知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特許6019412悪性腫瘍に対する高選択的細胞毒性を有するインディルビン誘導体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6019412
(24)【登録日】2016年10月14日
(45)【発行日】2016年11月2日
(54)【発明の名称】悪性腫瘍に対する高選択的細胞毒性を有するインディルビン誘導体
(51)【国際特許分類】
C07D 405/14 20060101AFI20161020BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20161020BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20161020BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20161020BHJP
A61K 31/404 20060101ALI20161020BHJP
【ＦＩ】
C07D405/14CSP
A61P35/00
A61P43/00 105
A61P43/00 111
A61P35/02
A61K31/404
【請求項の数】7
【全頁数】11
(21)【出願番号】特願2013-524655(P2013-524655)
(86)(22)【出願日】2012年7月5日
(86)【国際出願番号】JP2012067153
(87)【国際公開番号】WO2013011841
(87)【国際公開日】20130124
【審査請求日】2015年6月8日
(31)【優先権主張番号】特願2011-156299(P2011-156299)
(32)【優先日】2011年7月15日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】899000057
【氏名又は名称】学校法人日本大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所
(74)【代理人】
【識別番号】100077562
【弁理士】
【氏名又は名称】高野 登志雄
(74)【代理人】
【識別番号】100096736
【弁理士】
【氏名又は名称】中嶋 俊夫
(74)【代理人】
【識別番号】100117156
【弁理士】
【氏名又は名称】村田 正樹
(74)【代理人】
【識別番号】100111028
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 博人
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 孝
(72)【発明者】
【氏名】宮入 伸一
(72)【発明者】
【氏名】齋藤 弘明
(72)【発明者】
【氏名】田畑 恵市
【審査官】
三木 寛
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２００５／０４１９５４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２００７／１１７２６２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２００２／１００４０１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
米国特許出願公開第２００９／０１１１９８７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
特表２００２−５４１２４４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２００９−５２３１２５（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２０１０／０１３１６８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１０／０５１２２３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
DALLAVALLE,S. et al，Novel 7-Oxyiminomethyl Derivatives of Camptothecin with Potent in Vitro and in Vivo Antitumor Activi，Journal of Medicinal Chemistry，２００１年，Vol.44, No.20，p.3264-3274
【文献】
MLOCHOWSKI,J. et al，Derivatives of 1,10- and 4,7-phenanthrolinaldehydes and di(N,N-di-ethylamino)ethoxyphenanthrolines a，Journal fuer Praktische Chemie/Chemiker-Zeitung，１９９３年，Vol.335, No.7，p.623-627
【文献】
MLOCHOWSKI,J. et al，Synthesis of 2,7-fluorenone bisglycidyl ether and related compounds as potential cytostatics，Journal fuer Praktische Chemie，１９９０年，Vol.332, No.1，p.5-14
【文献】
Jun ADACHI, et al，Indirubin and Indigo Are Potent Aryl Hydrocarbon Receptor Ligands Present in Human Urine，The Journal of Biological Chemistry，２００１年，Vol.276 No.34，p.31475-31478
【文献】
EVE D., et al.，Anti-mitotic properties of indirubin-3'-monoxime, a CDK/GSK-3 inhibitor: induction of endoreplicatio，Oncogene，２００１年，Vol.20，p.3786-3797
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ０７Ｄ ４０５／１４
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
一般式（１）
（式中、Ａは炭素数１〜４のアルキレン基を示し、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基又はアルコキシ基を示す）
で表されるインディルビン誘導体又はその塩。
【化1】
で表されるインディルビン誘導体又はその塩。
【請求項2】
Ａがメチレン基である請求項１記載のインディルビン誘導体又はその塩。
【請求項3】
Ｒ1〜Ｒ4がそれぞれ独立して水素原子又はアルコキシ基である請求項１又は２記載のインディルビン誘導体又はその塩。
【請求項4】
請求項１〜３のいずれか１項記載のインディルビン誘導体又はその塩を有効成分とする医薬。
【請求項5】
請求項１〜３のいずれか１項記載のインディルビン誘導体又はその塩を有効成分とする悪性腫瘍治療剤。
【請求項6】
請求項１〜３のいずれか１項記載のインディルビン誘導体又はその塩を有効成分とするアポトーシス誘導剤。
【請求項7】
請求項１〜３のいずれか１項記載のインディルビン誘導体又はその塩、及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規なインディルビン誘導体又はその塩及びこれを含有する医薬に関する。【背景技術】
【0002】
がん（悪性腫瘍）は死亡原因の一位を占める疾患であり、新たな治療法が求められている。現在の悪性腫瘍治療法としては、外科療法、放射線療法、化学療法（抗悪性腫瘍剤）があるが、通常これらを組み合わせて治療が行なわれる。抗がん剤には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド系抗がん剤、抗生物質抗がん剤、白金製剤、分子標的薬等が用いられているが、これら抗がん剤の治療効果は未だ十分とは言えず、また副作用の発生頻度が高いという問題がある。【0003】
一方、インディルビンは、ヒト尿中から単離されたインドール系化合物であり、環境ホルモンの一種である２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＴＣＤＤ）よりもアリルハイドロカーボン受容体（ＡｈＲ）に高い親和性を有することが知られている。従って、インディルビンはＡｈＲの内因性リガンドの可能性が指摘されている（非特許文献１）。また、インディルビンは、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫｓ）、さらにグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）に作用して、細胞周期、細胞分化、神経細胞の極性形成などに影響を与えることが報告されている（非特許文献２）。これらのインディルビンの標的タンパク質は、細胞増殖に高度に関連しており、ＧＳＫ−３βは最近のがん治療分子標的薬のターゲットであるチロシンキナーゼの一種である。【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Ａｄａｃｈｉ，Ｊ．；Ｍｏｒｉ，Ｙ．；Ｍａｔｓｕｉ，Ｓ．；Ｔａｋｉｇａｍｉ，Ｈ．；Ｆｕｊｉｎｏ，Ｊ．；Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｈ．；Ｍｉｌｌｅｒ ＩＩＩ，Ｃ．Ａ．；Ｋａｔｏ，Ｔ．；Ｓａｅｋｉ，Ｋ．；Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６，３１４７５．
【非特許文献2】Ｄａｍｉｅｎｓ，Ｅ．；Ｂａｒａｔｔｅ，Ｂ．；Ｍａｒｉｅ，Ｄ．；Ｅｉｓｅｎｂｒａｎｄ，Ｇ．；Ｍｅｉｊｅｒ，Ｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００１，２０，３７８６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の課題は、新たな作用機序に基づく悪性腫瘍治療薬を提供することにある。【課題を解決するための手段】
【0006】
そこで本発明者は、がん治療の分子標的薬のターゲットであるチロシンキナーゼの一種であるＧＳＫ−３βやＣＤＫｓに作用することが知られているインディルビンに着目し、種々の誘導体を合成し、その癌細胞増殖抑制作用を検討してきたところ、インディルビンの３位をオキシム化し、さらにここにエポキシ基を導入したところ、該化合物が、従来から強い悪性腫瘍治療薬として知られているシスプラチンよりも強力な癌細胞増殖抑制作用を有することを見出し、本発明を完成した。【0007】
すなわち、本発明は、一般式（１）【0008】
【化1】
【0009】
（式中、Ａは炭素数１〜４のアルキレン基を示し、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基又はアルコキシ基を示す）で表されるインディルビン誘導体又はその塩を提供するものである。
【0010】
また本発明は、上記インディルビン誘導体又はその塩を有効成分とする医薬、特に悪性腫瘍治療剤、アポトーシス誘導剤を提供するものである。また本発明は、上記インディルビン誘導体又はその塩、及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物を提供するものである。
また本発明は、上記インディルビン誘導体又はその塩の、医薬、特に悪性腫瘍治療剤、アポトーシス誘導剤製造のための使用を提供するものである。
また本発明は、悪性腫瘍治療又はアポトーシス誘導のための、上記インディルビン誘導体又はその塩を提供するものである。
また本発明は、上記インディルビン誘導体又はその塩の有効量を投与することを特徴とする悪性腫瘍治療方法又はアポトーシス誘導方法を提供するものである。
【発明の効果】
【0011】
本発明のインディルビン誘導体（１）は、悪性腫瘍細胞の増殖を強力に抑制し、悪性腫瘍治療剤として有用である。【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】神経芽腫細胞であるＩＭＲ−３２、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＬＡ−Ｎ−１、ＮＢ−３９に対する本発明化合物（ＨＳ−２）の細胞傷害活性を示す図である。（図中、横軸は化合物濃度、縦軸は細胞生存率を示す。）
【図2】神経芽腫細胞であるＩＭＲ−３２に対する本発明化合物（ＨＳ−２）のアポトーシス誘導を示す図である。
【図3】神経芽腫細胞であるＩＭＲ−３２に対する本発明化合物（ＨＳ−２）のアポトーシス誘導を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明のインディルビン誘導体は、一般式（１）で表される。一般式（１）中、Ａは炭素数１〜４のアルキレン基を示すが、当該アルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ブチレン基等の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基が挙げられ、このうち、メチレン基、エチレン基がより好ましく、メチレン基が特に好ましい。【0014】
Ｒ1〜Ｒ4は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基又はアルコキシ基を示す。ここでハロゲン原子としては、塩素原子、フッ素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。アルコキシ基としては、炭素数１〜６のアルコキシ基が挙げられ、そのうちメトキシ基、エトキシ基、イソプロピルオキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、ｎ−ブチルオキシ基等の炭素数１〜４のアルコキシ基がより好ましく、メトキシ基、エトキシ基が特に好ましい。【0015】
また、Ｒ1〜Ｒ4としては、水素原子又はアルコキシ基が好ましく、特に水素原子が好ましい。【0016】
インディルビン誘導体（１）の塩としては、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩等の無機塩、酢酸塩、フマル酸塩等の有機酸塩が挙げられる。また、本発明のインディルビン誘導体（１）が不斉炭素原子を有する場合には、光学活性体及びラセミ体のいずれも含まれる。さらに、本発明化合物は、水和物等の溶媒和物の形態で存在してもよい。【0017】
インディルビン誘導体（１）は、例えば次の反応式に従って製造することができる。【0018】
【化2】
【0019】
（式中、Ｒ5はアルカノイル基を示し、Ｘはハロゲン原子を示し、Ａ、Ｒ1〜Ｒ4は前記と同じ）【0020】
すなわち、カルボン酸インドキシル類（２）及びイサチン類（３）を塩基の存在下に縮合させてインディルビン類（４）を得、これにヒドロキシルアミン又はその塩を反応させてインディルビン−３’−オキシム（５）を得、次いでこれにハロアルキルオキシラン類（６）を反応させることにより、インディルビン誘導体（１）が得られる。【0021】
反応式中、Ｒ5で示されるアルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基等が挙げられる。また、Ｘで示されるハロゲン原子としては、塩素原子、臭素原子等が挙げられる。【0022】
化合物（２）と化合物（３）との反応に用いられる塩基としては炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム等が挙げられる。この反応に用いられる溶媒としては、メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒が挙げられる。反応は、室温で行うことができ、反応時間は１０〜２４時間でよい。【0023】
化合物（４）にヒドロキシルアミン又はその塩を反応させて、オキシム体（５）を得る。この反応は、ピリジン、トルエン等の溶媒中加熱還流下に行うのが好ましい。【0024】
オキシム体（５）に反応させるハロヒドリン類（６）としては、エピブロモヒドリン、エピクロルヒドリン等が用いられる。この反応は、トリエチルアミン、ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の第三級アミンの存在下、ジメチルホルムアミド等の非プロトン性極性溶媒下、室温で行うことができる。【0025】
かくして得られるインディルビン誘導体（１）は、後記実施例に示すように、強力な悪性腫瘍細胞増殖抑制作用を有し、また悪性腫瘍細胞に対してアポトーシス誘導能を示すことから、悪性腫瘍治療剤として有用である。【0026】
本発明の悪性腫瘍治療剤は、ヒトを含む哺乳類の、多岐にわたる悪性腫瘍に対して有効であり、例えば咽頭癌、喉頭癌、舌癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、大腸癌、子宮癌、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、悪性黒色腫、甲状腺癌などの上皮がん；骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫、繊維肉腫、白血病や悪性リンパ腫、骨髄腫などの非上皮がんが挙げられる。【0027】
本発明の悪性腫瘍治療剤は、当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、顆粒化、錠剤化、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化することができる。【0028】
経口投与用には、インディルビン誘導体（１）を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、錠剤、丸剤、糖衣剤、軟カプセル、硬カプセル、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、シロップ、スラリー等の剤形に製剤化することができる。【0029】
非経口投与用には、インディルビン誘導体（１）を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、坐剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、本発明の治療剤を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、組成物は、油性又は水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、又は乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、インディルビン誘導体（１）を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液又は懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、インディルビン誘導体（１）を粉末化し、ラクトース又はデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。坐剤処方は、インディルビン誘導体（１）をカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造するかことができる。さらに、本発明の治療剤は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。【0030】
インディルビン誘導体（１）の投与量は、患者の症状、投与経路、体重、年令等によっても異なるが、例えば成人１日あたり１ｍｇ〜５００ｍｇであるのが好ましい。【0031】
本発明の悪性腫瘍治療剤は、通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、特に限定されず、経口投与でもよい。【実施例】
【0032】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。【0033】
実施例１（１）インディルビンの製造
【0034】
【化3】
【0035】
酢酸インドキシル（１．７５ｇ，１０ｍｍｏｌ）及びイサチン（１．４７ｇ，１０ｍｍｏｌ）の脱水メタノール（２０ｍＬ）懸濁液にアルゴンガスを５分間吹き込んだ。反応液に炭酸ナトリウム（２．１２ｇ，２０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１８時間撹拌した後、反応液を水（１Ｌ）に注いだ。析出した粗結晶を吸引ろ取し、粗結晶を得た。この粗結晶を１，４−ジオキサン／ヘキサンから再結晶し、インディルビン（１．８１ｇ，６９％）を紫色針状晶として得た。【0036】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ６．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，７−Ｈ），７．０２（２Ｈ，ｍ，５−Ｈ ａｎｄ ５’−Ｈ），７．２６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７．３，１．２Ｈｚ，６−Ｈ），７．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，７’−Ｈ），７．５８（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝８．１，１．２Ｈｚ，６’−Ｈ），７．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．１，１．２Ｈｚ，４’−Ｈ），８．７７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．８，１．２Ｈｚ，４−Ｈ），１０．９０（１Ｈ，ｓ，１−Ｈ），１１．０２（１Ｈ，ｓ，１’−Ｈ）．ＬＲＭＳ（ＥＩ）：２６２（［Ｍ］＋）．ＨＲＭＳｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１６Ｈ１０Ｎ２Ｏ２：２６２．０７４２，ｆｏｕｎｄ：２６２．０７４０．
【0037】
（２）インディルビン−３’−オキシムの製造【0038】
【化4】
【0039】
インディルビン（０．６４ｇ，２．４ｍｍｏｌ）を脱水ピリジン（２５ｍＬ）に溶解し、塩化ヒドロキシルアンモニウム（１．６７ｇ，２４ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を２．５時間加熱還流した後、室温に戻した。反応液を水（１００ｍＬ）に注ぎ、析出した粗結晶を吸引ろ取した。得られた粗結晶をメタノール／水から再結晶し、インディルビン３’−オキシム（０．６０ｇ，８９％）を赤色針状晶として得た。【0040】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ６．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，７−Ｈ），６．９５（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７．８，０．９Ｈｚ，５−Ｈ），７．０３（１Ｈ，ｍ，５’−Ｈ），７．１３（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７．８，０．９Ｈｚ，６−Ｈ），７．４０（２Ｈ，ｍ，６’− ａｎｄ ７’−Ｈ），８．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，４’−Ｈ），８．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，４−Ｈ），１０．７１（１Ｈ，ｓ，１−Ｈ），１１．７５（１Ｈ，ｓ，１’−Ｈ），１３，４８（１Ｈ，ｓ，ＮＯＨ）．ＬＲＭＳ（ＥＩ）：２７７（［Ｍ］＋）．ＨＲＭＳ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１６Ｈ１１Ｎ３Ｏ２：２７７．０８５１，ｆｏｕｎｄ：２７７．０８４８．
【0041】
（３）インディルビン３’−（Ｏ−オキシラン−２−イルメチル）オキシム（ＨＳ−２）の製造【0042】
【化5】
【0043】
インディルビン３’−オキシム（１００ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．１ｍＬ）及びエピブロモヒドリン（０．５ｇ，３．６ｍｍｏｌ）を順次加えた。室温にて２４時間撹拌し、水（５０ｍＬ）に注ぎ、吸引ろ取することで標題化合物（ＨＳ−２）（９５ｍｇ，７９％）を得た。本品はＴＬＣ，ＮＭＲにおいて純品である。【0044】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ２．８４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．９，２．６Ｈｚ，ｏｎｅ ｏｆ ＣＨ（Ｏ）ＣＨ２），２．９８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，ｏｎｅ ｏｆ ＣＨ（Ｏ）ＣＨ２），３．５２（１Ｈ，ｍ，ＣＨ（Ｏ）ＣＨ２），４．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．４，６．１Ｈｚ，ｏｎｅ ｏｆ ＮＯＣＨ２ＣＨ），４．８２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．４，３．５Ｈｚ，ｏｎｅ ｏｆ ＮＯＣＨ２ＣＨ），６．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，７−Ｈ），７．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，７’−Ｈ），７．０３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，５−Ｈ），７．０９（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７．８，１．２Ｈｚ，５’−Ｈ），７．２０（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７．８，１．２Ｈｚ，６−Ｈ），７．３９（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７．８，１．２Ｈｚ，６’−Ｈ），７．７０（１Ｈ，ｓ，１−Ｈ），８．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，４’−Ｈ），８．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，４−Ｈ），１１．５６（１Ｈ，ｓ，１’−Ｈ）．ＬＲＭＳ（ＥＩ）：３３３（［Ｍ］＋）．ＨＲＭＳ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１９Ｈ１５Ｎ３Ｏ３：３３３．１１１３，ｆｏｕｎｄ：３３３．１１１３．
【0045】
実施例２（抗腫瘍活性（１））抗腫瘍活性は、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム ブロミド）法により測定した。
９６−ｗｅｌｌプレートにＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁した腫瘍細胞（１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を１００μＬ播き、２４時間培養（５％ＣＯ2，３７℃，飽湿条件下）した。その後、被験化合物（終濃度１×１０-5〜１×１０-8Ｍ）及びコントロールとしてＤＭＳＯを０．２μＬずつそれぞれ添加し、４８時間腫瘍細胞に作用させた。次に、０．５％ＭＴＴ液を１０μＬ加え、３時間後に反応停止液（０．０４Ｎ ＨＣｌ／イソプロパノール）を１００μＬ加え反応を停止させた。よくピペッティングをした後、マイクロプレートリーダーにより５７０ｎｍ（ｔｏｐ）及び６５５ｎｍ（ｂｏｔｔｏｍ）における 吸光度を測定した。各検体の各濃度における細胞生存率は、コントロール群に対する百分率により求め、そこからＥＣ50値を算出した。腫瘍細胞としては、ヒト神経芽腫細胞であるＩＭＲ−３２、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＬＡ−Ｎ−１、ＮＢ−３９ならびにヒト肝がん細胞ＨｅｐＧ−２を用いた。また、非腫瘍細胞であるヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ヒト膵帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いた。
【0046】
本発明化合物（ＨＳ−２）の抗腫瘍活性を図１及び表１に示す。図１及び表１より、本発明化合物は、強力な抗腫瘍活性を有し、その抗腫瘍活性はシスプラチン（ＣＤＤＰ）の５０〜１００倍強いことが判明した。【0047】
【表1】
【0048】
実施例３（抗腫瘍活性（２））（１）培養液
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ社）にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を終濃度１０％となるように加え、さらにＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ溶液（ＧＩＢＣＯ）を０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた。
（２）試薬
Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ液は和光純薬工業製を用いた。
（３）操作
ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２細胞をＤＭＥＭ培地に懸濁し（１．０×１０5個／ｍＬ）、９６ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅに１００μＬずつ分注した。３７℃、５％ＣＯ2飽湿条件下にて培養してｐｌａｔｅに付着させた。２４時間培養後培地を吸引除去し、被験化合物を含む培地（１％ＤＭＳＯ含有）１００μＬを添加し、３７℃、５％ＣＯ2飽湿条件下にて培養した。２４時間培養後培地を吸引除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）で洗浄した。培地で１０倍希釈したＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ試液（１００μＬ）を各ｗｅｌｌに添加して先と同様の条件下にて培養した。１時間後、励起波長５７７ｎｍ、検出波長６１２ｎｍの蛍光強度を測定した。なお細胞生存率はｖｅｈｉｃｌｅ（１％ＤＭＳＯ含有）添加ｗｅｌｌの値を１００％として算出した。
【0049】
（４）結果ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２に対する細胞傷害活性（ＩＣ50：５０％傷害濃度）は、ＨＳ−２が１．０μＭであり、シスプラチン（ＣＤＤＰ）が１０μＭであった。
【0050】
実施例４（アポトーシス誘導能：Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色法）アポトーシス誘導能は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色法で核染色することにより試験した。
６−ＷｅｌｌプレートにＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁した細胞（ＩＭＲ−３２：１×１０5ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌ）を２ｍＬ播き、２４時間培養（５％ＣＯ2，３７℃、飽湿条件下）した。その後、被験化合物（終濃度１×１０-5Ｍ〜１×１０-7Ｍ）及びコントロールとしてＤＭＳＯを４μＬずつそれぞれに添加し、２４時間細胞に作用させた。次に、０．０２％Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２溶液を１００μＬ加え、１５分後に蛍光顕微鏡にて位相差像及び蛍光像を撮影し、細胞の形態変化を観察した。その結果、図２に示すように、本発明化合物（ＨＳ−２）は、０．１μＭで、核の凝集化及び断片化が認められることから、ＩＭＲ−３２細胞に対する細胞傷害活性はアポトーシス誘導によるものであることが判明した。
【0051】
実施例５（アポトーシス誘導能：フローサイトメトリー法）本発明化合物（ＨＳ−２）について、ヒト神経芽腫細胞であるＩＭＲ−３２細胞に対するアポトーシス誘導能をフローサイトメトリーにより検出した。すなわち、６−ＷｅｌｌプレートにＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁した細胞（ＩＭＲ−３２：１×１０6ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌ）を２ｍＬ播き、２４時間培養（５％ＣＯ2，３７℃、飽湿条件下）した。その後、化合物（ＨＳ−２）を終濃度１×１０-5Ｍ〜１×１０-7Ｍとなるように加え、３７℃、５％ＣＯ2条件下で２４時間インキュベーションした。細胞をトリプシンで剥離してＰＢＳで洗浄した後、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を加え、フローサイトメトリーを行った。この方法によれば、アポトーシスの初期段階の細胞はアネキシンＶ−ＦＩＴＣの蛍光のみが観察され、アポトーシスの後期段階の細胞はアネキシンＶとＰＩの両方の蛍光が観察される。
その結果、化合物（ＨＳ−２）は濃度依存的なアポトーシス誘導能が認められ、１０μＭで顕著なアポトーシス誘導効果が示された。この結果を図３に示す。
【0052】
その結果、本発明化合物は、１０-7Ｍという低い濃度から強力な抗腫瘍活性を有していた。正常細胞と比較して腫瘍細胞に活性の選択性が認められ(正常細胞におけるＩＣ50値は、ＨＵＶＥＣ：１．７５μＭ ＮＨＤＦ：６１．４μＭ）、この機構にはアポトーシスが関与することが示された。