特許 6029131 核酸導入剤、核酸導入方法及び細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6029131

(24)【登録日】2016年10月28日

(45)【発行日】2016年11月24日

(54)【発明の名称】核酸導入剤、核酸導入方法及び細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20161114BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20161114BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20161114BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20161114BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20161114BHJP

   C08L 33/14 20060101ALI20161114BHJP

   C08K 5/17 20060101ALI20161114BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C08L33/14

   C08K5/17

【請求項の数】3

【全頁数】10

(21)【出願番号】特願2011-287595(P2011-287595)

(22)【出願日】2011年12月28日

(65)【公開番号】特開2013-135623(P2013-135623A)

(43)【公開日】2013年7月11日

【審査請求日】2014年12月4日

(73)【特許権者】

【識別番号】510094724

【氏名又は名称】国立研究開発法人国立循環器病研究センター

(73)【特許権者】

【識別番号】000005278

【氏名又は名称】株式会社ブリヂストン

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】100119530

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 和幸

(74)【代理人】

【識別番号】100150360

【弁理士】

【氏名又は名称】寺嶋 勇太

(72)【発明者】

【氏名】中山 泰秀

(72)【発明者】

【氏名】岩井 良輔

(72)【発明者】

【氏名】根本 泰

【審査官】 福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００４−１５９５０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／１１７８２８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００８−１９５６８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−２７５００１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−２７５００２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５００６５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５０１１５６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリルアミドからなる群から選択されるカチオン性ポリマーと、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールとを、カチオン性ポリマーの重量部と２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールの重量部との比を１／１〜１／１０として含む組成物を調製することにより、核酸導入剤を製造する方法。

【請求項2】

請求項１に記載の核酸導入剤を製造する方法により製造された核酸導入剤と核酸と細胞とを液中で共存させて細胞に該核酸を導入する核酸導入方法。

【請求項3】

請求項２の核酸導入方法によって核酸が導入された細胞を製造する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞に核酸を導入するための核酸導入剤及び核酸導入方法と、この方法により核酸が導入された細胞とに関する。

【背景技術】

【0002】

近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡの導入のためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ付随ウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスが、治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし感染及び免疫反応の危険性は依然として残されている。

【0003】

特許文献１には、ベンゼンなどの芳香環を核として分岐鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターがＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることが記載されている。

【0004】

特許文献２には、ポリ[２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート]の温度感応性を利用した、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、このイニファターに対して、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を光照射リビング重合してなるスター型ポリマーよりなる遺伝子導入剤が記載されている。この遺伝子導入剤は、分岐鎖を構成する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体が、僅かながらカチオン性を有する。そのため、このカチオン性の２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート単位は、核酸との結合に寄与し、遺伝子導入剤の核酸担持量が多くなる。また、この遺伝子導入剤は、分岐鎖が感温性を有しており、温度を上昇させることにより、遺伝子導入剤が疎水性に変化する。

【0005】

より多くの核酸を担持することができる遺伝子導入剤として、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、このイニファターに対して、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を光照射リビング重合してなる遺伝子導入剤が特許文献３に記載されている。

【0006】

この特許文献３に記載される遺伝子導入剤は、分岐鎖を構成する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体が、僅かながらカチオン性を備えるため、このカチオン性の２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート単位が、核酸との結合に寄与し、核酸担持量を多くすることができる。また、分岐鎖が感温性を有していることから、温度を調整することにより、遺伝子導入剤を疎水性に変化させることができる。

【0007】

特許文献４には、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレートのポリマーを核酸複合体へ導入し、該ポリマーの側鎖が加水分解して陽電荷側鎖が陰電荷側鎖へ変換されることにより核酸複合体のデコンデンスを誘発することが記載されている。

【0008】

核酸複合体のデコンデンスは複合体内の核酸の状態の確認などを目的として強制的にある程度デコンデンスができる方法が確立されている。ヘパリンやデキストラン硫酸のような陰電荷ポリマーを混合し、複合体中に入り組んだイオン結合をイオン交換性に解離させるものであるが、物理化学実験のような試験管中で実施が可能な方法であり、細胞内で実施できるものではない。なぜなら細胞膜は陰電荷を帯びており、デキストラン硫酸のようなポリマーが細胞内へ侵入することは困難であるし、生体内で使用することを想定すると抗血栓性＝出血性の効果が使用を制限することとなる。ちなみに細胞内で核酸複合体をデコンデンスさせているのは細胞内に存在する天然のシアル酸、ヘパリン硫酸などの陰イオン性化合物であるとされている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特開２００８−１９５６８１号公報

【特許文献2】特開２０１０−１３６６３１号公報

【特許文献3】特開２０１１−７２２５７号公報

【特許文献4】特開２０１０−１１５１５３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

従来は核酸複合体中の核酸の状態を確認する目的で試験管中（ゲル中）で複合体のデコンデンスを行なう際にヘパリンを混合して行なっていたが、ヘパリンは高価であり、かつ、デコンデンスの効率は高くはなく、再現性も低かった（ヘパリン自体がロットごとに構造が微妙に異なる物質である）。本発明は、安価な低分子量化合物で効率良く、速やかな核酸デコンデンスが可能な核酸導入剤及び核酸導入方法と、この方法により核酸が導入された細胞を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明の核酸導入剤を製造する方法は、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリルアミドからなる群から選択されるカチオン性ポリマーと、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールとを、カチオン性ポリマーの重量部と２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールの重量部との比を１／１〜１／１０として含む組成物を調製するものである。

【0013】

本発明の核酸導入方法は、かかる本発明の核酸導入剤を製造する方法により製造された核酸導入剤と、核酸と、細胞とを液中で共存させて細胞に核酸を導入するものである。
本発明の核酸が導入された細胞を製造する方法は、かかる本発明の核酸導入方法によるものである。

【発明の効果】

【0014】

カチオン性ポリマー及び／又はカチオン性脂質と核酸と細胞とを溶液中に共存させて核酸を細胞に導入するに際し、この溶液中にさらに２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールを共存させると、核酸導入効率が向上することが認められた。この理由としては、カチオン性ポリマー及び／又はカチオン性脂質と核酸との複合体に対し２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールが作用して核酸が複合体からデコデンスするか又はデコデンスし易くなるためであるか、もしくは、細胞に取り込まれた核酸が転写因子に認識され易い形態になるためであることなどが推察される。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】電気泳動ゲル写真である。

【図2】実施例の結果を示すグラフである。

【図3】実施例の結果を示すグラフである。

【図4】実施例の結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。

【0017】

本発明の核酸導入剤は、カチオン性ポリマー及び／又はカチオン性脂質と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールとを含むものである。

【0018】

このカチオン性ポリマーとしては２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート，２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリルアミド、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）アクリルアミド、４−ビニルアニリン、修飾キトサン、修飾ゼラチン、ポリリジン、ポリアリルアミンなどが挙げられる。

【0019】

カチオン性脂質としては炭素数１０以上例えば炭素数１０〜３０のパラフィン又はオレフィンへ１級、２級、３級、又は４級アミンを導入した化合物などが挙げられる。

【0020】

カチオン性ポリマー及び／又はカチオン性脂質と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールとの比率はカチオン性ポリマー及び／又はカチオン性脂質１重量部に対し２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール１〜２０重量部特に３〜１０重量部であることが好ましい。

【0021】

本発明の核酸導入方法は、カチオン性ポリマー及び／又はカチオン性脂質と、核酸と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールと、細胞とを溶液中で共存させて核酸を細胞に導入するものである。共存させるための添加手順は、特に限定されるものではなく、例えば、カチオン性ポリマー及び／又はカチオン性脂質の溶液に対し核酸を添加し、次いで細胞を添加してもよく、カチオン性ポリマー及び／又はカチオン性脂質の溶液に対し、核酸、細胞、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールの順で添加してもよく、カチオン性ポリマー及び／又はカチオン性脂質と核酸と２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールとを混合して溶液としておき、この溶液を細胞培養液に添加してもよい。

【0022】

カチオン性ポリマー及び／又はカチオン性脂質と核酸とが溶液中で共存すると、溶液中における２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールや細胞の共存する場合でもしない場合でもカチオン性ポリマー及び／又はカチオン性脂質と核酸とは複合体（核酸複合体）を形成する。２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールが予め存在するか、又は後から添加されて共存することにより、この核酸複合体の核酸が解離し易い形態となるか、又は細胞内に取り込まれた後、転写因子に認識され易い形態になるものと推察される。

【0023】

なお、細胞はヒトなどの哺乳類細胞である。

【0024】

本発明では、カチオン性ポリマー及び／又はカチオン性脂質と核酸とのカチオン／アニオン比（Ｃ／Ａ比）は、１／０．７〜１／１．２、特に１／０．８〜１／１．１程度が好ましい。カチオン性ポリマー及び／又はカチオン性脂質と核酸とのＣ／Ａ比を上記範囲内とすることにより、ＤＭＡＥＭ単位の加水分解を抑制した上で、十分な遺伝子導入活性を得ることが可能である。

【0025】

なお、本発明において、Ｃ／Ａ比とは、ポリマー材料のカチオン（ＤＭＡＭＥ単位）のモル数と、核酸のアニオン（リン酸残基）のモル数との比を意味する。

【0026】

［核酸］
核酸としては、各種ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、デコイや単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子）、ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−４遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子、ＩＬ−７遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００、ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が利用できる。また、ＶＥＧＦ遺伝子、ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス、ｃ−ｍｙｂアンチセンス、ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス、ＰＣＮＡアンチセンス、Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が利用できる。

【0027】

核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。

【実施例】

【0028】

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。

【0029】

［実施例１］
ｉ）感温性カチオン性ホモポリマーの光重合による合成
２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート７．０ｇを５０ｍＬ容の透明軟質ガラス製のバイアル瓶へ加えてマグネットスタラーで混合し、高純度窒素ガスで１０分間パージした後に、丸型ブラック蛍光灯で紫外線を２１時間照射した。約５時間で増粘し、１５時間で固化した。光照射物をクロロホルムへ溶解して回収し、ｎ−ヘキサンで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ｎ−ヘキサン系で６回再沈殿を繰り返して精製し、ｎ−ヘキサンを蒸散させた後に少量のベンゼンへ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて感温性カチオン性ホモポリマーを得た。

【0030】

ポリエチレングリコールを標準物質とした数平均分子量は、ＧＰＣにより１２０，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝２．４）と測定された。続いて、^１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤ₃ＯＤ）の測定結果は、δ０．８−１．２ｐｐｍ（ｂｒ，３Ｈ，−ＣＨ_２−ＣＨ_３−），δ１．６−２．０ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ_２−ＣＨ_３−），δ２．２−２．４ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ_３)，δ２．５−２．７ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ_２−Ｎ），δ４．０−４．２ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，Ｏ−ＣＨ_２）となった。

【0031】

ii）核酸複合体の形成とＴｒｉｓによる解離
ホタルルシフェラーゼをコードするＤＮＡ（プロメガ社、ｐＧＬ３コントロール）を生理食塩水へ溶解し、終濃度を０．０３３μｇ／μＬに調整した。ｉ）で合成したカチオン性ポリマー５１．２μｇを６０μＬの生理食塩水へ溶解した。２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（Ｔｒｉｓ９９９（和光純薬）。以下、Ｔｒｉｓということがある。）を０μｇ、１６μｇ、３２μｇ、６４μｇ、９６μｇ、１２８μｇ又は１６０μｇを６０μＬの生理食塩水へ溶解して６種類の濃度溶液を調製した。調製したカチオン性ポリマー溶液３０μＬ及びＴｒｉｓ溶液３０μＬを混合し攪拌し、ポリマー・Ｔｒｉｓ溶液を調製した。

【0032】

ここへＤＮＡ溶液を９０μＬずつ加えて混合した（すべての溶液でＣ／Ａ比は１６でポリマー：Ｔｒｉｓの混合比が重量比で１：０、１：１、１：２、１：４、１：６、１：８、１：１０となる）。動的光散乱測定装置（シスメックス社、ゼーターサイザーＮＡＮＯ）を使用して核酸複合体の粒子径を測定すると、ポリマー：Ｔｒｉｓの混合比が１：０〜１：２の溶液では１８５ｎｍ〜２００ｎｍ程度で形成されるのに対して、混合比１：４では、核酸複合体、核酸単体、ポリマー単体のピークが混在して確認され（不安定で正確な測定は不能）、１：６では完全に核酸複合体のピークが消失した。

【0033】

アガロースゲルを使用したゲル・レターデーション実験でも、ポリマー：Ｔｒｉｓの混合比が１：０〜１：２の溶液では核酸複合体が構造維持されていることを示す結果が得られ（核酸複合体のバンドがスポット位置から泳動せず、かつ、ＤＮＡ単体のバンドも検出されていない）、混合比１：４ではＤＮＡが核酸複合体から解離して泳動している様子が示された（図１）。

【0034】

以上の検討から、ポリマー（上記カチオン性ホモポリマー）：Ｔｒｉｓの混合比が１：４を超えてＴｒｉｓ過剰となった際に核酸複合体は解離してＤＮＡをデコンデンス（リリース）することが分かった。一方で、ポリマー：Ｔｒｉｓの混合比が１：２以下の場合は通常の核酸複合体の構造を維持していることが示された。

【0035】

また、核酸複合体中のＤＮＡやＲＮＡを分析する際に、従来は複合体のデコンデンス処理（核酸複合体を解離させてＤＮＡやＲＮＡを単体で遊離させること）にヘパリンやデキストラン硫酸などアニオン性ポリマーと複合体をインキュベートする方法が公知であり当業者に広く利用されているが、本発明においては低分子量のカチオン性化合物である２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールを加えるだけで複合体のデコンデンスが可能となることが分かった。

【0036】

iii）核酸導入実験１
Ｔｒｉｓを核酸複合体へ加えることによる核酸導入効果を確認するために次の実験を行った。

【0037】

ホタルルシフェラーゼをコードするＤＮＡ（プロメガ社、ｐＧＬ３コントロール）を生理食塩水へ溶解し、終濃度を０．０３３μｇ／μＬに調整した。ｉ）で合成したカチオン性ポリマー５１．２μｇ又は２５．６μｇを６０μＬの生理食塩水へ溶解した。Ｔｒｉｓ９９９（和光純薬）を０μｇ、５１．２μｇ又は２５．６μｇを６０μＬの生理食塩水へ溶解した。調製したカチオン性ポリマー溶液３０μＬ及びＴｒｉｓ９９９溶液３０μＬを混合し攪拌し、ポリマー・Ｔｒｉｓ溶液を調製した。ここへＤＮＡ溶液を９０μＬずつ加えて混合した（Ｃ／Ａ比は１６又は８でポリマー：Ｔｒｉｓの混合比は１：０又は１：１となる）。なお、後述の通り、このＴｒｉｓ溶液を添加しない比較例も、これらと並行して行った。

【0038】

２４Ｗｅｌｌ培養皿へ細胞密度５×１０^４個／ｍＬへ調整したＣＯＳ−１細胞の完全培地浮遊液（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ溶液）を１ｍＬずつ播種し、２４時間培養した。

【0039】

２４時間後、培地交換を行い、各Ｗｅｌｌへ調製した核酸複合体溶液を２５μＬずつ添加して緩やかに混和し、さらに４８時間培養を続けた。

【0040】

培養４８時間後に培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄後に各Ｗｅｌｌに細胞溶解剤２００μＬを加え、４℃で３０分間放置し、超遠心処理で不溶物を沈殿させて上澄を遺伝子導入活性評価用の試料とした。遺伝子導入活性の評価はルシフェラーゼアッセイで行った。ホタルルシフェラーゼ活性はプロメガ社のルシフェラーゼアッセイキットを使用し、規格化はタンパク濃度で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。

【0041】

その結果は、図２に示す通り、Ｔｒｉｓを混合することにより、遺伝子導入活性（発現効率）が５倍〜１０倍と飛躍的に向上することが確認された。

【0042】

なお、図２中の■Ｔｒｉｓ＋はこの実験結果を示すものであり、□Ｔｒｉｓ−は、Ｔｉｒｓ溶液を添加しないこと以外は同一条件にて行った対照実験（比較例）である。後述の図３も同様である。

【0043】

iv）核酸導入実験２
Ｔｒｉｓを混合するタイミングを次のように上記核酸導入実験１と変えた他は同様の実験を行った。

【0044】

ホタルルシフェラーゼをコードするＤＮＡ（プロメガ社、ｐＧＬ３コントロール）を生理食塩水へ溶解し、終濃度を０．０３３μｇ／μＬに調整した。ｉ）で合成したカチオン性ポリマー２５．６μｇ又は１２．８μｇを６０μＬの生理食塩水へ溶解した。
カチオン性ポリマー溶液６０μＬへＤＮＡ溶液９０μＬを混合して核酸複合体を形成させた（Ｃ／Ａ比は１６又は８となる）。

【0045】

上記核酸導入実験１と同じＴｒｉｓ溶液を２５．６μｇ又は１２．８μｇを６０μＬの生理食塩水へ溶解した。なお、Ｔｒｉｓ溶液を添加しない比較例もこれらと並行して行った。

【0046】

２４Ｗｅｌｌ培養皿へ細胞密度１．５×１０^５個／ｍＬへ調整したＨｅｌａ細胞の完全培地浮遊液（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ溶液）を１ｍＬずつ播種し、２４時間培養した。

【0047】

２４時間後、培地交換を行い、各Ｗｅｌｌへ調製した核酸複合体溶液を２５μＬずつ添加して緩やかに混和し、３時間培養し、３時間後にＴｒｉｓ溶液を各Ｗｅｌｌへ６０μＬずつ混合（Ｔｒｉｓとカチオン性ポリマーの重量比は１：０又は１：１となる）してさらに４５時間培養を続けた。

【0048】

４５時間後は上記核酸導入実験１と同じ手法で細胞破砕液を調製し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図３に示す。

【0049】

図３の通り、この核酸導入実験２によっても、Ｈｅｌａ細胞に取り込まれた核酸複合体へＴｉｒｓを加えることで細胞内でもＴｒｉｓの作用が発現されて導入活性と同様に飛躍的に向上することが確認された。

【0050】

［実施例２］
ｉ）６分岐型イニファターの合成
１，２，３，４，５，６−ヘキサキスブロモメチルベンゼン５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル酸ナトリウム３０．０ｇをエタノール３００ｍＬ中へ加え、遮光下で室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過回収し、３リットルのメタノールへ投入して１０分間攪拌して濾過した。この操作を計４回繰り返した。沈殿物をクロロホルム２００ｍＬへ溶解し、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫中で１２時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，３，４，５，６，−テトラキス（Ｎ,Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル)ベンゼンの針状結晶を得た(収率９０％)。
¹H-NMR(in chloroform-d₁):δ1.26-1.31ppm(m,36H,-CH₂-CH₃),δ3.71-3.73ppm(q,12H,-N-CH₂-),・δ3.99-4.01ppm(q,12H,-N-CH₂-),δ4.57ppm(s,12H,Ar-CH₂).

【0051】

ii）６分岐型スター型Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミドの重合(２５ｋＤａ)
暗室で６ＤＣを２０ｍＬのクロロホルムへ溶解し、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミドを混合して全量をクロロホルムで５０ｍＬとした。終濃度はそれぞれ１．０Ｍと５ｍＭ（ａｓ ＤＣ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ）とした。反応容器へ移し、高純度窒素ガスを１０分間パージ(流量：２リットル／分)した。密栓して激しく攪拌しながら光照射した。光照射は市販の丸管形部ラックライト蛍光灯（東芝製）を使用して行なった。３００分照射後に溶液をエバポレーターで濃縮後、ｎ−ヘキサン／エーテル＝５０／５０（Ｖ／Ｖ）で再沈殿した。精製は再沈殿を６回繰り返し、室温で１時間真空乾燥後、水へ溶解して４８時間凍結乾燥した。ＧＰＣ：Ｍｎ＝２５，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．４０）

【0052】

iii）核酸導入実験３
上記ii）で合成した６分岐型スター型カチオン性ポリマー（Ｍｎ＝２５ｋＤａ）を核酸導入に使用した。核酸導入剤中の単位重量あたりの陽電荷数はカチオン性ポリマーのモノマー単位の分子量から計算して求めた。ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列ＭＡＰによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。

【0053】

６分岐型スター型カチオン性ポリマー（Ｍｎ＝２５ｋＤａ）は０．８μｇ〜１２．８μｇを６０μＬの生理食塩水へ溶解し、ＤＮＡ（上記と同じもの）は３μｇを９０μＬのＴｒｉｓ生理食塩水溶液として調製した。

【0054】

Ｔｒｉｓの量は６分岐型スター型カチオン性ポリマー（Ｍｎ＝２５ｋＤａ）との重量比で１：１又は６：１（Ｔｒｉｓ：ポリマー）となるように調整した。定法に従って核酸複合体を調製した。核酸複合体溶液の濃度は各Ｗｅｌｌに２５μＬを添加することで０．５μｇのＤＮＡが各Ｗｅｌｌへ投与されるように調整した。Ｃ／Ａ比はポリマーの濃度によって０．５、１、２、４、８となるように調整してある。

【0055】

２４Ｗｅｌｌ培養皿へ細胞密度１．５×１０^５個／ｍＬへ調整したラット皮下脂肪由来接着性細胞の完全培地浮遊液（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ溶液）を１ｍＬずつ播種し、２４時間培養した。２４時間後に上記の核酸複合体組成物を加え、４８時間の追加培養を行った。４８時間後、iii）と同様の手法でルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図４に示す。

【0056】

なお、Ｔｒｉｓを添加しないこと以外は同一条件で行ったブランク実験（比較例）の結果を図４にＢｌとして示した。

【0057】

図４の通り、初代細胞（ラット皮下脂肪由来の接着性細胞）でも核酸複合体へＴｒｉｓを混合することで導入活性の飛躍的な向上が確認された。Ｔｒｉｓ：ポリマーの混合比に関しては、１：１でも６：１でも効果が確認できた。Ｃ／Ａ比はＢｌの最適条件がＣＡ＝４であるものの、それよりも高めのＣＡ＝８で高い活性が確認された。核酸複合体の安定のために多くのポリマーが必要となった、つまり、Ｔｒｉｓが複合体の解離に機能している可能性が伺える。また、物理化学的な評価では、Ｔｒｉｓとポリマーの混合比が１：１では核酸複合体への影響は確認されなかったが、遺伝子導入活性の実験ではこの混合比でも十分な効果が確認されている。Ｔｒｉｓが核酸複合体へ何らかの作用をしていることが示唆された。

【0058】

iv）核酸導入実験４
核酸導入剤として６分岐型スター型カチオン性ポリマー（Ｍｎ＝２５ｋＤａ）の代わりに市販の遺伝子導入剤Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ、又はＧｅｎｅ Ｊｕｉｃｅを使用する以外はiii）の実験と同様の手法で遺伝子導入活性に対するＴｒｉｓの影響を評価した。

【0059】

その結果、すべての遺伝子導入剤でＴｒｉｓを混合することで遺伝子導入活性は数倍〜１０倍に向上することが確認された。

【0060】

この実験で使用した遺伝子導入剤はカチオン性高分子以外にカチオン性脂質もあり、核酸複合体の構造や表面電位、親水疎水性のバランスなどが相違するが、いずれのタイプの導入剤でも本発明のＴｒｉｓによる導入活性の向上が達成できることが分かった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】