特許 6026405 リン脂質薬物類似体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6026405

(24)【登録日】2016年10月21日

(45)【発行日】2016年11月16日

(54)【発明の名称】リン脂質薬物類似体

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/685 20060101AFI20161107BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20161107BHJP

   C07D 473/18 20060101ALI20161107BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20161107BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20161107BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/685

   A61K9/127

   C07D473/18

   A61P35/00

   A61P37/04

【請求項の数】17

【全頁数】103

(21)【出願番号】特願2013-506541(P2013-506541)

(86)(22)【出願日】2011年4月29日

(65)【公表番号】特表2013-525390(P2013-525390A)

(43)【公表日】2013年6月20日

(86)【国際出願番号】EP2011002152

(87)【国際公開番号】WO2011134668

(87)【国際公開日】20111103

【審査請求日】2014年3月28日

(31)【優先権主張番号】61/330,151

(32)【優先日】2010年4月30日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】512278445

【氏名又は名称】テロルメディクス エセアー

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100122389

【弁理士】

【氏名又は名称】新井 栄一

(74)【代理人】

【識別番号】100111741

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 夏夫

(74)【代理人】

【識別番号】100169971

【弁理士】

【氏名又は名称】菊田 尚子

(74)【代理人】

【識別番号】100180862

【弁理士】

【氏名又は名称】花井 秀俊

(72)【発明者】

【氏名】マイ， ロベルト

(72)【発明者】

【氏名】パッタリーノ， フランコ

(72)【発明者】

【氏名】ムーラ， エムヌニラ

(72)【発明者】

【氏名】バルベリス， アルシデ

【審査官】 平林 由利子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００２−３３８５０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／１１５３１９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００５／０１１７０８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００３−５１４７７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５１８０８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Chan, M. et al., Bioconjugate Chem., 2009, vol.20, p.1194-1200

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００−３３／４４

Ａ６１Ｋ ９／００− ９／７２

Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／４８

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ａもしくは式Ｂによる構造を有する化合物、

【化1】

または薬学的に許容されるその塩、互変異性体もしくは水和物を含む組成物
［式中、
Ｘ^１は、−Ｏ−であり、
Ｒ^１は、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシで置換されているＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、
Ｘ^２は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−である連結基であり、
ｎは、０であり、
Ｘ^３は、−ＰＯ_４−であり、
Ｒ^３は、−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｄおよび−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｅで置換されているＣ１〜Ｃ６アルキルであり、かつ
−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｄおよび−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｅは、−ＯＣ（Ｏ）−（ＣＨ_２）₁₀−ＣＨ₃である］。

【請求項2】

Ｒ^３が、−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｄおよび−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｅで置換されているＣ３アルキルである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記Ｒ^３のＣ３アルキルが、該Ｃ３アルキルの３位において−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｄで置換されており、該Ｃ３アルキルの２位において−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｅで置換されている、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

Ｒ^１が、−（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

リポソームを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

前記化合物が、以下：

【化2】

の構造を有する、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

請求項１から６のいずれか一項に記載の式Ａまたは式Ｂの構造を有する化合物を含む免疫刺激性組成物。

【請求項8】

被験体においてがんを処置するための請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物であって、該組成物は、それを必要としている被験体に、該がんを処置するのに有効な量で投与されることを特徴とする、組成物。

【請求項9】

前記被験体が、哺乳動物である、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

前記被験体が、ヒトである、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

前記がんが、膀胱がんである、請求項８から１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

前記組成物が、膀胱内滴下注入によって投与されることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

前記組成物が、膀胱への局所送達によって投与されることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。

【請求項14】

前記がんが、皮膚がんの前がんまたは皮膚がんである、請求項８から１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項15】

被験体において免疫応答を誘導するための請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項16】

前記免疫応答が、抗体応答である、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

前記抗体応答が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ抗体応答である、請求項１６に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連の特許出願
優先権は、２０１０年４月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／３３０，１５１号（発明の名称「Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｄｒｕｇ Ａｎａｌｏｇｓ」）に対して主張される。この出願は参照され、本明細書においてその全体が参考として援用される。

【0002】

分野
この技術は部分的に、リン脂質薬物類似体、ならびにこれを製造および使用する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

背景
ファルマコフォアは、被験体において治療効果を発揮することができる分子であることが多い。例えばファルマコフォアは、がんなどの細胞増殖状態の処置に有用であり得る抗細胞増殖作用を発揮できることがある。ファルマコフォアは、被験体において免疫系を刺激し、それによって特定の抗原に対する免疫応答を生じさせ、または増強できることがある。

【0004】

ファルマコフォアは、リン脂質薬物類似体中のリン脂質、またはリン脂質様分子にコンジュゲート（例えば、連結）することができる。リン脂質、またはリン脂質様構成成分は、コンジュゲートされていないファルマコフォアの作用とは異なる機能を類似体に与えることができる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

要旨
いくつかの実施形態において提供するのは、式Ａもしくは式Ｂによる構造を有する化合物を含む組成物、

【0006】

【化1】

【0007】

または薬学的に許容されるその塩、互変異性体もしくは水和物であり、式中、
Ｘ^１は、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＲ^ａ−であり、
Ｒ^ａは、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、もしくは置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり、またはＲ^ａおよびＲ^１は、窒素原子と一緒になって、複素環式もしくは置換複素環式を形成することができ、アルキルまたは複素環式基上の置換基は、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシＣ１〜Ｃ６アルキレン（ａｋｙｌｅｎｅ）、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールであり、
Ｒ^１は、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環式、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環式、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｈｅｔ、Ｈｅｔ Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシカルボニルであり、アルキル、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル（ａｌｋｃｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、Ｈｅｔ、アリールまたは複素環式基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ９複素環式、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールであり、
各Ｒ^２は、独立に、水素、−ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜Ｃ６アルキル（アルカノイル）、置換−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ６〜Ｃ１０アリール（アロイル）、置換−Ｃ（Ｏ）−Ｃ６〜Ｃ１０アリール、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ（カルボキシル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル（アルコキシカルボニル）、置換−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−ＮＲ^ａＲ^ｂ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃ（カルバモイル）、置換Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃ、Ｃ５〜Ｃ９環式、置換Ｃ５〜Ｃ９環式、Ｃ５〜Ｃ９複素環式、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環式、ハロ、ニトロ、またはシアノであり、アルキル、環式、アリールまたは複素環式基上の置換基は、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシＣ１〜Ｃ６アルキレン、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールであり、
各Ｒ^ｂおよびＲ^ｃは、独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環式、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環式、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｈｅｔ、Ｈｅｔ Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシカルボニルであり、アルキル、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、Ｈｅｔ、アリールまたは複素環式基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ９複素環式、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールであり、
Ｘ^２は、結合または連結基であり、ｎは、０、１、２、３または４であり、
Ｘ^３は、結合または−ＰＯ_４−であり、
Ｒ^３は、−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｄおよび−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｅで置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル；−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｄ、−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｅ、および１つ以上のさらなる置換基で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル；−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｄおよび−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｅで置換されているＣ１〜Ｃ６アルケニル；または−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｄ、−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｅ、および１つ以上のさらなる置換基で置換されているＣ１〜Ｃ６アルケニルであり、１つ以上のさらなる置換基は、独立に、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ９複素環式、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキレン、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールであり、
各Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、独立に、Ｃ６〜Ｃ３０アルキル、またはヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキレン、アミノ、シアノ、エポキシ、ハロゲンもしくはアリールの１つ以上で置換されているＣ６〜Ｃ３０アルキルである。

【0008】

特定の実施形態において、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、独立に、線状および飽和Ｃ６〜Ｃ３０アルキルであり、いくつかの実施形態において、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、同じまたは異なる。−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｄおよび−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｅの非限定的例には、独立に、ｎ−ヘキサノイル（Ｃ６、−ＯＣ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_４ＣＨ_３）、ｎ−オクタノイル（Ｃ８、−ＯＣ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_６ＣＨ_３）、ｎ−デカノイル（Ｃ１０、−ＯＣ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_８ＣＨ_３）、ｎ−ドデカノイル（Ｃ１２、ラウロイル、−ＯＣ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_１０ＣＨ_３）、ｎ−テトラデカノイル（Ｃ１４、ミリストイル、−ＯＣ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_１２ＣＨ_３）、ｎ−ヘキサデカノイル（Ｃ１６、パルミトイル、−ＯＣ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_１４ＣＨ_３）、ｎ−オクタデカノイル（Ｃ１８、ステアロイル（ｓｔｒｅａｒｏｙｌ）、−ＯＣ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_１６ＣＨ_３））、ｎ−エイコサノイル（Ｃ２０、アラキドイル、−ＯＣ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_１８ＣＨ_３））、ｎ−ドコサノイル（Ｃ２２、ベヘノイル、−ＯＣ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_２０ＣＨ_３））およびｎ−テトラコサノイル（Ｃ２４、リグノセロイル、−ＯＣ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_２２ＣＨ_３））が含まれる。Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、いくつかの実施形態において、独立に、線状および飽和Ｃ８〜Ｃ１８アルキルであり、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、独立に、線状および飽和Ｃ８、Ｃ１２またはＣ１８アルキルであることがある。いくつかの実施形態において、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、線状および飽和Ｃ６〜Ｃ３０アルキル、またはヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキレン、アミノ、シアノ、エポキシ、ハロゲンもしくはアリールの１つ以上で置換されている線状Ｃ６〜Ｃ３０アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、線状および飽和（例えば、ＳＣ１２）であり、いくつかの実施形態において、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、線状および不飽和（例えば、化合物Ａ）である。

【0009】

特定の実施形態において、各Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、飽和および線状Ｃ１２アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、エポキシ部分で置換されておらず、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、ヒドロキシル部分で置換されていないことがある。特定の実施形態において、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、エポキシ部分でもヒドロキシル部分でも置換されていない。様々な実施形態において、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、二重結合（例えば、不飽和）を含まない。

【0010】

いくつかの実施形態において、−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｒ^３は一緒になって、式Ｃによる構造を形成する。

【0011】

【化2】

【0012】

特定の実施形態において、−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｒ^３は一緒になって、式Ｄによる構造を形成する。

【0013】

【化3】

【0014】

いくつかの実施形態において、Ｘ^１は、Ｏであり、Ｒ^１は、Ｃ１〜６アルコキシで置換されているＣ１〜Ｃ１０アルキルであることがある。特定の実施形態において、ｎは、０であり、Ｘ^２は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−である。Ｒ^３は、−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｄおよび−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｅで置換されているＣ３アルキルであることがあり、特定の実施形態において、Ｒ^３ Ｃ３アルキルは、Ｃ３アルキルの３位において−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｄで置換されており、２位において−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｅで置換されている（例えば、−ＰＯ_４−部分がＣ３アルキルの１位に連結しており、−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｅ部分が２位にあり、−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｄ部分が３位にある式Ｃを参照されたい）。特定の実施形態において、Ｘ^１は、Ｏであり、Ｒ^１は、−（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、ｎは、０であり、Ｘ^２は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−であり、Ｘ^３は、−ＰＯ_４−であり、Ｒ^３は、−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｄおよび−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｅで置換されているＣ３アルキルであり、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、線状および飽和Ｃ１２アルキルである。

【0015】

いくつかの実施形態において、式Ａまたは式Ｂ中のベンゼン環は、非芳香環、複素非芳香環、または複素芳香環で置き換えられている。これらの環の例には、例えば、本明細書において一覧表示されているものが含まれる。例えば、非芳香環の例には、例えば、任意の５員または６員の、例えば、シクロアルキルが含まれる。複素非芳香環の例には、例えば、ピペリジンおよびピペラジンが含まれる。複素芳香環の例には、例えば、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、およびトリアジンが含まれる。

【0016】

特定の実施形態において、組成物は、リポソームを含む。組成物は、いくつかの実施形態において、抗原を含む。

【0017】

いくつかの実施形態においてまた提供するのは、本明細書に記載されている構造を有する化合物を含む免疫刺激性組成物である。特定の実施形態において、化合物はアジュバントとして機能し、免疫刺激性組成物は、抗原を含むことがある（例えば、組成物は、ワクチンとして機能する）。免疫刺激性組成物は、いくつかの実施形態において、ワクチンを含み、特定の実施形態において、一次ワクチンまたは混合ワクチンを構成する。

【0018】

免疫応答を誘導するための方法であって、本明細書において提供する構造を有する化合物を被験体に投与する工程を含む、方法もまた提供する。免疫応答を誘導するとは、特異的抗原に対する免疫応答を誘導すること、または（特異的抗原の非存在下で）全身的免疫応答を誘導することを意味する。一実施形態において、化合物はアジュバントとして作用し、全身的免疫応答ではなく特異的免疫応答と関連する。一実施形態において、化合物は、全身的免疫刺激物質として作用する。一実施形態において、この方法は、それを必要としている哺乳動物に、ある量の抗原、およびこれらに限定されないが、膀胱がんまたは皮膚がんを含めた障害を予防、阻害または処置するのに有効な本明細書において提供する構造を有する化合物を投与する工程を含む。したがって、特定の実施形態において、免疫応答は、抗原特異的免疫応答である。いくつかの実施形態において、免疫応答は、抗体応答であり、これは、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ抗体応答であることがある。いくつかの実施形態において、抗原は微生物抗原であり、例えば、マラリア抗原を投与してもよく、いくつかの実施形態において、抗原は、Ｅ．ｃｏｌｉ抗原である。抗原および化合物は、１つの組成物中に存在することがあり、いくつかの実施形態において、抗原および化合物は、異なる組成物中に存在する。特定の実施形態における化合物および／または抗原は、リポソームと関連する。抗原および化合物は、同時に、または異なる時に投与し得る。いくつかの実施形態において、抗原は、化合物の前に投与され、他の実施形態において、抗原は、化合物と同時に投与され、他の実施形態において、抗原は、化合物の後に投与される。

【0019】

特定の実施形態において、免疫応答は、抗原特異的免疫応答である。いくつかの実施形態において、免疫応答は抗体応答であり、これはＩｇＧ２ａ抗体応答であることがある。

【0020】

いくつかの実施形態において、被験体は、例えば、哺乳動物（ヒトなど）である。特定の実施形態において、化合物を、非限定的実施形態において、膀胱内滴下注入／局所送達などにより膀胱に投与する。

【0021】

いくつかの実施形態において、化合物を、例えば、局所送達によって皮膚に投与する。特定の実施形態においてまた提供するのは、被験体において状態を処置するための方法であって、本明細書に記載されている組成物を、それを必要としている被験体に、状態を処置するのに有効な量で投与する工程を含む、方法である。いくつかの実施形態においてまた提供するのは、被験体において状態を処置するための方法であって、本明細書に記載されている免疫刺激性組成物を、それを必要としている被験体に、状態を処置するのに有効な量で投与する工程を含む、方法である。被験体は哺乳動物であることがあり、特定の実施形態においてヒトでよい。状態はがん状態であることがあり、状態は微生物感染でもよい。特定の実施形態において、状態は膀胱がん状態であり、特定の実施形態において、組成物は、膀胱内滴下注入／膀胱への局所送達によって投与することができる。いくつかの実施形態において、がんは皮膚がんであり、化合物は、例えば、皮膚への局所送達によって、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、ローション剤または他の適当なビヒクル中で、局所的および／または局部的に投与することができる。処置し得る皮膚の前がん状態および皮膚がんには、例えば、光線性角化症（ＡＫ）、基底細胞癌（ＢＣＣ）、扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）、黒色腫および非黒色腫皮膚がんが含まれる。

【0022】

特定の実施形態を、以下の説明、実施例、特許請求の範囲および図面においてさらに記載する。

【0023】

図面は技術の実施形態を例示するが、限定的ではない。例示の明確さおよび容易さのため、図面は尺度通りに作製されず、場合によっては、様々な態様は、特定の実施形態の理解を促進するために、誇張または拡大して示し得る。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
式Ａもしくは式Ｂによる構造を有する化合物、

【化20】

または薬学的に許容されるその塩、互変異性体もしくは水和物を含む組成物
［式中、
Ｘ^１は、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＲ^ａ−であり、
Ｒ^ａは、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、もしくは置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり、またはＲ^ａおよびＲ^１は、窒素原子と一緒になって、複素環式環もしくは置換複素環式環を形成することができ、該アルキルまたは複素環式基上の置換基は、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシＣ１〜Ｃ６アルキレン、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールであり、
Ｒ^１は、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環式、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環式、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｈｅｔ、Ｈｅｔ Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシカルボニルであり、該アルキル、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、Ｈｅｔ、アリールまたは複素環式基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ９複素環式、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールであり、
各Ｒ^２は、独立に、水素、−ＯＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜Ｃ６アルキル（アルカノイル）、置換−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ６〜Ｃ１０アリール（アロイル）、置換−Ｃ（Ｏ）−Ｃ６〜Ｃ１０アリール、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ（カルボキシル）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル（アルコキシカルボニル）、置換−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−ＮＲ^ａＲ^ｂ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃ（カルバモイル）、置換Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｂＲ^ｃ、Ｃ５〜Ｃ９環式、置換Ｃ５〜Ｃ９環式、Ｃ５〜Ｃ９複素環式、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環式、ハロ、ニトロ、またはシアノであり、該アルキル、環式、アリールまたは複素環式基上の置換基は、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシＣ１〜Ｃ６アルキレン、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールであり、
各Ｒ^ｂおよびＲ^ｃは、独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環式、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環式、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｈｅｔ、Ｈｅｔ
Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシカルボニルであり、該アルキル、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、Ｈｅｔ、アリールまたは複素環式基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ９複素環式、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールであり、Ｘ^２は、結合または連結基であり、ｎは、０、１、２、３または４であり、
Ｘ^３は、結合または−ＰＯ_４−であり、
Ｒ^３は、−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｄおよび−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｅで置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル；−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｄ、−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｅ、および１つ以上のさらなる置換基で置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル；−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｄおよび−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｅで置換されているＣ１〜Ｃ６アルケニル；または−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｄ、−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｅ、および１つ以上のさらなる置換基で置換されているＣ１〜Ｃ６アルケニルであり、該１つ以上のさらなる置換基は、独立に、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ９複素環式、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルキレン、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールであり、
各Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、独立に、線状および飽和Ｃ６〜Ｃ３０アルキルである］。
（項目２）
Ｒ^ｄおよびＲ^ｅが、独立に、線状および飽和Ｃ６〜Ｃ３０アルキルである、項目１に記載の組成物。
（項目３）
Ｒ^ｄおよびＲ^ｅが、独立に、線状および飽和Ｃ８〜Ｃ１８アルキルである、項目１に記載の組成物。
（項目４）
Ｒ^ｄおよびＲ^ｅが、独立に、線状および飽和Ｃ８、Ｃ１２またはＣ１８アルキルである、項目１に記載の組成物。
（項目５）
Ｒ^ｄおよびＲ^ｅが、同じである、項目１に記載の組成物。
（項目６）
−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｒ^３が一緒になって、式Ｃ

【化21】

による構造を形成する、項目１から５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７）
−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｒ^３が一緒になって、式Ｄ

【化22】

による構造を形成する、項目１から５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８）
Ｘ^１が、Ｏである、項目１から７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９）
Ｒ^１が、Ｃ１〜６アルコキシで置換されているＣ１〜Ｃ１０アルキルである、項目１から８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０）
ｎが、０であり、Ｘ^２が、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−である、項目１から９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１）
Ｒ^３が、−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｄおよび−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｅで置換されているＣ３アルキルである、項目１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２）
前記Ｒ^３ Ｃ３アルキルが、該Ｃ３アルキルの３位において−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｄで置換されており、該Ｃ３アルキルの２位において−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｅで置換されている、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
Ｒ^ｄおよびＲ^ｅが、飽和および線状Ｃ１２アルキルである、項目１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４）
Ｘ^１が、Ｏであり、Ｒ^１が、−（ＣＨ_２）_２−ＯＣＨ_３であり、ｎが、０であり、Ｘ^２が、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−であり、Ｘ^３が、ホスフェートであり、Ｒ^３が、−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｄおよび−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ^ｅで置換されているＣ３アルキルであり、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅが、線状および飽和Ｃ１２アルキルである、項目１から４および６から１３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１５）
Ｒ^ｄおよびＲ^ｅが、エポキシ部分で置換されていない、項目１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１６）
Ｒ^ｄおよびＲ^ｅが、ヒドロキシル部分で置換されていない、項目１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１７）
Ｒ^ｄおよびＲ^ｅが、エポキシ部分でもヒドロキシル部分でも置換されていない、項目１から１６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１８）
リポソームを含む、項目１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１９）
抗原を含む、項目１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２０）
前記化合物が、ＳＣ１２である、項目１に記載の組成物。
（項目２１）
項目１から１９のいずれか一項に記載の式Ａまたは式Ｂの構造を有する化合物を含む免疫刺激性組成物。
（項目２２）
前記化合物が、アジュバントとして作用する、項目２１に記載の組成物。
（項目２３）
抗原を含む、項目２１または２２に記載の組成物。
（項目２４）
ワクチンを含む、項目２１から２３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２５）
被験体において状態を処置するための方法であって、項目１から２４のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要としている被験体に、該状態を処置するのに有効な量で投与する工程を含む、方法。
（項目２６）
被験体において状態を処置するための方法であって、項目２１または２４に記載の組成物を、それを必要としている被験体に、該状態を処置するのに有効な量で投与する工程を含む、方法。
（項目２７）
前記被験体が、哺乳動物である、項目２５または２６に記載の方法。
（項目２８）
前記被験体が、ヒトである、項目２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記状態が、がん状態である、項目２５から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記状態が、膀胱がん状態である、項目２５から２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記組成物が、膀胱内滴下注入によって投与される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記組成物が、膀胱への局所送達によって投与される、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記状態が、微生物感染である、項目２５から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記状態が、皮膚の前がん状態またはがん状態である、実施形態２５から２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
被験体において免疫応答を誘導するための方法であって、項目１から２４のいずれかに記載の組成物を前記被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目３６）
前記免疫応答が、抗体応答である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記抗体応答が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ抗体応答である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
抗原が、微生物抗原である、項目２５から３６のいずれか一項に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】図１は、Ｒａｗ２６４．７マウスマクロファージ細胞株研究における、化合物についてのサイトカイン産生を例示する。

【図2】図２は、Ｒａｗ２６４．７マウスマクロファージ細胞株研究における、化合物についてのサイトカイン産生を例示する。

【図3】図３は、Ｒａｗ２６４．７マウスマクロファージ細胞株研究についての生存データを示す。

【図4】図４は、ドナー１についてのＰＢＭＣ研究における、化合物についてのＩＬ−６産生のグラフである。

【図5】図５は、ドナー２についてのＰＢＭＣ研究における、化合物についてのＩＬ−６産生のグラフである。

【図6】図６は、ドナー３についてのＰＢＭＣ研究における、化合物についてのＩＬ−６産生のグラフである。

【図7】図７は、ドナー１についてのＰＢＭＣ研究における、化合物についてのＴＮＦ−α産生のグラフである。

【図8】図８は、ドナー２についてのＰＢＭＣ研究における、化合物についてのＴＮＦ−α産生のグラフである。

【図9】図９は、ドナー３についてのＰＢＭＣ研究における、化合物についてのＴＮＦ−α産生のグラフである。

【図10】図１０は、ＰＢＭＣ研究についての生存データを提供する。

【図11】図１１は、リン脂質類似体ＳＣ８、ＳＣ１２およびＳＣ１８の構造および分子量を示す。

【図12】図１２は、３人のドナーからの全血で行った、示されるような試験試薬との２４時間のインキュベーションの後の、二重陽性ＨＬＡ−ＤＲ＋／ＣＤ２０＋Ｂ細胞についての、ＣＤ４０発現についてのＭＦＩ値を示す。

【図13】図１３は、ドナー１からの全血で行った、示されるような試験試薬との２４時間のインキュベーションの後の、ＨＬＡ−ＤＲ＋／ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ１２３−ｍＤＣにおける、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＣＲ７発現についてのＭＦＩ値を例示する。

【図14】図１４は、ドナー２からの全血で行った、示されるような試験試薬との２４時間のインキュベーションの後の、ＨＬＡ−ＤＲ＋／ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ１２３−ｍＤＣにおける、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＣＲ７発現についてのＭＦＩ値を示す。

【図15】図１５は、ドナー３からの全血で行った、示されるような試験試薬との２４時間のインキュベーションの後の、ＨＬＡ−ＤＲ＋／ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ１２３−ｍＤＣにおける、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＣＲ７発現についてのＭＦＩ値を例示する。

【図16】図１６は、３人のドナー（Ｄ１〜Ｄ３）からの全血で行った、示されるような試験試薬との２４時間のインキュベーションの後の、ＨＬＡ−ＤＲ＋／ＣＤ１１ｃ−／ＣＤ１２３＋ｐＤＣにおける、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＣＲ７発現についてのＭＦＩ値を示す。

【図17】図１７は、細胞に対するＳＣ１２およびイミキモドの細胞毒性作用のバーチャートを集めたものである。皮膚ＳＣＣ細胞株を使用して、細胞数に相当する、マイクロタイターウェル（Ｅ−ｐｌａｔｅｓ、Ｒｏｃｈｅ）における電導度を連続的にモニターした。ＴＭＸは、チャートにおいてＳＣ１２を示す。

【図18】図１８は、ＳＣ１２またはイミキモドと接触した細胞の写真を集めたものである。同様の形態学的変化が、ＳＣ１２およびイミキモドによって誘発された。３日目に、細胞脱離、形態学的変化および増殖の阻害が、ＳＣ１２またはイミキモドで処理したＳＣＣ細胞において観察することができる。

【図19】図１９は、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ抗原に対するＩｇＧ力価の発生を示す（左：化合物Ａ、右、ＳＣ１２）。

【図20】図２０は、化合物ＡおよびＳＣ１２の合成のための合成スキームの例を提供する。

【図21】図２１は、化合物ＡおよびＳＣ１２の合成のための合成スキームの例を提供する。

【図22】図２２は、化合物ＡおよびＳＣ１２の合成のための合成スキームの例を提供する。

【図23】図２３は、化合物ＡおよびＳＣ１２の合成のための合成スキームの例を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本明細書において提供する組成物は、特定の状態（例えば、細胞増殖状態など）を処置するのに有用であり得る。種々の細胞増殖状態が存在し、表在性膀胱がんが、１タイプの例である。本明細書において提供する組成物はまた、ワクチンとしての役割を果たしてもよく、記載される化合物は、免疫応答を促進し、アジュバント活性を実現してもよい。

【0026】

提供する組成物は、特定の実施形態において、リン脂質類似体を含む。リン脂質類似体は、ファルマコフォア部分、およびリンカーを介してファルマコフォア部分にコンジュゲートしているリン脂質、またはリン脂質様部分を含むことが多い。

【0027】

理論に限定されるものではないが、本明細書に記載されている組成物は、１つ以上のトール様受容体の活性をモジュレートし得る（例えば、コンジュゲートは、アゴニスト、アンタゴニスト、または両方である）。「トール様受容体」（ＴＬＲ）という用語は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）に結合し、かつ哺乳動物において免疫応答を促進する受容体のファミリーのメンバーを意味する。１０種の哺乳動物ＴＬＲ、例えば、ＴＬＲ１〜１０が公知である。「トール様受容体アゴニスト」（ＴＬＲアゴニスト）という用語は、ＴＬＲと相互作用し、かつ受容体の活性を刺激する分子を意味する。合成ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲと相互作用し、受容体の活性を刺激するように設計された化合物である。「トール様受容体アンタゴニスト」（ＴＬＲアンタゴニスト）という用語は、ＴＬＲと相互作用し、受容体のシグナル伝達活性を阻害または中和する分子を意味する。合成ＴＬＲアンタゴニストは、ＴＬＲと相互作用し、受容体の活性を妨げるように設計された化合物である。ＴＬＲのアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−３またはＴＬＲ−９の活性をモジュレートすることがある。ＴＬＲの局所活性化は、悪性細胞の成長および生存のために必要ながん細胞−マトリックス相互作用を乱し、アポトーシスを誘発し得る。

【0028】

また、理論に限定されるものではないが、本明細書において提供する化合物は、有利な安定性を有するものとして特性決定することができる。例えば、本明細書に記載されている特定の化合物は、生理学的条件下で有利な化学的安定性および／または代謝安定性を有するものとして特性決定することができる。

【0029】

化合物
本明細書において使用する場合、「アルキル」、「アルケニル」および「アルキニル」という用語には、これらが非置換であるときＣおよびＨ原子のみを含有する、直鎖（本明細書において「線状」と称される）、分岐鎖（本明細書において「非線状」と称される）、環状の一価ヒドロカルビルラジカル、およびこれらの組合せが含まれる。アルキル部分の非限定的例には、メチル、エチル、イソブチル、シクロヘキシル、シクロペンチルエチル、２−プロペニル、３−ブチニルなどが含まれる。各々のこのような基中の炭素原子の総数は、本明細書に記載されていることがあり、例えば、基が１０個までの炭素原子を含有することができるとき、１〜１０ＣまたはＣ１〜Ｃ１０またはＣ１〜１０と表すことができる。ヘテロ原子（典型的にはＮ、ＯおよびＳ）が、例えば、ヘテロアルキル基におけるように、炭素原子を置き換えることが可能であるとき、基を記載する数は、例えば、Ｃ１〜Ｃ６とまだ記載されていても、基中の炭素原子の数、および記載されている環または鎖の骨格中の炭素原子の代わりとして含められるこのようなヘテロ原子の数の合計を表す。ＣおよびＨ原子のみを含有し、非置換であるアルキルは、「飽和」と称されることがある。アルケニルまたはアルキニルは一般に、各々、１個以上の二重結合または三重結合を含有するため「不飽和」である。アルケニルは、例えば、任意の数の二重結合（１個、２個、３個、４個または５個の二重結合など）を含むことができる。アルキニルは、例えば、任意の数の三重結合（１個、２個、３個、４個または５個の三重結合など）を含むことができる。

【0030】

アルキル、アルケニルおよびアルキニル置換基は、１〜１０Ｃ（アルキル）または２〜１０Ｃ（アルケニルもしくはアルキニル）を含有することがある。これらは、いくつかの実施形態において、１〜８Ｃ（アルキル）または２〜８Ｃ（アルケニルもしくはアルキニル）を含有することができる。これらは、１〜４Ｃ（アルキル）または２〜４Ｃ（アルケニルもしくはアルキニル）を含有することがある。単一の基は、複数のタイプの多重結合、または複数の多重結合を含むことができる。このような基は、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含有するとき、「アルケニル」という用語の定義内に含まれ、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を含有するとき、「アルキニル」という用語内に含まれる。

【0031】

アルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、このような置換が合成されることができ、存在することができる範囲内において任意選択で置換されることが多い。典型的な置換基には、これらに限定されないが、ハロ、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ、＝ＮＲ、ＯＲ、ＮＲ_２、ＳＲ、ＳＯ_２Ｒ、ＳＯ_２ＮＲ_２、ＮＲＳＯ_２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ_２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ_２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲ、およびＮＯ_２が含まれ、各Ｒは、独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、またはＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリールであり、各Ｒは、ハロ、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ’、＝ＮＲ’、ＯＲ’、ＮＲ’_２、ＳＲ’、ＳＯ_２Ｒ’、ＳＯ_２ＮＲ’_２、ＮＲ’ＳＯ_２Ｒ’、ＮＲ’ＣＯＮＲ’_２、ＮＲ’ＣＯＯＲ’、ＮＲ’ＣＯＲ’、ＣＮ、ＣＯＯＲ’、ＣＯＮＲ’_２、ＯＯＣＲ’、ＣＯＲ’、およびＮＯ_２で任意選択で置換されており、各Ｒ’は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールまたはＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリールである。アルキル、アルケニルおよびアルキニル基はまた、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールまたはＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリールで置換されていてもよく、これらの各々は、特定の基に適当である置換基で置換されていてもよい。

【0032】

「アセチレン」置換基は、任意選択で置換されており、式−Ｃ≡Ｃ−Ｒｉである、２〜１０Ｃアルキニル基であり、Ｒｉは、ＨまたはＣ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ１〜Ｃ８アシル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ７〜Ｃ１２アリールアルキル、もしくはＣ６〜Ｃ１２ヘテロアリールアルキルであり、各Ｒｉ基は、ハロ、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ’、＝ＮＲ’、ＯＲ’、ＮＲ’２、ＳＲ’、ＳＯ_２Ｒ’、ＳＯ_２ＮＲ’_２、ＮＲ’ＳＯ_２Ｒ’、ＮＲ’ＣＯＮＲ’_２、ＮＲ’ＣＯＯＲ’、ＮＲ’ＣＯＲ’、ＣＮ、ＣＯＯＲ’、ＣＯＮＲ’_２、ＯＯＣＲ’、ＣＯＲ’、およびＮＯ_２から選択される１つ以上の置換基で任意選択で置換されており、各Ｒ’は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アシル、Ｃ２〜Ｃ６ヘテロアシル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ７〜１２アリールアルキル、またはＣ６〜１２ヘテロアリールアルキルであり、これらの各々は、ハロ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４ヘテロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アシル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアシル、ヒドロキシ、アミノ、および＝Ｏから選択される１つ以上の基で任意選択で置換されており、２つのＲ’は連結されて、任意選択でＮ、ＯおよびＳから選択される３個までのヘテロ原子を含有する、３〜７員環を形成することができる。いくつかの実施形態において、−Ｃ≡Ｃ−ＲｉのＲｉは、ＨまたはＭｅである。

【0033】

「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」、および「ヘテロアルキニル」などは、相当するヒドロカルビル（アルキル、アルケニルおよびアルキニル）基と同様に定義されるが、「ヘテロ」という用語は、骨格残基内に１個〜３個のＯ、ＳもしくはＮであるヘテロ原子またはこれらの組合せを含有する基を意味し、したがって、相当するアルキル、アルケニル、またはアルキニル基の少なくとも１個の炭素原子は、特定したヘテロ原子の１つによって置き換えられ、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニル基が形成される。アルキル、アルケニルおよびアルキニル基のヘテロ形態についての典型的および好ましいサイズは一般に、相当するヒドロカルビル基についてと同じであり、ヘテロ形態上に存在し得る置換基は、ヒドロカルビル基について上記で記載したものと同じである。化学的安定性のために、他に特定しない限り、このような基は、オキソ基がニトロまたはスルホニル基におけるようにＮまたはＳ上に存在する場合を除いて、２個超の近接するヘテロ原子を含まないことがまた理解される。

【0034】

「アルキル」には、本明細書において使用する場合、シクロアルキルおよびシクロアルキルアルキル基が含まれる一方、「シクロアルキル」という用語は、本明細書において環炭素原子を介して連結している炭素環式非芳香族基を記載するために使用してもよく、「シクロアルキルアルキル」は、アルキルリンカーを介して分子に連結している炭素環式非芳香族基を記載するために使用してもよい。同様に、「ヘテロシクリル」は、環員として少なくとも１個のヘテロ原子を含有し、かつＣまたはＮでよい環原子を介して分子に連結している非芳香族環式基を記載するために使用し得る。「ヘテロシクリルアルキル」は、リンカーを介して別の分子に連結しているそのような基を記載するために使用し得る。シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、およびヘテロシクリルアルキル基に適したサイズおよび置換基は、アルキル基について上記で記載したものと同じである。本明細書において使用する場合、これらの用語はまた、環が芳香族でない限り、１つまたは２つの二重結合を含有する環を含む。

【0035】

本明細書において使用する場合、「アシル」は、カルボニル炭素原子の２つの利用可能な原子価位置の１つに結合しているアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアリールアルキルラジカルを含む基を包含し、ヘテロアシルとは、カルボニル炭素以外の少なくとも１個の炭素が、Ｎ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子で置き換えられている相当する基を意味する。したがって、ヘテロアシルには、例えば、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲおよび−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ_２ならびに−Ｃ（＝Ｏ）−ヘテロアリールが含まれる。

【0036】

アシルおよびヘテロアシル基は、これらがカルボニル炭素原子の開放原子価を介して結合している任意の基または分子に結合している。典型的には、これらは、Ｃ１〜Ｃ８アシル基（ホルミル、アセチル、ピバロイル、およびベンゾイルを含む）、ならびにＣ２〜Ｃ８ヘテロアシル基（メトキシアセチル、エトキシカルボニル、および４−ピリジノイルを含む）である。アシルまたはヘテロアシル基を含む、ヒドロカルビル基、アリール基、およびこのような基のヘテロ形態は、アシルまたはヘテロアシル基の相当する構成成分の各々のために一般に適切な置換基として本明細書に記載されている置換基で置換することができる。

【0037】

「芳香族」部分または「アリール」部分は、芳香族性の周知の特徴を有する単環式または縮合二環式部分を意味する。例には、フェニルおよびナフチルが含まれる。同様に、「複素環式芳香族化合物」および「ヘテロアリール」とは、環員としてＯ、ＳおよびＮから選択される１個以上のヘテロ原子を含有する、このような単環式または縮合二環式環系を意味する。ヘテロ原子を含むことによって、５員環ならびに６員環において芳香族性が可能となる。典型的な芳香族複素系には、単環式Ｃ５〜Ｃ６芳香族基（ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、チエニル、フラニル、ピロリル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、およびイミダゾリルなど）、ならびにこれらの単環式基の１つと、フェニル環とを、または芳香族複素単環式基のいずれかとを縮合させることによって形成される縮合二環式部分（Ｃ８〜Ｃ１０二環式基（インドリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、イソキノリル、キノリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、ピラゾロピリジル、キナゾリニル、キノキサリニル、シンノリニルなど）が形成される）が含まれる。環系に亘る電子分布に関して芳香族性の特徴を有する任意の単環式または縮合環二環式系は、この定義に含まれる。この定義はまた、少なくとも、分子の残りの部分に直接結合している環が、芳香族性の特徴を有する二環式基を含む。典型的には、環系は、５〜１２個の環員原子を含有する。単環式ヘテロアリールは、５〜６環員を含有することがあり、二環式ヘテロアリールは、８〜１０環員を含有することがある。

【0038】

アリールおよびヘテロアリール部分は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ５〜Ｃ１２アリール、Ｃ１〜Ｃ８アシル、およびこれらのヘテロ形態を含めた種々の置換基（これらの各々は、それ自体がさらに置換されていてもよい）で置換されていてもよい。アリールおよびヘテロアリール部分についての他の置換基には、ハロ、ＯＲ、ＮＲ_２、ＳＲ、ＳＯ_２Ｒ、ＳＯ_２ＮＲ_２、ＮＲＳＯ_２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ_２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ_２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲ、およびＮＯ_２が含まれ、各Ｒは、独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ７〜Ｃ１２アリールアルキル、またはＣ６〜Ｃ１２ヘテロアリールアルキルであり、各Ｒは、アルキル基について上記のように、任意選択で置換されている。アリールまたはヘテロアリール基上の置換基は、このような置換基の各タイプまたは置換基の各構成成分に適したものとして、本明細書に記載されている基でさらに置換されていてもよい。したがって、例えば、アリールアルキル置換基は、アリール部分上でアリール基に典型的な置換基で置換されていてもよく、アルキル部分上でアルキル基に典型的または適した置換基でさらに置換されていてもよい。

【0039】

同様に、「アリールアルキル」および「ヘテロアリールアルキル」とは、置換または非置換、飽和または不飽和の環状または非環状リンカーを含めた連結基（アルキレンなど）を介してそれらの結合ポイントに結合している芳香族環系および芳香族複素環系を意味する。リンカーは、Ｃ１〜Ｃ８アルキルまたはそのヘテロ形態であることが多い。これらのリンカーはまた、カルボニル基を含んでもよく、したがって、これによってこれらのリンカーがアシルまたはヘテロアシル部分として置換基を提供することが可能となる。アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル基中のアリールまたはヘテロアリール環は、アリール基について上記で記載した同じ置換基で置換されていてもよい。アリールアルキル基は、アリール基について上記で定義した基で任意選択で置換されているフェニル環、および非置換であるかまたは１つもしくは２つのＣ１〜Ｃ４アルキル基もしくはヘテロアルキル基で置換されているＣ１〜Ｃ４アルキレンを含むことがあり、アルキルまたはヘテロアルキル基は、任意選択で環化し、環（シクロプロパン、ジオキソラン、またはオキサシクロペンタンなど）を形成することができる。同様に、ヘテロアリールアルキル基は、アリール基上の典型的な置換基として上記に記載した基の１つ以上で任意選択で置換されているＣ５〜Ｃ６単環式ヘテロアリール基、および非置換であるＣ１〜Ｃ４アルキレンを含むことが多い。ヘテロアリールアルキル基は、１つまたは２つのＣ１〜Ｃ４アルキル基またはヘテロアルキル基で置換されていることがあり、あるいは任意選択で置換されているフェニル環またはＣ５〜Ｃ６単環式ヘテロアリール、および非置換であるか、または１つもしくは２つのＣ１〜Ｃ４アルキルもしくはヘテロアルキル基で置換されているＣ１〜Ｃ４ヘテロアルキレンを含み、アルキルまたはヘテロアルキル基は、任意選択で環化し、環（シクロプロパン、ジオキソラン、またはオキサシクロペンタンなど）を形成することができる。

【0040】

アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル基が任意選択で置換されていると記載されている場合、置換基は、基のアルキルもしくはヘテロアルキル部分上、またはアリールもしくはヘテロアリール部分上にあってよい。アルキルまたはヘテロアルキル部分上に任意選択で存在する置換基は、アルキル基について上記で記載したものと同じであることがあり、アリールまたはヘテロアリール部分上に任意選択で存在する置換基は、一般にアリール基について上記で記載したものと同じであることが多い。

【0041】

「アリールアルキル」基は、本明細書において使用する場合、これらが非置換である場合、ヒドロカルビル基であり、環およびアルキレンまたは同様のリンカー中の炭素原子の総数によって記載される。したがって、ベンジル基は、Ｃ７−アリールアルキル基であり、フェニルエチルは、Ｃ８−アリールアルキルである。

【0042】

上記のような「ヘテロアリールアルキル」とは、連結基を介して結合しており、かつアリール部分の少なくとも１個の環原子または連結基中の１個の原子が、Ｎ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子であるという点で「アリールアルキル」と異なるアリール基を含む部分を意味する。ヘテロアリールアルキル基は、環中およびリンカー中を合わせた原子の総数によって本明細書に記載されており、これらには、ヘテロアルキルリンカーを介して連結しているアリール基；ヒドロカルビルリンカー（アルキレンなど）を介して連結しているヘテロアリール基；およびヘテロアルキルリンカーを介して連結しているヘテロアリール基が含まれる。したがって、例えば、Ｃ７−ヘテロアリールアルキルには、ピリジルメチル、フェノキシ、およびＮ−ピロリルメトキシが含まれる。

【0043】

「アルキレン」とは、本明細書において使用する場合、二価のヒドロカルビル基を意味する。アルキレンは二価であるため、２つの他の基を一緒に連結することができる。アルキレンは、−（ＣＨ_２）_ｎ−（ｎは、１〜２０、１〜１０、１〜８、または１〜４でよい）と称されることが多いが、特定される場合、アルキレンはまた、他の基で置換することができ、他の長さでもよく、開放原子価は、鎖の反対端にある必要はない。したがって、−ＣＨ（Ｍｅ）−および−Ｃ（Ｍｅ）_２−をまたアルキレンと称してもよく、シクロプロパン−１，１−ジイルなどの環式基も同様である。アルキレン基が置換されている場合、置換基は、本明細書に記載のようなアルキル基上に典型的には存在するものを含む。

【0044】

適切なリンカーを利用して、リン脂質類似体（例えば、Ｘ^２）を構築することができ、複数のリンカーが公知である。リンカーの非限定的例には、−（Ｙ）_ｙ−、−（Ｙ）_ｙ−Ｃ（Ｏ）Ｎ−（Ｚ）_ｚ−、−（ＣＨ_２）_ｙ−Ｃ（Ｏ）Ｎ−（ＣＨ_２）_ｚ−、−（Ｙ）_ｙ−ＮＣ（Ｏ）−（Ｚ）_ｚ−、−（ＣＨ_２）_ｙ−ＮＣ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｚ−が含まれ、各ｙ（下付き文字）およびｚ（下付き文字）は、独立に、０〜２０であり、各ＹおよびＺは、独立に、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環式、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環式、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｈｅｔ、Ｈｅｔ Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシカルボニルであり、アルキル、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、Ｈｅｔ、アリールまたは複素環式基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ９複素環式、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである。特定の実施形態において、リンカーは、−Ｃ（Ｙ’）（Ｚ’）−Ｃ（Ｙ’’）（Ｚ’’）−リンカーであることがあり、各Ｙ’、Ｙ’’、Ｚ’およびＺ’’は、独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ５〜Ｃ９複素環式、置換Ｃ５〜Ｃ９複素環式、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｈｅｔ、Ｈｅｔ Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシカルボニルであり、アルキル、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、Ｈｅｔ、アリールまたは複素環式基上の置換基は、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ヒドロキシルＣ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ９複素環式、Ｃ１〜６アルコキシＣ１〜６アルケニル、アミノ、シアノ、ハロゲンまたはアリールである。利用することができるリンカーの特定の非限定的例には、下記が含まれる。

【0045】

【化4】

【0046】

いくつかの実施形態において、適切な血漿安定性をもたらすリンカーが選択される。適切な安定性は、約６０％以上（例えば、約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％）のコンジュゲート類似体がヒト血漿と約３００分接触した後に存在することがあることである。

【0047】

一般に、置換基中に含有される、任意のアルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、またはアリールもしくはアリールアルキル基、またはこれらの基の１つの任意のヘテロ形態は、それ自体がさらなる置換基で任意選択で置換されていてもよい。置換基がその他で記載されていない場合、これらの置換基の性質は、一次置換基自体に関して記載したものと同様である。したがって、例えば、Ｒ^１がアルキルである実施形態の場合、このアルキルは、Ｒ^１についての実施形態として一覧表示されている残りの置換基によって任意選択で置換されていてもよく、これは化学的に道理にかなっており、これは、アルキル自体について提供されるサイズ限界を損なわない。例えば、アルキルでまたはアルケニルで置換されているアルキルは、これらの実施形態についての炭素原子の上限を単純に拡張し、含まれない。しかし、アリール、アミノ、アルコキシ、＝Ｏなどで置換されているアルキルは本発明の範囲内に含まれ、これらの置換基の原子は、記載されているアルキル、アルケニルなどの基を記載するために使用される数にカウントされない。置換基の数が特定されていない場合、各々のこのようなアルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、またはアリール基は、その利用可能な原子価によっていくつかの置換基で置換されていてもよい。特に、これらの基のいずれかは、例えば、その利用可能な原子価のいずれかまたは全てにおいてフッ素原子で置換されていてもよい。

【0048】

「ヘテロ形態」とは、本明細書において使用する場合、指定した炭素環基の少なくとも１個の炭素原子が、Ｎ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子で置き換えられている、アルキル、アリール、またはアシルなどの基の誘導体を意味する。したがって、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、アリール、およびアリールアルキルのヘテロ形態は、各々、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロアシル、ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルである。オキソ基がＮまたはＳに結合しており、ニトロまたはスルホニル基を形成する場合を除いて、２個以下のＮ、ＯまたはＳ原子が、逐次的に通常連結していることが理解される。ヘテロ形態部分は、本明細書において「Ｈｅｔ」と称されることがある。

【0049】

「ハロ」または「ハロゲン」には、本明細書において使用する場合、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードが含まれる。フルオロおよびクロロが好ましいことが多い。「アミノ」は、本明細書において使用する場合、ＮＨ_２を意味するが、アミノが「置換されている」または「任意選択で置換されている」と記載されている場合、この用語は、ＮＲ’Ｒ’’を含み、各Ｒ’およびＲ’’は、独立にＨであり、あるいはアルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、アリール、もしくはアリールアルキル基、またはこれらの基の１つのヘテロ形態であり、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、アリール、もしくはアリールアルキル基、またはこれらの基の１つのヘテロ形態の各々は、相当する基について適切であると本明細書に記載されている置換基で任意選択で置換されている。この用語はまた、Ｒ’およびＲ’’が一緒に連結し、３〜８員環を形成する形態を含み、３〜８員環は、飽和、不飽和または芳香族でよく、かつ環員としてＮ、ＯおよびＳから独立に選択される１〜３個のヘテロ原子を含有し、かつアルキル基について適切であると記載されている置換基で任意選択で置換されており、または、ＮＲ’Ｒ’’が芳香族基である場合、これはヘテロアリール基について典型的であると記載されている置換基で任意選択で置換されている。

【0050】

本明細書において使用する場合、「炭素環」という用語は、環中に炭素原子のみを含有する環式化合物を意味し、一方、「複素環」とは、ヘテロ原子を含む環式化合物を意味する。炭素環および複素環構造は、単環式、二環式または複数の環系を有する化合物を包含する。本明細書において使用する場合、「ヘテロ原子」という用語は、炭素または水素でない任意の原子（窒素、酸素または硫黄など）を意味する。複素環の実例には、これらに限定されないが、テトラヒドロフラン、１，３ジオキソラン、２，３ジヒドロフラン、ピラン、テトラヒドロピラン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、１，３ジヒドロイソベンゾフラン、イソオキサゾール、４，５ジヒドロイソオキサゾール、ピペリジン、ピロリジン、ピロリジン２オン、ピロール、ピリジン、ピリミジン、オクタヒドロピロロ［３，４ｂ］ピリジン、ピペラジン、ピラジン、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、イミダゾリジン２，４ジオン、１，３ジヒドロベンゾイミダゾール２オン、インドール、チアゾール、ベンゾチアゾール、チアジアゾール、チオフェン、テトラヒドロチオフェン１，１ジオキシド、ジアゼピン、トリアゾール、グアニジン、ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン、２，５ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン、２，３，４，４ａ，９，９ａヘキサヒドロ１Ｈβカルボリン、オキシラン、オキセタン、テトラヒドロピラン、ジオキサン、ラクトン、アジリジン、アゼチジン、ピペリジン、ラクタムが含まれ、ヘテロアリールをまた包含し得る。ヘテロアリールの他の実例には、これらに限定されないが、フラン、ピロール、ピリジン、ピリミジン、イミダゾール、ベンゾイミダゾールおよびトリアゾールが含まれる。

【0051】

場合によっては、本明細書に記載されている化合物は、１つ以上のキラル中心を含有する。この技術は、異なる程度のキラル純度の、単離した立体異性体の形態の各々、ならびに立体異性体の混合物（ラセミ混合物を含めた）を含む。この技術はまた、形成することができる様々なジアステレオマーおよび互変異性体を包含する。本明細書に記載されている化合物はまた、１つ以上の互変異性型で存在し得る。例えば、Ｒが−ＯＨであるとき、本明細書に記載されている化合物は、１つ以上の互変異性型で存在し得る。本明細書に記載されている化合物は、特定の塩として存在することができる。薬学的に許容される塩の非限定的例は、本明細書に記載されている。

【0052】

「任意選択で置換されている」という用語は、本明細書において使用する場合、記載されている特定の基（複数可）が、非水素置換基を有さなくてもよく、または基（複数可）が、１つ以上の非水素置換基を有してもよいことを示す。他に特記されない限り、存在し得るこのような置換基の総数は、記載されている基の非置換形態上に存在するＨ原子の数に等しい。任意選択の置換基が二重結合を介して結合している場合（カルボニル酸素（＝Ｏ）など）、基は、２つの利用可能な原子価を占め、そのため含まれてもよい置換基の総数は、利用可能な原子価の数によって減少する。

【0053】

リン脂質類似体ファルマコフォア
特定の実施形態において提供するのは、式Ｅによる化合物、
Ｐ^１−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｒ^３（式Ｅ）
または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を含む組成物であり、式中、Ｘ^２、Ｘ^３およびＲ^３は、上記の通りであり、Ｐ^１は、ファルマコフォアである。

【0054】

いくつかの実施形態においてまた提供するのは、式Ｆもしくは式Ｇによる化合物、

【0055】

【化5】

【0056】

または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を含む組成物であり、式中、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｒ^３、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、上記の通りであり、Ｐ^１は、ファルマコフォアである。

【0057】

式Ｅ、ＦまたはＧによる構造を有する化合物に関して、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、特定の実施形態において、独立に、線状および飽和Ｃ６〜Ｃ３０アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、同じまたは異なる。いくつかの実施形態において、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、独立に、１個、２個、３個、４個または５個の二重結合（例えば、不飽和）を含む。特定の実施形態において、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、エポキシ部分で置換されておらず、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、ヒドロキシル部分で置換されていないことがある。特定の実施形態において、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、エポキシ部分でもヒドロキシル部分でも置換されていない。様々な実施形態において、Ｒ^ｄおよびＲ^ｅは、二重結合（例えば、不飽和）を含まない。

【0058】

式Ｅ、ＦまたはＧによる構造を有する化合物に関して、ファルマコフォアＰ^１は、免疫刺激性活性を示す任意の分子でよい。特定の実施形態において、ファルマコフォアＰ^１は、式Ｈによる構造、

【0059】

【化6】

【0060】

または薬学的に許容されるその塩を有し、リン脂質、またはリン脂質様構造は、任意の適切な連結ポイントにおいてファルマコフォアに連結しており、
式Ｈ中のＲ^１０、Ｒ^２０、およびＲ^３０は、各々独立に、水素；３個、４個、もしくは５個の炭素原子の環状アルキル；１個〜約１０個の炭素原子を含有する直鎖もしくは分岐鎖アルキル、および１個〜約１０個の炭素原子を含有する置換直鎖もしくは分岐鎖アルキル（置換基は、３個〜約６個の炭素原子を含有するシクロアルキル、および１個〜約４個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖アルキルで置換されている３個〜約６個の炭素原子を含有するシクロアルキルからなる群から選択される）；１個〜約１０個の炭素原子および１個以上のフッ素または塩素原子を含有するフルオロもしくはクロロアルキル；２個〜約１０個の炭素原子を含有する直鎖もしくは分岐鎖アルケニル、および２個〜約１０個の炭素原子を含有する置換直鎖もしくは分岐鎖アルケニル（置換基は、３個〜約６個の炭素原子を含有するシクロアルキル、および１個〜約４個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖アルキルで置換されている３個〜約６個の炭素原子を含有するシクロアルキルからなる群から選択される）；１個〜約６個の炭素原子のヒドロキシアルキル；アルコキシアルキル（アルコキシ部分は、１個〜約４個の炭素原子を含有し、アルキル部分は、１個〜約６個の炭素原子を含有する）；アシルオキシアルキル（アシルオキシ部分は、２個〜約４個の炭素原子のアルカノイルオキシまたはベンゾイルオキシであり、アルキル部分は、１個〜約６個の炭素原子を含有し、ただし、任意のこのようなアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、またはアシルオキシアルキル基は、窒素原子に直接結合した完全に炭素置換された炭素原子を有さない）；ベンジル；（フェニル）エチル；ならびにフェニル（前記ベンジル、（フェニル）エチルまたはフェニル置換基は、ベンゼン環上において１個〜約４個の炭素原子のアルキル、１個〜約４個の炭素原子のアルコキシ、およびハロゲンからなる群から独立に選択される１つまたは２つの部分で任意選択で置換されており、ただし、前記ベンゼン環が、前記部分の２つで置換されているとき、それらの部分は一緒になって、６個以下の炭素原子を含有する）；−ＣＨＲ_ｘＲ_ｙ［Ｒ_ｙは、水素または炭素−炭素結合であり、ただし、Ｒ_ｙが水素であるとき、Ｒ_ｘは、１個〜約４個の炭素原子のアルコキシ、１個〜約４個の炭素原子のヒドロキシアルコキシ、２個〜約１０個の炭素原子の１−アルキニル、テトラヒドロピラニル、アルコキシアルキル（アルコキシ部分は、１個〜約４個の炭素原子を含有し、アルキル部分は、１個〜約４個の炭素原子を含有する）、２−、３−、または４−ピリジルであり、さらにただし、Ｒ_ｙが炭素−炭素結合であるとき、Ｒ_ｙおよびＲ_ｘは一緒になって、１個〜約４個の炭素原子のヒドロキシまたはヒドロキシアルキル、１個〜約８個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖アルキル、１個〜約６個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖ヒドロキシアルキル、モルホリノメチル、ベンジル、（フェニル）エチルおよびフェニルからなる群から独立に選択される１個以上の置換基で任意選択で置換されているテトラヒドロフラニル基を形成し、ベンジル、（フェニル）エチルまたはフェニル置換基は、ベンゼン環上でメチル、メトキシ、またはハロゲンからなる群から選択される部分で任意選択で置換されている］；または
−Ｃ（Ｒ_Ｓ）（Ｒ_Ｔ）（Ｘ）（Ｒ_ＳおよびＲ_Ｔは、水素、１個〜約４個の炭素原子のアルキル、フェニル、および置換フェニル（置換基は、１個〜約４個の炭素原子のアルキル、１個〜約４個の炭素原子のアルコキシ、およびハロゲンからなる群から選択される）からなる群から独立に選択される）であり、
Ｘは、１個〜約４個の炭素原子を含有するアルコキシ、アルコキシアルキル（アルコキシ部分は、１個〜約４個の炭素原子を含有し、アルキル部分は、１個〜約４個の炭素原子を含有する）、１個〜約４個の炭素原子のハロアルキル、アルキルアミド（アルキル基は、１個〜約４個の炭素原子を含有する）、アミノ、置換アミノ（置換基は、１個〜約４個の炭素原子のアルキルもしくはヒドロキシアルキルである）、アジド、１個〜約４個の炭素原子のアルキルチオ、またはモルホリノアルキル（アルキル部分は、１個〜約４個の炭素原子を含有する））であり、
式ＨにおけるＲ^４０は、水素、Ｃ_１〜８アルキル、Ｃ_１〜８アルコキシ、またはハロであり、
式Ｈにおけるｎｎは、１、２、３、または４であり、
式ＨにおけるＲ^ａａおよびＲ^ｂｂは、各々独立に、水素、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル、ヒドロキシ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル、アダマンチル、アダマンチル（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル、アミノ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル、アミノスルホニル、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルカノイル、アリール、もしくはベンジルであり、またはＲ^ａａおよびＲ^ｂｂは、それらが結合している窒素と一緒になって、ピロリジノ、ピペリジノ、もしくはモルホリノ基を形成し、
式Ｈの５員環における破線は、５員環の窒素を、５員環の２個の窒素の間にある炭素と連結する任意選択の結合を示し、結合が存在するとき、Ｒ^１０またはＲ^３０は存在しない。

【0061】

いくつかの実施形態において、式ＨにおけるＲ^ａａまたはＲ^ｂｂの１つは、独立に、−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｒ^３であり、または式Ｃもしくは式Ｄによる構造を有し、他方のＲ^ａａまたはＲ^ｂｂは、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシである。

【0062】

特定の実施形態において、ファルマコフォアＰ^１は、式Ｉによる構造、

【0063】

【化7】

【0064】

または薬学的に許容されるその塩を有し、リン脂質、またはリン脂質様構造は、任意の適切な連結ポイントにおいてファルマコフォアに連結しており、Ｒ^ａａおよびＲ^ｂｂは、上記に定義されている通りである。いくつかの実施形態において、式ＩにおけるＲ^ａａまたはＲ^ｂｂの１つは、−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｒ^３であり、または式Ｃもしくは式Ｄによる構造を有し、他方のＲ^ａａまたはＲ^ｂｂは、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシである。

【0065】

また式Ｅ、ＦまたはＧによる構造を有する化合物に関して、ファルマコフォアＰ^１は、特定の実施形態において、式Ｊまたは式Ｋによる構造、

【0066】

【化8】

【0067】

または薬学的に許容されるその塩を有し、リン脂質、またはリン脂質様構造は、任意の適切な連結ポイントでファルマコフォアに連結しており、Ｒ^４０、ｎｎ、Ｒ^ａａおよびＲ^ｂｂは、上記に定義されている通りであり、Ｒ^ｃｃは、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシである。いくつかの実施形態において、式Ｊまたは式Ｋ中のＲ^ａａまたはＲ^ｂｂの１つは、−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｒ^３でありまたは式Ｃもしくは式Ｄによる構造を有し、他方のＲ^ａａまたはＲ^ｂｂは、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシである。後者の実施形態において、Ｒ^ｃｃは、水素であることがある。特定の実施形態において、式Ｊまたは式Ｋ中のＲ^ｃｃは、−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｒ^３であり、または式Ｃもしくは式Ｄによる構造を有する。後者の実施形態において、Ｒ^ａａまたはＲ^ｂｂは、独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシである。

【0068】

医薬組成物および製剤
本明細書に記載されている化合物は、薬学的に許容される塩として調製することができる。本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、親化合物がその酸性または塩基性塩を作製することによって修飾される、開示された化合物の誘導体を意味する。薬学的に許容される塩の例には、これらに限定されないが、塩基性残基（アミンなど）の鉱酸塩または有機酸塩；酸性残基（カルボン酸など）のアルカリ塩または有機塩などが含まれる。薬学的に許容される塩には、例えば、無毒性の無機酸または有機酸から形成される親化合物の、従来の無毒性塩または第四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、従来の無毒性塩には、無機酸（塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸など）に由来するもの；および有機酸（酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸など）から調製される塩が含まれる。他の例において、従来の無毒性の塩には、塩基（水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、カフェイン、様々なアミンなど）に由来するものが含まれる。薬学的に許容される塩は、従来の化学的手法によって、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、このような塩は、水中でまたは有機溶媒中で、または２つの混合物中で、これらの化合物の遊離酸または遊離塩基形態と、化学量論量の適当な塩基または酸とを反応させることによって調製することができる。一般に、非水性媒体（エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような）が好ましい。適切な塩の一覧は、その開示が参照により本明細書に組み込まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１４１８頁（１９８５年）に見出される。

【0069】

「薬学的に許容される」という用語は、本明細書において使用する場合、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応、または妥当な便益／リスク比と釣り合った他の問題もしくは合併症を伴わずに、正しい医学的判断の範囲内で、人間および動物の組織と接触させる使用に適した化合物、材料、組成物、および／または剤形を意味する。

【0070】

「安定的な化合物」および「安定的な構造」という用語は、反応混合物からの有用な程度の純度への単離、および効果的な治療剤への製剤の後に残存するように十分に強い化合物を示すことを意味する。安定的な化合物は、記載された処置方法において使用するために本明細書において意図される。

【0071】

本明細書に記載されている化合物は、１種以上の他の薬剤と組み合わせて製剤することができる。１種以上の他の薬剤は、これらに限定されないが、本明細書に記載されている別の化合物、抗細胞増殖剤（例えば、化学療法剤）、抗炎症剤、および抗原を含むことができる。

【0072】

本明細書に記載されている化合物は、医薬組成物として製剤し、哺乳動物宿主（ヒト患者またはヒトではない動物など）に、選択した投与経路に適合した種々の形態で投与することができる。投与経路の非限定的例には、経口、非経口、静脈内、筋内、局部的、滴下注入（例えば、膀胱滴下注入）、皮下、皮内の経路が含まれる。特定の実施形態において、組成物は、例えば、小胞内で局所的に投与される。組成物は、賦形剤、および時にはアジュバント、担体（例えば、同化可能、食用）、緩衝液、保存剤などを含むことがある。化合物は、特定の実施形態において、リポソーム組成物中でまたはマイクロエマルジョンとしてまた投与することができる。様々な薬物の持続放出系がまた考案されてきており、本明細書に記載されている化合物に適用することができる。例えば、その方法が参照により本明細書中に組み込まれている米国特許第５，６２４，６７７号を参照されたい。

【0073】

被験体の膀胱への投与のために、いくつかの実施形態において、約１０ｎＭ〜約１０００ｎＭ、または約１００ｎＭ〜約１０，０００ｎＭの濃度の本明細書に記載されている化合物を送達し得る。特定の実施形態において、本明細書に記載されている組成物は、局所的に適用される超音波、電磁放射もしくは電気穿孔もしくは他の電気をベースとした薬物送達技術、局所的化学的摩耗、または局所的物理的摩耗と併せて投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている組成物は、（例えば、局所的に適用される）界面活性剤を含み、または界面活性剤と共に投与され、本明細書に記載されている化合物が膀胱粘膜を通る透過性を増強させる。特定の実施形態において、本明細書における組成物は、例えば、粒径、受容体多量体化または持続放出に起因し得るエンドソーム取込みの増強を実現する。

【0074】

本明細書に記載されている化合物はハードもしくはソフトシェルゼラチンカプセル剤中に封入してもよく、錠剤に圧縮してもよく、または患者の食事の食物に直接組み込んでもよい。経口治療のための投与のために、活性化合物は、１種以上の添加剤と組み合わせてもよく、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエファーなどの形態で使用し得る。このような組成物および調製品は、少なくとも０．１％の活性化合物を含有することがある。組成物および調製品の百分率は変化してもよく、所与の単位剤形の重量の約２％〜約６０％であることがある。このような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、有効量レベルが得られる量である。

【0075】

錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などはまた、下記を含有し得る。結合剤（トラガカントガム、アカシア、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなど）；添加剤（リン酸二カルシウムなど）；崩壊剤（トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、アルギン酸など）；滑沢剤（ステアリン酸マグネシウムなど）；および甘味剤（スクロース、フルクトース、ラクトースまたはアスパルテームなど）または香味剤（ペパーミント、冬緑油、またはサクランボ香味料など）を加えてもよい。単位剤形がカプセル剤であるとき、上記のタイプの材料に加えて、液体担体（植物油またはポリエチレングリコールなど）を含有し得る。様々な他の材料は、コーティングとして、または固体単位剤形の物理的形態を他の方法で修飾するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、ゼラチン、ワックス、セラックまたは糖などでコーティングし得る。シロップ剤またはエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてスクロースまたはフルクトース、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、色素、ならびに香味料（サクランボまたはオレンジフレーバーなど）を含有し得る。当然ながら、任意の単位剤形の調製において使用される任意の材料は、用いられる量において、薬学的に許容されおよび実質的に無毒性であるべきである。さらに、活性化合物は、持続放出調製品および器具中に組み込み得る。

【0076】

活性化合物は、注入または注射によって投与し得る。活性化合物または薬学的に許容されるその塩の溶液は、無毒性の界面活性剤と任意選択で混合して、水中で調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、およびこれらの混合物中で、ならびに油中で調製することができる。貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの調製品は、微小生物の成長を防止するための保存剤を含有することがある。

【0077】

医薬品剤形は、活性成分を含む無菌水溶液もしくは分散液または無菌粉末を含むことができ、これらは無菌溶液剤または分散剤の即時調製のために適合され、任意選択でリポソーム中にカプセル化される。最終的な剤形は、製造および貯蔵の条件下で、無菌流体であり、安定的であることがある。液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、無毒性グリセリルエステル、および適切なこれらの混合物を含む溶剤または液体分散媒でよい。例えば、リポソームを形成することによって、分散剤の場合は必要とされる粒径を維持することによって、または界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。微小生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。等張剤、例えば、糖、緩衝液または塩化ナトリウムは、いくつかの実施形態において含まれる。注射可能な組成物の長時間吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物において使用することによってもたらすことができる。無菌溶液剤は、必要とされる量の活性化合物を、時には上記で列挙した他の成分の１つ以上と共に適当な溶剤に組み込み、それに続く濾過滅菌によって調製されることが多い。無菌の注射可能な溶液剤の調製のための無菌粉末の場合、利用されることがある調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これによって従前に滅菌濾過した溶液中に存在する任意のさらなる所望の成分に加えて活性成分の粉末が生じる。

【0078】

局所投与のために、本明細書における化合物は、例えば、液体形態であるときに、純粋な形態で施し得る。しかし、化合物を、固体または液体でよい許容される担体と組み合わせて、組成物または製剤として投与することが一般に望ましい。有用な固体担体には、微粉化した固体（タルク、クレイ、微結晶性セルロース、シリカ、アルミナなど）が含まれる。有用な液体担体には、水、アルコールまたはグリコールまたは水−アルコール／グリコールブレンド、またはプロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｇｌｙｃｏｌ）／エチレングリコール（ｅｔｈｙｌｅｎｇｌｙｃｏｌ）中のリン脂質が含まれ、有用な液体担体において、任意選択で無毒性の界面活性剤の助けによって、本化合物を有効なレベルで溶解または分散することができる。アジュバント（香料およびさらなる抗菌剤など）を加えて、所与の使用のための特性を最適化することができる。生成した液体組成物は、包帯および他の手当用品を含浸させるのに使用する吸収パッドから施し、またはポンプタイプもしくはエアゾール噴霧器を使用して患部上に噴霧することができる。

【0079】

増粘剤（合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪アルコール、変性セルロースまたは変性鉱物材料など）をまた、液体担体と共に用いて、使用者の皮膚へ直接施すための、広げられるペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、セッケンなどを形成させることができる。

【0080】

ＴＬＲアゴニストまたはＴＬＲアンタゴニストとして作用する本明細書における化合物の能力は、Ｌｅｅら、ＰＮＡＳ、１００巻：６６４６頁（２００３年）によって開示されている手順を含めた公知の薬理学的モデルを使用して決定し得る。

【0081】

化合物の有用な投与量は、動物モデルにおける化合物のインビトロの活性、およびインビボの活性を比較することによって決定することができる。マウス、および他の動物、ヒトへの有効な投与量を推定する方法は、当技術分野では公知である。いくつかの実施形態において、液体組成物中の本明細書に記載されている化合物の濃度は、約０．１〜２５重量％、および時には約０．５〜１０重量％である。半固体または固体組成物（ゲルまたは粉末など）中の濃度は、時には約０．１〜５重量％、および時には約０．５〜２．５重量％である。

【0082】

処置において使用するのに必要な化合物、またはその活性塩もしくは誘導体の量は、選択された特定の塩によってだけでなく、投与経路、処置される状態の性質、ならびに患者の年齢および状態によっても変化し、最終的に担当の医師または臨床医の判断による。一般に、適切な用量は、１日当たり約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１０〜約７５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、例えば、１日当たり３〜約５０ｍｇ／キログラム（レシピエントの体重）であることがあり、６〜９０ｍｇ／ｋｇ／日、または約１５〜６０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であることが多い。適切な用量は一般に、１日当たり約１〜１５０ｍｇ／ｋｇ（レシピエントの体重）の範囲、例えば、約１０〜約１３０ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約１２０ｍｇ／ｋｇ、約５０〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約６０〜９０ｍｇ／ｋｇ、約６５〜８５ｍｇ／ｋｇ、または例えば、約８０ｍｇ／ｋｇ／日であることがある。化合物は、単位剤形で好都合に投与され、例えば、単位剤形毎に５〜１０００ｍｇ、または１０〜７５０ｍｇ、または５０〜５００ｍｇの活性成分を含有し得る。活性成分を投与して、約０．０１〜約１００ｐＭ、約０．５〜約７５ｐＭ、約１〜５０ｐＭ、または約２〜約３０ｐＭの活性化合物のピーク血漿濃度を達成することができる。このような濃度は、例えば、任意選択で食塩水中で、活性成分の０．０５〜５％溶液の静脈内注射、または約１〜１００ｍｇの活性成分を含有する急速投与として経口的に投与することによって達成し得る。望ましい血中濃度は、約０．０１〜５．０ｍｇ／ｋｇ／時間を実現する持続注入によって、または約０．４〜１５ｍｇ／ｋｇの活性成分（複数可）を含有する断続的注入によって維持し得る。所望の用量は、単回用量で、または適当な間隔で投与される分割用量として、例えば、１日当たり２つ、３つ、４つもしくはそれを超える部分用量として好都合に提示し得る。部分用量自体は、例えば、吸入器からの複数回の吸入または目へ複数の液滴を施すことなどにより、いくつかの別々の大まかに間隔を空けた投与にさらに分割し得る。

【0083】

処置
提供する組成物は、被験体において特定の状態の処置または予防に有用であり得る。特定の実施形態において、このような状態には、例えば、増殖性状態（がん、微生物感染、心臓の状態および肥満状態など）、炎症状態および自己免疫性状態が含まれる。

【0084】

「処置する」および「処置すること」という用語は、本明細書において使用する場合、（ｉ）病的状態が起こることを予防すること（例えば、予防法）；（ｉｉ）病的状態を阻害し、もしくはその発生を抑止すること；（ｉｉｉ）病的状態を軽減すること；ならびに／または（ｉｖ）疾患もしくは状態の症状を寛解、緩和、低下させ、取り除くことを意味する。本明細書に記載されている候補分子または化合物は、製剤または医薬品において治療有効量でよく、これは、例えば、生物学的作用（例えば、炎症の阻害）をもたらし、または疾患もしくは状態の症状の寛解、緩和、低下、軽減、減少させもしくは取り除くことをもたらすことができる量である。これらの用語はまた、細胞の増殖速度を減少もしくは停止させ（例えば、腫瘍成長を遅延または休止させ）、または増殖性がん細胞の数を減少させる（例えば、腫瘍の部分または全体を除去する）ことを意味することができる。本明細書に記載されている分子は、それを必要としている被験体に投与して、黒色腫を潜在的に処置することができる。このような処置において、「処置すること」、「処置」および「治療効果」という用語は、細胞増殖速度を減少または停止させ（例えば、腫瘍成長を遅延または休止させ）、増殖性がん細胞の数を減少させ（例えば、腫瘍の部分または全部を切除し）、黒色腫状態を完全にまたは部分的に緩和することを意味することができる。

【0085】

予防剤または治療剤でよい薬物は、本明細書に記載のような黒色腫を有する任意の適当な被験体に投与することができる。被験体の非限定的例には、哺乳動物、ヒト、類人猿、サル、有蹄動物（例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、バッファロー、ラクダなど）、イヌ、ネコ、げっ歯類（例えば、ネズミ、マウス、ラット）などが含まれる。被験体は、雄または雌でよく、薬物は、特定の年齢群（例えば、若年、小児、青年、成人などを含めた）の被験体に投与することができる。

【0086】

「治療有効量」という用語は、本明細書において使用する場合は、被験体において、疾患もしくは障害を処置もしくは予防し、または疾患もしくは障害の症状を処置するために、本明細書において提供する化合物の量、または本明細書において提供する化合物の組合せの量を意味する。本明細書において使用する場合、「被験体」および「患者」という用語は一般に、本明細書に記載されている方法による処置（例えば、本明細書に記載されている化合物の投与）をこれから受ける、または受けた個体を意味する。

【0087】

増殖性状態は、がんであることがある。がんおよび関連する障害は、上皮細胞起源のものであることがある。いくつかの実施形態において、増殖性状態は、血液と関連する（白血病など）。白血病および他の血液の状態の非限定的例には、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病（例えば、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病の白血病）および骨髄異形成症候群；慢性白血病（これらに限定されないが慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病など）；および真性赤血球増加症が含まれる。

【0088】

特定の実施形態において、増殖性状態は、リンパ腫として提示される。リンパ腫の非限定的例には、ホジキン病および非ホジキン病が含まれる。増殖性状態は、多発性骨髄腫であることがあり、この非限定的例には、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫および髄外性形質細胞腫が含まれる。増殖性状態は、いくつかの実施形態において、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症；良性単クローン性ガンマグロブリン血症；または重鎖病として提示される。

【0089】

増殖性状態は、いくつかの実施形態において、肉腫（例えば、骨または結合組織における）として提示される。肉腫の非限定的例には、骨肉腫、骨の肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨の線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟部組織肉腫、血管肉腫（血管の肉腫）、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫が含まれる。

【0090】

いくつかの実施形態において、増殖性状態は、脳の状態（例えば、脳腫瘍）として提示される。脳の増殖性状態の非限定的例には、神経膠腫、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、乏突起膠腫、非グリア腫瘍、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、脳松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、原発性脳リンパ腫が含まれる。

【0091】

増殖性状態は、いくつかの実施形態において、乳がんである。非限定的な乳がんには、腺管癌、腺癌、小葉（小細胞）癌、腺管内癌、髄様乳がん、粘液性乳がん、管状乳がん、乳頭乳がん、パジェット病、および炎症性乳がんが含まれる。特定の実施形態において、増殖性状態は、副腎がんとして提示される。副腎がんの非限定的例には、褐色細胞腫（ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍ）および副腎皮質癌が含まれる。増殖性状態は、これらに限定されないが、乳頭状または濾胞性甲状腺がん、甲状腺髄様がんおよび未分化甲状腺がんを含めた甲状腺がんとして提示されるであることがある。

【0092】

特定の実施形態において、増殖性状態は、これらに限定されないが、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイドまたは島細胞腫瘍を含めた膵臓がんとして提示される。増殖性状態は、いくつかの実施形態において、下垂体がんとして提示され、この非限定的例には、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、末端肥大症、および尿崩症（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎｓｉｐｉｕｓ）が含まれる。いくつかの実施形態において、増殖性状態は、これらに限定されないが、眼の黒色腫（虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫、および毛様体黒色腫（ｃｉｌｌｉａｒｙ ｂｏｄｙ ｍｅｌａｎｏｍａ）、および網膜芽細胞腫など）を含めた眼がんとして提示される。

【0093】

特定の実施形態における増殖性状態は、これらに限定されないが、扁平上皮細胞癌、腺癌、黒色腫、扁平上皮細胞癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、およびパジェット病を含むことができる腟がんまたは外陰部がんとして提示される。いくつかの実施形態において、増殖性状態は、子宮頸がんとして提示され、これらに限定されないが、扁平上皮細胞癌および腺癌を含むことができる。子宮がんはまた、これらに限定されないが、子宮内膜癌および子宮肉腫を含めた特定の増殖性状態の一形態である。増殖性状態は、卵巣がんであることがあり、この非限定的例には、卵巣上皮癌、境界型腫瘍、生殖細胞腫瘍、および間質腫瘍が含まれる。

【0094】

いくつかの実施形態において、増殖性状態は食道がんであり、この非限定的例には、扁平上皮がん、腺癌、腺様嚢胞癌、粘表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣贅癌、および燕麦細胞（小細胞）癌が含まれる。増殖性状態は、これらに限定されないが、腺癌、菌状発育性（ポリポイド）、潰瘍性、表在性拡大型、散在性拡大型、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および癌肉腫を含めた胃がんとして提示されることがある。増殖性状態は、結腸がんまたは直腸がんとして提示されることがある。いくつかの実施形態において、増殖性状態は肝臓がんであり、この非限定的例には、肝細胞癌および肝芽腫が含まれる。特定の実施形態における増殖性状態は、これらに限定されないが、腺癌を含めた胆嚢がんとして提示される。特定の実施形態において、増殖性状態は、例えば、胆管癌（例えば、乳頭状、結節性、およびびまん性）などの胆管がんとして提示される。

【0095】

増殖性状態は、いくつかの実施形態において、肺がんである。肺がんの非限定的例には、非小細胞肺がん、扁平上皮細胞癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌および小細胞肺がんが含まれる。特定の実施形態において、増殖性状態は、胚腫瘍、精上皮腫、未分化、古典的（典型的）、精母細胞性、非セミノーマ、胎児性癌、奇形腫癌または絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）などの睾丸がんとして提示される。増殖性状態は、いくつかの実施形態において、これらに限定されないが、前立腺上皮内異常増殖、腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫を含めた前立腺がんである。特定の実施形態において、増殖性状態は、陰茎がん（ｐｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）である。

【0096】

増殖性状態は、口腔がんであることがあり、この非限定的例には、扁平上皮細胞癌；基底細胞がん（ｂａｓａｌ ｃａｎｃｅｒｓ）；これらに限定されないが腺癌、粘表皮癌、および腺様嚢胞癌などの唾液腺がんが含まれる。いくつかの実施形態において、増殖性状態は、これらに限定されないが、扁平上皮細胞がんおよびいぼ状を含めた咽頭がんである。増殖性状態は、皮膚がんとして提示されることがあり、この非限定的例には、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、黒子悪性黒色腫、および末端黒子型黒色腫が含まれる。

【0097】

いくつかの実施形態において、増殖性状態は、腎細胞癌、腺癌、グラヴィッツ腫瘍（ｈｙｐｅｍｅｐｈｒｏｍａ）、線維肉腫、移行細胞がん（腎盂および／または尿管）、およびウィルムス腫瘍などの腎臓がんである。特定の実施形態において、増殖性状態は膀胱がんであり、この非限定的例には、表在性膀胱がん、移行上皮癌、扁平上皮細胞がん、腺癌および癌肉腫が含まれる。

【0098】

特定の実施形態において、増殖性状態は、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽細胞腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌および乳頭状腺癌；膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺および皮膚のものを含めた癌腫（例えば、扁平上皮細胞癌）；リンパ球系統の造血器腫瘍（白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫を含めた）；骨髄細胞系統の造血器腫瘍（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｃｔｉｃ ｔｕｍｏｒｓ）（急性および慢性骨髄性白血病ならびに前骨髄球性白血病（ｐｒｏｍｙｃｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）を含めた）；中枢および末梢神経系の腫瘍（星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、およびシュワン細胞腫を含めた）；間葉起源の腫瘍（線維肉腫、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓｃａｒａｍａ）、および骨の肉腫を含めた）；ならびに他の腫瘍（黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫（ｋｅｒａｔｏａｃｔａｎｔｈｏｍａ）、精上皮腫、甲状腺濾胞がんおよび奇形癌を含めた）から選択されるがんである。アポトーシスにおける異常によってもたらされるがんは、本明細書に記載されている組成物によって対処することができることがまた意図される。このようながんは、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を有する癌腫、乳房、前立腺および卵巣のホルモン依存性腫瘍、ならびに前がん病変（家族性腺腫性ポリポーシス、および骨髄異形成症候群など）を含んでもよいが、それだけに限られない。特定の実施形態において、悪性病変もしくは異常増殖性変化（化生および異形成など）、または高増殖性障害は、皮膚、肺、結腸、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、膵臓、卵巣、または子宮において処置または予防し得る。

【0099】

細胞増殖性状態はまた、例えば、後天性免疫不全症候群、アデノウイルス感染症、アルファウイルス感染症、アルボウイルス感染症、ボルナ病、ブニヤウイルス感染症、カリシウイルス感染症、水痘、コロナウイルス感染症、コクサッキーウイルス感染症、サイトメガロウイルス感染症、デング熱、ＤＮＡウイルス感染症、伝染性膿瘡（ｅｃｔｈｙｍａ， ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓ）、脳炎、アルボウイルス、エプスタインバーウイルス感染症、伝染性紅斑、ハンタウイルス感染症、出血熱、ウイルス性肝炎、ウイルス性ヒト単純疱疹、帯状疱疹、耳性帯状疱疹、ヘルペスウイルス感染症、伝染性単核症、例えば、鳥またはヒトにおけるインフルエンザ、ラッサ熱、麻疹、伝染性軟属腫、流行性耳下腺炎、パラミクソウイルス感染症（ｏａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）、サシチョウバエ熱、ポリオーマウイルス感染症、狂犬病、呼吸器合胞体ウイルス感染症、リフトバレー熱、ＲＮＡウイルス感染症、風疹、遅発型ウイルス病、痘瘡、亜急性硬化性全脳炎、腫瘍ウイルス感染症、疣贅、西ナイル熱、ウイルス疾患および黄熱病を含めたウイルス性疾患を含む。例えば、ＳＶ４０形質転換ウイルスのラージＴ抗原は、ＵＢＦ上で作用し、ＵＢＦを活性化し、他のウイルスタンパク質をＰｏｌ Ｉ複合体に補充し、それによって細胞増殖を刺激して、ウイルス繁殖を確実にする。細胞増殖性状態はまた、血管形成に関連する状態（例えば、がん）、ならびに含脂肪細胞および他の脂肪細胞の増殖によってもたらされる肥満症を含む。

【0100】

細胞増殖性状態には、微生物感染が含まれる。微生物の非限定的例には、ウイルス、細菌、酵母および真菌が含まれる。記載された組成物によって処置し得る特定の微生物の例を、本明細書において一覧表示する。

【0101】

細胞増殖性状態はまた、心臓ストレス（高血圧症、バルーン血管形成、弁膜症および心筋梗塞など）からもたらされる心臓の状態を含む。例えば、心筋細胞は、心室壁の大半を構成する心臓中の分化した筋細胞であり、血管平滑筋細胞は、血管を裏打ちしている。両方とも筋細胞のタイプであるが、心筋細胞および血管平滑筋細胞は、収縮、成長および分化のそれらの機序において異なっている。心筋細胞は心臓の形成のすぐ後に高分化し、したがって、分裂する能力を失い、一方、血管平滑筋細胞は、収縮性から増殖性表現型へのモジュレーションを連続的に起こす。様々な病態生理学的ストレス（高血圧症、バルーン血管形成、弁膜症および心筋梗塞など）下で、例えば、心臓および血管は、心機能を低下させ、最終的に心不全として現れることがある形態学的成長が関連する変化を起こす。したがって、本明細書において提供するのは、心臓の状態を処置するために本明細書に記載されている化合物を有効量で投与することによって、心臓細胞の増殖性状態を処置する方法である。化合物は、心臓ストレスが起こりまたは検出される前または後に投与してもよく、化合物または核酸は、例えば、高血圧症、バルーン血管形成、弁膜症または心筋梗塞の発生または検出後に投与してもよい。このような化合物の投与は、血管筋細胞および／または平滑筋細胞の増殖を減少させ得る。

【0102】

細胞増殖状態はまた、肥満症に関し得る。いくつかの実施形態において、細胞増殖性状態は、含脂肪細胞の異常な増殖である。

【0103】

本明細書に記載されている化合物は、それを必要としている被験体に投与し、被験体において免疫応答を誘導することができる。免疫応答は、特定の実施形態において、異種抗原（例えば、病原体感染）に対して被験体によって自動的に生じさせ得る。いくつかの実施形態において、抗原は、本明細書に記載されている化合物と同時投与され、免疫応答は、抗原に対して被験体において開始される。特定の実施形態において、抗原は、特定の細胞増殖性状態（例えば、特定のがん抗原）または特定の病原体（例えば、グラム陽性菌壁抗原；Ｓ．ａｕｒｅｕｓ抗原）に対して特異的であり得る。免疫刺激性組成物は、いくつかの実施形態において、ワクチンまたは混合ワクチン中で投与し得る。免疫刺激性組成物は、特定の実施形態において、アジュバント組成物として投与してもよく、特定の実施形態において、抗原と併せて投与（例えば、抗原との逐次投与または同時の投与）し得る。

【0104】

本明細書に記載されている化合物は、それを必要としている被験体に投与し、１つ以上の炎症障害を潜在的に予防、阻害または処置することができる。本明細書において下記で使用する場合、「処置すること」、「処置」および「治療効果」という用語は、炎症反応を減少、阻害または停止（予防）し（例えば、抗体産生または特異的抗原に対する抗体の量を遅延または休止させ）、炎症性組織の量を減少させ、炎症状態を完全にまたは部分的に緩和することを意味することができる。炎症障害には、これらに限定されないが、アレルギー、喘息、自己免疫障害、慢性炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、炎症性腸疾患、ミオパチー（例えば、全身性硬化症、皮膚筋炎、多発性筋炎、および／または封入体筋炎と組み合わせた）、骨盤内炎症性疾患、再潅流傷害、関節リウマチ、移植片拒絶、脈管炎、および白血球障害（例えば、チェディアック−東症候群、慢性肉芽腫症）が含まれる。特定の自己免疫障害はまた、炎症障害（例えば、関節リウマチ）である。いくつかの実施形態において、炎症障害は、慢性炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、ミオパチー、骨盤内炎症性疾患、再潅流傷害、移植片拒絶、脈管炎、および白血球障害からなる群から選択される。特定の実施形態において、炎症状態には、これらに限定されないが、気管支拡張症、細気管支炎、嚢胞性線維症、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、アテローム性動脈硬化症、および敗血症性ショック（例えば、多臓器不全を伴う敗血症）が含まれる。いくつかの実施形態において、炎症障害は、アレルギー、喘息、ＡＲＤＳおよび自己免疫障害からなる群から選択される状態ではない。特定の実施形態において、炎症障害は、消化管炎症、脳炎、皮膚炎および関節の炎症からなる群から選択される状態ではない。特定の実施形態において、炎症障害は、好中球が媒介する障害である。いくつかの実施形態において、炎症状態はまた、細胞増殖状態（例えば、皮膚の炎症状態（例えば、湿疹）、円板状エリテマトーデス、扁平苔癬、硬化性苔癬、菌状息肉腫、光線皮膚症、バラ色粃糠疹および乾癬など）である。

【0105】

本明細書に記載されている化合物は、それを必要としている被験体に投与し、１つ以上の自己免疫障害を潜在的に処置することができる。このような処置において、「処置すること」、「処置」および「治療効果」という用語は、自己免疫応答を減少、阻害または停止し（例えば、抗体産生または特異的抗原に対する抗体の量を遅延または休止させ）、炎症性組織の量を減少させ、自己免疫状態を完全にまたは部分的に緩和することを意味することができる。自己免疫障害には、これらに限定されないが、自己免疫性脳脊髄炎、大腸炎、自己免疫性インスリン依存性真性糖尿病（ａｕｔｏｍｉｍｍｕｎｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）（ＩＤＤＭ）、およびウェゲナー肉芽腫症および高安動脈炎が含まれる。このような疾患について化合物を試験するためのモデルには、これらに限定されないが、（ａ）自己免疫性脳脊髄炎についての、（ｉ）ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチドによって誘発されるＣ５ＢＬ／６、（ｉｉ）ＳＪＬマウスＰＬＰ１３９〜１５１、または１７８〜１９１ＥＡＥ、および（ｉｉｉ）ＭＯＧまたはＰＬＰペプチドによって誘発されるＥＡＥの養子移入モデル；（ｂ）自己免疫性ＩＤＤＭについての、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス；（ｃ）大腸炎についての、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）が誘発する大腸炎モデルおよびトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）が誘発する大腸炎モデル；ならびに（ｄ）全身性小血管炎障害（ウェゲナー肉芽腫症および高安動脈炎についてのモデルとして）が含まれる。本明細書に記載されている化合物を被験体に投与して、下記の障害の１つ以上を潜在的に処置し得る。急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）；アジソン病；円形脱毛症；強直性脊椎炎；抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）；自己免疫性溶血性貧血；自己免疫性肝炎；自己免疫性内耳疾患；水疱性類天疱瘡；セリアック病；シャーガス病；慢性閉塞性肺疾患；クローン病（特発性炎症性腸疾患「ＩＢＤ」の２つのタイプの１つ）；皮膚筋炎；１型真性糖尿病；子宮内膜症；グッドパスチャー症候群；グレーブス病；ギランバレー症候群（ＧＢＳ）；橋本病；化膿性汗腺炎；特発性血小板減少性紫斑病；間質性膀胱炎；エリテマトーデス；混合性結合組織疾患；モルフェア；多発性硬化症（ＭＳ）；重症筋無力症；ナルコレプシー；神経性筋強直症；尋常性天疱瘡；悪性貧血；多発性筋炎；原発性胆汁性肝硬変；関節リウマチ；統合失調症；強皮症；シェーグレン症候群；側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」としてもまた公知である）；潰瘍性大腸炎（特発性炎症性腸疾患「ＩＢＤ」の２つのタイプの１つ）；脈管炎；白斑；ならびにウェゲナー肉芽腫症。いくつかの実施形態において、自己免疫障害は、クローン氏病（またはクローン病）、関節リウマチ、ループスおよび多発性硬化症からなる群から選択される状態ではない。

【0106】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている化合物は、１つ以上の他の療法（これらに限定されないが、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、および／または生物学的療法（例えば、免疫療法）が含まれる）の投与と組み合わせて利用される。これらに限定されないが、本明細書に記載されている化合物と組み合わせて使用することができる薬剤には、これらに限定されないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質（翻訳後修飾タンパク質を含めた）、抗体などを含めたタンパク性分子；小分子（１０００ダルトン未満）；無機または有機化合物；これらに限定されないが、二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡ、または二本鎖もしくは一本鎖ＲＮＡ、および三重らせん体核酸分子を含めた核酸分子を含めることができる。本明細書に記載されている化合物と組み合わせて使用される薬剤は、任意の公知の生物（これらに限定されないが、動物、植物、細菌、真菌、および原生生物、またはウイルスを含めた）に、または合成分子のライブラリーに由来することができる。本明細書に記載されている化合物と組み合わせて利用し得る薬剤には、タンパク質キナーゼ阻害剤（例えば、受容体タンパク質キナーゼ阻害剤）および血管形成阻害剤が含まれる。

【0107】

免疫刺激性組成物
本明細書に記載されている化合物は免疫刺激性活性を有してもよく、抗原に対する免疫応答のレベルを増強することができる。したがって、本明細書に記載されている化合物は、抗原と併せて投与することができるアジュバントとして有用であり得る。したがって、本明細書に記載されている化合物は、いくつかの実施形態において、抗原を含有するワクチン組成物の部分として組み込むことができ、特定の実施形態において、アジュバント組成物中の抗原とは別々に投与することができる。ワクチン組成物およびアジュバント組成物は、本明細書において集合的に「免疫刺激性組成物」と称される。

【0108】

免疫刺激性組成物構成成分
本明細書に記載されている化合物は、免疫刺激性組成物中で任意の有効量で利用することができる。特定の実施形態において、本明細書に記載されている化合物は、用量毎に約１マイクログラム〜約１００，０００マイクログラムの量で使用することができる。本明細書に記載されている化合物はまた、用量毎に約１マイクログラム〜約５０，０００マイクログラム、用量毎に約１マイクログラム〜約２５，０００マイクログラム、用量毎に約１マイクログラム〜約５，０００マイクログラム、用量毎に約１マイクログラム〜約４，０００マイクログラム、用量毎に約１マイクログラム〜約３，０００マイクログラム、用量毎に約１マイクログラム〜約２，０００マイクログラム、および用量毎に約１マイクログラム〜約１，０００マイクログラムの量で使用することができる。本明細書に記載されている化合物はまた、いくつかの実施形態において、用量毎に約５マイクログラム〜約７５０マイクログラム、用量毎に約５マイクログラム〜約５００マイクログラム、用量毎に約５マイクログラム〜約２００マイクログラム、用量毎に約５マイクログラム〜約１００マイクログラム、用量毎に約１５マイクログラム〜約１００マイクログラムの量で、および用量毎に約３０マイクログラム〜約７５マイクログラムの量で使用し得る。

【0109】

本明細書に記載されている化合物に加えて、免疫刺激性組成物は、１種以上の他の構成成分を含むことができる。例えば、トリテルペノイドを、免疫刺激性組成物に含めることができる。免疫刺激性組成物中での使用に適したトリテルペノイドは、これらに限定されないが、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ、トマチン、ニンジン抽出物、キノコ、およびステロイド系サポニンと構造的に類似したアルカロイドグリコシドを含めた多くの源（例えば、植物由来のまたは合成の同等物）に由来することができる。したがって、免疫刺激性組成物中での使用に適したトリテルペノイドには、サポニン、スクアレン、およびラノステロールが含まれる。免疫刺激性組成物中での使用に適したトリテルペノイドの量は、使用するトリテルペノイドの性質によって決まる。しかし、これらは一般に、用量毎に約１マイクログラム〜約５，０００マイクログラムの量で使用される。これらはまた、用量毎に約１マイクログラム〜約４，０００マイクログラム、用量毎に約１マイクログラム〜約３，０００マイクログラム、用量毎に約１マイクログラム〜約２，０００マイクログラム、および用量毎に約１マイクログラム〜約１，０００マイクログラムの量で使用することができる。これらはまた、用量毎に約５マイクログラム〜約７５０マイクログラム、用量毎に約５マイクログラム〜約５００マイクログラム、用量毎に約５マイクログラム〜約２００マイクログラム、用量毎に約５マイクログラム〜約１００マイクログラム、用量毎に約１５マイクログラム〜約１００マイクログラムの量で、および用量毎に約３０マイクログラム〜約７５マイクログラムの量で使用し得る。

【0110】

サポニンが使用される場合、免疫刺激性組成物は、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａの樹皮からの免疫学的に活性なサポニン画分を含有することが多い。サポニンは、例えば、Ｑｕｉｌ Ａ、または別の精製されたもしくは部分的に精製されたサポニン調製品でよく、これは商業的に得ることができる。このように、サポニン抽出物は、混合物または精製された個々の構成成分（ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、およびＱＳ−２１など）として使用することができる。いくつかの実施形態において、Ｑｕｉｌ Ａは、少なくとも８５％の純度である。他の実施形態において、Ｑｕｉｌ Ａは、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の純度である。

【0111】

ＣｐＧオリゴデオキシ核酸は、特異的塩基配列コンテクスト（ＣｐＧモチーフ）における非メチル化ＣＧジヌクレオチドの存在によって特性決定され、免疫刺激性特性を与えることができる。これらの免疫刺激性特性は、ＩＦＮ−、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１８の顕著な放出を伴うＴｈ１型応答の誘発を含む。ＣｐＧ ＯＤＮ（長さ１８〜２４ｂｐ）。担体（ＱＣＤＣ、ＱＣＤＣＲおよび他の組合せなど）は、ＣｐＧオリゴデオキシ核酸の取込みを促進することができる。免疫刺激性組成物において使用するためのＣｐＧの量は、使用されるＣｐＧの性質および意図する種によって決まる。しかし、これらは、用量毎に約１マイクログラム〜約２０ｍｇの量で使用されることが多い。これらはまた、用量毎に約１マイクログラム〜約１０ｍｇ、用量毎に約１マイクログラム〜約５ｍｇ、用量毎に約１マイクログラム〜約４ｍｇ、用量毎に約１マイクログラム〜約３ｍｇ、用量毎に約１マイクログラム〜約２ｍｇ、および用量毎に約１マイクログラム〜約１ｍｇの量で使用することができる。これらは、用量毎に約５マイクログラム〜約７５０マイクログラム、用量毎に約５マイクログラム〜約５００マイクログラム、用量毎に約５マイクログラム〜約２００マイクログラム、用量毎に約５マイクログラム〜約１００マイクログラム、用量毎に１０マイクログラム〜約１００マイクログラム、用量毎に約１５マイクログラム〜約１００マイクログラムの量で、および用量毎に約３０マイクログラム〜約７５マイクログラムの量で使用することができる。

【0112】

ステロールはまた免疫刺激性組成物において使用することができ、使用に適したステロールには、β−シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール、およびコレステロールが含まれる。これらのステロールは当技術分野において公知であり、商業的に購入することができる。免疫刺激性組成物において使用するのに適したステロールの量は、使用されるステロールの性質によって決まる。しかし、これらは、用量毎に約１マイクログラム〜約５，０００マイクログラムの量で使用されることが多い。これらはまた、用量毎に約１マイクログラム〜約４，０００マイクログラム、用量毎に約１マイクログラム〜約３，０００マイクログラム、用量毎に約１マイクログラム〜約２，０００マイクログラム、および用量毎に約１マイクログラム〜約１，０００マイクログラムの量で使用することができる。これらはまた、用量毎に約５マイクログラム〜約７５０マイクログラム、用量毎に約５マイクログラム〜約５００マイクログラム、用量毎に約５マイクログラム〜約２００マイクログラム、用量毎に約５マイクログラム〜約１００マイクログラム、用量毎に約１５マイクログラム〜約１００マイクログラム、および用量毎に約３０マイクログラム〜約７５マイクログラムの量で使用することができる。

【0113】

免疫刺激性組成物は、１種以上の免疫調節剤をさらに含むことができ、この非限定的例には、第四級アンモニウム化合物（例えば、ＤＤＡ）、およびインターロイキン、インターフェロン、または他のサイトカインが含まれる。これらの材料は、商業的に購入することができる。免疫刺激性組成物中での使用に適した免疫調節剤の量は、使用される免疫調節剤および被験体の性質によって決まる。しかし、これらは、用量毎に約１マイクログラム〜約５，０００マイクログラムの量で使用されることが多い。これらはまた、用量毎に約１マイクログラム〜約４，０００マイクログラム、用量毎に約１マイクログラム〜約３，０００マイクログラム、用量毎に約１マイクログラム〜約２，０００マイクログラム、および用量毎に約１マイクログラム〜約１，０００マイクログラムの量で使用することができる。これらはまた、用量毎に約５マイクログラム〜約７５０マイクログラム、用量毎に約５マイクログラム〜約５００マイクログラム、用量毎に約５マイクログラム〜約２００マイクログラム、用量毎に約５マイクログラム〜約１００マイクログラム、用量毎に約１５マイクログラム〜約１００マイクログラムの量で、および用量毎に約３０マイクログラム〜約７５マイクログラムの量で使用することができる。具体例において、ＤＤＡを含有する免疫刺激性組成物は、抗原溶液と新たに調製したＤＤＡの溶液とを単純に混合することによって調製することができる。

【0114】

免疫刺激性組成物は、１種以上のポリマーをさらに含むことができ、この非限定的例には、ＤＥＡＥデキストラン、ポリエチレングリコール、ならびにポリアクリル酸およびポリメタクリル酸（例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標））が含まれる。免疫刺激性組成物において使用するのに適したポリマーの量は、使用されるポリマーの性質によって決まる。しかし、これらは、約０．０００１％容量／容量（ｖ／ｖ）〜約７５％ｖ／ｖの量で使用されることが多い。いくつかの実施形態において、これらは、約０．００１％ｖ／ｖ〜約５０％ｖ／ｖの量、約０．００５％ｖ／ｖ〜約２５％ｖ／ｖの量、約０．０１％ｖ／ｖ〜約１０％ｖ／ｖの量、約０．０５％ｖ／ｖ〜約２％ｖ／ｖの量、および約０．１％ｖ／ｖ〜約０．７５％ｖ／ｖの量で使用される。特定の実施形態において、これらは、約０．０２％ｖ／ｖ〜約０．４％ｖ／ｖの量で使用される。ＤＥＡＥ−デキストランは、５０，０００Ｄａ〜５，０００，０００Ｄａの範囲の分子の大きさを有することができ、またはこれらは、５００，０００Ｄａ〜２，０００，０００Ｄａの範囲でよい。このような材料は、商業的に購入し、またはデキストランから調製し得る。

【0115】

いくつかの実施形態において、利用されるポリマーは、７６の平均当量を有するポリアクリル酸（例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）ポリマー）である。ポリアクリル酸は、平均直径が約０．２〜６．０ミクロンの一次ポリマー粒子から生成されることが多い。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）ポリマーは、カルボン酸基のｐＫａより高いｐＨ環境に曝露されたときに、これらの最初の容量の１０００倍およびこれらの最初の直径の１０倍まで水で膨張して、ゲルを形成する。カルボン酸基のｐＫａより高いｐＨで、カルボン酸基はイオン化し、これは負の電荷間の反発をもたらし、これによってポリマーの膨張を増加させる。

【0116】

免疫刺激性組成物は、１つ以上のＴｈ２刺激物質（例えば、Ｂａｙ Ｒ１００５（登録商標）およびアルミニウムなど）をさらに含むことができる。免疫刺激性組成物中での使用に適したＴｈ２刺激物質の量は、使用されるＴｈ２刺激物質の性質によって決まる。しかし、Ｔｈ２刺激物質は、用量毎に約０．０１ｍｇ〜約１０ｍｇの量で使用されることが多い。いくつかの実施形態において、このような刺激物質は、用量毎に約０．０５ｍｇ〜約７．５ｍｇの量、用量毎に約０．１ｍｇ〜約５ｍｇの量、用量毎に約０．５ｍｇ〜約２．５ｍｇの量、および用量毎に１ｍｇ〜約２ｍｇの量で使用される。具体例は、化学名「Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカンアミドアセテート」を有する糖脂質であるＢａｙ Ｒ１００５（登録商標）である。これは当技術分野において公知の手順によって合成することができる。これは空気の漏れない容器中で２〜８摂氏温度にて貯蔵されることが多い。この化学的または物理学的性質は、僅かに吸湿性であり、多形を形成せず、５０摂氏温度までの温度にて空気および光中で、ならびにｐＨ２〜１２の水性溶媒中で周囲温度にて化学的に安定的である。これは水溶液中でミセルを形成する両親媒性分子である。

【0117】

抗原
免疫刺激性組成物は、１種以上の抗原を含有することができる。抗原は、被験体において所望の免疫応答を生じさせることができる多種多様の物質のいずれかでよい。Ｑｕｉｌ Ａ単独は殺ウイルス性であるが、Ｑｕｉｌ Ａは、らせん状ミセルを形成するときに、コレステロールを加えると解毒される。免疫刺激性組成物は、非殺ウイルス性、および非溶血性または非膜溶解性でよい。したがって、免疫刺激性組成物と共に使用される抗原は、ウイルス（不活化、弱毒性、および修飾生）、細菌、寄生虫、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、合成ペプチド、タンパク質抽出物、細胞（腫瘍細胞を含めた）、組織、多糖類、炭水化物、脂肪酸、テイコ酸（ｔｅｉｃｈｉｏｃ ａｃｉｄ）、ペプチドグリカン、脂質、または糖脂質（個々に、または任意のこれらの組合せで）の１つ以上でよい。抗原はまた、本明細書において言及した生物から単離することができるヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチドの免疫原性フラグメントを含むことができる。抗原は、いくつかの実施形態において、がん特異的分子（タンパク質、ペプチド、脂質、核酸、炭水化物など）である。

【0118】

被験体において疾患をもたらさない生、修飾生、および弱毒性ウイルス株は、非病原性形態で単離することができ、または当技術分野において公知の方法（適切な細胞株における連続継代、または紫外線光もしくは化学的突然変異原への曝露を含めた）を使用して弱毒化することができる。不活化または死滅ウイルス株は、ホルマリン、βプロピオラクトン（ｂｅｔａｐｒｏｐｒｉｏｌａｃｔｏｎｅ）（ＢＰＬ）、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）、滅菌放射、熱などによる処理を含めて、当技術分野において公知の方法によって不活化されてきたものである。

【0119】

２種以上の抗原を組み合わせて、病原体によってもたらされる多種多様の疾患から被験体を保護することができる多価組成物を生成することができる。抗原は、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている化合物を含む単一の組成物中で組み合わせることができる。特定の実施形態において、複数の抗原を含む組成物は、本明細書に記載されている化合物を含む別々のアジュバント組成物と併せて（例えば、併行的または逐次的に）投与される。

【0120】

免疫刺激性組成物は、抗原としての微生物（例えば、不活化または弱毒性の細菌、ウイルス）または微生物構成成分を含むことができる。選択することができる細菌の非限定的例には、Ａｃｅｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｅｒｕｉａｎｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ａｒｈａｅｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、クラミドフィラ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉｅａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｉｓ、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌｓａ ｓｐ．）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｙｃｏｉｄｅｓ亜種ｍｙｃｏｉｄｅｓ ＬＣ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕ／ａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｉｖｏｓａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｃ９、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＳＩＫＷ１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｕｔｅｏｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、シュードモナス属Ｂ１１−１、Ａｌｃａｌｉｇｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｍｍｏｂｉｌｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｂｏｎｇｏｒｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｕｂｌｉｎ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｓｅｕｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｎｅｗｐｏｒｔ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｐｉｒｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｌｙｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｘｆｏｌｉａｔｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｉｅｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、シネコシスティス属（Ｓｙｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｍｉｎｕｔｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｒｅｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌａｄｉｕｍ）、およびレプトスピラ属（公知の病原体であるＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈａｒｄｊｏ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ ｈａｒｄｊｏ−ｂｏｖｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ ｈａｒｄｊｏ−ｐｒａｊｉｔｎｏ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｐｏｍｏｎａ、およびＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａなど）、ならびにこれらの組合せが含まれる。

【0121】

不活化ウイルス、弱毒性生ウイルス、および／またはウイルスの部分を、免疫刺激性組成物中で使用し得る。抗原産生のために使用することができるウイルスのいくつかの例には、これらに限定されないが、トリヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、イヌヘルペスウイルス、ウマヘルペスウイルス、ネコウイルス鼻気管炎ウイルス、マレック病ウイルス、ヒツジヘルペスウイルス、ブタヘルペスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、トリパラミクソウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパルボウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス３、ヒツジパラインフルエンザ３、牛疫ウイルス、ボーダー病ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ＢＶＤＶ Ｉ型、ＢＶＤＶ ＩＩ型、ブタコレラウイルス、トリ白血病ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ウシ型結核、ウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ニューカッスル病ウイルス、ヒツジ進行性肺炎ウイルス、ヒツジ肺腺癌ウイルス、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、向汎性ＣＣＶ、イヌ呼吸器系コロナウイルス、ウシコロナウイルス、ネコカリシウイルス、ネコ腸コロナウイルス、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｌｅｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ブタパルボウイルス、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）Ｉ型、ＰＣＶ ＩＩ型、ブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、シチメンチョウコロナウイルス、ウシ流行熱ウイルス、狂犬病、ロタウイルス（Ｒｏｔｏｖｉｒｕｓ）、水疱性口内炎ウイルス、レンチウイルス、トリインフルエンザ、ライノウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、イヌインフルエンザウイルス、ネコインフルエンザウイルス、ヒトインフルエンザウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、肝炎Ｂウイルス、ライノウイルス、および麻疹ウイルス、ならびにこれらの組合せが含まれる。

【0122】

ペプチド抗原の非限定的例には、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ ｐ６８、ＧｎＲＨ、ＩｇＥペプチド、Ｆｅｌ ｄ１、およびがん抗原、ならびにこれらの組合せが含まれる。他の抗原の例には、ヌクレオチド、炭水化物、脂質、糖脂質、ペプチド、脂肪酸、テイコ酸、およびペプチドグリカン、ならびにこれらの組合せが含まれる。

【0123】

免疫刺激性組成物による抗原の調製のために使用することができる寄生虫の非限定的例には、アナプラズマ属、肝蛭（肝吸虫）、コクシジウム、エイメリア属、ネオスポラカニナム、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、ジアルジア属、ディロフィラリア属（イヌ糸条虫）、アンシロストーマ属（鉤虫）、トリパノソーマ属、リーシュマニア属、トリコモナス属、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、バベシア属、シストソーマ属、テニア属、ストロンギロイデス属、アスカリス属、トリキネラ属、サルコシスティス属、ハモンディア、およびイソプソラ、ならびにこれらの組合せが含まれる。また意図されるのは、これらに限定されないが、マダニ（イクソデス属、コイタマダニ属、デルマセントル属、キララマダニ属、ウシマダニ属、イボマダニ属、およびチマダニ属、ならびにこれらの組合せを含めた）を含めた外部寄生虫である。

【0124】

免疫応答を誘導するために使用される抗原の量は、使用される抗原、被験体、および所望の反応のレベルによってかなり変化することができ、当技術分野において公知のように決定することができる。修飾生ウイルスまたは弱毒性ウイルスを含有するワクチンについて、抗原の治療有効量は、約１０^２組織培養感染量（ＴＣＩＤ）_５０以上〜約１０^１０ＴＣＩＤ_５０以下の範囲であることがある。多くのこのようなウイルスについて、治療有効用量は、約１０^２ＴＣＩＤ_５０以上〜約１０^８ＴＣＩＤ_５０以下の範囲であることがある。いくつかの実施形態において、治療有効用量の範囲は、約１０^３ＴＣＩＤ_５０以上〜約１０^６ＴＣＩＤ_５０以下である。特定の実施形態において、治療有効用量の範囲は、約１０^４ＴＣＩＤ_５０以上〜約１０^５ＴＣＩＤ_５０以下である。

【0125】

不活化ウイルスを含有するワクチンについて、抗原の治療有効量は、用量毎に少なくとも約１００相対単位であることがあり、用量毎に約１，０００以上〜約４，５００相対単位以下の範囲であることが多い。いくつかの実施形態において、抗原の治療有効量は、用量毎に約２５０以上〜約４，０００相対単位以下、用量毎に約５００以上〜約３，０００相対単位以下、用量毎に約７５０以上〜約２，０００相対単位以下、または用量毎に約１，０００以上〜約１，５００相対単位以下の範囲である。

【0126】

不活化ウイルスを含有するワクチン中の抗原の治療有効量はまた、相対的作用強度（ＲＰ）／ｍＬに関して測定することができる。治療有効量は、約０．１以上〜約５０ＲＰ／ｍＬ以下の範囲であることが多い。いくつかの実施形態において、抗原の治療有効量は、約０．５以上〜約３０ＲＰ／ｍＬ以下、約１以上〜約２５ＲＰ／ｍＬ以下、約２以上〜約２０ＲＰ／ｍＬ以下、約３以上〜約１５ＲＰ／ｍＬ以下、または約５以上〜約１０ＲＰ／ｍＬ以下の範囲である。

【0127】

ワクチン中で投与される特定の細菌性抗原についての細胞の数は、特定の実施形態において、約１×１０^６以上〜約５×１０^１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）／用量以下の範囲である。いくつかの実施形態において、細胞の数は、約１×１０^７以上〜５×１０^１０ＣＦＵ／用量以下、または約１×１０^８以上〜５×１０^１０ＣＦＵ／用量以下の範囲である。様々な実施形態において、細胞の数は、約１×１０^２以上〜５×１０^１０ＣＦＵ／用量以下、または約１×１０^４以上〜５×１０^９ＣＦＵ／用量以下、または約１×１０^５以上〜５×１０^９ＣＦＵ／用量以下、または約１×１０^６以上〜５×１０^９ＣＦＵ／用量以下、または約１×１０^６以上〜５×１０^８ＣＦＵ／用量以下、または約１×１０^７以上〜５×１０^９ＣＦＵ／用量以下の範囲である。

【0128】

ワクチン中で投与される特定の寄生虫抗原についての細胞の数は、特定の実施形態において、用量毎に約１×１０^２以上〜約１×１０^１０以下の範囲である。いくつかの実施形態において、細胞の数は、用量毎に約１×１０^３以上〜約１×１０^９以下、または用量毎に約１×１０^４以上〜約１×１０^８以下、または用量毎に約１×１０^５以上〜約１×１０^７以下、または用量毎に約１×１０^６以上〜約１×１０^８以下の範囲である。

【0129】

添加剤
水性免疫刺激性組成物は、特定の利点を実現することができる。これらは容易に製剤および投与され、注射部位反応の誘発がより少なくまたはより重大でないことがある。しかし、抗原を有する水性免疫刺激性組成物は、注射部位から拡散する傾向があり、被験体の肝臓によって取り除かれ、望ましくない非特異的免疫応答を生じさせる。

【0130】

油は、アジュバントの構成成分として加えられるとき、一般に、長期の遅延放出プロファイルを実現する。利用することができる油は、代謝可能な油または代謝可能でない油である。油は、水中油型、油中水型、または水中油中水型エマルジョンの形態でよい。水中油型エマルジョンは、いくつかの実施形態において提供することができ、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）製剤からなってもよい。この製剤は、水性構成成分、レシチン、鉱油、および界面活性剤を含む。この製剤の構成成分を記載している特許は、米国特許第５，０８４，２６９号および米国特許第６，５７２，８６１号を含む。油性構成成分は、いくつかの実施形態において、１容量％〜５０容量％の量で、または１０％〜４５％の量で、または２０％〜４０％の量で存在することができる。

【0131】

適切な油は、アルカン、アルケン、アルキン、ならびにこれらの相当する酸およびアルコール、これらのエーテルおよびエステル、ならびにこれらの混合物を含むことができる。油の個々の化合物は、軽質炭化水素化合物であることが多く、すなわち、このような構成成分は、６〜３０個の炭素原子を有することが多い。油は、石油製品から合成的に調製または精製することができる。部分は、直鎖または分岐鎖構造を有し得る。部分は完全飽和であり、または１個以上の二重もしくは三重結合を有し得る。本発明において使用するためのいくつかの代謝可能でない油には、例えば、鉱油、パラフィン油、およびシクロパラフィンが含まれる。「軽鉱油」を、免疫刺激性組成物における使用のために選択することができる。利用される油の１タイプは、ペトロラタムの蒸留によって得られ、白色鉱油より僅かに低い比重を有する。

【0132】

代謝可能な油には、代謝可能な無毒性油が含まれる。このタイプの油は、免疫刺激性組成物が投与される被験体の体によって代謝されることができ、被験体に対して毒性ではない、任意の植物油、魚油、動物油または合成的に調製された油でよい。植物油のための源には、木の実、種および穀物が含まれる。

【0133】

免疫刺激性組成物の他の構成成分は、薬学的に許容される添加剤（担体、溶剤、および賦形剤、等張剤、緩衝剤、安定剤、保存剤、血管収縮剤、抗菌剤、抗真菌剤など）を含むことができる。担体、溶剤、および賦形剤の非限定的例には、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール、油などが含まれる。等張剤の例には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが含まれる。有用な安定剤には、ゼラチン、アルブミンなどが含まれる。

【0134】

界面活性剤を使用して、エマルジョンの安定化を支援することができ、アジュバントおよび／または抗原のための担体として作用するように選択することができる。使用に適した界面活性剤には、いくつかの実施形態において、天然の生物学的に適合性の界面活性剤および非天然の合成界面活性剤が含まれる。生物学的に適合性の界面活性剤には、リン脂質化合物またはリン脂質の混合物が含まれる。リン脂質の一例は、ホスファチジルコリン（レシチン）（ダイズまたは卵レシチンなど）である。レシチンは、粗植物油を水洗浄し、このように得られた水和したガムを分離および乾燥することによって、ホスファチドおよびトリグリセリドの混合物として得ることができる。精製した生成物は、アセトン洗浄によってトリグリセリドおよび植物油を除去した後に残ったアセトン不溶性リン脂質および糖脂質についての混合物を分画することによって得ることができる。代わりに、レシチンは、様々な商業的なソースから得ることができる。他の適切なリン脂質には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、およびホスファチジルエタノールアミンが含まれる。リン脂質は、自然源から単離し、または通常のように合成し得る。

【0135】

使用することができる非天然の合成界面活性剤には、これらに限定されないが、ソルビタンをベースとする非イオン性界面活性剤、例えば、脂肪酸置換ソルビタン界面活性剤（名称ＳＰＡＮ（登録商標）またはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）で市販されている）；ポリエトキシ化ソルビトールの脂肪酸エステル（ＴＷＥＥＮ（登録商標））；ヒマシ油などの源からの脂肪酸のポリエチレングリコールエステル（ＥＭＵＬＦＯＲ（登録商標））；ポリエトキシ化脂肪酸（例えば、名称ＳＩＭＵＬＳＯＬ Ｍ−５３（登録商標）で利用可能なステアリン酸）；ポリエトキシ化イソオクチルフェノール／ホルムアルデヒドポリマー（チロキサポール（登録商標））；ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標））；ポリオキシエチレンノニルフェニル（ｎｏｎｐｈｅｎｙｌ）エーテル（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｎ）、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ）が含まれる。いくつかの実施形態において、界面活性剤、または界面活性剤の組合せは、０．０１容量％〜１０容量％、時には０．１容量％〜６．０容量％、および時々０．２容量％〜５．０容量％の量で、エマルジョン中に存在する。

【0136】

薬学的に許容される担体には、ありとあらゆる溶剤、分散媒、コーティング、安定化剤、賦形剤、保存剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤などが含まれる。担体（複数可）は一般に、免疫刺激性組成物の他の構成成分と適合性であり、投与されたとき被験体に有害でない。担体は無菌および発熱物質なしであることが多く、使用される投与様式に基づいて選択され、利用される担体は、医薬品の開発および使用を監督する適当な政府機関によって承認され、または今後承認されることが多い。

【0137】

免疫刺激性組成物は、特定の実施形態において、医薬ビヒクル、添加剤、または媒体としての役割を果たす、適合性の薬学的に許容される（すなわち、無菌または無毒性の）液体、半固体、または固体の賦形剤を含むことができる。賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどを含むことができる。等張剤は、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含むことができる。安定剤は、とりわけ、アルブミンを含むことができる。免疫刺激性組成物は、いくつかの実施形態において、例えば、ゲンタマイシン、メルチオラート、またはクロロクレゾールを含めた、抗生物質または保存剤を含むことができる。

【0138】

免疫刺激性組成物の調製
本明細書に記載されている化合物は、免疫刺激性組成物の製造において使用することができる。各用量は、被験体の年齢および全身状態、投与経路、抗原の性質、ならびに他の要因によって変化することができる治療有効量の抗原（複数可）（例えば、ワクチン）を含有することができる。免疫刺激性組成物中の他の構成成分の量および濃度を調節して組成物の物理的および化学的性質を修飾してもよく、決定することができる。免疫刺激性組成物は、以下に記載するように、ホモジナイズまたは微小流体操作することができる。

【0139】

免疫刺激性組成物は、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）として調製することができる。ＩＳＣＯＭは、サポニン、ステロール、およびリン脂質を組み合わせることによって調製することができる。例えば、ＩＳＣＯＭは、５重量％〜１０重量％のＱｕｉｌ Ａ、１％〜５％のコレステロールおよびリン脂質、ならびに残部はタンパク質を含有することができる。アジュバント製剤中のサポニンとステロールの比は、ほぼ１：１００重量／重量（ｗ／ｗ）〜５：１ｗ／ｗ程度であることがある。いくつかの実施形態において、過剰なステロールが存在し、サポニンとステロールの比は、少なくとも１：２ｗ／ｗ、または１：５ｗ／ｗでよい。特定の実施形態において、サポニンは、ステロールに対して過剰であり、約５：１ｗ／ｗのサポニンとステロールの比が使用される。ＩＳＣＯＭおよびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸは、市販されている（例えば、Ｉｓｃｏｎｏｖａ ＡＢ（Ｓｗｅｄｅｎ））。

【0140】

いくつかの実施形態において、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）は、１重量部のＤＤＡ毎に少なくとも０．１重量部のＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）の量でＤＤＡと組み合わせて使用される。特定の実施形態において、１重量部のＤＤＡ毎に少なくとも０．５重量部のＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）を使用する。様々な実施形態において、１重量部のＤＤＡ毎に少なくとも１重量部のＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）を使用する。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）およびＤＤＡの組合せは複合体を形成することが多く、それによってＤＤＡ第三級アミン官能基は、ポリマー上のカルボン酸側基を免疫機能化する。この複合体によって、特異的免疫細胞が、抗原およびアジュバントを同時に標的とし、抗原およびアジュバントを一緒に最適な時間および濃度で前記細胞に同時送達することを可能にする。

【0141】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている化合物は、特定の担体と共に製剤されず、免疫刺激性組成物の調製のための水性または他の薬学的に許容される緩衝液中で製剤されることがある。いくつかの実施形態において、免疫刺激性組成物は、適切なビヒクル（例えば、さらなるリポソーム、ミクロスフィアまたはカプセル化された抗原粒子など）中で提示される。抗原は、免疫刺激性組成物中に存在する場合、小胞膜中に含有され、または小胞膜の外に含有されてもよい。可溶性抗原は内側にあることが多く、疎水性または脂質付加された抗原は膜中に含有されていることが多い。

【0142】

免疫刺激性組成物は、投与経路、貯蔵の必要条件などによって様々な形態で作製することができる。例えば、これらは、注射用の使用に適した無菌水溶液剤もしくは分散剤の形態で作製することができ、または凍結乾燥、真空乾燥、もしくは噴霧乾燥技術を使用して凍結乾燥した形態で作製することができる。凍結乾燥した組成物は、安定化溶液、例えば、食塩水またはＨＥＰＥＳ中で、使用する前に再構成することができる。したがって、免疫刺激性組成物は、固体、半固体、または液体剤形として使用することができる。

【0143】

リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を水性緩衝媒体として使用してもよく、緩衝液のｐＨは、中性または僅かにアルカリ性または僅かに酸性でよい。したがって、ｐＨは６〜８のｐＨ範囲でよく、約７．０〜約７．３のｐＨを特定の実施形態において使用することができる。塩基（例えば、ＮａＯＨ）または塩基（例えば、ＨＣｌ）を必要に応じて使用して、ｐＨを調節することができる。典型的な濃度には、例えば、１Ｎ〜１０ＮのＨＣｌおよび１Ｎ〜１０ＮのＮａＯＨが含まれる。緩衝液の強度は、いくつかの実施形態において、１０〜５０ｍＭのＰＯ_４および１０〜１５０ｍＭのＰＯ_４でよい。特定の実施形態において、組成物は、粒子、例えば、約１０ナノメートル〜約１０００ナノメートルのナノ粒子を形成し、組成物は、約１００ナノメートル〜約４００ナノメートルの平均、平均的または公称サイズを有する粒子を形成することがある。

【0144】

免疫刺激性組成物は、いくつかの実施形態において、ホモジナイズまたは微小流体操作することができる。免疫刺激性組成物は、特定の実施形態において、１つまたは複数のホモジナイザーを１回または複数回通過させることなどにより一次ブレンド工程に供してもよい。任意の市販のホモジナイザー（例えば、Ｒｏｓｓ乳化装置（Ｈａｕｐｐａｕｇｅ、Ｎ．Ｙ．）、Ｇａｕｌｉｎホモジナイザー（Ｅｖｅｒｅｔｔ、Ｍａｓｓ．）、またはマイクロフルイディクス（Ｎｅｗｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）を、この目的のために使用することができる。いくつかの実施形態において、免疫刺激性組成物を１０，０００ｒｐｍで３分間ホモジナイズする。Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｎｅｗｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）から入手可能なモデル番号１１ＯＹ；Ｇａｕｌｉｎモデル３０ＣＤ（Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ．、Ｅｖｅｒｅｔｔ、Ｍａｓｓ．）；およびＲａｉｎｎｉｅ Ｍｉｎｉｌａｂタイプ８．３０Ｈ（Ｍｉｒｏ Ａｔｏｍｉｚｅｒ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄａｉｒｙ，Ｉｎｃ．、Ｈｕｄｓｏｎ、Ｗｉｓ．）などの市販のマイクロフルイダイザーを使用することによって、微小流体操作を達成することができる。これらのマイクロフルイダイザーは、２つの流体の流れが相互作用チャンバーにおいて高速度で相互作用し、サブミクロンサイズの液滴を有する組成物を形成するように、高圧下で小さな開口部を通して流体を押し出すことによって作動する。特定の実施形態において、２００ミクロンの限界寸法のチャンバーを１０，０００＋／−５００ｐｓｉで通過させることによって、製剤を微小流体操作する。

【0145】

免疫刺激性組成物の投与
免疫刺激性組成物の用量サイズは、被験体および抗原によって、約１ｍＬ以上〜約５ｍＬ以下の範囲でよい。例えば、イヌまたはネコについて、約１ｍＬの用量が典型的には使用され、一方、ウシにおいて、約２〜５ｍＬの用量が典型的には使用される。しかし、免疫刺激性組成物は、マイクロドーズで製剤することができ、約１００マイクロリットルの用量を使用することができる。

【0146】

免疫刺激性組成物のための非限定的投与経路には、非経口、経口、口腔鼻腔、鼻腔内、気管内、局部的、注射および皮内が含まれる。シリンジ、ドロッパー、針なし注射器具、パッチ、ポンプ、粒子（例えば、金微粒子）、電気伝達、電気穿孔法などを含めた任意の適切な器具を使用して、組成物を投与し得る。使用のために選択される経路および器具は、当技術分野において公知のように、アジュバントの組成、抗原、および被験体によって決まる。いくつかの実施形態において、免疫刺激性組成物は、膀胱内滴下注入によって投与される。

【0147】

免疫刺激性組成物を被験体に投与した後に、免疫応答をモニターすることができる。免疫応答を査定するための方法は当技術分野において公知であり、例えば、（特異的または非特異的）抗体価をアッセイすること、および血清サイトカインレベルを測定することなどの本明細書において提供する方法を含む。いくつかの実施形態において、免疫刺激性組成物を送達した後に、抗原特異的免疫応答（例えば、抗原特異的抗体、抗原特異的細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ））を査定する。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２（例えば、ＩｇＧ２ａ）抗体応答が誘発される。免疫刺激性組成物を送達した後で、免疫応答を査定することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている組成物は、被験体に投与されたときに、副作用（例えば、脾腫大）を殆ど誘発しないか全く誘発しない。

【実施例】

【0148】

下記に記載する実施例は特定の実施形態を例示し、技術を限定しない。

【0149】

（実施例１）
４−（（６−アミノ−２−（２−メトキシエトキシ）−８−オキソ−７Ｈ−プリン−９（８Ｈ）−イル）メチル）安息香酸（化合物７）の合成
この実施例は、化合物ＡおよびＳＣ１２を調製することができる方法を詳述し、下記の方法およびデータが含まれる。
−４−（（６−アミノ−２−（２−メトキシエトキシ）−８−オキソ−７Ｈ−プリン−９（８Ｈ）−イル）メチル）安息香酸（化合物７）の調製方法、および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）とのそのコンジュゲート
−化合物７の調製のための条件、およびマルチグラムスケールでの調製のスケールアップ
−化合物Ａを得るための、化合物７と１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）とのコンジュゲートの方法
−マルチグラムスケールで化合物Ａを調製する方法
−中間体およびコンジュゲート化合物のための分析方法
−化合物Ａの安定性研究
−７と１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ））とのコンジュゲート誘導体である、ＳＣ１２としても公知である化合物８の調製方法
−ＳＣ１２の安定性研究。

【0150】

下記のスキームは、化合物ＡおよびＳＣ１２を調製するために使用し得る方法の例を提示する。他の合成法を化合物ＡおよびＳＣ１２を調製するために使用してもよく、これらの他の合成法の例を、図２０〜２３に提供する。

【0151】

スキーム１

【0152】

【化9】

【0153】

Ａ．４−（（６−アミノ−２−（２−メトキシエトキシ）−８−オキソ−７Ｈ−プリン−９（８Ｈ）−イル）メチル）安息香酸７の調製
化合物２

【0154】

【化10】

【0155】

２，６−ジクロロプリン（１００ｇ、０．５３ｍｏｌ）を、機械式撹拌機、油浴、温度計、滴下漏斗、還流凝縮器および窒素注入口を備えた四つ口丸底フラスコ（３Ｌ）に充填する。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（１Ｌ）、続いて固体ブロモメチル−ベンゾニトリル（１１４．６ｇ、０．５８ｍｏｌ、１．１当量）および炭酸カリウム（１０９．７ｇ、０．７９ｍｏｌ、１．５当量）を加える。混合物を激しく撹拌し、８５〜９０℃で３時間加熱し、次いでこれを室温に冷却し、水（２Ｌ）と共に加える。大量の黄色の固体が直ちに形成される。混合物を３０分間撹拌し、次いでこれをブフナー漏斗中で濾過し、水（２×２００ｍＬ）および酢酸エチルで洗浄し、恒量が観察されるまで６５℃にて真空中で乾燥させる（約５時間）。中間体２バッチＣＨ７３０／２／１を、下記の試料の量および純度で淡黄色の固体として得る。１６０ｇ；９９％Ｙ；９０．２％ＨＰＬＣ純度。ＮＭＲおよびＭＳ分析は、構造と一致する。

【0156】

６００ｇの２，６−ジクロロプリンから出発して、反応をスケールアップし、繰り返す。下記の試料の量および純度で中間体２バッチＣＨ７３０／３／１を得る。９５０ｇ；９８．３％Ｙ；９２％ＨＰＬＣ純度。

【0157】

化合物３

【0158】

【化11】

【0159】

中間体２（１００ｇ、０．３３ｍｏｌ）を、機械式撹拌機、油浴、温度計、滴下漏斗、還流凝縮器および窒素注入口を備えた四つ口丸底フラスコ（３Ｌ）に充填する。乾燥ジメチルホルムアミド（７００ｍＬ）、続いてメタノール中のアンモニア溶液（７Ｎ）（１００ｍＬ、０．６６ｍｏｌ、２当量）を加える。混合物を室温で激しく撹拌する。２時間後、茶色の溶液を得て、次いで大量の固体が沈殿する。混合物を１２時間さらに撹拌し、次いで固体をブフナー漏斗上で濾過し、酢酸エチル（２００ｍＬ）で洗浄する。生成物を、恒量が観察されるまで６５℃にて真空中で乾燥させる（約６時間）。中間体３バッチＣＨ７３０／３／２を、下記の試料の量および純度で白っぽい固体として得る。６６ｇ；７１％Ｙ；９２．９％ＨＰＬＣ純度。ＮＭＲおよびＭＳ分析は、構造と一致する。

【0160】

９００ｇの中間体２で反応をスケールアップし、繰り返す。中間体３バッチＣＨ７３０／６／２を、下記の試料の量および純度で得る。６８０ｇ；７７％Ｙ；９１％ＨＰＬＣ純度。

【0161】

化合物４

【0162】

【化12】

【0163】

機械式撹拌機、油浴、温度計、滴下漏斗、還流凝縮器および窒素注入口を備えた四つ口丸底フラスコ（１Ｌ）に、２−メトキシエタノール（５００ｍＬ）を充填する。ナトリウム（６ｇ、０．２６ｍｏｌ、１．５当量）を、室温でアルゴン雰囲気下にて少量ずつ加える。中間体３（５０ｇ、０．１７５ｍｏｌ）を一度に加える。反応混合物を撹拌し、１００℃に６時間加熱し、次いでこれを室温に冷却する。水（１Ｌ）を加え、混合物を室温で３０分間撹拌する。固体をブフナー漏斗上で濾過し、水（２００ｍＬ）で洗浄し、恒量まで真空中で６５℃にて乾燥させる（約８時間）。中間体４バッチＣＨ７３０／２／３を、下記の試料の量および純度で白っぽい固体として得る。４０ｇ；７０％Ｙ；９５％ＨＰＬＣ純度。ＮＭＲおよびＭＳ分析は、構造と一致する。

【0164】

反応をスケールアップし、５５０ｇの化合物３で繰り返す。中間体４バッチＣＨ７３０／６／３を、下記の試料の量および純度で得る。５３２ｇ；７８％Ｙ、９４％ＨＰＬＣ純度。

【0165】

化合物５

【0166】

【化13】

【0167】

中間体４（１００ｇ、０．３ｍｏｌ）を、機械式撹拌機、油浴、温度計、滴下漏斗、還流凝縮器および窒素注入口を備えた四つ口丸底フラスコ（２Ｌ）に充填する。ジクロロメタン（１．５Ｌ）を加え、混合物を室温で激しく撹拌する。臭素（１９ｍＬ、０．３７ｍｏｌ、１．２当量）を、室温にて滴下で添加する。８時間撹拌した後、固体を濾過し、ジクロロメタン（３００ｍＬ）で洗浄し、粗化合物５を黄色の固体として得る。これをアセトン（５００ｍＬ）で結晶化し、中間体５を下記の試料の量および純度で淡黄色の固体として得る。バッチＣＨ７３０／３／４；１０９ｇ；８８％Ｙ。８２％ＨＰＬＣ純度。

【0168】

反応を、１５０ｇの化合物４で繰り返す。中間体５バッチＣＨ７３０／４／４を下記の試料の量および純度で得る。１７０ｇ；９２％Ｙ；８１％ＨＰＬＣ純度。第３の調製を行う。中間体５バッチＣＨ７３０／１１／４を下記の試料の量および純度で得る。８０ｇ；９１％ＨＰＬＣ純度。

【0169】

化合物７

【0170】

【化14】

【0171】

機械式撹拌機、油浴、温度計、滴下漏斗、還流凝縮器および窒素注入口を備えた四つ口丸底フラスコ（３Ｌ）に、メタノール（７００ｍＬ）を充填する。ナトリウム（１１．９ｇ、０．５２ｍｏｌ、３当量）を、少量ずつ加える。中間体５（７０ｇ、０．１７ｍｏｌ）を、溶液に一度に加える。透明な溶液が得られる（約６時間）まで、懸濁液を還流させながら激しく撹拌する。混合物を室温に冷却し、次いで水（５００ｍＬ）、続いて水酸化ナトリウム（３４ｇ、０．８５ｍｏｌ）を加える。混合物を８時間再び加熱還流させ、次いで室温に冷却する。濃塩酸を加える（１２０ｍＬ）。白色の固体が反応混合物から沈殿する。１時間撹拌した後、固体をブフナー漏斗上で濾過する。真空中で６５℃にて乾燥させた後（約８時間）、粗化合物６（５０ｇ）を得る。これをアセトニトリル（５００ｍＬ）に懸濁させ、ヨウ化ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ、３４ｇ、０．２３ｍｏｌ）と共に加える。クロロトリメチルシラン（Ａｌｄｒｉｃｈ、２９ｍＬ、０．２３ｍｏｌ）を滴下で添加した後、混合物を激しく撹拌し、５０℃に３時間加熱する。室温に冷却した後に、炭酸水素ナトリウムの飽和溶液を加え、反応混合物中でｐＨ６を得る。沈殿した固体をブフナー漏斗上で濾過し、最初に水（１００ｍＬ）で、次いでメタノール（５０ｍＬ）で洗浄する。粗化合物７バッチＣＨ７３０／１８／６ｂを、下記の試料の量および純度で淡黄色の固体として得る。４０ｇ、ＨＰＬＣ純度８９％
これを氷酢酸で２回結晶化させる（各回６００ｍＬ）。真空中で６５℃にて８時間乾燥させた後、化合物７バッチＣＨ７３０／１８／６ｃを、下記の試料の量および純度で得る。３４ｇ；５から５５％Ｙ；９３．６％ＨＰＬＣ純度。

【0172】

反応を、７０ｇの中間体５で繰り返す。化合物７バッチＣＨ７３０／１６／６ｂを、下記の試料の量および純度で得る。３８ｇ；６１％Ｙ；９２％ＨＰＬＣ純度。反応を、３０ｇの化合物５で再び繰り返す。化合物７バッチＣＨ７３０／２１／６ｄを、下記の試料の量および純度で得る。１８ｇ；６２％Ｙ；９２．２％ＨＰＬＣ純度。

【0173】

酸７は、通常の溶媒（メタノール、エタノール、ジクロロメタン、酢酸エチル、アセトニトリル、アセトン、クロロホルム）の大部分において可溶性でない。酸７を結晶化することを目的に多くの試みがなされる。ジメチルホルムアミド、ジメチルホルムアミド／水、ＤＭＳＯ／水、メタノール、アセトンを試験するが、全ての場合において、結晶化後の生成物は、結晶化前と同じ純度を有する。氷酢酸は、７の純度を増強するのに有効であり得る。最初の結晶化後に純度は増加するが、処理を繰り返すときに変化しない。目標値（９８％ＨＰＬＣ）は達成されなかった。

【0174】

化合物Ａの調製

【0175】

【化15】

【0176】

良好な収率および純度で化合物Ａを調製することを目的に多くの試みがなされる。最初に、酸７とＤＯＰＥとの直接のカップリングを試みる（方法Ａおよび方法Ｂ）。次いで、酸７を、ＤＯＰＥとのカップリングの前に活性化させる（方法Ｃおよび方法Ｄ）。方法Ａおよび方法Ｄの両方によって合理的な結果が得られる一方、反応混合物の後処理の間および精製相の間、困難が生じ得る。

【0177】

方法Ａ：酸７（２．６ｇ、７．２ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下にて乾燥ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に懸濁させる。ＨＡＴＵ（Ｏ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；２．９４ｇ、７．６ｍｍｏｌ、１．０５当量）を一度に、続いてトリエチルアミン（２ｍＬ、１４．４ｍｍｏｌ、２当量）を加える。混合物を室温で１５分間撹拌し、次いでＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、５．３７ｇ、７．２ｍｍｏｌ、１当量）の乾燥ジクロロメタン（１５０ｍＬ）溶液を滴下で添加する。このように得られた溶液を、試薬が完全に変換するまで１２時間撹拌する。ＨＰＬＣ分析は、化合物Ａが粗反応混合物において約８５％であることを示す。ジクロロメタンを減圧下で蒸発させ、残渣を水（１５０ｍＬ）に滴下で添加する。固体が反応混合物から分離する。生成物は結晶性ではなく、フィルターがブロックされるため、真空下での濾過の試みは失敗し得る。

【0178】

この時点でジクロロメタン（１５０ｍＬ）を加え、相を分離させる。ミルク状懸濁液が形成され、２相の分離は可能でない。濾過および抽出手順が失敗した場合、溶媒を真空下で蒸留によって完全に除去し、残渣を、ジクロロメタン／メタノール／酢酸（８／２／０．１）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。化合物Ａを、一例のＨＰＬＣ純度９４．６％（０．５ｇ）で、白色のアモルファス固体として得る。

【0179】

１５ｇの酸７から出発して反応を繰り返す。反応の結果は、前の操作と同様である。粗製物をクロマトグラフィーによって精製するが、標的生成物は低い収率で得られる（７．２ｇ；１６％Ｙ）。精製のために使用したシリカゲルをメタノール／酢酸（７／３）で洗浄するとき、残留生成物を回収する。その精製を、クロマトグラフィーによって再び試みる。クロマトグラフィーによる精製は、１〜２グラムのスケールで有効である。カラムに充填した化合物Ａの量を増加させ、多量の生成物をシリカゲルによって保持するが、回収率は低い。メタノールおよび酢酸の量を増加させなくてならず、この時点で生成物を、その不純物と一緒に定量的に回収する。

【0180】

結晶化技術をまた試みて、化合物Ａを精製する。ジエチルエーテル、ヘキサン、アセトン、アセトン／水および他の溶媒を試験する。メタノールはいくつかの不純物を低下させるのに有効であるが、メタノール中での長時間加熱の後で、新しい不純物が検出される（２０％まで）。

【0181】

この時点で、反応条件を研究し、反応粗製物中の不純物を最小化する。温度を低下させることは、より良好なプロファイルをもたらし、化合物Ａは、反応混合物中にて８８％ＨＰＬＣ純度で得られる。

【0182】

方法Ｂ：酸７とＤＯＰＥとの反応を、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）をカップリング剤として使用して試みる。どちらの場合でも、反応は起こらず、出発物質は未変化で回収される。

【0183】

方法Ｃ：酸７の活性化は、溶媒としてジクロロメタン中の１−ヒドロキシピロリジンで試みる。ジクロロメタン中での７の不溶性によって、反応は失敗する。

【0184】

方法Ｄ：酸７（１０ｇ、０．０２８ｍｏｌ）を、室温およびアルゴン雰囲気下にて、アセトニトリル（６０ｍＬ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（６０ｍＬ）の混合物に溶解する。カルボニルジイミダゾール（４．５５ｇ、０．０２８ｍｏｌ、１当量）を加え、このように得られた溶液を１時間撹拌する。ＤＯＰＥ（日油株式会社、＞９９％；２０．８ｇ、０．０２８ｍｏｌ、１当量）の乾燥ジクロロメタン溶液を、滴下で添加する。反応混合物を、試薬が完全に変換するまで１６時間撹拌する。アセトニトリルを蒸留によって真空中で除去する。水（２００ｍＬ）を残渣に加える。白色の固体が分離するが、濾過は可能でない。混合物を３０分間遠心分離する。溶媒を廃棄し、化合物ＡバッチＣＨ７３０／１６／８を固体（２５ｇ）として得る。これをシリカゲルに急速に通過させ、ジクロロメタン／イソプロパノール／酢酸（７／２／１）（ＣＨ７３０／１６／８ｃ、下記の試料の量および純度：２１ｇ；８９．６％ＨＰＬＣ純度）で溶出させ、次いで室温にて３０分間メタノールで処理し、ブフナー漏斗上で濾過する。化合物Ａを、固体として得る（１９ｇ、ＨＰＬＣ純度９４．５％）。２０ｇの酸７で反応を繰り返し、同様の結果を得る。

【0185】

方法ＡおよびＤを比較し、粗化合物Ａの収率および純度に関する限りは同様の結果が得られるが、不純物プロファイルは異なる。マルチグラムスケールで方法Ａによって得た試料の精製は実現可能でないことが決定される。酸７とＤＯＰＥとの間のカップリング反応を数回繰り返すが、純度＞９０％の化合物Ａの単離は容易に達成されない。

【0186】

合成工程
図２０は、式Ａまたは式Ｂの構造を有する特定の化合物を製造するために利用することができる他の合成工程の実施形態の例を示す。図２０は、化合物ＡおよびＳＣ１２を製造するための合成工程を特に示す。これらの工程の実施形態は、縮合環部分（８−ヒドロキシル）に結合しているヒドロキシル部分が、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）部分であることを除いて、式Ａまたは式Ｂの構造を有する中間体を含む。次いで、この−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）部分を、式Ａまたは式Ｂに示すヒドロキシル部分に変換する。−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）部分は、図２０の中間体９において特に示すように−ＯＣＨ３部分（すなわち、−ＯＭｅ部分）であることがある。−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）部分は、ＴＭＳＣｌ／ＮａＩ加水分解手順（例えば、Ｃａｒｅｙ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＩＶ Ｅｄ． − Ｐａｒｔ Ｂ： Ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１６３頁）および／またはメチルエノールエーテル加水分解（例えば、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１２巻（２００４年）１０９１〜１０９９頁）などの当技術分野において公知の工程によって、ヒドロキシル部分に変換することができる。

【0187】

図２１および２２は、式Ａまたは式Ｂの構造を有する特定の化合物を製造するために利用することができる合成工程の実施形態のさらなる例を示す。図２１および図２２は、化合物ＡおよびＳＣ１２を製造するための合成工程を特に示す。これらの工程の実施形態は、スキーム１の中間体７における第一級アミン部分が、構造−ＮＨ−（ｐｒｏｔ）を有する第二級アミンである（ｐｒｏｔ部分は、保護基である）（例えば、図２１における中間体１３および図２２における中間体１７）ことを除いて、上記に示したスキーム１における中間体７の構造を有する中間体を含む。これらの工程の実施形態はまた、式Ａまたは式Ｂにおける第一級アミン部分が、構造−ＮＨ−（ｐｒｏｔ）を有する第二級アミンである（例えば、図２１における中間体１４および図２２における中間体１８）ことを除いて、式Ａまたは式Ｂの構造を有する中間体を含む。当技術分野において公知の任意の適切な保護基を利用することができ、保護基は、例示として図２１に示すようなｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護基（例えば、図２１における中間体１３および１４）、または例示として図２２に示すようなベンジル保護基（例えば、図２２における中間体１７および１８）であることがある。特定の保護基は、ＲｄおよびＲｅが飽和アルキル部分（例えば、Ｂｏｃおよびベンジル）である化合物を生成するのに適しており、特定の保護基は、ＲｄおよびＲｅが１つ以上の不飽和を含むアルキル部分（例えば、Ｂｏｃ）である化合物を生成するのに適している。

【0188】

図２３は、式Ａまたは式Ｂの構造を有する特定の化合物を製造するために利用することができる他の合成工程の実施形態の例を示す。図２３は、ＳＣ１２を製造するための合成工程を特に示す。この工程の実施形態は、中間体７における第一級アミン部分が、構造−ＮＨ−（ｐｒｏｔ）を有する第二級アミンである（ｐｒｏｔ部分は、保護基である）（例えば、図２３における中間体１７）ことを除いて、上記に示したスキーム１における中間体７の構造を有する中間体を含む。この工程の実施形態はまた、式Ａまたは式Ｂにおける第一級アミン部分が、構造−ＮＨ−（ｐｒｏｔ）を有する第二級アミンである（例えば、図２３における中間体１８）ことを除いて、式Ａまたは式Ｂの構造を有する中間体を含む。この工程の実施形態は、中間体６における第一級アミン部分が、構造−ＮＨ−（ｐｒｏｔ）を有する第二級アミンである（例えば、図２３における中間体２１）ことを除いて、上記に示したスキーム１における中間体６の構造を有する中間体をさらに含む。当技術分野において公知の任意の適切な保護基を利用することができ、保護基は例示として図２３に示すようなベンジル保護基であることがある。

【0189】

図２０〜２３において、合成スキームにおける様々な化合物についての番号の指定は、他の図において使用される数、またはこの実施例１において使用される数と対応しなくてもよい。

【0190】

ＨＰＬＣのための試料の調製：
中間体番号５：１０ｍｌのクラスＡメスフラスコ中で、約１０ｍｇの正確に秤量した試料を、数滴のジメチルスルホキシドと共にメタノールに溶解した（最終濃度、約１ｍｇ／ｍｌ）。中間体番号７：１０ｍｌのクラスＡメスフラスコ中で、約５ｍｇの正確に秤量した試料を、数滴のジメチルスルホキシドと共にメタノールに溶解した（最終濃度、約０．５ｍｇ／ｍｌ）。

【0191】

化合物Ａ（下記で示した一番上の化合物）の断片化

【0192】

【化16】

【0193】

Ｘ線回折（ＸＲＤ）
化合物Ａの試料がアモルファスであったことが決定された。

【0194】

乾重量および化学組成（ＣＨＮ）
実験値は、化合物Ａの構造と一致した。

【0195】

旋光度
試料調製：２０ｍｇの化合物Ａをクロロホルムに溶解し、分析した。［α］Ｄ＝−３７．０８（分析の偏差：４３％）。偏差の高い値は溶液の乳白光を発する挙動によるものである可能性があると決定された。

【0196】

５ｍｇの化合物Ａをクロロホルムに溶解して分析を繰り返した。［α］Ｄ＝−８．７であることが見出された（分析の偏差：１６％）。

【0197】

溶解性
ヨーロッパ薬局方６．０に報告されている方法を使用した。
化合物Ａは、水に可溶性でなかった。
化合物Ａは、アセトニトリルに可溶性でなかった。
化合物Ａは、クロロホルム（１００ｍｇ／ｍＬ）に可溶性であった。
化合物Ａは、ＤＭＳＯに可溶性であった。

【0198】

ＤＭＳＯへの化合物Ａの溶解性は、生成物の３つの異なるバッチを使用して決定した。
−ＣＨ７３０／１６／８ｃ（ＨＰＬＣ純度５９％）
−ＣＨ７３０／１６／８ｇ（ＨＰＬＣ純度７１．５％）
−ＣＨ７３０／２３／８ｅ（ＨＰＬＣ純度９５．６％）
バッチＣＨ７３０／１６／８ｇを、ヨーロッパ薬局方に記載されている方法によって試験した。ＤＭＳＯを０．１ｍＬずつ１０３．７ｍｇの生成物に加え、各々の添加の後に、懸濁液をＶｏｒｔｅｘ機器で３分間振盪した。ＤＭＳＯ中の化合物ＡバッチＣｈ７３０／１６／８ｇの溶解性は、２５９ｍｇ／ｍＬであることが見出された。次いで、バッチＣＨ７３０／１６／８ｃ、ＣＨ７３０／１６／８ｇおよびＣＨ７３０／２３／８ｅを、各懸濁液をより長時間撹拌しながら試験した。３０分間撹拌した後、１００ｍｇの各バッチは、０．２ｍＬのＤＭＳＯに完全に溶解した。この方法によると、ＤＭＳＯ中の化合物Ａの溶解性は、５００ｍｇ／ｍＬであった。

【0199】

化合物Ａの安定性
化合物Ａのいくつかの試料をＨＰＬＣによって再試験し、それらの純度が数日で減少したことが見出された。結果を下記の表Ａに報告する。

【0200】

表Ａ

【表A】

【0201】

分解を起こした試料は、結晶化容器中で室温にて自然光下で貯蔵した。ＲＲＴ１．１およびＲＲＴ１．２において２つの主要な不純物はいつも存在した。結果として、化合物Ａは、室温および／または光の存在下で安定的な化合物でなかったことが決定された。この時点で、安定性研究をバッチＣＨ７３０／１６／８ｇで行った。下記の貯蔵条件を試験した。
−室温（約２５℃）および光の存在下での固体
−外部温度（２８〜３５℃）、太陽光下での固体
−＋４℃での固体
−室温および光の存在下でのクロロホルム中の溶液
−＋４℃でのクロロホルム中の溶液
−外部温度（２８〜３５℃）、太陽光下でのクロロホルム中の溶液
得られた結果は、以下の表Ｂに報告する。

表Ｂ： ＣＨ７３０／１６／８Ｇの安定性

【表B】

【0202】

数日後に、固体試料は殆ど完全に分解した。化合物Ａは、溶液中でより安定的のようであった。化合物ＡバッチＣＨ７３０／１６／８ｇの試料は、ｔ＝０で低い純度を有したため、安定性研究を新たに調製した試料（バッチＣＨ７３０／２３／８ｅ）で繰り返した。得られた結果を、以下の表Ｃに報告する。
表Ｃ： ＣＨ７３０／２３／８Ｅの安定性

【表C】

【0203】

化合物ＡはＴ＞２５℃および光の存在下で急速な分解を起こすことが、ＨＰＬＣ分析によって確認された。化合物は溶液中でより安定的であったことが示された。

【0204】

化合物Ａのストレスをかけた試料についてのＨＰＬＣ−ＭＳ分析
６日間外部温度（２８〜３５℃；ＨＰＬＣ純度３５．４％；報告番号＃０１１２）にて太陽光下で貯蔵した化合物ＡバッチＣＨ７３０／１６／８ｇの試料を、ＨＰＬＣ−ＭＳによって分析し、新たに調製したバッチＣＨ７３０／２３／８ｅと比較した。この研究の目的は、安定性研究の間にＨＰＬＣによって検出した不純物が、分析の人為産物ではなく、不純物が熱および光の作用によって本当に形成されたことを示すことであった。

【0205】

【化17】

【0206】

試料調製
溶液ａ：２ｍｇ／ｍｌの濃度を有するために、試料をジメチルスルホキシド−イソプロパノール（２０：８０）に溶解した。
溶液ｂ：「溶液ａ」を、メタノール：イソプロパノール：水（５０：２０：３０）＋０．１％ギ酸で１：５に希釈した。

【0207】

（実施例２）
ＳＣ１２の合成
以下で記載するのは、（２−（４−（（６−アミノ−２−（２−メトキシエトキシ）−８−オキソ−７Ｈ−プリン−９（８Ｈ）−イル）メチル）ベンズアミド）エチル２，３−ビス（オレオイルオキシ）プロピルホスフェート）の調製である。

【0208】

化合物ＡバッチＣＨ７３０／１６／８ｇで行ったＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、化合物の分解によって形成された主要な不純物が、酸化誘導体であったことを示した。酸７（化合物７）を１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）とコンジュゲートさせ、その安定性を研究した。生成物は、化合物８およびＳＣ１２と称される。化合物ＳＣ８およびＳＣ１８は、化合物７を、ＤＬＰＥとコンジュゲートする代わりに、各々、１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンまたは１，２−ジステアロイル（ｄｉｓｔｒｅａｒｏｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンとコンジュゲートすることを除いて同様に合成した。

【0209】

Ａ．ＳＣ１２（化合物８）の調製

【0210】

【化18】

【0211】

ＳＣ１２を調製する方法のこの例において、酸７（化合物７）（バッチＣＨ７３０／１８／６ｄ；１ｇ、０．００２８ｍｏｌ）を、アセトニトリル（６ｍＬ）およびＤＭＳＯ（６ｍＬ）の混合物に室温およびアルゴン雰囲気下にて溶解する。カルボニルジイミダゾール（４５５ｍｇ、０．００２８ｍｏｌ、１当量）を加え、このように得られた溶液を１時間撹拌する。ＤＬＰＥ（＞９９％；１．７８ｇ、０．００２８ｍｏｌ、１当量）の乾燥ジクロロメタン溶液を、滴下で添加する。試薬が完全に変換するまで、反応混合物を１６時間撹拌する。アセトニトリルを真空中で蒸留によって除去する。水（２００ｍＬ）を残渣に加える。白色の固体が分離する。固体をブフナー漏斗上で濾過し、メタノール（５ｍＬ）で洗浄する。真空中で３５℃にて乾燥させた後、白色の固体としてＳＣ１２を得る。１．８ｇ、Ｙ６５％、ＨＰＬＣ純度９０．３％、ＨＰＬＣ報告番号０１２１。

【0212】

Ｂ．ＳＣ１２の分析的特性決定
ＳＣ１２の構造を、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲおよびＭＳによって確認した。

【0213】

Ｃ．ＳＣ１２の安定性
安定性研究をＳＣ１２で行い、下記の条件を試験した。
−室温（約２５℃）および光の存在下でクロロホルム中の溶液
−室温および光の存在下での固体
−外部温度（２８〜３５℃）、太陽光下での固体
試料を、ｔ＝０においておよび２０日後に分析した。

【0214】

結果を下記の表１において報告し、これらのＲＲＴと共に形成された主要な不純物を一覧表示する。
表１

【0215】

【表1】

【0216】

得られたデータは、ＳＣ１２が化合物Ａより安定的であったことを示す。さらに、表２は、熱に関して化合物ＡおよびＳＣ１２の安定性の間の比較を示す。各化合物の固体試料を８０℃で維持し、ＨＰＬＣによって分析した。
表２

【0217】

【表2】

【0218】

（実施例３）
化合物の作用強度
ＰＢＭＣモデルおよびマウスマクロファージ細胞株Ｒａｗ２６４．７におけるＴＬＲ７アゴニスト活性を有する５つの試料の作用強度は、炎症促進性サイトカインであるＩＬ−６およびＴＮＦ−αの用量依存的な刺激を測定することによって決定した。

【0219】

方法および実験配置
研究は、下記に概要を述べるように２つのモデルにおいて配置した。
−モデル１：５つのＴＬＲ７アゴニストを、マウスマクロファージ細胞株モデルＲａｗ２６４．７において試験した。エンドポイントは、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの測定であった。
−モデル２：５つのＴＬＲ７アゴニストを、ＰＢＭＣモデルにおける作用強度について試験した。エンドポイントは、分泌されたＩＬ−６およびＴＮＦ−αの測定であった。

【0220】

モデル１
５つのＴＬＲアゴニストの作用強度を、Ｒａｗ２６４．７細胞株において、陽性対照（イミキモド）と比較して査定した。ＥＣ５０値を、ＩＬ−６およびＴＮＦ−α分泌について対照および各薬物候補について決定した。

【0221】

方法：Ｒａｗ２６４．７細胞を、ＲＰＭＩ培地および１０％ＦＣＳを使用してサプライヤーからの条件によって増殖させた。細胞を９６ウェルプレートに蒔き、７つの用量でＴＬＲ７アゴニストによって２４時間処理した。条件培地をＥＬＩＳＡ分析のために２４時間後に除去した。サプライヤーからのガイドラインによるＸＴＴアッセイを使用して、細胞を生存率について続いてアッセイした。

【0222】

実験配置：
１．未処理細胞
２．イミキモド
３．ＴＬＲ７アゴニスト１
４．ＴＬＲ７アゴニスト２
５．ＴＬＲ７アゴニスト３
６．ＴＬＲ７アゴニスト４
７．ＴＬＲ７アゴニスト５
化合物を、７つの用量（０．００３、０．０１、０３、０．１、０．５、２．０、１０．０マイクロモル）で試験した。各試験シリーズについて４連ウェルにおいて実験を行い、上清をプールし、ＥＬＩＳＡによって３連で測定した。

【0223】

モデル２
５つのＴＬＲアゴニストの作用強度を、ＩＬ−６およびＴＮＦ−α分泌を刺激する能力に基づいて査定し、作用強度をＰＢＭＣモデルにおいて陽性対照（イミキモド）と比較した。ＩＬ−６およびＴＮＦ−α分泌についてのＥＣ５０値を、対照および各薬物候補について決定した。

【0224】

方法：ＰＢＭＣを３人のドナーから精製し、９６ウェルプレート中、ヒト２％加熱不活化ＡＢ血清、グルタミン、Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐおよびβ−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ培地において２×１０^５個の細胞／ウェルで蒔いた。細胞を、７つの用量でＴＬＲ７アゴニストによって２４時間処理した。条件培地を、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αについてのＥＬＩＳＡ分析のために除去し、細胞生存をサプライヤーからのプロトコルに従ってＸＴＴ法によって決定した。

【0225】

実験配置：
１．未処理細胞
２．イミキモド
３．ＴＬＲ７アゴニスト１
４．ＴＬＲ７アゴニスト２
５．ＴＬＲ７アゴニスト３
６．ＴＬＲ７アゴニスト４
７．ＴＬＲ７アゴニスト５
７つの用量（０．００３、０．０１、０３、０．１、０．５、２．０、１０．０マイクロモル）で化合物を試験した。

【0226】

データ処理：
ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの濃度を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌソフトウェアを使用してＲ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓからのＥＬＩＳＡによって決定した。結果を、用量反応曲線を調製するために、およびＥＣ５０値の決定のために、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍで分析した。

【0227】

統計分析：
ドナーの数によって、個々のＥＣ５０値の間の統計的評価は関連性のあるものでなかった。

【0228】

結果および考察：
モデル１において、ＩＬ−６およびＴＮＦ−α分泌は、全ての化合物によって用量依存的に誘発されたが、ＤＭＳＯ自体によって誘発されなかった（図１〜２）。化合物は、異なるレベルの最大サイトカインレベルに達し、また異なるＥＣ５０値を示した。作用強度の順序は、最も強力なものが最初で下記の通りである。化合物Ａ＜ＳＣ１２＜ＳＣ１８＜ＳＣ８＝遊離ファルマコフォア＜イミキモド（表３）。遊離ファルマコフォア（「遊離ｐｈ」）は、構造

【0229】

【化19】

【0230】

を有する。

【0231】

ＸＴＴアッセイ（図３、Ｙ軸＝相対的生存、ｘ軸＝処理のための濃度）は、細胞が、より高い濃度の化合物によって僅かに影響されたことを示し、これはいくつかの化合物については、最も高い濃度におけるサイトカイン産生の減少に反映された（特に、化合物Ａ、ＳＣ１２およびＳＣ１８について；図１および２）。最も高い濃度によって誘発されたサイトカインレベルに基づいて、用量反応曲線の最大プラトーが決定されたため、最も高い濃度の化合物を考慮しなかった場合、このプラトーは僅かに増加した可能性がある。しかし、ダイナミックレンジにおける用量は、これによって影響されず、これはＥＣ５０値が最小限に影響されることを意味する。

【0232】

表３、各化合物の試験した７つの用量に基づいてＲａｗ２６４．７細胞株において決定されたＥＣ５０値

【0233】

【表3】

【0234】

モデル１について結論として、化合物Ａは、最も強力なＴＬＲ７アゴニストであり、続いてＳＣ１２、ＳＣ１８、遊離ファルマコフォアと共にＳＣ８、最後にイミキモドであった。この点において、このモデルにおいて５つの化合物全てはイミキモドより強力であった。

【0235】

モデル２について、ＰＢＭＣは、健康な匿名の成人ヒトドナーからのバフィーコートに由来した。３人のドナーにおいて、両方のＩＬ−６およびＴＮＦ−α分泌は、大部分の化合物によって用量依存的に誘発された。イミキモド、ＳＣ８および遊離ファルマコフォアなどのいくつかの化合物は、あるドナーにおいてサイトカインを誘発する弱い能力を示し、そこでは最も高い用量のみがサイトカイン産生を誘発した。化合物Ａは、３人のドナー全てにおいて、ＩＬ−６分泌について最も強力な化合物であった。ドナー２において、ＳＣ１２は化合物Ａと同じぐらい強力であり、一方、ドナー１および３において、ＳＣ１２は２番目に強力な化合物であった（表４）。平均して、化合物は、下記のような作用強度の順序を示した。化合物Ａ＜ＳＣ１２＜遊離ファルマコフォア＜イミキモド＜ＳＣ１８＜ＳＣ８。ＳＣ８は、確固とした用量反応曲線を可能としないサイトカインのレベルを示した。３人のドナーからの結果に基づいて、ＴＮＦ−α分泌について、ＳＣ１２は、化合物Ａより平均して僅かに強力であった（表４）。作用強度の順序は下記の通りである。ＳＣ１２＜化合物Ａ＜遊離ファルマコフォア＜ＳＣ１８＜ＳＣ８＜イミキモド（図７〜９）。しかし、イミキモドおよびＳＣ８についてのデータは不明確であり、３人のドナー全てにおいて、弱いＴＮＦ−α分泌のみを誘発した。生存アッセイは、研究に亘って試験した全ての濃度で全体的に良好な細胞の生存を示し、明らかな細胞毒性は観察されなかった。ＳＣ１２で処置された１人のドナー（２番）は、生存反応の増加を有した（図１０）が、サイトカイン反応の違いを反映しなかった（図５および８）。

【0236】

表４、６つのＴＬＲ７アゴニストについて３人のドナーからのＰＢＭＣにおいて決定したＥＣ５０値（平均作用強度を示す）

【0237】

【表4】

【0238】

モデル２について結論として、化合物ＡおよびＳＣ１２は、最も強力なＴＬＲ７アゴニストであった。化合物Ａは、ＩＬ−６の最も強力な刺激物質であり、ＳＣ１２は、ＴＮＦ−α分泌について化合物Ａより僅かに強力であった。他の化合物は、異なるドナーにおけるＰＢＭＣからＩＬ−６およびＴＮＦ−αを誘発する異なる能力を示したが、これらの作用強度は一般に、順序付けることができない。イミキモドおよびＳＣ８は、試験した最も高い濃度におけるサイトカイン誘発、および低いレベルの分泌されたサイトカインを示した。したがって、ＥＣ５０値は、イミキモドおよびＳＣ８について決定することができない。ＳＣ１８および遊離ファルマコフォアは、ＩＬ−６およびＴＮＦ−α分泌の両方について同様の反応を示し、イミキモドおよびＳＣ８についてよりも高いレベルに達したが、Ｒａｗ２６４．７モデルについてよりも高い値を有した。

【0239】

Ｒａｗ２６４．７細胞株は試験した全ての化合物に反応し、化合物Ａが最も強力であり、続いてＳＣ１２であった。これらの２つの後がＳＣ１８、ＳＣ８および遊離ファルマコフォアであり、同様の作用強度を示し、イミキモドはＩＬ−６およびＴＮＦ−αの最も弱い誘発を示した。

【0240】

ＰＢＭＣ実験は、２つの最も強力なＴＬＲ７アゴニストとして化合物ＡおよびＳＣ１２、続いてＳＣ１８および遊離ファルマコフォアを示したが、イミキモドおよびＳＣ８による処理の後に低いサイトカイン分泌が測定された。

【0241】

（実施例４）
ヒトＰＢＭＣにおける化合物ＡおよびＳＣ１２の２つの異なるバッチからのＴＬＲ７アゴニストの作用強度についての試験
目的
ＩＬ−６分泌の誘発について、ヒトＰＢＭＣにおける２つの異なるバッチにおいて産生される２つのＴＬＲ７アゴニストの作用強度を決定すること。

【0242】

方法および実験配置
ＰＢＭＣを２人のドナーから精製し、９６ウェルプレートにおいて、ヒト２％加熱不活化ＡＢ血清、グルタミン、Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐおよびβ−メルカプト−エタノールを含むＲＰＭＩ培地中で、２×１０^５個の細胞／ウェルで蒔いた。細胞を、４つの用量においてＴＬＲ７アゴニストによって２４時間処理した。条件培地を、ＩＬ−６のためのＥＬＩＳＡ分析のために除去し、ＥＣ５０値を各化合物および各バッチについて決定した。

【0243】

実験配置：
１．未処理細胞
２．未処理細胞（ビヒクル対照）
３．イミキモド
４．化合物Ａ（新しいバッチ＃２０２８９）
５．化合物Ａ（古いバッチ＃ＣＨ７３０／２５／８）
６．ＳＣ１２（新しいバッチ＃２０２８８）
７．ＳＣ１２（古いバッチ＃ＣＨ７３０／２／１３Ｄ）
全ての化合物を、４つの濃度（１０、１、０．１、０．０１マイクロモル）で試験した。ＩＬ６を、ＥＬＩＳＡによって条件培地中での２４時間のインキュベーションの後で決定した（ＩＬ６は、最後の実験において、最も比較できる用量反応結果を生じた）。

【0244】

データ処理：
ＩＬ−６の濃度は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌソフトウェアを使用してＲ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓからのＥＬＩＳＡによって決定した。結果は、用量反応曲線を調製するために、およびＥＣ５０値の決定のために、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍで分析した。

【0245】

統計分析：
少ない数のドナーのために、個々のＥＣ５０値の間の統計的評価は決定されなかった。

【0246】

結果および考察
ＩＬ−６は、最も高い濃度（１０マイクロモル）でのみＩＬ−６を誘発することにおいて活性であったイミキモドを除いて、全ての化合物によって用量依存的に誘発された。結果の要約を試験した２人のドナーについてのＥＣ５０値（上の２つの列）を示した表５に示し、３人のドナーで行った２つの化合物についての第１の実験からの値（下の３つの列）と比較した。イミキモドについてのＥＣ５０値は、この本実験において最後の実験と比較していくらかより高いようであった。これは、４℃での貯蔵、および潜在的に、使用前に完全に化合物を可溶化するのに使用する加熱手順によって説明することができる。この実験と、バッチＣＨ７３０／２／１３Ｄを試験したときの前の実験とを比較して、ＳＣ１２は同様のＥＣ５０値を示した。古いＳＣ１２バッチ（ＣＨ７３０／２／１３Ｄ）は、新しいバッチ（＃２０２８８）と比較して、また同様のＥＣ５０値を示した。化合物Ａは、この実験とバッチ（ＣＨ７３０／２５／８）を試験したときの前の実験との両方においてまた同様のＥＣ５０値を示した。新しい化合物Ａバッチ＃２０２８９は、古いバッチと比較して、また同様のＥＣ５０値を示した。最後の実験が試験した濃度において細胞毒性活性を示さなかったため、細胞生存についての試験は行わなかった。

【0247】

表５： ＳＣ１２および化合物Ａの異なるバッチによる、異なる時点において５人の異なるドナーからのＰＢＭＣにおいて決定したＥＣ５０値

【0248】

【表5】

【0249】

結論
２つのＴＬＲ７アゴニストであるＳＣ１２および化合物Ａは、本実験において同様のＥＣ５０を示したが、これらは同じ量の活性化合物を含有することを示す。これは、化合物（ＣＨ７３０／２／１３ＤおよびＣＨ７３０／２５／８）は、４℃でのＤＭＳＯ中の５カ月の貯蔵の間、活性を失わなかったことをさらに示す。

【0250】

（実施例５）
ラット、ウサギ、ミニブタおよびヒト血漿における化合物Ａの代謝安定性の調査、ならびにウサギおよびヒト血漿における代謝プロファイル；ヒト血漿における化合物ＡおよびＳＣ１２安定性の比較
略語：
２−ピペリジノエチル４−アミノ−５−クロロ−２−メトキシベンゾエート−Ｍ７３１９
アセトニトリル−ＡＣＮ
大気圧化学イオン化−ＡＰＣＩ
ジメチルスルホキシド−ＤＭＳＯ
電子スプレーイオン化−ＥＳＩ
ギ酸−ＨＣＯＯＨ
液体クロマトグラフィー／質量分析法−ＬＣ／ＭＳ
メタノール−ＭｅＯＨ
多重反応モデル−ＭＲＭ
保持時間−Ｒ．Ｔ．
超高性能液体クロマトグラフィー−ＵＰＬＣ。

【0251】

要約
化合物Ａ^＊（化合物Ａの別のバッチ）の安定性を、ラット、ウサギ、ミニブタおよびヒト血漿において試験し、代謝プロファイルをウサギおよびヒト血漿において査定した。化合物Ａ^＊は、ウサギおよびヒトにおいてエステラーゼによって高度に代謝され、ミニブタおよびラット種においてより低い程度で代謝された。ウサギについて３０分および１２０分において、ならびにヒトについて６０分および３００分において、２つの種において親化合物の残存百分率を概ね一定に維持しながら代謝を研究した。３つの代謝物がウサギにおいて見出され、ヒトにおいてこれらの２つが見出された。

【0252】

ウサギにおいて、主要な代謝物はモノエステルおよび酸代謝物であり、一方、僅かに微量のジ加水分解された代謝物が観察された。ヒト血漿において、ウサギで従前に検出された最初の２つの主要な代謝物のみが、選択された時点において同定され、酸生成物は１２０分において主流の代謝物であった。

【0253】

ヒトおよびウサギ種において、２つの主要な代謝物のみの形成に伴い、クリアランスの比較できるプロファイルおよび代謝プロファイルが見出され、律速段階はモノエステルの形成をもたらす加水分解であったが、これは酸誘導体に急速に変換されたことがこの研究によって見出された。

【0254】

ヒト血漿においてＳＣ１２と比較して化合物Ａの第２のバッチ（バッチ２０２８９）で行った第２の実験において、ＳＣ１２は１２０分まで代謝されず、化合物の７０％超は３００分においてまだ存在したため、ＳＣ１２は化合物Ａより安定的であったことが示唆された。これに反して、化合物Ａは、６０分のインキュベーションの後で不安定性を示した。

【0255】

イントロダクション
血漿中に存在する加水分解酵素は、化合物の代謝に強力に貢献した。エステル結合を含有する多くの薬物をプロドラッグとして使用して、透過性もしくは溶解性を増加させ、または全身の毒性作用を減少させた。エステラーゼは多くの種類で存在し、種差は一般に、生体媒質中の異なるタイプの存在、およびこれらの基質特異性の差異からもたらされることがある。さらに、生物変換は、様々な要因（年齢、性別および疾患など）によって影響されることがある。

【0256】

目的
アッセイの目的は、異なる時点におけるいくつかの血漿種における、親化合物の残存百分率として安定性を比較することであった。２つの時点において血漿中のインキュベーションの後で形成された主要な代謝物のプロファイリングを、ウサギおよびヒト血漿において行った。

【0257】

化合物Ａの異なるバッチによる第２の実験を、異なるバッチのヒト血漿を利用することによって、ＳＣ１２と比較して行った。

【0258】

血漿安定性および代謝研究
材料
下記の物質は、示したソースから得た。ＡＣＮは、Ｊ．Ｔ Ｂａｋｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙから、リドカイン、ベラパミルおよびＭ７３１９は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、ＨＣＯＯＨは、Ｆｌｕｋａから、脱イオン水は、ＭｉｌｌｉＱ ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）から。

【0259】

血漿試料は、示したソースから得た。
ラット血漿は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｃａｌｃｏ、Ｉｔａｌｙから、ミニブタ、ヒトおよびウサギ血漿は、Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃ、Ｒｅｎｎｅｓ、Ｆｒａｎｃｅから。

【0260】

化合物Ａ、２−（４−（（６−アミノ−２−（２−メトキシエトキシ）−８−オキソ−７Ｈ−プリン−９（８Ｈ）−イル）メチル）ベンズアミド）エチル２，３−ビス（オレオイルオキシ）プロピルホスフェート
バッチコード：化合物Ａ^＊（第１の実験）、２０２８９（第２の実験）
貯蔵条件：粉末として４℃、ＤＭＳＯ中のストック溶液として−２０℃
化合物ＳＣ−１２：２−（４−（（６−アミノ−２−（２−メトキシエトキシ）−８−オキソ−７Ｈ−プリン−９（８Ｈ）−イル）メチル）ベンズアミド）エチル２，３−ビス（オレオイルオキシ）プロピルホスフェート
バッチコード：２０２８８
貯蔵条件：粉末として４℃、乾燥させて、直接光から離して貯蔵
機器
クリアランス決定のためのＰｒｅｍｉｅｒｅ ＸＥトリプル四重極（Ｗａｔｅｒｓ）とインターフェースしているＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）、および代謝プロファイルのためのイオントラップＨＣＴｕｌｔｒａ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）とインターフェースしているＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）。

【0261】

方法
第１の実験：試験化合物（５０ｍＭのＤＭＳＯ）を、ＡＣＮで２５０μＭの最終濃度に希釈した（２連で）。異なる種の血漿（１ｍｌ）を化合物の２５０μＭ溶液（１０μｌ）でスパイクし、一定分量の５０μｌ容量を、０分、１５分、３０分、６０分、１２０分および５時間で採取し、ベラパミル（２５０ｎｇ／ｍｌ）（内部標準、Ｉ．Ｓ．）のＡＣＮ溶液（２００μｌ）で直ちにクエンチした。１０μｌのＭｅＯＨを加えて、溶解性を改善した。次いで、試料を１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、下記で報告するように分析した。リドカインおよびＭ７３１９を参照標準として使用し、上記のようにインキュベートした。上清画分を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。ゼロ時間インキュベーションを、１００％値として使用した。インキュベーションにおける基質の喪失パーセントを決定し、試験化合物のインビトロの半減期を推定した。

【0262】

５０μＭの試験化合物の最終濃度で代謝実験を行い、化合物の半減期に照らして確立した試料を２つの時点で集め、ＡＣＮおよび内部標準を加えた後でＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。

【0263】

第２の実験：試験化合物（ＤＭＳＯ中５ｍＭ）を、ＡＣＮ−ＭｅＯＨ（１：１）で２５０μＭの最終濃度に希釈した。

【0264】

ヒト血漿（１．１８０ｍｌ）を、化合物の２５０μＭ溶液（２０μｌ）（４．１６μＭの最終濃度）でスパイクし、一定分量の５０μｌ容量を、０分、１５分、３０分、６０分、１２０分および５時間で採取し、ベラパミル（２５０ｎｇ／ｍｌ）（内部標準、Ｉ．Ｓ．）のＡＣＮ：ＭｅＯＨ（９５：５）溶液（２００μｌ）で直ちにクエンチした。次いで、試料を３０００ｒｐｍで１０℃にて２０分間遠心分離し、下記で報告するように分析した。リドカインおよびＭ７３１９を参照標準として使用し、上記のようにインキュベートした。上清画分を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。ゼロ時間インキュベーションを、１００％値として使用した。

【0265】

試料分析
血漿安定性決定についての試料分析（第１の実験）
試料を、Ｐｒｅｍｉｅｒｅ ＸＥトリプル四重極（Ｗａｔｅｒｓ）とインターフェースしているＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）で分析した。

【0266】

溶離液は、以下であった。
相Ａ：９５％Ｈ２Ｏ、５％ＭｅＯＨ、０．１％ＨＣＯＯＨ
相Ｂ：５％Ｈ２Ｏ、９５％ＭｅＯＨ、０．１％ＨＣＯＯＨ
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ８、２．１×５ｍｍ、１．７ｕｍ、５５℃
注入容量：５μｌ
クロマトグラフ法を、表６において下記で報告する。

【0267】

表６、クリアランス決定のためのクロマトグラフ法

【0268】

【表6】

【0269】

ＥＳＩ陽性、キャピラリー３．４ｋＶ、抽出器５Ｖ、ソース温度１１５℃、脱溶媒和温度４５０℃、コーンガス９８Ｌ／ｈ、増倍管６３０Ｖ。

【0270】

表７において、化合物Ａに適用したＭＲＭ転移を報告した。

【0271】

表７、適用したＭＲＭ転移およびパラメーター

【0272】

【表7】

【0273】

代謝プロファイルのための試料分析
試料を、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ ＨＣＴｕｌｔｒａ（登録商標）イオントラップ質量分析計とカップリングしたＷａｔｅｒｓ ＵＰＬＣクロマトグラフィーシステムを使用して分析した。インキュベートした試料の分析の前に、化合物Ａを手動で注入し、親化合物の断片化を理解した。ＤＭＳＯ中の５０ｍＭ溶液をＡＣＮ／ＭｅＯＨ（１／１）で１μＭに希釈することによって、注入を行った。試料溶液を、イオントラップソースに４ｕｌ／分の流量で注入した。

【0274】

Ｔユニオンを介して、ＵＰＬＣシステムからの７５μｌ／分のＨ_２Ｏ／ＡＣＮ（１／１）＋０．１％ギ酸を、化合物溶液流と混合し、流量およびシグナルを安定化させた。

【0275】

下記の条件をイオントラップに適用した。ＥＳＩ陽性、キャピラリー−４ＫＶ、キャピラリー出口１６４．３Ｖ、スキマー４０Ｖ、トラップドライブ８８．４、ネブライザーガス７０ｐｓｉ、ドライガス１０ｌ／分、乾燥温度３５０℃。

【0276】

インキュベートした試料を、イオントラップＨＣＴ ｕｌｔｒａ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）とインターフェースしているＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）で分析した。

【0277】

溶離液は、以下であった。
相Ａ：９５％Ｈ２Ｏ、５％ＭｅＯＨ、０．１％ＨＣＯＯＨ
相Ｂ：５％Ｈ２Ｏ、９５％ＭｅＯＨ、０．１％ＨＣＯＯＨ
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ８、５０×２．１ｍｍ、１．７ｕｍ、５５℃
注入容量：５ｕｌ
クロマトグラフ法を、表８において下記で報告する。

【0278】

表８、代謝プロファイルのためのクロマトグラフ法

【0279】

【表8】

【0280】

試料分析（第２の実験）
化合物ＡおよびＳＣ１２を、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ ＨＣＴｕｌｔｒａ（登録商標）イオントラップ質量分析計とカップリングしたＷａｔｅｒｓ ＵＰＬＣクロマトグラフィーシステムを使用して分析した。

【0281】

溶離液は、以下であった。
相Ａ：９５％Ｈ２Ｏ、５％ＭｅＯＨ、０．１％ＨＣＯＯＨ
相Ｂ：５％Ｈ２Ｏ、９５％ＭｅＯＨ、０．１％ＨＣＯＯＨ
流量０．６ｍｌ／分、カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＳ Ｆ５、３．３ｃｍ×２．１ｍｍ；５５℃
注入量：１０μｌ
クロマトグラフ法を、表９において下記で報告する。

【0282】

表９、クロマトグラフ法

【0283】

【表9】

【0284】

下記の条件を、イオントラップに適用した。
−化合物Ａについて：ＥＳＩ陽性、キャピラリー−４ＫＶ、キャピラリー出口１６４．３Ｖ、スキマー４０Ｖ、トラップドライブ８８．４、ネブライザーガス７０ＰＳＩ、ドライガス１０ｌ／分、乾燥温度３５０℃。
−ＳＣ１２について：ＥＳＩ陽性、キャピラリー−４ＫＶ、キャピラリー出口２００Ｖ、スキマー４９．５Ｖ、トラップドライブ８５．０、ネブライザーガス７０ＰＳＩ、ドライガス１０ｌ／分、乾燥温度３５０℃。

【0285】

定量化のために使用するＭＲＭ転移を、表１０において報告した。

【0286】

表１０、ＭＲＭ転移

【0287】

【表10】

【0288】

データ分析
安定性を、０分時点における面積比（化合物／Ｉ．Ｓ．）に対する各時点における面積比（化合物／Ｉ．Ｓ．）の残存百分率として計算した。一般安定性分類を、表１１に報告する。

【0289】

表１１、１時間のインキュベーションにおける一般安定性分類

【0290】

【表11】

【0291】

ヒト血漿について６０分および３００分において、ならびにウサギ血漿について３０分および１２０分において、すなわち、２つの種が、親化合物の同様の残存百分率を示した時点において、代謝を研究した。スペクトルのＭＳ／ＭＳ分析と親スペクトルを比較することによって構造の割当を行った。

【0292】

結果
血漿安定性（第１の実験）
血漿安定性実験で得た結果を、表１２に示す。

【0293】

化合物Ａは、全ての試験した種において不安定であった。ウサギは最も高いクリアランスを有する種であり、続いてヒトおよびラット種であり、ミニブタは最も低いクリアランスを示した。ウサギ、ラットおよびヒト血漿において、３０分までの曲線の最初の部分は急勾配であり、一方、残りの部分は、より穏やかな勾配を有する。標準物質は、文献のデータと一致した。

【0294】

表１２、ラット、ウサギ、ミニブタおよびヒト血漿における化合物Ａの残存百分率（残存％−平均±Ｓ．Ｄ．）

【0295】

【表12】

【0296】

データは、平均±Ｓ．Ｄ．として表す、ｎ＝２、（^＊）であるとき（ｎ＝１）を除いて
血漿安定性（第２の実験）
化合物ＡおよびＳＣ１２についてのヒト血漿安定性実験の結果を表１３に示した。化合物Ａについて、６０分のインキュベーション後に不安定性（約８０％の残存）が観察され、３００分において５６％の残存に到達した。この第２の実験において、異なるバッチの化合物Ａが、第１の実験に関してヒト血漿の異なる分析条件およびバッチと一緒に利用された。これによって、得られた残存パーセントの間に観察された差異について説明することができた。

【0297】

ＳＣ１２は、１２０分までヒト血漿において安定的であった。化合物の７０％超が、３００分のインキュベーションの後にまだ存在した。このデータは、前の実験において見出されたものと一致する（データは示さず）。同じ実験において試験した標準化合物は、文献のデータと一致した（表１４）。

【0298】

表１３、ヒト血漿における化合物ＡおよびＳＣ１２の残存百分率

【0299】

【表13】

【0300】

データは、平均±Ｓ．Ｄ．として表す、ｎ＝２；（^＊）であるとき（ｎ＝１）を除いて
表１４、ヒト血漿における標準化合物の残存百分率

【0301】

【表14】

【0302】

代謝プロファイル
親化合物の断片化：主要なフラグメントは、表１５に報告するようにＭＳ／ＭＳスペクトルから属性付けした。

【0303】

表１５、化合物Ａの主要なフラグメントの属性

【0304】

【表15】

【0305】

代謝物プロファイリング
代謝プロファイルを、ウサギおよびヒト血漿において研究した。両方のマトリックスにおいて、親化合物（５０ｕＭ、開始濃度）は最後の時点で完全に代謝された。代謝物をフルスキャンで検出し、ピークをＭＨ＋およびＭＳ／ＭＳスペクトルによって割り当てた。親化合物はフルスキャンプロファイルにおいて低い反応を示し、したがって最初のフルスキャンクロマトグラムは有意でなかった。

【0306】

代謝物の概略をＭＨ＋および保持時間と共に、表１６において報告した。ウサギ種において、各々、５５７、８２１および３６０のＭＨ＋を有する３つの代謝物を、１．１分、６．３分および６．４分の保持時間（ｒ．ｔ．）で検出した。

【0307】

最も大量のピークは、ＭＨ＋８２１（Ｍ２）に相当し、これはモノ−エステル生成物に割り当てられたが、１２０分において酸代謝物に１：１で変換された。ジ加水分解された生成物に相当する小さなピークのみが、存在した（ＭＨ＋５５７、Ｍ１）。ヒト血漿において同様のプロファイルがまた観察されたが、２つの主要な代謝物は、ウサギプロファイルと同じＭＨ＋および保持時間を示し、これらの比は６０分のインキュベーションの後で１：１であり、一方、代謝物Ｍ３が３００分において主要な生成物であった。微量のジ加水分解された代謝物（ＭＨ＋５５７）が、ヒト血漿中で既に０時間において存在し、したがってこれは代謝物と見なさなかった。したがって、代謝の律速段階はモノエステルの形成であったが、一方、全ての他の分解段階はより一層速く起こると仮定された。ジアシルグリセロール部分の１位または３位における加水分解の潜在的選択性は属性付けられなかった。

【0308】

表１６、ウサギおよびヒト血漿において同定される代謝物

【0309】

【表16】

【0310】

結論
血漿中の化合物Ａの安定性を、４つの種（ウサギ、ヒト、ラットおよびミニブタ）において研究した。生成物は、ウサギおよびヒトにおいてエステラーゼによって高度に、ならびにミニブタおよびラットにおいてより少ない程度で代謝された。ウサギについて３０分および１２０分において、ならびにヒトについて６０分および３００分において、２つの種において親化合物の残存百分率を概ね一定に維持しながら、代謝を研究した。３つの代謝物がウサギにおいて見出され（Ｍ１、Ｍ２およびＭ３）、それらの２つがヒトにおいて見出された（Ｍ２およびＭ３）。ウサギにおいて、主要な代謝物は、モノエステルおよび酸代謝物であり、一方で、ほんの微量のジ加水分解された代謝物が観察された。ヒト血漿において、ウサギにおいて従前に検出されたモノエステルおよび酸代謝物のみが、選択された時点で同定され、酸生成物は１２０分において主流の代謝物であった。

【0311】

結論として、２つの種は、２つの主要な代謝物のみの形成によって、クリアランスの比較できるプロファイルおよび代謝プロファイルを提示し、律速段階はモノエステル形成をもたらす加水分解であったが、これは酸誘導体に急速に変換された。

【0312】

ＳＣ１２は、ヒト血漿において化合物Ａより安定的であると思われ、化合物の７０％が３００分においてまだ存在した。

【0313】

（実施例６）
ヒト全血アッセイにおける形質細胞様ＤＣ、骨髄ＤＣおよびＢ細胞に対するＴＬＲ７アゴニストの作用強度
目的
イミキモドと比較して、全血アッセイにおいて２つのＴＬＲ７アゴニストの作用強度を決定すること。具体的には、２つのＴＬＲ７アゴニストである化合物ＡおよびＳＣ１２が、全血アッセイにおける免疫細胞の活性化における作用強度の差異を示すかについて調査する。化合物ＡおよびＳＣ１２の生物学的作用の間の差異を示すことができるための最適なパラメーターは、Ｂ細胞、骨髄ＤＣおよび形質細胞様ＤＣの活性化の測定であると考えられた。

【0314】

方法および実験配置
概ね５５ｍＬの新鮮な全血の容量を、（Ｊ．Ａ． Ｉｄａ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、３１０巻、２００６年、８６〜９９頁）に記載されているように、３人の健康な成人の匿名ボランティアからのヘパリン添加Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ中に採取した。ドナーは健康であり、公知の免疫障害を患っておらず、薬物治療を受けていなかった。血液を採取する前に、化合物を、１０×希釈した試料に２０ｕｌで９６ウェル丸底プレートへと加えた。化合物を、血清を有さず、抗生物質を有するＲＰＭＩ培地で希釈した。抗生物質を、１０×濃度で加えた。血液を採取した後、全血試料を穏やかに混合し、均一な試料を得て、１８０ｕｌを、各ウェルに加えた。

【0315】

６時間および２４時間のインキュベーション後に、血漿を、ＥＬＩＳＡのために取り出した（ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＦＮ−α）。ＥＬＩＳＡは、全ての濃度について６時間および２４時間の時点において行った。選択された化合物濃度での２４時間のインキュベーションの後、細胞をＦＡＣＳによって活性化マーカーについて分析した。

【0316】

下記の試料を調製した。

【0317】

実験配置：
１．未処理細胞
２．未処理細胞（ビヒクル対照）
３．イミキモド（古いバッチ）
４．化合物Ａ（古いバッチ）
５．ＳＣ１２（古いバッチ）
全ての化合物を、最終濃度として０、０．０１、０．０３、０．１、０．５、２．０、１０．０マイクロモルの濃度で配置した。ビヒクル対照はＤＭＳＯ対照であり、本発明者らは化合物について使用した最も高い濃度を使用した。血液を加えた後、全てのプレートを、収集まで３７℃および５％ＣＯ_２で穏やかに撹拌した。試料を６時間または２４時間のインキュベーションの後に取り出し、適当なチューブ（２ｍｌ）中にプールした。

【0318】

６時間の時点について、プレートを５００×ｇで遠心分離した。上清（ＳＮ）をチューブに移し、１０．０００×ｇで１０分間遠心分離し、細胞およびタンパク質凝集物を除いた。浄化した上清を、分析まで−８０Ｃで冷凍した。

【0319】

２４時間の時点について、ウェル中の試料をチューブ中にプールし、これを５００×ｇで４Ｃにて１０分間遠心分離し、ＳＮを浄化した。ＳＮを別のチューブに取り出し、１０．０００×ｇで１０分間遠心分離し、凝集物などを除いた。浄化した上清を、分析まで−８０℃で冷凍した。

【0320】

ＦＡＣＳ分析
フローサイトメトリー分析は、２つの化合物濃度による２４時間の処理の後に、３人のドナーからの全血で行った。ドナー１およびドナー２についてのＦＡＣＳ分析は、ドナー３とは異なる日に行った。化合物濃度は下記の通りであった。
Ｂ細胞活性化：２ｕＭおよび１０ｕＭ
ｍＤＣ／ｐＤＣ：０．１ｕＭおよび０．５ｕＭ。

【0321】

ＦＡＣＳ分析を使用して、試験化合物が、Ｂ細胞、ならびに２つの異なるサブセットの樹状細胞、すなわち、骨髄ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ１２３−ＤＣおよび形質細胞様ＣＤ１１ｃ−／ＣＤ１２３＋ＤＣの活性化を誘発することができるかを同定した。下記のマーカーを研究し、異なるサブセットの活性化状態を同定した。
Ｂ細胞：ＨＬＡ−ＤＲ／ＣＤ２０／ＣＤ４０
ｐＤＣ：ＨＬＡ−ＤＲ／ＣＤ１２３＋／ＣＤ１１ｃ−／ＣＤ８０
ＨＬＡ−ＤＲ／ＣＤ１２３＋／ＣＤ１１ｃ−／ＣＤ８６
ＨＬＡ−ＤＲ／ＣＤ１２３＋／ＣＤ１１ｃ＋／ＣＣＲ７
ｍＤＣ：ＨＬＡ−ＤＲ／ＣＤ１２３−／ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ８０
ＨＬＡ−ＤＲ／ＣＤ１２３−／ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ８６
ＨＬＡ−ＤＲ／ＣＤ１２３−／ＣＤ１１ｃ＋／ＣＣＲ７。

【0322】

メーカーの説明書によって、ＦＡＣＳ染色を行った。自己蛍光を最小化するために、赤血球の溶解はＦＡＣＳ染色の前に行った。研究にできるだけ多くのＢ細胞およびＤＣを含めるために、ＦＡＣＳ分析は各染色について全部で５００，０００個の細胞で行った。Ｐ１ゲートを設定して、ＦＳＣ対ＳＳＣ上の関連する細胞のみを含めた（図１２〜１５を参照されたい）。所与のゲート設定における特定の活性化マーカーは実際の細胞サブセットを表すため、個々の分析の結果を平均蛍光強度（ＭＦＩ）値として提示した。アイソタイプバックグラウンド値を使用して、最大で非特異的染色細胞の２％が陽性ゲートにおいて見出すことができるようにゲートを設定した。

【0323】

データ処理：
サイトカインの濃度は、Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓからのＥＬＩＳＡによって決定した。結果は、用量反応曲線を調製するために、およびＥＣ５０値の決定のために、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍで分析した。ＦＡＣＳ分析をＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用することによって行い、続いてＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍで例示した。

【0324】

統計分析：
個々のＥＣ５０値の間の統計的評価は、不均一分散を伴う両側Ｔ検定を使用して決定する関連するサイトカインについてであった。

【0325】

結果および考察：
サイトカイン分泌
６時間および２４時間後のＩＬ−６分泌
化合物ＡおよびＳＣ１２との６時間のインキュベーションの後に、全てのドナーは、ＩＬ−６分泌を用量依存的に誘発した。イミキモドは、低く僅かな量のＩＬ−６を誘発し、これによって化合物ＡおよびＳＣ１２についてのようにシグモイド用量反応曲線は可能でなかった。表１７に見られるように、ＥＣ５０値を化合物ＡおよびＳＣ１２について決定した。３人のドナー全てにおいて、ＳＣ１２が化合物Ａより僅かに強力なＥＣ５０値を示す傾向があった。しかし、３人のドナーのみに基づいており、これは統計的に有意であると確認することができなかった。

【0326】

表１７、ＴＬＲ７アゴニストによる全血における６時間のインキュベーションの後のＩＬ−６分泌についてのＥＣ５０値

【0327】

【表17】

【0328】

化合物Ａ、ＳＣ１２およびイミキモドとの２４時間のインキュベーションの後、全てのドナーは、ＩＬ−６分泌を誘発したが、イミキモドは、試験した最も高い濃度においてのみ誘発した。ＥＣ５０値を全ての化合物について決定したが、しかしイミキモドについては最も高い濃度のみが検出可能なレベルを有意に超えたためこの決定は正確でなく、これによってシグモイド用量反応曲線は可能ではなかった。２４時間のインキュベーション後のＩＬ−６のレベルは、６時間のインキュベーションの後に見られたＩＬ−６のレベルをほんの僅かに超えた。２４時間のインキュベーション後のＩＬ−６分泌についての全ての化合物のＥＣ５０値は、表１８に見られた。ＳＣ１２が僅かにより強力であり、３人のドナー全てにおいて化合物Ａより低いＥＣ５０値を示したという６時間においての傾向と同じ傾向が２４時間においてあった。化合物ＡおよびＳＣ１２についてのＥＣ５０値における３人のドナー全てについての結果の間の両側Ｔ検定を使用した比較は、０．０７のＰ値を示したが、これは２つの化合物についての反応に有意差がなかったことを示す。

【0329】

表１８、ＴＬＲ７アゴニストによる全血における２４時間のインキュベーションの後のＩＬ−６分泌についてのＥＣ５０値

【0330】

【表18】

【0331】

要約すれば、３人のドナー全てにおいて、化合物ＡおよびＳＣ１２によってＩＬ６−分泌が同様のレベルまで誘発され、同様のＥＣ５０値であったが、ＳＣ１２は僅かにより強力である傾向を示した。さらに、ＩＬ−６分泌の範囲（４０００〜８０００ｐｇ／ｍｌ）は、Ｃｌａｒｋｅら、Ｊｏｕｒ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ＆ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２９巻、２号、２００９年、１１３〜１２６頁によって公開された結果と一致した。

【0332】

６時間および２４時間後のＩＦＮ−α分泌
化合物ＡおよびＳＣ１２との６時間のインキュベーションの後に、全てのドナーは、ＩＦＮ−α分泌を用量依存的に誘発し、一方、イミキモドは、ＩＦＮ−α分泌を誘発しなかった。ドナー１および２は、ＩＦＮ−αを２０００ｐｇ／ｍｌ範囲のレベルに誘発したが、一方、ドナー３は、５００ｐｇ／ｍｌ範囲に誘発したのみであった。表１９に見られるように、化合物ＡおよびＳＣ１２についてＥＣ５０値を決定した。３人のドナー全てにおいてＳＣ１２が化合物Ａより僅かに強力なＥＣ５０値を示す傾向が再びあったが、これは有意でなかった（Ｐ＝０．２３）。

【0333】

表１９、ＴＬＲ７アゴニストによる全血における６時間のインキュベーションの後のＩＦＮ−α分泌についてのＥＣ５０値

【0334】

【表19】

【0335】

化合物Ａ、ＳＣ１２およびイミキモドとの２４時間のインキュベーションの後に、全てのドナーは、ＩＦＮ−α分泌を誘発したが、イミキモドは再び、試験した最も高い濃度においてのみ誘発した。ＥＣ５０値を、化合物ＡおよびＳＣ１２について決定した。イミキモドについてのＥＣ５０値は、最も高い濃度のみにおける誘発によって再び正確ではなかった。ドナー１および２について、２４時間のインキュベーションの後のＩＦＮ−αのレベルは、６時間のインキュベーションの後に見られるＩＦＮ−αのレベル未満であったが、このサイトカインはアッセイにおいて細胞によって除去することができることを示す。２４時間のインキュベーション後のＩＦＮ−α分泌についての全ての化合物のＥＣ５０値は、表２０において見られた。２４時間後、３人のドナー全ては、１０００ｐｇ／ｍｌ範囲でＩＦＮ−αを誘発し、ドナー３は、ドナー１および２より遅く化合物ＡおよびＳＣ１２に反応したことを示した。ＳＣ１２は再び、化合物Ａより僅かに強力であったが、これは有意差がなかった（Ｐ＝０．１１）。

【0336】

表２０、ＴＬＲ７アゴニストによる全血における２４時間のインキュベーションの後のＩＦＮ−α分泌についてのＥＣ５０値

【0337】

【表20】

【0338】

結論として、ＩＦＮ−α分泌は、３人のドナー全てにおいて化合物ＡおよびＳＣ１２によって同様のレベルまで誘発され、同様のＥＣ５０値を有したが、ＳＣ１２は、僅かにより強力である傾向を示した。公開された結果と比較して、この研究において分泌されたＩＦＮ−αの範囲（１０００〜２０００ｐｇ／ｍｌ）は、レシキモドで示された公開されたデータよりも高かった（＜２００ｐｇ／ｍｌ）（Ｃｌａｒｋｅら、Ｊｏｕｒ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ＆ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２９巻、２号、２００９年、１１３〜１２６頁）。しかし、これは化合物ＡおよびＳＣ１２と比較した、予想されるより低いレシキモドの作用強度によって説明することができる。第２に、ＩＦＮ−α分泌は主にｐＤＣによって誘発されることが公知であったが、この研究においてＩＦＮ−αが６時間後に既に分泌されていたため、ｐＤＣは、化合物ＡおよびＳＣ１２による全血細胞の処理の後に見られる最初の反応の１つとして活性化されたことをこれは示す（Ｊ．Ａ． Ｉｄａ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌ ｍｅｔｈｏｄｓ、３１０巻、２００６年、８６〜９９頁）。

【0339】

６時間および２４時間後のＩＬ−１０分泌
イミキモド、化合物ＡまたはＳＣ１２との６時間のインキュベーションの後に、ＩＬ−１０産生は見られなかったが、これは、ＩＬ−１０分泌が、ＴＬＲ７アゴニストによる全血細胞の処理に対する二次的作用であったことを示す。化合物Ａ、ＳＣ１２またはイミキモドとの２４時間のインキュベーションの後に、全てのドナーはＩＬ−１０分泌を誘発したが、イミキモドは再び、試験した最も高い濃度のみにおいて誘発した。ＥＣ５０値を全ての化合物について決定したが、しかしイミキモドについて、この決定は再び最も高い濃度のみにおけるＩＬ−１０の誘発によって正確でなかった。２４時間のインキュベーションの後のＩＬ−１０分泌についての全ての化合物のＥＣ５０値は、表２１に見られた。２４時間後、３人のドナー全ては、２０００〜４００００ｐｇ／ｍｌ範囲でＩＬ−１０を誘発した。化合物ＡおよびＳＣ１２は、ＩＬ−１０を誘発する同様の能力を示したが、２つの化合物の間に有意差はなかった。

【0340】

表２１、ＴＬＲ７アゴニストによる全血における２４時間のインキュベーションの後のＩＬ−１０分泌についてのＥＣ５０値

【0341】

【表21】

【0342】

結論として、ＩＬ−１０は、アッセイにおいて後で誘発された（６時間後に誘発はないが、２４時間のインキュベーションの後にのみ誘発された）。これは、ＩＬ−１０が、恐らく試験した化合物によるＴＬＲ７ライゲーションの直接の作用としてではなく、アッセイにおける二次反応として誘発されたことを示す。これは、ＩＬ−１０がヒトＰＢＭＣモデルにおいて４時間後ではなく、１２時間および２０時間後にのみ誘発されたＤｏｕａｇｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１８２巻、２００９年、１９９１〜２００１頁による研究と一致した。さらに、Ｄｏｕａｇｉらは、ｍＤＣが、ｐＤＣと比較して、ＩＬ−１０の主要な産生細胞であったことを示した。マウスマクロファージおよびｍＤＣが、ＴＬＲライゲーションの後でｐＤＣよりＩＬ−１０を一層強力に産生したことを示したＢｏｏｎｓｔｒａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７７巻、２００６年、７５５１〜７５５８頁による研究によって支持されて、ＴＬＲ７ライゲーションによるＩＬ−１０分泌についての現在の結果は、ＩＬ−１０の分泌が、ｍＤＣまたは潜在的に全血アッセイにおいて存在するマクロファージにおいて、潜在的に二次反応として起こることを示す。

【0343】

６時間および２４時間後のＩＬ−１２ｐ４０分泌
化合物ＡおよびＳＣ１２との６時間のインキュベーションの後に、全てのドナーは、用量反応的態様でＩＬ−１２ｐ４０分泌を誘発し、一方、イミキモドは、最も高い濃度においてでさえもＩＬ−１２ｐ４０分泌を誘発しなかった。全てのドナーは、８．０００〜１２．０００ｐｇ／ｍｌ範囲のレベルにＩＬ−１２ｐ４０を誘発した。表２２に見られるように、ＥＣ５０値は化合物ＡおよびＳＣ１２について決定した。化合物は、ＩＬ−１２ｐ４０の誘発において同様に強力であるようであった（有意差なし）。

【0344】

表２２、ＴＬＲ７アゴニストによる全血における６時間のインキュベーションの後のＩＬ−１２ｐ４０分泌についてのＥＣ５０値

【0345】

【表22】

【0346】

化合物Ａ、ＳＣ１２またはイミキモドとの２４時間のインキュベーションの後に、全てのドナーは、化合物ＡおよびＳＣ１２による処理の後で、２０．０００〜２５．０００ｐｇ／ｍｌ範囲のＩＬ−１２ｐ４０のレベルにＩＬ−１２ｐ４０分泌を誘発し、一方、イミキモドは、最も高い濃度においてでさえもＩＬ−１２ｐ４０を誘発しなかった。表２３に見られるように、ＥＣ５０値を化合物ＡおよびＳＣ１２について決定した。両方の化合物は、同様のＥＣ５０値を示した（有意差なし）。

【0347】

表２３、ＴＬＲ７アゴニストによる全血における２４時間のインキュベーションの後のＩＬ−１２ｐ４０分泌についてのＥＣ５０値

【0348】

【表23】

【0349】

結論として、ＩＬ−１２ｐ４０−分泌は、３人のドナー全てにおいて化合物ＡおよびＳＣ１２によって同様のレベルに誘発され、同様のＥＣ５０値を有した。誘発は６時間および２４時間の処理の両方において見られ、２４時間の時点で量は増加した。マクロファージおよびｐＤＣにおける産生と比較して、マウス細胞においてＩＬ−１２ｐ４０は、ＴＬＲライゲーションによってｍＤＣにより主に産生される（Ｂｏｏｎｓｔｒａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７７巻、２００６年、７５５１〜７５５８頁）。ＩＬ−１２ｐ４０発現の同様のパターンがヒト細胞について見られた場合、化合物ＡおよびＳＣ１２が、ヒトｍＤＣにおいて同様の活性化プロファイルに従うことを示す。

【0350】

サイトカイン分泌に関する結論
化合物ＡおよびＳＣ１２は、全血細胞アッセイからの上清において同定されたＤＣにより分泌されるサイトカインの強力な誘発物質であり、一方、イミキモドはこれらのサイトカインの弱い誘発物質であった。ＰＢＭＣモデルにおける同じ化合物による従前の結果に基づいて、この結果は予想された。ＳＣ１２が、化合物Ａの作用強度と比較して、ＩＬ−６およびＩＦＮ−αの誘発において僅かにより強力である傾向があった。しかし、使用された３人のドナーの数によって、これは、統計的に有意であると示すことができなかった。

【0351】

ＩＬ−１０およびＩＬ−１２ｐ４０分泌について、化合物ＡおよびＳＣ１２は、この研究に基づいて同様に強力であった。ＩＬ−１０は、６時間のインキュベーション後に産生されなかったが、２４時間のインキュベーションの後のみに産生された。ＩＬ−１２ｐ４０は、６時間のインキュベーションの後および２４時間のインキュベーションの後の両方で誘発された。

【0352】

ＰＢＭＣおよび全血アッセイのＴＬＲ７活性化に関する現在の知識に基づいて、ｐＤＣは、ＩＦＮ−αの主要な産生細胞であることが公知である。ＩＬ−６は、ｍＤＣおよびｐＤＣの両方によって産生され、ＩＬ−１０は、ｍＤＣによって主に産生され、ＩＬ−１２ｐ４０は、ｍＤＣによって主に産生された。ＩＬ−６およびＩＦＮ−αの産生パターンは、ＳＣ１２が化合物ＡよりｐＤＣの活性化において僅かに強力であったことを示すことができた。ヒト初代細胞によるアッセイにおいて、ｐＤＣのＴＬＲ７リガンドの存在および活性化は、Ｂ細胞増殖の刺激のために必要であり、ｐＤＣからのＩＦＮ−αの産生は、Ｂ細胞増殖の活性化および抗体産生の開始のために必要であることが公知であった（Ｄｏｕａｇｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１８２巻、２００９年、１９９１〜２００１頁、図２および３）。

【0353】

ＰＢＭＣモデルにおける化合物ＡおよびＳＣ１２の試験による従前のモデルにおいて、化合物Ａは、ＩＬ−６分泌においてＳＣ１２より僅かに強力である傾向を示したが、これは従前の研究において有意でなかった。２つのモデルにおける化合物の作用強度における差異は、親油性の差異が各アッセイにおける細胞プールへの分配における差異を潜在的に示すため、化合物の化学的または物理学的性質における差異によって潜在的に説明することができる。全血アッセイは、大量の赤血球および血小板の存在によって概ね５０％の細胞容積を含有する。対照的に、ＰＢＭＣモデルは、より一層低い細胞容積（＜５％）を含有する。これに関して、全血アッセイ中に存在する多量の細胞は、高度に親油性の化合物のための緩衝液として作用し得る。

【0354】

ＦＡＣＳ分析
Ｂ細胞分析（図１２）：
Ｂ細胞上の活性化マーカーＣＤ４０の発現の分析を、二重陽性ＨＬＡ−ＤＲ（ＭＨＣクラスＩＩ）（Ｐ４ゲート）およびＣＤ２０細胞（Ｂ細胞マーカー）（Ｐ８ゲート）で行った。図１２は、３人のドナー（Ｄ１〜Ｄ３）からの全血で行った、示したような試験試薬による２４時間のインキュベーションの後の、二重陽性ＨＬＡ−ＤＲ＋／ＣＤ２０＋Ｂ細胞に対するＣＤ４０発現についてのＭＦＩ値を含めた、試験化合物による２４時間の処理の後の３人のドナーからの結果を示す。

【0355】

活性化マーカーＣＤ４０は、最も高い濃度（１０ｕＭ）での対照化合物イミキモドによる処理の後で、未処理またはＤＭＳＯ処理細胞と比較して、３人のドナー全てにおいて発現の増加を示す。試験化合物である化合物ＡおよびＳＣ１２の両方は、ドナー１およびドナー２において、全ての試験した濃度でＣＤ４０発現を誘発した。しかし、ドナー３において、未処理細胞と比較して、最も高い濃度の２つの試験化合物のみがＣＤ４０発現を誘発した。３人のドナー全てにおいて、化合物Ａは、１０ｕＭで試験したときに、３人のドナー全てにおいてＳＣ１２より僅かに高いＣＤ４０発現を刺激する弱い傾向を示した。しかし、この傾向は、少数のドナーのために、統計的に有意であると確認することができない。

【0356】

ＤＣ分析（図１３〜１５）：
同時刺激活性化マーカーＣＤ８０およびＣＤ８６ならびにケモカイン受容体ＣＣＲ７の発現パターンを、２つの異なるサブセットのＤＣで調査した。ドナー１からの未処理細胞についてのＤＣ分析のための試料は失われたが、未処理の（ＤＭＳＯ）対照細胞であった平行試料は、同様の対照細胞としての役割を果たした。

【0357】

１．骨髄樹状細胞（ｍＤＣ）：
骨髄ＤＣの分析は、ＨＬＡ−ＤＲ＋／ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ１２３−細胞に基づいており、したがって、全ての分析した細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ＋（Ｐ３）ゲートおよびＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ１２３−（Ｑ４）ゲートに含まれた（図１３〜１５におけるゲートを参照されたい）。

【0358】

ドナー１および２においてイミキモドはＣＤ８０の弱い発現を誘発したことが見出されたが、これはＣＤ８０発現が高かったドナー３と対照的であった。試験化合物である化合物ＡおよびＳＣ１２の両方は、３人のドナー全てにおいて、注目すべきＣＤ８０発現を誘発した。３人のうち２人のドナー（Ｄ１およびＤ３）において、最も高い濃度（０．５ｕＭ）のＳＣ１２は、ＣＤ８０発現に対して強力な刺激を示したが、これは化合物Ａについて見られたレベルより高かった。ドナー２において、化合物Ａは、最も高い濃度においてのみＳＣ１２より僅かに強力にＣＤ８０発現を刺激した。

【0359】

ｍＤＣにおけるＣＤ８６発現の分析は、未処理細胞が、３人のドナー全てにおいて高レベルのＣＤ８６を既に発現していたことを示したが、これは珍しい観察ではなかった。しかし、化合物Ａは、３人のドナー全てにおいて、ＣＤ８６の発現をさらに刺激する。ＳＣ１２は、ドナー２および３において、弱いＣＤ８６発現を誘発するが、ドナー１において誘発しない。０．１ｕＭでの最も低い濃度の両方の試験化合物は、ＣＤ８６発現を最も強力に誘発することを示した。これは、０．５ｕＭでの最も高い試験した用量が最も強力な濃度であったＣＤ８０発現と対照的であった。

【0360】

リンパ節ホーミング受容体であるケモカイン受容体ＣＣＲ７をまた、ｍＤＣで調査した。ＣＣＲ７発現は、ＣＤ８０およびＣＤ８６より高いドナー間の差異を示した。全てのドナーについて、化合物Ａは、最も高いＣＣＲ７発現を誘発し、ドナー１および３について、イミキモドはまた、高いＣＣＲ７発現を示したが、これはドナー２において見られなかった。ＳＣ１２は、全てのドナーについてＣＣＲ７発現のより強力でない刺激物質であった。

【0361】

２．形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）
ｐＤＣの分析は、ＨＬＡ−ＤＲ＋／ＣＤ１１ｃ−／ＣＤ１２３＋細胞に基づき、したがって、全ての分析した細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ＋（Ｐ３）ゲートおよびＣＤ１１ｃ−／ＣＤ１２３＋（Ｑ１）ゲートに含まれた。（図１３〜１５）。

【0362】

ｐＤＣにおいて、化合物ＡおよびＳＣ１２の両方は、３人のドナー全てにおいてＣＤ８０発現パターンにおける比較できる作用を示す。しかし、ＳＣ１２は、３人のドナー全てにおいて、化合物Ａより僅かに高いＣＤ８０発現を誘発する（ドナー３におけるより低い濃度を除く）。

【0363】

ｐＤＣにおけるＣＤ８６の発現は、ＳＣ１２が、３人のドナー全てにおいて、化合物Ａよりも高いＣＤ８６発現を誘発する傾向を有することを示す。しかし、ドナー１および３において、０．１ｕＭでの最も低い用量が最も高いＣＤ８６発現を誘発し、一方、ドナー２において、０．５ｕＭは最も強力な濃度であったため、最も強力な濃度は変化する。イミキモドは、ドナー３においてＳＣ１２および化合物Ａと同様の高いＣＤ８６発現を誘発する。

【0364】

ｐＤＣにおけるＣＣＲ７発現パターンは、ｍＤＣにおいて本発明者らが見出したものと同様であった。化合物Ａは、３人のドナー全てにおいて、ＳＣ１２より非常に高いＣＣＲ７発現を誘発した。図１６において、イミキモドは、３人のドナー（Ｄ１〜Ｄ３）からの全血に対して行った、示されるような試験試薬による２４時間のインキュベーションの後に、ＨＬＡ−ＤＲ＋／ＣＤ１１ｃ−／ＣＤ１２３＋ｐＤＣにおいてＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＣＲ７発現についてＭＦＩ値を示す。

【0365】

ＦＡＣＳ分析の結論：
Ｂ細胞研究についての全体的な結論は、３人のドナー全てにおいて、最も高い濃度（１０ｕＭ）での化合物ＡがＳＣ１２より僅かに高いレベルの成熟マーカーＣＤ４０を刺激するということであった。

【0366】

ＤＣ活性化について、ＳＣ１２は、活性化マーカーＣＤ８０の刺激に関して、化合物Ａより非常に強力であったが、（少数の例外が見られたが）ｍＤＣおよびｐＤＣの両方についても同様であった。

【0367】

活性化マーカーＣＤ８６について、化合物Ａは、ｍＤＣにおいてＳＣ１２より僅かに強力であり、一方、ＳＣ１２は、ｐＤＣにおいて化合物Ａより僅かに強力であったため、結果は少し異なった。しかし、ＣＤ８６の発現についての最も強力な濃度は、ドナーによって異なる。

【0368】

ケモカイン受容体ＣＣＲ７の発現は、化合物Ａが、大部分のドナーにおいて両方のＤＣサブセットにおいてＳＣ１２より強力であったことを示した。ＣＤ８６発現に関して、ＣＣＲ７誘発についての最も強力な化合物濃度は、ドナーによって異なった。

【0369】

イミキモドは一般に、全ての調査したマーカーの発現について、Ｂ細胞、ｍＤＣならびにｐＤＣにおいて、ドナー３においてのみ強力であることを示した。

【0370】

結果
化合物ＡおよびＳＣ１２は、サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＦＮ−αの誘発、ならびにＢ細胞、ｐＤＣおよびｍＤＣの両方における成熟マーカーの発現の増加において強力であった。これらのパラメーターについて測定した化合物ＡおよびＳＣ１２の生物学的作用の間の差異は、有意でなかった。しかし、より多数のドナーが使用された場合、統計的に有意な作用を示すことが可能であり得る。いくつかの作用は、ボーダーラインの有意性を示し、いくつかの成熟マーカーは、化合物の１つによってより強力に誘発される傾向を示した。

【0371】

傾向は、以下を示した。
化合物Ａは、下記のエンドポイントについてＳＣ１２より強力である傾向を示した。
１．ｍＤＣにおける成熟マーカーＣＤ８６の誘発
２．ｍＤＣおよびｐＤＣの両方についての移動受容体ＣＣＲ７の誘発
３．Ｂ細胞活性化マーカーＣＤ４０の誘発
ＳＣ１２は、下記のエンドポイントについて化合物Ａより強力である傾向を示した。
１．ｍＤＣおよびｐＤＣの両方における成熟マーカーＣＤ８０の誘発
２．ｐＤＣにおける移動マーカーＣＤ８６の誘発
３．サイトカインＩＬ−６およびＩＦＮ−αの誘発
ＩＬ−１０またはＩＬ−１２ｐ４０誘発のレベルにおいて、傾向を見ることができなかった。

【0372】

これらの結果に基づいて、化合物ＡおよびＳＣ１２は、新鮮なヒト血液と共にインキュベートするときに、有意に異なって挙動すると結論付けることはできない。

【0373】

ＣＤ８０およびＣＤ８６は、ＳＣ１２によってｐＤＣにおいてより強力に誘発され、ｐＤＣサイトカインＩＦＮ−αは、ＳＣ１２によってより強力に誘発されたため、ＳＣ１２は、ｐＤＣ活性化において化合物Ａより僅かに強力であった。さらに、化合物Ａは、Ｂ細胞活性化において僅かにより強力であり得る（１０ｕＭの濃度で試験したときに特に見られる）。

【0374】

（実施例７）
正所性ラット膀胱におけるイミキモドおよびＳＣ１２による前臨床プラセボ対照有効性研究
この研究のゴールは、Ｆ３４４ラットの正所性膀胱がんモデルにおけるイミキモド（Ｒ−４８７（１））およびＳＣ１２の液体製剤の有効性を評価することであった。４つの群（イミキモド、ＳＣ１２、ビヒクルおよびプラセボ群）を比較した。処理後、動物の健康な状態をモニターし、ラット膀胱および腫瘍に対する反応を組織病理学的に評価した。

【0375】

動物、材料および方法
腫瘍細胞
ＡＹ−２７ラット膀胱がん細胞株は、ＦＡＮＦＴ（Ｎ−［４−（５−ニトロ−２−フリル）−２−チアゾリル］ホルムアミド）を与えられたＦｉｓｃｈｅｒ Ｆ３４４ラットにおける原発性膀胱腫瘍から確立した。細胞株は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＡｌｂｅｒｔａおよびＣｒｏｓｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｅｄｍｏｎｔｏｎ、Ａｌｂｅｒｔａ、Ｃａｎａｄａから親切にも提供された。細胞を、加湿した９５％空気／５％二酸化炭素雰囲気中で、１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０（Ｌ−グルタミンを有する培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））において単層として培養した。培地を１週間に２回交換し、コンフルエントとなったとき、細胞を標準的トリプシン処理手順で継代した。実験のために使用した継代数は、２８および２９であった。

【0376】

動物
全部で５６匹の雌性Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｆ３４４ラットはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ Ｃｅｄｅｘ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、実験の開始前に少なくとも１週間順応させた。１７０ｇ±１０ｇの体重のラットを、１２時間の明／暗サイクルを伴う温度制御した環境で、ｇｏｌｄ ｆｌａｋｅｓ敷料（ＳＰＰＳ、Ｆｒａｓｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を有し、環境に恵まれた個々のケージ（Ｔｅｃｈｎｉｐｌａｓｔ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）に収容し、標準的な固形飼料および水に自由にアクセスさせた。毎日、ラットを秤量し、健康な状態についてモニターした。動物手順は動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）、Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ（Ｒａｄｂｏｕｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｎｉｊｍｅｇｅｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒｅ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって承認される必要があり、オランダおよびヨーロッパの規制に従ったプロトコルに従って行った。

【0377】

試料サイズの計算
５０％の予想される治療作用、０．０５のα、８０％の累乗および８０％腫瘍発生を使用して、群のサイズを計算した。これによって、１４の最小の群のサイズを得た。

【0378】

腫瘍細胞埋込み
腫瘍細胞埋込みを、Ｘｉａｏらのプロトコルによって０日目に行った（２）。Ｆ３４４ラットは、アイソジェニック腫瘍細胞を受け入れ、８０％超の膀胱腫瘍の確立がもたらされた（３）。エンロフロキサシン（Ｂａｙｅｒ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（５〜１０ｍｇ／ｋｇ）を、各カテーテル処置前に抗菌予防のために皮下に注射した。吸入麻酔：イソフルラン２〜５％（導入）、続いてイソフルラン２％、一酸化窒素０．５Ｌ／分および酸素１Ｌ／分下で実験を行った。ラット膀胱を、１６ゲージ（１．４ｍｍ）のプラスチック静脈内カニューレ（ＢＤ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ−Ａａｌｓｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって尿道を介してカテーテル処置し、排出させた。膀胱を０．１Ｍの塩酸塩（ＨＣｌ）（０．４ｍＬ）の１５秒の滴下注入によって事前調整し、０．１Ｍの水酸化カリウム（ＫＯＨ）（０．４ｍＬ）を１５秒間加えることによって中和した。膀胱から排出させ、０．０１ＭのＰＢＳ（０．８ｍＬ）で３回フラッシュした。新たに収集したＡＹ−２７細胞（２８継代および２９継代）を培地に再懸濁させた。膀胱調整の直後、および細胞収集後１時間以内に、細胞（０．５ｍｌの培地中１．５^＊１０^６個）をラット膀胱に滴下注入し、１時間留置した。ラットを１５分毎に９０°回転させた。１時間後、カテーテルを除去し、ラットは自発的に排泄することができた。

【0379】

表２４： 処理群

【0380】

【表24】

【0381】

処理
全てのラットは、膀胱内滴下注入を２日目および５日目に受けた。最初に上記のように、ラットを１時間の吸入によって麻酔した。続いてラットを、１．４ｍｍカニューレ（ＢＤ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して尿道を介してカテーテル処置し、膀胱から排出させ、ｐＨインジケーターストリップ（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してｐＨを測定した。膀胱内滴下注入を、１ｍＬのＬｕｅｒ−Ｌｏｋシリンジ（ＢＤ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して投与した。群１（ｎ＝１４）を、０．５ｍｌのイミキモド（０．１％）で処理した。群２を、０．５ｍｌのＳＣ１２（０．３８％）で処理した。群３は、ビヒクルによる滴下注入（Ｐｈｏｓａｌ５０）を受け、群４は、対照としてＮａＣｌによる滴下注入を受けた。試験剤を、ビヒクルとしてＰｈｏｓａｌ５０（Ｌｉｐｏｉｄ ＡＧ）に溶解した。滴下注入は膀胱内に１時間留まり、ラットを１５分毎に９０°回転させた。１時間後、カテーテルを除去した。自発的に排出された尿のｐＨを、ｐＨインジケーターストリップ（Ｍｅｒｃｋ）を使用して測定した。

【0382】

病理学的評価
１２日目に、二酸化炭素吸入を使用してラットを殺処分した。屍検で内臓を検査し、嚢胞切除を行った。膀胱を秤量し、４％緩衝を使用して固定し、薄片にし、パラフィンに包埋した。５μｍの切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を使用して染色した。泌尿器病理学者が膀胱切片を評価し、ＴＮＭ分類を使用してＴ段階をスコア化した（Ｕｎｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｔｒｅ ｌｅ Ｃａｎｃｅｒ、ＵＩＣＣ、２００２年）。さらに、膀胱毎の腫瘍の総数および腫瘍の浸潤深度を測定した。膀胱壁および／または周辺組織における炎症の量を、０（炎症なし）、１（軽度）、２（中程度）および３（重度の炎症）でスコア化した。

【0383】

結果
実験の間、ラットの健康な状態が損なわれた徴候はなく、人道的なエンドポイントに達したラットはなかった。予想される体重の僅かな減少が麻酔後の一日目にのみ見られたが、滴下注入後の日においては、全てのラットは体重を取り戻した。カテーテル処置の日に軽度の血尿が時折報告された。後日、尿は正常となった。処理の前および後の尿のｐＨは差異を示さなかった。全ての尿のｐＨは、６．５〜７．０で変化した。屍検において、膀胱以外の内臓への異常は見られなかった。肉眼での評価において、腫瘍陽性膀胱は、膀胱外の成長を伴わずに腫瘍塊を有するようである。１つのラット膀胱のみ（群３、ビヒクル処理）が、右の尿道口の近くに右尿管に向かって伸びる塊を示した。

【0384】

膀胱重量
膀胱重量は、腫瘍の存在と相関した（ｐ＜０．０００１、独立試料Ｔ検定）。表において、平均および範囲の概要を示す。群２（ＳＣ１２）と群３（ビヒクル）との間に平均膀胱重量の差異があった（ｐ＝０．００５、独立試料Ｔ検定）。他の群の間に平均膀胱重量における差異は見られなかった。

【0385】

表２５：処理群および対照群毎のラット膀胱の重量、重量（グラム）

【0386】

【表25】

【0387】

炎症
殆ど全部のラットにおいて、ある程度の炎症が存在した。群の間で、統計的有意差は観察されなかった（ｐ＝０．１０６、ピアソンのカイ二乗検定）。軽度および中程度の炎症は、全ての５６ケースの８７．５％を占めた。

【0388】

腫瘍および腫瘍反応
腫瘍陽性膀胱を有するラットの数は、イミキモド処理群（群１）について１４匹中９匹、ＳＣ１２処理群（群２）について１４匹中８匹、ビヒクル対照群（群３）について１４匹中１１匹、およびまたＮａＣｌ対照群（群４）について１４匹中１１匹であった。ビヒクル群における１つのｐＴａ腫瘍を除いて、全ての腫瘍はｐＴ２段階を示す。ｐＴ２腫瘍は、排尿筋に及ぶ。ｐＴａ腫瘍を有するラットにおいて、がん細胞の小さな部分が、正常な尿路上皮内層の上に見られ、浸潤は見られなかった。腫瘍発生に関して、個々の群の間に統計的有意差はなかった。群２と群４との間の腫瘍発生の差異は、０．２１０の有意でないｐ値を示す（フィッシャー直接検定）。所与の処理（例えば、イミキモド、ＳＣ１２、ビヒクルまたはＮａＣｌ）は、ロジスティック回帰分析をデータ上で行ったときに、結果を予測するものでなかった（腫瘍陽性対腫瘍陰性）。

【0389】

【表26】

【0390】

浸潤深度
腫瘍の浸潤深度を、Ｈ＆Ｅ染色した膀胱切片の組織病理学的評価において泌尿器病理学者が測定した。腫瘍細胞が見られた最も深いポイントを、浸潤深度とした。腫瘍陽性膀胱の平均浸潤深度は、個々の処理群（独立試料Ｔ検定、ｐ＝０．４８６〜０．９１２）の間で、またはＳＣ１２処理（群１、２）および対照処理（群３、４）動物（独立試料Ｔ検定、ｐ＝０．７０５）の間で有意差を示さなかった。

【0391】

表２７： 平均腫瘍浸潤深度

【0392】

【表27】

【0393】

腫瘍数
膀胱毎の腫瘍の絶対数は、泌尿器病理学者がカウントした。ビヒクル対照群における腫瘍の数は、他の群より多かった。単変量解析において、ビヒクル群（群３）における腫瘍の数は、群１および群４（ｐ＝０．０２）と、ならびに群２（ｐ＝０．００６）と有意に異なった。

【0394】

表２８：ラット膀胱毎の腫瘍の平均数

【0395】

【表28】

【0396】

結論
イミキモドおよびＳＣ１２は、抗腫瘍活性を引き起こし得る局所的免疫応答をもたらす。この実験の間に毒性の徴候は見られなかった。腫瘍割合に対する処理の作用は統計的に有意ではなかったが、イミキモドおよびＳＣ１２処理された動物に対して好ましい傾向が見られる。これらのデータに基づいて、今後の実験は、有効性を改善するために処理頻度の増加を有し得る。

【0397】

実施例７についての参照文献
（１）Ｈａｙａｓｈｉ Ｔ、Ｃｒａｉｎ Ｂ、Ｃｏｒｒ Ｍ、Ｃｈａｎ Ｍ、Ｃｏｔｔａｍ ＨＢ、Ｍａｊ Ｒら、Ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ７ ａｇｏｎｉｓｔ ＩＭＩＱＵＩＭＯＤ： Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ １、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ、２０１０年５月；１７巻（５号）：４８３〜９０頁。
（２）Ｘｉａｏ Ｚ、ＭｃＣａｌｌｕｍ ＴＪ、Ｂｒｏｗｎ ＫＭ、Ｍｉｌｌｅｒ ＧＧ、Ｈａｌｌｓ ＳＢ、Ｐａｒｎｅｙ Ｉら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｌｅ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｒａｔ ｂｌａｄｄｅｒ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌ ３、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、１９９９年１０月；８１巻（４号）：６３８〜４６頁。
（３）Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｅｎ Ｋ、Ｍｏｌｋｅｎｂｏｅｒ−Ｋｕｅｎｅｎ Ｊ、Ｏｏｓｔｅｒｗｉｊｋ Ｅ、Ｄｅ Ｋａａ ＣＡＨＶ、Ｗｉｔｊｅｓ ＪＡ．、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｒａｔ ｂｌａｄｄｅｒ ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｏｄｅｌ ｂｙ ｃｙｓｔｏｓｃｏｐｙ、Ｂｊｕ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、２００８年４月；１０１巻（７号）：８８９〜９３頁。

【0398】

（実施例８）
ＳＣ１２−細菌変異アッセイの毒性分析
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの試験株における遺伝子変異を誘発する能力について、栄養要求性菌株から原栄養性への復帰変異によって測定するように、ＳＣ１２を調査した。５つの試験株であるＴＡ１５３５、ＴＡ１５３７、ＴＡ９８、ＴＡ１００およびＷＰ２ ｕｖｒＡを使用した。フェノバルビトンおよびβナフトフラボンで事前処理したラットからの肝臓Ｓ９画分を使用して、代謝活性化の不存在下および存在下の両方で実験を行った。ＳＣ１２をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の溶液として使用した。ＳＣ１２を、５０００マイクログラム／プレートの最高濃度、および概ねハーフログ間隔を置いた４つのより低い濃度（１５８０、５００、１５８および５０．０マイクログラム／プレート）で毒性試験においてアッセイした。インキュベーション期間の終わりに、ＳＣ１２の沈殿が２つの最も高い濃度において観察された。Ｓ９代謝の存在下または不存在下で、任意の用量レベルの任意の試験株において毒性は観察されなかった。

【0399】

平板混入法を使用して、５０００マイクログラム／プレートの最大用量レベル、および２倍希釈によって間隔を置いた４つのより低い用量レベル（２５００、１２５０、６２５、および３１３マイクログラム／プレート）でＳＣ１２をアッセイした。Ｓ９代謝の存在下または不存在下で、任意の用量レベルの任意の試験株において毒性は観察されなかった。インキュベーション期間の終わりに、２つの最も高い濃度において、ＳＣ１２の沈殿が観察された。

【0400】

試験した任意の濃度で復帰変異体の数の増加は観察されなかったため、プレインキュベーションステップを、主要アッセイＩＩの全ての処理のために含めた。ＳＣ１２を、主要アッセイＩにおいて用いた同じ用量範囲でアッセイした。Ｓ９代謝の存在下または不存在下で、任意の用量レベルの任意の試験株において毒性は観察されなかった。

【0401】

スコア化を妨げなかったＳＣ１２の用量が関連する沈殿は、インキュベーション期間の終わりに４つの最も高い濃度において観察された。

【0402】

ＳＣ１２は、平板混入またはプレインキュベーションアッセイにおいて、任意の用量レベルで、Ｓ９代謝の存在下または不存在下で、任意の試験株によって復帰変異体コロニーの数の２倍の増加を誘発しなかった。

【0403】

ＳＣ１２は、報告した実験条件下で、Ｓ９代謝の存在下または不存在下で、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて復帰突然変異を誘発しないことが結論付けられた。

【0404】

（実施例９）
ラットにおけるＳＣ１２−単回用量静脈内研究の毒性分析
ＳＣ１２の急性毒性を、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットへの単一の静脈内投与、それに続く１４日の観察期間の後に調査した。引き続いて１匹の雄および１匹の雌ラットの群に７６、１００、８５および９０ｍｇ／ｋｇを投与し、７日の期間観察することによって予備相を行った。同様に構成されたさらなる群は、ビヒクル単独を投与され、対照としての役目を果たした。７６ｍｇ／ｋｇで死亡は起こらなかった。臨床的症状は、投与の日に観察された立毛および活性の低下に限定された。

【0405】

第２の群は、１００ｍｇ／ｋｇで投与された。両方の動物は投与によって痙攣の後に死亡した。次いで、第３の群は、８５ｍｇ／ｋｇで投与された。投与の日に、立毛が観察された。第４の群は、最終的に９０ｍｇ／ｋｇで投与された。死亡は起こらなかった。研究の２日目から４日目まで、立毛は観察されなかった。ビヒクル単独で処理された雄および雌動物において死亡は起こらず、臨床的症状は指摘されなかった。

【0406】

主要相において、５匹の雄動物および５匹の雌動物を９０ｍｇ／ｋｇで投与し、１４日の期間観察した。同様に構成された第２の群は、ビヒクル単独を受け、対照としての役目を果たした。９０ｍｇ／ｋｇで処理された３匹の雄は、投与の直後に死亡し、一方、２匹の雌は投与後２時間で死亡した。さらに、９０ｍｇ／ｋｇで投与された１匹の雄および１匹の雌は、研究の２日目に死亡していることが見つかった。単収縮、運動失調、立毛、活性の低下および猫背の姿勢が、動物において死亡前に観察される主要な徴候であった。運動失調、立毛、活性の低下、猫背の姿勢および半分閉じた目が、投与の日に生き残っている動物において指摘された。立毛は、研究の３日目まで観察された。同様に構成された第２の群は、８０ｍｇ／ｋｇで投与された。観察期間の間に、死亡は起こらず、臨床的症状は記録されなかった。ビヒクル単独を受けた動物において、死亡は起こらず、臨床的症状は観察されなかった。

【0407】

９０ｍｇ／ｋｇで処理された生き残っている動物、および８０ｍｇ／ｋｇで投与された動物は、研究の２日目に僅かから中程度の体重の減少を示した。１５日目までに回復が起こり、体重の変化は、研究の終わりに動物のこの種および年齢について予想される範囲内であった。研究の間にビヒクル単独を受けた動物において、体重の関連する変化は観察されなかった。生き残っている動物を、観察期間の終わりに二酸化炭素麻酔によって死亡させた。初期に死亡した動物を含めた全ての動物は、屍検に供された。９０ｍｇ／ｋｇでの処理された動物（初期に死亡した動物を含めた）、８０ｍｇ／ｋｇでの処理された動物、および対照動物の全てにおいて行った屍検において、異常は観察されなかった。これらの結果は、試験品目ＳＣ１２が、９０ｍｇ／ｋｇでの単回用量の静脈内投与に続いてラットにおいて死亡または毒性の有意な徴候を誘発し、一方、死亡および毒性の徴候は８０ｍｇ／ｋｇでは観察されなかったことを示す。したがって、この研究における最大耐用量は、８０ｍｇ／ｋｇであると考えられた。

【0408】

（実施例１０）
結合アッセイ
イミキモドおよびＳＣ１２を、各々図１７、および１８に示すように、酵素学的および放射線学的結合アッセイにおいて分析した。ＳＣ１２およびイミキモドを、異なるヒト組換え受容体タイプおよびサブタイプ、またはげっ歯類組織ホモジネートからの膜画分を使用して、放射性リガンド結合アッセイにおいて７３の主要な分子標的の中で評価した。３０マイクロモルの一定の濃度でＳＣ１２を試験した。

【0409】

Ａｌｄａｒａ（イミキモド）による処理の後に、イミキモドは、患者において最も通常の有害事象である疼痛関連症候群と関連する受容体（例えば、アデノシンおよびナトリウムチャネル）と結合することが示された。ＳＣ１２は、このタイプの受容体に結合しなかった。

【0410】

（実施例１１）
マウスにおけるＳＣ１２の静脈内薬物動態の調査
空腹時ＣＤ−１雄マウスにおいてＳＣ１２の薬物動態をアッセイした。

【0411】

材料および方法
ＩＶ急速投与を、５ｍｌ中１ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈に投与した。化合物重量は、２．０８／１０．０４ｍｌであった。２４匹のマウスを研究した。麻酔下の瀉血によって５分、１５分、３０分、６０分、２４０分、４８０分、および２４時間においてサンプリングを得た。ＳＣ１２を、５ｍｌ／ｋｇの用量で、水中の３％ＤＭＳＯ、２０％β−シクロ−デキストリンの製剤で投与した。実験の終わりにエチルエーテルを使用して動物を殺処分した。

【0412】

試料の調製：Ｓｉｒｏｃｃｏフィルタープレート中で、１００マイクロリットルの血漿を、５マイクロリットルのＩＳ（ＩＶ２９８、１０マイクログラム／ｍｌ）および１０マイクロリットルの５％Ｈ_３ＰＯ_４でスパイクした３００マイクロリットルのＡＣＮ／ＭｅＯＨに加えた。プレートを８０ｒｐｍで１０分間振盪し、次いで真空下で５分間濾過した。

【0413】

分析方法：ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ：Ｐｒｅｍｉｅｒｅ ＸＥ、溶離液：水（Ａ）、ＭｅＯＨ（Ｂ）および０．１％ＨＣＯＯＨ、勾配１５％Ｂ〜１００％Ｂ、０．１〜０．５、次いで、均一濃度１００％Ｂ、１．５分まで、流量０．８ｍｌ／分；カラムＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８、１．７マイクロメートル、２．１×５０ｍｍ、５０℃のカラム温度で５マイクロリットルの注入量、ＥＳＩ陽性、ＭＲＭ、抽出器５Ｖ；キャピラリー３．５ｋＶ；ソース温度１１５℃；溶解温度４５０℃。ＳＣ１２：ＭＨ＋９２１．５＞３８５．０５／４３９．２９、ＣＶ３５ＣＥ３３、ＬＬＯＱ：５ｎｇ／ｍｌ。

【0414】

データ分析：ノンコンパートメント分析、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ５．１；線形台形、均一な重量。

【0415】

結果
有害な行動上の作用は、処理において指摘されなかった。

【0416】

ＳＣ１２は、高いクリアランスに反映される、短いＭＲＴを伴う５４１ｎｇ／ｍｌの血漿中のＣｍａｘを示す（表２９）。恐らく減衰の最初の部分における非常に急速なクリアランスによって、最初の時点（５分）においていくらかの動物間のばらつきが観察され、一方、曲線の第２の部分において、血漿中濃度はゆっくりと減少し、２時間後にＬＬＯＱ（定量化の下限）未満となった。

【0417】

生データおよびノンコンパートメント分析結果を、表３０に報告する。

【0418】

表２９：薬物動態パラメーター

【0419】

【表29】

【0420】

表３０：生データおよびノンコンパートメント分析結果

【0421】

【表30】

【0422】

（実施例１２）
ヒトＣＹＰ４５０のインビトロでの阻害
ＳＣ１２とチトクロムＰ４５０酵素との相互作用を、蛍光ハイスループットＰ４５０アッセイ（Ｇｅｎｔｅｓｔ）使用して試験した。化合物のＩＣ５０は、アイソエンザイム（ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ３Ａ５）で計算した。

【0423】

材料および方法
Ｐ４５０アイソフォームの阻害を、ＣＹＰ代謝によって蛍光性となった特異的基質を使用して特異的アッセイにおいて測定した。ＡＣＮ（アセトニトリル）（ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ３Ａ５）またはＤＭＳＯ（全ての残りのアイソフォーム）に溶解した化合物を、インキュベーション／ＮＡＤＰＨ再生緩衝液を含有する９６ウェルプレートにおいて、濃度反応曲線（８つの濃度）において２連で試験した（ｎ＝２）。特異的アイソエンザイムおよび基質を加え、３７℃でインキュベートした。アッセイによって反応は異なる時に終了し、プレートを適当な発光／励起波長でＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔで読み取った。各アイソエンザイムのための公知の阻害剤についての２連で行った濃度反応曲線を、全てのアッセイにおいて陽性対照として試験した。

【0424】

データ分析
各化合物および標準物質について、ＩＣ５０（５０％阻害における濃度）は、Ｇｒａｆｉｔ ｖ．５．０．１を使用することによって決定した。

【0425】

結果
結果を、表３１（化合物）および表３２（標準物質）に示す。

【0426】

ＳＣ１２は、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ５およびＣＹＰ３Ａ４アイソフォームに対して中程度の阻害、ならびにＣＹＰ２Ｃ９に対して弱い阻害を示した一方、他のアイソフォーム活性を阻害しないようであった。ＳＣ１２は、特にＡＣＮ中で低溶解性を示したため、結果を過小評価することができた。行われた実験の全てにおいて標準参照阻害剤は、予想される作用強度を示した。

【0427】

表３１： Ｐ４５０の結果

【0428】

【表31】

【0429】

略語
ＢＦＣ： ７−ベンジルオキシ−４−（トリフルオロメチル）−クマリン
ＣＥＣ： ３−シアノ−７−エトキシクマリン
ＡＭＭＣ： ３−［２（Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ−メチルアミノ）エチル］−７−メトキシ−４−メチルクマリン
ＤＢＦ： ジベンジルフルオレセイン
ＤＭＳＯ： ジメチルスルホキシド
ＥＦＣ： ７−エトキシ−４−トリフルオロメチルクマリン
ＭＦＣ： ７−メトキシ−４−トリフルオロメチルクマリン。

【0430】

表３２： 標準的阻害剤に対するＰ４５０の結果

【0431】

【表32】

【0432】

（実施例１３）
哺乳動物血漿における化合物Ａの代謝安定性およびプロファイリングの調査、ならびにヒト血漿における化合物ＡおよびＳＣ１２の安定性の比較
化合物Ａの安定性を、５時間までラット、ウサギ、ミニブタおよびヒト血漿において試験し、代謝プロファイルを、ウサギおよびヒト血漿において査定した。化合物Ａは、ウサギおよびヒトにおいてエステラーゼ／アミダーゼによって高度に代謝され、ならびにミニブタおよびラット種においてより少ない程度で代謝された。ウサギについて３０分および１２０分において、ならびにヒトについて６０分および３００分において（すなわち、２つの種において、親化合物の概ね同じ残留百分率で機能する）代謝を研究した。３つの代謝物がウサギにおいて見出され、ヒトにおいてそれらの２つが見出された。

【0433】

ウサギにおいて、主要な代謝物は、モノエステル（１つのオレイン酸の喪失、Ｍ２）および酸代謝物（アミド加水分解、Ｍ３）であったが、一方、ほんの微量のジ加水分解された代謝物（両方のオレイン酸の喪失、Ｍ１）が観察された。ヒト血漿において、ウサギにおいて従前検出された最初の２つの主要な代謝物のみが、選択した時点で同定され、酸生成物（Ｍ３）は、１２０分において主流の代謝物であった。

【0434】

結論として、ヒトおよびウサギ種において、２つの主要な代謝物のみの形成によって、クリアランスの比較できるプロファイル、および代謝プロファイルが見出され、律速段階はモノエステル形成（Ｍ２）をもたらす加水分解であり、これは酸誘導体（Ｍ３）に急速に変換される。

【0435】

ＳＣ１２は１２０分まで代謝されず、化合物の７０％超が３００分においてまだ存在した（３００分において未変化の化合物Ａ：５５％）ため、ＳＣ１２と比較して、ヒト血漿において化合物Ａの第２のバッチによって行った第２の実験は、ＳＣ１２が化合物Ａより少し安定的であることを示唆した。

【0436】

（実施例１４）
皮膚がん細胞株に対するＳＣ１２の直接的アポトーシス促進性作用：
イミキモドとの比較
イミキモドは、その免疫調節性作用に加えて、腫瘍細胞においてアポトーシスを直接的に誘発することが報告されてきており、これはインビボでの異なる起源の腫瘍において確認されてきた。必要とされる濃度はＡｌｄａｒａ５％クリーム中の濃度のまだ概ね３ログ未満であるであるため、イミキモドのアポトーシス促進性活性は、インビボでのイミキモドの抗腫瘍作用の一因となり得る。

【0437】

実験方法および結果
細胞株：
皮膚扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）細胞株（ヒト）ＳＣＬ−Ｉ、ＳＣＬ−ＩＩ、ＳＣＣ−１２、ＳＣＣ−１３は、これらの成長挙動、およびデスリガンド（ＣＤ９５Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ−α）に対するアポトーシス感受性に関して、ならびに他の処理に関して良好に特性決定された。ＳＣＣ細胞は、標準条件（１０％ＦＢＳ）下で増殖する。

【0438】

ＳＣＣ細胞に対するＳＣ１２の直接アポトーシス促進性および細胞毒性作用の決定：
総細胞数に対する作用の時間依存性および用量依存性を、細胞数に相当する、マイクロタイターウェル（Ｅ−ｐｌａｔｅｓ、Ｒｏｃｈｅ）における電導度の連続モニタリングに基づくリアルタイム細胞分析によって調査した。異なる濃度のＳＣ１２ならびにイミキモド（Ｉｍｑ）を使用して４つの細胞株を処理し、細胞数を未処理対照細胞と比較した（各細胞株について２つの独立した実験、トリプル値、異なる濃度）。これらのアッセイについて、４つの細胞株を使用して、ＳＣＣ細胞に対する作用についての代表的な概要が得られるはずである。このように、細胞を異なる濃度のＳＣ１２またはイミキモドで処理した。成長およびアポトーシス作用を、少なくとも７日間顕微鏡によってモニターした。

【0439】

図１７は、ＳＣ１２およびイミキモドによる細胞数の減少を示す。皮膚ＳＣＣ細胞株を、細胞数に相当する、マイクロタイターウェル（Ｅ−ｐｌａｔｅｓ、Ｒｏｃｈｅ）における電導度について連続的にモニターした。ＴＭＸは、チャートにおいてＳＣ１２を示す。図１８は、ＳＣ１２およびイミキモドによって誘発された同様の形態学的変化を示す写真を提供する。３日目に、細胞脱離、形態学的変化および増殖の阻害を、ＳＣ１２またはイミキモドで処理されたＳＣＣ細胞において観察することができる。処理時間３ｄ、濃度：１２０マイクロモル。

【0440】

（実施例１５）
アジュバントとしての化合物ＡおよびＳＣ１２
化合物ＡおよびＳＣ１２のアジュバントタンパク質抗原を使用してパイロット免疫化研究を行った。免疫化実験を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現している２つの組換えタンパク質で行った。１つの抗原はマラリア寄生虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに由来し、他の抗原はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ（潰瘍性皮膚疾患であるブルーリ潰瘍をもたらす）に由来した。

【0441】

５匹のマウスの群は、３週間の間隔で、１０ナノモルの化合物ＡまたはＳＣ１２と混合した２０マイクログラムの標的抗原による３回の皮下免疫化を受けた。

【0442】

第３の免疫化の後、２０匹の免疫されたマウスの全ては、各々の標的抗原に対してＩｇＧ応答を発生した。化合物ＡおよびＳＣ１２の性能は同程度であった。局所的副作用（腫脹または潰瘍形成など）は観察されなかった。マウスにおける使用について承認された市販のアジュバントによる平行した免疫化は、より高い抗体価を生じたが、ここで局所的反応が観察された。

【0443】

図１９は、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ抗原に対するＩｇＧ力価の発生を示す（左：化合物Ａ、右、ＳＣ１２）。

【0444】

（実施例１６）
膀胱内の慢性処理後のマウス血清におけるイミキモドおよびＳＣ１２の曝露の調査
材料および方法
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスを、イミキモド（全部で２０８ｎｍｏｌ中０．１ｗ／ｖ％）またはＳＣ１２（全部で２０６．５ｎｍｏｌ中０．３８ｗ／ｖ％）によって膀胱内で処理した。血清試料をいくつかの時点（０日目、２時間、１日目、２４時間、および６日目、２時間）において採取した。

【0445】

試料の調製
イミキモド：Ｓｉｒｏｃｃｏフィルタープレート（Ｗａｔｅｒｓ）中で、５０マイクロリットルのマウス血清を、５マイクロリットルのＩＳ（イミキモド−Ｄ９、１００マイクログラム／ｍｌ）でスパイクした１９５マイクロリットルのアセトニトリル／メタノール（１：１）に加えた。プレートを１０分間振盪し、真空下で濾過した（５〜１０ｍｍ Ｈｇ）。

【0446】

ＳＣ１２：Ｓｉｒｏｃｃｏフィルタープレート（Ｗａｔｅｒｓ）中で、７０マイクロリットルのマウス血清を、５マイクロリットルのＩＳ（イミキモド−Ｄ９、１００ｎｇ／ｍｌ）でスパイクした２１０マイクロリットルのアセトニトリル／メタノール（１：１）に加えた。プレートを１０分間振盪し、真空下で濾過した（５〜１０ｍｍ Ｈｇ）。試料を蒸発させ、７０マイクロリットルのアセトニトリル／メタノール（１：１）に再懸濁させた。

【0447】

分析方法
イミキモド：ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ：Ｐｒｅｍｉｅｒｅ ＸＥ、溶離液：（ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ ９５／５（Ａ）＋０．１％ＨＣＯＯＨ、５／９５（Ｂ））、流量０．６０ｍｌ／分、９８％Ａ（０〜０．２０分）から１００％Ｂへの勾配（０．６分で）、次いで、１．１分まで１００％Ｂとする、０．４分間再調整。
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８、５０×２．１ｍｍ、１．７マイクロメートル；注入量５マイクロリットル、カラム温度５０℃。
ＳＣ１２：ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ：Ｐｒｅｍｉｅｒｅ ＸＥ、溶離液：（ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ ９５／５（Ａ）＋０．１％ＨＣＯＯＨ、５／９５（Ｂ））、流量０．８０ｍｌ／分、８５％Ａ（０〜０．１０分）から１００％Ｂへの勾配（０．４分で）、次いで、１．５分まで１００％Ｂとする、０．７分間再調整。
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ８、５０×２．１ｍｍ、１．７マイクロメートル、注入容量１０マイクロリットル、カラム温度５０℃。
ＳＣ１２、Ｑ１／Ｑ３ ９２１．５／３８５．０５；ＣＶ３５、ＣＥ３３
９２１．５／４３９．２９；ＣＶ３５、ＣＥ３３
イミキモド、Ｑ１／Ｑ３ ２４１．１／１１３．９８；ＣＶ３０、ＣＥ４５
２４１．１／１４０．９；ＣＶ３０、ＣＥ４０
ＩＳ：イミキモド−Ｄ９、Ｑ１／Ｑ３ ２５０．１／１１３．９８；ＣＶ３０、ＣＥ４５
ＥＳＩ陽性、ＭＲＭ、抽出器５Ｖ；キャピラリー３．５ｋＶ；ソース温度１４０℃；脱溶媒和温度４５０℃
ＬＬＯＱ：ＳＣ１２について０．５ｎｇ／ｍｌ、およびイミキモドについて２．５ｎｇ／ｍｌ
結果
この研究の目的は、イミキモドおよびＳＣ１２の膀胱内慢性投与後の、血清の曝露を評価することであった。ＳＣ１２およびイミキモドの血清レベルを、各々表３３および表３４に報告する。両方の化合物について、特に、ＳＣ１２について、低濃度が観察されたが、試料の主要な部分は、たとえＳＣ１２について得たＬＬＯＱが、イミキモドについて得たＬＬＯＱの５分の１であったとしても（０．５対２．５ｎｇ／ｍｌ）、ＬＬＯＱ未満であった。イミキモドは投与の２時間後まで血清中に存在したが、蓄積は起こらず、２４時間においてＬＬＯＱ未満をもたらし、処理の６日後の値は１日目と同程度である。

【0448】

表３３：血清中のＳＣ１２レベル
結果は平均±Ｓ．Ｄ．として表す、ｎ＝２

【0449】

【表33】

【0450】

表３４：血清中のイミキモドレベル
結果は平均±Ｓ．Ｄ．として表す、ｎ＝２

【0451】

【表34】

【0452】

略語の一覧
アセトニトリル ＡＣＮ
衝突エネルギー ＣＥ
コーン電圧 ＣＶ
ジメチルスルホキシド ＤＭＳＯ
電子スプレーイオン化 ＥＳＩ
内部標準 ＩＳ
液体クロマトグラフィー／質量分析法 ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
定量化の下限 ＬＬＯＱ
メタノール ＭｅＯＨ
多重反応モニタリング ＭＲＭ
超高性能液体クロマトグラフィー ＵＰＬＣ。

【0453】

（実施例１７）
ＲＡＷ２６４細胞における細胞内取込み
細胞アッセイにおいて、ＳＣ１２は、高い細胞内濃度に急速に達する。５×１０^６個のＲＡＷ２６４細胞は、１０ｃｍの組織培養皿に一晩接着した。培地を、１０マイクロモルの化合物ＡおよびＳＣ１２を含有する１０ｍｌの新しい培地に交換した。細胞を、１時間、６時間、および１８時間インキュベートした。上清（２ｍｌ）および細胞（ペレット）をトリプシン処理によって集め、ＬＣ−ＭＳによるそれに続く分析のために２０℃で冷凍した。表３５は、この分析の結果を示す。

【0454】

表３５、細胞内取込みアッセイの結果

【0455】

【表35】

【0456】

本明細書において参照されている各特許、特許出願、刊行物および文献の全体は、参照により組み込まれている。上記の特許、特許出願、刊行物および文献を引用することは、上記のいずれかが適切な従来技術であるという承認ではなく、これらの刊行物または文献の内容または日付に関する承認を構成しない。

【0457】

技術の基本的態様から逸脱することなく上記に対して修正を行ってもよい。技術を１つ以上の特定の実施形態を参照して十分に詳細に記載してきたが、本出願に特に開示されている実施形態に対して変更を行ってもよいことを当業者は認識するが、これらの修正および改善は、技術の範囲内および精神内である。

【0458】

本明細書に例示的に適切に記載されている技術は、本明細書において特に開示されていない任意の要素（複数可）の非存在下で行ってもよい。したがって、例えば、本明細書においてどの場合にも、「含む」、「本質的にからなる」および「からなる」という用語のいずれかは、他の２つの用語のいずれかと置き換えてもよい。用いられてきた用語および表現は、限定する用語としてではなく記載する用語として使用し、このような用語および表現を使用することは、示され、記載されている特徴またはその部分の任意の同等物を除外せず、様々な修正が特許請求した技術の範囲内で可能である。「ａ」または「ａｎ」という用語は、要素の１つまたは要素の複数が記載されていることが文脈的に明らかでない限り、それが修飾する要素の１つ以上を意味することができる（例えば、「１つの試薬」は、１つ以上の試薬を意味することができる）。「約」という用語は、本明細書において使用する場合、基礎を成すパラメーターの１０％以内の値（すなわち、プラスまたはマイナス１０％）を意味し、一連の値の最初の「約」という用語の使用は、値の各々を修飾する（すなわち、「約１、２および３」は、約１、約２および約３を意味する）。例えば、「約１００グラム」の重量は、９０グラム〜１１０グラムの重量を含むことができる。さらに、値の一覧が本明細書に記載されているとき（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または８６％）、一覧は、全ての中間値およびその小数値（例えば、５４％、８５．４％）を含む。したがって、本技術は代表的実施形態および任意選択の特徴によって特に開示されているが、本明細書において開示されている概念の修正および変形を当業者は用いてもよく、このような修正および変形はこの技術の範囲内であると考えられることを理解すべきである。

【0459】

技術の特定の実施形態を、下記の特許請求の範囲（複数可）において記載する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図18】