特許 6021230 内部コントロールを使用するヒトＤＮＡを定量するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6021230

(24)【登録日】2016年10月14日

(45)【発行日】2016年11月9日

(54)【発明の名称】内部コントロールを使用するヒトＤＮＡを定量するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20161027BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20161027BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12Q1/68 A

【請求項の数】19

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2013-553849(P2013-553849)

(86)(22)【出願日】2012年2月20日

(65)【公表番号】特表2014-506794(P2014-506794A)

(43)【公表日】2014年3月20日

(86)【国際出願番号】EP2012000833

(87)【国際公開番号】WO2012113577

(87)【国際公開日】20120830

【審査請求日】2014年12月10日

(31)【優先権主張番号】11155178.4

(32)【優先日】2011年2月21日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】61/588,975

(32)【優先日】2012年1月20日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507214038

【氏名又は名称】キアゲン ゲーエムベーハー

(73)【特許権者】

【識別番号】502310852

【氏名又は名称】キアゲン マンチェスター リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ディ パスクアール， フランチェスカ

(72)【発明者】

【氏名】エンゲル， ホルガー

(72)【発明者】

【氏名】シュトラウス， ザーシャ

(72)【発明者】

【氏名】セルウェル， ニコラ ジョー

【審査官】 田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０８−１０５８８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５４０４３６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／６８

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

サンプル中のゲノムの１種以上の核酸を定量するための方法であって、ここで増幅反応において、
ａ．第１の核酸は増幅され、増幅される遺伝子座は、前記ゲノム内のマルチコピー遺伝子座（ＭＣＬ）であり、ここで前記遺伝子座は、８０塩基対の範囲にわたって配列番号１に従う配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を共有し、前記マルチコピー遺伝子座は、少なくとも２種の異なる染色体上にコピーを有し、
ｂ．内部コントロール（ＩＣ）として添加された第２の核酸もまた、増幅され、ここで、標準曲線の生成を可能にするために異なる量の前記第２の核酸が増幅され、
ｃ．前記標準曲線を参考にして前記第１の核酸の増幅からの増幅産物の量が決定される、
方法。

【請求項2】

第３の核酸がさらに増幅され、前記遺伝子座は、ヒトＹ染色体上のマルチコピー遺伝子座（ＭＣＬ−Ｙ）であり、ここで前記遺伝子座は、８０塩基対の範囲にわたって配列番号１５に従う配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を共有し、
ａ．前記第３の核酸は、増幅され、
ｂ．前記第１の核酸および前記第３の核酸の増幅からの増幅産物の量が、決定される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第２の核酸の増幅産物の量もまた決定される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記増幅の方法が、ポリメラーゼ連鎖反応もしくはリアルタイムＰＣＲ反応であり、決定される核酸の量は、前記増幅の過程の間に、もしくは前記増幅反応の最後に終点測定としてのいずれかで決定される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

前記第１の核酸（ＭＣＬ）および／もしくは前記第３の核酸（ＭＣＬ−Ｙ）の増幅産物は、６０塩基対〜２００塩基対の間の長さである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

前記第２の核酸（ＩＣ）の増幅産物は、６０〜４００塩基対の間である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

前記第２の核酸（ＩＣ）の増幅産物は、１００〜４００塩基対の間である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記第２の核酸（ＩＣ）の増幅産物は、前記第１の核酸（ＭＣＬ）の増幅産物より長い、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

前記増幅反応が、以下：
ａ．８〜８．８の間のｐＨのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ならびに／または
ｂ．塩化カリウムおよび硫酸カリウムの群から選択されるカリウム塩、ならびに／または
ｃ．アンモニウム塩、ならびに／または
ｄ．塩化マグネシウム、ならびに／または
ｅ．ホットスタートポリメラーゼ
を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。

【請求項10】

前記アンモニウム塩が塩化アンモニウムもしくは硫酸アンモニウムである、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記増幅反応は、前記第２の核酸（ＩＣ）の１００〜５０００の間のコピーを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。

【請求項12】

以下：

【化6】

の群より選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法に従って第１の核酸（ＭＣＬ）を増幅するためのプライマー。

【請求項13】

以下：

【化7】

の群より選択される、請求項２に記載の方法に従って第３の核酸（Ｙ−ＭＣＬ）を増幅するためのプライマー。

【請求項14】

請求項１２に記載のプライマーからなる、第１の核酸（ＭＣＬ）を増幅するためのプライマー対。

【請求項15】

請求項１３に記載のプライマーからなる、第３の核酸（Ｙ−ＭＣＬ）を増幅するためのプライマー対。

【請求項16】

以下：

【化8】

の群から選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法に従って第２の核酸（ＩＣ）を増幅するためのプライマー。

【請求項17】

請求項１６に記載のプライマーからなる、第２の核酸（ＩＣ）を増幅するためのプライマー対。

【請求項18】

請求項１〜１１のいずれかに記載の方法に従ってヒト核酸を定量するためのキットであって、ここで前記キットは、請求項１２〜１７に記載のプライマーもしくはプライマー対を含む少なくとも１つのプライマーもしくはプローブを含む、キット。

【請求項19】

前記キット中の少なくとも１個のプライマーは、配列番号２、３、５、６、８、９、１０、１１および／もしくは１２とは、１８ヌクレオチドの範囲にわたって１以下のヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列を有する、請求項１８に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（発明の分野）
本発明は、分子生物学、診断学の分野、より詳細には、分析科学および法科学の分野にある。本発明はさらに、核酸増幅および定量の分野、より詳細には、ＤＮＡ定量の分野にある。

【0002】

さらに、ＤＮＡ染色における異なる寄与因子の存在の初期の評価は、しばしば、調査の間の非常に重要な情報である。この場合において、ＳＴＲ分析は、上記複数の寄与因子の干渉が原因で、結果として困難になる。

【0003】

混合サンプルの特定の場合は、女性および男性のＤＮＡの混合物を含む性的暴行の染色である。男性：女性ＤＮＡ比の正確な決定は、最適な下流ＳＴＲ分析の選択を補助する。非常に少量の利用可能な犯罪者ＤＮＡの場合、特定のタイプのＳＴＲ分析が行われて、Ｙ染色体上にもっぱら存在する遺伝的エレメントをアドレス決定し（ａｄｄｒｅｓｓ）得、従って、女性が一因となる干渉を排除する。

【背景技術】

【0004】

（背景）
法医学サンプルおよび他のサンプルから回収されたＤＮＡの量の決定は、ＤＮＡタイプ決定プロセス全体において重要な工程であるが、種々の他の科学分野におけるＤＮＡの検出においても同様である。０．５〜２ｎｇの狭い範囲の投入ＤＮＡは、例えば、多重ＤＮＡタイプ決定キットで最適な結果を生じるためにしばしば必要とされる。従って、ＤＮＡの非存在に起因して、陽性結果が陽性結果であり、そして／または陰性結果が陰性結果であることを確実にするために、ＤＮＡの定量は、絶対的に重要である。さらに、法医学的ＤＮＡ試験研究室の標準の質は、ヒト特異的ＤＮＡの定量を要する。これは、ヒトＤＮＡ、ならびに細菌ＤＮＡおよび他の外因性ＤＮＡを回収し得る単離技術に起因する。多くの手順が、ヒト特異的ＤＮＡの定量を可能にするために開発された（スタートブロット技術、液体ベースのハイブリダイゼーションアッセイおよびリアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）が挙げられる）。現在では、リアルタイムＰＣＲは、その広いダイナミックレンジおよび自動化の容易さに起因して、主要な技術である。

【0005】

現代のＳＴＲ−キットは、遙かに高感度になり、少量のＤＮＡを使用してすら、良好な結果を得ることができる。従って、少量の濃縮サンプル中ですらヒトＤＮＡの精密かつ正確な定量を可能にする方法、キットおよび核酸領域が望ましい。特定の定量および検出のキットは既に利用可能であるが、これらは、重大な欠点を有する。１つのこのようなキットは、Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｈｕｍａｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）であり、別のキットは、Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｄｕｏ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）であり、別のキットは、Ｐｌｅｘｏｒ ＨＹ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）である。Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｄｕｏ ＫｉｔおよびＰｌｅｘｏｒ ＨＹ Ｋｉｔはともに、ゲノム上の常染色体および性染色体（Ｙ染色体）標的を標的とする。上記キットの欠点：ＬａＳａｌｌｅら（Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ： Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， “Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉ−ｃｏｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”）によれば、上記Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｋｉｔｓは、定量においてより正確であるが、上記Ｐｌｅｘｏｒ ＨＹより低いダイナミックレンジを有する。上記Ｐｌｅｘｏｒ ＨＹは、マルチコピー標的の定量に起因して、より高いダイナミックレンジを提供するが、精度は低い。この低い精度は、上記マルチコピー標的に帰し得る。ゲノム上の２０コピーの全セット未満が増幅される場合、例えば、上記標的コピー数における不安定性が原因で、常染色体標的と性染色体（Ｙ）標的との間の増幅の比が変動し得る。上記Ｐｌｅｘｏｒ ＨＹキットのダイナミックレンジは、他のキットのものより僅かによい（ＬａＳａｌｌｅら、Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ： Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， “Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉ−ｃｏｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”）。統計的比較において、ＬａＳａｌｌｅらは、上記２種のキットの間で統計的差異を示した。

【0006】

法医学における別の重要なパラメーターは、分析されるべきＤＮＡの分解グレードである。上記Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ ＨｕｍａｎおよびＰｌｅｘｏｒ ＨＹのアンプリコンサイズは、６２塩基対（ｂｐ）から１３３塩基対まで変動し、有意差は、上記キットが分解されたＤＮＡに対して適用される場合に予測され得る。また、インヒビターが考慮されなければならない。ＤＮＡが上記反応に存在するが、阻害物質の存在に起因して結果が得られないことは、よくあり得る。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

（発明の要旨）
本発明は、上記で同定された問題を解決し、以下に概説されるように、以下の解決法を提供する。

【0008】

本発明は、サンプル中のゲノムの１種以上の核酸を定量および／もしくは検出するための方法に関し、ここで増幅反応において、（ａ）第１の核酸が増幅され、増幅される遺伝子座は、上記ゲノム内のマルチコピー遺伝子座（ＭＣＬ）であり、ここで上記遺伝子座は、８０塩基対の範囲にわたって配列番号１に従う配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を共有し、そして上記マルチコピー遺伝子座は、少なくとも２種の異なる染色体上にコピーを有し、（ｂ）内部コントロールとして添加された第２の核酸もまた増幅され、（ｃ）上記第１の核酸の増幅からの増幅産物の量が、決定される。

【0009】

本発明はまた、上記第１の核酸（ＭＣＬ）を増幅するためのプライマーおよびプライマー対に関する。

【0010】

さらに、本発明は、上記第２の核酸（ＩＣ）を増幅するためのプライマーおよびプライマー対に関する。

【0011】

さらに、本発明は、上記第３の核酸（ＭＣＬ−Ｙ）を増幅するためのプライマーおよびプライマー対に関する。

【0012】

これらは、キット中に存在し得る。よって、本発明はまた、ヒト核酸を検出および／もしくは増幅するためのキットに関する。

【0013】

本明細書において、上記第１の核酸は、以下でより詳細に概説され、「ＭＣＬ」としばしばいわれるマルチコピー遺伝子座である。

【0014】

本明細書において、上記第２の核酸は、以下でより詳細に概説され、「ＩＣ」としばしばいわれる内部コントロールである。

【0015】

本明細書において、上記第３の核酸は、以下でより詳細に概説され、「ＭＣＬ−Ｙ」としばしばいわれるＹ染色体上のマルチコピー遺伝子座である。

【0016】

（発明の詳細な説明）
上記で概説されるように、ヒトＤＮＡの定量および検出は困難である。しばしば、増幅に十分な量のＤＮＡが上記サンプル中に実際に存在するとしても、阻害性物質が陰性のＰＣＲ結果をもたらす。

【0017】

本発明は、この問題を解決する。本発明は、サンプル中のゲノムの１種以上の核酸を定量および／もしくは検出するための方法に関し、ここで増幅反応において、（ａ）第１の核酸は増幅され、増幅される遺伝子座は、上記ゲノム内のマルチコピー遺伝子座（ＭＣＬ）であり、ここで上記遺伝子座は、８０塩基対の範囲にわたって配列番号１に従う配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を共有し、上記マルチコピー遺伝子座は、少なくとも２種の異なる染色体上にコピーを有し、（ｂ）内部コントロールとして添加された第２の核酸もまた、増幅され、（ｃ）上記第１の核酸の増幅からの増幅産物の量が決定される。

【0018】

驚異的なことには、本発明者らは、反復エレメントではないマルチコピー遺伝子座が、核酸の検出および／もしくは定量のために使用される場合に、他の遺伝子座より優れていることを見いだした。反復エレメントが、個体間でコピー数において変化し得ることは、周知である。一般に、これら核酸は、任意の起源（原核生物、真核生物など）を有し得る。好ましくは、これらは、哺乳動物、およびより好ましくは、ヒトである。これは、本発明の１つの大きな利点は、法医学の分野におけるその適用であることが理由である。

【0019】

１つのこのような配列は、配列番号１において同定される。本発明者らは、この配列および／もしくはこれと配列類似性を共有する配列が、ヒトゲノムにおいて多くの回数見いだされ得ることを驚異的にも見いだした。

【0020】

上記ゲノム全体を通じて分布する配列は、全て正確に同一であるわけではない。上記選択されたプライマーがまた、ほぼ同一な配列に結合することは重要である。従って、理想的には、上記遺伝子座は、８０塩基対の範囲にわたって配列番号１に従う配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％もしくはさらに９５％もしくは９８％の配列同一性を共有する。

【0021】

２種の配列の間の％同一性の決定は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌの数学的アルゴリズム（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９３） ９０： ５８７３−５８７７）を使用して達成される。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （１９９０） ２１５： ４０３−４１０）のＢＬＡＳＴＮプログラムおよびＢＬＡＳＴＰプログラムの基本原理である。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行われて、配列番号１に相同なヌクレオチド配列を得る。比較目的でギャップを入れたアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９９７） ２５： ３３８９−３４０２）によって記載されるように利用される。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーターが使用される。

【0022】

複数コピーが増幅されることは、本発明の一局面である。理想的には、種々の染色体上の少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個のコピーが増幅される。配列番号１もしくはこれに非常に類似の配列は、ヒトゲノムにおいて２９回存在する。これは、それほど驚くべきことではないが、本発明の方法の能力を提供する。また、上記コピーは、種々の染色体上で見いだされ得る（例えば、１、４、５、７、１１、１６）。

【0023】

本明細書で定義されるような配列番号１様の配列および／もしくは本明細書で定義されるような配列番号１５様の配列が、本発明に従う方法において使用され得ることに注意することは重要である。配列番号１の配列を使用する方法について以下に概説される好ましい実施形態は、全て同様に、配列番号１５の配列に当てはまる。好ましくは、それらは、１つの方法において一緒に使用される。

【0024】

Ｙ染色体上のマルチコピー遺伝子座：
驚異的なことには、本発明者らはまた、Ｙ染色体上のマルチコピー遺伝子座が、核酸の検出および／もしくは増幅に使用される場合に、他の遺伝子座より優れていることを見いだした。なぜなら、反応の感度が増強され得るからである。これは、本発明の１つの大きな利点が、法医学の分野におけるその適用であることが理由である。

【0025】

１つのこのような配列は、配列番号１５において同定される。本発明者らは、驚異的なことには、この配列および／もしくはこれと配列類似性を共有する配列が、Ｙ染色体上に多くの回数見いだされ得ることを見いだした。

【0026】

本発明はまた、サンプル中のゲノムの１種以上の核酸を増幅および／もしくは検出するための方法に関し、ここで増幅反応において、
ａ．第１の核酸は増幅され、増幅される遺伝子座は、上記ゲノム内のＹ染色体上のマルチコピー遺伝子座（ＭＣＬ）であり、ここで上記遺伝子座は、８０塩基対の範囲にわたって配列番号１５に従う配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を共有し、
ｂ．内部コントロール（ＩＣ）として添加された第２の核酸もまた増幅され、
ｃ．上記第１の核酸の増幅からの増幅産物の量が決定される。

【0027】

上記Ｙ染色体全体を通じて分布する配列は、全て正確に同一であるわけではない。上記選択されたプライマーがまた、ほぼ同一な配列に結合することは重要である。従って、理想的には、上記遺伝子座は、８０塩基対の範囲にわたって配列番号１５に従う配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％もしくはさらには９５％もしくは９８％の配列同一性を共有する。

【0028】

性暴力サンプルの法医学的ワークフローは、ＳＴＲ反応を行う前に男性ＤＮＡの定量を示唆する。これは、どの種のＳＴＲキットが遺伝分析のために使用されなければならないかという決定を補助するために、次に、どの程度のＤＮＡがサンプルから得られたか、例えば、犯罪現場から集められたか、そしてこのＤＮＡのうちのどの程度が、ＳＴＲ反応において使用されるべきかを決定するために、最初に行われる。異なるＳＴＲキットが利用可能であり、代表的なＳＴＲキットは、異なる常染色体上の遺伝的長さの多型性を検出するが、いくらかの場合（例えば、性暴力サンプルでの場合）においては、Ｙ染色体上にもっぱらある長さの多型性の分析は、有利であり得る。なぜなら、女性のＤＮＡは、Ｙ染色体を有しないからである。

【0029】

代表的なＳＴＲ反応は、テンプレートＤＮＡの特定の範囲において最適に機能し、全分析は、非常に労働集約的であるので、従って、上記ＳＴＲ分析において非常に高い成功率を確実にする方法論が必要とされる。従って、これは、上記定量キットは、そのユーザーが存在するＤＮＡ量を確実に同定できるのみならず、インヒビター（これは、上記ＳＴＲ反応結果を損ない得、失敗もしくは貴重なサンプル材料の喪失を生じ、重大な阻害が観察される場合にさらに精製され得る）の非存在をも評価できる場合に、真の利点である。

【0030】

理想的には、上記第３の核酸（ＭＣＬ−Ｙ）の増幅産物は、６０塩基対〜２００塩基対の間の長さ、８０〜３００塩基対の間、１００〜２００塩基対の間、もしくは１２０〜１８０塩基対の間である。

【0031】

好ましい実施形態において、上記第３の核酸（ＭＣＬ−Ｙ）は、長さが約１３０塩基対（±２０％）である。

【0032】

本発明の１つの特徴は、ＰＣＲインヒビターの検出のための新規な内部コントロール（ＩＣ）である。上記ＩＣは、１種以上の特定の標的とともに同じ反応バイアル中で並行して同時増幅される。上記ＩＣは、上記反応においてＰＣＲインヒビターを検出するために使用される。よって、上記ＩＣの阻害（リアルタイムＰＣＲにおいて閾値サイクルにおけるシフトによって検出可能）は、上記反応においてＰＣＲインヒビターの特定の量の存在についてのマーカーである。

【0033】

法医学的ワークフローは、上記ＳＴＲ反応を行う前に、上記ＤＮＡの定量を示唆する。これは、どの程度のＤＮＡがサンプルから得られたか、例えば、犯罪現場から集められたか、そしてこのＤＮＡのうちのどの程度が、ＳＴＲ反応において使用されるべきかを決定するために、行われる。上記代表的ＳＴＲ反応は、テンプレートＤＮＡの特定の範囲において最適に機能し、全分析は、非常に労働集約的であり、従って、方法論は、上記ＳＴＲ分析において非常に高い成功率を確実にすることが必要とされる。従って、これは、上記定量キットは、そのユーザーが存在するＤＮＡ量を確実に同定できるのみならず、インヒビター（これは、上記ＳＴＲ反応結果を損ない得、失敗もしくは貴重なサンプル材料の喪失を生じ、重大な阻害が観察される場合にさらに精製され得る）の非存在をも評価できる場合に、真の利点である。

【0034】

本発明において、上記ＩＣが、インヒビターの存在を報告するが、良好な定量結果をなお与え、インヒビターがそれほど重要でないレベルにおいて存在する場合に、全ＤＮＡ濃度範囲にわたって内部コントロールの安定なＣｔ値を提供することによって、最近の法医学ワークフローに適合し、上記ＳＴＲ反応にとって重要なインヒビターの高い相関レベルを有するように、上記ＩＣの性質は驚異的である。市場に最近導入された新世代のＳＴＲキットのうちのいくつかは、先に導入されたキットより増大したインヒビター耐性を示す。これら新たなＳＴＲキットは、ＰＣＲインヒビターに対するより高い耐性を提供するようにさらに開発された。これはまた、その後のＳＴＲ反応の成功にとって重大な阻害のレベルをもっぱら報告するＩＣを提供することによって、ＤＮＡ定量方法論に新たな要件を提供する。

【0035】

本発明のＩＣは、上記サンプル核酸において起こらないコントロールＤＮＡ配列を有し、上記ＩＣをもっぱら特異的に検出するオリゴヌクレオチドプライマーおよび／もしくはプローブの選択を可能にする。

【0036】

好ましい実施形態において、上記ＩＣは、上記コントロールＤＮＡ配列を有する、ＰＣＲ産物もしくはプラスミドである。あるいは、上記ＩＣはまた、合成ロングマー（ｌｏｎｇｍｅｒ）、またはプラスミドもしくはベクターの任意の他の種であり得る。

【0037】

好ましい実施形態において、上記第２の核酸の増幅産物の量もまた、決定される。

【0038】

上記増幅法は、非等温性の方法もしくは等温性の方法のいずれかである。

【0039】

上記非等温性の増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉら（１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０）の群から選択され得る。ポリメラーゼ連鎖反応増幅が好ましい。

【0040】

上記等温性の増幅法は、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）（Ｖｉｎｃｅｎｔら（２００４） ＥＭＢＯ ｒｅｐ ５（８）：７９５−８００）、熱安定性ＨＤＡ（ｔＨＤＡ）（Ａｎら（２００５） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０（３２）：２８９５２−２８９５８）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒら（１９９２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０（７）：１６９１−６）、複数置換増幅（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＭＤＡ）（Ｄｅａｎら（２００２） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９（８）： ５２６１−５２６６）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（Ｌｉｕら（１９９６） Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １１８：１５８７−１５９４）、制限補助ＲＣＡ（Ｗａｎｇら（２００４） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １４：２３５７-２３６６）、単一プライマー等温性増幅（ＳＰＩＡ）（Ｄａｆｆｏｒｎら（２００４） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３７（５）：８５４−７）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）（Ｖｕｏｒｉｎｅｎら（１９９５） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３３： １８５６−１８５９）、ニック形成（ｎｉｃｋｉｎｇ）酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）（Ｍａｐｌｅｓら、ＵＳ２００９０１７４５３）、指数関数的増幅反応（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＥＸＰＡＲ）（Ｖａｎ Ｎｅｓｓら（２００３） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００（８）：４５０４−４５０９）、ループ媒介性等温性増幅（ＬＡＭＰ）（Ｎｏｔｏｍｉら（２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８（１２）：ｅ６３）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）（Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇら（２００６） ＰｌｏＳ Ｂｉｏｌ ４（７）：１１１５−１１２０）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）（Ｋｉｅｖｉｔｓら（１９９１） Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５：２７３−２８６）、スマート増幅プロセス（ＳＭＡＰ）（Ｍｉｔａｎｉら（２００７） Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４（３）：２５７−６２）の群から選択され得る。

【0041】

本発明の状況において「等温性増幅反応」とは、温度が上記反応の間に大きく変化しないことを意味する。好ましい実施形態において、上記等温性増幅反応の温度は、増幅が起こる主要な酵素反応工程の間に、１０℃を超えて、好ましくは、５℃を超えて、さらにより好ましくは、２℃を超えて外れない。

【0042】

核酸の等温性増幅の方法に依存して、異なる酵素が、上記増幅反応に必要とされる。核酸増幅のための公知の等温性の方法は、上述のものであり、ここで等温性条件下で核酸を増幅するための少なくとも１種の中温性酵素は、ヘリカーゼ、中温性ポリメラーゼ、鎖置換活性を有する中温性ポリメラーゼ、ニック形成酵素、組換えタンパク質、リガーゼ、グリコシラーゼおよび／もしくはヌクレアーゼからなる群より選択される。

【0043】

「ヘリカーゼ」は、当業者に公知である。それらは、ＮＴＰもしくはｄＮＴＰの加水分解から得られるエネルギーを使用して、２本のアニールされた核酸鎖（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド）を分離する核酸ホスホジエステル骨格に沿った方向に動くタンパク質である。規定されたヘリカーゼモチーフの存在に基づいて、ヘリカーゼ活性を所定のタンパク質に帰することは可能である。当業者は、本発明に従う方法における使用のためにヘリカーゼ活性を有する適したタンパク質を選択し得る。好ましい実施形態において、上記ヘリカーゼは、異なるファミリーのヘリカーゼを含む群から選択される：スーパーファミリーＩヘリカーゼ（例えば、ｄｄａ、ｐｃｒＡ、Ｆ−プラスミドｔｒａＩタンパク質ヘリカーゼ、ｕｖｒＤ）、スーパーファミリーＩＩヘリカーゼ（例えば、ｒｅｃＱ、ＮＳ３−ヘリカーゼ）、スーパーファミリーＩＩＩヘリカーゼ（例えば、ＡＡＶ ｒｅｐヘリカーゼ）、ＤｎａＢ様スーパーファミリーのヘリカーゼ（例えば、Ｔ７ファージヘリカーゼ）もしくはＲｈｏ様スーパーファミリーのヘリカーゼ。

【0044】

上記増幅法は、緩衝液、ｄＮＴＰもしくはＮＴＰ、加えて、必要とされる酵素を含む。

【0045】

本明細書で使用される場合、用語「ｄＮＴＰ」とは、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートに言及する。このようなｄＮＴＰの非限定的例は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰであり、これらはまた、標識された誘導体の形態において存在し得、例えば、蛍光標識、放射性標識、ビオチン標識を含む。改変ヌクレオチド塩基を有するｄＮＴＰがまた、包含され、ここで上記ヌクレオチド塩基は、例えば、ヒポキサンチン、キサンチン、７−メチルグアニン、イノシン、キサントシン（ｘａｎｔｈｉｎｏｓｉｎｅ）、７−メチルグアノシン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、５−メチルシチジンである。さらに、上記の分子のｄｄＮＴＰは、本発明に包含される。

【0046】

本明細書で使用される場合、用語「ＮＴＰ」とは、リボヌクレオシドトリホスフェートに言及する。このようなＮＴＰの非限定的例は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴＰであり、これらはまた、標識された誘導体の形態において存在し得、例えば、蛍光標識、放射性標識、ビオチン標識を含む。

【0047】

好ましい実施形態において、上記増幅の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応もしくはリアルタイムＰＣＲ反応であり、決定される核酸の量は、上記増幅の過程の間に、もしくは上記増幅反応の最後に終点測定としてのいずれかで決定される。

【0048】

オリゴヌクレオチドプライマーは、任意の適切な方法（例えば、ホスホトリエステルおよびホスホジエステル法もしくはその自動化実施形態）を使用して調製され得る。１つのこのような自動化実施形態において、ジエチルホスホルアミダイトは、出発物質として使用され、Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９−１８６２によって記載されるように合成され得る。改変固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成するための１つの方法は、米国特許第４，４５８，００６号に記載される。生物学的供給源から単離されたプライマー（例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化物）を使用することも可能である。好ましいプライマーは、約６〜１００塩基、より好ましくは、約２０〜５０塩基、最も好ましくは、約２０〜４０塩基の長さを有する。

【0049】

リアルタイムＰＣＲを使用するＤＮＡ定量
ＰＣＲの間に、ＤＮＡの量は、サイクルごとに理論的には倍加する。各サイクルの後に、ＤＮＡの量は、以前の状態の２倍になる。

【0050】

未知のサンプル中のＤＮＡの絶対量は、好ましくは、上記ＩＣを使用して決定される。

【0051】

リアルタイムＰＣＲ技術を使用して、蛍光は、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラーにおいて検出および測定され、上記生成物の指数関数的増加に対応するその幾何的増加は、各反応において閾値サイクル（ＣＴ）を決定するために使用される。

【0052】

標準曲線（標準物質の量の対数に対するＣＴ値／交点（ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）のプロット）は、標準物質の異なる希釈物を使用して生成される。未知のサンプルのＣＴ値は、上記標準曲線と比較され、上記標的の最初の量の計算を可能にする。定量されるべき核酸のタイプに対して適切な標準物質を選択することは、重要である。標準曲線を作成するために、少なくとも５種の異なる量の標準物質が定量されるべきであり、未知の標的の量は、上記標準曲線の範囲内に入るべきである。よって、一実施形態においてもまた、上記の定量工程が行われる。

【0053】

理想的には、上記第１の核酸（ＭＣＬ）の増幅産物は、６０塩基対〜２００塩基対の間の長さ、８０〜３００塩基対の間、１００〜２００塩基対の間もしくは１２０〜１８０塩基対の間の長さである。

【0054】

さらに、理想的には、上記第２の核酸（ＩＣ）の増幅産物は、６０〜４００塩基対の間、１００〜４００塩基対の間、８０〜３００塩基対の間もしくは１５０〜２５０塩基対の間である。

【0055】

驚異的なことには、上記第２の核酸（ＩＣ）の増幅が上記第１の核酸（ＭＣＬ）の増幅産物より長い場合、よりよい結果が達成され得ることが判明した。

【0056】

好ましい実施形態において、上記第１の核酸（ＭＣＬ）は、約１４０塩基対の長さ（±２０％）であり、上記第２の核酸（ＩＣ）は、約２００塩基対の長さ（±２０％）である。

【0057】

好ましい実施形態において、上記第３の核酸（ＭＣＬ−Ｙ）は、約１３０塩基対の長さ（±２０％）である。

【0058】

理想的には、上記増幅反応は、（ｉ）８〜８．８の間のｐＨのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２０℃において）、および／もしくは（ｉｉ）塩化カリウムおよび硫酸カリウムの群から選択されるカリウム塩、および／もしくは（ｉｉｉ）アンモニウム塩（好ましくは、塩化アンモニウムもしくは硫酸アンモニウム）、および／もしくは（ｖｉ）塩化マグネシウム、および／もしくは（ｖ）ホットスタートポリメラーゼ、を含む。

【0059】

好ましくは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの濃度は、１０〜１００ｍＭの範囲、最も好ましくは、２０〜７０ｍＭの範囲にあり、Ｋ^＋の濃度は、１〜２５ｍＭの範囲、最も好ましくは、２，５〜２０ｍＭの範囲にあり、ＮＨ_４^＋の濃度は、１〜４０ｍＭの範囲、最も好ましくは、２，５〜３０ｍＭの範囲にあり、Ｍｇ^２＋の濃度は、４種のｄＮＴＰの濃度に対して０，５ｍＭ〜８ｍＭ過剰であり、最も好ましくは、Ｍｇ^２＋の濃度は、４種のｄＮＴＰの濃度に対して０，７ｍＭ〜５ｍＭ過剰であり、ホットスタートポリメラーゼ、優先的には、ホットスタートポリメラーゼは、５分間未満のホットスタート時間、最も好ましくは２分間未満のホットスタート時間を可能にする。

【0060】

第２の核酸の量が正しく選択されることは、重要である。このＩＣは、反応系中にＤＮＡがあるか否か、もしくはインヒビターが反応系中に存在するという事実に起因して、おそらく反応産物が得られないかどうかを決定し得る。反応は、代表的には、５〜１００μｌの間の容積を有し、より好ましくは、７μｌ〜７５μｌの範囲にあり、最も好ましくは、１０μｌ〜５０μｌの範囲にあり、理想的には、１５μｌ〜２５μｌの範囲にある。

【0061】

本発明者らは、上記第２の核酸（ＩＣ）の１００〜５０００コピーの間が理想的であることを見いだした。好ましくは、２００〜２０００コピーの間が存在し、より好ましくは、５００〜１５００コピーの間、より好ましくは、１０００コピー（±２０％）が存在する。μｇ／μｌ単位の量は、核酸のサイズ／長さに依存する。好ましくは、上記核酸は、ＰＣＲ産物もしくはプラスミドＤＮＡである。

【0062】

本発明はまた、以下の群から選択される、上記第１の核酸（ＭＣＬ）を増幅するためのプライマーに関する：

【0063】

【化1】

本発明はさらに、以下のとおりのプライマーからなる、上記第１の核酸（ＭＣＬ）を増幅するためのプライマー対に関する：

【0064】

【化2】

本発明はさらに、以下の群から選択される、上記第２の核酸（ＩＣ）を増幅するためのプライマーに関する：

【0065】

【化3】

本発明はまた、以下からなる、上記第２の核酸（ＩＣ）を増幅するためのプライマー対に関する：

【0066】

【化4】

本発明はまた、以下の群から選択される、上記第３の核酸（ＭＣＬ−Ｙ）を増幅するためのプライマーに関する：

【0067】

【化5】

注記、本明細書において、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーが示される全ての場合（Ｓｃｏｒｐ）において、上記のように配列番号３８について、上記プライマーのプライミング部分（ｐｒｉｍｉｎｇ ｐａｒｔ）は、３’−プライム部分であり、本発明は、このような場合において、好ましくは、この部分に関し、プローブ部分（ａｇｔｇｇｇａｇａｇｃｔｇｇｇａａ−３’）に関しない。

【0068】

さらに、本発明は、ヒト核酸を検出および／もしくは定量するためのキットに関し、ここで上記キットは、ストリンジェントな条件下で、８０塩基対の範囲にわたって配列番号１に従う配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列を結合する１種以上のプライマー、上記第２の核酸（ＩＣ）をストリンジェントに結合する少なくとも１種のプライマーもしくはプローブを含むか、または上記に概説されたものに従うプライマーもしくはプライマー対を含む。

【0069】

理想的には、上記キットは、配列番号２、３、５、６、８、９、１０、１１および／もしくは１２、ならびに／または配列番号３７および／もしくは３８とは、１８ヌクレオチドの範囲にわたって５個以下のヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列を有する、少なくとも１種のプライマーを有する。理想的には、上記キットは、配列番号２、３、５、６、８、９、１０、１１および／もしくは１２、ならびに／または配列番号３７および／もしくは３８とは、１８ヌクレオチドの範囲にわたって５個以下のヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列を有する。
本願は特定の実施形態において例えば以下の項目を提供する：
（項目１）
サンプル中のゲノムの１種以上の核酸を定量および／もしくは検出するための方法であって、ここで増幅反応において、
ａ．第１の核酸は増幅され、増幅される遺伝子座は、前記ゲノム内のマルチコピー遺伝子座（ＭＣＬ）であり、ここで前記遺伝子座は、８０塩基対の範囲にわたって配列番号１に従う配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を共有し、前記マルチコピー遺伝子座は、少なくとも２種の異なる染色体上にコピーを有し、
ｂ．内部コントロール（ＩＣ）として添加された第２の核酸もまた、増幅され、
ｃ．前記第１の核酸の増幅からの増幅産物の量が決定される、
方法。
（項目２）
第３の核酸がさらに増幅され、前記遺伝子座は、ヒトＹ染色体上のマルチコピー遺伝子座（ＭＣＬ−Ｙ）であり、ここで前記遺伝子座は、８０塩基対の範囲にわたって配列番号１５に従う配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を共有し、
ａ．内部コントロールとして添加された前記第３の核酸は、増幅され、
ｂ．前記第１の核酸および前記第３の核酸の増幅からの増幅産物の量が、決定される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第２の核酸の増幅産物の量もまた決定される、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記増幅の方法が、ポリメラーゼ連鎖反応もしくはリアルタイムＰＣＲ反応であり、決定される核酸の量は、前記増幅の過程の間に、もしくは前記増幅反応の最後に終点測定としてのいずれかで決定される、項目１〜３に記載の方法。
（項目５）
前記第１の核酸（ＭＣＬ）および／もしくは前記第３の核酸（ＭＣＬ−Ｙ）の増幅産物は、６０塩基対〜２００塩基対の間の長さである、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記第２の核酸（ＩＣ）の増幅産物は、６０〜４００塩基対の間である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記第２の核酸（ＩＣ）の増幅産物は、１００〜４００塩基対の間である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記第２の核酸（ＩＣ）の増幅は、前記第１の核酸（ＭＣＬ）の増幅産物より長い、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記増幅反応が、以下：
ａ．８〜８．８の間のｐＨのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ならびに／または
ｂ．塩化カリウムおよび硫酸カリウムの群から選択されるカリウム塩、ならびに／または
ｃ．アンモニウム塩、好ましくは、塩化アンモニウムもしくは硫酸アンモニウム、ならびに／または
ｄ．塩化マグネシウム、ならびに／または
ｅ．ホットスタートポリメラーゼ
を含む、項目１〜７に記載の方法。
（項目１０）
前記増幅反応は、前記第２の核酸（ＩＣ）の１００〜５０００の間のコピーを含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
以下：

【化6】

の群より選択される、第１の核酸（ＭＣＬ）を増幅するためのプライマー。
（項目１２）
以下：

【化7】

の群より選択される、第３の核酸（Ｙ−ＭＣＬ）を増幅するためのプライマー。
（項目１３）
項目１１に記載のプライマーからなる、第１の核酸（ＭＣＬ）を増幅するためのプライマー対。
（項目１４）
項目１２に記載のプライマーからなる、第３の核酸（Ｙ−ＭＣＬ）を増幅するためのプライマー対。
（項目１５）
以下：

【化8】

の群から選択される、第２の核酸（ＩＣ）を増幅するためのプライマー。
（項目１６）
項目１５に記載のプライマーからなる、第２の核酸（ＩＣ）を増幅するためのプライマー対。
（項目１７）
ヒト核酸を検出および／もしくは定量するためのキットであって、ここで前記キットは、ストリンジェントな条件下で、８０塩基対の範囲にわたって配列番号１に従う配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列に結合する１個以上のプライマー、第２の核酸（ＩＣ）にストリンジェントに結合するか、または項目１１〜１６に記載のプライマーもしくはプライマー対を含む少なくとも１つのプライマーもしくはプローブ、ならびに必要に応じてさらに、配列番号１５（ＭＣＬ−Ｙ）に従う配列にストリンジェントに結合するプライマー、プライマー対および／もしくはプローブを含む、キット。
（項目１８）
前記キット中の少なくとも１個のプライマーは、配列番号２、３、５、６、８、９、１０、１１および／もしくは１２とは、１８ヌクレオチドの範囲にわたって５以下のヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列を有する、項目１７に記載のキット。
（項目１９）
サンプル中のゲノムの１種以上の核酸を定量および／もしくは検出するための方法であって、ここで増幅反応において、
ａ．第１の核酸は増幅され、増幅される遺伝子座は、前記ゲノム内のＹ染色体（ＭＣＬ）上にマルチコピー遺伝子座であり、ここで前記遺伝子座は、８０塩基対の範囲にわたって配列番号１５に従う配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を共有し、
ｂ．内部コントロール（ＩＣ）として添加された第２の核酸もまた、増幅され、
ｃ．前記第１の核酸の増幅からの増幅産物の量が決定される、
方法。

【図面の簡単な説明】

【0070】

【図1】図１は、最小限にした反応時間によって本発明の利点を示す。「Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘ」は、本発明の範囲にある方法の特別な実施形態を表す。第１のカラム（左から）は、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ＱリアルタイムＰＣＲ機器（Ｑｉａｇｅｎ）での「Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘ」法の実行時間を示す。カラム２は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製の７５００ Ｆａｓｔ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍでの「Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘ」法の実行時間を示す。比較のために、カラム３は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製の７５００ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍで実行した、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｈｕｍａｎ Ｋｉｔについての実行時間を示し、カラム４は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製の７５００ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍで実行した、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｄｕｏ Ｋｉｔについての実行時間を示し、カラム５は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製の７５００ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍで実行した、Ｐｒｏｍｅｇａ製のＰｌｅｘｏｒ ＨＹ Ｋｉｔについての実行時間を示す。

【図2】図２は、理論的濃度に関連して、異なる定量法の精度の比較を示す。「Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ」は、本発明の範囲にある方法の特別な実施形態を表す。市販の定量キットを設定し、適切なハンドブックに記載されるように分析した。既知の濃度のヒト参照ＤＮＡ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡから得た）の連続希釈物を、上記３種のキットのうちの全てに関してテンプレートとして使用した。上記「Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ」法は、それらの正確な濃度において、最大誤差２０％で使用されたテンプレートの全量を定量するために高い精度を提供し、特に、濃度６，２５ｐｇ／μｌ以下は、上記Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｈｕｍａｎ法（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｈｕｍａｎ Ｋｉｔに基づき、これは、単一コピーの標的を使用する）、および上記Ｐｌｅｘｏｒ ＨＹ法（Ｐｒｏｍｅｇａ製のＰｌｅｘｏｒ ＨＹ Ｋｉｔに基づき、これは、数コピーにおいて存在する標的を使用する）、説明において与えられた参照と比較して、遙かにより適切に定量した。Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｈｕｍａｎ法（単一コピー標的を使用する、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｈｕｍａｎ Ｋｉｔに基づく）は、大きな変動を示すか、または１２，５ｐｇ／μｌ ヒトＤＮＡ以下において定量結果を作成すらできなかった。上記Ｐｌｅｘｏｒ ＨＹは、理論的定量結果から大きな偏差を示す。上記ヒト参照ＤＮＡの所定の希釈物の２μｌを、各反応において使用した。濃度とは、上記テンプレート溶液中の濃度に言及する。ＮＴＣ：テンプレートなしコントロール。

【図3】図３は、異なる人種グループのドナーに由来するゲノムＤＮＡサンプル中の、配列番号１１および配列番号１２によって検出されるヒトマーカーのコピー数にバリエーションがないことを示す。定量的リアルタイムＰＣＲを、ヒトの特異的単一コピー標的と上記Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘマルチコピー標的とを比較するために使用して実行した。上記２種の標的の間のΔＣＴは、異なる集団について示される。ΔＣＴは全ての集団において一定であることが認識できるようになり、これは、領域の一定のコピー数が配列番号１１および配列番号１２によって検出されることを示す。

【図4】図４は、上記定量反応後のＳＴＲ分析という手段によって、高感度かつ正確な定量（図２に示される）の重要性を示す。図４において、図２のヒトＤＮＡの連続希釈物を使用して、上記Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ＥＳＳｐｌｅｘ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコルの後に、示されるＳＴＲプロフィールを生成した。図２において使用される最も低い濃度からでも完全なＳＴＲプロフィールを得るという可能性を実証し、低いテンプレート量すら非常に正確な定量の有用性を示す。

【図5-1】図５は、ヘマチンによる上記ＡｍｐＦｌＳＴＲ Ｉｄｅｎｔｉｌｅｒ反応の阻害に対する文献のデータセットを示し、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ（以下に示される出典から得た-Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｈｕｍａｎ ｐａｇｅ １３７）を使用して、上記ＤＮＡフィンガープリント反応は、最大２０μＭまでのヘマチン濃度ですら機能する。出典： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｃｍｓ／ｇｒｏｕｐｓ／ａｐｐｌｉｅｄ＿ｍａｒｋｅｔｓ＿ｓｕｐｐｏｒｔ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｇｅｎｅｒａｌｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｃｍｓ＿０４１３９５．ｐｄｆ 。

【図5-2】図５は、ヘマチンによる上記ＡｍｐＦｌＳＴＲ Ｉｄｅｎｔｉｌｅｒ反応の阻害に対する文献のデータセットを示し、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ（以下に示される出典から得た-Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｈｕｍａｎ ｐａｇｅ １３７）を使用して、上記ＤＮＡフィンガープリント反応は、最大２０μＭまでのヘマチン濃度ですら機能する。出典： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｃｍｓ／ｇｒｏｕｐｓ／ａｐｐｌｉｅｄ＿ｍａｒｋｅｔｓ＿ｓｕｐｐｏｒｔ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｇｅｎｅｒａｌｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｃｍｓ＿０４１３９５．ｐｄｆ 。

【図6-1】図６は、上記ＡｍｐＦｌＳＴＲ ＮＧＭ Ｋｉｔの阻害に対する文献のデータセットを示す。これは、いわゆる「次世代ＳＴＲキット」であり、インヒビターの存在に対して遙かにより耐性である（例においては、最大７５μＭ ヘマチン未満）。出典：ｈｔｔｐ：／／ｍａｒｋｅｔｉｎｇ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｉｍａｇｅｓ／Ａｌｌ＿Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒｓ／Ｆｏｒｅｎｓｉｃ＿０７１０／ｐｄｆｓ／Ｃｕｓｔｏｍｅｒ−Ｃｏｒｎｅｒ／ｎｅｘｔＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ｐｄｆ 。

【図6-2】図６は、上記ＡｍｐＦｌＳＴＲ ＮＧＭ Ｋｉｔの阻害に対する文献のデータセットを示す。これは、いわゆる「次世代ＳＴＲキット」であり、インヒビターの存在に対して遙かにより耐性である（例においては、最大７５μＭ ヘマチン未満）。出典：ｈｔｔｐ：／／ｍａｒｋｅｔｉｎｇ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｉｍａｇｅｓ／Ａｌｌ＿Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒｓ／Ｆｏｒｅｎｓｉｃ＿０７１０／ｐｄｆｓ／Ｃｕｓｔｏｍｅｒ−Ｃｏｒｎｅｒ／ｎｅｘｔＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ｐｄｆ 。

【図6-3】図６は、上記ＡｍｐＦｌＳＴＲ ＮＧＭ Ｋｉｔの阻害に対する文献のデータセットを示す。これは、いわゆる「次世代ＳＴＲキット」であり、インヒビターの存在に対して遙かにより耐性である（例においては、最大７５μＭ ヘマチン未満）。出典：ｈｔｔｐ：／／ｍａｒｋｅｔｉｎｇ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｉｍａｇｅｓ／Ａｌｌ＿Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒｓ／Ｆｏｒｅｎｓｉｃ＿０７１０／ｐｄｆｓ／Ｃｕｓｔｏｍｅｒ−Ｃｏｒｎｅｒ／ｎｅｘｔＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ｐｄｆ 。

【図6-4】図６は、上記ＡｍｐＦｌＳＴＲ ＮＧＭ Ｋｉｔの阻害に対する文献のデータセットを示す。これは、いわゆる「次世代ＳＴＲキット」であり、インヒビターの存在に対して遙かにより耐性である（例においては、最大７５μＭ ヘマチン未満）。出典：ｈｔｔｐ：／／ｍａｒｋｅｔｉｎｇ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｉｍａｇｅｓ／Ａｌｌ＿Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒｓ／Ｆｏｒｅｎｓｉｃ＿０７１０／ｐｄｆｓ／Ｃｕｓｔｏｍｅｒ−Ｃｏｒｎｅｒ／ｎｅｘｔＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ｐｄｆ 。

【図7-1】図７は、定量反応におけるインヒビター感度の例を示す。データは、市販のキットＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ ＨｕｍａｎおよびＹの開発検証レポートからとっている。データは、以下においてキット供給業者の検証レポート中で入手可能である：Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｈｕｍａｎｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｃｍｓ／ｇｒｏｕｐｓ／ａｐｐｌｉｅｄ＿ｍａｒｋｅｔｓ＿ｓｕｐｐｏｒｔ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｇｅｎｅｒａｌｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｃｍｓ＿０４１３９５．ｐｄｆＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｄｕｏｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ．ｂｒ／ｓｉｔｅ／ｍａｔｅｒｉａｌ／５ｑ７ａｑｑｂｍ．ｐｄｆ法医学的ワークフローから、上記ＳＴＲ反応が行われる前に、上記ＤＮＡの定量が示唆される。これは、どの程度のＤＮＡが、サンプルから得られたか（例えば、犯罪現場から集められたか）、およびこのＤＮＡのうちのどの程度がＳＴＲ反応において使用されるべきかを決定するために行われる。上記代表的なＳＴＲ反応は、テンプレートＤＮＡの特定の範囲において最適に機能し、全体の分析は、非常に労働集約的であるので、上記ＳＴＲ分析において非常に高い成功率を確実にする方法論が必要である。従って、上記定量キットが、ユーザーが存在するＤＮＡの量を確実に同定するだけでなく、インヒビター（上記ＳＴＲ反応結果を損ない得、失敗もしくは貴重なサンプル材料の喪失を生じさせ得、重大な阻害が観察される場合にさらに精製され得る）の非存在を評価することをも可能にするのであれば、真に有利である。上記データは、合わされたＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ ＨｕｍａｎキットおよびＹキットのみが、上記ヒト標的と比較して、上記内部コントロール標的の僅かにより低い安定性を示すことを示す。この場合、上記ＩＣのＣｔ値は、インヒビターが上記ＤＮＡサンプル中に含まれる場合に、より高い値へとシフトする一方で、上記Ｈｕｍａｎキットおよび上記ＹキットのＣｔ値は、少なくともヘマチンのより少ない量に関して安定なままである。上記Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ ｈｕｍａｎキットおよびＹキットの場合、インヒビター（例えば、ヘマチン）への耐性が、極めて小さい（反応系において１６μＭ〜２０μＭ ヘマチンの間）。よって、ＳＴＲキットの次世代に必要とされる場合、より多量のインヒビター耐性と適合性である方法論は、失われつつある。

【図7-2】図７は、定量反応におけるインヒビター感度の例を示す。データは、市販のキットＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ ＨｕｍａｎおよびＹの開発検証レポートからとっている。データは、以下においてキット供給業者の検証レポート中で入手可能である：Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｈｕｍａｎｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｃｍｓ／ｇｒｏｕｐｓ／ａｐｐｌｉｅｄ＿ｍａｒｋｅｔｓ＿ｓｕｐｐｏｒｔ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｇｅｎｅｒａｌｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｃｍｓ＿０４１３９５．ｐｄｆＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｄｕｏｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ．ｂｒ／ｓｉｔｅ／ｍａｔｅｒｉａｌ／５ｑ７ａｑｑｂｍ．ｐｄｆ法医学的ワークフローから、上記ＳＴＲ反応が行われる前に、上記ＤＮＡの定量が示唆される。これは、どの程度のＤＮＡが、サンプルから得られたか（例えば、犯罪現場から集められたか）、およびこのＤＮＡのうちのどの程度がＳＴＲ反応において使用されるべきかを決定するために行われる。上記代表的なＳＴＲ反応は、テンプレートＤＮＡの特定の範囲において最適に機能し、全体の分析は、非常に労働集約的であるので、上記ＳＴＲ分析において非常に高い成功率を確実にする方法論が必要である。従って、上記定量キットが、ユーザーが存在するＤＮＡの量を確実に同定するだけでなく、インヒビター（上記ＳＴＲ反応結果を損ない得、失敗もしくは貴重なサンプル材料の喪失を生じさせ得、重大な阻害が観察される場合にさらに精製され得る）の非存在を評価することをも可能にするのであれば、真に有利である。上記データは、合わされたＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ ＨｕｍａｎキットおよびＹキットのみが、上記ヒト標的と比較して、上記内部コントロール標的の僅かにより低い安定性を示すことを示す。この場合、上記ＩＣのＣｔ値は、インヒビターが上記ＤＮＡサンプル中に含まれる場合に、より高い値へとシフトする一方で、上記Ｈｕｍａｎキットおよび上記ＹキットのＣｔ値は、少なくともヘマチンのより少ない量に関して安定なままである。上記Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ ｈｕｍａｎキットおよびＹキットの場合、インヒビター（例えば、ヘマチン）への耐性が、極めて小さい（反応系において１６μＭ〜２０μＭ ヘマチンの間）。よって、ＳＴＲキットの次世代に必要とされる場合、より多量のインヒビター耐性と適合性である方法論は、失われつつある。

【図8】図８は、定量反応におけるインヒビター感度の例を示す。データは、市販のキットであるＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｄｕｏの開発検証レポートからとっている。データは、以下においてキット供給業者の検証レポートにおいて入手可能である：Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｄｕｏｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ．ｂｒ／ｓｉｔｅ／ｍａｔｅｒｉａｌ／５ｑ７ａｑｑｂｍ．ｐｄｆ 上記Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｄｕｏ Ｋｉｔにおける内部コントロールシステムは、インヒビターの存在下でのヒト特異的標的よりも安定である。この場合における上記内部コントロールシステムの有用性は、当然のことながら、上記内部コントロールシステムが、上記サンプル中のインヒビターの存在のいかなる指標も与えないと同時に、上記ＤＮＡ定量が、既に損なわれていることから低い。実際に、上記ＲＰＰＨ１および上記ＳＲＹシステムのＣｔ値は、少量のインヒビターにおいてすらより高い値にシフトする。１２，５μＭ ヘマチンの存在下で、上記ＲＰＰＨ１システムのＣｔ値が＞４０へと劇的に増大することは、上記ヒトＤＮＡの定量を不可能にする。上記サンプル中のインヒビターの存在に対する耐性は、次世代ＳＴＲ−キットと比較して非常に低い（すなわち、１０μＭ ヘマチンおよび３，７５ｎｇ／μｌ フミン酸）。

【図9-1】図９は、定量反応におけるインヒビター感度の例を示す。データは、市販のキットＰｌｅｘｏｒ ＨＹの開発検証レポートからとっている。データは、以下においてキット供給業者の検証レポートにおいて入手可能である：Ｐｌｅｘｏｒ ＨＹｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｐｌｅｘｏｒｈｙ／ａｎ１５７．ｐｄｆ上記Ｐｌｅｘｏｒ ＨＹ Ｋｉｔは、常染色体標的（上側パネル）および上記内部コントロール（ＩＰＣ）（下側パネルにおいて示される）に関して、上記Ｃｔ値の、より高い値への匹敵するシフトによって認識できるように、上記ヒト標的と比較して、上記内部コントロール標的のほとんど同じ安定性を示す。この場合、上記ＩＣのＣｔ値は、インヒビターが上記ＤＮＡサンプル中に含まれる場合に、より高い値へとシフトする。上記ヒト特異的標的のＣｔ値すら上記インヒビターが上記サンプル中に含まれる場合により高いレベルへとシフトするので、上記ＤＮＡ定量を損なう。上記Ｐｌｅｘｏｒ ＨＹの場合において、インヒビター（例えば、ヘマチン）への耐性は、極めて小さい（上記反応系において約２５μＭ ヘマチン）。

【図9-2】図９は、定量反応におけるインヒビター感度の例を示す。データは、市販のキットＰｌｅｘｏｒ ＨＹの開発検証レポートからとっている。データは、以下においてキット供給業者の検証レポートにおいて入手可能である：Ｐｌｅｘｏｒ ＨＹｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｐｌｅｘｏｒｈｙ／ａｎ１５７．ｐｄｆ上記Ｐｌｅｘｏｒ ＨＹ Ｋｉｔは、常染色体標的（上側パネル）および上記内部コントロール（ＩＰＣ）（下側パネルにおいて示される）に関して、上記Ｃｔ値の、より高い値への匹敵するシフトによって認識できるように、上記ヒト標的と比較して、上記内部コントロール標的のほとんど同じ安定性を示す。この場合、上記ＩＣのＣｔ値は、インヒビターが上記ＤＮＡサンプル中に含まれる場合に、より高い値へとシフトする。上記ヒト特異的標的のＣｔ値すら上記インヒビターが上記サンプル中に含まれる場合により高いレベルへとシフトするので、上記ＤＮＡ定量を損なう。上記Ｐｌｅｘｏｒ ＨＹの場合において、インヒビター（例えば、ヘマチン）への耐性は、極めて小さい（上記反応系において約２５μＭ ヘマチン）。

【図10】図１０は、ＰＣＲインヒビターであるフミン酸およびヘマチンの所定の濃度の存在下で、本発明の範囲における反応の結果を示す。本発明の使用を介して、より高い濃度のインヒビターに対する上記内部コントロールの高い安定性および上記ヒト特異的標的のより高い安定性が、達成できた。このことは、上記内部コントロールが完全に阻害されたとしても、正確な定量を与える。上記ヒト特異的標的の阻害は、８０〜１００μＭの間の濃度のヘマチンにおいて始まり、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＡｍｐＦｌＳＴＲ ＮＧＭもしくはＱｉａｇｅｎのＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ＥＳＳｐｌｅｘのような次世代ＳＴＲキットのインヒビター耐性と完全に適合する。

【図11-1】図１１は、配列表を示す。

【図11-2】図１１は、配列表を示す。

【図12-1】図１２は、理論的濃度に関連して異なる定量法の精度の比較を示す。「Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ＨＹｒｅｓ」は、本発明の範囲にある方法の特別な実施形態を表す。市販の定量キットを、適切なハンドブックに記載されるように設定および分析した。ヒトＤＮＡ（ＱＩＡａｍｐ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｋｉｔを使用して匿名のドナーに由来するヒト血液から単離）の連続希釈物および既知の濃度のその混合物を、上記３種のキットのうちの全てのテンプレートとして使用した。上記「Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ＨＹｒｅｓ」法は、それらの正しい濃度において使用されるテンプレートの全ての量を定量するために、高い精度を提供し、特に、６，２５ｐｇ／μｌ以下の濃度は、上記Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ ＤＵＯ法（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ ＤＵＯキットに基づき、これは、単一コピー標的を使用する）および上記Ｐｌｅｘｏｒ ＨＹ法（ＰｒｏｍｅｇａのＰｌｅｘｏｒ ＨＹキットに基づき、数コピーにおいて存在する標的（説明において与えられる参照）を使用する）と比較して、はるかにより正確に定量された。Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ ＤＵＯ法（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ ＤＵＯキットに基づき、単一コピー標的を使用する）は、高い変動性を示したか、または１，５ｐｇ／μｌ以下のヒトＤＮＡでは定量結果を生成すらできず、女性ＤＮＡバックグラウンドの存在下で１，５ｐｇ／μｌ未満の男性ＤＮＡ濃度を定量できなかった。上記Ｐｌｅｘｏｒ ＨＹは、バックグラウンド女性ＤＮＡの存在下もしくは非存在下で、３ｐｇ／μｌ未満の男性ＤＮＡ画分を定量できなかった。上記ヒト参照ＤＮＡの２μｌの所定の希釈物を、各反応において使用した。濃度は、上記テンプレート溶液中の濃度を参照する。

【図12-2】図１２は、理論的濃度に関連して異なる定量法の精度の比較を示す。「Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ＨＹｒｅｓ」は、本発明の範囲にある方法の特別な実施形態を表す。市販の定量キットを、適切なハンドブックに記載されるように設定および分析した。ヒトＤＮＡ（ＱＩＡａｍｐ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｋｉｔを使用して匿名のドナーに由来するヒト血液から単離）の連続希釈物および既知の濃度のその混合物を、上記３種のキットのうちの全てのテンプレートとして使用した。上記「Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ＨＹｒｅｓ」法は、それらの正しい濃度において使用されるテンプレートの全ての量を定量するために、高い精度を提供し、特に、６，２５ｐｇ／μｌ以下の濃度は、上記Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ ＤＵＯ法（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ ＤＵＯキットに基づき、これは、単一コピー標的を使用する）および上記Ｐｌｅｘｏｒ ＨＹ法（ＰｒｏｍｅｇａのＰｌｅｘｏｒ ＨＹキットに基づき、数コピーにおいて存在する標的（説明において与えられる参照）を使用する）と比較して、はるかにより正確に定量された。Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ ＤＵＯ法（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ ＤＵＯキットに基づき、単一コピー標的を使用する）は、高い変動性を示したか、または１，５ｐｇ／μｌ以下のヒトＤＮＡでは定量結果を生成すらできず、女性ＤＮＡバックグラウンドの存在下で１，５ｐｇ／μｌ未満の男性ＤＮＡ濃度を定量できなかった。上記Ｐｌｅｘｏｒ ＨＹは、バックグラウンド女性ＤＮＡの存在下もしくは非存在下で、３ｐｇ／μｌ未満の男性ＤＮＡ画分を定量できなかった。上記ヒト参照ＤＮＡの２μｌの所定の希釈物を、各反応において使用した。濃度は、上記テンプレート溶液中の濃度を参照する。

【図13-1】図１３は、定量反応後のＳＴＲ分析による高感度および正確な定量（図１２に示される）の重要性を示す。図１３において、図１２のヒトＤＮＡの連続希釈物を使用して、上記Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ＥＳＳｐｌｅｘ Ｐｌｕｓキット（Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコルの後に、示されるＳＴＲプロフィールを生成した。図１２に使用される最低濃度からすら完全なＳＴＲプロフィールを得るという可能性が示され、さらに少量のテンプレートの非常に正確な定量の有用性を実証する。

【図13-2】図１３は、定量反応後のＳＴＲ分析による高感度および正確な定量（図１２に示される）の重要性を示す。図１３において、図１２のヒトＤＮＡの連続希釈物を使用して、上記Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ＥＳＳｐｌｅｘ Ｐｌｕｓキット（Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコルの後に、示されるＳＴＲプロフィールを生成した。図１２に使用される最低濃度からすら完全なＳＴＲプロフィールを得るという可能性が示され、さらに少量のテンプレートの非常に正確な定量の有用性を実証する。

【図14】図１４は、最小化された反応時間によって、本発明の利点をさらに示す。上記「ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘ ＨＹｒｅｓ」は、本発明の範囲の方法の特別な実施形態を表す。第１カラム（左から）は、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ＱリアルタイムＰＣＲ機器（ＱＩＡＧＥＮ）での上記「ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘ ＨＹｒｅｓ」法の実施時間を示す。カラム２は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの７５００ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍでの上記「ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘ ＨＹｒｅｓ」法の実施時間を示す。比較のために、カラム３は、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ＱリアルタイムＰＣＲ機器（ＱＩＡＧＥＮ）で実施した、ＱＩＡＧＥＮのＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘキットについての実施時間を示し、カラム４は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの７５００ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍで実施した、ＱＩＡＧＥＮの上記ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘキットについての実施時間を示し、カラム５は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの７５００ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍで実施した、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｈｕｍａｎ Ｋｉｔについての実施時間を示し、カラム６は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの７５００ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍで実施した、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｄｕｏ Ｋｉｔについての実施時間を示し、カラム７は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの７５００ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍで実施した、Ｐｒｏｍｅｇａの上記Ｐｌｅｘｏｒ ＨＹ Ｋｉｔについての実施時間を示す。

【図15】図１５は、本発明の方法を使用する結果を示す。上記方法を、ＰＣＲインヒビターであるフミン酸およびヘマチンの所定の濃度の存在下で適用した。本発明を使用して、より高濃度のインヒビターに対する上記内部コントロールの高い安定性および上記ヒト特異的標的のより高い安定性が達成できた。これは、上記内部コントロールが完全に阻害されたとしても、正確な定量を与える。上記ヒト特異的標的の阻害は、９０〜１１０μＭの間のヘマチン濃度で始まり、これは、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＡｍｐＦｌＳＴＲ ＮＧＭもしくはＱＩＡＧＥＮのＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ＥＳＳｐｌｅｘのような次世代ＳＴＲキットのインヒビター耐性と完全に適合する。

【図16-1】図１６は、Ｙ−ＭＣ配列（すなわち、Ｙ染色体マルチコピー配列）を示す。配列番号１５は、参照配列のみとして働く。配列番号１５〜３５はまた、使用され得る。上記に概説されるように、上記方法はまた、Ｙ染色体配列のみを使用し得る。

【図16-2】図１６は、Ｙ−ＭＣ配列（すなわち、Ｙ染色体マルチコピー配列）を示す。配列番号１５は、参照配列のみとして働く。配列番号１５〜３５はまた、使用され得る。上記に概説されるように、上記方法はまた、Ｙ染色体配列のみを使用し得る。

【発明を実施するための形態】

【0071】

ヒトＤＮＡの定量は、法医学分野においてＳＴＲ反応の設定に必須の工程である。多くの異なるキットが、ＤＮＡを定量するために、市場で市販されている（Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｈｕｍａｎ、Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｙ、Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｄｕｏ、Ｐｌｅｘｏｒ ＨＹ）が、全てのこれらキットは、異なる欠点を有する（例えば、ヒトＤＮＡで増幅されるＰＣＲ産物は短く、分解されたＤＮＡの代表ではなく、上記反応は、時間がかかり、上記選択された標的は、異なる集団もしくは個体において安定ではない）。

【0072】

上記第１の核酸のＰＣＲ産物は、１４６ｂｐである。４８分の反応時間を達成した。これは、一部は、８〜９の間のｐＨ範囲を有し、ＮＨ_４^＋、Ｋ^＋およびＭｇ^２＋イオン、ならびにファストホットスタート酵素の存在を含むファストＰＣＲ反応化学と、非化学的ホットスタート法（例えば、抗体、アプタマーもしくはアフィボディー（ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ））に起因するが、特に、インヒビターの存在を報告するが、良好な定量結果をなお与える内部コントロールと合わせて、より高い感度および信頼性を提供する安定なマルチコピー標的にも起因する。この内部コントロールは、全ＤＮＡ濃度範囲にわたって安定なＣｔ値を有する。

【0073】

最初かつ最も驚くべき結果は、本発明の成分に起因する高い反応速度である。ファスト非化学的ホットスタートＤＮＡポリメラーゼの組み合わせ（例えば、抗体、アプタマーもしくはアフィボディー、ＮＨ^４＋、Ｋ^＋およびＭｇ^２＋イオンを含む反応緩衝液に起因する）、ならびにまた、好ましくは、上記マルチコピーを検出するためのｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーの使用は、この結果をもたらす。上記反応を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８．０〜８．８の間のｐＨ、カリウム塩（好ましくは、クロリドもしくはスルフェート）、アンモニウム塩（好ましくは、クロリドもしくはスルフェート）、塩化マグネシウム、各ｄＮＴＰ、２．５Ｕの示された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに表１に与えられる正方向プライマーおよび逆方向プライマーの各々０．１μＭを含む反応緩衝液において行った。

【0074】

【表1】

上記反応化学はまた、市販のＰＥＧ−８０００、分子量約８０００ダルトンを有するポリエチレングリコールを含んだ。上記反応はまた、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含んだ。

【0075】

当該分野の技術水準における他の方法は、遙かにより時間がかかる。他方で、この組み合わせは、上記マルチコピー標的のより感度が高くより信頼性の高い検出、よって、ＤＮＡの量のより良好な定量を可能にする。表１のプライマーは、ゲノムの非反復性マルチコピー標的を増幅する。マルチコピー標的を使用することの大きな利点は、達成され得る高感度である。異なる集団内のこの標的領域の安定性はまた、多施設試験（ここで、そのコピー数が異なる人種群に属する個体に関して測定された）においてもいまや示された。（以下の図を参照のこと）。

【0076】

非常に高感度であり、他方で、ＤＮＡが上記サンプル中に含まれない場合には真の陰性シグナルを示す定量ツールを有することは、法医学分野において重要である。上記Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｈｕｍａｎを使用する定量の後、６，２５ｐｇ／μｌの濃度の下で信頼できる定量は不可能であった。この場合、ユーザーは、上記ＳＴＲプロフィールを得て、上記サンプルを「ＤＮＡを含まない」として分類しようとしない（以下の図２）。上記Ｐｌｅｘｏｒ ＨＹキットを使用すると、低濃度サンプルと上記ＮＴＣとの間のシグナルにほとんど差異はなかった。

【0077】

本発明を使用すると、このようなＤＮＡ濃度範囲における定量が可能であり、完全なＳＴＲプロフィールすら得られ得る（図３）。この結果は、この信頼性の高い定量が、上記ＳＴＲプロフィールの予測される結果とよりよい相関関係を有することを示す。実際に、このことは、非常に少量のＤＮＡを使用して、いかなるＳＴＲプロフィールをも失わないようにする一助となり、決してＤＮＡを含まないサンプルを分析することを回避する。

【0078】

法医学的適用のためのＤＮＡ定量における理想的内部コントロールは、上記ＤＮＡの定量を損なうことなく、上記サンプル中のＰＣＲインヒビターの存在を示すはずであるＰＣＲシステムである。上記定量結果は、ユーザーに、上記ＤＮＡフィンガープリント反応設定についての定量データをさらに利用する可能性を与えるために、可能な限り安定であり、ＰＣＲインヒビターの存在下でも同様である。

【0079】

Ｉｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒを使用すると、上記ＤＮＡフィンガープリント反応は、２０μＭのヘマチン濃度に達するまで機能する。

【0080】

いわゆる「次世代ＳＴＲキット」は、最大７５μＭ未満のヘマチンが添加され得る例において、インヒビターの存在に遙かにより耐性である。

【0081】

代表的な法医学的ワークフローは、上記ＳＴＲ反応が行われる前に、上記ＤＮＡの定量を示唆する。これは、どの程度のＤＮＡがサンプルから得られたか（例えば、犯罪現場から集められたか）、およびこのＤＮＡのうちのどの程度がＳＴＲ反応において使用されるべきかを決定するために行われる。代表的ＳＴＲ反応は、テンプレートＤＮＡの特定の範囲において最適に機能し、その分析は、非常に労働集約的であるので、非常に高い成功率を確実にする方法論が必要とされる。従って、本発明は、そのユーザーが存在するＤＮＡ量を確実に同定できるのみならず、インヒビター（これは、上記ＳＴＲ反応結果を損ない得、失敗もしくは貴重なサンプル材料の喪失を生じ得る）の非存在をも評価できることは、真の利点である。

【0082】

定量反応におけるインヒビター感度のいくつかの例は、以下のプロットに示される。

【0083】

Ｐｌｅｘｏｒ ＨＹは、ここで見いだされ得る：
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｐｌｅｘｏｒｈｙ／ａｎ１５７．ｐｄｆ。

【0084】

Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｈｕｍａｎは、ここで見いだされ得る：
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｃｍｓ／ｇｒｏｕｐｓ／ａｐｐｌｉｅｄ＿ｍａｒｋｅｔｓ＿ｓｕｐｐｏｒｔ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｇｅｎｅｒａｌｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｃｍｓ＿０４１３９５．ｐｄｆ。

【0085】

Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｄｕｏは、ここで見いだされ得る：
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ．ｂｒ／ｓｉｔｅ／ｍａｔｅｒｉａｌ／５ｑ７ａｑｑｂｍ．ｐｄｆ。

【0086】

Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ ＨｕｍａｎキットおよびＹキットの組み合わせのみが、上記ヒト標的と比較して、内部コントロール標的のわずかに低い安定性を示す。この場合、上記ＩＣのＣｔ値は、インヒビターが上記ＤＮＡサンプルに含まれる場合に、より高い値へとシフトする一方で、上記Ｈｕｍａｎキットおよび上記ＹキットのＣｔ値は、少なくともより少量のヘマチンに関しては安定なままである。上記Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ ｈｕｍａｎキットおよびＹキットの場合には、インヒビター（例えば、ヘマチン）に対する耐性は、ほとんどない（上記反応において１６μＭ〜２０μＭの間のヘマチン）。

【0087】

上記Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｄｕｏ Ｋｉｔにおける内部コントロールシステムは、インヒビターの存在下での上記ヒト特異的標的より安定である。この場合の上記内部コントロールシステムの有用性は、当然のことながら、上記内部コントロールシステムが、上記サンプル中のインヒビターの存在のいかなる指標をも与えない一方で、上記ＤＮＡ定量は既に損なわれているので、低い。実際に、上記ＲＰＰＨ１および上記ＳＲＹシステムのＣｔ値は、少量のインヒビターにおいてすらより高い値にシフトする。１２，５μＭ ヘマチンの存在下で上記ＲＰＰＨ１システムのＣｔ値が＞４０へと劇的に増大したことは、上記ヒトＤＮＡの定量を不可能にする。

【0088】

上記サンプル中のインヒビターの存在に対する耐性は、次世代ＳＴＲキットと比較して非常に低い（すなわち、１０μＭ ヘマチンおよび３，７５ｎｇ／μｌ フミン酸）。

【0089】

上記Ｐｌｅｘｏｒ ＨＹキットは、上記ヒト標的と比較して、上記内部コントロール標的のほぼ同じ安定性を示す。この場合において、上記ＩＣのＣｔ値は、インヒビターが上記ＤＮＡサンプル中に含まれる場合に、より高い値へとシフトする。さらに、上記ヒト特異的標的のＣｔ値は、上記インヒビターが上記サンプル中に含まれる場合に、より高いレベルへとシフトするので、正確なＤＮＡ定量を困難にする。上記Ｐｌｅｘｏｒ ＨＹの場合において、インヒビター（例えば、ヘマチン）への耐性は、極めて小さい（上記反応において約２５μＭ ヘマチン）。

【0090】

本発明者らは、高濃度のインヒビターに対する上記内部コントロールの高い安定性および上記ヒト特異的標的のより高い安定性を達成できた。このことは、上記内部コントロールが完全に阻害されたとしても、正確な定量を与える。上記ヒト特異的標的の阻害は、８０〜１００μＭの間の濃度のヘマチンにおいて始まり、これは、次世代ＳＴＲキット（例えば、ＡＢＩ ＮＧＭ^ＴＭキット）のインヒビター耐性と完全に適合する。

【0091】

リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲ産物の増幅のリアルタイム検出に基づくということは公知である。実際には、法医学におけるＤＮＡ定量目的でのこのＰＣＲ産物の長さは、非常に重要である。事実、ＤＮＡの定量は、ＤＮＡフィンガープリント分析に向かう第１の工程であり、これは、代表的には、短いタンデム反復（ＳＴＲ）の分析である。これら反復は、多重反応において分析され、ここで異なる遺伝子座が、同じ反応ウェルでのＰＣＲを介して増幅される。これら遺伝子座の増幅産物は、上記遺伝子座（これは分析されなければならない）に依存して、約１００ｂｐから最大約４５０ｂｐまで変動し得る。

【0092】

分解されたＤＮＡ（これは、例えば、染色がストレス因子（例えば、光）に曝された場合に起こりうる）の場合には、上記ヒトＤＮＡの平均フラグメント長が短くなり、しばしば、最も長い遺伝子座が、もはや増幅可能ではない。上記定量アッセイがより短いＤＮＡフラグメントを検出する場合、上記アッセイは、ＳＴＲサイズのフラグメントの量を過大評価し得、それほど増幅されておらず（ｕｎｄｅｒ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）検出されていないＳＴＲ対立遺伝子の比較的高い割合を生じ、これは望ましくない結果になる。従って、本発明者らは、定量目的で増幅されるべきより長いフラグメントを選択する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12-1】

【図12-2】

【図13-1】

【図13-2】

【図14】

【図15】

【図16-1】

【図16-2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]

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