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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6025127
(24)【登録日】2016年10月21日
(45)【発行日】2016年11月16日
(54)【発明の名称】抗腫瘍剤、腫瘍検出用マーカー及び経口ワクチン剤
(51)【国際特許分類】
A61K 35/745 20150101AFI20161107BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20161107BHJP
A61K 38/00 20060101ALI20161107BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20161107BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20161107BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20161107BHJP
C12N 1/21 20060101ALN20161107BHJP
C12Q 1/04 20060101ALN20161107BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20161107BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20161107BHJP
【ＦＩ】
A61K35/745
A61K39/395 T
A61K37/02
A61K49/00 Z
A61P35/00
!C12N15/00 A
!C12N1/21ZNA
!C12Q1/04
!C07K16/00
!C07K19/00
【請求項の数】10
【全頁数】47
(21)【出願番号】特願2014-524909(P2014-524909)
(86)(22)【出願日】2013年7月12日
(86)【国際出願番号】JP2013069717
(87)【国際公開番号】WO2014010758
(87)【国際公開日】20140116
【審査請求日】2014年10月2日
(31)【優先権主張番号】特願2012-158044(P2012-158044)
(32)【優先日】2012年7月13日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】597023558
【氏名又は名称】学校法人帝京平成大学
(74)【代理人】
【識別番号】100091096
【弁理士】
【氏名又は名称】平木 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100118773
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 節
(74)【代理人】
【識別番号】100180954
【弁理士】
【氏名又は名称】漆山 誠一
(72)【発明者】
【氏名】平 裕一郎
(72)【発明者】
【氏名】石田 功
【審査官】
森井 文緒
(56)【参考文献】
【文献】
特表２００５−５２３８７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２０１０／１２６０７３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
英国特許出願公開第０２４８２５３５（ＧＢ，Ａ）
【文献】
特表２００２−５２１４９４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
Curr. Cancer Drug Targets (2004) vol.4, no.8, p.689-702
【文献】
Nat. Med. (1998) vol.4, no.11, p.1281-1286
【文献】
Protein Eng. Des. Sel. (2007) vol.20, no.12, p.583-890
【文献】
BMC Immunol. (2009) vol.10, 43
【文献】
Virus Res. (Sep 2010) vol.155, issue 1, p.55-60
【文献】
Mol. Ther. (2010) vol.18, no.7, p.1397-1407
【文献】
Nat. Biotechnol. (2002) vol.20, issue 7, p.702-706
【文献】
J. Exp. Med. (2007) vol.204, no.12, p.2789-2796
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ａ６１Ｋ
ＰｕｂＭｅｄ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
シグナルペプチド、腫瘍細胞の表面抗原を認識して結合する、分子量が35kDa以下の単鎖抗体、及び一又は二以上の外毒素及び／又は標識タンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸を発現可能な状態で含む組換え偏性嫌気性グラム陽性菌を有効成分とする循環器内投与用抗腫瘍剤。
【請求項2】
偏性嫌気性グラム陽性菌がビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）である、請求項１に記載の循環器内投与用抗腫瘍剤。
【請求項3】
前記核酸が二以上の単鎖抗体をコードする、請求項１又は２に記載の循環器内投与用抗腫瘍剤。
【請求項4】
前記標識タンパク質が蛍光タンパク質又は発光タンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の循環器内投与用抗腫瘍剤。
【請求項5】
前記単鎖抗体がラクダ科動物由来の一本鎖抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の循環器内投与用抗腫瘍剤。
【請求項6】
シグナルペプチド、腫瘍細胞の表面抗原を認識して結合する、分子量が35kDa以下の単鎖抗体、及び一又は二以上の外毒素及び／又は標識タンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸を発現可能な状態で含む組換え偏性嫌気性グラム陽性菌を有効成分とする循環器内投与用腫瘍検出用マーカー。
【請求項7】
偏性嫌気性グラム陽性菌がビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）である、請求項６に記載の循環器内投与用腫瘍検出用マーカー。
【請求項8】
前記核酸が二以上の単鎖抗体をコードする、請求項６又は７に記載の循環器内投与用腫瘍検出用マーカー。
【請求項9】
前記標識タンパク質が蛍光タンパク質又は発光タンパク質である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の循環器内投与用腫瘍検出用マーカー。
【請求項10】
前記単鎖抗体がラクダ科動物由来の一本鎖抗体である、請求項６〜９のいずれか一項に記載の循環器内投与用腫瘍検出用マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、組換え偏性嫌気性グラム陽性菌を有効成分とする抗腫瘍剤、腫瘍検出用マーカー及び経口ワクチン剤に関する。【背景技術】
【0002】
ビフィズス菌をはじめとする偏性嫌気性菌は、静脈内に投与した場合、非常に高い選択性をもって腫瘍のみで増殖する（非特許文献１）。これは、腫瘍の中心部が低酸素領域であることから嫌気的環境が存在し、偏性嫌気性菌が生存及び増殖可能なためと考えられている。また、ビフィズス菌は、グラム陽性菌であり、死後もエンドトキシンを放出する危険性がないという利点もある。一方、腫瘍組織の中心部のこの嫌気的環境は、従来の化学療法に抵抗性を生ずる原因とも考えられている（非特許文献２）。それ故、ビフィズス菌の上記特徴を利用して、腫瘍組織に対するＤＤＳ（ドラッグ・デリバリー・システム）担体としての有用性が注目されつつある。例えば、特許文献１及び非特許文献３では、固形癌治療を目的としてプロドラッグである５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に転換可能な大腸菌のシトシンデアミナーゼ（ＣＤ：ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）を発現する組換えビフィズス菌を作出し、この組換えビフィズス菌を５−ＦＣと共に投与することで抗腫瘍効果を得る発明が開示されている。しかし、この方法は、組換えビフィズス菌の他に、５−ＦＣを大量に生体に投与する必要があるため煩雑であり、副作用等を考慮すると臨床開発時には様々な制約が生ずる問題があった。
また、特許文献２には、生物活性を有するポリペプチドを高いレベルで分泌発現させることができる組換えビフィズス菌を作出し、組換えビフィズス菌を腫瘍に直接注入する発明が開示されている。しかし、この方法は、腫瘍の位置を正確に特定する必要があるため適用範囲が狭く、また体内深部に腫瘍が存在する場合には、侵襲性が高いことから、汎用性を欠くという問題があった。
他の細菌を用いた腫瘍に対する治療法としては、特許文献３及び非特許文献４及び５に記載のクロストリジウム・ノーヴィ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ）や、非特許文献６及び７に記載のサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）等が報告されているが、いずれも病原性細菌由来であり、有害な外毒素を分泌することから、投与する生体の安全面で大きな問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特許第３６４２７５５
【特許文献2】ＷＯ／２０１０／１２６０７３
【特許文献3】特開２００９−５４１３１９
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Ｋｉｍｕｒａ Ｎ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４０（６）：２０６１−２０６８．
【非特許文献2】Ｔｒｅｄａｎ Ｏ，ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，９９：１４４１−１４５４．
【非特許文献3】Ｓ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉ．，１０１（９）：１９２５．
【非特許文献4】Ｄａｎｇ Ｌ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８：１５１５５−１５１６０．
【非特許文献5】Ｉａｎ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１４：１３０８−１３１１．
【非特許文献6】Ｐａｗｅｌｅｋ Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５７：４５３７−４５４４．
【非特許文献7】Ｔｏｓｏ Ｊ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２０：１４２−１５２．
【発明の概要】
【0005】
本発明の課題は、機能性ペプチドをコードする核酸を発現及び分泌可能な状態で標的細胞周辺にまで送達できる薬剤送達用担体として機能する組換え偏性嫌気性グラム陽性菌を提供することである。本発明の課題は、侵襲性が低く副作用の少ない、かつ標的特異性の高い抗腫瘍剤及び／又は治療効果を経時的にモニタリングできる腫瘍検出用マーカーを提供することである。
本発明の課題は、非侵襲的で副作用が低く、かつ標的特異性の高い経口ワクチン剤を提供することである。
薬剤送達用担体としての偏性嫌気性菌の臨床応用を考慮すると、汎用性の高い静脈内投与による治療法が有効である。しかし、そのためには、癌細胞を特異的に標的とし、かつ細胞傷害活性が高い生理活性ペプチドを構築する必要がある。ところが、ビフィズス菌内で免疫グロブリン（ＩｇＧ）を発現させた場合、機能性を有する抗体が発現しないという大きな問題があった。
本発明者らは、上記課題を解決するためシグナルペプチド、単鎖抗体で構成される低分子量の抗腫瘍抗体、及び外毒素からなる分泌型融合タンパク質をコードする核酸を含む遺伝子組み換えビフィズス菌を作製し、担癌マウスＸｅｎｏｇｒａｆｔｍｏｄｅｌに静脈内に投与したところ、該組換えビフィズス菌は、非常に高い選択性で腫瘍内に蓄積し、かつ生体に大きな副作用を及ぼすことなく、分泌された融合タンパク質の細胞傷害活性によりその腫瘍細胞の増殖を９０％以上抑制することに成功した。本発明は、当該研究結果に基づくものであって、具体的には以下の発明を提供する。
（１）シグナルペプチド、単鎖抗体及び一又は二以上の機能性ペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸を発現可能な状態で含む組換え偏性嫌気性グラム陽性菌。
（２）偏性嫌気性グラム陽性菌がビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）である、（１）に記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌。
（３）前記単鎖抗体は、分子量が３５ｋＤａ以下の低分子抗体である、（１）又は（２）に記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌。
（４）前記核酸が二以上の単鎖抗体をコードする、（１）〜（３）のいずれかに記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌。
（５）前記単鎖抗体が標的細胞の表面抗原を認識し、結合する、（１）〜（４）のいずれかに記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌。
（６）前記標的細胞が腫瘍細胞である、（５）に記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌。
（７）前記機能性ペプチドが外毒素及び／又は標識タンパク質である、（５）又は（６）に記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌。
（８）前記標識タンパク質が蛍光タンパク質又は発光タンパク質である、（７）に記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌。
（９）前記機能性ペプチドがワクチン抗原ペプチドである、（１）〜（５）のいずれかに記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌。
（１０）（７）に記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌を有効成分とする抗腫瘍剤。
（１１）（７）又は（８）に記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌を有効成分とする抗腫瘍剤及び／又は腫瘍検出用マーカー。
（１２）（９）に記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌を有効成分とする経口ワクチン剤。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１２−１５８０４４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【0006】
図１は、実験に用いた融合タンパク質をコードする各発現カセットの構造を示す図である。図２は、構築した融合タンパク質のイムノブロッティングを示す図である。
図３ａは、各融合タンパク質によるＡ４３１細胞の増殖阻害を示す図である。
図３ｂは、各融合タンパク質によるＢｘＰＣ−３細胞の増殖阻害を示す図である。
図３ｃは、各融合タンパク質によるＨＴ−２９細胞の増殖阻害を示す図である。
図４ａは、Ａ４３１細胞とＥｃ−８Ｃ７ＥＧＦＰの結合を示す。左カラムはバッファのみを添加した陰性対照の結果を、右カラムはＥｃ−８Ｃ７ＥＧＦＰを添加した時の結果を、それぞれ示している。各カラムの上段は蛍光像、下段は同視野の明視野像である。
図４ｂは、ＨＴ−２９細胞とＥｃ−８Ｃ７ＥＧＦＰの結合を示す。左カラムはバッファのみを添加した陰性対照の結果を、右カラムはＥｃ−８Ｃ７ＥＧＦＰを添加した時の結果を、それぞれ示している。各カラムの上段は蛍光像、下段は同視野の明視野像である。
図４ｃは、Ａ４３１細胞におけるＥＧＦＲインターナリゼーションの経時的結果を示す。上段は蛍光像、下段は同視野の明視野像である。
図５は、Ｅｃ−８Ｃ７ＥＧＦＰと組換えヒトＥＧＦＲ細胞外ドメインとの結合親和性を示す図である。
図６は、ビフィズス菌と大腸菌のシャトルベクターｐＫＫＴ４２７の構造を示す図である。
図７は、ＭＲＳ選択寒天培地上に出現した８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを発現する組換えビフィズス菌のコロニー数を示す図である。腫瘍、血液及び脾臓は、いずれもヒト皮膚癌由来細胞Ａ４３１を皮下移植した担癌マウスから採取したサンプルである。また、各サンプルで白丸、黒丸、三角等は、同一個体由来であることを示す。各サンプルの横棒は、平均値を示す。
図８は、Ａ４３１細胞を皮下移植した担癌マウスに対し、８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを発現する組換えビフィズス菌を静脈内投与した時の該マウスにおける肝機能の変化を示す図である。（ｎ＝５）
図９は、Ａ４３１細胞担癌マウスにおいて組換えビフィズス菌より分泌された８Ｃ７ＥＧＦＰのＥＧＦＲインターナリゼーションを示す図である。
図１０は、Ａ４３１細胞を皮下移植した担癌マウスに対し、８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを発現する組換えビフィズス菌を静脈内投与した時の抗腫瘍効果を示す図である。
図１１は、ＢｘＰＣ−３細胞を皮下移植した担癌マウスに対し、８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを発現する組換えビフィズス菌を静脈内投与した時の抗腫瘍効果を示す図である。
図１２は、ヒト非小細胞肺がん由来細胞のＰＣ−９細胞を皮下移植した担癌マウスに、８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを発現する組換えビフィズス菌を静脈内投与した時の抗腫瘍効果を示す図である。
図１３は、８Ｃ７ ＥＧＦＰを発現する組換えビフィズス菌を経口投与したマウス（８Ｃ７ ＥＧＦＰ）及び陰性対照となるｐＫＫＴ４２７含有組換えビフィズス菌を経口投与したマウス（ｐＫＫＴ４２７）のそれぞれの糞中における抗ＥＧＦＰ抗体産生量を示す図である。
図１４は、ｃｏｌｏｎ２６細胞を皮下移植した担癌マウスに対し、８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを発現する組換えビフィズス菌を静脈内投与した時の血清中の抗８Ｃ７ ＥＧＦＰ抗体の誘導性を示す図である。ｎｌｇＧは、陰性対照のＮｏｒｍａｌ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧを示す。抗ＥＧＦＰ抗体は、陽性対照である。
【発明を実施するための形態】
【0007】
以下で本発明について具体的に説明をする。１．組換え偏性嫌気性グラム陽性菌
１−１．概要及び定義
本発明の第１の態様は、組換え偏性嫌気性グラム陽性菌（以下、しばしば「組換え細菌」と略称する）である。本発明の組換え細菌は、融合タンパク質をコードする核酸を発現可能な状態で含む薬剤送達用担体である。
「偏性嫌気性グラム陽性菌」とは、グラム陽性菌に分類される偏性嫌気性菌をいう。ここで、「偏性嫌気性菌」とは、絶対嫌気性菌とも呼ばれ、高酸素存在下では増殖できず、死滅する性質を有する細菌をいう。したがって、哺乳動物の体内においては、低酸素で嫌気状態の消化器官内、主として腸内では増殖可能であるが、溶存酸素の存在する血液等の体液中や通常の組織内では増殖することができない。「グラム陽性菌」とは、グラム染色により紫色又は紺色に染色される細菌の総称である。グラム陽性菌には、桿菌、球菌、らせん菌が知られるが、本明細書では特に限定はしない。グラム陽性菌は、内毒素（エンドトキシン）を含まないことから、死後も内毒素を放出しない。それ故、安全性の面で本発明の薬剤送達用担体として好ましい。本発明の組換え細菌としては、例えば、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（本明細書では、以下ビフィドバクテリウム属を総称して「ビフィズス菌」と呼ぶ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）が該当し得る。好ましくはビフィズス菌である。これは、ビフィズス菌が外毒素（エキソトキシン）を分泌せず、また乳酸菌として日常的に利用されており、人体等に対する安全性が確認されているからである。ビフィズス菌は、いずれの種であってもよいが、好ましくは人間の腸管内に生息する種類、具体的には、Ｂ．ビフィドゥム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）、Ｂ．ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、Ｂ．ブレイブ（Ｂ．ｂｒａｖｅ）、Ｂ．インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）及びＢ．アドレセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）である。
１−２．構成
本発明の偏性嫌気性グラム陽性菌は、融合タンパク質をコードする核酸（以下、しばしば「融合遺伝子」とする）を発現可能な状態で含む。以下、本発明の組換え細菌を特徴付ける融合遺伝子及びそれを発現可能な状態にする発現カセットの構成について具体的に説明をする。
１−２−１．融合遺伝子の構成
本明細書において「融合タンパク質をコードする核酸（融合遺伝子）」とは、遺伝子組み換え技術によって複数の遺伝子等を融合して構築された、融合タンパク質をコードする外来性核酸をいう。融合遺伝子は、後述する発現カセット内に挿入された状態で本発明の組換え細菌内に導入されている。
本明細書において「融合タンパク質」とは、シグナルペプチド、単鎖抗体及び機能性ペプチドを含み、それらを連結した細胞外分泌性タンパク質である。シグナルペプチド、単鎖抗体及び機能性ペプチドは、直接連結されていてもよいし、リンカーペプチドを介して間接的に連結されていてもよい。リンカーペプチドの長さやアミノ酸配列は、単鎖抗体及び機能性ペプチドのそれぞれの機能を阻害しなければ、特に限定はしない。例えば、２０アミノ酸以下、又は１５アミノ酸以下で自己フォールディングしないアミノ酸配列等が好適である。以下、融合タンパク質を構成するシグナルペプチド、単鎖抗体及び機能性ペプチドについて、具体的に説明をする。
（１）シグナルペプチド
シグナルペプチドは、細胞内で生合成されたタンパク質の細胞外移行に必要なペプチドである。通常、Ｎ末端側にＬｙｓやＡｒｇのような正電荷を有するアミノ酸を配し、それに続いてＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、及びＰｈｅのような疎水性の高いアミノ酸配列を配する。また、シグナルペプチドのＣ末端側には、シグナルペプチドの切断と分泌を促進するシグナル配列後挿入配列及び／又は融合タンパク質からシグナルペプチドを切断するシグナルペプチダーゼ認識部位を含むアミノ酸配列を有していてもよい。シグナルペプチドは、本発明の細菌内で発現された前記融合タンパク質を、膜に存在するトランスロケーター等を介して細胞外に分泌する機能を担う。シグナルペプチドのアミノ酸配列は、特に限定はしない。偏性嫌気性グラム陽性菌内で機能し得る公知のあらゆるシグナル配列のアミノ酸配列を利用することができる。また、シグナルペプチドのアミノ酸長も、特に限定はしない。通常は、３アミノ酸〜６０アミノ酸の範囲内にあればよい。ただし、融合タンパク質の分子量が大きくなりすぎないようにするためアミノ酸長の短いシグナルペプチドが好ましい。
シグナルペプチドは、融合タンパク質のＮ末端側に配置する。
（２）単鎖抗体
前記融合タンパク質には、単鎖抗体が含まれる。本明細書において「単鎖抗体」とは、一本鎖ポリペプチドで構成され、かつ単体で標的物質を認識し、結合することのできる抗体をいう。二本鎖以上で構成される抗体は、分子量的に大き過ぎるため偏性嫌気性グラム陽性菌内では発現しない可能性や、抗体機能を有する適切な立体構造が構築されないが高いためである。したがって、本発明の単鎖抗体は、１つあたりの分子量が３５ｋＤａ以下の低分子抗体であることが好ましい。天然抗体及び人工抗体は、問わない。
本明細書で「天然抗体」とは、いずれかの脊椎動物が産生する抗体と同一のアミノ酸配列を有する抗体をいう。天然抗体の単鎖抗体の具体例としては、例えば、ラクダ科の動物が産生する一本鎖抗体が挙げられる（Ｚｈａｎｇ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：４４６−４４８）（以下、本明細書では「ラクダ科一本鎖抗体」とする）。ラクダ科一本鎖抗体は、Ｌ鎖がなくＨ鎖のみで構成される抗体であり、Ｈ鎖のＶＨ領域のみで抗原と結合できるため、分子量は、約１４ｋＤａと、通常の抗体の１０分の１程度しかない。また、一般に抗原親和性が高く、熱、酸及び塩基に対する耐性が高いという性質がある（Ｄｅｆｆａｒ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，２００９，Ａｆｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８（１２）：２６４５−２６５２）。それ故、本発明における単鎖抗体として非常に好適である。ラクダ科の動物種は、ラクダ科一本鎖抗体を産生できれば、その種類は問わない。例えば、ラマ、アルパカ、ラクダ等のいずれの動物種由来の抗体も利用することができる。
本明細書で「人工抗体」とは、人工的に構築された抗体である。例えば、前記天然抗体のアミノ酸配列に適当な変異を導入した単鎖抗体の他、天然界には原則存在しない構造上の改変を行った単鎖抗体が挙げられる。後者の人工抗体の単鎖抗体の具体例としては、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ：ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）が挙げられる。一本鎖Ｆｖは、免疫グロブリン分子において、Ｌ鎖とＨ鎖に位置する可変領域（すなわち、それぞれＶＬ及びＶＨ）を十分な長さの柔軟性リンカーによって連結し、１本のポリペプチド鎖に包含した構造を有する、分子量約３５ｋＤａ以下の合成抗体である。一本鎖Ｆｖ内において両可変領域は、互いに自己集合して１つの機能的な抗原結合部位を形成することができる。
前記融合タンパク質において、単鎖抗体は二以上含まれていてもよい。ただし、抗体数が多くなると融合タンパク質の分子量が大きくなるため、単鎖抗体は、数個、例えば２〜４個、２〜３個又は２個が好ましい。個々の単鎖抗体は、適当なリンカーペプチドで連結されていることが望ましい。リンカーペプチドの長さやアミノ酸配列は、それぞれの単鎖抗体の抗原結合活性を阻害しなければ、特に限定はしない。例えば、前述した単鎖抗体と外毒素を連結するリンカーペプチドと同一であってもよい。単鎖抗体を二以上含む場合、個々の単鎖抗体は、異なる抗原エピトープを認識してもよい。抗原である同一標的物質の異なるエピトープを認識する二以上単鎖抗体を含む融合タンパク質は、抗原親和性をより高めることができる。
単鎖抗体の標的物質は、特に限定しないが、好ましくは細胞である。したがって、単鎖抗体は、標的細胞の表面抗原を認識し、結合するものが好ましい。前述のように本発明の組換え細菌は、嫌気性環境下でのみ増殖可能であることから、生体内において嫌気的環境下となる細胞が標的細胞として好適である。具体的には、腫瘍細胞又は腸管上皮細胞が挙げられる。
単鎖抗体は、融合タンパク質において、シグナルペプチドのＣ末端側であれば、後述する機能性ペプチドとの順序は特に制限はしないが、機能性ペプチドのＮ末端側に配置することが好ましい。
（３）機能性ペプチド
前記融合タンパク質には、機能性ペプチドが含まれる。本明細書において「機能性ペプチド」とは、生体内又は細胞内において、特定の生物活性、例えば、酵素活性、触媒活性、基質としての機能、又は生物学的阻害若しくは亢進機能（例えば、細胞傷害活性、）を有するペプチドをいう。具体的には、例えば、外毒素、蛍光タンパク質、又は発光タンパク質、酵素、抗原ペプチド、が挙げられる。
機能性ペプチドの由来する生物種は問わない。また、機能性ペプチドは、天然型又は非天然型のいずれであってもよい。天然型の機能性ポリペプチドとは、天然界に存在するペプチドをいう。一方、非天然型の機能性ポリペプチドとは、天然型の機能性ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、その機能性ペプチドが有する特有の機能を失わない範囲においてアミノ酸配列に適当な変異（アミノ酸の付加、欠失、置換を行ったもの）を導入した改変ペプチドをいう。
前記融合タンパク質において、機能性ペプチドは二以上含まれていてもよい。ただし、複数の機能性ペプチドを含む場合、融合タンパク質全体の分子量が大きくなり過ぎることから、機能性ペプチドの総分子量は、８０ｋＤａ以下、好ましくは４０ｋＤａ以下とするのがよい。二以上の機能性ペプチドを包含する場合、それぞれの機能性ペプチドは、同一の又は異なる種類とすることができる。例えば、外毒素と酵素、又は外毒素と蛍光タンパク質又は発光タンパク質を組み合わせた機能性ペプチドが挙げられる。二以上の機能性ペプチドを包含する場合、個々の機能性ペプチドは、直接連結されていてもよいが、それぞれの機能性ペプチドが独自の機能を効率的に発揮し得るように適当なリンカーペプチドで連結されていることが好ましい。リンカーペプチドの長さやアミノ酸配列は、機能性ペプチドの機能を阻害しなければ、特に限定はしない。二以上の異なる機能性ペプチドを１つの融合タンパク質に包含させることによって、単鎖抗体が認識する標的物質に対して異なる機能を付与することが可能となる。
機能性ペプチドは、融合タンパク質において、シグナルペプチドのＣ末端側であれば、特に制限はしないが、前記単鎖抗体のＣ末端側に配置することが好ましい。
以下、本発明の組換え細菌において、機能性ペプチドとして働き得る、上述の外毒素、酵素、蛍光タンパク質又は発光タンパク質、抗原ペプチドについて具体的に説明をする。
（ｉ）外毒素
「外毒素」（エキソトキシン）とは、細菌が菌体外に分泌する毒性タンパク質である。外毒素は、細胞傷害活性を有し、かつその塩基配列が既知であれば種類は問わない。例えば、緑膿菌毒素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｘｉｎ；ＰＴ）及びその派生物、例えば、ＰＴから細胞接着ドメインを除去した外毒素Ａ（配列番号９）、ジフテリア毒素（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ：ＤＴ）及びその派生物、並びにリシン（Ｒｉｃｉｎ）及びその派生物が挙げられる（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｕ．＆ Ｐａｓｔａｎ Ｉ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１９８（１）：２７−４５）。緑膿菌外毒素Ａは、癌細胞内へ取り込まれた後、ＥＦ−２をＡＤＰリボシル化して不活性化することでタンパク質合成を阻害し、強い殺細胞効果を発揮することが知られている。前記単鎖抗体に外毒素が連結された融合タンパク質は、イムノトキシン（免疫毒素）として機能し得る。
（ｉｉ）酵素
機能性ペプチドとしての酵素の種類は、塩基配列が既知であれば特に問わない。標的物質に対して直接作用する酵素であってもよいし、標的物質に対して直接作用はせず、その周辺で機能する酵素であってもよい。後者の具体的な例としては、発光に寄与するルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）等が挙げられる。前記単鎖抗体に酵素が連結された融合タンパク質は、イムノエンザイム（免疫酵素）として機能し得る。
（ｉｉｉ）蛍光タンパク質又は発光タンパク質（標識タンパク質）
機能性ペプチドとしての蛍光タンパク質の種類は、塩基配列が既知であれば特に問わない。上記天然型及び非天然型のいずれであってもよい。ただし、上記理由からアミノ酸長の短いものが好ましい。また、励起波長、蛍光波長も特に限定はしない。これらの波長は、状況及び必要に応じて適宜選択すればよい。具体的な蛍光タンパク質としては、例えば、ＣＦＰ、ＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＹＦＰ、ＰＥ、ＰｅｒＣＰ、ＡＰＣ、ＧＦＰ等が挙げられる。
また、発光タンパク質についても、塩基配列が既知であればその種類は、特に問わない。上記蛍光タンパク質と同様に、天然型及び非天然型のいずれであってもよいが、アミノ酸長の短いものが好ましい。具体的な発光タンパク質としては、例えば、イクオリン、等が挙げられる。
（ｉｖ）抗原ペプチド
本明細書において「抗原ペプチド」とは、一以上のエピトープ（抗原決定基）を包含し、当該ペプチドを投与した個体に対して、免疫応答を誘導可能なペプチドをいう。抗原ペプチドは、前記免疫応答の誘導活性を有していれば、すなわち抗原エピトープを一以上含んでいれば、その種類は問わない。例えば、ウイルス（インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス−１型、エイズウイルス、西ナイル熱ウイルス、パピローマウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス）由来のペプチド、ＨＥＲ２タンパク質、マラリア原虫、トリパノソーマ原虫、チフス菌由来のペプチド等が挙げられる。ただし、融合タンパク質中の単鎖抗体が認識する抗原ではないことを前提とする。また、抗原ペプチドのアミノ酸の長さも一以上のエピトープを含んでいれば、特に限定はしない。ただし、前述のように機能性ペプチドの総分子量がある程度制限されることから、上限は８００アミノ酸以下、好ましくは４００アミノ酸以下である。また、下限は、１エピトープを含み得る最小のアミノ酸長、例えば、７アミノ酸以上、好ましくは８アミノ酸以上、より好ましくは９アミノ酸以上である。前記単鎖抗体に抗原ペプチドが連結された融合タンパク質は、イムノアンチゲン（免疫抗原；抗体と抗原の融合ペプチド）として機能し得る。
１−２−２．発現カセットの構成
本明細書において「発現カセット」とは、前記融合遺伝子を含み、それを融合タンパク質として発現可能な状態にすることのできる発現システムをいう。本明細書において、「発現可能な状態」とは、当該発現カセットに含まれる融合遺伝子が組換え細菌内で発現可能なように、遺伝子発現に必要なエレメントの制御下に配置されている状態をいう。遺伝子発現に必要なエレメントには、プロモーター及びターミネーターが挙げられる。
プロモーターは、組換え細菌内で作動可能なプロモーターであれば、特に制限はしないが、使用する偏性嫌気性グラム陽性菌由来のプロモーターが好ましい。例えば、偏性嫌気性グラム陽性菌にビフィズス菌のＢ．ロンガムを使用する場合には、Ｂ．ロンガムのｈｕｐ遺伝子プロモーター（配列番号４）が挙げられる。また、プロモーターには、その発現制御の性質により過剰発現型プロモーター、構成的プロモーター、部位特異的プロモーター、段階特異的プロモーター、又は誘導性プロモーター等が知られている。本発明における発現カセットに使用するプロモーターがいずれのプロモーターであるかは、特に限定はしない。必要に応じて適宜選択すればよい。好ましくは、過剰発現型プロモーター又は構成的プロモーターである。前記発現カセットにおいて、プロモーターは、前記融合遺伝子の開始コドンよりも上流の５’側に配置される。
ターミネーターは、組換え細菌内で、前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であれば特に限定はしない。例えば、ヒストン様タンパク質ターミネーター（ＨＵＴ）（配列番号１０）が挙げられる。好ましくはプロモーターと同一生物種由来のターミネーターであり、より好ましくはプロモーターが由来する生物種のゲノム上で、そのプロモーターと組となっているターミネーターである。前記発現カセットにおいて、ターミネーターは、前記融合遺伝子の終止コドンよりも下流の３’側に配置される。
前記融合タンパク質を組換え細菌内で安定的に発現させるため、発現カセットを包含するベクターを発現ベクターとして同菌体内に導入することができる。又は、相同性組換えを介して同菌のゲノム内に挿入してもよい。発現ベクターを使用する場合、ベクターには、プラスミド等を使用することができる。ベクターは、本発明の組換え細菌内で複製可能であり、また菌体内で安定的に保持される適当な選抜マーカー遺伝子を含むものを用いる。ベクターは、大腸菌等の他の細菌内でも複製可能なシャトルベクターであってもよい。例えば、ｐＫＫＴ４２７、ｐＢＥＳＡＦ２、ｐＰＳＡＢ１等が挙げられる。組換え細菌のゲノム内に挿入する場合、融合遺伝子のみを組換え細菌のゲノム中に発現可能な状態となるように挿入してもよい。すなわち、組換え細菌の内在性のプロモーターやターミネーターの制御下に融合遺伝子を挿入してもよい。
発現カセットは、１つの発現カセット内に１つの融合遺伝子を含むモノシストロニックであってもよいし、二以上の融合遺伝子を含むポリシストロニックであってもよい。
１−３．組換え偏性嫌気性グラム陽性菌の製造方法
本発明の組換え細菌は、当該分野で公知の分子遺伝学的方法を用いて製造することができる。例えば、前記融合遺伝子であれば、シグナルペプチド、単鎖抗体及び外毒素をそれぞれコードする核酸を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＰｒｅｓｓやＡｕｓｕｂｅｌｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ａ ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓに記載の手法を用いて構築すればよい。
上記単鎖抗体は、任意の標的物質を抗原とすることができる。ただし、その場合、標的物質を特異的に認識し、結合する抗体をコードする遺伝子の塩基配列情報が必要となる。この抗体の塩基配列情報は、標的物質に対する抗体の塩基配列が公知であれば、その配列情報を利用することができる。
標的物質に対する抗体が未知の場合には、その標的物質に対するモノクローナル抗体の作製は、当該分野で公知の方法に従って行えばよい。以下に、その作製例を示す。
標的とする腫瘍細胞等を免疫原としてラクダ科の動物に投与して免疫する。必要であれば、免疫を効果的に行うためにアジュバントを添加してもよい。アジュバントの例としては、市販の完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）等が挙げられ、これらを単独で又は混合して用いることができる。免疫原溶液の１回の投与量は、前記動物１匹当たり約５０〜２００μｇの免疫原を含んでいればよい。免疫の間隔は，特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは１〜４週間間隔で、２〜１０回、好ましくは５〜７回追加免疫を行う。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法等により繰り返し行う。続いて、免疫された動物から抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、末梢血細胞が好ましい。次に、末梢血細胞からＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴプライマー及びランダム６ｍｅｒプライマーを用いてｃＤＮＡを合成する。このｃＤＮＡから、ラクダ科一本鎖抗体の可変領域（ＶＨＨ領域）の遺伝子をＰＣＲにより増幅し、ｐＣＡＮＴＡＢ６などのファージミドベクターに上記遺伝子を組み込み、エレクトロポレーション法で大腸菌ＴＧ１に導入する。上記の大腸菌ＴＧ１にＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを感染させ、ファージを回収することにより、ラクダ科一本鎖抗体可変領域（ＶＨＨ領域）発現ファージライブラリーを取得する。標準的には１×１０７ｐｆｕ種以上のライブラリーとなる。
標的抗原に対する抗体を発現するファージを選別するにはバイオパニングを行う。これは、固定化した標的抗原に抗体ファージライブラリーを反応させ、結合しなかったファージを洗浄により除去した後に、結合したファージを溶出し大腸菌に感染させて増殖させるという操作を３回から５回行うことで標的抗原に特異的なファージを濃縮する方法である。パニングしたファージを大腸菌ＴＧ１に再感染させた後、ＶＨＨ挿入ｐＣＡＮＴＡＢファージミドベクターを含むＴＧ１クローンを単離し、個々のＴＧ１クローンにＫ０７ヘルパーファージを感染させて、ＶＨＨ抗体を提示したクローン化ファージを得る。これらの中から抗原に反応するクローンを選択する。取得したファージから抗体の塩基配列を得ることができる。
融合遺伝子は、発現可能なように上記発現カセット内に分子遺伝学的方法を用いて挿入される。発現カセットは、必要に応じて、例えば、プラスミド等のベクターに組み込む。ベクターに発現カセットを組み込むには、発現カセットの５’末端及び３’末端を適当な制限酵素で切断し、ベクター内のマルチクローニングサイト等の対応する制限部位に挿入する方法等を採用することができる。また、ベクターが本発明の組換え細菌内で発現可能な発現用ベクターである場合、前記融合遺伝子をその発現用ベクターの発現制御領域内（ベクター内のプロモーター及びターミネーター間のマルチクローニング部位等）に挿入することで、発現カセットを構築すると同時に目的の発現ベクターを構築することも可能である。これらの具体的な方法については、例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）に記載の方法を参照すればよい。
目的の組換え細菌は、前記発現ベクター、発現カセット又は融合遺伝子を薬剤送達用担体である偏性嫌気性グラム陽性菌に導入することによって製造できる。発現ベクター等を目的の偏性嫌気性グラム陽性菌内へ導入する方法は、当該分野で公知の分子生物学的方法を用いればよい。例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）やリン酸カルシウム法の公知の方法を用いることができる。これらの具体的な方法については、例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（２００１）に記載の方法を参照すればよい。
２．抗腫瘍剤
２−１．概要
本発明の第２の態様は、抗腫瘍剤である。本発明において「抗腫瘍剤」とは、腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を有し、該細胞をアポトーシスに至らしめ、その結果、腫瘍細胞の増殖を抑制することのできる薬剤をいう。ただし、その薬効は、腫瘍細胞の増殖を抑制できればよく、腫瘍細胞を根絶させずともよい。
本発明の抗腫瘍剤は、第１態様の組換え細菌を有効成分とすることを特徴とする。本発明の抗腫瘍剤によれば、有効成分である組換え細菌が腫瘍内でのみ増殖し、腫瘍内でイムノトキシンを分泌することによって、効率的に腫瘍の増殖を抑制し、腫瘍を退縮させることができる。
２−２．構成
本発明の抗腫瘍剤は、前述のように第１態様の組換え細菌を有効成分とする。この場合の組換え細菌は、融合遺伝子が標的細胞である腫瘍細胞の表面抗原を認識して、結合する単鎖抗体をコードし、また、機能性ペプチドが外毒素をコードしている。したがって、本発明の抗腫瘍剤の有効成分である組換え細菌は、細胞外分泌性抗腫瘍細胞イムノトキシンを分泌することとなる。
一般に腫瘍細胞は、その細胞表面に癌細胞表面抗原を発現している。例えば、癌胎児性抗原、メソテリンが挙げられる。融合遺伝子にコードされる単鎖抗体は、このような表面抗原を認識し、結合するものが好ましい。あるいは、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）のような細胞の増殖等を制御する受容体が機能亢進によって癌化（例示したＥＧＦＲの場合であれば、非小細胞肺癌、前立腺癌等）した場合には、その癌化の原因となった受容体等（前述の例示ではＥＧＦＲ）の細胞外ドメインを認識し、結合する単鎖抗体であってもよい。このように、有効成分である組換え細菌は、細胞外分泌性イムノトキシンをコードする融合遺伝子において、単鎖抗体部分の塩基配列を交換することで、あらゆる腫瘍抗原に対応することが可能となる。本発明の抗腫瘍剤の標的となる腫瘍は、腫瘍を形成するものであれば、良性、悪性を問わず、いずれの腫瘍であってもよい。例えば、脳腫瘍、甲状腺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、大腸癌、咽頭癌、肺癌、肝臓癌、腎癌、副腎癌、膵臓癌、胆道癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、線維肉腫、肥満細胞腫又はメラノーマが標的腫瘍として挙げられる。
本発明の組換え細菌が融合遺伝子を発現した場合、その産物である細胞外分泌性抗腫瘍細胞イムノトキシンは、細胞外に分泌される。分泌されたそのイムノトキシンは、単鎖抗体部分で標的物質である腫瘍細胞に結合し、その細胞は外毒素部分の細胞傷害活性によりアポトーシスが誘導される。
本発明の有効成分である組換え細菌は、抗腫瘍剤において生菌状態で含まれる。本発明の第１態様に記載の組換え細菌は、高濃度の酸素存在下では増殖できず、やがて死滅する。したがって、生体内においては、酸素分圧の低い部位でのみ増殖、生存が可能である。そのような部位の代表的な例として、進行癌に見られる腫瘍（固形癌）の中心部位又は腸管内が挙げられる。それ故、本発明の抗腫瘍剤は、注射等により体内投与した場合、腫瘍選択的送達性の高い抗腫瘍剤となり得る。
また、本発明の抗腫瘍剤は、有効成分である組換え細菌の生存、増殖、イムノトキシンの発現及び分泌を阻害又は抑制しない範囲において、他の抗腫瘍剤と併用することができる。
本発明の抗腫瘍剤は、組換え細菌を生菌状態で維持又は保存することを前提として、原則として当該分野で公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）に記載の方法を用いればよい。具体的な製剤化の方法は、投与方法によって異なる。投与方法は、経口投与と非経口投与に大別されるが、本発明の抗腫瘍剤の場合、非経口投与がより好ましい。
本発明の抗腫瘍剤を非経口投与する場合、その具体例としては、注射による投与が挙げられる。本発明の抗腫瘍剤を注射で投与する場合、組換え細菌を製薬上許容可能な溶媒と混合し、必要に応じて製薬上許容可能な担体を加えた懸濁液剤として調製することができる。
「製薬上許容可能な溶媒」は、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る水溶液、又は油性液のいずれであってもよい。水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液が挙げられる。補助剤としては、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム、その他にも低濃度の非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−６０）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。油性液としては、ゴマ油、大豆油が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用することもできる。また、緩衝剤、例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えば、ベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。
注射剤には、製薬上許容される賦形剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ｐＨ調節剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化すればよい。
注射は、例えば、血管内注射、リンパ管内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等が挙げられるが、本発明の抗腫瘍剤の有効成分である組換え細菌が腫瘍内で増殖して、その腫瘍細胞の増殖を抑制するという機序から、腫瘍巣の位置が明確でない場合には、全身投与である血管内注射又はリンパ管内注射等の循環器内投与が好ましい。血管内注射には、静脈内注射及び動脈内注射等があるが、本発明の抗腫瘍剤を投与する場合いずれであってもよい。一方、腫瘍巣の位置が確定している場合には、前記全身投与の他、腫瘍へ直接的に投与する局所投与であってもよい。
本発明の抗腫瘍剤を経口投与する場合については、後述する経口ワクチン剤の項に記載の方法に準じればよいことから、ここではその説明を省略する。
本発明の抗腫瘍剤における組換え細菌の含有量は、原則１回の投与でその菌体が標的の腫瘍に生存かつ増殖可能な状態で達し得る量で、かつそれを適用する被検体に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しない量であればよい。このような含有量は、抗腫瘍剤の標的細胞の種類、癌の進行度、腫瘍の大きさ、全身における腫瘍巣数、抗腫瘍剤の剤形及び投与方法によって異なるため、それぞれの条件を勘案し、適宜定められる。
本明細書の抗腫瘍剤の投与対象は、腫瘍を有する又は有する蓋然性の高い被検体である。本明細書で「被検体」とは、本発明の抗腫瘍剤を適用する動物いう。例えば、哺乳動物、好ましくはヒト、イヌ、ネコ、ウマ、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、サル等、より好ましくはヒトである。
２−３．効果
本発明の抗腫瘍剤によれば、有効成分である組換え細菌が酸素分圧の低い腫瘍内でのみ生存及び増殖し、抗腫瘍細胞イムノトキシンを分泌する。それ故、該イムノトキシンを腫瘍細胞にまで効率的に伝達し、かつ継続的に作用させることができる。また、イムノトキシンの作用により腫瘍細胞の増殖が抑制され、腫瘍が退縮することによって、組織中の酸素分圧が高まると、偏性嫌気性グラム陽性菌である組換え細菌は、生存不能となることから生体内から自動的に排除することができる。これにより、従来の細菌療法と比較して、固形がんに対して非病原性の偏性嫌気性菌で他の抗腫瘍薬を投与することなく、単独の静脈内への投与により抗腫瘍効果を発揮することのできる安全でかつ簡便な治療法を提供することができる。
また、本発明の抗腫瘍剤は、静脈内注射が可能であることから、被検体に与える侵襲性も低いという利点を有する。
３．腫瘍検出用マーカー
３−１．概要
本発明の第３の態様は、腫瘍検出用マーカーである。本発明において「腫瘍検出用マーカー」とは、生体内において腫瘍を検出することができるマーカーである。
本発明の腫瘍検出用マーカーは、第１態様の組換え細菌を有効成分とすることを特徴とする。本発明の腫瘍検出用マーカーによれば、有効成分である組換え細菌が腫瘍内でのみ増殖し、腫瘍内で酵素、蛍光タンパク質又は発光タンパク質を分泌することによって、生体内における腫瘍の位置や大きさをモニタリングすることができる。
３−２．構成
基本的な構成は、第２態様の抗腫瘍剤に準じる。そこで、ここでは主に前記抗腫瘍剤と異なる点について説明をし、重複する構成については原則省略する。
本発明の腫瘍検出用マーカーは、前述のように第１態様の組換え細菌を有効成分とする。この場合の組換え細菌は、融合遺伝子が標的細胞である腫瘍細胞の表面抗原を認識して、結合する単鎖抗体をコードし、機能性ペプチドが標識タンパク質又は標識化を誘導するタンパク質をコードしている。標識タンパク質としては、例えば、前述の蛍光タンパク質又は発光タンパク質が挙げられる。また、標識化を誘導するタンパク質としては、ルシフェリンやルミノールのような発光素又は蛍光素を基質とする酵素（ルシフェラーゼやペルオキシダーゼ）が挙げられる。したがって、本発明の腫瘍検出用マーカーの有効成分である組換え細菌は、細胞外分泌性抗腫瘍細胞イムノマーカー（免疫標識子）を分泌することとなる。
本発明の組換え細菌が融合遺伝子を発現した場合、その産物である細胞外分泌性抗腫瘍細胞イムノマーカーは、細胞外に分泌される。分泌されたイムノマーカーは、単鎖抗体部分で標的物質である腫瘍細胞に結合し、その細胞は標識化される。具体的には、機能性ペプチドが発光タンパク質又は蛍光タンパク質のような標識タンパク質であった場合、単鎖抗体部分と連結されたそれらの標識タンパク質によって腫瘍細胞が直接標識化されることとなる。一方、機能性ペプチドが酵素であった場合、鎖抗体部分と連結された酵素によって腫瘍細胞が酵素標識されることとなる。
本発明の腫瘍検出用マーカーは、第２態様の抗腫瘍剤と併用することができる。この場合、有効成分である組換え細菌が、腫瘍検出用マーカーと抗腫瘍剤をそれぞれ独立した分子として分泌する、すなわち同一標的物質を認識する単鎖抗体を含む異なる融合タンパク質を分泌する、同一の又は異なる組換え細菌であってもよいし、機能性タンパク質部分に外毒素と標識タンパク質又は酵素を含む１つの融合タンパク質を分泌する組換え細菌であってもよい。これらの場合、同一の腫瘍細胞を標識化すると同時に、外毒素の作用によって腫瘍細胞に細胞傷害を付与することが可能となる。
また、有効成分である組換え細菌の生存、増殖、イムノマーカーの発現、及び分泌を阻害又は抑制しない範囲において、他の抗腫瘍剤と併用することもできる。
３−３．検出
本発明の腫瘍検出用マーカーを被検体に投与した場合、その個体が腫瘍を有していれば、有効成分である組換え細菌がその腫瘍内で増殖し、抗腫瘍細胞イムノマーカーが分泌される。分泌されたイムノマーカーは、腫瘍細胞を標識化する。標識化された腫瘍細胞の検出は、イムノマーカーが発光タンパク質又は蛍光タンパク質のような標識タンパク質の場合には、その標識タンパク質自身の発する発光又は蛍光を、また酵素標識の場合には、生体内に投与されたルシフェリン等の基質の酵素反応による発光又は蛍光を、検出すればよい。イムノマーカーの検出方法は、特に限定はしない。腫瘍の多くは、生体内部に存在するため、開腹等の手術によって腫瘍を露出させた上でイムノマーカーを検出してもよいし、生体内の発光又は蛍光を体外から非侵襲的に検出してもよい。好ましくは体外から検出する方法である。イムノマーカー由来の発光又は蛍光を体外から検出する方法としては、限定はしないが、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏバイオイメージング法を用いることができる。例えば、Ｋａｔｚ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：５５２１−５５２５、Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，１：２８９−２９８，Ｋａｔｚ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．，１１３：１５１−１６０等に記載の方法を用いて検出することができる。市販のＩＶＩＳＩｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ）やそれに類似する装置により検出してもよい。
３−４．効果
本発明の腫瘍検出用マーカーによれば、生体内の腫瘍の位置及び大きさをイムノマーカーに基づいて生体外部からモニタリングすることができる。また、本発明の腫瘍検出用マーカーと第２態様の抗腫瘍剤とを併用することで、イムノトキシンにより腫瘍細胞の増殖を抑制させると共に、イムノマーカーにより生体内の腫瘍を生体外部から検出することによって、腫瘍の縮退や治癒効果を経時的にモニタリングすることが可能となる。
４．経口ワクチン剤
４−１．概要
本発明の第４の態様は、経口ワクチン剤である。本発明において「経口ワクチン剤」とは、経口投与することによって、その投与個体の腸管免疫応答を誘導することのできるワクチン剤をいう。
本発明の経口ワクチン剤は、第１態様の組換え細菌を有効成分とすることを特徴とする。本発明の経口ワクチン剤によれば、有効成分である組換え細菌が消化器官内、特に腸内で増殖し、細胞外分泌性抗原ペプチド（イムノアンチゲン）を分泌することによって、腸管粘膜を介して投与個体に抗原ペプチドに対する免疫応答を誘導させることができる。
４−２．構成
基本的な構成は、第２態様の抗腫瘍剤に準じる。そこで、ここでは主に前記抗腫瘍剤と異なる点について説明をし、重複する構成については原則省略する。
本発明の経口ワクチン剤は、第２態様の抗腫瘍剤と同様に第１態様の組換え細菌を有効成分とする。ただし、第２態様の抗腫瘍剤と異なり、この場合の組換え細菌は、融合遺伝子がコードする単鎖抗体が腸管上皮細胞等の表面抗原、又は杯細胞から分泌されるムチン等を認識して結合する点、及び機能性ペプチドが抗原ペプチドをコードしている点において異なる。前記腸管上皮細胞は、Ｍ細胞、Ｐａｎｅｔｈ細胞、杯細胞、吸収上皮細胞、腸管内分泌細胞のいずれであってもよい。好ましくは、濾胞被覆上皮（ＦＡＥ；ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）に存在するＭ細胞である。抗原ペプチドは、第１態様に記載のように１つ以上のエピトープを有し、かつ投与する個体に免疫応答誘導すべき種々のペプチドである。
本発明の組換え細菌が消化器官内で融合遺伝子を発現した場合、その産物であるイムノアンチゲンが、腸管上皮細胞又は腸粘膜に結合し、腸管免疫応答を誘導することができる。
本発明の経口ワクチン剤は、経口投与によって投与個体に対して免疫応答を誘導することを特徴とする。したがって、本発明の経口ワクチン剤は、経口投与剤である。
本発明の経口ワクチン剤は、有効成分である組換え細菌に加えて、製薬上許容可能な担体を添加してもよい。
「製薬上許容可能な担体」とは、薬剤の製剤化や生体への適用を容易にし、また有効成分である組換え細菌の生存を維持するために、その菌体の作用を阻害又は抑制しない範囲で添加される物質をいう。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤又は潤滑沢剤が挙げられる。
「賦形剤」としては、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖（具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム）、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プルロニック、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。
「結合剤」としては、例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。
「崩壊剤」としては、例えば、前記デンプンや、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム又はそれらの塩が挙げられる。
「充填剤」としては、例えば、前記糖及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム）が挙げられる。
「乳化剤」としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが挙げられる。
「流動添加調節剤」及び「滑沢剤」としては、例えば、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが挙げられる。
その他、必要に応じて、矯味矯臭剤、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、増量剤、付湿剤、保湿剤（例えば、グリセリン、澱粉等）、吸着剤（例えば、澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等）、崩壊抑制剤（例えば、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等）、コーティング剤、着色剤、保存剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤等を含むこともできる。上記のような担体を、一又は二以上、必要に応じて適宜使用すればよい。
経口ワクチン剤の剤形としては、例えば、固形剤（錠剤、丸剤、舌下剤、カプセル剤、ドロップ剤を含む）、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤等を挙げることができる。さらに固形剤は、必要に応じ、当該分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠とすることができる。剤形の具体的な形状、大きさについては、いずれもそれぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。
４−３．効果
本発明の経口ワクチン剤によれば、従来注射等により生体に投与していたワクチン剤を非侵襲的に経口で投与することができる。
本発明の経口ワクチン剤によれば、有効成分である組換え細菌が腸管内で持続的に生存及び増殖可能なことから、ワクチンとしてのイムノアンチゲンを継続的に投与個体に付与することが可能となる。
【実施例】
【0008】
＜実施例１：発現カセットの構築＞以下で偏性嫌気性グラム陽性菌として本実施例において使用するビフィズス菌導入用発現カセットの構造及びその構築方法について説明する。
（１）抗ＥＧＦＲ抗体／緑膿菌外毒素Ａ融合タンパク質発現カセット（以下、「８Ｃ７ ｔｏｘｉｎ」とする）（図１ａ；配列番号１／アミノ酸配列：配列番号１６）
本発明の第１態様に記載の構造を有する融合遺伝子を包含する融合タンパク質発現カセットである。当該発現カセットは、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位、Ｂ．ロンガムｈｕｐ遺伝子由来のプロモーター領域（配列番号４）、Ｂ．ロンガム由来のｕｓｐ分泌シグナル配列（配列番号５）、ＤＴＹ（シグナル配列後挿入配列）、リンカーペプチド（ＧＧＳＧＧ）２コード配列（配列番号６）で連結した２つの抗ＥＧＦＲラマ一本鎖抗体コード配列（ＰＭＰ８Ｃ７；配列番号７及び８；特開２００８−５３４９３３，特表２００９−５１１０３２）、外毒素としての細胞接着に関与するドメインを除去した緑膿菌外毒素Ａコード配列（配列番号９；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｕ．，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１９８：２７−４５）、終止コドン、ＳｐｅＩ部位、ヒストン様タンパク質由来のターミネーター（ＨＵＴ）（配列番号１０）、そしてＮｏｔＩ切断部位の順に連結された融合遺伝子をデザインし、ＤＮＡ合成を行って作製した。その後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にクローニングし、ＤＮＡ配列を確認した。
（２）抗ＥＧＦＲ抗体／ＥＧＦＰ融合タンパク質発現カセット（以下、「８Ｃ７ ＥＧＦＰ」とする）（図１ｂ；配列番号２）
本発現カセットは、外毒素に代えて蛍光タンパク質ＥＧＦＰを連結した対照及び局在性検出用発現カセットである。当該発現カセットは、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位から２つの抗ＥＧＦＲアルパカ一本鎖抗体までは前記８Ｃ７ ｔｏｘｉｎと同じ構造を有し、それに続いて再びリンカーペプチド（ＧＧＳＧＧ）２コード配列、ＥＧＦＰ（Ｚｈａｎｇ Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２２７（３）：７０７−１１）、終止コドン、ＳｐｅＩ切断部位、ＨＵＴ、Ｈｉｓ−Ｔａｇ配列、そしてＮｏｔＩ切断部位の順に連結された遺伝子をデザインし、ＤＮＡ合成を行って作製した。その後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドにクローニングし、ＤＮＡ配列を確認した。
（３）緑膿菌外毒素Ａタンパク質発現カセット（以下、「Ｔｏｘｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ」とする）（図１ｃ；配列番号３）
本発現カセットは、単鎖抗体部分を含まない外毒素のみからなる対照用発現カセットである。当該発現カセットは、８Ｃ７ ｔｏｘｉｎからリンカーペプチドを含む２つの抗ＥＧＦＲラマ一本鎖抗体コード配列を除去し、細胞接着ドメインを除いた緑膿菌外毒素Ａコード配列（配列番号９）のＣ末にＨｉｓ−Ｔａｇ配列を付加した構造を有しており、ＤＮＡ合成を行って作製した。その後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドにクローニングし、ＤＮＡ配列を確認した。
＜実施例２：融合タンパク質８Ｃ７ ｔｏｘｉｎの細胞増殖阻害活性＞
本実施例では、実施例１に記載の８Ｃ７ ｔｏｘｉｎ等の融合タンパク質を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）の調製とその融合タンパク質の細胞増殖阻害活性について検証した。
（１）大腸菌発現用Ｅｃ−８Ｃ７ ｔｏｘｉｎ、Ｅｃ−Ｔｏｘｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ、及びＥｃ−８Ｃ７ ＥＧＦＰの発現ベクターの構築
大腸菌発現用Ｅｃ−８Ｃ７ ｔｏｘｉｎ発現カセットは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドに挿入された８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを鋳型として、配列番号１１及び１２のｐｒｉｍｅｒセットを用いてＰＣＲによる増幅を行った。ＰＣＲの条件はＤＮＡポリメラーゼとしてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ、大津市、日本）を用いて９５℃１分を１サイクル、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分を２５サイクルで実施した。増幅産物は、ＭｉｎＥｌｕｔｅカラム（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて添付のプロトコルに従って精製し、ＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで制限酵素消化後、１．２％アガロースで電気泳動を行い、ゲルから目的のバンド切り出してＤＮＡゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて添付のプロトコルに従って精製単離した。これをｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の対応する制限部位に挿入し、Ｓｔｒｅｐ Ｔａｇ（Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｔ．Ｇ．，Ｓｋｅｒｒａ Ａ．，２００７，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２（６）：１５２８−３５）、（ＧＧＳＧＧ）２リンカーペプチドで連結した２つのＰＭＰ８Ｃ７、細胞接着に関与するドメインを除去した緑膿菌外毒素Ａの配列、Ｈｉｓ Ｔａｇを持つＥｃ−８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを構築した（図１ｄ）。
大腸菌発現用Ｅｃ−８Ｃ７ ＥＧＦＰ発現カセットは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドに挿入された抗ＥＧＦＲ抗体／ＥＧＦＰ融合タンパク質発現カセットを鋳型として、配列番号１３及び１４のｐｒｉｍｅｒセットを用いてＰＣＲによる増幅を行った。ＰＣＲの条件は上記と同一とした。増幅産物は、ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムを用いて添付のプロトコルに従って精製し、ＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで制限酵素消化後、１．２％アガロースで電気泳動を行い、目的のバンドをゲルから切り出してＤＮＡゲル抽出キットを用いて添付のプロトコルに従って精製単離した。これをｐＥＴ−２２ｂ（＋）のＭＣＳの対応する制限部位に挿入し、Ｓｔｒｅｐ Ｔａｇ、（ＧＧＳＧＧ）２リンカーペプチドで連結した２つのＰＭＰ８Ｃ７、（ＧＧＳＧＧ）２リンカーペプチド、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、Ｈｉｓ Ｔａｇを持つＥｃ−８Ｃ７ ＥＧＦＰを構築した（図１ｅ）。
大腸菌発現用Ｅｃ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ発現カセットは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドに挿入されたＴｏｘｉｎ ｃｏｎｔｏｒｏｌ発現カセットを鋳型として、配列番号１５及び１２のｐｒｉｍｅｒセットを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。ＰＣＲの条件は上記と同一とした。増幅産物は、ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムを用いて添付のプロトコルに従って精製し、ＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで制限酵素消化後、１．５％アガロースで電気泳動を行い、目的のバンドをゲルから切り出してＤＮＡゲル抽出キットを用いて添付のプロトコルに従って精製単離した。これをｐＥＴ−２２ｂ（＋）のＭＣＳの対応する制限部位に挿入し、Ｓｔｒｅｐ Ｔａｇ、細胞接着に関与するドメインを除去した緑膿菌外毒素Ａの配列、Ｈｉｓ Ｔａｇを持つＥｃ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌを構築した（図１ｆ）。
（２）Ｅｃ−８Ｃ７ ｔｏｘｉｎ、Ｅｃ−Ｔｏｘｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ、及びＥｃ−８Ｃ７ ＥＧＦＰの発現及び精製
上記（１）で構築した各発現カセットを含むｐＥＴ−２２ｂ（＋）プラスミドＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（Ｎｏｖａｇｅ社）又はＢＬ２１ＳｔａｒＴＭ（ＤＥ３）Ｏｎｅ Ｓｈｏｔコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に添付のプロトコルに従って導入した。各形質転換体からの組換えタンパク質の発現は、以下の条件で行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体クローンを２ＹＴＡ培地（１００μｇ／ｍＬのａｍｐｉｃｉｌｌｉｎを含む２ＹＴ培地）で３７℃培養し、ＯＤ６００＝０．５〜０．６に達した時点でＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、タカラバイオ社）を終濃度１ｍＭ（ＢＬ２１（ＤＥ３）ＳｔａｒＴＭ株では０．５ｍＭ）となるように培地に加えて、３０℃で３時間培養した。集菌後、１００ｍＬ培養液当たり１０ｍＬの抽出バッファ（５０ｍＭ ＮａＰｈｏｓｐｈａｔｅ ｐＨ７．８，３００ｍＭ ＮａＣｌ，ＥＤＴＡ−Ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋａｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ社））に再縣濁して、氷中でＳｏｎｉｆｉｅｒ ２５０（Ｂｒａｎｓｏｎ社）を用いて、Ｏｕｔｐｕｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ ２、Ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ ５０％の条件で超音波処理を行い、菌体を破砕した。処理後の縣濁液を１５０００ｒｐｍで４℃にて１５分遠心して、上清を回収した。融合タンパク質の精製は、ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いた。超音波処理縣濁液の遠心上清をそのままＨｉｓＴｒａｐカラムにかけ、結合バッファ（２０ｍＭ ＮａＰｈｏｓｐｈａｔｅ，０．５Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｐＨ７．４）でカラムを洗浄した後、５００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含む溶出液で融合タンパク質を溶出させた。
精製の結果を全ての融合タンパク質のＣ末端に位置するＨｉｓタグに対する抗ＨｉｓＴａｇ抗体を用いたウエスタンブロットで検出し確認した。その結果、それぞれ予想される位置にバンドが検出された（データ示さず）。また、融合タンパク質が完全長であることを組換えタンパク質のＮ末端のＳｔｒｅｐ Ｔａｇに結合するストレプタクチンＨＲＰ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）を用いて、膜を洗浄後化学発光試薬ＬｕｍｉｎａｔａＴＭ Ｆｏｒｔｅを加えてＩｍａｇｅＱｕａｎｔＬＡＳ４０００（富士フィルム／ＧＥ）を使って検出した。結果を図２に示す。これらの結果から完全長のＥｃ−８Ｃ７ ｔｏｘｉｎ、Ｅｃ−８Ｃ７ ＥＧＦＰ、Ｅｃ−Ｔｏｘｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌを精製できたことが確認された。得られた融合タンパク質は、１０％グリセリンを添加して、４℃で保存した。
（３）Ｅｃ−８Ｃ７ ｔｏｘｉｎの細胞増殖阻害活性
ＥＧＦＲを過剰発現するＡ４３１細胞（ヒト皮膚癌由来細胞、理化学研究所バイオリソースセンター、つくば市、日本より入手）、ＥＧＦＲの発現量が少ないＢｘＰＣ−３細胞（ヒト膵臓癌由来細胞、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＵＳより入手）（Ｆｏｌｉａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ．２０１１，１３７；３１−４１）、及びＨＴ−２９細胞（ヒト結腸癌由来細胞、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＵＳＡより入手）に対する各融合タンパク質の増殖抑制作用を検討した。Ｆａｌｃｏｎ ９６ウエル培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社）に２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／５０μＬ培地（０．２％ウシ胎児血清（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｔｕｌａｒｅ、ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭ培地）／ｗｅｌｌで細胞を加え、３時間培養後、上記（２）で精製したＥｃ−８Ｃ７ｔｏｘｉｎ、Ｅｃ−８Ｃ７ＥＧＦＰ、Ｅｃ−Ｔｏｘｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌを４００、２００、１００、５０及び２５ｎｇ／ｍＬで含む培地を５０μＬずつ添加した。上記３種の細胞株は、０．２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で３日間培養する条件では、細胞は死なないものの、ほとんど増殖しない。Ｅｃ−８Ｃ７ｔｏｘｉｎ、Ｅｃ−８Ｃ７ＥＧＦＰ、Ｅｃ−Ｔｏｘｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌはＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＮＪ，ＵＳＡ）で精製したサンプルを使用したため、培地に添加時に混入するバッファ成分を考慮して、バッファコントロールを置いた。培養３日目に１０μＬのＭＴＴ試薬（ナカライテスク社）を加えた。さらに２時間培養後に１００μＬ／ｗｅｌｌで可溶化液を加え、ピペッティングで細胞を溶解してＯＤ５７０ｎｍの吸光度を測定した。細胞無添加培地のウエルの測定値をバックグランド値として全測定値から減じた。各希釈のバッファコントロールのウエルを１００％として、その相対値で示した。アッセイはデュブリケートで行い、２ウエルの平均値を取った。
結果を図３に示す。図３ａはＡ４３１細胞の、図３ｂはＢｘＰＣ−３細胞の、図３ｃはＨＴ−２９細胞の結果である。図３ａで示すように、Ｅｃ−８Ｃ７ ｔｏｘｉｎは、Ａ４３１細胞について濃度依存の増殖阻害活性が検出され、ＩＣ５０は０．６８ｎｍｏｌ／Ｌ（４７．５ｎｇ／ｍＬ）であった。一方、陰性対照であるＥｃ−Ｔｏｘｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌでは増殖阻害活性が検出されなかった。したがって、Ｅｃ−８Ｃ７ ｔｏｘｉｎの標的細胞特異的な細胞増殖阻害活性が立証された。この結果は、Ｅｃ−８Ｃ７ ｔｏｘｉｎが抗ＥＧＦＲ抗体部分でＥＧＦＲに結合し、ＥＧＦＲインターナリゼーション（ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ Ｊ．Ｌ．＆ Ｃｅｒｅｓａ Ｂ．Ｐ．，２０１０，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．５１（７）３４５５−３４６１）が生じて細胞内に取り込まれ、その後、外毒素部分が細胞質内にトランスロケーションし、ＥＦ−２をＡＤＰリボシル化して不活性化することによって、Ａ４３１細胞のタンパク質合成が阻害されたことを示唆している。また、陰性対照であるＥｃ−８Ｃ７ ＥＧＦＰで細胞増殖阻害活性が検出されなかったことは、Ｅｃ−８Ｃ７ ＥＧＦＰが抗ＥＧＦＲ抗体部分でＥＧＦＲに結合しても外毒素部分がないことでＥＧＦＲのシグナル伝達を阻害できず、細胞増殖に影響及ぼさないことが示唆された。一方、図３ｂに示すように、ＥＧＦＲの発現量が少ないＢｘＰＣ−３細胞に対してＥｃ−８Ｃ７ ｔｏｘｉｎは、弱い増殖阻害活性（２００ｎｇ／ｍＬの８Ｃ７ ｔｏｘｉｎで約４０％阻害活性）しか検出されず、また、図３ｃに示すように、ＨＴ−２９細胞に対するＥｃ−８Ｃ７ ｔｏｘｉｎの増殖阻害活性は検出されなかった。
＜実施例３：８Ｃ７ ＥＧＦＰの腫瘍細胞との結合及びＥＧＦＲ ＥＣＤとの解離定数の測定＞
本実施例では、実施例２に記載のＥｃ−８Ｃ７ ＥＧＦＰとＥＧＦＲを発現する生細胞との結合を検討した。
（１）Ｅｃ−８Ｃ７ ＥＧＦＰの腫瘍細胞との結合
ファルコン２４ウエルプレート（ベクトン・ディッキンソン社）に２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／０．５ｍＬ培地（０．２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地）／ｗｅｌｌでＥＧＦＲの過剰発現株Ａ４３１細胞及び低発現株ＨＴ−２９細胞をそれぞれ播き、翌日、実施例２で精製したＥｃ−８Ｃ７ ＥＧＦＰを１０μｇ／ｍＬ含有する０．２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に交換した。２時間培養後、前記培地を除去し、ＰＢＳ（Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋フリー・リン酸緩衝生理食塩水）で２回洗浄して、０．５ｍＬ／ｗｅｌｌでＰＢＳを加え、蛍光顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳ Ｔｉ、Ｎｉｋｏｎ）で観察した。ＨｉｓＴｒａｐカラムで精製したＥｃ−８Ｃ７ＥＧＦＰを使用したため、培地に添加時に混入するバッファ成分を考慮して、バッファコントロールを置いた。
結果を図４ａ、及び４ｂに示す。図４ａでは、Ａ４３１細胞の表面にＥｃ−８Ｃ７ＥＧＦＰの蛍光が検出され、Ｅｃ−８Ｃ７ ＥＧＦＰとＡ４３１細胞との結合が検出できた。また、一部の細胞ではＥＧＦＲのインターナリゼーションが確認された。一方、図４ｂのＨＴ−２９細胞では、Ｅｃ−８Ｃ７ＥＧＦＰの蛍光は検出されず、Ｅｃ−８Ｃ７ ＥＧＦＰがＨＴ−２９細胞と結合しないことが明らかとなった。
（２）Ｅｃ−８Ｃ７ ＥＧＦＰのＥＧＦＲインターナリゼーションの検出
Ａ４３１細胞を用いてＥＧＦＲインターナリゼーションを経時的に観察した。Ａ４３１細胞を１×１０６ ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ培地（１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地）／３５ｍｍφｄｉｓｈで３枚のｄｉｓｈに播き、１日培養後、１０μｇ／ｍＬのＥｃ−８Ｃ７ ＥＧＦＰを含む培地（１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地）に交換して、１枚は４℃で１時間、１枚は３７℃で２時間、もう１枚は３７℃で４時間インキュベートした。それぞれ、２ｍＬのＰＢＳ／ｄｉｓｈで２回洗浄して、蛍光顕微鏡で観察した。
結果を図４Ｃに示す。３７℃の条件下では、大半の細胞でＥＧＦＲインターナリゼーションを観察することができた。
（３）Ｅｃ−８Ｃ７ ＥＧＦＰとＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ；ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）との解離定数（ＫＤ）の測定
Ｅｃ−８Ｃ７ ＥＧＦＰと組換えヒトＥＧＦＲ ＥＣＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）との結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いた表面プラズモン共鳴法にて解析した。測定手法はシングルサイクルカイネティクス法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌｕｍｅ ３４９，Ｉｓｓｕｅ １，１ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００６，Ｐａｇｅｓ １３６−１４７）で行い、Ｅｃ−８Ｃ７ ＥＧＦＰを１．５６ｎＭ（１回目）、３．１３ｎＭ（２回目）、６．２５ｎＭ（３回目）、１２．５ｎＭ（４回目）、２５ｎＭ（５回目）の順で連続添加して測定した。
結果を図５に示す。Ｅｃ−８Ｃ７ ＥＧＦＰと組換えヒトＥＧＦＲ ＥＣＤのＫＤ値は１１ｎｍであった。
＜実施例４：組換えビフィズス菌の腫瘍蓄積性とマウスへの影響＞
ヌードマウス背部にＡ４３１細胞を移植して固形がんを形成させたＸｅｎｏｇｒａｆｔｍｏｄｅｌにおいて、８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを発現し、分泌する組換えビフィズス菌を静脈内に投与したときの、その組換えビフィズス菌の腫瘍蓄積性とマウスへの影響を検証した。
（１）８Ｃ７ ｔｏｘｉｎの発現用ベクター及び８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを発現する組換えビフィズス菌の構築
ベクターは、ｐＴＢ６（Ｔａｎａｋａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．６９（２）：４２２−４２５）のレプリコンを含むビフィズス菌と大腸菌とのシャトルベクターｐＫＫＴ４２７（図６；Ｙａｓｕｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３７（１）：ｅ３）を使用した。ｐＫＫＴ４２７のＭＣＳ（マルチクローニングサイト）におけるＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩの間に、ビフィズス菌用発現カセット（図１ａ）を挿入した。構築した発現ベクターをビフィズス菌Ｂ．ロンガム１０５−Ａ（元京都薬科大学・加納康正教授より供与）にエレクトロポレーション法を用いて導入した。エレクトロポレーションの条件は、２．４ｋＶ／ｃｍ、２５μＦ、２００Ωの条件で行った。得られた組換えビフィズス菌を生理食塩水に再懸濁してヌードマウス投与液を調製した。
（２）組換えビフィズス菌の腫瘍蓄積性
６週齢の雌のＫＳＮ／Ｓｌｃヌードマウス（日本エスエルシー、浜松、日本）に、２×１０６のＡ４３１細胞を皮下移植し、固形がんが形成された２週後に前記（１）で調製した組換えビフィズス菌を１．５×１０９個、静脈内に投与した。陰性対照には、組換えビフィズス菌を静脈内に投与していないヌードマウスを使用した。体内の組換えビフィズス菌の栄養補助のために、全マウスに毎日１ｍＬの２０％ラクツロース（和光純薬、大阪、日本）を腹腔内に投与した。投与後、１週後にマウスから腫瘍（ｎ＝５、平均値２７７．２ｍｍ３）、及び対照として血液及び脾臓を回収し、血液は直接、腫瘍と脾臓はＭＲＳ培地（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、５０ｍＭショ糖、３．４ｍｇ／ｍＬ Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム塩、及び０．２ｍｇ／ｍＬ Ｌ−システイン塩酸塩）中でホモジナイズ後、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを含むＭＲＳ寒天培地（前記ＭＲＳ液体培地に１．５％のＢａｃｔｏ Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加して調製）に塗布し、容器又は袋内に脱酸素剤であるアネロパック・ケンキ（三菱ガス化学、東京、日本）を入れてビフィズス菌が増殖可能な程度の低酸素状態にした嫌気環境下で３７℃にて２日間培養し、ＭＲＳ選択寒天培地上に出現したコロニーを計測した。
結果を図７に示す。この図が示すように、組換えビフィズス菌は、血液や脾臓と比較して腫瘍に１００倍から１，０００倍の選択性で蓄積することが明らかとなった。
（３）組換えビフィズス菌の静脈内投与による体重及びＧＰＴ値の変化
（２）の組換えビフィズス菌を投与したヌードマウスにおいて、組換えビフィズス菌の静脈内投与日（Ｄａｙ０）と腫瘍回収時の投与後１週（Ｄａｙ７）に体重を計測した。陰性対照としては組換えビフィズス菌を静脈内に投与していないＡ４３１細胞移植マウスを用いた。各群はｎ＝５で実施した。
結果を表１に示す。
【表1】
また、（２）の組換えビフィズス菌を投与したヌードマウスと陰性対照のマウスのそれぞれから採取した血液から血清を調製し、トランスアミラーゼＣＩＩ・テストワコー（和光純薬）を用いて、肝機能障害の有無を調べるために、ＧＰＴ（ＡＬＴ）値を測定した。血清は採取した血液を室温で３０分、４℃で一晩インキュベートし、１，０００×ｇで遠心分離した後、上清を採取することによって得た。
結果を図８に示す。組換えビフィズス菌の静脈内投与群（８Ｃ７ ｔｏｘｉｎ）では、陰性対照（Ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較してＧＰＴ値に大きな変化が見られなかった。
以上の結果は、殺細胞活性を有する外毒素を含む融合タンパク質８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを分泌する組換えビフィズス菌をマウスに静脈内に投与したとしても、生体に対して副作用をほとんど及ぼさないことを示唆している。
＜実施例５：８Ｃ７ ＥＧＦＰを発現する組換えビフィズス菌を用いたｉｎ ｖｉｖｏでのＥＧＦＲインターナリゼーションの検出＞
（１）８Ｃ７ ＥＧＦＰの発現ベクターの構築と組換えビフィズス菌の調製
８Ｃ７ ＥＧＦＰ発現ベクターは、実施例４に記載のシャトルベクターｐＫＫＴ４２７のＭＣＳにおけるＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩの間に、ビフィズス菌用発現カセット８Ｃ７ ＥＧＦＰ（図１ｂ）を挿入した。構築した８Ｃ７ ＥＧＦＰ発現ベクターをＢ．ロンガム１０５−Ａにエレクトロポレーション法を用いて導入した。エレクトロポレーションの条件は、２．４ｋＶ／ｃｍ、２５μＦ、２００Ωの条件で行った。得られた組換えビフィズス菌を生理食塩水に再懸濁してヌードマウス投与液を調製した。
（２）組換えビフィズス菌のＡ４３１細胞坦癌マウスへの投与及びＥＧＦＲインターナリゼーションの検出
６週齢の雌のＫＳＮ／Ｓｌｃヌードマウスに、２×１０６のＡ４３１細胞を皮下移植し、固形がんが形成された２週後に前記（１）で調製した組換えビフィズス菌を１．５×１０９個、静脈内に投与した。陰性対照には、組換えビフィズス菌を静脈内に投与していないヌードマウスを使用した。体内の組換えビフィズス菌の栄養補助のために、全マウスに毎日１ｍＬの２０％ラクツロース（和光純薬、大阪、日本）を腹腔内に投与した。投与後、１週後にマウスから腫瘍（ｎ＝１０、平均値４５０ｍｍ３）を回収し、凍結組織切片作製用包埋剤ティシュー・テックＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（サクラファインテックジャパン、東京、日本）中で凍結保存した。凍結切片は、凍結ミクロトームＬｅｉｃａ ＣＭ３０５０ Ｓ（Ｌｅｉｃａ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、１０μｍの厚さで作製した。封入剤は、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて、封入時にＤＡＰＩ（４’，６−Ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）で核染色を行った。スライドガラスは、Ｍｉｃｒｏ Ｓｌｉｄｅ Ｇｌａｓｓ（松波硝子、大阪、日本）を用い、カバーガラスは、Ｎｅｏ Ｍｉｃｒｏ Ｃｏｖｅｒ Ｇｌａｓｓ（松波硝子）を用いた。蛍光顕微鏡は、Ｅｃｌｉｐｓｅ８０ｉ（ニコン、東京、日本）を使用した。ＤＡＰＩ染色した細胞核を波長３４０〜３８０ｎｍの励起光により４００ｎｍ付近の蛍光として検出し、８Ｃ７ ＥＧＦＰは波長４６５〜４９５ｎｍの励起光により５０５ｎｍ付近の蛍光として検出した。
結果を図９に示す。図９ａ及び図９ｂは８Ｃ７ ＥＧＦＰを、図９ｃは陰性対照を示す。これらの図では、８Ｃ７ ＥＧＦＰの蛍光を矢印で、ＤＡＰＩの蛍光は矢頭で示している。Ａ４３１細胞の核周辺に点状にＥＧＦＰの緑色の蛍光が認められることから、ｉｎ ｖｉｖｏでも８Ｃ７ ＥＧＦＰのＥＧＦＲインターナリゼーションが生じていることが明らかとなった。これは、８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを発現し、分泌する組換えビフィズス菌を静脈内に投与した場合、ｉｎ ｖｉｖｏであっても緑膿菌外毒素Ａが、癌細胞内へ取り込まれ、癌細胞に対して強い殺細胞効果を発揮することを示唆している。また、図９ｂでは直線状の蛍光像（矢印）が見られたが、これは組換えビフィズス菌が直線状に並んで生息している（Ｙａｚａｗａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：２６９−２７４）ことを示唆している。同様の結果は、ヒト膵臓癌由来細胞ＢｘＰＣ−３細胞でも得られた（図示せず）。
＜実施例６：８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを発現する組換えビフィズス菌を静脈内投与した場合の抗腫瘍効果（１）＞
Ａ４３１細胞のＸｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌに、８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを発現する組換えビフィズス菌を静脈内投与した場合の抗腫瘍効果について検証した。
（１）陰性対照Ｔｏｘｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌの発現用ベクターの構築と組換えビフィズス菌の調製
抗体依存性の抗腫瘍効果を検討するため陰性対照として、図１ｃに記載のＴｏｘｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌを用いた。実施例４に記載のシャトルベクターｐＫＫＴ４２７のＭＣＳにおけるＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩの間に、ビフィズス菌用発現カセットＴｏｘｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ（図１ｃ）を挿入した。構築したＴｏｘｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ発現ベクターをＢ．ロンガム１０５−Ａにエレクトロポレーション法を用いて導入した。エレクトロポレーションの条件は、２．４ｋＶ／ｃｍ、２５μＦ、２００Ωの条件で行った。得られた組換えビフィズス菌を生理食塩水に再懸濁してヌードマウス投与液を調製した。
（２）Ａ４３１細胞のＸｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌにおける組換えビフィズス菌の抗腫瘍効果の測定
６週齢の雌のＫＳＮ／Ｓｌｃヌードマウスに、２×１０６のＡ４３１細胞を皮下移植し、８日後に各群（Ｖｅｈｉｃｌｅ、８Ｃ７ ｔｏｘｉｎ、Ｔｏｘｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ；各ｎ＝５）を約１３０ｍｍ３になるように群分けした後、実施例４（１）で調製した８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを発現する組換えビフィズス菌及び本実施例（１）で調製したＴｏｘｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌを発現する組換えビフィズス菌を１．５×１０９個で静脈内に投与した。陰性対照（Ｖｅｈｉｃｌｅ）には、組換えビフィズス菌を静脈内に投与していないヌードマウスを使用した。体内の組換えビフィズス菌の栄養補助のために、全マウスに毎日１ｍＬの２０％ラクツロース（和光純薬、大阪、日本）を腹腔内に投与した。腫瘍径は、Ａ４３１細胞を皮下移植した日の８日、１０日、１５日、１８日、２０日後にノギスを用いて計測した。腫瘍体積は、「（短径）２×（長径）／２」の計算式で算出した。
結果を図１０に示した。８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを発現する組換えビフィズス菌では、陰性対照のＶｅｈｉｃｌｅと比較して、９３％の腫瘍増殖抑制効果がみられた。一方、抗ＥＧＦＲ一本鎖抗体ＰＭＰ８Ｃ７を含まない陰性対照Ｔｏｘｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌを発現する組換えビフィズス菌では、ほとんど腫瘍増殖抑制効果がみられなかった。これらの結果は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、組換えビフィズス菌から分泌された８Ｃ７ ｔｏｘｉｎが抗ＥＧＦＲ一本鎖抗体部分を介してＡ４３１細胞表面のＥＧＦＲ受容体と結合し、緑膿菌外毒素Ａ部分によって殺細胞効果を発揮したことを示唆している。今回得られた抗腫瘍効果はＥＧＦＲのチロシンキナーゼを選択的に阻害する低分子の分子標的薬であるゲフィニチブと同等の腫瘍殖抑制効果（Ｊａｍｅｓ Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，７：４２３０−４２３８）を有しており、腫瘍増殖抑制効果としては十分であることが明らかとなった。
＜実施例７：８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを発現する組換えビフィズス菌を静脈内投与した場合の抗腫瘍効果（２）＞
ＢｘＰＣ−３細胞のＸｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌに、８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを発現する組換えビフィズス菌を静脈内投与した場合の抗腫瘍効果について検証した。
（１）ＢｘＰＣ−３細胞のＸｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌにおける組換えビフィズス菌の抗腫瘍効果の測定
６週齢の雌のＫＳＮ／Ｓｌｃヌードマウスに、２×１０６のＢｘＰＣ−３細胞を皮下移植し、１２日後に各群（Ｖｅｈｉｃｌｅ、８Ｃ７ ｔｏｘｉｎ、Ｔｏｘｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ；ｎ＝５）を約９５ｍｍ３になるように群分けした後、実施例４（１）で調製した８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを発現する組換えビフィズス菌及び本実施例（１）で調製したＴｏｘｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌを発現する組換えビフィズス菌を１．５×１０９個で静脈内に投与した。さらに、２７日後に１．５×１０９個の組換えビフィズス菌を静脈内に再投与した。陰性対照（Ｖｅｈｉｃｌｅ）には、組換えビフィズス菌を静脈内に投与していないヌードマウスを使用した。体内の組換えビフィズス菌の栄養補助のために、全マウスに毎日１ｍＬの２０％ラクツロース（和光純薬、大阪、日本）を腹腔内に投与した。腫瘍径は、ＢｘＰＣ−３細胞を皮下移植した日の１２日、１５日、２２日、２７日、３２日、３７日後にノギスを用いて計測した。腫瘍体積は、「（短径）２×（長径）／２」の計算式で算出した。
結果を図１１に示す。８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを発現する組換えビフィズス菌では、陰性対照のＶｅｈｉｃｌｅと比較して、９０％の腫瘍増殖抑制効果がみられた。一方、抗ＥＧＦＲ一本鎖抗体ＰＭＰ８Ｃ７を含まない陰性対照Ｔｏｘｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌを発現する組換えビフィズス菌では、ほとんど腫瘍増殖抑制効果がみられなかった。これらの結果は、実施例６と同様に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、組換えビフィズス菌から分泌された８Ｃ７ ｔｏｘｉｎが抗ＥＧＦＲ一本鎖抗体部分を介してＡ４３１細胞表面のＥＧＦＲ受容体と結合し、緑膿菌外毒素Ａ部分によって殺細胞効果を発揮したことを示唆している。今回得られた抗腫瘍効果は、膵臓癌の治療で使用される代謝拮抗薬ゲムシタビン、及びＥＧＦＲを標的とするモノクローナル抗体セツキシマブの併用効果（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８；１４：５１４２−５１４９）よりも腫瘍増殖抑制効果が強く、腫瘍増殖抑制効果としては十分であることが明らかとなった。
（２）ＢｘＰＣ−３細胞のＸｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌにおける組換えビフィズス菌投与時の体重変化
（１）の組換えビフィズス菌を投与したヌードマウスにおいて、組換えビフィズス菌の静脈内投与日（Ｄａｙ ０）基準値として投与後１５日目（Ｄａｙ １５）、２２日目（Ｄａｙ ２２）、２７日目（Ｄａｙ ２７）、３２日目（Ｄａｙ ３２）及び３７日目（Ｄａｙ ３７）に体重を計測した。各群はｎ＝５で実施した。
結果を表２に示す。
【表2】
＜実施例８：８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを発現する組換えビフィズス菌を静脈内投与した場合の抗腫瘍効果（３）＞
ＰＣ−９細胞（ヒト非小細胞肺がん由来細胞、免疫生物研究所、藤岡市、日本より入手）のＸｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌに、８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを発現する組換えビフィズス菌を静脈内投与した場合の抗腫瘍効果について検証した。
（１）ＰＣ−９細胞のＸｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌにおける組換えビフィズス菌の抗腫瘍効果の測定
６週齢の雌のＫＳＮ／Ｓｌｃヌードマウスに、１．７×１０６のＰＣ−９細胞を皮下移植し、８日後に各群（Ｖｅｈｉｃｌｅ、８Ｃ７ ｔｏｘｉｎ、Ｔｏｘｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ；ｎ＝５）を約９５ｍｍ３になるように群分けした後、実施例４（１）で調製した８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを発現する組換えビフィズス菌及び実施例６（１）で調製したＴｏｘｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌを発現する組換えビフィズス菌を１．５×１０９個で静脈内に投与した。陰性対照（Ｖｅｈｉｃｌｅ）には、組換えビフィズス菌を静脈内に投与していないヌードマウスを使用した。体内の組換えビフィズス菌の栄養補助のために、全マウスに毎日１ｍＬの２０％ラクツロース（和光純薬、大阪、日本）を腹腔内に投与した。腫瘍径は、ＰＣ−９細胞を皮下移植した日の９日、１０日、１１日、１４日、１７日、２１日、２４日後にノギスを用いて計測した。腫瘍体積は、「（短径）２×（長径）／２」の計算式で算出した。
結果を図１２に示す。８Ｃ７ ｔｏｘｉｎを発現する組換えビフィズス菌では、陰性対照のＶｅｈｉｃｌｅと比較して、７７％の腫瘍増殖抑制効果がみられた。一方、抗ＥＧＦＲ一本鎖抗体ＰＭＰ８Ｃ７を含まない陰性対照Ｔｏｘｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌを発現する組換えビフィズス菌では、ほとんど腫瘍増殖抑制効果がみられなかった。これらの結果は、実施例６、７と同様に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、組換えビフィズス菌から分泌された８Ｃ７ ｔｏｘｉｎが抗ＥＧＦＲ一本鎖抗体部分を介してＡ４３１細胞表面のＥＧＦＲ受容体と結合し、緑膿菌外毒素Ａ部分によって殺細胞効果を発揮したことを示唆している。
＜実施例９：８Ｃ７ ＥＧＦＰを発現する組換えビフィズス菌を経口投与した場合の腸管免疫応答の誘導＞
８Ｃ７ ＥＧＦＰを発現する組換えビフィズス菌を経口投与した場合の腸管免疫応答の誘導について検証した
（１）陰性対照となるｐＫＫＴ４２７含有組換えビフィズス菌の構築と８Ｃ７ ＥＧＦＰを発現する組換えビフィズス菌の経口投与
陰性対照となるｐＫＫＴ４２７含有組換えビフィズス菌は、ｐＫＫＴ４２７をそのままＢ．ロンガム１０５−Ａにエレクトロポレーション法を用いて導入して調製した。エレクトロポレーションの条件は、２．４ｋＶ／ｃｍ、２５μＦ、２００Ωの条件で行った。得られた組換えビフィズス菌と実施例５（１）で調製した８Ｃ７ ＥＧＦＰを発現する組換えビフィズス菌を生理食塩水に再懸濁してマウス投与液を調製し、６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃＣｒＳｌｃマウス（日本エスエルシー、浜松、日本）の各群（ｐＫＫＴ４２７、８Ｃ７ ｔｏｘｉｎ；ｎ＝４）に６．０×１０９個の組換えビフィズス菌を経口投与した。腸管内の組換えビフィズス菌の栄養補助のために、全マウスに毎日０．２ｍＬの２０％ラクツロースを２週間経口投与した。組換えビフィズス菌を経口投与した日の３１日後に糞を回収して、２０％（ｗ／ｖ）になるように氷冷したｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉ（ロシュ・ダイアグノスティックス、バーゼル、スイス）入りＰＢＳで懸濁し、遠心分離後、上清を０．２２μｍｆｉｌｔｅｒでろ過したものを試料とした。腸管免疫応答の誘導は、試料中のＥＧＦＰに対する糞中の抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した。ＥＬＩＳＡ法は９６穴プレート上で行い、抗原は実施例２（２）で調製したリコンビナント８Ｃ７ ＥＧＦＰ（１６μｇ）を用いて、室温で１時間以上Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＴＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）でブロッキング後、３回ＴＢＳ−Ｔで洗浄後、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＴＢＳで２倍希釈した試料を５０μＬ添加した。室温で２時間インキュベートした後、３回ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。１００００倍希釈したＧｏａｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ＋ＩｇＭ＋ＩｇＡ−Ｈ＆Ｌ ＨＲＰ（ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）５０μＬを加えて、３７℃にて１時間インキュベートした後、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ＴＭＢ溶液（和光純薬、大阪、日本）を５０μＬ添加して、室温で２時間インキュベート後、発色停止液である硫酸を５０μＬ添加し、吸光光度計でＯＤ４５０の値を測定した。
結果を図１３に示す。８Ｃ７ ＥＧＦＰを発現する組換えビフィズス菌群で糞中の抗ＥＧＦＰ抗体産生量が有意（ｔ検定、ｐ＝０．００４７）に増加していた。これは８Ｃ７ ＥＧＦＰを発現する組換えビフィズス菌を経口投与することで腸管免疫応答が誘導されたことを示唆している。
＜実施例１０：８Ｃ７ ＥＧＦＰを発現する組換えビフィズス菌を静脈内投与したときの血中における自己抗体の非産生の確認＞
８Ｃ７ ＥＧＦＰを発現する組換えビフィズス菌を静脈内投与した場合に血中に抗８Ｃ７ ＥＧＦＰ抗体が誘導されないことを確認した。
（１）ｃｏｌｏｎ２６細胞のＸｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌの構築と組換えビフィズス菌の静脈内投与
６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃＣｒＳｌｃマウス（日本エスエルシー、浜松、日本）１５匹にｃｏｌｏｎ２６細胞（マウス直腸癌由来細胞、理化学研究所バイオリソースセンター、つくば市、日本より入手）を１．０×１０６個で皮下移植し、７日後に平均１３３ｍｍ３になるように３群（８Ｃ７ ＥＧＦＰ；ｎ＝８、８Ｃ７ ＥＧＦＰ（ビフィズス菌回収用）；ｎ＝３、無処置群用；ｎ＝４）に群分けした後、８Ｃ７ ＥＧＦＰ群及び８Ｃ７ ＥＧＦＰ（ビフィズス菌回収）群のそれぞれに８Ｃ７ ＥＧＦＰを発現する組換えビフィズス菌を１．０×１０８個で静脈内に投与した。８Ｃ７ ＥＧＦＰ（ビフィズス菌回収）群は、ｃｏｌｏｎ２６細胞を皮下移植したマウスに８Ｃ７ ＥＧＦＰを発現する組換えビフィズス菌を投与した後、その組換えビフィズス菌の腫瘍蓄積性を確認するために次の（２）で使用するマウス群であって、実質的には８Ｃ７ ＥＧＦＰ群と同じ処理を行っている。
（２）ｃｏｌｏｎ２６細胞での組換えビフィズス菌の腫瘍蓄積性
８Ｃ７ ＥＧＦＰ（ビフィズス菌回収）群では、皮下移植の１８日後に腫瘍を摘出して、１ｍＬのＭＲＳ培地中でホモジナイズした後、１００μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含むＭＲＳ寒天培地に塗布した。続いて、容器又は袋内に脱酸素剤であるアネロパック・ケンキ（三菱ガス化学、東京、日本）を入れてビフィズス菌が増殖可能な程度の低酸素状態にした嫌気環境下で３７℃にて２日間培養した。ＭＲＳ選択寒天培地上に出現したコロニーを計測したところ、平均４．３×１０６個／匹のビフィズス菌を得た。この結果からマウス静脈内に投与された８Ｃ７ ＥＧＦＰを発現する組換えビフィズス菌が、腫瘍に生存状態で蓄積することが確認された。
（３）血清中の抗８Ｃ７ ＥＧＦＰ抗体の非誘導性の確認
皮下移植の２８日、３５日後に８Ｃ７ ＥＧＦＰを発現する組換えビフィズス菌群と無処置群のそれぞれから採取した血液より血清を調製した。免疫応答の誘導の有無を調べるために、ＥＧＦＰに対する血清中の抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した。ＥＬＩＳＡ法は９６穴プレート上で行い、抗原は実施例２（２）で調製したリコンビナント８Ｃ７ ＥＧＦＰ（１６μｇ）を用いた。室温で１時間以上Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＴＢＳでブロッキング後、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＴＢＳで２０００倍希釈した血清を５０μＬ添加した。陰性対照として３ｍｇ／ｍＬのＮｏｒｍａｌ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）をＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＴＢＳで１５０００倍希釈して使用した。陽性対照として１ｍｇ／ｍＬの抗ＥＧＦＰ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＵＳＡ）をＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＴＢＳで５０００倍希釈して使用した。室温で２時間インキュベートし、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、１００００倍希釈したＧｏａｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ＋ＩｇＭ＋ＩｇＡ−Ｈ＆Ｌ ＨＲＰの５０μＬを加えて、３７℃で１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ＴＭＢ溶液を５０μＬ添加した。室温で２時間インキュベート後、発色停止液である硫酸を５０μＬ添加し、吸光光度計でＯＤ４５０の値を測定した。
結果を図１４に示す。８Ｃ７ ＥＧＦＰ投与群は、無処置群、及び陰性対照のｎＩｇＧと比較して血清中の抗ＥＧＦＰ抗体量が優位に増加しなかった。これはｃｏｌｏｎ２６細胞のＸｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌにおいて８Ｃ７ ＥＧＦＰを発現する組換えビフィズス菌を静脈内投与しても血中に抗８Ｃ７ＥＧＦＰ抗体が誘導されないことを示している。臨床試験においてイムノトキシンを静脈内に投与した場合、自己抗体の産生が治療上の問題となる（Ｊａｍｅｓ Ａ．Ｐｏｓｅｙ，Ｍｏｈａｍｍａｄ Ｂ．Ｋｈａｚａｅｌｉ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ａ．Ｂｏｏｋｍａｎ，ｅｔ ａｌ、２００２、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，８：３０９２−３０９９）が、この結果から本治療法では自己抗体の産生が問題とならないことが立証された。
【産業上の利用可能性】
【0009】
本発明の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌によれば、機能性ペプチドをコードする核酸を発現及び分泌可能な状態で標的細胞周辺にまで送達できる薬剤送達用担体を提供することができる。本発明の抗腫瘍剤及び／又は腫瘍検出用マーカーによれば、侵襲性が低く、副作用の少ない、かつ標的特異性の高い固形癌増殖抑制剤及び／又は腫瘍検出用マーカーを提供することができる。この固形癌増殖抑制剤及び腫瘍検出用マーカーを用いることで、固形癌の増殖抑制による治療効果を経時的にモニタリングが可能となる。
本発明の経口ワクチン剤によれば、非侵襲的で副作用が低く、かつ標的特異性の高い経口ワクチン剤を提供することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］