】
11及びR12の少なくとも一方として、置換アミドは好ましく、置換アミドとしては、1置換のN−置換アミドを挙げることができ、好ましい例として、N−アルキルアミド、N−アミノアルキルアミドを挙げることができる。このようなN−アルキルアミド、N−アミノアルキルアミドとしては、炭素数1〜10、好ましくは炭素数1〜5、さらに好ましくは炭素数1〜3、特に好ましくは炭素数3のものであり、N−アミノアルキルアミドが特に好ましい。置換アミドと水素原子の組み合わせ、特にN−アミノ(C1〜C3アルキル)アミドと水素原子の組み合わせは、R11及びR12の組み合わせとして好ましい。
【0069】
11及びR12の少なくとも一方として、アミド基は好ましく、アミド基と水素原子の組み合わせは、R11及びR12の組み合わせとして好ましい。
【0070】
11及びR12の少なくとも一方として、シアノ基は好ましく、シアノ基とシアノ基の組み合わせ、及びシアノ基と水素原子の組み合わせは、R11及びR12の組み合わせとして好ましい。
【0071】
11及びR12の少なくとも一方として、水素原子は好ましく、水素原子を少なくとも1個含む組み合わせ、及び水素原子と水素原子の組み合わせは、R11及びR12の組み合わせとして好ましい。
【0072】
このような塩基の好適な構造式を以下に例示する。本発明において使用可能な塩基は以下の例示に限定されるものではない。
【化10】
【0073】
本発明においてプローブとは、公知の一緒に結合された二つ以上のヌクレオシドサブユニット又は核酸塩基サブユニットを有するポリマーを意味し、DNAおよび/もしくはRNA又はそのアナログを含む。
【0074】
アナログとは、非天然のヌクレオチドであり、天然のヌクレオチドであるデオキシリボヌクレオチド(DNA)やリボヌクレオチド(RNA)と同様の機能を有するものをいう。すなわち、ヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドと同様にリン酸ジエステル結合により鎖を形成することができ、かつ、ヌクレオチドアナログを用いて形成されたプライマーやプローブは、ヌクレオチドのみを用いて形成されたプライマーやプローブと同様に、PCRやハイブリダイゼーションに用いることができる。
【0075】
このようなヌクレオチドアナログとして、例えば、PNA(ポリアミドヌクレオチド誘導体)、LNA(BNA)、ENA(2’−O,4’−C−Ethylene−bridgednucleic acids)、及びこれらの複合体等がある。ここで、PNAは、DNAやRNAのリン酸と5炭糖からなる主鎖をポリアミド鎖に置換したものである。また、LNA(BNA)は、リボヌクレオシドの2’部位の酸素原子と4’部位の炭素原子がメチレンを介して結合している2つの環状構造を持つ化合物である。
【0076】
上記のアナログに限定されず、そのプローブがハイブリダイゼーションアッセイ条件下で標的部位と相補的であり、安定にハイブリダイゼーションし得るものであればよい。ここで、相補的な配列とは、ハイブリダイゼーション条件下で安定な水素結合を形成し得る塩基配列を有することを意味し、各プローブの核酸間の完全な一致は必要とされない。
【0077】
本発明の光応答性核酸類を含むプローブ(すなわち、光連結プローブ)とは、前記プローブにおいて、少なくとも一つの光応答性核酸類を含むプローブであり、該光応答性核酸類を含むプローブは、標的部位に対して相補的な配列をもつ。
【0078】
本発明において第一のプローブ(以下、光連結プローブと称する場合がある)とは、標的部位対して相補的な配列を有し、かつ、前記光応答性核酸類を含む核酸類プローブをいう。当該光連結プローブは前記の式I〜VIIで表される基を有した光応答性核酸類を含んでいればよい。
【0079】
本発明の光連結方法は、核酸サンプル中に存在する標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有し、光応答性核酸類を含む第一のプローブと、を反応溶液中でハイブリダイゼーションさせ、光照射することにより光連結させる方法において、該第一のプローブが該光応答性核酸類に起因する自己会合(すなわち、自己内での光連結)を抑制させることを特徴とする、光連結方法である。
【0080】
本発明の光連結方法の第一の態様としては、核酸サンプル中の標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有する光応答性核酸類を含む第一のプローブを反応溶液中でハイブリダイゼーションさせ、光照射することによって該標的部位中に存在する標的核酸と該第一のプローブ中の該光応答性核酸類との間で光連結するクロスリンク型の光連結方法において、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを共存させることで、該第一のプローブの自己内での光連結を抑制させる光連結方法が挙げられる。
【0081】
これにより、該標的部位中に存在する標的核酸と該第一のプローブ間の光連結効率を向上させることができる。例えば、所定の光連結条件下で、標的部位とハイブリダイゼーションしなかった未反応の該第一のプローブに該第二のプローブをハイブリダイゼーションさせることで、該第一のプローブが自己会合して二次構造を形成することを防ぎ、光照射による該第一のプローブの自己内での光連結を抑制する。その結果、標的部位中に存在する標的核酸と光連結しなかった未反応の該第一のプローブは光連結能を維持しているため、長時間光照射を継続すること、又は変性やアニーリングの温調サイクルにおいて光照射を複数回繰り返すことで、光連結効率を向上させることができる。
【0082】
前記の高い相補性とは、光応答性核酸類を含む該第一のプローブと該第二のプローブとが互いに相補的な関係にあり、所定の光連結条件下で該第一のプローブ中の該光応答性核酸類が自己内で光連結する塩基が、相補的な該第二のプローブとハイブリダイゼーションしている状態を意味する。該第二のプローブは完全相補な関係であってもよく、該第一のプローブに対して相補的であることが好ましいが、所定の光連結条件下において該第一のプローブとハイブリダイゼーションできれば完全な相補関係は必ずしも必要とはされない。例えば、該第一のプローブの配列の種類や長さ等の情報から、該第一のプローブを構成する核酸類塩基のうち、自己内の光連結に関与する箇所が特定される場合、該当箇所の塩基以外は必ずしも相補的である必要はない。
【0083】
ここで、該第一のプローブ中の光応答性核酸類は標的部位中の標的核酸と光連結するものであるから、当然に該光応答性核酸類は該第二のプローブと光連結しないように設計することが必要である。よって、該光応答性核酸類の標的核酸との光連結を阻害しないように、該第二のプローブを設計することも好ましい。例えば、該第二のプローブがハイブリダイゼーションすることで該光応答性核酸類を含む第一のプローブの自己会合を抑制しつつ、光応答性核酸類の結合能を失わないように設計することが挙げられる。
【0084】
光応答性核酸類が光連結することが可能な塩基は公知であるか、当業者であれば試行錯誤なく同定することができる。例えば、式I又はIIで示される光応答性核酸類はシトシン、チミンやウラシルといったピリミジン塩基と光連結することが公知であることから、該第二のプローブは該第一のプローブ内のピリミジン塩基と相補的な配列となるように設計して使用することができる。なお、第二のプローブは、該第一のプローブ中の該光応答性核酸類が自己内で光連結することが可能なすべての塩基と相補的である必要は無く、少なくとも、所定の光連結条件下で、該第一のプローブ中の該光応答性核酸類が自己内で光連結する塩基と相補的であれば良い。
【0085】
但し、該第二のプローブが該第一のプローブに対してハイブリダイゼーションするためには、連続した塩基を必要とすることは公知であることから、該第二のプローブが必要に応じて、該第一のプローブ内の光応答性核酸類が自己内で光連結する核酸類の塩基以外とも相補性を必要とすることは自明である。
【0086】
また、第二のプローブは、連続した単数の配列として前記第一のプローブの自己内の光連結を抑制することもできるし、第一のプローブ内に存在する光応答性核酸類が光連結可能な核酸と相補性を有する、非連続な複数の配列として使用することもできる。当業者であれば、公知の方法に従って、解析方法や光連結条件に応じて、ハイブリダーゼンション可能な塩基配列や鎖長などを考慮して、連続した単数の配列でも非連続な複数の配列でも、適宜、設計して使用することが可能である。
【0087】
光応答性核酸類は前記光応答性核酸類を含むプローブの中央付近に配置することも可能であるが、該第一のプローブの末端側に配置することもできる。利用する解析系において、使用可能な該第一のプローブの鎖長が制限される場合(例えば、ハイブリダイゼーション可能な最小の鎖長など)、光応答性核酸類を該第一のプローブの末端側に配置することにより、該第一のプローブと安定的にハイブリダイゼーションするように前記第二のプローブを設計することができる。
【0088】
なお、光応答性核酸類を末端に配置することによって、該光応答性核酸類の立体障害のため、ハイブリダイゼーションによって該末端塩基を光連結する核酸との距離を接近させることが不十分になり、標的部位と光連結できない可能性が考えられる場合には、該光応答性核酸類を、末端よりも内側に導入することがより好ましく、更には末端から2〜5塩基目に導入することがより好ましい。
【0089】
従来の技術常識では、プローブは、標的部位以外とは相補的配列を有しないようにすること、及び、プローブが自己配列内において二次構造を形成することを防ぐためにプローブ内に相補的配列を有しないようにすることはもちろん、2つ以上のプローブを使用する場合、それらのプローブ間で相補的配列が少ないことがプローブ設計にあたり重要であるとされていた。
【0090】
しかし本発明の光連結方法では、標的部位に相補的な配列を有し、光応答性核酸類を含む第一のプローブに対して、標的部位と競合関係にある、該第一のプローブと相補性が高い第二のプローブを利用することで、光連結効率を向上させることができたのは意外な効果である。
【0091】
当業者であれば、前記光応答性核酸類を含む第一のプローブが自己内で光連結することが可能か否かについて、公知の方法を適宜選択して使用することができる。例えば、ソフトウェアを使用して塩基の隣接計算や所与の構造の遊離エネルギー計算から、前記光連結プローブの二次構造を予測し、自己内の光連結に関与する核酸を選定することも可能である。更に、後述する実施例のように、所定の光連結条件下において、自己内で光連結するか否か検討することもできる。
【0092】
また、第二のプローブに光応答性核酸類を含めることもでき、第二のプローブとして自己会合を抑制する機能と、光応答性核酸類を含む第一のプローブ(光連結プローブ)として光連結する機能を有するように設計して使用することもできる。
【0093】
光応答性核酸類を含むプローブは、光連結する作用を示す場合には第一のプローブとして、また、自己会合を抑制する作用を示す場合には第二のプローブとして称される場合がある。例えば、標的部位のセンス鎖プローブ、該標的部位のアンチセンス鎖プローブがともに光応答性核酸類を含む場合、該センス鎖プローブを第一のプローブとした場合には該アンチセンス鎖プローブは第二のプローブとなり、該アンチセンス鎖プローブが第一のプローブである場合には、該センス鎖プローブは第二のプローブとして機能する。
この場合、該第二のプローブは、該標的部位のアンチセンス鎖の標的核酸と、クロスリンク型の光連結をすることができる。
【0094】
また、自己会合を抑制する方法であれば上記の方法に限定されることなく、多様な解析方法において本発明の光連結方法を適宜変更して使用することが可能である。
【0095】
例えば、配列が一本鎖である場合(例えばmRNA等)は、光応答性核酸類は少なくとも第一のプローブに含有されていれば良いが、標的部位が二本鎖である場合(例えばdsDNA等)は、光応答性核酸類は第一のプローブだけでなく、第二のプローブにも含有されていることが好ましい。例えば、野生型配列を光連結し、変異型配列を高感度に検出する場合であって、さらに核酸増幅反応を伴う遺伝子解析である場合は、野生型配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両鎖に光連結することで更に高感度に変異型配列を検出、同定することができる。
【0096】
また、第一のプローブ及び第二のプローブが共に光応答性核酸類を有する(すなわち、光連結プローブとして機能する)場合、第一のプローブと第二のプローブの非相補性領域において、第一のプローブ及び/又は第二のプローブ内に存在する光応答性核酸類が自己内で光連結できないように、第一のプローブ及び/又は第二のプローブに相補的な配列を有する第三のプローブを使用することもできる。第三のプローブは、前記第二のプローブの態様と同様に設計し、使用することができる。
【0097】
本発明の光連結方法の第二の態様としては、核酸サンプル中の標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有する光応答性核酸類を含む第一のプローブと、該標的部位に対して相補的な配列を有し標的核酸を含む第四のプローブとを反応溶液中で隣接して配置するようにハイブリダイゼーションさせ、光照射することによって該第四のプローブに存在する標的核酸と該第一のプローブ中の該光応答性核酸類との間で光連結するライゲーション型の光連結方法において、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを共存させることで、該第一のプローブの自己内での光連結を抑制させる光連結方法が挙げられる。
【0098】
該第一のプローブに相補的な配列をもつ、第二のプローブの使用によって、光応答性核酸類が挿入された末端とは反対側の末端に存在する塩基と結合して自己配列内での会合を抑制することも可能である。
【0099】
該ライゲーション型の光連結方法としては、WO2007/058326号公報に記載の方法を本願に取り込んで使用することができる。当業者であれば、光連結方法が該ライゲーション型であることを除いて、本発明の光連結方法の第一の態様を、適宜改変して、該第二の態様を容易に実施することができる。このようなライゲーション型の光応答性核酸類を使用した方法では、該第一のプローブはその3’末端又は5’末端に光応答性核酸類を有しており、標的部位に上記の該第一プローブ及び該第四プローブがハイブリダイゼーションした場合以外にも、該第一のプローブ内の光応答性核酸類とピリミジン塩基とが空間的配置により近接した場合に会合して光連結することを防ぐ使用方法も可能である。
【0100】
以下にライゲーション型の光連結方法について詳述する。
光応答性核酸類を含む第一のプローブと標的核酸を含む第四のプローブは、所定の標的部位において、隣接してハイブリダイゼーションするように配置され、且つ、光照射によって光連結可能なように隣接して該光応答性核酸類と該標的核酸とが配置される。
【0101】
このとき、該光応答性核酸類は第一のプローブの末端に位置するように設計されることが好ましい。また、第四のプローブは第一のプローブと隣接する側の末端が光連結可能な標的核酸となるように設計することが好ましい。
【0102】
また、該第一のプローブと第四のプローブとが1塩基分の間隙も無く近接し、両プローブに光照射された際に光連結によって結合した連続した一本の核酸配列を構成しうることが好ましい。
【0103】
光応答性核酸類を含む該第一のプローブと標的核酸を含む該第四のプローブとが光照射によって連結されることによって、更に安定的な標的部位の塩基配列と相補的な塩基配列を生成する。
【0104】
例えば、光応答性核酸類として、5−カルボキシビニル−2’−デオキシウリジン(CVUと表記する)を有する第一のプローブを使用した場合、このCVUは、標的核酸であるピリミジン塩基と光連結性を示し、チミンの塩基部分と炭素−炭素二重結合を形成する。
【0105】
標的部位である検出対象である核酸配列と、該CVUを含む該第一のプローブと、標的核酸を含む該第四のプローブと、を混合しハイブリダイゼーションさせる。すると、塩基配列の相補性に従って、標的部位に対して該第一のプローブと該第四のプローブとが光連結可能になるように隣接して整列する。この状態で光照射を行うと、光反応により光連結されて、CVUと標的核酸であるピリミジン塩基とが共有結合で1本に連結された状態となる。
【0106】
このようなライゲーション型の光連結方法には、上記のように第一のプローブと第四のプローブのそれぞれ末端側で光連結可能な光応答性核酸類を使用すれば良いが、例えば、該光応答性核酸類として式III〜VIIで示される化合物が使用できる。
【0107】
前記第一の態様又は前記第二の態様はそれぞれ単独で実施することもできるが、該第二の態様は該第一の態様と組み合わせて実施することもできる。例えば、光応答性核酸類を含む第一のプローブがクロスリンク型の光連結を行い、光応答性核酸類を含む第二のプローブがライゲーション型の光連結を行う方法、又は、光応答性核酸類を含む第一のプローブがライゲーション型の光連結を行い、光応答性核酸類を含む第二のプローブがクロスリンク型の光連結を行う方法などが挙げられる。
【0108】
本発明の光連結方法の第三の態様としては、前記光連結プローブは、標的部位とハイブリダイゼーション可能な限り、所定の光連結条件下において、光連結プローブ内の光応答性核酸類が自己会合する核酸を、該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換した該光連結プローブを設計し、自己内の光連結を抑制させることも可能である。また、センス鎖プローブとアンチセンス鎖プローブとがプローブ間で光連結することを防ぐために該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換してプローブを設計し、プローブ間での光連結を抑制させることもできる。例えば、該光応答性核酸類がCNVKである場合はピリミジン塩基からアデニン、グアニンやイノシンのようなプリン塩基に置換して実施することも可能である。置換する塩基の数は、標的部位或いはプローブ内に存在するピリミジン塩基数に応じて適宜設定することができる。
【0109】
また、光応答性核酸類がCNVKである場合、光連結可能な塩基である、シトシンやチミンのピリミジン環を人工的に変換した合成塩基を使用することもできる。この場合、光照射による[2+2]付加環化反応が起きないようにすることで、光連結プローブが自己配列内で光連結することを抑制することができる。この場合使用可能な合成塩基としては、例えば、ピリミジン環の5位もしくは6位の炭素を窒素に置換した5−アゾ−チミン、6−アゾ−チミン、5−アゾ−シトシン、6−アゾ−シトシン等の合成塩基等が挙げられる。
【0110】
該第三の態様は単独で実施することもできるが、前記第一の態様及び/又は前記第二の態様と組み合わせて実施することもできる。
当業者であれば、公知の情報から使用する光応答性核酸類がどの塩基を標的とするか、どのような化学反応機構により光連結を行うか等の性質を考慮し、標的となる塩基に対して置換もしくは修飾を実施して、合成塩基を適宜使用することが可能である。
【0111】
本発明の光連結方法は、緩衝作用のある塩を含む反応溶液中で行うことができる。緩衝作用のある塩としてはカコジル酸塩、リン酸塩、トリス塩をあげることができる。緩衝作用のある塩の濃度は、5〜250mmol/Lの範囲にあることが好ましい。また、アルカリ金属及び/又はアルカリ土類金属の塩を含むことが好ましい。アルカリ金属及び/又はアルカリ土類金属として塩化ナトリウム、及び塩化マグネシウムをあげることができる。さらに反応溶液中にDMSOやホルムアミド等の有機溶剤を加えることで光応答性核酸類を含むプローブと標的部位との特異的な光結合反応を促すこともできる。但し、その後又は同時に行われる遺伝子解析方法を阻害するような物質の混入を避けることが好ましい。特に核酸増幅反応と同時に行う場合は核酸増幅反応に適した反応組成であることが好ましい。
【0112】
本発明の光連結方法における光照射は、一般に350〜380nmの範囲、好ましくは365nmの波長を含む光が好ましく、特に好ましくは365nmの単波長のレーザー光である。好適な実施の様態において光照射による光反応は1秒〜数秒以内が好ましい。但し、容器および溶液の光透過性を考慮してさらに時間をかけて行うこともできる。
【0113】
また、前記光の照射は1回以上行えばよいが、複数繰り返すことにより、光連結効率を高めることができる。当業者であれば、利用する遺伝子解析方法に応じて、適宜、選択して実施することができる。例えば、PCR法において増幅サイクル毎に光照射を繰り返すことによって、より確実に野生型核酸の増幅を抑制することができる。全増幅サイクルで光を照射してもよいし、任意の増幅サイクルから照射を開始又は終了してもよい。
【0114】
また、標的核酸に対して一度光連結した光連結プローブが、光照射による光平衡反応により開裂しないように、光照射時の波長の選択および出力の選択をすることも重要である。光照射時の波長の選択および出力の選択に関しては、当業者であれば過度の検討を実施せず選択可能である。
【0115】
また、別の好適な実施の態様によれば、局所的に前記プローブ濃度を高めることで前記プローブと前記標的部位との会合を効率的かつ迅速化することができ、その結果、光連結効率を向上させることができる。
【0116】
例えば、核酸は反応溶液中で負に帯電することから、アニオン性物質を共存させることにより、局所的に実質的な密度を高め、光連結効率を向上させることができる。アニオン性物質のように負に帯電した物質は、ポリエチレングリコールやデキストランのような帯電していない非イオン性ポリマーに比べて、ハイブリダイゼーションを促進し光連結効果をあげることが可能である。
【0117】
このようなハイブリダイゼーション促進剤としては、公知のアニオン性物質が使用可能であり、例えば、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、又はその塩を使用することができる。アニオン性物質は光連結が行われる反応溶液中に存在していれば良く、核酸サンプル中の対象とする遺伝子を解析する遺伝子解析方法において、光連結以外の反応に影響を及ぼさないように、当業者であれば、適切な濃度範囲を適宜検討の上決定して使用することができる。例えば、ポリアクリル酸塩は、約0.2〜10%(容量に対する重量百分率(w/v)で表す、以下同じ)の範囲が好ましく、0.5〜5%程度がより好ましい。ポリメタクリル酸塩では、約1.0〜50%の範囲が好ましく、5〜25%程度がより好ましい。
【0118】
これらのポリマーの分子量は、広い範囲にわたるが、約5,000〜100,000ダルトンであることが好ましく、分子量約5,000〜10,000ダルトンであることがより好ましい。本発明におけるハイブリダイゼーション促進を意図して、同等の種々のアクリル酸塩重合体を使用することも可能であり、アクリル酸塩の様々な単独重合体および共重合体であって、ハイブリダイゼーション促進特性を有することが予期される化合物を使用することができる。
【0119】
なお、上記のハイブリダイゼーション効率の向上方法は、光連結条件下における、標的部位と光応答性核酸類を含むプローブのハイブリダイゼーションだけではなく、あらゆるハイブリダイゼーションにおいて有用なことは、当業者であれば自明である。
【0120】
また、本発明の光連結において、前記光連結プローブと前記標的部位との会合を効率的かつ迅速化することで光連結効率を向上させることができる。
【0121】
例えば、核酸サンプル中の標的部位を含む核酸配列の存在量に関わらず、光応答性核酸類を含む光連結プローブの濃度を高くすることで、光連結効率を向上させることができる。その場合、光連結時におけるプローブ濃度は約0.1μmol/L以上であることが好ましく、約1μmol/L以上であることがより好ましく、約10μmol/L以上であることが最も好ましい。
【0122】
このように光応答性核酸類を含む光連結プローブが、自己配列内で光連結することを抑制したり、局所的に光連結プローブの濃度を高めて標的部位と効果的にハイブリダイゼーションしたりすることで、光連結効率を向上させることが可能である。
【0123】
本発明における光連結方法は、公知の、核酸サンプル中の対象とする遺伝子を解析する遺伝子解析方法に使用することができる。これは、対象とする遺伝子の有無やその配列を同定するだけでなく、該遺伝子の精製や選択的回収も含まれることは、当業者であれば設計変更の範囲内である。
上記の精製や選択的回収の例としては、該遺伝子の精製や核酸サンプル中の標的核酸類を含む核酸を選択的に収集する前処理工程が挙げられる。これらの前処理工程における使用は、下記に述べる遺伝子解析方法において極めて有効である。従って、該前処理の後に続いて実施される遺伝子解析方法、遺伝子検出方法において高感度で正確な解析を達成することが可能となり、好ましい。
【0124】
また、本発明で使用可能な遺伝子解析方法としては、公知の遺伝子検出方法や核酸増幅方法等が使用できる。遺伝子検出方法や核酸増幅方法としては、様々な方法が知られているが、Invader法、Sniper法、TaqMan PCR法、Hybridization Probe法、SNPIT法、Pyrominisequencing法、Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC)法、MALDI−TOF/MS法、NanoChip法などが迅速且つハイスループットで解析する方法として挙げられる。また、本発明で使用可能な別の遺伝子解析方法としては、例えば、標的部位に未知の変異型核酸があると思われる場合に、検出領域の増幅産物について塩基配列を決定することで変異型核酸の有無を判定することができる。
【0125】
本発明の遺伝子検出方法の利用としては、標的部位に対して相補的で光応答性核酸類を含む光連結プローブを蛍光標識したものをハイブリダイゼーションさせ、光照射により該標的核酸と該光連結プローブ間で光連結させ、蛍光を検出することにより、該遺伝子を検出する方法が挙げられる。当業者であれば、本発明の光連結方法を、遺伝子解析の目的に応じて適宜変更して実施することができ、また、公知の遺伝子検出方法に容易に使用することができる。
【0126】
本発明において核酸増幅方法とは、公知のポリメラーゼ反応を利用した鋳型核酸の増幅反応をいい、例えば、WO2012/033190号公報に開示されている公知の核酸の増幅抑制方法において、本発明の光連結方法を利用することができる。
【0127】
核酸の増幅方法における本発明の光連結方法の利用としては、標的部位を含む検出対象である核酸配列(増幅用ヌクレオチド配列)を増幅可能なプライマーを用いて、公知の核酸増幅方法を実施する際に、検出対象である遺伝子の核酸の変異に基づいて、ある核酸配列(例えば、野生型核酸)の増幅を抑制する一方、それ以外の核酸配列(例えば、変異型核酸)のみを選択的に増幅させる方法における利用が挙げられる。
【0128】
野生型核酸又は変異型核酸のいずれを増幅抑制の対象とするかは、その目的に応じて適宜選択することができ、特に限定されるものではないが、例えば、核酸サンプル中の存在比に大きな偏りがある場合、大量に存在する核酸(例えば、野生型核酸)の増幅を抑制し、微量に存在する核酸(例えば、変異型核酸)のみを選択的に増幅することにより、微量に存在する核酸の有無を検出することができる。
【0129】
例えば、本発明の光連結方法により、増幅抑制対象である野生型核酸(標的部位を有する)に対して、該標的部位に相補的な配列を有し、光応答性核酸類を含む第一のプローブをハイブリダイゼーションさせ、光照射により該標的核酸と該第一のプローブとで光連結させることにより、該野生型核酸の増幅を抑制して、検出対象である変異型核酸のみを選択的に増幅する。
【0130】
また、TaqMan法によって使用されるTaqManプローブのように、必要に応じて蛍光物質や消光物質で配列中の塩基を標識してもよい。変異型核酸に対するTaqManプローブ等の公知の検出用プローブを利用することにより、対象核酸の検出だけでなく定量を行うこともできる。
【0131】
また、本発明の光連結方法による特定の核酸の増幅抑制方法は、他の核酸増幅方法と同時に行うこともできるし、核酸増幅方法の前処理段階として実施することもできる。当業者であれば、本発明の光連結方法を、遺伝子解析の目的に応じて適宜変更して実施することができ、また、公知の遺伝子増幅方法に容易に使用することができる。
【0132】
前記選択的核酸増幅に用いるプライマーは、変異型核酸の増幅用ヌクレオチド配列を増幅することのできるプライマーであり、それは同時に、光応答性核酸類を有するプローブが光連結される前の野生型核酸において、野生型核酸の増幅用ヌクレオチド配列も増幅できるプライマーである。
【0133】
野生型配列を有する分子は光照射によって光応答性核酸類を有する光連結プローブと光連結しているため、架橋された塩基より3’末側への伸長反応が進まず増幅されない。一方、変異型配列を有する分子の大部分は光応答性核酸類を有する光連結プローブと光連結していないため、伸長反応が起こり、その結果、選択的な核酸増幅が成される。
【0134】
核酸増幅法に使用可能な増幅プライマーは、1又は2以上の標的部位を含む増幅用ヌクレオチド配列をPCRにより増幅し得るプライマーであり、増幅用ヌクレオチド配列を挟む2種類のプライマーである。例えば、増幅用ヌクレオチド配列の上流端領域と相同的なヌクレオチド配列を有するフォワードプライマーと、増幅用ヌクレオチド配列の下流端領域と相補的なヌクレオチド配列を有するリバースプライマーとからなる2種類のプライマーであってもよい。なお、PCRにおいて用いられる該2種類のプライマーの各濃度は、PCR産物として二本鎖核酸を得ることができる濃度比であれば特に限定されるものではないが、等濃度で用いることが好ましい。
【0135】
PCRに用いられるこれらのプライマーは増幅用ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列の配列情報から常法により設計、合成することができる。PCRに用いられるこれらのプライマーは、ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログからなる群より選択される1以上がリン酸ジエステル結合により連結したものである。プライマーの長さは、プライマーのTm値、増幅ヌクレオチド配列の種類等を考慮して適宜決定することができるが、10〜100分子連結したものであることが好ましい。
【0136】
PCR反応に使用される試薬の種類、量、調製方法および反応条件等のプロトコルは常法に従って行うことができる。なお、PCRに用いられるDNAポリメラーゼは、通常PCRにおいて用いられるDNAポリメラーゼであれば特に限定されるものではないが、耐熱性ポリメラーゼであることが好ましい。
【0137】
光応答性核酸類を有するプローブは、光照射により標的部位との光連結によってポリメラーゼの伸長反応を阻害することから、光応答性核酸類を有するプローブ自体にヌクレアーゼ活性に対する抵抗性は必要としない。従って、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの使用も可能である。但し、光応答性核酸類を有するプローブがプライマーとして機能し、ポリメラーゼの伸長反応が生じ得る場合は、ポリメラーゼによる伸長反応が起こる温度で標的分子から解離するようにTm値を考慮するか、光応答性核酸類を有するプローブの3’末端に伸長反応を阻害する物質を修飾することによって増幅プライマーとして機能しないようにすることが好ましい。また、本発明の光連結方法のために第一のプローブ、第二のプローブ、第三のプローブ、第四のプローブを使用する場合、これらのプローブについても同様に、増幅プライマーとして機能しないようにTm値の考慮ならびに3’末端に伸長反応を阻害するような物質を修飾することが好ましい。
【0138】
また、PCR反応において、通常のPCR増幅反応に適した反応組成で実施できる。さらに選択的増幅反応を促すために反応液中にDMSOやホルムアミド等、ハイブリダイゼーション条件に影響を与える物質を加えることも可能である。
【0139】
本発明の光連結キットは、本発明の光連結方法が実施できるように構成される。具体的には、前記本発明の光連結方法の第一の態様、前記第二の態様、前記第三の態様などが実施される。該光連結キットを構成する第一のプローブ、第二のプローブ、第三のプローブ、第四のプローブとは、本発明の光連結方法における第一のプローブ、第二のプローブ、第三のプローブ、第四のプローブと同じものを意味する。
【0140】
本発明の第一の光連結キットとしては、少なくとも、核酸サンプル中の標的部位に対して相補的な配列を有し、該標的部位中の標的核酸と光連結する光応答性核酸類を含む第一のプローブ(光連結プローブ)と、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを含む。
また、光応答性核酸類を含む該第二のプローブを含むこともできる。この場合、前記第二のプローブは光連結プローブとしても機能する。
更に、光連結プローブとして機能する、前記第一のプローブ及び/又は前記第二のプローブに相補的な配列を有する第三のプローブを含むこともできる。
【0141】
本発明の第二の光連結キットとしては、少なくとも、核酸サンプル中の標的部位に対して相補的な配列を有する光応答性核酸類を含む第一のプローブ(光連結プローブ)と、該第一のプローブの該光応答性核酸類と光連結する標的核酸を含む第四のプローブと、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを含む。
また、光応答性核酸類を含む該第二のプローブを含むこともできる。この場合、前記第二のプローブは光連結プローブとしても機能する。
更に、光連結プローブとして機能する、前記第一のプローブ及び/又は前記第二のプローブに相補的な配列を有する第三のプローブを含むこともできる。
【0142】
本発明の第三の光連結キットとしては、少なくとも、核酸サンプル中の標的部位に対して相補的な配列を有する光応答性核酸類を含む第一のプローブ(光連結プローブ)を含み、該光連結プローブは、該光連結プローブ内の光応答性核酸類が自己会合する核酸を、該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換して該光連結プローブの自己内の光連結を抑制されたものである。
【0143】
本発明の光連結キットには、利用する遺伝子解析方法に応じて、反応溶液、標識酵素、核酸増幅用のポリメラーゼ、核酸増幅用のプライマー等を含むこともできる。当業者であれば、公知のキットの構成に応じて、適宜、選択して設計することができる。
【実施例】
【0144】
以下では、光連結プローブの光応答性核酸類としてCNVKを使用し、上皮成長因子受容体(epidermal growth factor receptor:EGFR)遺伝子配列の一部を標的部位とした場合を例に詳細な説明をするが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。本発明の精神から離れることなく、いかなる変更、改良又は改変を加えることができることは当業者には自明である。
また、本実施例中において、アミノ酸文字表記と該アミノ酸の位置番号とで示された表記の場合には野生型を、元のアミノ酸一文字表記と該アミノ酸位置番号に加えて、更に置換されたアミノ酸一文字表記を組合せて表記される場合には変異型をあらわすものとする。
【0145】
[実施例1:光連結プローブの自己配列内での光連結確認]
実施例1−1.光連結プローブの調製
EGFR遺伝子上のエクソン21(ex.21)領域の一部と同配列の100merからなるオリゴヌクレオチドを合成し(配列番号1)、光連結対象の鋳型とした。
[配列番号1] 100merオリゴヌクレオチド:
5’−AGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAA−3’(配列番号1)
【0146】
この合成オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション可能な16merからなる光連結プローブは以下のように調製した。光連結プローブとして、光応答性プローブ(photo−reactive probe)を光応答性核酸類である3−シアノビニルカルバゾール−1’−β−デオキシリボシド(CNVK)の導入位置を変えて4種類設計した(配列番号2〜5)。これらPREPの配列を表1に示す。なお、CNVKのPREPへの導入位置をnとして示す。
CNVKは特開2009−254279号公報に記載の方法に従って調製し、プローブの合成はファスマック社に委託した。また、CNVKの構造式を図1に示す。
【0147】
【表1】
【0148】
実施例1−2.光連結プローブへの光照射処理
実施例1−1.にて合成した各PREPをTEにて100μmol/Lに溶解し、各200pmolを別々の0.2mLチューブに分取した。それぞれのサンプルに対して以下の条件にて光照射を実施した。なお、光連結波長である365nmの光照射はUV−LED照射器(ZUV−C30H:オムロン)を、開裂波長である312nmの光照射はUVトランスイルミネーター(フナコシ)を使用した。
【0149】
条件1:光未照射
各PREPに対して光照射を行わない。
条件2:光連結光照射
各PREPに365nmの光を室温にて1分間照射する。
条件3:光連結光照射+光連結開裂光照射
条件2の光照射を施した各PREPに、312nmの光を室温にて5分間照射する。
【0150】
実施例1−3.電気泳動による評価
光照射処理の影響を見るため、実施例1−2.の条件で処理した各々のPREPを滅菌水で10μmol/Lに希釈後、MultiNA(島津製作所)を用いてマイクロチップ電気泳動を行った。そのゲルイメージを図2図5に示す。
【0151】
4種類すべてのPREPにおいて、光連結波長の光を照射することにより電気泳動のバンドが低分子側にシフトした。これは、明らかにPREPのコンフォメーションが変化したことを示唆している。
また、光連結波長の光を照射した後に光連結開裂波長の光を照射すると、低分子側にシフトしたバンドが、光連結波長の光を照射する前(すなわち、光未照射)のバンドの位置に戻ることが確認された。これは、自己の配列内で形成していた光連結が開裂し元の状態に戻ったものと考えられる。
この現象は、4種類すべてのPREPにおいて同様に確認されたことから、光連結部位であるCNVKの導入位置に関係なく起こると考えられた。
【0152】
[実施例2:光照射処理をした光連結プローブの光連結効率の評価]
実施例2−1.光連結プローブの調製
評価対象の光連結プローブは、実施例1−2.で調製したPREPa.〜PREPd.を使用した。
【0153】
実施例2−2.光連結プローブの光連結反応
0.2mLチューブに、標的部位として100pmol/Lの合成オリゴヌクレオチド2μLを分取し、10μmol/LのPREP(実施例1−2.記載の各条件で処理したもの)2μLを加え、1×PCRバッファー(10mmol/L Tris−HCl(pH8.3),50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl,0.001%(W/V) gelatin)の終濃度で総量を20μLとした。
これを95℃にて5分間加熱処理し、50℃にて5秒間静置した後、50℃でUV−LEDにより365nmの光を30秒間照射した。なお、対照として光を照射しないサンプルを同時に用意した。
【0154】
実施例2−3.定量PCR反応溶液の調製と反応条件
実施例2−2.で調製したサンプル(対照サンプルを含む)の各調製液20μLに80μLの滅菌水をそれぞれ加えよく混合した後、その内5μLずつを鋳型としてプライマーEGFR Ex.21FおよびEx.21Rによりライトサイクラー(Light Cycler:ロッシュ)を使用して定量PCR反応を実施した。
【0155】
PCR反応試薬にはLight Cycler Fast Start DNA Master SYBER Green I(ロッシュ)を使用した。なお、プライマーの配列は以下の通りである。
EGFR ex.21F:5’−GAACGTACTGGTGAAAACACC−3’(配列番号6)
EGFR ex.21R:5’−GCATGGTATTCTTTCTCTTCC−3’(配列番号7)
【0156】
実施例2−4.光連結効率の評価
実施例2−2.で光連結処理を実施したサンプルと光連結処理を実施しなかった対照のサンプルを鋳型として、それぞれ実施例2−3.の条件にて定量PCR反応を実施した。PREPが光連結した標的部位は、共有結合により架橋された箇所でポリメラーゼの伸長反応が止まるため、増幅反応の鋳型として機能しなくなる。従って、定量PCR反応において、光連結処理を実施しなかった対照サンプルよりも通常遅いサイクルにて蛍光シグナルが立ち上がってくる。そのため、PREPにより光連結された標的部位の量を以下の式に従い算出し、光連結効率として表記することができる。
ΔCt=光連結処理後の標的部位のCt値−光連結未処理の標的部位のCt値
光連結効率(%)=(1−2ΔCt)×100
このようにして、各PREPの標的部位への光連結効率を評価した結果を表2に示す。
【0157】
【表2】
【0158】
その結果、いずれのPREPにおいても、光連結波長を1分間照射した後においては著しく光連結効率が低下していることが確認された。また、開裂波長を5分間照射することによって、一度失われた光連結効率が再び回復し、光連結可能な状態になっていることが確認された。
この結果から、PREPに対して光連結波長が照射されると、PREPの自己配列内で光連結され、その結果、PREPの光連結能が消失したことで、標的部位に対する光連結効率が大きく低下したと考えられる。
さらに、自己の配列内で光連結してしまったPREPに対して光連結開裂波長である312nmの光を照射することで、自己配列内で形成していた光連結が開裂し元の状態に戻ったために、低下していた光連結効率が回復したと考えられる。
また、いずれのPREPにおいても光連結能の消失および回復が認められることからPREPに対するCNVKの導入位置に関わらずPREPの自己内での光連結および開裂が起こることが示唆された。
これらの結果は、実施例1において光連結反応後の電気泳動バンドがシフトし、光連結開裂波長の光を照射した後には電気泳動バンドが元の位置に戻った事実とも一致するものである。
【0159】
[実施例3:プリン塩基のみで構成される光連結プローブにおける自己配列内での光連結確認]
光応答性核酸類であるCNVKとは光連結しない、プリン塩基のみで構成されたPREPを合成し、合成した各PREPが光連結波長の光を照射しても自己配列内で光連結しないことを確認した。
【0160】
実施例3−1.光連結プローブの調製
光連結プローブとして、プリン塩基であるアデニン(A)もしくは、グアニン(G)のみで構成した以下の3種のPREPを調製した。合成したPREPの配列を表3に示す。その際、光応答性核酸類であるCNVKの導入位置(X)および鎖長(16mer)は統一とした。
【表3】
【0161】
実施例3−2.光連結プローブへの光照射処理
実施例3−1.にて合成した各PREPをTEにて100μmol/Lに溶解し、各200pmolを別々の0.2mLチューブに分取した。それぞれのサンプルに対して以下の条件にて光照射を実施した。
なお、光連結波長である365nmの光照射はUV−LED照射器を使用した。
条件1:光未照射
各PREPに対して光照射を行わない。
条件2:光連結光照射
各PREPに365nmの光を4℃にて3分間照射する。
【0162】
実施例3−3.電気泳動による評価
光照射処理の影響をみるために、実施例3−2.の条件で処理した各々のPREPを滅菌水で10μmol/Lに希釈後、MultiNAを用いてマイクロチップ電気泳動を行った。そのゲルイメージを図6図8に示す。
【0163】
3種類いずれのPREPにおいても、光連結波長の光を照射する前後で、電気泳動のバンドに移動度の違いは見られなかった。このことから、プリン塩基のみで構成されたPREPは、光応答性核酸類であるCNVKと結合可能な塩基がプローブの配列内に存在していないため、自己の配列内で光連結しなかったことが推察された。
【0164】
[実施例4:相補配列を利用した光連結プローブの自己配列内での光連結抑制]
実施例4−1.光連結プローブの調製
野生型配列であるEGFR遺伝子上の790番目のスレオニン(T790)、858番目のロイシン(L858)および861番目のロイシン(L861)に該当する核酸配列を標的部位として、EGFR遺伝子のコード鎖、すなわち、センス鎖にハイブリダイゼーションするアンチセンス鎖(AS鎖)の光連結プローブであるPREPを設計し、同時にEGFR遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリダイゼーションするセンス鎖(S鎖)の光連結プローブであるPREPも設計した。その際に、センス鎖のPREPとアンチセンス鎖のPREPの相補性を以下の組み合わせのように変化させ、お互いの光連結プローブ同士が光連結しない位置に実施例1で記載したCNVKを配した。図9に光連結プローブとして実際に使用したPREPの配列とその相補性についての模式図を示す。図中のAS鎖は野生型EGFR遺伝子配列のセンス鎖と相補的であることを意味し、S鎖は野生型EGFR遺伝子配列のアンチセンス鎖と相補的であることを意味するものとする。
【0165】
(1)L861: 相補性が低い組み合わせの例
L861 AS鎖:5’−CTCTTCCGCACCCAnCAG−3’(配列番号11)
L861 S鎖 :5’−TTGGGCTGGCCAAnCTGC−3’(配列番号12)
(2)T790: 相補性が高い組み合わせの例
T790 AS鎖:5’−TGAnCTGCGTGATGAG−3’(配列番号13)
T790 S鎖 :5’−CAnCTCATCACGCAGC−3’(配列番号14)
(3)L858: 相補性が(1)及び(2)の中間的な組み合わせの例
L858 AS鎖:5’−CAnTTTGGCCAGCCC−3’(配列番号15)
L858 S鎖 :5’−CAnTTTGGGCTGGCCA−3’(配列番号16)
【0166】
実施例4−2.光連結プローブへの光照射処理
光連結プローブへの光照射処理は、以下の条件に従って実施した。
条件1:AS鎖、光未照射
実施例4−1.にて合成したEGFR遺伝子のセンス鎖にハイブリダイゼーションするAS鎖のPREPを各々、TEにより10μmol/Lに調製したものを条件1とした。
条件2:AS鎖、光照射
条件1と同様に調製した各々のAS鎖のPREPを、サーマルサイクラー(アプライド社製)にて4℃にした後、UV−LED照射器にて365nmの光を3分間照射したものを条件2とした。
条件3:S鎖、光未照射
実施例−1.にて合成したEGFR遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリダイゼーションするS鎖のPREPを各々、TEにより10μmol/Lに調製したものを条件3とした。
条件4:S鎖、光照射
条件3と同様に調製した各々のS鎖のPREPを、サーマルサイクラーにて4℃にした後、UV−LED照射器にて365nmの光を3分間照射したものを条件4とした。
条件5:S鎖+AS鎖光未照射
実施例4−1.にて合成したEGFR遺伝子のセンス鎖にハイブリダイゼーションするAS鎖のPREPと、EGFR遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリダイゼーションするS鎖のPREPを、それぞれが終濃度で10μmol/Lになるように混合したものを条件5とした。
条件6:S鎖+AS鎖光照射
条件5と同様に混合した各PREP溶液を、サーマルサイクラーにて4℃にした後、UV−LED照射器にて光を3分間照射したものを条件6とした。
【0167】
実施例4−3.電気泳動による評価
実施例4−2.の条件にて調製したPREP試料を、MultiNAを用いてマイクロチップ電気泳動を行った。そのゲルイメージを、図10図12に示す。図10は(1)L861を標的部位としたPREPの組み合わせ、図11は(2)T790、図12は(3)L858の結果である。
【0168】
(1)L861:相補性が低い組み合わせ
電気泳動の結果より、相補性が低い組み合わせでは、センス鎖に対するPREP単独の場合、アンチセンス鎖に対するPREP単独の場合のいずれも光照射処理後にバンドシフトが認められ、自己の配列内で光連結されていることが示唆された(図10のレーン1〜4)。
また、センス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPを混合した条件5においては、条件1および条件3において見られた、センス鎖に対するPREP単独の場合及びアンチセンス鎖に対するPREP単独の場合と同じ位置にバンドが認められたことから、センス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPとはハイブリダイゼーションしていないと考えられた。
さらに、センス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPを混合し光照射した条件6においても、センス鎖に対するPREPに光照射処理した条件2とアンチセンス鎖に対するPREPに光照射処理した条件4のバンドと同じ位置にバンドが認められた。
【0169】
(2)T790:相補性が高い組み合わせ
電気泳動の結果より、相補性が高い組み合わせにおいても、センス鎖に対するPREP単独の場合、アンチセンス鎖に対するPREP単独の場合のいずれも光照射処理後にバンドシフトが認められ、自己の配列内で光連結していることが示唆された(図11のレーン1〜4)。
また、センス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPを混合した条件5においては、光照射を行っていない条件1のセンス鎖に対するPREP単独の場合と、光照射を行っていない条件3のアンチセンス鎖に対するPREP単独の場合とは、異なる位置に一本のバンドが認められたことから、センス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPがハイブリダイゼーションしていることが推察された。
さらに、センス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPを混合したものに光照射を行った条件6においては、光照射する前と同じ位置にバンドが認められ、センス鎖に対するPREP、アンチセンス鎖に対するPREPの光照射による自己の配列内で光連結した場合に検出される位置には、バンドが認められなかった。
このことから、光照射時にセンス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPがハイブリダイゼーションしていれば、自己の配列内で光連結は起こらないことが示唆された。
【0170】
(3)L858:相補性が(1)及び(2)の中間的な組み合わせ
電気泳動の結果より、相補性が中間的な組み合わせにおいても、センス鎖に対するPREP単独の場合、アンチセンス鎖に対するPREP単独の場合のいずれも光照射後にバンドシフトが認められ自己の配列内で光連結していることが示唆された(図12のレーン1〜4)。
また、センス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPを混合した条件5においては、光照射を行っていない条件1のセンス鎖に対するPREP単独の場合と、光照射を行っていない条件3のアンチセンス鎖に対するPREPの単独の場合とは、異なる位置にバンドが認められたことから、センス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPがハイブリダイゼーションしていることが推察された。
【0171】
さらに、センス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPを混合したものに光照射を行った条件6においては、光照射する前とは異なる位置に2本のバンドが確認された。
低分子側のバンド(下のバンド)はセンス鎖に対するPREP単独の場合、又はアンチセンス鎖に対するPREP単独の場合に光照射し自己の配列内で光連結された場合のバンドの位置と同じであることから、センス鎖に対するPREP又はアンチセンス鎖に対するPREPの自己会合に由来するバンドと考えられた。
また、高分子側のバンド(上のバンド)は、センス鎖に対するPREP単独の場合、アンチセンス鎖に対するPREP単独の場合の、自己会合由来のバンドとも異なる位置に認められた。このことから、センス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPとのハイブリダイゼーションは維持されているが、ハイブリダイゼーション出来ない塩基の部分にて光連結が行われ、バンドがシフトしたものと考えられた。
【0172】
以上より、相補性が低いPREPを混合して使用した場合においては、センス鎖に対するPREP又はアンチセンス鎖に対するPREPをそれぞれ単独で使用した場合にも、各々のPREPを混合させて使用した場合にも、PREPが自己の配列内で光連結することが確認された。
また、センス鎖に対するPREPとアンチセンス鎖に対するPREPとが中程度の相補性がある場合でも、ハイブリダイゼーションしていない塩基中にCNVKと光連結可能なシトシン又はチミンのようなピリミジン塩基が存在していると、自己の配列内において光連結してしまうことが示唆された。
このことから、光連結プローブが自己の配列内で光連結することを抑制するためには、光連結プローブ間の相補性を高くすることが効果的であると考えられた。また、CNVKと光連結可能なピリミジン塩基が相補鎖によって覆われ、CNVKと結合可能な状態で存在しないようにすることが効果的であると考えられた。
【0173】
[実施例5:相補性の高い光連結プローブを用いた光連結の確認]
実施例5−1.光連結プローブの調製
T790を標的部位とした、実施例4−1.(2)で調製した相補性の高い組合せであるPREPを使用した。
【0174】
実施例5−2.EGFRエクソン20(ex.20)領域における野生型遺伝子断片の調製
健常者の末梢血から通常の方法によりヒトゲノムDNAを調製し、これを鋳型としてプライマーセットEGFR ex.20F及びEGFR ex.20Rを使用してT790に該当する核酸配列を包むEGFRエクソン20(ex.20)の領域を通常のPCR反応条件により増幅した。PCR反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。
EGFR ex.20F:5’−CAGAAGCCTACGTGATGG−3’(配列番号17)
EGFR ex.20R:5’−ACCTTTGCGATCTGCACAC−3’(配列番号18)
【0175】
得られたPCR増幅産物をpGEMT easy Vector(プロメガ)内に、添付のプロトコルに従って挿入しクローニングした。
このプラスミドを鋳型として、前記プライマーセットEGFR ex.20F及びEGFR ex.20Rを使用して通常のPCR反応条件によって増幅を行い、PCR Purification Kit(キアゲン)を用いて精製することで、直鎖状のEGFR ex.20の野生型遺伝子断片を得た(配列番号19)。
PCR Purification Kit(キアゲン社製)を用いて精製したEGFR ex.20の野生型遺伝子断片の重量濃度をNanoDrop spectrophtometer(Thermo Scientific)を用いて測定し、増幅断片長を考慮して各遺伝子断片のコピー数を算出したものを、野生型核酸として以下の反応の検討鋳型として用いた。
【0176】
[配列番号19] EGFR ex.20野生型断片
5’−CAGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGT−3’(配列番号:19)
【0177】
実施例5−3.光連結反応時の試薬組成
0.2mLチューブに、実施例5−2.で調製した標的核酸(1×10コピー/μL)を2μLと、10μmol/Lに調製した、実施例4−1.(2)に示すT790に該当する核酸塩基を標的とした、T790 AS鎖(配列番号3)及びT790 S鎖(配列番号4)のPREPをそれぞれ2μLずつ加え、1×PCRバッファー(10mmol/L Tris−HCl(pH8.3),50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl,0.001%(W/V) gelatin)の終濃度で総量を20μLとした。
【0178】
実施例5−4.光連結反応時の条件
実施例5−3.で調製した核酸サンプル溶液に対して、2つの温度条件にて光連結波長である365nmの光照射を実施した。なお、対照として光を照射しないサンプルを同時に用意した。
条件1:50℃において光照射
95℃にて3分間加熱処理後、50℃にて30秒間静置した後、50℃で光を30秒間照射した。
条件2:4℃において光照射
95℃にて3分間加熱処理後、4℃にて1分間静置した後、4℃で30秒間光照射した。
【0179】
実施例5−5.定量PCRによる光連結量の確認
実施例5−4.で光連結反応を実施した各反応液20μLに80μLの滅菌水をそれぞれ加えよく混合した後、その内5μLずつを鋳型としてライトサイクラー(LC 480 Ver2:ロッシュ)を使用して定量PCR反応を実施した。
定量PCR用反応液としては、以下の試薬を混合して調製し、1サンプルあたりの最終液量が25μLになるように滅菌水を加えて調製した。12.5μLの2×Premix Ex Taq(登録商標)(タカラバイオ)に、増幅プライマーとしてEGFR ex.20F及びEGFR ex.20Rをそれぞれ5pmolずつ添加した。
さらに末端蛍光標識した検出プローブを2.5pmol添加した。この検出プローブの配列は以下の通りである。
Total LNAプローブ:5’−Cy5/CTT+CGGC+TGC+CTC/BHQ2−3’(配列番号20)
なお、配列中の+はそれに続く塩基がLNAであることを示し、Cy5はクエンチャーとなる蛍光色素を、BHQ2は蛍光抑制物質を、それぞれ示す。当該検出プローブの合成はIDT社に委託した。
また、定量PCR反応は95℃,10秒+(95℃,3秒/58℃,30秒)×45サイクルの条件で実施した。
各々の試料について、光連結効率は実施例2と同様に定量PCRで算出したΔCt値から評価した。その結果を図13に示す。
【0180】
50℃で光連結波長である365nmの光照射をした場合、ΔCtが4程度で光を複数回照射してもほぼ一定であるのに対して(図13における黒丸)、4℃で実施した場合には光を照射するたびにΔCtが上昇することが確認された(図13における黒三角形)。この事は、50℃においては、光を複数回照射しても光連結量が増加しないのに対して、4℃においては光を照射するたびに光連結量が増加していることを意味している。
従って、4℃においては、PREP相補鎖間のハイブリダイゼーション形成が維持され、PREPの自己配列内での光連結が抑制されたため、光を複数回照射するたびに光連結量が増加したのに対し、50℃においては、PREP相補鎖間のハイブリダイゼーションが十分に維持されず、PREPが自己の配列内で光連結したことにより、PREPが鋳型に対して光連結できなくなったために、光を複数回照射しても光連結量が増加しないものと考えられた。
つまり、光連結プローブの自己の配列内での光連結を抑制するためには、光連結プローブの相補鎖の相補性を高めることと、相補的な光連結プローブ同士(又は光連結プローブと相補的な第二のプローブと)が十分にハイブリダイゼーションを形成できる温度条件で光を照射する必要がある。
【0181】
[実施例6:ハイブリダイゼーション促進のための添加剤検討]
実施例5の結果から、50℃にて光を照射した際には相補的な光連結プローブ同士のハイブリダイゼーションが維持できていないことが示唆された。そこで、光連結プローブ間のハイブリダイゼーションを促進可能な添加剤に関して検討を実施した。種々検討を実施したが、その中でも効果が高かった陰性荷電を持つ高分子(ポリアクリル酸:pAAc)に関しての結果を示す。
【0182】
実施例6−1.光連結プローブの調製
T790に該当する核酸配列を標的とした、実施例4−1.(2)で調製した相補性の高い組合せであるPREPを使用した。
【0183】
実施例6−2.EGFRエクソン20(ex.20)領域における野生型遺伝子断片の調製
健常者の末梢血を材料として、実施例5−2.と同じ方法でEGFR ex.20領域における野生型遺伝子断片を調製した。
【0184】
実施例6−3.光連結反応時の試薬組成
0.2mLチューブに、実施例6−2.で調製したex.20の野生型遺伝子断片(1×10コピー)を2μLと、10μmol/Lに調製した、実施例4−1.(2)に示すT790に該当する核酸配列を標的とした、T790 AS鎖(配列番号13)及びT790 S鎖(配列番号14)の光連結プローブであるPREPをそれぞれ2μLと、10%(w/w)ポリアクリル酸(pAAc)を2μL加え、1×PCRバッファー(10mmol/L Tris−HCl(pH8.3),50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl,0.001%(W/V) gelatin)の終濃度で総量を20μLとした。
【0185】
実施例6−4.光連結反応時の条件
実施例5−3.で調製した核酸サンプル溶液に対して以下の条件で光照射を実施した。なお、対照として365nmの光を照射しないサンプルを同時に用意した。
条件1:ポリアクリル酸(pAAc)添加した核酸サンプル溶液について、4℃で光照射した。
条件2:ポリアクリル酸(pAAc)未添加の核酸サンプル溶液について、4℃で光照射した。
条件3:ポリアクリル酸(pAAc)添加の核酸サンプル溶液について、50℃で光照射した。
条件4:ポリアクリル酸(pAAc)未添加の核酸サンプル溶液について、50℃で光照射した。
【0186】
実施例6−5.定量PCRによる光連結量の確認
実施例5−4.で光照射により光連結させた試料について、定量PCRを行った。定量PCRの条件は実施例5と同一の条件で実施した。
各々の試料について、光連結効率は実施例2と同様に定量PCRで算出したΔCt値から評価した。4℃で光照射した結果については図14に、50℃で光照射した結果については図15に示す。
【0187】
光連結波長である365nmの光照射処理を4℃で行った場合には、pAAcを添加することで光照射1サイクルでのΔCtが増加していた(図14における黒三角形)。これは、pAAcを添加したことで鋳型に対してPREPがより効果的にハイブリダイゼーション可能になり、光照射1回あたりの光連結量を増加させたためである。つまり、pAAcはPREPと鋳型のハイブリダイゼーションを促進させている。
【0188】
また、光連結波長である365nmの光照射処理を50℃で行った場合においても、pAAcを添加することでΔCtが大きく増加していた(図15における黒三角形)。これは、光連結波長である365nmの光照射処理を4℃で行った場合の結果と同様に、pAAcによって鋳型に対してPREPがより効果的にハイブリダイゼーション可能になったことに加え、PREP相補鎖間でのハイブリダイゼーションが促進されたため、PREPの相補鎖間で十分なハイブリダイゼーションの形成が可能となり、その結果、PREPの自己配列内での光連結が抑制されたものと考えられた。
【0189】
このことからも、光連結波長である365nmの光照射時に光連結プローブ相補鎖間のハイブリダイゼーションを維持し、光連結プローブの自己配列内での光連結を抑制し、光連結プローブを光連結可能な状態に維持することが光連結効率を向上させることに効果的であることが確認された。
【0190】
[実施例7:遺伝子変異検出感度の確認]
これまでの実施例に示した通り、光連結プローブの自己配列内での光連結を抑制することで、標的部位との光連結効率を向上することが可能であることが分かった。この事を踏まえ、遺伝子変異検出感度への効果を検証するため、EGFR遺伝子のT790Mを標的として遺伝子変異検出を行った。
【0191】
実施例7−1.変異型EGFR遺伝子断片の調製
実施例5−2.で調製した野生型プラスミドに、公知の方法に従い、PrimeSTAR(登録商標)Mutagenesis Basal Kit(タカラバイオ)を用いてT790Mの変異を導入した。すなわち、当該方法により、EGFR遺伝子の2639番目の塩基をシトシン(C)からチミン(T)に変異させた。これを変異型プラスミドとした。
次に、このプラスミドを鋳型として、実施例4に記載のプライマーセットEGFR ex.20F及びEGFR ex.20Rを使用して通常のPCR反応条件によって増幅を行い、直鎖状のEGFR変異型遺伝子断片を得た。得られた変異型遺伝子断片をPCR Purification Kitを用いて精製した後、重量濃度をNanoDrop spectrophtometerを用いて測定し、増幅断片長を考慮して各遺伝子断片のコピー数を算出したものを変異型核酸とし、以下の検討の鋳型として用いた(配列番号21)。
【0192】
EGFR ex.20 変異型断片
5’−CAGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAACTCATCATGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGT−3’(配列番号:21)
【0193】
実施例7−2.変異型混入サンプルの調製
実施例5−2.で調整した野生型核酸と実施例7−1.で調製した変異型核酸の混合比率を変えて3種類(変異1%、変異0.1%、変異0.01%)調製し、変異型核酸検出用の試料として用いた。使用した野生型核酸と変異型核酸の混合比を表4に示す。また、変異型核酸を混合しない試料を変異0%の試料とした。また、混合型は1μLあたりのコピー数を示す。
【表4】
【0194】
実施例7−3.光連結プローブの調製
T790に該当する核酸配列を標的とした、実施例−1.(2)で調製した相補性の高い組合せである光連結プローブを使用した。
【0195】
実施例7−4.光連結反応時の試薬組成
0.2mLチューブに、実施例7−2.で調製した実施例4−1.(2)に示すT790に該当する核酸配列を標的とした、T790 AS鎖(配列番号13)及びT790 S鎖(配列番号14)のPREPをそれぞれ2μLと、10%(w/w)ポリアクリル酸(pAAc)を2μL加え、1×PCRバッファー(10mmol/L Tris−HCl(pH8.3),50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl,0.001% (W/V) gelatin)の終濃度で総量を20μLとした。
【0196】
実施例7−5.光連結反応時の条件
実施例7−4.で調製したサンプルに対して、UV−LEDにより光連結波長である365nmの光照射を実施した。95℃にて3分間加熱処理後、95℃にて30秒間維持し、50℃にて5秒間静置した後、50℃で光を30秒間照射する工程を1サイクルとし、合計10回繰り返した。
【0197】
実施例7−6.定量PCRによる光連結量の確認
実施例7−5.の各調製液20μLに80μLの滅菌水をそれぞれ加えよく混合した後、その内5μLを取り45μLの滅菌水を加えた。この内5μLずつを鋳型としてライトサイクラーを使用して定量PCR反応を実施した。なお、定量PCRは実施例5及び実施例6と同一の条件で実施した。
【0198】
その結果を図16に示す。図16において、aは変異1%、bは変異0.1%、cは変異0.01%、dは変異0%の結果を示す。グラフの縦軸は蛍光強度の対数表示値であり、横軸はPCRサイクル数である。変異型0%(野生型のみ)に比して、変異が混入している場合は蛍光シグナルが高くなっている。その結果、変異1%から変異0.01%まで濃度依存的に変異を検出していることが確認された。これは、PREPの自己配列内で光連結を抑制することで、野生型配列に対する光連結効率が向上したことに起因すると思われる。
光連結プローブの自己配列内での光連結を抑制することで、これまで非常に難しかった変異0.01%の存在比においても変異型核酸を選択的かつ効果的に増幅することが可能となった。
以上より、本法は高感度かつ高精度に変異遺伝子を検出可能であることが示された。
【0199】
[実施例8:イノシンを導入したPREPの評価]
実施例8−1.光連結プローブ(PREP)の調製
光連結対象の鋳型としては、実施例1−1.で調製した、EGFR遺伝子上のエクソン21(ex.21)領域の一部と同配列の100merからなるオリゴヌクレオチドを使用した。
この合成オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション可能な16merからなるPREPをイノシンの導入位置を変えて3種類設計した(配列番号23〜25)。1つは、イノシンを導入しないPREPを比較対象用のコントロールとして設計した(配列番号22)。これらPREPの配列を表5に示す。尚、光連結性核酸類であるCNVKのPREPへの導入位置をnとし、イノシンの導入位置をIとして示す。
【表5】
【0200】
実施例8−2.PREPへの光照射処理
実施例8−1.にて合成した各PREPをTEにて100μmol/Lに溶解し、各200pmolを別々の0.2mLチューブに分取した。それぞれのサンプルに対して以下の条件にて光照射を実施した。尚、クランプ形成波長である365nmの光照射はUV−LED照射器(ZUV-C30H:オムロン)を使用した。
条件1:光未照射
各PREPに対して光照射を行わない。
条件2:クランプ形成光照射
各PREPに365nmの光を4℃にて3分間照射する。
【0201】
実施例8−3.電気泳動による評価
光照射処理の影響を見るため、実施例8−2.の条件で処理した各々のPREPを滅菌水で10μmol/Lに希釈後、MultiNA(島津製作所)を用いてマイクロチップ電気泳動を行った。そのゲルイメージを図17に示す。
イノシンを導入していないPREP(PREP e.)、イノシンを1箇所導入したPREP(PREP f.)はUV照射後のバンドが低分子側にシフトしているのに対して、イノシンを2個、3個導入したPREP(PREP g.、PREP h.)はUV照射後のバンドシフトが見られなくなった。これは、イノシンを導入していないPREP、イノシンを1個しか導入していないPREPは、UV照射により明らかなPREPのコンフォメーション変化が生じているのに対して、イノシンを2個、3個導入することでPREPのコンフォメーション変化を抑制したことを示している。
このことから、PREP内のクロスリンクターゲットとなるピリミジン塩基をイノシンのようなクロスリンクターゲットとならない塩基に置き換えることで、PREPの自己配列内でのクランプ形成を抑制可能であることが示された。
【0202】
[実施例9:光照射処理をしたPREPのクランプ形成効率の評価]
実施例9−1.光連結プローブ(PREP)の調製
評価対象のPREPは、実施例8−1.で調製したPREP e.とPREP h.を使用した。
【0203】
実施例9−2.PREPの光連結反応(クランプ形成反応)
0.2mLチューブに、標的部位を有する核酸配列として100pmol/Lの合成オリゴヌクレオチド2μLを分取し、100μmol/LのPREP(実施例8−2.記載の各条件で処理したもの)2μLを加え、1×PCRバッファー(10mmol/L Tris−HCl(pH8.3),50mmol/L KCl,1.5 mmol/L MgCl,0.001%(W/V)gelatin)の終濃度で総量を20μLとした。
これを95℃にて5分間加熱処理し、45℃にて5秒間静置した後、45℃でUV−LEDにより365nmの光を30秒間照射した。尚、対照として光を照射しないサンプルを同時に用意した。
【0204】
実施例9−3.定量PCR反応溶液の調製と反応条件
実施例9−2.で調製したサンプル(対照サンプルを含む)の各調製液20μLに80μLの滅菌水をそれぞれ加えよく混合した後、更にその内5μLずつを45μLの滅菌水に混合した。混合したサンプルの内5μLを鋳型としてライトサイクラー(LC 480Ver2:ロッシュ社製)を使用して定量PCR反応を実施した。
定量PCR用反応液としては、以下の試薬を混合して調製し、1サンプルあたりの最終液量が25μLになるように滅菌水を加えて調製した。12.5μLの2×Premix Ex Taq(登録商標)(タカラバイオ社製)に、増幅プライマーとしてEGFR ex.21F(配列番号:6)及びEGFR ex.21R(配列番号:7)をそれぞれ5pmolずつ添加した。
さらに末端蛍光標識した検出プローブを2.5pmol添加した。この検出プローブの配列は以下の通りである。
Total LNAプローブ:5’−Cy5/CAGCATGT+CAAGA+TCACAGA/BHQ_2−3’(配列番号26)
尚、配列中の+はそれに続く塩基がLNAであることを示し、Cy5は蛍光色素を、BHQ2は蛍光抑制物質を、それぞれ示す。当該検出プローブの合成はIDT社に委託した。
また、定量PCR反応は95℃,10秒+(95℃,3秒/56℃,30秒)×45サイクルの条件で実施した。
【0205】
各々の試料について、クランプ形成効率は実施例2と同様に定量PCRで算出したΔCt値から評価した。その結果を図18に示す。
尚、プライマーの配列は以下の通りである。
EGFR ex.21F:5’−GAACGTACTGGTGAAAACACC−3’(配列番号6)
EGFR ex.21R:5’−GCATGGTATTCTTTCTCTTCC−3’(配列番号7)
【0206】
イノシンを導入していないPREP e.を用いた場合、ΔCtが4程度でUVを複数回照射してもほぼ一定であるのに対して(図18中三角印)、イノシンを導入したPREP h.を用いた場合、UVの照射回数を増やすごとにΔCtが増加する(図18の四角印)ことが分かる。
これは、イノシンを導入していないPREPは、PREPの自己配列内でのクランプ形成が起き、光を複数回照射してもPREPの鋳型に対するクランプ形成量が増加しなかったのに対し、イノシンを導入したPREPは、PREPの自己配列内でのクランプ形成が抑制されたため、PREPが鋳型に対して十分にクランプ形成可能となったためUV照射回数に応じてクランプ形成量が増加したものと考えられる。
つまり、PREPの自己の配列内でのクロスリンクターゲット塩基をイノシンのような光連結の標的核酸とならない塩基に置換することで、PREPの自己配列内での光連結を抑制でき、PREPのクランプ形成量を増加可能であることが示された。
【0207】
[実施例10:相補性の高いPREPを用いたクランプ形成の確認]
実施例10−1.光連結プローブ(PREP)の調製
野生型配列であるEGFR遺伝子上の861番目のロイシン(L861)に該当する核酸配列を標的部位として、実施例8−1.で設計したPREP e.の配列をEGFR遺伝子のコード鎖、即ちセンス鎖にハイブリダイゼーションするアンチセンス鎖(AS鎖)のPREPとし(配列番号22)、同時にEGFR遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリダイゼーションするセンス鎖(S鎖)のPREPも設計した(配列番号27)。CNVKの導入位置をnとして示す。
L861 AS鎖:5’−GCAnCCAGCAGTTTGG−3’(配列番号22)
L861 S鎖 :5’−CTGnCCAAACTGCTGG−3’(配列番号27)
【0208】
また、センス鎖のPREPとアンチセンス鎖のPREPの相補性とが完全相補の関係であって、お互いのPREP同士が光連結しない位置にCNVKを配し、且つ、各PREPのCNVKが本来光連結できる標的核酸をイノシンに置換したPREPを設計した。CNVKの導入位置をnとし、イノシンの導入位置をIとして示す。
L861 AS鎖:5’−GCAnCCAGCAGTITGG−3’(配列番号28)
L861 S鎖 :5’−CCAAnCTGCTGGGIGC−3’(配列番号29)
図19にクランププローブとして実際に使用したPREPの配列とその相補性についての模式図を示す。
【0209】
実施例10−2.EGFRエクソン21(ex.21)領域における野生型遺伝子断片の調製
健常者の末梢血から通常の方法によりヒトゲノムDNAを調製し、これを鋳型としてプライマーセットEGFR ex.21F及びEGFR ex.21Rを使用してL861に該当する核酸配列を包むEGFRエクソン21(ex.21)の領域を通常のPCR反応条件により増幅した。PCR反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。
EGFR ex.21F(out):5’−GCATGAACTACTTGGAGGAC−3’(配列番号30)
EGFR ex.21R(out):5’−ACCTAAAGCCACCTCCTTAC−3’(配列番号31)
得られたPCR増幅産物をpGEMT easy Vector(プロメガ)内に、添付のプロトコルに従って挿入しクローニングした。
【0210】
このプラスミドを鋳型として、前記プライマーセットEGFR ex.21F及びEGFR ex.21Rを使用して通常のPCR反応条件によって増幅を行い、PCR Purification Kit(キアゲン社製)を用いて精製することで、直鎖状のEGFR ex.21の野生型遺伝子断片を得た(配列番号32)。
PCR Purification Kit(キアゲン社製)を用いて精製したEGFR ex.21の野生型遺伝子断片の重量濃度をNanoDrop spectrophtometer(Thermo Scientific)を用いて測定し、増幅断片長を考慮して各遺伝子断片のコピー数を算出したものを、野生型核酸として以下の反応の検討鋳型として用いた。
【0211】
[配列番号32] EGFR ex.21野生型断片
5’−GCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTGGT−3’(配列番号32)
【0212】
実施例10−3.光連結反応時の試薬組成
0.2mLチューブに、実施例10−2.で調製した標的核酸(1×10コピー/μL)を2μLと、100μmol/Lに調製した、実施例10−1.に示すL861に該当する核酸塩基を標的とした、L861 AS鎖(配列番号28)及びL861 S鎖(配列番号29)のPREPをそれぞれ2μLずつ加え、1×PCRバッファー(10mmol/L Tris−HCl(pH8.3),50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl,0.001%(W/V)gelatin)の終濃度で総量を20μLとした。
【0213】
実施例10−4.光連結反応時の条件
実施例10−3.で調製した核酸サンプル溶液に対して、95℃にて5分間加熱処理し、45℃にて5秒間静置した後、45℃でUV−LEDにより365nmの光を30秒間照射した。尚、対照として光を照射しないサンプルを同時に用意した。
【0214】
実施例10−5.定量PCRによるクランプ量の確認
実施例10−4.で光連結反応を実施した各反応液20μLに80μLの滅菌水をそれぞれ加えよく混合した後、更にその内5μLずつを45μLの滅菌水に混合した。混合したサンプルの内5μLを鋳型としてライトサイクラー(LC 480Ver2:ロッシュ社製)を使用して定量PCR反応を実施した。
定量PCR用反応液としては、以下の試薬を混合して調製し、1サンプルあたりの最終液量が25μLになるように滅菌水を加えて調製した。12.5μLの2×Premix Ex Taq(登録商標)(タカラバイオ社製)に、増幅プライマーとしてEGFR ex.21F及びEGFR ex.21Rをそれぞれ5pmolずつ添加した。さらに末端蛍光標識した検出プローブを2.5pmol添加した。検出プローブには、実施例9に記載のプローブ(配列番号26)と同じものを使用し、定量PCR反応は実施例9−2.と同じ条件で行った。
【0215】
各々の試料について、クランプ形成効率は実施例2と同様に定量PCRで算出したΔCt値から評価した。その結果を図20に示す。
既存の設計手法により設計したPREP(三角印)は、UVを複数回照射してもΔCtがある一定のところで飽和してしまうが、イノシンを導入し完全相補で設計したPREPを用いることでUV複数回照射するごとにΔCtを増加させることができることが分かる。
これは、PREP内にイノシンを導入し、かつPREPの相補性を高めたことでPREPの自己配列内でのクランプ形成を抑制出来たためと考えられる。このことからもクランプ形成波長である365nmの光照射時にPREP相補鎖間のハイブリダイゼーションを維持し、PREPの自己配列内でのクランプ形成を抑制し、PREPをクランプ形成可能な状態に維持することがクランプ形成効率を向上させることに効果的であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【0216】
本発明は、光応答性核酸類を含むプローブを用いた、光連結効率を向上させる方法に関するものであり、高感度かつ高精度に遺伝子を解析することができる。例えば、大量に存在する野生型遺伝子に混在する微量に存在する変異型遺伝子を選択的に検出する際に使用できる。また、従来の評価方法では検出が困難であった標的とする核酸が微量にしか存在しない核酸サンプルからの遺伝子検出も可能にするものである。
また、以上のような解析が可能になることは、手術により摘出された組織や生検材料のような侵襲性の高い検査材料に限定されず、例えば血液試料のような標的とする核酸が微量にしか存在しない試料をも材料として扱えるため、困難であった治療効果の確認やモニタリング検査を可能にする。これらは、癌の早期発見や、個々の患者について薬剤感受性や薬剤応答性をはじめとした薬効評価等に適用することで、個別化医療の実現を可能とするものである。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【0217】
配列表の配列番号2〜5の各塩基配列は、人工的に合成したプローブ配列であり、それぞれ、PREPa.(6番目のnはCNVK)、PREPb.(8番目のnはCNVK)、PREPc.(10番目のnはCNVK)、PREPd.(12番目のnはCNVK)である。配列番号8〜10の各塩基配列は、人工的に合成したプローブ配列であり、それぞれ、PREP−A(3番目のnはCNVK)、PREP−G(3番目のnはCNVK)、PREP−AG(3番目のnはCNVK)である。配列番号11〜16の各塩基配列は、人工的に合成したプローブ配列であり、それぞれ、プローブL861 AS(15番目のnはCNVK)、プローブL861 S(14番目のnはCNVK)、プローブT790 AS(4番目のnはCNVK)、プローブT790 S(3番目のnはCNVK)、プローブL858 AS(3番目のnはCNVK)、プローブL858 S(3番目のnはCNVK)である。配列番号20の塩基配列は、人工的に合成したプローブ配列であり、Total LNAプローブ(4番目のC、8番目のT、11番目のCはLNA)である。配列番号22〜25の各塩基配列は、人工的に合成したプローブ配列であり、それぞれ、PREPe.(4番目のnはCNVK)、PREPf.(4番目のnはCNVK、14番目のnはイノシン)、PREPg.(4番目のnはCNVK、13〜14番目のnはイノシン)、PREPh.(4番目のnはCNVK、12〜14番目のnはイノシン)である。配列番号26の塩基配列は、人工的に合成したプローブ配列であり、Total LNAプローブ(9番目のC、14番目のTはLNA)である。配列番号27〜29の各塩基配列は、人工的に合成したプローブ配列であり、それぞれ、プローブL861 S(4番目のnはCNVK)、プローブT861 AS(4番目のnはCNVK、13番目のnはイノシン)、プローブT861 S(5番目のnはCNVK、14番目のnはイノシン)である。
図1
図9
図13
図14
図15
図16
図18
図19
図20
図2
図3
図4
図5
図6
図7
図8
図10
図11
図12
図17
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]