特許 6029596 ビスホスホネートプロドラッグ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6029596

(24)【登録日】2016年10月28日

(45)【発行日】2016年11月24日

(54)【発明の名称】ビスホスホネートプロドラッグ

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/48 20060101AFI20161114BHJP

   A61K 31/704 20060101ALI20161114BHJP

   A61K 31/663 20060101ALI20161114BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20161114BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20161114BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20161114BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20161114BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20161114BHJP

【ＦＩ】

   A61K47/48

   A61K31/704

   A61K31/663

   A61K45/00

   A61P19/08

   A61P35/00

   A61P35/04

   A61P43/00 123

【請求項の数】10

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2013-554818(P2013-554818)

(86)(22)【出願日】2012年2月24日

(65)【公表番号】特表2014-512341(P2014-512341A)

(43)【公表日】2014年5月22日

(86)【国際出願番号】EP2012000813

(87)【国際公開番号】WO2012113571

(87)【国際公開日】20120830

【審査請求日】2015年2月23日

(31)【優先権主張番号】EP11001551

(32)【優先日】2011年2月24日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】501477462

【氏名又は名称】ケイテーベー ツモルフォルシュングスゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】クラッツ フェリクス

(72)【発明者】

【氏名】ホッホデルファー カトリン

【審査官】 深谷 良範

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５０５９７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平０８−５０１５４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／０８３６１４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，２００８年，Vol.18，p.816-820

【文献】 Biomacromolecules，２００５年，Vol.6，p.2800-2808

【文献】 Calcified Tissue International，１９９６年，Vol.59，p.168-173

【文献】 Pharmaceutical Research，２００１年，Vol.18, No.5，p.646-651

【文献】 Journal of Applied Polymer Science，２００６年，Vol.101，p.3192-3201

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ４７／４８

Ａ６１Ｋ ３１／６６３

Ａ６１Ｋ ３１／７０４

Ａ６１Ｋ ４５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）薬学的におよび／または診断上活性な化合物と、
（ｂ）薬学的におよび／または診断上活性な化合物に結合した開裂性リンカーと、
（ｃ）開裂性リンカーに結合したスペーサー基と、
（ｄ）スペーサー基に結合した１つまたは複数のビスホスホネート基と
を含むプロドラッグであって、１つまたは複数のビスホスホネート基の少なくとも１つが、以下の構造（ＩＩｃ）

【化1】

［式中、
ｏは、０〜１２から独立して選択される整数であり、
ｐは、０〜２から独立して選択される整数であり、
ｑは、０〜２から独立して選択される整数であり、
Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ_２、ＳＯ_３Ｈ、ＣＮ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ_３、−ＣＨＯ、−ＣＨＯＣＨ_３、Ｃ_１−８アルキル基およびＣ_１−６アリール基からなる群から選択され、
Ｒ^１は、同じまたは異なってもよく、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ_２、ＣＮ、ＣＯＯＣＨ_３、−ＣＨＯ、−ＣＨＯＣＨ_３、Ｃ_１−８アルキル基およびＣ_１−６アリール基からなる群から独立して選択され、
Ｅは、Ｏ、ＮＨ、炭素−炭素単結合、炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合を表し、
Ｍは、水素、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムおよび２−アンモニウム−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオールから独立して選択され、
Ｇは、Ｓ、Ｏ、ＮＨ、炭素−炭素単結合、炭素−炭素二重結合またはトリアゾールを表す］
を有する、プロドラッグ、
ここで、薬学的におよび／または診断上活性な化合物が、Ｎ−ニトロソウレア、アントラサイクリンドキソルビシン、２−ピロリノアントラサイクリン、モルホリノアントラサイクリン、ジアセタトキシアルキルアントラサイクリン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンおよびアメタントロン；アルキル化剤、クロラムブシル、ベンダムスチン、メルファラン、およびオキサザホスホリン；代謝拮抗物質、５−フルオロウラシル、２’−デオキシ−５−フルオロウリジン、シタラビン、クラドリビン、フルダラビン、ペントスタチン、ゲムシタビン、６−チオグアニンおよび６−メルカプトプリン；葉酸拮抗薬、メトトレキサート、ラルチトレキセド、ペメトレキセドおよびプレビトレキセド、タキサン、パクリタキセルおよびドセタキセル；カンプトセシン、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、１０−ヒドロキシカンプトセシン、ＧＧ２１１、ラルトテカン、９−アミノカンプトセシンおよびカンプトセシン；ビンカアルカロイド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビン；カリケアマイシン；メイタンシノイド；アウリスタチン；エポチロン；デュオカルマイシン；ブレオマイシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトマイシンＣおよびｃｉｓ−構造白金（ｌｌ）錯体からなる群から選択される細胞増殖抑制剤であり、
開裂性リンカー（ｂ）が、酵素的におよび／またはｐＨ依存的に開裂可能である基を含む。

【請求項2】

開裂性リンカー（ｂ）が、−Ａｒｇ−、−Ａｒｇ−Ａｒｇ−、−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−、−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−、−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−、−Ｌｙｓ−、−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−、−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−、−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−、−Ｖａｌ−Ａｒｇ−、−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ａｒｇ−、−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−、−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−、−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−、−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−、−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｎｐｈ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−、−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−、−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−、−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−および−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−からなる群から選択される酵素的に開裂可能なペプチド配列を含む、請求項１に記載のプロドラッグ。

【請求項3】

開裂性リンカー（ｂ）が、ｐＨ値の低下時に開裂可能である酸感受性基を含み、酸感受性基が、エステル、アセタール、ケタール、イミン、アコニチル、ヒドラゾン、アシルヒドラゾンおよびスルホニルヒドラゾン結合またはトリチル基を含有する結合から選択される、請求項１に記載のプロドラッグ。

【請求項4】

開裂性リンカー（ｂ）が、以下の基

【化2】

［式中、ＬおよびＺは、Ｏ、ＳおよびＮＨから独立して選択され、Ｒは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ_２、ＣＮ、ＯＨ、Ｃ_１−８アルキル基およびＣ_１−６アリール基からなる群から独立して選択される、フェニル環の１つまたは複数の置換基を表す］
の１つから選択される自壊性基をさらに含み、薬学的におよび／または診断上活性な化合物（ａ）が自壊性基のＺ末端に結合している、請求項１から３のいずれか一項に記載のプロドラッグ。

【請求項5】

スペーサー基（ｃ）が、マレインイミド基、ハロゲンアセトアミド基、ハロゲンアセテート基、ピリジルチオ基、ビニルカルボニル基、アジリジン基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、ジスルフィド基、および置換または非置換アセチレン基からなる群から得られる単位を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のプロドラッグ。

【請求項6】

スペーサー基（ｃ）が、脂肪族鎖−（ＣＨ_２）_ｎ−（ｎは、１から１２の整数である）、オリゴエチレングリコール−（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｎ−（ｎは、１から１２の整数である）、合成ポリ（エチレングリコール）、もしくはフェニル環（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ_２、ＳＯ_３Ｈ、ＣＮ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、Ｃ_１−８アルキル基およびＣ_１−６アリール基からなる群から選択される１つまたは複数の置換基で必要に応じて置換されている）、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のプロドラッグ。

【請求項7】

式（ＩＩｃ）中のＧが、Ｓである、請求項１から６のいずれか一項に記載のプロドラッグ。

【請求項8】

単位（ｃ）が、以下の構造（ＩＸ）から（ＸＩＩ）

【化3】

［式中、ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）を表し、ｌ、ｍおよびｎは、０から１２の整数から独立して選択される］
の１つから選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載のプロドラッグ。

【請求項9】

単位（ａ）および（ｂ）が、一緒になって、以下の構造（ＸＩＩＩ）から（ＸＶＩＩＩ）

【化4】

の１つから選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載のプロドラッグ。

【請求項10】

請求項１から９のいずれか一項に記載のプロドラッグと、必要に応じて薬学的に許容される担体、薬学的に許容されるアジュバントおよび／または希釈剤とを含む、医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、薬学的におよび／または診断上活性な化合物と、１つまたは複数のビスホスホネート基とを含むプロドラッグ、そのようなプロドラッグを製造するための方法、ならびに、転移を含む骨がん等の骨関連障害の治療に使用される、前記プロドラッグを含む医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

健康な骨は、その寿命の間、再構築され続け、全体の骨格の約８％が毎年更新されている。骨形成および吸収、いわゆる再形成は、均衡状態にあり、完全に発達した骨の特徴であり、造骨細胞（骨芽細胞）および骨吸収細胞（破骨細胞）が前記プロセスに関与する。骨再構築における吸収は、広範な細胞膜である破骨細胞の波状縁の、骨表面に対する結合から始まる。表面接触の後、リソソーム酵素（例えば酸性ホスファターゼまたはカテプシン）およびマトリックスメタロプロテアーゼが分泌され、ＡＴＰ−依存性イオンポンプが、いわゆる吸収窩を形成する骨の溝部におけるｐＨ値を低下させる。吸収段階の終わりに、破骨細胞は骨表面から解放され、骨芽細胞またはその前駆細胞が窩内に定着し、骨形成を開始する。

【0003】

骨障害は、骨形成と骨吸収との間の不均衡を特徴とする。例えば、悪性疾患が進行すると、微小転移が形成されることがよくあるが、これは一次診断においては発見されないことが多い。最も一般的には、転移は、肝臓、肺および骨に形成される。骨転移の症状は重篤である。特に、骨髄における転移の成長により、周囲の骨質が冒される。一方では、これは圧力損傷によるものである。また一方では、腫瘍細胞が、腫瘍領域において骨形成と骨吸収との間の自然の均衡を変化させ、そのようにして骨質を破壊する物質を分泌する。これらのプロセスは、多くの場合疼痛をもたらし、最終的に、非常に治癒しにくい骨折を引き起こす可能性がある。脊椎が冒されると、神経または骨髄自体が椎体の崩壊により破砕されるという追加的なリスクがある。これは、麻痺および感覚障害の症状をもたらし得る。さらに、多くの場合において、その結果として、血液中のカルシウムが急増し、いわゆる高カルシウム血症となる。

【0004】

骨転移は、血流量が高くかつ再形成が顕著な領域に定着し、成長因子およびプロテアーゼが腫瘍細胞の増殖および侵入を促進する。骨転移は、Ｘ線写真上で造骨性または溶骨性に分類されるが、これらは骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収との間の不均衡により生じる。骨芽細胞および破骨細胞に加えて、骨転移は、線維芽細胞、マクロファージ、内皮細胞およびそれぞれの転移した原発性腫瘍の腫瘍細胞からなり、これらが共にいくつかの成長因子およびプロテアーゼ、特にマトリックスメタロプロテアーゼ、カテプシンおよびウロキナーゼを分泌し、これらが骨転移を開始および促進する。

【0005】

骨転移の現在の治療は対症療法的であり、化学療法、疼痛治療およびビスホスホネートの使用の組合せに基づいている。ビスホスホネートによる治療は、骨折および骨痛の発生を低減し、したがってクオリティオブライフを改善するが、患者の生存期間を延ばすことはない。対症療法および治療法の選択肢を改善するために、新たな治療法的アプローチが至急必要とされている。

【0006】

１つの有望な治療法的アプローチは、骨標的化である。特に、骨組織の最も著しい特徴は、主にアパタイトＣａ_１０（ＰＯ_４）_６Ｘ_２（式中、Ｘは、フッ化物（フッ素アパタイト）、ヒドロキシ（ヒドロキシアパタイト）または塩化物（クロロアパタイト）である）からなる、約７０質量％のミネラル分を有する石化した細胞外基質である。さらに、有機基質が約２０質量％、水が約１０質量％を占める。

【0007】

過去において、ビスホスホネート、テトラサイクリン、ポリマロネートおよびポリアスパルテート、ならびにシアル酸が、骨標的化のための骨指向性リガンドとして提案され、ビスホスホネートの物質クラスが最も良く検証されてきた。

【0008】

ビスホスホネートは、ピロホスフェートの誘導体であり、加水分解に不安定な中心のＰ−Ｏ−Ｐ結合が、安定なＰ−Ｃ−Ｐ結合により置き換えられている。

【0009】

ビスホスホネートは、破骨細胞の不活性化をもたらすが、他の作用機序、例えばファルネシル−ピロホスフェートシンターゼまたはマトリックスメタロプロテアーゼの阻害等も仮定されている。ビスホスホネートと骨アパタイトとの間の親和性は非常に高い。

【0010】

また、抗腫瘍剤を含むビスホスホネート誘導体、例えばシスプラチンアナログのビスホスホネート錯体およびメトトレキサートのビスホスホネート誘導体等が開発されている。しかしながら、シスプラチンアナログのビスホスホネート錯体の場合、シスプラチンと比較して大幅に高い用量が必要である。さらに、メトトレキサートビスホスホネート誘導体は、著しい全身毒性を示す。

【0011】

ＷＯ−Ａ−２００７／０９２３３８は、ビスホスホネートおよび抗葉酸剤を含む組成物を開示している。さらに、ＷＯ−Ａ−２００８／０７７２４１は、ホスホネート化グリコペプチドおよびリポグリコペプチド抗生物質、ならびに骨および関節感染症の治療におけるそれらの使用を開示している。ＷＯ−Ａ−０２／０８３１５０および米国特許第６，２１４，８１２号には、ビスホスホネート複合体が記載されている。しかしながら、これらの文献はいずれも、所望の作用部位、すなわち骨の中／上において薬学的に活性な化合物を選択的に放出することができるプロドラッグ系は扱っていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】ＷＯ−Ａ−２００７／０９２３３８

【特許文献2】ＷＯ−Ａ−２００８／０７７２４１

【特許文献3】ＷＯ−Ａ−０２／０８３１５０

【特許文献4】米国特許第６，２１４，８１２号

【非特許文献1】Ｊ．Ｋ．Ｗｏｏｄｗａｒｄ、Ｉ．Ｈｏｌｅｎ、Ｒ．Ｅ．Ｃｏｌｅｍａｎ、Ｄ．Ｊ．Ｂｕｔｔｌｅ、Ｂｏｎｅ ２００７、４１、９１２

【非特許文献2】Ｄ．Ｅ．Ｃｈｕｎｇ、Ｆ．Ｋｒａｔｚ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００６、１６、５１５７〜５１６３頁

【非特許文献3】Ｆ．Ｋｒａｔｚ、Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ ２００７、１６、８５５〜８６６頁

【非特許文献4】Ｆ．Ｋｒａｔｚら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２、４５、５５２３〜５５３３頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

したがって、本発明の根本にある技術的課題は、骨転移を含む骨がん等の骨関連障害の治療のための標的指向性プロドラッグを提供することであり、このプロドラッグは、薬学的におよび／または診断上活性な化合物の骨内でのより効率的な放出を示すべきであり、遊離型の薬学的におよび／または診断上活性な化合物と比較して、全身毒性が低減されているべきであり、したがって副作用がより低くなければならない。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明によれば、上記の技術的問題は、（ａ）薬学的におよび／または診断上活性な化合物と、（ｂ）薬学的におよび／または診断上活性な化合物に結合した開裂性リンカーと、（ｃ）開裂性リンカーに結合したスペーサー基と、（ｄ）スペーサー基に結合した１つまたは複数のビスホスホネート基とを含むプロドラッグであって、１つまたは複数のビスホスホネート基の少なくとも１つが、以下の構造（ＩＩｃ）

【0015】

【化1】

【0016】

［式中、
ｏは、０〜１２から独立して選択される整数であり、
ｐは、０〜２から独立して選択される整数であり、
ｑは、０〜２から独立して選択される整数であり、
Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ_２、ＳＯ_３Ｈ、ＣＮ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ_３、−ＣＨＯ、−ＣＨＯＣＨ_３、Ｃ_１−８アルキル基およびＣ_１−６アリール基からなる群から選択され、
Ｒ^１は、同じまたは異なってもよく、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ_２、ＣＮ、ＣＯＯＣＨ_３、−ＣＨＯ、−ＣＨＯＣＨ_３、Ｃ_１−８アルキル基およびＣ_１−６アリール基からなる群から独立して選択され、
Ｅは、Ｏ、ＮＨ、炭素−炭素単結合、炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合を表し、
Ｍは、水素、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムおよび２−アンモニウム−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオールから独立して選択され、Ｇは、Ｓ、Ｏ、ＮＨ、炭素−炭素単結合、炭素−炭素二重結合またはトリアゾール部分、好ましくはＳを表す］
を有するプロドラッグを提供することにより解決される。

【0017】

特に、本発明によるプロドラッグの構造はまた、以下の構造により表すことができ、上に定義されたように、薬学的におよび／または診断上活性な化合物（ａ）は、開裂性リンカー（ｂ）に結合し、開裂性リンカー（ｂ）は、スペーサー基（ｃ）に結合し、スペーサー基（ｃ）は、１つまたは複数のビスホスホネート基（ｄ）に結合している。

【0018】

【化2】

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】化合物１４を用いた開裂試験（実施例４（ａ））のクロマトグラムである。

【図2】化合物１６を用いた開裂試験（実施例４（ｂ））のクロマトグラムである。

【図3】化合物２３を用いた開裂試験（実施例４（ｃ））のクロマトグラムである。特に、カテプシンＢを用いたｐＨ５．０および３７℃での化合物２３のインキュベーション試験のクロマトグラムが示されている。開裂生成物ドキソルビシンが参照として含まれている。

【図4】ｐＨ７．４および３７℃における、プロドラッグ１４および２３のヒドロキシアパタイト（ＨＡ）に対する結合を示す図である。

【図5】３７℃およびｐＨ７．４で４時間後の、ビスホスホネートプロドラッグ１４および２３ならびにドキソルビシンの自然骨に対する結合試験を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本発明によるプロドラッグは、転移を含む骨がん等の骨関連障害の治療に特に好適である。本発明によるプロドラッグは、酸性環境または骨転移における特定酵素の発現を利用して、骨転移内で薬学的におよび／または診断上活性な化合物を放出するように設計されている。特に、骨転移は、ｐＨ値の低下および特定プロテアーゼの過剰発現を特徴とする。骨転移において過剰発現する最も重要なプロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼ、ＡＤＭＡＰ（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）、カテプシンＢおよびＫならびにｕＰＡ（ウロキナーゼ−プラスミノーゲン活性化因子）ならびにｔＰＡ（組織−プラスミノーゲン活性化因子）である（Ｊ．Ｋ．Ｗｏｏｄｗａｒｄ、Ｉ．Ｈｏｌｅｎ、Ｒ．Ｅ．Ｃｏｌｅｍａｎ、Ｄ．Ｊ．Ｂｕｔｔｌｅ、Ｂｏｎｅ ２００７、４１、９１２）。

【0021】

さらに、骨再形成および骨転移中にアパタイトマトリックスを分解するために、ｐＨ値は、生理的ｐＨ値に対して低下していなければならない。吸収窩におけるｐＨ値は、酸性範囲内にある。ｐＨの勾配は、炭酸脱水酵素ＩＩ型によるＨ^＋イオンの提供により確実となり、このイオンは、ＡＴＰイオンポンプを用いて破骨細胞から波状縁を介して外に運搬される。細胞外環境の酸性化により、リソソーム分泌されたプロテアーゼ、例えばカテプシンＢおよびＫは、そのタンパク質分解活性のための理想的な環境を有する。マトリックスメタロプロテアーゼおよびＡＤＭＡＰ（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）の骨転移における過剰発現に加え、ウロキナーゼ−プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の発現が、骨転移の形成に関連する。

【0022】

薬学的におよび／または診断上活性な化合物（ａ）は、好ましくは、細胞増殖抑制剤、細胞毒性薬、サイトカイン、免疫抑制剤、抗リウマチ剤、消炎剤、抗生物質、鎮痛剤、ウイルス静止剤、および抗真菌剤、転写因子阻害剤、細胞周期調節剤、ＭＤＲ調節剤、血管破壊剤、プロテアソームまたはプロテアーゼ阻害剤、タンパク質キナーゼ阻害剤、アポトーシス調節剤、酵素阻害剤、血管形成阻害剤、ホルモンまたはホルモン誘導体、放射性物質、発光性物質、ならびに光吸収物質からなる群から選択される。

【0023】

抗腫瘍剤としてのプロドラッグの適用を考慮すると、薬学的におよび／または診断上活性な化合物は、Ｎ−ニトロソウレア、アントラサイクリンドキソルビシン、２−ピロリノアントラサイクリン、モルホリノアントラサイクリン、ジアセタトキシアルキルアントラサイクリン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンおよびアメタントロン、ならびにそれらの任意の誘導体；アルキル化剤クロラムブシル、ベンダムスチン、メルファラン、およびオキサザホスホリン、ならびにそれらの任意の誘導体；代謝拮抗物質５−フルオロウラシル、２’−デオキシ−５−フルオロウリジン、シタラビン、クラドリビン、フルダラビン、ペントスタチン、ゲムシタビン、６−チオグアニンおよび６−メルカプトプリン、ならびにそれらの任意の誘導体；葉酸拮抗薬メトトレキサート、ラルチトレキセド、ペメトレキセドおよびプレビトレキセド、タキサンパクリタキセルおよびドセタキセル、ならびにそれらの任意の誘導体；カンプトセシントポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、１０−ヒドロキシカンプトセシン、ＧＧ２１１、ラルトテカン、９−アミノカンプトセシンおよびカンプトセシン、ならびにそれらの任意の誘導体；ビンカアルカロイドビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビン、ならびにそれらの任意の誘導体；カリケアマイシンおよびその任意の誘導体；メイタンシノイドおよびその任意の誘導体；アウリスタチンおよびその任意の誘導体；エポチロンおよびその任意の誘導体；デュオカルマイシンおよびその任意の誘導体；ブレオマイシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトマイシンＣおよびｃｉｓ−構造白金（ＩＩ）錯体からなる群から選択される細胞増殖抑制剤であることが好ましい。

【0024】

開裂性リンカー（ｂ）に結合するために、薬学的におよび／または診断上活性な化合物（ａ）は、誘導体化されてもよい。したがって、化学誘導体化に好適な部分を含有するために、本発明のプロドラッグの調製に使用される薬学的におよび／または診断上活性な化合物は、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＮＨ−ＮＨ_２、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ_２、−ＳＯ_３Ｈ、−ＳＨまたはカルボニル基から選択される少なくとも１つの官能基を含有してもよい。

【0025】

本発明によれば、開裂性リンカー（ｂ）は、開裂可能な基を含む。前記開裂は、好ましくは、所望の作用部位、例えば骨、特に骨転移において起きる。骨転移は、ｐＨ値の低下および特定酵素の過剰発現を特徴とするため、開裂性リンカーは、酵素的におよび／またはｐＨ依存的に開裂可能である基を含むことが好ましい。例えば、本発明のプロドラッグの開裂性リンカーは、好ましくはプロテアーゼの開裂性ペプチド配列内に位置する少なくとも１つのペプチド結合を含有してもよい。したがって、ペプチド結合は、それぞれのペプチド配列を開裂性リンカー内に挿入することにより実現され得る。好適な酵素は、例えば、プロテアーゼおよびペプチダーゼ、例えばマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼおよびプラスミン活性化因子であり、これらは、関節リウマチまたはがん等の疾患において増強された様式で形成または活性化され、過剰組織分解、炎症および転移をもたらす。酵素の好ましい例は、メタロプロテアーゼ、ＡＤＭＡＰ（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）、カテプシンＢおよびＫならびにｕＰＡ（ウロキナーゼ−プラスミノーゲン活性化因子）ならびにｔＰＡ（組織−プラスミノーゲン活性化因子）であるが、これらの酵素が一般に骨転移において過剰発現されるためである。

【0026】

本発明の好ましい実施形態において、開裂性リンカーは、
−Ａｒｇ−、−Ａｒｇ−Ａｒｇ−、−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−、−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−、−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−、−Ｌｙｓ−、−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−、−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−、−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−、−Ｖａｌ−Ａｒｇ−、−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ａｒｇ−、−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｄ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−、−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−、−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−、−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−、−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｎｐｈ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−、−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−、−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−、−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−および−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
からなる群から選択される酵素的に開裂可能なペプチド配列を含む。

【0027】

本発明の別の好ましい実施形態において、開裂性リンカーは、ｐＨ値の低下時に開裂可能である酸感受性基を含む。好ましくは、この酸感受性基は、少なくとも１つの酸感受性結合を含有する。酸感受性基は、エステル、アセタール、ケタール、イミン、アコニチル、ヒドラゾン、アシルヒドラゾンおよびスルホニルヒドラゾン結合またはトリチル基を含有する結合から選択されることが特に好ましい。骨転移は、一般にｐＨ値の低下を特徴とするため、そのような酸感受性基は、所望の部位、すなわち転移において開裂可能である。

【0028】

薬学的におよび／または診断上活性な化合物を放出するために、開裂性基は、所望の作用部位で開裂し、そのようにして薬学的におよび／または診断上活性な化合物を解放する。開裂性リンカー（ｂ）は、ペプチド開裂または酸感受性結合の開裂後に、不安定な自壊性スペーサー薬物誘導体（自然反応では加水分解し、薬学的におよび／または診断上活性な化合物を放出する）を生成する１つまたは複数の自壊性基をさらに含有してもよい。好ましくは、開裂性リンカーは、以下の基

【0029】

【化3】

【0030】

［式中、ＺおよびＬは、Ｏ、ＳおよびＮＨから独立して選択され、Ｒは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ_２、ＣＮ、ＯＨ、Ｃ_１−８アルキル基およびＣ_１−６アリール基からなる群から独立して選択される、フェニル環の１つまたは複数の置換基を表す］
の１つから選択される自壊性基を含み、薬学的におよび／または診断上活性な化合物（ａ）は、自壊性基のＺ末端に結合している。

【0031】

さらに、本発明によるプロドラッグは、開裂性リンカー（ｂ）に結合したスペーサー基（ｃ）をさらに含む。この基は、単なるスペーサーとしての機能を有し得るが、さらにプロドラッグの水溶性、生体適合性および／または分子質量を高める機能も有し得る。さらに、スペーサー基（ｃ）はまた、合成上の理由のみから存在してもよく、すなわち、好都合な合成経路による１つまたは複数のビスホスホネート基（ｄ）への開裂性リンカー（ｂ）の接続を可能とするために存在してもよい。したがって、スペーサー基（ｃ）は、制限されず、１つまたは複数のビスホスホネート基（ｄ）への開裂性リンカー（ｂ）の好都合な接続を可能とする任意の基を含み得る。

【0032】

スペーサー基（ｃ）は、例えば、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、または炭素−炭素単結合、炭素−炭素二重結合もしくは炭素−炭素三重結合により、１つまたは複数のビスホスホネート基（ｄ）に結合してもよい。

【0033】

例えば、スペーサー基（ｃ）は、マレインイミド基、ハロゲンアセトアミド基、ハロゲンアセテート基、ピリジルチオ基、ビニルカルボニル基、アジリジン基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、ジスルフィド基、および置換または非置換アセチレン基からなる群から得られる単位を含み得る。特に、好適な試薬の添加後、上記の基は、以下の例示的に示される構造を有してもよく、式中、Ｚは、Ｏ、ＳまたはＮＨであってもよい。

【0034】

【化4】

【0035】

本発明のさらに好ましい実施形態において、スペーサー基（ｃ）はまた、脂肪族鎖−（ＣＨ_２）_ｎ−（ｎは、１から１２の整数である）、オリゴエチレングリコール−（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｎ−（ｎは、１から１２の整数である）、合成ポリ（エチレングリコール）、もしくはフェニル環（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ_２、ＳＯ_３Ｈ、ＣＮ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、Ｃ_１−８アルキル基およびＣ_１−６アリール基からなる群から選択される１つまたは複数の置換基で必要に応じて置換されている）、またはそれらの組合せを含み得る。スペーサー基は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）、ポリグリセロール（ＰＧ）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）およびＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）コポリマー、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される合成ポリマーを含有することが特に好ましい。スペーサー基は、例えば１，０００から５０，０００Ｄａの範囲の質量を有するＰＥＧを含むことが特に好ましい。ＰＥＧは、２，０００から２０，０００Ｄａの範囲の質量を有することがより好ましい。そのようなスペーサー基の例は、以下の構造ＳｕＯＯＣ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＰＥＧ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−ＴｒｔのＰＥＧの市販の保護メルカプト誘導体から得ることができる。この基は、構造−ＯＯＣ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＰＥＧ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−を有するスペーサー基の単位に変換され得る。

【0036】

上記リンカー基は、プロドラッグの効率的な合成の面で有利となり得る。さらに、合成ポリマーは、プロドラッグの水溶性、生体適合性、分子質量および生体内分布の面で有利となり得る。

【0037】

本発明によれば、プロドラッグは、スペーサー基に結合した１つまたは複数のビスホスホネート基（ｄ）を含み、１つまたは複数のビスホスホネート基の少なくとも１つ、好ましくは全てが、上記式（ＩＩｃ）の構造を有する。本発明の好ましい実施形態において、プロドラッグは、１つから１２個のビスホスホネート基を含有する。プロドラッグは、１つ、２つまたは３つのビスホスホネート基を含有することが特に好ましい。プロドラッグが２つより多いビスホスホネート基を含有する場合、ビスホスホネート基は、式（ＩＩｃ）に従うビスホスホネート基の他に、任意の好適なビスホスホネート基から選択され得る。本発明の好ましい実施形態において、ビスホスホネート基は、式（ＩＩｃ）に従うビスホスホネート基の他に、エチドロネート、クロドロネート、チルドロネート、パミドロネート、１−アミノ−１，１−ジホスホネートメタン（アミノＢＰ）、リセドロネート、イバンドロネート、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、アレンドロネートおよびゾレドロネートからなる群から独立して選択される。上記ビスホスホネートは、スペーサー基に結合し得るような様式で化学修飾されてもよい。本発明の特に好ましい実施形態において、ビスホスホネート基は、パミドロネートである。

【0038】

別の好ましい実施形態において、ビスホスホネート基（ｄ）は、式（ＩＩｃ）に従うビスホスホネート基以外に、独立して、以下の構造（ＩＩａ）から（Ｖａ）、（ＩＩｂ）から（Ｖｂ）

【0039】

【化5】

【0040】

【0041】

【0042】

［式中、
ｏは、０〜１２から独立して選択される整数であり、
ｐは、０〜２から独立して選択される整数であり、
ｑは、０〜２から独立して選択される整数であり、
ｒは、１または２から独立して選択される整数であり、
ｓは、０〜１２から独立して選択される整数であり、
ｔは、０〜２から独立して選択される整数であり、
ｕは、０または１から独立して選択される整数であり、
ｖは、０〜２から独立して選択される整数であり、
ＸおよびＹのそれぞれは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ_２、ＳＯ_３Ｈ、ＣＮ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ_３、−ＣＨＯ、−ＣＨＯＣＨ_３、Ｃ_１−８アルキル基およびＣ_１−６アリール基からなる群から独立して選択され、
Ｒ^１は、同じまたは異なってもよく、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ_２、ＣＮ、ＣＯＯＣＨ_３、−ＣＨＯ、−ＣＨＯＣＨ_３、Ｃ_１−８アルキル基およびＣ_１−６アリール基からなる群から独立して選択され、
Ｅは、Ｏ、ＮＨ、炭素−炭素単結合、炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合を表し、
Ｍは、水素、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムおよび２−アンモニウム−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオールから独立して選択される］
の１つを有する。

【0043】

本発明によれば、異なる成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）は、いかなる制限もなしに任意に組み合わされて、本発明のプロドラッグを生成し得る。

【0044】

本発明の好ましい実施形態において、プロドラッグは、以下の一般式（Ｉ）：

【0045】

【化6】

【0046】

［式中、単位（ｄ）は、上に定義された上記構造（ＩＩ）から（Ｖ）の１つを有する１つまたは複数のビスホスホネート基を表し、単位（ｃ）は、スペーサー基を表し、単位（ｂ）は、開裂性リンカーを表し、単位（ａ）は、薬学的におよび／または診断上活性な化合物を表す］
を有する。

【0047】

一般式（Ｉ）の上記プロドラッグにおいて、１つより多くのビスホスホネート基が存在する場合、単位（ｄ）は、式（ＩＩｃ）に従うビスホスホネート基以外に、以下の構造（ＶＩａ）から（ＶＩＩＩａ）または（ＶＩｂ）から（ＶＩＩＩｂ）

【0048】

【化7】

【0049】

【0050】

［式中、
Ｒ^１は、同じまたは異なってもよく、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ_２、ＣＮ、ＣＯＯＣＨ_３、−ＣＨＯ、−ＣＨＯＣＨ_３、Ｃ_１−８アルキル基およびＣ_１−６アリール基からなる群から独立して選択され、
Ｍは、水素、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムおよび２−アンモニウム−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオールから独立して選択される］
の１つを含有し得る。

【0051】

また、一般式（Ｉ）の上記プロドラッグにおいて、単位（ｃ）は、以下の構造（ＩＸ）から（ＸＩＩ）

【0052】

【化8】

【0053】

の１つから選択されることが好ましい。

【0054】

上記構造（ＩＸ）から（ＸＩＩ）において、ｌ、ｍおよびｎは、０から１２の整数から独立して選択される。上記構造（ＩＸ）および（Ｘ）において、ｎが１から１２の整数である場合、ｍは、好ましくは０であり、ｍが１から１２の整数である場合、ｎは、好ましくは０である。上記構造（ＩＸ）および（Ｘ）において、ｌは３であり、ｍは５であり、ｎは０であることが特に好ましい。上記構造（ＸＩ）において、ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）を表し、ｌおよびｍは、好ましくは２であり、ｎは、好ましくは５である。

【0055】

一般式（Ｉ）の上記プロドラッグにおいて、単位（ａ）および（ｂ）は、一緒になって、以下の構造（ＸＩＩＩ）から（ＸＶＩＩ）

【0056】

【化9】

【0057】

【0058】

の１つから選択されることがさらに好ましい。

【0059】

上記単位（ＸＩＩＩ）において、開裂性リンカーは、ウロキナーゼにより開裂され得るＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇペプチド配列を含む。上記単位（ＸＩＶ）および（ＸＶＩＩＩ）において、開裂性リンカーは、酸に不安定なヒドラゾン単位を含む。上記単位（ＸＶ）および（ＸＶＩ）において、開裂性リンカーは、それぞれ、カテプシンＢにより開裂され得るＰｈｅ−ＬｙｓおよびＶａｌ−Ａｌａペプチド配列を含む。

【0060】

本発明の別の態様は、上に定義されたプロドラッグ、ならびに必要に応じて薬学的に許容される担体、および／または薬学的に許容されるアジュバント、および／または希釈剤を含む医薬組成物に関する。

【0061】

医薬組成物は、例えば、溶媒および希釈剤、例えば塩化ナトリウム溶液または任意の薬学的に許容される緩衝剤を含有する溶液を含有してもよい。さらに、本発明の医薬組成物は、患者への投与に好適な任意の形態、例えば注射剤の形態、錠剤もしくはカプセル剤、または吸入用組成物であってもよい。

【0062】

特定の実施形態によれば、上に定義された医薬組成物は、骨関連障害の治療、特に骨転移を含む骨がんの治療に使用される。

【0063】

本発明の別の実施形態によれば、上に定義されたプロドラッグは、キットに含まれてもよく、キットは、１種または複数種のアジュバント、例えば緩衝剤または薬学的に許容される担体をさらに含有してもよい。

【0064】

本発明のプロドラッグの合成経路は制限されない。一例において、本発明のプロドラッグは、マレインイミド基、開裂性リンカーならびに薬学的におよび／または診断上活性な化合物を含む構成単位を使用して合成され得る。前記構成単位の合成は、先行技術から知られている（例えばＤ．Ｅ．Ｃｈｕｎｇ、Ｆ．Ｋｒａｔｚ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００６、１６、５１５７〜５１６３頁；Ｆ．Ｋｒａｔｚ、Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ ２００７、１６、８５５〜８６６頁を参照されたい）。

【0065】

ビスホスホネートは、実施例１および２に示されるように、まず二重結合を、次いで遊離スルフヒドリル基を含有する脂肪族側鎖を導入し、次いでマレイミドを保持するプロドラッグと反応させることにより、テトラエチルメチレン−ビスホスホネートから調製され得る。

【0066】

本発明によれば、好ましくは所望の作用部位においてプロドラッグが開裂した際に、プロドラッグに含有される薬学的におよび／または診断上活性な化合物の促進された特異的な放出を有利に示す、新規な標的指向性プロドラッグが提供される。したがって、最新技術と比較して、例えば、骨がん等の骨障害の細胞増殖抑制治療の高い有効性へと繋がる、極めて改善された薬物放出が有利に達成される。したがって、例えばがん患者の骨転移の治療の改善が可能であり、プロドラッグに含有される細胞増殖抑制剤は、より低い副作用を示す。

【0067】

本発明を以下の実施例において例示するが、決してこれらに限定するものではない。

【実施例1】

【0068】

ドキソルビシンプロドラッグ、ドキソルビシンの６−マレイミドカプロイルヒドラゾン（ｈｙｄａｚｏｎｅ）誘導体（ＤＯＸＯ−ＥＭＣＨ）および（３−メルカプトプロピルチオ）エチレン−ビスホスホン酸に基づくビスホスホネートプロドラッグの合成を、以下で説明する。ＤＯＸＯ−ＥＭＣＨは、酸感受性チオール結合薬であり、ｐＨ５．０で開裂可能でドキソルビシンを放出する（Ｆ．Ｋｒａｔｚら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２、４５、５５２３〜５５３３頁）。

【0069】

【化10】

【0070】

ジエチルアミン（２．２８ｍＬ、２１．９１ｍｍｏｌ、１当量）およびパラホルムアルデヒド（３．２９ｇ、１０９．５６ｍｍｏｌ、５当量）の６５ｍＬメタノール中の懸濁液を、無色溶液となるまで加温した。混合物を室温に冷却し、テトラエチルメチレン−ビスホスホネート７を添加した。次いで、反応混合物を２４時間還流し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をトルエン中に溶解し、溶液を濃縮して真空下で乾燥させると、６．０ｇ（８２％）の８が無色油として得られた。
化合物8の¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ[ppm] 1.34 (t, 12H, J = 7.1 Hz), 2.69 (tt, 1 H, J = 11.0 Hz, J = 23.8 Hz), 3.37 (s, 3H), 3.89 (td, 2H, J = 5.5 Hz, J = 16.2 Hz), 4.14-4.21 (m, 8H). ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃): δ[ppm] 16.3, 16.4, 38.8 (t, J = 132.6 Hz), 58.7, 62.6 (t, J = 6.6 Hz), 68.0.
次のステップにおいて、２．２ｇのテトラエチル２−メトキシエチレン−ビスホスホネート８（６．６２ｍｍｏｌ、１当量）を、１５０ｍＬの無水トルエン中に希釈し、０．１８ｇのｐ−トルエンスルホン酸（０．９７ｍｍｏｌ、０．１５当量）を添加した。分子篩４Åを含有するソックスレー装置を使用して反応混合物を一晩還流し、溶媒を減圧下で除去すると、やや黄色の油が得られた。５０ｍＬのＣＣｌ_４を粗生成物に添加した後、溶液を水（３×３０ｍＬ）で洗浄し、水層を真空下で凍結乾燥により乾燥させた。化合物９が無色の油（１．６８ｇ、８５％）として得られた。
化合物9の¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ[ppm] 1.33 (t, 12H, J= 7.1 Hz), 4.07-4.18 (m, 8H), 6.97 (dd, 2H, J = 33.8 Hz, J = 35.8 Hz). ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃): δ[ppm] 16.2, 62.6, 132.0 (t, J = 166.5 Hz), 149.2. ³¹P NMR: δ[ppm] 13.0.
ビスホスホネートエステルを加水分解するために、９（０．９７ｇ、３．０２ｍｍｏｌ、１当量）を無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（２０ｍＬ）中に希釈し、溶液を０℃に冷却した。次いで、トリメチルシリルブロミド（４．３９ｍＬ、３３．２３ｍｍｏｌ、１１当量）を滴加した。溶液を室温に加温し、４８時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した後、メタノール（１５ｍＬ）を添加し、混合物を室温で２０分間撹拌した。最後に、溶媒を蒸発させ、残渣を真空下で乾燥させると、化合物１０が黄色の油として得られた。粗生成物を、それ以上精製を行わずに次のステップに使用した。

【0071】

Ｎ_２雰囲気下で、０．８４ｇの粗生成物１０（４．４９ｍｍｏｌ、１当量）を５ｍＬの１−ブタノールで希釈し、１，３−プロパンジチオール１１を添加し、溶液を還流下で３．５時間加熱した。混合物を室温に冷却し、３０ｍＬのＨ_２Ｏを添加した。この溶液をヘキサン（４×２０ｍＬ）で抽出し、水層を凍結乾燥させると、１２が無色の固体（０．８４ｇ、９４％）として得られた。
化合物12の¹H NMR (400 MHz, D₂O): δ[ppm] 1.77 (p, 2H, J = 7.1 Hz), 2.43 (tt, 1 H, J = 6.5 Hz, J = 23.0 Hz), 2.50 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 2.59 (t, 2H, J = 7.1 Hz), 2.90 (td, 2H, J = 6.4 Hz, J = 16.0 Hz). ¹³C NMR (125 MHz, D₂O): δ[ppm] 22.5, 27.0 (t, J = 4.3 Hz), 30.2, 32.2, 39.1 (t, J = 124.1 Hz). ³¹P NMR: δ[ppm] 19.7.
ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ ２９５（Ｍ−Ｈ）^＋。

【0072】

最後のステップにおいて、８ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）およびｔｅｒｔ−ブタノール（１：１）中に溶解した２１．４４ｍｇ（３．５ｍｍｏｌ）のＤＯＸＯ−ＥＭＣＨ １３を、８ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中に溶解した９．５ｍｇの１２に、室温で滴加し、試料を５分間撹拌した。溶媒を高真空下で除去すると、７０ｍｇの１４が赤色粉末として得られた。Ｓｙｎｅｒｇｉ ＭＡＸ−ＲＰ ４μｍ（４．６×２５０ｍｍ）ＨＰＬＣで、１５％のアセトニトリルおよび８５％の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を移動相Ａとして、３０％のアセトニトリルおよび７０％の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を移動相Ｂとして使用して、純度を測定した。勾配は、１００％の相Ｂまで０から３５分、相Ａまで３５から４０分であった。流量１ｍＬ／分。

【0073】

質量スペクトルは、アグリコンを含まない生成物の主ピークを示した。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ ９１６．２（Ｍ−Ｈ）^＋。

【実施例2】

【0074】

ビスホスホネートドキソルビシンプロドラッグ、カテプシンＢにより開裂されるＥＭＣ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−Ｄｏｘｏ（１５）（ＥＭＣ＝６−マレイミドカプロン酸；ｄｏｘｏ＝ドキソルビシン；ＰＡＢＣ＝パラ−アミノベンジルオキシカルボニル）および（３−メルカプトプロピルチオ）エチレン−ビスホスホン酸１２（４つのステップ（上記参照）において合成）の合成を、以下に示す。

【0075】

【化11】

【0076】

最後のステップにおいて、１４ｍＬのエタノール中に溶解した６０ｍｇ（３．４ｍｍｏｌ）のＥＭＣ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−Ｄｏｘｏ １５を、１４ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中に溶解した１６．７ｍｇの１２（３．４ｍｍｏｌ）の溶液に、３７℃で滴下により添加し、試料を３０分間撹拌した。溶媒を遠心分離し、溶媒を高真空下で除去すると、１４０ｍｇの１６が赤色粉末として得られた。Ｓｙｎｅｒｇｉ ＭＡＸ−ＲＰ ４μｍ（４．６×２５０ｍｍ）ＨＰＬＣで、１５％のアセトニトリルおよび８５％の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を移動相Ａとして、３０％のアセトニトリルおよび７０％の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を移動相Ｂとして使用して、純度を測定した。勾配は、１００％の相Ｂまで０から３５分、相Ａまで３５から４０分であった。流量１ｍＬ／分。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ １４５７（Ｍ＋Ｈ）^＋。

【実施例3】

【0077】

ビスホスホネートドキソルビシンプロドラッグ、カテプシンＢにより開裂されるＥＭＣ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢＣ−Ｄｏｘｏ（１８）および（３−メルカプトプロピルチオ）エチレン−ビスホスホン酸１２（４つのステップ（上記参照）において合成）の合成を、以下に示す。

【0078】

【化12】

【0079】

ドキソルビシンプロドラッグ２２、ＥＭＣ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢＣ−Ｄｏｘｏを、以下で説明される６つのステップで合成した。

【0080】

１０ｍＬのＴＨＦ中に希釈した２．０ｇのＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＳｕ（４．５８ｍｍｏｌ、１当量）を、１５ｍＬのＨ_２Ｏ中に溶解した０．４３ｇのＨ−Ａｌａ−ＯＨ（４．８１ｍｍｏｌ、１．０５当量）の溶液および０．４０ｇのＮａＨＣＯ_３（４．８１ｍｍｏｌ、１．０５当量）の溶液に添加した。直ちに、無色溶液が濁った。Ｈ_２Ｏ、ＴＨＦおよびジエチルエーテルの混合物（６０ｍＬ、１：１：１）を、透明溶液が生じるまで添加した。溶液を室温で十分に撹拌した。１週間後、溶媒を減圧下で除去し、３０ｍＬのクエン酸（１５％水溶液）および５０ｍＬの酢酸エチルを添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。相を分離し、水層を酢酸エチルで３回（３×１００ｍＬ）抽出した。合わせた有機相を乾燥させ、溶媒を蒸発させた。その後、残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ ３０：１＋１％ＡｃＯＨ）により精製すると、無色固体（１．６０ｇ、８５％）が得られた。
¹H NMR (DMSO-d₆): δ[ppm] 0.87 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.90 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 1.27 (d, 3H, J = 7.3 Hz), 1.94-2.06 (m, 1 H), 3.90 (t, 1 H, J = 7.2 Hz), 4.17-4.31 (m, 4H), 7.30-7.35 (m, 2H), 7.39-7.44 (m, 3H), 7.76 (t, 2H, J= 6.6 Hz), 7.89 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 8.22 (d, 1 H, J = 6.9 Hz), 12.50 (bs, 1 H). ¹³C NMR (DMSO-d₆): δ[ppm] 17.5, 18.6, 19.6, 30.9, 47.1, 47.9, 60.2, 66.1, 120.5, 125.8, 127.5, 128.1, 141.1, 144.2, 144.3, 156.5, 171.4, 174.4.
不活性ガス雰囲気下で、０．３６ｇのＦｍｏｃ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＯＨ １７（０．８８ｍｍｏｌ、１当量）、０．１３ｇの４−アミノベンジルアルコール（１．０６ｍｍｏｌ、１．２当量）および０．３３ｇのＥＥＤＱ（１．３３ｍｍｏｌ、１．５当量）のジクロロメタン中の懸濁液を、透明な溶液が生じるまでメタノールで処理した。その次の２日間の間に、沈殿物が形成された。濾過後、沈殿物をジエチルエーテルで洗浄し、室温で１５分間超音波処理した。この手順を２回繰り返し、生成物１８を高真空下で乾燥させた（０．２９ｇ、６４％）。
¹H NMR (DMSO-d₆): δ[ppm] 0.86 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.90 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 1.31 (d, 3H, J = 7.1 Hz), 1.96-2.04 (m, 1 H), 3.92 (t, 1 H, J = 7.2 Hz), 4.21 -4.34 (m, 3H), 4.40-4.46 (m, 3H), 5.11 (t, 1 H, J = 5.7 Hz), 7.24 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.33 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 7.40-7.47 (m, 3H), 7.54 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.75 (t, 2H, J = 7.1 Hz), 7.89 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 8.17 (d, 1 H, J = 7.0 Hz), 9.93 (bs, 1 H). ¹³C NMR (DMSO-d₆): δ[ppm] 18.6, 18.7, 19.6, 30.8, 47.1, 49.4, 60.4, 63.0, 66.1, 119.3, 120.5, 125.8, 127.3, 127.5, 128.0, 128.1, 137.8, 138.0, 141.1, 144.2, 144.3, 156.6, 171.3, 171.4.
窒素雰囲気下で、４．２ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（２４．５５ｍｍｏｌ、３当量）を、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢＯＨ １８（４．２２ｇ、８．１８ｍｍｏｌ、１当量）およびビス−ＰＮＰカーボネート（３．７３ｇ、１２．２８ｍｍｏｌ、１．５当量）の無水ジクロロメタン（８４ｍＬ）中の懸濁液に添加した。この黄色混合物を、透明溶液が生じるまで４２ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で処理し、室温で一晩撹拌した。次いで、溶液を水（６０ｍＬ）で洗浄し、相を分離した。水層をジクロロメタン（３０ｍＬ）で４回抽出し、合わせた有機相を乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。油状の黄色残渣をジエチルエーテル（３０ｍＬ）で処理し、超音波処理し、沈殿物を真空下で乾燥させると、生成物１９が白色固体（４．１ｇ、７４％）として単離された。
¹H NMR (DMSO-d₆): δ[ppm] 0.87 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.90 (d, 3H, J = 6.7 Hz), 1.32 (d, 3H, J = 7.0 Hz), 1.96-2.05 (m, 1 H), 3.94 (t, 1 H, J = 7.3 Hz), 4.21 -4.34 (m, 3H), 4.45 (p, 1 H, J = 7.0 Hz and 13.8 Hz), 5.25 (s, 2H), 7.31-7.47 (m, 7H), 7.55-7.77 (m, 6H), 7.89 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 8.21 (d, 1 H, J = 6.9 Hz), 8.30-8.33 (m, 2H), 10.10 (s, 1 H). ¹³C NMR (DMSO-d₆): δ[ppm] 18.4, 18.7, 19.6, 30.8, 47.1, 49.5, 60.4, 66.1, 70.7, 119.5, 120.5, 123.6, 125.8, 126.6, 127.5, 128.1, 129.9, 139.9, 141.1, 144.2, 144.3, 145.6, 152.4, 155.7, 156.6, 171.5, 171.7.
窒素雰囲気下で、化合物１９（Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ、８９ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、１．１当量）、ドキソルビシン・ＨＣｌ（６９ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、１当量）およびＤＩＰＥＡ（２０μＬ、０．１２ｍｍｏｌ、１当量）を、２ｍＬのＤＭＦ（無水）中に溶解し、室温で一晩撹拌した。ジエチルエーテルおよびヘキサンの混合物（５：１、１００ｍＬ）を用いた５分間にわたる滴下により、粗生成物を沈殿させた。沈殿物を遠心分離し、ジエチルエーテルで２回洗浄し、真空下で乾燥させた。この粗生成物２０（１３０ｍｇ）を、それ以上精製を行わずに次のステップに使用した。

【0081】

２０（１３０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、１当量）を、３ｍＬのピペリジン（ＤＭＦ中２０％）に溶解し、室温で１０分間撹拌した。ジエチルエーテルおよびヘキサンの混合物（１００ｍＬ、４：１）により生成物を沈殿させ、次いでフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ ３０：１）により精製した。溶媒の除去後、２つのステップで４９％の収率で生成物２１が得られた（５１ｍｇ）。

【0082】

窒素下で、Ｈ_２Ｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢＣ−ＤＯＸＯ ２１（０．４４ｇ、０．５１ｍｍｏｌ、１当量）を、ジクロロメタン（無水）および無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの混合物（５：１、４２ｍＬ）中に溶解した。２３４ｍｇの６−マレイミドカプロン酸（ｍａｌｅｉｍｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣ−ＯＳｕ）（０．７６ｍｍｏｌ、１．５当量）の添加後、溶液を７１μＬのトリエチルアミン（０．５１ｍｍｏｌ、１当量）で処理し、室温で１８時間撹拌した。粗生成物を、６００ｍＬのヘキサンおよび１００ｍＬのジエチルエーテルの混合物で沈殿させた。赤色固体をエーテルで２回洗浄し、真空下で乾燥させ、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ ３１：１）により精製すると、生成物２２が赤色固体（２１３ｍｇ、４０％）として得られた。

【0083】

Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ ３００Å Ｃ１８ ５μｍ［４．６×２５０ｍｍ］およびプレカラム［３．９×２０ｍｍ］を用いてＨＰＬＣ分析を行った。クロマトグラフィー条件：流量：１．０ｍＬ／分、移動相Ａ：１５％のＣＨ_３ＣＮ、８５％の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；移動相Ｂ：３０％のＣＨ_３ＣＮ、７０％の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；注入体積：５０μＬ；勾配：０〜１．５分 １００％移動相Ａ；１．５〜２０分 ３０％のＣＨ_３ＣＮ、７０％の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に上昇；２０〜４５分 ７０％のＣＨ_３ＣＮ、３０％の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液；４５〜５５分 初期移動相に低下；５５〜５８分 １００％移動相Ａ。Ｃ_５３Ｈ_６１Ｎ_５Ｏ_１８、ＨＲＭＳ ＥＳＩ−ＴＯＦ：計算値［Ｍ＋Ｎａ］^＋ １０７８．３９、実測値１０７８．２。

【0084】

最後のステップにおいて、３５ｍｇの化合物１２を２９ｍＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．４）で溶解し、３．２ｍＭのチオール濃度を得た。４０ｍＬの１０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．４、３．２ｍＭ）中に溶解した９９ｍｇのＥＭＣ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢＣ−ＤＯＸＯ ２２の溶液を、５分間にわたりビスホスホネート溶液に滴加した。混合物を室温で１５分間十分に撹拌し、液体窒素で凍結させた。凍結乾燥後、赤色の粗生成物を、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ（ＨＰＬＣグレード）１：１で溶出するフラッシュクロマトグラフィー（ＲＰ １８）により精製すると、２３が赤色固体として得られた。Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ ３００Å Ｃ１８ ５μｍ［４．６×２５０ｍｍ］およびプレカラム［３．９×２０ｍｍ］を用いてＨＰＬＣ分析を行った。クロマトグラフィー条件：流量：１．２ｍＬ／分、移動相Ａ：２０％のＣＨ_３ＣＮ、８０％の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；移動相Ｂ：７０％のＣＨ_３ＣＮ、３０％の２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；注入体積：２０μＬ；勾配：０〜５分 １００％移動相Ａ；５〜４０分 ７０％のＣＨ_３ＣＮ、３０％の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に上昇；４０〜５０分 ７０％のＣＨ_３ＣＮ、３０％の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液；５０〜６０分 初期移動相に低下；６０〜６５分 １００％移動相Ａ。Ｃ_５８Ｈ_７５Ｎ_５Ｏ_２４Ｐ_２Ｓ_２、ＨＲＭＳ ＥＳＩ−ＴＯＦ：計算値［Ｍ−Ｈ］⁻ １３５０．３６４０、実測値１３５０．３７７２。

【実施例4】

【0085】

化合物１４、１６および２３を用いた開裂試験
（ａ）化合物１４を用いた開裂試験
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中の１４の３００μΜ溶液１ｍＬを調製し、５０μＬ試料を逆相ＨＰＬＣにより分析した（図１Ａを参照）。４００μＬのこの溶液に、４μＬの濃リン酸を添加すると、３．８のｐＨ値が得られた。室温で５分後、５０μＬの試料を逆相ＨＰＬＣにより分析すると（図１Ｂを参照）、参照としての純ドキソルビシン（図１Ｃを参照）との比較により示されるように、ドキソルビシンへの迅速な開裂が起きたことが示された。
（ｂ）化合物１６を用いた開裂試験
カテプシンＢを用いた１６の開裂のために、１００ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＥＤＴＡ Ｎａ_２および０．１５ｍｇのＬ−システインを含有する１５０μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）、６．７μＬのカテプシンＢ溶液（２３．８Ｕ／ｍｇ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製、ドイツ）を、１６の１００μＬ溶液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０中３００μΜ）に添加し、溶液を３７℃で１時間インキュベートした。

【0086】

図２Ａは、ｔ＝０時間でのクロマトグラムを示すが、１６は約４５．７分で溶出している（５０μＬ注入）。１時間のインキュベーション時間の後、５０μＬの試料を逆相ＨＰＬＣにより分析すると（図２Ｂを参照）、参照としての純ドキソルビシン（図２Ｃを参照）との比較により示されるように、ドキソルビシンへの完全な開裂が起きたことが示された。

【0087】

Ｓｙｍｍｅｔｒｙ３００、Ｃ１８、５μｍ（４．６×２５０ｍｍ）ＨＰＬＣを用い、１５％のアセトニトリルおよび８５％の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を移動相Ａとして、３０％のアセトニトリルおよび７０％の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を移動相Ｂとして使用して、ＨＰＬＣを行った。勾配は、０から１．５分 １００％相Ａ、１．５から２０分 １００％Ｂまで、２０分から４５分 １００％Ｂ、４５から５５分 １００％Ａまでであった。流量１ｍＬ／分；注入体積：５０μＬ。
（ｃ）化合物２３を用いた開裂試験
１７６μＬの化合物２３［１．５ｍＭ］のストック溶液を、９μＬのカテプシンＢ（０．４ｍｇ／ｍＬ、２３．８Ｕ／ｍｇ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製、ドイツ）およびＬ−システイン（８ｍＭ）を含有する２６４μＬの緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．０）で希釈した。混合物を３７℃でインキュベートし、０分後、２０分後、４０分後、６０分後および１２０分後に一定量（６５μＬ）を採取し、ＨＰＬＣにより分析した。

【0088】

Ｓｙｍｍｅｔｒｙ３００ Ｃ１８ ５μｍ［４．６×２５０ｍｍ］およびプレカラム［３．９×２０ｍｍ］を用いてＨＰＬＣを行った。クロマトグラフィー条件；流量：１．２ｍＬ／分、移動相Ａ：２０％のＣＨ_３ＣＮ、８０％の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；移動相Ｂ：７０％のＣＨ_３ＣＮ、３０％の２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；注入体積：２０μＬ；勾配：０〜５分 １００％移動相Ａ；５〜４０分 ７０％のＣＨ_３ＣＮ、３０％の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に上昇；４０〜５０分 ７０％のＣＨ_３ＣＮ、３０％の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液；５０〜６０分 初期移動相に低下；６０〜６５分 １００％移動相Ａ。

【0089】

図３は、ｔ＝０分、２０分、４０分、６０分および１２０分でのクロマトグラムを示すが、２３は約１９分（５０μＬ注入）で溶出している。２時間のインキュベーション時間の後、５０μＬの試料を逆相ＨＰＬＣにより分析すると（図３を参照）、参照としての純ドキソルビシン（図３を参照）との比較により示されるように、ドキソルビシンへの完全な開裂が起きたことが示された。

【実施例5】

【0090】

化合物１４および２３のヒドロキシアパタイトに対する結合試験
一般手順：ファルコンチューブ内で、試験化合物をリン酸緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する４ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．４）中に希釈し、３００μΜの濃度の溶液を得た。ヒドロキシアパタイト（３０当量）を添加し、懸濁液を十分撹拌して３７℃でインキュベートした。ヒドロキシアパタイトを含まない試料の別の溶液を、対照として使用した。それぞれの場合において、０時間後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後および２０時間後に、試料を遠心分離し（４０００ｒｐｍ、時間：６０秒、Ｈｅｒａｅｕｓ（登録商標）Ｍｅｇａｆｕｇｅ（登録商標）１．０）、上澄みの吸光度を分光光度計で４９５ｎｍの波長で測定した（ε_４９５（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）＝１０６５０Ｍ^−１ｃｍ^−１）。それぞれの結果は３回の測定の算術平均を表し、ＨＡ結合のパーセントを計算した。

【0091】

図４に示されるように、プロドラッグ１４および２３は、ヒドロキシアパタイトに速やかに結合し、ｐＨ７．４および３７℃において、１時間後ですでに両方のプロドラッグの約５０％がヒドロキシアパタイトに結合している。時間が経つにつれて上澄みの赤色の強度が低下し、元の白色のヒドロキシアパタイト粉末がそれに伴って赤く着色するのが観察された。カテプシン開裂性プロドラッグ２３については、５時間後の結合は９０％を超え、２４時間後では本質的に１００％であった。酸感受性プロドラッグ１４は、同様の曲線形状を示したが、５時間後にＨＡ結合の飽和が生じ、１４の約８０％がＨＡに結合した。

【実施例6】

【0092】

化合物１４および２３の自然骨基質に対する結合試験
この結合アッセイのために、ウシの骨断片を小片（６ｍｍ×４ｍｍ×１ｍｍ）に切断した。骨片は未処理のままとし、水（再蒸留）および無水エタノールで洗浄し、室温で一晩乾燥させた。次いで、ファルコンチューブ内で、プロドラッグをリン酸緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する４ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．４）中に溶解し、３００μΜの濃度を得た。約５０ｍｇの未処理骨片を透明赤色溶液に添加し、試料を３７℃で撹拌下インキュベートした。４時間後、試料を遠心分離し（４０００ｒｐｍ、時間：６０秒、Ｈｅｒａｅｕｓ（登録商標）Ｍｅｇａｆｕｇｅ（登録商標）１．０）、上澄みの吸光度を分光光度計で４９５ｎｍの波長で測定した（ε_４９５（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）＝１０６５０Ｍ^−１ｃｍ^−１）。骨結合のパーセントを計算した。

【0093】

対照として、骨断片と共にインキュベートしたドキソルビシンを使用した。予想通り、ドキソルビシンの自然骨への結合は観察されなかった（図５参照）。対照的に、両方のプロドラッグは５０〜７５％が、ｐＨ７．４で４時間後に骨基質に結合した（図５）。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]