特許 6023862 誘導肝幹細胞及びその製造方法、並びに、該細胞の応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6023862

(24)【登録日】2016年10月14日

(45)【発行日】2016年11月9日

(54)【発明の名称】誘導肝幹細胞及びその製造方法、並びに、該細胞の応用

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20161027BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20161027BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20161027BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20161027BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20161027BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20161027BHJP

   C07K 14/82 20060101ALI20161027BHJP

   C07K 14/76 20060101ALI20161027BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/10

   C12N5/0735

   C12N5/071

   C12N15/00 A

   C12N15/00 G

   C12N1/00 G

   C07K14/82

   C07K14/76

【請求項の数】6

【全頁数】39

(21)【出願番号】特願2015-178153(P2015-178153)

(22)【出願日】2015年9月10日

(62)【分割の表示】特願2011-552705(P2011-552705)の分割

【原出願日】2011年2月3日

(65)【公開番号】特開2016-10406(P2016-10406A)

(43)【公開日】2016年1月21日

【審査請求日】2015年10月8日

(31)【優先権主張番号】特願2010-22600(P2010-22600)

(32)【優先日】2010年2月3日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】515277791

【氏名又は名称】石川 哲也

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100075270

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 泰

(74)【代理人】

【識別番号】100101373

【弁理士】

【氏名又は名称】竹内 茂雄

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100128750

【弁理士】

【氏名又は名称】廣瀬 しのぶ

(74)【代理人】

【識別番号】100188374

【弁理士】

【氏名又は名称】一宮 維幸

(72)【発明者】

【氏名】石川 哲也

(72)【発明者】

【氏名】萩原 啓太郎

(72)【発明者】

【氏名】落谷 孝広

【審査官】 太田 雄三

(56)【参考文献】

【文献】 SI-TAYEB K et al.，Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.，Hepatology，２０１０年 １月，vol. 51，p. 297-305

【文献】 SULLIVAN G J et al.，Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells.，Hepatology，２０１０年 １月，vol. 51，p. 329-335

【文献】 落谷 孝広，肝細胞分化指向性の高いヒトHepa-iPS細胞の作製，Drug Delivery System，２０１０年 ５月，vol. 25, no. 3，p. 237

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣｉＮｉｉ

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも、下記（1）及び（2）の要件を具備することを特徴とするヒト誘導肝幹細胞：
（1）胚性幹細胞のマーカー遺伝子である下記表1の遺伝子群の中から選択され、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、NANOG遺伝子、ZFP42遺伝子、及びSALL4遺伝子を含む、少なくとも15種の遺伝子を発現するか又はNANOG遺伝子、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、TDGF1遺伝子、DNMT3B遺伝子、ZFP42遺伝子、TERT遺伝子、GDF3遺伝子、SALL4遺伝子、及びGABRB3遺伝子を含む、少なくとも15種の遺伝子を発現し;

【表1】

（2）肝細胞で特徴的に発現している、遺伝子グループ（a）-（f）の何れか一つを発現するか：
（a）SERPINA1遺伝子、ALB遺伝子、FGA遺伝子、及びAGT遺伝子;
（b）TF遺伝子、AHSG遺伝子、及びFABP1遺伝子;
（c）ASGR2遺伝子、C3遺伝子、C5遺伝子、F2遺伝子、SERPINA3遺伝子、SERPINA5遺伝子、SLC13A5遺伝子、及びVTN遺伝子;
（d）アルファ-フェトプロテイン（AFP）遺伝子、トランスサイレチン（TTR）遺伝子、アルブミン（ALB）遺伝子、及びアルファ1-アンチトリプシン（AAT）遺伝子;
（e）AFP遺伝子、TTR遺伝子、TF遺伝子、APOA2遺伝子、APOA4遺伝子、AHSG遺伝子、FGA遺伝子、AGT遺伝子、FABP1遺伝子、SERPINA1遺伝子、及びRBP4遺伝子;及び
（f）CD81遺伝子、SCARB1遺伝子、OCLN遺伝子、及びCLDN1遺伝子、
又は肝細胞で特徴的に産生している、タンパク質グループ（g）を発現している：
（g）アルファ-フェトプロテイン（AFP）タンパク質及びアルブミン（ALB）タンパク質。

【請求項2】

前記ヒト誘導肝幹細胞で発現している前記（1）に記載の胚性幹細胞のマーカー遺伝子の発現量が、ヒト胚性幹細胞で発現している遺伝子の発現量と比較して1/4から4倍である、請求項1に記載されたヒト誘導肝幹細胞。

【請求項3】

更に、被検物質により、下記表２の遺伝子群の中から選択される少なくとも1種の遺伝子について、その発現が抑制又は誘導され、若しくは、該遺伝子の遺伝子産物の活性が促進又は阻害される、請求項1又は2に記載されたヒト誘導肝幹細胞。

【表2】

【請求項4】

請求項1〜3の何れかに記載されたヒト誘導肝幹細胞を、TGF-betaシグナル阻害剤、Rho associatied kinase（Rho関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ）の阻害剤、MEK（mitogen activated protein kinase）/ERK（extracellular signal regulated kinases 1 and 2）経路阻害剤、及び/又はGSK（Glycogen Synthase Kinase）3阻害剤を添加した培地中で培養する工程を含む、ヒト誘導肝幹細胞の培養方法。

【請求項5】

請求項4に記載されたヒト誘導肝幹細胞の培養方法であって、TGF-betaシグナル阻害剤がA-83-01、Rho associatied kinase（Rho関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ）の阻害剤がY-27632、MEK（mitogen activated protein kinase）/ERK（extracellular signal regulated kinases 1 and 2）経路阻害剤がPD0325901、及びGSK（Glycogen Synthase Kinase）3阻害剤がCHIR99021であるヒト誘導肝幹細胞の培養方法。

【請求項6】

請求項1〜3の何れかに記載されたヒト誘導肝幹細胞を用いることを特徴とする非ヒト動物モデル作製方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、安全性試験、毒性試験、代謝試験、薬物相互作用試験、抗ウイルス活性試験、高脂血症薬、高血圧治療薬、低分子化合物医薬、抗体医薬などの医薬品のスクリーニング試験、創薬標的スクリーニング、動物モデル作製、肝細胞産生タンパク質の生産、及び再生医療に有用な誘導肝幹細胞に関し、特に、肝細胞としての性質を有し、胚性幹細胞のマーカー遺伝子群を胚性幹細胞と同等の量で発現すると共に、長期増殖継代培養が可能であることを特徴とする誘導肝幹細胞、その製造方法、及び、該細胞の応用に関する。

【背景技術】

【0002】

製薬企業における新薬の研究開発は、研究開発期間の長期化に加え、研究開発費用の高コスト化の問題も抱えている。しかも、将来、新薬になると期待される候補は数多く存在するものの、研究開発が進むにつれて有効性や安全性に問題が生じ、その大半が、開発を断念せざるを得ないという状況にある。

【0003】

一般に、新薬開発には９〜17年もの長い年月と、数十億円〜数百億円もの莫大な研究開発費が必要であるため、前臨床などの早期段階で候補化合物を絞り込むことのできる創薬ツールがあれば、その開発費を抑えることができると云われている。

【0004】

しかしながら、現在の非臨床試験においては、薬物の安全性や毒性等の評価において動物を用いた試験を行う必要があり、このことが、開発費を高騰させる一つの要因となっている。また、ヒトと動物の種差によって薬物の生体内動態が異なる場合があり、安全性について充分な評価を行うことができないため、臨床試験段階に入って候補化合物に毒性があることが分かり、開発を断念するという場合もある。

【0005】

そこで、研究開発の早期段階において、候補化合物のヒト生体内における動態等を予測及び評価する評価系の確立が強く望まれる中、現在、「種差の壁」の限界を有する動物実験に代わる、ヒト肝細胞を用いた評価システムの構築を目指し、日々研究がなされている。このような評価システムは、医薬品開発の早いステージで安全性の高い候補薬を正確に絞り込むことができるため、特に製薬企業に大きな需要がある。

【0006】

従来のヒト培養細胞を用いた非臨床試験では、外国人の初代培養肝細胞又は既存細胞株などが用いられている。しかしながら、初代培養肝細胞については圧倒的にドナーが不足しており、ロット差が非常に大きいという問題がある。とりわけ、日本人の初代培養肝細胞は、倫理問題及び法規制のために入手が著しく困難であり、安定的な供給は不可能である。

【0007】

更に、肝臓中に発現している薬物代謝酵素は、多くの医薬品の代謝を触媒するという重要な役割を果たしているが、遺伝子多型も存在し、その発現量及び活性には大きな個人差が存在するので、上記した非臨床試験における課題は深刻である。
また、膨大な数の個人の差に対応するために、それらの差を網羅する複数のドナー由来の初代培養肝細胞を代表細胞として、各種試験に繰り返し使用することが可能であることが望ましい。しかしながら、初代培養肝細胞を培養皿で培養しても、ほとんど増殖培養できないため、同じ肝細胞を継代培養して、繰り返し、様々な試験に使用することは事実上不可能であるという問題もある。

【0008】

一方、既存細胞株の多くは核型異常を起こした細胞であり、また、膨大な数の個人の差を網羅する多数の細胞株も存在しない。更に、従来の方法で長期継代培養された既存細胞株は初代培養肝細胞と同様の薬物代謝酵素活性やトランスポーター誘導能を示さないため、この結果から臨床におけるヒトでの安全性、代謝等を予測することは不可能である。
このような諸事情から、肝細胞の性質を有し、長期にわたって継代培養可能である細胞が望まれているが、そのような細胞が膨大な数の個人の差を網羅する複数のドナーから見出されたという報告は未だなされていない。

【0009】

また、肝臓の幹細胞として、肝細胞への分化能を有する肝幹細胞の存在が想定されている。しかしながら、胚性幹細胞及び誘導多能性幹細胞のように自己複製遺伝子を発現し、長期にわたって生体外で継代培養可能であるような性質を有する肝幹細胞が見出されたという報告も未だなされてはいない。

【0010】

そこで、生体外において、理論上すべての組織の体細胞、生殖細胞に分化する分化多能性を保ちつつ、未分化な状態でほぼ無限に自己複製させることができる胚性幹細胞（Embryonic stem cells：ES細胞）（本明細書においては、以下「胚性幹細胞」と記載する。）が、再生医療のみならず創薬の分野にも応用できないか検討されている。胚性幹細胞とは、動物の発生初期段階である胚盤胞期の胚の一部に属する内部細胞塊より作られる幹細胞株のことであり、英語の頭文字を取り、ES細胞とも呼ばれる。

【0011】

胚性幹細胞を樹立するには、受精卵又は受精卵より発生が進んだ胚盤胞までの段階の初期胚が必要となる。ヒトの場合には、受精卵を材料として用いるため、生命の萌芽を滅失してしまうということが倫理的な問題として認識されている。そのため、ヒト胚性幹細胞については、その作製を含め研究を認めない国があり、また、パーキンソン病などの神経変性疾患、脊髄損傷などこれまで根治療法が確立されていない疾患を治療できる可能性を認めて、研究を許容している国においても、ヒト胚性幹細胞の取り扱いには厳しい制約が課されている。このように、胚性幹細胞の基礎研究・応用研究では、倫理的な問題が高い障壁となっている。

【0012】

また、胚性幹細胞を実際に使用するには、胚性幹細胞をある特定の細胞に分化させる必要があり、肝細胞や神経細胞、心筋細胞、膵臓ベータ細胞などに分化させる方法が盛んに開発されている。しかしながら、このような特定の細胞への分化は難しく、特に肝細胞への分化誘導は困難である。現時点では、創薬研究に利用可能である高品質な成熟肝幹細胞への高効率分化誘導法は確立されていない。今までに報告された全ての分化誘導法は、3週間程度の長期間を要するものであり、高い費用、手間、時間をかけて高分化誘導させた肝細胞様細胞は、ほとんど増やすことはできないものである。

【0013】

最近、OCT3/4遺伝子（OCT3/4は遺伝子名でOCT3又は4と表記される場合もあるが、本明細書においては、以下POUF1遺伝子と記載する。）、SOX2遺伝子、KLF4遺伝子及びc-MYC遺伝子（特許文献1）の導入、或いは、塩基性線維芽細胞増殖因子存在下でのPOU5F1遺伝子、SOX2遺伝子及びKLF4遺伝子（非特許文献1）の導入により、ヒト等の体細胞から誘導多能性幹細胞という胚性幹細胞と同様な未分化細胞を作製することができるとの報告がなされた（特許文献2）。ヒトの誘導多能性幹細胞（induced Pluripotent Stem Cells;iPS細胞）（本明細書においては、以下「誘導多能性幹細胞」と記載する。）は、（1）体を形作るあらゆる細胞になり得る三胚葉への分化多能性と、（2）特定の条件下においてその未分化性を維持したまま培養皿の中で無限に継代培養することのできる、自己複製能という2つの特徴を有することが知られている。そして、このヒト誘導多能性幹細胞は、形態、遺伝子発現、細胞表面抗原、長期自己複製能、テラトーマ（良性腫瘍）形成能において、ヒト胚性幹細胞に非常に類似しており(非特許文献2、非特許文献3)、更に、HLAの遺伝子型は由来細胞である体細胞と全く同じであるという報告がなされている（非特許文献3）。

【0014】

この誘導多能性幹細胞の作製では、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、KLF4遺伝子、c-MYC遺伝子の4つの遺伝子、又は、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、KLF4遺伝子の3つの遺伝子を細胞へ導入するだけで分化した体細胞を未分化な多能性幹細胞へ「初期化・リプログラミング」すると考えられている。しかしながら、ヒト細胞では、4つの遺伝子で0.1%-0.01％、3つの遺伝子で0.01%-0.001％の効率で体細胞から誘導多能性幹細胞が作製される。従って、99.9%-99.999％の細胞は、遺伝子導入により誘導多能性幹細胞にリプログラミングされないということになる。

【0015】

更に、胚性幹細胞に特徴的に発現するNANOG遺伝子、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、SALL4遺伝子、LIN28遺伝子及びTERT遺伝子などは、多能性幹細胞の未分化性維持に重要な因子と考えられ、細胞の分化を抑制していると考えられていた。従って、分化した細胞では、分化遺伝子（分化細胞の性質）の発現に伴い、未分化性維持に重要な因子と考えられているNANOG遺伝子、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、SALL4遺伝子、LIN28遺伝子及びTERT遺伝子の発現は消失する。
つまり、未分化性維持に重要な因子と考えられているNANOG遺伝子、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、SALL4遺伝子、LIN28遺伝子及びTERT遺伝子、並びに、分化細胞の多数の性質（多数の分化遺伝子の発現）が共に発現する細胞は作製不可能であると考えられていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0016】

【特許文献1】特開2008-283972

【特許文献2】特開2008-307007

【非特許文献】

【0017】

【非特許文献1】Nakagawa M et al., Nat Biotechnol., 2008, 26,101-6

【非特許文献2】Takahashi K, Yamanaka S et al., Cell, 2007, 131, 861-872

【非特許文献3】Masaki H, Ishikawa T et al., Stem Cell Res., 2008, 1, 105-115

【0018】

そこで本発明者らは、未分化性維持に重要な遺伝子と肝細胞の多数の性質が共存する細胞の作製の可否について鋭意研究した結果、胚性幹細胞に特徴的な遺伝子を発現するにもかかわらず、肝細胞に特徴的な遺伝子を発現する誘導肝幹細胞が得られることを見出すと共に、この誘導肝幹細胞が、安全性試験、毒性試験、代謝試験、薬物相互作用試験、抗ウイルス活性試験、高脂血症薬、高血圧治療薬、低分子化合物医薬、抗体医薬などの医薬品のスクリーニング試験、創薬標的スクリーニング、動物モデルの作製、肝細胞産生タンパク質の生産、及び再生医療に有用であることを見出し、本発明を完成した。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0019】

従って本発明の第1の目的は、胚性幹細胞に特徴的な遺伝子を発現するにもかかわらず、肝細胞に特徴的な遺伝子を発現する誘導肝幹細胞を提供することにある。
本発明の第2の目的は、胚性幹細胞に特徴的な遺伝子を発現するにもかかわらず、肝細胞に特徴的な遺伝子を発現する誘導肝幹細胞を作製する方法を提供することにある。

【0020】

本発明の第3の目的は、本発明の誘導肝幹細胞を用いた、安全性試験方法、毒性試験方法、代謝試験方法、薬物相互作用試験方法、抗ウイルス活性試験方法、高脂血症薬、高血圧治療薬、低分子化合物医薬、抗体医薬などの医薬品のスクリーニング試験方法、創薬標的スクリーニング方法、動物モデル作製方法、肝細胞産生タンパク質の生産方法、及び再生医療等の方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0021】

即ち本発明の第1の発明は、少なくとも、下記（1）〜（3）の要件を具備することを特徴とする誘導肝幹細胞である（請求項1）。
（1）胚性幹細胞のマーカー遺伝子である下記表1の遺伝子群の中から選択される少なくとも15種の遺伝子を発現している。

【表1】

（2）肝細胞としての性質を有する。
（3）3日以上増殖培養又は継代培養可能である。

【0022】

本発明の誘導肝幹細胞で発現している前記（1）胚性幹細胞のマーカー遺伝子の発現量が、胚性幹細胞で発現している遺伝子の発現量と比較して1/8〜8倍であることが、誘導肝幹細胞の性質維持又は長期培養継続の観点から好ましく（請求項2）、特に、1/4〜4倍であることが好ましい（請求項3）。本発明の誘導肝幹細胞は、前記（1）胚性幹細胞のマーカー遺伝子として、NANOG遺伝子、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子及びSALL4遺伝子が発現していることが好ましい（請求項4）。

【0023】

前記（2）肝細胞としての性質に関連する遺伝子として、下記表2の遺伝子群から選択される15種以上が発現していることが好ましい（請求項5）。

【表2】

【0024】

また前記（2）肝細胞としての性質に関連する遺伝子として、AFP遺伝子、TTR遺伝子、TF遺伝子、APOA2遺伝子、APOA4遺伝子、AHSG遺伝子、FGA遺伝子、AGT遺伝子、FABP1遺伝子、SERPINA1遺伝子及びRBP4遺伝子が発現していることが好ましい（請求項6）。

【0025】

本発明の誘導肝幹細胞は、更に、中内胚葉系幹細胞及び/又は内胚葉系幹細胞に特徴的なSOX17遺伝子、FOXA2遺伝子、GSC遺伝子、EOMES遺伝子、TCF2遺伝子から選択される少なくとも１種を発現していることが好ましく（請求項7）、被検物質により、下記表3の遺伝子群の中から選択された少なくとも1種の遺伝子について、その発現が抑制又は誘導され、若しくは、該遺伝子の遺伝子産物の活性が促進又は阻害されることが好ましい（請求項8）。

【0026】

【表3】

【0027】

更に本発明の誘導肝幹細胞は、1カ月以上増殖培養又は継代培養可能であることが好ましい（請求項9）。

【0028】

本発明の第２の発明は、哺乳動物の細胞を誘導肝幹細胞に誘導する工程を含む誘導肝幹細胞の製造方法であって、該行程が、前記哺乳動物の細胞を、SOX2遺伝子の遺伝子産物に対してPOU5F1遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が大きくなるように、誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の遺伝子産物が存在する状態におく行程であることを特徴とする、誘導肝幹細胞の製造方法である（請求項10）。該行程は、前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子又はこれらの遺伝子産物を使用すると共に、SOX2遺伝子又は該遺伝子の遺伝子産物に対するPOU5F1遺伝子又は該遺伝子の遺伝子産物の使用比率が1より大きい行程であることが好ましい（請求項11）。
前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要な前記POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の使用比率が、POU5F1遺伝子＞KLF4遺伝子＞SOX2遺伝子の関係を満たすことが好ましく（請求項12）、特に、4：2：1であることが好ましい（請求項13）。

【0029】

前記哺乳動物の細胞として、成体由来の細胞、新生仔由来の細胞、新生仔皮膚由来の細胞、発がん個体の細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、又は、胚性幹細胞若しくは誘導多能性幹細胞から分化した細胞を用いることが好ましく（請求項14）、前記哺乳動物がヒトであることが好ましい（請求項15）。

【0030】

更に本発明の第3の発明は、本発明の誘導肝幹細胞を用いる試験方法であり（請求項16）、この試験方法としては、安全性試験方法、毒性試験方法、代謝試験方法、薬物相互作用試験方法、抗ウイルス活性試験方法、高脂血症薬、高血圧治療薬、低分子化合物医薬、抗体医薬などについての医薬品のスクリーニング試験方法（請求項17）がある。本発明の第4の発明は創薬標的スクリーニング方法（請求項18）、第5の発明は動物モデル作製方法（請求項19）、第6の発明は肝細胞産生タンパク質の生産方法（請求項20）、第7の発明は哺乳動物を対象とする治療方法である（請求項21）。

【発明の効果】

【0031】

本発明によれば、人種、性、年齢、遺伝的背景が異なるドナーからヒト誘導肝幹細胞を作製することが可能であるため、本発明は、新薬の臨床試験に先立つ安全性試験、毒性試験、代謝試験、薬物相互作用試験などの非臨床試験に有効である。また、ヒト誘導肝幹細胞を用いた非臨床試験は、新薬開発の効率化に寄与する創薬ツールとなる。

【発明を実施するための最良の形態】

【0032】

以下、本発明の誘導肝幹細胞、その製造方法、及び、該細胞の応用について詳細に説明する。
本発明の誘導肝幹細胞は、少なくとも、下記（1）〜（3）の要件を具備することを特徴とする誘導肝幹細胞である。
（1）胚性幹細胞のマーカー遺伝子である前記表1の遺伝子群の中から選択された少なくとも15種の遺伝子を発現している。
（2）肝細胞としての性質を有する。
（3）3日以上増殖培養又は継代培養可能である。

【0033】

次に、本発明の誘導肝幹細胞において、胚性幹細胞のマーカー遺伝子として知られている前記（1）胚性幹細胞のマーカー遺伝子の発現は、本発明の誘導肝幹細胞が、理論的には無限に自己複製し、事実上誘導肝幹細胞のまま長期継代培養可能な性質を有する細胞であることを特定するものである。本発明の誘導肝幹細胞においては、前記表1の遺伝子群の中から選択される少なくとも15種の遺伝子が発現していることが必要である。

【0034】

本発明の誘導肝幹細胞においては、前記（1）胚性幹細胞のマーカー遺伝子が発現していればよく、特に制限されることはないが、本発明の誘導肝幹細胞が発現している前記（1）胚性幹細胞のマーカー遺伝子の発現量が、胚性幹細胞で発現している遺伝子の発現量と比較して1/16〜16倍であることが好ましく、1/8〜8倍であることがより好ましい。特に、本発明の誘導肝幹細胞が発現している前記（1）胚性幹細胞のマーカー遺伝子の発現量が、胚性幹細胞で発現している遺伝子の発現量と比較してほぼ同等、すなわち、1/4〜4倍以内であることが、誘導肝幹細胞の状態を維持するため又は長期継代培養の観点から好ましく、1/2〜2倍以内であることが最も好ましい。

【0035】

本発明の誘導肝幹細胞においては、未分化であることを維持する観点から、前記（1）胚性幹細胞のマーカー遺伝子として、前記表1の遺伝子群の中から選択される少なくとも15種の遺伝子が、本発明の誘導肝幹細胞で発現している遺伝子の発現量と、胚性幹細胞で発現している遺伝子の発現量とを比較して1/2〜2倍の範囲で発現していることが好ましく、この範囲内で発現している前記（1）胚性幹細胞のマーカー遺伝子の数が、20、25以上と増えるほど好ましい。

【0036】

本発明の誘導肝幹細胞においては、前記（1）胚性幹細胞のマーカー遺伝子として、前記表1の遺伝子群のうち、胚性幹細胞で発現している遺伝子の発現量と比較して、5種以上の遺伝子の発現量が1/2〜2倍、10種以上の遺伝子の発現量が1/4〜4倍、20種以上の遺伝子の発現量が1/8〜8倍の範囲で発現していることが好ましい。

【0037】

本発明の誘導肝幹細胞においては、前記（1）胚性幹細胞のマーカー遺伝子として、前記表1の遺伝子群のうち、NANOG遺伝子、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子を含む5種の遺伝子が、胚性幹細胞で発現している遺伝子の発現量と比較して1/4〜4倍の範囲で発現していることが好ましく、NANOG遺伝子、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子及びSALL4遺伝子の5遺伝子が、1/4〜4倍の範囲で発現していることがより好ましく、特に、NANOG遺伝子、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、TDGF1遺伝子、DNMT3B遺伝子、ZFP42遺伝子、TERT遺伝子、GDF3遺伝子、SALL4遺伝子、GABRB3遺伝子の10種類の遺伝子が、1/4〜4倍の範囲で発現しているものが更に好ましい。

【0038】

前記した比較対象となる胚性幹細胞としては、hES_H9（GSM194390）、hES_BG03（GSM194391）、hES_ES01（GSM194392）の何れかが用いられる。これらの遺伝子発現データは、データベースであるGene Expression Omnibus〔GEO〕（“Gene Expression Omnibus〔GEO〕、[online]、 [2010年1月28日検索]、インターネット＜http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/＞）から取得することが可能である。

【0039】

本発明の誘導肝幹細胞は、前記（2）肝細胞としての性質を有することが必要である。本発明の誘導肝幹細胞における肝細胞としての性質としては、肝細胞に特徴的な性質であれば、特に制限されることはないが、主に、肝細胞に特徴的なタンパク質（遺伝子産物）の産生等が挙げられる。具体的には、血清タンパク質（AFP、TTR、TF、APOA2、APOA4、AHSG、FGA、AGT、FABP1、SERPINA1、RBP4など）の産生、糖類代謝、アミノ酸代謝、脂質代謝、及び鉄代謝関連の酵素の産生、薬物代謝酵素及びトランスポーターの産生などが挙げられるが、これらに制限されることはない。

【0040】

本発明の誘導肝幹細胞は、前記（2）肝細胞としての性質に関連する遺伝子を発現していることが好ましい。このような遺伝子は、肝細胞で特徴的に発現している遺伝子であり、肝細胞としての性質に関連する遺伝子であればよく、例えば、肝細胞に特徴的なタンパク質の産生などに関連する遺伝子を例示することができる。具体的には、血清タンパク質の産生、糖類代謝、アミノ酸代謝、脂質代謝、及び鉄代謝関連の酵素の産生、薬物代謝酵素及びトランスポーターの産生等に関連する遺伝子を挙げることができるが、これらに制限されるものではない。特に、薬物代謝酵素及びトランスポーターの生産に関連する遺伝子としては、例えば、前記表3の遺伝子群などが挙げられる。このような薬物代謝酵素及びトランスポーターの生産に関連する遺伝子は、本発明の誘導肝幹細胞が取り込んだ、医薬品の候補化合物などの被検物質等により、遺伝子発現、誘導、抑制等を示す。

【0041】

本発明の誘導肝幹細胞の一態様としては、前記（2）肝細胞としての性質に関連する遺伝子として、肝関連遺伝子である前記表2の遺伝子群から選択された少なくとも15種の遺伝子を発現していてもよい。これらの遺伝子は、ヒト初代培養肝細胞で発現している、肝細胞に特徴的な遺伝子である。
各遺伝子シンボルに対するジェンバンクアセッション番号は前記表2の通りである。各遺伝子情報については、NCBIのホームページ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/）から入手できる。

【0042】

前記（2）肝細胞としての性質に関連する遺伝子としては、肝細胞に特徴的な性質を強く有する細胞が得られるという観点から、前記表2の遺伝子群のうち50種以上の遺伝子が発現していることが好ましく、特に、80種以上が発現していることが好ましい。本発明の誘導肝幹細胞においては、前記表2の遺伝子群の中でも、AFP遺伝子を発現していることが好ましく、特に、AFP遺伝子、TTR遺伝子、TF遺伝子、APOA2遺伝子、APOA4遺伝子、AHSG遺伝子、FGA遺伝子、AGT遺伝子、FABP1遺伝子、SERPINA1遺伝子及びRBP4遺伝子が発現していることが好ましい。
前記遺伝子は、一般に肝細胞で数多く発現している遺伝子であり、逆に胚性幹細胞も含めた肝細胞以外の細胞では、これらの遺伝子の多くは、実質的に発現していないことが知られている。

【0043】

また、本発明の誘導肝幹細胞の別の態様では、前記（2）肝細胞としての性質に関連する遺伝子として、以下に挙げる遺伝子を発現していてもよい。

【0044】

本発明の誘導肝幹細胞においては、GSTM3遺伝子、SLC22A1遺伝子、GSTA5遺伝子、ALDH1A1遺伝子、CYP27A1遺伝子、CYP1B1遺伝子、ALDH2遺伝子、GSTA2遺伝子、GSTA3遺伝子、GSTA5遺伝子、CYP4A2遺伝子、UGT2B11遺伝子などを発現していてもよい。このような遺伝子が発現している場合には、薬物動態に関わるタンパク質を産生するような肝細胞の性質を示すので、特に、毒性試験方法に有用である。

【0045】

本発明の誘導肝幹細胞においては、GSTM3遺伝子、SLC22A1遺伝子、GSTA5遺伝子、ALDH1A1遺伝子、CYP27A1遺伝子、CYP1B1遺伝子、ALDH2遺伝子、GSTA2遺伝子、GSTA3遺伝子、GSTA5遺伝子、CYP4A2遺伝子、UGT2B11遺伝子などを発現していてもよい。このような遺伝子が発現している場合には、薬物代謝関連酵素に関わるタンパク質を産生するような肝細胞の性質を示すので、特に、代謝試験方法に有用である。

【0046】

本発明の誘導肝幹細胞においては、CD81遺伝子、SCARB1遺伝子、OCLN遺伝子、CLDN1遺伝子などを発現していてもよい。このような遺伝子が発現している場合には、HCVの複製に関するタンパク質を産生するような肝細胞の性質を示すので、特に、抗ウイルス活性試験方法に有用である。

【0047】

本発明の誘導肝幹細胞においては、APOA1遺伝子、APOA2遺伝子、APOA4遺伝子、APOB遺伝子、FABP1遺伝子、AGT遺伝子などを発現していてもよい。このような遺伝子が発現している場合には、脂質代謝、血圧に関するタンパク質を産生するような肝細胞の性質を示すので、特に、高脂血症薬、高血圧治療薬などの医薬品スクリーニング試験に有用である。

【0048】

本発明の誘導肝幹細胞においては、CCL2遺伝子、CDKN1A遺伝子、ICAM1遺伝子、JUNB遺伝子、RGS2遺伝子、CCND1遺伝子などを発現していてもよい。このような遺伝子が発現している場合には，トランスポーター及び代謝型受容体関連タンパク質を生産するような肝細胞の性質を示すので、特に、低分子化合物、抗体などの医薬品のスクリーニング試験に有用である。

【0049】

本発明の誘導肝幹細胞においては、ALB遺伝子、TTR遺伝子、TF遺伝子、RBP4遺伝子、FGA遺伝子、FGB遺伝子、FGG遺伝子、AHSG遺伝子、AFP遺伝子、FN1遺伝子、SERPINA1遺伝子、PLG遺伝子などを発現していてもよい。このような遺伝子が発現している場合には、血清タンパク質の生産のような肝細胞の性質を示すので、特に、動物モデル作製方法に有用である。

【0050】

本発明の誘導肝幹細胞においては、ALB遺伝子、TTR遺伝子、TF遺伝子、RBP4遺伝子、FGA遺伝子、FGB遺伝子、FGG遺伝子、AHSG遺伝子、AFP遺伝子、FN1遺伝子、SERPINA1遺伝子、PLG遺伝子などを発現していてもよい。このような遺伝子が発現している場合には、血清タンパク質の生産のような肝細胞の性質を示すので、特に、ヒト以外の動物を対象とする治療方法に有用である。

【0051】

本発明の誘導肝幹細胞は、中内胚葉系幹細胞及び/又は内胚葉系幹細胞に特徴的な性質を有していてもよく、更に、中内胚葉系幹細胞及び/又は内胚葉系幹細胞に発現する遺伝子であるSOX17遺伝子、FOXA2遺伝子、GSC遺伝子、EOMES遺伝子、TCF2遺伝子から選択される少なくとも１種を発現していてもよい。特に、SOX17遺伝子、FOXA2遺伝子、GSC遺伝子、EOMES遺伝子及びTCF2遺伝子の全てを発現しているものが好ましい。

【0052】

また、本発明の誘導肝幹細胞は、被検物質により、薬物代謝酵素及びトランスポーターの産生に関連する遺伝子である前記表３の遺伝子群の中から選択される少なくとも１種について、その発現が抑制又は誘導され、若しくは、該遺伝子の遺伝子産物の活性が促進又は阻害されるものであってもよい。ここで被検物質とは、医薬品の候補物質のことであり、本発明の誘導肝幹細胞がこのような被検物質を取り込むと、本発明の誘導肝幹細胞の薬物代謝酵素及びトランスポーターの産生に関連する遺伝子の発現が抑制又は誘導され、これら遺伝子の遺伝子産物の活性が促進又は阻害される。このような細胞は、薬物代謝試験などの創薬応用に有用である。トランスポーター遺伝子、核レセプター遺伝子を含む薬物代謝遺伝子の発現については、個人差があることが知られており、本発明の誘導肝幹細胞は、多種多様の細胞から誘導できるため、このような個人差を網羅した多数の誘導幹細胞を得ることが可能である。従って、被検物質により、本発明の誘導肝幹細胞において前記表3に記載された遺伝子の発現が抑制・誘導及び遺伝子産物の活性が誘導・阻害されるものであれば、創薬開発ツールとして有用である。従って、本発明の誘導肝幹細胞は、薬物動態試験、安全性試験、毒性試験、代謝試験、薬物相互作用試験等に有用な細胞である。
本発明の誘導肝幹細胞は、多様な肝細胞の性質を示すので、各種医薬品・化合物の代謝、作用機構の解析、肝臓の形成と機能を制御する分子の探索及び解析等に非常に有用である。従って、安全性試験、毒性試験、代謝試験、薬物相互作用試験、抗ウイルス活性試験（特にB型・C型肝炎）、高脂血症薬、高血圧治療薬、低分子化合物医薬、抗体医薬等の医薬品のスクリーニング試験、創薬標的のスクリーニング（肝繊維化、肝硬変、脂肪肝炎、メタボリックシンドローム、造血など）、肝細胞産生タンパク質の生産、動物モデル作製、再生医療等に用いることができる。

【0053】

また、本発明の誘導肝幹細胞は3日以上増殖培養又は継代培養が可能であるが、1カ月以上、半年或いは1年以上という長期に渡って増殖可能な誘導肝幹細胞であり、この事は理論的には無限に自己複製が可能であることを意味する。

【0054】

本発明の誘導肝幹細胞を増殖培養又は継代培養する培地としては、胚性幹細胞、多能性幹細胞等を増殖培養又は継代培養することが可能な培地であれば、特に制限されることはないが、胚性幹細胞、多能性幹細胞等の培養に適した培地が好ましく用いられる。このような培地としては、例えば、ES培地〔40％ ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、40％のF12培地（シグマ社製）、2mM L-グルタミン又はGlutaMAX（シグマ社製）、１％のnon essential amino acid（シグマ社製）、0.1mMのβ-メルカプトエタノール（シグマ社製）、15〜20％のKnockout Serum Replacement(インビトロジェン社製)、10μg/ｍlのゲンタマイシン（インビトロジェン社製）、4〜10ng/mlのFGF2因子〕（以下ES培地という）、0.1mMのβ-メルカプトエタノールを除いたES培地で、マウス胚性繊維芽細胞（以下MEF）を24時間培養した上清である馴化培地に、0.1mMのβ-メルカプトエタノール及び10ng/mlのFGF2を加えた培地（以下MEF馴化ES培地）、iPS細胞用最適培地（iPSellon社製）、フィーダー細胞用最適培地（iPSellon社製）、StemPro〔登録商標〕hESC SFM（インビトロジェン社製）、mTeSR1（ステムセルテクノロジー・ベリタス社製）、アニマルプロテインフリーのヒトES/iPS細胞維持用無血清培地TeSR2〔ST-05860〕（ステムセルテクノロジー・ベリタス社製）、霊長類ES/iPS細胞用培地（リプロセル社）、ReproStem（リプロセル社）、ReproFF（リプロセル社）などを例示することができるが、これらの培地に制限されることはない。ヒトの細胞を用いる場合には、ヒト胚性幹細胞の培養に適した培地を用いてもよい。

【0055】

本発明の誘導肝幹細胞を増殖培養又は継代培養する手法については、胚性幹細胞、多能性幹細胞等の培養において当業者が通常用いる方法であれば、特に制限されることはない。例えば、細胞から培地を除きPBS(-)で洗浄し、細胞剥離液を加えて静置した後、細胞剥離液を除き、1X抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地を加えて遠心分離し、更に、上清を除去した後、1X抗生物質-抗真菌剤、mTeSR及びY-27632を加え、MEFが播種してあるゼラチンコート又はコラーゲンコートに細胞懸濁液を播種することによって、継代培養する方法などを具体的に例示することができる。

【0056】

更に、本発明の誘導肝幹細胞においては、遺伝子導入から1カ月以上長期培養した場合でも、分化しないように、TGF-betaなどの活性を阻害又は中和する各種の阻害剤又は抗体、HGF、FGF1〜21等の線維芽細胞増殖因子、アクチビンなどを培地に添加してもよく、線維芽細胞増殖因子としては、特に酸性線維芽細胞増殖因子であるFGF1（aFGFともいう。以下FGF1と記載する。）、塩基性線維芽細胞増殖因子であるFGF2（bFGFともいう。以下FGF2と記載する。）、FGF4、FGF7が好ましく用いられる。このような抗体としては、例えば、これら増殖因子に対するポリクローナル又はモノクローナル中和抗体などを例示することができる。また、microRNA、siRNAやアンチセンスRNAを用いて、TGF-betaなどの遺伝子の発現を抑制してもよい。TGF-betaなどに対する低分子化合物の阻害剤を用いることも可能である。例えば、TGF-betaシグナリングの阻害剤としてはALK阻害剤（A-83-01など）、TGF-beta RI阻害剤、TGF-beta RIキナーゼ阻害剤などが挙げられる。なお、上記した線維芽細胞増殖因子は、誘導される体細胞の種類に応じて選択され、ヒト、マウス、牛、馬、豚、ゼブラフィッシュ等を由来とする線維芽細胞増殖因子を用いることができる。

【0057】

更に、Rho associatied kinase (Rho関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ)の阻害剤であるY-27632 (Calbiochem; water soluble)、Fasudil(HA1077:Calbiochem)などを培地中に添加することもできる。

【0058】

その他にも、FGF receptor tyrosine kinase、MEK（mitogen activated protein kinase）/ERK（extracellular signal regulated kinases 1 and 2）経路、及びGSK(Glycogen Synthase Kinase)3の三つの低分子阻害剤〔SU5402、PD184352及びCHIR99021〕、MEK/ERK経路及びGSK3の二つの低分子阻害剤〔PD0325901及びCHIR99021〕、ヒストンメチル化酵素G9aの阻害剤である低分子化合物〔BIX-01294（BIX）〕、アザシチジン、トリコスタチンA（TSA）、7-hydroxyflavone、lysergic acid ethylamide、kenpaullone、TGFβ receptorI kinase/activin-like kinase 5 （ALK5）の阻害剤〔EMD 616452〕、TGF-βreceptor 1（TGFBR1）kinaseの阻害剤〔E-616452及びE-616451〕、Src-family kinaseの阻害剤〔EI-275〕、thiazovivin、PD0325901、CHIR99021、SU5402、PD184352、SB431542、抗TGF-β中和抗体、A-83-01、Nr5a2、p53阻害化合物、p53に対するsiRNA、p53経路の阻害剤等を培地に添加することもできる。

【0059】

また、本発明の誘導肝幹細胞は、公知の方法により凍結及び解凍することが可能である。凍結方法としては、例えば、細胞から培地を除きPBS(-)で洗浄し、細胞剥離液を加えて静置した後、細胞剥離液を除き、1X抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地を加えて遠心分離し、次いで、上清を除去した後、凍結用保存液を加えてセラムチューブに分注し、-80℃で一晩凍結させた後、液体窒素にて保管する方法等を例示することができる。また、解凍方法としては、37℃の恒温槽中で解凍し、1X抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地に懸濁させて用いる方法等が例示できる。

【0060】

第2の発明である、哺乳動物の細胞を誘導肝幹細胞に誘導する工程を含む誘導肝幹細胞の製造方法において、対象となる哺乳動物としては、哺乳動物であれば特に制限されることはなく、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ミニブタなどのブタ、ウシ、ウマ、カニクイザルなどのサル等の霊長類、ヒト等を挙げることができるが、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ネコ、ミニブタ、ウマ、カニクイザル、ヒトが好ましく、特にヒトが好ましく用いられる。

【0061】

また、前記哺乳動物の細胞としては、哺乳動物の細胞であれば何れも使用可能である。例えば、脳、肝臓、食道、胃、十二指腸、小腸、大腸、結腸、膵臓、腎臓、肺などの各臓器や、骨髄液、筋肉、脂肪組織、末梢血、皮膚、骨格筋の細胞などを例示することができるが、これらに制限されることはない。中でも、内胚葉性の肝臓、胃、十二指腸、小腸、大腸、結腸、膵臓、肺等由来の細胞が好ましく、特に、胃、結腸由来の細胞が好ましく用いられる。これらの細胞は、がん治療の手術時に、医療廃棄物として容易に入手することが可能である点からも好ましい。

【0062】

また、臍帯組織（臍帯、臍帯血）、羊膜、胎盤、羊水由来細胞などの出産時に付随する組織、体液由来の細胞も用いることが可能であり、特に新生仔の各組織のような、出生直後の組織（新生仔の皮膚等）由来の細胞を用いてもよい。また、動物の胎仔の細胞なども利用可能である。

【0063】

また、前記哺乳動物の細胞として、成体由来の細胞、新生仔由来の細胞、新生仔皮膚由来の細胞、発がん個体の細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞から分化した細胞などを用いることができる。

【0064】

発がん個体のがんの種類は特に制限されることはなく、悪性腫瘍、固形がん、癌種、肉腫、脳腫瘍、造血器がん、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫等の、何れのがんも使用することができる。例えば、口腔がん、咽頭がん、上気道がん、肺がん、肺細胞がん、食道がん、胃がん、十二指腸がん、膵がん、肝がん、胆のうがん、胆道がん、大腸がん、結腸がん、直腸がん、乳がん、甲状腺がん、子宮体がん、子宮けいがん、卵巣がん、精巣がん、腎がん、膀胱がん、前立腺がん、皮膚がん、悪性黒色腫、脳腫瘍、骨肉腫、血液のがん等が挙げられるが、これらに制限されることはない。中でも、内胚葉系である、胃がん、乳がん、結腸がん、大腸がん個体の非がん組織又はがん組織由来の細胞が好ましく用いられる。

【0065】

本発明の製造方法において、前記哺乳動物の細胞として哺乳動物から採取された細胞を用いることもできる。哺乳動物から採取した細胞は、直ちに使用しても、公知の方法で保存、培養等した後使用することも可能である。培養する場合には、継代数は特に制限されるものではないが、初代培養から第4継代培養までの細胞が好ましく、初代培養から第2継代培養までの細胞を用いることが特に好ましい。ここで、初代培養とは、哺乳動物から細胞が採取された直後の培養を意味し、初代培養を1回継代培養すると第2継代培養、更に1回継代培養すると第3継代培養となる。

【0066】

本発明の製造方法における誘導肝幹細胞に誘導する行程は、前記哺乳動物の細胞を、SOX2遺伝子の遺伝子産物に対してPOU5F1遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が大きくなるように、誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の遺伝子産物が存在する状態におく行程であることをが必要である。なお、ここで「状態におく」とは、そのような状態になるように調節する場合のみならず、そのような状態になっている細胞を選択して調製する場合をも含む概念である。
また本発明の製造方法においては、哺乳動物の細胞から本発明の誘導肝幹細胞への誘導時に、これらの遺伝子の遺伝子産物が特定の比率で細胞内に存在することが必要である。これにより、哺乳動物の細胞に内在される前記（１）胚性幹細胞のマーカー遺伝子が発現し、最終的に、本発明の誘導肝幹細胞が誘導される。
本発明の製造方法においては、前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子に係る遺伝子産物の細胞内存在比率が、POU5F1遺伝子＞KLF4遺伝子＞SOX2遺伝子の関係を満たすことが好ましく、更にPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が、順次、4:2:1となるように調節することが、誘導肝幹細胞への高効率誘導の観点から最も好ましい。

【0067】

本発明の製造方法においては、前記哺乳動物の細胞を、SOX2遺伝子の遺伝子産物に対してPOU5F1遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が大きくなるように、誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の遺伝子産物が存在する状態におくことができればよく、その方法としては、例えば誘導多能性幹細胞の誘導技術として公知の方法などがあるが、これに制限されることはない。

【0068】

例えば、前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の発現強度を上昇させることができる遺伝子を、前記哺乳動物の細胞に導入してこれらの遺伝子を強発現させ、細胞に遺伝子産物を生産させたり、このような遺伝子の発現強度を上昇させることができる遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質やmRNAなどを前記哺乳動物の細胞中に導入するなどの方法を例示することができる。必要に応じて、前記哺乳動物の細胞内へ導入するベクターの量、導入する遺伝子の量、培地に添加する遺伝子産物の量などを調節することによって、SOX2遺伝子の遺伝子産物に対してPOU5F1遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が大きくなるように調節することが可能である。

【0069】

本発明の製造方法において、前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の発現強度を上昇させることができる遺伝子としては、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子そのものを用いることができる。前記哺乳動物の細胞中における前記POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子又はSOX2遺伝子の発現が不十分である場合には、該細胞中に不足した遺伝子又は遺伝子産物を導入し、前記細胞中の前記POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子又はSOX2遺伝子が発現している場合には、それ以外の遺伝子又はその遺伝子産物を、前記POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の代わりに導入しても良い。上記それ以外の遺伝子としては、誘導多能性幹細胞を誘導することが知られている遺伝子、例えば、NANOG遺伝子、LIN28遺伝子、TBX3遺伝子、PRDM14遺伝子、L-MYC遺伝子、c-MYC遺伝子、N-MYC遺伝子、SALL1遺伝子、SALL4遺伝子、UTF1遺伝子、ESRRB遺伝子、NR5A2遺伝子、REM2 GTPase遺伝子、TCL-1A遺伝子、Yes-associated protein (YAP)遺伝子、E-カドヘリン遺伝子、p53ドミナントネガティブ変異体遺伝子、p53shRNA遺伝子等を用いることができる。前記誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の発現強度を上昇させることができる遺伝子は、単独、又は二種以上を組み合わせて使用することができる。
また、前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子と、これらの遺伝子の代わりに用いられる遺伝子を組み合わせて使用することは、本発明の好ましい実施態様である。

【0070】

例えば、既に、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、c-MYC遺伝子又はSOX2遺伝子を強く発現している細胞であれば、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、c-MYC遺伝子又はSOX2遺伝子を使用することなく、p53ドミナントネガティブ変異体遺伝子、p53shRNA遺伝子等を組み合わせて使用することにより、本発明の誘導肝幹細胞を誘導することも可能である。

【0071】

前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子及びこれらの遺伝子の代わりに使用される遺伝子の遺伝子産物であるタンパク質やmRNAなどを、前記哺乳動物の細胞中に導入する方法としては、誘導多能性幹細胞の誘導技術として公知の方法などをあげることができるが、これに制限されることはない。例えば、これらの遺伝子の遺伝子産物である、タンパク質やmRNA等を培地に添加しても良い。

【0072】

本発明の製造方法においては、更に、誘導肝幹細胞への誘導効率を上げるために、誘導多能性幹細胞を誘導することが知られている化合物、例えば、FGF receptor tyrosine kinase、MEK（mitogen activated protein kinase）/ERK（extracellular signal regulated kinases 1 and 2）経路、GSK(Glycogen Synthase Kinase)3の三つの低分子阻害剤〔SU5402、PD184352及びCHIR99021〕、MEK/ERK経路及びGSK3の二つの低分子阻害剤〔PD0325901及びCHIR99021〕、ヒストンメチル化酵素G9aの阻害剤である低分子化合物〔BIX-01294（BIX）〕、アザシチジン、トリコスタチンA（TSA）、7-hydroxyflavone、lysergic acid ethylamide、kenpaullone、TGFβ receptorI kinase/activin-like kinase 5 （ALK5）の阻害剤〔EMD 616452〕、TGF-βreceptor 1（TGFBR1）kinaseの阻害剤〔E-616452及びE-616451〕、Src-family kinaseの阻害剤〔EI-275〕、thiazovivin、PD0325901、CHIR99021、SU5402、PD184352、SB431542、抗TGF-β中和抗体、A-83-01、Nr5a2、p53阻害化合物、p53に対するsiRNA、p53経路の阻害剤等を、本発明の誘導肝幹細胞を誘導する際に用いられる培地中に添加することができる。

【0073】

また、誘導肝幹細胞への誘導効率を上げるため、更に、microRNAを用いることも可能である。具体的には、microRNAを前記哺乳動物の細胞に発現ベクターを用いて導入したり、microRNAを培地に添加したりするなど、当業者が通常行う方法を用いることができる。

【0074】

誘導肝幹細胞への誘導効率を上げるために用いることができるmicroRNAとしては、miR-154、miR-200、miR-368、miR-371、miR-291-3p、miR-294、miR-295、miR-302などを用いることができる。ヒトの細胞を用いる場合には、ヒトのmicroRNAを用いてもよい。具体的にはhsa-miR-372〔MI0000780〕、hsa-miR-373〔MI0000781〕、hsa-miR-302b〔MI0000772〕、hsa-miR-302c〔MI0000773〕、hsa-miR-302a〔MI0000738〕、hsa-miR-302d〔MI0000774〕、hsa-miR-367〔MI0000775〕、hsa-miR-520〔MI0003158〕等が挙げられるが、これらのmicroRNAに制限されることはない。これらのmicroRNAの中から１種、又は、２種以上を組み合わせて用いることができる。

【0075】

これらのmicroRNAの情報については、miRBaseのホームページ（http://www.mirbase.org/）から入手することが可能である。かっこ内は、miRBaseのアクセション番号であり、hsa-はヒトを表す。

【0076】

前記哺乳動物の細胞を誘導肝幹細胞に誘導する工程においては、本発明の誘導肝幹細胞を培養する培地に添加される、TGF-betaなどの活性を阻害又は中和する各々の阻害剤又は抗体、FGF1〜21等の線維芽細胞増殖因子などを使用することもできる。線維芽細胞増殖因子としては、特にFGF1、FGF2、FGF4、FGF7が好ましく用いられる。TGF-betaの阻害剤としては、例えば、TGF-betaシグナリングの阻害剤としてはALK阻害剤（A-83-01など）、TGF-beta RI阻害剤、TGF-beta RIキナーゼ阻害剤などが挙げられる。
これらの成分は、前記哺乳動物の細胞を誘導肝幹細胞に誘導する工程において用いられる培地中に添加することが好ましい。

【0077】

前記した誘導肝幹細胞に誘導する行程として、好ましい例としては、前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子又はこれらの遺伝子産物を使用すると共に、SOX2遺伝子又は該遺伝子の遺伝子産物に対するPOU5F1遺伝子又は該遺伝子の遺伝子産物の使用比率が１より大きいことが好ましい。誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子又はこれらの遺伝子産物の使用比率が、POU5F1遺伝子＞KLF4遺伝子＞SOX2遺伝子の関係を満たすことが好ましく、更にPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子又はこれらの遺伝子産物の使用比率が、順次、4:2:1であることが、誘導肝幹細胞への高効率誘導の観点から最も好ましい。POU5F1（OCT3/4）遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子の各遺伝子シンボルに対するジェンバンクアセッション番号は表4の通りである。

【0078】

【表4】

【0079】

本発明の製造方法において、前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子を使用する場合には、これらの遺伝子を発現ベクターなどを利用して前記哺乳動物の細胞中に導入する方法など、当業者が通常行う方法を用いることができる。誘導肝幹細胞への誘導に必要な前記POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子のタンパク質やmRNA等の遺伝子産物を使用する場合には、誘導の際に用いる培地に遺伝子産物を添加するなど、当業者が通常行う方法を用いることができる。

【0080】

上記したように前記の誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子、これらの遺伝子産物に加え、更に、上記した本発明の誘導肝幹細胞の誘導効率を上げるために、前記したNANOG遺伝子、LIN28遺伝子、TBX3遺伝子、PRDM14遺伝子、L-MYC遺伝子、c-MYC遺伝子、N-MYC遺伝子、SALL1遺伝子、SALL4遺伝子、UTF1遺伝子、ESRRB遺伝子、NR5A2遺伝子、REM2 GTPase遺伝子、TCL-1A遺伝子、Yes-associated protein (YAP)遺伝子、E-カドヘリン遺伝子、p53ドミナントネガティブ変異体遺伝子、p53shRNA遺伝子等の遺伝子又はこれらの遺伝子産物、化合物、FGF1〜21等の線維芽細胞増殖因子、ALK阻害剤（A-83-01など）、TGF-beta RI阻害剤、TGF-beta RIキナーゼ阻害剤などを使用することも可能である。

【0081】

前記哺乳動物の細胞から誘導肝幹細胞を製造するために、前記哺乳動物の細胞に遺伝子を導入する方法としては、公知の方法であれば特に制限されることはないが、ウイルスベクター、プラスミド、人工染色体（HAC）、エピソーマルベクター（EBV）、ミニサークルベクター、ポリシストロニック発現ベクター、Cre/loxPシステムを応用したベクター、ファージインテグラーゼを利用したベクター、ピギーバックなどのトランスポゾンなどのベクター等を用いることができる。

【0082】

前記哺乳動物の細胞に、遺伝子を導入するために使用可能なウイルスベクターとしては、公知のベクターであれば何れも使用することが可能である。例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、サル免疫不全ウイルスベクター（ディナベック株式会社）、アデノ随伴ウイルスベクター（ディナベック株式会社）、ゲノムに外来遺伝子が残存しないセンダイウイルスベクター（ディナベック株式会社、株式会社医学生物学研究所）、センダイミニベクター（ディナベック株式会社）、HVJ等が挙げられるが、これらに制限されることはない。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス由来レトロウイルスベクターなどがある。

【0083】

ウイルスベクタープラスミドとしては、公知のウイルスベクタープラスミドであれば何れも使用することが可能である。例えば、レトロウイルス系としてpMXs、pMXs-IB、pMXs-puro、pMXs-neo（但し、pMXs-IBはpMXs-puroのピューロマイシン耐性遺伝子の代わりにブラストシジン耐性遺伝子を搭載したベクターである）[Toshio Kitamura et. al.,” Retrovirus-mediated gene transfer andexpression cloning: Powerful tools in functional genomics”, Experimental Hematology,2003,31(11):1007-14]が好ましく、他にも、MFG[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6733-6737(1995)]、 pBabePuro[Nucleic Acids Research, 18, 3587-3596(1990)]、LL-CG、CL-CG、CS-CG、CLG[Journal of Virology, 72, 8150-8157(1998)]等が挙げられる。また、アデノウイルス系としてはpAdex1[Nucleic Acids Res., 23, 3816-3821(1995)]等を用いることができる。

【0084】

前記哺乳動物の細胞を誘導肝幹細胞に誘導する工程において用いられる培地としては、胚性幹細胞、多能性幹細胞等を培養可能な培地であれば特に制限されることはないが、胚性幹細胞、多能性幹細胞等の培養に適した培地を用いて培養することができる。このような培地としては、本発明の誘導肝幹細胞を培養する培地として例示した、ES培地、MEF馴化ES培地、iPS細胞用最適培地、フィーダー細胞用最適培地、StemPro〔登録商標〕hESC SFM、mTeSR1、アニマルプロテインフリーのヒトES/iPS細胞維持用無血清培地TeSR2〔ST-05860〕、霊長類ES/iPS細胞用培地、ReproStem、ReproFF等が挙げられるが、これらに限定されることはない。ヒトの細胞を用いる場合には、ヒト胚性幹細胞の培養に適した培地を用いることが好ましい。
また、由来細胞が線維芽細胞でない場合、例えば、胃又は結腸がん患者由来の細胞のような上皮系細胞を用いる場合には、遺伝子導入後にフィーダー細胞との共培養を行うことが好ましい。

【0085】

第3の発明は、本発明の誘導肝幹細胞を用いることを特徴とする試験方法である。本発明の試験方法は、安全性試験方法、毒性試験方法、代謝試験方法、薬物相互作用試験方法、抗ウイルス活性試験方法、及び、高脂血症薬、高血圧治療薬、低分子化合物医薬、抗体医薬などの医薬品のスクリーニング試験方法として好適である。

【0086】

本発明の誘導肝幹細胞を用いる薬物相互作用試験方法としては、例えば、人種、性、年齢、遺伝的背景（多型など）が異なるドナーからヒト誘導肝幹細胞を作製し、医薬品の候補化合物と共に培養して、これらの細胞における各種シトクロムP450(CYP)サブファミリー酵素の遺伝子の発現をDNAマイクロアレイ（クラボウ社製）、多機能ジーンエクスプレッサーGenomeLabTM GeXP（ベックマン・コールター社製）等を用いて調べることにより、P450(CYP)サブファミリー酵素と医薬品の候補化合物の相互作用を明らかにする試験方法などがある。また、シトクロムP450酵素によって代謝された後に蛍光産物を生成する基質を用いる方法によっても、P450(CYP)サブファミリー酵素と医薬品の候補化合物の相互作用を調べることが可能である。

【0087】

シトクロムP450酵素は、広範な疎水性の化学物質を酸化的に代謝する重要な触媒であり、この酵素の薬物代謝は、薬物クリアランス、毒性、活性化に関わるため、薬物間の有害な相互作用にも影響を及ぼすことがあることが知られている。従って、低分子治療薬等の開発の際には、この酵素と薬物の相互作用を精査することが必要である。

【0088】

本発明の誘導肝幹細胞を用いる抗ウイルス活性試験方法としては、例えば、本発明の誘導肝幹細胞を培養している培養液に、肝炎ウイルスA、B又はCを添加して感染させ、抗ウイルス薬の医薬品の候補化合物を添加することにより、その化合物の薬効を評価する試験方法などを挙げることができる。

【0089】

本発明の誘導肝幹細胞を用いる高脂血症薬のスクリーニング試験方法としては、例えば、本発明の誘導肝幹細胞を培養したプレートに、高脂血症薬の候補化合物を添加して培養した後、培養上清に分泌されるリポタンパク質や脂質を分析することにより、添加した高脂血症薬の候補化合物の薬効を評価する試験方法などが挙げられる。

【0090】

培養液上清に分泌されるリポタンパク質及び脂質の分析としては、例えば、CM（カイロミクロン）、VLDL（超低比重リポタンパク質）、LDL（低比重リポタンパク質）、HDL（高比重リポタンパク質）等のタンパク質や、FC（フリーコレステロール）、PL（リン脂質）、TC（総コレステロール）等の脂質について、ゲルろ過HPLC法により分析する試験方法（LipoSEARCH；スカイライト・バイオテック社）等が挙げられる。

【0091】

また、Usui S, Hara Y, Hosaki S, Okazaki M,“A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC”, J. Lipid Res., 2002;43:805-14.及びMitsuyo Okazaki, Shinichi Usui, Masato Ishigami, Naohiko Sakai, Tadashi Nakamura, Yuji Matsuzawa, Shizuya Yamashita, “Identification of Unique Lipoprotein Subclasses for Visceral Obesity by Component Analysis of Cholesterol Profile in High-Performance Liquid Chromatography”, Arterioscler Thromb Vasc Biol. March 2005に記載されている方法によっても測定可能である。

【0092】

第4の発明は、本発明の誘導肝幹細胞を用いることを特徴とする創薬標的スクリーニング方法である。

【0093】

第5の発明は、本発明の誘導肝幹細胞を用いることを特徴とする動物モデルの作製方法である。

【0094】

第6の発明は、本発明の誘導肝幹細胞を用いることを特徴とする肝細胞産生タンパク質の生産方法である。
本発明の誘導肝幹細胞は、肝細胞としての性質を有するため、様々な肝細胞に特徴的なタンパク質を産生することができる。そこで、特定の肝細胞に特異的なタンパク質を生産する本発明の誘導肝幹細胞を培養し、肝細胞に特徴的なタンパク質を生産する方法などを例示することができる。

【0095】

第7の発明は、本発明の誘導肝幹細胞を用いることを特徴とする、哺乳動物を対象とする治療方法である。
本発明の治療方法においては、哺乳動物の細胞から誘導した本発明の誘導肝幹細胞を、哺乳動物の肝臓に移植する治療方法である。例えば、イヌの細胞から誘導した本発明の誘導肝幹細胞を、イヌの肝臓に移植することができる。

【0096】

以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されるものではない。

【実施例1】

【0097】

１．パントロピックレトロウイルスベクターの調製
POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsの3遺伝子のレトロウイルスベクタープラスミドを、Fugene HD（ロシュ社製；Cat no.4709691）を用いて、パントロピックレトロウイルスベクター調製用パッケージング細胞であるPlat-GP細胞に導入し、レトロウイルスベクター液を調製した。遺伝子POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsは順に4:2:1の比率で使用した。4:2:1の比率は、パッケージング細胞に遺伝子を導入する時でもよく、また、別々にPOU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsの3遺伝子のレトロウイルスベクター液を作製して、4:2:1の比率で混合してもよい。詳細は、以下の通りである。

【0098】

＜新生児皮膚組織由来の細胞へ遺伝子導入するレトロウイルスベクター液の調製＞
遺伝子POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsは、addgeneのベクターを用いた(後記表5)。
各ベクターの量は、POU5F1-pMXs(addgene製) 2μg、KLF4-pMXs(addgene製) 1μg、SOX2-pMXs(addgene製) 0.5μg、Venus-pCS2(Nagai T et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol 2002; 20: 87-90.?) 0.5μg、VSV-G-pCMV(Cell Biolab製) 2μg、FuGENE HD(ロッシュ製) 18μlとした。

【0099】

＜胃がん患者がん組織由来の細胞へ遺伝子導入するレトロウイルスベクター液の調製＞
遺伝子POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsは、構築したベクターである(表5)。
各ベクターの量は、POU5F1-pMXs 5μg、KLF4-pMXs 2.5μg、SOX2-pMXs 1.25μg、Venus-pCS2 1.25μg、VSV-G-pCMV 5μg、GFP-pMXs(Cell Biolab製) 1.25μg、FuGENE HD 45μlとした。

【0100】

＜胃がん患者非がん組織由来の細胞へ遺伝子導入するレトロウイルスベクター液の調製＞
遺伝子POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsは、構築したベクターである(表5)。
各ベクターの量は、POU5F1-pMXs 5μg、KLF4-pMXs 2.5μg、SOX2-pMXs 1.25μg、Venus-pCS2 1.25μg、VSV-G-pCMV 5μg、GFP-pMXs 1.25μg、FuGENE HD 45μlとした。

【0101】

＜成人皮膚組織由来の細胞へ遺伝子導入するレトロウイルスベクター液の調製＞
遺伝子POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsは、構築したベクターである(表5)。
各ベクターの量は、POU5F1-pMXs 5μg、KLF4-pMXs 2.5μg、SOX2-pMXs 1.25μg、Venus-pCS2 1.25μg、VSV-G-pCMV 5μg、GFP-pMXs 1.25μg、FuGENE HD 45μlとした。

【0102】

＜結腸がん患者のがん組織由来の細胞へ遺伝子導入する、レトロウイルスベクター液の調製＞
遺伝子POU5F1-pMXs、KLF4-pMXs、SOX2-pMXsは構築したベクターである(表5)。
各ベクターの量は、POU5F1-pMXs 5μg、KLF4-pMXs 2.5μg、SOX2-pMXs 1.25μg、Venus-pCS2 1.25μg、VSV-G-pCMV 5μg、GFP-pMXs 1.25μg、FuGENE HD 45μlとした。

【0103】

レトロウイルスベクタープラスミドを導入したPlat-GP細胞を、48時間以上培養した後、24時間毎に3回上清を回収し、ステリフリップ-HVフィルターユニット:0.45μm径のフィルター（ミリポア社製；Cat no. SE1M003M00）でろ過を行った。以上の手順により3遺伝子（POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に4:2:1）のパントロピックレトロウイルスベクター液が調製された。パントロピックレトロウイルスベクターは、様々な細胞に遺伝子導入することが可能であるが、ヒト細胞にも高い効率で遺伝子導入した。

【0104】

【表5】

【実施例2】

【0105】

２．新生児皮膚組織由来の細胞からヒト誘導肝幹細胞の作製
出生直後の組織であるヒト新生児皮膚組織由来の細胞（商品名：新生児正常ヒト皮膚繊維芽細胞；初代培養；Lot no. 7F3956）から、ヒト誘導肝幹細胞を作製した。
凍結保存されたヒト新生児皮膚組織由来の細胞（初代培養；ロンザ社製；CC-2511；Lot no.7F3956）1本を、37℃の恒温槽中で解凍し、1X抗生物質-抗真菌剤（インビトロジェン社製；Cat no.15240-062）及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）(インビトロジェン社製；Cat no.11965-092)培地に懸濁し、10mlの細胞懸濁液を得た。

【0106】

次いで、得られた細胞懸濁液を、1000rpm、4℃で5分間遠心分離し、上清を除去した後、線維芽細胞培地キット-2（2% FBS）（以下登録商標 FGM-2 BulletKitという）（ロンザ社製；Cat no. CC-3132）12mlに懸濁して、細胞懸濁液を得た。20μg/cm2の濃度のマトリゲル（ベクトンディクソン社製；Cat no.356230）で、底面を30分以上コーティングされた6ウェルプラスチックシャーレ（ヌンク社製；Cat no.140675）上に、得られた細胞懸濁液を2mlずつ加えて細胞を播種した。

【0107】

3日後に培地を除き、1ウェルあたり2mlの3遺伝子（POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に4:2:1）レトロウイルスベクター液を添加し、37℃で24時間感染させた。ウイルス上清を除去し、FGM-2 BulletKitを2mlずつ加え、37℃で一日培養した。その後2日毎にMEF馴化ES培地の交換を続け、3遺伝子導入から12、14、17日後にES培地で培地交換を行った。使用したMEF馴化ES培地及びES培地の組成は、下記の通りである。

【0108】

＜MEF馴化ES培地>
MEF
マイトマイシンC処理初代マウス胚性繊維芽細胞〔DSファーマバイオメディカル社製〕Cat no. R-PMEF-CF
馴化ES培地
ノックアウトD-MEM（インビトロジェン社製；Cat no. 10829-018）500ml
20%ノックアウト血清リプレースメント（インビトロジェン社製；Cat no. 10828-028）
50μg/ml ゲンタマイシン（インビトロジェン社製；Cat no. 15750-060）
1XMEM非必須アミノ酸液（インビトロジェン社製；Cat no.11140-050）
10 ng/ml bFGF（ぺプロテック社製；Cat no.100-18B）
0.1mM 2-メルカプトエタノール（シグマアルドリッチ社製；Cat no. M7154）

【0109】

＜ES培地＞
ノックアウトD-MEM（インビトロジェン社製；Cat no. 10829-018）500ml
20%ノックアウト血清リプレースメント（インビトロジェン社製； Cat no. 10828-028）
50μg/mlゲンタマイシン（インビトロジェン社製； Cat no. 15750-060）
1XMEM非必須アミノ酸液（インビトロジェン社製； Cat no.11140-050）
10ng/ml bFGF（ぺプロテック社製； Cat no.100-18B）
103U/ml 組み換え ヒトLIF（和光純薬社製； Cat no.129-05601）
0.1mM 2-メルカプトエタノール（シグマアルドリッチ社製； Cat no. M7154）
0.5μM ALK5阻害剤(A-83-01)（シグマアルドリッチ社製； Cat no.A5480）
0.5μM PD0325901（アクソンメディケム社製； Cat no.1408）
3μM CHIR99021（アクソンメディケム社製； Cat no.1386）

【0110】

遺伝子導入から18日後から、フィーダーフリー用ヒトES/iPS細胞用培地 mTeSR 1 (ステムセルテクノロジー社製；Cat no.05850）で、毎日培地交換を行った。遺伝子導入から30日後にコロニーを1クローン(NFB1-3)ピンセットでピックアップし、フィーダー細胞上に移した。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞（DSファーマバイオメディカル社製；Cat no.R-PMEF-CF）であり、誘導肝幹細胞のピックアップ前日に、5.0×104cell/cm2となるようにゼラチンコート24ウエルプレート（イワキ社製；Cat no.11-020-012）に播種した。
下記に新生児皮膚組織由来のヒト誘導肝幹細胞の継代（p）とRNA回収用キットのバッファー(Buffer)へ溶解した日（day）を示した。

【0111】

＜新生児皮膚組織由来のヒト誘導肝幹細胞＞
NFB1-3
day52: 24well(p1)→6well(p2)
day55: 6well(p2)→10cm(p3)
day61: passage (p4)
day62: Buffer RLT (RNA精製前の細胞の溶解液)処理 (p5)

【実施例3】

【0112】

３．胃がん患者のがん組織由来の細胞からヒト誘導肝幹細胞の作製
ヒト胃がん（進行がん）患者のがん組織から細胞を単離した。得られた細胞に、3遺伝子（POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に4:2:1）レトロウイルスベクター液を添加し、遺伝子導入することで、ヒト誘導肝幹細胞を作製した。詳細は以下の通りである。
手術時に得られた胃がん（進行がん：男性、67歳、日本人）新鮮組織の一部を、ハンクス平衡塩液（フェノールレッドを含まない）（インビトロジェン社製；Cat no.14175-095）で洗浄し、剪刀を用いて約1mm2に細断した。更に、ハンクス平衡塩液（フェノールレッドを含まない）で上清が透明になるまで洗浄し、上清を除去し、組織沈殿に対して5ml 0.01% コラゲナーゼ（和光純薬社製；Cat no.034-10533）/1X抗生物質-抗真菌剤（インビトロジェン社製；Cat no.15240-062）を加え、振盪器を用いて、37℃で60分間攪拌した。

【0113】

組織沈殿が十分消化されたことを確認後、1X抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）(インビトロジェン社製；Cat no.11965-092)培地を35ml加えて、1000rpm、4℃で5分間遠心分離した。次いで、上清を除去した後、1X抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）(インビトロジェン社製；Cat no.11965-092)培地を40ml加えて、1000rpm、4℃で5分間再度遠心分離した。次いで、上清を除去した後、1X抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地を10ml加え、コラーゲンコートディッシュ60mm(イワキ社製；Cat no.11-018-004)に播種した。

【0114】

24時間後に培地を除き、5mlの3遺伝子のレトロウイルスベクター液を添加し、37℃で1日間感染させた。ウイルス上清を除去し、マイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞（DSファーマバイオメディカル社製；Cat no.R-PMEF-CF）5.0×104cell/cm2を、1X抗生物質-抗真菌剤（インビトロジェン社製；Cat no.15240-062）及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地5mlに懸濁後、胃がん患者のがん組織由来の遺伝子導入細胞を培養したコラーゲンコートディッシュ60mm(イワキ社製；Cat no.11-018-004)に播種し、共培養した。
その後3日毎にMEF馴化ES培地の交換を続け、遺伝子導入から15日後から、フィーダーフリー用ヒトES/iPS細胞用培地 mTeSR 1 (ステムセルテクノロジー社製、Cat no.05850）で毎日培地交換を行った。

【0115】

3遺伝子導入から25日後に、誘導肝幹細胞のコロニーを1クローン(GC1-2)、ゼラチンコート24ウエルプレート中のマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞上にピックアップした。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞（DSファーマバイオメディカル社製；Cat no.R-PMEF-CF）であり、誘導肝幹細胞のピックアップ前日に5.0×104cell/cm2となるようにゼラチンコート24ウエルプレート（イワキ社製、Cat no.11-020-012）に播種した。
下記に胃がん患者のがん組織由来ヒト誘導肝幹細胞の継代（p）とRNA回収用キットのバッファー(Buffer)へ溶解した日（day）を示した。

【0116】

＜胃がん患者のがん組織由来ヒト誘導肝幹細胞＞
GC1-2
day37: 24well(p1)→6well(p2)
day43: 6well(p2)→10cm (p3)
day56: passage (p4)
day57: passage and stock (p5)
day60: Buffer RLT (RNA精製前の細胞の溶解液)処理

【実施例4】

【0117】

４．胃がん患者非がん組織由来の細胞からヒト誘導肝幹細胞の作製
胃がん患者非がん組織由来の細胞に、3遺伝子（POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に4:2:1）レトロウイルスベクター液を添加し、遺伝子を導入することによって、ヒト誘導肝幹細胞を作製した。詳細は以下の通りである。
手術時に得られた胃がん（進行がん：男性、67歳、日本人）患者の非がん新鮮組織の一部を、ハンクス平衡塩液（フェノールレッドを含まない）（インビトロジェン社製；Cat no.14175-095）で洗浄し、剪刀を用いて約1mm2に細断した。ハンクス平衡塩液（フェノールレッドを含まない）で上清が透明になるまで洗浄した後、上清を除去し、組織沈殿に対して5ml 0.01% コラゲナーゼ（和光純薬社製；Cat no.034-10533）/1X抗生物質-抗真菌剤（インビトロジェン社製；Cat no.15240-062）を加え、振盪器を用いて37℃で60分間攪拌した。

【0118】

組織沈殿が十分消化されたことを確認した後、1X抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）(インビトロジェン社製；Cat no.11965-092)培地を35ml加えて、1000rpm、4℃で5分間遠心分離した。次いで、上清を除去した後、1X抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地を40ml加えて、1000rpm、4℃で5分間再度遠心分離した。更に、上清を除去した後、1X抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）(インビトロジェン社製；Cat no.11965-092)培地を10ml加え、コラーゲンコートディッシュ60mm(イワキ社製；Cat no.11-018-004)に播種した。

【0119】

約24時間後、培地を除き、5mlの3遺伝子（POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に4:2:1）レトロウイルスベクターを添加し、37℃で約24時間感染させた。ウイルス上清を除去し、マイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞（DSファーマバイオメディカル社製；Cat no.R-PMEF-CF）5.0×104cell/cm2を、1X抗生物質-抗真菌剤（インビトロジェン社製、Cat no.15240-062）及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地5mlに懸濁させた後、胃がん患者非がん組織由来の遺伝子導入された細胞が培養されたコラーゲンコートディッシュ60mmへ播種し、共培養した。

【0120】

それ以降、3日毎にMEF馴化ES培地の交換を続け、3遺伝子導入から31日後、mTeSR 1で毎日培地交換を行った。遺伝子導入から46日後にコロニーの1クローン(NGC1-2)をピックアップし、ゼラチンコート24ウエルプレート中のマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞上に継代培養した。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞（DSファーマバイオメディカル社製；Cat no.R-PMEF-CF）であり、誘導肝幹細胞のピックアップ前日に5.0×104cell/cm2となるようにゼラチンコート24ウエルプレート（イワキ社製；Cat no.11-020-012）に播種した。
下記に胃がん患者非がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞の継代（p）とRNA回収用キットのバッファー(Buffer)へ溶解した日（day）を示した。

【0121】

＜胃がん患者非がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞＞
NGC1-2
day52: 24well(p1)→6well(p2)
day58: 6well(p2)→10cm(p3)
day65: passage, stock and Buffer RLT (RNA精製前の細胞の溶解液)処理(p4)

【実施例5】

【0122】

５．結腸がん患者のがん組織由来の細胞からヒト誘導肝幹細胞の作製
ヒト結腸がん（S字結腸がん）患者のがん新鮮組織由来の細胞に3遺伝子（POU5F1、KLF4、SOX2の比率が順に4:2:1）レトロウイルスベクター液を添加し、遺伝子導入することで、ヒト誘導肝幹細胞を作製した。詳細は以下の通りである。
手術時に得られた結腸がん（S状結腸がん：男性、55歳、日本人）の一部をハンクス平衡塩液（フェノールレッドを含まない）（インビトロジェン社製；Cat no.14175-095）で洗浄し、剪刀を用いて約1mm2に細断した。ハンクス平衡塩液（フェノールレッドを含まない）で上清が透明になるまで洗浄した。次いで、上清を除去し、組織沈殿に対して5ml 0.01% コラゲナーゼ（和光純薬社製；Cat no.034-10533）/1X抗生物質-抗真菌剤（インビトロジェン社製；Cat no.15240-062）を加え、振盪器を用いて、37℃で60分間攪拌した。

【0123】

組織沈殿が十分消化されたことを確認した後、1X抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）(インビトロジェン社製、Cat no.11965-092)培地を35ml加えて1000rpm、4℃で5分間遠心分離した。上清を除去した後、1X抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地を40ml加えて、1000rpm、4℃で5分間再度遠心分離した。上清を除去した後、11X抗生物質-抗真菌剤及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）培地を10ml加え、コラーゲンコートディッシュ100mm(イワキ社製、Cat no. 11-018-006)に播種した。

【0124】

約24時間後に培地を除き、10mlの3遺伝子のレトロウイルスベクター液を添加し、その5時間後、5mlのLuc-IRES-GFPのレトロウイルスベクター液を添加し、37℃で約24時間感染させた。ウイルス上清を除去し、マイトマイシン処理を行ったMEF(DSファーマバイオメディカル社製；Cat no. R-PMEF-CF）5.0×104cell/cm2を1X抗生物質-抗真菌剤（インビトロジェン社製、Cat no.15240-062）及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）(インビトロジェン社製、Cat no.11965-092)培地10mlに懸濁させた後、結腸がん患者のがん組織由来の遺伝子導入細胞が培養されたコラーゲンコートディッシュ60mmへ播種し、共培養した。

【0125】

その後、3日毎にMEF馴化ES培地の交換を続け、遺伝子導入22日後から、mTeSR 1で毎日培地交換を行った。遺伝子導入から31日後に、コロニーの1クローン(CC1-4)をピックアップし、ゼラチンコート24ウエルプレート中のマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞（DSファーマバイオメディカル社製；Cat no.R-PMEF-CF）に継代培養した。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞（DSファーマバイオメディカル社製；Cat no.R-PMEF-CF）であり、誘導肝幹細胞のピックアップ前日に5.0×104cell/cm2となるようにゼラチンコート24ウエルプレート（イワキ社製；Cat no.11-020-012）に播種した。
下記に結腸がん患者がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞の継代（p）とRNA回収用キットのバッファー(Buffer)へ溶解した日（day）を示した

【0126】

＜結腸がん患者がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞＞
CC1-4
day40: 6well(p2)→6well(p2)
day45: 6well(p2)→10cm(p3)
day51: passage and stock (p4)
day54: passage and stock (p5)
day59: passage and stock (p5)
day63: Buffer RLT (RNA精製前の細胞の溶解液)処理（p5）

【実施例6】

【0127】

６．成人皮膚組織由来の細胞からヒト誘導肝幹細胞の作製
成人皮膚組織由来の細胞（商品名：成人正常ヒト皮膚繊維芽細胞；初代培養；ロンザ社製；Lot no.76582）からヒト誘導肝幹細胞を作製した。
凍結保存された成人正常ヒト皮膚繊維芽細胞（初代培養；ロンザ社製；Lot no.76582）1本を、37℃の恒温槽中で解凍し、1X抗生物質-抗真菌剤（インビトロジェン社製；Cat no.15240-062）及びFBSを10％含むD-MEM（高グルコース）(インビトロジェン社製；Cat no.11965-092)培地に懸濁させ、10mlの細胞懸濁液を得た。次いで、1000rpm、4℃で5分間遠心分離し上清を除去した後、FGM-2 BulletKit 20mlに懸濁させた。20μg/cm2の濃度のマトリゲル（ベクトンディクソン社製）で、底面を30分以上コーティングしたディッシュ100mm(ヌンク社製；Cat no. 172958)上に、該細胞懸濁液を10mlずつ加えて細胞を播種した。

【0128】

約24時間後に培地を除き、10mlの3遺伝子のレトロウイルスベクター液を添加し、37℃で24時間感染させた。ウイルス上清を除去し、MEF馴化ES培地10mlを加えた。その後3日毎にMEF馴化ES培地の交換を続け、遺伝子導入18日後から、mTeSR 1 (ステムセルテクノロジー社製）で毎日培地交換を行った。遺伝子導入28日後から6日間、MEF馴化ES培地で毎日培地交換を行った。更に遺伝子導入34日後からmTeSR 1で毎日培地交換を行った。遺伝子導入39日後に、コロニーを1クローン(AFB1-1)、ゼラチンコート24ウエルプレート中のマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞（DSファーマバイオメディカル社製；Cat no.R-PMEF-CF）にピックアップした。なお、フィーダー細胞はマイトマイシン処理を行ったマウス胚性繊維芽細胞（DSファーマバイオメディカル社製；Cat no.R-PMEF-CF）であり、誘導肝幹細胞のピックアップ前日に5.0×104cell/cm2となるようにゼラチンコート24ウエルプレート（イワキ社製；Cat no.11-020-012）に播種した。
下記に成人皮膚組織由来のヒト誘導肝幹細胞の継代（p）とRNA回収用キットのバッファー(Buffer)へ溶解した日（day）を示した。

【0129】

＜成人皮膚組織由来のヒト誘導肝幹細胞＞
AFB1-１
day50: 24well(p1)→6well(p2)
day54: 6well(p2)→10cm(p3)
day59: passage (p4)
day63: passage (p5)
day67: passage and stock and Buffer RLT (RNA精製前の細胞の溶解液)処理 (p5)

【0130】

上記した実施例2〜6で実施された継代培養は、以下の通りである。
細胞から培地を除きPBS(-)で洗浄した後、細胞剥離液を加えた。37℃で5分間静置したのち、細胞剥離液を除き、1X抗生物質-抗真菌剤（インビトロジェン社製；Cat no.15240-062）及びFBS(インビトロジェン社製；Cat no.26140-079)を10％含むD-MEM（高グルコース）(インビトロジェン社製；Cat no.11965-092)培地を20ml加えて、1000rpm、4℃で5分間遠心分離した。次いで、上清を除去した後、1X抗生物質-抗真菌剤（インビトロジェン社製；Cat no.15240-062）及びmTeSR、10μM Y-27632を加え、MEF 1.0×106cells/dishが播種してあるゼラチンコート100mmに細胞懸濁液を播種した。

【0131】

継代培養時の細胞剥離液としては、以下の2種類を用いた。
（１）0.25％トリプシン-1mM EDTA溶液（インビトロジェン社製；Cat no. 25200-056）
（２）10mg/mlコラゲネース (インビトロジェン社製；Cat no. 17104-019)10ml、
100mM 塩化カルシウム溶液1ml、
PBS 59ml、
2.5％トリプシン溶液(インビトロジェン社製；Cat no. 15090-046)10ml、
ノックアウト血清リプレースメント(インビトロジェン社製；Cat no.10828-028)20ml

【実施例7】

【0132】

７．ヒト誘導多能性幹細胞とヒト誘導肝幹細胞の長期培養
ヒト誘導肝幹細胞(AFB1-1、NGC1-2)を、半年以上の長期に渡って継代培養を行った。培地は、mTeSR1（ステムセルテクノロジー・ベリタス社製）、bFGF添加霊長類ES/iPS細胞用培地（リプロセル社）、又はbFGF添加ReproStem（リプロセル社）などを用いた。MEF使用時にはコラーゲン又はゼラチンコートの培養皿を用いた。MEF非使用時にはマトリゲルコートした培養皿を用いた。その結果、0.05〜0.5μM A-83-01（TGF-βシグナル阻害剤、TGF-β type I receptor ALK5 kinase , type I activin/nodal receptor ALK4 and ALK7阻害剤）の添加は、ヒト誘導肝幹細胞の自己複製に有用であり、増殖速度、形態とも非常に良好であった。

【実施例8】

【0133】

８．マイクロアレイによる肝細胞マーカー遺伝子と胚性幹細胞マーカー遺伝子の定量解析
アジレント社製Whole Human Genome オリゴDNAマイクロアレイ（4Ｘ44K）により、ゲノムワイドな遺伝子発現（mRNAのトランスクリプトーム）を解析した。
＜試料＞
実施例2〜6のヒト誘導肝幹細胞（NFB1-3, GC1-2, NGC1-2, AFB1-1, CC1-4）のtotal RNAとゲノムDNAを、実施例2〜6において、事前にBuffer RLT (RNA精製前の細胞の溶解液)で処理した溶液から、AllPrep DNA/RNA Mini Kit (50)（キアゲン社製；Cat no.80204）を用いて抽出した。
試料として、ヒト誘導肝幹細胞（NFB1-3, GC1-2, NGC1-2, AFB1-1, CC1-4）のtotal RNA を使用した。

【0134】

＜実験方法＞
（１）クオリティーチェック
RNA用LabChip(アジレント社製の登録商標)キットを用いて、Agilent 2100 Bioanalyzer (アジレント社製)でtotal RNA の品質のチェックを行ったところ、全てのRNAサンプルのクオリティーは良好であった。また、NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies)で、RNA濃度及びRNAの純度の評価を行ったところ、何れのサンプルにおいてもcRNA合成に必要なtotal RNA量があることが確認され、純度も高いことが確認された。

【0135】

（２）cRNAの合成
各サンプルのtotal RNA (500ng)から、Quick Amp Labeling kit（アジレント社製）を用いて、アジレント社のプロトコールに従って、2本鎖cRNAを合成した。作製したcDNAから、in vitro transcriptionによりcRNAを合成した。この際、Cyanine色素で標識されたCTP（Cyanine 3-CTP）を取り込ませ、蛍光標識を行った。

【0136】

（３）ハイブリダイゼーション
Gene Expression Hybridization Kit（アジレント社製）を使用して、ハイブリダイゼーション標識cRNAをハイブリダイゼーションバッファーに加え、アジレント製Whole Human Genome オリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）上で17時間ハイブリダイズし、洗浄後、アジレントマイクロアレイスキャナで、DNAマイクロアレイのイメージを読み取り、Feature Extraction Software (v.9.5.3.1)を用いて、各スポットの蛍光シグナルを数値化した。

【0137】

＜遺伝子の定量解析結果＞
発現の有無は、全体の遺伝子発現の分布（各プローブの蛍光値の分布）の中央値を0として評価した。0を超えた発現値を示したプローブを、遺伝子発現を検出したプローブとし、遺伝子発現を有りとして、発現プローブの数として表した。

【0138】

なお、解析ソフトとしては、GeneSpring GX 10.0（アジレント・テクノロジー株式会社）を使用し、ノーマライゼーションは、50th percentileで行った。比較したヒト胚性幹細胞（hES_ES01）のマイクロアレイデーターは、GEOからダウンロードして使用した。

【0139】

１．肝細胞で特徴的に発現している遺伝子
下記表6に、本発明のヒト誘導肝幹細胞において発現している、肝細胞で特徴的に発現している遺伝子を示す。肝細胞で特徴的に発現しているアジレント社製Whole Human Genome オリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）の発現プローブ156（144遺伝子）の内、ヒト誘導肝幹細胞が発現していた発現プローブ数と各々の表にプローブ名（Probe name）、遺伝子シンボル（GeneSymbol）、ジェンバンクアセッションナンバー（Genebank Accession No）を記載した。

【0140】

【表6】

【0141】

下記表7に、実施例3で誘導した胃がん患者がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞（GC1-2）で発現している遺伝子の表を示した。
胃がん患者がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞：GC1-2
肝細胞で特徴的な発現プローブ数は138であった。

【表7】

【0142】

下記表8に、実施例6で誘導した成人皮膚組織由来のヒト誘導肝幹細胞（AFB1-1）で発現している遺伝子を示した。
成人皮膚組織由来のヒト誘導肝幹細胞：AFB1-1
肝細胞で特徴的な発現プローブ数は133であった。

【表8】

【0143】

下記表9に、実施例4で誘導した胃がん患者非がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞（NGC1-2）で発現している遺伝子を示した。
胃がん患者非がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞：NGC1-2
肝細胞で特徴的な発現プローブ数は、131であった。

【表9】

【0144】

下記表10に、実施例2で誘導した新生児皮膚組織由来のヒト誘導肝幹細胞（NFB1-3）で発現している遺伝子を示した。
新生児皮膚組織由来のヒト誘導肝幹細胞：NFB1-3
肝細胞で特徴的な発現プローブ数は、96であった。

【表10】

【0145】

下記表11に、実施例5で誘導した結腸がん患者がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞（CC1-4）が発現している遺伝子を示した。
結腸がん患者がん組織由来のヒト誘導肝幹細胞：CC1-4
肝細胞で特徴的な発現プローブ数は、92であった。

【表11】

【0146】

２．ヒト胚性幹細胞で特徴的に発現している遺伝子
ヒト胚性幹細胞で特徴的に発現している、アジレント社製Whole Human Genome オリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）の発現プローブ数31（23の遺伝子；表12）の内、31のプローブ数が、実施例2〜6のヒト誘導肝幹細胞でヒト胚性幹細胞とほぼ同程度（1/4〜4倍以内）に発現していた。ヒト胚性幹細胞とその遺伝子のプローブ名（Probe name）、遺伝子シンボル（GeneSymbol）、ジェンバンクアセッションナンバー（Genebank Accession No）を記載した。

【0147】

【表12】

【0148】

以上の結果より、ヒト誘導肝幹細胞は、肝細胞の性質である肝細胞のマーカー遺伝子が発現しているだけでなく、胚性幹細胞に特徴的な遺伝子がヒト胚性幹細胞と同等に発現していることが実験的に検証された。
マイクロアレイの結果をさらに解析すると、本発明の誘導肝幹細胞は中内胚葉系幹細胞及び内胚葉系幹細胞に特徴的な性質を有していた。詳しくは、中内胚葉系幹細胞及び内胚葉系幹細胞で特徴的に発現する遺伝子であるSOX17遺伝子、FOXA2遺伝子、GSC遺伝子、EOMES遺伝子、TCF2遺伝子の全てを発現していた。実施例2〜6のヒト誘導肝幹細胞（NFB1-3、GC1-2、NGC1-2、AFB1-1、CC1-4）の内、肝細胞に特徴的な遺伝子が比較的少なく、低発現のヒト誘導肝幹細胞（NFB1-3、CC1-4）は、SOX17遺伝子、FOXA2遺伝子、GSC遺伝子、EOMES遺伝子、TCF2遺伝子が他のヒト誘導肝幹細胞（GC1-2、NGC1-2、AFB1-1）より高発現していた。

【0149】

上記したように、胃がん患者由来非がん組織から作製したヒト誘導肝幹細胞（NGC1-2）、及び、成人皮膚組織から作製したヒト誘導肝幹細胞(AFB1-1)は、肝細胞のマーカー遺伝子であるアルファ-フェトプロテイン（AFP）、トランスサイレチン（TTR）、アルブミン（ALB）及びアルファ1‐アンチトリプシン（AAT）を発現し、胚性幹細胞に特徴的な遺伝子であるPOU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、NANOG遺伝子、ZFP42遺伝子をヒト胚性幹細胞と同等に発現していることが確認された。なお、AATはSERPINA1、トランスサイレチンはプレアルブミン、ZFP42はREX1とも表記されることもある。

【実施例9】

【0150】

９．免疫蛍光染色による肝細胞マーカーと胚性幹細胞マーカーの定量検出
実施例4で誘導した胃がん患者由来非がん組織から作製したヒト誘導肝幹細胞（NGC1-2）と、実施例6で誘導した成人皮膚組織から作製したヒト誘導肝幹細胞(AFB1-1)を、Lab-Tek（登録商標） Chamber Slide（登録商標）System （Nunc社製、Cat no. 177429）に播種した。翌日培地を除き、PBS(-)で2回洗浄した後、10%ホルマリン溶液を加えて、室温で15分静置した。次いで、10%ホルマリン溶液を除き、PBS(-)で3回洗浄した後、0.1% Triton-X100 (ICN Biomedical社製)を加え、室温で15分静置した。次いで、0.1% Triton-X100溶液を除きPBS(-)で3回洗浄した後、ブロッキング溶液（TBS系；pH7.2）（ナカライテスク社製；Cat no.05151-35）を加えて室温で一時間静置した。50倍希釈した一次抗体を、4℃一晩あるいは室温で一時間反応させた。その後、PBS(-)で2回洗浄した後、500倍希釈した二次抗体を室温で30分間反応させた。使用した一次抗体及び二次抗体は、下記の通りである。

【0151】

＜一次抗体＞
ヤギ抗ヒトNANOG抗体（R＆Dシステム社製；Lot no.KKJ03）、マウス抗ヒトSSEA-4抗体(ミリポア社製；Lot no.LV1488380)、マウス抗ヒトCD9抗体（R＆Dシステム社製；Lot no.JOK04）、ウサギ抗ヒトα-1-Fetoprotein抗体（ダコ社製；Lot no.A 0008）、マウス抗ヒトAlbumin抗体（シグマアルドリッチ社製；Lot no.A6684）

【0152】

＜二次抗体＞
ロバ抗ヤギIgG抗体Alexa Fluor594標識（インビトロジェン社製；Cat no.A11058）、ヤギ抗マウスIgG抗体Alexa Fluor488標識(インビトロジェン社製；Cat no.A11001)、ヤギ抗マウスIgG抗体Alexa Fluor594標識(インビトロジェン社製；Cat no.A11005)、ロバ抗ウサギIgG抗体Alexa Fluor488標識(インビトロジェン社製；Cat no.A21206)

【0153】

染色した後、蛍光顕微鏡で観察した結果、胃がん患者由来非がん組織から作製したヒト誘導肝幹細胞と成人皮膚組織から作製したヒト誘導肝幹細胞は肝細胞の性質である、アルファ-フェトプロテイン（AFP）、アルブミン（ALB）タンパク質を産生し、胚性幹細胞に特徴的な糖脂質、NANOG、SSEA-4、CD9が発現する細胞であった（図なし）。

【実施例10】

【0154】

１０．CD81遺伝子、SCARB1遺伝子、OCLN遺伝子及びCLDN1遺伝子の共発現
アジレント社製Whole Human Genome オリゴDNAマイクロアレイ（4X44K）を用いて、C型肝炎ウイルス（HCV）の複製に重要な遺伝子であるCD81遺伝子、SCARB1遺伝子、OCLN遺伝子及びCLDN1遺伝子を解析した。解析ソフトは、GeneSpring GX 10.0を使用し、ノーマライゼーションは、50th percentileで行った。実験手法は実施例8と同様である。

【0155】

＜遺伝子の定量解析結果＞
3種類のヒト胚性幹細胞、hES_H9（GSM194390）、hES_BG03（GSM194391）及びhES_ES01（GSM194392）と、誘導多能性幹細胞、iPS cells 201B7（GSM241846）のマイクロアレイデーターは、GEOからダウンロードして使用した。

【0156】

ヒト誘導肝幹細胞は、C型肝炎ウイルス（HCV）の複製に重要な遺伝子であるCD81遺伝子、SCARB1遺伝子、OCLN遺伝子及びCLDN1遺伝子が共発現していることが確認され、実験的に検証された。従って、本発明の誘導肝幹細胞に肝炎ウイルスCを感染させ、複製させながら、抗ウイルス薬の候補化合物を添加することにより、その化合物の薬効を評価する試験が可能であることが示唆された。さらに、ヒト胚性幹細胞、及び、ヒト誘導多能性幹細胞についても同様の用途が示唆された。

【0157】

本発明の誘導肝幹細胞の誘導においては、前記哺乳動物の細胞を、SOX2遺伝子の遺伝子産物に対してPOU5F1遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が大きくなるように、誘導肝幹細胞への誘導に必要なPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子及びSOX2遺伝子の遺伝子産物が存在する状態におくことが必要がある。本発明においては、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が、POU5F1遺伝子＞KLF4遺伝子＞SOX2遺伝子の関係を満たすことが好ましく、更にPOU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が、順次、4:2:1であることが、誘導肝幹細胞への高効率誘導の観点から最も好ましい。
また、本発明においては、さらに、胚性幹細胞に特徴的に発現するNANOG遺伝子、POU5F1遺伝子、SOX2遺伝子、ZFP42遺伝子、SALL4遺伝子、LIN28遺伝子及びTERT遺伝子などは、様々な生体中の細胞を生体外で自己複製させる「自己複製遺伝子」として機能する。

【0158】

本発明の誘導肝幹細胞の誘導における、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率は、分化を決定づける重要な要因の一つと考えられ、多能性幹細胞の作製においては、POU5F1遺伝子、KLF4遺伝子、及びSOX2遺伝子の遺伝子産物の細胞内存在比率が1:1:1であり、未分化細胞であることが判明した。

【産業上の利用可能性】

【0159】

本発明によれば、人種、性、年齢、遺伝的背景（多型など）が異なるドナーからヒト誘導肝幹細胞を作製することが可能となるため、臨床試験において様々な患者さんに投与される医薬品候補などの効果、安全性、毒性、薬物相互作用の評価に先だって非臨床試験でその評価、予測をすることができるため、本発明のヒト誘導肝幹細胞が、新薬開発の効率化、患者さんの負担軽減に寄与する創薬ツールとなるので、産業上極めて有用である。
本発明の誘導肝幹細胞は、肝臓の形成と機能を制御する分子の探索及び解析、例えば、肝繊維化、肝硬変、脂肪肝炎、メタボリックシンドローム、造血などにおける創薬、並びに各種医薬品・化合物の代謝、作用機構の解析、ワクチン作製、バイオリアクターへの応用などに非常に有用である。