【図1】ＦＯＰ患者からのｉＰＳ細胞の形成を調べた結果を示す。（Ａ）ＦＯＰ患者及び健常者からのｉＰＳ細胞の形成効率（Efficiency (%)）を示す。ＡＰ陽性とＥＳ様の形態（典型的(typical)な形態）によってｉＰＳコロニーを判定した。（Ｂ）６０ｍｍシャーレにおけるｉＰＳ細胞コロニーのＡＰ染色を示す。（Ｃ）ｉＰＳ細胞のコロニーの形態を示す。目盛尺：２００μｍ。（Ｄ）ＦＯＰ及び対照における典型的(typical)な及び異常(atypical)なｉＰＳ細胞コロニーの数及び比率を示す。

【図2】ＡＬＫ２キナーゼ阻害剤処理による、ＦＯＰ線維芽細胞からのｉＰＳ細胞の生成と維持を調べた結果を示す図である。（Ａ）ＡＬＫ２キナーゼ阻害剤であるＬＤＮ−１９３１８９（ＬＤＮ）及びドルソモルフィンの処理によるｉＰＳ細胞コロニー形成の改善効果を示す。ＡＰ陽性とＥＳ様の形態によってｉＰＳコロニーを判定した。左と右のパネルはそれぞれ、患者Ｆ２と患者Ｆ４である。（Ｂ）ＬＤＮで治療した個々の患者から生成されたＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞の位相差写真を示す。目盛尺：２００μｍ。（Ｃ）センダイウイルス及びヒトＥＳマーカーのＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す。ｉＰＳのＦ１−１、Ｆ２−１及びＦ４−１はそれぞれ患者Ｆ１、Ｆ２及びＦ４に由来するｉＰＳ細胞株を示す。２０１Ｂ７：対照のヒトｉＰＳ細胞株。ＳｅＶ（＋）：ＳｅＶを感染させた線維芽細胞。（Ｄ）多能性マーカーについてのＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞株の免疫蛍光染色及びＡＰ染色を示す。目盛尺：２００μｍ。（Ｅ）ＬＤＮなしでのＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞株の自発的な分化を調べた結果を示す。未分化（Ｕ）は典型的(typical)なｉＰＳコロニーを示す。部分的分化（Ｐ）は部分的に分化したコロニーを示し、分化（Ｄ）は完全に分化したコロニーを示す（上段写真）。阻害剤を伴った又は伴わない（真ん中と下のパネル）ＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞株における３種のコロニーの数及び比率。目盛尺：２００μｍ。（Ｆ）ＬＤＮを伴わずに培養したＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞株における分化マーカーの免疫蛍光染色を示す。４種のｉＰＳ細胞株を染色し、ｉＰＳ細胞株Ｆ２〜６から得た代表的なデータが示されている。目盛尺：２００μｍ。（Ｇ）多能性及び分化に関連する遺伝子の発現に関する定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。データはＧＡＰＤＨに対して標準化し、ＬＤＮを伴わずに培養した２０１Ｂ７ヒトｉＰＳ細胞株に対する相対的な発現レベルとして表す。

【図3】ＦＯＰに由来する線維芽細胞からのｉＰＳ細胞の形成効率と、ＡＬＫ２キナーゼ阻害の時期との関係を調べた結果を示す。（Ａ）ＬＤＮによる処理の実験計画を示す。ｉＰＳ細胞の誘導培養は、図示される期間、ＬＤＮによって処理される。（Ｂ）図３Ａに示す期間、３種の濃度：０ｎＭ，３０ｎＭ及び２００ｎＭのＬＤＮで処理した６０ｍｍシャーレにおける患者Ｆ２（左）と健常者Ｎ１（右）に由来するｉＰＳ細胞コロニーのＡＰ染色の結果を示す。ｄ１−ｄ７、ｄ１−ｄ３０、及びｄ８−ｄ３０はそれぞれ、１日目〜７日目、１日目〜３０日目及び８日目〜３０日目のＬＤＮの処理期間を示す。（Ｃ）各期間ＬＤＮで処理したｉＰＳ細胞コロニーの形成効率を示す。典型的(typical)なＡＰ陽性コロニーを３０日目で計数した。グラフ横軸において、「１」から「７」は、それぞれのＬＤＮ処理期間を表し、「１」は「d1-d30」を、「２」は「d1-d7」を、「３」は「d1-d30」を、「４」は「d8-d30」を、「５」は「d8-d14」を、「６」は「d15-d21」を、「７」は「d22-d30」を表す（図３Ａを参照）。

【図4】ＡＬＫ２キナーゼ阻害剤について調べた結果を示す。（Ａ）正常なｉＰＳ細胞及びＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞の全般的遺伝子発現パターンを調べた結果を示す。ＬＤＮ−１９３１８９の存在下及び非存在下における、ｉＰＳ細胞株Ｎ３−１、ｉＰＳ細胞株Ｆ１−１及びＦ２−１、及びｉＰＳ細胞株Ｆ４−１についての全般的遺伝子発現パターンの散布図を示す。（Ｂ）ＬＤＮ−１９３１８９及びドルソモルフィンの構造を示す。

【図5】ＡＬＫ２遺伝子における突然変異及びＦＯＰ−ｉＰＳ細胞のＡＬＫ２活性の阻害を調べた結果を示す。（Ａ）ＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞株のＡＬＫ２遺伝子におけるゲノム塩基配列を決定した結果を示す。６１７Ｇ＞Ａ（Ｒ２０６Ｈ）及び１０６７Ｇ＞Ａ（Ｇ３５６Ｄ）の突然変異を矢印で示した。（Ｂ）ドルソモルフィン（ＤＭ）で処理したＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞の位相差像を示す。左のパネル：患者Ｆ２に由来するｉＰＳ細胞；右のパネル：患者Ｆ４に由来するｉＰＳ細胞。目盛尺：２００μｍ。（Ｃ）ＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞株における３種のコロニーの数及び比率を示す。ｉＰＳ Ｆ２−１及びｉＰＳ Ｆ４−２の細胞をＤＭと共に、又はＤＭを伴わずに培養した。未分化（Ｕ）、部分分化（Ｐ）及び完全分化（Ｄ）のコロニーは図２Ｅで記載したように定義する。目盛尺：２００μｍ。（Ｄ）ＬＤＮ−１９３１８９（ＬＤＮ）で処理した又は処理しない正常対照（２０１Ｂ７）及びＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞（Ｆ２−１及びＦ４−１）におけるリン酸化Ｓｍａｄ１／５／８の免疫ブロット解析の結果を示す。ＢＭＰ−４で処理したｉＰＳのＦ２−１、Ｆ４−１及び２０１Ｂ７におけるＳｍａｄ１／５／８のリン酸化の相対的レベルは、２０１Ｂ７細胞のみよりは高く、Ｓｍａｄ１／５／８のそのようなリン酸化はＬＤＮによる処理によって阻害される。１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−４で処理した又は処理しない２０１Ｂ７ｉＰＳ細胞をそれぞれ、Ｓｍａｄ１／５／８リン酸化の陰性対照及び陽性対照として用いた。（Ｅ）ＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞におけるＳｍａｄ１／５／８のリン酸化に対するＤＭの効果を調べた結果を示す。ＦＯＰ由来のｉＰＳ細胞（Ｆ２−１及びＦ４−２）におけるＳｍａｄ１／５／８のリン酸化は、ＬＤＮによるもののようにＤＭによる処理によって双方とも阻害される。リン酸化されたＳｍａｄ１／５／８の相対的レベルは総Ｓｍａｄ１に対して標準化されている。

【図6】ＦＯＰ−ｉＰＳ細胞についての遺伝子発現を解析した結果を示す。（Ａ）ＬＤＮの非存在下でｉＰＳ Ｆ２−１とＦ２−２の間で共通して２倍以上、上方又は下方調節される発現遺伝子に関するベン図を示す。５４，６７５の遺伝子中、１，４１７の発現遺伝子が、Ｆ２のｉＰＳ細胞株間で共通して上方調節され、３９４の遺伝子が下方調節される。（Ｂ）ＬＤＮの非存在下で培養されたｉＰＳのＦ１−１、Ｆ２（Ｆ２−１とＦ２−２）及びＦ４−１の間で２倍以上、共通して上方又は下方調節される遺伝子についてのベン図を示す。これらのｉＰＳ細胞株の遺伝子発現プロファイルを互いに比較すると、５１６の遺伝子の発現が共通して上方調節されることが示され、８５の遺伝子の発現が下方調節されることが示された。

【図7】乳児型クラッベ病患者由来の線維芽細胞からｉＰＳ細胞を誘導した結果を示す。