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特許6023045新規７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼノックアウト突然変異体およびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6023045
(24)【登録日】2016年10月14日
(45)【発行日】2016年11月9日
(54)【発明の名称】新規７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼノックアウト突然変異体およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20161027BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20161027BHJP
C12N 9/04 20060101ALI20161027BHJP
C12P 33/02 20060101ALI20161027BHJP
C12P 33/06 20060101ALI20161027BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21
C12N15/00 AZNA
C12N9/04 A
C12P33/02 Z
C12P33/06 Z
【請求項の数】16
【全頁数】64
(21)【出願番号】特願2013-511696(P2013-511696)
(86)(22)【出願日】2011年5月27日
(65)【公表番号】特表2013-528381(P2013-528381A)
(43)【公表日】2013年7月11日
(86)【国際出願番号】EP2011058711
(87)【国際公開番号】WO2011147957
(87)【国際公開日】20111201
【審査請求日】2014年4月30日
(31)【優先権主張番号】10015726.2
(32)【優先日】2010年12月16日
(33)【優先権主張国】EP
(31)【優先権主張番号】10164003.5
(32)【優先日】2010年5月27日
(33)【優先権主張国】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】510255107
【氏名又は名称】ファルマツェル、ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】100060368
【弁理士】
【氏名又は名称】赤岡 迪夫
(74)【代理人】
【識別番号】100124648
【弁理士】
【氏名又は名称】赤岡 和夫
(74)【代理人】
【識別番号】100154450
【弁理士】
【氏名又は名称】吉岡 亜紀子
(72)【発明者】
【氏名】シュミット，ロルフ
(72)【発明者】
【氏名】ブラウン，ミハエル
(72)【発明者】
【氏名】リュー，ルオ
(72)【発明者】
【氏名】アイグナー，アルノ
(72)【発明者】
【氏名】ヴォイスター・ボッツ，ディルク
【審査官】
福間 信子
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２００９／１１８１７６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特表２００５−５２０４９７（ＪＰ，Ａ）
【文献】
CARREA G et al., Enzymatic synthesis of 12-ketoursodeoxycholic acid from dehydrocholic acid in a membrane reactor，Biotechnology Letters, Vol.14, No.12，p.1131-1135, 1992
【文献】
MOBUS E et al., Molecular cloning, overexpression, and characterization of steroid-inducible 3-alpha-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase from Comamonas testosteroni，Journal of Biological Chemistry, Vol.273, No.47，p.30888-30896, 1998
【文献】
TANABE T et al., Roles of the Ser146, Tyr159, and Lys163 residues in the catalytic action of 7alpha-hydroxysteroid dehydrogenase from Escherichia coli, Journal of Biochemistry, Vol.124, No.3, p.634-641, 1998
【文献】
WARNER TG et al., Enhancing therapeutic glycoprotein production in Chinese hamster ovary cells by metabolic engineering endogenous gene control with antisense DNA and gene targeting, Glycobiology, Vol.9, No.9, p.841-850, 1999
【文献】
RecName: Full=3-alpha-hydroxysteroid dehydrogenase, Database UniProt [online], Accession No.P23457, 2010.03.02, [Retrieved on 2015.11.27], Internet<URL: http://www.uniprot.org/uniprot/P23457.txt?version=97>
【文献】
CARREA G. et al.，Biotechnology and Bioengineering，１９８４年，Vol.XXVI，pp.560-563
【文献】
COLEMAN J.P. et al.，Journal of Bacteriology，１９９４年，Vol.176, No.16，pp.4865-4874
【文献】
Carrea G., et al.，Enzymatic synthesis of 12-ketoursodeoxycholic acid from dehydrocholic acid in a membrane reactor，Biotechnology Letters，１９９２年，Vol.14, No.12，pp.1131-1135
【文献】
Giovannini P.P., et al.，7alpha- and 12alpha-hydroxysteroid dehydrogenases from Acinetobacter calcoaceticus lwoffii: a new integrated chemo-enzymatic route to ursodeoxycholic acid，Steroid ，２００８年，Vol.73，pp.1385-1390
【文献】
Mobus E., et al.，Molecular cloning, overexpression, and characterization of steroid-inducible 3-alpha-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase from Comamonas testosteroni，J. Biol. Chem.，１９９８年，Vol.273, No.47，pp.30888-30896
【文献】
LIU LUO，APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY，２０１１年 ４月，V90 N1，P127-135
【文献】
Braun M. et al.，12alpha-Hydroxysteroid dehydrogenase from Clostridium group P, strain C 48-50，Eur. J. Biochem，１９９１年，Vol.196，pp.439-450
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ １５／００−９０
Ｃ１２Ｐ ３３／００−２０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７α−ＨＳＤＨ）は阻害されているが、機能的に異なるヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ活性は発現され、
７α−ＨＳＤＨを内因的に発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉから誘導され、
前記機能的に異なるヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ活性は３α−，３β−，７β−，１１α−，１１β−，１２α−，１２β−，１７α−，１７β−，２０α−または２０β−ＨＳＤＨから選択される、組換え微生物。
７α−ＨＳＤＨを内因的に発現するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉから誘導され、
前記機能的に異なるヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ活性は３α−，３β−，７β−，１１α−，１１β−，１２α−，１２β−，１７α−，１７β−，２０α−または２０β−ＨＳＤＨから選択される、組換え微生物。
【請求項2】
７α−ＨＳＤＨをコードする核酸配列が相同組換えにより、または遺伝子破壊によりノックアウトされている請求項１に従った組換え微生物。
【請求項3】
７α−ＨＳＤＨとは機能的に異なるＨＳＤＨを組換え発現する請求項１または請求項２のいずれかに従った組換え微生物。
【請求項4】
ノックアウト７α−ＨＳＤＨは配列同定番号１０に従ったアミノ酸配列を有するか、または配列同定番号９に従った核酸配列によってコードされる請求項１から請求項３までのいずれか１項に従った組換え微生物。
【請求項5】
７α−ＨＳＤＨとは機能的に異なる発現されたＨＳＤＨは以下のアミノ酸配列の一つを含有する請求項１から請求項４までのいずれか１項に従った組換え微生物：
ａ）配列同定番号２９および３１から選ばれた３α−ＨＳＤＨ配列、
ｂ）配列同定番号２５から選ばれた７β−ＨＳＤＨ配列、
ｃ）配列同定番号１２，１４または１６から選ばれた１２α−ＨＳＤＨ配列、または
ｄ）配列ａ）、ｂ）およびｃ）の一つに対して少なくとも９０％の同一度を有するＨＳＤＨをコードする、それらから誘導されたアミノ酸配列。
ａ）配列同定番号２９および３１から選ばれた３α−ＨＳＤＨ配列、
ｂ）配列同定番号２５から選ばれた７β−ＨＳＤＨ配列、
ｃ）配列同定番号１２，１４または１６から選ばれた１２α−ＨＳＤＨ配列、または
ｄ）配列ａ）、ｂ）およびｃ）の一つに対して少なくとも９０％の同一度を有するＨＳＤＨをコードする、それらから誘導されたアミノ酸配列。
【請求項6】
７α−ＨＳＤＨの酵素活性が阻害されている請求項１から請求項５までのいずれか１項に従った組換え微生物が所望のＨＳＤＨが発現される条件下で培養され、発現されたＨＳＤＨが単離され、単離されたＨＳＤＨ中に機能性７α−ＨＳＤＨが実質上検出されない、７α−ＨＳＤＨとは機能的に異なる所望のＨＳＤＨの組換え生産方法。
【請求項7】
ステロイド構造の位置３α−，３β−，１１α−，１１β−，１２α−，１２β−，１７α−，１７β−，２０α−または２０β−の少なくとも１位置において、ヒドロキシル基に加え、ステロイド構造の７位に少なくとも一つのさらなるヒドロキシル基を含んでいるヒドロキシステロイドの選択的酵素酸化方法であって、該ヒドロキシステロイドが請求項６に従って調製された３α−，３β−，１１α−，１１β−，１２α−，１２β−，１７α−，１７β−，２０α−または２０β−ＨＳＤＨの存在下において、または請求項１から請求項５までのいずれか１項の組換え微生物の存在下において反応させられ、そして生成した少なくとも一つの酸化生産物が任意に反応バッチから単離される前記方法。
【請求項8】
ヒドロキシステロイドがコール酸（ＣＡ）または塩、アミドまたはアルキルエステルのようなコール酸誘導体である請求項７に従った方法。
【請求項9】
ＣＡまたはその誘導体は１２−ケトケノデオキシコール酸（１２−ケト−ＵＤＣＡ）を与えるように、または対応する誘導体を与えるように反応させられる請求項８に従った方法。
【請求項10】
式（１）
（式中、Ｒはアルキル，Ｈ，アルカリ金属イオンまたはＮ（Ｒ３）４＋を表し、ここでＲ３は同一または異なってＨまたはアルコールを表す。）
のウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の生産方法であって、
ａ）式（２）のコール酸（ＣＡ）
（式中、Ｒは上と同じ意味を有し、Ｒａは同一または異なってＨまたはアシルを表す。）が請求項６に従って調製された１２α−ＨＳＤＨの存在下、または請求項１から請求項５のいずれか１項の前記１２α−ＨＳＤＨを発現する組換え微生物の存在下式（３）の対応する１２−ケトケノデオキシコール酸（１２−ケト−ＵＤＣＡ）
（式中、ＲおよびＲａは上に示した意味を有する。）へ酸化され、その後
ｂ）式（３）の１２−ケト−ＣＤＣＡが式（４）のケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）
（式中、ＲおよびＲａは上に示した意味を有する。）を与えるように脱酸素化反応させられ、そして
ｃ）式（４）のＣＤＣＡが式（５）の７−ケトリトコール酸（ＫＬＣＡ）
（式中、ＲおよびＲａは上に示した意味を有する。）へ７位において化学的に酸化され、そして
ｄ）式（５）のＫＬＣＡが還元され、そして
ｅ）反応生産物が任意にさらに精製される、前記方法。
【化26】
のウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の生産方法であって、
ａ）式（２）のコール酸（ＣＡ）
【化27】
【化28】
ｂ）式（３）の１２−ケト−ＣＤＣＡが式（４）のケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）
【化29】
ｃ）式（４）のＣＤＣＡが式（５）の７−ケトリトコール酸（ＫＬＣＡ）
【化30】
ｄ）式（５）のＫＬＣＡが還元され、そして
ｅ）反応生産物が任意にさらに精製される、前記方法。
【請求項11】
ステロイド構造の位置３，１１，１２，１７または２０にある少なくとも一つのケト基に加え、ステロイド構造の７位に少なくとも一つのさらなるケト基を有するケトステロイドの酵素還元方法であって、請求項６に従って調製された３α−，３β−，７β−，１１α−，１１β−，１２α−，１２β−，１７α−，１７β−，２０α−または２０β−ＨＳＤＨの存在下において、または請求項１から請求項５までのいずれか１項の組換え微生物の存在下において前記ケトステロイドが反応させられ、そして生成した一つの還元生産物が任意に反応バッチから単離される前記方法。
【請求項12】
所望の反応を触媒する少なくとも一つの前記ＨＳＤＨが溶解した、分散したまたは固定化した形で使用され、または該方法が請求項１から請求項５のいずれか１項の組換え微生物の任意に固定化された全細胞の存在下に実施される、請求項７から請求項１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
所望の反応を触媒する少なくとも一つの前記ＨＳＤＨは７β−ＨＳＤＨ、３α−ＨＳＤＨおよび／または１２α−ＨＳＤＨである、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
式（１）のウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）
（式中、Ｒはアルキル，Ｈ，アルカリ金属イオンまたはＮ（Ｒ３）４を表し、ここでＲ３は同一または異なってＨまたはアルキルを表す。）の生産方法であって、
ａ）任意に式（２）のコール酸（ＣＡ）
（式中、Ｒは前記の意味を有する。）を式（３）のデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）へ化学的に酸化し、
（式中、Ｒは前記の意味を有する。）
ｂ）ＤＨＣＡが請求項６に従って調製された７β−ＨＳＤＨと３α−ＨＳＤＨで任意の順序で、または両方の酵素の同時存在下で対応する式（５）の１２−ケトウルソデオキシコール酸（１２−ケト−ＵＤＣＡ）
（式中、Ｒは前記の意味を有する。）へ還元され、
ｃ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡが化学的にＵＤＣＡへ還元され、そして
ｄ）反応生産物が任意にさらに精製される前記方法。
【化31】
ａ）任意に式（２）のコール酸（ＣＡ）
【化32】
【化33】
ｂ）ＤＨＣＡが請求項６に従って調製された７β−ＨＳＤＨと３α−ＨＳＤＨで任意の順序で、または両方の酵素の同時存在下で対応する式（５）の１２−ケトウルソデオキシコール酸（１２−ケト−ＵＤＣＡ）
【化34】
ｃ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡが化学的にＵＤＣＡへ還元され、そして
ｄ）反応生産物が任意にさらに精製される前記方法。
【請求項15】
酵素レドックス工程は助因子再生工程と組合わされる請求項７から請求項１４のいずれか１項に従った方法。
【請求項16】
前記ｂ）は、前記７β−ＨＳＤＨと前記３α−ＨＳＤＨを発現する１以上の微生物の存在下で行われる、請求項１４に従った方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規な微生物７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７α−ＨＳＤＨ）ノックアウト突然変異体と、そして例えば３α−，７β−または１２α−ＨＳＤＨのような異なる官能性の他のＨＳＤＨの製造のためのその使用と、そしてコール酸化合物の酵素反応におけるこのように製造されたＨＳＤＨ酵素の使用、そして特にウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の製造における使用に関する。本発明は特にＵＤＣＡの新規合成方法に関する。
【背景技術】
【0002】
活性物質であるウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）および関連するジアステレオマーであるケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）は永年胆石の医学的処置に使用されている。両化合物は炭素原子７上のヒドロキシ基の配位のみが相違する（ＵＤＣＡ：β配位、ＣＤＣＡ：α配位）。先行技術において純粋に化学的に実施されるか、または化学的および酵素的プロセスステップの組合せよりなる種々のＵＤＣＡの製造方法が記載されている。各場合出発点はコール酸（ＣＡ）またはコール酸から生産されるＣＤＣＡである。
【0003】
このようにＵＤＣＡ製造のための古典的な化学的方法は以下のように概略的に表すことができる。【0004】
重大な欠点は中でも以下のとおりである。化学的酸化は選択的ではないため、カルボキシル基および３αと７α−ヒドロキシル基はエステル化によって保護しなければならない。
【0005】
酵素１２α−ＨＳＤＨの使用に基づく代替的化学／酵素法が例えば本出願人のＰＣＴ／ＥＰ２００９／００２１９０に記載されている。特にここでは組換え生産された１２α−ＨＳＤＨが使用される。この酵素は好ましくは組換えＥ．ｃｏｌｉホストによって生産され、それから単離され、そして反応に使用される。
【0006】
１２α−ＨＳＤＨはＣＡを選択的に１２−ケト−ＣＤＣＡへ酸化する。ここでは古典的化学方法において必要な二つの化学的保護ステップは必要でない。
【0007】
この方法ではこのように生産された価値ある生産物ＵＤＣＡがこれまで未知の理由でリトコール酸（ＬＣＡ）で汚染されることが問題である。
【0008】
新規７β−ＨＳＤＨと、還元ルートでのＵＤＣＡの生産におけるその使用が本出願人のＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６８５７６に記載されている。ここで組み換えＥ．ｃｏｌｉホストがやはり内因性７α−ＨＳＤＨを生産し、そして７α−ＨＳＤＨが３，１２−ジケト−ＣＤＣＡ副生物をデヒドコール酸から生産するのが問題である。この３，１２−ジケト−ＣＤＣＡはもはや７β−ＨＳＤＨの基質ではなく、そのため所望の生産物に加え、所望できない副産物も蓄積される。
【0009】
それ故本発明の目的は、上に記載した不利益を回避するＵＤＣＡの製造のための新規な方法の提供である。特にＬＣＡまたは、３，１２−ジケト−ＣＤＣＡのような不純物なしでＵＤＣＡの酵素／化学的生産を可能にすることである。
【発明の概要】
【0010】
本発明に従い、驚くべきことに例えばＬＣＡのような望まない不純物の出現の原因は複雑な化学的副反応の望まない結果ではないことが発見された。ＬＣＡの出現は１２α−ＨＳＤＨ自体によって触媒される副反応の結果でもない。むしろ酵素反応ステップを触媒する１２α−ＨＳＤＨ酵素が７α−ＨＳＤＨ活性の結果として酵素不純物を含有する。この結果は１２−ケト−ＣＤＣＡの７，１２−ジケト−ＬＣＡへの酸化であり、これはＵＤＣＡへ導くさらなる化学的変換の途中で化学的副反応においてＬＣＡへ還元される。このことは以下のスキームに示される。【0011】
特に７，１２−ジケト−ＬＣＡの生成の原因は１２α−ＨＳＤＨの７α−ＨＳＤＨの酵素による汚染であることが発見された。１２α−ＨＳＤＨ（その短い形のような）の組換え生産において、特にＥ．ｃｏｌｉホスト細胞を用いる生産において、１２α−ＨＳＤＨ自体が事実精製後内因性７α−ＨＳＤＨ酵素によって汚染される。両方の酵素は非常に似た分子量を有し、そして実質上同じ配列長さのため（１２α−ＨＳＤＨ（短い形）または７α−ＨＳＤＨのための２５７または２５５アミノ酸）精製の間他の点で全く似た分離挙動を有し、そのためこのように生産された１２α−ＨＳＤＨは実質上常に７α−ＨＳＤＨで汚染されている。
【0012】
７β−ＨＳＤＨも困難なしに望まない７α−ＨＳＤＨから分離できない。
【0013】
本発明に従えば、例えばもはや７α−ＨＳＤＨ活性を有しない１２α−ＨＳＤＨまたは７β−ＨＳＤＨのようなＨＳＤＨの調製は１２α−ＨＳＤＨまたは例えば７β−ＨＳＤＨのような他のＨＳＤＨの組換え生産に使用される発現ホスト中の二次活性の選択的遮断のみによって驚くほど成功した。
【0014】
このため発現ホストＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ゲノタイプ：Ｆ−ｏｍｐＴ ｇａｌ ｄｃｍ Ｉｏｎ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）λ（ＤＥ３［ｌａｃｌ ｌａｃＵＶ５−Ｔ７遺伝子１ｉｎｄ１ ｓａｍ７ ｎｉｎ５］）（Ｎｏｖａｇｅｎ）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８５）１８９，１１３−１３０）が組換えタンパクの生産のために大部分使用される。しかしながら、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）はＮＡＤＨ−依存性７α−ＨＳＤＨを含有し、これは本発明によって今や発見されたように、例えばＵＤＣＡの生産において望まない副産物であるリトコール酸の生成を生じる。
【0015】
ＵＤＣＡの製造においてＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）からの７α−ＨＳＤＨの結果としての副反応の回避のため、内因性７α−ＨＳＤＨをコードする遺伝子は、例えば最初相同組換えによってＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）から本発明に従って成功してノックアウトされた。得られた株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨは、ＵＤＣＡの製造においてもはや前記の望まない副反応を生じさせない１２α−ＨＳＤＨの組換え生産を許容する。
【0016】
本発明に従えば、以下の概略図に示すように、７α−ＨＳＤＨによって触媒される副反応なしにはじめてＵＤＣＡの合成が可能になる。このため１２α−ＨＳＤＨはＣＡを１２−ケト−ＣＤＣＡへ選択的に酸化する。【0017】
上の目的の提案した解決法は、内因性７α−ＨＳＤＨはＮＡＤＨ依存性酵素であるが，組換え発現された１２α−ＨＳＤＨはＮＡＤＰＨ依存性であることが発見されたから、すべてもっと驚くべきである。しかしながらこの７α−ＨＳＤＨも、本発明に従って発見されたように、ＮＡＤＰＨの存在においてＮＡＤＨの不存在にもかかわらず僅かの活性を示す。この僅かの活性は、たとえ酵素合成ステップが全細胞でなく単離された酵素で実施されたとしても、価値ある生産物ＵＤＣＡを望まない態様においてＬＣＡで終局的に汚染するのに十分である。全細胞を使用する時、細胞からの細胞ＮＡＤＨの存在のため、７α−ＨＳＤＨが完全に活性であり、それにより副生成物生成がさらに劇的に増加されるであろう。
【0018】
このため本発明により、上の酵素／化学的合成ルートに従ったＬＣＡ不含ＵＤＣＡの製造が、１２α−ＨＳＤＨ活性を発現するがしかし妨害する７α−ＨＳＤＨ活性なしの組換えた全細胞を用いて可能になる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】図１は、コロニーＰＣＲの結果を示す。特に、組換えによって集積したアパレマイシン抵抗性遺伝子に相当する１５００塩基対を含んでいるバンドを見ることができる。抵抗性はゲノム中に集積され、そして７α−ＨＳＤＨの遺伝子はノックアウトされた。痕跡１にＤＮＡマーカーを示す。痕跡２は１５００塩基対を含んでいるＰＣＲ生成物を示す。
【図2】図２は、種々のＥ．ｃｏｌｉとのコール酸（ＣＡ）のインキュベーションの結果を示す。Ａ：Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）とコール酸；Ｂ：ノックアウト突然変異体Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨとコール酸；Ｃ：対照としてのコール酸。図Ａ中の矢印は酸化生成物（７−ケト−３，１２−ジヒドロキシコラン酸）を示す；Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）による変換における保持時間（ＲＴ）＝７．５分。不純物のため７−ケト−３，１２−ジヒドロキシコラン酸の領域の小さいピークがノックアウト株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）にも見られたが、しかし観察されたピークは陰性対照（Ｃ）におけるよりも大きくない。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本発明は特に以下の具体例に関する。１． ７α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７α−ＨＳＤＨ）の酵素活性は阻害されているが、機能的に異なるヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（例えば３α−，３β−，７β−，１１α−，１１β−，１２α−，１２β−，１７α−，１７β−，２０α−，または２０β−ＨＳＤＨ，特に３α−，７β−，または１２α−ＨＳＤＨのような）の酵素活性は発現可能に含まれている組換え微生物。
【0021】
ここでは阻害された７α−ＨＳＤＨは例えばＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋）のような任意の所望助因子依存性を示す。
【0022】
任意に、そのように修飾された微生物は、所望のＨＳＤＨ活性を発現するばかりでなく、例えば助因子再生を助ける酵素（後でもっと詳しく説明するような）のような、ＨＳＤＨと組合せて任意に作用することができる他のタンパクまたは酵素を発現するように付加的に修飾されることができる。これらの例はアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）およびホルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）である。
【0023】
特に本発明は、特に７α−ＨＳＤＨ（例えばＮＡＤＨ−依存性）の内因性酵素活性は阻害されているが、１２α−ＨＳＤＨ（例えばＮＡＤＰＨ依存性）の酵素活性は発現可能に含まれているタイプの微生物のような、７α−ＨＳＤＨの酵素活性は阻害されているが、外因性１２α−ＨＳＤＨの酵素活性は発現可能に含まれている組換え微生物に関する。基本的には７α−ＨＳＤＨと１２α−ＨＳＤＨとは同じまたは異なる助因子依存性を発揮することができ、すなわち７α−ＨＳＤＨおよび１２α−ＨＳＤＨの両方がＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋）依存であることができる。しかしながら７α−ＨＳＤＨおよび１２α−ＨＳＤＨは種々の助因子に依存性であることができる。このため７α−ＨＳＤＨは例えばＮＡＤＨ（またはＮＡＤ＋）に依存性であることができ、そして１２α−ＨＳＤＨはＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤＰ＋）に依存性であること、またはその逆であることができる。特に種々の助因子に依存性の場合、各ケースにおいて他の助因子の存在下分析的に検出可能な酵素活性も観察できる。このため例えば７α−ＨＳＤＨがＮＡＤＨ（またはＮＡＤ＋）に依存性であることができるが、しかしＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤＰ＋）の存在下分析的に検出できる酵素活性を示すこともできる。
【0024】
もし１２α−ＨＳＤＨの代りに３α−，３β−，１１α−，１１β−，１２β−，１７α−，１７β−，２０α−，および２０β−ＨＳＤＨのような１種以上の他のＨＳＤＨを発現させ、そして任意に例えば３α−および／または７β−ＨＳＤＨのように単離することを意図するならば、上記が対応してあてはまる。
【0025】
２． ７α−ＨＳＤＨをコードする核酸配列が特に相同組換えにより、または遺伝子破壊（特にコードされる遺伝子産物の酵素機能を阻害する核酸配列の挿入によって）によってノックアウトされた具体例１に従った組換え微生物。
【0026】
３． ７α−ＨＳＤＨを発現する前駆体微生物、特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌、特にＥ．ｃｏｌｉのような、７α−ＨＳＤＨを内因的に発現する前駆体微生物から誘導された前出具体例の一つに従った組換え微生物。
【0027】
４． Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１から誘導された具体例３に従った組換え微生物。
【0028】
５． 特に３α−，７β−および／または１２α−ＨＳＤＨのような、７α−ＨＳＤＨとは機能的に異なるＨＳＤＨを組換え発現する前出具体例の一つに従った組換え微生物。
【0029】
６． 阻害された（ノックアウトされた）７α−ＨＳＤＨが配列同定番号１０に従ったアミノ酸配列を有するか、または配列同定番号９に従った核酸配列によってコードされる、前出具体例の一つに従った組換え微生物。
【0030】
７． ７α−ＨＳＤＨとは機能的に異なる発現されたＨＳＤＨが以下のアミノ酸配列の一つを含んでいる前出具体例の一つに従った組換え微生物：ａ）配列同定番号２９および３１から選択された３α−ＨＳＤＨ配列、
ｂ）配列同定番号２５から選ばれた７β−ＨＳＤＨ配列、
ｃ）配列同定番号１２，１４または１６から選ばれた、または
ｄ）少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも７５％の、特に例えば９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８または９９％のような少なくとも８５％のａ），ｂ）またはｃ）の配列の一つとの同一度を有する、ａ），ｂ）またはｃ）から誘導されたＨＳＤＨをコードするアミノ酸配列を含んでいる１２α−ＨＳＤＨ配列。
【0031】
８． 例えば３α−，３β−，７β−，１１α−，１１β−，１２α−，１２β−，１７α−，１７β−，２０α−または２０β−ＨＳＤＨ、特に３α−，７β−または１２α−ＨＳＤＨのような、７α−ＨＳＤＨとは機能的に異なる所望のＨＳＤＨの組換え生産方法であって、７α−ＨＳＤＨの酵素活性が阻害されている前出具体例の一つに従った組換え微生物が所望のＨＳＤＨの発現される条件下で培養され、そしてこのように発現されたＨＳＤＨが単離され、単離されたＨＳＤＨ中に７α−ＨＳＤＨが実質上検出されない方法。
【0032】
特に、本発明は前出具体例の一つに従った組換え微生物が１２α−ＨＳＤＨを発現する条件下で培養され、そして発現された１２α−ＨＳＤＨが単離され、単離された酵素が７α−ＨＳＤＨによって汚染されていない、特にＮＡＤＰＨ依存性の１２α−ＨＳＤＨの生産に関する。
【0033】
しかしながら本発明は特に、前出具体例の一つに従った組換え微生物が１２α−ＨＳＤＨを発現する条件下で培養され、そして発現された酵素が単離され、単離された酵素が７α−ＨＳＤＨによって汚染されていない、ＮＡＤＨ、特にＮＡＤＰＨ依存性の７β−ＨＳＤＨの生産に関する。
【0034】
９． 具体例１ないし７の一つに従った組換え微生物から得ることができる、７α−ＨＳＤＨ酵素または酵素活性によって汚染されていない、特にＮＡＤＰＨ依存性７α−ＨＳＤＨまたはＮＡＤＰＨ依存性二次活性を有するＮＡＤＨ依存性７α−ＨＳＤＨによって汚染されていない、３α−，３β−，７β−，１１α−，１１β−，１２α−，１２β−，１７α−，１７β−，２０α−または２０β−ＨＳＤＨ、特に３α−，７β−または１２α−ＨＳＤＨ、特にＮＡＤＰＨ依存性７β−ＨＳＤＨまたは１２α−ＨＳＤＨのような組換えＨＳＤＨ。
【0035】
１０． 具体例６に従った配列番号から選ばれ、そしてこれら配列に対して少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７５％、特に９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８または９９％のような少なくとも８５％の同一度でそれらから誘導されたアミノ酸配列を含む具体例９に従った、例えば３α，３β−，７β−，１１α−，１１β−，１２α−，１２β−，１７α−，１７β−，２０α−または２０β−ＨＳＤＨ、特に３α−，７β−または１２α−ＨＳＤＨのような組換えＨＳＤＨ。
【0036】
１１． ステロイド構造の３α−，３β−，１１α−，１１β−，１２α−，１２β−，１７α−，１７β−，２０α−または２０β−位の少なくとも一つの、特にステロイド構造の１２α−位のヒドロキシル基に加え、ステロイド構造の７α−位の少なくとも一つのさらなるヒドロキシル基を含んでいるヒドロキシステロイドの選択的酵素酸化方法であって、ヒドロキシステロイドが３α−，３β−，１１α−，１１β−，１２α−，１２β−，１７α−，１７β−，２０α−または２０β−ＨＳＤＨ、特に具体例９または１０に従った１２α−ＨＳＤＨの存在下に、または具体例１ないし７の一つに従った組換え微生物の存在下に反応させられ、そして生成した少なくとも一つの酸化生成物が任意に反応バッチから単離される方法。
【0037】
１２． ヒドロキシステロイドがコール酸（ＣＡ）または特に塩、アミドまたはアルキルエステルのようなコール酸誘導体である具体例１１に従った方法。
【0038】
１３． ＣＡまたはその誘導体が１２−ケトケノデオキシコール酸（１２−ケト−ＣＤＣＡ）を与えるように、または対応する誘導体を与えるように反応させられる具体例１２に従った方法。
【0039】
１４． 反応がＮＡＤ（Ｐ）＋の存在下に行われる具体例１１ないし１３の一つに従った方法。
【0040】
１５． 消費されたＮＡＤ（Ｐ）＋が電気化学的にまたは酵素で再生される具体例１４に従った方法。
【0041】
１６． 式（１）のウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の製造方法であって、【化1】
ここで、
ａ）式（２）のコール酸（ＣＡ）
【化2】
【化3】
その後、
ｂ）式（３）の１２−ケト−ＣＤＣＡが式（４）のケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）を与えるように脱酵素化反応に供せられ、
【化4】
そして、
ｃ）式（４）のＣＤＣＡが７位において式（５）の７−ケトリトコール酸（ＫＬＣＡ）へ酸化され、
【化5】
そして、
ｄ）式（５）のＫＬＣＡが還元され、そして
ｅ）任意に反応生成物がさらに精製されることを含む方法。
【0042】
１７． もしＲａがアシルを表すならば、反応スッテプｂ）またはｃ）の実施後任意にこのアシル基が除去される具体例１６に従った方法。
【0043】
１８． ステップａ）がＮＡＤ（Ｐ）＋の存在下で行われる具体例１６または１７に従った方法。
【0044】
１９． 消費されたＮＡＤ（Ｐ）＋が電気化学的にまたは酵素により再生される具体例１８に従った方法。
【0045】
２０． ステロイド構造の３，１１，１２または２０位に、特にステロイド構造の１２位および／または３位の少なくとも一つのケト基に加え、ステロイド構造の７位にさらなるケト基を持っているケトステロイドの選択的酵素還元方法であって、該ケトステロイドが具体例９または１０に従った３α−，３β−，７β−，１１α−，１１β−，１２α−，１２β−，２０α−または２０β−ＨＳＤＨの存在下、特に７β−ＨＳＤＨおよび／または３α−ＨＳＤＨの存在下、あるいは具体例１ないし７の一つに従った組換え微生物の存在下反応させられ、そして生成した少なくとも一つの還元生成物が任意に反応バッチから単離される方法。
【0046】
２１． 式（１）のウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の製造方法であって、【化6】
ここで、
ａ）任意に式（２）のコール酸（ＣＡ）
【化7】
【化8】
ｂ）ＤＨＣＡが、具体例９または１０の一つに従った７β−ＨＳＤＨと３α−ＨＳＤＨにより、両酵素の任意の所望順番また同時存在下、式（５）の対応する２−ケトウルソデオキシコール酸（１２−ケト−ＵＤＣＡ）へ還元され、
【化9】
そして次に、
ｄ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡが化学的にＵＤＣＡへ還元され、そして
ｅ）反応生成物が任意にさらに精製される、方法。
【0047】
２２． 酵素レドックスステップが助因子再生ステップ（特定の酵素的な）と組み合わされる具体例１１ないし２１に従った方法。
【0048】
２３． ＨＳＤＨが溶解、分散または固定化した形で使用されるか、または方法が具体例１ないし７の一つに従った組換え微生物の任意に固定化された全細胞の存在下に実施される、具体例１１ないし２２の一つに従った方法。［本発明のさらなる具体例］
【0049】
１．一般的定義および使用した略号ステロイド構造の置換基に関しここで使用される位置番号は以下の命名法に一致して与えられる。
【化10】
【0050】
【表1】
【0051】
本発明の文脈において、ある遺伝子（例えば７α−ＨＳＤＨ遺伝子のような）のための微生物の「ノックアウト」突然変異体（またはノックアウト株）は、関係する遺伝子がＤＮＡレベルで「不活性化」されている微生物の突然変異体を意味するものと理解すべきである。
【0052】
そのような不活性化は最も広い意味に解すべきであり、そして例えばタンパクが翻訳されないように適切な構造遺伝子の核酸配列の完全欠失か、またはもとの構造遺伝子によってコードされるタンパクに比較してその機能が制限された、特に完全に抑制された不完全タンパクがコードされ、翻訳されるように部分的欠失に基づくことができる。さらに構造遺伝子は、読取りフレーム中に一以上の早熟ストップコドンが出現し、そしてタンパクの有意な部分が翻訳されない程度に構造遺伝子の核酸配列が変性する、当業者に知られた“ナンセンス変異”によってノックアウトされることができる。
【0053】
代って、“ミスセンス変異”を導入することができる。この場合は機能のために必須の個々のまたは多数のアミノ酸（例えば基質結合に責任あるアミノ酸、触媒中心またはアロステリック領域、または他のタンパクまたは分子と結合また相互作用に責任があるアミノ酸）が除去されるか、または関心ある機能の部分的または完全損失へ導くアミノ酸によって置換される。さらに読取りフレームのシフトへ導き（フレームシフト）そしてそのため制限された機能を有するタンパクの発現へ導き、そして特にＮ−末端近くのフレームシフトの発生において、完全な機能損失へ導く一以上のヌクレオチドの挿入を実行することができる。また、ノックアウトすべきタンパクの構造遺伝子中へ個々のタンパク（マーカータンパク）（例えば抗生物質抵抗性へ導くタンパク）をコードする核酸配列の挿入を使用することができ、そして成功したノックアウトの遺伝表現型検出として挿入した核酸配列の発現を使用することができる。
【0054】
ノックアウト突然変異体は、関心ある構造遺伝子の発現に必要な調節領域、例えば構造遺伝子のプロモーターまたはエンハンサーに核酸の完全または部分的欠失または挿入のための前述した対策によってもつくることができる。しかしながらノックアウトは特に、ノックアウトすべき構造遺伝子の核酸配列中のマーカータンパクのための転写可能な核酸配列の挿入によって構造遺伝子の部分的または完全欠失により、または両方の方法の組合せによって生起する。もし関心ある遺伝子の機能を果たすことができる関心ある遺伝子またはその相同体のコピーの数が微生物または細胞に存在すれば、例えば細菌染色体上の、細菌染色体上および同時に原核生物細胞内のプラスミドのような染色体外エレメント上の、または原核生物染色体の異なるポイントに、または種々の原核生物染色体上と任意に付加的に原核生物細胞中の染色体外ＤＮＡ上に多数の遺伝子が存在すれば、関心ある遺伝子のコピーまたは相同体の多数、好ましくは全部をノックアウトすることができる。
【0055】
“内因性”とは、例えば野生タイプゲノム（ここで定義した）中に既に含まれている遺伝子のような、遺伝子情報を意味するものと理解すべきである。
【0056】
“外因性”とは、例えば野生タイプゲノム中に含まれていない遺伝子のような、遺伝子情報を意味するものと理解すべきである。もし、外因性遺伝子情報、例えば本発明に従った１２α−ＨＳＤＨ含有発現ユニットが野生タイプ株のゲノム中に導入され、それによって遺伝子的に変性された株が生産されたならば、この遺伝子情報ははじめて生産された遺伝子株をその子孫と比較すれば内因性であるが、しかしこの遺伝子情報を含んでいない元の野生タイプ株との比較において外因性である。
【0057】
術語“野生タイプ”は、本発明に従い、対応する出発微生物を意味するものと理解すべきであり、必ずしも自然に存在する微生物に対応する必要はない。
【0058】
関係に応じて、術語“微生物”は出発微生物（野生タイプ）または本発明に従って遺伝子的に変性された微生物を意味するものと理解すべきである。
【0059】
もし対応するタンパク生産物に永久にまたは限られた期間（例えばインキュベーション後）翻訳されるならば、コードする配列は、“発現可能”に微生物に含まれている。
【0060】
本発明の意味において、“阻害”は生物学的機能の完全なまたは部分的な阻害を含む。特に、例えば酵素活性のような生物学的機能をある理由で望まなければ、例えば７α−ＨＳＤＨの酵素活性が分析的に検出できなければ、本発明によって阻害が存在する。
【0061】
他に詳細が与えられていなければ、術語“７α−ＨＳＤＨ”は、ＮＡＤ（Ｐ），特にＮＡＤの化学量論的消費を伴う、少なくとも１２−ケト−ＣＤＣＡの、７，１２−ジケト−ＬＣＡへの立体特異性および／またはレジオ特異性酸化を触媒するデヒドロゲナーゼ酵素を指す。そのような酵素はＥＣ番号１．１．１．１５９として分類されている。７α−ＨＳＤＨは特に、例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｂｓｏｎｕｍ， Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９９４，４８６５−４８７４）のようなＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １９９１，２１７３−２１７９）， Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｌｏｇｙ ２００３，４７，４７５−４８４）そしてＢｒｕｃｅｌｌａ Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍのような腸内叢の微生物中に発見される。このため本発明は基本的にこれら微生物のすべてに適用できる。
【0062】
もし他に詳細が与えられていなければ、術語“１２α−ＨＳＤＨ”は、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の化学量論的消費を伴う、少なくともコール酸（ＣＡ）の１２−ケトケノデオキシコール酸（１２−ケト−ＣＤＣＡ）への立体特異性および／またはレジオ特異性酸化を触媒するデヒドロゲナーゼ酵素を指す。そのような酵素はＥＣ番号１．１．１．１７６として分類されている。ＮＡＤＰ＋−依存性（Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｈｙｌｅｍｏｎ（１９７８）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ５２８（１）：１４８−５７）およびＮＡＤ＋−依存性（Ｍａｃｄｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９７６）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ４５０（２）：１４２−５３）タイプ両方が存在する。他のＨＳＤＨ不存在で高い２α−ＨＳＤＨ活性を発現する唯一の既知微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｉｍ ｓｐ．グループＰ株４８−５０ ＤＳＭ ４０２９である。特に好適な１２α−ＨＳＤＨおよびこれらの変異体は本出願人のＰＣＴ／ＥＰ２００９／００２１９０に記載されており、さらに参照される。
【0063】
もし他に詳細が与えられていなければ、術語“７β−ＨＳＤＨ”は、ＮＡＤＰＨの化学量論的消費を伴う、少なくともＤＨＣＡの３，１２−ジケト−７β−ＣＡへの立体特異性および／またはレジオ特異性還元、またはその逆反応を触媒するデヒドロゲナーゼ酵素を指す。この酵素は天然または組換え生産された酵素であることができる。基本的にこの酵素は例えば細胞タンパク不純物との混合物中に存在するが、しかし好ましくは純粋形である。好適な検出方法は、例えば次の文献に記載されている。（例えば、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＡＤＰ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ７β−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ ａｎｄ Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ． Ｓ． Ｈｉｒａｎｏ ａｎｄ Ｎ． Ｍａｓｕｄａ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９８２）。しかしながらここでは７−ケト基の還元を可能にするＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓからの７β−ＨＳＤＨは検出できなかった。この活性の酵素はＥＣ番号１．１．１．２０１に分類されている。
【0064】
もし他に詳細が与えられていなければ、術語“３α−ＨＳＤＨ”は、特にＮＡＤＨおよびＮＨＤＰＨの化学量論的消費および任意に対応する逆反応を伴う、少なくとも１３，２−ジケト−７β−ＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの立体特異性および／またはレジオ特異性還元を触媒するデヒドロゲナーゼ酵素を指す。好適な検出方法は、例えば以下の実験の部に記載されているか、または文献から既知である。好適な酵素は、例えばＣｏｍａｎｏｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ（例えばＡＴＣＣ１１９９６）から得ることができる。ＮＡＤＰＨ依存性３α−ＨＳＤＨは、例えばネズミから得られ、同様に使用できることが知られている。（Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ３ ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ／ｄｉｈｙｄｒｏｄｉｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ， Ｊ Ｅ Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ， Ｍ Ｈｕｉｚｉｎｇａ ａｎｄ Ｔ Ｍ Ｐｅｎｎｉｎｇ， Ｍａｙ １５， １９９１， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２６６，８８２０−８８２５）。この活性の酵素はＥＣ番号１．１．１．５０に分類されている。
【0065】
本発明に従えば、“純粋形”または“純粋”または“本質的に純粋”な酵素とは、例えばビウレット法またはＬｏｗｒｅｙらの方法に従ったタンパク検出方法（Ｒ．Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｈｅｉｄｅｒｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９８２）を見よ）のような通常のタンパク検出方法によって決定し、全タンパク質の８０％以上、好ましくは９０％以上、特に９５％以上、そして９９％以上の純度を有する酵素を意味するものと理解すべきである。
【0066】
“レドックス均等物”とは、例えばＮＡＤ＋およびＮＡＤＨ＋のようなニコチンアミド誘導体、またはその還元形であるＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨのような電子供与体または電子受容体として使用し得る小分子有機化合物を意味するものと理解すべきである。
【0067】
本発明に従えば、“コール酸化合物”とは、コール酸の基本炭素骨格、特にステロイド構造を有し、環位置７および任意に環位置３および／または１２にケトおよび／またはヒドロキシもしくはアシルオキシ基が存在する化合物を意味するものと理解すべきである。
【0068】
例えば“コール酸化合物”または“ウルソデオキシコール酸”のような特定タイプの化合物は、出発化合物（例えばコール酸またはウルソデオキシコール酸のような）の誘導体をも意味するものと理解すべきである。
【0069】
そのような誘導体は、例えば化合物のリチウム、ナトリウムおよびカリウム塩のようなアルカリ金属塩、およびアンモニウム塩のような“塩”を含む。ここでアンモニウム塩はＮＨ４＋塩、および少なくとも１個の水素原子をＣ１−Ｃ６アルキル基で置換したアンモニウム塩を含む。典型的なアルキル基は、メチル、エチル、ｎ−またはｉ−プロピル、ｎ−，ｓｅｃ−またはｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルおよび１回または複数回分岐したそれらの類縁体である。
【0070】
本発明に従った“アルキルエステル”化合物は、例えばＣ１−Ｃ６アルキルエステルのような低級アルキルエステルである。非限定的な例として、メチル、エチル、ｎ−またはｉ−プロピル、ｎ−，ｓｅｃ−またはｔｅｒｔ−ブチルエステル、または例えばｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシルエステルおよびその１回または多数回分岐類縁体を挙げることができる。
【0071】
“アミド”は、アンモニアまたは１級もしくは２級アミンによる、本発明に従った酸の変換生成物である。そのようなアミンは、例えばモノ−またはジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミンであり、アルキル基は相互に独立し例えばカルボキシ、ヒドロキシ、ハロゲン（Ｆ，Ｃｌ，ＢｒまたはＩのような）、ニトロおよびスルホネート基で任意にさらに置換されることができる。
【0072】
本発明に従った“アシル基”は、例えばアセチル、プロピオニルおよびブチリルのような炭素原子２ないし４個を有する非芳香基、および任意に置換された単環芳香環を有する芳香族基であり、ここで好適な置換基は、例えば、ヒドロキシ、ハロゲン（Ｆ，Ｃｌ，ＢｒまたはＩのような）、ニトロ、例えばＣ１−Ｃ６アルキル基であり、例えばベンゾイルまたはトルオイル基である。
【0073】
例えばコール酸、ウルソデオキシコール酸、１２−ケト−ケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸および７−ケト−リトコール酸のような本発明に従って使用され、または生産されるヒドロキシステロイド化合物は、立体異性的に純粋な形か、または他のまたはそれから得ることができる他の立体異性体との混合物の形で本発明方法に使用することができる。しかしながら好ましくは、使用または製造される化合物は、本質的に立体異性的に純粋な形で使用または単離される。
【0074】
本発明に従えば、“固定化”とは、例えば７β−ＨＳＤＨのような本発明に従った生触媒を固体、例えば周囲の液体媒体に本質的に不溶な支持体へ共有または非共役的に結合することを意味するものと理解される。
【0075】
２．タンパク、特に本発明に従って製造することができる組換え酵素
【0076】
２．１ １２α−ＨＳＨＤ類そのような１２α−ＨＳＨＤは本出願人のＷＯ２００９／１１８１７６に記載されている。
【0077】
本発明に従えば、発現された１２α−ＨＳＤＨは特にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．から得ることができ、そして還元条件下においてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）によって決定し、約２７ないし３０ｋＤのような約２６ｋＤより大きい、特に２６．５ｋＤより大きい分子量を持っている。それらは特に１２α−ＨＳＤＨ長鎖バージョンについて約２９ｋＤより大きい、特に２９．３５９ｋＤのような約２９．１ないし２９．５ｋＤの、または１２α−ＨＳＤＨ短鎖バージョンについて２７．８の計算分子量を有する。ここでは分子量の詳細はそれに限られないが酵素のサブユニットに関し、天然タンパクは例えば大体同じサイズのサブユニット４から構成される。
【0078】
特にそのようなタンパクはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．グループＰ株４８−５０（ＤＳＭ４０２９）から得られる。この酵素は、例えば２０ないし１００Ｕ／ｍｇまたは２５ないし８５Ｕ／ｍｇのような約１０，１５，２０または２５Ｕ／ｍｇより大きい範囲の比活性において調製される。比活性の決定は実験の部に示した標準条件下に実施される。
【0079】
本発明に従えば、特に以下のアミノ酸配列モチーフを含む１２α−ＨＳＤＨが使用される。ａ）ＬＩＮＮ
ｂ）ＲＭＧＩＦＤ
ｃ）（１）ＭＤＦＩＤＦＫＥＭＧＲＭＧＩＦＤＧＫＶＡＩＩＴＧＧＧＫＡＫＳＩＧＹＧＩＡＶＡＹＡＫ
（２）ＭＤＧＦＩＤＦＫＥＭＧＲＭＧＩ
（３）ＩＴＧＧＧＫＡＫＳＩＧＹＧＩＡ
（４）ＩＦＤＧＫ
（５）ＧＩＦＤＧＫ
から選ばれたＮ−末端配列
ｄ）ＦＧＤＰＥＬＤＩ，または例えばＧＤＰＥＬＤＩ，ＦＧＤＰＥＬＤ，ＤＰＥＬＤＩ， ＦＧＤＰＥＬ，ＧＤＰＥＬ，ＤＰＥＬＤ，ＧＤＰＥＬＤ
【0080】
さらに本発明に従って使用される１２α−ＨＳＤＨは、Ｘが任意のアミノ酸残基を表すＴＧＸ３ＧＸＧタイプのＮ末端（すなわち約１ないし３０アミノ酸残基のＮ−末端の領域を含んでいないことを特徴としている。
【0081】
特に以下の１２α−ＨＳＤＨが使用される。ａ）各場合位置＋１また＋２から始まって配列同定番号１２，１４または１６に従ったアミノ酸配列の一つを含むもの；または
ｂ）少なくとも６０％の配列同一度パーセントを有する、ａ）に従った配列から誘導されたアミノ酸配列を含むもの；または
ｃ）アミノ酸配列ａ）およびｂ）に従ったタンパクコードする核酸配列によってコードされたもの；または
ｄ）配列同定番号１１，１３または１５に従ったコードする核酸配列により、または発現のため使用される微生物のそれぞれのコドン使用に適応させたそれから誘導された配列によりコードされたもの；または
ｅ）少なくとも６０％の配列同一度パーセントを有する、配列同定番号１１，１３または１５に従った核配配列の一つから誘導されたコードする配列によってコードされたもの。
【0082】
コドン使用に対する核酸配列の適応化は例えばｈｔｔｐ：／／ｓｌａｍ．ｂｓ．ｊｈｍｉ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｇｄＲｅｖＴｒａｎｓ．ｃｇｉ．においてアクセス可能な慣用方法に従って実施することができる。
【0083】
修飾した共基質使用および／または減少した生成物阻害を有する１２α−ＨＳＤＨ突然変異体も使用することができ、そして特に配列モチーフＶＬＴＧＲＮＥ中の共基質使用を修飾する少なくとも一つの突然変更を持つ、上の定義に従った１２α−ヒドロキシステロイドデヒドゲナーゼから誘導された突然変異体を使用することができる。そのような突然変異体の非限定例は、このモチーフ中少なくとも一つの以下のアミノ酸置換：Ｇ→Ｄ；Ｒ→Ａを有するもの、および例えば少なくとも配列同定番号１６の位置９８または１００に対応するアミノ酸Ｑの突然変異を含む、特に配列同定番号１６中のＱ９８Ｈに対応する突然変異を含むような、酵素の基質結合ポケットを形成するアミノ酸残基の領域における生成物阻害を減少させる少なくとも突然変異を持つ突然変異体を含む。
【0084】
位置９８（配列同定番号１６に基づいて）におけるさらなる可能なアミノ酸置換は、Ａ，Ｎ，Ｄ，Ｃ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｍ，Ｓ，Ｔ，Ｖを含む。本発明に従った１２α−ＨＳＤＨの相同性モデルに基づいて、置換は生成物のカルボキシル結合の弱化へ導くものと推測される。それ故、隣接位置Ｓ１００（配列同定番号１６に基づいて）も以下のアミノ酸Ａ，Ｎ，Ｄ，Ｃ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｍ，Ｔ，Ｖ，Ｋへ突然変異された。
【0085】
本発明に従った１２α−ＨＳＤＨのグループは、このように、Ｑ→Ａ，Ｎ，Ｄ，Ｃ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｍ，Ｓ，Ｔ，Ｖ；
Ｓ→Ａ，Ｎ，Ｄ，Ｃ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｍ，Ｔ，Ｖ，Ｋ；
から選ばれた位置９８または１００（配列同定番号１６に基づいて）における一または二の突然変異を含む。
【0086】
２．２ ７β−ＨＳＤＨ類７β−ＨＳＤＨ類は本出願人のＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６８５７６に記載されている。嫌気性細菌、特にＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ ３９７９（ＡＴＣＣ２５９８６）のようなＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ属から得ることができる７β−ＨＳＤＨは配列番号２５に従ったアミノ酸配列およびそれから誘導される機能的均等物を含む。
【0087】
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ３９７９から得られる７β−ＨＳＤＨは以下の性質の少なくとも一つ、例えばそのような性質の２，３，４，５，６，７またはすべてによって特徴付けられる。ａ）分子量（ＳＤＳゲル電気泳動）：約２８−３２ｋＤａ，特に２９−３１ｋＤａ，特に約３０ｋＤａ；
ｂ）分子量（特にＳＤＳ不存在下のような非変性条件下でのゲル濾過）；約５３ないし６０ｋＤａ、特に５５ないし５７ｋＤａ、例えば５６．１ｋＤａ；これにより本発明に従った７β−ＨＳＤＨは、４５ｋＤａのＨｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．（上を見よ）によって記載されたＣ．ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２５９８６からの７β−ＨＳＤＨ酵素と明らかに異なる。これはＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ３９７９からの７β−ＨＳＤＨのダイマー性格（四次元構造）を確認する。
ｃ）７−ケト−ＬＣＡのカルボニル基の７β−ヒドロキシル基への立体特異性還元；
ｄ）ｐＨ８．５ないし１０．５、特に９ないし１０の範囲のＵＤＣＡ酸化のための至適ｐＨ；
ｅ）ｐＨ３．５ないし６．５、特にｐＨ４ないし６の範囲のＤＨＣＡおよび７−ケト−ＬＣＡの還元のための至適ｐＨ；これにより驚くべきことにｐＨの選択による酸化（特徴（ｄ））および還元操作へ影響させる可能性が与えられる。
ｆ）各場合以下の表に述べた値の±２０％、特に±１０％、±５％、±３％、±２％または１％範囲内のここで述べた基質／助因子の少なくとも一つに対する下表からの動力学パラメータの少なくとも一つ；
【0088】
【表2】
ｂ）１Ｕ＝１μｍｏｌ／分
ｃ）これにより本発明に従った酵素は、明らかに低いＫｍおよびＶｍａｘ値（０．４および０．２）が記載され、そしてＮＡＤＨに対しては活性が、測定できなかったＨｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．（上を見よ）によって記載されたＣ．ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２５９８６からの７β−ＨＳＤＨ酵素とは明らかに異なる。
【0089】
ｇ）Ｃａｖｉａ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ， Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓおよびＭｕｓ ｍｕｓｕｌｕｓ を含む、動物１１β−ＨＳＤＨサブグループに関連するＣ．ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ３９７９からの生核生物７β−ＨＳＤＨの分子進化配列；
【0090】
例えば、本発明に従った７β−ＨＳＤＨは以下の性質または性質の組合せを示す。ａ）；ｂ）；ａ）およびｂ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）およびｅ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）およびｅ）およびｆ）。
【0091】
そのような７β−ＨＳＤＨは７−ケトステロイドの対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異性還元（水素化）および／またはステロイド構造上に７位と少なくともさらなるケト基を含んでいるケトステロイドの対応する７β−ヒドロキシステロイドへのレジオ特異性水素化（還元）、例えばデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）の７位の対応する３，１２−７β−コラン酸の対応する３，１２−ジケト−７β−コラン酸塩への還元を触媒し、そして例えばＮＡＤＰＨ依存性である。
【0092】
好適な７β−ＨＳＤＨは配列同定番号２５（アクセッション番号ＺＰ＿０１７７３０６１）に従ったアミノ酸配列、またはこの配列に対し、例えば少なくとも６５，７０，７５，８０，８５または９０のような、例えば少なくとも９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９および９９．５％の同一度を持ち、任意に付加的に上の定義に従った以下の性質または組み合わせによって特徴化される配列から誘導される配列を持つ。
【0093】
２．３ 他のタンパク本発明は、例えば３α−，３β−，７β−，１１α−，１１β−，１２α−，１２β−，１７α−，１７β−，２０α−，または２０β−ＨＳＤＨ、特に３α−，７β−，または１２α−ＨＳＤＨ活性を有する実際に記載したタンパクまたは酵素に限定されず、反対にそれらの機能的均等物にも及ぶ。
【0094】
本発明の文脈において実際に記載された酵素の“機能的均等物”またはアナログは、実際に記載された酵素とは異なるが、例えば７β−または１２α−ＨＳＤＨ活性のような所望の生物学的活性を有するポリペプチドである。
【0095】
このため例えば“機能的均等物”とは７β−または１２α−ＨＳＤＨのようなＨＳＤＨ活性のために使用されるテストにおいて少なくとも１％、例えば少なくとも１０％または２０％、例えば少なくとも５０％または７０％または９０％高いまたは低い酵素活性を有し、ここで規定したアミノ配列を含む酵素を意味するものと理解すべきである。機能的均等物はさらに、好ましくはｐＨ４ないし１１の間において安定であり、そしてｐＨ６ないし１０、特に８．５ないし９．５の範囲に至適ｐＨを有し、そして１５℃ないし８０℃または２０℃ないし７０℃、例えば約４５ないし６０℃または約５０ないし５５℃の範囲に至適温度を有する。
【0096】
７β−または１２α−ＨＳＤＨ活性のようなＨＳＤＨ活性は、種々の既知テストにより検出することができる。限定しないが、例えば実験の部に規定したような標準化条件下、例えばコール酸のような参照基質を使用するテストを挙げることができる。
【0097】
本発明に従い、“機能的均等物”とは、前述したアミノ酸配列の少なくとも１配列位置において実際に挙げた以外の異なるアミノ酸を有し、しかしながら前述の生物学的活性の一つを有する“突然変異体”をも含む。このため“突然変異体”は一以上のアミノ酸の付加、置換、欠失および／または逆位によって得ることができる突然変異体を含み、ここで挙げた変化はそれらが本発明に従った性質プロフィルを有する突然変異体へ導く限り、どの配列位置でも起こることができる。特にもし突然変異体と未変化ポリペプチドの間の反応パターンが定性的に一致するならば、すなわち例えば同じ基質が異なる速度で変換されるならば、その時機能的均等物が達成される。好適なアミノ酸置換の例は以下の表に要約されている。
【0098】
【表3】
【0099】
上の意味で"機能的均等物"は記載したポリペプチドおよび機能的均等物の"前駆体"および該ポリペプチドの"塩"でもある。
【0100】
ここで"前駆体"は、所望の生物学的活性有り無しのポリペプチドの天然または合成前駆体である。
【0101】
表現"塩"は、本発明に従ったタンパク分子のカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は公知の態様で調製することができ、そして例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄および亜鉛塩のような無機塩、および例えばトリエタノールアミン、アルギニン、リジン、ピペリジン等のような有機塩基との塩を含む。同様に本発明は、塩酸または硫酸のような鉱酸との塩、および酢酸およびシュウ酸のような有機酸との塩のような酸付加塩にも関する。
【0102】
本発明に従ったポリペプチドの"機能性誘導体"は、公知の技術によって機能性アミノ酸側鎖上またはそれらのＮ−またはＣ−末端に生成させることができる。そのような誘導体は、例えば、カルボキシル基の脂肪族エステル；アンモニアまたは１級または２級アミンとの反応によって得られるカルボキシル基のアミド；アシル基との反応によって調製される遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、またはアシル基との反応によって調製された遊離ヒドロキシ基のＯ−アシル誘導体を含む。
【0103】
"機能的均等物"は、勿論他の生物からアクセスし得るポリペプチドと、天然に存在する変種をも含む。例えば、相同性配列領域の範囲は配列比較によって確立することができ、均等酵素は本発明の詳細な説明によって決定することができる。
【0104】
同様に"機能的均等物"は、例えば所望の生物学的機能を有する、本発明に従ったポリペプチドのフラグメント、好ましくは個々のドメインまたは配列モチーフを含む。
【0105】
"機能的均等物"はさらに、前述したポリペプチド配列の一つまたはそれからの機能的均等物と、機能的Ｎ−またはＣ−末端結合において機能的に異なる少なくとも一つのさらなる非相同性配列を含む融合タンパク（すなわち融合タンパク部分の相互に有意な損傷なしの）である。そのような非相同配列の非限定例は、シグナルペプチド、ヒスチジンアンカーまたは酵素である。
【0106】
本発明に従って付加的に含まれた"機能的均等物"は、実際に開示されたタンパクの相同体を含む。これらは、実際に開示されたアミノ酸配列の一つに対して、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），１９８８，２４４４−２４４８のアルゴリズムに従って計算し、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、特に９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８または９９％の相同性（同一性）を持っている。本発明に従った相同ペプチドの相同性または同一性は、特にここに実際に記載されたアミノ酸配列の一つの全長に対する、同一アミノ酸残基のパーセンテージを意味する。
【0107】
パーセンテージ同定値は、ＢＬＡＳＴアライメント、アルゴリズムｂｌａｓｔｐ（タンパク−タンパクＢＬＡＳＴ）により、または後で示すＣｌｕｓｔａｌアジャストメントの使用によって決定とすることができる。
【0108】
可能性あるタンパクグリコシル化の場合、本発明に従った"機能的均等物"は、脱グリコシル化したまたはグリコシル化した形およびグリコシル化パターンの変化によって得られる修飾形において上で指定したタイプのタンパクを含む。
【0109】
本発明に従ったタンパクまたはポリペプチドの相同体は、突然変異生成により、例えば点突然変異、タンパクの伸長またはトランケーションによって生成させることができる。
【0110】
本発明に従ったタンパクの相同体は、例えばトランケーション突然変異体のようなコンビナトリアルバンクのスクリーニングによって同定することができる。例えば、タンパク変種の斑入りバンクは、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的リゲーションにより、核酸レベルにおけるコンビナトリアル突然変異生成によって生成させることができる。退化オリゴヌクレオチド配列から可能性ある相同体のバンクの生成のために使用できる多数のプロセスが存在する。退化遺伝子配列の化学合成はＤＮＡシンセサイザー中で実施することができ、そして次に合成遺伝子は好適な発現ベクター中へリゲートすることができる。遺伝子の退化セットの使用は、可能性あるタンパク配列の所望のセットをコードする混合物中にすべての配列の生成を可能にする。退化オリゴヌクレオチドの合成方法は当業者に知られている（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：４７７）。
【0111】
点突然変異またはトランケーションによって生成させたコンビナトリアルバンクの遺伝子生産物のスクリーニングのための、および選択された性質を有する遺伝子生産物のｃＤＮＡバンクのスクリーニングのためのいくつかの技術が先行技術において知られている。これらの技術は、本発明に従った相同体のコンビナトリアル突然変異生成によって生産された遺伝子バンクの急速スクリーニングに適応化させることができる。高いスループットで分析が行われる大きな遺伝子バンクのスクリーニングのために最も頻繁に使用される技術は、複製可能な発現ベクター中への遺伝子バンクのクローニング、生成したベクターバンクでの適当な細胞の形質転換、および所望の活性の検出がその生産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易化する条件下でコンビナトリアル遺伝子の発現を含む、バンク中の機能的突然変異体の頻度を増大させる技術である、Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｍｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｉｓ（ＲＥＭ）をスクリーニングテストと組み合わせて相同体を同定するために使用することができる（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｒｖａｎ（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３）：３２７−３３１）。
【0112】
３．核酸および構造体３．１ 核酸
本発明はまた、例えば３α−，３β−，７β−，１１α−，１１β−，１２α−，１２β−，１７α−，１７β−，２０α−または２０β−ＨＳＤＨ活性、特に３α−，７β−または１２α−ＨＳＤＨ活性のようなＨＳＤＨ活性を有する酵素をコードする核酸配列、または本発明に従ったノックアウト突然変異体の生産に使用される構造体に関する。
【0113】
本発明はまた、ここに記載した実際の配列に対し一定の程度の同一性を有する核酸に関する。
【0114】
二つの核酸間の"同一性"は、各場合核酸全長にわたってヌクレオチドの同一性を意味し、特に以下のパラメータで調節した、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄを使用するＩｎｆｏｒｍａｘ社（ＵＳＡ）のＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ ７．１ソフトウエア（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ，Ｓｈａｒｐ ＰＭ．Ｆａｓｔ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｏｎ ａ ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒ．Ｃｏｍｐｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１９８９ Ａｐｒ；５（２）：１５１−１）の助けによる比較によって計算した同一性を意味する。
【0115】
マルチプルアライメントパラメータ：ギャップオープニングペナルティ １０
ギャップエキステンションペナルティ １０
ギャップセパレーションペナルティ範囲 ８
ギャップセパレーションペナルティ オフ
アライメント遅延のための％アイデンティティ ４０
残基特異性ギャップ オフ
親水性残基ギャップ オフ
トランジション計量 ０
対アライメントパラメータ：
ＦＡＳＴ アルゴリズム オン
Ｋ−ｔｕｐｌｅ サイズ １
ギャップペナルティ ３
ウインドウサイズ ５
ベストダイアゴナルの数 ５
【0116】
これに代って、同一性は以下のパラメータをもって、Ｃｈｅｎｎａ，Ｒａｍｕ，Ｓｕｇａｗａｒａ Ｈｉｄｅａｋｉ，Ｋｏｉｋｅ Ｔａｄａｓｈｉ，Ｌｏｐｅｚ，Ｒｏｄｏｒｉｇｏ，Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔｏｂｙ Ｊ，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄｅｓｍｏｎｄ Ｇ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊｕｌｉｅ Ｄ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｃｌｕｓｔａｌ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｇａｍｓ（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１（１３）：３４９７−５００；インターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＃に従って決定することができる。
【0117】
ＤＮＡギャップオープンペナルティ １５．０ＤＮＡギャップエキステンションペナルティ ６．６６
ＤＮＡマトリックス アイデンティティ
タンパクギャップオープンペナルティ １０．０
タンパクギャップエキステンションペナルティ ０．２
タンパクマトリックス Ｇｏｎｎｅｔ
タンパク／ＤＮＡ ＥＮＤＧＡＰ −１
タンパク／ＤＮＡ ＧＡＰＤＩＳＴ ４
【0118】
ここで述べたすべての核酸配列（例えばｃＤＮＡおよびｍＲＮＡのような１本鎖または２本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、例えば二重らせんの個々の重複する相補的核酸構造単位のフラグメント縮合によるような、ヌクレオチド構造単位からの化学合成によってそれ自体公知の態様で生産することができる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば、ホスホアミダイト法（Ｖｏｅｔ，Ｖｏｅｔ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．８９６−８９７）に従って公知の態様で実施することができる。合成オリゴヌクレオチドの付加と、ＤＮＡポリメラーゼおよびリゲーション反応のＫｌｅｎｏｗフラグメントによるギャップの充填、および一般クローニング方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【0119】
本発明は、上記ポリペプチドの一つ、および例えば合成ヌクレオチドアナログを用いてアクセス可能なそれらの機能的均等物をコードする核酸配列（例えばｃＤＮＡおよびｍＲＮＡのような１本鎖および２本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ）に関する。
【0120】
本発明は、本発明に従ったポリペプチドおよびタンパクまたは生物学的に活性なそれらのセクションをコードする単離された核酸分子と、例えば本発明に従ったコードする核酸の同定または増幅のためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用することができる核酸フラグメントの両方に関する。
【0121】
本発明に従った核酸分子は、さらに暗号遺伝子領域の３'−および／または５'−端に翻訳されない配列を含むことができる。
【0122】
さらに本発明は、実際に記載された核酸配列およびそのセクションに対し相補的な核酸分子またはその部分を含む。
【0123】
本発明に従ったヌクレオチド配列は、他の細胞タイプおよび生物中の相同性配列の同定および／またはクローニングに使用することができるプローブおよびプライマーの生産を可能にする。そのようなプローブまたはプライマーは、通常"厳格"な条件下、本発明に従った核酸配列のセンスストランドの、または対応するアンチセンスストランドの少なくとも約１２，好ましくは約２５，例えば４０，５０または７５の連続するヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含んでいる。
【0124】
"単離"された核酸分子が核酸の天然源中に存在する他の核酸分子から分離され、そしてもしそれが組換え技術によって生産されるならば他の細胞物質または培地が実質上皆無にされるか、またはもしそれが化学的に合成されるならば化学的前駆体または他の化学品が実質上皆無にされることでできる。
【0125】
本発明に従った核酸分子は、分子生物学的に標準技術によって単離されることができ、そして配列情報が本発明によって提供される。例えば、ｃＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブとして実際に開示した完成した配列の一つまたはその部分と、そして標準ハイブリダイゼーション技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｓｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．１９８９に記載されいるような）を使用することによって適当なｃＤＮＡバンクから単離することができる。さらに、開示した配列の一つまたはその部分を含んでいる核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができ、この配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチドプライマーが使用される。このようにして増幅された核酸は適当なベクターにクローンされ、そしてＤＮＡ配列分析によって特徴化される。本発明に従ったオリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡシンセサイザーを使用して標準合成プロセスによって生産されることができる。
【0126】
本発明に従った核酸配列またはその誘導体、これらの配列の相同体およびその部分は、他の細菌から、例えばゲノムまたはｃＤＮＡバンクを用い、慣用のハイブリダイゼーションプロセスまたはＰＣＲ技術を使用して単離することができる。
【0127】
"ハイブリダイズ"とは、ポリマーまたはオリゴヌクレオチドが、標準条件下で大部分相補的な配列へ結合する能力を意味し、非相補的パートナー間の非特異性結合はこれら条件下では抑制される。このため、配列は９０〜１００％相補的であることができる。相互に特異的に結合し得る相補配列の性質は、例えばノーザンまたはサウザンブロット技術またはＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲにおいてプライマー結合において使用される。
【0128】
ハイブリダイゼーションのため、保存された領域の短いオリゴヌクレオチドが有利に使用される。しかしながら、ハイブリダイゼーションのため、本発明に従った核酸のもっと長いフラグメントまたは完全な配列を使用することも可能である。これらの標準的条件は使用する核酸に従って（オリゴヌクレオチド、長いフラグメント、または完全な配列）変動し、またはどのタイプの核酸、ＤＮＡかＲＮＡが使用されるかによって変動する。このため、例えばＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのための溶融温度は、同じ長さのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのそれよりも約１０℃低い。
【0129】
標準的条件は、例えば、核酸に従い、０．１ないし５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の濃度を有する水性緩衝溶液中４２ないし５８℃の温度、または付加的に５０％ホルムアミドの存在下、例えば５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド中４２℃の温度を意味する。有利には、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、０．１×ＳＳＣと約３０℃ないし４５℃の温度である。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドについては、ハイブリダイゼーション条件は、有利には０．１×ＳＳＣと約３０℃ないし５５℃、好ましくは４５℃ないし５５℃の温度である。ハイブリダイゼーションのためのこれらの規定した温度は、例示であって、約１００ヌクレオチドの長さと、Ｇ+Ｃ含量５０％の核酸のためのホルムアミド不存在下の計算された溶融温度である。ＤＮＡハイブリダイゼーションのための実験条件は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ"，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９のような遺伝子学の教科書に記載されており、そして例えば核酸の長さ、ハイブリッドの性格またはＧ+Ｃ含量に応じて当業者に知られた式に従って計算することができる。当業者はさらにハイブリダイゼーションについての情報を以下の教科書から推論することができる。
【0130】
Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１９８５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（ｅｄｓ），１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｂｒｏｗｎ（ｅｄ），１９９１，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ
【0131】
"ハイブリダイゼーション"は特に、厳格な条件下で実施することができる。そのようなハイブリダイゼーション条件は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９，９．３１−９．５またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に記載されている。
【0132】
"厳格な"ハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ，７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％デキストランサルフェートおよび変性したサケ精子ＤＮＡ２０ｇ／ｍｌ中４２℃でのインキュベーションと、６５℃において、０．１×ＳＳＣを使用し、フィルター上の洗浄ステップを意味すると理解すべきである。
【0133】
本発明はまた、実際に開示された、または誘導し得る核酸配列の誘導体に関する。
【0134】
このように本発明に従ったさらなる核酸配列は、例えば配列同定番号１ないし９，１１，１３，１５，１７ないし２２，２４，２６，２７，２８，３０および３３ないし３７から誘導することができ、そして単一または多数のヌクレオチドの付加、置換、挿入また欠失によってそれらから区別することができるが、しかし所望の性質プロフィルを有するポリペプチドをさらにコードすることができる。
【0135】
本発明に従えば、実際に挙げた配列、および例えば天然に存在する変種、例えばそれらのスプライス変種または対立遺伝子変種のような天然に存在する変種と比較して、“サイレント”突然変異を含む。または特別の起源または宿主生物のコドン使用に対応して修飾された核酸配列が含まれる。
【0136】
同様に本発明は、保守的ヌクレオチド置換（すなわち関係するアミノ酸が同じ電荷、サイズ、極性および／または溶解度のアミノ酸によって置換される）によって得ることできる配列に関する。
【0137】
本発明はまた、実際に開示された核酸の配列多形によって誘導された分子に関する。これらの遺伝子多形は天然変異による集団内の個々間に存在することができる。これら天然の変異は慣例的に遺伝子の核酸配列中に１ないし５％の変動を生ずる。
【0138】
本発明に従った前述の核酸配列の誘導体は、誘導されたアミノ酸レベルにおいて全体の配列範囲にわたって少なくとも６０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、非常に好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する例えば対立遺伝子変動を意味するものと理解すべきである（アミノ酸レベルの相同性に関し、ポリペプチドのための前出の具体例を参照することができる。）。有利には、相同性は配列のサブエリアより高いことができる。
【0139】
さらに誘導体は、例えばプロモーターとの融合を意味するものと理解すべきである。指示した核酸配列の上流に位置するプロモーターは、プロモーターの機能または効率を傷つけることなく、少なくとも１個のヌクレオチド置換、少なくとも１個の挿入、逆位および／または欠失によって修飾することができる。加えて、プロモーターはそれらの配列の修飾によってそれらの活性を増加されることができ、または外来生物が一層活性なプロモーターによって完全に置換されることができる。
【0140】
さらに機能性突然変異体の生産は当業者に既知である。
【0141】
使用される技術に応じて、当業者は遺伝子中または代って非コーディング核酸領域（これは例えば発現の調節のために重要である）中にランダムなまたはもっとターゲット化した突然変異体を完全に導入することができ、そして後で遺伝子バンクを創製することができる。このために必要な分子生物学的方法は当業者に既知であり、そして例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１に記載されている。
【0142】
遺伝子の修飾およびこれらによってコードされるタンパクの修飾方法は永年当業者に熟知されており、例えば以下を含む。
【0143】
−遺伝子の一つまたは多数のヌクレオチドが標的化された態様で置換される部位特異性変異生成（Ｔｒｏｗｅｒ ＭＫ（Ｅｄ．）１９９６；Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）
【0144】
−所望のアミノ酸のためのコドンが遺伝子の任意の望む部位において置換または付加される既知変異生成（Ｋｅｇｌｅｒ−Ｅｂｏ ＤＭ，Ｄｏｃｋｔｏｒ ＣＭ，ＤｉＭａｉｏ Ｄ（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２：１５９３；Ｂａｒｅｔｔｉｎｏ Ｄ，Ｆｅｉｇｅｎｂｕｔｚ Ｍ， Ｖａｌｃａｒｅｌ Ｒ， Ｓｔｕｎｎｅｎｂｅｒｇ ＨＧ（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２：５４１；Ｂａｒｉｋ Ｓ （１９９５） Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３：１）
【0145】
−核酸配列がエラープローンポリメラーゼ連鎖反応によって変異されるエラープローンポリメラーゼ連鎖反応（エラープローンＰＣＲ）（Ｅｃｋｅｒｔ ＫＡ，Ｋｕｎｎｋｅｌ ＴＡ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８：３７３９）
【0146】
−例えば核酸配列の増加した変異率が欠陥ＤＮＡ修復メカニズムのために発生するミューテーター株中の遺伝子の通過（Ｇｒｅｅｎｅｒ Ａ，Ｃａｌｌａｈａｎ Ｍ，Ｊｅｒｐｓｅｔｈ Ｂ（１９９６）Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｕｓｉｎｇ ａｎ Ｅ．ｃｏｌｉｍｕｔａｔｏｒ ｓｔｒａｉｎ．Ｉｎ：Ｔｒｏｗｅｒ ＭＫ（Ｅｄ．）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈａｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ），または
【0147】
−密接に関連した遺伝子が生成され、消化され、そしてフラグメントがポリメラーゼ連鎖反応のための鋳型として使用され、繰り返したストランド分離および再接近によって全長さのモザイク遺伝子が最後につくられるＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰＣ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９；Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰＣ（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９１：１０７４７）。
【0148】
“指令した進化”を使用し（Ｒｅｅｔｚ ＭＴ ａｎｄ Ｊａｅｇｅｒ Ｋ−Ｅ（１９９９）， Ｔｏｐｉｃｓ Ｃｕｒｒ Ｃｈｅｍ ２００：３１； Ｚｈａｏ Ｈ，Ｍｏｏｒｅ ＪＣ， Ｖｏｌｋｏｖ ＡＡ， Ａｒｎｏｌｄ ＦＨ（１９９９），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ， ｉｎ； Ｄｅｍａｉｎ ＡＬ， Ｄａｖｉｅｓ ＪＥ（Ｅｄ．）Ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙに記載されている）当業者は機能的突然変異体を選択した態様で、そして大スケールで製造することができる。ここでは、第１工程においてそれぞれのタンパクの遺伝子バンクが製造され、そこでは上に示した方法を使用することができる。遺伝子バンクは適当な態様に、例えば細菌により、またはファージディスプレーシステムによって発現される。
【0149】
大部分所望の性質に相当する性質を有する機能性突然変異体を発現する宿主生物の関心ある遺伝子は突然変異のさらなるラウンドに服させることができる。この変異のステップおよびスクリーニングのステップは現在の機能的突然変異体が適当な程度まで所望の性質を持つまで反復的に繰り返すことができる。この反復操作により、限られた数の変異、例えば１ないし５の変異を段階的に実施することができ、そして関心ある酵素性質に対するそれらの影響について評価され、選択される。選択された突然変異体は次に同じ態様でさらなる変異ステップに服される。これによって検討すべき個の突然変異体の数を有意に減らすことができる。
【0150】
本発明に従った結果は、所望の修飾した性質を有するさらなる酵素を選択的に生成させるために必要な、関心ある酵素の構造および配列に関する重要な情報を収穫する。特に“ホットスポット”、すなわち選択した変異の導入によって酵素性質を修飾するために潜在的に適した配列部分を規定することができる。
【0151】
本発明に従ったＨＳＤＨのホットスポット領域の非限定例を以下に要約する。３５−４０、特に３７−３８（各場合ＨＳＤＨ＿ショート（配列同定番号１４）のアミノ酸配列に基づいて）
９０−１０５、９３−１００または９６−１００、特に９７および／または９８（各場合ＨＳＤＨ＿ショート（配列同定番号１４）のアミノ酸配列に基づいて）
【0152】
３．２． 構造体本発明はさらに、調節核酸配列の遺伝子コントロールのもとに本発明に従ったポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現構造体、および少なくとも一つのこれらの発現構造体を含むベクターに関する。
【0153】
“発現ユニット”とは、本発明に従って、ここで規定し、そして発現すべき核酸または遺伝子へ機能的に連結された後、発現を調節する、すなわちこの核酸またはこの遺伝子の転写および翻訳を調節するプロモーターを含んでいる、発現活性を有している核酸を意味するものと理解すべきである。それ故これを“調節核酸配列”ということもできる。プロモーターに加え、例えばエンハンサーのようなさらなる調節エレメントが存在することができる。
【0154】
本発明に従えば、“発現カセット”または“発現構造体”とは、発現すべき核酸または発現すべき遺伝子へ機能的に連結されたまたは発現すべき遺伝子へ機能的に連結された発現ユニットを意味するものと理解すべきである。発現ユニットと対照的に、発現カセットはこのため、転写および翻訳を調節する核酸配列のみならず、転写および翻訳の結果タンパクとして発現される核酸配列をも含む。
【0155】
本発明の文脈において、術語“発現”または“過発現”は、対応するＤＮＡによってコード化される微生物中の一以上の酵素の細胞内活性の生産および増加を記載する。この目的で、例えば遺伝子を生物へ導入することができ、存在する遺伝子を他の遺伝子で置換することができ、遺伝子のコピー数を増加することができ、強力なプロモーターを使用することができ、または高い活性を有する対応する酵素をコードする遺伝子を使用することができ、そしてこれらの方策は任意に組み合わせることができる。
【0156】
好ましくは、本発明に従ったそのような構造体は、それぞれのコード化配列の５’−上流のプロモーターと、３’−下流のターミネーター配列と、そして任意に慣用の調節エレメント、すなわち各場合コード化配列へ作用的に連結された調節エレメントを含む。
【0157】
本発明に従えば、“プロモーター”、“プロモーター活性を有する核酸”、または“プロモーター配列”は、転写すべき核酸との機能的連結において核酸の転写を調節する核酸の意味であると理解すべきである。
【0158】
“機能的”または“作用的”連結は、例えば核酸の転写を保証する核酸配列と、そして例えばターミネーターのように、プロモーター活性を有する核酸の一つと、転写すべき核酸配列と、そして任意の調節エレメントの配列とが、調節エレメントの各自が核酸配列の転写においてその機能を充足するように配置された配列を意味するものと理解すべきである。この目的のため、化学的意味での直接連結は絶対的に必要ではない。例えばエンハンサー配列のような遺伝子制御配列は、標的配列においてさらに除去された位置において、または他のＤＮＡ分子からそれらの機能を発揮することができる。転写される核酸配列がプロモーター配列の後に（すなわち３’−末端側に）配置され、そのため両方の配列が共有結合で連結されることが好ましい。ここでは、プロモーター配列と、発現すべき核酸配列の間の距離は、２００塩基対未満、または１００塩基対以下、または５０塩基対以下であることができる。
【0159】
プロモーターおよびターミネーターに加え、挙げることができるさらなる調節エレメントの例は、標的化配列、エンハンサー、ポリアデニル化信号、選択できるマーカー、増幅信号、複製起源等を含む。好適な調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。
【0160】
特に本発明に従った構造体は、配列同定番号１１，１３または１５、またはこれの誘導体および相同体と、そして遺伝子発現の制御、例えば増大のため有利には一以上の調節信号と作用的または機能的に連結されたそれから誘導し得る核酸配列を含む。
【0161】
これらの調節配列に加え、これら配列の天然の調節が実際の構造遺伝子以前に存在することができ、そして天然調節がスイッチオフされ、遺伝子発現が増大されるように任意に遺伝子的に修飾されることができる。しかしながら核酸構造体は、もっと簡単に、すなわち追加の調節信号がコード化配列の前に挿入されず、そしてその調節を有する天然プロモーターが除去されずに構築することができる。これに代って、天然調節配列は、もはや調節が行われず、そして遺伝子発現が増大されるように突然変異される。
【0162】
好ましい核酸構造体は、有利には、核酸配列の増大した発現を可能にするプロモーターへ機能的に連結された既に述べた“エンハンサー”の一つ以上を含んでいる。さらなる調節エレメントまたはターミネーターのような、追加的有益配列をＤＮＡ配列の３'−末端へ挿入することもできる。本発明に従った核酸は、構造体中に１以上のコピーで存在することができる。構造体の任意の選択のため、抗生物質耐性または栄養補給性を補足する遺伝子のようなさらなるマーカーが構造体中に存在することができる。
【0163】
ｃｏｓ，ｔａｃ，ｔｒｐ，ｔｅｔ，ｔｒｐ−ｔｅｔ，ｌｐｐ，ｌａｃ，ｌｐｐ−ｌａｃ，ｌａｃｌｑ，Ｔ７，Ｔ５，Ｔ３，ｇａｌ，ｔｒｃ，ａｒａ，ｒｈａＰ，（ｒｈａＰＢＡＤ）ＳＰ６，ラムダ−ＰＲのようなプロモーター中に、またはラムダーＰＬプロモーター中に好適な調節配列の例が存在する。これらはグラム陰性細菌に有利に使用される。さらなる有利な調節配列は、イーストまたはカビプロモーターＡＤＣ１，ＭＦアルファ，ＡＣ，Ｐ−６０，ＣＹＣ１，ＧＡＰＤＨ，ＴＥＦ，ｒｐ２８およびＡＤＨ中のグラム陽性プロモーター中に存在する。人工プロモーターも調節のために使用し得る。
【0164】
宿主生物中に発現のため、核酸構造体は、有利には、例えば宿主中で遺伝子の最適で発現を可能にするプラスミドまたはファージのようなベクター中に挿入される。プラスミドおよびファージのほかに、ベクターは、当業者に知られたすべての他のベクター、例えばＳＶ４０，ＣＭＶ，バキュロウイルスおよびアデノウイルスのようなウイルス、トランスポソン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、および鎖状またはサークル状ＤＮＡを意味するものと理解すべきである。これらのベクターは宿主生物中で自発的に複製または染色体的に複製されることができる。これらのベクターは本発明のさらなる具体例を代表する。
【0165】
好適なプラスミドは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ中のｐＥＴ２８ａ（＋），ｐＬＧ３３８，ｐＡＣＹＣ１８４，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９，ｐＫＣ３０，ｐＲｅｐ４，ｐＨＳ１，ｐＫＫ２２３−３，ｐＤＨＥ１９．２，ｐＨＳ２，ｐＰＬｃ２３６，ｐＭＢＬ２４，ｐＬＧ２００，ｐＵＲ２９０，ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１，λｇｔ１１；ストレプトミセス中のｐＩＪ１０１，ｐＩＪ３６４，ｐＩＪ７０２またはｐＩＪ３６１；バチルス中のｐＵＢ１１０，ｐＣ１９４またはｐＢＤ２１４；コリネバクテリウム中のｐＳＡ７７またはｐＡＪ６６７；カビ中のｐＡＬＳ１，ｐＩＬ２またはｐＢＢ１１６；イースト中の２αＭ，ｐＡＧ−１，ＹＥｐ６，ＹＥｐ１３またはｐＥＭＢＬＹｅ２３；または植物中のｐＬＧＶ２３，ｐＧＨＩａｃ＋，ｐＢＩＮ１９，ｐＡＫ２００４またはｐＤＨ５１である。言及したプラスミドは可能性あるプラスミドの小さな選択である。さらなるプラスミドは当業者には既知であり、そして例えば専門書Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｅｄｓ．Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５，ＩＳＢＮ０４４４９０４０１８）から推論することができる。
【0166】
ベクターのさらなる具体例において、本発明に従った核酸構造体、または本発明に従った核酸は、直鎖状ＤＮＡの形で微生物に有利に導入され、そして同種または異種組み換えによって宿主生物中に集積されることができる。この直鎖状ＤＮＡはプラスミドのような直鎖状ベクターから、または単に本発明に従った核酸構造体または核酸のみから構成されることができる。
【0167】
生物中の異種遺伝子の最適発現のため、生物に使用される特異的"コドン利用"に対応して核酸を修飾するのが有利である。“コドン利用”は、関連する生物の既知の遺伝子のコンピューター分析によって容易に決定することができる。
【0168】
本発明に従った発現カセットの生産は、適当なコード化ヌクレオチド配列と、ターミネーターまたはポリアデニル化信号との適切なプロモーターの融合によって実施される。この目的のため、例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）に記載されているような慣用の組み換えおよびクローニング技術が使用される。
【0169】
好適な宿主生物中の発現のため、組換え核酸構造体または遺伝子構造体が、宿主中に遺伝子の最適発現を可能にする宿主特異性ベクター中に有利に挿入されるベクターは当業者には良く知られ、そして例えば“Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ”（Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ（１９８５）から推論することができる。
【0170】
４． 微生物文脈に応じて、用語“微生物”は出発微生物（野生タイプ）、または遺伝子的に修飾された組換え微生物、または両者を意味するとして理解できる。
【0171】
本発明に従ったベクターの助けにより、本発明に従った少なくとも一つのベクターで形質転換された組換えノックアウト微生物が調製され、本発明に従ったポリペプチドの生産のために使用することができる。有利には、上に記載した本発明に従った組換え構造物が宿主システムに導入され、発現される。ここでは、例えば共沈澱、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクション等のような、当業者が熟知しているクローニングおよびトランスフェクション方法が前述した核酸をそれぞれの発現システム中に発現させるために好ましく使用される。好ましいシステムは、例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９７またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されている。
【0172】
本発明に従った核酸または核酸構造体のための細換え宿主生物は原則として原核または真核生物である。有利には宿主生物としてバクテリア、カビまた酵母のような微生物が使用される。有利には、グラム陽性またはグラム陰性バクテリア、好ましくはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ，Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ，ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅまたはＮｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ科のバクテリア、特に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ｎｏｒｃａｒｄｉａ，Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍまたはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属のバクテリアが使用される。特に好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。さらなる有利なバクテリアはアルファプロトバクテリア、ベータプロトバクテリアまたはガンマプロトバクテリアのグループ中に見出される。
【0173】
本発明に従った宿主生物は、好ましくは本発明において記載した少なくとも一つの核酸配列、核酸構造体またはＨＳＤＨ活性を有する酵素、例えば３α−，３β−，７β−，１１α−，１１β−，１２α−，１２β−，１７α−，１７β−，２０α−，または２０β−ＨＳＤＨ活性、特に本発明に従った３α−，７β−，または１２α−ＨＳＤＨ活性を有する酵素をコードするベクターを含んでいる。
【0174】
本発明に従った方法に使用される生物は、宿主生物に応じて当業者に知られた態様で増殖または培養される。原則として微生物は通常糖の形の炭素源と、通常イースト抽出物のような有機窒素源または硫酸アンモニウムのような塩の形の窒素源と、鉄、マグネシウムおよびマンガン塩のような微量元素と、そして任意にビタミンを含む液体培地中で０℃および１００℃の間の、好ましくは１０℃および６０℃の間の温度において酸素通気下に培養される。この間栄養液のｐＨを固定値に保つことができる。すなわち培養の間調節し、または調節しないことができる。培養はバッチ式、半バッチ式または連続式に実施することができる。栄養分は発酵開始時に提供するか、または後で半連続的または連続的に供給することができる。
【0175】
５．ＵＤＣＡの酵素／化学的生産５．１ 酸化方法
これは例えば本出願人のＷＯ２００９／１１８７６に記載されている。
【0176】
長年胆石症の医学的処置のため、活性物質ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）と、関連するジアステレオマーであるケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）が使用されて来た。両化合物は７Ｃ原子上のヒドロキシル基の配位によってのみ異なる（ＵＤＣＡ：β−配位、ＣＤＣＡ：α−配位）。ＵＤＣＡの商業的量の生産のため、以前は原料としてＣＤＣＡが使用される方法が好ましくは使用されて来た。ＣＤＣＡは代ってコール酸（ＣＡ）から好ましく製造される。
【0177】
５．１．１ ＣＤＣＡ生産専ら化学的な方法に代り、本発明に従ってＣＡの１２−ケトケノデオキシコール酸（１２−ケト−ＣＤＣＡ，ＣＡＳ２４５８−０８−４）への酵素触媒酸化と、次にこの化合物のＣＤＣＡへのさらなる変換が提供される。この合成ルートはたった二工程であり、このため純粋に化学的なルートに比較して実施するのに明らかに簡単である。
第１工程：酵素酸化
【化11】
【化12】
【0178】
第１工程に従って、コール酸が１２α−ＨＳＤＨによって１２−ケトケノデオキシコール酸（１２−ケト−ＣＤＣＡ）へＮＡＤＰ＋依存的に酸化される。この反応は可逆的である。１２α−ＨＳＤＨは酵素クラス１．１．１．１７６に属し、主にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌に見出される。
【0179】
この酵素酸化は、本発明に従った１２α−ＨＳＤＨ（ロングまたはショートバージョン）と、例えばＡＤＨ ｍｓまたはＡＤＨ ｔのようなＡＤＨによる助因子再生により好ましくは生起する。
【0180】
第２工程に従った脱酵素化は、古典的な化学的Ｗｏｌｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ還元であり、上に記載したＣＤＣＡＩＩＩの脱酵素化に類似して実施される。このルートの有意義な利益は、酵素の選択性のため不純物リトコール酸が生成されないことである。
【0181】
５．１．２ ＣＤＣＡのＵＤＣＡへの反応上のＣＤＣＡがＵＤＣＡ（ＣＡＳ１２８−１３−２）のための原料として使用される。第１の合成工程において、ＣＤＣＡの７位のヒドロキシル基が対応ケトンへ酸化される。７−ケトリトコール酸（３α−ヒドロキシ−７−ケトコラン酸、略してＫＬＣＡ，ＣＡＳ ４６５１−６７−６）が生成する。第２工程において、７位のケト基の立体特異性還元が続く。この目的はできるだけ高いジアステレオマー選択性をもってＵＤＣＡを得ることである。一般にＵＤＣＡは還元直後ジアステレオマーＣＤＣＡの数パーセントをなお含有している。活性物質ＵＤＣＡへ到達するため粗ＵＤＣＡは第３工程で精製しなければならない。
【0182】
第１工程：【化13】
【化14】
粗ＵＤＣＡ→純粋ＵＤＣＡ
【0183】
ＣＤＣＡの酸化は、慣例的に次亜塩素酸ナトリウム水溶液で行われる。文献では代りにクロム酸酸化がなお見られる。ＫＬＣＡは固体として得られ、これは第２工程でさらに処理される。還元はアルコール中の金属ナトリウムで実施することができる。ＵＤＣＡ：ＣＤＣＡ約８５：１５の組成を有する粗製物が得られる。代替法において、ＫＬＣＡは溶媒としてアルコール（脂肪族アルコールのような）中カリウムｔ−ブチレートまたは水酸化カリウム（ＥＰ−Ａ−０２３００８５）のような塩基と共にニッケル触媒（ラネーニッケル）上水素を使用して還元される。加えて、カリウムおよびリチウム（ナトリウムより高い選択性、Ｃ．Ｇｉｏｒｄａｎｏ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１９８５，９７，５１０）および亜鉛（ＥＳ４８９６６１）および電気化学的（ＵＳ４５４７２７１）も付加的に可能である。
【0184】
粗製ＵＤＣＡの純ＵＤＣＡへの精製は、ジアステレオマー塩の分離である。これはＵＤＣＡの適当な塩の調製、単離およびその後の分裂によって実施される。文献には以下の精製方法が挙げられている。対応するＵＤＣＡエステルの調製、再結晶および分裂（ＥＰ−Ａ−０３８６５３８）、押出（ＪＰ６０００６６９９）およびクロマトグラフ法（ＩＴ２０００ＭＩ１１７７）。
【0185】
５．２ 還元方法そのような方法は、例えば本出願人のＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６８５７６に記載されている。
【0186】
５．２．１ＣＡのヒドロキシル基が酸性溶液（例えばＨ２ＳＯ４）中のクロム酸またはクロム酸により、既知の態様において古典的化学的経路においてカルボニル基へ酸化される。それによりＤＨＣＡが生成する。
【0187】
５．２．２ ＤＨＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの酵素または微生物反応水溶液中に、ＤＨＣＡはＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの存在下３α−ＨＳＤＨまたは７β−ＨＳＤＨまたはその突然変異体によって１２−ケト−ＵＤＣＡへ特異的に還元される。助因子ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨは、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、またはホルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）、またはグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、またはそれらの突然変異体により、そしてイソプロパノールまたはギ酸ナトリウムまたはグルコースの存在下再生することができる。反応は緩和な条件下で進行する。例えば、反応はｐＨ＝６ないし９、特にｐＨ＝約８において、そして約１０ないし３０、１５ないし２５または約２３℃において実施することができる。３α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨは段階的に、すなわち任意の順番で次々に、または同時に、すなわち組み合わせて使用することができる。
【0188】
微生物反応工程においては、必要な酵素活性を発現する組換え微生物は適当な液体培地中、反応すべき基質（ＤＨＣＡ）の存在下嫌気的または好気的に培養されることができる。好適な培養条件は当業者に知られている。それは例えば５ないし１０または６ないし９のｐＨ範囲と、１０ないし６０、または１５ないし４５または２５ないし４０または３７℃の範囲の温度を含む。好適な培地は、例えばＬＢおよびＴＢ培地を含む。反応は例えばバッチ式または連続式または他の慣用のプロセス（上に記載したような）で行うことができる。反応時間は例えば分から数時間または数日の範囲であることができ、例えば１ないし４８時間であることができる。任意に、もし酵素活性が連続的に発現されなければ、例えば約ＯＤ６００＝０．５ないし１０の標的細胞密度に達した後適当なインデューサーの添加によって誘発することができる。
【0189】
５．２．３ １２−ケト−ＵＤＣＡのＵＤＣＡへの化学反応１２−ケト−ＵＤＣＡの１２−ケト基はそれ自体既知のＷｏｌｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ還元によって除去される。これによって１２−ケト−ＵＤＣＡが生成する。この反応においてカルボニル基は最初ヒドラジンでヒドラゾンへ変換される。その後ヒドラゾンは塩基（例えばＫＯＨ）の存在下２００℃へ加熱され、窒素が分解除去されてＵＤＣＡが生成する。
【0190】
６．ＨＳＤＨの組換え生産本発明はまた、３α−，３β−，７β−，１１α−，１１β−，１２α−，１２β−，２０α−，または２０β−ＨＳＤＨ、特に３α−，７β−，または１２α−ＨＳＤＨのようなＨＳＤＨ、またはこれらの機能的生物学的活性フラグメントの組換え生産であって、ここでＨＳＤＨ生産ノックアウト微生物が培養され、ポリペプチドの発現が任意に誘発され、そしてポリペプチドが培養物から単離される組換え生産を含む。もし望むならば、ポリペプチドは大規模工業スケールで生産することができる。
【0191】
本発明に従って調製されるノックアウト微生物はバッチプロセスで（バッチ式培養）において、または流加培養プロセスまたは反復流加培養プロセスにおいて連続的にまたは非連続的に培養することができる。公知の培養方法の要約はＣｈｍｉｅｌの教科書（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９９１））またはＳｔｏｒｈａｓの教科書（Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｄｅｖｉｃｅｓ （Ｖｉｅｗｅｇ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，１９９４））に見られる。
【0192】
使用すべき培養培地はそれぞれの株の要求を好適に満たさなければならない。種々の微生物の培地は、ハンドブック“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）に含まれている。
【0193】
本発明に従って使用し得るこれらの培地は、通常一以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび／または微量元素を含んでいる。
【0194】
好ましい炭素源は、単糖類、二糖類または多糖類である。非常に良い炭素源は、例えばグルコース、フラクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースである。糖は、糖蜜または製糖の他の副産物のような複合化合物として培地へ添加することもできる。種々の炭素源の混合物を添加することも有利である。他の可能性ある炭素源は、例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油およびココナッツ油のような油脂、例えばパルミチン酸、ステアリン酸またはリノレイン酸のような脂肪酸、例えばグリセロール、メタノールまたはエタノールのようなアルコールおよび例えば酢酸または乳酸のような有機酸である。
【0195】
窒素源は、通常有機または無機窒素化合物か、またはこれら化合物を含んでいる材料である。例示的窒素源は、アンモニアガスまたは硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウムのようなアンモニウム塩、硝酸塩、尿素、アミノ酸、またはコーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク、イーストエキス、ミートエキス等の複合窒素源を含む。窒素源は個別にまたは混合物として使用することができる。
【0196】
培地中に存在することができる無機塩は、塩化物、またはカルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄のリン酸または硫酸塩である。
【0197】
イオウ源として、例えば硫酸塩、亜硫酸塩、ジチオナイト、テトラチオネート、チオ硫酸塩、硫化物のような無機イオウ含有化合物を使用することができるが、メルカプタンおよびチオールのような有機イオウ化合物を使用することもできる。
【0198】
リン源としては、リン酸、リン酸二水素カリウム、またはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩を使用することができる。
【0199】
金属イオンを溶液中に保持するためキレート剤を培地へ添加することができる。特に好適なキレート剤は、カテコールまたはプロトカテキュエートのようなジヒドロキシフェノール、クエン酸のような有機酸を含む。
【0200】
本発明に従って使用し得る発酵培地は、ビタミンのような他の発育因子または発育プロモーターを慣用的に含み、これらは、例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩およびピリドキシンを含む。発育因子および塩は、イーストエキス、糖蜜、コーンスチープリカー等のような複合培地成分からしばしば誘導される。さらに培地へ好適な前駆体を添加することもできる。培地配合物の正確な組成は、詳細な実験に強く依存し、そしてそれぞれの特定のケースのために個別的に決定される。培地最適化のための情報は教科書“Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ｅｄ．Ｐ．Ｍ．Ｒｈｏｄｅｓ，Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）ｐｐ．５３−７３，ＩＳＢＮ ０ １９ ９６３５７７ ３）から得られる。発育培地は、スタンダード１（Ｍｅｒｃｋ）またはＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ，ＤＩＦＣＯ）等のような商業的サプライヤーからも得ることができる。
【0201】
すべての培地成分は熱（１．５バールおよび１２１℃において２０分）または無菌濾過によって滅菌される。成分は一所に、またはもし必要ならば別々に滅菌することができる。すべての培地成分は発育のスタートから存在することができ、または場合によって連続的またはバッチ式に添加することができる。
【0202】
培養物の温度は通常１５℃ないし４５℃、好ましくは２５℃ないし４０℃の間であり、そして実験の間コンスタントに保つか、または変えることができる。培地のｐＨは５ないし８．５の範囲内でなければならず、好ましくは７付近である。培養のためのｐＨは、培養の間、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアまたはアンモニア水のような塩基性化合物の添加、またはリン酸または硫酸のような酸性化合物の添加によってコントロールすることができる。泡発生の制御のため、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用することができる。プラスミドの安定性の維持のため、例えば抗生物質のような好適な選択的に作用する物質を培地へ加えることができる。好気的条件を維持するため、酸素または環境空気のような酸素含有ガス混合物が培養物中に導入される。培養物の温度は通常２０℃ないし４５℃である。培養は所望の生成物が最大に生産されるまで継続される。この目的は通常１０時間ないし１６０時間で達成される。
【0203】
発酵ブロスはその後さらに処理される。要請に応じ、バイオマスは、例えば遠心、濾過、デカンテーションまたはこれらの組合せのような分離方法によって、または完全に放置することによって完全にまたは部分的に発酵ブロスから除去することができる。
【0204】
もしポリペプチドが培養培地中に分泌されないならば、細胞を破壊し、そして既知タンパク単離方法に従って溶解物から回収することもできる。代って細胞は、高周波数超音波により、例えばフレンチ圧力セル中のような高圧力により、オスモリシスにより、界面活性剤、分解酵素または有機溶媒の作用により、または言及したプロセスのいくつかの組合せによって破壊することができる。
【0205】
ポリペプチドの精製は、Ｑ−セファロースクロマトグラフィーのような分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性クロマトグラフィーのような既知のクロマトグラフィープロセスを使用し、および限外濾過、結晶化、塩析、透析および天然ゲル電気泳動のような他の慣用のプロセスを使用して達成することができる。好適プロセスは、例えば、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｆ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｅｒｌａｇ Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｎｅｗ ＹｏｒｋまたはＳｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎに記載されている。
【0206】
組換えタンパク単離のため、決定したヌクレオチド配列を伸長し、そしてそのため例えばより簡単な精製のために役立つ修飾したポリペプチドまたは融合タンパクをコードするベクターシステムまたはオリゴヌクレオチドを使用することが組換えタンパクの単離のために有利であり得る。このタイプの好適な修飾は、例えば、ヘキサヒスチジンアンカーとして知られた修飾、または抗体によって抗原として認識されることができるエピトープのような（例えばＨａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（Ｎ．Ｙ．）Ｐｒｅｓｓに記載されているような）アンカーとして機能する"タグ"である。これらのアンカーは、例えばクロマトグラフィーカラムへ充填することができる、またはマイクロタイタープレート上または他のキャリア上に使用されるポリマーマトリックスのような固体担体へのタンパクの付着のために役立つことができる。
【0207】
同時に、これらアンカーはタンパクの認識のためにも使用することができる。タンパクの認識のため蛍光染料のような慣用なマーカー、基質との反応後検出可能な反応生成物を形成する酵素マーカー、または放射性マーカーが単独で、またはタンパクの誘導体化のアンカーと組合せて使用されることができる。
【0208】
７． 酵素固定化本発明に従った酵素は、ここに記載したプロセスにおいて遊離または固定形で使用することができる。固定化酵素とは、不活性担体へ固定される酵素の意味であると理解される。好適な担体材料およびその上に固定化された酵素は、ＥＰ−Ａ−１１４９８４９，ＥＰ−Ａ−１０６９１８３およびＤＥ−ＯＳ−１００１９３７７３およびそれらに引用された参照から知られている。この点に関し、これら明細書の開示全体が参照される。好適な担体材料は、例えばカオリナイト、ケイ藻土、パーライトのような粘土、粘土鉱物、シリカ、アルミナ、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉、アニオン交換材料、ポリスチレン、アクリル樹脂、フェノールホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタンおよびポリエチレンおよびポリプロピレンのような合成高分子を含む。担体材料は慣例的に固定された酵素のために微粉砕された粒子の形で使用され、多孔質形が好ましい。担体材料の粒子寸法は５ｍｍ以下、特に２ｍｍ以下（分布カーブ）である。同様に、全細胞触媒としてデヒドロゲナーゼの使用において、遊離または固定化形を選ぶことができる。担体材料は、例えばアルギン酸カルシウムおよびカラギーナンである。酵素それに細胞は、グルタルアルデヒドを用いて直接架橋する（ＣＬＥＡへの架橋）ことができる。対応してそしてさらなる固定化プロセスは、例えば、Ｊ．Ｌａｌｏｎｄｅ ａｎｄ Ａ．Ｍａｒｇｏｌｉｎ“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅｓ”ｉｎ Ｋ．Ｄｒａｕｚ ａｎｄ Ｈ．Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｅｎｚｙｍｅ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ２００２，ｖｏｌ．ＩＩＩ，９９１−１０３２，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍに記載されている。
【0209】
８．ノックアウト突然変異体の生産ノックアウト方法、例えば核酸または核酸配列を欠失または挿入する方法は当業者に知られており、そして例えばオリゴヌクレオチドとＰＣＲを使用する慣用方法、および所望の修飾した核酸配列をプラスミド中に組入れることができる、プラスミドと制限酵素を使用する方法を含む。このおよび他の分子遺伝子方法は一般に知られており、そして例えば以下の文献に記載されている。Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ（１９８９）ａｎｄ ｉｎ Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４），Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）；“Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ１８５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９９０；“Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ”，ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０４，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９９１；“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｅ”，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １５４，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８７；ａｎｄ Ｃ．Ｄ．Ｓｍｏｌｋｅ（ｅｄ．），Ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈａｎｄｂｏｏｋ；ｔｏｏｌｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ． Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ２０１０；Ｃ．Ｍｕｈｌｈａｒｄｔ， “Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｏｒ：Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｅ／Ｇｅｎｏｍｉｃｓ”，６ｔｈ ｅｄ．，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ ２０１０；Ｄ．Ｃｌａｒｋ，Ｎ．Ｐａｚｄｅｒｎｉｋ，“Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ”，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，２００９；Ｍ．Ｊａｈｎｓｏｎ（Ｅｄ．），”Ｇｅｎｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｅｎ”，４ｔｈ ｅｄ．， Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，２００６；Ｊ．Ｍ．Ｓ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｄ．Ｓｔｉｒｌｉｎｇ（Ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．２２６，“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ，２００３
【0210】
ノックアウト突然変異体生産のためのさらなる知られた方法は相同組換えに基づいている。ここではマーカー遺伝子は、ノックアウトすべき遺伝子の配列と相同であり、そして適当なビヒクル（例えばプラスミド、挿入配列、トランスポゾン）によってノックアウトすべき標的配列と合体される両脇配列が備えられる。これは好ましくは宿主生物中、染色体中に（宿主生物に応じて細菌染色体また真核生物染色体）、または関係する宿主中の染色体外核酸構造体（例えばプラスミド）上に配置される。しかしながら無細胞またはインビトロシステムも同様に考えられる。適当な組換えシステムの存在下（例えばレコンビナーゼ）、相同組換えが生起し、両脇配列の相同性のためマーカー遺伝子が標的配列中に集積され、そして標的配列の両脇配列間に横たわる核酸領域が置換により除去される。この態様において挿入されたマーカー遺伝子の遺伝子産物はノックアウト突然変異体の選択のために使用することができる。好ましくはマーカー遺伝子は、抗生物質含有固形培地プレートまたは液体培地によって選択を行うことができるように、抗生物質抵抗を仲介するタンパクをコードする。しかしながらマーカー遺伝子は他のタンパク、例えば蛍光タンパク、例えばグリーン蛍光タンパク（ＧＦＰ）をコードし、そのため蛍光顕微鏡によるコロニー観察によって、または蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって選択を行うことができるようにされる。相同組換えの原理は、一般に知られており、そして組換えの他の形に加え、例えば以下の文献に記載されている。Ｒ．Ｙ．Ｓｔａｎｉｅｒ，Ｊ．Ｌ．Ｉｎｇｒａｈａｍ，Ｍ．Ｌ．Ｗｈｅｅｌｉｓ，Ｐ．Ｒ．Ｐａｉｎｔｅｒ（ｅｄ．）”Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ”，５ｔｈ ｅｄ；， １９８６，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｌｔｄ．， Ｈｏｕｎｄｍｉｌｌｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， ｐｐ．２７８−２８５，ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ ｉｎ ”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ”， Ｖｏｌｕｍｅ ＩＩ， Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ （ｅｄ．）， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ， ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， １９８６， ｐｐ．５７−６５；Ｋａｒｌ Ｄｒｌｉｃａ， “ＤＮＡ ｕｎｄ Ｇｅｎｋｌｏｎｉｅｒｕｎｇ−ｅｉｎ Ｌｅｉｔｆａｄｅｎ”，Ｇ．Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， Ｊｅｎａ， １９９５，”Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ”ｃｈａｐｔｅｒ，ｐｐ．１５５−１６１， ａｎｄ Ｄ．Ｈ．Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｃ．Ｗｉｎｉｓｔｏｒｆｅｒ， ”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ＰＣＲ“， ｉｎ：Ｊ．Ｍ．Ｓ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ， Ｄ．Ｓｔｉｒｌｉｎｇ（ｅｄｓ．），”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．２２６，“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ，２００３，Ｃｈａｐｔｅｒ ７０，ｐｐ．５１７−５２５；ａｎｄ Ａ．Ｓ．Ｗａｌｄｍａｎ（ｅｄ．），“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．２６２，”Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ−Ｒｅｖｉｅｗｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ，２００４；Ｆ．Ｐ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｆ．Ｖａｎｄｏｍｅ，Ｊ．ＭｃＢｒｅｗｓｔｅｒ（Ｅｄ．），”Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”，Ａｌｐｈａｓｃｒｉｐｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２００９； Ｆ．Ｐ．Ｍｉｌｌｅｒ， Ａ．Ｆ．Ｖａｎｄｏｍｅ， Ｊ．ＭｃＢｒｅｗｓｔｅｒ（Ｅｄｓ．），”Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”，Ａｌｐｈａｓｃｒｉｐｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， ２０１０ Ａ．Ａｇｕｉｌｅｒａ ａｎｄ Ｒ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ， ２００７． Ｓｐｅｃｉａｌ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｇｅｎｅ−ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｒｅ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ， ｉｎ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｆｏｒ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａｎｉｍａｌｓ ”Ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ｒａｌｆ Ｋｕｈｎ ａｎｄ Ｗｏｌｆｇａｎｇ Ｗｕｒｓｔ（ｅｄｓ．）， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ．， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ２００９， ａｎｄ Ｗｏｌｆ Ｓ．Ｅ． ａｎｄ Ｗｏｏｄｓｉｄｅ， Ｋ．Ｊ， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ ｂｕｒｎ ｒｅｓｅｒａｃｈ， Ｊ． Ｓｕｒｇ． Ｒｅｓ． １２３（２）：３２８−３３９，２００５．
【0211】
さらに遺伝子ノックアウト生産のための商業的キット、例えばＥ．Ｃｏｌｉおよび関連する細菌種のための“Ｔａｒｇｅ Ｔｒｏｎ”遺伝子ノックアウトシステムがＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得ることができる。
【0212】
ノックアウト突然変異体生産または遺伝子修飾に適当な他のシステムの例は、Ｓａｕｅｒ Ｂ ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ Ｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（１４）：５１６６−５１７０，１９８８に記載されているＣｒｅ／Ｌｏｘシステム、また“Ｒｅｄ／ＥＴ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ−Ｃｌｏｎｉｎｇ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅｓ”と題するユーザーハンドブックに記載され、さらにＵＳ６，３５５，４１２；ＵＳ６，５０９，１５６およびＥＰ４１３９５６１の特許に記載されている、“Ｒｅｄ／ＥＴ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”システム（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）である。
【0213】
９．助因子再生助因子の必要性は、助因子再生酵素との組合せにより減らすことができる。このため先行技術の種々の方法を使用することができる。
【0214】
先行技術は、例えば、グルタメートデヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）（Ｃａｒｒｅａ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， １９８４，２６（５）：ｐｐ５６０−５６３）の使用を教える。ＧＬＤＨはα−ケトグルタレートのグルタメートへの同時還元的アミノ化を伴ってＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ＋へ再酸化する。
【0215】
これに代って助因子再生のためにアルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ−Ｔｂ、ＡＤＨ−ＬｂおよびＡＤＨ−ｍｓが提案されている（Ｆｏｓｓａｔｉ，Ｅ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，２００６，９３（６）：ｐ．１２１６−２０）。ＡＤＨはＮＡＤＰ＋の再生と同時に２−プロパノールをアセトンに変換する。
【0216】
ＮＡＤＨまたはＮＡＤの再生のための他の２級アルコールデヒドロゲナーゼは、Ｃａｎｄｉｄａ属およびＰｉｃｈｉａ属のイーストから単離されるものであり、例えば以下のものがある。Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ（ＣＰＣＲ）（ＵＳ５，５２３，２２３，ＵＳ５，７６３，２３５；Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９３ Ｎｏｖ；１５（ＩＩ）：９５０−８）；Ｐｉｃｈｉａ ｃａｐｓｕｌａｔａ（ＤＥ １０３２７４５４．４）；Ｐｉｃｈｉａ ｆａｒｉｎｏｓａ ＣＡ １２６１／２００５，Ｋ１．Ｃ１２Ｎ）；Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ （ＥＰ１１７９５９５Ａ１）；Ｃａｎｄｉｄａ ｎｅｍｏｄｅｎｄｒａ（Ａ １２６１／２００５，Ｋ１．Ｃ１２Ｎ）；Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ （Ａ １２６１／２００５，Ｋ１．Ｃ１２Ｎ）；およびＰｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｄｉｓ （Ａ １２６１／２００５，Ｋ１．Ｃ１２Ｎ）からのカルボニルレダクターゼ。加えてＮＡＤＨの再生はＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａのクラスの細菌、例えばＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ （ＵＳ５，５２３，２２３）；Ｎｏｒｃａｒｄｉａ ｆｕｓｃａ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６３（１０）（１９９９），ｐ．１７２１−１７２９；Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３ Ｓｅｐ：６２（４）：３８０−６，Ｅｐｕｂ ２００３ Ａｐｒ ２６）；Ｒｈｏｄｏｃｕｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００３ Ｊａｎ ２４；８（２）：４０２−６）またはＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｐｅｃ．（Ａ １２６１／２００５，Ｋ１．Ｃ１２Ｎ）から単離された２級アルコールデヒドロゲナーゼで実施することもできる。
【0217】
ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＰの再生のために適切な２級アルコールデヒドロゲナーゼ／オキシドレダクターゼは、例えば、Ｌｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒ（ＵＳ５，２００，３３５）；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｄｒｅｖｉｓ（ＤＥ１９６１０９８４Ａ１，Ａｃｔａ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２０００ Ｄｅｃ；５６ Ｐｔ１２：１６９６−８）；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｉｎｏｒ（ＤＥ １０１１９２７４）；Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃａｒｎｏｓｕｍ（Ａ １２６１／２００５，Ｋ１．Ｃ１２Ｎ）からのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｅｓ属の生物から単離されたもの、またはＴｈｅｍｏａｎｅｒｏｂｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ，Ｔｈｅｍｏａｎｅｒｏｂｉｕｍ ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉからのものである。
【0218】
ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ，ＮＡＤ＋の再生と共にピルベートのラクテートへの反応）はＥＰ−Ａ−１７３１６１８に記載されている。
【0219】
助因子再生のための好適な他のデヒドロゲナーゼはグルコースデヒドロゲナーゼ、少なくともギ酸をＣＯ２への酸化を触媒するホルメートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、またはホスファイトデヒドロゲナーゼである。
【0220】
実験の部もし他に詳細が与えられていなければ、本発明の文脈において実施されるクローニング工程、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、制限切断、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡフラグメントの精製、ニトロセルロースまたはナイロン膜への核酸の転写、ＤＮＡフラグメントの連結、微生物の形質転換、微生物の培養、ファージの複製、および組換えＤＮＡの配列分析は、上で引用したＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）の記載のとおりに実施することができる。
【0221】
相同組換えによるノックアウト実験は、Ｋ．Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ（ＰＮＡＳ Ｊｕｎｅ ６，２０００，ｖｏｌ．９７，ｎｏ．１２，６６４０−６６４５）の記載に従って行われる。
【0222】
Ａ．一般的詳細１．材料
【表4】
【0223】
２．方法２．１ １２α−ＨＳＤＨ活性測定のための標準条件
この活性は以下のように定義される。この酵素１Ｕ（１単位）は、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８．０）中の５ｍＭコール酸溶液の１μｍｏｌ／分の室温（すなわち約２０℃−２３℃）における反応を触媒する酵素の量に相当する。
【0224】
反応混合液は、全容積１ｍｌ中、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０ ８８０μｌ
１００ｍＭコール酸（水に溶解、２Ｍ ＫＯＨでｐＨ８に調節） １０μｌ
酵素溶液（上の緩衝液中１ないし１０Ｕ／ｍｌの範囲） １０μｌ
１ｍＭ ＮＡＤＰ＋（上の緩衝液中）（これで反応がスタート） １００μｌ
を有する。
【0225】
３４０ｎｍにおいて吸収の増加を測定し、そして活性は６．２２ｍＭ−１ｘｃｍ−１のモル消衰係数を用いて酵素単位（Ｕすなわちμｍｏｌ／分）として計算される。
【0226】
２．２ ７β−ＨＳＤＨ活性測定のための標準条件反応混合物は、全容積１ｍｌ中、
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０ ８８０μｌ
１０ｍＭ ＵＤＣＡ（水に溶解、ｐＨ８．０） １０μｌ
酵素溶液（上の緩衝液中１ないし１０Ｕ／ｍｌの範囲） １０μｌ
１ｍＭ ＮＡＤＰ＋（上の緩衝液中）
１００μｌ
を含有する。
【0227】
３４０ｎｍにおける吸収の増加を測定し、そして活性は６．２２ｍＭ−１ｘｃｍ−１のモル消衰係数を用いて酵素単位（Ｕすなわちμｍｏｌ／分）として計算される。
【0228】
２．３ コール酸の反応生成物の分析のためのＨＰＬＣ法カラム：Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ ＳＴＡＲ ＲＰ−１８（Ｈｉｔｂａｒ ＲＴ１２５−４ プレパック、プレカラム ＬｉＣｈｒｏ（ＡＲＴ ＳＴＡＲ ＲＰ１８，Ｍｅｒｃｋ）ＨＰＬＣシステム：ＬＣ２０ＡＤ（島津、日本）フロー：１ｍｌ／分
サンプル：１ｍｇ／ｍｌにおいて２０μｌ
検出波長：２００ｎｍ
【表5】
７−ケト−３，１２−デヒドロキシコラン酸 ７．５分
コール酸 １３．５分
【0229】
３．発現ベクターとプラスミドおよびそれらの生産ｐＩＪ７７３（配列同定番号１）
このプラスミドｐＩＪ７７３は、アパラマ抵抗（Ｂ．Ｇｕｓｔ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １８， ２００３ ｖｏｌ．１００，Ｎｏ．４，１５４１−１５４６）をコードする遺伝子を含んである。この抵抗は組換えが行われた後の選別のために必要である。
【0230】
ｐＪＯＥ６０３８．１（ｐＩＪ７９０から誘導）（配列同定番号２）このプラスミドｐＪＯＥ６０３８．１（Ｂ．Ｇｕｓｔ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １８， ２００３ ｖｏｌ．１００，Ｎｏ．４，１５４１−１５４６）は、Ｇａｍ，ＢｅｔおよびＥｘｏの３遺伝子よりなるラムダレッド組換えシステムを含んでいる（Ｋ．Ｍｕｒｔｈｙ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ａｐｒ．１９９８，ｐ．２０６３−２０７１）。Ｇａｍは宿主エクソヌクレアーゼＲｅｃ ＢＣＤ Ｖを阻害し、そしてＢｅｔとＥｘｏが組換えを実施するのを可能にする。
【0231】
ｐＣＰ２０選択マークの切り出しのため、このプラスミドｐＣＰ２０（Ｋ．Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｂ．Ｗａｎｎｅｒ，ＰＮＡＳ Ｊｕｎｅ ６，２０００ ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１２，６６４０−６６４５）が使用され、切り出しのために必要なＦＬＰレコンビナーゼをコードする。ＦＬＰレコンビナーゼはＤＮＡをＦＲＴ部位の間で切断する。
【0232】
ｐＥＴ２８ａ（＋）ｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）は、Ｔ７プロモーターおよび転写スタートのコントロールのもとにＭＣＳを含み、そして１２α−ＨＳＤＨの発現に役立つベクターである。発現はイソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘発される。
【0233】
ｐＥＴ２８ａ（＋）−７β−ＨＳＤＨこのプラスミドは以下のように調製した（出願人のＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６８５７６も参照）。
【0234】
最初１７β−ＨＳＤＨコード配列を増幅した。鋳型としてＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２５９８６（ＤＳＭ３９７９）のゲノムＤＮＡと、プライマー５’−ｇｇｇａａｔｔｃＣＡＴＡＴＧＡＡＣＣＴＧＡＧＧＧＡＧＡＡＧＴＡ−３’（配列同定番号２６）と、
５’−ｃｃｃＡＡＧＣＴＴＴＡＧＴＣＧＣＧＧＴＡＧＡＡＣＧＡ−３’（配列同定番号２７）を使用してＰＣＲ産物を得た。プライマー配列中のＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断部位はアンダーラインで示してある。ＰＣＲ産物はＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、次に酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断した。
【0235】
消化したＰＣＲ産物は精製し、そして発現ベクター産物のためＴ４リガーゼを用いてｐＥＴ−２８（ａ）（＋）にクローンされた。得られた発現構造体は次にＥ．ＣｏｌｉＤＨ５の細胞に形質導入された。期待されるタンパクは、信号ペプチドとＮ−末端６ｘＨｉｓタグとトロンビン切断部位を含む２０のアミノ酸残基を含むべきである。挿入したＤＮＡの配列は配列決定によってチェックされた（配列同定番号２４および２５参照）。
【0236】
ｐＥＴ２２ｂ（＋）３α−ＨＳＤＨこれはＣｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉからの３α−ＨＳＤＨ配列（配列同定番号２８および２９を参照）が慣用のやり方で切断部位ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩを介してクローンされたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターである（Ｏｐｐｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６，２４１（３）：７４４−７４９）。
【0237】
ｐＥＴ２１ａ（＋）ＦＤＨ Ｄ２２１ＧこれはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｃｃａｅ Ｎ１０からのホルメートデヒドロゲナーゼ（配列同定番号３２）が切断部位ＮａｅＩおよびＥｃｏＲＩを介してクローンされたｐＥＴ２１ａ（＋）ベクターである。部位指向突然変異生成により、ホルメートデヒドロゲナーゼの位置２２１（位置１のメチオニンは考慮しない）または位置２２２（位置１のメチオニンから計算：配列同定番号３８および２３参照）がグリシン残基で置換された。このようにして得られたＦＤＨ突然変異体はＮＡＤＨばかりでなくＮＡＤＰＨも再生することができる。ホルメートデヒドロゲナーゼはヌクレオチド配列の位置１２０２に（スタートコドンＡＴＧを考慮に入れて計算）１個の塩基欠失を有し、これは最後のアミノ酸バリンのアラニンへの置換に導く。同時にこの塩基欠失は停止コドンの遮断と、もともと読取り枠外にあったＨｉｓタグの活性化へ導く（配列同定番号２２および２３参照）（ＨｉｓタグなしのＦＤＨＤ２２１Ｇについては配列同定番号３７および３８を見よ）。
【0238】
発現ベクターは以下のように調製された（本出願人のＥＰ出願１００１５７２６を見よ）。ａ）ｐＥＴ２１ａ（＋）のクローニング
Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｓｃｏｗ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｒｕｓｓｉａのカルチャーコレクションから得たＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｃｃａｅ Ｎ１０（寄託番号４３２９２）のゲノムＤＮＡが増幅の鋳型として役立つ。増幅のプライマーは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ ＧｍｂＨ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇから注文し得た以下の配列であった。
【0239】
【化15】
【0240】
ＰＣＲバッチおよびＰＣＲプログラムは下表に示されている。
【0241】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｃｃａｅからのホルメートデヒドロゲナーゼの増幅のためのＰＣＲバッチ【表6】
【0242】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｃｃａｅからのホルメートデヒドロゲナーゼの増幅のためのＰＣＲプログラム【表7】
【0243】
切断したベクターＤＮＡ１００ｎｇと切断したＦＤＨ−ＤＮＡ１１１ｎｇとがＴ４リガーゼ（３Ｕ／μＬ）の１μｌと１０メリガーゼ緩衝液の１μｌ（各場合Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ）で処理され、そして蒸留水で全体積１０μｌへもたらされた。リゲーションバッチは４℃において一夜インキュベートされた。
【0244】
リゲーション工程終了後、リゲーションバッチ１０μＬが標準的プロトコールに従って生成された化学的に適格なＥ．ＣｏｌｉＤＨ５αの２００μＬへ加えられた。その後氷上のインキュベーション工程３０分間行われ、４２℃におけるヒートショック（９０秒）が続いた。その後無菌ＬＢ培地６００μｌが形質転換バッチへ加えられ、そして細胞が振とうインキュベーター中２００ｒｐｍおよび３７℃において４５分間インキュベートされた。次の工程においてベンチ遠心機中３０００ｒｐｍにおいて６０秒遠心され、上清７００μｌが捨てられ、細胞は残りの上清中に再懸濁され、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを加えたＬＢ寒天プレート上にプレートアウトされた。その後この寒天プレートは３７℃において一夜インキュベートされる。
【0245】
ｂ）ｐＥＴ２１ａ（＋）ＦＤＨ Ｄ２２１Ｇの生産以下のプライマーが使用された。
【0246】
【化16】
【0247】
メガプライマーＰＣＲプログラム【表8】
２ｘＥＺＣｌｏｎｅミックス、ＥＺＣｌｏｎｅ溶液１、１．１ｋｂマーカーおよびＤｐｎ１は、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈＩＩＥＺＣｌｏｎｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から得た。
【0248】
ＭＥＧＡ ＷＨＯＰ ＰＣＲのためのバッチ（全体積５０μＬ）【表9】
【0249】
ＭＥＧＡ ＷＨＯＰのＰＣＲプログラム【表10】
【0250】
このようにして前述した発現プラスミドであるｐＥＴ２１ａ（＋）ＦＤＨ Ｄ２２１Ｇが得られる。
【0251】
４．微生物株 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）
遺伝子型 Ｆ−ｏｍｐＴｇａｌ ｄｃｍＩｏｎ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）
λ（ＤＥ３［１ａｃＩ ＩａｃＵＶ５ Ｔ７ｇｅｎｅ１ ｉｎｄ１ ｓａｍ７ ｎｉｎ５］）
【0252】
Ｂ．実施例実施例１：Ｅ．Ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）の７α−ＨＳＤＨ欠失変異体（Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨ）（タイプ１）（相同組換えによるノックアウト）の生産
【0253】
１．１ Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）からの７α−ＨＳＤＨの配列情報アミノ酸配列（配列番号１０）
長さ：２５５アミノ酸
タイプ：タンパク
起源：Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）
【化17】
【0254】
核酸配列（配列同定番号９）長さ：７６８塩基対
タイプ：核酸
起源：Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）
アクセッション：ＮＣ＿０１２９７１ＲＥＧＩＯＮ：１６４２７０．１６４３２３７
【化18】
【0255】
１．２ アパラマイシン欠失カセットの生産Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）からの７α−ＨＳＤＨをノックアウトするため以下のプライマーが製造された。
【化19】
ＶＦＮＳＤＥＮＬＲＬＤＧＫ （Ｎ→Ｃ）
がそして後方プライマーから
ＴＶＳＧＧＧＶＱＥＬＮ （Ｎ→Ｃ）
がコードされる。
【0256】
アパラマイシン抵抗カセットのための相同配列はイタリックになっている。プラスミドｐＩＪ７７３からのアパラマイシン抵抗カセットは両脇をＦＲＴ部位で挟まれ（Ｂ．Ｇｕｓｔ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １８， ２００３，ｖｏｌ．１００，Ｎｏ．４，１５４１−１５４６）、組換え実施後ゲノムから再び除去されることを許容する。
【0257】
鋳型としてプラスミドｐＩＪ７７３からのアパラマイシン抵抗カセットを用いたＰＣＲはＳａｍｂｒｏｏｋ（１９９８）のような標準的プロトコールに従って実施された。７α−ＨＳＤＨの遺伝子からの二つの相同性アームを有する製造されたＰＣＲ産物は精製された。
【0258】
１．３ 標準的配列の組換え／欠失ｐＩＪ７９０（Ｂ．Ｇｕｓｔ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １８， ２００３，ｖｏｌ．１００，Ｎｏ．４，１５４１−１５４６）の反転したＮｈｅｌ切断部位を備えたプラスミドｐＪＯＥ６０３８．１はエクソヌクレアーゼ（ラムダレッドレコンビナーゼ、Ｋ．Ｍｕｒｐｈｙ；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ａｐｒ．１９９８、ｐ．２０６３−２０７１）をコードする。このプラスミドｐＪＯＥ６０３８．１は温度感受性であり、３７℃において培養によって失われる。プラスミドｐＪＯＥ６０３８．１はエレクトロポレーション（２５μＦ，２００オームおよび２．５ｋＶ）によってＥ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質導入された。１コロニーをＬＢの５ｍｌ中に取り、３０℃で一夜培養した。ＬＢ培地４０ｍｌが１：１００で接種され、３０℃でインキュベートされた。ＯＤ６００約０．３において、培養物が０．４％Ｌ−アラビノースで誘発され、組換えを可能とするエクソヌクレアーゼ（ラムダレッドレコンビナーゼ）を発現させるため３７℃で１時間インキュベートされた。
【0259】
細胞を遠心分離し、氷冷水３０ｍｌで洗った。細胞を再び遠心分離し、氷水７００μｌで再懸濁した。この懸濁液５０μｌはＰＣＲ産物（上の工程１からの）５μｌと共に氷上で３０分インキュベートされた。エレクトロポレーション後（２５μＦ、２００オーム、２．５ｋＶ）、予冷したＬＢ培地１ｍｌを直ちにそれへピペットした。細胞は３７℃において２時間４５分インキュベートされた。次に細胞はＬＢアパラマイシン寒天プレート上にプレートアウトされた。１コロニーがピックアップされた。７α−ＨＳＤＨでのコロニーＰＣＲは１５００ｂｓバンド（アパラマイシン抵抗カ）を示した。このことは、７α−ＨＳＤＨの遺伝子が置換され、そしてアパラマイシン抵抗がゲノム中に集積したことを示す。（図１を見よ）。このようにして得られたノックアウト株は、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨ ＡｐａｒＲと命名された。
【0260】
１．４ 抵抗の切除二つのＦＲＴ部位によって挟まれたノックアウトのための抵抗遺伝子は再び切り出さなければならない。切り出しのため、必要なＦＬＰレコンビナーゼをコードするプラスミドｐＣＰ２０（Ｋ．Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｂ．Ｗａｎｎｅｒ，ＰＮＡＳ Ｊｕｎｅ ６，２０００，ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１２，６６４０−６６４５）が使用される。プラスミドｐＣＰ２０も温度感受性であり、３７℃における培養によって失われる。プラスミドｐＣＰ２０はノックアウト株Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨ中にエレクトロポレーション（２５μＦ，２００オーム、２．５ｋＶ）によって形質導入される。４コロニーがＬＢ−０上にすじつけされ、４２℃で一夜培養される。ＦＬＰレコンビナーゼが発現され、アパラマイシン抵抗遺伝子が切り出される。このようにしてノックアウト株Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨが得られる。
【0261】
抵抗の損失テストのため、ＬＢアパラマイシン培地およびＬＢ−０培地上に５０コロニーがすじつけされる。ＬＢ−０上で増殖するコロニーだけがもはやアパラマイシン抵抗性を持っていない。１コロニーをＬＢ５ｍｌ中に取り、コール酸２０ｍＭを培養物５ｍｌへ加える。ＨＰＬＣによって酸化物７−ケト−３，１２−ジヒドロキシコール酸（ＲＴ：７．５分）がノックアウト株では検出できなかった。しかしながらＥ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）はコール酸に対して７α−ＨＳＤＨ活性を明らかに示した（ＲＴ：１３．５分）。このように７α−ＨＳＤＨ遺伝子は成功的にノックアウトされた（図２を見よ）。このように７α−ＨＳＤＨなしの株Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨが成功して作られた。
【0262】
実施例２ Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨ（タイプ１）を用いる１２α−ＨＳＤＨの不均質発現
【0263】
Ｔ７プロモーターのコントロール下にあるＭＣＳと転写スタートとを含み、Ｔ７ターミネーターを有するベクターｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）が１２α−ＨＳＤＨの発現に用いられた。発現はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘発される。
【0264】
このため、配列をコードする１２α−ＨＳＤＨ（ショートバージョン）がＰＣＲ増幅された（本出願人のＰＣＴ／ＥＰ２００９／００２１９０も参照）。ＰＣＲ産物は、鋳型としてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．グループ株４８−５０のゲノムＤＮＡと、プライマー対、【化20】
【0265】
ＰＣＲ産物はアガロースゲルへ適用され、分離され、そして切り出された。その後ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで制限され、そしてｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターとリゲートされ、そしてＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断された。
【0266】
Ｎ−末端Ｈｉｓ−タグは以下の配列番号７および８のプライマーを使用するＱｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅによりその後除去された。プラスミドを配列決定し、検証した。【化21】
【0267】
Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨを用いる発現の研究のため、以下に示したプロトコールに従って化学的に適格な細胞が生産された。１２α−ＨＳＤＨを有する（Ｈｉｓ−タグなし）のベクターｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｔ７プロモーターおよびカナマイシン抵抗を含んでいる）がＥ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨに形質導入された。
【0268】
化学的に適格な細胞の生産Ｅ．Ｃｏｌｉの一夜培養物１ｍｌがＬＢ培地１００ｍｌ中に接種された。細胞は３７℃および１８０ｒｐｍにおいてＯＤ６０００．４〜０．６までインキュベートされた。細胞は氷上で１５分冷却され、４℃および４０００ｒｐｍにおいて遠心された。上清を除去し、細胞を予め冷やしたＴｆｂＩ溶液（酢酸カリウム３０ｍＭ，塩化ルビジウム１００ｍＭ，塩化カルシウム１０ｍＭ，塩化マグネシウム５０ｍＭ、グリセロール１５％）４０ｍｌに再懸濁した。氷上で１５分インキュベーション後、細胞を遠心分離した。上清は除去した。細胞を予め冷やしたＴｆｂＩＩ溶液（ＭＯＰＳ１０ｍＭ，塩化カルシウム７５ｍＭ，塩化ルビジウム１０ｍＭ，グリセロール１５％）４ｍｌに再懸濁した。形質転換のため、適格細胞２００μｌ中にプラスミドＤＮＡ１μｌを加え、混合物を氷上で１０分インキュベートした。細胞のヒートショックは４２℃で４０秒実施された。次にＬＢ培地８００μｌが直ちに加えられた。細胞は３７℃および２００ｒｐｍにおいて１時間インキュベートされた。形質転換した細胞を遠心分離し、上清を除去した。ペレットをＬＢ寒天プレート上にプレートアウトした。プレートをコロニー生産のため３７℃でインキュベートした。１コロニーをＬＢ５ｍｌに取った。４時間後、ＬＢ５０ｍｌにプレ培養物５ｍｌを接種した。約０．８のＯＤ６００において、細胞を０．５ｍＭ・ＩＰＴＧで誘発した。細胞を２５℃および１４０ｒｐｍで一夜インキュベートした。細胞を再び遠心分離し、再懸濁し、消化した。上に示した方法に従って１２α−ＨＳＤＨ活性が決定された。１２α−ＨＳＤＨの収率はＬＢ培地１Ｌあたり約５０ｋＵであった。
【0269】
実施例３ Ｅ．Ｃｏｌｉ ７α−ＨＳＤＨノックアウト突然変異体（Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２９（ＤＥ３）ｈｄｈＡ−ＫａｎＲ＋）（タイプ２）の生産（遺伝子破壊によるノックアウト）
【0270】
目的は、発現株Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）の妨害７α−ＨＳＤＨ活性の欠失である。
【0271】
以下の方法を使用し、抗生物質抵抗遺伝子が７α−ＨＳＤＨの標的遺伝子中に挿入され、それにより標的遺伝子がスイッチオフされる。
【0272】
３．１ Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）からの７α−ＨＳＤＨのための配列情報実施例１を参照。
【0273】
３．２ 使用したプライマーＥ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）からの７α−ＨＳＤＨのスイッチオフのため以下のプライマーが作成された。
【0274】
ＴａｒｇｅＴｒｏｎＴＭ遺伝子ノックアウトシステム（セクション３．３を見よ）に使用される。ＬＩ．ＬｔｒＢイントロンの再ターゲティングのためのプライマー：【化22】
【0275】
以下の部位への再プログラムされたイントロンの挿入位置【化23】
【0276】
３．３ ノックアウト突然変異体の作成ノックアウトされた突然変異体の作成は、製造者の指図書に従ってＳｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈのＴａｒｇｅＴｒｏｎ遺伝子ノックアウトシステムにより実施された。それはＱｉａｇｅｎのＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットのＴａｒｇｅＴｒｏｎ遺伝子ノックアウトシステムのステップＢ．６．に従ったＰＣＲ生産物の精製に使用された。
【0277】
リニヤー化されたｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃベルター中へＨｉｄＩＩＩ／ＢｓｒＧＩ消化イントロンのリゲーションは以下のように実施された。反応は１６℃で一夜行われた。２０μｌバッチ：
２μｌ ＰＡＣＤ４Ｋ−Ｃリニヤーベクター（４０ｎｇ）
６μｌ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｒＧＩ−消化イントロンＰＣＲ産物
２μｌ ＡＴＰ（１０ｍＭ）
２μｌ リガーゼ緩衝液（１０ｘ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）
２μｌ Ｔ４リガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａ）
６μｌ Ｈ２Ｏ
【0278】
リゲーション反応溶液５μｌを化学的に適格なＥ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞２００μｌへ加え、氷上で２０分インキュベートした。さらなる形質転換は製造者の指示書によって実施した。
【0279】
形質転換バッチをカナマイシン３３μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天プレート上にプレートアウトした。カナマイシン抵抗性細胞を採取し、各場合ＬＢ一夜培養物（各場合カナマイシン溶液５μｌ（３３ｍｇ／ｍＬ）を含有）中に数夜再接種した。最後にＬＢ培養物（カナマイシン溶液（３３ｍｇ／ｍＬ）２００μｌ含有）２００ｍｌへ一夜培養物を接種し、シェーカーインキュベーター中３７℃および１８０ｒｐｍにおいて５時間インキュベートした。次に温度を４２℃へ１時間上げた。ＬＢ一夜培養物５ｍＬへこの培養物（各場合カナマイシン溶液（３３ｍｇ／ｍＬ）を含む）を接種した。３７℃および１８０ｒｐｍにおいて一夜インキュベーション後、培養物をカナマイシン３３μｇ／ｍＬ含有するＬＢ寒天プレート上にすじつけした。３７℃において一夜インキュベーション後、コロニーを採取し、カナマイシン３３μｇ／ｍＬとクロラムフェニコール３４μｇ／ｍＬを含んでいるＬＢ寒天プレート上にすじつけした。
【0280】
３７℃で一夜インキュベートション後、クロラムフェニコール抵抗性突然変異株が見出された。これは誘発し得るノックアウトシステムを支持し、そしてノックアウト成功後もはや必要としないプラスミドの消失を確認するために必要である。
【0281】
カナマイシン抵抗性は挿入によってのみ活性である。それはベクターｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ上に欠失を有する。カナマイシンおよびクロラムフェニコールの両方の上で増殖するコロニーは、このため所望のノックアウトを最大の確率で含んでいるが、さらにｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃベクターも含んでいる。もし菌株が付加的にのみカナマイシン抵抗性であるならばそれらはｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃだけでなく、所望のノックアウトも失っている。
【0282】
３．４ ノックアウトの検出プライマー
【化24】
【0283】
生成したフラグメントは２．５〜３ｋｂの長さを有し、プライマー７ａｌｐｈａ−ｋｏ−ｃｈｅｃｋ＿ｆｗｄを使用して配列決定された。この配列決定に基づいて、７α−ＨＳＤＨのＤＮＡ配列はｐＡＣＤ４Ｋベクターの挿入によって中断されており、７α−ＨＳＤＨのノックアウトが生じたことを検出することができた。（配列決定データは示さず）。
【0284】
３．５ ノックアウト株での１２α−および７β−ＨＳＤＨ突然変異体の発現このノックアウト株の有用性は、例えばシエーカーフラスコスケールの１２α−および７β−ＨＳＤＨ突然変異体の酵素発現によって検証された（結果は示さず）。
【0285】
実施例４：各場合ノックアウト株Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨ（タイプ１）の使用により生産された、７β−ＨＳＤＨ、ＦＨＤ Ｄ２２１Ｇおよび３α−ＨＳＤＨによるＤＨＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの酵素反応
【0286】
この実施例においては、特別のＦＤＨ突然変異体を用いる同時助因子再生を伴うＤＨＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの二段階酵素反応が検証される。使用したＦＤＨ突然変異体は助因子としてＮＡＤＰ＋とＮＡＤ＋の両方を受け入れるので、ＮＡＤＨ依存性３α−ＨＳＤＨのための反応バッチへ追加の助因子再生システムを導入する必要はない。
【0287】
例示のため、以下にグラフの形で示した二つの部分反応によって反応が示される。【化25】
【0288】
この目的のため、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓからの酵素７β−ＨＳＤＨと、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉからの酵素３α−ＨＳＤＨのと、上の実施例１に従って作ったノックアウト株Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨ（タイプ１）に互いに別々に調製された。
【0289】
４．１ 使用したプラスミド：７α−ＨＳＤＨ，３α−ＨＳＤＤおよびＦＤＨ Ｄ２２１Ｇの発現のためのプラスミド：
ｐＥＴ２８ａ（＋）−７β−ＨＳＤＨ
ｐＥＴ２２ｂ（＋）−３α−ＨＳＤＨ
ｐＥＴ２１ａ（＋）−ＦＤＨ−Ｄ２２１Ｇ
【0290】
４．２ 細菌株および培養条件：実施例１に従って作ったノックアウト株Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７β−ＨＳＤＨ（タイプ１）が必要な抗生物質を含有するＬＢ培地中で培養された。０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘発し、ＯＤ６００＝０．８に到達後、インキュベーションが２５℃および１４０ｒｐｍにおいて１２時間継続された。
【0291】
４．３ 酵素過発現および精製Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨ中の７β−ＨＳＤＨ、３α−ＨＳＤＨおよびＦＤＨ突然変異体Ｄ２２１Ｇの過発現、および酵素精製は以下の条件下で行われた。
【0292】
Ｅ．Ｃｏｌｉノックアウト株が発現構造体を用いて形質転換された。このため発現構造体を含有する株がカナマイシン３０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地（２リットルシェーカーフラスコ中２ｘ４００ｍｌ）中で増殖された。
【0293】
遠心により（１００００ｘｇ、１５分、４℃）細胞が収穫された。ペレットがリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８，０．１Ｍ ＰＭＳＦ含有）２０ｍｌ中に再懸濁された。細菌はＳｏｎｉｆｉｅｒ超音波装置（Ｂｒａｎｓｏｎドイツ）を用いて１分間の超音波処理（４０Ｗ出力、４０％作業インターバルおよび１分間ブレーク）によりコンスタント冷却下消化された。タンパク濃度が製造者の指令書に従ってＢＣＡテストキット（テルモＵＳＡ）を用いて決定された。さらに、サンプルが１２．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、そしてＣｏｏｍａｓｓｉｅブリリアントブルー染色により分析された。タンパクの純度はＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ Ｂｅｔａ ４．０．２（Ｓｃｉｏｎ ＵＳＡ）を用いてデンシトメトリーにより決定された。７β−ＨＳＤＨ、３α−ＨＳＤＨおよびＦＤＨの細胞抽出物は粗抽出物であった。７α−ＨＳＤＨは既にノックアウトされているので、さらなる精製は余分であった。
【0294】
培養培地リットル当たりの収量（シェーカーフラスコ中ＯＤ６００約６において）は次のとおりであった。７β−ＨＳＤＨ：３８８３Ｕ（ＤＨＣＡおよびＮＡＤＰＨに対して）
３α−ＨＳＤＨ：６８５３Ｕ（ＤＨＣＡおよびＮＡＤＨに対して）
ＦＤＨ変異体 ：４７Ｕ（ギ酸ナトリウムおよびＮＡＤ＋に対して）
【0295】
タンパクの含量および純粋はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ Ｂｅｔａ ４．０．２（Ｓｃｉｏｎ ＵＳＡ）によるデンシトメーター走査によって決定された。
【0296】
４．４ 調製的スケールにおける１２−ケト−ＵＤＣＡの酵素合成７β−ＨＳＤＨ（２．４Ｕ／ｍｌ）、３α−ＨＳＤＨ（２．４Ｕ／ｍｌ），ＦＤＨ Ｄ２２１Ｇ（０．３２５Ｕ／ｍｌ），ＮＡＤＰ＋（１０μＭ），ＮＡＤ＋（１０μＭ），ギ酸ナトリウム（２５０ｍＭ），ＤＨＣＡ（１０ｍＭ，３．２ｇ）およびリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ６）を含んでいる反応バッチ８００ｍｌを２４℃において撹拌した。この実験に使用した３種の酵素すべては追加の精製工程なしで粗抽出物として使用した。１２時間後、１０ｋＤａのポアサイズを有する膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）を用いて限外濾過によって酵素を除くことによって反応を停止した。濾液中の生産物を塩酸でｐＨ２へ酸性化し、その後紙で濾過することによって精製した。６０℃で一夜乾燥後、所望の生産物２．９ｇが得られた。
【0297】
分析データ（一部）：１Ｈ ＮＭＲ（重水素化ＤＭＳＯ，５００ＭＨＺ）δ＝３．９２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３αおよびＨ−７β）、
１Ｈ ＮＭＲ（重水素化ＤＭＳＯ，１２５ＭＨＺ）δ＝６９．３８（ＣＨ，３−Ｃ）；δ＝６９．０９（ＣＨ，７−Ｃ）；δ＝２１３．８６（Ｃ，１２−Ｃ）
収率９０．６％、純度９９％
【0298】
配列割り当て表【表11】
ＮＡ＝核酸配列
Ｌ＝ロング形
Ｋ＝ショート形
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]