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特許6029112エクソソームの分析方法、エクソソーム分析用試薬およびエクソソーム分析装置
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6029112
(24)【登録日】2016年10月28日
(45)【発行日】2016年11月24日
(54)【発明の名称】エクソソームの分析方法、エクソソーム分析用試薬およびエクソソーム分析装置
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20161114BHJP
G01N 33/542 20060101ALI20161114BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20161114BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 D
G01N33/53 Y
G01N33/542 A
G01N33/531 B
【請求項の数】9
【全頁数】18
(21)【出願番号】特願2013-550169(P2013-550169)
(86)(22)【出願日】2012年10月25日
(86)【国際出願番号】JP2012077621
(87)【国際公開番号】WO2013094307
(87)【国際公開日】20130627
【審査請求日】2015年6月30日
(31)【優先権主張番号】特願2011-281618(P2011-281618)
(32)【優先日】2011年12月22日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】513086728
【氏名又は名称】テオリアサイエンス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100115255
【弁理士】
【氏名又は名称】辻丸 光一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100129137
【弁理士】
【氏名又は名称】中山 ゆみ
(74)【代理人】
【識別番号】100154081
【弁理士】
【氏名又は名称】伊佐治 創
(72)【発明者】
【氏名】落谷 孝広
【審査官】
草川 貴史
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１０／０５６３３７（ＷＯ，Ａ２）
【文献】
国際公開第００／１７６４３（ＷＯ，Ａ２）
【文献】
国際公開第２００９／０９２３８６（ＷＯ，Ａ２）
【文献】
国際公開第２０１２／０４８３７２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
Cauchon E、外７名，Development of a homogeneous immunoassay for the detection of angiotensin I in plasma using AlphaLISA acceptor beads technology.，Anal Biochem，２００９年 ５月，Vol.388,No.1，Page.134-139
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中のエクソソームを分析するエクソソームの分析方法であって、
前記試料に、
前記エクソソームが有する第１抗原と特異的に結合する第１抗体、および
前記エクソソームが有する第２抗原と特異的に結合する第２抗体
を添加する添加工程と、
前記第１抗原および前記第１抗体を反応させ、前記第２抗原および前記第２抗体を反応させる反応工程と、
前記第１抗原および前記第１抗体の反応と、前記第２抗原および前記第２抗体の反応とを検出する検出工程と
を含み、
前記第１抗体が、励起光により励起される励起標識に結合可能な抗体であり、
前記第２抗体が、前記励起標識の励起により発生する一重項酸素によりシグナルを発するシグナル発生標識に結合した抗体であり、
前記添加工程において、
さらに、前記励起標識を添加し、
前記反応工程において、
前記第１抗原に前記第１抗体が結合され、前記第２抗原に前記第２抗体が結合され、
前記検出工程において、
前記第１抗体に前記励起標識が結合され、励起光により前記励起標識が励起され、前記励起標識の励起による一重項酸素により前記シグナル発生標識から発せられたシグナルを検出することを特徴とするエクソソームの分析方法。
前記試料に、
前記エクソソームが有する第１抗原と特異的に結合する第１抗体、および
前記エクソソームが有する第２抗原と特異的に結合する第２抗体
を添加する添加工程と、
前記第１抗原および前記第１抗体を反応させ、前記第２抗原および前記第２抗体を反応させる反応工程と、
前記第１抗原および前記第１抗体の反応と、前記第２抗原および前記第２抗体の反応とを検出する検出工程と
を含み、
前記第１抗体が、励起光により励起される励起標識に結合可能な抗体であり、
前記第２抗体が、前記励起標識の励起により発生する一重項酸素によりシグナルを発するシグナル発生標識に結合した抗体であり、
前記添加工程において、
さらに、前記励起標識を添加し、
前記反応工程において、
前記第１抗原に前記第１抗体が結合され、前記第２抗原に前記第２抗体が結合され、
前記検出工程において、
前記第１抗体に前記励起標識が結合され、励起光により前記励起標識が励起され、前記励起標識の励起による一重項酸素により前記シグナル発生標識から発せられたシグナルを検出することを特徴とするエクソソームの分析方法。
【請求項2】
前記第１抗原および前記第２抗原が、前記エクソソームに特異的に発現している抗原であることを特徴とする請求項１記載の分析方法。
【請求項3】
前記第１抗原が、前記エクソソームに特異的に発現している抗原であり、
前記第２抗原が、前記エクソソームを分泌する細胞に特異的な抗原であることを特徴とする請求項１記載の分析方法。
前記第２抗原が、前記エクソソームを分泌する細胞に特異的な抗原であることを特徴とする請求項１記載の分析方法。
【請求項4】
前記第１抗原が、前記エクソソームを分泌する細胞に特異的な抗原であり、
前記第２抗原が、前記エクソソームに特異的に発現している抗原であることを特徴とする請求項１記載の分析方法。
前記第２抗原が、前記エクソソームに特異的に発現している抗原であることを特徴とする請求項１記載の分析方法。
【請求項5】
前記エクソソーム分析を、界面活性剤を含まない反応液中で行うことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項6】
前記試料が、血清であることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項7】
前記試料が、１〜１５μＬの範囲であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項8】
試料中のエクソソームの分析に使用する試薬であって、
前記エクソソームが有する第１抗原と特異的に結合する第１抗体と、
前記エクソソームが有する第２抗原と特異的に結合する第２抗体と、
励起光により励起される励起標識と、
を含み、
前記第１抗体が、前記励起標識に結合可能な抗体であり、
前記第２抗体が、前記励起標識の励起により発生する一重項酸素によりシグナルを発するシグナル発生標識に結合した抗体であり、
請求項１から７のいずれか一項に記載の分析方法に使用する
ことを特徴とするエクソソーム分析用試薬。
前記エクソソームが有する第１抗原と特異的に結合する第１抗体と、
前記エクソソームが有する第２抗原と特異的に結合する第２抗体と、
励起光により励起される励起標識と、
を含み、
前記第１抗体が、前記励起標識に結合可能な抗体であり、
前記第２抗体が、前記励起標識の励起により発生する一重項酸素によりシグナルを発するシグナル発生標識に結合した抗体であり、
請求項１から７のいずれか一項に記載の分析方法に使用する
ことを特徴とするエクソソーム分析用試薬。
【請求項9】
試料中のエクソソームを分析する装置であって、
前記試料に、
前記エクソソームが有する第１抗原と特異的に結合する第１抗体、
前記エクソソームが有する第２抗原と特異的に結合する第２抗体、および
励起光により励起される励起標識
を添加する添加手段と、
前記第１抗原および前記第１抗体を反応させ、前記第２抗原および前記第２抗体を反応させる反応手段と、
前記第１抗原および前記第１抗体の反応と、前記第２抗原および前記第２抗体の反応とを検出する検出手段と
を含み、
前記第１抗体が、前記励起標識に結合可能な抗体であり、
前記第２抗体が、前記励起標識の励起により発生する一重項酸素によりシグナルを発するシグナル発生標識に結合した抗体であり、
前記反応手段は、
前記第１抗原に前記第１抗体を結合させ、前記第２抗原に前記第２抗体を結合させ、
前記検出手段は、
前記第１抗体に前記励起標識が結合され、励起光により前記励起標識が励起され、前記励起標識の励起による一重項酸素により前記シグナル発生標識から発せられたシグナルを検出し、
請求項１から７のいずれか一項に記載の分析方法に使用することを特徴とするエクソソーム分析装置。
前記試料に、
前記エクソソームが有する第１抗原と特異的に結合する第１抗体、
前記エクソソームが有する第２抗原と特異的に結合する第２抗体、および
励起光により励起される励起標識
を添加する添加手段と、
前記第１抗原および前記第１抗体を反応させ、前記第２抗原および前記第２抗体を反応させる反応手段と、
前記第１抗原および前記第１抗体の反応と、前記第２抗原および前記第２抗体の反応とを検出する検出手段と
を含み、
前記第１抗体が、前記励起標識に結合可能な抗体であり、
前記第２抗体が、前記励起標識の励起により発生する一重項酸素によりシグナルを発するシグナル発生標識に結合した抗体であり、
前記反応手段は、
前記第１抗原に前記第１抗体を結合させ、前記第２抗原に前記第２抗体を結合させ、
前記検出手段は、
前記第１抗体に前記励起標識が結合され、励起光により前記励起標識が励起され、前記励起標識の励起による一重項酸素により前記シグナル発生標識から発せられたシグナルを検出し、
請求項１から７のいずれか一項に記載の分析方法に使用することを特徴とするエクソソーム分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、エクソソームの分析方法、エクソソーム分析用試薬およびエクソソーム分析装置に関する。【背景技術】
【0002】
臨床において、がんの診断には、例えば、がん細胞に特徴的に発現する腫瘍関連抗原（いわゆる、腫瘍マーカー）が使用されている。このような腫瘍マーカーの分析には、腫瘍マーカーに特異的に結合する抗体による分析方法が使用されている。【0003】
一方、卵巣がん患者において、がんの進行に伴い、血液中のエクソソーム量が増大することが報告されている（非特許文献１）。【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Taylor et al., Gynecologic Oncol, 100(2008) pp13-21
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
前記非特許文献１における血液中のエクソソームの分析は、エクソソームにおいて発現している特定のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の分析によるものであり、ｍｉＲＮＡの分析には、煩雑な操作が必要である。【0006】
そこで、本発明は、試料中のエクソソームを簡易に分析可能なエクソソームの分析方法、エクソソーム分析用試薬およびエクソソーム分析装置を提供することを目的とする。【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明のエクソソームの分析方法は、試料中のエクソソームを分析するエクソソームの分析方法であって、前記試料に、
前記エクソソームが有する第１抗原と特異的に結合する第１抗体、および
前記エクソソームが有する第２抗原と特異的に結合する第２抗体
を添加する添加工程と、
前記第１抗原および前記第１抗体を反応させ、前記第２抗原および前記第２抗体を反応させる反応工程と、
前記第１抗原および前記第１抗体の反応と、前記第２抗原および前記第２抗体の反応とを検出する検出工程とを
含むことを特徴とする。
【0008】
本発明のエクソソーム分析用試薬は、試料中のエクソソームの分析に使用する試薬であって、前記エクソソームが有する第１抗原と特異的に結合する第１抗体と、
前記エクソソームが有する第２抗原と特異的に結合する第２抗体と
を含み、
前記本発明の分析方法に使用する
ことを特徴とする。
【0009】
本発明のエクソソーム分析装置は、試料中のエクソソームを分析する装置であって、前記試料に、
前記エクソソームが有する第１抗原と特異的に結合する第１抗体、および
前記エクソソームが有する第２抗原と特異的に結合する第２抗体
を添加する添加手段と、
前記第１抗原および前記第１抗体を反応させ、前記第２抗原および前記第２抗体を反応させる反応手段と、
前記第１抗原および前記第１抗体の反応と、前記第２抗原および前記第２抗体の反応とを検出する検出手段と
を含み、
前記本発明の分析方法に使用する
ことを特徴とする。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、試料中のエクソソームを簡易に分析できる。このため、例えば、本発明の分析方法は、がんの発症の有無、がんの再発の有無等のがんの診断等に極めて有用であり、臨床検査への適用が大いに期待される。また、本発明のエクソソーム分析用試薬およびエクソソーム分析装置によれば、本発明の分析方法を、効率的に行える。【図面の簡単な説明】
【0011】
【図2C】図２Ｃは、本発明の実施例において、エクソソーム定量分析に使用する検量線（ビオチン化抗体：Purified Mouse Anti-Human CD63、アクセプタービーズ(Acceptor Beads)結合抗体：Purified Mouse Anti-Human CD63）である。
【図2D】図２Ｄは、本発明の実施例において、エクソソーム定量分析に使用する検量線（ビオチン化抗体：Purified Mouse Anti-Human CD9、アクセプタービーズ(Acceptor Beads)結合抗体：Purified Mouse Anti-Human CD9）である。
【図2E】図２Ｅは、本発明の実施例において、エクソソーム定量分析に使用する検量線（ビオチン化抗体：Purified Mouse Anti-Human CD81、アクセプタービーズ(Acceptor Beads)結合抗体：Purified Mouse Anti-Human CD81）である。
【図2F】図２Ｆは、本発明の実施例において、エクソソーム定量分析に使用する検量線（ビオチン化抗体：Purified Mouse Anti-Human CD63、アクセプタービーズ(Acceptor Beads)結合抗体：Purified Mouse Anti-Human CD9）である。
【図2G】図２Ｇは、本発明の実施例において、エクソソーム定量分析に使用する検量線（ビオチン化抗体：Purified Mouse Anti-Human CD9、アクセプタービーズ(Acceptor Beads)結合抗体：Purified Mouse Anti-Human CD81）である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
［エクソソームの分析方法］本発明のエクソソームの分析方法は、前述のように、試料中のエクソソームを分析するエクソソームの分析方法であって、前記試料に、前記エクソソームが有する第１抗原と特異的に結合する第１抗体、および前記エクソソームが有する第２抗原と特異的に結合する第２抗体を添加する添加工程と、前記第１抗原および前記第１抗体を反応させ、前記第２抗原および前記第２抗体を反応させる反応工程と、前記第１抗原および前記第１抗体の反応と、前記第２抗原および前記第２抗体の反応とを検出する検出工程とを含むことを特徴とする。
【0013】
前記試料は、特に制限されず、例えば、生体由来の試料等があげられる。前記生体由来の試料は、特に制限されず、例えば、血液、尿、汗、唾液、母乳、精液、リンパ液、脳脊髄液、涙液等があげられる。前記血液試料は、例えば、全血、血清、血漿等があげられ、これらの中でも、血清が特に好ましい。【0014】
前記試料は、例えば、取り扱いが容易であることから、液状の検体（液体検体）が好ましい。前記試料は、例えば、未希釈液をそのまま液体検体として使用してもよいし、溶媒に、懸濁、分散または溶解した希釈液を液体検体として使用してもよい。前記検体が固体の場合、例えば、前記溶媒に懸濁、分散または溶解した希釈液を液体検体として使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等があげられる。前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、従来公知の緩衝液があげられる。また、前記試料は、例えば、前記血液等から、超遠心法等によりエクソソームを調製し、これに、前記溶媒等を添加して調製してもよい。【0015】
前記試料の使用量は、特に制限されず、例えば、１〜１５μＬの範囲である。このように、本発明によれば、例えば、少量の試料で、エクソソームを分析できる。前記試料の使用量は、１〜１０μＬの範囲であることが好ましく、より好ましくは１〜５μＬの範囲である。【0016】
前記エクソソームは、動物細胞から分泌される直径３０〜１００ｎｍの脂質二重膜で覆われた膜小胞であり、抗原を有する。本発明によれば、前記エクソソームが有する二つの抗原（前記第１抗原および前記第２抗原）を利用して、試料中のエクソソームを分析する。このため、試料中のエクソソームを簡易に分析できる。前記分析は、例えば、定性分析でもよいし、定量分析でもよいし、半定量分析でもよい。【0017】
前記エクソソームが有する第１抗原および第２抗原は、例えば、前記エクソソームに特異的に発現している抗原（以下、「エクソソーム特異的抗原」ということがある。）、または前記エクソソームを分泌する細胞に特異的な抗原（以下、「細胞種特異的抗原」ということがある。）があげられる。前記第１抗原および前記第２抗原の組み合わせは、例えば、下記（１）〜（３）の３通りが例示できる。（１）第１抗原：エクソソーム特異的抗原、第２抗原：エクソソーム特異的抗原
（２）第１抗原：エクソソーム特異的抗原、第２抗原：細胞種特異的抗原
（３）第１抗原：細胞種特異的抗原、 第２抗原：エクソソーム特異的抗原
【0018】
前記エクソソーム特異的抗原は、例えば、CD63、CD9、CD81、CD37、CD53、CD82、CD13、CD11、CD86、ICAM-1、Rab5、Annexin V、LAMP1等があげられる。前記細胞種特異的抗原は、例えば、エクソソームの分析対象とする細胞の種類により適宜決定できる。前記細胞が、がん細胞である場合、前記細胞種特異的抗原は、例えば、がん細胞特異的抗原ということができ、例えば、Caveolin-1、EpCAM、FasL、TRAIL、Galectine3、CD151、Tetraspanin 8、EGFR、HER2、RPN2、CD44、TGF-β等があげられる。前記細胞は、前記がん細胞に限定されず、例えば、エクソソームが関与する疾患に関連する細胞があげられ、具体的には、例えば、アルツハイマー等の神経変性疾患、免疫不全に関連する疾患、不妊、うつ病、自閉症等の精神疾患、パーキンソン病等の難治療性疾患、自己免疫性疾患、リウマチアレルギー性疾患等に関連する細胞があげられる。前記細胞種特異的抗原は、前記がん細胞特異的抗原に限定されず、例えば、前述のエクソソームが関与する疾患に関連する細胞に特異的に発現している抗原でもよい。【0019】
前述のように、前記第１抗体は、前記第１抗原に特異的に結合する抗体であり、前記第２抗体は、前記第２抗原に特異的に結合する抗体である。前記第１抗体および前記第２抗体は、例えば、免疫グロブリン(Ｉｇ)、抗体フラグメント、キメラ抗体等があげられる。前記免疫グロブリンは、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等があげられる。前記抗体フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等があげられる。前記キメラ抗体は、例えば、ヒト化抗体等があげられる。前記抗体は、例えば、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類、ヒト等の動物種由来のものでもよく、特に制限されない。前記抗体は、例えば、前記動物種由来の血清から、従来公知の方法により調製してもよいし、市販の抗体を使用してもよい。前記抗体は、例えば、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれでもよく、モノクローナル抗体が好ましい。【0020】
前記第１抗体は、励起光により励起される励起標識に結合可能な抗体であることが好ましく、この場合、前記第２抗体は、前記励起標識の励起により発生する一重項酸素によりシグナルを発するシグナル発生標識に結合した抗体であることが好ましい。前記励起標識は、前記第１抗体に結合可能であり、励起光により励起される標識である。前記励起標識は、励起担体であることが好ましく、具体的には、例えば、PerkinElmer社製の励起担体（いわゆる、「ドナービーズ」）があげられる。前記励起標識を励起する励起光の波長は、特に制限されず、前記励起標識の種類等に応じて、適宜設定できる。前記第１抗体と前記励起標識との結合の方式は、特に制限されず、例えば、前記第１抗体をビオチン化された抗体とし、前記励起標識をストレプトアビジン被覆標識とし、両者を結合する方式があげられる。前記第１抗体のビオチン化は、従来公知の方法により行え、具体的には、例えば、後述の実施例に記載の方法より行える。前記ストレプトアビジン被覆標識は、例えば、PerkinElmer社製の「AlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated Alpha Donor Bead)」を使用できる。【0021】
前記シグナル発生標識は、前記励起標識の励起により発生された一重項酸素によりシグナルを発する。前記シグナル発生標識は、シグナル発生担体であることが好ましい。前記シグナルは、蛍光シグナルが好ましい。このようなシグナル発生標識は、具体的には、例えば、PerkinElmer社製の「AlphaLISA Acceptor Beads」（いわゆる、「アクセプタービーズ」）があげられる。前記第２抗体と前記シグナル発生標識との結合方法は、特に制限されず、例えば、後述の実施例に記載の方法により行える。【0022】
本発明の分析方法において、エクソソームの分析を妨げない範囲で、反応液には、従来公知の添加剤が含まれていてもよい。ただし、本発明の分析方法においては、エクソソーム分析を、界面活性剤が含まれていない反応液中で行うことが好ましい。前記界面活性剤は、例えば、Triton X-100等があげられる。前記反応液に、前記界面活性剤が含まれていることで、例えば、エクソソームの分析精度が低下する場合があるためである。前記反応液に、前記界面活性剤を含まないようにするために、前記試料、前記第１抗体および前記第２抗体の調製において、前記界面活性剤を使用しないことが好ましい。【0023】
以下に、本発明の分析方法について、実施形態１〜３の３通りの分析方法を例示する。ただし、本発明は、以下の実施形態には限定されない。実施形態１の分析方法は、前記第１抗体および前記第２抗体として、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体を使用する実施形態である。実施形態２の分析方法は、第１抗体として、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体を使用し、第２抗体として、細胞種特異的抗原に結合する抗体を使用する実施形態である。実施形態３の分析方法は、第１抗体として、細胞種特異的抗原に結合する抗体を使用し、第２抗体として、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体を使用する実施形態である。実施形態１〜３の分析方法において、前記第１抗体は、前記励起標識に結合可能な抗体であり、前記第２抗体は、前記シグナル発生標識に結合した抗体であり、前記添加工程において前記励起標識を添加し、前記試料として血清を使用する。【0024】
（実施形態１）まず、実施形態１の分析方法について、説明する。実施形態１の分析方法は、前述のように、前記第１抗体および前記第２抗体として、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体を使用し、前記添加工程、前記反応工程および前記検出工程を行う。
【0025】
まず、前記血清試料に、前記第１抗体、前記第２抗体および前記励起標識を添加する。前記各組成の添加順序は、特に制限されず、例えば、前記第１抗体および前記第２抗体を先に添加し、インキュベートした後に、前記励起標識を添加するのが好ましい。【0026】
つぎに、前記反応工程および前記検出工程を、図１Ａの模式図を参照して説明する。【0027】
図１Ａに示すように、エクソソーム１１には、エクソソーム特異的抗原１２および１３が発現している。反応液において、第１抗体１４および第２抗体１５は、前記血清試料中のエクソソーム１１が有するエクソソーム特異的抗原１２および１３に結合する。さらに、第１抗体１４に励起標識１６が結合する。励起標識１６が励起光１８により励起されると、一重項酸素が発生する。ここで、第１抗体１４および第２抗体１５がエクソソーム特異的抗原１２および１３に結合しているため、励起標識１６とシグナル発生標識１７とは、接近した状態にある。このため、前記一重項酸素により、シグナル発生標識１７からシグナルが発せられる。前記検出工程では、このシグナルを検出する。【0028】
（実施形態２）つぎに、実施形態２の分析方法について、説明する。実施形態２の分析方法は、前述のように、前記第１抗体として、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体を使用し、前記第２抗体として、細胞種特異的抗原に結合する抗体を使用し、前記添加工程、前記反応工程および前記検出工程を行う。
【0029】
まず、前記血清試料に、前記第１抗体、前記第２抗体および前記励起標識を添加する。前記各組成の添加順序は、特に制限されず、例えば、前記第１抗体および前記第２抗体を先に添加し、インキュベートした後に、前記励起標識を添加するのが好ましい。【0030】
つぎに、前記反応工程および前記検出工程を、図１Ｂの模式図を参照して説明する。【0031】
図１Ｂに示すように、エクソソーム１１には、エクソソーム特異的抗原１２と細胞種特異的抗原２３とが発現している。反応液において、第１抗体１４は、前記血液試料中のエクソソーム１１に含まれるエクソソーム特異的抗原１２に結合する。第２抗体２５は、エクソソーム１１に含まれる細胞種特異的抗原２３に結合する。さらに、第１抗体１４に励起標識１６が結合する。励起光１８により励起標識１６が励起されると、一重項酸素が発生する。ここで、第１抗体１４がエクソソーム特異的抗原１２に結合し、第２抗体２５が細胞種特異的抗原２３に結合しているため、励起標識１６とシグナル発生標識１７とは、接近した状態にある。このため、前記一重項酸素により、シグナル発生標識１７からシグナルが発せられる。前記検出工程では、このシグナルを検出する。【0032】
（実施形態３）つぎに、実施形態３の分析方法について、説明する。実施形態３の分析方法は、前述のように、前記第１抗体として細胞種特異的抗原に結合する抗体を使用し、前記第２抗体として、エクソソーム特異的抗原に結合する抗体を使用し、前記添加工程、前記反応工程および前記検出工程を行う。
【0033】
まず、前記血清試料に、前記第１抗体、前記第２抗体および前記励起標識を添加する。前記各組成の添加順序は、特に制限されず、例えば、前記第１抗体および前記第２抗体を先に添加し、インキュベートした後に、前記励起標識を添加するのが好ましい。【0034】
つぎに、前記反応工程および前記検出工程を、図１Ｃの模式図を参照して説明する。【0035】
図１Ｃに示すように、エクソソーム１１には、エクソソーム特異的抗原１３と細胞種特異的抗原２２とが発現している。反応液において、第１抗体２４は、前記血液試料中のエクソソーム１１に含まれる細胞種特異的抗原２２に結合する。第２抗体１５は、エクソソーム１１に含まれるエクソソーム特異的抗原１３に結合する。さらに、第１抗体２４に励起担体１６が結合する。励起光１８により励起担体１６が励起されると、一重項酸素が発生する。第１抗体２４が細胞種特異的抗原２２に結合し、第２抗体１５がエクソソーム特異的抗原１３に結合しているため、励起標識１６と、シグナル発生標識１７とは、接近した状態にある。このため、前記一重項酸素により、シグナル発生標識１７からシグナルが発せられる。前記検出工程では、このシグナルを分析する。【0036】
本発明の分析方法は、例えば、さらに、前記検出工程における検出値を補正する補正工程を含んでもよい。前記補正工程は、例えば、前記検出値を、検出値と試料中のエクソソーム濃度との相関関係により、補正できる。前記相関関係は、例えば、エクソソーム濃度が既知である標準試料について、本発明と同様に検出し、前記試料の検出値と、前記標準試料の検出値とをプロットすることにより求められる。前記標準試料は、エクソソームの希釈系列が好ましい。このように補正を行うことで、より信頼性の高い検出が可能となる。前記試料と前記標準試料とに含まれるエクソソームは、同一種の細胞（例えば、同一種のがん細胞）から分泌されたエクソソームであることが好ましい。【0037】
［エクソソーム分析用試薬］本発明のエクソソーム分析用試薬は、前述のように、試料中のエクソソームの分析に使用する試薬であって、前記エクソソームが有する第１抗原と特異的に結合する第１抗体と、前記エクソソームが有する第２抗原と特異的に結合する第２抗体とを含み、前記本発明の分析方法に使用することを特徴とする。本発明のエクソソーム分析用試薬は、前記本発明のエクソソーム分析方法の記載を引用できる。
【0038】
［エクソソーム分析装置］本発明のエクソソーム分析装置は、前述のように、試料中のエクソソームを分析する装置であって、前記試料に、前記第１抗体および前記第２抗体を添加する添加手段と、前記第１抗原および前記第１抗体を反応させ、前記第２抗原および前記第２抗体を反応させる反応手段と、前記第１抗原および前記第１抗体の反応と、前記第２抗原および前記第２抗体の反応とを検出する検出手段とを含み、前記本発明の分析方法に使用することを特徴とする。本発明のエクソソーム分析装置は、前記本発明のエクソソーム分析方法の記載を引用できる。
【0039】
前記添加手段は、例えば、分析装置の内部または外部に配置された、前記第１抗体、前記第２抗体を吸引および排出する吸排手段、ならびに、前記各組成の吸引量および／または排出量を制御する制御手段を有する。前記吸排手段は、例えば、ポンプ等があげられる。前記制御手段は、例えば、バルブ等があげられる。前記添加手段により、前記試料に、前記第１抗体および前記第２抗体が添加され、反応液が調製される。【0040】
前記反応手段は、例えば、前記反応液を、攪拌、吸排、振とう、超音波処理等する手段があげられる。【0041】
前記検出手段は、例えば、光学分析機器等があげられ、具体例として、例えば、蛍光測定装置等があげられる。前記検出手段は、例えば、反応液に励起光を照射する励起光照射手段を有してもよい。【0042】
本発明の分析装置によれば、前述の本発明の分析方法を実行できる。以下に、前記励起標識および前記シグナル発生標識を使用する場合を例にとり、本発明の分析装置の使用方法を例示するが、これには制限されない。【0043】
前記分析装置の内部または外部に、前記血液試料、前記第１抗体、前記第２抗体を配置する。【0044】
まず、前記添加手段により、前記第１抗体、前記第２抗体および前記励起標識を、前記試料に添加する。前記添加順序は、特に制限されず、例えば、前記第１抗体および前記第２抗体を前記試料に先に添加し、インキュベートした後に、さらに、前記励起標識を添加することが好ましい。この場合、本発明の分析装置は、インキュベーターを備えることが好ましい。つぎに、前記励起光照射手段から、前記反応液に励起光を照射し、前記検出手段により、前記シグナル発生標識から発せられたシグナルを検出する。このように、本発明の分析装置によれば、前述の本発明の分析方法を、例えば、自動で行える。【実施例】
【0045】
つぎに、本発明の実施例について、説明する。本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。【0046】
１．エクソソーム特異的抗原に結合する抗体前記エクソソーム特異的抗原に結合する抗体として、下記（１）〜（３）の抗体を準備した。
（１）Purified Mouse Anti-Human CD63（BD Biosciences社、Clone：H5C6）
（２）Purified Mouse Anti-Human CD9（BD Biosciences社、Clone：M-L13）
（３）Purified Mouse Anti-Human CD81（BD Biosciences社、Clone：JS-81）
【0047】
２．抗体のビオチン化前記抗体を、下記（１）〜（７）の手順に基づいてビオチン化し、ビオチン化抗体を調製した。
（１）準備した抗体を、Zeba Spin Desalting columns 7K MWCO（Thermo社）を使用して、バッファーを置換した。1.5mLチューブにカラムをセットし、1500×g（14700m/s2）で１分間遠心した。
（２）前記遠心後、前記カラムに、PBS 300μLを添加し、1500×g（14700m/s2）で１分間遠心した。このPBS添加および遠心を、３回繰り返した。
（３）前記カラムを、新しい1.5mLチューブに移し、前記抗体を添加し、1500×g（14700m/s2）で２分間遠心した。
（４）1mg/mL 抗体溶液（PBS） 100μLに、2mg/mL ChromaLink Biotin 354S（solulink社） 7.62μLを添加し、さらに、PBS 92.38μLを添加し、全量を200μLとした。
（５）この溶液を、23℃の恒温水槽で、２時間インキュベートして、前記抗体をビオチン化した。
（６）前記（１）および（２）を行った、新しいZeba Spin Desalting columnsを準備し、前記ビオチン化した抗体 100μLを、前記カラムに添加し、1500×g（14700m/s2）で２分間遠心した。
（７）得られたビオチン化抗体を、濃度とラベル比を算出し、PBS中で終濃度500mM（500mmol/L）に調整した。
【0048】
３．抗体のビオチン化の確認図２Ａに示すように、AlphaLisa ImmunoAssay BufferにAlphaLISAアクセプタービーズ(AlphaLISA Acceptor Beads)10μg/mLを加え、総量を50μLになるようにして測定した。AlphaLISA Immunoassay Bufferの組成は、図２Ａにも示したとおり、25mM HEPES、0.1% カゼイン、0.5% トリトンX-100、1mg/mL デキストラン-500、0.05%プロクリン-300(proclin-300)からなる。前記抗体のビオチン化は、Anti-mouse IgG AlphaLISA Acceptor Beads（PerkinElmer社）を使用し、下記（１）〜（５）の手順でアッセイして確認した。
（１）AlphaLISA Immunoassay Buffer（PerkinElmer社）を使用して、ビオチン化抗体を、1.5、5、15、50nM（nmol/L）に希釈した。同様に、5mg/mL Anti-mouse IgG AlphaLISA Acceptor Beadsを、AlphaLISA Immunoassay Bufferで、１００倍に希釈した（濃度50μg/mL）。
（２）９６ウェルホワイトプレート（PerkinElmer社、1/2 AreaPlate-96）の各ウェルに、AlphaLISA Immunoassay Buffer 5μLを添加し、さらに、前記（１）で希釈したビオチン化抗体 10μLを添加した。前記ビオチン化抗体の終濃度は、0.3、1、3、10nM（nmol/L）となる。また、コントロールとして、前記希釈したビオチン化抗体に代えて、PBS 10μLを添加した（ビオチン化抗体の終濃度：0nM（nmol/L））。
（３）さらに、前記（１）で希釈したAnti-mouse IgG AlphaLISA Acceptor Beads（50μg/mL） 10μLを添加し、室温・遮光条件下において、１時間インキュベートした。
（４）5mg/mL AlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated Alpha Donor Bead)（PerkinElmer社）を、AlphaLISA Immunoassay Bufferで、62.5倍に希釈した（濃度80μg/mL）。この希釈したAlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated Alpha Donor Bead) 25μLを、前記インキュベート後の各ウェルに添加し、TopSeal-A（PerkinElmer社）を前記プレートに貼り、室温・遮光条件下において、３０分間インキュベートした。
（５）前記インキュベート後、EnSpire（PerkinElmer社）による分析を行った。前記エクソソーム特異的抗原に結合する抗体は、Purified Mouse Anti-Human CD63（BD Biosciences社、Clone：H5C6）、Purified Mouse Anti-Human CD9（BD Biosciences社、Clone：M-L13）、Purified Mouse Anti-Human CD81の3種類である。これら3種類のそれぞれについて、前記ビオチン化抗体の濃度が1.5、5、15、50nM(nmol/L)であるサンプルに対してそれぞれEnSpireを用いてシグナルを分析し、前記抗体がビオチン化されていることを確認した。前記分析は、Measure Technology：AlphaScreenに設定（励起波長：６８０ｎｍ、検出波長：５２０〜６２０ｎｍ）して行った（以下、同様）。この結果、図２Ａに示すように、AlphaLISAアクセプタービーズ(AlphaLISA Acceptor Beads)に結合した前記ビオチン化抗体及びAlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated Alpha Donor Bead)に結合した前記ビオチン化抗体同士が結合していることが確認された。
【0049】
４．AlphaLISAアクセプタービーズ(AlphaLISA Acceptor Beads)への抗体の結合図２Ｂに示すように、AlphaLisa ImmunoAssay Bufferに1nM のBiotinylated AntiMouse IgG Anitibodyを加え、総量を50μLになるようにして測定した。AlphaLISA Immunoassay Bufferの組成は、図２Ｂに示したとおりであり、すなわち、前記「3.抗体のビオチン化の確認」(図２Ａ)で用いたものと同じである。前記抗体を、下記（１）〜（９）の手順に基づいてAlphaLISAアクセプタービーズ(AlphaLISA Acceptor Beads)に結合させた。
（１）前記「２．抗体のビオチン化」における前記（１）〜（３）を行った。
（２）Anti-mouse IgG AlphaLISA Acceptor Beads 50μLを、前記カラムをセットした1.5mLチューブに移し、16000×g（156800m/s2）で１５分間遠心した。前記遠心後、上清を除去した。
（３）前記遠心後の沈殿したAlphaLISA Acceptor Beadsに、PBS 50μLを添加し、16000×g（156800m/s2）で１５分間遠心した。前記遠心後、上清を除去した。
（４）前記遠心後の沈殿したAlphaLISA Acceptor Beadsに、PBS 88.75μLを添加し、ボルテックスして再懸濁させた。
（５）前記懸濁液に、1mg/mL 抗体溶液（PBS） 100μLを添加し、さらに、10% Tween-20 1.25μLおよび25mg/mL NaBH3CN溶液 10μLを添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。
（６）前記インキュベート後の懸濁液に、65mg/mL カルボキシメチルアミン溶液（0.8M（mol/L） NaOH溶液） 10μLを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
（７）前記インキュベート後の懸濁液を、16000×g（156800m/s2）で１５分間遠心した。前記遠心後、上清を除去し、沈殿に、0.1M（mol/L） Tris-HCl（pH8.0） 200μLを添加して懸濁させた。そして前記と同様に遠心した。この操作を２回繰り返して洗浄した。
（８）前記洗浄後の懸濁液を、16000×g（156800m/s2）で１５分間遠心し、上清を除去した。沈殿に、0.05% Proclin-300を含むPBS 200μLを添加して、再懸濁させた。このようにして、AlphaLISAアクセプタービーズ(AlphaLISA Acceptor Beads)に結合させた抗体（以下、「アクセプタービーズ(Acceptor Beads)結合抗体」ということがある。）を調製した（終濃度5mg/mL）。
（９）前記懸濁液を、ボルテックス後軽くスピンダウンし、ソニケーターを使用して、１秒２０回のソニケーションを行った。これを、４℃・遮光条件下において保存した。
【0050】
５．抗体とアクセプタービーズ(Acceptor Beads)の結合との確認 前記抗体のAlphaLISAアクセプタービーズ(AlphaLISA Acceptor Beads)への結合は、Biotin-SP-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)（JacksonImmunoResearch社）を使用し、下記（１）〜（５）の手順でアッセイして確認した。（１）AlphaLISA Immunoassay Bufferを使用して、前記アクセプタービーズ(Acceptor Beads)結合抗体を、10、50μg/mLに希釈した。同様に、AlphaLISA Immunoassay Bufferを使用して、前記ビオチン化抗体を、5nM（nmol/L）に希釈した。
（２）前記９６ウェルホワイトプレートの各ウェルに、AlphaLISA Immunoassay Buffer 5μLを添加し、さらに、前記（１）で希釈したビオチン化抗体 10μLを添加した。
（３）さらに、前記（１）で希釈したアクセプタービーズ(Acceptor Beads)結合抗体 10μLを添加し、室温・遮光条件下において、１時間インキュベートした。コントロールとして、前記希釈したアクセプタービーズ(Acceptor Beads)結合抗体に代えて、PBS 10μLを添加した。
（４）5mg/mL AlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated Alpha Donor Bead)を、AlphaLISA Immunoassay Bufferで、62.5倍に希釈した（濃度80μg/mL）。この希釈したAlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated Alpha Donor Bead) 25μLを、前記インキュベート後の各ウェルに添加し、TopSeal-Aを前記プレートに貼り、室温・遮光条件下において、３０分間インキュベートした。
（５）前記インキュベート後、EnSpireによる分析を行った。前記エクソソーム特異的抗原に結合する抗体は、Purified Mouse Anti-Human CD63（BD Biosciences社、Clone：H5C6）、Purified Mouse Anti-Human CD9（BD Biosciences社、Clone：M-L13）、Purified Mouse Anti-Human CD81の3種類である。これら3種類のそれぞれに対して前記AlphaLISA Acceptor Beads抗体濃度が0、2、10μg/mLであるサンプルを用意し、EnSpireでシグナルを分析した。この分析により、前記抗体がAlphaLISAアクセプタービーズ(AlphaLISA Acceptor Beads)に結合していることを確認した。前記分析は、Measure Technology：AlphaScreenに設定して行った。この結果、図２Ｂに示すように、AlphaLISAアクセプタービーズ(AlphaLISA Acceptor Beads)に結合した前記ビオチン化抗体（Biotinylated Anti-Mouse IgG Antibody）及びAlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated Alpha Donor Bead)に結合した前記ビオチン抗体（Biotinylated Anti-Mouse IgG Antibody）同士が結合していることが確認された。なお、前記AlphaLISA Acceptor Beads抗体濃度が0μg/mLであるサンプルには、いずれにおいてもシグナルは、観測されなかった。
【0051】
６．エクソソームの定量（エクソソームの調製）
がん細胞の培養上清から、超遠心法により、下記（１）〜（７）の手順に基づいてエクソソームを調製した。
（１）前立腺がん細胞株PC3（入手元：ATCC）を、15cmディッシュに播種し、培養した。
（２）前記播種の翌日、前記がん細胞をPBSで一度洗浄し、血清が含まれていないAdvanced PRMI1640（Invitrogen社）に培地を交換し、２日間培養した。
（３）前記培養後、培養上清を回収し、2000×g（19600m/s2）で１０分間遠心し、上清を回収した。
（４）前記上清を、フィルター（孔径：0.22μm）でろ過した。
（５）前記ろ液を、100000×g（980000m/s2）で、４℃・７０分間超遠心した。
（６）前記超遠心後、上清を除去し、沈殿にPBSを添加し、さらに、100000×g（980000m/s2）で、４℃・７０分間超遠心した。
（７）前記超遠心後、上清を除去し、沈殿にPBSを添加し、４℃で一晩置き、翌日にボルテックスして、エクソソームを回収した。
【0052】
（検量線作成）前記ビオチン化抗体、前記アクセプタービーズ(Acceptor Beads)結合抗体により、下記（１）〜（５）の手順に基づいて前記回収したエクソソームの定量分析を行い、エクソソームの検量線を作成した。下記（１）〜（４）において、AlphaLISA Universal Buffer（PerkinElmer社）は、0.1% BSAおよび0.05% Proclin-300を含むPBSを使用した。
（１）ビオチン化抗体およびアクセプタービーズ(Acceptor Beads)結合抗体を、AlphaLISA Universal Buffer（PerkinElmer社）を使用して、それぞれ、5nM（nmol/L）および50μg/mLに希釈した。
（２）前記回収したエクソソームを、AlphaLISA Universal Bufferを使用して希釈し、所定濃度の希釈系列を作成した。
（３）前記９６ウェルホワイトプレートの各ウェルに、前記希釈したエクソソーム 5μLを添加した。コントロールとして、AlphaLISA Universal Buffer 5μLを添加し、さらに、5nM（nmol/L） ビオチン化抗体 10μLおよび50μg/mL アクセプタービーズ(Acceptor Beads)結合抗体 10μLを添加し、室温・遮光条件下において、１時間インキュベートした。
（４）5mg/mL AlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated Alpha Donor Bead)を、AlphaLISA Immunoassay Bufferで、62.5倍に希釈した（濃度80μg/mL）。この希釈したAlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated Alpha Donor Bead) 25μLを、前記インキュベート後の各ウェルに添加し、TopSeal-Aを前記プレートに貼り、室温・遮光条件下において、３０分間インキュベートした。なお、インキュベート時間は、特に制限されず、例えば、温度条件等の変更に応じて、１時間〜終夜の範囲とすることもできる。
（５）前記インキュベート後、EnSpireを使用して、シグナルを分析し、エクソソームを分析した。前記分析は、Measure Technology：AlphaScreenに設定して行った。そして、エクソソームの希釈系列から検量線を作成した。
【0053】
（検量線作成結果）下記（１）〜（６）のビオチン化抗体およびアクセプタービーズ(Acceptor Beads)結合抗体の組み合わせについて、検量線を作成した。下記（１）〜（６）の抗体の組み合わせおよびその検量線を、それぞれ、図２Ｃ〜図２Ｈに示す。
【0054】
（１）ビオチン化抗体：Purified Mouse Anti-Human CD63アクセプタービーズ(Acceptor Beads)結合抗体：Purified Mouse Anti-Human CD63
ｙ＝０．００１７ｘ（Ｒ２＝０．９８９１）
（２）ビオチン化抗体：Purified Mouse Anti-Human CD9
アクセプタービーズ(Acceptor Beads)結合抗体：Purified Mouse Anti-Human CD9
ｙ＝０．０２０１ｘ（Ｒ２＝０．９８２６）
（３）ビオチン化抗体：Purified Mouse Anti-Human CD81
アクセプタービーズ(Acceptor Beads)結合抗体：Purified Mouse Anti-Human CD81
ｙ＝０．０１８６ｘ（Ｒ２＝０．９９８５）
（４）ビオチン化抗体：Purified Mouse Anti-Human CD63
アクセプタービーズ(Acceptor Beads)結合抗体：Purified Mouse Anti-Human CD9
ｙ＝０．０１４１ｘ（Ｒ２＝０．９９６）
（５）ビオチン化抗体：Purified Mouse Anti-Human CD9
アクセプタービーズ(Acceptor Beads)結合抗体：Purified Mouse Anti-Human CD81
ｙ＝０．００３７ｘ（Ｒ２＝０．９９９８）
（６）ビオチン化抗体：Purified Mouse Anti-Human CD81
アクセプタービーズ(Acceptor Beads)結合抗体：Purified Mouse Anti-Human CD63
ｙ＝０．００３１ｘ（Ｒ２＝０．９９９８）
【0055】
図２Ｃ（前記（１））では、PBS溶液中、0.1％BSAと0.05%プロクリン‐300(proclin-300)からなるAlphaLisa Universal Bufferに1nMのBiotinylated AntiCD63 Antibodyおよび10μg/mLのAnti-CD63-conjugated AlphaLISA アクセプタービーズ(Acceptor Bead)を加え、総量を50μLになるようにして測定した。なお、図２Ｃでは、AlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated Alpha Donor Bead)に結合したBiotinylated AntiCD63 Antibody及びAnti-CD63-conjugated AlphaLISAアクセプタービーズ(Acceptor Bead)に結合したBiotinylated AntiCD63 Antibodyが、それぞれPC3エクソソーム内の抗原CD63に結合している様子を示した。シグナルを横軸に、タンパク質濃度(μg/ml)を縦軸にプロットし、検量線を作成したところ、ｙ＝０．００１７ｘ（Ｒ２＝０．９８９１）という式を得た。【0056】
図２Ｄ(前記（２）)では、前記 AlphaLisa Universal Bufferに1nM のBiotinylated AntiCD9 Antibodyおよび10μg/mLのAnti-CD9-conjugated AlphaLISAアクセプタービーズ(Acceptor Bead)を加え、総量を50μLになるようにして測定した。なお、図２Ｄでは、AlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated Alpha Donor Bead)に結合したBiotinylated AntiCD9 Antibody及びAnti-CD9-conjugated AlphaLISAアクセプタービーズ(Acceptor Bead)に結合したBiotinylated AntiCD9 Antibodyが、それぞれPC3エクソソーム内の抗原CD9に結合している様子を示した。シグナルを横軸に、タンパク質濃度(μg/ml)を縦軸にプロットし、検量線を作成したところ、ｙ＝０．０２０１ｘ（Ｒ２＝０．９８２６）という式を得た。【0057】
図２Ｅ（前記（３））では、前記 AlphaLisa Universal Bufferに1nMのBiotinylated AntiCD81 Antibodyおよび10μg/mLのAnti-CD81-conjugated AlphaLISA アクセプタービーズ(Acceptor Bead)を加え、総量を50μLになるようにして測定した。なお、図２Ｅでは、AlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated Alpha Donor Bead)に結合したBiotinylated AntiCD81 Antibody及びAnti-CD81-conjugated AlphaLISAアクセプタービーズ(Acceptor Bead)に結合したBiotinylated AntiCD81 Antibodyが、それぞれPC3エクソソーム内の抗原CD81に結合している様子を示した。シグナルを横軸に、タンパク質濃度(μg/ml)を縦軸にプロットし、検量線を作成したところ、ｙ＝０．０１８６ｘ（Ｒ２＝０．９９８５）という式を得た。【0058】
図２Ｆ（前記（４））では、前記AlphaLisa Universal Bufferに1nMのBiotinylated AntiCD63 Antibodyおよび10μg/mLのAnti-CD9-conjugated AlphaLISAアクセプタービーズ(Acceptor Bead)を加え、総量を50μLになるようにして測定した。なお、図２Ｆでは、AlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated Alpha Donor Bead)に結合したBiotinylated AntiCD63 Antibody及びAnti-CD9-conjugated AlphaLISAアクセプタービーズ(Acceptor Bead)に結合したBiotinylated AntiCD63 Antibodyが、それぞれPC3エクソソーム内の抗原CD63及び抗原CD9に結合している様子を示した。シグナルを横軸に、タンパク質濃度(μg/ml)を縦軸にプロットし、検量線を作成したところ、ｙ＝０．０１４１ｘ（Ｒ２＝０．９９６）という式を得た。【0059】
図２Ｇ（前記（５））では、前記AlphaLisa Universal Bufferに1nMのBiotinylated AntiCD9 Antibodyおよび10μg/mLのAnti-CD81-conjugated AlphaLISAアクセプタービーズ(Acceptor Bead)を加え、総量を50μLになるようにして測定した。なお、図２Ｇでは、AlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated Alpha Donor Bead)に結合したBiotinylated AntiCD9 Antibody及びAnti-CD81-conjugated AlphaLISAアクセプタービーズ(Acceptor Bead)に結合したBiotinylated AntiCD81 Antibodyが、それぞれPC3エクソソーム内の抗原CD9及び抗原CD81に結合している様子を示した。シグナルを横軸に、タンパク質濃度(μg/ml)を縦軸にプロットし、検量線を作成したところ、ｙ＝０．００３７ｘ（Ｒ２＝０．９９９８）という式を得た。【0060】
図２Ｈ（前記（６））では、前記AlphaLisa Universal Bufferに1nMのBiotinylated AntiCD81 Antibodyおよび10μg/mLのAnti-CD63-conjugated AlphaLISAアクセプタービーズ(Acceptor Bead)を加え、総量を50μLになるようにして測定した。なお、図２Ｈでは、AlphaScreenストレプトアビジンドナービーズ(Streptavidin-coated Alpha Donor Bead)に結合したBiotinylated AntiCD81 Antibody及びAnti-CD63-conjugated AlphaLISAアクセプタービーズ(Acceptor Bead)に結合したBiotinylated AntiCD63 Antibodyが、それぞれPC3エクソソーム内の抗原CD81及び抗原CD63に結合している様子を示した。シグナルを横軸に、タンパク質濃度(μg/ml)を縦軸にプロットし、検量線を作成したところ、ｙ＝０．００３１ｘ（Ｒ２＝０．９９９８）という式を得た。【0061】
［実施例１］本実施例では、前立腺がん患者の血清および健常者の血清を使用して、血清中のエクソソームを分析し、前立腺がん患者の血清および健常者の血清中のエクソソーム量の差を確認した。
【0062】
（１）血清の準備前立腺がん患者（ステージ４、ｎ＝４）および健常者（ｎ＝４）から全血を採取し、前記全血から血清を調製した。下記エクソソーム分析に使用する血清量は、4μLとした。
【0063】
（２）エクソソーム分析下記表１に示す組成の反応液となるように、前記「６．エクソソームの定量」における「検量線作成」の前記（１）〜（４）と同様の操作を行い、前記（５）と同様にして、シグナルを分析し、得られたシグナル値を血清に含まれるエクソソーム量として分析した。
【0064】
【表1】
【0065】
図３のグラフに、前記両血清中のエクソソームの分析結果を示す。図３に示すように、前立腺がん患者の血清中には、健常者の血清中よりも、有意に多くのエクソソームが含まれることが確認された。この結果から、血清中のエクソソームを分析することで、分析対象が、がん患者であるか、健常者であるかを区別できることが確認された。したがって、本発明によれば、血液中のエクソソームを簡易に分析でき、例えば、血液試料提供者が、健常者であるか、がん患者であるかを診断できるといえる。【0066】
［実施例２］本実施例では、肝がん患者のがんの切除手術直後の血清および再発後の同患者の血清を使用して、血清中のエクソソームを分析し、がんの切除手術直後および再発後の血清中のエクソソーム量の差を確認した。
【0067】
（１）血清の準備がんの切除手術直後の肝がん患者の全血、および再発後の同患者の全血を採取し、前記全血から血清を調製した（ｎ＝１２）。下記エクソソーム分析に使用する血清量は、4μLとした。
【0068】
（２）エクソソーム分析前記（１）で調製した血清を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、がんの切除手術直後の肝がん患者の血清、および再発後の同患者の血清に含まれるエクソソーム量を分析した。
【0069】
図４のグラフに、前記両血清中のエクソソームの分析を示す。図４に示すように、がんの切除手術直後の肝がん患者の血清中よりも、再発後の同患者の血清の方が、多くのエクソソームが含まれることが確認された。この結果から、血清中のエクソソームを分析することで、がんの切除手術を行った患者について、切除手術後にがんが再発しているかを判別できることが確認された。したがって、本発明によれば、例えば、血液中のエクソソームを分析することで、がん患者におけるがん切除手術後の再発の有無を診断できるといえる。【0070】
以上のように、本発明によれば、試料中のエクソソームを簡易に分析できる。このため、例えば、本発明のエクソソームの分析方法は、がんの発症の有無、がんの再発の有無等のがんの診断等に極めて有用であり、臨床検査への適用が大いに期待される。【符号の説明】
【0071】
１１ エクソソーム１２、１３ エクソソーム特異的抗原
１４、２４ 第１抗体
１５、２５ 第２抗体
１６ 励起標識
１７ シグナル発生標識
１８ 励起光
２２、２３ 細胞種特異的抗原