特許 6024939 薬物代謝機能測定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6024939

(24)【登録日】2016年10月21日

(45)【発行日】2016年11月16日

(54)【発明の名称】薬物代謝機能測定方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20161107BHJP

   G01N 33/60 20060101ALI20161107BHJP

   C12Q 1/26 20060101ALN20161107BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/68

   G01N33/60 Z

   !C12Q1/26

【請求項の数】5

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2011-224666(P2011-224666)

(22)【出願日】2011年10月12日

(65)【公開番号】特開2013-81430(P2013-81430A)

(43)【公開日】2013年5月9日

【審査請求日】2014年10月8日

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】504160781

【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100101904

【弁理士】

【氏名又は名称】島村 直己

(72)【発明者】

【氏名】川井 恵一

(72)【発明者】

【氏名】藤田 健一

【審査官】 竹内 祐樹

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１１−１０６８４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５３８２７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５０２１９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５１２１４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５３９０６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Drug Metab. Dispos., 1999, 27(11), pp.1360-1366

【文献】 Fundam. Clin. Pharmacol., 2003, 17(3), pp.349-353

【文献】 Curr. Drug Metab., 2010, 11(6), pp.516-525

【文献】 Hepatology, 1984, 4(1), pp.47-52

【文献】 Drug Metab. Dispos., 2007, 35(4), pp.633-639

【文献】 Food Chem. Toxicol., 2003, 41(8), pp.1185-1192

【文献】 J. Nucl. Med., 1991, 32(5), pp.819-824

【文献】 日本畜産学会報、１９８６年、５７巻、２号、１０９〜１１４頁

【文献】 長崎大学水産学部研究報告、１９８１年、５１号、２９〜３３頁

【文献】 Toxicology, 2005, 207(2), pp.179-190

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

Ｇ０１Ｎ ３３／００−３３／９８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

天然アミノ酸の放射性標識体及び非天然アミノ酸の放射性標識体を投与された被検者の血液、血清、血漿、尿及び唾液から選ばれる試料に含まれる前記放射性標識体の放射性代謝物を、薬物の適正投与量を決定するために、又は被検者の代謝異常を検査するために、分析することを含む薬物代謝機能の測定方法。

【請求項2】

被検者の試料が尿から得られる試料である請求項１に記載の方法。

【請求項3】

薬物の適正投与量を決定するために行う請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

被検者の代謝異常を検査するために行う請求項１又は２に記載の方法。

【請求項5】

放射性核種で標識されたＮ−イソプロピル−ｐ−ヨードアンフェタミンを投与された被検者の血液、血清、血漿、尿及び唾液から選ばれる試料に含まれる前記Ｎ−イソプロピル−ｐ−ヨードアンフェタミンの放射性代謝物を、被検者のＣＹＰ２Ｃ１９による代謝の異常を検査するために、分析することを含む薬物代謝機能の測定方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

薬物等の代謝物を利用した薬物代謝機能測定方法に関する。

【背景技術】

【0002】

シトクロムＰ４５０は、細菌から植物、哺乳動物に至るまでのほとんどすべての生物に存在する、分子量約４５０００から６００００の酸化酵素で、異物（薬物）代謝においては主要な第一相反応の酵素である。還元状態で一酸化炭素と結合して４５０ｎｍに吸収極大を示す色素という意味でシトクロムＰ４５０（Ｐ４５０）と命名された。シトクロムＰ４５０は、水酸化酵素ファミリーの総称であり、略してＣＹＰ（シップ）と呼ばれることが多い。様々な基質を水酸化するので、多くの役割を果たす。肝臓において解毒を行う酵素として知られているが、ステロイドホルモンの生合成、脂肪酸の代謝や植物の二次代謝など、生物の正常活動に必要な反応にも関与している。シトクロムＰ４５０は、ＮＡＤＰＨなどの電子供与体と酸素を用いて基質を水酸化することも共通である。シトクロムＰ４５０は細胞内の小胞体に多く、一部はミトコンドリアに存在する。動物では肝臓に多く、特によく研究されている。

【0003】

シトクロムＰ４５０の代謝能が低い人では、通常の用法・用量にて服用すると、血中濃度が上昇し、治療域を超えるリスクがあり、一方、代謝能の高い人では、血中濃度が治療域に達せず、治療効果が得られないリスクがある。シトクロムＰ４５０の代謝能が低い人が、通常の代謝能の人と同じ量を継続的に服用すると、薬物が蓄積し、血中濃度がより上昇するリスクがある。

【0004】

薬物の適正投与量を決定したり、患者の代謝異常を検査する上で、シトクロムＰ４５０による薬物代謝機能を測定することは非常に重要である。

【0005】

特許文献１には、シトクロムＰ４５０等の薬物代謝酵素を作用させた後、生じた生成物（代謝物）を免疫化学的手法により測定する薬物代謝酵素活性の測定方法が開示されている。

【0006】

しかしながら、特許文献１に記載の方法では、各代謝物の抗体を調製する必要があり、また代謝物が不明の場合には、抗体を調製することは困難である。

【0007】

特許文献２には、呼気分析によって、^１３Ｃ標識シトクロムＰ４５０ ２Ｃ１９アイソザイム（ＣＹＰ２Ｃ１９）基質化合物の静脈内投与又は経口投与後に被験体が吐き出した^１３ＣＯ_２の相対量を求めることにより、ＣＹＰ２Ｃ１９関連代謝能を測定する方法が開示されている。

【0008】

しかしながら、特許文献２に記載の方法は、脱アルキル反応（脱Ｏ−メチル反応）によるもので、代謝を受けるＯ−メチル基にラベルをして、呼気中の^１３Ｃを測定することが必要であり、適用範囲が限られる。

【0009】

また、生体内に投与する放射性化合物としては、種々の放射性医薬品が知られているが、従来生体内に投与されていた放射性医薬品は、その作用・効果を奏するためには、代謝されないことが前提であり、これまで、放射性代謝物を分析することは行われていなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】特開２００４−６９４９１号公報

【特許文献2】特表２０１０−５０２１９４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明の課題は、代謝物の構造等が不明であっても適用でき、かつ適用範囲が広い薬物代謝機能測定方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）放射性化合物を投与した被検者の試料に含まれる前記放射性化合物の放射性代謝物を分析することを含む薬物代謝機能の測定方法。
（２）薬物代謝機能がシトクロムＰ４５０による薬物代謝機能である前記（１）に記載の方法。
（３）放射性化合物が放射性アミノ酸である前記（１）に記載の方法。
（４）放射性アミノ酸が天然アミノ酸及び／又は非天然アミノ酸の放射性標識体である前記（３）に記載の方法。
（５）薬物の適正投与量を決定するために行う前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）被検者の代謝異常を検査するために行う前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（７）被検者の試料が血液、血清又は血漿から得られる試料である前記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）Ｎ−イソプロピル−ｐ−ヨードアンフェタミンもしくはその塩、又はこれらの標識体を含有するシトクロムＰ４５０による薬物代謝機能を測定するための検査薬。

【発明の効果】

【0013】

本発明の薬物代謝機能測定方法は、代謝物の構造等が不明であっても適用でき、かつ適用範囲が広い。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１はヒト肝ミクロゾーム及びＮＡＤＰＨの存在下におけるＮ−イソプロピル−ｐ−ヨードアンフェタミン塩酸塩（ＩＭＰ）の濃度の反応時間依存的減少を示す。

【図2】図２は１２種の組み換えヒトＣＹＰによるＩＭＰの消失反応の結果を示す。

【図3A】図３ＡはＣＹＰ２Ｃ１９によるＩＭＰの消失反応の結果を示す。

【図3B】図３ＢはＣＹＰ１Ａ１によるＩＭＰの消失反応の結果を示す。

【図4】図４はＣＹＰ２Ｃ１９^＊２／^＊２のＩＭＰの消失に対する効果を示す。

【図5】図５は^１２５Ｉ−Ｎ−イソプロピル−ｐ−ヨードアンフェタミン塩酸塩（^１２５Ｉ−ＩＭＰ）由来放射性代謝物の液体クロマトグラフィーにおけるピーク面積の経時変化を示す。

【図6】図６はマウス膵臓、肝臓、腎臓における^１４Ｃ−Ｌ−Ｍｅｔ及び^１４Ｃ−／^３Ｈ−Ｄ−Ｍｅｔのタンパクへの組み込み率を示す。

【図7】図７は肝臓、腎臓における^１４Ｃ−Ｌ−Ｍｅｔ及び^１４Ｃ−Ｄ−Ｍｅｔの組織内放射性代謝物の存在比を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明の薬物代謝機能の測定方法に用いる放射性化合物としては、生体内で代謝され、放射性代謝物を生じるものであれば、特に制限はなく、例えば、シトクロムＰ４５０により代謝され、放射性代謝物を生じるもの、天然アミノ酸及び／又は非天然アミノ酸の放射性標識体が挙げられる。

【0016】

前記シトクロムＰ４５０により代謝され、放射性代謝物を生じる放射性化合物としては、例えば、脳血流診断薬として市販されている^１２３Ｉ−Ｎ−イソプロピル−ｐ−ヨードアンフェタミン（^１２３Ｉ−ＩＭＰ）又はその塩、例えば塩酸塩が挙げられる。

【0017】

また、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）の各分子種について、基質となりうる化合物が知られているので、これらの化合物に対応する放射性化合物を常法により合成して用いることができる。

【0018】

ＣＹＰの各分子種と基質となりうる化合物との具体例を以下に示す。
（ＣＹＰ１Ａ２）
amitriptyline, caffeine, clomipramine, clozapine, cyclobenzaprine, estradiol, fluvoxamine, haloperidol, imipramine, mexiletine, naproxen, olanzapine, ondansetron, acetaminophen, propranolol, riluzole, ropivacaine, tacrine, theophylline, tizanidine, verapamil, R-warfarin, zileuton, zolmitriptan
（ＣＹＰ２Ｂ６）
bupropion, cyclophosphamide, efavirenz, ifosphamide, methadone, sorafenib
（ＣＹＰ２Ｃ８）
amodiaquine, cerivastatin, paclitaxel, repaglinide, sorafenib, torsemide
（ＣＹＰ２Ｃ９）
非ステロイド性抗炎症薬：diclofenac, ibuprofen, lornoxicam, meloxicam, S-naproxen, piroxicam, suprofen
経口血糖降下剤:tolbutamide, glipizide
アンジオテンシンII阻害薬：losartan, irbesartan
スルホニル尿素系薬剤：glyburide, glibenclamide, glipizide, glimepiride, tolbutamide
その他：amitriptyline, celecoxib, fluoxetine, fluvastatin, glyburide, nateglinide, phenytoin-4-OH2, rosiglitazone, tamoxifen, torsemide, S-warfarin
（ＣＹＰ２Ｃ１９）
プロトンポンプ阻害薬：lansoprazole, omeprazole, pantoprazole, rabeprazole
抗てんかん剤：diazepam, phenytoin, S-mephenytoin, phenobarbitone
その他：amitriptyline, carisoprodol, citalopram, chloramphenicol, clomipramine, clopidogrel, cyclophosphamide, hexobarbital, imipramine, indomethacin, R-mephobarbital, moclobemide, nelfinavir, nilutamide, primidone, progesterone, proguanil, propranolol, teniposide, R-warfarin
（ＣＹＰ２Ｄ６）
tamoxifen
β遮断薬：carvedilol, S-metoprolol, propafenone, timolol
抗うつ薬：amitriptyline, clomipramine, desipramine, fluoxetine, imipramine, paroxetine
抗精神病薬：haloperidol, perphenazine, risperidone, thioridazine, zuclopenthixol
その他：alprenolol, amphetamine, aripiprazole, atomoxetine, bufuralol, chlorphenimipramine, chlorpromazine, codeine, debrisoquine, dexfenfluramine, dextromethorphan, donepezil, duloxetine, encainide, flecainide, fluvoxamine, lidocaine, metoclopramide, methoxyamphetamine, mexiletine, minaprine, nebivolol, nortriptyline, ondansetron, oxycodone, perhexiline, phenacetin, phenformin, promethazine, propranolol, sparteine, tramadol, venlafaxine
（ＣＹＰ２Ｅ１）
麻酔薬：enflurane, halothane, isoflurane, methoxyflurane, sevoflurane
その他：acetaminophen, aniline, benzene, chlorzoxazone, ethanol, N,N-dimethylformamide, theophylline
（ＣＹＰ３Ａ４，５，７）
マクロライド系抗生物質：clarithromycin, erythromycin (not 3A5)
抗不整脈薬：quinidine (not 3A5)
ベンゾジアゼピン系薬物：alprazolam, diazepam, midazolam, triazolam
免疫調節剤：cyclosporine, tacrolimus (FK506)
抗ＨＩＶ薬：indinavir, nelfinavir, ritonavir, saquinavir
消化管運動改善薬：cisapride
抗ヒスタミン薬：astemizole, chlorpheniramine, terfenadine
カルシウム拮抗薬：amlodipine, diltiazem, felodipine, lercanidipine, nifedipine, nisoldipine, nitrendipine, verapamil
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬：atorvastatin, cerivastatin, lovastatin, simvastatin
ステロイド類：estradiol, hydrocortisone, progesterone, testosterone
その他：alfentanil, aprepitant, aripiprazole, boceprevir, buspirone, caffeine, cilostazol, cocaine, dapsone, dexamethasone, dextromethorphan, docetaxel, domperidone, eplerenone, fentanyl, finasteride, gleevec, haloperidol, imipramine, irinotecan, LAAM, lidocaine, methadone, nateglinide, ondansetron, pimozide, propranolol, quetiapine, quinine, risperidone, salmeterol, sildenafil, sirolimus, sorafenib, sunitinib, tamoxifen, taxol, telaprevir, terfenadine, torisel, trazodone, vincristine, zaleplon, ziprasidone, zolpidem

【0019】

天然アミノ酸は代謝されやすく、非天然アミノ酸は代謝を受けにくい。したがって、天然アミノ酸及び／又は非天然アミノ酸の放射性標識体を投与した被検者の試料に含まれる放射性代謝物を分析することにより、薬物代謝機能を測定することができ、薬物の適正投与量を決定したり、被検者の代謝異常を検査することができる。

【0020】

本発明の薬物代謝機能の測定方法においては、目的に応じて、基質となる放射性化合物を１種又は２種以上を用いる。

【0021】

分析対象物である放射性代謝物の形態としては、有機物、無機物、イオンのいずれでもよいが、分析の容易性の点で有機物が好ましい。本発明における放射性アミノ酸の代謝物には、当該放射性アミノ酸が組み込まれたタンパクも包含される。

【0022】

本発明の測定方法に用いる放射性化合物を合成するために用いる放射性核種としては、例えばトリチウム（^３Ｈ）、１１−炭素（^１１Ｃ）、１４−炭素（^１４Ｃ）、１５−酸素（^１５Ｏ）、１８−フッ素（^１８Ｆ）、３２−リン（^３２Ｐ）、５９−鉄（^５９Ｆｅ）、６７−銅（^６７Ｃｕ）、６７−ガリウム（^６７Ｇａ）、８１ｍ−クリプトン（^８１ｍＫｒ）、８１−ルビジウム（^８１Ｒｂ）、８９−ストロンチム（^８９Ｓｒ）、９０−イットリウム（^９０Ｙ）、９９ｍ−テクネチウム（^９９ｍＴｃ）、１１１−インジウム（^１１１Ｉｎ）、１２３−ヨード（^１２３Ｉ）、１２５−ヨード（^１２５Ｉ）、１３１−ヨード（^１３１Ｉ）、１３３−キセノン（^１３３Ｘｅ）、１１７ｍ−スズ（^１１７ｍＳｎ）、１５３−サマリウム（^１５３Ｓｍ）、１８６−レニウム（^１８６Ｒｅ）、１８８−レニウム（^１８８Ｒｅ）、２０１−タリウム（^２０１Ｔｌ）、２１２−ビスマス（^２１２Ｂｉ）、２１３−ビスマス（^２１３Ｂｉ）及び２１１−アスタチン（^２１１Ａｔ）が挙げられる。

【0023】

本発明における放射性化合物の投与経路としては、静脈内、皮内、皮下、経口、経粘膜、及び直腸投与などが挙げられる。被検者の試料としては、例えば血液、血清、血漿、尿、唾液又はその他体液、好ましくは血液、血清、血漿が挙げられる。

【0024】

放射性化合物の投与形態としては、投与経路に適した剤形であれば、注射剤、液剤、錠剤等から適宜選択すればよく、本発明の作用及び効果を損なわない限り、薬学的に許容される担体、又は剤形によって当該技術分野において一般的に使用される添加剤を更に含んでもよい。添加剤として、例えば、着色剤、保存剤、風味剤、香り改善剤、呈味改善剤、甘味剤、又は安定剤、その他薬学的に許容される添加剤を含有することができる。

【0025】

放射性化合物の投与量は、投与方法、投与する化合物ならびに患者の年齢、性別及び体重によって、適宜決定すればよい。

【0026】

本発明の測定方法においては、放射性化合物を投与した被検者の試料に含まれる前記放射性化合物の放射性代謝物を分析する。前記放射性代謝物の分析は、例えば、親化合物（未変化体）の放射性化合物と前記放射性代謝物とを分離して、前記放射性代謝物の放射能を測定することにより行うことができる。

【0027】

脂溶性の放射性化合物は、代謝されることにより水溶性の放射性代謝物を生じることが多く、このような場合には、例えばオクタノール抽出法により親化合物（未変化体）の放射性化合物と前記放射性代謝物とを分離することができる。また、薄層クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー等によっても、親化合物（未変化体）の放射性化合物と前記放射性代謝物とを分離することができる。

【0028】

本発明の測定方法によれば、一般的な放射性診断薬においては夾雑物されている放射性代謝物を解析することにより、各種代謝異常、例えばＣＹＰの異常を見つけることができ、また、代謝物を見ることにより、ＣＹＰ分子種ごとの遺伝子を調べることなく、ＣＹＰファミリー全体として代謝プロファイルができ、また薬物の適正投与量を決定できる。

【0029】

本発明の測定方法は、放射性代謝物を分析するので、非標識代謝物を分析する場合に比較して、非常に低い投与量でも十分な効果を発揮することができ、更に、内因性の代謝物と容易に区別することもできる。

【0030】

Ｎ−イソプロピル−ｐ−ヨードアンフェタミン（ＩＭＰ）はＣＹＰ２Ｃ１９により選択的に代謝される。したがって、ＩＭＰもしくはその塩、又はこれらの標識体は、ＣＹＰ、特にＣＹＰ２Ｃ１９による薬物代謝機能を測定するための検査薬として用いることができる。前記したように低い投与量で十分な効果が得られ、また脳血流診断薬として市販されているように、安全性が確認されている点から、^１２３Ｉ−Ｎ−イソプロピル−ｐ−ヨードアンフェタミン（^１２３Ｉ−ＩＭＰ）又はその塩を用いることが好ましい。

【0031】

ＩＭＰ又は^１２３Ｉ−ＩＭＰの塩としては、薬学的に許容される塩が好ましく、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、ピロ硫酸、メタリン酸等の無機酸、又はクエン酸、安息香酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、スルホン酸（例えば、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸）等の有機酸との塩が挙げられる。

【0032】

ＩＭＰの標識体に用いる標識としては、例えば、前記の放射性核種による標識の他、同位体、蛍光等による標識が挙げられる。

【実施例】

【0033】

以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0034】

（実施例１）Ｎ−イソプロピル−ｐ−ヨードアンフェタミン塩酸塩のＣＹＰ２Ｃ１９による代謝物の分析
（目的）
^１２３Ｉ−Ｎ−イソプロピル−ｐ−ヨードアンフェタミン塩酸塩（^１２３Ｉ−ＩＭＰ）は、臨床において単光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）による脳血流の診断に用いられている。^１２３Ｉ−ＩＭＰはヒトの体内で代謝を受ける希な診断薬である。代謝の第１段階は^１２３Ｉ−ｐ−ヨードアンフェタミンの生成であること、また引き続いて^１２３Ｉ−ｐ−ヨード安息香酸、更に^１２３Ｉ−ｐ−ヨード馬尿酸へと代謝されることが報告されている。しかしながらこれまでにこれらの代謝反応に関与する薬物代謝酵素についての知見はない。そこで本実験ではＩＭＰの代謝におけるチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）の関与を調べた。

【0035】

（方法）
Ｎ−イソプロピル−ｐ−ヨードアンフェタミン塩酸塩（ＩＭＰ）及びｐ−ヨード安息香酸の非標識体を使用した。ヒト肝ミクロゾームを酵素源とし、ＩＭＰからｐ−ヨード安息香酸への代謝がＮＡＤＰＨ依存的に起こるか否かを調べた。このときＩＭＰの消失の有無及びその程度も調べた。組み換えヒトＣＹＰ１Ａ１、１Ａ２、１Ｂ１、２Ａ６、２Ｂ６、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、２Ｅ１、３Ａ４及び３Ａ５を用いて、ＩＭＰの代謝における各ＣＹＰ分子種の寄与を調べた。
Ｉ．試薬
リン酸水素二ナトリウム・１２水（和光純薬）
リン酸二水素カリウム（和光純薬）
ＥＤＴＡ・２Ｎａ（和光純薬）
Glucose-6-phosphate（和光純薬）
β−ＮＡＤＰ^＋（和光純薬）
Glucose-6-phosphate dehydrogenase（和光純薬）
ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ（和光純薬）
過塩素酸（６０％）（和光純薬）
ｐ−クロロ安息香酸（和光純薬）
アセトニトリル（和光純薬）
ジブチルアミンフォスフェート溶液（Ｄ４試薬）（Ｗａｔｅｒｓ）
ＢＤウルトラプール１５０ドナープールドヒト肝ミクロゾーム（日本ベクトン・ディッキンソン）
特級グリセリン（和光純薬）

【0036】

II．試薬調製
１．ミクロゾーム
納品時にミクロゾームは２５０ｍＭスクロースに懸濁され、蛋白濃度は２０ｍｇ／ｍＬである。一度融解してミクロゾーム５００μＬに対しグリセリンを１２５μＬ添加した（蛋白濃度は１６ｍｇ／ｍＬとなる）。エッペンに分注して−８０℃に保存し、反応時に必要量を融解して使用した。

【0037】

２．０．１６７ｍＭ ＥＤＴＡ／０．３３Ｍ ＮａＫリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
（１）０．５Ｍリン酸水素二ナトリウム水溶液（ＭＷ：３５８．１４、１７９．０７ｇ／１０００ｍＬ）に０．５Ｍリン酸二水素カリウム水溶液（ＭＷ１３６．０９、３４．０２ｇ／５００ｍＬ）を加え、０．５Ｍ ＮａＫリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を調製した。
（２）０．５ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を調製した（ＭＷ３７２．２４、３７．２２ｍｇ／２００ｍＬ）。
（３）０．５ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液：０．５Ｍ ＮａＫリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）＝１：２の割合で混合し、０．１６７ｍＭ ＥＤＴＡ／０．３３Ｍ ＮａＫリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）とした。

【0038】

３．ＮＡＤＰＨ生成系（用時調製）
（１）１Ｍ ＭｇＣｌ_２水溶液を調製（ＭＷ：２０３．３０、１０．１７ｇ／５０ｍＬ）した。
（２）Glucose-6-phosphate １８．２ｍｇを精製水５３６μＬに溶解した。
（３）β−ＮＡＤＰ^＋４．５ｍｇを精製水４８２．４μＬに溶解した。
（４）（２）の溶解したGlucose-6-phosphateと（３）のβ−ＮＡＤＰ^＋を混合し、（１）の１Ｍ ＭｇＣｌ_２水溶液５３．６μＬ及びGlucose-6-phosphate dehydrogenase（１０００Ｕ／１ｍＬ）１０．７２μＬを添加しＮＡＤＰＨ生成系とした。

【0039】

III．実験方法
１．親化合物（ＩＭＰ）減少を指標とした方法
反応溶液は０．０５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＫリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．６４ｍｇ／ｍＬ蛋白相当のグリセリン添加ヒト肝ミクロゾーム、ＮＡＤＰＨ生成系（０．５ｍＭ β−ＮＡＤＰ^＋、５ｍＭ Glucose-6-phosphate、１Ｕ／ｍＬ Glucose-6-phosphate dehydrogenase、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）及び０．５μＭ ＩＭＰを混合し２５０μＬとなるようにした（ｉ）。対照は、ＮＡＤＰＨ生成系を精製水に置き換え行ったもの（ii）、ミクロゾーム及びＮＡＤＰＨ生成系を精製水に置き換え行ったもの（iii）を実施した。ＩＭＰ添加で反応を開始し３７℃で反応後、５０μＬ過塩素酸水溶液を加え反応を停止させた。反応時間を１０、２０、６０分間とした。反応停止後、内部標準物質の２０μＭ ｐ−クロロ安息香酸水溶液を３０μＬ添加し１５０００ｒｐｍ、２０℃で５分間遠心した。その上清１００μＬを液体クロマトグラフィーにて分析した。
１検体あたりの組成及び操作を表１に示す。

【0040】

【表1】

【0041】

分析条件を以下に示す。
カラム：CAPCELL PAK C18 SG120，４．６×２５０ｍｍ（資生堂製）
カラム温度：４０℃
移動相Ａはアセトニトリル３３０ｍＬ、水６７０ｍＬを混ぜ、ジブチルアミンフォスフェート溶液（Ｄ４試薬）１０ｍＬを加えた。
移動相Ｂはアセトニトリル９００ｍＬ、水１００ｍＬを混ぜ、ジブチルアミンフォスフェート溶液（Ｄ４試薬）１０ｍＬを加えた。
溶離条件：移動相Ａ：移動相Ｂ＝１００：０→７８：２２（０ｍｉｎ．→１６ｍｉｎ．）グラディエント、その後移動相Ａ：移動相Ｂ＝１００：０で９分平衡化した。
流量：０．８ｍＬ／ｍｉｎ．
検出（ＵＶ）：ＩＭＰは２３２ｎｍ、代謝物ｐ−ヨード安息香酸は２４８ｎｍ、内部標準物質ｐ−クロロ安息香酸は２３５ｎｍで検出した。
＊本条件で約６．３分にＩＭＰ、約１５．６分に代謝物ｐ−ヨード安息香酸、約１２．６分に内部標準物質ｐ−クロロ安息香酸が検出された。

【0042】

２．代謝物（ｐ−ヨード安息香酸）の増加を指標とした方法
反応溶液は０．０５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＫリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．６４ｍｇ／ｍＬ蛋白相当のグリセリン添加ヒト肝ミクロゾーム、ＮＡＤＰＨ生成系（０．５ｍＭ ＮＡＤＰ^＋、５ｍＭ Glucose-6-phosphate、１Ｕ／ｍＬ Glucose-6-phosphate dehydrogenase、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）及び１０００μＭ ＩＭＰを混合し２５０μＬとなるようにした。対照は、実験方法１．と同様に行った。ＩＭＰ添加で反応を開始し３７℃で反応後、５０μＬ過塩素酸水溶液を加え反応を停止させた。反応時間を１０、６０、１２０分間とした。反応停止以降の操作、分析方法は、実験方法１．と同じである。
１検体あたりの組成は、実験方法１．の５μＭ ＩＭＰを１０ｍＭ ＩＭＰとし、他は同様に行った。

【0043】

（結果・考察）
ＩＭＰ（０．５又は１μＭ）をヒト肝ミクロゾーム及びＮＡＤＰＨの存在下においてインキュベートしたところ、ｐ−ヨード安息香酸の生成は認められなかった。ＩＭＰの濃度は、ＮＡＤＰＨの存在下において反応時間依存的に減少し（図１）、ＩＭＰがヒト肝ミクロゾーム中の酵素によりＮＡＤＰＨ依存的に代謝されることを明らかにした。組み換えヒトＣＹＰを用いた実験により、ＩＭＰはＣＹＰ２Ｃ１９により独占的に代謝されることを見いだした（図２及び３）。ＣＹＰ２Ｃ１９によるＩＭＰの消失反応のＫｍは８．６μＭ、Ｖｍａｘは９．７ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｎｍｏｌ ＣＹＰであった。ＣＹＰ２Ｃ１９を欠損するヒト肝ミクロゾーム（ＣＹＰ２Ｃ１９^＊２／^＊２）を用いた場合、ＩＭＰの消失速度は野生型のＣＹＰ２Ｃ１９を発現するヒト肝ミクロゾームを用いた場合の約５０％であり（図４）、ＩＭＰの代謝がＣＹＰ２Ｃ１９の遺伝子多型に依存することを明らかにした。ＩＭＰがＣＹＰ２Ｃ１９によって代謝された結果、未知ピークがＨＰＬＣクロマトグラムで検出された。ピーク面積はＩＭＰピークの減少に比例して反応時間依存的に増加した。

【0044】

（結論）
以上、ＩＭＰはＣＹＰ２Ｃ１９により代謝されることがわかった。したがって、ＩＭＰ又はその標識体を用いることにより、シトクロムＰ４５０による薬物代謝機能を測定できることがわかった。

【0045】

（実施例２）^１２５Ｉ−Ｎ−イソプロピル−ｐ−ヨードアンフェタミン塩酸塩のＣＹＰ２Ｃ１９による代謝物の分析
Ｎ−イソプロピル−ｐ−ヨードアンフェタミン塩酸塩（ＩＭＰ）の代わりに^１２５Ｉ−Ｎ−イソプロピル−ｐ−ヨードアンフェタミン塩酸塩（^１２５Ｉ−ＩＭＰ）を用いた以外は実施例１と同様にして実験を行った。結果を表２及び図５に示す。

【0046】

【表2】

【0047】

^１２５Ｉ−ＩＭＰもＩＭＰと同様に、ＣＹＰ２Ｃ１９により代謝されることがわかった。したがって、^１２５Ｉ−ＩＭＰを用いることにより、シトクロムＰ４５０による薬物代謝機能を測定できることがわかった。

【0048】

（実施例３）放射性ヨウ素標識アミノ酸の放射性代謝物の分析
（１）放射性ヨウ素標識チロシンの調製
^１２５Ｉ−３−ヨード−Ｄ−チロシン（^１２５Ｉ−Ｄ−ＭＩＴ）及び^１２５Ｉ−３−ヨード−Ｌ−チロシン（^１２５Ｉ−Ｌ−ＭＩＴ）を以下のようにして調製した。
^１２５Ｉ−ＮａＩは、Ａｍｅｒｓｈａｍ社より購入した。^１２５Ｉ−Ｄ−ＭＩＴ及び^１２５Ｉ−Ｌ−ＭＩＴは、Ｄ−及びＬ−チロシンを原料としてｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ−Ｔ法によりそれぞれ作製した。即ち、ｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ−Ｔ ２．０×１０^−８ｍｏｌｅ（Ａｌｄｒｉｃｈ社）を溶解した０．０５Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ６．２）１０μｌを、標識原料のアミノ酸１．０×１０^−８ｍｏｌｅと無担体^１２５Ｉ−ＮａＩ（７，４〜３７ＭＢｑ）を食む３５μｌの０．４Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ６．２）に加えた。反応液を２分間放置し、飽和ピロ亜硫酸ナトリウム水溶液の１０倍希釈液を加え、反応を止めた。放射性ヨウ素標識ＭＩＴの精製は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）カラムクロマトグラフィー（１０×２００ｍｍ、溶出液；酢酸エチル：メタノール：２Ｎアンモニア水＝４０：１０：４）により行なった。溶出した標識アミノ酸画分を集め、減圧下、溶媒を完全に留去した後、生理食塩水に溶解し、以下の実験に用いた。

【0049】

（２）マウス組織ホモジネートを用いた脱ヨウ素化反応
体重約２５ｇのｄｄＹ系雄性マウス２匹を屠殺解剖した後、即座に肝臓及び腎臓を摘出し、一定量の組織に水冷したＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）を加えてホモジナイズした。氷冷した各ホモジネート１００μｌに^１２５Ｉ−Ｄ−ＭＩＴ又は^１２５Ｉ−Ｌ−ＭＩＴを２０μｌ（１．１×１０^−１３ｍｏｌｅ、７．４ｋＢｑ）加えて、３７℃あるいは４℃にてインキュベートし、５分後、トリクロロ酢酸を最終濃度が５％になるように加えた。遠心分離した後、その上清をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ社Ａｒｔ．５５５３、展開溶媒；メタノール：酢酸＝１００：１，メタノール：１０％酢酸アンモニア水＝１０：１）にて分析した。インキュベート５分後の結果を表３に示す。

【0050】

【表3】

【0051】

^１２５Ｉ−Ｄ−ＭＩＴは、３７℃及び４℃のいずれの温度条件においてもほとんど脱ヨウ素化を受けなかった。一方、^１２５Ｉ−Ｌ−ＭＩＴは３７℃でインキュベートすると、ほとんど脱ヨウ素化された。

【0052】

（３）マウス体内分布実験と代謝物の分析
^１２５Ｉ−Ｄ−ＭＩＴ及び^１２５Ｉ−Ｌ−ＭＩＴのそれぞれの生理食塩溶液０．１ｍｌ（１．６×１０^−１３ｍｏｌｅ、１１．１ｋＢｑ）を体重約２５ｇのｄｄＹ系雄性マウス２匹に尾静脈より投与し、一定時間後にエーテル麻酔にて屠殺した。ヘパリン処理注射器を用いて心臓穿刺により採血した後、肝臓、腎臓を摘出した。

【0053】

各組織５０ｍｇを精秤し、重炭酸緩衝溶液４５０μｌを加え、ホモジナイズした。この一定量を１．９ｍｌに希釈し、１００％トリクロロ酢酸溶液０．１ｍｌを加え、混和した。遠心分離した後、その上清をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ社Ａｒｔ．５５５３、展開溶媒；メタノール：酢酸＝１００：１，メタノール：１０％酢酸アンモニア水＝１０：１）にて分析した。インキュベート１０分後の結果を表４に示す。

【0054】

【表4】

【0055】

いずれの組織においても、^１２５Ｉ−Ｄ−ＭＩＴに比較して、^１２５Ｉ−Ｌ−ＭＩＴは容易に代謝（酵素的脱ヨウ素化）され、放射性代謝物である遊離ヨウ素が多量に検出された。この傾向は尿中ではより顕著であった。

【0056】

以上のように、^１２５Ｉ−Ｄ−ＭＩＴ及び^１２５Ｉ−Ｌ−ＭＩＴは代謝のしやすさが大きく異なり、これらの傾向を利用し、個体差、病態の変化による放射性代謝物の量の相違を測定することにより、薬物代謝機能を測定が可能であることがわかった。

【0057】

（実施例４）放射性天然／非天然アミノ酸の放射性代謝物の分析
５週齢ｄｄＹ系雄性マウスに標識Ｌ−／Ｄ−メチオニン（Ｍｅｔ）を尾静脈注し、１０分後にマウスを屠殺した後、膵臓、肝臓、腎臓を摘出した。摘出臓器に重炭酸緩衝液を加えホモジナイズした。このホモジネートに最終濃度５％となるように１００％トリクロロ酢酸（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を加え、混和した。この沈殿画分をグラスフィルター（ＧＣ−５０、Ｔｏｙｏ）に捕集し、氷冷５％トリクロロ酢酸で洗浄した後、１５０℃、１時間加熱処理することによりタンパクを固定し、その放射能を測定したものをタンパク画分への組み込み率として評価した。

【0058】

また、前記のトリクロロ酢酸を加えたホモジネートを遠心分離し、上清を薄層クロマトグラフィーにスポット後、展開溶媒（ブタノール：酢酸：水＝４：１：１）で展開し、イメージングプレート（ＢＡＳ−ＳＲ２０２５，Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）に露光後、ＢＡＳ５０００（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）を用いて解析したものを酸可溶性画分における未変化体残存率として評価した。

【0059】

Ｄ−Ｍｅｔについて、膵臓においては、体内分布実験の膵臓を分析したため、ダブルトレーサー用の^３Ｈ体を用いた。また、肝臓、腎臓に関しては酸可溶性画分における代謝安定性の評価に^１４Ｃ専用イメージングプレートを用いたために、［Ｓ−ｍｅｔｈｙｌ−^１４Ｃ］−Ｄ−Ｍｅｔ（^１４Ｃ−Ｄ−Ｍｅｔ；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いた。したがって、放射性代謝物分析におけるＤ−Ｍｅｔの表記は^１４Ｃ−／^３Ｈ−Ｄ−Ｍｅｔとする。

【0060】

トレーサー投与後１０分のマウス膵臓、肝臓、腎臓における^１４Ｃ−Ｌ−Ｍｅｔ及び^１４Ｃ−／^３Ｈ−Ｄ−Ｍｅｔのタンパクへの組み込み率を図６に示した。^１４Ｃ−Ｌ−Ｍｅｔは組織集積率の約２５〜５０％のタンパク組み込み率を示したのに対し、^１４Ｃ−／^３Ｈ−Ｄ−Ｍｅｔでは約３％と^１４Ｃ−Ｌ−Ｍｅｔと比較し顕著に低下した。

【0061】

また、図７に代表的な代謝性組織である肝臓、腎臓の組織集積率を１００％としたときの^１４Ｃ−Ｌ−Ｍｅｔ及び^１４Ｃ−Ｄ−Ｍｅｔの組織内放射性代謝物の存在比を示す。^１４Ｃ−Ｄ−Ｍｅｔにおいては約８０％が未変化体として存在していたのに対し、^１４Ｃ−Ｌ−Ｍｅｔにおいては未変化体は約４０％以下しか存在しておらず、約２５〜５０％はタンパク画分に、約２５〜５０％は放射性代謝物として存在していることを確認した。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】