特許 6019536 高効率触媒、その調製および使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6019536

(24)【登録日】2016年10月14日

(45)【発行日】2016年11月2日

(54)【発明の名称】高効率触媒、その調製および使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/06 20060101AFI20161020BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20161020BHJP

   C12N 9/08 20060101ALI20161020BHJP

   G01N 33/58 20060101ALI20161020BHJP

   C07D 487/22 20060101ALI20161020BHJP

【ＦＩ】

   C07K7/06ZNA

   C07K7/08

   C12N9/08

   G01N33/58 Z

   C07D487/22

【請求項の数】7

【全頁数】38

(21)【出願番号】特願2013-537148(P2013-537148)

(86)(22)【出願日】2011年11月4日

(65)【公表番号】特表2013-542949(P2013-542949A)

(43)【公表日】2013年11月28日

(86)【国際出願番号】EP2011069425

(87)【国際公開番号】WO2012059584

(87)【国際公開日】20120510

【審査請求日】2014年10月27日

(31)【優先権主張番号】MI2010A002059

(32)【優先日】2010年11月5日

(33)【優先権主張国】IT

(73)【特許権者】

【識別番号】513110942

【氏名又は名称】インキディア エス．アール．エル．

(74)【代理人】

【識別番号】100091683

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄

(72)【発明者】

【氏名】パヴォーネ、ヴィンチェンツォ

(72)【発明者】

【氏名】ナストリ、フラヴィア

(72)【発明者】

【氏名】マリオ、オルネッラ

(72)【発明者】

【氏名】ロンバルディ、アンジェリーナ

【審査官】 田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０６−１７２３８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Chem. Eur. J.，２００３年，Vol.9，p.5643-5654

【文献】 Chem.Eur.J.，２０１１年 ４月，Vol.17，p.4444-4453

【文献】 Langmuir，２０１０年１１月１１日，Vol.26,No.23，p.17831-17835

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の一般式（Ｉ）：

【化1】

（Ｉ）
式中：
大環状部の窒素原子は、金属イオンＭｅと錯形成し、ＭｅはＦｅ、Ｍｎ、およびＲｕからなる群より選択されるもので、任意の可能な酸化状態にあり；
Ｒ１は、一般式（ＩＩ）の基であり：

【化2】

式中
ｎ＝２であり；
Ａは、Ａｃｅ−Ａｓｐ、Ａｃｅ−Ａｓｎ、およびＡｃｅ−Ｐｒｏからなる群より選択され；
Ｘ１は、Ｇｌｕ、Ａａｄａ、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、およびＬｅｕからなる群より選択され；
Ｙ２は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｙ３は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｙ４は、Ｌｅｕであり；
Ｘ５は、Ｈｉｓ、４Ｔａｚ、および５Ｔａｚからなる群より選択され；
Ｘ６は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびａＴｈｒからなる群より選択され；
Ｙ７は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｘ８は、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、Ｄａｐ、およびＤａｂからなる群より選択され；
Ｘ９は、Ｇｌｕ、Ａａｄａ、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、およびＬｅｕからなる群より選択され；
Ｙ１０は、ＬｙｓまたはＯｒｎであり；
Ｂは、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＮＨ２であり；
Ｌは、ＣＯであり；
Ｒ２およびＲ７は、ＣＨ３であり；
Ｒ８は、一般式（ＩＩＩ）を有し、

【化3】

式中：
ｍ＝２であり；
Ｃは、Ａｃｅ−Ａｓｐ、Ａｃｅ−Ａｓｎ、またはＡｃｅ−Ｐｒｏであり；
Ｚ１は、Ｇｌｕ、Ａａｄａ、Ａｒｇ、およびｈＡｒｇからなる群より選択され；
Ｗ２は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｗ３は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｗ４は、Ｌｅｕであり；
Ｚ５は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、およびＡｉｂからなる群より選択され；
Ｚ６は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、およびＳｅｒからなる群より選択され；
Ｗ７は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｚ８は、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、Ｄａｐ、およびＤａｂからなる群より選択され；
Ｚ９は、Ｇｌｕ、Ａａｄａ、Ａｒｇ、およびｈＡｒｇからなる群より選択され；
Ｄは、ＮＨ２であり；
Ｐは、ＣＯであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、互いに独立して、Ｈまたはメチルである、
である化合物。

【請求項2】

請求項１に記載の化合物であって、式中：
大環状部の窒素原子は、金属イオンＭｅと錯形成し、ＭｅはＦｅ、Ｍｎ、およびＲｕからなる群より選択されるもので、任意の可能な酸化状態にあり；
Ｒ１は、一般式（ＩＩ）の基であり：
式中
ｎ＝２であり；
Ａは、Ａｃｅ−Ａｓｐであり；
Ｘ１は、Ｇｌｕ、またはＡｒｇ、またはＬｅｕであり；
Ｙ２は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｙ３は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｙ４は、Ｌｅｕであり；
Ｘ５は、Ｈｉｓであり；
Ｘ６は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびＴｈｒからなる群より選択され；
Ｙ７は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｘ８は、Ｌｙｓであり；
Ｘ９は、Ｇｌｕ、またはＡｒｇ、またはＬｅｕであり；
Ｙ１０は、ＬｙｓまたはＯｒｎであり；
Ｂは、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＮＨ２であり；
Ｌは、ＣＯであり；
Ｒ２およびＲ７は、ＣＨ３であり；
Ｒ８は、一般式（ＩＩＩ）を有し、式中：
ｍ＝２であり；
Ｃは、Ａｃｅ−Ａｓｐであり；
Ｚ１は、ＧｌｕまたはＡｒｇであり；
Ｗ２は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｗ３は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｗ４は、Ｌｅｕであり；
Ｚ５は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、およびＡｉｂからなる群より選択され；
Ｚ６は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、およびＳｅｒからなる群より選択され；
Ｗ７は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｚ８は、Ｌｙｓであり；
Ｚ９は、ＧｌｕまたはＡｒｇであり；
Ｄは、ＮＨ２であり；
Ｐは、ＣＯであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、互いに独立して、Ｈまたはメチルである、
である化合物。

【請求項3】

タンパク質、ペプチド、抗原、抗体もしくはその断片、受容体リガンド、ビオチン、ストレプトアビジン、酵素、酵素阻害剤、オリゴヌクレオチド、またはＰＮＡと共有結合している、請求項１から２のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項4】

固相マトリクス、ナノ粒子、または電極に担持されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項5】

エポキシ化反応、酸化反応、ヒドロキシル化反応、ニトロ化反応、または過酸化反応の触媒としての、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物の使用。

【請求項6】

免疫診断キット、免疫組織化学検査、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成キット、ＥＬＩＳＡ、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ウエスタンブロット法、細胞蛍光測定法、または電気化学的デバイスにおける、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物の使用。

【請求項7】

以下：
汚染物質の分解；
医薬の代謝経路の特定；
を目的とする、
および
（ｉ）水中の汚染物質、（ｉｉ）食品中の保存添加物、または（ｉｉｉ）体内の薬物または毒性物質の存在を特定するための化学的プローブとして使用すること
を目的とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ポルフィリン様含窒素大環状分子でありペプチド官能基を有する合成化合物、ならびにそれらの調製および精密化学におけるそれらの使用に関する。本化合物は、例えば、触媒として、水溶液中または水−アルコール溶媒中での過酸化、酸化、水酸化、フェノールニトロ化、および不活性化合物エポキシ化などの反応に用いたり、水質管理および除染に用いたり、検査診断に用いたりすることができる。本化合物はまた、例えば、免疫組織化学検査、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成、ＥＬＩＳＡ測定、ならびにサザンブロット、ノーザンブロット、およびウエスタンブロット検査にも用いることができる。本発明による化合物は、そのままでも使用できるし、生体分子（抗体、抗原、酵素、受容体、核酸、ペプチド、およびタンパク質など）と共有会合した状態でも使用できる。本発明による化合物は、天然型および変異型血液タンパク質の低分子量（２０００〜５０００ａｍｕ）類似体であり、従って大変有利なことに発現または抽出産物の代替物となることが見込まれるので、幅広い用途を有する。本発明による化合物はまた、固相マトリクスおよび／または常磁性および非常磁性ナノ粒子に支持された状態で用いることができる。

【背景技術】

【0002】

文献には、様々な組成を有し、様々な金属イオンをその中に取り込んだ窒素大環状分子が、非常に数多く見られる。応用性の観点から特に有望なものは、メソ−テトラアリール置換ポルフィリン類である。（”Metallo-porphyrins in catalytic oxidations” (1994) Sheldon R. A. ed. Dekker, NY; D. Mansuy, C. R. Chimie, 2007, 10, pp 392; Meunier, B. Chem. Rev. 1992, 92, pp. 1411）。応用の可能性があるにも関わらず、報告されている窒素大環状分子のほとんどは、いろいろな理由から工業的にまったく利用されてこなかった。理由としては、以下が挙げられる：１）水および生体液に対する溶解性の低さ；２）触媒反応課程における回転率および／または選択性の低さ；３）活性化するために強力な酸化試薬を使う必要があること。

【0003】

触媒特性を改善するために、β−ピロール位およびメソ位で置換された他のポリフィリンが、その後開発された（例えば、Bruice T. C. et al. PNAS, 1986, pp4646を参照）。しかしながら、これらの化合物も水溶性による制限が厳しく、実際には、水相／有機相界面での使用しかできない。

【0004】

メソ位を親水性基（アニオン型、カチオン型のいずれでも）で置換したポルフィリンは、水溶性であるが、工業用途での精密化学で有用となり得るほどの触媒効率は依然として有していない（Lindsay Smith, J. R. et al. J. Chem. Soc. Chem. Comm 1985, pp410; Bernadou, J. et al. Tetrahedron letters, 1988, pp6615）。

【0005】

最近になって、新規のペプチド−ポルフィリン結合体が報告された。これらの結合体は、ポルフィリンに結合したペプチド数に基づいて、モノ付加体とジ付加体に分類することができる。例えば、ミクロペルオキシダーゼは、シトクロムｃのタンパク分解で得られるモノ付加ポルフィリンである。これらの化合物はまた、ペプチド要素のシステインとプロトポルフィリンＩＸのビニル基との間の２本のチオエーテル結合も特徴とする。タンパク分解に用いた酵素によって異なるミクロペルオキシダーゼが得られるが、その違いは、ペプチド鎖のアミノ酸の個数が違うことによって特徴づけられる（Aron, J.; Baldwin, D. A.; Marques, H. M.; Pratt, J. M.; Adams, P. A. J. Inorg. Biochem. 1986, 27, 227）。これらの化合物は、通称ミクロペルオキシダーゼＭＰ８、ＭＰ９、ＭＰ１０、およびＭＰ１１という（Munro, O. Q.; Marques, H. M. Inorg. Chem. 1996, 35, 3752; Adams, P. A. In: Peroxidases in Chemistry and Biology, 1993, Vol. II, Everse, J., Everse, K. E. & Grisham, M. B., eds, pp. 171-200. CRC Press, Boston, MA, USA; Marques, H. M. Dalton Trans. 2007, 4371）。

【0006】

今日最もよく特徴がわかっているミクロペルオキシダーゼのペプチド配列を以下に示す：
ＭＰ８：Ｈ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−ＯＨ（J. Aron, D. A. Baldwin, H. M. Marques, J. M. Pratt, P. A. Adams, J. Inorg. Biochem. 1986, 27, 227; D. A. Baldwin, H. M. Marques, J. M. Pratt, J. Inorg. Biochem. 1986, 27, 245; M. S. A. Hamza, J. M. Pratt, J. Chem. Soc, Dalton Trans. 1994, 1367）；
ＭＰ９：Ｈ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−ＯＨ（Baldwin, D. A.; Mabuya, M. B.; Marques, H. M. S. Afr. J. Chem. 1987, 40, 103）；ＭＰ１１：Ｈ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−ＯＨ（Carraway, A. D.; McCollum, M. G.; Peterson, J. Inorg. Chem. 1996, 35, 6885）；ＭＰ'１１：Ｈ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−ＯＨ（C. Dallacosta, E. Monzani, L. Casella, ChemBioChem. 5, 2004, 1692）；Ａｃ−ＭＰ８：Ａｃ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−ＯＨ（Munro, O. Q.; Marques, H. M. Inorg. Chem. 1996, 35, 3752; Munro, O. Q.; Marques, H. M. Inorg. Chem. 1996, 35, 3768; Carraway, A. D.; McCollum, M. G.; Peterson, J. Inorg. Chem. 1996, 35, 6885）；ビス−Ａｃ−ＭＰ１１：Ａｃ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ（Ａｃ）−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−ＯＨ（Carraway, A. D.; McCollum, M. G.; Peterson, J. Inorg. Chem. 1996, 35, 6885）；Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＭＰ８：Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−ＯＨ（Casella, L.; De Gioia, L.; Frontoso Silvestri, G.; Monzani, E.; Redaelli, C; Roncone, R.; Santagostini, L. J. Inorg. Biochem. 2000, 79, 31）；Ｐｒｏ−ＭＰ８：Ｈ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−ＯＨ（Casella, L.; De Gioia, L.; Frontoso Silvestri, G.; Monzani, E.; Redaelli, C; Roncone, R.; Santagostini, L. J. Inorg. Biochem. 2000, 79, 31）；Ｐｒｏ_２−ＭＰ８：Ｈ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−ＯＨ（Casella, L.; De Gioia, L.; Frontoso Silvestri, G.; Monzani, E.; Redaelli, C; Roncone, R.; Santagostini, L. J. Inorg. Biochem. 2000, 79, 31）；ＭＰ９−２２−（ＦｍｏｃＡｌａＰｒｏ）：Ｈ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ）−ＯＨ（Casella, L.; De Gioia, L.; Frontoso Silvestri, G.; Monzani, E.; Redaelli, C; Roncone, R.; Santagostini, L. J. Inorg. Biochem. 2000, 79, 31）。

【0007】

ミクロペルオキシダーゼは、本発明が権利請求するペプチドとは構造が大きく異なっており、鉄の五配位構造を取るものの、その配列中にヒスチジン残基が１つしか含まれていないので、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の触媒活性と比較して非常にささやかな触媒活性しか示さない。ＭＰ８、ＭＰ１１、およびＨＲＰ酵素について、Ｈ_２Ｏ_２を用いたＡＢＴＳ酸化における速度パラメーターをいくつか例として示す。

【0008】

【表1】

【0009】

そのうえ、Ｈ_２Ｏ_２による有機物質の触媒的酸化中に触媒の迅速な分解が観測される。ミクロペルオキシダーゼの使用を制限する別の要因は、その水溶性の低さである。Ｎ−アセチル化ミクロペルオキシダーゼは、水溶性が上がり、酸化剤としてＨ_２Ｏ_２を用いた有機物質の酸化における触媒活性が向上しているが、それでも依然として分解されやすくささやかな触媒活性しか有さない。このため、ミクロペルオキシダーゼはいまだに工業的に利用されていない。

【0010】

ペプチド−ポルフィリンモノ付加結合体の他の例は、Casella L. et al.による報告（J. Chem. Soc. Dalton Trans. 1993, 2233）があり、最近ではNicolis S. et al.による総説（Comptes Rendus Chimie 10, 2007, 380-391）で再考されている。これらの分子も、本発明が権利請求する分子とは構造が大きく異なり、ミクロペルオキシダーゼと同じような制限（触媒活性の低さなど）を多数有しているため、いまだに工業的に利用されていない。

【0011】

新規のペプチド−ポルフィリンジ付加結合体は、Bensonにより報告されている（Benson, D. R.; Hart, B. R.; Zhu, X.; Doughty, M. B. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 8502; Arnold, P. A.; Benson, D. R.; Brink, D. J.; Hendrich, M. P.; Jas, G. S.; Kennedy, M. L.; Petasis, D. T.; Wang, M. Inorg. Chem. 1997, 36, 5306; Wang, M; Kennedy, M. L.; Hart, B. R.; Benson, D. R. Chem. Commun. 1997, 883; Williamson, D. A.; Benson, D. R. Chem. Commun. 1998, 961; Liu, D.; Williamson, D. A.; Kennedy, M. L.; Williams, T. D.; Morton, M. M.; Benson, D. R. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 11798; Liu, D.; Lee, K. -H.; Benson, D. R. Chem. Commun. 1999, 1205; Kennedy, M. L.; Silchenko, S.; Houndonougbo, N.; Gibney, B. R.; Dutton, P. L.; Rodgers, K. R.; Benson, D. R. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 4635）。これらの化合物は、メソヘムのプロピオニル基に結合した２本の等価なペプチドを特徴とし、ＰＳＭ（ペプチドサンドイッチ化メソヘム）と称される：ＰＳＭ１、Ａｃ−ＡＫＥＡＡＨＡＥＡＡＥＡＡ−ＮＨ２；ＰＳＭ２、Ａｃ−ＡＡＥＡＡＥＡＨＡＡＥＫＡ−ＮＨ２；ＰＳＭ３、Ａｃ−ＡＫＥＡＨＡＡＥＡＡＥＡＡ−ＮＨ２；ＰＳＭ４、Ａｃ−ＡＡＥＡＡＥＡＡＨＡＥＫＡ−ＮＨ２；ＰＳＭ５、Ａｃ−ＡＡＨＡＥＡＡＥＡＫＥＡＡ−ＮＨ２；ＰＳＭ６、Ａｃ−ＡＡＥＡＡＥＡＨＡＡＥＫＡ−ＮＨ２；ＰＳＭ７、Ａｃ−ＡＡＥＦＡＥＡＨＡＡＥＫＡ−ＮＨ２；ＰＳＭ８、Ａｃ−ＡＡＥＷＡＥＡＨＡＡＥＫＡ−ＮＨ２。

【0012】

ヒスチジンを含有する等価なペプチドがこれらの分子に存在することが、鉄の六配位構造と関係している。結果として、これらの分子は有機物質と結合する遠位を持たないので、Ｈ_２Ｏ_２による有機物質の酸化が関係する反応において非常に低い触媒活性しか示さない。このＰＳＭシリーズの化合物は１つとしていまだに工業的に利用されていない。

【0013】

他のジ付加化合物としてミモクロムと称されるものがあるが、これらは以下に記載および再考されている：Nastri F. et al. Chem. Eur. J. 1997, 3, pp340; D'Auria G. et al. Chem. Eur. J. 1997, 3, pp350; Nastri F. et al. J. Biol. Inorg Chem. 1998, 3, pp671; Nastri F. et al. Biopolymers (Peptide Science)1998, pp5; Lombardi A. et al. Chem Rev. 2001, pp316; Lombardi A. et al. Inorg. Chim. Acta 1998, 275-276, pp301; Lombardi A. et al. Chem. Eur. J. 2003, 9, pp5643; Di Costanzo L. et al. J. Biol. Inorg. Chem. 2004, 9, pp1017; およびLombardi A. et al. Chem. Rev. 2001, 101, 3165-3189。

【0014】

ミモクロムＩ、ＩＩ、およびＩＶ（Nastri F. et al. Chem. Eur. J. 1997, 3, pp340; D'Auria G. et al. Chem. Eur. J. 1997, 3, pp350; Lombardi A. et al. Inorg. Chim. Acta 1998, 275-276, pp301; Lombardi A. et al. Chem. Eur. J. 2003, 9, pp5643; Di Costanzo L. et al. J. Biol. Inorg. Chem. 2004, 9, pp1017）も、ビス−ヒスチジン鉄配位構造を特徴とし、その結果Ｂｅｎｓｏｎが報告したＰＳＭと同様な制限を示す。一方、ミモクロムＩＩＩ、Ｖ、およびＶＩ（Lombardi A. et al. Chem. Rev. 2001, 101, 3165-3189）は、五配位構造を示すが、しかしながら、２本のペプチド鎖（これらは長さが等しいものである）の特定のアミノ酸組成のため、これらの類縁体は、天然型ペルオキシダーゼの触媒活性以上の触媒活性を示すことはない。ミモクロムおよびＨＲＰ酵素について、Ｈ_２Ｏ_２を用いたＡＢＴＳ酸化における速度パラメーターをいくつか例として示す。

【0015】

【表2】

【0016】

このため、ミモクロムはいまだに工業的に利用されていない。

【0017】

さらに他の複雑な系はヘモアブザイム（Ricoux R., Raffy Q., Mahy J. P. C. R. Chimie 2007, 10, 684-702）である。これらは、分子量が非常に大きいという欠点を有し、本質的に変性および分解を受けるものである。ヘモアブザイムおよびＨＲＰ酵素について、Ｈ_２Ｏ_２を用いたＡＢＴＳ酸化における速度パラメーターをいくつか例として示す。

【0018】

【表3】

【0019】

他にもペプチド−ポルフィリン錯体系が、Sasaki T. and Kaiser E. T., JACS 1989, pp380; Akerfeldt K. S. et al. JACS, 1992, pp9656; Arnold, P. A. et al. JACS 1997, pp3181; Sakamoto S. et al. Chem Commun. 1997, pp1221; Kennedy, M. L. et al. JACS 2001, 123, pp4635に報告されており、最近ではReedy, C. J. and Gibney, B. R.（Chem. Rev. 2004, 104, pp. 617）に再考されている。これらの化合物は全て、六配位構造のヘム中心を有し、したがって、何かに応用できそうな触媒活性をまったく有していない。詳細には、ヘリクロム系（Sasaki T. and Kaiser E. T., JACS 1989, pp380）、テトラフィリン系（Akerfeldt K. S. et al. JACS, 1992, pp9656）、およびペプチド−メソヘム結合体（Arnold, P. A. et al. JACS 1997, pp3181; Sakamoto S. et al. Chem Commun. 1997, pp1221）は、らせん構造を誘導する目的でポルフィリン環を共有結合でペプチド配列に導入してある合成ペプチド−ポルフィリン結合体の例である。Choma C. T. et al. （JACS 1994, pp856）およびRobertson D. E. et al. （Nature 1994, pp425）により開発された系が、六配位型合成ヘムタンパク質の最初の例であるが、この系は「４ヘリックスバンドル」構造モチーフを取り入れたペプチド配列からなり、共有結合ではない方式で１つ以上のヘム基を系の内部に結合させることができる。

【0020】

またしても、上記の化合物のなかで、天然型ペルオキシダーゼの性質に匹敵するかこれより優れた性質を示すものは１つもない。

【0021】

したがって、今日までに提案されている構造による解決策は、以下の要求を同時に満足させるには不適切であることが明らかとなった：１）高い触媒効率；２）高い触媒回転率；３）水または水−アルコール溶媒系に対する適切な溶解性；４）触媒サイクル中の分解に対する耐性；５）低分子量かつ高比活性。西洋ワサビペルオキシダーゼは、ｐＨ＝４．６で自身が有する最大活性と比較すると、中性ｐＨでは触媒活性が落ちる。

【0022】

その他、天然型または変異型酵素（ペルオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０、オキダーゼ、およびモノオキシゲナーゼなど）は、Ｈ_２Ｏ_２活性化を必要とする反応において要求される高い触媒活性を満足するものの、非常に高価であり、変性しやすく、したがって保存期間が限られたものになると思われ、それでいて第一にかなり巨大な分子サイズ（３０，０００〜２００，０００Ｄａ）を有することが挙げられるので、これらの産業利用は限られると思われる。例えば、ＨＲＰで機能化した常磁性ナノ粒子が、文献に報告されている（Xiaoyan Y. et al., Anal. Biochem. 2009, 393, pp56）。しかしながら、コーティングの度合いは相対的に低く、このことがナノ粒子に係留された触媒部位の個数の制限に関与しており、結果として触媒増幅も低い。

【0023】

多くの標準検査診断法（免疫組織化学検査、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法、ＥＬＩＳＡ法、およびブロッティング法など）は、所望の生成物を検出する方法を利用するが、この方法は、検出しようとする分析物を含む検査試料を、その分析物と特異的に相互作用する能力がある認識分子とともにインキュベーションすることを含む。次いで、認識現象を信号（蛍光、比色、蛍光定量、電気化学、または放射性信号など）の発生により定量化する。多くの場合、分析物が低濃度で存在するときには、検査に１つ以上の増幅層を導入して信号を増幅する必要がでてくる。例えば、認識要素が一次抗体ならば、色素原の変換を触媒する酵素で機能化した二次抗体を加えることができる。その結果、各認識要素について、高純度の色素原がある一定の時間で産生される。

【0024】

ＥＬＩＳＡ検査では、西洋ワサビペルオキシダーゼ分子を３個まで導入して機能化した抗体が一般に用いられる。このように置換度が比較的低く決まってしまうのは、主にペルオキシダーゼの分子サイズ（約４５０００Ｄａ）によるものであり、したがって、置換度をもっと上げることが望ましいにも関わらず、そのような抗体を得ることができない。発色がＥＬＩＳＡ検査板に結合させた抗体数だけでなく分子認識を増幅する酵素の分子数にも依存するという事実から見ると、この態様は特に関連性が高い。そのうえ、小分子（ペプチド、抗原、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、受容体アゴニストまたはアンタゴニスト、および酵素阻害剤）は、超巨大分子（天然型または変異型酵素など）に結合させると、標的分子を認識する能力を失ってしまう。

【0025】

したがって、今日、免疫組織化学検査、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法、ＥＬＩＳＡ検査、ならびにサザンブロット、ノーザンブロット、およびウエスタンブロット検査に提案されている天然型または変異型酵素は、以下の要求を同時に満足させるのに適切であるとは言い切れないことが明らかとなった：
１）非常に高い感度；２）高い安定性；３）使用の汎用性および簡便さ。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0026】

【非特許文献1】”Metallo-porphyrins in catalytic oxidations” (1994) Sheldon R. A. ed. Dekker, NY

【非特許文献2】D. Mansuy, C. R. Chimie, 2007, 10, pp 392

【非特許文献3】Meunier, B. Chem. Rev. 1992, 92, pp. 1411

【非特許文献4】Bruice T. C. et al. PNAS, 1986, pp4646

【非特許文献5】Lindsay Smith, J. R. et al. J. Chem. Soc. Chem. Comm 1985, pp410

【非特許文献6】Bernadou, J. et al. Tetrahedron letters, 1988, pp6615

【非特許文献7】Aron, J.; Baldwin, D. A.; Marques, H. M.; Pratt, J. M.; Adams, P. A. J. Inorg. Biochem. 1986, 27, 227

【非特許文献8】Munro, O. Q.; Marques, H. M. Inorg. Chem. 1996, 35, 3752

【非特許文献9】Adams, P. A. In: Peroxidases in Chemistry and Biology, 1993, Vol. II, Everse, J., Everse, K. E. & Grisham, M. B., eds, pp. 171-200. CRC Press, Boston, MA, USA

【非特許文献10】Marques, H. M. Dalton Trans. 2007, 4371

【非特許文献11】D. A. Baldwin, H. M. Marques, J. M. Pratt, J. Inorg. Biochem. 1986, 27, 245

【非特許文献12】M. S. A. Hamza, J. M. Pratt, J. Chem. Soc, Dalton Trans. 1994, 1367

【非特許文献13】Baldwin, D. A.; Mabuya, M. B.; Marques, H. M. S. Afr. J. Chem. 1987, 40, 103

【非特許文献14】Carraway, A. D.; McCollum, M. G.; Peterson, J. Inorg. Chem. 1996, 35, 6885

【非特許文献15】C. Dallacosta, E. Monzani, L. Casella, ChemBioChem. 5, 2004, 1692

【非特許文献16】Munro, O. Q.; Marques, H. M. Inorg. Chem. 1996, 35, 3768

【非特許文献17】Casella, L.; De Gioia, L.; Frontoso Silvestri, G.; Monzani, E.; Redaelli, C; Roncone, R.; Santagostini, L. J. Inorg. Biochem. 2000, 79, 31

【非特許文献18】Casella L. et al., J. Chem. Soc. Dalton Trans. 1993, 2233

【非特許文献19】Nicolis S. et al., Comptes Rendus Chimie 10, 2007, 380-391

【非特許文献20】Benson, D. R.; Hart, B. R.; Zhu, X.; Doughty, M. B. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 8502

【非特許文献21】Arnold, P. A.; Benson, D. R.; Brink, D. J.; Hendrich, M. P.; Jas, G. S.; Kennedy, M. L.; Petasis, D. T.; Wang, M. Inorg. Chem. 1997, 36, 5306

【非特許文献22】Wang, M; Kennedy, M. L.; Hart, B. R.; Benson, D. R. Chem. Commun. 1997, 883

【非特許文献23】Williamson, D. A.; Benson, D. R. Chem. Commun. 1998, 961

【非特許文献24】Liu, D.; Williamson, D. A.; Kennedy, M. L.; Williams, T. D.; Morton, M. M.; Benson, D. R. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 11798

【非特許文献25】Liu, D.; Lee, K. -H.; Benson, D. R. Chem. Commun. 1999, 1205

【非特許文献26】Kennedy, M. L.; Silchenko, S.; Houndonougbo, N.; Gibney, B. R.; Dutton, P. L.; Rodgers, K. R.; Benson, D. R. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 4635

【非特許文献27】Nastri F. et al. Chem. Eur. J. 1997, 3, pp340

【非特許文献28】D'Auria G. et al. Chem. Eur. J. 1997, 3, pp350

【非特許文献29】Nastri F. et al. J. Biol. Inorg Chem. 1998, 3, pp671

【非特許文献30】Nastri F. et al. Biopolymers (Peptide Science)1998, pp5

【非特許文献31】Lombardi A. et al. Chem Rev. 2001, pp316

【非特許文献32】Lombardi A. et al. Inorg. Chim. Acta 1998, 275-276, pp301

【非特許文献33】Lombardi A. et al. Chem. Eur. J. 2003, 9, pp5643

【非特許文献34】Di Costanzo L. et al. J. Biol. Inorg. Chem. 2004, 9, pp1017

【非特許文献35】Lombardi A. et al. Chem. Rev. 2001, 101, 3165-3189

【非特許文献36】Ricoux R., Raffy Q., Mahy J. P. C. R. Chimie 2007, 10, 684-702

【非特許文献37】Sasaki T. and Kaiser E. T., JACS 1989, pp380

【非特許文献38】Akerfeldt K. S. et al. JACS, 1992, pp9656

【非特許文献39】Arnold, P. A. et al. JACS 1997, pp3181

【非特許文献40】Sakamoto S. et al. Chem Commun. 1997, pp1221

【非特許文献41】Kennedy, M. L. et al. JACS 2001, 123, pp4635

【非特許文献42】Reedy, C. J. and Gibney, B. R., Chem. Rev. 2004, 104, pp. 617

【非特許文献43】Choma C. T. et al., JACS 1994, pp856

【非特許文献44】Robertson D. E. et al., Nature 1994, pp425

【非特許文献45】Xiaoyan Y. et al., Anal. Biochem. 2009, 393, pp56

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0027】

本発明は、新規クラスの低分子量（２０００〜５０００Ｄａ）ペプチド−ポルフィリン結合体に関する。この結合体は、これまでに一度も記載されたことのない特定のアミノ酸組成により、高い触媒効率という生体模倣した性質を保証する。本発明による化合物は、単独で用いることも、所望の巨大分子（モノクローナルおよびポリクローナル抗体、抗体断片、抗原、受容体、受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、ビオチン、酵素、酵素阻害剤、核酸、ＰＮＡ、ペプチド、ならびにタンパク質など）と共有会合させて用いることもできる。本発明による化合物は、固相マトリクスおよび／または常磁性および非常磁性ナノ粒子に支持させて用いることもできる。

【0028】

本発明による化合物は、以下の一般式（Ｉ）を有する：

【0029】

【化1】

【0030】

（Ｉ）

【0031】

式中：
大環状部の窒素原子は、金属イオンＭｅと錯形成し、ＭｅはＦｅ、Ｍｎ、およびＲｕからなる群より選択されるもので、任意の可能な酸化状態にあり；
Ｒ１は、一般式（ＩＩ）の基であり：

【0032】

【化2】

【0033】

式中：
ｎ＝１、または２、または３であり；
Ａは、Ｓｕｃ、またはＡｃｅ、またはＡｃｅ−Ａｓｐ、またはＡｃｅ−Ａｓｎ、またはＡｃｅ−Ｐｒｏ、またはＡｃｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、またはＡｃｅ−Ｏｒｎ−Ｐｒｏであり；
Ｘ１は、Ｇｌｕ、Ａａｄａ、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、およびＯｒｎからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｙ２は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、およびＯｒｎからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｙ３は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、およびＯｒｎからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｙ４は、Ｌｅｕであり；
Ｘ５は、Ｈｉｓ、ｈＣｙｓ、Ｍｅｔ、４Ｔａｚ、および５Ｔａｚからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ａＴｈｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、およびＯｒｎからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｙ７は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、およびＯｒｎからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｇｌｕ、Ａａｄａ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、Ｄａｐ、およびＤａｂからなる群より選択される、アミド結合を形成するのに適した官能基を側鎖に有するアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｇｌｕ、Ａａｄａ、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、およびＯｒｎからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｙ１０は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、およびＯｒｎからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｂは、ＮＨ２、またはＩｌｅ−ＮＨ２、またはＩｌｅ−Ｔｈｒ−ＮＨ２、またはＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＮＨ２、またはＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＮＨ２、またはＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｏｒｎ−ＮＨ２であり；
Ｌは、Ｘ８の側鎖上の官能基がアミンの場合はＣＯ、Ｘ８の側鎖上の官能基がカルボキシルの場合はＮＨであり；
Ｒ２およびＲ７は、同一であるか異なっていて、ＨまたはＣＨ３であり；
置換基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ８のうちの１つは、式Ｑ−（ＣＨ_２）ｓ−を有し、式中、ｓ＝１、または２、または３であり、Ｑは、ＮＨ_２ＣＯ、またはＣＨ_３ＣＯＮＨ、またはＨＯＯＣ、またはＣＨ_３ＯＯＣであるか、あるいは置換基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ８のうちの１つは、一般式（ＩＩＩ）の基であり：

【0034】

【化3】

【0035】

式中：
ｍ＝１、または２、または３であり；
Ｃは、Ｓｕｃ、またはＡｃｅ、またはＡｃｅ−Ａｓｐ、またはＡｃｅ−Ａｓｎ、またはＡｃｅ−Ｐｒｏ、またはＡｃｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、またはＡｃｅ−Ｏｒｎ−Ｐｒｏであり；
Ｚ１は、Ｇｌｕ、Ａａｄａ、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、およびＯｒｎからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｗ２は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、およびＯｒｎからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｗ３は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、およびＯｒｎからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｗ４は、Ｌｅｕであり；
Ｚ５は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、およびＡｉｂからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｚ６は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびａＴｈｒからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｗ７は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、およびＯｒｎからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｚ８は、Ｇｌｕ、Ａａｄａ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、Ｄａｐ、およびＤａｂからなる群より選択される、アミド結合を形成するのに適した官能基を側鎖に有するアミノ酸であり；
Ｚ９は、Ｇｌｕ、Ａａｄａ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、およびＬｅｕからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｄは、ＮＨ２、またはＬｙｓ−ＮＨ２、またはＯｒｎ−ＮＨ２であり；
Ｐは、Ｚ８の側鎖上の官能基がアミンの場合はＣＯ、Ｚ８の側鎖上の官能基がカルボキシルの場合はＮＨであり、
式（ＩＩＩ）ではない残りの置換基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ８は、同一であるか異なっていて、Ｈ、メチル、エチル、およびビニルから選択される。

【0036】

以下の表に、化合物中の一般式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）による配列の組み合わせをいくつか示す。表中、１つの行にある各セルは、その配列の所定の位置において可能な選択肢を表す。

【0037】

一般式（ＩＩ）

【0038】

【表4】

【0039】

一般式（ＩＩＩ）

【0040】

【表5】

【0041】

本発明による化合物で好適なものは、一般式（Ｉ）の式中が以下のとおりのものである：
大環状部の窒素原子は、金属イオンＭｅと錯形成し、ＭｅはＦｅ、Ｍｎ、およびＲｕからなる群より選択されるもので、任意の可能な酸化状態にあり；
Ｒ１は、一般式（ＩＩ）の基であり：
式中
ｎ＝２または３であり；
Ａは、Ｓｕｃ、またはＡｃｅ、またはＡｃｅ−Ａｓｐ、またはＡｃｅ−Ａｓｎ、またはＡｃｅ−Ｐｒｏであり；
Ｘ１は、Ｇｌｕ、Ａａｄａ、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、およびＬｅｕからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｙ２は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｙ３は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｙ４は、Ｌｅｕであり；
Ｘ５は、Ｈｉｓ、ｈＣｙｓ、Ｍｅｔ、４Ｔａｚ、および５Ｔａｚからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ａＴｈｒ、およびＧｌｕからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｙ７は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｘ８は、Ｇｌｕ、Ａａｄａ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、Ｄａｐ、およびＤａｂからなる群より選択される、アミド結合を形成するのに適した官能基を側鎖に有するアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｇｌｕ、Ａａｄａ、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、およびＬｅｕからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｙ１０は、ＬｙｓまたはＯｒｎであり；
Ｂは、ＮＨ２、またはＩｌｅ−ＮＨ２、またはＩｌｅ−Ｔｈｒ−ＮＨ２、またはＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＮＨ２であり；
Ｌは、Ｘ８の側鎖上の官能基がアミンの場合はＣＯ、Ｘ８の側鎖上の官能基がカルボキシルの場合はＮＨであり；
Ｒ２およびＲ７は、同一であるか異なっていて、ＨまたはＣＨ３であり；
置換基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ８のうちの１つは、式Ｑ−（ＣＨ_２）ｓ−を有し、式中、ｓ＝２または３であり、Ｑは、ＮＨ_２ＣＯ、またはＣＨ_３ＣＯＮＨ、またはＨＯＯＣ、またはＣＨ_３ＯＯＣであるか、あるいは置換基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ８のうちの１つは、一般式（ＩＩＩ）の基であり：
式中
ｍ＝２または３であり；
Ｃは、Ｓｕｃ、Ａｃｅ、Ａｃｅ−Ａｓｐ、Ａｃｅ−Ａｓｎ、またはＡｃｅ−Ｐｒｏであり；
Ｚ１は、Ｇｌｕ、Ａａｄａ、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、およびＬｅｕからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｗ２は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｗ３は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｗ４は、Ｌｅｕであり；
Ｚ５は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、およびＡｉｂからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｚ６は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびａＴｈｒからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｗ７は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｚ８は、Ｇｌｕ、Ａａｄａ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、Ｄａｐ、およびＤａｂからなる群より選択される、アミド結合を形成するのに適した官能基を側鎖に有するアミノ酸であり；
Ｚ９は、Ｇｌｕ、Ａａｄａ、Ｏｒｎ、ｈＡｒｇ、およびＬｅｕからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｄは、ＮＨ２であり；
Ｐは、Ｚ８の側鎖上の官能基がアミンの場合はＣＯ、Ｚ８の側鎖上の官能基がカルボキシルの場合はＮＨであり；
式（ＩＩＩ）ではない残りの置換基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ８は、同一であるか異なっていて、Ｈ、メチル、エチル、およびビニルから選択される。

【0042】

以下の表に、好適な化合物中の一般式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）による配列の組み合わせをいくつか示す。表中、１つの行にある各セルは、その配列の所定の位置において可能な選択肢を表す。

【0043】

一般式（ＩＩ）

【0044】

【表6】

【0045】

一般式（ＩＩＩ）

【0046】

【表7】

【0047】

本発明による化合物でより好適なものは、一般式（Ｉ）の式中が以下のとおりのものである：
大環状部の窒素原子は、金属イオンＭｅと錯形成し、ＭｅはＦｅ、Ｍｎ、およびＲｕからなる群より選択されるもので、任意の可能な酸化状態にあり；
Ｒ１は、一般式（ＩＩ）の基であり：
式中
ｎ＝２であり；
Ａは、Ａｃｅ−Ａｓｐ、またはＡｃｅ−Ａｓｎ、またはＡｃｅ−Ｐｒｏであり；
Ｘ１は、Ｇｌｕ、Ａａｄａ、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、およびＬｅｕからなる群より選択され；
Ｙ２は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｙ３は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｙ４は、Ｌｅｕであり；
Ｘ５は、Ｈｉｓ、４Ｔａｚ、および５Ｔａｚからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびａＴｈｒからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｙ７は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｘ８は、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、Ｄａｐ、およびＤａｂからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｇｌｕ、Ａａｄａ、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、およびＬｅｕからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｙ１０は、ＬｙｓまたはＯｒｎであり；
Ｂは、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＮＨ２であり；
Ｌは、ＣＯであり；
Ｒ２およびＲ７は、ＣＨ_３であり；
Ｒ８は、式Ｑ−（ＣＨ_２）ｓ−を有し、式中、ｓ＝２であり、Ｑは、ＮＨ_２ＣＯ、またはＣＨ_３ＣＯＮＨ、またはＨＯＯＣ、またはＣＨ_３ＯＯＣであるか、あるいはＲ８は、一般式（ＩＩＩ）を有し、式中：
ｍ＝２であり；
Ｃは、Ａｃｅ−Ａｓｐ、またはＡｃｅ−Ａｓｎ、またはＡｃｅ−Ｐｒｏであり；
Ｚ１は、Ｇｌｕ、Ａａｄａ、Ａｒｇ、およびｈＡｒｇからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｗ２は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｗ３は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｗ４は、Ｌｅｕであり；
Ｚ５は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、およびＡｉｂからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｚ６は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、およびＳｅｒからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｗ７は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｚ８は、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、Ｄａｐ、およびＤａｂからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｚ９は、Ｇｌｕ、Ａａｄａ、Ａｒｇ、およびｈＡｒｇからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｄは、ＮＨ２であり；
Ｐは、ＣＯであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、互いに同一であるか異なっていて、Ｈまたはメチルである。

【0048】

以下の表に、より好適な化合物中の一般式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）による配列の組み合わせをいくつか示す。表中、１つの行にある各セルは、その配列の所定の位置において可能な選択肢を表す：

【0049】

一般式（ＩＩ）

【0050】

【表8】

【0051】

一般式（ＩＩＩ）

【0052】

【表9】

【0053】

本発明による化合物でさらにより好適なものは、一般式（Ｉ）の式中が以下のとおりのものである：
大環状部の窒素原子は、金属イオンＭｅと錯形成し、ＭｅはＦｅ、Ｍｎ、およびＲｕからなる群より選択されるもので、任意の可能な酸化状態にあり；
Ｒ１は、一般式（ＩＩ）の基であり：
式中
ｎ＝２であり；
Ａは、Ａｃｅ−Ａｓｐであり；
ＸＩは、Ｇｌｕ、またはＡｒｇ、またはＬｅｕであり；
Ｙ２は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｙ３は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｙ４は、Ｌｅｕであり；
Ｘ５は、Ｈｉｓであり；
Ｘ６は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびａＴｈｒからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｙ７は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｘ８は、Ｌｙｓであり；
Ｘ９は、Ｇｌｕ、またはＡｒｇ、またはＬｅｕであり；
Ｙ１０は、ＬｙｓまたはＯｒｎであり；
Ｂは、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＮＨ２であり；
Ｌは、ＣＯであり；
Ｒ２およびＲ７は、ＣＨ３であり；
Ｒ８は、式Ｑ−（ＣＨ_２）ｓ−を有し、式中、ｓ＝２であり、Ｑは、ＮＨ_２ＣＯ、またはＣＨ_３ＣＯＮＨ、またはＨＯＯＣ、またはＣＨ_３ＯＯＣであるか、あるいはＲ８は、一般式（ＩＩＩ）を有し、式中：
ｍ＝２であり；
Ｃは、Ａｃｅ−Ａｓｐであり；
Ｚ１は、ＧｌｕまたはＡｒｇであり；
Ｗ２は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｗ３は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり；
Ｗ４は、Ｌｅｕであり；
Ｚ５は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、およびＡｉｂからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｚ６は、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、およびＳｅｒからなる群より選択されるアミノ酸であり；
Ｗ７は、Ｇｌｎ、またはＧｌｕ、またはＡｉｂであり；
Ｚ８は、Ｌｙｓであり；
Ｚ９は、ＧｌｕまたはＡｒｇであり；
Ｄは、ＮＨ２であり；
Ｐは、ＣＯであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、互いに同一であるか異なっていて、Ｈまたはメチルである。

【0054】

以下の表に、さらにより好適な化合物中の一般式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）による配列の組み合わせのいくつかを示す。表中、１つの行にある各セルは、その配列の所定の位置において可能な選択肢を表す。

【0055】

一般式（ＩＩ）

【0056】

【表10】

【0057】

一般式（ＩＩＩ）

【0058】

【表11】

【0059】

一般式（Ｉ）の化合物は、適した対イオンと組み合わせて用いることもできるが、ただしそれらは特定の用途に対応しているものとする。

【0060】

本発明が権利請求する分子のような低分子量化合物についての、本明細書中以下に記載されるまったくもって新しい類のない性質は、選ばれた構造的解決策に由来する。以下の構造的特徴を有するペプチド−ポルフィリンジ付加体を、ここに初めて報告するとともに権利請求する：
ａ）長さの異なる２本のペプチド；一方のペプチド鎖は１０〜１６個のアミノ酸残基を有し、他方は、９〜１２個のアミノ酸残基を有する；ｂ）ポルフィリンとの共有会合がこれまでに報告されたことのない、長さの等しい、すなわち１０個または１１個または１２個のアミノ酸残基を有する２本のペプチド。以下の構造的特徴を有するペプチド−ポルフィリンモノ付加体も、ここに初めて報告するとともに権利請求する：
ａ）ペプチド鎖は、１０〜１６個のアミノ酸残基を有する；ｂ）ペプチド配列は、ポルフィリンとの共有会合がこれまでに報告されていない。

【0061】

驚いたことに、これらの構造的解決策は全て、それらの様々な構成要素の多くが親水性ではなかったとしても、良好な水溶性（＞ｍＭ）を本発明が権利請求する化合物に付与する。この特徴は、特に重要である。なぜならこの特徴により、本発明が権利請求する分子を水溶液および水−アルコール溶液の両方で使用することが可能になり、その結果これまでに報告された大多数の他の修飾ポルフィリンが持つ利用上の問題が排除されるからである。

【0062】

そのうえ、今日までに報告されているプロセスとは異なり、本発明が権利請求する化合物を触媒に用いて不活性分子（Ｈ_２Ｏ_２、Ｏ_２、またはＮＯなど）を活性化する場合、その高い回転数と触媒効率は、天然型または変異型血液タンパク質のもの以上である。この特徴は低コストで工業的に利用するための必須要素である。記載の化合物は、実施例１３にさらにより詳細に記載されるとおり、非常に高い比活性を示す。記載の化合物は、使用する触媒１グラムあたり、毎分数キログラムの基質を変換することができる。

【0063】

本発明が権利請求する化合物のいくつかについて、酸化剤としてＨ_２Ｏ_２を用いたＡＢＴＳ酸化における比活性値を以下にまとめる。

【0064】

【表12】

【0065】

そのうえ、本発明による化合物は、その化学的性質により、生体分子と共有結合して機能化することを、非常に簡単で経済的で汎用的なものにし、そして何よりその分子サイズの小ささにより、非常に高い置換度で、生体巨大分子（モノクローナルおよびポリクローナル抗体、抗体断片、抗原、受容体、受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、ビオチン、酵素、酵素阻害剤、核酸、ＰＮＡ、ペプチド、ならびにタンパク質など）を、その性質を変えることなく、本発明が権利請求する分子で置換することができ、それと同時に、存在する触媒量を増やすことができる。したがって、化学的、電気化学的、または分光学的プローブを、高い効率で認識現象を増幅する特徴を持たせながら、標的巨大分子の標的とすることができる。

【0066】

そのうえ、本発明が権利請求する分子を固相マトリクスまたはナノ粒子に支持させる場合、高いコーティング度合いの支持体を、文献で既知のコーティング法を用いて得ることができる。コーティングの度合いは、天然型または変異型酵素系を用いて達成される度合いより高く、１０倍にもなり得る。

【0067】

したがって、本発明が権利請求する化合物は、以下のように用いることができる：１）純粋な酸化剤（Ｈ_２Ｏ_２、Ｏ_２）を用いた脂肪族および芳香族炭化水素のヒドロキシル化反応の触媒として；２）純粋な酸化剤（Ｈ_２Ｏ_２、Ｏ_２）を用いた脂肪族および芳香族オレフィンのエポキシ化反応の触媒として；３）純粋な酸化剤（Ｈ_２Ｏ_２、Ｏ_２）を用いた脂肪族および芳香族炭化水素の酸化反応の触媒として；４）純粋な酸化剤（Ｈ_２Ｏ_２、Ｏ_２）を用いた脂肪族および芳香族炭化水素の過酸化反応の触媒として；５）フェノールニトロ化触媒として；６）汚染物質の分解；７）リグニンの分解；８）水中の汚染物質を特定するプローブとして；９）食品中の保存料を特定するプローブとして；１０）体内の薬物および毒性産物の濃度を特定するプローブとして；１１）医薬の代謝経路を特定するｉｎ ｖｉｔｒｏ診断；１２）体液中の医薬および毒性産物の濃度の特定；１３）免疫診断；１４）免疫組織化学検査；１５）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成；１６）ＥＬＩＳＡ検査；１７）サザンブロット、ノーザンブロット、およびウエスタンブロット検査；１８）細胞蛍光測定；１９）電気化学的デバイス。

【0068】

そのうえ、本発明による化合物は、合成および精製が容易であり、しかも低分子量であるため、発現または抽出により得られる血液タンパク質よりも低いコストで大規模に得ることができる。提案される合成手順は、主に、確立された固相ペプチド合成法に基づいており、Ｆｍｏｃ化学反応に代表されるような保護基を用いた合成が好ましい。本発明が権利請求する生成物の合成に必要な窒素大環状分子の多くは、市販されているか、でなければ文献に記載される方法の１つで合成することができる（Wijesekera T. P. ＆ Dolphin D. in “Metalloporphyrins in catalytic oxidations” 1994, ed. Sheldon R. A., Dekker N. Y.）。

【0069】

本発明が関係する式（Ｉ）の化合物は、文献で既知の様々な手法により合成することができる。こうした手法として、固相ペプチド合成法、溶液ペプチド合成法、有機化学合成法、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。選択される合成スキームは、合成される特定分子の組成に明らかに依存する。好ましくは、製造コストの低い、特に産業規模でコストの低い、固相の技法と従来の溶液法の適切な組み合わせに基づく合成法が用いられる。具体的には、そのような方法として以下が挙げられる。

【0070】

ｉ）適切に活性化したＮ保護アミノ酸とアミノ酸またはＣ保護ペプチド鎖との連続カップリングによるペプチド鎖断片の溶液合成、この合成は、中間体の単離、および続いてこの断片のＮ末端およびＣ末端の選択的脱保護を伴い、所望のペプチドが得られるまでこれらのカップリングを行う。これらの段階に続いて、窒素大環状分子との結合に関係する基の選択的脱保護、および大環状分子との縮合を行う。側鎖の完全な脱保護が必要な場合は、この段階で行うことができる。

【0071】

ｉｉ）不溶性重合体支持体で行うペプチド鎖のＣ末端からＮ末端に向かっての固相合成、残基Ｘ８の側鎖の選択的脱保護、および必要な場合は、他の残基の側鎖は保護したままのペプチドの樹脂からの切断。これに続いて、文献で既知のアミド結合形成方法の１つを用いて、ペプチドを窒素大環状分子の官能基と縮合させる。このとき窒素大環状分子は、金属と錯形成しているかいないかのいずれかである。これに続いて、適切な捕捉剤の存在下、ＴＦＡで完全脱保護を行う。含窒素大環状分子にまだ金属が挿入されていなければ、随意に挿入する。

【0072】

以下の実施例により、本発明による化合物をさらに例示するが、これらは制限するものではない。

【実施例1】

【0073】

３，７，１２，１７−テトラメチルポルフィリン−２（１８）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｈｉｓ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−Ｌｙｓ^１１−Ｉｌｅ^１２−Ｔｈｒ^１３−Ｌｅｕ^１４−ＮＨ_２）−１８（２）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ_３−Ｇｌｎ_４−Ｌｅｕ^５−Ｓｅｒ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−ＮＨ_２）−ジ−プロピオンアミドの合成；この化合物は、一般式（Ｉ）の式中が以下のとおりのものである：

【0074】

大環状部の窒素原子はＦｅ３＋イオンに配位しており；Ｒ２およびＲ７はＣＨ３であり；Ｒ４およびＲ６はＨであり；Ｒ３およびＲ５はＣＨ３であり；Ｒ１は一般式（ＩＩ）を有し、式中ｎ＝２であり；ＡはＡｃｅ−Ａｓｐであり、Ｘ１はＧｌｕであり；Ｙ２はＧｌｎであり；Ｙ３はＧｌｎであり；Ｙ４はＬｅｕであり；Ｘ５はＨｉｓであり；Ｘ６はＳｅｒであり；Ｙ７はＧｌｎであり；Ｘ８はＬｙｓ（Ｎ，ε−プロピオンアミド）であり；Ｘ９はＡｒｇであり；Ｙ１０はＬｙｓであり；ＢはＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＮＨ２であり；ＬはＣＯであり；ＡはＡｃｅ−Ａｓｐであり；Ｒ８は一般式（ＩＩＩ）を有し、式中ｍ＝２であり；ＣはＡｃｅ−Ａｓｐであり；Ｚ１はＧｌｕであり；Ｗ２はＧｌｎであり；Ｗ３はＧｌｎであり；Ｗ４はＬｅｕであり；Ｚ５はＳｅｒであり；Ｚ６はＳｅｒであり；Ｗ７はＧｌｎであり；Ｚ８はＬｙｓ（Ｎ，ε−プロピオンアミド）であり；Ｚ９はＡｒｇであり；ＤはＮＨ２であり；ＰはＣＯである。

【0075】

３，７，１２，１７−テトラメチルポルフィリン−２（１８）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｈｉｓ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−Ｌｙｓ^１１−Ｉｌｅ^１２−Ｔｈｒ^１３−Ｌｅｕ^１４−ＮＨ_２）−１８（２）−Ｎ_９^ε−Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｓｅｒ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−ＮＨ_２）−ジ−プロピオンアミドの合成について異なる工程を以下に記載する。

【0076】

デカペプチド（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ^２（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｎ^３（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ^４（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ^５−Ｓｅｒ^６（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ^７（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ^８（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０（Ｐｂｆ）−ＮＨ_２）（１）の合成

【0077】

Ｆｍｏｃ戦略を用いて、手動の固相ペプチド合成により、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上でペプチド（１）を合成した。Ｓｉｅｂｅｒ樹脂とは、９−Ｆｍｏｃ−アミノキサンテン−３−イルオキシ−Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂（１００〜２００メッシュ、１％２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン含有、置換レベル：０．５２ｍｍｏｌｇ^−１）であり、保護ペプチドアミドの合成における優れた支持体である。

【0078】

アミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨとして挿入した。第９位のＬｙｓ残基は、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）−ＯＨとして挿入した。メトキシトリチル保護基（Ｍｍｔ）は、穏やかな酸性条件下（１％ＴＦＡ含有ＤＣＭまたはＡｃＯＨ／ＴＦＥ／ＤＣＭ＝１：２：７（ｖ／ｖ））でリシンの側鎖から除去することができる保護基である。この挙動により、除去に９５％にも上るＴＦＡが必要な他の側鎖保護基の存在下、Ｍｍｔ基を選択的に除去することができる。この基を選択的に除去することができるため、全体が保護されたペプチドを、Ｌｙｓ９側鎖の遊離ε−アミノ基を通じて、ポルフィリン大環状分子とカップリングすることができる。

【0079】

合成は、０．２５ｍｍｏｌ規模で行った。Ｎ−αＦｍｏｃの脱保護は、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（ｖ／ｖ）溶液を用いて達成した。各サイクルで、３分間および７分間の別々の２つの処理を用いた。

【0080】

各アミノ酸についてカップリング工程を２回行った（４５分のカップリング時間）。最初のカップリングでは、Ν，Ν−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、３当量のＦｍｏｃ−アミノ酸、３当量のＰｙＢｏｐ／ＨＯＢｔ、および６当量のＤＩＥＡを用いた。第２のカップリングでは、代わりに、ＤＭＦ中、２当量のＦｍｏｃ−アミノ酸、２当量のＨＡＴＵ、および４当量のＤＩＥＡを用いた。カップリングごとに、Ｋａｉｓｅｒ検査で反応の完了を確認した。

【0081】

合成完了後、４．７％無水酢酸および４％ピリジンを含むＤＭＦを用いて、Ｎ末端を１５分間アセチル化した。

【0082】

焼結ガラスロート中、ペプチジル樹脂とＡｃＯＨ／ＴＦＥ／ＤＣＭ＝１：２：７（ｖ／ｖ）で処理してリシン９のＭｍｔ基を選択的に除去した。樹脂を１０分間震盪撹拌し、溶媒を減圧除去した。この工程を１５回繰り返した。最後に、樹脂をイソプロパノールおよびＤＣＭで洗った。Ｍｍｔ基の切断後、１％ＴＦＡ／ＤＣＭ（体積％）溶液を加えて、全体を保護したペプチドアミドを樹脂から切断した。樹脂を２分間震盪撹拌し、ろ液を氷冷した５％ピリジン／メタノール（体積％）含有フラスコに集めた。この処理を何度も繰り返した。最後に、樹脂をＤＣＭで洗った。ろ液は、シリカゲルＴＬＣを用い、クロロホルム／メタノール／酢酸＝８０：１８：２（ｖ／ｖ／ｖ）で確認した。所望の生成物を含有する画分を１つにまとめ、体積が５％になるまで減圧濃縮した。

【0083】

残渣に氷冷した水を加え、混合物を氷上で冷却して、保護ペプチドを析出しやすくした。生成物を濾過し、新鮮な水で数回洗い、真空乾燥させて、粗Ｃ末端デカペプチドアミド（１）を得た。

【0084】

生成物の単一性は、分析ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラムに、アセトニトリルを含む０．１％ＴＦＡ水溶液を、アセトニトリル濃度を３０分かけて５０％から９５％に増加させながら流速１ｍＬｍｉｎ^−１で使用）により確認した。クロマトグラムは、保持時間２３．８分の位置に主ピークを示した。ペプチドが目的物であることは、ＥＳＩ−ＭＳ分光測定により調べて、予想される分子量（２４６３ａ．ｍ．ｕ．）であることを確認した。

【0085】

ペプチドの収率は８５％だった。

【0086】

テトラデカペプチド（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ^２（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｎ^３（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ^４（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ^５−Ｈｉｓ^６（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ^７（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ^８（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０（Ｐｂｆ）−Ｌｙｓ^１１（Ｂｏｃ）−Ｉｌｅ^１２−Ｔｈｒ^１３（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ^１４−ＮＨ_２）（２）の合成

【0087】

テトラデカペプチド（２）を、デカペプチド（１）と同様に合成した。アミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨとして挿入した。第９位のＬｙｓ残基は、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）−ＯＨとして挿入した。

【0088】

生成物の単一性は、分析ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラムに、アセトニトリルを含む０．１％ＴＦＡ水溶液を、アセトニトリル濃度を３０分かけて５０％から９５％に増加させながら流速１ｍＬｍｉｎ^−１で使用）により確認した。クロマトグラムは、保持時間２３．４分の位置に主ピークを示した。ペプチドが目的物であることは、ＥＳＩ−ＭＳ分光測定により調べて、予想される分子量（３３１１ａ．ｍ．ｕ．）であることを確認した。

【0089】

ペプチドの収率は９０％だった。

【0090】

ペプチド−ポルフィリン中間体（３）：３，７，１２，１７−テトラメチルポルフィリン−１８（２）−プロピオン酸−２（１８）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ^２（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｎ^３（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ^４（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ^５−Ｓｅｒ^６（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ^７（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ^８（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０（Ｐｂｆ）−ＮＨ_２）プロピオンアミド、すなわちモノペプチド付加体の合成

【0091】

この中間体は、デカペプチド（１）とジュウテロポルフィリンＩＸ（ＤＰ−ＩＸ）を溶液中でカップリングすることで合成した。

【0092】

デカペプチド（１）（０．１００ｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）とジュウテロポルフィリンＩＸ・２ＨＣｌ（０．０２８ｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）を、ＤＩＥＡ（０．０３２ｍＬ、０．１８４ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ３０ｍＬに溶解させた。次いで、ＰｙＢｏｐ（０．０２５ｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．００７５ｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（０．０１７ｍＬ、０．０９６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解させた溶液を滴下した。反応液を室温で３時間撹拌した。反応は、分析ＨＰＬＣ（Ｃ８カラムに、アセトニトリルを含む０．１％ＴＦＡ水溶液を、アセトニトリル濃度を２０分かけて５０％から９０％に増加させながら使用）およびシリカゲル薄層クロマトグラフィー（溶媒系は、クロロホルム／メタノール＝９０：１０）でモニターした。反応液を減圧濃縮して体積を２０％まで減少させ、冷ジエチルエーテルで沈殿させた。粗生成物をシリカゲルカラム（５×６０ｃｍ）に乗せ、クロロホルム／メタノール溶媒のメタノール濃度を０％から１０％に上げながら段階的に溶出させて精製した。生成物はメタノール濃度１０％で溶出し、収率は４８％であった。分析ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＥＳＩ／ＭＳ分光測定により、生成物の純度および目的物であることを確認した（２９８０ａｍｕ）。

【0093】

最終生成物：３，７，１２，１７−テトラメチルポルフィリン−２（１８）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｈｉｓ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−Ｌｙｓ^１１−Ｉｌｅ^１２−Ｔｈｒ^１３−Ｌｅｕ^１４−ＮＨ_２）−１８（２）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｓｅｒ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−ＮＨ_２）−ジ−プロピオンアミド（４）の合成

【0094】

モノペプチド付加体（３）（０．０５０ｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）、テトラデカペプチド（２）（０．０５２ｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（０．００９ｍＬ、０．０５１ｍｍｏｌ）を、２０％ＴＦＥ（ｖ／ｖ）含有ＤＭＦ１６ｍＬに溶解した。次いで、ＨＡＴＵ（０．００６５ｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１ｍＬに加えた溶液を滴下し、室温で合計２時間、反応を進行させた。反応中、ｐＨを確認した。反応の進行は、分析ＨＰＬＣ（ＶｙｄａｃＣ８カラムに、アセトニトリルを含む０．１％ＴＦＡ水溶液を、アセトニトリル濃度を２０分かけて５０％から９０％に増加させながら流速１ｍＬｍｉｎ^−１で使用）および薄層クロマトグラフィー（溶媒系はクロロホルム／メタノール＝９０：１０）で追跡した。反応液を減圧濃縮して体積を２０％まで減少させ、冷ジエチルエーテルで沈殿させた。粗生成物を真空乾燥した。側鎖の脱保護は、開裂混合物（０．７５ｇフェノール含有チオアニソール／Ｈ_２Ｏ／ＥＤＴ／ＴＦＡ＝０．２５／０．５／０．５／８．７５、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）を加え０℃で２．５時間作用させることにより行った。この処理を２回行った。ロータリーエバポレーターで反応液を濃縮し体積を約１〜２ｍＬにした。粗生成物に冷ジエチルエーテルを加えて捕捉剤および沈殿物を抽出した。次いで、粗生成物を真空乾燥し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラムに、アセトニトリルを含む０．１％ＴＦＡ水溶液を、アセトニトリル濃度を３５分かけて１０％から８０％に増加させながら使用）で精製した。所望の生成物を含む画分をプールし、凍結乾燥させて、最終生成物０．０２５ｇ（７．２×１０^−３ｍｍｏｌ、収率４２％）を得た。分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより、精製した生成物は純度が＞９９％であることが示され、ＥＳｉ／ＭＳにより予想分子量（３４９９ａｍｕ）を確認した。

【0095】

生成物３，７，１２，１７−テトラメチルポルフィリン−２（１８）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｈｉｓ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−Ｌｙｓ^１１−Ｉｌｅ^１２−Ｔｈｒ^１３−Ｌｅｕ^１４−ＮＨ_２）−１８（２）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｓｅｒ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−ＮＨ_２）−ジ−プロピオンアミド（５）のＦｅ３＋錯体の合成

【0096】

文献の手順（Buchler JW. in The Porphyrins, Vol. 1 (Ed. D. Dolphin), Academic Press. New York. 1979, pp.389）に従って、大環状分子に鉄イオンを挿入した。最終化合物（４）（０．００６ｇ、１．７×１０^−６ｍｏｌ、最終濃度１．０×１０^−４Ｍ）を酢酸／ＴＦＥ＝６／４（ｖ／ｖ）に加えた溶液に、酢酸鉄（ＩＩ）（５０モル倍過剰）を加えた。反応液を、窒素下で還流させながら３時間４０℃に維持した。反応は、分析ＨＰＬＣでモニターした。次いで、溶媒を減圧除去し、生成物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラムに、アセトニトリルを含む０．１％ＴＦＡ水溶液を、アセトニトリル濃度を５８．４分かけて１０％から８０％に増加させながら使用）で精製して単一物にした。純粋な生成物０．００３２ｇ（０．９０×１０^−３ｍｍｏｌ、収率５４％）が得られた。ＥＳＩ／ＭＳ分析により、予想分子量（３５５２ａｍｕ）を確認した。

【実施例2】

【0097】

抗体と共有結合した、実施例１に記載の化合物の合成

【0098】

実施例１に記載の化合物を、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて、モノクローナルマウス抗体、抗ヒトＩｇＧ（以下、ＩｇＧと示す）と共有結合させた。Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣがアミンとスルフヒドリルのクロス架橋剤であることから、この試薬を架橋剤として選択した。ヘテロ二官能性架橋剤は、２つの同一部分間（抗体抗体間など）の架橋形成を決定づけないことから、高い結合レベルを達成するのに最適な試薬である。結合プロトコルは２工程からなった。

【0099】

化合物（５）のＬｙｓ１１の側鎖のＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（６）試薬による修飾

【0100】

化合物（５）０．００２ｇを、０．１Ｍリン酸緩衝液（０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．２）０．８ｍＬに溶解させた。この溶液に、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを０．００４３ｇ（モル比約１：２０）含有する水溶液０．２ｍＬを加えた。反応液を、撹拌しながら室温で２時間インキュベートした。

【0101】

反応の進行は、ＬＣ−ＭＳで追跡した。反応が完了したら、ＰＤ１０脱塩カラムに溶出緩衝液として１００ｍＭリン酸緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を用いて、反応液を精製した。所望の生成物（６）を含む画分をプールして凍結乾燥させた。

【0102】

ＩｇＧ分子（７）へのスルフヒドリル基の導入

【0103】

アセトニトリル０．０１０ｍＬにＳ−アセチルチオ酢酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＡＴＡ）０．８ｍｇを溶解させ、これを、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９）を用いた抗体溶液（ＩｇＧ、１ｍｇ／ｍＬ、約６．７×１０^−６Ｍ）に加えた。反応は、撹拌しながら３０分間室温に維持した。修飾された抗体を、脱塩カラムを用いて、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９）で溶出させて精製した。

【0104】

ＳＡＴＡ−修飾抗体溶液にヒドロキシルアミン原液（ヒドロキシルアミン塩酸塩０．０５０ｇを０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９）１．０ｍｌに溶解させて調製）０．１００ｍＬを加えて（ＮＨ２ＯＨの量は、抗体の約３０モル倍過剰）、ＳＡＴＡ−修飾抗体の脱アセチル化を行った。

【0105】

反応は、撹拌しながら２時間室温に維持した。反応生成物を過剰のヒドロキシルアミンから精製する目的で、１００ｍＭリン酸緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ５）で平衡化した脱塩カラムを用いた。

【0106】

修飾抗体（７）と化合物（６）の結合による結合生成物（８）の生成

【0107】

０．００３Ｌの反応体積で化合物（６）０．００２５ｇと修飾抗体（７）０．００１ｇを反応させて、最終結合生成物（８）を得た。

【0108】

反応は、撹拌しながら２時間室温に維持した。反応の進行は、分析ＨＰＬＣ（０．１Ｍリン酸緩衝液（３．５ｍＭのＳＤＳ、ｐＨ６）で平衡化した分子ふるいカラムを使用）で追跡した。結合生成物を、ガラスカラム（１０×１５０ｍｍ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００スーパーファイン１０−４０を充填）を用いてゲル濾過することにより精製した。分離は、０．１Ｍリン酸緩衝液（０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７）を流速３ｍＬ／ｈで流して行った。２８０ｎｍの吸収帯と３９８ｎｍの吸収帯の比を分析することで、結合比を見積もった。その結果、結合比は１３（化合物（６）／ＩｇＧ）であるとの見積もりになった。

【実施例3】

【0109】

化合物３，７，１２，１７−テトラメチルポルフィリン−２（１８）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｈｉｓ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−Ｌｙｓ^１１−Ｉｌｅ^１２−Ｔｈｒ^１３−Ｌｅｕ^１４−ＮＨ_２）−１８（２）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｓｅｒ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−ＮＨ_２）−ジ−プロピオンアミドの合成；この化合物は、一般式（Ｉ）の式中が以下のとおりのものである：

【0110】

大環状部の窒素原子はＲｕ２＋イオンに配位しており；Ｒ２およびＲ７はＣＨ３であり；Ｒ４およびＲ６はＨであり；Ｒ３およびＲ５はＣＨ３であり；Ｒ１は一般式（ＩＩ）を有し、式中ｎ＝２であり；ＡはＡｃｅ−Ａｓｐであり、Ｘ１はＧｌｕであり；Ｙ２はＧｌｎであり；Ｙ３はＧｌｎであり；Ｙ４はＬｅｕであり；Ｘ５はＨｉｓであり；Ｘ６はＳｅｒであり；Ｙ７はＧｌｎであり；Ｘ８はＬｙｓ（Ｎ，ε−プロピオンアミド）であり；Ｘ９はＡｒｇであり；Ｙ１０はＬｙｓであり；ＢはＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＮＨ２であり；ＬはＣＯであり；Ａは、Ａｃｅ−Ａｓｐであり；Ｒ８は一般式（ＩＩＩ）を有し、式中ｍ＝２であり；ＣはＡｃｅ−Ａｓｐであり；Ｚ１はＧｌｕであり；Ｗ２はＧｌｎであり；Ｗ３はＧｌｎであり；Ｗ４はＬｅｕであり；Ｚ５はＳｅｒであり；Ｚ６はＳｅｒであり；Ｗ７はＧｌｎであり；Ｚ８はＬｙｓ（Ｎ，ε−プロピオンアミド）であり；Ｚ９はＡｒｇであり；ＤはＮＨ２であり；ＰはＣＯである。

【0111】

この化合物の合成は、ルテニウムイオンを大環状分子（ＤＰ−ＩＸ）に挿入することから始めた。続いて、デカペプチド（化合物１）およびテトラデカペプチド（化合物２）を、実施例１に記載したように、大環状分子とカップリングさせた。

【0112】

詳細には、多少変更した金属カルボニル法を用いて、ルテニウムイオンをポルフィリン環に挿入することで、Ｒｕ（ＩＩ）−ＣＯ−ＤＰ−ＩＸ錯体を調製した。

【0113】

この方法は基本的に、高沸点非プロトン性溶媒（トルエン、ＤＭＦ、ジオキサンなど）、「金属担体」としてのトリルテニウムドデカカルボニルＲｕ_３（ＣＯ）_１２、および還流条件下での非常に長い反応時間を使用する。本発明者らにより最適化された実験条件は、溶媒として酢酸−酢酸ナトリウム溶液を使用することに基づく（Hartmann M. et al. J. Biol. Inorg. Chem. 1997, 2, pp427）。詳細には、２０．０ｍｇのＤＰ−ＩＸを、酢酸ナトリウム１３３．０ｍｇを含む酢酸溶液６．３ｍｌに溶解させた。８３ｍｇのＲｕ_３（ＣＯ）_１２（約４当量）をこの溶液に加え、混合物を８５℃に加熱して還流させた。

【0114】

金属化は、ＵＶ−ｖｉｓ分光測定および分析ＲＰ−ＨＰＬＣでモニターした。２４時間反応後の混合物の分析から、Ｒｕ２＋が大環状分子に挿入されたことを確認した（収率８０％）。

【0115】

反応液を冷却し、次いでこれに冷水５０ｍＬを加えた。所望の生成物、未反応ＤＰ−ＩＸ、および過剰のＲｕ_３（ＣＯ）_１２を含む赤褐色固体の形成が観測された。固体を、遠心分離により溶液から分離し、続いてメタノール処理した。メタノールを加えると、未反応ＤＰ−ＩＸおよび所望の生成物が溶解したので、Ｒｕ_３（ＣＯ）_１２の不溶性ペレットを遠心分離により溶液から分離した。所望の生成物を、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー（Ｃ１８カラム（２．２×２５ｃｍ）に、アセトニトリルを含む０．１％ＴＦＡ水溶液を、アセトニトリル濃度を３３分かけて２０％から８０％に増加させながら使用）で精製した。所望の生成物を含む画分をプールして凍結乾燥させ、純粋な生成物９．６ｍｇ（１５×１０^−３ｍｍｏｌ、収率４４％）を得た。

【0116】

生成物の単一性は、分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより確認した。ＭＡＬＤＩ質量分析は、Ｒｕ（ＩＩ）−ＤＰ−ＩＸ分子イオンピークに相当する主ピークがｍ／ｚ６１０ａｍｕに存在することを示した。実際、ＭＡＬＤＩレーザー光源による試料のイオン化の間に、金属イオンからのＣＯ脱離が観測される（Ishii K. et al. Inorg. Chem. 2004, 43, pp7369）。ＣＯの存在は、生成物のＩＲスペクトルを分析することにより確認した。ＩＲスペクトルは、Ｒｕ（ＩＩ）−ＣＯ−ポルフィリン錯体に特徴的なν＝１９８９ｃｍ^−１の吸収帯を示した。

【0117】

Ｒｕ（ＩＩ）−ＣＯ−ＤＰ−ＩＸとデカペプチド（１）とのカップリング、さらに続いてテトラデカペプチド（２）とのカップリングは、実施例（１）に記載したとおりに行った。

【0118】

最終生成物をＲＰ−ＨＰＬＣで精製して、収率４２％で得た。単一性および目的物であることは、ＬＣ−ＭＳ／ＥＳＩ分析で確認した（３６２５ａｍｕ）。

【実施例4】

【0119】

化合物３，７，１２，１７−テトラメチルポルフィリン−１８（２）−プロピオン酸−２（１８）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｈｉｓ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−Ｌｙｓ^１１−Ｉｌｅ^１２−Ｔｈｒ^１３−Ｌｅｕ^１４−ＮＨ_２）プロピオンアミドの合成、この化合物は、一般式（Ｉ）の式中が以下のとおりのものである：

【0120】

大環状部の窒素原子はＦｅ３＋イオンに配位しており；Ｒ２およびＲ７はＣＨ３であり；Ｒ４およびＲ６はＨであり；Ｒ３およびＲ５はＣＨ３であり；Ｒ１は一般式（ＩＩ）を有し、式中ｎ＝２であり；ＡはＡｃｅ−Ａｓｐであり、Ｘ１はＧｌｕであり；Ｙ２はＧｌｎであり；Ｙ３はＧｌｎであり；Ｙ４は、Ｌｅｕであり；Ｘ５はＨｉｓであり；Ｘ６はＳｅｒであり；Ｙ７はＧｌｎであり；Ｘ８はＬｙｓ（Ｎ，ε−プロピオンアミド）であり；Ｘ９はＡｒｇであり；Ｙ１０はＬｙｓであり；ＢはＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＮＨ２であり；ＬはＣＯであり；Ａは、Ａｃｅ−Ａｓｐであり；Ｒ８は一般式（ＩＩＩ）を有し、式中ｍ＝２であり、ＱはＨＯＯＣである。

【0121】

この化合物の合成は、実施例（１）に記載のテトラデカペプチド、Ａｃｅ−Ａｓｐ^１（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ^２（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｎ^３（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ^４（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ^５−Ｈｉｓ^６（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ^７（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ^８（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０（Ｐｂｆ）−Ｌｙｓ^１１（Ｂｏｃ）−Ｉｌｅ^１２−Ｔｈｒ^１３（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ^１４−ＮＨ_２）（中間体（２））およびＤＰ−ＩＸを用いて行った。実施例（１）に記載したように、テトラデカペプチドとＤＰ−ＩＸをカップリングさせた。実施例（１）に記載したのと同じ手順で、側鎖の保護基を外し、鉄イオンを大環状分子に挿入してから、最終生成物をＲＰ−ＨＰＬＣで精製した（収率４８％）。単一性および目的物であることは、ＬＣ−ＭＳ／ＥＳＩ分析で確認した（２３１１ａｍｕ）。

【実施例5】

【0122】

化合物３，７，１２，１７−テトラメチルポルフィリン−２（１８）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｈｉｓ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ｌｅｕ^１０−Ｌｙｓ^１１−Ｉｌｅ^１２−Ｔｈｒ^１３−Ｌｅｕ^１４−ＮＨ_２）−１８（２）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｓｅｒ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−ＮＨ_２）−ジ−プロピオンアミドの合成、この化合物は、一般式（Ｉ）の式中が以下のとおりのものである：

【0123】

大環状部の窒素原子はＦｅ３＋イオンに配位しており；Ｒ２およびＲ７はＣＨ３であり；Ｒ４およびＲ６はＨであり；Ｒ３およびＲ５はＣＨ３であり；Ｒ１は一般式（ＩＩ）を有し、式中ｎ＝２であり；ＡはＡｃｅ−Ａｓｐであり、Ｘ１はＧｌｕであり；Ｙ２はＧｌｎであり；Ｙ３はＧｌｎであり；Ｙ４はＬｅｕであり；Ｘ５はＨｉｓであり；Ｘ６はＳｅｒであり；Ｙ７はＧｌｎであり；Ｘ８はＬｙｓ（Ｎ，ε−プロピオンアミド）であり；Ｘ９はＬｅｕであり；Ｙ１０はＬｙｓであり；ＢはＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＮＨ２であり；ＬはＣＯであり；ＡはＡｃｅ−Ａｓｐであり；Ｒ８は一般式（ＩＩＩ）を有し、式中ｍ＝２であり；ＣはＡｃｅ−Ａｓｐであり；Ｚ１はＧｌｕであり；Ｗ２はＧｌｎであり；Ｗ３はＧｌｎであり；Ｗ４はＬｅｕであり；Ｚ５はＳｅｒであり；Ｚ６はＳｅｒであり；Ｗ７はＧｌｎであり；Ｚ８はＬｙｓ（Ｎ，ε−プロピオンアミド）であり；Ｚ９はＡｒｇであり；ＤはＮＨ２であり；ＰはＣＯである。

【0124】

この化合物の合成は、以下を用いて行った：ａ）デカペプチド（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ^２（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｎ^３（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ^４（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ^５−Ｓｅｒ^６（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ^７（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ^８（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０（Ｐｂｆ）−ＮＨ_２）（中間体１）、実施例（１）に記載のとおりに合成；ｂ）テトラデカペプチド（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ^２（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｎ^３（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ^４（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ^５−Ｈｉｓ^６（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ^７（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ^８（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ^９−Ｌｅｕ^１０−Ｌｙｓ^１１（Ｂｏｃ）−Ｉｌｅ^１２−Ｔｈｒ^１３（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ^１４−ＮＨ_２）（中間体（２））、Ｘ９の位置にアルギニン（Ｐｂｆ）の代わりにロイシンを有するもの、実施例（１）に記載のとおりに合成；ｃ）ＤＰ−ＩＸ。テトラデカペプチド、デカペプチドとＤＰ−ＩＸとのカップリングは、実施例１に記載のとおりに行った。

【0125】

実施例（１）に記載したのと同じ手順で、側鎖の保護基を外し、鉄イオンを大環状分子に挿入してから、最終生成物をＲＰ−ＨＰＬＣで精製した（収率２５％）。単一性および目的物であることは、ＬＣ−ＭＳ／ＥＳＩ分析で確認した（３５０９ａｍｕ）。

【実施例6】

【0126】

化合物３，７，１２，１７−テトラメチルポルフィリン−２（１８）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｌｅｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｈｉｓ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−Ｌｙｓ^１１−Ｉｌｅ^１２−Ｔｈｒ^１３−Ｌｅｕ^１４−ＮＨ_２）−１８（２）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｓｅｒ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−ＮＨ_２）−ジ−プロピオンアミドの合成、この化合物は、一般式（Ｉ）の式中が以下のとおりのものである：

【0127】

大環状部の窒素原子はＦｅ３＋イオンに配位しており；Ｒ２およびＲ７はＣＨ３であり；Ｒ４およびＲ６はＨであり；Ｒ３およびＲ５はＣＨ３であり；Ｒ１は一般式（ＩＩ）を有し、式中ｎ＝２であり；ＡはＡｃｅ−Ａｓｐであり、Ｘ１はＬｅｕであり；Ｙ２はＧｌｎであり；Ｙ３はＧｌｎであり；Ｙ４はＬｅｕであり；Ｘ５はＨｉｓであり；Ｘ６はＳｅｒであり；Ｙ７はＧｌｎであり；Ｘ８はＬｙｓ（Ｎ，ε−プロピオンアミド）であり；Ｘ９はＡｒｇであり；Ｙ１０はＬｙｓであり；ＢはＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＮＨ２であり；ＬはＣＯであり；ＡはＡｃｅ−Ａｓｐであり；Ｒ８は一般式（ＩＩＩ）を有し、式中ｍ＝２であり；ＣはＡｃｅ−Ａｓｐであり；Ｚ１はＧｌｕであり；Ｗ２はＧｌｎであり；Ｗ３はＧｌｎであり；Ｗ４はＬｅｕであり；Ｚ５はＳｅｒであり；Ｚ６はＳｅｒであり；Ｗ７はＧｌｎであり；Ｚ８はＬｙｓ（Ｎ，ε−プロピオンアミド）であり；Ｚ９はＡｒｇであり；Ｄは、ＮＨ２であり；ＰはＣＯである。

【0128】

この化合物の合成は、以下を用いて行った：ａ）デカペプチド（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ^２（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｎ^３（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ^４（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ^５−Ｓｅｒ^６（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ^７（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ^８（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０（Ｐｂｆ）−ＮＨ_２）（中間体１）、実施例（１）に記載のとおりに合成；ｂ）テトラデカペプチド（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ^２−Ｇｌｎ^３（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ^４（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ^５−Ｈｉｓ^６（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ^７（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ^８（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０（Ｐｂｆ）−Ｌｙｓ^１１（Ｂｏｃ）−Ｉｌｅ^１２−Ｔｈｒ^１３（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ^１４−ＮＨ_２）（中間体（２））、Ｘ１の位置にＧｌｕ（ＯｔＢｕ）の代わりにロイシンを有するもの、実施例（１）に記載のとおりに合成；ｃ）ＤＰ−ＩＸ。テトラデカペプチド、デカペプチドとＤＰ−ＩＸとのカップリングは、実施例１に記載のとおりに行った。

【0129】

実施例（１）に記載したのと同じ手順で、側鎖の保護基を外し、鉄イオンを大環状分子に挿入してから、最終生成物をＲＰ−ＨＰＬＣで精製した（収率２７％）。単一性および目的物であることは、ＬＣ−ＭＳ／ＥＳＩ分析で確認した（３５３６ａｍｕ）。

【実施例7】

【0130】

化合物３，７，１２，１７−テトラメチルポルフィリン−２（１８）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｈｉｓ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−Ｌｙｓ^１１−Ｉｌｅ^１２−Ｔｈｒ^１３−Ｌｅｕ^１４−ＮＨ_２）−１８（２）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｇｌｙ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−ＮＨ_２）−ジ−プロピオンアミドの合成、この化合物は、一般式（Ｉ）の式中が以下のとおりのものである：

【0131】

大環状部の窒素原子はＦｅ３＋イオンに配位しており；Ｒ２およびＲ７はＣＨ３であり；Ｒ４およびＲ６はＨであり；Ｒ３およびＲ５はＣＨ３であり；Ｒ１は一般式（ＩＩ）を有し、式中ｎ＝２であり；ＡはＡｃｅ−Ａｓｐであり、Ｘ１はＧｌｕであり；Ｙ２はＧｌｎであり；Ｙ３はＧｌｎであり；Ｙ４はＬｅｕであり；Ｘ５はＨｉｓであり；Ｘ６はＳｅｒであり；Ｙ７はＧｌｎであり；Ｘ８はＬｙｓ（Ｎ，ε−プロピオンアミド）であり；Ｘ９はＡｒｇであり；Ｙ１０はＬｙｓであり；ＢはＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＮＨ２であり；ＬはＣＯであり；ＡはＡｃｅ−Ａｓｐであり；Ｒ８は一般式（ＩＩＩ）を有し、式中ｍ＝２であり；ＣはＡｃｅ−Ａｓｐであり；Ｚ１はＧｌｕであり；Ｗ２はＧｌｎであり；Ｗ３はＧｌｎであり；Ｗ４はＬｅｕであり；Ｚ５はＧｌｙであり；Ｚ６はＳｅｒであり；Ｗ７はＧｌｎであり；Ｚ８はＬｙｓ（Ｎ，ε−プロピオンアミド）であり；Ｚ９はＡｒｇであり；ＤはＮＨ２であり；ＰはＣＯである。

【0132】

この化合物の合成は、以下を用いて行った：ａ）デカペプチド（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ^２（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｎ^３（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ^４（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ^５−Ｇｌｙ^６−Ｓｅｒ^７（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ^８（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０（Ｐｂｆ）−ＮＨ_２）（中間体１）、実施例（１）に記載のとおりに合成、Ｚ５の位置にセリン（ｔＢｕ）の代わりにグリシンを有する；ｂ）テトラデカペプチド（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ^２（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｎ^３（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ^４（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ^５−Ｈｉｓ^６（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ^７（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ^８（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０（Ｐｂｆ）−Ｌｙｓ^１１（Ｂｏｃ）−Ｉｌｅ^１２−Ｔｈｒ^１３（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ^１４−ＮＨ_２）（中間体（２））、実施例（１）に記載のとおりに合成；ｃ）ＤＰ−ＩＸ。

【0133】

テトラデカペプチド、デカペプチドとＤＰ−ＩＸとのカップリングは、実施例１に記載のとおりに行った。実施例（１）に記載したのと同じ手順で、側鎖の保護基を外し、鉄イオンを大環状分子に挿入してから、最終生成物をＲＰ−ＨＰＬＣで精製した（収率２８％）。単一性および目的物であることは、ＬＣ−ＭＳ／ＥＳＩ分析で確認した（３５２２ａｍｕ）。

【実施例8】

【0134】

化合物３，７，１２，１７−テトラメチルポルフィリン−２（１８）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｈｉｓ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−Ｌｙｓ^１１−Ｉｌｅ^１２−Ｔｈｒ^１３−Ｌｅｕ^１４−ＮＨ_２）−１８（２）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｌｅｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｓｅｒ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−ＮＨ_２）−ジ−プロピオンアミドの合成、この化合物は、一般式（Ｉ）の式中が以下のとおりのものである：

【0135】

大環状部の窒素原子はＦｅ３＋イオンに配位しており；Ｒ２およびＲ７はＣＨ３であり；Ｒ４およびＲ６はＨであり；Ｒ３およびＲ５はＣＨ３であり；Ｒ１は一般式（ＩＩ）を有し、式中ｎ＝２であり；ＡはＡｃｅ−Ａｓｐであり、Ｘ１はＧｌｕであり；Ｙ２はＧｌｎであり；Ｙ３はＧｌｎであり；Ｙ４はＬｅｕであり；Ｘ５はＨｉｓであり；Ｘ６はＳｅｒであり；Ｙ７はＧｌｎであり；Ｘ８はＬｙｓ（Ｎ，ε−プロピオンアミド）であり；Ｘ９はＬｅｕであり；Ｙ１０はＬｙｓであり；ＢはＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＮＨ２であり；ＬはＣＯであり；ＡはＡｃｅ−Ａｓｐであり；Ｒ８は一般式（ＩＩＩ）を有し、式中ｍ＝２であり；ＣはＡｃｅ−Ａｓｐであり；Ｚ１はＬｅｕであり；Ｗ２はＧｌｎであり；Ｗ３はＧｌｎであり；Ｗ４はＬｅｕであり；Ｚ５はＳｅｒであり；Ｚ６はＳｅｒであり；Ｗ７はＧｌｎであり；Ｚ８はＬｙｓ（Ｎ，ε−プロピオンアミド）であり；Ｚ９はＡｒｇであり；ＤはＮＨ２であり；ＰはＣＯである。

【0136】

この化合物の合成は、以下を用いて行った：ａ）デカペプチド（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ^２−Ｇｌｎ^３（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ^４（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ^５−Ｇｌｙ^６−Ｓｅｒ^７（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ^８（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０（Ｐｂｆ）−ＮＨ_２）（中間体１）、実施例（１）に記載のとおりに合成、Ｚ１の位置にＧｌｕ（ＯｔＢｕ）の代わりにロイシンを有する；ｂ）テトラデカペプチド（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ^２（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｎ^３（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ^４（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ^５−Ｈｉｓ^６（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ^７（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ^８（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０（Ｐｂｆ）−Ｌｙｓ^１１（Ｂｏｃ）−Ｉｌｅ^１２−Ｔｈｒ^１３（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ^１４−ＮＨ_２）（中間体（２））、実施例（１）に記載のとおりに合成；ｃ）ＤＰ−ＩＸ。

【0137】

テトラデカペプチド、デカペプチドとＤＰ−ＩＸとのカップリングは、実施例１に記載のとおりに行った。実施例（１）に記載したのと同じ手順で、側鎖の保護基を外し、鉄イオンを大環状分子に挿入してから、最終生成物をＲＰ−ＨＰＬＣで精製した（収率３０％）。単一性および目的物であることは、ＬＣ−ＭＳ／ＥＳＩ分析で確認した（３５３６ａｍｕ）。

【実施例9】

【0138】

化合物３，７，１２，１７−テトラメチルポルフィリン−２（１８）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｈｉｓ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−Ｌｙｓ^１１−Ｉｌｅ^１２−Ｔｈｒ^１３−Ｌｅｕ^１４−ＮＨ_２）−１８（２）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｓｅｒ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ｌｅｕ^１０−ＮＨ_２）−ジ−プロピオンアミドの合成、この化合物は、一般式（Ｉ）の式中が以下のとおりのものである：

【0139】

大環状部の窒素原子はＦｅ３＋イオンに配位しており；Ｒ２およびＲ７はＣＨ３であり；Ｒ４およびＲ６はＨであり；Ｒ３およびＲ５はＣＨ３であり；Ｒ１は一般式（ＩＩ）を有し、式中ｎ＝２であり；ＡはＡｃｅ−Ａｓｐであり、Ｘ１はＧｌｕであり；Ｙ２はＧｌｎであり；Ｙ３はＧｌｎであり；Ｙ４はＬｅｕであり；Ｘ５はＨｉｓであり；Ｘ６はＳｅｒであり；Ｙ７はＧｌｎであり；Ｘ８はＬｙｓ（Ｎ，ε−プロピオンアミド）であり；Ｘ９はＬｅｕであり；Ｙ１０はＬｙｓであり；ＢはＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＮＨ２であり；ＬはＣＯであり；ＡはＡｃｅ−Ａｓｐであり；Ｒ８は一般式（ＩＩＩ）を有し、式中ｍ＝２であり；ＣはＡｃｅ−Ａｓｐであり；Ｚ１はＧｌｕであり；Ｗ２はＧｌｎであり；Ｗ３はＧｌｎであり；Ｗ４はＬｅｕであり；Ｚ５はＳｅｒであり；Ｚ６はＳｅｒであり；Ｗ７はＧｌｎであり；Ｚ８はＬｙｓ（Ｎ，ε−プロピオンアミド）であり；Ｚ９はＬｅｕであり；ＤはＮＨ２であり；ＰはＣＯである。

【0140】

この化合物の合成は、以下を用いて行った：ａ）デカペプチド（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ^２−Ｇｌｎ^３（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ^４（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ^５−Ｇｌｙ^６−Ｓｅｒ^７（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ^８（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ^９−Ｌｅｕ^１０−ＮＨ_２）（中間体１）、実施例（１）に記載のとおりに合成、Ｚ９の位置にＡｒｇ（Ｐｂｆ）の代わりにロイシンを有する；ｂ）テトラデカペプチド（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ^２（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｎ^３（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ^４（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ^５−Ｈｉｓ^６（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ^７（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ^８（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０（Ｐｂｆ）−Ｌｙｓ^１１（Ｂｏｃ）−Ｉｌｅ^１２−Ｔｈｒ^１３（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ^１４−ＮＨ_２）（中間体（２））、実施例（１）に記載のとおりに合成；ｃ）ＤＰ−ＩＸ。

【0141】

テトラデカペプチド、デカペプチドとＤＰ−ＩＸとのカップリングは、実施例１に記載のとおりに行った。実施例（１）に記載したのと同じ手順で、側鎖の保護基を外し、鉄イオンを大環状分子に挿入してから、最終生成物をＲＰ−ＨＰＬＣで精製した（収率２８％）。単一性および目的物であることは、ＬＣ−ＭＳ／ＥＳＩ分析で確認した（３５０９ａｍｕ）。

【実施例10】

【0142】

実施例１に記載の化合物のペルオキシダーゼ活性

【0143】

この実施例では、Ｈ_２Ｏ_２および次の二次基質、ＡＢＴＳおよびグアヤコール、を用いた、化合物Ｆｅ（ＩＩＩ）−３，７，１２，１７−テトラメチルポルフィリン−２（１８）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｈｉｓ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−Ｌｙｓ^１１−Ｉｌｅ^１２−Ｔｈｒ^１３−Ｌｅｕ^１４−ＮＨ_２）−１８（２）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｓｅｒ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−ＮＨ_２）−ジ−プロピオンアミドのペルオキシダーゼ活性について記載する。化合物の合成は実施例１に記載してある。

【0144】

この化合物の二次基質ＡＢＴＳに対するペルオキシダーゼ活性は、Ｈ_２Ｏ_２の存在下でのＡＢＴＳ^＋・ラジカルカチオンの形成を追跡することで評定した。

【0145】

反応は、分光分析手法を用い、反応媒体中の生成物の出現を測定することで追跡した。ＡＢＴＳ^＋・カチオンラジカルの形成は、６６０ｎｍ（λ_ｍａｘ（ε）＝６６０ｎｍ（１．４０×１０^４Ｍ^−１ｃｍ^−１））で追跡した。反応は、５０％ＴＦＥ（ｖ／ｖ）含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中、触媒濃度を２．０×１０^−７Ｍにして行った。

【0146】

化合物の速度パラメーターは、還元基質の濃度を一定にしてＨ_２Ｏ_２濃度を変化させることにより、またその逆を行うことにより、決定した。

【0147】

より詳細には、様々なＨ_２Ｏ_２濃度（０．０１÷２００ｍＭの範囲）で行われた実験では、ＡＢＴＳ濃度は０．１ｍＭで一定に保たれた。様々なＡＢＴＳ濃度（０．００５÷０．１ｍＭの範囲）で行われた実験では、Ｈ_２Ｏ_２濃度は５０ｍＭであった。

【0148】

実験データを、２基質のミカエリス・メンテン速度式に当てはめ、以下の速度パラメーターを得た：Ｋ_ｍ^ＡＨ_２＝８．４±０．２ １０^−２ｍＭおよびｋ_ｃａｔ＝３７０．９±１４ｓ^−１。

【0149】

グアヤコール基質に対するペルオキシダーゼ活性は、グアヤコールの酸化生成物であるテトラグアヤコールの形成を追跡することで評定した。ε_４７０＝２．６６×１０^４Ｍ^−１ｃｍ^−１を考慮に入れて、４７０ｎｍの吸収の変化を測定した。

【0150】

詳細には、様々なＨ_２Ｏ_２濃度（１÷４０ｍＭの範囲）で行われた実験では、グアヤコール濃度は０．１ｍＭで一定に保たれた。様々なグアヤコール濃度（０．００２５÷０．０７の範囲）で行われた実験では、Ｈ_２Ｏ_２濃度は１０ｍＭであった。

【0151】

実験データを、２基質のミカエリス・メンテン速度式に当てはめ、以下の速度パラメーターを得た：Ｋ_ｍ^ＡＨ_２＝９．２±０．４ １０^−２ｍＭおよびｋ_ｃａｔ＝８．０±０．１ｓ^−１。

【0152】

ＡＢＴＳ酸化の場合、ｐＨ＝６．５での比活性は１０４ｍｍｏｌｇ^−１ｓ^−１である。この値は、西洋ワサビペルオキシダーゼの値（９３ｍｍｏｌｇ^−１ｓ^−１、ｐＨ４．６）と同等である。グアヤコール酸化の場合、比活性は西洋ワサビペルオキシダーゼの値の２倍の高さである。

【実施例11】

【0153】

フェノールニトロ化

【0154】

化合物Ｆｅ（ＩＩＩ）−３，７，１２，１７−テトラメチルポルフィリン−２（１８）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｈｉｓ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−Ｌｙｓ^１１−Ｉｌｅ^１２−Ｔｈｒ^１３−Ｌｅｕ^１４−ＮＨ_２）−１８（２）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｓｅｒ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−ＮＨ_２）−ジ−プロピオンアミドについて、フェノールニトロ化を触媒する能力を評定した。化合物の合成は実施例１に記載してある。反応液の分析は、分析ＨＰＬＣにより、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を用い、Ｈ_２Ｏ／０．１％ＴＦＡ（Ａ）とＣＨ_３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（Ｂ）を溶出液として、２０分かけてＢの割合を１０％から９０％に直線的に増加させながら、流速１ｍＬ／ｍｉｎで流して行った。出発物質および生成物の濃度は、市販の試料および４−シアノフェノールを内部標準として用いて作製した較正曲線から求めた。フェノールニトロ化のための標準のインキュベーションは、リン酸緩衝液（ｐＨ６．５、５０％ＴＦＥ（ｖ／ｖ））中、０．２μΜの触媒、２０ｍＭのＮａＮＯ２、および３ｍＭのＨ_２Ｏ_２の存在下、フェノール濃度１ｍＭで行った。

【0155】

反応は、室温で、インキュベーション時間を４０分として行った。反応液をＲＰ−ＨＰＬＣで分析した結果、４−ニトロフェノールおよび２−ニトロフェノール両方の形成が示された。反応時間４０分での４−ニトロフェノールおよび２−ニトロフェノールの収率は、Ｈ_２Ｏ_２、ＮＯ_２⁻、およびフェノールの濃度を上げると増加した。ニトロフェノール類（４−体および２−体）の最大収率は、基質および酸化剤濃度がそれぞれ１．０ｍＭ、ＮＯ_２⁻濃度が４０ｍＭの場合に達成された。

【0156】

これらの条件では、ニトロフェノール類の合計収率は、約１４．８％であった。ラクトペルオキシダーゼの存在下でのニトロフェノール類の合計収率は、この４倍にすぎない。

【実施例12】

【0157】

実施例２に記載の化合物の触媒活性

【0158】

例として、酸化剤としてＨ_２Ｏ_２および還元剤としてＡＢＴＳを用いた場合の、抗体と共有結合した化合物Ｆｅ（ＩＩＩ）−３，７，１２，１７−テトラメチルポルフィリン−２（１８）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｈｉｓ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−Ｌｙｓ^１１−Ｉｌｅ^１２−Ｔｈｒ^１３−Ｌｅｕ^１４−ＮＨ_２）−１８（２）−Ｎ_９^ε−（Ａｃｅ−Ａｓｐ^１−Ｇｌｕ^２−Ｇｌｎ^３−Ｇｌｎ^４−Ｌｅｕ^５−Ｓｅｒ^６−Ｓｅｒ^７−Ｇｌｎ^８−Ｌｙｓ^９−Ａｒｇ^１０−ＮＨ_２）−ジ−プロピオンアミドのペルオキシダーゼ活性について、以下に記載する。化合物の合成は実施例２に記載したとおりである。

【0159】

実験は、５０％ＴＦＥ（ｖ／ｖ）含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中で行った。実施例１０に記載したとおり、触媒反応過程は、６６０ｎｍ（ε＝１４７００Ｍ^−１ｃｍ^−１）でＡＢＴＳ^＋・ラジカルカチオンの形成を追跡することにより評定した。化合物の速度パラメーターは、還元基質の濃度を一定にしてＨ_２Ｏ_２濃度を変化させることにより、またその逆を行うことにより、決定した。

【0160】

より詳細には、最初の実験では、ＡＢＴＳ濃度および結合体濃度を、それぞれ、０．１ｍＭおよび２×１０^−７Ｍで一定に保ち、Ｈ_２Ｏ_２濃度を、１０〜１００ｍＭの範囲で変化させた。次の実験では、Ｈ_２Ｏ_２濃度および結合体濃度を、それぞれ、５０ｍＭおよび２×１０^−７Ｍで一定に保ち、ＡＢＴＳ濃度を０．００５÷０．１ｍＭの範囲で変化させた。

【0161】

実験データを、２基質のミカエリス・メンテン速度式に当てはめ、以下の速度パラメーターを得た：Ｋ_ｍ^ＡＨ_２＝０．１２３ｍＭおよびｋ_ｃａｔ＝９１ｓ^−１。

【実施例13】

【0162】

触媒活性の比較

【0163】

実施例４、５、６、７、８、および９に記載の化合物の触媒活性を、実施例１０の記載と同様にして求めた。

【0164】

Ｈ_２Ｏ_２存在下でのＡＢＴＳ酸化に対する触媒活性について、実施例１、４、５、６、７、８、および９に記載の化合物と、天然型および組換ペルオキシダーゼならびに他の類似体との比較を、以下に記載する。

【0165】

Ｈ_２Ｏ_２を用いたＡＢＴＳ酸化に対する触媒活性

【0166】

【表13】

【0167】

比活性（ｍｏｌｇ^−１ｍｉｎ^−１）に換算した触媒活性も表に記載する。比活性は、触媒１グラムあたり１分あたりに変換される基質のモル数に相当する。実施例に記載した化合物全てについて、中性ｐＨでの比活性は、天然型ペルオキシダーゼよりも高く、その２００倍まで達するものもあり、最大活性の条件（ｐＨ＝４．６）では、ＨＲＰに匹敵するかこれより高いものである。比活性は、先行技術の化合物（ＭＰ８、ＭＰ１１、ＴｏＣＰＰ−１３Ｇ１０、ＴｏＣＰＰ−１４Ｈ７）の比活性よりも高く、その１００，０００倍まで達するものもあり、またミモクロムファミリーの比活性よりも高い。

【0168】

略号の記載

【0169】

アミノ酸の命名および略号については、IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature（Eur. J. Biochem. 1984, 138, pp9）の推奨を参照。「側鎖」は、αアミノ酸のα炭素に結合した任意の鎖を意味する。アミノ酸は、特に記載のない限り、Ｌ型配置のものである。使用したその他の略号は以下のとおり：

【0170】

Ｓｕｅ＝スクシニル、Ａｃｅ＝アセチル、Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ａｓｎ＝アスパラギン、Ｐｒｏ＝プロリン、Ｌｙｓ＝リシン、Ｏｒｎ＝オルニチン、Ｇｌｕ＝グルタミン酸、Ａａｄａ＝α−アミノアジピン酸、Ａｒｇ＝アルギニン、ｈＡｒｇ＝ホモアルギニン、Ｌｅｕ＝ロイシン、Ｇｌｎ＝グルタミン、Ｈｉｓ＝ヒスチジン、ｈＣｙｓ＝ホモシステイン、Ｍｅｔ＝メチオニン、４ＴＡＺ＝β−（４−チアゾリル）−アラニン、５ＴＡＺ＝β−（５−チアゾリル）−アラニン、Ｓｅｒ＝セリン、Ｔｈｒ＝トレオニン、ａＴｈｒ＝アロ−トレオニン、Ｄａｐ＝２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｄａｂ＝２，４−ジアミノ酪酸、Ｉｌｅ＝イソロイシン、Ｇｌｙ＝グリシン、Ａｌａ＝アラニン、Ａｉｂ＝α−アミノイソ酪酸、Ｆｍｏｃ＝フルオレニルメトキシカルボニル、ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸、ｔＢｕ＝ｔｅｒｔ−ブチル、Ｔｒｔ＝トリチル、ＰＢＦ＝２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン、ＤＶＢ＝ジビニルベンゼン、Ｍｍｔ＝メトキシトリチル、ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド、ＰｙＢｏｐ＝ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート、ＨＯＢｔ＝ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＩＤＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン、ＨＡＴＵ＝２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート、ＴＦＥ＝トリフルオロエタノール、ＤＣＭ＝ジクロロメタン、Ｂｏｃ＝ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、ｓｕｌｐｈｏ−ＳＭＣＣ＝スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）＝シクロヘキサン−１−カルボキシラート、ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸塩、ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム、ＡＢＴＳ＝２，２’−アジノ−ビス−３−エチル−ベンゾチアジン−６−スルホン酸、ＤＰ−ＩＸ＝ジュウテロポルフィリンＩＸ。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]