特許 6027545 生体液検査装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6027545

(24)【登録日】2016年10月21日

(45)【発行日】2016年11月16日

(54)【発明の名称】生体液検査装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 15/14 20060101AFI20161107BHJP

【ＦＩ】

   G01N15/14 G

   G01N15/14 C

【請求項の数】9

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2013-547891(P2013-547891)

(86)(22)【出願日】2012年1月2日

(65)【公表番号】特表2014-501928(P2014-501928A)

(43)【公表日】2014年1月23日

(86)【国際出願番号】FR2012000001

(87)【国際公開番号】WO2012093223

(87)【国際公開日】20120712

【審査請求日】2014年12月19日

(31)【優先権主張番号】11/00050

(32)【優先日】2011年1月7日

(33)【優先権主張国】FR

(73)【特許権者】

【識別番号】313015649

【氏名又は名称】ホリバ アベイクス エス アー エス

【氏名又は名称原語表記】ＨＯＲＩＢＡ ＡＢＸ ＳＡＳ

(73)【特許権者】

【識別番号】506309102

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・デュ・リモージュ

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＬＩＭＯＧＥＳ

(73)【特許権者】

【識別番号】506310061

【氏名又は名称】セントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・サイエンティフィーク・セエヌアールエス

【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ ＣＮＲＳ

(74)【代理人】

【識別番号】100080001

【弁理士】

【氏名又は名称】筒井 大和

(74)【代理人】

【識別番号】100093023

【弁理士】

【氏名又は名称】小塚 善高

(74)【代理人】

【識別番号】100117008

【弁理士】

【氏名又は名称】筒井 章子

(72)【発明者】

【氏名】ロンギート，ネリー

(72)【発明者】

【氏名】ヌラン，フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】ブリュネル，パトリック

【審査官】 渡邊 吉喜

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０７−０９２０７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０７−１２８２１９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５２９１３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−００２９６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−１６９９１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０９−２２９８４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０９−３１１１０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平０５−５０８９１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５１７２９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第０５１０６１８７（ＵＳ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ１５／００−１５／１４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体液が通過するチャネル（２）と、前記チャネル（２）の第１領域（１０）に配置された第１検査モジュール（４）と、前記チャネル（２）の第２領域（１２）に配置された第２検査モジュール（８）と、を備え、
第２検査モジュール（８）の出力を表す量を提供するように構成される、生体液を検査する装置であって、
第１検査モジュール（４）は、第１領域（１０）を通過する生体液の少なくとも１つの電気的特性を測定するように配置され、第２検査モジュール（８）は、第２領域（１２）を通過する生体液の少なくとも１つの光学的特性を測定するように配置され、並びに、
検査装置はさらに第１検査モジュール（４）及び第２検査モジュール（８）に接続され、かつ第１検査モジュール（４）の出力により第２検査モジュール（８）を制御するように配置されるコントローラ（６）を備え、
ここで、コントローラ（６）は、第１検査モジュール（４）の出力信号に相対して選択された遅延の制御信号を発することができ、
コントローラ（６）は、第１検査モジュール（４）が配置された第１領域（１０）と第２検査モジュール（８）が配置された第２領域（１２）との間の距離に応じた遅延と、第２検査モジュール（８）の照明光源（１８）のスイッチング時間に応じた遅延との差に基づいて、前記選択した遅延を画定するように構成される、装置。

【請求項2】

第２検査モジュール（８）は、一方に第２領域（１２）を照明するように配置される照明ユニット（１４）、他方に第２領域（１２）を通過した光の少なくとも１つの光学的特性を収集し測定するように配置される分析ユニット（１６）を備え、コントローラ（６）は、照明ユニット（１４）を制御する、請求項１に記載の装置。

【請求項3】

コントローラ（６）はさらに分析ユニット（１６）を制御する、請求項２に記載の装置。

【請求項4】

照明ユニット（１４）は、少なくとも１つのレーザ及び／又は少なくとも１つの発光ダイオード及び／又は少なくとも１つのレーザダイオードを備える照明光源（１８）を備える、請求項２又は３に記載の装置。

【請求項5】

照明光源（１８）は白色レーザを備える、請求項４に記載の装置。

【請求項6】

照明光源（１８）は、各発光波長がある複数のレーザを備える、請求項４に記載の装置。

【請求項7】

照明ユニット（１８）は、照明光源（１８）から放出された光を受光する第１端部（２２）と第２領域を照明する第２端部（２６）を備える光ガイド（２０）を備える、請求項４〜６のいずれか１項に記載の装置。

【請求項8】

照明ユニット（１８）は、照明光源（１８）から放出された光を受光し、かつ、コントローラ（６）の制御下で選択的に光を再放出するように配置される音響光学モジュレータを備える、請求項４〜７のいずれか１項に記載の装置。

【請求項9】

前記チャネルの各領域に配置される１つ以上の副検査モジュールを備え、各副検査モジュールは、各領域を通過する生体液の少なくとも１つの光学的特性を測定するように配置され、前記コントローラは、前記副検査モジュールの少なくともいくつかを制御するように配置される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生体液を検査する装置、特にフローサイトメトリー及び血液用装置に関する。

【背景技術】

【0002】

最新光学の発展に伴い、細胞分析の分野は顕著に発展している。

【0003】

多色光源の集積により、様々な細胞を検出、分析しうる分析器の製造が可能となり、かつ、物理学の進展で測定の質が向上した。

【0004】

しかしながら、当該進展は限界に達している。実際、多色光源を分析器に集積する多色光源の製造方法があるが、これでは最新の分析が限定される不利益がある。

【0005】

第１の方法は、ＱＴＨ（クオーツタングステンハロゲン）ランプタイプ又は水銀ランプやキセノンランプ等の放電光源タイプの光源を用いる。

【0006】

ＱＴＨランプの輝度は比較的低い。熱力学の法則を放射率ε（Ｔ）の温度（Ｔ）を導くタングステンフィラメントに適用すると、波長にかかわらず輝度は低いことを示す。

【0007】

さらに、フィラメントが著しく高温でなければ光子束は増えず、電力は単に耐用年限を消費しないと高まらない。しかしながら、タングステンフィラメントが３０００℃を超える高温になると、耐用年限が１０００時間未満となる非可逆性老化メカニズムが生じる。

【0008】

さらに、測定点での電力密度は開口数が大きい成形光学を選択しなければ高められない。実際、入射照明コーンは３０°よりも開く。従来のフローサイトメトリー系は狭角で回折する光を測定するため、その可能性が限られる。

【0009】

放射光源はＱＴＨランプに比較して極めて明るいが、以下の多くの不利益に留意すべきである：
−空間コヒーレンスが低い拡張放射源は、狭角での回折信号の測定に適さない；
−当該光源は超高電圧により脈動し、低レベル信号を処理する電子コンポーネントで電磁干渉が発生する；
−干渉が原則パルスの発生と処理に基づくため、パルスで周波数スペクトル幅が極めて広い干渉はフィルタ除去が困難で、フローサイトメトリー系で測定される信号を直接干渉する；
−機械的に極端に脆弱である；及び
−集中使用のためのフローサイトメトリー系で耐用年限が数百時間以下である。

【0010】

つまり、当該タイプの光源は使用年限が劣り、スペクトル電力密度がサイトメトリーへの適用や蛍光分析での利用に極めて劣ることが示される。さらに、当該空間コヒーレンスが低い拡張放射源は、狭角回折測定に適さない。

【0011】

他の方法は、多くの有用なエネルギー特性があるレーザを用いることである。しかしながら、用いられるレーザは単色で、連続又は同時に測定するにはレーザを複数共同で位置合わせして用いなければならない。

【0012】

当該方法は、結果として分析器の製造における位置合わせの製造費用が高くなる。

【0013】

同様の問題はスペクトルがそれほど拡張しない光源でも生じる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0014】

【特許文献1】仏国特許出願公開第２８７８０３２号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

本発明は上記課題を改良する。

【課題を解決するための手段】

【0016】

そのために、本発明は生体液を検査する装置を提案したが、当該装置は、第１領域に第１検査モジュールが配置され、かつ、第２領域に第２検査モジュールが配置される前記生体液が通過するチャネルを備え、第２検査モジュールの出力を表す量を提供するように配置される。

【0017】

当該第１検査モジュールは、第１領域を通過する生体液の少なくとも１つの電気的特性を測定するように配置される。当該第２検査モジュールは、第２領域を通過する生体液の少なくとも１つの光学的特性を測定するように配置される。

【0018】

当該検査装置はさらに第１検査モジュール及び第２検査モジュールに接続され、かつ第１検査モジュールの出力により第２検査モジュールを制御するように配置されるコントローラ（６）を備える。

【発明の効果】

【0019】

本発明の装置は光学測定と初期電気測定を制御して連結しうる点で特に有利である。つまり、実装コストを下げ、かつ機械的及び光学的安定性を改善しつつ、例えば、単色レーザ、スーパーコンティニウムレーザともいう白色レーザ、ＬＥＤ又はＲＣＬＥＤ等の複数の光源を用いうる。

【0020】

本発明の他の特徴及び利点は、以下の、実施例に制限されない詳細な説明及び図面からより明確となる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】本発明の装置の一部の概略図を示す。

【図2】図１の第２検査モジュールの第１実施形態を示す。

【図3】図２の照明ユニットから得られる光学窓の画像を示す。

【図4】図１のコントローラの概略図を示す。

【図5】時間関数としての図１の装置の種々の信号を示す。

【図6】図２の照明モジュールを備える装置で得られる画像の例を示す。

【図7】図１の第２検査モジュールの第２実施形態を示す。

【図8】図７の照明光源の発光スペクトルを示す。

【図9】図７の照明モジュールを備える装置で得られる画像例を示す。

【図10】図７の照明モジュールを備える装置で得られる画像例を示す。

【図11】図７の照明モジュールを備える装置で得られる画像例を示す。

【発明を実施するための形態】

【0022】

以下の図面と説明は概ね特定要素を含む。つまり、それらは、本発明のより良い理解を目的とするだけでなく、適宜、定義にも寄与する。

【0023】

図１は本発明の検査装置を示し、その装置は、流体チャネル２、第１検査モジュール４、コントローラ６及び第２検査モジュール８を備える。

【0024】

本明細書の例示では、分析される流体は血液で、図１のチャネル２で矢印の方向へ流れる。本発明は特に血液計数分野で特に有利に用いられ、より一般に、全ての流体の全ての生物学的分析に関する。つまり、本発明はフローサイトメトリー等の実行に用いられうる。

【0025】

チャネル２は本装置の測定管の一部である。例えば特許文献１から公知のように、測定管は、焦点ノズルとその端部の反対側に配置された毛細管とを備える。

【0026】

この形態により流体力学的遮蔽効果が得られ、血液細胞は測定区域や領域という区域や領域に個々に入る。図１は、チャネル２を含む測定区域の領域での装置の拡大図である。

【0027】

本発明は細胞に関し、流体中のより一般的な粒子を検出する流体検査に適することが理解されるべきである。粒子としては、細胞、小胞、寄生虫又はウイルスがあげられるが、これらに限定されないことが理解されるべきである。

【0028】

本明細書の例示では、チャネル２は第１領域又は区域１０と第２区域又は領域１２を備え互いに軸方向で２１０μｍ離れている。当該距離は装置により変化でき、一般に数十〜数百μｍである。当該領域や区域は同程度で、検査モジュール間又は領域間の距離のどちらも記載されうる。

【0029】

以下、区域及び領域との用語は、同要素、つまり、分析される血液細胞が個々通過するチャネル２の区切られた部分に用いられうる。

【0030】

第１検査モジュール４は第１領域１０に配置され、当該領域を通過する流体の電気的又は磁気的特性が測定される。

【0031】

本明細書の例示では、測定はチャネル２内のマイクロオリフィスを介して実行される。第１検査モジュール４はマイクロオリフィスに接続される電流源を備え、それにより、電流がモジュールの領域内のチャネル２を通過する。

【0032】

細胞がなければ、第１領域１０を通過する流体は、マイクロオリフィスの両側に配置された２つの電極で測定される負荷インピーダンスＺを規定する。血液の１つの細胞が第１領域１０を通過するとインピーダンスＺが増加する。一方、インピーダンスが変化して細胞体積が決定され、細胞計数が実行される。

【0033】

第２検査モジュール８は第２領域１２に配置され、その領域を通過する流体の光学的特性が測定される。

【0034】

第２モジュール８は、一方に照明ユニット１４を、他方に分析ユニット１６を備える。図２と図７を参照して当該要素を以下に記載する。

【0035】

図２は、チャネル２の軸方向に観察される第２検査モジュール８の第１実施形態を示す。

【0036】

当該実施形態では、照明ユニット１４は、Zarlink製モデルＺＬ６０００３等の共振空洞発光ダイオード（ＲＣＬＥＤ）を備える照明光源１８と光ガイド２０を備える。照明光源１８は光ガイド２０の入力端２２に接続する。

【0037】

特許文献１に記載されたように、光ガイド２０は、反対側に成形システム２８が配置される出力端２６を備える。

【0038】

当該光ファイバ端部は、マイクロマシニングにより異なって処理される端部２６を形成し、第２領域１２で図３に示すようなビームプロファイルを得る。変形例では、微細構造光ファイバ、従来の導波光ファイバ又は反射屈折、屈折又は回折系等の他の光学系を用い得る。また、光学系はアナモルフィック光学系でもよい。

【0039】

チャネル２は他面に分析ユニット１６は、対物レンズ３０、ダイアフラム３２及びコリメートレンズ３４を備え、さらに光学分析器３８の集束レンズ３６が続く。

【0040】

光学分析器３８はそれ自体公知であり、光電子倍増管やフォトダイオードや他の光電検出装置である検出器を備えうる。

【0041】

分析ユニット１６は、収集される光信号が検査で予期される流体と光の相互作用効果である狭角回折及び／又は広角回折及び／又は吸収及び／又は蛍光性及び／又は蛍光寿命：に対応するよう調節されうる。

【0042】

本明細書の例示では、ＲＣＬＥＤで形成される照明光源１８は、約３ｎｓと非常に迅速に応答する。当該光学コンポーネントの出力で観察される発光スペクトルは６４０〜６６０ｎｍにわたる。

【0043】

また、ＲＣＬＥＤにより形成される照明光源１８は、Ｑ−スイッチ、つまり、指示により光放射を発しうる利点がある。

【0044】

当該指示はコントローラ６で生成される。図４に示すように、コントローラ６は、コンピュータ５０、リミッタ５２及び２つの信号発生器５４と５６を備える。図１から明らかなように、コントローラ６は、一方で第１検査モジュール４を接続し、他方で第２検査モジュール８を接続する。コントローラ６の機能は、細胞が第１検査モジュール４で検出されると第２検査モジュール８の起動を制御することである。

【0045】

そのため、コントローラ６は、第１検査モジュール４から検出信号を受信し、第２検査モジュール８の起動用の制御信号を以下の４組の変数グループを考慮するよう送信を遅延させる：
−第１検査モジュール４の測定区域と第２検査モジュール８の測定区域の距離；
−チャネル２内の流体速度；
−ゼロでもよい照明光源１８のＱ−スイッチング時間；及び
−細胞外観の多様性。

【0046】

つまり、検査モジュール８で、照明光源１８は、第１検査モジュール４で先に検出された細胞が第２領域１２内へ通過すると正確にＱ−スイッチされる。同様に、光学分析器３８は、照明光源１８がＱ−スイッチされると測定を正確に実行するよう制御される。

【0047】

従って、照明光源１８は光学分析器として適する場合に照明され、寄生光に影響されないようにする。

【0048】

適切な遅延計算用のデータはメモリに格納され、コンピュータ５０で処理されて、最終的に照明光源１８の又は検出モジュール３８のＱ−スイッチングに用いられる。適切な遅延計算用データはコンピュータ５０で処理され、リアルタイムで照明光源１８又は検出モジュール３８のＱ−スイッチングに用いられる。

【0049】

コントローラ６は様々な形態であってよく、特に、異なる電子コンポーネント又はＦＰＧＡ（フィールドプログラマブルゲートアレイ）又はＣＰＬＤ（コンプレックスプログラマブルロジカル装置）系の電子システムを備える電子回路の形態であってよい。

【0050】

コンピュータ５０は、例えば上記４組の変数の関数として遅延の値を検索する「ルックアップテーブル」又は４組の変数の関数として遅延を直接計算する数学関数を用いる。

【0051】

コンピュータ５０の出力で、一方が照明ユニット１４に接続され、他方が分析ユニット１６に接続される信号発生器５４と５６を制御する。

【0052】

信号発生器５４は信号を発生し、照明光源１８に応じた信号の形状をとる。本明細書の例示では、照明光源１８のＲＣＬＥＤはギザギザの電流信号で励起され、そのパルスの形状、持続時間及び強度は、光源の関数として変化しうる。

【0053】

信号発生器５６は、光源１８から発する光学信号の時間幅、つまり、持続時間及び光源又信号５４の幅の変化に応じた測定窓を形成する。つまり、照明光源１８のＱ−スイッチング時間が概ね名目値の所定量だけ変化しうる場合、信号発生器５６は、それを加味して測定窓をより広くする。例えば、光学信号の時間幅が５μｓで、照明光源１８のＱ−スイッチング時間が平均Ｑ−スイッチング時間から３μｓだけ変化すると、形成する測定窓は８μｓである。

【0054】

リミッタ５２はコンピュータ５０と信号発生器５４の間に配置される制御バリアである。

【0055】

現在の血液分析器では、大部分の白血球細胞の測定で計算する最大照明の繰返し周波数は約１０ｋＨｚである。その結果、発生器５４の周波数を最大周波数よりも高くして照明光源１８を作動させても有用でなくその必要もない。

【0056】

しかしながら、検査モジュール４は１０ｋＨｚより高い周波数で細胞を検出でき、コントローラ６の周波数をより高めて照明光源１８を作動させうる。このリミッタ５２は当該状態を回避しうる。

【0057】

リミッタ５２はまた、周波数が制限される照明光源で励起信号の発生を回避しうる。それは、例えば、以下に記載される図７の光源である。

【0058】

本明細書の例示では、照明ユニット１８が起動されないと光子ノイズが生じ、分析ユニットで測定窓を形成するのに全く役に立たないため、リミッタ５２はまた信号発生器５６に接続される。

【0059】

発生器５４のパルス幅は一般に測定窓の幅よりも狭い。しかしながら、パルス幅はまた、単に、光源の固有の特性及び生体細胞の通過速度に依存してよい。

【0060】

変形例では、リミッタ５２は、信号発生器５４に及び／又は信号発生器５６に及び／又はコンピュータ５０に個別に組み込まれてもよい。他の変形例では、コンピュータ５０は、遅延計算で細胞の検出頻度を考慮しうる。実際に、照明光源１８のＱ−スイッチング時間は、コンピュータが受けるＱ−スイッチングパルスの周波数の関数として変化しうる。他の変形例では、コントローラ６は、有用なパラメータを格納するメモリを備えうる。

【0061】

他の実施形態では、コントローラ６はまた、分析パラメータを照明ユニット１４及び／又は分析ユニット１６へ送信して、第１検査モジュール４で実行される測定の関数として特定の調節を行いうる。

【0062】

図５は、コントローラ６で実行される処理のより良い理解のために時間関数として装置に流れる種々の信号を示す例示である：
−第１曲線は第１検査モジュール４の出力での信号を表す；
−第２曲線は、コントローラ６での第１曲線の信号の成形を表す；
−第３の曲線は、以下で定義するｔ（遅延）と等しい持続時間だけ相殺された、コントローラ６の出力での信号を示す；
−第４の曲線は遅延してＱ−スイッチングされる、照明光源１８の出力での（光）信号を表し、持続時間は照明光源自体に応じて遅延し、ｔ（Ｑ−スイッチング源）であり、照明光源に応じて遅延の時間がゼロでよい；
−第５の曲線は、上記測定窓という、コントローラ６から分析ユニット１６へ送信される制御信号を表す。

【0063】

つまり、コントローラ６で適用される遅延は以下の：ｔ（遅延）＝ｔ（モジュール間の距離）−ｔ（Ｑ−スイッチング源）であることが分かる。そして、分析ユニット１６は、上記測定窓との、光源１８のパルスの持続時間である時間窓で測定するように制御される。

【0064】

変形例では、遅延はまた、コントローラ６で制御信号を計算して発生させる時間を加味して計算される。当該パラメータの調節は、手作業でも自動的でもよい。

【0065】

変数遅延制御として用いるコントローラ６は極めて重要で有利である。実際、非変数遅延するコントローラ６を用いて第１検査モジュール４及び第２検査モジュール８の相対位置を変位させる。しかしながら、当該構成の調節は複雑で時間がかかる。

【0066】

さらに、また、第１検査モジュール４と第２検査モジュール８の距離が、第１領域の機械部品での光反射を回避し、水力で焦点を合わせる最適条件であり、大きすぎず、小さすぎないことが有利である。

【0067】

当該制約のため、遅延の固定化を産業化するには極めて複雑で高価になるが、品質は不十分である。

【0068】

コントローラ６を用いると当該問題が解決される。検査モジュールを変位し、再度位置合わせするよりも、遅延の計算を調節する方が有利だからである。さらに、コントローラ６による照明ユニット１４及び分析ユニット１６を制御すると光パルスは細胞が通過する瞬間だけＱ−スイッチして当該パルスに対して測定窓を調節すれば寄生光を制限できる。

【0069】

図６は、図２の第２検査モジュールを用いる図１の装置から得られるマトリックスの例示である。

【0070】

ここで、検査装置は、粒子流で２つの逐次測定を含む細胞診断分析器を構成する。第１測定は粒子の電気検出に対応し、第２測定はフィルタ処理されないＲＣＬＥＤの光ビームと粒子の相互作用に対応する。

【0071】

上記のとおり、ＲＣＬＥＤは適当なテンション値である矩形信号の注入によりコントローラで制御されるＱ−スイッチ照明光源である。上記のとおり、ＲＣＬＥＤの応答時間は非常に迅速（３ｎｓ）で、光学コンポーネントの出力で観察される光スペクトルは、６４０〜６６０ｎｍである。

【0072】

図７は、図２と非常に類似する、検査モジュール８の第２実施形態を示す。この実施形態は、照明ユニット１４（図１に示す）が変更される点及び分析ユニット１６（図１に示す）がさらに干渉フィルタ４０、波長フィルタ４２と４４（Semrock（セムロック）のモデルFITC-3540B ExciterとFF01 530/43）並びに集束レンズ４８がある他の光学分析器４６を備える点で異なる。

【0073】

本実施形態では、照明ユニット１４はＲＣＬＥＤの代わりに白色レーザを備える照明光源１８を備える。白色レーザ１８はフォトニック結晶光ファイバ（図示せず）で光ガイド２０の入力端２２に接続される。

【0074】

上記のように、光ガイド２０は成形システム２８が反対側に配置される出力端２６を備える。光ファイバの端部は端部２６を形成し、マイクロマシニングにより異なるように処理されて、第２領域１２で図３に示すようなビームプロファイルを得た。代替例では、微細構造光ファイバ、従来の導波光ファイバ又はレンズ系等の他の光学系を用いうる。

【0075】

照明光源１８としての白色レーザを用いると可能性が広がる。本明細書に記載した例では、白色レーザ１８は、最大繰り返し周波数２ｋＨｚ、光パルス幅４５０ｐｓ及び最大パルスエネルギー８μＪであるポンプレーザを高非線形フォトニック結晶光ファイバへ連結して得られる。

【0076】

そのファイバの出力で観察される光スペクトルは、３８０〜１７５０ｎｍであり、エネルギースーパーコンティニウムを形成する。スーパーコンティニウムスペクトルの例は図８に示す。白色レーザは最大周波数２ｋＨｚに対して全スペクトル６ｍＷにわたり平均パワーがある。

【0077】

バンド幅３６ｎｍの４８８ｎｍ（Semrock（セムロック）モデルFITC-3540B Exciter）の波長を中心とするバンドバスフィルタを用いて、チアゾールオレンジが活性化される。従って、この波長バンドでの光ビームの平均パワーは、２９０μＷ、つまり、３２０Ｗのピークパワーである。ここで、光エネルギーは１４５ｎＪと見積もられるが、図１０に示すように、満足信号対雑音比での蛍光信号と回折信号の測定が満たされる。

【0078】

白色レーザを用いると、波長スペクトルが広く、検出されるべき蛍光色素の関数として望ましい波長をフィルタ処理しうる。実際に、蛍光色素は特定の波長でのみ活性化される。従って、期待した結果により活性化されうる蛍光色素の選択の自由度は、この幅広いスペクトル源の結果より大きい。また、白色レーザにより形成される照明光源１８は、Ｑ−スイッチ、つまり、指示により光放射を発するという利点がある。

【0079】

照明光源１８の白色レーザは、適切なテンション値である矩形信号の注入によりコントローラ６により制御され得るＱ−スイッチレーザである。上記のとおり、ポンプレーザの発光波長は１０６４ｎｍで、赤外範囲で放出されるレーザであり、その最大周波数は２ｋＨｚである。白色レーザは当該ポンプをフォトニック結晶ファイバに連結して得られる。

【0080】

リミッタ５２は、本実施形態で特に有利に用いられうる。実際、本実施形態の照明光源１８の最大周波数が２ｋＨｚであることが示された。その結果、信号発生器５４が２ｋＨｚよりも大きな周波数でその光源を起動する必要はない。

【0081】

しかしながら、検査モジュール４は周波数が２ｋＨｚよりも高くても細胞を検出し、その結果、コントローラ６の周波数が高すぎても照明光源１８を起動しうる。当該状態はリミッタ５２により回避しうる。本明細書の例示では、リミッタ５２は、近過ぎる細胞を分けて検出し、照明光源の逐次起動の変化は２ｋＨｚ以下に等しくなる。

【0082】

図９〜１１は、図７に記載する装置の検査モジュール８で得られる結果を例示する。当該例示では、有核細胞に含まれる核酸分子に結合すると蛍光する特定の特徴があるチアゾールオレンジ含有試薬を用いて血液試料を予め培養した。蛍光は、チアゾールオレンジを青色範囲で活性化し、緑色範囲で発する蛍光を測定して検出しうる。

【0083】

ここで、照明ユニットの光ビームは、青色範囲でフィルタ除去され、検出された信号は、青色範囲で広角回折の第１コンポーネントとチアゾールオレンジから生じる蛍光の第２成分（青色範囲で活性化し緑色範囲で発光する）を備える。

【0084】

得られた測定は図９〜１１でバイパラメトリック表示として示される。当該データにより、異なる白血球個体群が特徴つけられて計数され、細胞中の核酸の存在が明らかになる。

【0085】

この光源の平均電力は低いが、得られた結果は極めて確実で、図９〜１１の画像は異なる白血球個体群が良好に分離されたことを示す。これは、可視範囲でのピークパワーが十分で、信号対雑音比が高まり、光学系が最適化されたためである。

【0086】

従って、当該実施形態は、照明ユニットの光ガイドが照明光源として白色レーザを用いて、コントローラが照明ユニットと分析器を共に制御することに特徴付けられる。

【0087】

当該要素は必ずしも不可欠でないことに留意すべきである。照明ユニットのみを制御してよい。さらに、上記のように、光ガイドは省略されてよく、他の要素に置換されてよい。

【0088】

さらに、本明細書に記載される白色レーザはＱ−スイッチ源である。しかしながら、連続レーザ、他の（受動的及び／又は能動的）Ｑ−スイッチレーザ又は時間スライサー有又は無のモード同期レーザに基づき、他のスーパーコンティニウム光源を用いてよい。

【0089】

本発明は特にパルス化形態で動作する光源に適用されうる。ピーク電力（１ｋＷより高い）が高く、平均電力（１０Ｗ未満）は適当であるものを用いるからである。

【0090】

モードロックレーザは１ＭＨｚよりも高い高繰返周波数により特徴付けられ、それは、空洞での光の往復周波数に対応する。

【0091】

一般に、概ねピコ秒及びフェムト秒であるパルスの維持期間に起因し、当該パルスに搬送されるエネルギーは低い。このタイプのレーザは、照明により高繰返周波数で直接用いられて、細胞は分析窓の前を通過する。

【0092】

当該条件下で、複数パルスが細胞を照明し、光信号と生体要素の同期は必要ない。それにもかかわらず、本発明の範囲内で、細胞移動と同期可能な単一のパルスを指示で収集されうる電気光学モジュレータ（ポッケルスセル（Pockels Cell）や音響光学モジュレータ）の使用を想定しうる。

【0093】

タイミングジッターは約数ナノ秒で、一般に１〜５ｎｓであり、生体細胞へのパルス到達の不確実性に対応する。

【0094】

このタイプのシステムはＱ−スイッチレーザと同等であるが、パルス持続時間が約ピコ秒、エネルギー１μＪ未満の、モジュレータに連結された繰返周波数が約１ｋＨｚから数百ｋＨｚへ変化する点で異なる。当該アプローチは現在あまり競合しない。当該レーザの価格がＱ−スイッチ固体レーザ（ダイオード励起ＹＡＧ：Ｎｄマイクロレーザタイプ）に比較して極めて高いからである。後者は、数ナノ秒やピコ秒のパルスを極めて単純な方法で生成できる。当該原理は、レーザ空洞内に存在する損失や獲得に作用する、レーザ空洞のＱ−ファクタ（Ｑ−スイッチ）が迅速に変化するためである。能動Ｑ−スイッチングと受動Ｑ−スイッチングという２つのＱ−スイッチングがある。

【0095】

能動Ｑ−スイッチングは、空洞への光電子コンポーネントの導入や反転分布の原点でのポンプ光源の発光の変調に基づく。

【0096】

第１に、光電子コンポーネントを用いて、タイミングジッターが１００ｎｓ未満と低い発光が得られうる。しかしながら、モジュレータを挿入することでレーザ空洞長が長くなる。その結果、鼓動で振幅不安定性が導入されうる縦モードがいくつか出現する。空洞で選択フィルタを用いると問題が解決されるが、レーザシステムのコストが高まる。

【0097】

第２に、レーザのポンピングが迅速に変調してパルスの持続時間が短くなる。それにもかかわらず、増幅媒体の蛍光時間により時間が遅延し、空洞のＱ−スイッチングの原点の時間内でエネルギーが分散される。

【0098】

その結果、タイミングジッターは１μｍよりも大きい。それにもかかわらず、レーザ光源が例えば、ダイオードレーザやマイクロレーザ等の微小共振器がある場合に、小ジッターが多量に得られた。しかしながら、ジッターのない光源は、非線形が影響してスペクトルを拡張しうるために増幅が必要である。当該システムは複雑でコストも一般に高い。

【0099】

受動レーザＱ−スイッチングは、レーザ空洞内への飽和可能吸収性タイプの光学コンポーネントの導入に基づく。この「タイムゲート」をＱ−スイッチングする外部電源は必要なく、レーザ増幅された自然放出によりその吸収が飽和され、空洞の品質係数が迅速に変更されうるに過ぎない。

【0100】

その結果、空間は狭くてよく、極短共振器が製造でき、数十ピコ〜数ナノ秒のパルスが生成しうる。

【0101】

当該光源は、一般にジッターが１μｓより大きく、外部制御での同期は困難である。当該光源のコストは低く、得られるパルスは一般に能動Ｑ−スイッチングで得られるよりものより短い。

【0102】

能動及び受動のＱ−スイッチングで、２つの方法の利点を組み合わせうる。能動Ｑ−スイッチングで出力パルスが他のシステムや生物元素と同期しうると共に、受動Ｑ−スイッチングでパルスは短くなる。タイミングジッターは、１〜１０ｋＨｚの繰返周波数に対して約２〜３マイクロ秒である。

【0103】

また、ダブル能動及び受動Ｑ−スイッチング、即ち、２つの能動Ｑ−スイッチングと１つの受動Ｑ−スイッチングを備えるか又は２つの受動Ｑ−スイッチングと１つの能動Ｑ−スイッチングを備えるシステムがある。当該レーザはタイミングジッターとパルス維持期間の各効果を組み合わせて光源の性能を向上する。

【0104】

本発明の範囲内で、少なくとも１つの外部又は内部の空洞能動Ｑ−スイッチングシステムを用いる随意のレーザ光源は、タイミングジッターが約３μｓ未満であると所望の用途に用いられうる。

【0105】

フローサイメトリーでスーパーコンティニウムを用いるためには、レーザには特定の特性がなければならない。まず、パルス生成遅延（ＰＣＤ）は、一定でなければならない。遅延は、スーパーコンティニウムレーザへ送られるＱ−スイッチング信号とその後の光パルスの生成で相殺された時間に対応する。

【0106】

第２に、ジッターは、光パルスが現れる２つの時間の最大時間変動である。測定がスーパーコンティニウムがあるフローサイメトリーで測定の信頼性を獲得するため、ＰＣＤ及びジッターの変動は、好ましくは、約１μｍ未満でなければならない。最後に、周波数範囲の光パルス同士間のエネルギー変動は、５％未満でなければならない。

【0107】

重要な要素は、全ての光源がコントローラでＱ−スイッチされると、各パルス又は、例えば１以上のパルスを選択できるスイッチとして機能する音響光学モジュレータで制御されうることである。それはＭＯＥＭＳ又はポッケルスタイプの電気光学要素であってよい。

【0108】

ダイオード、レーザダイオード又はコントローラで制御される音響光学モジュレータに接続された複数の単色レーザ等の他の照明光源も用いてよい。

【0109】

さらに、他の測定を行うのに血管のさらに下流に他の光学検査モジュールを加えてよい。当該検査モジュールは第２検査モジュール８の制御を行う同様な方法で、コントローラ６で同様に制御されうる。その場合、コントローラ６に他の信号発生器を設けるべきである。

【0110】

また、カスケード接続された光源のＱ−スイッチングのいくつかは、各々の光源の遅延を管理して実行されうる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】