特許 6019540 抗原特異的又はリガンド特異的結合タンパク質の同定

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6019540

(24)【登録日】2016年10月14日

(45)【発行日】2016年11月2日

(54)【発明の名称】抗原特異的又はリガンド特異的結合タンパク質の同定

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20161020BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20161020BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20161020BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALI20161020BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12Q1/02

   C12N5/10

   C12N5/0781

【請求項の数】19

【全頁数】74

(21)【出願番号】特願2014-250886(P2014-250886)

(22)【出願日】2014年12月11日

(62)【分割の表示】特願2010-549052(P2010-549052)の分割

【原出願日】2009年3月4日

(65)【公開番号】特開2015-97528(P2015-97528A)

(43)【公開日】2015年5月28日

【審査請求日】2014年12月18日

(31)【優先権主張番号】08004096.7

(32)【優先日】2008年3月5日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】61/125,886

(32)【優先日】2008年4月29日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】510240262

【氏名又は名称】４−アンチボディ アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】100071054

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 高久

(72)【発明者】

【氏名】グラヴンダー ウルフ

(72)【発明者】

【氏名】シュティッツ ヨーン

【審査官】 柴原 直司

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００４−５３２６４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第０３／０８３０７５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Roitt, I.外著/多田富雄監訳, 「免疫学イラストレイテッド」, 原書第5版, 株式会社南江堂, (2000), p.93-106

【文献】 Immunol. Lett., (2005), 97, [1], p.69-80

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

所望の抗原又はリガンドに対して特異的な、膜結合型抗体の産生をもたらす重鎖の定常領域を含む抗体又はその重鎖を組換え技術によって細胞表面上に発現する、安定的に形質導入された少なくとも１つの脊椎動物宿主細胞を単離及び同定する方法であって、
（ａ）複製能のないレトロウイルス粒子を用いることによって、前記抗体又はその重鎖を発現して形質導入された宿主細胞表面上に提示する能力を有するように、前記少なくとも１つのレトロウイルス発現コンストラクトを宿主細胞ゲノムに安定的に組み込むことで、前記抗体又はその重鎖をコードする少なくとも１つのレトロウイルス発現コンストラクトを脊椎動物宿主細胞に形質導入するステップと、
前記脊椎動物宿主細胞は、前記抗体又はその重鎖の膜付着を促進するＩｇα及びＩｇβ分子を内因性発現する前駆Ｂリンパ球であり、かつ内因性抗体ポリペプチドおよび少なくとも１つの代替軽鎖成分を発現することができない、
（ｂ）前記抗体又はその重鎖を前記脊椎動物宿主細胞内で安定発現させ、前記脊椎動物宿主細胞表面上に提示させるステップと、
（ｃ）特異的な抗原結合性を呈する細胞を非結合性細胞集団から分離して、前記所望の抗原又はリガンドと高い親和力を持つ高親和性の抗原結合体を選択的に単離することにより、前記抗体又はその重鎖を発現する脊椎動物宿主細胞を、前記所望の抗原又はリガンドと結合するその能力に基づき濃縮するステップと、
（ｄ）前記レトロウイルスで形質導入し、濃縮した脊椎動物宿主細胞から、その細胞表面上の前記所望の抗原またはリガンドに対して特異的な前記抗体又はその重鎖を発現する、安定的に形質導入された少なくとも１つの脊椎動物宿主細胞を単離及び同定するステップと、
を含む、方法。

【請求項2】

ステップ（ｄ）の前に、前記濃縮した脊椎動物宿主細胞を組織培養で増殖させるステップがある、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ステップ（ｃ）の後に、前記濃縮した脊椎動物宿主細胞を組織培養で増殖させるステップがあり、その後、請求項１に記載のステップ（ｃ）が少なくとも１回繰り返される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記レトロウイルス形質導入が、０．１以下の感染多重度で実施される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記抗体が完全長抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記脊椎動物宿主細胞が、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、ブタと、ヒツジと、ウシと、ウマと、マウス、ラット、ウサギ、及びモルモットを含むげっ歯類とを含む哺乳類からなる種の群に由来する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記脊椎動物宿主細胞の細胞種がマウスである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記完全長抗体が、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、及びキメラ抗体からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。

【請求項9】

前記少なくとも１つの発現コンストラクトが、（ｉ）ある抗体重鎖配列及び複数の抗体軽鎖配列、又は（ｉｉ）ある抗体軽鎖配列及び複数の抗体重鎖配列をコードする複数の発現コンストラクトである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記抗体又はその重鎖が、レトロウイルス形質導入時に可変結合ドメインのコード配列を生成するためＶ（Ｄ）Ｊ組換えを可能にする前記少なくとも１つのレトロウイルス発現コンストラクトによりコードされる可変結合ドメインを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

ステップ（ｂ）が、突然変異を誘発する条件下で実施される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記レトロウイルスで形質導入された脊椎動物宿主細胞における前記抗体又はその重鎖の発現が、
（ａ）少なくとも１つの抗生物質選択マーカー、
（ｂ）少なくとも１つのスクリーニングマーカー、及び／又は
（ｃ）それらの組み合わせ、
と操作可能に接続され、前記抗体又はその重鎖の発現が、少なくとも１本の内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）を用いて関連する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記少なくとも１つのスクリーニングマーカーが、
（ｉ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）からなる群から選択される蛍光タンパク質、又は
（ｉｉ）ＣＤ７、ＣＤ３４、及び低親和性神経成長因子受容体からなる群から選択される細胞表面マーカー、
である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記濃縮ステップ（ｃ）が、
（ｉ）蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、
（ｉｉ）顕微操作、又は
（ｉｉｉ）固定化した抗原又はリガンドに対するパニング法、
を用いて、細胞を非結合集団と物理的に分離することにより実施される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法によって得られる少なくとも１つの前駆Ｂリンパ球。

【請求項16】

少なくとも１つの前駆Ｂリンパ球が、膜結合型抗体の産生をもたらす重鎖の定常領域を含む抗体又はその重鎖を発現して細胞表面上に提示する能力を有するように、ゲノムに安定的に組み込まれ、かつ所望の抗原またはリガンドに対して特異的な前記抗体またはその重鎖をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、少なくとも１つのレトロウイルス発現コンストラクトを有し、
前記抗体又はその重鎖の膜付着を促進するＩｇα及びＩｇβ分子を内因性発現し、
内因性抗体ポリペプチドおよび少なくとも１つの代替軽鎖成分を発現することができない、
少なくとも１つの前駆Ｂリンパ球。

【請求項17】

前記抗体が、完全長抗体である、請求項１５または１６に記載の少なくとも１つの前駆Ｂリンパ球。

【請求項18】

前記少なくとも１つのレトロウイルス発現コンストラクトが、
（ｉ）抗体重鎖配列及び複数の抗体軽鎖配列、または
（ｉｉ）抗体軽鎖配列及び複数の抗体重鎖配列
をコードする複数の発現コンストラクトである、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の少なくとも１つの前駆Ｂリンパ球。

【請求項19】

前記少なくとも１つの前駆Ｂリンパ球が、複数の前駆Ｂリンパ球であって、
それぞれの前駆Ｂリンパ球が、異なる前記抗体又はその重鎖を発現して細胞表面上に提示するように形質導入されている、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の少なくとも１つの前駆Ｂリンパ球。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、脊椎動物細胞内においてインビトロで結合タンパク質の多様なコレクションを生成、発現、及びスクリーニングするための新規方法を開示し、これによりリガンド反応性又は抗原反応性結合タンパク質の同定及び単離が可能となる。特に、本発明は、所望の抗原又はリガンドに対して特異的な、例えば抗体又はその断片などの結合タンパク質をコードする少なくとも１本のヌクレオチド配列をレトロウイルスにより発現させて、単離し、及び同定するための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ディスプレイ技術は、極めて多くの障害及び疾患における診断及び治療用途の特定の高親和性結合タンパク質の単離において、重要な役割を果たしている。こうした技術は、抗体工学、合成酵素、プロテオミクス、及び無細胞タンパク質合成といった広範な分野に及ぶ。生体分子のディスプレイ技術は、モジュール単位でコードされる生体分子の大規模なプールの構築、特性選択のためのそれらの提示、及びそれらの構造の迅速な特性決定（解読）を可能とするもので、タンパク質多様性の獲得及び分析を大規模に行うのに特に有用である。最近では、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ及び微生物ディスプレイによる抗体の単離から、インビトロディスプレイ技術がひときわ認知されるようになっており、今や抗体工学及びタンパク質工学の主流のプラットフォームとなっている。しかしながら、微生物による発現及び提示系は、特に、抗体のような大型の二量体脊椎動物タンパク質の発現については、制約を被る。これは、かかる発現系では、操作された抗体断片の提示が必要であるのに一般に完全長抗体を発現できないことが原因であると同時に、グリコシル化の欠如、シャペロンタンパク質の不在、細胞内コンパートメントの欠如、及び真核細胞特異的タンパク質輸送（これらは、個々に、及びまとまって、微生物により発現する哺乳類タンパク質にタンパク質フォールディングのアーチファクトをもたらす）も原因である。最近では、酵母、植物及び哺乳類細胞を含む真核宿主細胞を用いるインビトロディスプレイ法も開発されている。酵母及び植物細胞発現系もまた、グリコシル化の欠如並びに特定の脊椎動物及び哺乳類細胞に特異的なシャペロンの欠如を被り、従って、かかる系における脊椎動物タンパク質の発現には、タンパク質フォールディングに関して同じ制約が該当する。抗体のような大型の組換えタンパク質の発現、適切なタンパク質フォールディング及び翻訳後修飾は、理想的には系統的に最も近縁の細胞系内でタンパク質を発現する、脊椎動物発現系においてのみ、妥当な効率性及び品質で起こると予想され得る。

【0003】

従って、げっ歯類又はヒト由来の抗体のように治療上有益なタンパク質は、理想的にはげっ歯類又はヒトの細胞内で発現されるとともに、臨床級の治療用完全長抗体の産生に、かかる種由来の発現系のみが規制当局によって認可されることは当然である。しかしながら、脊椎動物及び哺乳類の細胞をベースとする発現系は手間がかかり、安定的に産生する細胞系及びクローンを樹立するのに必要なタイムフレームが長く、且つかかる細胞の効率的で制御された遺伝子改変は多くの場合に単純ではないため、こうした系はスクリーニング及び提示の方法としてはそれほど魅力的なものとはならない。例えば、ＤＮＡトランスフェクション法は、トランスフェクト細胞に一時的に、或いは安定的に組み込むＤＮＡコンストラクトの数を制御することができず、タンパク質ライブラリ、従って純粋な遺伝子のクローン発現による表現型スクリーニングが妨げられる。代替的なウイルス系は、クローン発現の適切な制御、遺伝子コンストラクトの安定的な維持が欠如しているか、及び／又はかかる系は標的細胞に細胞変性効果（例えばワクシニアウイルス発現）を引き起こすことが多いという事実を被り、従ってタンパク質クローンは、例えば、抗原に対する特異的結合性などの特定の表現型について、提示することができないか、及び／又は連続的に濃縮することができない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

従って、本発明の目的は、先行技術の原核生物及び真核生物遺伝子発現系及び選択系についての上述した制約及び欠点を全て明確に克服する方法を提供することである。本発明に係る方法は、特に、哺乳類細胞、特にＢリンパ球細胞系における抗体などの結合タンパク質の安定したレトロウイルス発現を利用するものであり、それにより、適切なグリコシル化、シャペロンタンパク質及びタンパク質輸送があるなかでの抗体タンパク質の安定発現、好ましくはクローン発現が実現され、適切なタンパク質フォールディングが確実に起こるとともに、抗原結合性の抗体クローンについての効率的な、且つ必要であれば反復的なスクリーニングが可能となる。本発明に係る方法の好ましい実施形態は、前駆リンパ球内での抗体又はその断片のレトロウイルス発現に基づくことから、本明細書に開示される技術を、「レトロ細胞ディスプレイ（Ｒｅｔｒｏｃｙｔｅ Ｄｉｓｐｌａｙ）」（レトロウイルスプレＢリンパ細胞ディスプレイ（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｐｒｅＢ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｄｉｓｐｌａｙ）による）と称する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明は、概して、治療用又は診断用抗体又はその断片の提供に関する。特に、本発明は、治療用途に有益な、完全ヒトアミノ酸配列を有する抗原反応性抗体の同定及び選択に関する。本発明の実施形態は、脊椎動物細胞、好ましくは哺乳類細胞内で抗体又はその断片を含む結合タンパク質の多様なコレクションを発現可能とするレトロウイルス発現ベクター、及びリガンド反応性又は抗原反応性分子の効率的な単離方法を含む。本発明は、３つの代替的な方法により、抗体又はその断片などの結合タンパク質の多様なコレクションを生成するための新規方法を提供する。第一には、軽鎖又は重鎖の多様なコレクション（ライブラリ）に対する少なくとも１個の重鎖又は軽鎖分子の鎖シャフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）によるものであり（鎖シャフリング手法）、又は第二には、インサイチュでの脊椎動物細胞へのレトロウイルス形質導入後に、レトロウイルスにより形質導入した発現コンストラクトの体細胞突然変異により、抗体重鎖と軽鎖との少なくとも１つの組み合わせを多様化させることによるものであり（体細胞突然変異手法）、又は第三には、抗体の可変結合ドメインのコード領域であって、「準生殖細胞系（ｑｕａｓｉ−ｇｅｒｍｌｉｎｅ）」配置にある、すなわち、Ｖ、場合によりＤ及びＪ遺伝子セグメントになお分かれているコード領域を含む、レトロウイルスにより形質導入した発現コンストラクトの、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えによるものである（Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え手法）。抗体又はその断片を含む結合タンパク質の多様なコレクションは、上述の方法を任意に組み合わせることによっても生成され得ることが理解されるべきである。好ましくは、前記結合タンパク質又は抗体若しくはその断片は、前駆リンパ球の表面に提示される。

【0006】

本発明は、特に、レトロウイルス形質導入を用いて、脊椎動物細胞内で結合タンパク質、好ましくは抗体の多様なコレクションを安定発現、場合によりクローン発現させる方法を提供し、それにより、当該技術分野において公知の、プラスミドベース又は組込みのないウイルスベースの代替的な脊椎動物発現系と比較して、結合タンパク質コード遺伝子の増幅、単離、及びクローニングが大幅に促進される。代表的な、しかし非限定的な例として、内因性抗体を発現することができず、従って宿主細胞において膜結合型抗体として異種の組換え抗体しか発現しないマウス前駆リンパ球のレトロウイルス形質導入が開示される。さらに、本発明は、抗原反応性の結合細胞の集団について繰り返し濃縮し、続いてそこから、抗原反応性又はリガンド反応性の結合タンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野において公知の標準的な分子生物学的手順によってクローニング及び配列決定することができるように、リガンド反応性又は抗原反応性の結合タンパク質、例えば抗体又はその断片を発現する細胞を、どのように単離し、場合によりインビトロで増殖させることができるかについて説明する（図１）。

【0007】

本発明に係る方法の好ましい実施形態は、結合タンパク質、好ましくはヒト完全長抗体のレトロウイルス発現に関するが、これは、その任意の断片（例えば、抗体の単鎖Ｆ_ｖ又はＦ_ａｂ断片）の発現に対しても同様に用いることができる。レトロウイルス形質導入プロトコルが開示され、これは、場合により、（ｉ）宿主細胞内での結合タンパク質のクローン発現を確実にするための、単一の結合タンパク質をコードするコンストラクトの単一の標的細胞への送達；（ｉｉ）第１のポリペプチド鎖をコードする少なくとも１つの発現コンストラクトと、第２のポリペプチド鎖をコードする少なくとも１つの発現コンストラクトとのシャフリングと、それによる機能的多量体結合タンパク質（例えば、抗体分子）の生成；（ｉｉｉ）インサイチュで脊椎動物細胞に形質導入したときの、少なくとも１つの結合タンパク質をコードする少なくとも１つの発現コンストラクトの体細胞突然変異；及び（ｉｖ）インサイチュで脊椎動物細胞にレトロウイルス形質導入したときの、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え機構による少なくとも１つの発現コンストラクトからの結合タンパク質発現の生成、を可能とする。

【0008】

結合タンパク質をコードするコンストラクトのインサイチュでの体細胞突然変異を実現するため、レトロウイルス発現ベクター及びそれらの利用法が開示され、ここで、前記ベクターは、タンパク質コード配列を標的として体細胞超突然変異を生じさせるシス調節遺伝子要素を含み、これは、好ましくは活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）経路を介するか（Ｐａｐａｖａｓｉｌｉｏｕ ＆ Ｓｃｈａｔｚ，２００２）、又は結合タンパク質コード配列を標的として体細胞突然変異を生じさせる他の酵素を用いることによるものである。結合タンパク質、好ましくは抗体又はその断片の多様なコレクションを、インサイチュでＶ（Ｄ）Ｊ組換えにより生成するための、レトロウイルスベクターコンストラクト及びその利用法が開示され、ここで、前記コンストラクトは、「準生殖細胞系」配置に配列された、可変部（Ｖ）、場合により多様性（Ｄ）、及び接合部（Ｊ）遺伝子セグメントを含み、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えとして公知のプロセスにより遺伝子セグメントが組換え活性化遺伝子（ＲＡＧ）の媒介によって再配列されることを通じて、免疫グロブリン又は免疫グロブリン様結合タンパク質のコード領域を構築することが可能である（Ｇｒａｗｕｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。

【0009】

さらなる態様に従えば、本発明は、組換え結合タンパク質の多様なコレクションを安定的に発現するレトロウイルス形質導入細胞を、続いて少なくとも１つの対象のリガンド又は抗原と結合することにより標識する方法、及び前述の対象のリガンド又は抗原と結合する細胞を、適当な二次試薬により検出する方法についてさらに説明する。好ましくは高速蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）により、リガンド反応性又は抗原反応性細胞を特異的に標識し、及びそれらを濃縮又は単離するための方法が開示される。レトロウイルス形質導入細胞は安定発現の表現型であるため、場合により抗原反応性細胞を単離し、組織培養で再び増殖させてもよく、それにより、場合により、抗原の標識と、抗原特異的な濃縮と、リガンド反応性又は抗原反応性細胞の増殖との反復サイクルを実施することができ、最終的に細胞のサブクローニングを実施し、標準的なＰＣＲクローニング法により抗原反応性抗体のヌクレオチドコード領域を同定することが可能となる方法について記載される（図１）。

【0010】

本明細書に開示される方法は、少なくとも１つのベクターコンストラクトから抗体鎖又はその断片の多様なコレクションを発現させることが可能であり、このベクターコンストラクトは、脊椎動物細胞にインサイチュで導入し、発現させると、場合により多様な結合タンパク質のコレクションを生じ得る。脊椎動物細胞内での抗体鎖の発現は、好ましくはレトロウイルス形質導入によって媒介される。

【0011】

そのため、本発明の第１の態様は、所望の抗原又はリガンドに対して特異的な抗体又はその断片をコードする少なくとも１本のヌクレオチド配列を単離及び同定する方法に関し、この方法は、
（ａ）抗体又はその断片をコードする少なくとも１つのレトロウイルス発現コンストラクトを脊椎動物宿主細胞に形質導入するステップと、
（ｂ）前記抗体又はその断片を前記脊椎動物宿主細胞内で発現させるステップと、
（ｃ）前記抗体又はその断片を発現する脊椎動物宿主細胞を、前記所望の抗原又はリガンドと結合するその能力に基づき濃縮するステップと、
（ｄ）レトロウイルスで形質導入し、濃縮した脊椎動物宿主細胞から、前記抗体又はその断片をコードする前記少なくとも１本のヌクレオチド配列を単離及び同定するステップと、
を含む。

【0012】

前述のステップに加え、ステップ（ｄ）の前に、濃縮した脊椎動物宿主細胞を組織培養で増殖させるステップがあってもよい。さらに、ステップ（ｃ）の後に、濃縮した脊椎動物宿主細胞を組織培養で増殖させるステップがあって、その後、ステップ（ｄ）が実行される前に、ステップ（ｃ）が少なくとも１回繰り返されてもよい。

【0013】

少なくとも１つの抗体のクローン発現を実現するためには、レトロウイルスが形質導入した細胞の大部分が、宿主細胞ゲノムに組み込む抗体鎖１本につき１つのみの組換えレトロウイルスコンストラクトによって遺伝的に改変されるようにして、レトロウイルス形質導入を制御することが好ましい。従って、本発明の一実施形態において、レトロウイルス形質導入は０．１以下の感染多重度（ＭＯＩ）で実施される。

【0014】

本発明の方法に係る抗体は、好ましくは完全長抗体である。抗体の断片は、重鎖、軽鎖、単一のＶ_Ｈドメイン、単一のＶ_Ｌドメイン、ｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、及びＦ（ａｂ’）２断片からなる群から選択され得る。抗体又はその１つ若しくは複数の断片は、天然に存在するアミノ酸配列か、人工的に操作されたアミノ酸配列か、又はそれらの組み合わせを有し得る。

【0015】

本発明の方法は、好ましくは、抗体鎖をコードする少なくとも１本のヌクレオチド配列の単離及び同定に用いられるが、当業者には、本発明の方法が、Ｉｇスーパーファミリーに属する任意の単量体若しくは多量体細胞表面受容体、及びその任意の機能的断片、又はＴＮＦα受容体スーパーファミリーに属する単量体若しくは多量体細胞表面受容体、若しくはその任意の断片をコードする少なくとも１本のヌクレオチド配列の単離及び同定にも用いられ得ることは明らかであろう。

【0016】

さらに、結合タンパク質が完全長抗体である場合、その完全長抗体は、完全ヒト抗体と、１つ又は複数の非ヒト抗体のＣＤＲ領域がヒト抗体フレームワークにグラフトされたヒト化抗体と、ある脊椎動物種由来の可変領域ドメインが別の脊椎動物種の定常領域ドメインと組み合わされるキメラ抗体であって、その定常ドメインが、好ましくは１つ又は複数のヒト抗体に由来するキメラ抗体とからなる群から選択される。

【0017】

本明細書に開示される方法のある実施形態において、脊椎動物宿主細胞は、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類及び哺乳類を含む種の群に由来し得る。哺乳類種の群には、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ及びげっ歯類が含まれ得る。さらにげっ歯類の群には、マウス、ラット、ウサギ及びモルモットが含まれ得る。本発明の好ましい実施形態において、脊椎動物宿主細胞種はマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）である。

【0018】

本発明の方法に用いられる脊椎動物宿主細胞は、任意の脊椎動物の器官に由来してもよく、但し、好ましくはリンパ球系列細胞に由来する。本発明に用いられる好ましいリンパ球はＢ細胞系列のものであり、これは、こうした細胞が抗体特異的なシャペロンタンパク質を発現することと、こうした細胞内では、Ｉｇα及びＩｇβなどの、抗体の細胞表面への固定を媒介するのに必要なアクセサリー分子が発現することとが理由である。より好ましくは、Ｂ細胞は前駆Ｂリンパ球であり、これは、プレＢ細胞がいかなる内因性抗体鎖も発現しないことが認められ得るためである。事実、本発明で利用されるものとして好ましいリンパ球は、いわゆる代替軽鎖の成分を含め、遺伝子λ５、ＶｐｒｅＢ１及びＶｐｒｅＢ２によってコードされる内因性抗体ポリペプチドを発現することができない。従って、好ましいリンパ球は、Ｂ細胞特異的なＩｇα及びＩｇβ分子などの抗体分子の膜付着（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）を促進するアクセサリー膜タンパク質は発現するが、しかし、いかなる内因性抗体ポリペプチドも代替軽鎖成分も発現しない。しかしながら、当該技術分野において公知の方法、例えば、こうしたタンパク質の発現ベクターを安定的にトランスフェクトすることにより、Ｉｇα及びＩｇβ分子を異所的に発現させることが可能であり得ることは留意されるべきである。本発明の好ましい実施形態において、抗体分子は、内因的に発現したＩｇα及びＩｇβタンパク質を介してリンパ球の細胞膜に固定され、これらのＩｇα及びＩｇβタンパク質は、マウスプレＢリンパ球内では天然に発現する。

【0019】

本明細書に開示される方法は、対象のリガンド又は抗原に対して所望の結合特性を示す細胞の単離、及び対象とする所望の結合タンパク質をコードする遺伝子の単離を可能にする手順を含む。本明細書に開示される、脊椎動物細胞内で抗体をレトロウイルスによって発現させる好ましい方法により、抗体の安定発現、好ましくはクローン発現が可能となり、当該技術分野において公知の、プラスミドベース又は組込みのないウイルスベースの代替的な脊椎動物発現系と比較して、抗体をコードする遺伝子の増幅、単離、及びクローニングが大幅に促進される。本開示の方法は、
（ｉ）多量体結合タンパク質の少なくとも１本のポリペプチド鎖（例えば、抗体の重鎖等）をコードする少なくとも１つの発現コンストラクトの、少なくとも１本の対応するポリペプチド鎖（例えば、抗体の軽鎖等）をコードする少なくとも１つの発現コンストラクトとのシャフリングと、それによる機能的多量体結合タンパク質（例えば、抗体等）の生成、
（ｉｉ）インサイチュで脊椎動物細胞に導入したときの、少なくとも１つの結合タンパク質をコードする少なくとも１つの発現ベクターの体細胞突然変異、
（ｉｉｉ）インサイチュで脊椎動物細胞に導入したときの、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えとして公知のプロセスによる、少なくとも１つの発現ベクターに含まれる免疫グロブリン及び免疫グロブリン様分子の可変結合ドメインをコードするＶ（可変部）、場合によりＤ（多様性）、及びＪ（接合部）遺伝子セグメントの体細胞組換え、又は
（ｉｖ）手順（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の任意の組み合わせ、
のいずれかにより、インビトロで結合タンパク質の多様なコレクションを効率的に生成することを可能にする。

【0020】

好ましい実施形態に従えば、少なくとも１本のヌクレオチド配列は、ある抗体重鎖配列と複数の抗体軽鎖配列とを含むか、又は−代替的に−ある抗体軽鎖配列と複数の抗体重鎖配列とを含む複数のヌクレオチド配列である。

【0021】

別の好ましい実施形態に従えば、抗体又はその断片は可変結合ドメインを含み、このドメインは、レトロウイルス形質導入時に可変結合ドメインのコード配列を生成するためＶ（Ｄ）Ｊ組換えを可能にする少なくとも１つのレトロウイルス発現コンストラクトによりコードされる。

【0022】

さらに好ましい実施形態において、上記の方法のステップ（ｂ）は、突然変異を誘発する条件下で、好ましくは、内因的に、或いは異所的に発現する活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）の発現を介して実施され、ここでＡＩＤの異所性発現は、誘導可能な条件下で実施される。

【0023】

上記の方法の一態様において、前記抗体又はその断片をコードする少なくとも１つのレトロウイルス発現コンストラクトは、その発現コンストラクトによってコードされる可変結合ドメインを標的としてＡＩＤ媒介性の体細胞突然変異を生じさせることが可能なシス調節性のプロモーター要素とエンハンサー要素との組み合わせを含み、ここでプロモーター要素及びエンハンサー要素は、
（ａ）免疫グロブリン重鎖プロモーター要素、イントロンエンハンサー（ＥμＨ）要素及び３’αエンハンサー要素、
（ｂ）免疫グロブリンκ軽鎖プロモーター要素、κイントロンエンハンサー（κｉＥ）要素及び３’κエンハンサー（３’κＥ）要素、
（ｃ）免疫グロブリンλ軽鎖プロモーター要素、λ２−４エンハンサー要素及びλ３−１エンハンサー要素、並びに
（ｄ）それらの任意の機能的な組み合わせ、
からなる群から選択される。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】この図は、所望の抗原又はリガンドに対して特異的な抗体などの結合タンパク質の同定及び単離を可能にする「レトロ細胞ディスプレイ」の原理を示す。第１のステップにおいて、結合タンパク質の多様なコレクションの発現を生じさせることのできる少なくとも１つのレトロウイルス発現コンストラクトが、好適な脊椎動物宿主細胞（「選択用細胞（ｓｅｌｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）」）に安定的に形質導入される。これは、少なくとも１つの結合タンパク質をコードする少なくとも１つのレトロウイルスベクターを、レトロウイルスパッケージング細胞にトランスフェクトすることにより達成され（ステップ１）、このパッケージング細胞は、レトロウイルスタンパク質Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＥｎｖを構成的に、又は一時的に発現し得る。その後、少なくとも１つのレトロウイルス結合タンパク質コンストラクトをトランスフェクトしたパッケージング細胞が、トランスフェクション後２４〜７２時間以内に、少なくとも１つのレトロウイルス発現コンストラクトを含む組換えレトロウイルス粒子を産生する。結果として生じるレトロウイルス粒子は、レトロウイルスパッケージング細胞の細胞培養上清に蓄積し、これを用いて好適な脊椎動物宿主細胞（「選択用細胞」）を形質導入することができ（ステップ２）、その後この宿主細胞が結合タンパク質を発現する。好ましい方法では、抗体又はその断片などの結合タンパク質は「選択用細胞」の細胞表面上に発現し、次に細胞は、所望の抗原又はリガンドで標識される（ステップ３）。次に、抗原又はリガンドの結合した細胞は、好ましくは蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）により分析され、好ましくは予備的な高速ＦＡＣＳにより特異的な抗原結合性を呈する細胞が非結合性細胞集団と分離される（ステップ４）。抗原反応性又はリガンド反応性細胞は、場合により組織培養で再び増殖させてもよく、及びレトロウイルス形質導入細胞は安定発現の表現型であるため、検出可能な抗原反応性又はリガンド反応性細胞集団が得られる時点まで、抗原特異的細胞分取と組織培養増殖とのサイクルを繰り返してもよい。この抗原反応性又はリガンド反応性細胞集団は、最終的な好ましい単細胞分取ステップに供されてもよく、又は集団ベースでの結合タンパク質コード遺伝子のクローニングに直接用いられてもよい。次のステップ（ステップ５）では、当該技術分野において公知の標準方法により、結合タンパク質ライブラリに対して特異的な、及び／又は他のベクター配列に対して特異的な配列と結合するプライマー対を用いるＲＴ−ＰＣＲ又はゲノムＰＣＲによって、抗原選択的又はリガンド選択的細胞プール又は細胞クローンから、関連する結合ドメインのコード領域がクローニングされる。次に、場合により、クローニングし、配列決定した結合タンパク質のコード領域を、選択した任意の発現系において組換えタンパク質として発現させて、機能に関する特性決定をさらに行い、抗原又はリガンドに対する結合特異性を確認してもよい（ステップ６）。

【図2a】（ａ）この図は、抗体又は免疫グロブリン及びその断片の概略的構造を示し、これらは開示される本発明に係る好ましい結合タンパク質である。図２ａ）はＩｇＧ抗体の概略的構造を示す（左）。ＩｇＧ抗体は、特徴的なＹ字型構造を特徴として、２本の同一の免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖及び軽鎖からなり、重鎖及び軽鎖は、それぞれ、４つの免疫グロブリンドメイン（Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３）及び２つの免疫グロブリンドメイン（Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌ）を含む。Ｖドメインは、ＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖の高度に可変的な抗原結合領域であり、一方、Ｃ_Ｈ及びＣ_Ｌドメインは定常領域ドメインに相当する。ＩｇＨ鎖の可変領域ドメインは、Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントによってコードされ、一方、ＩｇＬ鎖の可変領域ドメインは、Ｖ及びＪ遺伝子セグメントのみによってコードされ、これらの遺伝子セグメントは、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えとして公知のプロセスにより、初期Ｂリンパ球新生の間に生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子座から組み立てられる必要がある（図２ｂ）及び２ｃ）。抗体ＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖は、ジスルフィド架橋により共有結合で一体に保持される。ジスルフィド架橋は、可動性のヒンジ領域、すなわちＣ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメインとの間に近い位置で同一のＩｇＨ鎖を共に連結し、一方、図示されるとおりの、Ｃ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｌドメインとの間のさらなるジスルフィド架橋が、ＩｇＨ鎖とＩｇＬ鎖とを共有結合で連結する（図２ａ左）。Ｆａｂ断片は、完全長抗体の一価の断片であって、天然のジスルフィド架橋により連結されるＶ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１／Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌドメインのみを含み、これは、完全長抗体から酵素的なパパイン切断によって得ることもでき、又はＣ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３欠失ＩｇＨ鎖をＩｇＬ鎖と共に発現させることにより、組換えタンパク質として発現させることもできる。完全ヒト抗体の別の断片は、単鎖可変ドメイン断片（ｓｃＦｖ断片）であり、これは、合成リンカー又は人工的なジスルフィド架橋によって連結されるＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖の可変領域ドメインのみを含む。完全長抗体、又は図示されるＦａｂ断片及びｓｃＦｖ断片のような抗体断片のいずれの発現も、本発明を実現するための結合タンパク質として発現させ得る。

【図2b】図２ｂ）は、生殖細胞系ＩｇＨ鎖の対立遺伝子上で生じ、結果として抗体Ｖ_Ｈドメインのコード領域を組み立てるＶ（Ｄ）Ｊ組換えのプロセスを概略的に図示する。脊椎動物種におけるＩｇＨ鎖の可変ドメインは、複数のＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントによってコードされ、これらの遺伝子セグメントは、生殖細胞系の配置では分離している。初期Ｂリンパ球新生のなかでＶ（Ｄ）Ｊ組換えが起こる間、１つの選択されたＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントが部位特異的に再配列され、抗体Ｖ_Ｈドメインに固有のコード領域が生成される。ＩｇＨ鎖の遺伝子座におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えは順序立てられたプロセスであり、通常、双方のＩｇＨ鎖対立遺伝子上での、ある特定のＤ遺伝子セグメントの、ある特定のＪ遺伝子セグメントとの再配列から開始される。Ｄ遺伝子がＪ遺伝子に対して再配列されて初めて、１つの特定のＶ領域が、既に組み立てられたＤＪ領域に部位特異的に接合し、それによりＶ_ＨドメインをコードするＶ−Ｄ−Ｊ ＯＲＦが生成される。Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えのプロセスは、前駆リンパ球特異的な組換え活性化遺伝子（ＲＡＧ）１及び２の発現に依存する。

【図2c】図２ｃ）は、生殖細胞系ＩｇＬ鎖の対立遺伝子上で生じ、結果として抗体Ｖ_Ｌドメインのコード領域を組み立てるＶ（Ｄ）Ｊ組換えのプロセスを概略的に図示する。脊椎動物種におけるＩｇＬ鎖の可変ドメインは、Ｖ及びＪ遺伝子セグメントのみによってコードされ、これらの遺伝子セグメントは、ＩｇＨ鎖の遺伝子座における遺伝子セグメントと同様に、生殖細胞系の配置では分離している。抗体Ｖ_Ｌドメインの生成は、図示されるとおり、ただ１つの部位特異的Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え現象を必要とするのみである。

【図3a】この図は、レトロウイルス形質導入によって抗体などの対象の結合タンパク質（ＢＰＯＩ）（或いは「Ｘ」で表される）を発現させるための標的細胞の安定的な遺伝子改変の原理を概略的に示す。図３ａ）は、野生型レトロウイルスゲノムの概略的な構成を図示し（左上）、ここで、構造及び機能タンパク質であるＧａｇ、Ｐｏｌ及びＥｎｖの遺伝子は、レトロウイルスゲノムに隣接するいわゆる５’長末端反復（ＬＴＲ）配列と３’ＬＴＲ配列との間に位置する。５’ＬＴＲは、レトロウイルス遺伝子の発現に、及び感染宿主細胞内でのレトロウイルスゲノムの複製にも重要である。レトロウイルスゲノムにおけるもう一つの重量な領域は、Ψ（プサイ）パッケージングシグナルであり、これは、レトロウイルス粒子の複製及び／又は産生中、レトロウイルスＲＮＡをパッケージングするために必要なものである。組換えレトロウイルス粒子を生成するには、野生型レトロウイルスゲノムから、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子が除去され、それにより５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲ及びΨ（プサイ）パッケージングシグナルのみが残され得る。次に、組換えレトロウイルスベクターを構築するため、いくつかの固有の、且つ好都合な制限酵素部位を含む多重クローニング部位（ＭＣＳ）を導入することが好都合である。上／右に図示されるとおりのこの設計は、最も単純なレトロウイルス導入ベクターに相当する。５’ＬＴＲ領域は、下流に位置する任意の遺伝子の発現を駆動することのできるプロモーター活性を有するため、抗体などの組換えタンパク質（例えば、対象の結合タンパク質（ＢＰＯＩ）「Ｘ」）を発現させることが可能な組換えレトロウイルスを発現させるためには、最小限、「空の」レトロウイルス導入ベクターにＢＰＯＩのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を挿入すればよい。しかしながら、発現レベルを向上させるため、対象の遺伝子（例えば、ＢＰＯＩ−「Ｘ」）の発現は、場合により別の異種プロモーター（Ｐｒｏｍ．）によって駆動されてもよく、且つマーカー遺伝子を、例えば、ここに図示されるとおり、５’ＬＴＲプロモーター及びΨパッケージングシグナルの下流に任意に付加することにより、レトロウイルスで形質導入したコンストラクトの選択及び／又は追跡を可能としてもよい。

【図3b】図３ｂ）は、抗体などのＢＰＯＩ−「Ｘ」の安定発現をもたらす標的細胞のレトロウイルス形質導入の手順を概略的に示す。そのためには、まず初めに、ＢＰＯＩ−「Ｘ」の発現カセットを含む組換えレトロウイルスコンストラクトを、レトロウイルスパッケージング細胞系（ＰＣＬ）に一時的にトランスフェクトして、野生型レトロウイルスの構造及び機能レトロウイルスタンパク質Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＥｎｖを発現させる（左）。レトロウイルスＰＣＬは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＥｎｖタンパク質の発現コンストラクトを、好適な、且つトランスフェクトが容易な細胞系（例えば、標準的なヒト２９３ＨＥＫ細胞、又はマウスＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞）に、安定的に、或いは一時的にトランスフェクトことによって生成することができる。トランスフェクションの２〜３日後、ＢＰＯＩ−「Ｘ」遺伝子を含む組換えレトロウイルスゲノムが、複製能のないレトロウイルス粒子にパッケージングされ、これはＰＣＬの細胞培養上清中に蓄積する。これらのレトロウイルス粒子が複製能を有しないのは、それらに機能的なレトロウイルスのＧａｇ、Ｐｏｌ及びＥｎｖタンパク質の遺伝子がなく、従って、その遺伝的なペイロードを標的細胞に１回しか送達することができないという、レトロウイルス形質導入、又はシングルラウンド感染と称されるプロセスのためである。レトロウイルス形質導入中、パッケージングされた組換えレトロウイルスのＲＮＡは標的細胞に導入され、そこでｃＤＮＡに逆転写された後、標的細胞ゲノムに安定的に組み込まれる。その後、ｃＤＮＡレトロウイルスコンストラクトが宿主細胞ゲノムに組み込まれることにより、レトロウイルス形質導入の２〜３日後、ＢＰＯＩ−「Ｘ」のような対象の遺伝子が、標的細胞によって永久的に発現する。

【図4ab】この図は、本発明を実現するために用いることのできる好ましいタイプのレトロウイルス発現コンストラクトの概略的な設計を示す。この図面は、標準的なＤＮＡクローニングプラスミド骨格（閉じた黒色の線）に含まれるレトロウイルスベクターの概略的な設計を図示する；レトロウイルスゲノムに関連する遺伝子及び領域は強調表示される。ヒトＩｇγ_１Ｈ鎖及びＩｇκＬ鎖のｃＤＮＡコード領域を含むある好ましいベクターの生成がパネル（ａ）に図示され、その詳細なクローニングは図５及び図６に示されるとともに実施例１に提供される。このｃＤＮＡコード領域は強力な構成的ＣＭＶプロモーター（Ｐｒｏｍ）により駆動され、且つ、ＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖のＶコード領域に対する体細胞超突然変異を促進するＩｇκイントロンエンハンサー（κｉＥ）要素と３’κエンハンサー（３’κＥ）要素とが、上流及び下流に隣接する。レトロウイルスＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖の発現コンストラクトは、それぞれ、抗生物質耐性マーカーのハイグロマイシンＢ（ｈｙｇｒｏ^Ｒ）及びピューロマイシン（ｐｕｒｏ^Ｒ）のオープンリーディングフレームをさらに含み、これにより、それぞれの抗生物質薬物選択を、レトロウイルスで形質導入した脊椎動物細胞の培養物に適用して、安定的に組み込まれたＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖コンストラクトを選択することが可能となる。加えて、好都合な固有の制限酵素部位が強調表示され、これらは、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩによるＶコード領域の直接的な置換、又は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩを用いることによるＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖コード領域全体の置換を可能にする。このようにして、ある既存のＩｇＨ鎖又はＩｇＬ鎖発現コンストラクトから、種々のＶ領域、さらにはＶ領域の集合全体を本開示の発現ベクターに容易にクローニングすることができる。（ｂ）このパネルには、可変部コード領域のＤＮＡ断片による置換を含む別のクラスの好ましいベクターが示され、ここで可変部コード領域は、Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメント（ＩｇＨコンストラクトについて）並びにＶ及びＪ遺伝子セグメント（ＩｇＬ鎖コンストラクトについて）になお分かれており、「準生殖細胞系」配置にある。その他の点では（ａ）に提供されるレトロウイルス発現ベクターと同一であるが、これらのＶ（Ｄ）Ｊ組換え能を有するレトロウイルスベクターは、ＩｇＨ鎖又はＩｇＬ鎖の可変結合ドメインのコード領域を生成するために、まず初めに、Ｖ、場合によりＤ及びＪ遺伝子セグメントの部位特異的再配列を受けなくてはならない。Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え後のＩｇＨ鎖の発現を可能にする、かかるベクターの詳細なクローニングは、図１１に示される。こうしたコンストラクトに固有の特徴は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え活性細胞においてインサイチュで、例えば、内因性のＲＡＧ１及びＲＡＧ２タンパク質を発現する前駆リンパ球内で、多様なＶドメインコード領域を生成するその能力である。Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えのプロセスは厳密なものではないため、ＩｇＨについての所与のＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメント群、又はＩｇＬについての所与のＶ及びＪ遺伝子セグメント群のなかの個々の１つのレトロウイルスベクターから、可変部コード領域配列の多様なコレクションが生じ得る。Ｖ、場合によりＤ及びＪ遺伝子セグメントの接合の多様性は、エキソヌクレアーゼ活性、ＴｄＴ媒介性のＮ領域付加、及びＰヌクレオチド生成という要因が組み合わさった結果であり、これらの要因が全て、個々に、又は合わさってコーディング接合部の多様化に寄与し得る。Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントは、種々のＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントファミリーメンバーを固有の制限酵素部位によって容易に置換することができるような形でクローニングされているため、生成して、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え能を有する宿主細胞に導入したコンストラクトの数が限られていたとしても、インサイチュで生成される結合タンパク質の多様性について、膨大な多様性をもたらすことができる。こうしたベクターは、Ｖ（Ｄ）Ｊ再配列されたＶドメインコード領域に体細胞超突然変異をもたらす追加的なκｉＥ及び３’κＥ要素を含むため、インサイチュで生成された多様な結合タンパク質の一次コレクションは、場合により、ＡＩＤ依存性の体細胞超突然変異プロセスによってさらに突然変異を誘発することができる。このようにして、本開示のレトロウイルスコンストラクトと、ＡＩＤ媒介性の体細胞超突然変異が活性であるか、又は活性化させることのできる、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え活性を呈する宿主細胞（例えば前駆リンパ球）とを用いて、インビボでの抗体多様性の生成プロセス全体をインサイチュ及びインビトロで繰り返すことができる。

【図4c】（ｃ）このパネルは、本発明を実現するために用いることのできるレトロウイルスコンストラクトのさらに別の設計を概略的に図示する。ここで、ＩｇＨ及びＩｇＬコード領域の発現は、レトロウイルス骨格の５’ＬＴＲプロモーターによって駆動されるとともに、ＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖の発現は、それぞれ、ＧＦＰ及びＹＦＰ自己蛍光マーカーの発現に関連付けられ、これにより、単に形質導入細胞を緑色及び黄色蛍光について分析するだけで、ＩｇＨ及びＩｇＬ発現細胞を追跡及び単離することが可能となる。こうしたコンストラクトは、さらなる標識手順なしに「選択用細胞」の感染多重度を制御できるため、極めて有用である。図４ａ）〜ｃ）において、コンストラクトに含まれる重要なＤＮＡ配列について用いられている符号の凡例が提供される。図をより良く理解できるよう、ＩｇＨ及びＩｇＬコード領域は可変ドメイン（Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ）ごとに細分化して提供され、全てが、内因性のリーダー（Ｌ）配列と、ヒンジ（Ｈ）コード領域と、定常コード領域（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、Ｃ_Ｌ）と、膜貫通コード領域（Ｍ１／２、この領域は２つのエクソンによってコードされるため）とを含む。

【図5a】図５ａ〜ｅは、レトロウイルスＩｇＨ（ヒトＩｇγ_１アイソタイプ）発現ベクターを構築するためのクローニング戦略を示し、これは実施例１に詳細が開示され、図４（ａ）に基本的な設計が提供される。膜結合型ＩｇＧ並びに分泌型ＩｇＧの双方の発現コンストラクトのクローニングが図示され、これは実施例１に詳述される−全体的な参照を目的として、プラスミドマップにおける固有の制限酵素部位が提供される。ここで図５ｅに開示されるとおりの最終的なレトロウイルスＩｇγ_１Ｈ鎖発現コンストラクトに基づき、任意の他のＶ_Ｈドメインコード領域か、又は多様なＶ_Ｈドメインコード領域のコレクション（ライブラリ）を、固有のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩ制限酵素部位を用いて、既存のＶ_Ｈ領域を前記任意の他のＶ_Ｈドメインコード領域で置換することにより、ベクターに導入することができる。図５ａは第１の予備クローニングステップを図示し、ここでは、実施例１に記載されるとおり、部位特異的突然変異誘発によって市販のｐＬＨＣＸベクター骨格からＥｃｏ４７ＩＩＩ制限部位（丸で囲まれている）が取り除かれる。これによりレトロウイルスベクター骨格ｐＬＨＣＸｍ１が生成され、ここでＥｃｏ４７ＩＩＩ制限酵素部位は、Ｖ_Ｈドメインコード領域のクローニング及び置換のために、後に再導入され得る。こうした目的のためにＥｃｏ４７ＩＩＩを用いる利点は、Ｅｃｏ４７ＩＩＩが、発現させたヒトＩｇγ_１Ｈ鎖のアミノ酸組成を変化させることなく、ヒトＶ_Ｈコード領域とＣγ_１コード領域との間の境界に直接導入することができる唯一の制限酵素部位であるという事実に基づく。図５ａは、膜貫通エクソンＭ１／Ｍ２を伴う、又は伴わないヒトγ_１定常領域遺伝子のクローン断片を、ｐＬＨＣＸｍ１のＭＣＳに存在する固有のＨｉｎｄＩＩＩ及びＣｌａＩ制限酵素部位を用いてｐＬＨＣＸｍ１骨格にクローニングする方法をさらに示す。断片は、実施例１に詳述されるとおり、後にクローニングすることを目的として、隣接する追加的なＥｃｏ４７ＩＩＩ及びＮｏｔＩ制限酵素部位を含むように設計した。

【図5b】図５ｂ）は、Ｖ_Ｈドメインコード領域をもたないクローン中間物のプラスミドマップを示し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩ部位に隣接する特定のＶ_Ｈコード領域をコンストラクトにクローニングする方法を示す。

【図5c】このように生成されるこうしたコンストラクトは、図５ｃに図示されるとともに、原則的に、任意のレシピエント細胞系においてヒトＩｇγ_１Ｈ鎖の発現をもたらすのに十分であり得る。

【図5d】しかしながら、ＡＩＤ依存的様式でＶ_Ｈコード領域をさらに突然変異を誘発することが可能であることは本発明の一態様であって、２つのさらなるクローニングステップが開示され、そこでは、発現カセットのＣＭＶプロモーターの上流の固有のＢｇｌＩＩ部位に、追加的な隣接配列を有するコアκｉＥ要素がクローニングされ（図５ｃ下及び図５ｄ）、及びヒトＩｇγ_１Ｈ鎖の発現カセットの下流の固有のＣｌａＩ部位に、何らかの隣接ＤＮＡ配列を有する３’κＥ要素がクローニングされる。

【図5e】この結果、膜結合型又は分泌型のいずれかのヒトＩｇγ_１Ｈ鎖の最終的な発現ベクターが得られ、これらについてのプラスミドマップが図５ｅに提供される。これらのコンストラクトは、図４ａに既に開示した概略的なプラスミドマップに対応するが、但しここでは正確な制限酵素マップであり、尺度どおりに描かれる。

【図6a】図６ａ〜ｄは、レトロウイルスＩｇＬ（ヒトＩｇκＬアイソタイプ）発現コンストラクトの構築について、実施例１に提供される詳細なクローニング戦略を示し、コンストラクトの基本的な設計は、既に図４（ｂ）に提供した。ここで図６ｄに開示されるとおりの、最終的なレトロウイルスＩｇκＬ鎖発現コンストラクトを基本として、任意の他のＶ_Ｌドメインコード領域か、又は多様なＶ_Ｌドメインコード領域のコレクション（ライブラリ）を、固有のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩ制限酵素部位を用いて、既存のＶ_Ｌ領域を１つ又は複数の前記任意の他のＶ_Ｌドメインコード領域と置換することにより、ベクターに導入することができる。レトロウイルスＩｇＬ鎖発現ベクターについてのクローニング戦略は、予備クローニングステップによって改変したレトロウイルスベクター骨格を生成する必要があり、その骨格に、図示されるとおりの好都合な制限酵素部位を用いて所望の要素がクローニングされ得る。第１のステップにおいて、市販のプラスミドｐＬＰＣＸから、実施例２に記載されるとおりの部位特異的突然変異誘発によりΨ（プサイ）パッケージングシグナルの不要なＥｃｏ４７ＩＩＩ部位を取り除き、結果として改変プラスミドｐＬＰＣＸｍ１を得た（図６ａ）。

【図6b】第２のステップにおいて、市販のプラスミドｐＬＨＣＸからの大型のＡｓｃＩ−ＢｌｐＩ消化断片を、ｐＬＰＣＸｍ１からのＡｓｃＩ−ＮｃｏＩ断片とライゲートすることにより、新規のｐＬＰＣＸｍ２骨格を生成した（図６ｂ）。双方の断片について、適合性を有しないＢｌｐＩ及びＮｃｏＩ ＤＮＡ末端は、実施例１に記載されるとおりクレノウ断片を用いてヌクレオチドで充填されていなければならなかった。結果として得られたｐＬＰＣＸｍ２骨格に、図示されるとおり、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＣｌａＩを介してヒトκＬ鎖の定常領域（Ｃκ）を挿入した（図６ｂ）。

【図6c】ヒトＩｇＨ鎖のクローニング戦略と同様に、さらなるクローニング手順を促進するため、ヒトＣκ断片をさらにＥｃｏ４７ＩＩＩ及びＮｏｔＩ部位に隣接させた。ヒトＣκ断片の挿入後、固有のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩ部位を介して、一つの選択されたヒトＶκ要素をコンストラクトにクローニングした（図６ｃ）。

【図6d】このコンストラクトは、原則的に、任意のレシピエント細胞系にヒトＩｇκＬ鎖の発現をもたらすのに十分であり得る。しかしながら、ＩｇＨ鎖発現コンストラクトの場合と同じく（図５ａ〜ｅ）、追加的なκｉＥ及び３’κＥ要素を、コンストラクトのなかの、ＩｇＨ鎖コンストラクトのクローニング戦略と同じＩｇκＬ鎖発現カセットの上流及び下流の固有のＢｇｌＩＩ及びＣｌａＩ部位にクローニングした（図６ｃ及び６ｄ）。最終的なコンストラクトにおいてもまた、次にＶκドメインコード領域を、ＡＩＤ媒介性の体細胞超突然変異の標的とすることができる。最終的なコンストラクトは、図４（ｂ）に詳解される概略的なプラスミドマップに対応するが、但しここには正確な制限酵素マップが含まれ、尺度どおりに描かれる。

【図7】この図は、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）のレトロウイルス発現コンストラクトについてのクローニング戦略を示す。図示されるとおり、市販のｐＬＰＣＸレトロウイルスベクター骨格を用い、且つ実施例２に記載されるとおり、ＡＩＤコード領域を含むマウス脾臓ｃＤＮＡ由来の特定のＲＴ−ＰＣＲ断片を、ＰＣＲ増幅プライマーに挿入した適合するＸｈｏＩ制限酵素部位を用いて、ｐＬＰＣＸベクターの固有のＸｈｏＩ制限部位にクローニングした。

【図8a】この図（８ａと、その続きの８ｂ）は、ＩｇκＬ鎖エンハンサー要素を含む、及び含まないレトロウイルスレポーターコンストラクトについての詳細なクローニング戦略を示し、これはまた実施例２にも提供される。

【図8b】ＩｇκＬ鎖エンハンサー要素は、定義されたＥＧＦＰ終止突然変異の復帰突然変異によって体細胞突然変異の同定及び定量化を可能にする。

【図9a】この図は、本開示のレトロウイルスベクターが、好ましくは抗体Ｖコード領域のように、Ｖプロモーター要素の下流にクローニングされた配列のＡＩＤ媒介性の体細胞突然変異を可能にすることについての実験的な概念実証を提供する。パネル（ａ）は、レトロウイルスＡＩＤ発現コンストラクトが安定的にトランスフェクトされた５つの選択されたＦＡ−１２ Ａ−ＭｕＬＶ形質転換細胞クローンのウエスタンブロッティングによるＡＩＤ発現の分析を示し、レトロウイルスＡＩＤ発現コンストラクトのクローニングについては図７に図示した。ウエスタンブロット分析からは、ＦＡ−１２トランスフェクタントクローン１〜４において約２５ｋＤの明確なＡＩＤ特異的シグナルが示され、しかしトランスフェクタント５においては示されず、またトランスフェクトしていない陰性対照（ＮＣ）においても示されない。それ以降の、ＡＩＤ媒介性の体細胞超突然変異（ＳＨＭ）用のレトロウイルスレポーターベクターの試験には、トランスフェクタント３を使用した。

【図9b】この試験はパネル（ｂ）に図示される：ここで、ＡＩＤを発現するＦＡ−１２トランスフェクタント３及びＡＩＤを発現しないＦＡ−１２トランスフェクタント５に、図８のレトロウイルスレポーターコンストラクト（一回はＩｇκエンハンサー要素を含むもので、一回は含まないもの）をレトロウイルスで形質導入した。予想どおり、エンハンサー要素を含むレポーターコンストラクトを、ＡＩＤを発現するＦＡ−１２トランスフェクタントクローン３に形質導入したときにのみ、形質導入の１０日後、０．２％の頻度で緑色の復帰突然変異体の形質導入体を検出することが可能であった。これらの０．２％の緑色細胞から、単細胞分取により１００個の個別の細胞クローンを単離し、増殖後、これらのクローンを緑色蛍光についてＦＡＣＳにより再度分析した。単細胞分取したクローンの大部分（９５％）が一様な緑色蛍光発現を示し、その蛍光強度は、最初に分取した０．２％の緑色細胞の培地緑色蛍光シグナルと同じで、且つ図９ｂの左下のパネルに提供される代表的なＧＦＰ発現パターンと同様であったことから、元の緑色の集団がＥＧＦＰ終止突然変異の復帰突然変異に起因したことが確認された。中央のＦＡＣＳヒストグラムに典型的に図示されるとおり、４個のクローンが二峰性の緑色蛍光パターンを示し、単細胞分取した１００個のクローンのうち１個のみが、ほとんどいかなる緑色蛍光も示さなかった（右側のＦＡＣＳヒストグラム）。

【図10】この図は、体細胞超突然変異を定量化するためのＥＧＦＰレポーターコンストラクトをクローニングするために用いた、終止突然変異を操作されたＥＧＦＰコード領域の配列を示す。パネル（ａ）には、ＥＧＦＰオープンリーディングフレームのコドン１０７及び１０８において４つのヌクレオチドが突然変異し、それによりコドン１０７に終止コドンが生じ、コドン１０８にリジンからスレオニンへのアミノ酸変化が生じたことが示される。これらの４つのヌクレオチド変化は、さらに、体細胞超突然変異時の終止コドン復帰突然変異の診断マーカーとして用いることができたことによって示されるとおり、結果として固有のＳｐｅＩ制限酵素部位の導入をもたらした。ＴＡＧ終止コドンのＧヌクレオチドは、いわゆるＲＧＹＷ配列モチーフに埋め込まれ、このモチーフは、体細胞超突然変異のホットスポットであることが知られている。ＳｐｅＩ制限酵素消化によって分析した２４個の復帰突然変異体クローンにおいて、その部位がＳｐｅＩ消化に対して耐性となった（従って、突然変異した）ことを確認することができた。これらのクローンのうちの１０個において、配列分析から、元のＴＡＧ終止コドンのＧヌクレオチドがＣヌクレオチドに突然変異し、結果としてＴＡＣコドンになったことが明らかとなり、それにより制限酵素分析が裏付けられたとともに、ＡＩＤ媒介性の体細胞突然変異がＲＧＹＷモチーフのＧを標的としていることが実証された。（ｂ）このパネルは、突然変異ＥＧＦＰのＯＲＦ全体を示し、この突然変異ＥＧＦＰのＯＲＦは、図５（ｅ）に既に開示したレトロウイルスＩｇγ１Ｈ鎖コンストラクトに、Ｖ_Ｈドメインコード領域に代えてクローニングしたものである。

【図11a】実施例４に詳細に開示されるとおりの、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え能を有するレトロウイルスＩｇＨ鎖発現ベクターの詳細なクローニング戦略の説明である。

【図11b】実施例４に詳細に開示されるとおりの、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え能を有するレトロウイルスＩｇＨ鎖発現ベクターの詳細なクローニング戦略の説明である。

【図12】「準生殖細胞系」配置にあるＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントのＶ（Ｄ）Ｊ組換えを必要とするレトロウイルスコンストラクトが、ＲＡＧ１／ＲＡＧ２陽性前駆リンパ球に形質導入されると、産生的に再配列された重鎖発現コンストラクト及びＩｇ＋細胞を生じ得ることについての概念実証。パネル（ａ）は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え能を有するレトロウイルス発現ベクター（クローニングの詳細な説明は、図１１を参照）をＡ−ＭｕＬＶ形質転換プレＢ細胞系２３０−２３８に形質導入した後の、表面免疫グロブリン陽性細胞の生成（０．０４％、左のＦＡＣＳプロットの右上象限）を示すデータを含む。免疫グロブリンの発現は、図４ｃに概略的に示されるとおり、コンストラクトを使用したＥＧＦＰの発現と関連付けられる。従って、免疫グロブリン発現細胞は、緑色の（すなわち安定的に形質導入された）細胞集団においてのみ生成され得る。右の染色パネルは、１回のＦＡＣＳ濃縮ラウンドと、微量の（０．０４％）表面免疫グロブリン細胞の８日間にわたる組織培養による増殖とを行った後の、表面免疫グロブリン発現の再分析を示す。この１回の濃縮ラウンド後、免疫グロブリン陽性細胞の合計頻度は１７．８％に上昇し（緑色の、すなわち安定的に形質導入された集団において検出可能であると予想されたとおり）、そこからＰＣＲアンプリコンを得て配列決定した。（ｂ）．代表例として、このパネルは、「準生殖細胞系」のＶ（Ｄ）Ｊ組換え能を有するレトロウイルスベクターを形質導入した１回の濃縮ラウンド後の表面免疫グロブリン細胞に由来するＰＣＲアンプリコンから得られたＤＮＡ配列（クローン２２５、上にアミノ酸翻訳を付す）を示す。参照として、（ｂ）の上段に、Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントのコード領域の配列を提供し、これもまた、Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの上にアミノ酸翻訳を付すが、Ｄセグメント配列は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え後の接合の多様性に応じて３つの異なるリーディングフレームで読み取られ得る。「準生殖細胞系」配置のＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメント間に介在する配列は、点で表される。回収したクローン２２５の配列は、真正のＶ（Ｄ）Ｊ再配列イベントを明確に表し、組み立てられたＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメント間のコーディング接合部において、ヌクレオチド欠損及びＴｄＴ触媒によるＮ配列付加の典型的な特徴を明確に認めることができる（クローン２２５からは、全ての介在配列がなくなっている）。クローン２２５の配列はオープンリーディングフレームを示し、且つ、前述のコーディング接合部における変化を除いては、Ｖ、Ｄ及びＪ配列にさらなる体細胞突然変異は含まなかった。

【図13】エコトロピックＭＬＶ由来のベクター遺伝子導入に対する感受性についての種々のＡ−ＭｕＬＶ形質転換マウスプレＢ細胞系のパネル試験を示すデータ。パッケージングされた、導入ベクターＬＥＧＦＰ−Ｎ１を包含するレポーター遺伝子ＥＧＦＰを有するベクター調製物を用いて、０．５のＭＯＩで１×１０^５個の細胞を形質導入した。形質導入は、実施例５に詳述されるとおりに実行した。形質導入の２日後、ＦＡＣＳを用いてＥＧＦＰの発現により遺伝子導入を検出した。プレＢ細胞系１８／８１を除き、それ以外の試験したＡ−ＭｕＬＶ形質転換プレＢ細胞系の全てが、適用条件下に４０〜６０％の範囲の頻度で形質導入に対して感受性を有したとともに、これらは原則的に、本発明に使用することができる。処理していない未導入標的細胞を陰性対照として供し、これは緑色蛍光を示さなかった（図示せず）。

【図14】レトロ細胞ディスプレイの選択用細胞として用いることのできる、内因性のマウス抗体発現を欠く細胞を同定するための、内因性ＩｇＭ重鎖（ｃｙ−μＨ）の細胞内発現についてのマウスプレＢ細胞系のパネルの特性決定。細胞を透過処理し、ＦＩＴＣ（ＦＬ１）と結合させた抗マウスＩｇＭ重鎖抗体を使用して染色した。処理していない細胞を陰性対照として供した。この実験は、細胞系ＦＡ−１２、１６２４−５、１６２４−６、１８／８１−ｃｌ８−１１、及び４０Ｅ１に内因性抗体発現が事実上認められなかったことを示し、従ってこれらは本発明の方法に使用することができる。

【図15】図４（ｃ）に開示される設計に従うレトロウイルス発現ベクターの複雑度、及びＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖をシャッフルした抗体ライブラリを生成するための実験原理の説明。（ａ）レトロウイルスベクターライブラリＩｇＨ（６５０）−ＬＩＢ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ及びＩｇＬ（２４５）−ＬＩＢ−ＩＲＥＳ−ＹＦＰは、完全ヒト抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）のコード領域の定義されたコレクションを含み、それぞれ６５０個及び２４５個の完全に配列決定された異なるクローンの複雑度を有する。双方のベクターともパッケージング配列プサイ（Ψ）と、隣接する長末端反復（ＬＴＲ）と、内部リボソーム侵入シグナル（ＩＲＥＳ）とを含む。５’ＬＴＲにおけるウイルスプロモーターによって媒介される抗体ポリペプチド鎖の発現と同じく、ＩＲＥＳは、それぞれ、レポーター遺伝子ｇｆｐ及びｙｆｐを関連付けて発現することが可能である。これにより、選択用細胞にウイルスで遺伝子導入すると、形質導入に成功した、免疫グロブリン鎖を発現する細胞を、ＦＡＣＳを用いて好都合に検出及び濃縮することが可能となる。（ｂ）形質転換プレＢ細胞における完全ヒト抗体のコレクションの生成。一時的なパッケージング細胞を生成するため、ヒト抗体の重鎖をコードするレトロウイルス導入ベクターライブラリのライブラリ（ＩｇＨ（６５０）−ＬＩＢ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）を、パッケージングコンストラクト（ｐＶＰａｃｋ−ＧＰ）及びエンベロープコンストラクト（ｐＶＰａｃｋ−Ｅｃｏ）と共に好適なレシピエント細胞にコトランスフェクトする。トランスフェクションの２日後、パッケージングされたそれぞれの導入ベクターライブラリを有する生成されたベクター粒子ライブラリを回収し、選択用プレＢ細胞の形質導入に用いる。導入された重鎖及びレポーター遺伝子ｇｆｐを発現する形質導入細胞を増殖し、ＦＡＣＳを用いて濃縮する。増殖後、細胞は第２の形質導入に供する。このときは、ＩｇＬ（２４５）−ＬＩＢ−ＩＲＥＳ−ＹＦＰライブラリを導入し、その後、ＦＡＣＳを用いてＹＦＰ及びヒト軽鎖を発現する細胞を増殖させて濃縮する。得られた集団は、１６２４−５細胞によって発現する定義されたヒト抗体ライブラリを示す完全ヒト抗体をなし、最大１５９’２５０個のクローンの複雑度を含む。

【図16】この図は、ＩｇＨ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ及びＩｇＬ−ＩＲＥＳ−ＹＦＰライブラリによる二段階形質導入が、形質導入を確実にする条件下でどのように実施され、その結果、形質導入細胞の大部分においてポリペプチド鎖のクローン発現が生じたのかを示す。１．５×１０^６個の１６２４−５マウスＡ−ＭｕｌＶ形質転換プレＢ細胞を、図１５に既に示したとおりの、ＩｇＨ鎖ライブラリＩｇＨ−ＬＩＢ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ又はＩｇＬ鎖ライブラリＩｇＬ−ＬＩＢ−ＩＲＥＳ−ＹＦＰをそれぞれコードする組換えレトロウイルスベクターを含む種々の量のベクター粒子上清（１：１；１：５；１：２０；１：５０；１：１００；１：２００希釈）を補充した１ｍｌの組織培養培地の中に懸濁した。形質導入細胞の大部分が宿主細胞ゲノムに組み込まれた導入ベクターの単一のコピーを受け取ることを確実にするため、１０％未満の遺伝子導入効率（ＭＯＩ＜０．１、結合したＧＦＰ又はＹＦＰレポーターの発現による検出時）を示す細胞を、感染４日後にＦＡＣＳ分取を用いて濃縮した。細胞を６日間増殖させ、上記のとおり、パッケージングされた抗体の軽鎖コード領域を有するベクター粒子を１：５希釈で用いて、第２の形質導入に供した。ここで、重鎖発現に関して選択したＧＦＰ陽性細胞に、ＩｇＬ−ＬＩＢ−ＩＲＥＳ−ＹＦＰライブラリを形質導入するベクター粒子を感染させ、逆も同様に行った。感染後４日目、ＦＡＣＳを用いてＧＦＰ及びＹＦＰを発現する形質導入細胞を濃縮した。約２０％の細胞が、第２の形質導入後にＧＦＰ及びＹＦＰ発現を示した。１個の細胞につき唯１つのベクターの組込みが起こったことを確かめるため、集団の約３分の１を濃縮し、そこから、第２のラウンドにおいて形質導入されたレポーター遺伝子は低〜中程度しか発現しなかった（約８％）ことが明らかとなった。

【図17】レトロ細胞ディスプレイ実験に最適なＩＬ−１５抗原染色条件を実現する最適条件を定義するための、抗ＩＬ−１５基準抗体を発現するプレＢ細胞の集団で染色したＩＬ−１５のＦＡＣＳによる力価測定。実施例７に詳細に開示されるとおりの染色手順には、２．５μｇ／ｍｌ〜０．１μｇ／ｍｌの範囲のＩＬ−１５抗原の力価測定が含まれ、これは、示されるとおりの２つの異なるポリクローナルビオチン化抗ＩＬ−１５二次抗体濃度とし、ＦＡＣＳによりストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲートで検出した。表面Ｉｇ＋細胞を抗ＩｇκＬ鎖−ＡＰＣ抗体で対比染色した。見て分かるとおり、最適なＩＬ−１５染色は、０．１又は０．５μｇ／ｍｌのＩＬ−１５抗原濃度で、３μｇ／ｍｌの二次ポリクローナル抗ＩＬ−１５抗体を用いて達成される。

【図18】プレＢ細胞系を発現する抗ＩＬ−１５基準抗体（ＰＣ＝陽性対照）のＦＡＣＳ同定の分析。これは、図１７で説明及び決定された最適化ＩＬ−１５染色条件を用いることにより、種々の希釈の抗体を発現するプレＢ細胞の多様なライブラリにスパイクした。左上のパネルは、ＩｇＨ鎖ライブラリとＩｇＬ鎖ライブラリとの組み合わせを形質導入した対照プレＢ細胞のＩｇκＬ鎖−ＡＰＣ／ＩＬ−１５二重染色を示し、これらのライブラリの生成は既に図１６に示した（ＮＣ＝陰性対照）。右上のパネルは、実施例７に詳細に開示されるとおり、基準ＩＬ−１５抗体のＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖をコードするレトロウイルス発現ベクターを形質導入したプレＢ細胞のＩｇκＬ鎖−ＡＰＣ／ＩＬ−１５二重染色を示す（ＰＣ＝陽性対照）。ＮＣ細胞のＦＡＣＳプロファイルは、抗ＩｇκＬ鎖−ＡＰＣ染色によって検出したとき、Ａｂライブラリ形質導入細胞の約５０％が表面Ｉｇ＋であることを示している。しかしながら、表面Ｉｇ＋細胞のなかに、ＩＬ−１５との結合を示すものはない。対照的に、９０％超の細胞が表面Ｉｇを発現したＰＣ細胞は、ｘ軸上の特異的シグナルにより、特異的なＩＬ−１５抗原結合が明らかである。予想どおり、ＰＣ細胞上での表面Ｉｇの発現が高度なほど、特異的ＩＬ−１５シグナルへのシフトがより顕著で、表面Ｉｇ＋／ＩＬ−１５結合性細胞の斜めの染色パターンを生じ、これは、示されるとおり、楕円形のゲートによって強調表示される。下段のパネルは、ＮＣランダム抗体ライブラリを発現する細胞集団にスパイクした５つの異なる希釈のＰＣ細胞における表面ＩｇとＩＬ−１５結合性とについての二重ＦＡＣＳ染色を示すもので、特異的抗ＩＬ−１５基準抗体を発現するＰＣ細胞が、ＮＣ細胞ライブラリにスパイクしたＰＣ細胞のパーセンテージに近い頻度で検出され得ることを示している。

【図19】実施例７に詳細に開示されるとおりの、多様な抗体ライブラリからのレトロ細胞ディスプレイによるＩＬ−１５反応性細胞集団の濃縮についての概念実証。上のパネルは、Ｉｇ−レトロベクター形質導入細胞の頻度の指標となるＧＦＰ／ＹＦＰ発現（ｙ軸）と、特異的ＩＬ−１５染色の指標となるＩＬ−１５／抗ＩＬ−１５−ｂｉｏ（ｘ軸）とについてのＦＡＣＳ染色を示す。左上のパネルは、形質導入していない対照プレＢ細胞（ＮＣ＝陰性対照）の二色ＦＡＣＳ分析を示し、中央上のパネルは、陽性対照（ＰＣ）としての、抗ＩＬ−１５基準抗体を形質導入したプレＢ細胞の二色ＦＡＣＳ分析を示す。右上のパネルは、基準抗ＩＬ１５抗体のＩｇＨ鎖をコードする、単一のＩｇＨ鎖をコードするレトロウイルスベクターを、７×１０^４本超の異なるＩｇκＬ鎖の多様なライブラリと組み合わせて形質導入した細胞の集団の同じ二色ＦＡＣＳ染色を示す。従って、このＩｇＬ鎖がシャッフルされたライブラリは、潜在的に７×１０^４本超の異なる抗体を含み、且つ、予想どおり、右上のＦＡＣＳプロファイルに示されるとおりの、抗体を発現し、且つＩＬ−１５反応性である細胞に対するさらに極めて狭いゲーティングにより、ＩＬ−１５反応性細胞はほとんど検出できなかった（ここでは２．４２％、示されるとおり、陰性集団に近いゲーティングによる）。濃縮した集団を組織培養で増殖させて、同一の染色手順及びＦＡＣＳ分取を３回繰り返し、これは、同一の条件下での３回のＦＡＣＳ染色についての下段の３つのＦＡＣＳパネルに示されるとおりである。見て分かるとおり、連続的な濃縮／細胞増殖サイクルにより、抗体発現がほぼ１００％陽性で、且つＩＬ−１５反応性について元のＰＣ細胞系よりさらに多くが陽性となった細胞の集団が生じた。このデータは、ＦＡＣＳ分取及び増殖を繰り返すことにより、抗原反応性細胞をほとんど検出不能な集団から、本質的に１００％抗原反応性細胞の集団へと、レトロ細胞ディスプレイの３回の連続ラウンドを用いて高度に抗原反応性の細胞集団を濃縮することに成功し得ることを明確に示している。

【図20】この図は、図１９に示されるとおり、３回のＩＬ−１５抗原濃縮を行った細胞集団から単細胞分取後に樹立した２４個の個別の細胞クローンのうちの４個の代表的な細胞クローンについての特異的ＩＬ−１５抗原反応性を示し、裏付ける。４個の選択された細胞クローンをクローンＦ、Ｈ、Ｖ及びＷと命名し、その全てが、安定的に形質導入されたＩｇコードレトロウイルスベクターの指標となるＧＦＰ／ＹＦＰ陽性細胞に対し、特異的ＩＬ−１５反応性を示す。予想どおり、より高い抗体レベルを表すより高度なＧＦＰ／ＹＦＰ発現の細胞ほど、より高いＩＬ−１５特異性を示し、Ｉｇ／ＩＬ−１５二重染色において特徴的な斜めの染色シグナルをもたらした。全ての細胞クローンが特異的ＩＬ−１５反応性を示した。これは、染色においてＩＬ−１５抗原を省くと、結果としてＩＬ−１５特異的反応性の消失に至る（図示せず）ことによって実証される。このデータは、当初は抗原反応性をほとんど検出不能な細胞を示す細胞集団から、高頻度で抗原反応性細胞クローンを得るのに、レトロ細胞ディスプレイが効率的な方法であることの概念実証を提供する。

【図21】この図は、抗原反応性細胞のレトロ細胞ディスプレイ濃縮の成功についての第２の概念実証を提供し、これは、初期細胞集団における最小限のＩＬ−１β反応性細胞集団から開始し、レトロ細胞ディスプレイ細胞濃縮／組織培養増殖の３回の連続ラウンドを用いて、本質的に４０％が抗原反応性である細胞集団へのＩＬ−１β抗原反応性細胞の濃縮に成功したことを示すことによる。ＧＦＰ／ＹＦＰ発現（抗体発現の指標となる）についての二重染色及びＩＬ−１β反応性が提供される。上段には、示されるとおり、形質導入していないプレＢ選択用細胞（陰性対照＝ＮＣとして、左上）と、抗ヒトＩＬ−１β特異的基準抗体ＳＫ４８−Ｅ２６をコードするレトロウイルスベクターと共に同時形質導入した細胞（陽性対照＝ＰＣとして、右上）とについてのＦＡＣＳ染色が提供される。下段のパネルは、示されるとおり、且つ実施例８に詳細に開示されるとおり、１．２×１０^５本超の個別のＩｇＬ鎖クローンの多様なＩｇＬ鎖ライブラリを、ＳＫ４８−Ｅ２６基準抗体のＩｇＨ鎖に対してシャフリングすることによって生成した抗体ライブラリについて、レトロ細胞ディスプレイ濃縮ラウンドを行う前（０回濃縮）並びに１、２及び３回行った後の、抗体発現についてのＦＡＣＳ染色と、ＩＬ−１β反応性とを示す。これらのデータは、レトロ細胞ディスプレイ発現及び濃縮が、抗原特異的細胞の集団を、当初はほとんど検出不能なレベルから濃縮する強力な手段であることについての、第２の抗原を用いた独立した概念実証を提供する。

【図22】この図は、実施例８に詳細に開示されるとおりのレトロ細胞ディスプレイによって同定された新規抗体のＩＬ−１β抗原反応性の確認を示す。図２１に示される３回濃縮した細胞集団から、単細胞分取によって２４個の個別の細胞クローンを樹立した。これらの２４個の細胞クローンから、実施例８に開示されるとおり、１２個のクローンがＬＣＢ２４と称される新規ＩｇＬ鎖を有した。ＩＬ−１β特異的基準抗体ＳＫ４８−Ｅ２６のＩｇＨ鎖（実施例８を参照）と同時発現させた新規ＬＣＢ２４ ＩｇκＬ鎖のＩＬ−１β特異性について、クローニングし、且つ配列を特性決定したＩｇＬ鎖及びＩｇＨ鎖レトロウイルス発現ベクターを元の選択用細胞系に再形質導入した後、ＦＡＣＳにより分析した。ＦＡＣＳ染色は、示されるとおり、二色ＦＡＣＳによる抗体発現（ＧＦＰ／ＹＦＰを介した）及びＩＬ−１β反応性の分析を示す。予想どおり、形質導入していない選択用細胞（ＮＣ＝陰性対照、左）ではＩＬ−１β反応性は検出されず、一方、基準抗体ＳＫ４８−Ｅ２６のＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖を発現する陽性対照細胞（中央）では、明確なＩＬ−１β特異的染色が検出される。同様のＩＬ−１β特異的なシグナルが、ＳＫ４８−Ｅ２６基準抗体ＩｇＨ鎖ベクターと、ＩＬ−１β特異的レトロ細胞ディスプレイ細胞クローンからクローニングした新規の完全ヒトＬＣＢ２４ ＩｇκＬ鎖とを形質導入した、抗体を発現する選択用細胞（右）において、検出可能である。

【図23】ＬＣＢ２４ ＩｇｋＬ鎖／ＳＫ４８−Ｅ２５ ＩｇＨ鎖によってコードされる新規抗体がＩＬ−１５に対して交差反応性を有しないことの確認。左の２つのＦＡＣＳ染色は、示されるとおり、ＩＬ−１５ ＦＡＣＳ染色アッセイの陰性対照及び陽性対照を示す（ＮＣ＝陰性対照、形質導入していない選択用細胞、ＰＣ＝陽性対照、抗ＩＬ−１５基準抗体をコードするＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖ベクターを形質導入した選択用細胞）。右の２つのＦＡＣＳ染色は、ＳＫ４８−Ｅ２６ ＩｇＨ鎖及びＬＣＢ２４ ＩｇＬ鎖からなる新規抗体をコードする抗体発現細胞に対しても、又は元のＳＫ４８−Ｅ２６ ＩｇＨ／ＩｇＬの組み合わせを発現する細胞に対しても、ＩＬ−１５反応性がないことを示す。これは、ＳＫ４８−Ｅ２６ ＩｇＨ鎖とＬＣＢ２４ ＩｇＬ鎖とからなる新規抗体が、ＩＬ−１βに対して特異的なだけでなく、概してＩＬ−１５のような他のタンパク質に対して交差反応性を有しない（すなわち、付着しない）ことを実証している。

【図24】この図は、実施例９に開示されるとおり、多様なＩｇＬ鎖ライブラリを多様なＩｇＨ鎖ライブラリとシャフリングすることにより生成された抗体ライブラリから、レトロ細胞ディスプレイ細胞濃縮／組織培養増殖の３回の連続ラウンドにより、ストレプトアビジン−ＡＰＣ−Ｃｙ７抗原反応性細胞の濃縮に成功したことを示す。ストレプトアビジン−ＡＰＣ−Ｃｙ７反応性細胞は、示されるとおり、高速細胞分取と、それに続く細胞培養物の増殖とのラウンドを３回連続して行うことによって濃縮した。抗体発現細胞のストレプトアビジン−ＡＰＣ−Ｃｙ７抗原に対する結合特異性は、抗原の存在下（下段のパネル）及び不在下（上段のパネル）で連続的に濃縮した細胞集団のＦＡＣＳプロファイルを分析することによって実証される。これは、鎖シャフリング手法に用いられ得るいかなる基準抗体も存在しないなかでのレトロ細胞ディスプレイによる抗原特異性の効率的な濃縮についての概念実証を実証する。

【図25】この図に提供されるデータは、ストレプトアビジン−ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデム色素のＣｙ７蛍光色素に対する特異的反応性について、図２４に開示される３回のレトロ細胞ディスプレイ濃縮を行った細胞集団の特異性の証拠を提供する。このため、示されるとおり、形質導入していない選択用細胞と、ＩｇＨ鎖／ＩｇＬ鎖ライブラリの組み合わせを発現する濃縮していない細胞と、３回のストレプトアビジン−ＡＰＣ−Ｃｙ７濃縮を行った細胞集団とを、抗体発現（ＧＦＰ／ＹＦＰ蛍光によって示される）及び種々のストレプトアビジン−蛍光色素コンジュゲートに対する反応性について、ＦＡＣＳにより分析した。３回のストレプトアビジン−ＡＰＣ−Ｃｙ７濃縮を行った細胞集団のみがストレプトアビジン−ＡＰＣ−Ｃｙ７と結合したが、ストレプトアビジン−ＡＰＣ又はストレプトアビジン−ＡＰＣ−Ｃｙ５．５には結合せず、また、選択用細胞又は多様な抗体ライブラリを発現する選択用細胞のいずれについても、ストレプトアビジン−ＡＰＣ−Ｃｙ７の非特異的染色を検出することはできなかった。これは、抗原特異的基準抗体由来の抗体ＩｇＨ鎖又はＩｇＬ鎖を必要とすることのない、多様な抗体ライブラリを発現する細胞からの特異的抗体の効率的且つ高度に特異的なレトロ細胞ディスプレイ濃縮についての概念実証を提供する。

【図26】同じＩｇＨ鎖を共有する、レトロ細胞ディスプレイによって同定された２つの新規ヒト抗体は、抗原ストレプトアビジン−ＡＰＣ−Ｃｙ７との特異的結合を示す。実施例９に開示されるとおり、レトロ細胞ディスプレイ濃縮の３回のラウンド後、単一分取した細胞クローンから２本の異なるＩｇＨ鎖配列（ＨＣ４９及びＨＣ５８）及び２本の異なるＩｇＬ鎖配列（ＬＣ４及びＬＣ１０）を同定することができた。この図では、標的抗原ストレプトアビジン−ＡＰＣ−Ｃｙ７との反応性について、ＩｇＬ鎖ＬＣ４及びＬＣ１０の、ＨＣ４９及びＨＣ５８との可能な全ての対を調べた。このため、示されるとおり、且つ実施例９に開示されるとおり、異なるＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖をコードするレトロウイルス発現ベクターの組み合わせを選択用細胞に形質導入した。示されるとおり、新規抗体ＨＣ５８／ＬＣ４及びＨＣ５８／ＬＣ１０（双方とも同じＩｇＨ鎖を共有する）は、ストレプトアビジン−ＡＰＣ−Ｃｙ７抗原との特異的結合を示したが、一方、ＨＣ４９／ＬＣ４及びＨＣ４９／ＬＣ１０によってコードされる抗体は、特に著しい結合活性は示さなかった。２個の新規抗体クローンを選択用細胞に再び形質導入したときの、その抗原ストレプトアビジン−ＡＰＣ−Ｃｙ７に対する特異的結合性は、複雑度の高い抗体ライブラリにおける微量の抗体結合体の同定に、本明細書に開示されるとおりのレトロ細胞ディスプレイを用いることが可能であることの確定的な証拠を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0025】

用語
ここで、「及び／又は」は、本明細書で使用される場合、２つの特定の特徴又は構成要素の各々の、他方を伴う、又は伴わない明確な開示とみなすべきであることを指摘することが好都合である。例えば「Ａ及び／又はＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の、まさにここで各々が個々に記載されるのと同じ、明確な開示とみなすべきである。

【0026】

親和性成熟：抗原刺激性のＢリンパ球によって産生される抗体の結合特異性が抗原の駆動により向上する高度に調節性の免疫学的過程であり、主として胚中心で起こる。この過程は、概して、より高親和性の抗体を生成するＢリンパ球の選択的な増殖及び生存に関連した抗体の可変ドメインのコード領域を標的とする体細胞超突然変異によって引き起こされる。

【0027】

抗体：この用語は、天然であろうと、又は部分的若しくは完全に合成的に産生されたものであろうと、免疫グロブリンを示す。この用語には、例えばラクダ又はラマ由来の重鎖のみの抗体のような抗体抗原結合部位を含む任意のポリペプチド又はタンパク質もまた含まれる。完全長抗体は、２本の同一の重（Ｈ）鎖と２本の同一の軽（Ｌ）鎖とを含む。その単量体形態では、２本のＩｇＨ鎖と２本のＩｇＬ鎖とがまとまって対称なＹ字型ジスルフィド結合抗体分子を形成し、これは、ＩｇＨ鎖の可変領域とＩｇＬ鎖の可変領域との組み合わせによって形成される２つの結合ドメインを有する。

【0028】

抗体は、天然の供給源から精製によって単離し、又は得てもよく、或いは、遺伝子操作、組換え発現によって、又は化学合成によって得てもよく、ひいてはそれらは、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってはコードされないアミノ酸を含み得る。完全ヒト抗体は、ヒト重鎖及び軽鎖、すなわちヒト種からの可変ドメイン及び定常ドメインを含む。キメラ抗体は、ある脊椎動物種由来の可変領域ドメインが、別の脊椎動物種の定常領域ドメインと組み合わされたものを含む。キメラ抗体の定常ドメインは、通常、１つ又は複数のヒト抗体に由来する。ヒト化抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲを、ヒト起源のＩｇＨ及びＩｇＬ可変ドメインのフレームワーク領域にグラフトすることによって産生することができる。

【0029】

抗体断片：完全な抗体の断片は、抗原を結合する機能を果たし得ることが示されている。結合性断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一の抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）ｄＡｂ断片、これはＶＨ又はＶＬドメインからなる；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、２つの結合したＦａｂ断片を含む二価断片；（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ここではＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとがペプチドリンカーによって結合し、このペプチドリンカーにより、２つのドメインが結び付いて抗原結合部位を形成することができる；（ｖｉｉｉ）二重特異性の単鎖Ｆｖ二量体；及び（ｉｘ）「ダイアボディ」、遺伝子融合によって構築された多価又は多重特異的断片である。Ｆｖ、ｓｃＦｖ又はダイアボディ分子は、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとを結合するジスルフィド架橋を取り込むことによって安定化させ得る。また、ＣＨ３ドメインと接合したｓｃＦｖを含むミニボディが作製されてもよい。結合性断片の他の例はＦａｂ’であり、これは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含め、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に数個の残基が付加される点でＦａｂ断片とは異なり、及び他の例はＦａｂ’−ＳＨであり、これは、定常ドメインの１つ又は複数のシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片である。ある場合には、重鎖又は軽鎖も、抗体断片とみなされ得る。当業者は容易に理解するであろうとおり、上記の抗体断片は全て、前記断片の由来元である未処理の抗体全体のうちの少なくとも１つの機能を示し、従って「機能的」断片と称される。

【0030】

抗原：免疫グロブリン（又は抗体）の可変ドメインによって結合することのできる任意の生体分子又は化学物質。

【0031】

結合タンパク質：この用語は、互いに結合する一対の分子のうちの一方のタンパク質を定義する。結合タンパク質の結合パートナーは、通常リガンドと称される。結合対のタンパク質は、天然由来であっても、又は完全若しくは部分的に合成的に産生されてもよい。一対の分子のうちの一方のタンパク質は、その表面上のある範囲か、又は空洞を有し、これは、一対の分子のうちの他方のタンパク質の特定の空間的な極性構成と結合し、従ってそれと相補的である。結合対のタイプの例は、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質である。本発明は、好ましくは抗原−抗体タイプの反応に関する。

【0032】

相補性決定領域（ＣＤＲ）：この用語は、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の超可変領域を指す。ＣＤＲは、抗原と直接接触を確立する免疫グロブリンの三次元構造領域である。抗体は、典型的には３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲとを含む。ＣＤＲは通常、抗原受容体のなかで最も多様な部分である。

【0033】

ドメイン：特定の三次元構造によって特徴付けられる生体分子の構造的部分（例えば、免疫系の多くの分子に見ることができ、いわゆるＩｇスーパーファミリーに属するＩｇ様ドメインなどの、構造的に関連性のある免疫グロブリンの可変又は定常領域ドメイン）。

【0034】

胚中心：末梢リンパ器官（例えば、リンパ節又は脾臓）内の明確な組織学的構造であり、ここでは、抗原提示細胞間及び異なるＴリンパ球集団間で同種の相互作用が起こり、結果として抗原反応性リンパ球が増殖的に拡大し、並びに抗原反応性Ｂリンパ球によって産生された抗体に親和性成熟及びクラススイッチ組換えが生じる。

【0035】

生殖細胞系配置：遺伝子及び遺伝子座の、それらが親から受け継がれたとおりの、且つ生殖細胞系を通じて以降の世代に伝わるであろうとおりの再配列されていない配置。例えばリンパ球におけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えのような、体細胞において起こるＤＮＡ組換え現象は、特定の遺伝子座上の遺伝情報の再シャフリング又は欠損をもたらし、従って生殖細胞系配置からの遺伝子の変化をもたらす。

【0036】

プレＢリンパ球：前駆Ｂリンパ球は、特定の前駆Ｂ細胞特異的遺伝子、例えばλ５並びにＶ_{ｐｒｅＢ１}及びＶ_{ｐｒｅＢ２}遺伝子などの発現、及びＶ（Ｄ）Ｊ組換えに関わる前駆リンパ球特異的因子（例えば、ＲＡＧ−１、ＲＡＧ−２）の発現によって特徴付けられる。加えて、前駆Ｂリンパ球は、双方の重鎖対立遺伝子上のＤＪ_Ｈ又は少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖対立遺伝子上の少なくとも１つのＶ_ＨＤＪ_Ｈ再配列の存在によって特徴付けられ、一方、軽鎖遺伝子座は、なお再配列されないままの生殖細胞系配置であり、従ってプレＢ細胞は完全な抗体を発現することができない。

【0037】

一次リンパ器官：マウス及びヒトにおいて造血幹細胞からリンパ球を生じさせる器官、例えば、骨髄、胸腺、及び胎児期における肝臓。

【0038】

「準生殖細胞系」配置：隣接する組換えシグナル配列が生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子座から人工的な遺伝子コンストラクトにクローニングされたＶ、場合によりＤ、及びＪ遺伝子セグメントの人工的な配列構成であり、かかる人工的な遺伝子コンストラクトにおけるＶ、場合によりＤ、及びＪ遺伝子セグメントの配列構成は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えのプロセスによって遺伝子セグメントの可変部コード領域に部位特異的に組み換えることがなお可能である。

【0039】

体細胞突然変異：結果としてゲノムの特異的領域に点突然変異が導入される体細胞内の過程。これが高頻度で起こるとき（塩基対当たりの細胞分裂当たり１０^−４回超の突然変異）、それは体細胞超突然変異として知られる。

【0040】

Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え：これは、抗体及びＴ細胞受容体の多様性を生じさせるためのプロセスであり、機能的な抗体遺伝子を作成する方法である。これには、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖タンパク質をコードする多くの遺伝子セグメントの再配列が関わり、リンパ球内でしか起こらない。

【0041】

トランスフェクトする／トランスフェクション：真核細胞の文脈では、これは核酸配列を真核細胞に導入する過程であり、通常、化学的及び／又は物理的方法の利用を伴う。

【0042】

形質転換する／形質転換：真核細胞の文脈では、これは、連続的に増殖し続ける細胞系を樹立するため細胞を不死化する過程である。

【0043】

形質導入する：組換えウイルスの産生を介してＤＮＡを脊椎動物細胞に送達する過程。このため、ウイルス粒子の構造タンパク質を発現するパッケージング細胞系に、ウイルスＤＮＡコンストラクトをウイルス構造タンパク質にパッケージングするための調節要素を含む組換えウイルスＤＮＡコンストラクトがトランスフェクトされる。これにより組換えウイルスが産生され、それを用いて（哺乳類の）標的細胞を感染させることができ、組換えウイルスゲノムにクローニングされた遺伝情報の導入がもたらされる。

【0044】

ベクター／コンストラクト：人工的に生成された核酸配列であり、これを用いて異なる生命体及び種の間で核酸要素を行き来させることができ、さらに、これを用いてゲノム情報を伝播、増幅、及び維持することができる。

【0045】

抗体、又は免疫グロブリンは、最も広範なクラスの結合タンパク質であり、治療及び診断用途に特に有用であることが判明している。治療用抗体は、商業的に最も成功しているクラスの生物学的薬物として展開しており、抗体ベースの治療薬を開発するための新規の強力な方法は、常に有益である（Ｂａｋｅｒ，２００５）。

【0046】

抗体は、ジスルフィド結合により共有結合する２本の同一の重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖糖タンパク質からなる（図２ａ）。各免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）及び軽鎖（ＩｇＬ）ポリペプチドは、各抗体によって異なるＮ末端可変ドメインと、同じ免疫グロブリンサブタイプ（アイソタイプ）に属する異なる抗体間で同一のＣ末端定常領域とを含む（図２ａ）。ＩｇＨ鎖の可変ドメインとＩｇＬ鎖の可変ドメインとの組み合わせが、抗体の抗原結合ポケットを作り出してその特異性を決定する一方、定常領域は抗体の免疫エフェクター機能を決定する。免疫グロブリンのその可変ドメインにおける多様性は、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインが、Ｖ（可変部）、Ｄ（多様性）、及びＪ（接合部）遺伝子セグメントと命名される複数の遺伝子セグメントによってコードされるという事実に起因する。Ｂリンパ球の分化中、１つのＶ、１つのＤ（ＩｇＨ鎖の遺伝子座にのみ存在する）及び１つのＪ遺伝子セグメントが各細胞においてランダムに選択されて、部位特異的に再配列され、それによりＶ_Ｈ又はＶ_Ｌドメインのコード領域が生成される。この部位特異的遺伝子組換え過程は前駆リンパ球においてのみ起こり、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えとして公知である（Ｇｒａｗｕｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）（図２ｂ及び図２ｃも参照のこと）。遺伝子セグメントの再配列は、組換え活性化遺伝子（ＲＡＧ）１及び２産物によって媒介される。Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントは複数あり、且つ遺伝子セグメントの接合は不正確であるため、免疫系によって日々産生される何百万ものＢリンパ球により、異なるＶ領域特異性の膨大なレパートリーが生じ得る（Ｇｒａｗｕｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントを含むため、抗体のＶ_Ｈドメインのコード領域は２つの逐次的なＶ（Ｄ）Ｊ再配列イベントを必要とするが、それに対し、免疫グロブリン遺伝子座にはＤ遺伝子セグメントがなく、Ｖ_Ｌコード領域は１つのＶからＪへの再配列イベントによって生成される（図２ｃ）。従って、ＩｇＨ鎖のＣＤＲ３領域においてＶ（Ｄ）Ｊ組換えにより生じる接合部の多様性は、ＩｇＬ鎖についてただ１つの再配列イベントのみによって生じるＣＤＲ３接合部の多様性より大きい。加えて、その間にＩｇＨ鎖の遺伝子再配列が起こる初期のＢ細胞分化段階において、酵素の末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）が発現する。この酵素は、ＤのＪとの、及びＶのＤとの接合部に、鋳型によらないヌクレオチドを付加することができ（いわゆるＮ配列多様性）、ＩｇＨ鎖のＣＤＲ３レパートリーをさらに多様化させる。対照的に、ＩｇＬ鎖のＣＤＲ３レパートリーは、Ｂ細胞分化のなかでより後期の、ＴｄＴ発現が大部分下方制御されるときに、ＶがＪ遺伝子セグメントと接合して形成されるもので（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、いくらか複雑度が低い。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌコード領域にＣＤＲ３の多様性が生じること以外にも、ＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖の双方のレパートリーは、Ｔ細胞依存性免疫反応の過程で成熟Ｂ細胞において引き起こされる体細胞超突然変異のプロセスによってさらに多様化し得る（Ｐａｐａｖａｓｉｌｉｏｕ ＆ Ｓｃｈａｔｚ，２００２）。体細胞突然変異は、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌコード領域を特異的に標的化し、Ｂ系列特異的酵素である活性化誘導シチジンデアミナーゼ（略称ＡＩＤ、Ｐａｐａｖａｓｉｌｉｏｕ ＆ Ｓｃｈａｔｚ，２００２を参照）によって媒介される。免疫化のなかで起こる体細胞超突然変異の結果として、免疫原に対してより高親和性の抗体突然変異体を発現する細胞が、主として胚中心で起こる免疫化の過程で積極的に選択され、結果としてより高親和性の抗体を産生する細胞が濃縮される。ここで、これらの抗体はＣＤＲ１及び２にも突然変異を蓄積し、これが、抗体レパートリーの親和性成熟と称される過程である。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌコード領域に対するＡＩＤ媒介性の多様化及び特異的標的化は、シス調節遺伝子要素又はモチーフ、特に、再配列したＶ_Ｈ及びＶ_Ｌコード領域の近傍に位置するＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖遺伝子座のエンハンサー要素の存在によって著しく高まる（Ｂａｃｈｌ ＆ Ｏｌｓｓｏｎ，１９９９）。

【0047】

古典的な完全長治療用抗体に加え、完全ヒト抗体の断片、例えば、いわゆるＦ_ａｂ断片（図２ａ）、単鎖Ｆ_ｖ断片（図２ａ）、単一のＶ_Ｈドメインのみからなるナノボディ等を含む別の形態の結合タンパク質もまた、治療用及び診断用薬剤としてますます研究されるようになっている。しかしながら、当業者には、かかる機能的な抗体断片が、タンパク質ベースの標準的な生化学方法によるか、又は所望の完全長抗体のコーディング情報が利用可能であるならば、従来の分子生物学的方法により、完全長抗体から容易に得られることは明らかである。

【0048】

伝統的には、対象の分子又はエピトープ（抗原）に対するモノクローナル抗体は、小型の実験動物、又は家畜、例えば、それぞれ、マウス、ラット、ウサギ、又は、ヤギ及びロバを免疫化することにより生成される。繰り返し免疫化した後、動物は、ポリクローナル抗体をその血清から単離するため出血させるか、又は、モノクローナル抗体を生成するため、動物は屠殺され、それによりリンパ節又は脾臓のような二次リンパ器官からリンパ球が単離される。単離されたリンパ球を不死化骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマが生成され、続いてそのハイブリドーマがサブクローニングされ、所望の機能特性、例えば、特定の抗原又は標的との結合を呈するモノクローナル抗体の分泌についてスクリーニングされる。

【0049】

抗体工学における最初の技術躍進、すなわち、Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎによる、いわゆるモノクローナル抗体を生成するためのハイブリドーマ技術の開発（Ｋｏｅｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５）から、ヒト疾患の治療にモノクローナル抗体を用いることができるようになるまでには、長い時間を要した。

【0050】

抗体が臨床に登場するまでに時間がかかった主な理由は、ヒト患者の治療にげっ歯類抗体を用いたことに伴う当初の失敗であった。かかる抗体が患者の免疫系に入り込むと、免疫系はげっ歯類抗体を外来タンパク質と認識し、中和抗体の生成を含め、そうした抗体に対する免疫反応を開始する（ＨＡＭＡ＝ヒト抗マウス抗体反応として知られる）。ＨＡＭＡ反応は、半減期、ひいては適用された抗体の効力の著しい低下につながり得るとともに、さらには、入り込んだ非ヒトタンパク質に免疫系が過剰反応すれば、重篤な副作用にもつながり得る。

【0051】

従って、ヒト抗体に「より一層」類似した治療用抗体の開発には、医療上及び商業上、多大な利益があった。当初は、これは既存のげっ歯類抗体の遺伝子操作を用いて達成され、結果としてキメラ抗体、或いはヒト化抗体が開発された（Ｃｌａｒｋ，２０００）。キメラ抗体は、標準的な遺伝子操作及びクローン技術を用いて、げっ歯類抗体の可変結合ドメインをヒト抗体の定常領域と融合することにより生成される。ヒト化抗体は、対照的に、げっ歯類抗体由来の可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）のみをヒト抗体の可変領域フレームワークに導入することにより生成され、この導入もまた、標準的な分子生物学的技術によって行われる。キメラ抗体の生成手順は容易だが、これらの抗体はなお３３％の異種配列を含み、免疫原性となる高い可能性を内包する（Ｃｌａｒｋ，２０００）。実際、キメラ抗体のマウス部分に対する免疫反応は十分に考証されており、ＨＡＣＡ反応（ＨＡＣＡ＝ヒト抗キメラ抗体）と称される。

【0052】

前記とは対照的に、ヒト化抗体が免疫原性となる可能性は一層低下する。しかしながら、ヒト化抗体を遺伝子操作すると同時に、ＣＤＲグラフト後にも元のげっ歯類抗体の結合親和性及び特異性を維持する手順は単純なことではなく、突然変異生成とスクリーニングとのサイクルを繰り返すことにより、さらなる全面的な最適化が必要となることが多い。上述の理由から、キメラ化及びヒト化手法は、近年では、治療用抗体の開発に選択する方法としてはあまり評価されないようになっている。

【0053】

治療用抗体を開発するためのキメラ抗体及びヒト化抗体とは別の進展もまた、「完全ヒト」抗体の開発を可能にする革新的な技術プラットフォームの開発によって促進されており、この「完全ヒト」とは、アミノ酸配列がヒト血清抗体と同一であることによる。完全ヒト抗体は、理論的には、ヒト患者において免疫原性及び副作用が最も低いと考えられる。

【0054】

２つの最も確立されている「完全ヒト抗体」開発プラットフォームは：
Ａ）ヒト免疫グロブリントランスジェニックマウス技術、ここでは、生殖細胞系ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座の大型の導入遺伝子が、マウスゲノムに導入されている（Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，１９９８；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９８／２４８９３ Ａ２号パンフレット）。こうしたトランスジェニックマウスをヒト抗体の開発に用いるため、こうしたトランスジェニックマウス系統は、内因性マウス免疫グロブリン重鎖及びκ軽鎖遺伝子座に機能欠失を有する遺伝子ノックアウトマウス系統と交配されている。従って、こうしたヒト免疫グロブリントランスジェニックマウスは、免疫化すると、概してヒト液性免疫反応を開始する。但し、抗体産生細胞のほぼ半分はなお内因性マウスλ軽鎖を有するため、それらは以降の治療用抗体開発に使用することはできず、廃棄しなければならない。Ｂ）ファージディスプレイ技術、これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のバクテリオファージの表面上での、抗体断片（例えば、単鎖Ｆ_ｖ又はＦ_ａｂ断片のような）の高度に多様なライブラリの発現（ディスプレイ）に基づくものである（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９２／０１０４７ Ａ１号パンフレット）。特異的結合体を同定するため、適当な複雑度、品質及び起源のファージライブラリを固定化した抗原と結合させ（「パニング」）、それにより固定化抗原と結合するファージクローンを濃縮する。数回のパニングラウンド後、選択された結合性クローンの配列が確定される。この方法の変形例は、完全に無細胞のリボソームディスプレイ技術であり、ここで抗体断片は、ファージに提示されるのではなく、翻訳された結合体がなおリボソームに「付着する」条件下でのインビトロ転写及び翻訳により発現される（Ｈａｎｅｓ ＆ Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，１９９７）。ファージディスプレイ又はリボソームディスプレイのいずれについても、一つの非常に重要なステップは、結合性断片を操作して再び完全長抗体にし、次にこれを脊椎動物細胞内で発現させることである。これは、ファージ選択したクローンを操作して再び完全長抗体の形態にし、脊椎動物細胞で発現させた後、抗体が適切に発現できるかどうか、及び元のファージ結合特性がなお維持されているかどうか（これは必ずしも該当しないこともある）について分析する必要がある。

【0055】

ヒト免疫グロブリントランスジェニックマウス技術及びファージディスプレイ技術は、治療用抗体の開発に多大な影響を与えたが、双方の技術プラットフォームとも、それに関連する利点と欠点とを有する。

【0056】

トランスジェニックマウス技術の一つの利点は、こうしたマウスではインビボでの免疫化時に天然で親和性成熟が起こるため、高親和性抗体を送達できることであり、ヒトトランスジェニックマウスに由来する、所与の抗原に対するヒト抗体の親和性プロファイルが、野生型マウスと同等であり得ることが実証されている。しかしながら、ヒト免疫グロブリントランスジェニック動物に関連するいくつかの欠点として：
１）トランスジェニック動物が抗原に耐性を有する場合（これは、ほとんどの場合には、内因的に発現した宿主タンパク質と構造的に極めて類似していることに起因する）、かかる「保存された」抗原に対する高親和性抗体の生成は、結果として極めて困難か、又は不可能でさえあり得る。２）正常な野生型動物における場合と同じく、ヒト免疫グロブリントランスジェニック動物の抗体は、強力な抗原エピトープに対して選好的に生成され、従って、治療的価値のある、機能的だが弱いエピトープに対する抗体の開発は難題となり得る。３）最後に、ヒト免疫グロブリントランスジェニック動物は、既存の抗体の親和性を最適化するためには用いることができない。その理由は、トランスジェニック動物の生成に必要なタイムフレームが、１つの所与の抗体クローンを最適化するためだけとしては、長過ぎることである。かかる手法には、１つの特定の抗体について２つのＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖トランスジェニックマウス系統の生成が関わり得るとともに、次に、これらの２つのトランスジェニック系統を、内因性免疫グロブリン重鎖及びκ軽鎖の双方の発現能を欠く少なくとも２つのノックアウト動物系統に対して遺伝的に戻し交配することがさらに必要となり得るが、これは、数世代にわたる系統育成と長いタイムフレームが必要なプロセスである。

【0057】

上記と同じ制約が、最近報告されている技術プラットフォームにも該当し、これは、マウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座の生殖細胞系可変部（Ｖ）、多様性（Ｄ）及び接合部（Ｊ）遺伝子セグメントが、部位特異的遺伝子標的法により、ヒト生殖細胞系Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子領域（の各部）と置換されているマウスの開発に基づくものである（Ｍｕｒｐｈｙ ＆ Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，国際公開第０２／０６６６３０ Ａ１号パンフレット）。こうした「免疫グロブリン遺伝子ノックイン」マウスでは、マウスのＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントが、マウス生殖細胞系における相同組換えにより、ヒト免疫グロブリン遺伝子重鎖及び軽鎖遺伝子座のものと部位特異的に置換されている。従って、完全ヒト抗体を産生するヒト免疫グロブリントランスジェニックマウスと対照的に、このマウス系統は、マウス定常領域骨格にヒト抗原結合領域を有する「逆キメラ（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」抗体を産生する。

【0058】

ファージ及び／又はリボソームディスプレイ手法は、考えられる利点として、極めて高速の技術プラットフォームであることが挙げられ、これは、複雑度の高い結合タンパク質のライブラリからの最初の結合体の同定を、数週間以内で達成し得るためである。しかしながら、ファージディスプレイはまた、深刻な欠点も伴う。１）この系には親和性成熟が一切ないため、ファージ又はリボソームディスプレイスクリーンから高親和性の結合体を同定するのは、単純なことではない。この問題に対処するため、１０^１２個超のクローンに相当する極めて複雑度の高いファージライブラリが開発されている。しかしかかる複雑度の高いライブラリを用いたとしても、最初の結合性クローンは抗原に対して最適以下の親和性しか有しないことが多く、かかる結合体は、通常、煩雑で時間のかかるさらなる最適化手順を用いて最適化する必要がなおある。２）ファージディスプレイでは、ファージゲノムが比較的小さいサイズの分子のコード領域にしか対応できないため、発現するのはｓｃＦ_ｖ又はＦ_ａｂ断片などの抗体断片のみである。３）結合タンパク質は、ファージｇＩＩＩタンパク質などのキャリヤータンパク質と融合させる必要がある。結果として得られる融合タンパク質は、その親の抗体又は結合活性タンパク質と比較して低い抗原反応性を示すことがよくある（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ＆ Ｃｈａｍｅｓ，２０００）。４）ファージディスプレイが、ホモ及びヘテロ多量体形態の形成を通じて結合性の表現型を達成するタンパク質を制御された形で組み立てることは、例えば、二量体タンパク質は共有結合型のリンカー分子によって組み立てられざるを得ないため、容易に可能ではない。しかしながら、抗体工学の場合、あらゆる抗体重鎖がどの軽鎖とも対形成することができるわけではないため、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の適切に調節された組立ては必須である。５）細菌ベース又はバクテリオファージベースの系は、提示された対象のタンパク質の適切な翻訳後修飾（グリコシル化、ミリストイル化など）を提供せず、これは発現したタンパク質の結合特性に悪影響を及ぼすことが多い。６）原核生物の発現は、脊椎動物細胞と比較して異なるタンパク質のタンパク質フォールディングを生じ、これは、例えば、酸化還元電位及びシャペロンの欠如などの点で、細胞質環境が真核生物又は脊椎動物の宿主細胞と劇的に異なるためである。７）ファージ提示系は、続いて、極めて非生理学的な「パニング」条件下で抗原結合性又は捕捉性アッセイに供され、それにより反応性細胞が濃縮されるが、これは、高い割合の偽陽性結合体の同定につながり、最終的にはそうした偽陽性結合体を廃棄しなければならない。

【0059】

上述の欠点の結果として、ファージ−ディスプレイ選択された抗体断片の多くは、親和性がそれほど高くなく、及び／又は構造的アーチファクトを抱え得る。加えて、ファージディスプレイ選択された結合体を再び操作して、脊椎動物細胞内で完全長抗体として発現させると、ファージ選択された抗体が発現不良となるか、若しくは全く発現できないか、又は結合特性の変化を呈することが起こり得る。

【0060】

ヒト免疫グロブリントランスジェニック／ノックインマウス技術及びファージディスプレイの制約のいくつかに対処するため、最近では、ヒト抗体を発現する細胞を生じるインビトロでの一次マウスプレＢ細胞の遺伝子改変と、それに続く機能的Ｂ細胞コンパートメントを欠く免疫不全レシピエントマウスへのグラフトが関わる代替的な技術が開発されている（Ｇｒａｗｕｎｄｅｒ ＆ Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，国際公開第０３／０６８８１９ Ａ１号パンフレット）。これにより、グラフトされたマウスにおいてヒト抗体を発現するＢ細胞サブセットの部分的な再構成が起こり、続いてこのマウスは、任意の所望の抗原又はリガンドによって免疫化され得る。この技術を用いて新規の抗体若しくは結合タンパク質を開発したり、又は既存の抗体を、所定の標的に対するその親和性に関して最適化したりすることができる（Ｇｒａｗｕｎｄｅｒ ＆ Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，国際公開第０３／０６８８１９ Ａ１号パンフレット）。

【0061】

この方法では、レトロウイルス発現系を用いることが好ましく、これは、発現コンストラクトの単一のコピーの遺伝子導入を個々のプレＢ細胞に導入することができる（Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｓｔｉｔｚ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００５）ことが理由であり、また、どの抗体発現コンストラクトがマウスに対するグラフトに用いられるべきかについて（例えば、抗原が事前に選択された抗体ライブラリ、疾患を有する患者由来の抗体ライブラリ、又は個別の抗体クローン）、完全な選択の自由があることも理由である。従って、この技術の特定の利点は、抗体の新規開発、並びに既存の治療用抗体候補の最適化に適用することのできるその柔軟性である。

【0062】

完全ヒト抗体を開発するための他のげっ歯類ベースの系が記載されており、それには、ヒトドナーから単離されたヒト造血前駆細胞を免疫不全マウスに移植することが関わる（Ｍｏｓｉｅｒ ＆ Ｗｉｌｓｏｎ，国際公開第８９／１２８２３ Ａ１号パンフレット）。かかるヒト細胞グラフトマウスでは、ヒトＢ細胞はある程度成長するが、しかしながら、近年のこの方法の改良（Ｔｒａｇｇｉａｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）にもかかわらず、かかる「ヒト化マウス」においては、ヒト抗体の親和性成熟を含む満足のいく液性免疫反応は達成されない。加えて、ヒト免疫グロブリントランスジェニック又は「ノックイン」マウスの場合と同じく、既存の抗体は最適化することができない。

【0063】

いかなる種類のマウスベース抗体技術プラットフォームも、通常、インビボでの免疫化を必要とし、これは、インビトロ手法と比較したとき、依然として時間のかかる作業である。

【0064】

従って、前述のマウスに関連する手法に加え、最近では、様々な代替的なインビトロ技術が開発されている。しかしながら、高品質で高親和性の抗体産物の開発に、これらの系がどの程度効率的であるかを、なお立証する必要がある。あるインビトロ系は、特定の疾患を有するヒト患者からの、抗原によって濃縮された記憶Ｂ細胞の単離に基づき、このＢ細胞は、単離され、次にインビトロでエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）形質転換により不死化された後、抗原反応性ＥＢＶ系列についてスクリーニングされ得る（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，国際公開第０４／７６６７７ Ａ２号パンフレット）。着想は同様だが、しかし方法論は異なるものとして、初めに急性疾患病態を患う患者由来の抗体産生形質細胞を末梢血から単離し、次に非産生性のヘテロ骨髄腫との融合によって不死化した後、所望の抗体産生についてスクリーニングする手法がある（Ｌａｎｇ ｅｔ ａｌ，国際公開第９０／１３６６０ Ａ２号パンフレット）。或いは、ワクチン接種又は免疫化した個人からのＢ細胞の単離と、それに続く、細胞集団からの（Ｌａｗｓｏｎ ＆ Ｌｉｇｈｔｗｏｏｄ，国際公開第０４／１０６３７７ Ａ１号パンフレット；Ｓｃｈｒａｄｅｒ，国際公開第９２／０２５５１ Ａ１号パンフレット）、或いは単一細胞ＰＣＲ（Ｍｕｒａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，国際公開第０４／０５１２６６ Ａ１号パンフレット）による、特異的抗体遺伝子の単離及びクローニングを目的とする方法が記載されている。しかしながら、これらの技術はいずれも、ヒト患者における関連Ｂ細胞集団の利用可能性に依存し、その一般的な利用に関しては極めて限られているため、主に抗感染症治療用抗体候補の同定に用いられている。さらに、いずれのヒトＢ細胞ベースのスクリーニング手法でも、抗体の親和性成熟、若しくは抗原特異的な開発、又は既存の抗体の最適化は不可能である。

【0065】

従って、最近では、さらなる代替的インビトロ方法が記載されており、これには、一時的な発現系を用いた真核細胞における組換え抗体の発現及びスクリーニングが関わる（Ｚａｕｄｅｒｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ，国際公開第０２／１０２８５５ Ａ２号パンフレット及びＢｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ，国際公開第０８／０５５７９５ Ａ１号パンフレット）。こうした系は、トランスジェニックマウス技術、ファージディスプレイ技術及びヒトＢ細胞に由来する技術のボトルネックの一部を解決するが、こうした系は、なお数多くの制約を特徴とする。第一に、公知の真核細胞ベースの抗体発現／スクリーニング技術は、組換え抗体に安定的な発現パターンをもたらさず、所望の結合特異性を有する抗体発現細胞の濃縮サイクルの繰り返しを避けることができない。第二に、真核細胞ベースの抗体発現が関わる公知の手法はいずれも、結合体クローンのクローン発現を制御することができず、従って、治療用抗体開発の場合には、所望の抗原又はリガンド結合活性を有するＩｇＨ鎖とＩｇＬ鎖との対応する対を同定することが難題となる。第三に、Ｚａｕｄｅｒｅｒ及びＳｍｉｔｈ（国際公開第０２／１０２８５５ Ａ２号パンフレット）に記載される技術は、いかなるインビトロ突然変異生成も、又は発現した抗体の遺伝子組換えも不可能であり、この方法は、単にスクリーニング手順に過ぎない。従って、結合タンパク質の親和性成熟の側面は、この技術によっては対処されない。最後に、真核生物の発現／スクリーニング系はいずれも、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントのＶ（Ｄ）Ｊ組換えの機序を活用した、個々の抗体発現コンストラクトからのインサイチュでの多様な抗体レパートリーの生成と適合しない。

【0066】

Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ（欧州特許出願公開第１ ０４１ １４３ Ａ号明細書）により、生物学的に活性なペプチド及び核酸を同定するための代替的方法が提案されている。欧州特許出願公開第１ ０４１ １４３ Ａ号明細書に記載されている好ましい方法は、個々の細胞が数多くの異なるＲＮＡ又はペプチドを発現することができるように、多数のレトロウイルスベクターが細胞に導入され得る初期スクリーニング手順を含む。続いて表現型の変化を示す細胞が単離され、当該クローンのレトロウイルスＤＮＡがＰＣＲにより単離される。次に、このＰＣＲ産物を用いてウイルスパッケージング細胞を再トランスフェクトし、さらなるレトロウイルスベクターを作成することができる。次に、これらのレトロウイルスベクターを用いて種々の細胞を形質導入することができ、最終的に、第２のクローニング手順後、活性物質を同定することができる。本質的に、この方法によると、生物学的に活性なペプチド又は核酸の移入によって細胞の表現型に間接的な変化がもたらされる。これは、レトロウイルスで形質導入したコンストラクトが結合タンパク質、好ましくは抗体を直接コードし、それがスクリーニングの対象となる本発明の方法とは対照的である。また、欧州特許出願公開第１ ０４１ １４３ Ａ号明細書に記載されるペプチド及び核酸は、本発明の方法によって同定される抗体又は抗体断片とはサイズが大幅に異なることも留意されるべきである。

【0067】

別のレトロウイルスベースのゲノムスクリーニング方法が、国際公開第０３／０８３０７５ Ａ２号パンフレット（Ｂｒｅｍｅｌ ｅｔ ａｌ）に記載される。この方法は、特徴付けられていない遺伝子及びタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ配列の発現及びスクリーニングに関する。ある細胞系にレトロウイルス発現コンストラクトを形質導入し、それによりゲノムＤＮＡウイルスがプロウイルスとしてその細胞系のゲノムに挿入され、次にプロウイルスからのポリペプチドの発現を直接分析する方法が記載される。かかる方法は、細胞系を濃縮する機会も、また分析の実施前に発現したポリペプチドを単離及び同定する機会も提供せず、これはＢｒｅｍｅｌ及び共同研究者によって開発されたハイスループットスクリーニング技術を損なうものであり得る。

【0068】

Ｂｅｅｒｌｉ及び共同研究者から最近公表された特許出願（国際公開第０８／０５５７９５ Ａ１号パンフレット）は、ヒト抗体を単離するためのスクリーニングプラットフォームについて記載しており、これはシンドビスウイルス発現系を利用する。このプラットフォームの本質的な特徴は、対象の抗原に対して特異的なＢ細胞が、ヒトドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から直接単離される出発ライブラリの生成である。このＢ細胞のプールから組換えの抗原反応性ｓｃＦｖライブラリが生成され、シンドビスウイルス発現系を用いる哺乳類細胞表面提示によってスクリーニングされる。ファージディスプレイと同様に、この系の欠点の一つは、対象のｓｃＦｖを再度操作して、脊椎動物細胞内で完全長ＩｇＧとして発現させなければならないことである。こうした抗体は脊椎動物細胞では良好に発現せず、及び／又は結合特性の変化を示し得るため、かかるプロセスは、変換時の対象抗体の親和性の喪失を伴い得る。

【0069】

対照的に、本明細書に開示される本発明は、結合タンパク質、好ましくは抗体、又はその断片を開発及び最適化するための方法の、固有の、且つ極めて強力な組み合わせを含む。マウスベースの技術と比較して、本明細書に開示される本発明の主な利点は、抗体の最適化及び新規開発の観点における完全な柔軟性、並びに特異的結合体を短時間で同定する速さである。本発明の全ての態様はインビトロで実現されるため、種間で高度に保存されているか、又は実験動物において毒性を有し得る抗原に対する抗体の開発に関して、制約がない。

【0070】

ファージディスプレイベースの技術と比較して、本明細書に開示される本発明の鍵となる利点は、結合タンパク質、特に抗体が、脊椎動物細胞内、好ましくはＢリンパ球環境、すなわち抗体の天然の宿主細胞内で完全長抗体として発現することができ、そのため最も自然で適切なタンパク質フォールディング、正しい翻訳後修飾、及び重鎖と軽鎖との対形成の質の制御が確実となることである。

【0071】

ヒトＢ細胞手法と比較して、開示される本発明の鍵となる利点は、任意の所望の標的に対する抗体の開発に関する完全な柔軟性、既存の抗体の親和性を最適化可能であること、その系においてどのタイプの抗体を発現させるか（抗原によって濃縮されたもの、合成のもの、患者由来のもの、ＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖シャフリングの条件下で、等）に関する完全な選択の自由である。

【0072】

プラスミドベースの発現コンストラクト又は組込みのないウイルスベクターのいずれかが関わる他の真核細胞ベースの発現系と比較して、「レトロ細胞ディスプレイ」の開示される本発明の鍵となる利点は、レトロウイルス遺伝子導入技術を用いることにより、安定的で持続的なクローン発現を実現できることである。標的細胞内で組換え抗体が安定的で持続的なクローン発現をすることにより、抗体遺伝子を同定するためのモノクローナル細胞の単離及び増殖が可能であることを含め、抗原特異的又はリガンド特異的細胞の反復的な濃縮サイクルが可能となる。さらに、本明細書に開示される本発明では、単一のレトロウイルスコンストラクトを用いたインサイチュでの脊椎動物宿主細胞へのレトロウイルス形質導入時に、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えのリンパ球特異的機序を活用するか、或いは体細胞超突然変異の過程を活用して結合タンパク質をさらに突然変異生成させることにより、さらなる遺伝的多様性を生じさせることがさらに可能である。

【0073】

従って、当該技術分野において知られている治療用抗体を開発するための公知の技術のいずれと比較しても、本明細書に開示されるレトロ細胞ディスプレイ方法は、既存の技術が被る多くの顕著な制約に対し、独自の新しい強力な解決策を提供する。

【0074】

本明細書に開示される本発明は、対象のリガンド又は抗原と特異的に結合する結合タンパク質の発現、スクリーニング及び同定に広範に適用することができる。本発明は、限定はされないが、単量体、ホモ又はヘテロ多量体の膜結合型受容体、例えば、Ｔ細胞受容体、サイトカイン、又はケモカイン受容体を含め、任意の結合タンパク質で、また、他の足場タンパク質でも実施することができるが、本発明に係る好ましい結合タンパク質は完全長抗体であり、完全ヒト抗体が特に好ましい。しかしながら、限定はされないが、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦ_ｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、単一のＶ_Ｈ若しくはＶ_Ｌドメイン、単一の重鎖若しくは軽鎖、又はそれらの任意の組み合わせを含め、任意の天然に存在する、又は人工的に操作された改変を伴う抗体の任意の（機能的）断片を用いて本発明を実現し得ることは理解されるべきである。完全長抗体に関しては、本発明は、特に、例えば、単に例示としていくつかの方法を挙げれば、部位特異的若しくは領域特異的突然変異生成、異なる抗体由来の天然に存在する配列の融合、ＣＤＲ配列のランダム化、ＤＮＡシャフリング、エラープローンＰＣＲによって生じさせた改変など、抗体結合領域のいかなる種類の人工的に操作又は設計された改変にも適用することが可能である。

【0075】

本発明に係る結合タンパク質の発現に好ましい方法は、脊椎動物宿主細胞のレトロウイルスベクター媒介性の形質導入の使用である。

【0076】

レトロウイルスベクターの使用は、遺伝子治療の分野で長年にわたり調査されている。例えば、特定の細胞型を標的とすることのできるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを操作するため、Ｐｅｒａｂｏ ｅｔ ａｌ．（国際公開第０３／０５４１９７ Ａ２号パンフレット）は、標的ペプチドをコードするランダム化配列を、ウイルスのカプシド遺伝子のなかの、一次細胞受容体との結合に重要な部位に挿入してＡＡＶライブラリを作成しており、このＡＡＶライブラリはウイルスカプシドのコンテクストでペプチドを提示した。培養環境によってもたらされる選択圧が、感染過程における各ステップ、すなわち、結合、取込み、脱殻、核転座、複製、及び遺伝子発現を完遂するウイルスクローンの能力による選択を駆動した。この技法を用いることにより、白血病細胞に効率的に形質導入するベクターが生成された。かかる技法は、それまで野生型ＡＡＶによる感染に対して耐性を有した標的細胞を感染させるウイルス突然変異体を生成するために有用であり得るが、これは、インビトロでの結合タンパク質の多様なコレクションの生成をもたらすものではない。

【0077】

そのため、結合タンパク質を発現させるための本願に記載される方法は、真核生物及び／又は脊椎動物宿主細胞内での組換えタンパク質の発現について、当該技術分野において公知の任意の他の方法に優るいくつかの鍵となる利点を有する。

【0078】

１）組換えレトロウイルスコンストラクトは、宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれるため、安定的で持続的な発現の表現型の結合タンパク質をもたらす。２）「感染多重度」（ＭＯＩ）と称されるレトロウイルス粒子の標的細胞との比として適当なものを利用し、好ましくは０．１以下のＭＯＩで実施されることにより、レトロウイルス形質導入を制御することができ、それにより、レトロウイルス形質導入細胞の大部分が、宿主細胞ゲノムに組み込まれたただ１つの組換えレトロウイルスコンストラクトのみによって遺伝的に改変され、結果として少なくとも１つの所望の結合タンパク質のクローン発現が生じる。結合タンパク質のクローン発現は、個々の結合タンパク質の同定及びクローニングを大幅に促進するため、従ってこの態様は、本発明の好ましい実施形態に相当する。しかしながら、代替的実施形態において、本発明はまた、０．１より大きいＭＯＩでのレトロウイルス形質導入を用いて実現されてもよい。

【0079】

レトロ細胞ディスプレイの基礎としてのレトロウイルス形質導入の前述の利点にもかかわらず、脊椎動物宿主細胞内での組換え結合タンパク質の発現は、代替的方法、例えば、限定はされないが、一時的若しくは安定的なＤＮＡトランスフェクションか、ＲＮＡトランスフェクションにより、又はアデノウイルス若しくはポックスウイルスベースのベクターなどの、ＤＮＡベースのウイルスベクターの導入により、実現されてもよい−但し、前述の代替的方法はいずれも、脊椎動物宿主細胞内での結合タンパク質の安定的なクローン発現を、容易に制御可能な形で実現することはできない。

【0080】

本発明の実現に好ましい脊椎動物宿主細胞は、Ｂリンパ球系列の細胞、特に前駆Ｂリンパ球であり、前駆Ｂリンパ球は多くの場合に内因性抗体発現を欠くが、好ましいアクセサリータンパク質、例えば、適切なタンパク質フォールディング及び抗体構築のためのシャペロン、又は抗体分子の膜付着を促進するアクセサリー膜タンパク質、例えば、Ｂ細胞特異的Ｉｇα又はＩｇβタンパク質を発現する。

【0081】

脊椎動物宿主細胞内でのレトロウイルス形質導入による組換えタンパク質の発現の原理は、確立された手順であり、組換えレトロウイルスベクターの構築が関わる。組換えレトロウイルスベクターは比較的小型であり（組み込まれる組換えＤＮＡの最大サイズ：８〜１０ｋＢ）、且つ標準的な分子生物学的方法によりプラスミドベクターとしてクローニング及び操作することができ、このプラスミドベクターからレトロウイルスＲＮＡゲノムが転写され得る。野生型レトロウイルスゲノムが含む遺伝子は、ｇａｇと、ｐｏｌと、ｅｎｖとの３個のみであり、これらはそれぞれ、核コアタンパク質と、レトロウイルスインテグラーゼ、プロテアーゼ、ＲＮアーゼ、及び逆転写酵素と、エンベロープタンパク質とをコードする（図３ａ）。加えて、レトロウイルスゲノムは、レトロウイルスＲＮＡゲノムのウイルス粒子へのパッケージングに必要なプサイ（Ψ）配列などのシス調節配列と、レトロウイルス転写終結のためのポリＡシグナルと、最後に、いわゆるレトロウイルスの宿主細胞ゲノムへの組込みのためのプロモーター要素及びシグナルを含む５’及び３’長末端反復（ＬＴＲ）とを含む（図３ａ）。組換えレトロウイルスを構築するため、野生型レトロウイルスのｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖコード領域が、プロモーター又はエンハンサーなどの関連するシス調節要素を含む対象の遺伝子用の任意の発現カセットに置換される（図３ａ）。かかる組換えレトロウイルスゲノムを宿主ゲノムに安定的に組み込むため、レトロウイルスゲノムを含むプラスミドベクターは、いわゆるレトロウイルスパッケージング細胞系（ＰＣＬ）に一時的に、或いは安定的にトランスフェクトされなければならない。このＰＣＬは、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖによってコードされるウイルスの構造タンパク質を一時的又は安定的な形でトランス発現し、従って、組換えウイルスゲノム（導入ベクター）の、複製能を有しないレトロウイルス粒子へのパッケージングを可能とする（図３ｂ）。こうしたレトロウイルス粒子では、標的細胞のシングルラウンド感染（形質導入）が可能である（図３ｂ）。レトロウイルス粒子の標的細胞への侵入は、Ｅｎｖタンパク質が標的細胞上の特定の受容体と特異的に相互作用することによって媒介される。従って、Ｅｎｖタンパク質の性質が、同種の受容体を発現する特定の宿主細胞に対するレトロウイルス粒子のトロピズムを決定する。エコトロピックなレトロウイルスはげっ歯類細胞に限られ、アンホトロピックなレトロウイルスは、げっ歯類及びヒト細胞を含む様々な種に感染することができ、及びパントロピックなレトロウイルスは、あらゆる真核細胞膜上に存在する構造を介して細胞侵入が起こるため、細胞膜を有するいかなる複製細胞にも感染することができる。様々な異なるトロピズムを有するレトロウイルスベクター粒子はまた、単に例示としていくつか例を挙げれば、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）若しくはＨＩＶ及びＳＩＶなどの他のウイルスの異種エンベロープタンパク質、又はさらには細胞膜タンパク質を用いても生成することができる−「シュードタイピング」として公知の技法である。細胞侵入後、レトロウイルスはウイルスゲノムを宿主細胞に送達することができ、そこでウイルスタンパク質の媒介によりゲノムがｃＤＮＡに逆転写され、最終的には宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれて、送達された遺伝子の安定発現が可能となる（図３ｂ）。本発明の好ましい実施形態では、エコトロピックＭＬＶ粒子が、マウスＢ細胞への遺伝子導入の媒介に用いられる。しかしながら、当業者は、任意の他のエンベロープ又は膜貫通タンパク質でシュードタイピングした任意の感染性レトロウイルスベクターが、その親ドナー種、細胞型又はその発現と無関係な任意の適当な標的選択用細胞内において、ベクター細胞の侵入を媒介する同種受容体の形質導入を媒介するならば、それを本発明の実現に用い得ることを理解するであろう。

【0082】

レトロウイルスベクター媒介性の遺伝子導入を実現するため、導入ベクターを安定的に、或いは一時的に発現するパッケージング細胞の細胞培養上清から、ベクターを含むレトロウイルス粒子（組換えレトロウイルスゲノムの転写産物、又は導入ベクターを含む）が回収され得る（図３ｂ）。これは、当業者に公知の広範なプロトコル及びその変形例により実行することができる。本発明の好ましい実施形態は、標的細胞の形質導入を可能とするため、以下を実施することができる：１）パッケージング細胞をベクター粒子と分離する適当なろ過ステップ又は遠心ステップのいずれかの通過を用いた、無細胞レトロウイルス粒子を含む上清の調製。こうしたレトロウイルス粒子の調製物は、その後、様々なタイムフレームで同時インキュベートすることによるか、又はいわゆる「スピン感染」を実施することにより、脊椎動物宿主細胞の形質導入に用いられる。ここで、標的細胞懸濁液が、培地を含むレトロウイルス粒子と混合され、低速遠心に供される（図３ｂ）。２）或いは、レトロウイルス粒子の通過は許容するが、パッケージング細胞の通過は許容しない膜による、双方の細胞集団の細胞間接触又は分離を可能とする、標的細胞のパッケージング細胞との共培養。

【0083】

レトロウイルス形質導入のための宿主標的細胞として、本方法の好ましい実施形態は、内因性のマウス免疫グロブリンタンパク質を発現せず、且つエコトロピックな宿主範囲のレトロウイルスで形質導入することのできるげっ歯類由来のＢリンパ球系列細胞を使用する。Ｂリンパ球系列の細胞は、膜結合型完全長免疫グロブリンの細胞表面発現及び固定に好都合なＢ細胞特異的Ｉｇα及びＩｇβタンパク質を既に発現しているという利点を有する。その点で、免疫グロブリン陰性形質細胞由来細胞、例えば骨髄腫細胞、例として、限定はされないが、Ｓｐ２／０、ＮＳＯ、Ｘ６３及びＡｇ８６５３は、一般に膜免疫グロブリン付着のためのアクセサリーＩｇα及びＩｇβタンパク質をもたない。かかる場合、及びＩｇα及びＩｇβタンパク質を発現しない任意の他の脊椎動物宿主細胞においては、Ｉｇα及びＩｇβタンパク質の発現が当業者にとって標準的な手順でＩｇα及びＩｇβの発現ベクターのトランスフェクション又は形質導入時にもたらされるならば、本方法はなお適用され得る。従って、Ｉｇα及びＩｇβの双方のタンパク質を異所性発現させると、本方法は任意の脊椎動物宿主細胞系で実現され得るが、但しこれは、前記脊椎動物宿主細胞系を形質導入することのできる、適当なトロピズムを有するレトロウイルス粒子が産生されることが条件である。明確にすれば、パントロピックなレトロウイルス粒子（例えば、限定はされないが、ＶＳＶのＧタンパク質によりシュードタイピングされた粒子）が、免疫グロブリンアンカー分子Ｉｇα及びＩｇβを異所的に発現するよう改変された宿主細胞と併せて用いられる場合、本明細書に開示される本発明は任意の脊椎動物宿主細胞で実現され得る。

【0084】

Ｂリンパ球系列の好ましい細胞は、例えば、限定はされないが、任意の脊椎動物種由来の、前駆Ｂ細胞、Ｂ白血病細胞又はＢリンパ腫細胞であり、また、組織培養で長期間にわたり増殖させることのできる一次前駆Ｂ細胞もある。前駆Ｂリンパ球は、かかる細胞系の大部分が内因性の免疫グロブリンタンパク質を発現しないため、免疫グロブリンのレトロウイルス発現に理想的な宿主細胞であり得る。特に、マウスプレＢ細胞系のような細胞は、エーベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭｕＬＶ）で形質転換することにより、任意のマウス系統から容易に得ることができる。しかしながら、長期増殖型の一次プレＢ細胞、並びにＡ−ＭｕＬＶ形質転換プレＢ細胞のいずれも、プレＢ細胞特異的タンパク質のＶｐｒｅＢ及びλ５を発現し、これらは合わせていわゆる代替軽鎖を形成する。代替軽鎖は、従来の軽鎖がないとき、免疫グロブリン重鎖と代替軽鎖とのプレＢ細胞受容体複合体を形成することができる。組換え重鎖及び軽鎖からなる免疫グロブリンを発現することが望ましいため、プレＢ細胞は、単一、二重又は三重遺伝子ノックアウトのいずれかとして、λ５、又はＶｐｒｅＢ１、又はＶｐｒｅＢ２遺伝子の遺伝子産物を含む代替軽鎖成分の発現を欠くものが好ましい。代替軽鎖は異種の重鎖と結合し得ることが知られているため、代替軽鎖の発現は、様々な程度でＩｇＨ／ＩｇＬ対のスクリーニングを妨害し得ることが予想されるが、しかしプレＢ細胞における代替軽鎖タンパク質の発現レベルは概して低いため、本方法は、なお、代替軽鎖成分を発現する野生型プレＢ細胞を使用して実現することができる。要約すれば、Ｉｇα及びＩｇβを発現し、且つ内因性免疫グロブリンタンパク質を発現しない任意の脊椎動物細胞系を、本方法の標的宿主細胞として用いることができ、代替軽鎖欠損プレＢ細胞が、本発明の実現に好ましい宿主細胞である。

【0085】

発現、スクリーニング、及び同定に好ましい結合タンパク質は、完全長抗体、及びアミノ酸配列上、完全にヒト型の免疫グロブリンである。しかしながら、脊椎動物細胞内での細胞発現が可能な任意の結合タンパク質が、本開示の方法に従い特異的リガンド又は抗原結合性についてのスクリーニング及び選択に供され得ることは理解されなければならない。例えば、かかる結合タンパク質としては、任意の脊椎動物種由来の抗体の断片、例えば、単鎖Ｆｖ、Ｆａｂ断片（図２ａ）又は単一のＶ_Ｈ若しくはＶ_Ｌドメイン、又は重鎖若しくは軽鎖を挙げることができ、これらは好ましくは細胞表面膜への付着が可能となる形で発現する。これは、例えば、ＧＰＩアンカードメインを利用して、他のＩ型膜貫通タンパク質の膜アンカーと融合することによるか、又は他の当該技術分野において公知の方法により実現され得る。さらに、本方法はまた、他の膜結合型タンパク質、例えば、限定はされないが、単量体若しくは多量体サイトカイン受容体、又は二量体Ｔ細胞受容体などにも適用可能であり得る。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のレトロウイルス発現は、好ましくは、重鎖用及び軽鎖の別個のレトロウイルス発現コンストラクトを逐次的に形質導入することにより実現される。しかしながら、本発明はまた、標的細胞の同時形質導入を実施することによっても実現することができ、ここではＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖の別個のレトロウイルスコンストラクトが用いられる。異なるレトロウイルスベクターからＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖を別個に発現させると、免疫グロブリン重鎖の多様なコレクションをコードするレトロウイルスベクターのコレクションが、免疫グロブリン軽鎖の多様なコレクションをコードするレトロウイルス発現ベクターのコレクションとランダムに組み合わされ得るという利点がもたらされる。この、いわゆる重鎖と軽鎖とのシャフリングにより、重鎖及び軽鎖のコレクションの合計数が限られていても、種々の免疫グロブリン結合特異性の広範な多様性を生み出すことができる（例えば、１０^４本の異なる重鎖を１０^４本の異なる軽鎖とランダムに組み合わせると、理論的には１０^８種の異なる抗体特異性が得られる）。ＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖ベクターのコレクションのシャフリングは、好ましくは片側シャフリングで実施され、これはつまり、抗体の１本のポリペプチド鎖が、単一の抗体鎖をコードする単一のコンストラクトであることを意味する。

【0086】

しかしながら、レトロウイルスＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖の発現はまた、双方のタンパク質が同じレトロウイルス骨格上でコードされる場合にも実現され得ることは理解されるべきである（下記参照）。その最も簡単な構成では、重鎖及び軽鎖発現は、重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡを空のレトロウイルスベクターにクローニングすることによってもたらされ、この場合、発現は５’ＬＴＲのプロモーター活性によって駆動され、且つ適切なＲＮＡプロセシングは３’ＬＴＲ配列によって媒介される（図３ａ）。重鎖コンストラクトは、好ましくはその内因性の膜貫通コード領域を含むべきであり、それにより組換え免疫グロブリンの最適な膜付着が可能となる。しかしながら、当業者には、発現した改変免疫グロブリンの表面付着を確実にするため、他の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインを抗体の定常領域と融合させてもよいことは明らかである。特に、抗体断片の発現、又は免疫グロブリン以外の結合タンパク質の発現に関しては、結合体の細胞表面発現には異なる膜結合型タンパク質の膜貫通領域が有利であり得る。

【0087】

抗体又はその断片の細胞表面発現は本発明の好ましい実施形態であるが、或いはまた、これらの生体分子は、可溶性の分泌タンパク質として発現させて、従って抗体の検出が液相で実施されてもよい。かかる発現形態が有利となり得るのは、単一の産生クローン及び結合体のスクリーニングに可溶性抗体を必要とするアッセイが関わる場合か、又はアッセイが半流動培地で実施される場合であり、アッセイは、単細胞クローンに関する発現レベル及び結合特異性の定量化を可能にする。組換え免疫グロブリンの発現ベクターは、あらゆる既知の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖アイソタイプをコードするものが用いられてもよく、完全ヒト抗体の場合、Ｉｇκ軽鎖又はＩｇλ軽鎖のいずれかを含む、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２及びＩｇＥ抗体の発現が可能となる。ヒト重鎖及び軽鎖のいずれのレトロウイルス発現ベクターにおいても、ヒト重鎖及び軽鎖の可変部コード領域のみが、固有の制限酵素、例えば、限定はされないが、レトロウイルス抗体発現ベクターの概略図に示されるとおり（４ａ及び４ｂ）、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩを用いて置換され得ることが好ましい。これにより、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の定常コード領域に対してインフレームでの、Ｖ領域ライブラリ又は個々のＶ領域コード領域のいずれかによる、レトロウイルス発現ベクターにおける可変部コード領域のクローニング及び置換が容易に可能となる。単一の特異性をコードする発現ベクターの生成を目的とするか、或いは結合タンパク質のコレクションの生成を目的として、可変領域ドメインのみを交換するかかるスキームが好ましい。これに関連して、異なる種に由来する可変領域ドメイン及び定常領域ドメインを含む完全長抗体（キメラ抗体）を発現させてもよい。

【0088】

結合タンパク質の最も単純なレトロウイルス発現ベクターは、対象の結合タンパク質又は遺伝子のｃＤＮＡコード領域を「空の」レトロウイルス発現ベクター骨格に挿入することにより、構築することができる（図３ａ）。形質導入細胞の直接的な検出を可能にする選択マーカー及び／又はスクリーニングマーカー（例えば高感度緑色蛍光タンパク質、ＥＧＦＰ）が一切なくとも、本発明は実現することができ、これは、分泌型又は膜結合型のいずれかの形態の結合タンパク質の安定発現に基づいて、レトロウイルスベクターから結合タンパク質を安定的に発現する細胞を同定及び単離することができるためである。しかしながら、レトロウイルス発現ベクターには様々な特徴が含まれることが好ましい。第１の特徴は、組換え結合タンパク質の発現を駆動する強力な構成的又は誘導性プロモーター要素であり、これはコーディングｃＤＮＡ領域のすぐ上流に配置される（図４ａ、ｂ）。かかるプロモーターは、例えば、限定はされないが、前初期ＣＭＶプロモーター、βアクチンプロモーター、ＥＦ−１αプロモーターなどの構成的プロモーターか、又はテトラサイクリン誘導性若しくは任意の他の抗生物質誘導性プロモーターなどの、テトラサイクリン若しくは他の抗生物質及びドキシサイクリンなどのその誘導体を付加若しくは除去することにより発現を上方制御又は下方制御し得る誘導性プロモーターであり得る。レトロウイルスベクター骨格によっては、５’ＬＴＲプロモーターが、或いは強力な構成的プロモーターでさえも、サイレンシングされ得ることが知られているため、レトロウイルス発現コンストラクトには誘導性プロモーター要素を含めることが、別の好ましい実施形態である。

【0089】

プロモーター要素に加え、レトロウイルス発現コンストラクトにマーカー遺伝子を含めることが好ましい実施形態である。マーカー遺伝子により、後に、組換え結合タンパク質を検出することなく宿主細胞の安定的なレトロウイルス形質導入を選択及び／又はモニタすることが可能となる（図４ａ、ｂ）。選択及び／又はスクリーニングマーカーは、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖レトロウイルス発現ベクターの逐次的な形質導入が関わる好ましい二段階レトロウイルス形質導入プロトコルに特に有用である。二段階形質導入プロトコルでは、まず初めに、１本又は複数の第１の免疫グロブリンポリペプチド鎖をコードする少なくとも１つのレトロウイルス発現コンストラクトを脊椎動物宿主細胞に形質導入し、その少なくとも１本の第１のポリペプチド鎖が安定的に発現した後、１本又は複数の対応する他方の免疫グロブリンポリペプチド鎖をコードする少なくとも１つのレトロウイルス発現コンストラクトによる第２の形質導入を行い、次に、完全抗体又は抗体のコレクションを生成させる。第１の形質導入イベントの成功についての選択又はスクリーニングに選択又はスクリーニングマーカーが用いられる場合、これは、抗体のような多量体結合タンパク質の別個の鎖をコードする少なくとも２つのレトロウイルス発現コンストラクトの同時形質導入頻度を最適化するのに極めて有用である。従って、選択及び／又はスクリーニングマーカーの使用は極めて好ましい。

【0090】

哺乳類細胞の選択に有用な抗生物質耐性を付与する選択マーカーとしては、限定はされないが、例えば、ピューロマイシン、ネオマイシン、ハイグロマイシンＢ、ミコフェノール酸、ヒスチジノール、ブレオマイシン、及びフレオマイシンに対して耐性の遺伝子が挙げられる。別個のレトロウイルスコンストラクトによってコードされた抗体のような多量体タンパク質を発現させるには、異なるポリペプチド鎖の発現を異なる選択マーカーと関連付けることが好ましく、それにより、対応する発現コンストラクトの安定的な形質導入について個別に選択することが可能となる。

【0091】

宿主細胞へのレトロウイルス形質導入のモニタリングを可能にするマーカー遺伝子としては、限定はされないが、形質導入細胞に自己蛍光を付与する遺伝子、例えば、限定はされないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）及び赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）が挙げられる。或いは、ＣＤ７若しくはそのトランケート型変異体、ＣＤ３４若しくはそのトランケート型変異体、又は低親和性神経成長因子受容体などの細胞表面マーカーが用いられてもよい。好ましい実施形態において、こうした抗生物質選択マーカー、蛍光マーカー又は細胞表面マーカーの発現は、いわゆる内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）を介した組換え結合タンパク質の発現と関連し、このＩＲＥＳにより、脊椎動物細胞では、単一のプロモーター要素から２つの遺伝子が併せて同時に発現することが可能となる（図４ｂ）。しかしながら、当業者はまた、別のプロモーター要素によって駆動される別個の発現カセットがレトロウイルスコンストラクトに含まれ、その発現カセットから選択及び／又はマーカー遺伝子を発現させることによっても、本発明を実現することができる。免疫グロブリンのような多量体タンパク質を別個のレトロウイルスベクターから発現させるには、種々の結合タンパク質鎖ごとに異なる選択及び／又はスクリーニングマーカーと連結されることが好ましく、それにより、種々の発現コンストラクトの安定的な形質導入を個別にモニタすることが可能となる。

【0092】

上記に概説されるとおり、組換え結合タンパク質の発現が別個のプロモーターによって駆動される場合、任意の選択又はスクリーニングマーカー遺伝子は、５’ＬＴＲの下流並びに５’ＬＴＲ及びΨパッケージングシグナルの下流にクローニングされ、従ってその発現が５’ＬＴＲプロモーターによって駆動されてもよい（図３及び図４を参照）。

【0093】

上述されるとおり、本発明の好ましい実施形態は、Ｂリンパ球系列の細胞内、好ましくはプレＢリンパ球内で組換え抗体又はその断片を発現することである。従って、組換え抗体の発現を、Ｂ系列細胞において選択的に高レベルな発現をもたらすことが知られているプロモーターとエンハンサーとの組み合わせによって駆動することがさらに好ましい。かかるプロモーター／エンハンサーの組み合わせは、例えば、限定はされないが、免疫グロブリンκ軽鎖プロモーターと、κ−イントロンと、３’κエンハンサーとの組み合わせ、又は免疫グロブリン重鎖と、重鎖イントロンと及び３’αエンハンサーとの組み合わせであり得る。免疫グロブリンκ軽鎖プロモーターと、κ−イントロンと、３’κエンハンサーとの組み合わせが好ましく（図４ａ、ｂ）、これは、この組み合わせが、Ｂ系列細胞内での免疫グロブリン鎖の高レベル発現を可能にするとともに、シス調節遺伝子要素のこの組み合わせが、活性化Ｂ細胞特異的酵素ＡＩＤ（活性化誘導シチジンデアミナーゼ）によって媒介される調節的な様式での抗体のコード領域に対する体細胞超突然変異を促進可能であることが知られているためである。この体細胞超突然変異は、以下でさらに詳述されるとおり、本発明の実施形態である。

【0094】

しかしながら、当業者は、本発明を実現するためのレトロウイルスベクターにおける特定の組換え抗体の発現が、所望の脊椎動物宿主細胞内での抗体の発現を、細胞表面膜上で、或いは分泌形態で可能にするシス調節性プロモーター／エンハンサー要素とコード領域との任意の組み合わせによって生じ得ることを理解するであろう。

【0095】

別個のレトロウイルス発現コンストラクトから抗体などの多量体結合タンパク質を発現させることが、本発明の好ましい実施形態であるが（図４ａ及びｂ）、本発明はまた、多量体結合タンパク質の異なるタンパク質鎖の発現が、同じレトロウイルス発現コンストラクトと関連している場合にも、実現され得る。免疫グロブリンの場合、これは、限定はされないが、１つのプロモーターからの重鎖及び軽鎖の発現、及びＩＲＥＳ配列による重鎖及び軽鎖のコード領域の分離によって達成され得る。この代替例では、重鎖をプロモーターのすぐ下流に、及び軽鎖をＩＲＥＳの下流にクローニングすることが好ましく、これは、ＩＲＥＳに続く遺伝子が、多くの場合にＩＲＥＳの上流の遺伝子よりいくらか低いレベルで発現することが知られているためである。軽鎖は小型の分子であるため、軽鎖の発現がＩＲＥＳを介して制御される場合、ＩＲＥＳ連結を介して発現される重鎖及び軽鎖の化学量論的発現が、より良好に実現されると予想される。

【0096】

或いは、個々の各結合タンパク質鎖の発現が別個に制御されるように、２つの別個の発現カセットを単一のレトロウイルス骨格にクローニングすることにより、抗体などの二量体結合タンパク質の２本の鎖の同時発現が実現されてもよい。この手法の代替として、また、相反する方向への転写活性をもたらす双方向プロモーターを用いることにより、同じベクターにおける２本の異なる結合タンパク質鎖の発現を関連付けることも可能である。後者の選択肢は、近接したプロモーターの発現レベルに悪影響を及ぼし得るプロモーター干渉が起こらないという潜在的な利点を有する。

【0097】

例えば免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖などの、２つの結合タンパク質コード領域を有するレトロウイルスベクターの詳細な遺伝子構成にかかわらず、この方法によれば、結合タンパク質対を標的細胞に単回でレトロウイルス遺伝子導入することが可能な点は強調されるべきであり、それにより二量体結合タンパク質のクローン発現の制御を促進することが可能となり、且つ、二段階レトロウイルス形質導入プロトコルと比較して、結合体を発現する細胞集団を生成するためのタイムフレームが短縮される。

【0098】

プロモーター及びエンハンサーなどのシス調節遺伝子要素、並びに抗生物質耐性マーカー及び自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子などの選択可能又はスクリーニング可能なマーカー遺伝子に加え、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のコード領域を、種々のコンテクストでレトロウイルス発現ベクターにクローニングすることができる。

【0099】

本発明の好ましい実施形態において、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖コード領域は、適切な表面発現及び／又は分泌に必要なリーダー配列を含む連続したｃＤＮＡ配列として、レトロウイルス発現コンストラクトにクローニングされる。エンハンサー要素を伴うかかる発現ベクターの基本的な設計の例が、図４ａに図示される。好ましくは、重鎖はヒトγ１重鎖アイソタイプをコードし、軽鎖はκ軽鎖アイソタイプをコードするが、しかしながら、本発明を実現するため、ヒト又は他の脊椎動物種の任意の他の重鎖及び軽鎖アイソタイプが用いられ得ることが理解されるべきである。かかるレトロウイルスｃＤＮＡ発現ベクターでは、可変部コード領域と定常部コード領域との間の接合部に固有の制限酵素を含むことが好ましく、これにより、発現する抗体の特異性を変化させるためＶ_Ｈ及びＶ_Ｌコード領域のみを置換することが可能となったり、又は標的細胞において多様なレトロウイルス抗体ライブラリを発現させるため、多数のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌコード領域を挿入することが可能となったりし得る。好ましい実施形態において、Ｖ_Ｈ−Ｃγ１とＶ_Ｌ−Ｃκとの境界に導入される制限酵素部位はＥｃｏ４７ＩＩＩ部位であり（図４ａ、ｂ）、これは発現する重鎖のアミノ酸組成を変化させることがなく、定常部κコード領域の第１位における保存されたスレオニンからセリンへのアミノ酸変化をもたらすのみであり、この変化は、レトロウイルスにより発現するヒトＩｇＧ_１分子の結合特性には影響しない。

【0100】

ｃＤＮＡ構成にある、異種で、好ましくは完全ヒト型の抗体のコーディング情報を含むレトロウイルスコンストラクトの代替例として、生殖細胞系の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に見られる典型的なエクソン−イントロン構造を有するゲノム構成のコード領域を含むレトロウイルス発現ベクターが用いられてもよい。レトロウイルスベクターは、レトロウイルス粒子のパッケージング時にｍＲＮＡに転写されるため、発現コンストラクトのかかる構成は、コード領域の転写構成が、レトロウイルスゲノムの５’ＬＴＲの転写方向と逆方向に延びることを必要とする。これは、そうでなければ、組換えコンストラクトが標的細胞に形質導入されて安定的に組み込まれる前に、レトロウイルス導入ベクターが既にスプライシングを受け、その時エクソン−イントロン構造が失わるであろうためである。しかしながら、こうしたコンストラクトは、抗体を膜結合型又は分泌型のいずれかの抗体として発現させ得る機能性を提供する。いずれの抗体として発現するかは、形質導入の標的となる細胞の性質と、標的細胞が、分泌型抗体の内部終止コドンで転写を終結させる能力を有するのか、それとも、分泌型抗体の終止コドン上流のスプライスドナーの選択的スプライシングにより、膜結合型免疫グロブリンの膜貫通エクソンのアクセプターをスプライスする能力を有するのかに依存する。

【0101】

本発明の好ましい態様は、ヒト抗体又は任意の異種抗体又はその断片のレトロウイルス発現コンストラクトの生成及び利用であり、ここで重鎖及び／又は軽鎖の可変部コード領域は、さらにＶ（Ｄ）Ｊ組換えの過程により、「準生殖細胞系」配置にあるＶ、場合によりＤ、及びＪ遺伝子セグメントから、標的細胞に組み立てられる必要がある。かかる発現ベクターの基本的設計の説明が図４ｂに図示され、これは再配列されていないコンストラクトの特徴をなお共有しており、重鎖及び軽鎖の「生殖細胞系」Ｖ−Ｄ−Ｊ又はＶ−Ｊカセットは、好ましくはＪ要素コード領域の３’側境界のＥｃｏ４７ＩＩＩを含む固有の制限酵素部位によって置換することができる。かかるベクターに含まれるＶ、Ｄ及びＪ要素は、保存された組換えシグナル配列（ＲＳＳ）に隣接し、このＲＳＳは、組換え活性化遺伝子（ＲＡＧ）１及び２の認識モチーフであることが公知である。任意の脊椎動物細胞においてＲＡＧ１及びＲＡＧ２を同時発現させると、かかるベクターは、Ｖ、場合によりＤ及びＪ遺伝子セグメントを部位特異的に組み換え、それにより、抗体重鎖及び軽鎖の可変ドメインをそれぞれコードするＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域が生成される。ＲＡＧ−１及びＲＡＧ−２遺伝子の発現、従ってＶ（Ｄ）Ｊ組換え活性は、通常、初期前駆リンパ球に限られている。従って、好ましくは前駆リンパ球を用いて本発明を実現すると、自動的にＶ（Ｄ）Ｊ組換えの活性が提供される。しかしながら、ＲＡＧ−１及びＲＡＧ−２を過剰発現させると、任意の体細胞性の脊椎動物細胞系のＶ（Ｄ）Ｊ組換え能が高まり得ることが公知であり、従って当業者は、本発明のこの態様を、任意の非前駆リンパ球細胞系で、ＲＡＧ−１及びＲＡＧ−２の異所性発現をもたらすことにより実現してもよい。代替例として、ＲＡＧ−１又はＲＡＧ−２欠損細胞系であっても用いることができ、ここでは、ＲＡＧ−１又はＲＡＧ−２の欠損が、対応するＲＡＧ遺伝子又はその断片の過剰発現によって補完される。

【0102】

かかるＶ（Ｄ）Ｊ再配列可能なコンストラクトは、脊椎動物宿主細胞に安定的に形質導入される単一のレトロウイルス発現コンストラクトから、ＲＡＧ−１及びＲＡＧ−２媒介性のＶ（Ｄ）Ｊ組換えを介して、抗体特異性の多様なレパートリーを生成することができるという利点を有する。

【0103】

Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子要素の接合部は、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ相補性決定領域（ＣＤＲ）３に見られる多様なアミノ酸配列に大きく寄与する不正確さの大部分に関与することが公知であるが、いくつかのＶ領域ファミリー、Ｄ及びＪ要素に相当するＶ−Ｄ−Ｊ−Ｃγ１及びＶ−Ｊ−Ｃκレトロウイルスコンストラクトのコレクションを用いることが好ましく、それにより、既に生殖細胞系遺伝子セグメント配列のレベルで提供されている多様性が高まる。それにもかかわらず、好ましくは、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの過程によって媒介されるＶ、場合によりＤ、及びＪ遺伝子セグメントの体細胞組立てを可能にするレトロウイルスコンストラクトを用いれば、インサイチュで前駆リンパ球に形質導入したときに、可変ドメイン結合領域の高い多様性を生じさせることができ、従って、単一の、又は限られた数のコンストラクトから、ＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖の多様なコレクションを生成することができるであろう。

【0104】

Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの不正確な接合によって生じる多様性は、前駆リンパ球特異的に発現する遺伝子である末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）が存在することによって大幅に高まる。ＴｄＴは、相補的な鋳型ＤＮＡ鎖がなくともヌクレオチドを３’ＤＮＡ末端に付加することのできる唯一のＤＮＡポリメラーゼである。接合の多様性を高めるため、内因性ＴｄＴ発現レベルの高い細胞を用いるか、或いは、当該技術分野において公知の方法により、レトロ細胞ディスプレイに用いられる標的宿主細胞内でＴｄＴを異所的に発現させるか、そのいずれかが好ましい。

【0105】

本発明の別の実施形態は、２つ以上のＶ、又はＤ又はＪ遺伝子セグメントを含むＶ（Ｄ）Ｊ再配列可能レトロウイルスコンストラクトの使用であり、従って、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの過程により、同じコンストラクトからの各再配列クローンによって異なるＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントが用いられ得る。かかるコンストラクトへの多数の異なるＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの取込みは、ＤＮＡを受け入れるレトロウイルスベクターの総合的な能力によってのみ制限され、その能力は、最大８〜１０キロベースの範囲であると報告されている。

【0106】

異種抗体又はその断片の発現にＶ（Ｄ）Ｊ組換え能を有するレトロウイルスコンストラクト（図４ａ，ｂの下側パネル）を用いることは、本発明の態様であるが、この手法による多様なレパートリーの生成は、主として、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３領域における多様性の生成に限定されてことは明らかであり、これは、初期Ｂリンパ球新生中に生成される一次抗体レパートリーの特徴と非常に類似している。

【0107】

適応免疫系の特徴は、抗体可変ドメインの親和性成熟のその能力であり、これは、可変ドメインコード領域の体細胞超突然変異に基づく。体細胞超突然変異は、酵素の活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）によって著しく亢進することが公知である。さらに、高レベルの体細胞超突然変異は、免疫グロブリン遺伝子座からのシス調節性エンハンサー要素の存在に依存し、有益な作用は、Ｉｇκイントロンと３’κエンハンサー要素との組み合わせについて最も明確に記載されている。従って、本発明の態様は、当該技術分野において公知の方法により、これらのシス調節要素を含むレトロウイルス発現コンストラクトを用いて、かかる免疫グロブリン発現コンストラクトを構成的に、或いは誘導的に、ＡＩＤ酵素を内因的又は異所的に発現する標的細胞内に、レトロウイルスにより発現させることである。

【0108】

体細胞超突然変異能を有するレトロウイルスコンストラクトのコンテクストで、且つＡＩＤ発現宿主細胞のコンテクストで「レトロ細胞ディスプレイ」を適用することにより、ＡＩＤ発現宿主細胞への形質導入後、インサイチュで抗体をさらに多様化することが可能となる。

【0109】

本発明のこれらの態様の組み合わせは、適応免疫系で起こるあらゆる分子的及び遺伝的イベント、すなわち、限られた数のＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントを含む１つ又は限られた数のコンストラクトからの一次抗体レパートリーの生成、及び追加的な、抗体の抗原結合性可変ドメインのコード領域のＡＩＤ媒介性の体細胞超突然変異を再現するものである。

【0110】

所望の抗原に対してより高親和性の抗体結合体の特異的選択は、レトロ細胞ディスプレイにより、標準的なＦＡＣＳベースの技術と、それに続く強力な抗原結合体の高速の予備的細胞分取によって検出される所望の選択抗原に対する高い結合性を介して達成することができる。従って、強力な結合体を選択的に単離することができ、及びレトロウイルスベクターによりコードされる抗体遺伝子を、限定はされないが、ゲノムＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲを含む当該技術分野において公知の標準的な分子生物学的方法により、選択された細胞又は細胞クローンから、再単離し、クローニングし、配列決定することができる。

【0111】

好ましい実施形態において、最終的な細胞分取ステップが単細胞分取として実施され、それによりクローン単離及び最終的な抗原反応性細胞クローンの増殖が可能となり、選択された結合体からの同種ＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖対のコード領域のクローニング及び配列決定が促進される。

【0112】

必要であれば、ＦＡＣＳ濃縮した細胞を培養下で増殖させてもよく、場合により、抗原結合及び高度に反応性の細胞の反復的な高速細胞分取に再度供してもよく、これは、場合により、所望の染色強度、ひいては所望の抗原に対して期待される結合特異性が実現されるまで、繰り返し適用され得るプロセスである（図１）。抗原反応性細胞のこの選択的な濃縮及びインビトロ増殖は、Ｔ細胞依存性免疫反応において起こる、より高親和性の結合体の選択的増殖を模倣するものである。

【0113】

高速細胞分取装置の補助による抗原反応性細胞の濃縮は、本発明を実現する好ましい方法に過ぎず、しかし、細胞を抗原反応性について選択及び単離する他の方法、例えば、限定はされないが、固体支持体上に固定化した抗原と細胞を結合させるパニング法が適用されてもよいことは留意されるべきである。さらに、顕微操作による手法、例えば、限定はされないが、マイクロタイタープレートにおける限界希釈条件下での細胞の増殖又は半流動培地での細胞クローンとしての増殖によって抗原反応性細胞を濃縮することが可能であり、それにより、顕微鏡の補助による方法で細胞クローンの特異的抗原染色及び／又は標識及びその同定を行い、その後、手動及び／又はロボット補助により抗原反応性クローンを選び取ることが可能となる。

【0114】

本発明のさらなる実施形態は、可変抗体結合ドメインのコード領域を特異的に突然変異の標的とする突然変異誘発条件の存在下で、抗原選択／ＦＡＣＳ分取／抗原反応性細胞の増殖の反復サイクルを実施することである。この手法により、細胞増幅ラウンドごとに、より高親和性の突然変異体が生成され、これらはインサイチュで生成される。レトロ細胞ディスプレイで高い抗原結合性を示す細胞を分取し、濃縮すると、より高親和性の突然変異体を選択的に濃縮し、増殖させることができる。特に、発現コンストラクトが、限定はされないが、免疫グロブリンκイントロン及び３’κエンハンサー要素を含め、抗体可変領域にＡＩＤ媒介性の体細胞超突然変異をもたらすことが公知のシス調節性プロモーター及びエンハンサー要素を含む場合（図４ａ及びｂ）、抗体発現細胞内でＡＩＤ酵素を過剰発現させることにより、抗体可変領域ドメインを標的とする高い突然変異率を実現することができる。かかる手法は、内因的に、或いは異所的に、ＡＩＤを構成的に発現する細胞を用いて実現され得るが、本発明の一態様はＡＩＤ発現ベクターを利用する。ＡＩＤ発現ベクターでは、誘導性プロモーター、例えば、限定はされないが、テトラサイクリン及び／又はドキシサイクリン誘導性プロモーター系を用いてＡＩＤ発現を誘導し、及び再び発現を停止させることができ（Ｇｏｓｓｅｎ ＆ Ｂｕｊａｒｄ，１９９２）、ここでは、対象の遺伝子の発現は、原核生物のｔｅｔオペロンのタンデムリピートに隣接する最小のＣＭＶプロモーターによって制御されるとともに、ＨＳＶ−ＶＰ１６−Ｔｅｔ−リプレッサー融合タンパク質を用いて発現を誘導又は抑制することができ、この融合タンパク質のｔｅｔオペロンに対する結合は、テトラサイクリン又はテトラサイクリン誘導体によってアロステリックに制御される。

【0115】

以下の非限定的な実施例において、本発明がより詳細に説明される。

【実施例】

【0116】

実施例１
ハイグロマイシンＢ及びピューロマイシン抗生物質薬剤選択マーカーをそれぞれ含む完全ヒト免疫グロブリン重（ＩｇＨ）鎖及び免疫グロブリン軽（ＩｇＬ）鎖のレトロウイルス発現ベクターのクローニング 先述のとおり、本発明は、種々の設計の結合タンパク質のレトロウイルス発現ベクター（例えば、図４ａ〜ｃを比較）により実現することができる。本発明を実現するために用いることのできるベクター設計の１つの例として、レトロウイルス発現ベクターについての、完全ヒトＩｇＧ_１／κＬ抗体の発現、及び標的細胞内でこうしたベクターを安定的に維持するための抗生物質耐性マーカーを用いた選択を可能にする詳細なクローニング戦略が、本明細書に記載される。

【0117】

ａ）ヒト免疫グロブリン重（ＩｇＨ）鎖のレトロウイルス発現ベクターの構築
レトロウイルスヒト免疫グロブリン重鎖発現ベクターを構築するための出発点として、市販のレトロウイルスベクターｐＬＨＣＸ（ＢＤ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いた（図５ａ）。ｐＬＨＣＸは、レトロウイルス骨格の５’ＬＴＲプロモーターによって駆動されるハイグロマイシンＢ耐性マーカー遺伝子を含む。加えて、ｐＬＨＣＸは、ＣＭＶ前初期プロモーターと、その後ろに、発現させる対象の遺伝子を挿入するための単純な多重クローニング部位（ＭＣＳ）とを含む。加えて、ｐＬＨＣＸ骨格は、ＣＭＶプロモーターの上流に、好都合な固有のＢｇｌＩＩ制限酵素部位を含み（図５ａ）、そこにさらなる遺伝子要素をクローニングすることができる。

【0118】

本発明の好ましい実施形態は、ヒト定常γ１重鎖コード領域に対するヒトＶ_Ｈコード領域のインフレームクローニングのためにＥｃｏ４７ＩＩＩ制限酵素を用いるものである。これは、この特定の制限酵素部位を、発現するＩｇＨ鎖のアミノ酸組成を変化させることなく、Ｖ_Ｈコード領域とＣγ１コード領域との間の接合部に導入することができるためである。しかしながら、ｐＬＨＣＸは、Ψパッケージングシグナル内に１つのＥｃｏ４７ＩＩＩ制限酵素部位を含み（図５ａ）、このため、上述のＶ_Ｈ領域クローニング戦略にＥｃｏ４７ＩＩＩを単純に用いることはできない。ｐＬＨＣＸベクター骨格からこの不都合なＥｃｏ４７ＩＩＩ制限酵素部位を取り除くため、図５ａに詳細に示すとおりの、以下の第１の予備クローニングステップを実施した。市販のＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ（商標）キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いた部位特異的突然変異誘発により、製造者の指示に従い、所望の突然変異をもたらす特異的プライマー対を用いて、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ認識配列ＡＧＣＧＣＴの３番目のＣヌクレオチドをＡに置換して、Ψパッケージングシグナル内のＥｃｏ４７ＩＩＩ部位を取り除いた。改変されたベクターはｐＬＨＣＸ−ｍ１と命名し、Ψ（プサイ）パッケージングシグナルにおけるこの単一の塩基対の置換が、改変ベクターｐＬＨＣＸ−ｍ１のレトロウイルス形質導入の効率性に影響を及ぼさないことを確認した（データは示さず）。

【0119】

ｐＬＨＣＸ−ｍ１骨格に、膜貫通コード領域Ｍ１及びＭ２を有する、又は有しないヒトＣγ１の定常領域をコードするｃＤＮＡを同時にクローニングした。ＲＴ−ＰＣＲにより、鋳型としてのヒト末梢血リンパ球のｃＤＮＡと、フォワード及びリバースプライマー配列番号１、配列番号２、配列番号３とを使用して（下記参照）、Ｃγ１−ｍ及びＣγ１−ｓ ＤＮＡ断片を増幅した。膜結合型のヒトＩｇＧのＲＴ−ＰＣＲ増幅には、配列番号１と配列番号２とのプライマーの組み合わせを用い、分泌型のヒトＩｇＧのクローニングには、配列番号１と配列番号３とのプライマーの組み合わせを用いた。フォワード及びリバースＰＣＲ増幅プライマーは、それぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＣｌａＩ制限酵素部位を含み、それによりＰＣＲ増幅断片を、ｐＬＨＣＸ−ｍ１内のＣＭＶプロモーターの下流にある固有のＨｉｎｄＩＩＩ及びＣｌａＩ部位に定方向性クローニングすることが可能であった（図５ａ）。フォワードＰＣＲ増幅プライマーは、発現する完全長ＩｇＧ_１重鎖のアミノ酸組成を変化させることなく、Ｖ_Ｈ領域を定常領域とインフレーム融合するのに有用な内部Ｅｃｏ４７ＩＩＩ部位をさらに含んだ。リバースＰＣＲ増幅プライマー配列番号２及び配列番号３は、さらなる内部ＮｏｔＩ部位を含み、これにより、例えば、種々のＩｇアイソタイプを発現させるための定常領域コード領域の交換など、一般的なクローニングを目的とした、コード領域のすぐ下流でのコンストラクトの制限酵素消化が可能であった。

【数1】

【0120】

配列番号１と共に、分泌型のヒトＩｇＧ_１をＰＣＲ増幅するためのリバースプライマーとしてプライマー配列番号２を使用し、これは、クローニングを目的とした固有のＮｏｔＩ部位（下線）を含んだ。

【数2】

【0121】

配列番号１と共に、膜結合型のヒトＩｇＧ_１をＰＣＲ増幅するためのリバースプライマーとしてプライマー配列番号３を使用し、これは、クローニングを目的とした固有のＮｏｔＩ部位（下線）を含んだ。

【数3】

【0122】

分泌型のヒトＣγ１について約１．０ｋｂの、及び膜結合型のヒトＣγ１について約１．２ｋｂの得られたＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＣｌａＩ制限酵素で消化し、同時に適合する制限酵素部位のｐＬＨＣＸ−ｍ１に定方向性クローニングし、結果としてそれぞれプラスミドｐＬＨＣＸ−ｍ１−Ｃγ１−ｓ及びｐＬＨＣＸ−ｍ１−Ｃγ１−ｍを得た（図５ｂもまた参照）。次に、固有の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩ、隣接するＶ_Ｈ領域断片を使用して、分泌型又は膜結合型ヒトＣγ１のコード領域に対しＶ_Ｈ鎖領域をインフレームでクローニングすることができた（図５ｂ）。この制限酵素の組み合わせは、全７つのヒトＶ遺伝子セグメントファミリーのヒトＶ_Ｈコード領域では、極めて稀にしか見られない。

【0123】

完全ヒトＩｇＧ１重鎖発現ベクターを構築するため、先に同定した、ＮＩＰ−オボアルブミンに対して特異的な完全ヒト抗体のヒトＶ_Ｈコード領域を、コンストラクトｐＬＨＣＸ−ｍ１−Ｃγ１ｓ及びｐＬＨＣＸ−ｍ１−Ｃγ１ｍにＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩ断片として挿入し、結果として、それぞれプラスミドｐＬＨＣＸ−ｍ１−ＶＨＣγ１ｓ及びｐＬＨＣＸ−ｍ１−ＶＨＣγ１ｍを得た（図５ｃ）。リーダー配列と５’−ＨｉｎｄＩＩＩ及び３’Ｅｃｏ４７ＩＩＩクローニング部位とを含むＮＩＰ−オボアルブミン特異的ヒト抗体のＶ_Ｈコード領域を、配列番号４に提供する。翻訳の改良のため、開始ＡＴＧの上流に２つの追加的なＣヌクレオチドが付加されていることに留意されたい（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列の近似）：

【数4】

【0124】

配列番号４において、クローニングのためのＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩ制限酵素部位には下線を付す。リーダー配列の開始ＡＴＧは９位から始まる。

【0125】

図５ｃに図示されるこのヒトＩｇＧ_１重鎖発現ベクターは、本発明を実現し、且つレトロウイルスＩｇＬ鎖発現ベクターと組み合わせてレトロ細胞ディスプレイを実施するには既に十分であるものの、体細胞超突然変異の標的がＶ_Ｈコード領域となるよう機能させるには、免疫グロブリン軽鎖又は重鎖遺伝子座に特定のシス調節性エンハンサー要素が存在する必要がある。κ軽鎖遺伝子座のκイントロン及び３’κエンハンサー要素により、活性プロモーターの下流に位置するＶ領域を体細胞超突然変異の標的とすることが可能になることが公知であるため、基本となるレトロウイルスヒトＩｇ重鎖発現ベクターｐＬＨＣＸｍ１−ＶＨＣｇ１ｍ及びｐＬＨＣＸｍ１−ＶＨＣｇ１ｓ（図５ｃ）を、以下の方法で、κイントロン及び３’κエンハンサー要素を含むようにさらに改変した。マウスのκイントロンエンハンサー（κｉＥ）の配列は、Ｊκ５要素と定常κコード領域との間に位置する約２．３ｋｂ長の遺伝子間領域内に置かれ、その配列は、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｂａｎｋエントリＶ００７７７に由来し得る。コアκｉＥは、この遺伝子間領域内に約０．５ｋｂしか含まれず、その配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎｂａｎｋエントリＸ００２６８に由来し得る。κｉＥ領域を含むＪκ５からＣκまでの２．３ｋｂの断片全体には、内部ＢｇｌＩＩ部位が含まれ、これは、この制限酵素を用いたＰＣＲ増幅ゲノム断片のｐＬＨＣＸ−ｍ１−ＶＨＣγ１−ｓ及びｐＬＨＣＸ−ｍ１−ＶＨＣγ１−ｍベクターへのクローニングを妨げる。しかしながら、この領域には内部ＢａｍＨＩ制限酵素断片がないため、ＢａｍＨＩ部位に隣接したゲノムＰＣＲ断片をＢｇｌＩＩ線状化ベクターｐＬＨＣＸ−ｍｏｄ１−ＶＨＣγ１ｓ及びｐＬＨＣＸ−ｍ１−ＶＨＣγ１ｍにクローニングすることは可能である（図５ｃ）。フォワードプライマー配列番号５及びリバースプライマー配列番号６を用いて、マウスゲノムＤＮＡ由来のこのゲノム断片をＰＣＲ増幅することにより、Ｊκ５〜Ｃκの約２．３ｋｂの遺伝子間領域全体を双方とも含み、ｐＬＨＣＸ−ｍ１−ＶＨＣγ１ｓ及びｐＬＨＣＸ−ｍ１−ＶＨＣγ１ｍの固有のＢｇｌＩＩ制限酵素部位にクローニングするためのさらなるＢａｍＨＩ制限酵素部位（下線）を双方とも含むベクターを構築し、結果として、それぞれプラスミドｐＬＨＣＸ−ｍ１−ＶＨＣγ１ｓ−κｉＥ及びｐＬＨＣＸ−ｍ１−ＶＨＣγ１ｍ−κｉＥを得た（図５ｄ）。

【数5】

【0126】

マウスκ軽鎖遺伝子座由来のゲノム断片を含む約２．３ｋｂのκｉＥ全体を挿入することに加え、コアκｉＥを含む、より短い約０．８ｋｂのゲノムＰＣＲ断片（Ｖ００７７７の３６３４〜４３９４位、配列番号７）もまた、ｐＬＨＣＸ−ｍ１−ＶＨＣγ１−ｓ及びｐＬＨＣＸ−ｍ１−ＶＨＣγ１−ｍの固有のＢｇｌＩＩ部位にクローニングした（図示せず）。このゲノムＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅に用いたフォワード及びリバースＰＣＲプライマーを、配列番号８及び配列番号９として示す。

【数6】

【0127】

ゲノムＰＣＲ断片を含む約０．８ｋｂの断片コアκｉＥはまた、ＢａｍＨＩ消化ＰＣＲ断片としても、ベクターｐＬＨＣＸ−ｍ１−ＶＨＣγ１−ｓ及びｐＬＨＣＸ−ｍ１−ＶＨＣγ１−ｍの双方の固有のＢｇｌＩＩ制限酵素部位にクローニングした（ここには図示せず）。

【0128】

寄託されたマウス３’κエンハンサー要素の配列は、ＮＣＢＩ−Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号Ｘ１５８７８として検索することができ、マウスゲノムの定常κコード領域の約８．７ｋｂ下流に位置する８０８ｂｐの遺伝子配列に含まれる。

【0129】

マウス３’κエンハンサーは内部ＣｌａＩ部位を含まないため、レトロウイルスベクターｐＬＨＣＸ−ｍ１−ＶＨＣγ１ｓ−３’κＥ及びｐＬＨＣＸ−ｍ１−ＶＨＣγ１ｍ−３’κＥの固有のＣｌａＩ部位にクローニングするため、追加的なＣｌａＩ制限酵素部位を含むフォワードＰＣＲプライマー配列番号１０及びリバースＰＣＲプライマー配列番号１１を用いて、マウスゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した（図５ｄ）。

【数7】

【0130】

この結果、最終的なＩｇγ_１Ｈ鎖発現ベクターｐＬＨＣＸ−ｍ１−ＶＨＣγ１ｓ−３’κＥ−κｉＥ及びｐＬＨＣＸ−ｍ１−ＶＨＣγ１ｍ−３’κＥ−κｉＥ（図５ｅ）を得た。これらのベクターはいずれも、ＩｇＬ鎖と同時発現させると、それぞれ分泌型又は膜結合型ヒトＩｇＧ_１抗体の産生をもたらすＩｇ重鎖をコードする。

【0131】

双方のベクターとも、Ｉｇγ_１Ｈ鎖発現カセットの上流及び下流に、κｉＥ及び３’κＥシス調節要素をさらに含み、発現したＩｇγ_１Ｈ鎖のＶ_Ｈ領域に体細胞超突然変異がもたらされる。

【0132】

ｂ）ヒトＩｇκ軽鎖のレトロウイルス発現ベクターのクローニング
レトロウイルス組込みのための抗生物質選択を可能にするレトロウイルスヒト免疫グロブリン軽鎖発現ベクターを構築するための出発点として、市販のレトロウイルスベクターｐＬＰＣＸ（ＢＤ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用した（図６ａ）。このベクターは、ピューロマイシン耐性を付与する抗生物質選択マーカーを含み、レトロウイルス骨格の５’ＬＴＲプロモーターにより駆動される。ｐＬＨＣＸ骨格（実施例１ａを参照）と同様の設計だが、ｐＬＰＣＸは、２つのＥｃｏ４７ＩＩＩ部位と、より多くの制限酵素部位を有するＭＣＳとを含み、しかし、ＣＭＶプロモーターの上流に好都合な固有のＢｇｌＩＩ部位はない（図６ａ）。

【0133】

ｐＬＰＣＸベクター骨格からＥｃｏ４７ＩＩＩ制限酵素を取り除き、同時にＣＭＶプロモーターの上流に固有のＢｇｌＩＩ制限酵素を導入するため、以下の予備クローニングステップを実施した：第１のステップにおいて、市販のＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ（商標）キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いた部位特異的突然変異誘発により、製造者の指示に従い、所望の突然変異をもたらす特異的プライマー対を用いて、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ認識配列ＡＧＣＧＣＴの３番目のＣヌクレオチドをＡに置換して、ｐＬＨＣＸのパッケージングシグナル内のＥｃｏ４７ＩＩＩ部位を取り除いた（図６ａ）。Ψ（プサイ）パッケージングシグナルにおけるこの単一の塩基対の置換が、突然変異ベクターのレトロウイルス形質導入の効率性に影響を及ぼさないことを確認した（データは示さず）。突然変異ベクターはｐＬＰＣＸ−ｍ１と命名した（図６ａ）。Ｅｃｏ４７ＩＩＩ部位が完全に欠如していて、且つＣＭＶプロモーターの上流に固有のＢｇｌＩＩ部位をさらに含むｐＬＰＣＸベクター骨格を得るため、ＮｃｏＩ消化したＤＮＡ末端をクレノウ酵素によって充填したｐＬＰＣＸ−ｍ１のＡｓｃＩ−ＮｃｏＩ断片を、ＢｌｐＩ消化したＤＮＡ末端をクレノウ酵素によって充填したＡｓｃＩ−ＢｌｐＩ消化ｐＬＨＣＸ骨格にクローニングし（図６ｂ）、それにより、ｐＬＰＣＸ−ｍ２と命名されるベクターを生成した。ここでは、本質的にｐＬＨＣＸのハイグロマイシンＢ遺伝子のみが、ｐＬＰＣＸのピューロマイシン耐性マーカーによって置換されている（図６ｂ）。

【0134】

ＩｇκＬ鎖発現ベクターを構築するため、ｐＬＰＣＸ−ｍ２に定方向性クローニングするための、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＣｌａＩ制限酵素部位をそれぞれ含むフォワードプライマー配列番号１２及びリバースプライマー配列番号１３を用いて、ヒト末梢血リンパ球ｃＤＮＡから定常κ軽鎖コード領域をＰＣＲクローニングした（図６ｂ）。第ａ．）節に記載されるとおり、フォワードプライマー配列番号１２は、Ｖ_Ｌコード領域の定常κ軽鎖コード領域とのインフレーム融合を可能にするＥｃｏ４７ＩＩＩ部位をさらに含んだため、結果としてヒト定常κ軽鎖の１位における１つの保存されたスレオニンからセリンへのアミノ酸置換のみが生じた。リバースプライマーはさらなる内部ＮｏｔＩ部位を含み、例えば定常κコード領域の交換などの、後のクローニング手順を促進した。

【数8】

【0135】

定常κ軽鎖コード領域を、５’末端でＨｉｎｄＩＩＩ／Ｅｃｏ４７ＩＩＩ部位に、及び３’末端でＮｏｔＩ／ＣｌａＩ部位に隣接してｐＬＰＣＸ−ｍ２に挿入し、結果としてプラスミドｐＬＰＣＸ−ｍ２−Ｃκを得た。

【0136】

完全ヒトＩｇκＬ重鎖発現ベクターを構築するため、先に同定した、ＮＩＰ−オボアルブミンに対して特異的な完全ヒト抗体由来のヒトＶκコード領域を、コンストラクトｐＬＰＣＸ−ｍ２−ＣκにＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩ断片として挿入した（図６ｃ）。リーダー配列と５’−ＨｉｎｄＩＩＩ及び３’Ｅｃｏ４７ＩＩＩクローニング部位とを含むＮＩＰ−オボアルブミン特異的ヒト抗体のＶκコード領域を、配列番号１４に提供する。翻訳の改良のため、開始ＡＴＧの上流に２つの追加的なＣヌクレオチドが付加されていることに留意されたい（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列の近似）：

【数9】

【0137】

配列番号１４において、クローニングのためのＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩ制限酵素部位には下線を付す。リーダー配列の開始ＡＴＧは９位から始まる。このＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩ断片をＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩ線状化ｐＬＰＣＸ−ｍ２−Ｃκに挿入し、結果として発現コンストラクトｐＬＰＣＸ−ｍ２−ＶκＣκを得た（図６ｃ）。

【0138】

このレトロウイルスのκ軽鎖発現ベクターは、本発明を実現し、且つレトロウイルスＩｇ重鎖発現ベクターと同時発現させたときにレトロ細胞ディスプレイを実施するには既に十分であるものの、Ｉｇ重鎖発現コンストラクトと同じクローニング戦略に従い、κｉＥ及び３’κＥ要素も含むさらなるベクターをクローニングした。従って、マウスκｉＥを、プライマー対の配列番号５及び配列番号６（上記参照）により増幅した約２．３ｋｂのＢａｍＨＩ消化したゲノムＰＣＲ断片か、又はプライマー対の配列番号８及び配列番号９（上記参照）により増幅した約０．８ｋｂのＢａｍＨＩ消化したゲノムＰＣＲ断片のいずれかとして、ＣＭＶプロモーターの上流の、ｐＬＰＣＸ−ｍ２−Ｖκ−Ｃκにおける固有のＢｇｌＩＩ部位に挿入した。ここに図示されるのは、約２．３ｋｂのゲノムマウスκｉＥを含む断片のｐＬＰＣＸ−ｍ２−ＶκＣκへのクローニングのみであり、その結果としてプラスミドｐＬＰＣＸ−ｍ２−ＶκＣκ−κｉＥを得た（図６ｄ）。

【0139】

最後に、上記の実施例１ａに記載されるκｉＥ及び３’κＥを含むＩｇＨ鎖レトロウイルス発現ベクターの構築と同様に、マウス３’κＥを、プライマー対の配列番号１０及び配列番号１１により増幅したＣｌａＩ消化ゲノムＰＣＲ断片として、κ軽鎖コード領域の下流の固有のＣｌａＩ制限部位に挿入し、それによりレトロウイルス発現ベクターｐＬＰＣＸ−ｍ２−Ｖκ−Ｃκ−κｉＥ−３’κＥを生成した（図６ｄ）。

【0140】

κｉＥ及び３’κＥ要素を含むＩｇＨ鎖発現ベクターと同じく、このベクターも、以上から、コンストラクトにクローニングされる任意のＶκコード領域に体細胞超突然変異をもたらすために必要なあらゆるシス調節要素を含む（下記参照）。

【0141】

実施例２
活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）を過剰発現する細胞系の生成
活性化されたＢ細胞特異的タンパク質の活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）は、任意の脊椎動物細胞系に体細胞超突然変異の表現型を付与するのに必要且つ十分な固有のトランス活性化因子であることが実証されている。ＡＩＤを発現する細胞では、転写活性のある遺伝子座が、シス調節性エンハンサー要素、特に免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座のκｉＥ及び３’κＥ要素に対して正しいコンテクストで配列されている場合には、それらが体細胞超突然変異の特異的な標的となり得る。ＡＩＤを安定的に発現する細胞系を得るため、まず初めに、マウスＡＩＤをコードするレトロウイルス発現コンストラクトを以下のように構築した：

【0142】

完全なマウス脾臓ｃＤＮＡ由来の忠実度の高いＰｆｘポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、製造者の指示に従い、ＰＣＲ増幅断片を適合するベクターにライゲーションするためのさらなるＸｈｏＩクローニング部位を含むフォワードＰＣＲプライマー配列番号１５及びリバースＰＣＲプライマー配列番号１６を用いて、マウスＡＩＤ ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。加えて、フォワードプライマーは、ＸｈｏＩ部位の下流及びマウスＡＩＤ ＯＲＦの開始ＡＴＧコドンの上流にさらなる２つのＣヌクレオチド（斜体で強調される）を含み、それによりＫｏｚａｋ翻訳開始配列に近似し、従ってクローニングされたｃＤＮＡの適切な翻訳が確実となった。

【数10】

【0143】

得られた６２０ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ産物をＸｈｏＩで消化したうえ、ＢＤ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）からの、ＸｈｏＩ消化され、且つアルカリ性ホスファターゼ処理されたｐＬＰＣＸにライゲートした。正しい向きで挿入断片を含むライゲーション産物を診断的な制限酵素消化によって決定した。マウスＡＩＤ ｃＤＮＡ挿入断片を正しい向きで含む正しい制限酵素パターンを有するクローンを、ＤＮＡ配列決定により確認し、ｐＬＰＣＸ−ｍＡＩＤと命名した（図７）。

【0144】

クローニングしたマウスＡＩＤ ｃＤＮＡの配列は、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｂａｎｋエントリＡＦ１３２９７９として提供される、公表されているマウスＡＩＤ ｃＤＮＡ ＯＲＦに正確に対応した。

【0145】

次に、１０μｇのＰｖｕＩ線状化ｐＬＰＣＸ−ｍＡＩＤコンストラクトを、３００Ｖ、９６０μＦの周囲温度での電気穿孔により、８００μｌの無添加ＲＰＭＩ培地に再懸濁した５×１０^６個のＦＡ−１２エーベルソン形質転換プレＢ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、ＦＣＳを含有する２０ｍｌの増殖培地に再懸濁し、１０枚の９６ウェルプレートに２００μｌ／ウェルでプレーティングした。トランスフェクションの４８時間後、増殖培地に２μｇ／ｍｌピューロマイシン抗生物質を添加することにより、安定的にトランスフェクトされた細胞を選択した。

【0146】

トランスフェクションの１０〜１４日後、数十個のピューロマイシン耐性コロニーを検出することができ、選択されたクローンを、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む新鮮な培養培地に移した。ピューロマイシン耐性クローンをさらに増殖させ、製造者の推奨どおり市販の抗マウスＡＩＤ抗体を用いるＥＣＬウエスタンブロッティングにより、特定の数のクローンをマウスＡＩＤタンパク質の発現について試験した（図９ａを参照）。

【0147】

分析したＦＡ−１２−ＡＩＤトランスフェクト細胞クローンの約８０％において特異的ＡＩＤタンパク質バンドを検出することができ、予想どおり、２５ｋＤの見かけの分子量を示した。これから、マウスＡＩＤタンパク質を構成的に過剰発現するいくつかの細胞系が得られたと結論付けられた。

【0148】

実施例３
シス調節性κｉＥ及び３’κＥ要素を含むレトロウイルスヒト免疫グロブリン発現コンストラクトにおいてレポーター遺伝子を標的とする体細胞超突然変異の実証
次に、本発明に開示されるとおりの、レトロウイルス発現コンストラクト内のヒト抗体可変領域が、ＡＩＤ媒介性の体細胞超突然変異の標的であることを実証した。このために、レポーターコンストラクトを生成し、これは、ヒトＩｇＨ鎖のＶ領域ＯＲＦが突然変異ＥＧＦＰ ＯＲＦに置換されており、ここで終止コドンは、体細胞超突然変異のホットスポットであることが公知のＲＧＹＷ配列モチーフのコンテクストに導入した（Ｂａｃｈｌ ＆ Ｏｌｓｓｏｎ，１９９９）。

【0149】

ＥＧＦＰ ＯＲＦのコドン１０７に、チロシンコドンをＴＡＧ終止コドンに変化させる終止突然変異を導入した。加えて、コドン１０８を改変し、それにより突然変異ＥＧＦＰ配列内に新規の診断用ＳｐｅＩ制限部位が生成され、従ってコドン１０７に終止突然変異の復帰突然変異が起こると、ＳｐｅＩ部位は破壊され、それにより復帰突然変異体の同定及び特性決定が促進される。ＥＧＦＰ ＯＲＦに導入された配列改変は図１０ａに図示され、突然変異ＥＧＦＰ ＯＲＦの全体は図１０ｂに提供される。

【0150】

体細胞超突然変異を実証するためのレポーターコンストラクトを以下のとおり構築した：
忠実度の高いＰｆｘポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と、ｐＬＨＣＸｍ１−ＶＨＣγ−ｓ−κｉＥ−３’κＥにおけるＶ_Ｈ領域のＥＧＦＰ ＯＲＦとの置換を可能にする追加的なＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩ制限酵素部位を各々含むフォワードプライマー配列番号１７及び配列番号１８とにより、鋳型としてプラスミドｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（ＢＤ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）からＥＧＦＰ ＯＲＦをＰＣＲ増幅した。フォワードプライマーは、ＡＴＧ開始コドンの上流に、斜体で強調されるさらに２つのＣヌクレオチドを含んだ。これは、Ｋｏｚａｋ翻訳開始コンセンサス配列を近似し、且つ正しいＡＴＧ開始コドンでの適切な翻訳開始を確実にするものである。

【数11】

【0151】

７３７ｂｐのＰｆｘ増幅されたＥＧＦＰ ＰＣＲ断片を、Ｚｅｒｏ−Ｂｌｕｎｔ ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の一部であるｐＣＲ４−Ｔｏｐｏベクターに直接クローニングし、結果としてｐＣＲ４−Ｔｏｐｏ−ＥＧＦＰベクターを得た（図１１）。次に、図１０に示されるとおり、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ（商標）キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用い、製造者の指示に従い、所望の突然変異をもたらす特異的プライマー対を用いて、ｐＣＲ４−Ｔｏｐｏ−ＥＧＦＰの配列検証したクローンを、ＥＧＦＰ ＯＲＦのコドン１０７及び１０８で突然変異させ、それによりプラスミドｐＣＲ４−Ｔｏｐｏ−ＥＧＦＰｍｕｔを生成した。

【0152】

制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩを用いた二重制限酵素消化により、ｐＣＲ４−Ｔｏｐｏ−ＥＧＦＰｍｕｔの配列検証した突然変異ＥＧＦＰ ＯＲＦをプラスミドから回収した。消化断片を、エンハンサー要素を含まないＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩ二重消化プラスミドｐＬＨＣＸｍ１−ＶＨＣγ−ｓ−κｉＥ−３’κＥ（図５ｅ）並びにＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩ二重消化プラスミドｐＬＨＣＸｍ１−ＶＨＣγ−ｓ（図５ｃ）にライゲートした。それにより、双方のベクターにおいて、Ｖ_Ｈコード領域が突然変異ＥＧＦＰ ＯＲＦにより置換され、これをＣγ_１領域とインフレーム融合し、結果としてレポータープラスミドｐＬＨＣＸｍ１−Ｅ（ｍｕｔ）−Ｃγ−ｓ−κｉＥ−３’κＥ、及び対照のレポータープラスミドｐＬＨＣＸｍ１−Ｅ（ｍｕｔ）−Ｃγ−ｓを得た（図１１）。

【0153】

双方のプラスミドをピューロマイシン耐性ＦＡ−１２ ＡＩＤトランスフェクタントクローン３（ＡＩＤを発現する）に、及び対照として５（ＡＩＤを発現しない）に形質導入した。形質導入細胞を、形質導入後２４時間目から開始して２ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ選択下に培養し、培養後６、８及び１０日目の緑色自己蛍光細胞の出現について細胞を分析した。κｉＥ及び３’κＥのコンテクストにおいて（すなわち、プラスミドｐＬＨＣＸｍ１−Ｅ（ｍｕｔ）−Ｃγ−ｓ−κｉＥ−３’κＥを用いて）突然変異ＥＧＦＰレポーターコンストラクトが発現した実験、及びＡＩＤ発現がウエスタンブロッティングにより検出可能であったＦＡ−１２ ＡＩＤトランスフェクタント（すなわちＦＡ−１２ ＡＩＤトランスフェクタントクローン３）においてのみ、ＦＡＣＳにより約０．２％（図９ｂ）の定常状態の頻度の緑色細胞を検出可能であったとき、培養後６、８及び１０日で緑色自己蛍光細胞を検出することができた。対照実験のいずれにおいても（ＡＩＤを発現しない、及び／又はコンストラクトにエンハンサー要素が存在しないもの、データは示さず）、実験期間の１０日間以内に緑色細胞は検出することができなかった。

【0154】

０．２％ＥＧＦＰ陽性集団から、２つの９６ウェルの個々のウェルに１９２個の単細胞を分取し、十分な細胞が増殖した後、これらの単一分取されたクローンから１００個のクローンを、ＦＡＣＳにより緑色蛍光について分析した。分析した１００個のクローンから、９５個のクローンが同質の蛍光パターンを示し、単一分取された細胞で検出される蛍光と同様の強度、すなわち約１０^２ログの蛍光であった（ＦＡ−１２細胞の対照細胞の自己蛍光は、閾値ラインによって示される１０^１ログ未満の蛍光レベルに留まった）。４個のクローンは、異質の蛍光パターンを示し、ＥＧＦＰ発現について、細胞の約半数が陰性であり、且つ細胞の半数が陽性であった。分析した１００個のクローンのうち１つのみが、事実上全くＥＧＦＰ蛍光を示さなかったが、このクローンはまた、バックグラウンド自己蛍光レベルを僅かに上回った。異質及び陰性のＥＧＦＰパターンを有する５個のクローンは、レトロウイルス組み込み体のＥＧＦＰ発現の（部分的）位置サイレンシングに起因し得るか、又はこの結果は、単細胞分取のアーチファクトに起因し得る。それにもかかわらず、クローンの大部分（９５％）において、ＥＧＦＰ発現を明確に検出することができた。こうしたクローンのうち２４個を、安定的に形質導入された細胞からＥＧＦＰ遺伝子を再度増幅するため、クローニングプライマー配列番号１７及び配列番号１８を用いてＰＣＲにより分析した。

【0155】

突然変異ＥＧＦＰ ＯＲＦを含むレポーターベクターからのＰＣＲ産物とは対照的に、ＥＧＦＰ発現クローンからの２４個のＰＣＲ産物のいずれも、ＳｐｅＩ制限酵素によって消化することができなかったことから、突然変異ＥＧＦＰ ＯＲＦのコドン１０７におけるＴＡＧ終止突然変異の復帰突然変異が示唆される（データは示さず）。

【0156】

ＰＣＲ産物のうち１０個をＤＮＡ配列決定により分析し、これまでに文献に記載されているとおり、１０個全てのクローンが、ＥＧＦＰ ＯＲＦに導入されたＲＧＹＷモチーフにおけるＧヌクレオチドのＧ−＞Ｃ突然変異を含んだことが確認された（Ｂａｃｈｌ ＆ Ｏｌｓｓｏｎ，１９９９）。

【0157】

これは、κｉＥ及び３’κＥ要素などのシス調節遺伝子要素の存在に依存して、且つＡＩＤ発現に依存して、体細胞突然変異、従って突然変異生成のレベルが上昇し、活性プロモーターの下流のＤＮＡ領域、ひいては、開示されるレトロウイルス発現コンストラクトのコンテクストにおいてはヒト抗体鎖のＶ_Ｈコード領域が標的なり得ることを実証している。

【0158】

κｉＥ及び３’κＥコンストラクトにおけるＡＩＤ依存性の体細胞突然変異のレベルの推定に関して、推定突然変異率は、約３×１０^−５突然変異／ｂｐ／生成の範囲であった。この値は、インビボで報告された、最高１０^−４又はさらには１０^−３／ｂｐ／生成に至る率に達し得る体細胞超突然変異率よりなお低い。それにもかかわらず、検出された突然変異率は、脊椎動物細胞において報告されている１０^−８突然変異／ｂｐ／生成の範囲であると推定されるバックグラウンドの突然変異率と比べると、なお著しく高かった。従って、高い体細胞突然変異率により、本開示のレトロウイルスコンストラクトにおける活性プロモーターの下流の領域がエンハンサー及びＡＩＤ依存的な様式で特異的に標的化され、従って、ＡＩＤ発現により媒介される体細胞超突然変異に基づき、インビボで突然変異誘発条件下にレトロ細胞ディスプレイを適用することが可能であると結論付けられる。

【0159】

実施例４
Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え能を有するレトロウイルス発現ベクターを用いることによるヒト抗体コード領域のインサイチュ生成の実証
ａ）ＩｇＨ鎖発現の前にＶ（Ｄ）Ｊ組換えを必要とするレトロウイルスヒト重（ＩｇＨ）鎖発現ベクターのクローニング 実施例１に記載されるｃＤＮＡ発現ベクターから重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖をレトロウイルスにより発現させる手法の代替として、異なるレトロウイルスＩｇＨ鎖ベクタークラスを構築した。ここでは、可変部コード領域が、「準生殖細胞系」配置にある別個のＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントによりコードされ、これらの遺伝子セグメントは、発現前にＶ（Ｄ）Ｊ組換えの過程により組み立てられる必要がなおある。Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えは、Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの部位特異的だがいくらか不正確な組立てを媒介し、従って、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え活性細胞、例えば前駆Ｂ細胞をインサイチュで形質導入すると、単一の発現コンストラクトから多様なＶコード領域を生成することができる。

【0160】

このため、生殖細胞系Ｖ_Ｈ３．３０、Ｄ_Ｈ１．２６及びＪ_Ｈ３遺伝子セグメントを、Ｂ細胞欠失ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に由来するゲノムＤＮＡから個々にＰＣＲクローニングした。生殖細胞系Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの増幅に用いたＰＣＲプライマーは、保存された組換えシグナル配列（ＲＳＳ）とさらなる介在ＤＮＡ配列とを含む隣接ＤＮＡ配列が含まれ、それによりＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの適切な組立てが可能となるように選択した。全てのＰＣＲアンプリコンは、プルーフリーディング耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＰｆｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて生成したとともに、最初にｐＳＣ−Ｂ ＰＣＲクローニングベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にサブクローニングし、いずれの場合にも供給者の指示に従った。ｐＳＣ−ＢにサブクローニングしたＰＣＲ断片をＤＮＡ配列決定により確認し、ＤＮＡ配列が配列検証された場合には、それらの断片をそれ以降のクローニングにのみ用いた。

【0161】

生殖細胞系ヒトＶ_Ｈ３．３０断片をＰＣＲ増幅するため、ＤＮＡプライマー配列番号１９及び配列番号２０を用い、これらは、ＰＣＲクローニングしたＤＮＡ断片のさらなるサブクローニングを可能にするＢａｍＨＩ及びＮｈｅＩ制限酵素部位（示されるとおり）を含んだ。

【数12】

【0162】

このようにして、フランキングＤＮＡを有する生殖細胞系ＶＨ３．３０遺伝子セグメントを含む６２３ｂｐ長のＰＣＲアンプリコンを得た（配列番号２１）。図１１ａを参照のこと。

【数13】

【0163】

次に、制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩのための部位をそれぞれ含むプライマー対の配列番号２２及び配列番号２３を用いて、隣接ゲノムＤＮＡを有するヒトＤＨ１．２６断片を含むヒトゲノムＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を実現した（図１１ａ）。

【数14】

【0164】

このようにして、隣接ＤＮＡを有する生殖細胞系ＤＨ１．２６遺伝子セグメントを含む３３６ｂｐ長のＰＣＲアンプリコンを得た（配列番号２４）。

【数15】

【0165】

最後に、示されるとおりの、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩのための部位をそれぞれ含むプライマー対の配列番号２５及び配列番号２６を用いて、隣接ゲノムＤＮＡを有するヒトＪＨ３断片を含むヒトゲノムＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を実現した（図１１ａ）。

【数16】

【0166】

このようにして、隣接ＤＮＡを有する生殖細胞系ＪＨ３遺伝子セグメントを含む２３９ｂｐ長のＰＣＲアンプリコンを得た（配列番号２７）。

【数17】

【0167】

続いて、３つのＤＮＡ断片、配列番号２１、配列番号２４及び配列番号２７を、固有のＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ及びＸｂａＩ制限酵素部位を含むシャトルベクターにクローニングし、従って、適合する制限酵素部位を介してＤＮＡ断片を連続的にライゲーションすることにより、遺伝子セグメントＶＨ３．３０、ＤＨ１．２６及びＪＨ３を含むカセットを組み立てることができた。配列番号２１を、ＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩ断片としてＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩ線状化シャトルベクターにライゲートし、次にＮｈｅＩ−ＸｈｏＩ消化断片の配列番号２４を、既に配列番号２１を含むＮｈｅＩ−ＸｈｏＩ線状化シャトルベクターにライゲートし、最後に、ＳａｌＩ−ＸｂａＩ消化断片の配列番号２７を、既にクローニングした配列番号２１及び配列番号２４を含むＸｈｏＩ−ＸｂａＩ線状化シャトルベクターにライゲートして、それによりシャトルベクター内に人工的なＶＨ３．３０−ＤＨ１．２６−ＪＨ３カセットを生成した（図１１ａ）。

【0168】

次に、人工的に組み立てられたＶＨ３．３０、ＤＨ１．２６及びＪＨ３遺伝子セグメントを含む「準生殖細胞系」カセット全体を、レトロウイルスベクターＭｉｇＲ１（Ｐｅａｒ ｅｔ ａｌ．１９９８）にクローニングした（コンストラクトＭｉｇＲ１−ｍｕＨ、図１１ｂ）。このＭｉｇＲ１は、ＭｉｇＲ１ベクターの固有のＢｇｌＩＩ及びＨｐａＩ部位にクローニングされたヒトμＨ鎖のコード領域（配列番号２８、以下を参照）を既に含んでいる。ＭｉｇＲ１−ｍｕＨにおいてＶＨコード領域を定常μＨ鎖コード領域と隔てる固有のＸｈｏＩ部位（配列番号２８の中央に太字体で強調される）を用いて、定常コード領域に転移した形態のＪＨにおけるアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、ＶＨ３．３０−ＤＨ１．２６−ＪＨ３カセットをインフレームで定常μＨ鎖コード領域にライゲートすることができた。

【数18】

【0169】

挿入断片のそれぞれ５’末端及び３’末端におけるＢｇｌＩＩ−ＨｐａＩ制限酵素部位もまた、太字体で強調したうえ下線が付され、これらはＭｉｇＲ１ベクター骨格への転移を示す（Ｐｅａｒ ｅｔ ａｌ．１９９８）。

【0170】

ＭｉｇＲ１レトロウイルス骨格に含まれる配列番号２８のＶコード領域を、ＶＨ３．３０−ＤＨ１．２６−ＪＨ３「準生殖細胞系」カセットと置換するため、ＢｇｌＩＩを含むフォワードプライマー配列番号２９及びＸｈｏＩを含むリバースプライマー配列番号３０を用いたＰＣＲにより、約１．１ｋｂのＶＨ３．３０−ＤＨ１．２６−ＪＨ３断片を再増幅する必要があった（図１１ａ）。

【数19】

【0171】

得られた約１．１ｋｂのＰＣＲ断片をＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩで消化し、ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ線状化μＨ鎖を含むＭｉｇＲ１ベクターにライゲートし、それにより結果としてＶ−Ｄ−Ｊ組換え能を有するレトロウイルス発現ベクターｐＶＤＪ−ｍｕＨ−ＭｉｇＲ１を得た（図１１ｂ）。

【0172】

ｂ）前駆Ｂ細胞に形質導入すると多様な配列を生成する、レトロウイルスＶ−Ｄ−Ｊベクターにおいて起こる真正のＶ（Ｄ）Ｊ組換えの実証 概念実証として、「準生殖細胞系」配置のＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントを含むレトロウイルスベクターで適切なＶ（Ｄ）Ｊ組換えが起こり得ることを実証するため、実施例１ｂに記載されるとおり、ベクターｐＶＤＪ−ｍｕＨ−ＭｉｇＲ１をＡ−ＭｕＬＶ形質転換プレＢ細胞系２３０−２３８にレトロウイルスＩｇＬ鎖発現ベクターと共に同時形質導入した。ｐＶＤＪ−ｍｕＨ−ＭｉｇＲ１コンストラクトでＶ（Ｄ）Ｊ組換え現象が起こる場合にのみ、その結果としてＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントのインフレーム再配列が生じ、二重形質導入細胞の細胞表面に完全長ヒトＩｇＭ抗体が発現することができる。ｐＶＤＪ−ｍｕＨ−ＭｉｇＲ１ベクターの形質導入の効率性は、ＩＲＥＳ結合ＥＧＦＰマーカー遺伝子の同時発現によりモニタすることができる。図１２（ａ）で見て分かるとおり、少なくともｐＶＤＪ−ｍｕＨ−ＭｉｇＲ１コンストラクトにより形質導入された細胞のうち０．０４％の極めて小さい集団が（形質導入の効率性は４４．７％であった）、抗κ軽鎖抗体でのＦＡＣＳ染色により計測したとき、細胞表面上に検出可能なＩｇＭ発現を示した。特に、ｐＶＤＪ−ｍｕＨ−ＭｉｇＲ１コンストラクトで形質導入しなかった細胞集団においては、ＩｇＭを発現する細胞は事実上検出できなかったことから（図１２（ａ）の右下象限）、染色の特異性が実証された。

【0173】

図１２（ａ）の右上象限に検出することのできた微量のＩｇＭ発現細胞を、ＦＡＣＳ−Ａｒｉａ高速細胞分取装置（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を用いた予備細胞分取により分取し、８日間にわたり組織培養で増殖させて、それによりレトロウイルス組込み体を特性決定するための細胞を増殖させた。増殖８日後のＥＧＦＰ発現（組み込まれたｐＶＤＪ−ｍｕＨ−ＭｉｇＲ１コンストラクトの指標となる）及び表面ＩｇＭについてのＦＡＣＳプロファイルから、細胞表面上にＩｇＭを示し、且つｐＶＤＪ−ｍｕＨ−ＭｉｇＲ１コンストラクトを含んだ（緑色蛍光による計測時、図１２（ｂ））クローン増殖細胞は、おそらくほとんどないことが示された。図１２（ｂ）のＦＡＣＳプロットの右上範囲の明確な細胞集団を分取し、プールした細胞集団からゲノムＤＮＡを調製した。

【0174】

ｐＶＤＪ−ｍｕＨ−ＭｉｇＲ１コンストラクトにおいてＶＨの上流及びＪＨ領域の下流に結合するプライマーを用いた診断的ＰＣＲにより、ゲノムＤＮＡを分析した。予想どおり、診断的ＰＣＲの結果、再配列されていないＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメント（約１．２ｋｂ断片）を示す、ほぼ等しい強度の２つの異なるバンドと、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えされた遺伝子セグメントを示す、より小さい約０．５ｋｂの断片とが得られた（データは示さず）。より大きいＰＣＲバンドを配列決定することにより、このＰＣＲアンプリコンが、なお「準生殖細胞系」配置にある再配列されていないＶ−Ｄ−Ｊカセットを表すことを確認した。これらの再配列されていないコンストラクトは、細胞を２つ以上のコンストラクトで形質導入した場合にＩｇＭ陽性細胞中になお検出可能であったことから、そのうちの全てがＶ（Ｄ）Ｊ組換えに利用可能であったわけではないと考えられる。より小さいＰＣＲアンプリコンは、ＰＣＲ産物を配列決定しても固有の配列は得られず、個々のＰＣＲ断片を配列分析するためにはｐＳＣ−Ｂ ＰＣＲクローニングベクターにサブクローニングする必要があった。

【0175】

分析した６個のプラスミドのうち、２個が同一の真正のＶ（Ｄ）Ｊ組換え配列を含み、これらはＶ（Ｄ）Ｊ組換えによるＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの部位特異的接合についてのあらゆる特有の特徴を示した。そうした特徴には、コード領域におけるヌクレオチドの喪失、及び前駆リンパ球特異的酵素の末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）によって触媒される鋳型によらない配列（Ｎ領域）の付加が含まれる（図１２（ｂ））。

【0176】

クローン２２５の配列（図１２ｂ）によって表される既に回収した２本の配列は、Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントを含むレトロウイルス発現ベクターが、前駆Ｂリンパ球においてＶ（Ｄ）Ｊ組換えを受ける能力を有することの確かな証拠である。なぜなら、この時点における効率性が低いように見えるとしても、真正のＶ（Ｄ）Ｊ組換えイベントのあらゆる徴候を示すこれらの配列が、その他の方法でどのように生成され得たかについて、他に説明がないためである。前駆リンパ球のレトロウイルス形質導入のコンテクストにおけるＶ（Ｄ）Ｊ組換えの効率性が上昇すると、「準生殖細胞系」配置のＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントを含む限られた数のレトロウイルスベクターから、抗体配列の多様なコレクションを生成することができると結論付けられる。

【0177】

実施例５
レトロ細胞ディスプレイに好適な選択用マウスＢ細胞系の同定及び特性決定
ａ）Ｂ細胞系における内因性抗体の発現は、潜在的にレトロ細胞ディスプレイにおけるその選択用細胞としての利用を妨げ得る。これは、内因性マウス免疫グロブリン鎖の組換え完全抗体鎖との対形成が、その細胞表面提示に悪影響を及ぼし得るか、又は結合特異性が不確定な混合ヒト−マウス免疫グロブリンの発現につながり得るためである。従って、文献に記載されるエーベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭｕＬＶ）により形質転換されたマウスプレＢ細胞系のパネルを、内因性ＩｇＭ重鎖（μＨ）の細胞内発現について、ＦＩＴＣ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と結合させた抗マウスＩｇＭ重鎖抗体を用いて調べた。これらの細胞は、系統４０Ｅ１、２３０−２３８、２０４−１−８（Ａｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９８１）、１８−８１、１８−８１サブクローン８−１１（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＆ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ １９７８）、ＲＡＧ−２欠損マウス由来の６３−１２（ここではＦＡ−１２と称される）細胞（Ｓｉｎｋａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、及び三重代替軽鎖ノックアウトマウス由来の１６２４−５、１６２４−６（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，２００２）を含んだ。Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍキット（Ｃａｌｔｅｃｈ）を用いて、製造者の指示に従い、細胞を透過処理した。図１４に示されるとおり、細胞系ＦＡ−１２、４０Ｅ１、及び１８−８１サブクローン８−１１、１６２４−５及び１６２４−６は、細胞内ＩｇＭ染色のシグナルをほとんど又は全く示さなかったため、レトロ細胞ディスプレイに好適な選択用細胞として適格とされた。

【0178】

ｂ）レトロ細胞ディスプレイはレトロウイルスベクター媒介性の遺伝子導入に基づくため、マウスＡ−ＭｕＬＶ形質転換プレＢ細胞系のパネルを、そのレトロウイルス形質導入に対する感受性について、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー遺伝子を含むエコトロピックＭＬＶ由来のベクター粒子を用いてさらに調べた（図１３）。限界希釈により１８−８１サブクローン８−１１プレＢ細胞に対して予め力価を決定した、パッケージングされたレポーター遺伝子ＧＦＰを含む導入ベクターＬＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を有するベクター調製物を用いて、０．５のＭＯＩで１×１０^５個の細胞を形質導入した。ベクター粒子は、以下に記載されるとおり生成した。形質導入は、基本的に、１．５ｍｌエッペンドルフ試験管内における３，３００ｒｐｍ、３０℃での３時間にわたる遠心を用いて、スピン感染により実施した。形質導入の２日後、ＦＡＣＳ分析によりＧＦＰ発現細胞の頻度を測定することによって遺伝子導入を分析した。処置していない未導入の標的細胞を陰性対照として供した。図１３に示されるとおり、元の１８−８１細胞のみが、ＭＬＶベクター形質導入に対して極めて低い寛容性を示した（＜１０％）。他の全ての細胞系は、４０％以上の遺伝子導入効率が明らかとなった。特に、ＦＡ−１２、４０Ｅ１及び１６２４−５細胞では、遺伝子導入効率が最も高く、本実験においては５０％超に達した。

【0179】

まとめると、ａ）内因性マウス免疫グロブリン発現が低いか、又はないこと、及びｂ）レトロウイルス形質導入に対する感受性の双方の基準を考慮すれば、レトロ細胞ディスプレイにはＦＡ１２、４０Ｅ１及び１６２４−５細胞が最も好適であることが分かった。しかしながら、組換え重鎖及び軽鎖からなる免疫グロブリンを発現させることが望ましいため、代替軽鎖成分の発現が欠如した（λ５、又はＶｐｒｅＢ１、又はＶｐｒｅＢ２遺伝子から発現させることが可能な）Ｂ細胞も好ましく、これは、代替軽鎖成分がまた、野生型プレＢ細胞では組換え軽鎖との重鎖結合について競合し得るためである。従って、代替軽鎖三重ノックアウトマウスに由来する１６２４−５細胞が、これ以降のレトロ細胞ディスプレイ技術に最も適した細胞であるものと予想される。しかしながら、ここで分析した別の細胞系を含め、内因性免疫グロブリン発現がない／低いことと、レトロウイルスによる形質導入性との基準を満たす任意の他の細胞系が、本明細書に開示される方法の実現に用いられ得ることは理解されなければならない。

【0180】

実施例６完全ヒト抗体ライブラリをクローン性に安定発現する選択用細胞の生成
完全ヒト抗体鎖及びそのライブラリをコードするパッケージング導入ベクターを有するベクター粒子を生成するため、及び続いてそれらをマウスＢ細胞系の形質導入に用いるため、以下の方法により感染実験を実施した。トランスフェクションの１６〜２４時間前、ヒト胎児腎臓２９３Ｔ−ＨＥＫ細胞を、１０ｃｍの組織培養皿につき、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及びＬグルタミンを補充した１０ｍｌのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、２×１０^６でプレーティングした。５μｇの各導入ベクターＩｇＬ（２４５）−ＬＩＢ−ＩＲＥＳ−ＹＦＰ及びＩｇＨ（６５０）−ＬＩＢ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（ＩＲＥＳによりＧＦＰ又はＹＦＰ発現と結び付けられた重鎖又は軽鎖のライブラリをコードする、図１５）と、３μｇのｐＶＰａｃｋ−ＧＰ（ＭＬＶのｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を有する発現コンストラクト）と、２．５μｇのｐＶＰａｃｋ−Ｅｃｏ（エコトロピックＭＬＶのｅｎｖ遺伝子を含む発現コンストラクト、双方ともＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）との混合物を調製し、１ｍｌの無血清ＤＭＥＭ中、３０μｌのＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）と共にインキュベートし、１５〜３０分間、室温で静置したままとした。次に、１０ｃｍ皿に播種した２９３Ｔ−ＨＥＫ細胞に、Ｆｕｇｅｎｅ／ＤＮＡ混合物を静かに添加した。重鎖及び軽鎖コード導入ベクターを、別個の一時的なパッケージング細胞にトランスフェクトした。

【0181】

トランスフェクションの４８時間後、一時的なパッケージング細胞からベクター粒子を含む上清を回収し、３，０００ｒｐｍで遠心して、混入している細胞を取り除いた。パッケージングされた抗体の重鎖又は軽鎖コード領域を有する種々の量のベクター粒子（１：１； １：５； １：２０； １：５０； １：１００； １：２００希釈）を補充した１ｍｌの培地に、１．５×１０^６個の１６２４−５マウスＢ細胞を懸濁した。１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆカップ内で、３，３００ｒｐｍ、３０℃で３時間にわたり遠心することにより、形質導入を実施した。用いられなかった上清は、後の時点で利用するため−８０℃で保存した。宿主細胞ゲノムに導入ベクターの単一のコピーが組み込まれたことを確実にするため、感染の４日後に遺伝子導入の効率性（ＧＦＰ又はＹＦＰの発現により検出される）が１０％より低いことが明らかとなった細胞は、ＦＡＣＳを用いて濃縮した（図１６）。細胞を６日間にわたり増殖させたうえ、上記のとおり、先に凍結した、パッケージングされた抗体の軽鎖コード領域を有するベクター粒子を１：５希釈で用いて、第２の形質導入手順に供した。ここで、重鎖発現用に選択されたＧＦＰ陽性細胞を、軽鎖−ＩＲＥＳ−ＹＦＰライブラリを形質導入するベクター粒子に感染させ、逆もまた同様に行った（図１５及び図１６）。感染の４日後、形質導入に成功してＧＦＰ及びＹＦＰを発現する細胞を、ＦＡＣＳを用いて濃縮した。第２の形質導入後、細胞の約２０％がＧＦＰ及びＹＦＰ発現を示した。細胞１個につき単一のベクターの組込みのみが起こったことを確かにするため、集団の約３分の１を濃縮したところ、第２のラウンドで形質導入されたレポーター遺伝子の発現は低度又は中程度に過ぎないことが明らかとなった（約８％、図１６を参照）。

【0182】

実施例７
レトロ細胞ディスプレイによる抗原反応性ヒト抗体発現細胞の検出及び濃縮
ａ）レトロ細胞ディスプレイ概念実証実験の準備として、第一に、選択用細胞上でレトロウイルス発現させるＩＬ−１５結合抗体に最適な染色及び検出条件を決定した。ヒトＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖ライブラリを同時発現する１６２４−５ Ａ−ＭｕＬＶ形質転換プレＢ細胞を、細胞表面上のヒト抗ＩＬ−１５抗体をコードするレトロウイルス発現ベクターを発現する１６２４−５ Ａ−ＭｕＬＶ形質転換プレＢ細胞と２：１の比で混合した。混合した細胞試料は、示されるとおりの、様々な濃度の組換えヒトＩＬ−１５（０．１〜２．５μｇ／ｍｌ）、及び様々な濃度のポリクローナルビオチン化抗ｈｕ−ＩＬ−１５抗体（１．０及び３．０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、これらは、最終的にストレプトアビジン−フィコエリトリン（ｓｔｒｅｐ−ＰＥ）により明らかにされた。抗体を提示する細胞を、免疫グロブリンを発現しない細胞と区別するため、試料をさらに抗ｈｕ−ＩｇκＬ−ＡＰＣ抗体で対比染色した。図１７の右上の２つのＦＡＣＳパネルを見ると分かるとおり、一次試薬としての０．１及び０．５μｇ／ｍｌの組換えＩＬ−１５と、二次染色試薬としての３．０μｇ／ｍｌのビオチン化抗ｈｕ−ＩＬ−１５抗体との組み合わせを用いると、ＩＬ−１５反応性細胞が最も効率的に検出された（２０．１及び２０．４％）。

【0183】

ｂ）次に、概念実証実験を実施し、ここでは、ヒトＩＬ−１５に対して特異的な基準抗体を、ヒト抗体の多様なライブラリを発現する細胞のプールにスパイクし、その後、スパイクインされた抗原反応性細胞をＦＡＣＳにより分析した。この実験の準備において、１６２４−５細胞内でレトロウイルスにより発現する抗体のライブラリ（実施例６を参照）を、表面Ｉｇ発現及びＩＬ−１５結合性について（ＮＣ）、ヒトＩＬ−１５抗原に対して特異的な基準抗体を発現する１６２４−５細胞系（ＰＣ）と同時に染色した。これらのＮＣ及びＰＣ細胞系に対するＦＡＣＳ分析が図１８に示され、これは、ＰＣ細胞の表面上に提示された抗ＩＬ−１５基準抗体の特異的ＩＬ−１５染色を実証する。ＰＣ細胞がヒト抗体のランダムコレクションを発現するＮＣ細胞系にスパイクされた場合に、基準抗ＩＬ−１５Ａｂ発現細胞系がなおＦＡＣＳにより定量的に検出可能であるかどうかを分析するため、ＮＣライブラリにおける異なる希釈のＰＣ細胞を、上記で決定した最適化ＩＬ−１５染色条件を用いて、特異的ＩＬ−１５結合性についてＦＡＣＳにより分析した。陰性対照細胞のＦＡＣＳ分析からは、わずかな集団しかＩＬ−１５結合活性を示さないことが明らかとなった。対照的に、陽性対照集団の６０％超が、ＩＬ−１５と結合することが実証された。上記の双方の集団を、１０、１２．５、２５、３７．５、及び５０％の比率で混合すると、抗体ライブラリ細胞プール中に混合した陽性対照細胞のパーセンテージの、ＩＬ−１５と結合することが示された細胞の割合との間に相関が認められた。従って、ＩＬ−１５反応性細胞は、他の非特異的抗体発現細胞との混合物中にあるとき、ＦＡＣＳ染色により定量的に検出することができると結論付けられる。

【0184】

ｃ）次に、微量のＩＬ−１５反応性細胞をレトロ細胞ディスプレイにより濃縮する概念実証実験を実施した。このため、ＩＬ−１５ ＩｇＨ鎖（ＧＦＰと結合）のレトロウイルス形質導入により、１６２４−５プレＢ細胞内で発現するヒト抗体の高度に多様なコレクションを生成し、ヒトＩｇκＬ鎖（ＹＦＰと結合）の複雑度の高いコレクション（複雑度 約７×１０^４）を同時形質導入した。このようにして、ヒトＩｇκＬ鎖の多様なコレクションを、ヒト抗ＩＬ−１５特異的抗体由来の単一のＩｇＨ鎖に対してシャフリングすることにより、レトロ細胞ディスプレイ抗体ライブラリを作成した。先に決定したとおりの最適条件を用いて、ＩＬ−１５反応性について細胞を染色した。高速ＦＡＣＳ細胞分取と、それに続く細胞培養物の増殖との３回の連続ラウンドにより、ＩＬ−１５反応性細胞を濃縮した。レトロ細胞ディスプレイ濃縮の３回のラウンド後、ヒト抗体を発現する細胞集団を得ることができ、これは、基本的に、ＩＬ−１５反応性細胞をほとんど検出することのできなかった初期細胞集団由来の抗原ＩＬ−１５について定量的に染色した（図１９）。この実験から、レトロ細胞ディスプレイ濃縮の反復ラウンドを効率的に用いて、ＩＬ−１５結合性細胞を濃縮できたことが実証された。

【0185】

ｄ）３回のＩＬ−１５濃縮を行った細胞プールから樹立した個々の細胞クローンのＩＬ−１５結合特異性の確認（先述の実施例を参照）。次に、ＩＬ−１５特異的レトロ細胞ディスプレイ濃縮に３回供された細胞プールから、単細胞分取により２５個の個々の細胞クローンを樹立した。これらの２５個の細胞クローンを、そのＩＬ−１５特異性について、ＩＬ−１５染色により、先に最適化した染色条件を用いて（実施例７ａを参照）特徴付けた。ＩＬ−１５染色の特異性についての対照として、全てのクローンはまた、ＩＬ−１５抗原を除くあらゆる染色試薬と共にインキュベートした。２５個の単細胞クローンの大部分は高度に特異的なＩＬ−１５染色パターンを示し、これは、ＩＬ−１５抗原を染色反応から外すと失われた。代表的なＩＬ−１５特異的染色を、４個の選択された個別の細胞クローンで図１９に示す。これらのクローンについての染色は、３回のＩＬ−１５抗原濃縮を行った細胞集団から樹立された２５個の細胞クローン（ＡからＹまで、アルファベット順に命名）の全体を代表するものであり、これらは全て試験され、ＩＬ−１５抗原結合性に対し陽性であった。染色の特異性についての陰性及び陽性対照を、示されるとおり、図１９に提供する。

【0186】

実施例８
鎖シャフリング又は誘導進化手法：高速細胞分取による抗原特異的ヒト抗体発現細胞の検出及び反復濃縮、抗原選択された細胞からの可変領域コード領域のクローニング、及び抗原特異性の確認
上記のとおり（実施例６）、約１．２×１０^５の複雑度のヒトＩｇκＬ鎖のライブラリを、標的抗原ヒトＩＬ−１βに対する基準抗体ＳＫ４８−Ｅ２６（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９５／０７９９７ Ａ１号パンフレット）の重鎖と併せて発現する細胞ライブラリを作成した。こうした鎖を含むレトロウイルスベクター骨格は、図４ｃ及び図１１にさらに詳細に図示される（実施例４もまた参照のこと）。このため、３×１０^６個の１６２４−５ Ａ−ＭｕＬＶ形質転換１６２４−５プレＢ細胞を、ＳＫ４８−Ｅ２６ ＩｇＨ鎖コード導入ベクターを含む粒子により、０．１未満のＭＯＩで形質導入した。形質導入の１日後、ＢＤからのＦＡＣＳＡｒｉａを用いた標準的な高速細胞分取によりＧＦＰ陽性細胞を濃縮した。分取した細胞を、加湿されたインキュベーター内で５日間にわたり組織培養により増殖した。増殖後、細胞集団を、上記のとおり（実施例５）、パッケージングされたＩｇκＬ鎖ライブラリを有する粒子で、標準的なスピン感染により１．５のＭＯＩで形質導入し、細胞を組織培養で２日間、形質導入から回復させた。２日間の回復及び増殖期間後、ＧＦＰ及びＹＦＰを同時発現する、従って少なくとも１本の重鎖と１本の軽鎖とのコンストラクトを有する５×１０^５個の細胞を、ＢＤからのＦＡＣＳＡｒｉａを用いた予備的細胞分取を用いて濃縮した。こうしてＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖コンストラクトの同時発現について濃縮した細胞集団を、さらに４日間、組織培養で増殖した。この最後の増殖後、ＩｇＨ鎖／ＩｇＬ鎖ライブラリを発現する２×１０^６個の細胞のアリコートを、１００μｌの容量中２μｇ／ｍｌで組換えヒトＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により３０分間、氷上で染色し、その後、１％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて２回の洗浄ステップを行った。ＩＬ−１βに対する、ビオチンとコンジュゲートしたポリクローナル抗体とのインキュベーション後、細胞を再び２回洗浄し、続いて、抗原結合性細胞の検出、及びその後のフローサイトメトリーを用いた濃縮のために、ストレプトアビジン−ＡＰＣで染色した。ＦＡＣＳによる第１の細胞分取ラウンド後、細胞を５日間増殖させ、上記のとおりの、抗ＩＬ−１β染色と陽性染色細胞の濃縮とのさらなるラウンドに供した。この選別を３回繰り返した（図２１）。レトロ細胞ディスプレイ濃縮の３回のラウンド後に得られた細胞集団を、上記のとおり、ＩＬ−１β結合性について再び染色したが、このとき反応性細胞は、それまでのようにバルク集団としては濃縮せず、ＢＤからのＦＡＣＳＡｒｉａを用いた単細胞分取により個々の細胞クローンを９６ウェルプレートに分取した。７日間の培養及び増殖後、個々の細胞クローンを、ＩＬ−１β抗原特異性について、記載したプロトコルを用いて、加えて陰性対照として、抗原ＩＬ−１βを除くあらゆる二次試薬により、再び分析した。予想どおり、フローサイトメトリーを用いて実証されたとおり、抗原の存在下における特異的ＦＡＣＳシグナルにより明らかになったように、一部のクローンが標的抗原に対して特異的結合性を示したが、抗原が存在しない場合には、特異的結合性は示さなかった（クローンの二次検出試薬のいずれかとのバックグラウンドでの結合を除く）。しかしながら、一部のクローンは、抗原の存在と関係なく染色シグナルを示したが、これは、こうしたクローンが、ＩＬ−１β反応性を検出するために用いられた二次試薬のいずれかと非特異的に結合したことを示す。全体では、２４個の細胞クローンのゲノムＤＮＡを単離し、オリゴヌクレオチド配列番号３１及び配列番号３２を用いる標準的ゲノムＰＣＲの鋳型として供した。これらのオリゴヌクレオチドは、レトロウイルス軽鎖ライブラリにコードされるヒト軽鎖の可変領域の、それぞれ上流及び下流に特異的に結合する。

【数20】

【0187】

分析した各細胞クローンから予想されたサイズのＰＣＲアンプリコンが得られ、それらのＰＣＲアンプリコンを直接ＤＮＡ配列解析に供した。個別に決定したとき、分析した２４個のクローンのうち１２個が、ＬＣＢ２４と称される同一の、しかし新規のＩｇκＬ鎖を有することが示され、また、予想どおりＳＫ４８−Ｅ２６のＩｇＨ鎖も有した。

【0188】

予想どおり、ＳＫ４８−Ｅ２６ ＩｇＨ鎖と併せてＬＣＢ２４ ＩｇＬ鎖を発現する１２個全てのクローンが、上述されるとおりフローサイトメトリーを用いると、特異的ＩＬ−１βシグナルを示した。

【0189】

増幅した新規ＬＣＢ２４ ＩｇκＬ鎖を含む選択されたＰＣＲアンプリコンを、可変部コード領域に隣接する制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩ（図４ｃ）で消化し、その断片を、ＬＣＢ２４ Ｖ_Ｌコード領域の定常ヒトκ軽鎖コード領域とのインフレーム融合を可能にする適合する制限酵素部位により、レトロウイルスＩｇκＬ鎖発現ベクターにクローニングした。従って、得られたベクターは、新規の完全ヒトＩｇκＬ鎖をコードした。

【0190】

再クローニングし、さらに配列検証した、ＬＣＢ２４ ＩｇκＬ鎖のレトロウイルス発現ベクターを、ＩＬ−１β基準抗体ＳＫ４８−Ｅ２６のＳＫ４８Ｅ２６ ＩｇＨ鎖と共に１６２４−５細胞に形質導入した。組織培養で２日間増殖させた後、ＢＤからのＦＡＣＳＡｒｉａを用いた高速細胞分取によりＧＦＰ＋／ＹＦＰ＋細胞を濃縮した。結果として得られたＩｇ発現細胞を、まず初めに、そのＩＬ−１βとの結合能力について記載されるとおり試験した。予想どおり、ＳＫ４８−Ｅ２６の重鎖と共にＬＣＢ２４を提示することにより媒介されたその反応性が確認された（図２２）。新規抗体が概して他の抗原又はタンパク質と交差反応することを排除するため、ＬＣＢ２４ ＩｇＬ／ＳＫ４８−Ｅ２６ ＩｇＨの組み合わせを発現する細胞を、先述のとおりＩＬ−１５反応性についてアッセイした。図２３に示されるとおり、新規ＩｇＬ ＬＣＢ２４／ＨＣ ＳＫ４８−Ｅ２６抗体についてＩＬ−１５に対する反応性を検出することはできなかったことから、新規抗体の標的抗原特異性が示された。さらなる対照として、抗ＩＬ−１５特異的基準抗体（陽性対照として）、及び元のＳＫ４８−Ｅ２６ ＩＬ−１β抗体を発現する細胞系を含めた。抗ＩＬ−１５抗体発現細胞は、予想どおりＩＬ−１５に対して特異的染色を示したが、ＳＫ４８−Ｅ２６ ＩＬ−１β抗体又は細胞については、反応性は認められなかった（図２３）。

【0191】

要約すれば、ＩＬ−１β特異的基準抗体ＳＫ４８−Ｅ２６の重鎖に対してシャッフルした軽鎖のライブラリを用いたスクリーニング実験において、抗原特異的反応性を媒介する新規軽鎖が同定された。

【0192】

実施例９
シャッフルしたＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖ライブラリに対するレトロ細胞ディスプレイスクリーニング。高速細胞分取による抗原特異的ヒト抗体発現細胞の検出及び反復濃縮、抗原選択された細胞からの可変領域コード領域のクローニング、及び抗原特異性の確認
上記のとおり（実施例６）、約０．１のＭＯＩを用いて、複雑度が約６．５×１０^５の重鎖（ＧＦＰと結合）のライブラリを発現する細胞ライブラリを生成した。こうした鎖を含むレトロウイルスベクター骨格は、図４ｃ及び図１１にさらに詳細に図示される（実施例４もまた参照のこと）。このため、３×１０^６個の１６２４−５ Ａ−ＭｕＬＶ形質転換１６２４−５プレＢ細胞を、上述のＩｇＨ鎖ライブラリをコードする導入ベクターを含む粒子により、０．１未満のＭＯＩで形質導入した。形質導入の２日後、ＢＤからのＦＡＣＳＡｒｉａを用いた標準的な高速細胞分取によりＧＦＰ陽性細胞を濃縮した。ＧＦＰ＋細胞の分取後、細胞を組織培養でさらに２日間にわたり増殖した。増殖後、ＧＦＰ＋細胞集団を、２４５本の完全配列を特徴とする軽鎖からなるパッケージングされた軽鎖ライブラリを有する粒子により、１より大きいＭＯＩで先述のとおり形質導入した。形質導入の２日後、ＧＦＰ＋／ＹＦＰ＋二重形質導入細胞を高速細胞分取により濃縮し、こうして細胞の大部分がＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖ライブラリの双方を有する細胞集団を、組織培養で３日間にわたり再び増殖した。この後、２．５×１０^５個の細胞のアリコートを、上記のとおり、とりわけＳＡＶ（ストレプトアビジン）−ＡＰＣ−Ｃｙ７を含む抗原のカクテルで染色し（実施例８を参照）、標的抗原の反応性についてフローサイトメトリーを用いて濃縮した。同時に、抗体ＩｇＨ／ＩｇＬライブラリを発現する細胞集団を、抗ＩｇＬκ特異的抗体を用いて染色した。これらの細胞のうち約７５％が、細胞表面上にヒト抗体を提示することが分かった（データは示さず）。抗原反応性細胞を、ＢＤからのＦＡＣＳＡｒｉａを用いた高速細胞分取により分取し、濃縮した細胞を組織培養で７日間にわたり増殖した。上記と同じ染色及び細胞濃縮手順をさらに２回繰り返した。３回のレトロ細胞ディスプレイ選択ラウンド後、得られた細胞集団を再び染色して標的抗原ＳＡＶ−ＡＰＣ−Ｃｙ７の結合性を評価し、フローサイトメトリーを用いて分析した。図２４に示されるとおり、得られたバルク集団はＳＡＶ−ＡＰＣ−Ｃｙ７との結合性を示したことから、ＳＡＶ−ＡＰＣ−Ｃｙ７に対して抗原特異性を有する抗体の選択の成功が示された。標的抗原ＳＡＶ−ＡＰＣ−Ｃｙ７に対する反応の特異性を評価するため、３回濃縮したライブラリ発現細胞を、抗原ＳＡＶ−ＡＰＣ及びＳＡＶ−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５によっても染色した（図２５）。陰性対照として供された形質導入していない細胞及び選択していないライブラリを発現する細胞と同様に、これらの抗原には、３回のＳＡＶ−ＡＰＣ−Ｃｙ７濃縮を行った細胞は結合しなかった。しかしながら、後者の細胞は、ここでも確かに、ＳＡＶ−ＡＰＣ−Ｃｙ７に対する強力な反応性が明らかとなったことから、選択された細胞集団の抗原特異性が、ＳＡＶ−ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデム色素のＣｙ７蛍光色素を対象としたことが示唆される。

【0193】

３回濃縮した細胞集団のゲノムＤＮＡを単離し、オリゴヌクレオチド配列番号３１（上記参照）及び配列番号３３を用いる標準的なゲノムＰＣＲの鋳型として供した。これらのオリゴヌクレオチドは、レトロウイルスライブラリにコードされるヒト軽鎖及び重鎖のコード領域の上流及び下流に特異的に結合する。

【数21】

【0194】

予想されたサイズの重鎖及び軽鎖のＰＣＲアンプリコンが得られ、それらを、標準的なＰＣＲ断片クローニングベクターｐＳＣ−Ｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に、製造者の推奨どおりに個別にサブクローニングした。ＩｇＨ ＰＣＲ断片サブクローニング及びＩｇＬ ＰＣＲ断片サブクローニングから各々得られた１０個の細菌クローンから、クローニングされた重鎖及び軽鎖領域を有するｐＳＣ−Ｂプラスミドクローンを単離し、これらを全て、ＤＮＡ配列解析に供した。ＤＮＡ配列決定により、ＨＣ４９、ＨＣ５８と称される２本の異なるＩｇＨ鎖配列と、ＬＣ４及びＬＣ１０と称される２本の異なるＩｇＬ鎖配列とが明らかとなった。

【0195】

Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌコード領域を含むＤＮＡ断片を、配列検証したクローンからＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏ４７ＩＩＩ消化により単離した。これは、これらの制限酵素部位が、ＨＣ４９、ＨＣ５８、ＬＣ４及びＬＣ１０のそれぞれのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域の可変領域（図４ｃを参照）に隣接するためである。ＨＣ４９、ＨＣ５８、ＬＣ４及びＬＣ１０の単離したＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を、上記のとおり、ヒトＩｇγ１Ｈ鎖（ＧＦＰと結合したＩＲＥＳを発現する）及びヒトＩｇκＬ鎖（ＹＦＰと結合したＩＲＥＳを発現する）の定常領域をそれぞれ有するレトロウイルスレシピエントベクターにクローニングした。これにより、新規ＨＣ４９及びＨＣ５８ ＩｇＨ鎖、ＬＣ４及びＬＣ１０ ＩｇＬ鎖の完全ヒトＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖をコードするレトロウイルス発現ベクターコンストラクトが生成された。これらのベクターを１６２４−５プレＢ細胞に同時形質導入し、８日間増殖させた後、前と同じくフローサイトメトリーを用いてＧＦＰ＋／ＹＦＰ＋細胞を濃縮した。得られた細胞を、まず初めに、そのＳＡＶ−ＡＰＣ−Ｃｙ７との結合能力について記載したとおり試験した。図２６に示されるとおり、抗体ＨＣ４９／ＬＣ４及びＨＣ／ＬＣ１０を発現する細胞の反応性は、ＳＡＶ−ＡＰＣ−Ｃｙ７に対して特に著しい結合活性を示さなかった。対照的に、抗体ＨＣ５８／ＬＣ４及びＨＣ５８／ＬＣ１０によって媒介される反応性は、直ちに認められた。これは、公知の抗原特異性を有する基準抗体由来の公知のＩｇＨ鎖又はＩｇＬ鎖のいずれも必要とすることのない、ＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖の多様なコレクションのシャフリングに基づくレトロ細胞ディスプレイによる新規抗原特異的抗体の同定の成功についての概念実証を提供するものである。

【0196】

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・国際公開第８９／１２８２３ Ａ１号パンフレット：Ｍｏｓｉｅｒ ＤＥ及びＷｉｌｓｏｎ ＤＢ「Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ ａｎｉｍａｌ」．
・国際公開第９０／１３６６０ Ａ２号パンフレット：Ｌａｎｇ ＡＢ，Ｌａｒｒｉｃｋ ＪＷ，Ｃｒｙｚ ＳＪ「Ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｓｅｒｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ」．
・国際公開第９２／０１０４７ Ａ１号パンフレット：ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ Ｊ，Ｐｏｐｅ ＡＲ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＫＳ，Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ＨＲＪＭ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＤ，Ｊａｃｋｓｏｎ ＲＨ，Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，ＫＰ，Ｍａｒｋｓ ＪＤ，Ｃｌａｃｋｓｏｎ ＴＰ，Ｃｈｉｓｗｅｌｌ ＤＪ，Ｗｉｎｔｅｒ ＧＰ，Ｂｏｎｎｅｒｔ ＴＰ「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｉｒｓ」．
・国際公開第９２／０２５５１ Ａ１号パンフレット：Ｓｃｈｒａｄｅｒ ＪＷ「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ａ ｄｅｓｉｒｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ」．
・国際公開第９５／０１９９７ Ａ１号パンフレット：Ｙｏｕｎｇ ＰＲ，Ｇｒｏｓｓ ＭＳ，Ｊｏｎａｋ ＺＬ，Ｔｈｅｉｓｅｎ ＴＷ，Ｈｕｒｌｅ ＭＲ，Ｊａｃｋｓｏｎ ＪＲ「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｄ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＩＬ−１ｂｅｔａ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＩＬ−１ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｉｎ ｍａｎ」．
・国際公開第９８／２４８９３ Ａ２号パンフレット：Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ａ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ Ｒ，Ｋｌａｐｈｏｌｚ Ｓ，Ｍｅｎｄｅｚ Ｍ，Ｇｒｅｅｎ Ｌ「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍａｍｍａｌｓ ｈａｖｉｎｇ ｈｕｍａｎ Ｉｇ ｌｏｃｉ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐｌｕｒａｌ Ｖ_Ｈ ａｎｄ Ｖ_ｋ ｒｅｇｉｏｎｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｔｈｅｒｅｆｒｏｍ」．
・国際公開第０２／０６６６３０ Ａ１号パンフレット：Ｍｕｒｐｈｙ ＡＪ及びＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ ＧＤ「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ」．
・国際公開第０２／１０２８５５ Ａ２号パンフレット：Ｚａｕｄｅｒｅｒ Ｍ及びＳｍｉｔｈ ＥＳ「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ」．
・国際公開第０３／０１７９３５ Ａ２号パンフレット：ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｉｎｋｅｌ ＪＧＪ，ｖａｎ Ｄｉｊｋ ＭＡ，Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ Ｊ，Ｇｅｒｒｉｔｓｅｎ ＡＦ，Ｂａａｄｓｇａａｒｄ Ｏ「Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １５（ＩＬ−１５）」．
・国際公開第０３／０５４１９７ Ａ２号パンフレット：Ｐｅｒａｂｏ Ｌ，Ｂｕｅｎｉｎｇ Ｈ，Ｅｎｓｓｌｅ Ｊ，Ｒｅｉｄ Ｍ，Ｈａｌｌｅｋ Ｍ「Ａ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｇｅｎｅｓ ｏｒ ｃａｐｓｉｄ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｃｌｏｎｅｓ ｗｉｔｈ ｄｅｓｉｒｅｄ ｃｅｌｌ ｔｒｏｐｉｓｍ」．
・国際公開第０３／０６８８１９ Ａ１号パンフレット：Ｇｒａｗｕｎｄｅｒ Ｕ及びＭｅｌｃｈｅｒｓ ＧＦ「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｕｓｅ ｔｈｅｒｅｏｆ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」．
・国際公開第０３／０８３０７５ Ａ２号パンフレット：Ｂｒｅｍｅｌ ＲＤ，Ｂｌｅｃｋ ＧＴ，Ｉｍｂｏｄｅｎ Ｍ，Ｅａｋｌｅ Ｋ「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」．
・国際公開第０４／０５１２６６ Ａ１号パンフレット：Ｍｕｒａｇｕｃｈｉ Ａ，Ｋｉｓｈｉ Ｈ，Ｔａｍｉｙａ Ｅ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｍ「Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ａｒｒａｙ ｃｈｉｐ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ」．
・国際公開第０４／０７６６７７ Ａ２号パンフレット：Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ Ａ「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ＥＢＶ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌｓ」．
・国際公開第０４／１０６３７７ Ａ１号パンフレット：Ｌａｗｓｏｎ ＡＤＧ及びＬｉｇｈｔｗｏｏｄ ＤＪ「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」．
・国際公開第０８／０５５７９５ Ａ１号パンフレット：Ｂｅｅｒｌｉ Ｒ，Ｂａｃｈｍａｎｎ Ｍ，Ｂａｕｅｒ Ｍ「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｄｉｓｐｌａｙ」．

【図1】

【図2a】

【図2b】

【図2c】

【図3a】

【図3b】

【図4ab】

【図4c】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図5d】

【図5e】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図6d】

【図7】

【図8a】

【図8b】

【図9a】

【図9b】

【図10】

【図11a】

【図11b】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]