特許 6031131 肺癌治療用、特に非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）治療用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6031131

(24)【登録日】2016年10月28日

(45)【発行日】2016年11月24日

(54)【発明の名称】肺癌治療用、特に非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）治療用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7105 20060101AFI20161114BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20161114BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20161114BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20161114BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20161114BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20161114BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20161114BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20161114BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20161114BHJP

   A61K 47/48 20060101ALI20161114BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20161114BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20161114BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/7105

   A61K39/00 HZNA

   A61P35/00

   A61P37/04

   A61P11/00

   A61P43/00 121

   A61K39/39

   A61K37/08

   A61K47/18

   A61K47/48

   A61K48/00

   !C12N15/00 A

【請求項の数】24

【全頁数】69

(21)【出願番号】特願2015-7164(P2015-7164)

(22)【出願日】2015年1月16日

(62)【分割の表示】特願2012-251602(P2012-251602)の分割

【原出願日】2008年10月8日

(65)【公開番号】特開2015-110613(P2015-110613A)

(43)【公開日】2015年6月18日

【審査請求日】2015年2月16日

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2007/008770

(32)【優先日】2007年10月9日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】509014386

【氏名又は名称】キュアバック アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】バーナー，マレイケ

(72)【発明者】

【氏名】プロブスト，ヨヘン

(72)【発明者】

【氏名】ランデー，トーマス

(72)【発明者】

【氏名】ヘール，イングマー

【審査官】 六笠 紀子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００６／００８１５４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第０２／０９８４４３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２００４／００４７４３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００６／０２４５１８（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／００

Ａ６１Ｋ ３１／７１０５

Ａ６１Ｋ ３８／１６

Ａ６１Ｋ ３９／３９

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ３７／０４

ＷＰＩ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

活性（免疫賦活）組成物を調製するための、５つの異なる抗原をコードする少なくとも５つのＲＮＡの使用であって、
上記活性（免疫賦活）組成物の上記少なくとも５つのＲＮＡは、全て同時に、または、少なくとも１つと別の少なくとも１つとが異なるタイミングとなるように、投与されるものであり、
上記５つの抗原は、
・ＮＹ−ＥＳＯ−１、
・ＭＡＧＥ−Ｃ１、
・ＭＡＧＥ−Ｃ２、
・５Ｔ４、および
・Ｓｕｒｖｉｖｉｎ
であり、且つ
さらなるＲＮＡはＭＵＣ１をコードしているものである、使用。

【請求項2】

上記５つのＲＮＡのうちの少なくとも１つがｍＲＮＡである、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

上記５つのＲＮＡのうちの少なくとも１つは、請求項１に規定されている抗原のフラグメント、変異体またはエピトープをコードするＲＮＡから選択されるＲＮＡを含む、請求項１または２に記載の使用。

【請求項4】

上記５つのＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号３、１８、２０、２２および２５のＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一のＲＮＡから選択されるＲＮＡを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。

【請求項5】

上記さらなるＲＮＡは配列番号１のＲＮＡ配列である、または配列番号１のＲＮＡ配列と少なくとも８０％同一である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。

【請求項6】

上記５つのＲＮＡのうちの少なくとも１つは改変ＲＮＡである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。

【請求項7】

上記改変ＲＮＡが安定化ｍＲＮＡである、請求項６に記載の使用。

【請求項8】

上記５つのＲＮＡのうちの少なくとも１つのコード領域のＧ／Ｃ含量は、野生型ＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含量と比べて増加している、請求項６または７に記載の使用。

【請求項9】

上記５つのＲＮＡのうちの少なくとも１つにコードされたアミノ酸配列は、野生型ＲＮＡがコードするアミノ酸配列と比べて改変されていない、請求項８に記載の使用。

【請求項10】

上記５つのＲＮＡのうちの少なくとも１つのリボソーム結合部位の環境におけるＡ／Ｕ含量が、野生型ＲＮＡのリボソーム結合部位の環境におけるＡ／Ｕ含量と比べて増加している、請求項６〜９のいずれか１項に記載の使用。

【請求項11】

改変ｍＲＮＡの上記コード領域ならびに／または５’および／もしくは３’非翻訳領域は、野生型ＲＮＡと比べて不安定配列要素を含まないように改変されている、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の使用。

【請求項12】

上記改変ｍＲＮＡによって上記コードされたアミノ酸配列は、野生型ＲＮＡがコードするアミノ酸配列と比べて改変されていない、請求項１１に記載の使用。

【請求項13】

上記改変ｍＲＮＡは、５’キャップ構造、ならびに／またはポリ（Ａ）尾部、ならびに／またはポリ（Ｃ）尾部、ならびに／または少なくとも１つのＩＲＥＳ、ならびに／または少なくとも１つの５’および／もしくは３’安定化配列を有する、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の使用。

【請求項14】

上記改変ｍＲＮＡは、１０〜２００アデノシンヌクレオチドのポリ（Ａ）尾部、および／または１０〜２００シトシンヌクレオチドのポリ（Ｃ）尾部を有する、請求項１３に記載の使用。

【請求項15】

上記５つのＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号４、１９、２１、２３および２６のＲＮＡ配列、もしくは配列番号４、１９、２１、２４および２６のＲＮＡ配列と同一または少なくとも８０％同一のＲＮＡから選択されるＲＮＡを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用。

【請求項16】

上記少なくとも５つのＲＮＡは、配列番号４、１９、２１、２４および２６のＲＮＡ配列と同一またはこれらの配列のいずれかと少なくとも９０％同一である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用。

【請求項17】

上記さらなるＲＮＡは、配列番号２のＲＮＡ配列である、または配列番号２のＲＮＡ配列と少なくとも８０％同一である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用。

【請求項18】

上記さらなるＲＮＡ配列は、配列番号２のＲＮＡ配列である、または配列番号２のＲＮＡ配列と少なくとも９０％同一である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用。

【請求項19】

上記５つの異なる抗原をコードする上記少なくとも５つのＲＮＡは、配列番号４、１９、２１、２４および２６のＲＮＡ配列である、またはこれらの配列のいずれかと少なくとも９５％同一であって、
上記さらなるＲＮＡは、配列番号２のＲＮＡ配列と同一または配列番号２のＲＮＡ配列と少なくとも９５％同一である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用。

【請求項20】

上記５つのＲＮＡのうちの少なくとも１つは、１つ以上のポリカチオンと複合化されている、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の使用。

【請求項21】

上記５つのＲＮＡのうちの少なくとも１つは、プロタミンまたはオリゴフェクタミンと複合化されている、請求項２０に記載の使用。

【請求項22】

上記活性（免疫賦活）組成物は少なくとも１つのアジュバントをさらに含んでいる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の使用。

【請求項23】

上記５つの異なる抗原をコードする少なくとも５つのＲＮＡはキットの構成要素である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の使用。

【請求項24】

上記５つの異なる抗原をコードする少なくとも５つのＲＮＡはワクチンの構成要素である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

本発明は、哺乳類において（獲得）免疫反応を引き起こし得る少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを含む活性（免疫賦活）組成物に関する。本発明は、さらに上記活性（免疫賦活）組成物を含有するワクチンに関し、さらに、肺癌、特に非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、好ましくは、主要な３つのサブタイプである肺扁平上皮癌、腺癌および肺大細胞癌から選択される肺癌もしくはそれに関連する疾患の治療用の、（ワクチン調製用）活性（免疫賦活）組成物および／または（獲得）免疫反応を引き起こすワクチンの使用に関する。最後に、本発明は活性（免疫賦活）組成物および／またはワクチンを備えるキット、特に部品キットに関する。

【0002】

全ての悪性腫瘍のうち、２５％は気管支癌（肺の癌）である。気管支癌は、世界中において、男性における最も多い癌関連の死亡原因であり、女性の場合も２番目に多い癌関連の死亡原因である。ドイツでは、前立腺癌および結腸直腸癌に続いて、３番目に多い癌の種類である。世界中で年間１３０万人が、肺癌によって死亡している。中央ヨーロッパでは、人口１００．０００人中およそ６０人が肺癌に罹患しており、肺癌と新たに診断される人数は徐々に上昇している（現在ドイツでは、年間およそ５０．０００人）。肺癌と診断されると、全体的に見て平均的な５年後の生存率はほんの５％である。とはいえ、各患者の推定余命は完全にその患者の病期（ＴＭＮ分類）および冒された癌（肺癌）のサブタイプ（下記参照）に左右される。

【0003】

顕微鏡下で悪性細胞の大きさおよび外観を識別することによって分類される主要な肺癌のサブタイプは、小細胞肺癌（２０％）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（８０％）である。この分類は、単に組織学的な基準による分類ではあるが、疾患の臨床管理および予後の際に非常に重要な意味を持つ。小細胞肺癌であれば通常は化学療法で治療を行う。一方、非小細胞肺癌であれば一次療法として手術を行う場合がほとんどである。

【0004】

非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、予後および管理がおおよそ同じであるということから、同一のグループにされている。３種類のサブタイプ：肺扁平上皮癌、腺癌および肺大細胞癌がこれに当てはまる。主な治療方法は手術を行うことであるが、患者の４分の１しか切除に成功せず、再発率も５０％である。進行期の疾患に対する治療方法として、手術を行った後に補助化学療法および／または補助放射線療法の両方を行う方法がある。一方、単独療法（一次療法）としての化学療法は、比較的効果に乏しい結果しか得られない方法として捉えられている。一般的に用いられている４種類の併用化学療法処方計画を比較したところ、優勢なものはなかった。回答率は１５％から２２％であり、１年後の生存率は１％から３６％であった（例えば、O'Mahony, D., S. Kummar, et al. (2005)."Non-small-cell lung cancer vaccine therapy: a concise review." J Clin Oncol 23(35):9022-8を参照）。したがって、術前化学療法では期待余命を延命させる結果を得られていないものの、補助化学療法では、放射線療法と組み合わせられた場合も含めて、推定余命をはるかに長くする効果が得られている。

【0005】

今日において用いられている化学療法の一つとして、一次療法としても用いられる白金系薬物と例えばゲムシタビンとを組み合わせた方法などがあり、たとえばペメトレキセドは二次療法として用いられる。

【0006】

ＮＳＣＬＣの治療に用いられる他の選択肢として、分子レベルで腫瘍に特異的なターゲット構造に影響を及ぼすことで伝統的な細胞傷害性化学療法の成功を促す、いわゆる「標的治療」がある。用いられる物質には、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）のチロシンキナーゼに作用する、ベバシズマブ（腫瘍起因性血管形成抑制剤）またはエルロチニブが挙げられる。

【0007】

現在の肺癌の治療における治療方法は、確実にいくらかは改善してきているものの、特にＮＳＣＬＣに関しては、死亡率の高さを鑑み、代わりのもしくは改善されたさらなる治療方法を強く求める傾向がいまだ上昇し続けている。

【0008】

したがって、ここでＮＳＣＬＣの治療方法として免疫システムの利用が提案されている。免疫システムは、数々の疾患において治療および予防に重要な役割を果たしている。現段階での知識によれば、例えば腫瘍細胞を識別して破壊することで臓器を保護する様々な機構が哺乳類によってもたらされている。これらの腫瘍細胞は、組織の正常な細胞および組織から区別されて検出されなければならない。

【0009】

ヒトなどの脊椎動物の免疫システムは、多種類のタンパク質、細胞、臓器および組織からなり、それぞれが精巧かつ機能的なネットワークで相互作用する。この複雑な免疫反応として、特定の病原体または腫瘍細胞をより効率的に認識するよう、脊椎動物のシステムは経時的に適応する。適応プロセスは免疫記憶を作り出し、後にまた同様の状態に遭遇した際に、より効果的な保護を可能とする。この適応免疫または獲得免疫のプロセスは、ワクチン接種計画の基礎となる。

【0010】

獲得免疫システムは抗原に特異的であり、抗原提示と呼ばれるプロセス中に特定の「自己」または「非自己」抗原を認識する必要がある。抗原を特定することで、特定病原体または病原体感染細胞もしくは腫瘍細胞に適合する反応を引き起こすことができる。これらの適合反応を開始させる能力は、「記憶細胞」と呼ばれる細胞によって体内に保持されている。病原体が体に２回以上感染した場合、この特定の記憶細胞を用いて、素早く病原菌を破壊する。したがって、この獲得免疫システムは免疫記憶を得られるだけではなくより強い免疫反応を起こし、１つ以上のシグネチャー抗原（signatre antigen）によって各病原体または腫瘍細胞が「記憶」される。

【0011】

脊椎動物における獲得免疫システムの主要成分としては、主に細胞レベルでのリンパ球および分子レベルでの抗体が含まれる。獲得免疫システムにおける細胞成分としてのリンパ球として、骨髄中の造血肝細胞から得られたＢ細胞およびＴ細胞が挙げられる。Ｂ細胞は液性反応と関連性があり、Ｔ細胞は細胞性免疫反応に関連している。Ｂ細胞およびＴ細胞の両方が、特定標的を認識する受容体分子を有している。Ｔ細胞は、抗原（例えば、病原体の小さなフラグメント）が処理されて腫瘍組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と呼ばれる「自己」受容体と組み合わさって提示された後にのみ、病原体ターゲット構造などの「非自己」標的を認識する。一方、Ｂ細胞抗原特異的受容体はＢ細胞表面上の抗体分子であり、表面上の抗体が特定の外来性抗原と結合したときに病原体を認識する。この抗原／抗体複合体はＢ細胞によって吸収され、タンパク質分解によってペプチドにまで処理される。次に、Ｂ細胞はこの抗原ペプチドを、表面にあるＭＨＣクラスＩＩ分子に提示する。このＭＨＣおよび抗原の組み合わせは、適合するヘルパーＴ細胞を引き寄せる。このヘルパーＴ細胞は、リンフォカインを放出し、Ｂ細胞を活性化させる。活性化されたＢ細胞が分裂を開始すると、その娘細胞は、この抗原を認識する抗体を数百万コピー分泌する。これらの抗体は血漿およびリンパ液中に循環し、抗原を発現している病原体または腫瘍細胞と結合し、補体活性によって破壊するよう、または食細胞が取り込んで破壊するようにマーキングする。

【0012】

獲得免疫システムの細胞成分として、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８^＋）はＣＴＬ−反応を示し得る。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８^＋）は、ＭＨＣＩ型分子に結合している、内因性病原体由来および自己抗原由来のペプチドを認識することができる。ＣＤ８^＋−Ｔ細胞は、細胞傷害性タンパク質を細胞内に放出することによって、破壊作用を実行する。

【0013】

免疫システムの機構は、治療処置のための標的を形成する。適切な方法は、一般的に、自然免疫反応を引き起こすためのアジュバント投与、または獲得免疫反応を引き起こすための抗原もしくは免疫原の投与に基づいている。一般的に抗原が病原体の特定成分（例えば、表面タンパク質）またはそのフラグメントに基づいているため、患者に対する核酸の投与、またそれに続く所望のポリペプチド、タンパク質または抗原の発現も想定している。

【0014】

従来の免疫反応の誘発、免疫法またはワクチン接種方法は、必要な遺伝子情報を細胞内に取り入れるために用いられるＤＮＡ分子の使用に基づいている。例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリプレントランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよびリポフェクション等、ＤＮＡを細胞に導入する種々の方法が開発されてきており、特にリポフェクションが適していると証明されている。同様に、ＤＮＡウイルスがＤＮＡビヒクルとして用いられてもよい。ＤＮＡウイルスはその感染特性により、非常に高いトランスフェクション効率を得ることができる。用いられるウイルスは、トランスフェクションを受けた細胞に機能的な感染性粒子が形成されないよう、遺伝学的に改変されている。このように注意はしていても、導入された遺伝子およびウイルス性遺伝子の、例えば潜在的な組換え行為による制御不能な誘導が発生するリスクを排除することはできない。このことはまた、宿主細胞ゲノムの無傷の遺伝子に、例えば組換えによってＤＮＡが挿入されるリスクをも有する。この結果、この遺伝子は変異する可能性があり、したがって完全もしくは部分的に活性を失うか、誤った情報に応答する可能性が出てくる。言い換えると、細胞にとって不可欠な遺伝子産物の合成が完全に抑制されるか、あるいは改変されたもしくは不正確な遺伝子産物が発現する可能性がある。ＤＮＡが細胞増殖の制御に関わる遺伝子に組み入れられる場合は、ある特定のリスクが発生する。この場合、宿主細胞が変質し、癌または腫瘍の形成につながる恐れがある。さらに、細胞に導入されたＤＮＡを発現させる場合、対応するＤＮＡ媒介物がウイルス性ＣＭＶプロモーターなどの強力なプロモーターを含有している必要がある。処置細胞のゲノムにこのようなプロモーターを組み込むことは、細胞内における遺伝子発現の制御に不必要な変更を引き起こしてしまう可能性がある。免疫反応を引き起こす因子として（例えば、ワクチンとして）ＤＮＡを用いる他のリスクとしては、外来性ＤＮＡを導入した患者内での病原体抗ＤＮＡ抗体の誘導であり、結果として（致命的ともなり得る）免疫反応を引き起こす可能性がある。

【0015】

概して、効果的に免疫システムを刺激することで肺癌、特に非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を治療し、かつＤＮＡ系組成物による導入遺伝子の伝播が制御できないという問題を回避し得る効率的なシステムを構築する余地および必要性がある。

【0016】

したがって、本発明の課題は、ａ）免疫システムを刺激することで肺癌を治療し、かつｂ）上記不利益を回避し得る、組成物を提供することである。

【0017】

この課題は、本発明の構成要素によって解決される。特に、以下の抗原からなる群より選択される少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む活性（免疫賦活）組成物によって解決される：
・ｈＴＥＲＴ、
・ＷＴ１、
・ＭＡＧＥ−Ａ２、
・５Ｔ４、
・ＭＡＧＥ−Ａ３、
・ＭＵＣ１、
・Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、
・ＮＹ−ＥＳＯ−１、
・ＣＥＡ、
・Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、
・ＭＡＧＥ−Ｃ１、および／または
・ＭＡＧＥ−Ｃ２。

【0018】

本発明に係る活性（免疫賦活）組成物に含まれているように、上記群の少なくとも２つの抗原、抗原タンパク質、または抗原ペプチドの特定の組み合わせが、（獲得）免疫システムを効果的に刺激し、肺癌、特に非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療を可能とすることが見出されたことは驚くべきことである。本明細書では、抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドの各用語は同義として用いられ得る。本発明の記載内容において、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物はさらに、免疫反応、好ましくは本明細書中に定義された獲得免疫反応を、活性（免疫賦活）組成物に含まれるもしくはコードされる成分の１つによって引き起こすことができる組成物としても解釈される。この成分の１つは、上記少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする上記少なくとも１つのＲＮＡであることが好ましく、（ｍ）ＲＮＡであることが好ましい。

【0019】

活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡはｈＴＥＲＴをコードし得る。この発明の記載内容において、「ｈＴＥＲＴ」はヒトテロメラーゼ逆転写酵素であり、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物に用いられる場合、「ｈＴＥＲＴ」をコードするＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の好ましい配列は、図７（配列番号７）に示されており、より好ましくは図８（配列番号８）に示されている。Ｍｉｎｅｖ，Ｈｉｐｐら（２０００）は、テロメラーゼがヒト細胞における悪性トランスフォメーションに関連しているリボ核タンパク質酵素であると開示している（Minev, B., J. Hipp, et al. (2000)."Cytotoxic T-cell immunity against telomerase reverse-transcriptase in humans." Proc Natl Acad Sci U S A 97(9):4796-801）。テロメラーゼ活性は大多数のヒトの腫瘍において上昇しており、その遺伝子産物が全てのヒトの腫瘍に共通する最初の分子となる。クラスＩのＭＨＣ分子に結合する、内生的に処置されたテロメラーゼペプチドの生成は、異なる由来の腫瘍を細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の標的にすることができる。したがって、Ｍｉｎｅｖ，Ｈｉｐｐらによれば、通常の大人および癌患者においてテロメラーゼペプチドを認識する前駆体ＣＴＬが免疫付与によって拡大し得るのであれば、このことで癌に対するワクチン治療を進展させることができるとしている。Ｍｉｎｅｖ，Ｈｉｐｐらはまた、正常な個人および前立腺癌に罹患している患者を、テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＲＴ）由来の２つのＨＬＡ−Ａ２．１制限ペプチドに対してｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化したところ、大多数がｈＴＲＴ特異的ＣＴＬを生成したことを示した。ＣａｒｐｅｎｔｅｒおよびＶｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ（２００６）（Carpenter, E. L. and R. H. Vonderheide (2006);"Telomerase-based immune therapy of cancer."Expert Opin Biol Ther 6(10):1031-9）は、１９９７年にヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）をクローニングしたところからｈＴＥＲＴを抗腫瘍免疫療法標的として初めて臨床試験を行うまでの進歩は速かったと報告している。ｈＴＥＲＴは、ヒトの癌の大多数において過剰発現されるが、正常な成体組織においてはその発現が制限される。ｈＴＥＲＴは、発癌の際に決定的な役割を有し、癌幹細胞によって発現され得る。しかしながら、自己抗原であるにもかかわらず、ｈＴＥＲＴはｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において免疫原性を有する。乳癌、前立腺癌、肺癌およびその他癌に罹患している患者に対して、ｈＴＥＲＴ免疫療法のフェーズＩの研究がいくつか完了しており、その臨床的および免疫学的な結果は有望なものであった。免疫療法によって、機能的な抗腫瘍Ｔ細胞を、臨床毒性が発生することなく患者内で誘発させることができた。ｈＴＥＲＴに基づく治療向けにも、免疫予防方法として個体にワクチン接種をする機会が想定され得る。Ｎａｉｒ，Ｓ．Ｋ．およびＨｅｉｓｅｒら（２０００）は、マウスＴＥＲＴ ＲＮＡを形質導入した樹状細胞をワクチン接種したマウスにおける、抗マウスＴＥＲＴ免疫性の誘導について開示している（Nair,S.K., A.Heiser etal. (2000)."Induction of cytotoxic T-cell responses and tumor immunity against unrelated tumors using telomerase reverse-transcriptase RNA transfected dendriticcells." Nat Med 6(9):1011-7.を参照）。したがって、好ましい実施形態によれば、活
性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図７に示されている配列（配列番号７）、より好ましくは図８に示されている配列（配列番号８）から選択されるｈＴＥＲＴ抗原をコードしていてもよい。さらに好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図７に示されるｈＴＥＲＴ配列（配列番号７）、より好ましくは図８に示されるｈＴＥＲＴ配列（配列番号８）のフラグメント、変異体またはエピトープから選択されるｈＴＥＲＴ抗原を代替的にまたは付加的にコードし得る。

【0020】

活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、さらにＷＴ１をコードし得る。本発明の内容では、「ＷＴ１」はウィルムス腫瘍１であり、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物に用いられる場合、「ＷＴ１」をコードするＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の好ましい配列は図９（配列番号９）に示されており、より好ましくは図１０（配列番号１０）に示されており、そしてさらに好ましくは図１１（配列番号１１）に示されている。Ｏｋａ，Ｙ．Ａ．およびＴｓｕｂｏｉら（２００４）は、ウィルムス腫瘍タンパク質が肺癌で過剰発現されることを見出した（Oka, Y., A. Tsuboi et al. (2004). "Induction of WT1 (Wilms' tumor gene)-specific cytotoxic T-cells by WT1 peptide vaccine and the resultant cancer regression." Proc Natl Acad Sci U S A 101(38): 13885-90）。Ｏｋａら（２００４、上記）は、肺癌に罹患している患者１０人に対し、ＷＴ１由来ペプチドのワクチン接種を行った。そして、この臨床反応が抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞活性と相互関係を有することを示した。ウィルムス腫瘍遺伝子ＷＴ１は、白血病および様々な種類の固形腫瘍で過剰発現し、ＷＴ１タンパク質はこのような悪性腫瘍に対する免疫療法において魅力的な活性標的抗原であることを示した。Ｏｋａら（２００４、上記）は、乳癌もしくは肺癌、脊髄形成異常性症候群、または急性骨髄性白血病に罹患している患者に対して行われた、ＷＴ１ペプチドを用いた免疫療法のフェーズＩ臨床研究の結果を報告した。ＷＴ１ワクチン接種の有効性が評価できた患者２０人のうち、１２人は白血病性芽細胞または腫瘍の大きさおよび／または腫瘍マーカーが減少するなどの臨床反応を示した。ＷＴ１ワクチン接種後のＷＴ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞の出現率と臨床反応の間で明白な相互関係が観察された。したがって、ＷＴ１ワクチン接種がＷＴ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘発し、正常な組織を傷つけることなく癌を退行させる結果を示した。好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図９に示される配列（配列番号９）、より好ましくは図１０に示される配列（配列番号１０）、さらに好ましくは図１１に示される配列（配列番号１１）から選択されるＷＴ１抗原をコードし得る。さらに好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図９に示されるＷＴ１配列（配列番号９）、より好ましくは図１０に示されるＷＴ１配列（配列番号１０）、さらに好ましくは図１１に示されるＷＴ１配列（配列番号１１）のフラグメント、変異体またはエピトープから選択されるＷＴ１抗原を代替的もしくは付加的にコードし得る。

【0021】

活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、さらにＭＡＧＥ−Ａ２をコードし得る。この発明の記載内容において、「ＭＡＧＥ−Ａ２」はメラノーマ抗原ファミリーＡ，２Ｂであり、「ＭＡＧＥ−Ａ２」をコードするＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の好ましい配列は、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物に用いられる場合、図１４に示す配列（配列番号１４）であり、より好ましくは図１５に示す配列（配列番号１５）である。ＧｉｌｌｅｓｐｉｅおよびＣｏｌｅｍａｎ（１９９９）（Gillespie, A. M. and R. E. Coleman (1999). "The potential of melanoma antigen expression in cancer therapy." Cancer Treat Rev 25(4):219-27）は、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、頭頚部癌、肺癌、上顎癌、メラノーマ、食道癌、骨肉腫、および卵巣癌で発現したことを報告している。したがって、好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図１４に示される配列（配列番号１４）、より好ましくは図１５に示される配列（配列番号１５）から選択されるＭＡＧＥ−Ａ２抗原をコードし得る。さらなる好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図１４（配列番号１４）に示されるＭＡＧＥ−Ａ２配列、より好ましくは図１５に示されるＭＡＧＥ−Ａ２配列（配列番号１５）のフラグメント、変異体またはエピトープから選択されるＭＡＧＥ−Ａ２抗原を代替的にまたは付加的にコードし得る。

【0022】

活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、さらに５Ｔ４をコードし得る。この発明の記載内容において、「５Ｔ４」は栄養膜糖タンパク質であり、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物に用いられる場合、「５Ｔ４」をコードするＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の好ましい配列は、図３に示す配列（配列番号３）であり、さらに好ましくは図４に示す配列（配列番号４）である。Ｈａｒｒｏｐ、Ｃｏｎｎｏｌｌｙら（２００６）は、ヒト癌胎児性抗原５Ｔ４が、プラセンタならびに結腸直腸癌、胃癌、腎臓癌および卵巣癌を含む種々のヒトの癌において高いレベルで発現しているものの、正常な組織ではほとんど発現していない、ロイシンに富む７２−ｋＤａ膜糖タンパク質であることを報告している（Harrop, R., N. Connolly, et al.(2006). "Vaccination of colorectal patientswith modified Vaccinia Ankara delivering the tumor antigen 5T4 (TroVax) inducesimmune responses which correlate with disease control: a phase I/II trial." Clin Cancer Res 12(11 Pt 1):3416-24を参照）。５Ｔ４の過剰発現は、結腸直腸癌、胃癌、および卵巣癌の患者における予後不良に関連している。このような悪化因子であるにもかかわらず、大多数の患者（１７人中１６人；９４％）において、５Ｔ４特異的細胞性および／または液性免疫反応がＴｒｏＶａｘ免疫化後に引き起こされ、これは多くの他の癌免疫療法試験と比べて有益であると考えられた。まとめると、これらは、ｉ．ｍ．およびｉ．ｄ．投与経路を介して送達されたＴｒｏＶａｘの安全性および免疫原性を示している。ＺｈａｏおよびＷａｎｇ（２００７）（Zhao, Y. and Y. Wang(2007). "5T4 oncotrophoblastic glycoprotein: janus molecule in life and a novel potential target againsttumors." Cell Mol Immunol 4(2):99-104）は、５Ｔ４腫瘍栄養膜糖タンパク質が胚組織および様々な悪性腫瘍の細胞表面に発現する膜貫通タンパク質であることを報告している。これは、胚形成における大量の細胞移動、移植に関連した細胞浸潤、および腫瘍形成における腫瘍性転移を含む、複数の生物学的および病理的プロセスにおいて不可欠な役割を果たしている。Ｋｏｐｒｅｓｋｉ，Ｂｅｎｋｏら（２００１）によると、５Ｔ４は、癌治療において潜在的な標的となる上皮悪性腫瘍において高頻度で過剰発現する栄養膜糖タンパク質である（Kopreski, M. S., F. A. Benko et al.(2001). "Circulating RNA as a tumor marker: detection of 5T4 mRNA in breast およびlung cancer patient serum." AnnN Y Acad Sci 945:172-8を参照）。血清を、進行性乳癌（患者５人）または非小細胞
肺癌（患者１４人）に罹患している患者１９人から、および、増幅可能なＲＮＡを有する正常な対照ボランティア２５人から集めた。血清から抽出されたＲＮＡは、ヘミネステッド（heminested）の二段階反応のＲＴ−ＰＣＲで、ゲル電気泳動法で検出された産物を用いて増幅した。５Ｔ４ ｍＲＮＡは、乳癌患者５人中２人、肺癌患者１４人中６人の、計１９人中８人（４２％）の癌患者血清から再現性をもって検出されたが、正常な対照血清からは２５人中３人（１２％）のみからしか検出されなかった（ｐ＝０．０３５）。したがって、好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図３に示す配列（配列番号３）、より好ましくは図４に示す配列（配列番号４）から選択される５Ｔ４抗原をコードし得る。さらに好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図３に示される５Ｔ４配列（配列番号３）、より好ましくは図４に示される５Ｔ４（配列番号４）のフラグメント、変異体、またはエピトープから選択される５Ｔ４抗原を代替的にまたは付加的にコードし得る。

【0023】

活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、さらにＭＡＧＥ−Ａ３をコードし得る。本発明の記載内容において「ＭＡＧＥ−Ａ３」はメラノーマ抗原ファミリーＡ，３であり、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物に用いられる場合、「ＭＡＧＥ−Ａ３」をコードするＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の好ましい配列は、図１６に示す配列（配列番号１６）であり、より好ましくは図１７に示す配列（配列番号１７）である。ＧｉｌｌｅｓｐｉｅおよびＣｏｌｅｍａｎ（１９９９）（Gillespie, A. M. and R. E. Coleman(1999). "The potential of melanoma antigen expression in cancer therapy." Cancer Treat Rev 25(4):219-27を参照）は、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、グリオーム、頭頚部癌、肺癌、上顎癌、メラノーマ、ニューロブラストーマ、食道癌および卵巣癌での発現を報告した。Ｓｉｅｎｅｌ，Ｖａｒｗａｒｋら（２００４）は、早期非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）におけるＭＡＧＥ−Ａ３発現率を割り出すための研究を開示している（Sienel, W., C. Varwerk, et al. (2004). "Melanoma associated antigen (MAGE)-A3 expression in Stages I and II non-small-cell lung carcinoma: results of a multi-center study." Eur J Cardiothorac Surg 25(1):131-4を参照）。手術可能な臨床ステージＩまたはＩＩのＮＳＣＬＣの一次腫瘍サンプルを２０４人の患者から集め、病理学的病期を判定した。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を用いてＭＡＧＥ−Ａ３の転写物を検出することで、組織サンプルからＭＡＧＥ−Ａ３の発現を分析した。ＭＡＧＥ−Ａ３の発現は、調査した病期Ｉ〜ＩＩ一次腫瘍２０４のうち８０（３９．２％）にて観察された。Ａｔａｎａｃｋｏｖｉｃ，Ａｌｔｏｒｋｉら（２００４）は、元々はメラノーマにて同定された腫瘍関連抗原であるＭＡＧＥ−Ａ３が、非小細胞肺腫瘍からも見つかったと開示している（Atanackovic, D., N. K. Altorki et al. (2004). "Vaccine-induced CD4+ T-cell responses to MAGE-3 protein in lung carcinoca patients." J Immunol 172(5):3289-96を参照）。臨床試験において、９人のＮＳＣＬＣ患者にこのタンパク質をワクチン接種したところ、３人から抗体反応が得られた。アジュバントＡＳＯ２Ｂと組み合わされたＭＡＧＥ−Ａ３を受けた患者８人のうち７人が、ＭＡＧＥ−Ａ３に対する抗体を産生した。これらの患者の何人かはさらにタンパク質に対するＴ細胞反応も得られた。したがって、好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図１６に示される配列（配列番号１６）、より好ましくは図１７に示される配列（配列番号１７）から選択されるＭＡＧＥ−Ａ３抗原をコードし得る。さらに好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図１６に示すＭＡＧＥ−Ａ３配列（配列番号１６）、より好ましくは図１７に示すＭＡＧＥ−Ａ３（配列番号１７）のフラグメント、変異体またはエピトープから選択されるＭＡＧＥ−Ａ３抗原を代替的にまたは付加的にコードし得る。

【0024】

活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、さらにＭＵＣ１をコードし得る。この発明の記載内容において、「ＭＵＣ１」はムチン１であり、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物に用いられる場合、「ＭＵＣ１」をコードするＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の好ましい配列は、図１に示す配列（配列番号１）であり、より好ましくは図２に示す（配列番号２）である。癌関連ムチンは、免疫療法の潜在的な標的である。これらの分子は、内皮細胞表面に悪性細胞を容易に接着させることで転移を促進すると考えられている。Ｄｅｎｄａ−ＮａｇａｉおよびＩｒｉｍｕｒａ（２０００）（Denda-Nagai, K. and T. Irimura (2000). "MUC1 in cancer-host interactions." Glycoconj J 17(7-9): 649-58）によると、乳癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、結腸癌、および卵巣癌を含む全ての腺癌の９０％において、ＭＵＣ−１が過剰発現する。Ｋｏｎｔａｎｉ，Ｔａｇｕｃｈｉら（２００１）は、肺癌の６０％においてＭＵＣ−１が過剰発現していることを見出したと開示し（Kontani, K.,O. Taguchi et al. (2001). "Modulation of MUC1 mutin as an escape mechanism of breast carcinoma cells from autologous cytotoxic T-lymphocytes." Br J Cancer 84(9):1258-64を参照）、一方でＫｏｎｔａｎｉ，Ｔａｇｕｃｈｉら（２００３）は、ＭＵＣ１陽性癌で細胞免疫性を引き起こさせるべくパルスＤＣをＭＵＣ１抗原とともに用いる方法を分析する研究において、臨床的にＭＵＣ−１陽性患者９人のうち７人から、腫瘍マーカーレベルの低下または悪性胸水の消失のいずれかの反応が治療に対して現われることを見出した（Kontani, K., O. Taguchi, et al. (2003). "Dendriticcell vaccine immunotherapy of cancer targeting MUC1 mutin." Int J Mol Med 12(4):493-502を参照）。反応のあった患者のうち３人はＮＳＣＬＣに罹患していた。Ｐａｌｍｅｒ，Ｐａｒｋｅｒら（２００１）は、病期ＩＩＩ／ＩＶのＮＳＣＬＣに対してＭＵＣ１ペプチドをフェーズＩ臨床試験で用いる際の安全性および認容性が得られたと報告している（Palmer, M., J. Parkerら(2001). "Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung carcinoma." Clin Lung Cancer 3(1):49-57;discussion 58を参照）。１２人の患者のうち５人（４２％）が免疫反応を示し、１２人の患者のうち４人（３３％）が安定疾患となった。Ｗｉｅｒｅｃｋｙ，Ｍｕｅｌｌｅｒら（２００６）は、さらに様々な血液病および上皮悪性腫瘍に過剰発現するＴＡＡ ＭＵＣ１の、ＨＬＡ−Ａ２結合新規９−ｍｅｒペプチドを２つ同定している（Wierecky, J.,M. Mueller et al. (2006). "Dendritic cell-based cancer immunological therapy targeting MUC-1." Cancer Immunol Immunother 55(1):63-7を参照）。これらのペプチドでＤＣパルスした後に生成された細胞傷害性Ｔ細胞は、抗原特異的およびＨＬＡ限定的にＭＵＣ１を発現する腫瘍細胞の溶解を引き起こすことができた。２つの臨床研究のうち、ＭＵＣ１由来ペプチドでパルスしたＤＣを用いて行った進行癌に罹患している患者へのワクチン接種は、深刻な副作用もなく寛容を示し、免疫反応を引き起こすことができた。転移腎細胞癌に罹患している２０人の患者のうち、６人の患者から、３つの客観的応答（１ＣＲ、２ＰＲ）を示す転移の退行を示した。したがって、好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図１に示す配列（配列番号１）、より好ましくは図２に示す配列（配列番号２）から選択されるＭＵＣ１抗原をコードし得る。さらに好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図１に示す配列（配列番号１）、より好ましくは、図２に示す配列（配列番号２）のフラグメント、変異体またはエピトープから選択されるＭＵＣ１抗原を代替的にまたは付加的にコードし得る。

【0025】

活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、さらにＨｅｒ−２／ｎｅｕをコードし得る。本発明の記載内容において、「Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ」はｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽細胞白血病ウイルス性腫瘍遺伝子ホモログ２であり、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物に用いられている場合、「Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ」をコードするＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の好ましい配列は、図５に示す配列（配列番号５）であり、より好ましくは図６に示す配列（配列番号６）である。Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，Ｓｏｔｉｒｏｐｏｌｏｕら（２００４）によれば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ＨＥＲ２またはｃ−ｅｒｂ−Ｂ２でも知られる）は、チロシンキナーゼ活性を有し、広範囲にわたって上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体と相同関係を有する１８５−ｋＤａタンパク質受容体である（Baxevanis, C. N.,P. A. Sotiropoulou, et al. (2004). "Immunobiology of HER-2/neu oncoprotein and its potential application in cancer immunotherapy." Cancer Immunol Immunother 53(3):166-75を参照）。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは多くの上皮腫瘍に発現し、全卵巣癌および乳癌のおよそ２０−２５％、全膵臓腺癌のおよそ３５−４５％、そして結腸直腸癌のおよそ９０％において発現することが知られている。ＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現は、予後不良のマーカーを表している。Ｈｅｒ−２の過剰発現は、乳、卵巣、膵臓、結腸、肺、および他の組織にある悪性腫瘍で観察されている。Ｈｅｒ−２は通常、種々のヒトの組織（皮膚、消化管上皮、乳、卵巣、肝細胞）において低いレベルで発現する。Ｂｅｒｎｈａｒｄ，Ｓａｌａｚａｒ（２００２）は、能動的に癌患者をＨＥＲ−２／ｎｅｕに対して免疫する臨床試験の早期段階で免疫性が生成される結果が得られ、一定期間、その免疫反応が持続したと結論付けている（Bernhard,H., Salazar L. et al. (2002). "Vaccination against the HER-2/neu oncogenic protein." Endocr Relat Cancer 9(1): 33-44を参照）。現在のワクチン試験は、エピトープまたはペプチド系ワクチンの使用のみに焦点を当てている。この理由のほどんどは、ペプチドワクチン手法がげっ歯類モデルにおけるｎｅｕ特異的な寛容を回避できるという観察を受けた結果である。Ｂｅｒｎｈａｒｄら（２００２、上記）によれば、次世代のワクチンの取り組みは、タンパク質系ワクチン、ＤＣに負荷されたＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗原製剤、および核酸系製剤を含む可能性が高い。これらの手法を前臨床レベルで研究するげっ歯類モデルの研究は見込みがあった。そのため、活性免疫処置後におけるｅｘ ｖｉｖｏでのＨＥＲ−２／ｎｅｕ特異的Ｔ細胞の増殖、またはＨＥＲ−２／ｎｅｕ発現ＤＣを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ培養は、進行期のＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現腫瘍の治療の選択肢として考えられていた。Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，Ｓｏｔｉｒｉｄｏｕら（２００６）は、ヒトにおいては、ワクチンに用いられるペプチドに対する免疫反応が検出されているものの、臨床反応が何も記述されていないことを見出した（Baxevanis, C. N.,N. N. Sotiriadouら(2006). "Immunogenic HER-2/neu peptides as tumor vaccines." Cancer Immunol Immunother 55(1):85-95を参照）。Ｄｉｓｉｓ，Ｇｏｏｌｅｙら（２００２）によれば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕはＥＧＦＲファミリーの一員である（Disis, M. L., T. A. Gooley et al. (2002). "Generation of T-cell immunology to the HER-2/neu protein after active immune process with HER-2/neu peptide-based vaccines." J ClinOncol 20(11):2624-32を参照）。これは、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌および肺癌
にて高頻度に過剰発現する。フェーズＩ臨床試験にて、３８人の患者（２人がＮＳＣＬＣ患者）にＨｅｒ−２／ｎｅｕペプチドをワクチン接種したところ、患者の９２％が、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対するＴ細胞免疫性を生成した。したがって、好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図５に示す配列（配列番号５）、より好ましくは図６に示す配列（配列番号６）から選択されるＨｅｒ−２／ｎｅｕ抗原をコードし得る。さらに好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図５に示すＨｅｒ−２／ｎｅｕ配列（配列番号５）、より好ましくは図６に示すＨｅｒ−２／ｎｅｕ配列（配列番号６）のフラグメント、変異体またはエピトープから選択されるＨｅｒ−２／ｎｅｕ抗原を代替的にまたは付加的にコードし得る。

【0026】

活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、さらにＮＹ−ＥＳＯ−１をコードし得る。この発明の記載内容において、「ＮＹ−ＥＳＯ−１」は癌／精巣抗原１Ｂであり、本発明の活性（免疫賦活）組成物に用いられる場合、「ＮＹ−ＥＳＯ−１」をコードするＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の好ましい配列は、図２０に示す配列（配列番号２０）であり、より好ましくは図２１に示す配列（配列番号２１）である。Ｃｈｅｎ，Ｓｃａｎｌａｎら（１９９７）は、ＲＴ−ＰＣＲによって、種々のヒトの腫瘍におけるＮＹ−ＥＳＯ−１のｍＲＮＡ発現を報告している：メラノーマ２３／６７、卵巣癌２／８、乳癌１０／３３、甲状腺癌２／５、前立腺癌４／１６、膀胱癌４／５、結腸癌０／１６、バーキットリンパ腫１／２、グリオーム０／１５、基底細胞癌０／２、胃癌０／１２、平滑筋肉腫０／２、肺癌２／１２、その他肉腫０／２、腎臓癌０／１０、膵臓癌０／２、リンパ腫０／１０、セミノーム０／１、ヘパトーム２／７、脊髄腫瘍０／１（Chen, Y. T., M. J. Scanlan et al. (1997). "A testicular antigen aberrantly expressed in human cancers detected by autologous antibody screening." Proc Natl Acad Sci U S A 94(5):1914-8を参照）。Ｊａｇｅｒ，Ｋａｒｂａｃｈら（２００６）は、ＮＹ−ＥＳＯ−１が種々のヒト悪性腫瘍に発現する癌／精巣抗原であり、ＮＹ−ＥＳＯ−１を標的とするワクチン方法が開発されていることを報告している（Jager, E.,J. Karbach et al. (2006). "Recombinant vaccinia/fowlpox NY-ESO-1 vaccines induce both humoral and cellular NY-ESO-1-specific immune responses in cancer patients." Proc Natl Acad Sci U S A 103(39):14453-8を参照）。この研究では、組換えｖａｃｃｉｎｉａ−ＮＹ−ＥＳＯ−１および組換えｆｏｗｌｐｏｘ−ＮＹ−ＥＳＯ−１の安全性および免疫原性を、種々の腫瘍種を有する３６人の一連の患者において分析を行った。各コンストラクトについて、まず個別に２つの異なる投与量で分析を行い、次に組換えｖａｃｃｉｎｉａ−ＮＹ−ＥＳＯ−１の後に組換えｆｏｗｌｐｏｘ−ＮＹ−ＥＳＯ−１を投与するプライム・ブースト法で分析を行った。ワクチンは、個別または組み合わせの両方において良好な寛容を有した。高い割合の患者において、少なくとも４回のワクチン接種を月間隔で行うことで、広範囲のＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープに対するＮＹ−ＥＳＯ−１特異的抗体反応および／または特異的ＣＤ８およびＣＤ４Ｔ細胞反応を引き起こすことができた。ワクチン接種を受けた患者５人から得られたＣＤ８Ｔ細胞クローンは、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現メラノーマ標的細胞を溶解することが示された。メラノーマに罹患している何人かの患者では、ワクチン接種をすることで疾病の自然経過が良い方向に影響したような印象を強く受けた。Ｄａｖｉｓ，Ｃｈｅｎら（２００４）は、皮内に注射されたＨＬＡ−Ａ２制限ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドは安全かつ免疫原性を有することを報告をしている（Davis, I. D.,W. Chen et al. (2004). "Recombinant NY-ESO-1 protein with ISCOMATRIX adjuvant induces broad integrated antibodies and CD4(+) and CD8(+) T-cell responses in humans." Proc Natl Acad Sci U S A 101(29):10697-702）。これらの試験は安全性および免疫原性を割り出すためだけに設計されたものであるが、何人かの患者は、腫瘍の退行または疾病の安定化を示した。また、Ｊａｇｅｒ，Ｇｎｊａｔｉｃら（２０００）によって、切除ＮＹ−ＥＳＯ−１発現メラノーマを有する患者において、抗体反応ならびにＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞反応を含む広範囲のＮＹ−ＥＳＯ−１特異的免疫反応が、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸアジュバント（ＣＳＬ社、Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）と組み合わせた組換えＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質による免疫化後に見られることが明示された（Jager, E., S. Gnjatic et al.(2000). "Induction of primary NY-ESO-1 immunity: CD8+ T-cell and antibody responses in peptide-vaccinated patients with NY-ESO-1+ cancers." Proc Natl Acad Sci U S A 97(22):12198-203を参照）。このワクチンに対する免疫反応は、長期無病生存率に関連するように見受けられた。さらに、Ｏｄｕｎｓｉ，Ｑｉａｎら（２００７）は、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドを有するワクチン接種が、卵巣癌に対して一体的な液性およびＴ細胞反応を引き起こすと報告している（Odunsi, K.,F. Qianら(2007). "Vaccination with an NY-ESO-1 peptide of HLA class I/II specificities induces integrated humoral and T-cell responses in ovarian cancer." Proc Natl Acad Sci U S A 104(31):12837-42を参照）。したがって、好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図２０に示す配列（配列番号２０）、より好ましくは図２１に示す配列（配列番号２１）から選択されるＮＹ−ＥＳＯ−１抗原をコードし得る。さらに好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図２０に示すＮＹ−ＥＳＯ−１配列（配列番号２０）、より好ましくは図２１に示すＮＹ−ＥＳＯ−１配列（配列番号２１）のフラグメント、変異体またはエピトープから選択されるＮＹ−ＥＳＯ−１抗原を代替的にまたは付加的にコードし得る。

【0027】

活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、さらにＣＥＡをコードし得る。本発明の記載内容において、「ＣＥＡ」は癌胎児性抗原（ＣＥＣＡＭ５＝癌胎児性抗原関連細胞接着分子５）であり、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物に用いられる場合、「ＣＥＡ」をコードするＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の好ましい配列は、図１２に示す配列（配列番号１２）であり、より好ましくは図１３に示す配列（配列番号１３）である。Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ（１９９９）によると、ＣＥＡは接着分子として機能する１８０ｋＤａ癌胎児性糖タンパク質であり、ＮＳＣＬＣの７０％において過剰発現する（Hammarstrom, S. (1999). "The carcinoembryonic antigen (CEA) family: structures, suggested functions and expression in normal and malignant tissues." Semin Cancer Biol9(2):67-81）。Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ（２００２）は、ＣＥＡが癌に対する活性ワクチ
ン手法の標的として多くの魅力的な特徴を有していると報告している（Berinstein, N. L.(2002). "Carcinoembryonic antigen as a target for therapeutic anticancer vaccines: a review." J Clin Oncol 20(8):2197-207）。ＣＥＡは好ましい発現パターンを有しており、全てのヒト癌の５０％を越える種類で発現する。ＣＥＡ自身が腫瘍形成プロセスの中で役割を果たすこともあり、癌が進行する間、発現を選択、維持することができる。ＣＥＡは様々なＭＨＣクラス１分子に処理、提示されていることが多く立証されている。また、ＣＥＡに対する免疫寛容は絶対ではない。ヒトＴ細胞がＣＥＡを発現している癌細胞を認識し、それに対して活性化し、癌細胞を溶解することができるという多くのデータが存在している。ＣＥＡを標的抗原として用いたいくつかの異なる治療ワクチン手法を評価したところ、安全性は確立されている。また、ＣＥＡに対する液性および／または細胞反応は立証されている。ほとんどの場合、これらのＢｅｒｉｎｓｔｅｉｎ（２００２、上記）によって発表された研究には非常に進行した難治性の転移結腸癌患者が選ばれているが、臨床活動のいくつかの証拠では、疾病の安定化、および何人かの患者では客観的応答が立証されている。アゴニストＣＥＡ ＭＨＣクラスＩ結合ペプチド（ＣＡＰ１−６Ｄ）およびＣＥＡを組み込んだポックスウイルスベクターによってパルスした樹状細胞は、共刺激分子の有無に関わらず、活性化ＣＤ８Ｔ細胞反応において最も活性が高かった。残念ながら樹状細胞手法は、患者に特異的な樹状細胞の調製物を得る物流上の難しさによって制限され得る。ＣＥＡを標的としたカナリア痘ベクターシステムを用いた４つのフェーズＩ研究が報告された。これらの試験によって、この手法が安全、かつ主として注入部位に限定してグレード１および２の緩い毒性を示すことを示した。また、この試験は、特定細胞性Ｔ細胞反応が大多数の患者においてＣＥＡに対して活性化し得ることを示している。これらの反応は、ベクター内にＢ７．１共刺激分子を含ませること、または注入部位に組換えＧＭ−ＣＳを加えることで増強させ得る。客観的臨床応答は報告されなかったが、これらフェーズＩ研究の患者のかなりの割合の者が疾病の安定化を経験した。ＣＥＡを認識するＴ細胞の割合をさらに増強させるためのワクチン接種方法があり、これは、これらワクチンの臨床活性を増大させると考えられている。少なくともいくつかのワクチンは軽微な疾病状態であればより効果的であることを示唆するデータがある。Ｕｅｄａ，Ｉｔｏｈら（２００４）は、ＣＥＡ由来ペプチドをパルスした自己樹状細胞を用いて、転移胃腸癌または肺癌に罹患している患者１８人を治療した１つの研究を記載している（Ueda, Y.,T. Itoh et al. (2004). "Dendritic cell-based immunotherapy of cancer with carcinoembryonic antigen-derived, HLA-A24-restricted CTL epitope: Clinical outcomes of 18 patients with metastasis gastrointestinal or lung adenocarcinomas." Int J Oncol 24(4):909-17を参照）。ほとんどの患者について、皮膚試験で測定した免疫反応、およびｉｎ ｖｉｔｒｏＴ細胞アッセイを観察した。客観的臨床応答は報告されなかったが、この免疫療法を受けている間、何人かの患者の疾病は安定していた。したがって、好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図１２に示す配列（配列番号１２）、より好ましくは図１３に示す配列（配列番号１３）から選択されるＣＥＡ抗原をコードし得る。さらに好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図１２に示すＣＥＡ配列（配列番号１２）、より好ましくは図１３に示す配列（配列番号１３）のフラグメント、変異体またはエピトープから選択されるＣＥＡ抗原を代替的にまたは付加的にコードし得る。

【0028】

活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、さらにＳｕｒｖｉｖｉｎをコードし得る。本発明の記載内容において、「Ｓｕｒｖｉｖｉｎ」はバキュロウイルスＩＡＰリピート含有５（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）であり、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物に用いられた場合、「ｓｕｒｖｉｖｉｎ」をコードするＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の好ましい配列は、図１８に示す配列（配列番号１８）であり、より好ましくは図１９に示す配列（配列番号１９）である。Ｓｕｒｖｉｖｉｎは、Ｇｒｕｂｅ，Ｍｏｒｉｔｚら（２００７）によって定義付けられている（Grube, M.,S. Moritz et al. (2007). "CD8+ T-cellsreactive to survivin antigen in patients with multiple myeloma." Clin Cancer Res13(3):1053-60を参照）。Ｓｕｒｖｉｖｉｎはアポトーシスファミリーの阻止剤の一員
であり、様々な種類の悪性腫瘍で過剰発現する。ｓｕｒｖｉｖｉｎエピトープを認識する細胞傷害性Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて引き起こされ得、また白血病、乳癌、およびメラノーマに罹患している患者に対してワクチン接種をすることによって引き起こされ得る。多発性骨髄腫に罹患している患者において、ｓｕｒｖｉｖｉｎ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が出現しているかを調べた。そして、２３人の患者のうち９人から、また２１人の健康なボランティアのうち１人から、Ｔ細胞認識ＨＬＡ−Ａ２．１結合ｓｕｒｖｉｖｉｎペプチドが検出された。Ｓｕｒｖｉｖｉｎ活性Ｔ細胞は末期分化型エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＣＲ７）として同定された。骨髄標本における骨髄腫細胞の陽性ｓｕｒｖｉｖｉｎ発現は、１１人の患者のうち７人において観察された。Ｓｕｒｖｉｖｉｎは上皮および血液由来のほとんどのヒト癌細胞から多く発現し、過剰発現は癌の進行、予後不良、耐性、そして短期患者生存率に関連している。Ｄｕｆｆｙ，Ｏ’Ｄｏｎｏｖａｎ（２００７）は、Ｓｕｒｖｉｖｉｎがほとんど全ての悪性腫瘍において過剰発現する１６．５ｋＤａのタンパク質であり、正常な分化成体組織においてはほとんど検出されないと報告している（Duffy, M. J., N. O'Donovan,ら(2007). "Survivin: a promising tumor biomarker." Cancer Lett 249(1):49-60を参照）。機能的に、ｓｕｒｖｉｖｉｎはアポトーシスの制御、細胞増殖の促進、および血管形成の促進をすることが示されている。これらの処理における役割と一致して、ｓｕｒｖｉｖｉｎは、癌の進行において重要な役割を果たすと説明されていた。正常組織および悪性組織の間での発現に大きな違いがあるため、さらに癌の進行における原因となる役割のために、ｓｕｒｖｉｖｉｎは現在、潜在的な腫瘍マーカーとして集中的に調査が行われている。新たに出てきているデータは、ｓｕｒｖｉｖｉｎを測定することで膀胱癌の早期診断、複数癌の種類の予後判断、そして多様な抗癌治療に対する反応の予測を手助けし得ることを示唆している。Ｚｅｉｓ，Ｓｉｅｇｅｌら（２００３）は、ｓｕｒｖｉｖｉｎ−ＲＮＡを形質導入した自己樹状細胞を用いてＰＢＭＣを刺激することによって生成されたヒトｓｕｒｖｉｖｉｎ特異的ＣＴＬは、血液悪性細胞系から、急性骨髄性白血病に罹患している患者から単離された一次腫瘍細胞までの範囲において、細胞傷害性を示した（Zeis, M., S. Siegel et al. (2003). "Generation of cytotoxic responses in mice and human individuals against hematological malignancy using survivin-RNA-transfected dendritic cells." J Immunol 170(11):5391-7を参照）。また、ｓｕｒｖｉｖｉｎ−ＲＮＡを形質導入した樹状細胞をマウスにワクチン接種することで、ｓｕｒｖｉｖｉｎ発現リンパ腫によるチャレンジに対する長期耐性を有することにつながり、腫瘍拒絶Ａｇとしてのｓｕｒｖｉｖｉｎの潜在的な可能性を示した。血液学腫瘍に対する免疫治療手法のためのターゲット構造としてのｓｕｒｖｉｖｉｎの使用について、証拠が得られた。したがって、好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図１８に示す配列（配列番号１８）、より好ましくは図１９に示す配列（配列番号１９）から選択されるＳｕｒｖｉｖｉｎ抗原をコードし得る。さらに好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図１８に示すＳｕｒｖｉｖｉｎ配列（配列番号１８）、より好ましくは図１９に示すＳｕｒｖｉｖｉｎ配列（配列番号１９）のフラグメント、変異体またはエピトープから選択されるＳｕｒｖｉｖｉｎ抗原を代替的にまたは付加的にコードし得る。

【0029】

活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、さらにＭＡＧＥ−Ｃ１をコードし得る。本発明の記載内容において、「ＭＡＧＥ−Ｃ１」はメラノーマ抗原ファミリーＣ，１であり、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物に用いられる場合、「ＭＡＧＥ−Ｃ１」をコードするＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の好ましい配列は、図２２に示す配列（配列番号２２）であり、より好ましくは図２３に示す配列（配列番号２３）であり、そしてさらに好ましくは図２４に示す配列（配列番号２４）である。Ｌｕｃａｓ，Ｄｅ Ｓｍｅｔら（１９９８）は、ＲＤＡを行うことで、最近、ＭＡＧＥ−Ｃ１を同定した（Lucas,S., C. De Smet et al. (1998). "Identification of a new MAGE gene with tumor-specific expression by representational difference analysis." Cancer Res 58(4):743-52を参照）。試験を行った正常組織のパネルにおいて、精巣を除き、ＭＡＧＥ−Ｃ１を発現しなかった。腫瘍サンプルのうち、ＭＡＧＥ−Ｃ１はセミノーム、メラノーマ、および膀胱癌で高頻度に発現した。また、頭頚部癌、乳癌、非小肺癌、前立腺腺癌および肉腫でもかなりの割合で発現した。Ｊｕｎｇｂｌｕｔｈ，Ｃｈｅｎら（２００２）は、乳癌、卵巣癌、肝臓癌、精巣癌、膀胱癌、メラノーマおよび非小細胞肺癌（３９％）での発現を開示している（Jungbluth, A. A.,Y. T. Chenら(2002). "CT7 (MAGE-C1) antigen expressionin normal and neoplastic tissues." Int J Cancer 99(6):839-45を参照）。Ｇｕｒｅ
，Ｃｈｕａら（２００５）は、癌精巣抗原の発現に関して５２３人もの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者の腫瘍を分析した（Gure, A. O.,R. Chua et al. (2005). "Cancer-testis genes are coordinately expressed and are markers of poor outcome in non-small-cell lung carcinoma." Clin Cancer Res 11(22):8055-62を参照）。ＭＡＧＥ−Ｃ１は１８，８％の患者に存在した。Ｓｃａｎｌａｎ，Ａｌｔｏｒｋｉら（２０００）はさらに、３３の非小細胞肺癌におけるＣＴ抗原の発現を報告した：ＭＡＧＥ−Ｃ１：３０％（Scanlan, M. J.,N. K. Altorki et al. (2000). "Expression of cancer-testis antigens inlung carcinoma: definition of bromodomain testis-specific gene (BRDT) as a new CT gene, CT9." Cancer Lett 150(2):155-64を参照）。したがって、好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図２２に示す配列（配列番号２２）、より好ましくは図２３に示す配列（配列番号２３）、さらに好ましくは図２４に示す配列（配列番号２４）から選択されるＭＡＧＥ−Ｃ１抗原をコードし得る。さらに好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図２２に示すＭＡＧＥ−Ｃ１配列（配列番号２２）、より好ましくは図２３に示すＭＡＧＥ−Ｃ１配列（配列番号２３）、さらに好ましくは図２４に示すＭＡＧＥ−Ｃ１配列（配列番号２４）のフラグメント、変異体、もしくはエピトープから選択されるＭＡＧＥ−Ｃ１抗原を代替的にまたは付加的にコードし得る。

【0030】

活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、さらにＭＡＧＥ−Ｃ２をコードし得る。本発明の記載内容において、「ＭＡＧＥ−Ｃ２」はメラノーマ抗原ファミリーＣ２であり、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物に用いられる場合、「ＭＡＧＥ−Ｃ２」をコードするＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の好ましい配列は、図２５に示す配列（配列番号２５）であり、より好ましくは図２６に示す配列（配列番号２６）である。Ｌｕｃａｓ，Ｄｅ Ｐｌａｅｎら（２０００）は、メラノーマ細胞系にＲＤＡを行うことで、最近、ＭＡＧＥ−Ｃ２を同定した（Lucas, S.,E. De Plaen et al. (2000). "MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C2, and MAGE-C3: four new members of the MAGE family with tumor-specific expression." Int J Cancer 87(1):55-60を参照）。ＭＡＧＥ−Ｃ２は、試験を行った正常組織のパネルにおいては、精巣を除き、発現しなかった。腫瘍サンプルのうち、ＭＡＧＥ−Ｃ２はセミノーム、メラノーマ、および膀胱癌から高頻度に発現した。また、頭頚部癌、乳癌、非小肺癌および肉腫においてもかなりの割合で発現した。Ｓｃａｎｌａｎ，Ａｌｔｏｒｋｉら（２０００）は、３３の非小細胞肺癌におけるＣＴ抗原の発現を報告した：ＭＡＧＥ−Ｃ２：３０％（Scanlan, M. J.,N. K. Altorki et al. (2000). "Expression of cancer-testis antigens in lung carcinoma: definition of bromodomain testis-specific gene (BRDT) as a new CT gene, CT9." Cancer Lett 150(2):155-64を参照）。したがって、好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図２５に示す配列（配列番号２５）、より好ましくは図２６に示す配列（配列番号２６）から選択されるＭＡＧＥ−Ｃ２抗原をコードし得る。さらに好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、図２５に示すＭＡＧＥ−Ｃ２配列（配列番号２５）、より好ましくは図２６に示すＭＡＧＥ−Ｃ２配列（配列番号２６）のフラグメント、変異体またはエピトープから選択されるＭＡＧＥ−Ｃ２抗原を代替的にまたは付加的にコードし得る。

【0031】

上記規定の、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡがコードし得る抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドは、これらの配列のフラグメントまたは変異体を含んでいてもよい。このようなフラグメントまたは変異体は、一般的に、上記記載の抗原、抗原タンパク質、抗原ペプチド、配列、またはそれらをコードする核酸配列のいずれか１つと、核酸レベルもしくはアミノ酸レベルにおいて、野生型配列全体に対して少なくとも５％，１０％，２０％，３０％，４０％，５０％，６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、同様により好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％またはさらに９７％の配列相同性を有する配列を含み得る。

【0032】

本発明の記載内容における抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドの「フラグメント」は、上記に定義した抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドの配列を含み得、この配列は、アミノ酸配列（またはこれをコードする核酸配列）に関して、オリジナル（ネイティブ）タンパク質（もしくはこれをコードする核酸配列）のアミノ酸配列と比べてＮ末端、Ｃ末端、および／または配列内にてトランケートされている（truncated）ものである。このようなトランケーション（truncation）は、アミノ酸レベルもしくは対応する核酸レベルにおいて起こり得る。したがって、上記規定のフラグメントの配列相同性は、好ましくは上記規定の抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチド全体、もしくはそのような抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドの（コードする）核酸配列全体を参照している。

【0033】

本発明の記載内容における抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドのフラグメントは、さらに、アミノ酸をおよそ６からおよそ２０もしくはそれ以上の長さを有する上記規定の抗原、抗原タンパク質もしくは抗原ペプチドの配列を含んでいてもよい。例えば、ＭＨＣクラスＩ分子によって処理・提示された、好ましくはおよそ８からおよそ１０、例えば８、９、もしくは１０のアミノ酸（または６、７、１１、もしくは１２のアミノ酸）の長さを有するフラグメント、または、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって処理・提示された、好ましくは１３以上のアミノ酸の長さ、例えば１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくはそれ以上のアミノ酸を有するフラグメントが挙げられる。これらのフラグメントはアミノ酸配列のいずれの部分からも選択され得る。これらのフラグメントは、一般的にペプチドフラグメントとＭＨＣ分子とからなる複合体としてＴ細胞内に認識される。すなわち、フラグメントは一般的に、ネイティブ形態では認識されない。

【0034】

本明細書に記載の抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドのフラグメントはまた、これらの抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドのエピトープを含み得る。本発明の記載内容におけるエピトープ（「抗原決定基」とも呼ばれる）とは、本明細書に記載の（ネイティブ）抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドの外面に位置する、好ましくはアミノ酸を５〜１５、より好ましくはアミノ酸を５〜１２、さらに好ましくはアミノ酸を６〜９有するフラグメントであり、抗体またはＢ細胞受容体として、すなわちネイティブ形態で認識され得るフラグメントである。抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドのこのようなエピトープは、さらにこのような抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドの、本明細書中に記載の変異体から選択されてもよい。本明細書において、抗原決定基は、本明細書に規定されている抗原、抗原タンパク質もしくは抗原ペプチドのアミノ酸配列において不連続な、本明細書において規定されている抗原、抗原タンパク質もしくは抗原ペプチドの分節を三次元構造として組み合わせることで形成される高次構造的または不連続エピトープか、単一のポリペプチド鎖からなる連続もしくは直線エピトープであり得る。

【0035】

上記規定の抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドの「変異体」は、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡによってコードされ得る。この場合、上記で規定されている抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドをコードする少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡの核酸が入れ替えられている。このようにして、例えば１つ以上のアミノ酸を置換、挿入および／または欠失したアミノ酸配列を有する、１つ以上の変異でオリジナルの配列と異なるアミノ酸配列を有する抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドを生成することができる。これらのフラグメントおよび／または変異体は、全長ネイティブ抗原もしくは抗原タンパク質と同一の生体作用または特異的活性、例えば特異的抗原特性を有することが好ましい。

【0036】

本発明に係る活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡはさらに、コードするアミノ酸配列が生理学的配列と比較して同類アミノ酸置換を有する、上記で規定した抗原または抗原タンパク質をコードし得る。これらをコードするヌクレオチド配列およびこれらのコードされたアミノ酸配列は特に、上記で規定した変異体に該当する。同一クラスから派生するアミノ酸が入れ替えられる置換は、同類置換と呼ばれる。特に、これらは脂肪族側鎖を有するアミノ酸、ポジティブもしくはネガティブにチャージされた側鎖を有するアミノ酸、もしくは側鎖に芳香族基を有するアミノ酸、またはヒドロキシルブリッジに入り込める側鎖（例えばヒドロキシル機能を有する側鎖）を有するアミノ酸である。つまりは、例えば極性側鎖を有するアミノ酸が同様に極性側鎖を有する別のアミノ酸と置き換えられるか、または、例えば疎水性側鎖で特徴付けられるアミノ酸が同様の疎水性側鎖を有する別のアミノ酸と置換される（例えば、セリン（トレオニン）とトレオニン（セリン）またはロイシン（イソロイシン）とイソロイシン（ロイシン））。挿入および置換は、特に、三次元構造に変化を生じさせない配列位置、または結合領域に影響を与えない位置で可能である。挿入または欠失による三次元構造の変化は、例えばＣＤスペクトル（円二色性スペクトル）を用いて容易に判定できる（Urry, 1985, Absorption, Circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modern Physical Methods in Biochemistry, Neuberger et al. (ed.), Elsevier, Amsterdam）。

【0037】

さらに、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡによってコードされ得る上記で規定した抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドの変異体は、抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドがそれぞれ変更されることなく、遺伝暗号の縮重に応じて上記少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡの核酸が入れ替えられたこれらの配列を含み得る。すなわち、上記意味においてアミノ酸配列または少なくともその一部では、１つ以上の変異においてオリジナル配列と異ならないこともある。

【0038】

２つの配列（例えば本明細書に規定したＲＮＡもしくはｍＲＮＡ配列等の核酸配列、またはアミノ酸配列、好ましくは上記で規定した抗原、抗原タンパク質もしくは抗原ペプチドのアミノ酸配列などのコードされたアミノ酸配列）における一致の割合を決定するべく、配列を順番に並べ、続いて互いに比較する。こうすることで、例えば、第一の配列にギャップを挿入することができ、第二の配列の対応する位置の要素を比較することができる。第一の配列の位置が第二の配列の対応する位置と同じ要素によって占められている場合は、２つの配列はこの位置で同一である。２つの配列が同一かどうかの率は、同一である位置の数を位置の合計数で割った数である。２つの配列が同一である割合は、数学的アルゴリズムによって算出することができる。使用可能な数学的アルゴリズムの例としてＫａｒｌｉｎら（１９９３），ＰＮＡＳ ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７またはＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２が好ましいが、これに特に限定されない。このようなアルゴリズムはＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。このプログラムによって、ある一定の範囲まで本発明の配列と同一である配列を同定することができる。

【0039】

上記に規定したとおり、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物は、上記群の抗原の中から選択されるいずれか少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを有する。なぜなら、本発明によれば、上記群の少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原からなる特定の組み合わせは、肺癌、特に非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を治療する（獲得）免疫システムを効率的に刺激するからである。しかしながら、本発明は、上記群の抗原のいずれもから選択される３，４，５，６，７，８，９，１０，１１または１２の（好ましくは異なる）抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡを有する活性（免疫賦活）組成物を提供することができ、これら抗原のいかなる組み合わせも可能であり、想定される。

【0040】

特に好ましい実施形態によれば、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、下記抗原からなるサブグループより選択されるいかなる抗原の少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードし得る：
・ｈＴＥＲＴ、
・ＷＴ１、
・５Ｔ４、
・ＮＹ−ＥＳＯ−１、
・Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、および／または
・ＭＡＧＥ−Ｃ２。

【0041】

より好ましくは、本発明はまた、上記群もしくはサブグループのいかなる抗原から選択される少なくとも３，４，５または６の（好ましくは異なる）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む活性（免疫賦活）組成物を提供し得る。なお、これら抗原のいかなる組み合わせをも可能である。

【0042】

したがって、他の特に好ましい実施形態によって、本発明の上記活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、下記の抗原の組み合わせを（少なくとも）いずれか１つ含む上記群またはサブグループの抗原のいずれもから選択される少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードし得る：
・ｈＴＥＲＴおよびＷＴ１、もしくは
・ｈＴＥＲＴおよび５Ｔ４、もしくは
・ｈＴＥＲＴおよびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ｈＴＥＲＴおよびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１および５Ｔ４、もしくは
・ＷＴ１およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ＷＴ１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＷＴ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・５Ｔ４およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・５Ｔ４およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・５Ｔ４およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、
または
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１および５Ｔ４、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，５Ｔ４，およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，５Ｔ４，およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，５Ｔ４，およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ，およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１，５Ｔ４およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ＷＴ１，５Ｔ４およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＷＴ１，５Ｔ４およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＷＴ１，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・５Ｔ４，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・５Ｔ４，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・５Ｔ４，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、
または
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，５Ｔ４およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，５Ｔ４およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，５Ｔ４およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，５Ｔ４，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，５Ｔ４，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１，５Ｔ４，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＷＴ１，５Ｔ４，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１，５Ｔ４，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・５Ｔ４，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、
または
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，５Ｔ４，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，５Ｔ４，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１，５Ｔ４，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、
または
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，５Ｔ４，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２。

【0043】

より好ましくは、本発明の上記活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、下記抗原の組み合わせの（少なくとも）いずれか１つを含む上記群またはサブグループの抗原のいずれもから排他的に選択される少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードし得る：
・ｈＴＥＲＴおよびＷＴ１、もしくは
・ｈＴＥＲＴおよび５Ｔ４、もしくは
・ｈＴＥＲＴおよびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ｈＴＥＲＴおよびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１および５Ｔ４、もしくは
・ＷＴ１およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ＷＴ１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＷＴ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・５Ｔ４およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・５Ｔ４およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・５Ｔ４およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、
または
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１および５Ｔ４、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，５Ｔ４，およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，５Ｔ４，およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，５Ｔ４，およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ，およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１，５Ｔ４およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ＷＴ１，５Ｔ４およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＷＴ１，５Ｔ４およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＷＴ１，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・５Ｔ４，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・５Ｔ４，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・５Ｔ４，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、
または
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，５Ｔ４およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，５Ｔ４およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，５Ｔ４およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，５Ｔ４，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，５Ｔ４，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１，５Ｔ４，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＷＴ１，５Ｔ４，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１，５Ｔ４，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・５Ｔ４，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、
または
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，５Ｔ４，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，５Ｔ４，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１，５Ｔ４，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、
または
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，５Ｔ４，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２。

【0044】

さらに好ましい実施形態によれば、本発明は少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡを有する活性（免疫賦活）組成物を提供し、
ａ）上記少なくとも２つの抗原のうち、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、３つ、４つ、５つまたは６つが、
・５Ｔ４、
・ＮＹ−ＥＳＯ−１、
・ＭＡＧＥ−Ａ２、
・ＭＡＧＥ−Ａ３、
・ＭＡＧＥ−Ｃ１、および／または
・ＭＡＧＥ−Ｃ２から選択され、
ｂ）さらなる抗原が、本明細書に規定した少なくとも１つの抗原、好ましくは、本明細書中に記載の抗原の組み合わせ、群またはサブグループのいずれもから選択され、例えば、上記さらなる抗原は、
・ｈＴＥＲＴ、
・ＷＴ１、
・ＭＡＧＥ−Ａ２、
・５Ｔ４、
・ＭＡＧＥ−Ａ３、
・ＭＵＣ１、
・Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、
・ＮＹ−ＥＳＯ−１、
・ＣＥＡ、
・Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、
・ＭＡＧＥ−Ｃ１、および／または
・ＭＡＧＥ−Ｃ２
から選択される。

【0045】

さらに好ましい実施形態によれば、ａ）に係る上記少なくとも１つの抗原は、
・ＮＹ−ＥＳＯ−１、
・ＭＡＧＥ−Ｃ１、および／または
・ＭＡＧＥ−Ｃ２
から選択される。

【0046】

他の好ましい実施形態によれば、ａ）に係る上記少なくとも１つの抗原は、
・ＭＡＧＥ−Ｃ１、および／または
・ＭＡＧＥ−Ｃ２
から選択される。

【0047】

他の好ましい実施形態によれば、ｂ）に係る上記少なくとも１つの抗原は、以下の組み合わせのいずれか１つに規定された一つまたは複数の抗原から選択される：
・ｈＴＥＲＴおよびＷＴ１、もしくは
・ｈＴＥＲＴおよびＭＡＧＥ−Ａ２、もしくは
・ｈＴＥＲＴおよび５Ｔ４、もしくは
・ｈＴＥＲＴおよびＭＡＧＥ−Ａ３、もしくは
・ｈＴＥＲＴおよびＭＵＣ１、もしくは
・ｈＴＥＲＴおよびＨｅｒ−２／ｎｅｕ、もしくは
・ｈＴＥＲＴおよびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ｈＴＥＲＴおよびＣＥＡ、もしくは
・ｈＴＥＲＴおよびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ｈＴＥＲＴおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１およびＭＡＧＥ−Ａ２、もしくは
・ＷＴ１および５Ｔ４、もしくは
・ＷＴ１およびＭＡＧＥ−Ａ３、もしくは
・ＷＴ１およびＭＵＣ１、もしくは
・ＷＴ１およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ、もしくは
・ＷＴ１およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ＷＴ１およびＣＥＡ、もしくは
・ＷＴ１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＷＴ１およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＷＴ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２および５Ｔ４、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２およびＭＡＧＥ−Ａ３、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２およびＭＵＣ１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２およびＣＥＡ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・５Ｔ４およびＭＡＧＥ−Ａ３、もしくは
・５Ｔ４およびＭＵＣ１、もしくは
・５Ｔ４およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ、もしくは
・５Ｔ４およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・５Ｔ４およびＣＥＡ、もしくは
・５Ｔ４およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・５Ｔ４およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・５Ｔ４およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＵＣ１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３およびＣＥＡ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＡＧＥ−Ｃ１
・ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＡＧＥ−Ｃ２
・ＭＵＣ１およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ、もしくは
・ＭＵＣ１およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ＭＵＣ１およびＣＥＡ、もしくは
・ＭＵＣ１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＭＵＣ１およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＭＵＣ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＨＥＲ−２／ＮＥＵおよびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ＨＥＲ−２／ＮＥＵおよびＣＥＡ、もしくは
・ＨＥＲ−２／ＮＥＵおよびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＨＥＲ−２／ＮＥＵおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＨＥＲ−２／ＮＥＵおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＣＥＡ、もしくは
・ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＣＥＡおよびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＣＥＡおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＣＥＡおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ｃ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、
または
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１およびＭＡＧＥ−Ａ２、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１および５Ｔ４、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１およびＭＡＧＥ−Ａ３、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１およびＭＵＣ１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１およびＣＥＡ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２および５Ｔ４、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２およびＭＡＧＥ−Ａ３、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２およびＭＵＣ１、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２およびＣＥＡ、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＭＡＧＥ−Ａ３、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＭＵＣ１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＣＥＡ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＵＣ１、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＣＥＡ、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＣＥＡ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＣＥＡ、もしくは
・ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＨＥＲ−２／ＮＥＵ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＣＥＡ、もしくは
・ＨＥＲ−２／ＮＥＵ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＨＥＲ−２／ＮＥＵ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＨＥＲ−２／ＮＥＵ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＣＥＡ，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＣＥＡ，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・Ｓｕｒｖｉｖｉｎ，ＭＡＧＥ−Ｃ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、
または
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２および５Ｔ４、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２およびＭＡＧＥ−Ａ３、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２およびＭＵＣ１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２およびＣＥＡ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＭＡＧＥ−Ａ３、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＭＵＣ１、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＣＥＡ、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＵＣ１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＣＥＡ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＣＥＡ、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＣＥＡ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＣＥＡ、もしくは
・ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＨＥＲ−２／ＮＥＵ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＨＥＲ−２／ＮＥＵ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＨＥＲ−２／ＮＥＵ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＣＥＡ，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ，ＭＡＧＥ−Ｃ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、
または
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＭＡＧＥ−Ａ３、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＭＵＣ１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＣＥＡ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＵＣ１、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＣＥＡ、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＣＥＡ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＣＥＡ、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＣＥＡ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＨＥＲ−２／ＮＥＵ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＨＥＲ−２／ＮＥＵ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ，ＭＡＧＥ−Ｃ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、
または
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＵＣ１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＣＥＡ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＣＥＡ、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＣＥＡ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＣＥＡ、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＨＥＲ−２／ＮＥＵ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ，ＭＡＧＥ−Ｃ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、
または
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＣＥＡ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＣＥＡ、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＣＥＡ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ，ＭＡＧＥ−Ｃ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、
または
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＮＹ−ＥＳＯ−１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＣＥＡ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＣＥＡ、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２；もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ，ＭＡＧＥ−Ｃ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、
または
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＣＥＡ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ，ＭＡＧＥ−Ｃ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、
または
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＳｕｒｖｉｖｉｎ、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ，ＭＡＧＥ−Ｃ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、
または
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ１、もしくは
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＭＡＧＥ−Ｃ２、もしくは
・ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ，ＭＡＧＥ−Ｃ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２、
または
・ｈＴＥＲＴ，ＷＴ１，ＭＡＧＥ−Ａ２，５Ｔ４，ＭＡＧＥ−Ａ３，ＭＵＣ１，Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，ＮＹ−ＥＳＯ−１，ＣＥＡ，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ，ＭＡＧＥ−Ｃ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２。

【0048】

他の特に好ましい実施形態によれば、ｂ）に係る上記少なくとも１つの抗原は、上記で規定した抗原の以下の特定の組み合わせから選択される：
・Ｓｕｒｖｉｖｉｎおよび５Ｔ４。

【0049】

本発明に係る上記活性（免疫賦活）組成物の上記少なくとも１つのＲＮＡは、一般的にいかなるＲＮＡであってもよく、好ましくは、これに限定されないが、コーディングＲＮＡ、環状もしくは直線状ＲＮＡ、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡ（２つの一本鎖ＲＮＡの非共有結合性会合によるＲＮＡも考えられ得る）、または少なくとも部分的に自己相補的である、部分的に二本鎖もしくは部分的に一本鎖のＲＮＡである。なお、部分的に二本鎖もしくは部分的に一本鎖のＲＮＡ分子は一般的に、長さの異なる一本鎖ＲＮＡ分子または同じ長さを有する２本の一本鎖ＲＮＡ分子からなり、一方の一本鎖ＲＮＡ分子が他方の一本鎖ＲＮＡ分子と部分的に相補的であり、両方でその領域に二本鎖ＲＮＡを形成する、すなわち、ＲＮＡ配列全体に対して部分的に二本鎖もしくは部分的に一本鎖のＲＮＡを形成する。より好ましくは、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは一本鎖ＲＮＡであり、さらに好ましくは直線状ＲＮＡである。本発明に係る活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であることが最も好ましい。本明細書において、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は一般的に（少なくとも）いくつかの構成要素からなるＲＮＡであり、例えば任意的な５’−ＵＴＲ領域、上流に位置するリボソーム結合部位とその後に続くコード領域、ポリ−Ａ尾部（および／またはポリ−Ｃ−尾部）が続き得る任意的な３’−ＵＴＲ領域などによって構成される。

【0050】

特に好ましい一実施形態によって、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原は、それぞれ１つの（単シストロン性）ＲＮＡ、好ましくは１つの（単シストロン性）ｍＲＮＡによってコードされる。言い換えると、本発明の活性（免疫賦活）組成物は、少なくとも２つの（単シストロン性）ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを有し、少なくとも２つの（単シストロン性）ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、それぞれ上述の群もしくはサブグループのいずれか１つ、好ましくは上述の組み合わせの中の１つから選択される（好ましくは異なる）抗原を１つだけコードし得る。

【0051】

他の特に好ましい実施形態によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物は、（少なくとも）１つのバイシストロン性または多シストロン性ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ、すなわち、上述の群もしくはサブグループのいずれか１つから、好ましくは上述の組み合わせの中の１つから選択される少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原のコード配列を２つ以上有する（少なくとも）１つのＲＮＡを含んでいてもよい。このような、（少なくとも）１つのバイシストロン性または多シストロン性ＲＮＡの少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原のコード配列は、後述の少なくとも１つのＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）配列によって分離されてもよい。したがって、「少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする」という表現は、上記（少なくとも）１つの（バイシストロン性または多シストロン性）ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡが、例えば上述の抗原の群の少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１または１２の（好ましくは異なる）抗原または上述の規定に含まれるこれらのフラグメントもしくは変異体をコードし得ることを意味し得るが、これに限定されない。より好ましくは、上記（少なくとも）１つの（バイシストロン性またはさらに多シストロン性）ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡが、例えば、上述の抗原のサブグループまたは上記規定に含まれるフラグメントもしくは変異体の中の、少なくとも２，３，４，５または６の（好ましくは異なる）抗原をコードし得ることを意味し得るが、これに限定されない。本明細書において、上記で規定したいわゆるＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）配列は、単独のリボソーム結合部位として機能し得るが、それぞれがリボソームによって翻訳されるいくつかのタンパク質をコードするバイシストロン性または多シストロン性ＲＮＡとなるように機能してもよい。本発明に用いられるＩＲＥＳ配列の例としては、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）、ペスチウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、古典的豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）のＩＲＥＳ配列が挙げられる。

【0052】

さらに特に好ましい実施形態によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物は、上記で規定したような少なくとも１つの単シストロン性ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡと、上記で規定したような少なくとも１つのバイシストロン性または多シストロン性ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡとの混合物を含み得る。上記少なくとも１つの単シストロン性ＲＮＡおよび／または上記少なくとも１つのバイシストロン性または多シストロン性ＲＮＡは、異なる抗原または上記規定に含まれるそのフラグメントもしくは変異体をコードすることが好ましく、抗原は上述の抗原の群またはサブグループのいずれか１つから選択されることが好ましく、上記記載の組み合わせのいずれか１つから選択されることがより好ましい。しかしながら、本発明の活性（免疫賦活）組成物が全体として上記で規定した少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原を提供していれば、少なくとも１つの単シストロン性ＲＮＡおよび少なくとも１つのバイシストロン性または多シストロン性ＲＮＡは、上述の抗原の群またはサブグループのいずれか１つ、好ましくは上述の組み合わせのいずれか１つから選択される同一の抗原を（部分的に）コードすることもできる。このような実施形態は、本発明の活性（免疫賦活）組成物を、それを必要としている患者に例えば時間依存的等、時差的に投与する際に有効である。このような本発明の活性（免疫賦活）組成物の成分、特に少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする異なるＲＮＡは、例えば部分組成物のキット（の異なる部分）内に含まれていたり、本発明に係る別の活性（免疫賦活）組成物として個別に投与されたりしてもよい。

【0053】

上記で規定した抗原の群またはサブグループから、より好ましくは上述の組み合わせの中から選択される少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、一般的に約５０〜約２００００、または約１００〜約２００００のヌクレオチド、好ましくは約２５０〜約２００００のヌクレオチド、より好ましくは約５００〜約１００００、さらに好ましくは約５００〜約５０００の長さを有している。

【0054】

一実施形態によれば、上記で規定した抗原の群もしくはサブグループ、より好ましくは上述の組み合わせの中から選択される少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、修飾ＲＮＡであってもよく、本明細書中に規定した任意の修飾が活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡに導入され得る。本明細書中に規定した修飾は、好ましくは本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡの安定化をもたらす。

【0055】

第１の実施形態によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、「安定化ＲＮＡ」、好ましくは安定化ｍＲＮＡとして、つまりはｉｎ ｖｉｖｏ分解（例えば、エキソヌクレアーゼもしくはエンドヌクレアーゼによる分解）に対して基本的に耐性である（ｍ）ＲＮＡとしてもたらされてもよい。このような安定は、例えば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡの修飾リン酸骨格によってもたらされる。本発明に関連する骨格修飾は、ＲＮＡに含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸が化学修飾されている修飾である。この関連で好ましく用いられるヌクレオチドは、ホスホロチオネート修飾リン酸骨格等、リン酸骨格に含まれる少なくとも１つのリン酸酸素が好ましくは硫黄原子と入れ替えられているリン酸骨格を含んでいる。安定化（ｍ）ＲＮＡはさらに、例えば、荷電ホスホネート酸素がアルキルまたはアリール基と入れ替えられているアルキルおよびアリールホスホネート、または荷電酸素残基がアルキル化された状態で存在するリン酸ジエステルおよびアルキルリン酸トリエステルなどの、非イオン性リン酸類似体をさらに含んでいてもよい。このような骨格修飾は一般的に、メチルホスホネート、ホスホアミデートおよびホスホロチオネート（例えば、シチジン−５’−Ｏ−（１−チオリン酸塩））からなる群からの修飾を含むが、これに限定されない。

【0056】

本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、付加的にまたは代替的に糖修飾を含み得る。本発明に関連する糖修飾は、少なくとも１つのＲＮＡのヌクレオチドの糖を化学修飾したものであり、一般的には、２’−デオキシ−２’−フルオロ−オリゴリボヌクレオチド（２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸塩、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸塩）、２’−デオキシ−２’−デアミンオリゴリボヌクレオチド（２’−アミノ−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸塩、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸塩）、２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルシチジン−５’−三リン酸塩、２’−メチルウリジン−５’−三リン酸塩）、２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、およびこれらの異性体（２’−アラシチジン−５’−三リン酸塩、２’−アラウリジン−５’−三リン酸塩）、またはアジド三リン酸塩（２’−アジド−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸塩、２’−アジド−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸塩）からなる群より選択される糖修飾を含むが、これに限定されない。

【0057】

本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡはまた、少なくとも１つの塩基修飾を付加的または代替的に含んでいてもよい。この塩基修飾は、変更されていない、すなわち本来（＝ネイティブ）のＲＮＡ配列と比べて、少なくとも１つのＲＮＡ配列によってコードされているタンパク質の発現を著しく上昇させるのに適している。この場合での「著しく」は、ネイティブＲＮＡ配列の発現と比べて、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％もしくは６０％、より好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは１００％そして最も好ましくは少なくとも１５０％、２００％もしくは３００％かそれ以上、タンパク質の発現が上昇することを意味する。本発明と関連して、このような塩基修飾を有するヌクレオチドは、以下からなる塩基修飾ヌクレオチドの群から選択されることが好ましい：２−アミノ−６−クロロプリンリボシド−５’−三リン酸塩、２−アミノアデノシン−５’−三リン酸塩、２−チオシチジン−５’−三リン酸塩、２−チオウリジン−５’−三リン酸塩、４−チオウリジン−５’−三リン酸塩、５−アミノアリルシチジン−５’−三リン酸塩、５−アミノアリルウリジン−５’−三リン酸塩、５−ブロモシチジン−５’−三リン酸塩、５−ブロモウリジン−５’−三リン酸塩、５−ヨードシチジン−５’−三リン酸塩、５−ヨードウリジン−５’−三リン酸塩、５−メチルシチジン−５’−三リン酸塩、５−メチルウリジン−５’−三リン酸塩、６−アザシチジン−５’−三リン酸塩、６−アザウリジン−５’−三リン酸塩、６−クロロプリンリボシド−５’−三リン酸塩、７−デアザアデノシン−５’−三リン酸塩、７−デアザグアノシン−５’−三リン酸塩、８−アザアデノシン−５’−三リン酸塩、８−アジドアデノシン−５’−三リン酸塩、ベンゾイミダゾール−リボシド−５’−三リン酸塩、Ｎ１−メチルアデノシン−５’−三リン酸塩、Ｎ１−メチルグアノシン−５’−三リン酸塩、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−三リン酸塩、Ｏ６−メチルグアノシン−５’−三リン酸塩、プソイドウリジン−５’−三リン酸塩，およびプロマイシン−５’−三リン酸塩、キサントシン−５’−三リン酸塩。特に、５−メチルシチジン−５’−三リン酸塩、７−デアザグアノシン−５’−三リン酸塩、５−ブロモシチジン−５’−三リン酸塩、およびプソイドウリジン−５’−三リン酸塩からなる塩基修飾ヌクレオチドの群より選択される、塩基修飾用のヌクレオチドが好ましい。

【0058】

他の実施形態によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、リボースまたは塩基構成成分の修飾を含む修飾ヌクレオチドをさらに導入することによって、同様に修飾（および好ましくは安定化）することができる。一般的に、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡは、グアノシン、ウラシル、アデノシン、および／またはシトシンまたはその類似体等、いかなるネイティブ（＝天然の）ヌクレオチドを含み得る。これに関連して、ヌクレオチド類似体は天然のヌクレオチドの非自然発生変異体として定義される。したがって、類似体は、非自然発生官能基を有する化学的に誘導体化されたヌクレオチドである。非自然発生官能基は、天然のヌクレオチドに付加されるかもしくは天然のヌクレオチドから取り除かれたもの、または天然のヌクレオチドの自然発生官能基と置換されたものであることが好ましい。そのため、天然のヌクレオチドの各構成要素、すなわち、ＲＮＡ配列の骨格（上記参照）を形成する塩基構成要素、糖（リボース）構成要素および／またはリン酸構成要素は、修飾されていてもよい。グアノシン、ウラシル、アデノシン、およびシトシンの類似体は、アセチル化、メチル化、ヒドロキシ化等、化学的に改変された、天然のまたは非天然のグアノシン、ウラシル、アデノシン、チミジンまたはシトシンを含み、これに限定されることはないが、例えば、１−メチル−アデノシン、１−メチル−グアノシン、１−メチル−イノシン、２，２−ジメチル−グアノシン、２，６−ジアミノプリン，２’−アミノ−２’−デオキシアデノシン、２’−アミノ−２’−デオキシシチジン、２’−アミノ−２’−デオキシグアノシン、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド、２−アミノプリン−リボシド、２’−アラアデノシン、２’−アラシチジン、２’−アラウリジン、２’−アジド−２’−デオキシアデノシン、２’−アジド−２’−デオキシシチジン、２’−アジド−２’−デオキシグアノシン、２’−アジド−２’−デオキシウリジン、２−クロロアデノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシアデノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン、２’−フルオロ−２’−デオキシグアノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン、２’−フルオロチミジン、２−メチル−アデノシン、２−メチル−グアノシン、２−メチル−チオ−Ｎ６−イソペネニル−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−２−アミノアデノシン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシアデノシン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシシチジン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシグアノシン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシウリジン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルイノシン、２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン、２−チオシチジン、２−チオ−シトシン、３−メチル−シトシン、４−アセチル−シトシン、４−チオウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−ウラシル、５，６−ジヒドロウリジン、５−アミノアリルシチジン、５−アミノアリル−デオキシ−ウリジン、５−ブロモウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、５−クロロ−アラ−シトシン、５−フルオロ−ウリジン、５−ヨードウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン、５−メトキシ−ウリジン、５−メチル−２−チオ−ウリジン、６−アザシチジン、６−アザウリジン、６−クロロ−７−デアザ−グアノシン、６−クロロプリンリボシド、６−メルカプト−グアノシン、６−メチル−メルカプトプリン−リボシド、７−デアザ−２’−デオキシ−グアノシン、７−デアザアデノシン、７−メチル−グアノシン、８−アザアデノシン、８−ブロモ−アデノシン、８−ブロモ−グアノシン、８−メルカプト−グアノシン、８−オキソグアノシン、ベンゾイミダゾール−リボシド、ベータ−Ｄ−マンノシル−キュェオシン，ジヒドロ−ウラシル、イノシン、Ｎ１−メチルアデノシン、Ｎ６−（［６−アミノヘキシル］カルバモイルメチル）−アデノシン、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン、Ｎ６−メチル−アデノシン、Ｎ７−メチル−キサントシン、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、プロマイシン、キュェオシン，ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ワイブトキソシン，キサントシン，およびキシロ−アデノシンを含む。このような類似体の調製は、米国特許第４，３７３，０７１号、第４，４０１，７９６号、第４，４１５，７３２号、第４，４５８，０６６号、第４，５００，７０７号、第４，６６８，７７７号、第４，９７３，６７９号、第５，０４７，５２４号、第５，１３２，４１８号、第５，１５３，３１９号、第５，２６２，５３０号、および第５，７００，６４２号等により、当事者に公知である。上記で規定した類似体の場合、本発明の活性（免疫賦活）組成物のＲＮＡの免疫原性を向上させ、および／またはすでに導入されているＲＮＡにおけるさらなる修飾を妨害しないものが、本発明に従って類似体に付与されることがとりわけ好ましい。

【0059】

特定の実施形態によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、脂質修飾を含むことができる。このような脂質修飾ＲＮＡは一般的に、本明細書に規定した、上記規定の抗原の群またはサブグループから、好ましくは組み合わせの中から選択される少なくとも２つの抗原をコードするＲＮＡを含んでいる。このような脂質修飾ＲＮＡはさらに、そのＲＮＡと共有結合するリンカーを少なくとも１つ、および対応するリンカーと共有結合する脂質を少なくとも１つ含んでいることが一般的である。あるいは、脂質修飾ＲＮＡは、本明細書に規定した少なくとも１つのＲＮＡ、およびそのＲＮＡと（リンカーなしで）共有結合している少なくとも１つの（二機能性）脂質を含む。第３の選択肢によれば、脂質修飾ＲＮＡは、本明細書に規定したＲＮＡ、そのＲＮＡと共有結合しているリンカーを少なくとも１つ、および対応するリンカーと共有結合している脂質を少なくとも１つ、そしてさらにそのＲＮＡと（リンカーなしで）共有結合している（二機能性）脂質を少なくとも１つ、含んでいる。

【0060】

本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡに含まれている（複合化または共有結合している）脂質は、一般的に、好ましくはそれ自身で生物学的に活性のある脂質または親油性残基である。このような脂質は、ＲＲＲ−アルファトコフェロール（旧Ｄ−アルファトコフェロール），Ｌ−アルファトコフェロール、Ｄ，Ｌ−アルファトコフェロールのラセミ化合物，ビタミンＥコハク酸塩（ＶＥＳ）等のアルファトコフェロール（ビタミンＥ）、レチノイン酸およびレチノール等のビタミンＡおよびその誘導体、ビタミンＤおよびそのエルゴステロール前駆体等のビタミンＤおよびその誘導体、ビタミンＥおよびその誘導体、もしくはビタミンＫならびに関連キノンもしくはフィトール化合物等のビタミンＫおよびその誘導体等のビタミン類、または、コール酸、デオキシコール酸、デヒドロコール酸等の胆汁酸、コーチゾン、ジゴキシゲニン、テストステロン、コレステロールまたはチオコレステロールといったステロイド類など、天然物質または天然化合物を含むことが好ましい。本発明の範囲内における他の脂質または親油性残基は、ポリアルキレングリコール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533）、ドデカンジオール、ヘキサデカノールまたはウンデシル残基等のＣ１−Ｃ２０−アルカン、Ｃ１−Ｃ２０−アルケンまたはＣ１−Ｃ２０−アルカノール化合物といった脂肪族基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10, 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49）、ホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール、スフィンゴ脂質、セレブロシド、ガングリオシド、もしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート等のリン脂質（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリアミンまたはポリアルキレングリコール（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969）、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、パルミチンもしくはパルミチル残基（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229）、オクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール残基（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923）、また、蝋、テルペン、脂環式炭化水素、飽和およびモノ不飽和もしくは多価不飽和脂肪酸残基等を含む。

【0061】

本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡが分解するのを回避するべく、様々な方法で安定化させることができる。一般的にｉｎ
ｖｉｖｏにおけるｍＲＮＡまたはＲＮＡの不安定性または（速い）分解はＲＮＡ系組成物を応用する際に深刻な問題を引き起こし得ることが知られている。このＲＮＡの不安定性は、一般的にＲＮＡ分解酵素「ＲＮＡａｓｅ」（リボヌクレアーゼ）によって引き起こされる。このようなリボヌクレアーゼのコンタミネーションがあると、溶液中のＲＮＡが完全に分解してしまう場合もある。したがって、細胞の細胞質内におけるｍＲＮＡの自然分解は非常に精巧に制御されており、上記組成物を用いる前に特別な処理、特にピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ）を用いて処理することで、ＲＮａｓｅのコンタミネーションを全般的に取り除くことができる。これに関連し、従来技術においてもいくつかの自然分解メカニズムが知られており、これらも同様に利用し得る。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて末端構造はｍＲＮＡにとって一般的に非常に重要である。例として、天然のｍＲＮＡの５’末端にはいわゆる「キャップ構造」（修飾グアノシンヌクレオチド）があり、３’末端は最大２００のアデノシンヌクレオチドの配列（いわゆるポリＡ尾部）である。

【0062】

したがって、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、特にｍＲＮＡとして提供される場合、いわゆる「５’キャップ」構造を付加することでＲＮａｓｅによる分解に対して安定化され得る。これに関連して、「５’キャップ」構造としてｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＡまたはＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが特に好ましい。しかしながら、このような修飾は、例えば脂質修飾等が本発明の免疫賦活組成物の（ｍ）ＲＮＡの５’末端にいまだ導入されていない場合、もしくはこの修飾が（未修飾もしくは化学的に修飾された）（ｍ）ＲＮＡの免疫原性に影響を与えない場合にのみ導入される。

【0063】

さらに好ましい実施形態によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡにおいて、特にＲＮＡがｍＲＮＡである場合、３’末端のポリＡ尾部は、一般的に約１０〜２００のアデノシンヌクレオチド、好ましくは約１０〜１００のアデノシンヌクレオチド、さらに好ましくは約２０〜１００のアデノシンヌクレオチド、またはよりさらに好ましくは約４０〜８０のアデノシンヌクレオチドを含み得る。

【0064】

さらに好ましい実施形態によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡにおいて、特にＲＮＡがｍＲＮＡである場合、３’末端のポリ−Ｃ尾部は一般的に約１０〜２００のシトシンヌクレオチド、好ましくは約１０〜１００のシトシンヌクレオチド、より好ましくは約２０〜７０シトシンヌクレオチド、またはよりさらに好ましくは約２０〜６０もしくは１０〜４０のシトシンヌクレオチドを含み得る。

【0065】

本発明の他の実施形態によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、修飾され、それにより安定化され得、特にＲＮＡがｍＲＮＡの形態である場合、ＲＮＡのＧ／Ｃ含量、好ましくは少なくとも１つのＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含量を改変することによって、安定化され得る。

【0066】

本発明の特に好ましい実施形態では、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含量は改変されており、特に、対応する野生型（ｍ）ＲＮＡすなわち未改変（ｍ）ＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含量と比べて、増加している。少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡにおけるコードされたアミノ酸配列は、対応する野生型（ｍ）ＲＮＡにおけるコードされたアミノ酸配列と比べて改変されていないことが好ましい。

【0067】

本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡの修飾は、翻訳されるあらゆる（ｍ）ＲＮＡ領域の配列が、その（ｍ）ＲＮＡの効率的な翻訳にとって重要であるという点に基づいて行われる。したがって、様々なヌクレオチドの組成物および配列が重要である。特に、Ｇ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含量が増加している配列はＡ（アデノシン）／Ｕ（ウラシル）含量が増加している配列よりも安定している。本発明によれば、（ｍ）ＲＮＡのコドンは、翻訳アミノ酸配列を保持しながらもＧ／Ｃヌクレオチド含量が増加しているように、その野生型（ｍ）ＲＮＡと比べて変化している。複数のコドンが１つの同一アミノ酸をコードすること（いわゆる、遺伝暗号の縮重）に留意して、安定性を得るのに最も適したコドンを決定することができる（いわゆる、代替コドンの使用）。

【0068】

少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡによってコードされているアミノ酸に応じて、少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡ配列における野生型配列と異なるような改変は、種々可能である。ＧまたはＣのヌクレオチドのみを含むコドンによってコードされるアミノ酸の場合、コドンを改変する必要は無い。したがって、Ｐｒｏ（ＣＣＣまたはＣＣＧ）、Ａｒｇ（ＣＧＣまたはＣＧＧ）、Ａｌａ（ＧＣＣまたはＧＣＧ）、およびＧｌｙ（ＧＧＣまたはＧＧＧ）のそれぞれのコドンは、ＡまたはＵが存在しないため、改変する必要がない。

【0069】

対照的に、Ａおよび／またはＵのヌクレオチドを含むコドンは、同一アミノ酸をコードする、Ａおよび／またはＵを含まないコドンと置換することで改変できる。これらの例として、以下が挙げられる：
Ｐｒｏのコドンは、ＣＣＵまたはＣＣＡからＣＣＣまたはＣＣＧに改変でき、
Ａｒｇのコドンは、ＣＧＵまたはＣＧＡまたはＡＧＡまたはＡＧＧからＣＧＣまたはＣＧＧに改変でき、
Ａｌａのコドンは、ＧＣＵまたはＧＣＡからＧＣＣまたはＧＣＧに改変でき、
Ｇｌｙのコドンは、ＧＧＵまたはＧＧＡからＧＧＣまたはＧＧＧに改変できる。

【0070】

他の場合では、コドンからＡまたはＵのヌクレオチドを排除することはできないものの、Ａおよび／またはＵのヌクレオチド含量のより少ないコドンを用いることで、ＡおよびＵ含量を減らすことができる。これらの例は以下のとおりである：
Ｐｈｅのコドンは、ＵＵＵからＵＵＣに改変でき、
Ｌｅｕのコドンは、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵまたはＣＵＡからＣＵＣまたはＣＵＧに改変でき、
Ｓｅｒのコドンは、ＵＣＵまたはＵＣＡまたはＡＧＵからＵＣＣ，ＵＣＧまたはＡＧＣに改変でき、
Ｔｙｒのコドンは、ＵＡＵからＵＡＣに改変でき、
Ｃｙｓのコドンは、ＵＧＵからＵＧＣに改変でき、
Ｈｉｓのコドンは、ＣＡＵからＣＡＣに改変でき、
Ｇｌｎのコドンは、ＣＡＡからＣＡＧに改変でき、
Ｉｌｅのコドンは、ＡＵＵまたはＡＵＡからＡＵＣに改変でき、
Ｔｈｒのコドンは、ＡＣＵまたはＡＣＡからＡＣＣまたはＡＣＧに改変でき、
Ａｓｎのコドンは、ＡＡＵからＡＡＣに改変でき、
Ｌｙｓのコドンは、ＡＡＡからＡＡＧに改変でき、
Ｖａｌのコドンは、ＧＵＵまたはＧＵＡからＧＵＣまたはＧＵＧに改変でき、
Ａｓｐのコドンは、ＧＡＵからＧＡＣに改変でき、
終止コドンＵＡＡはＵＡＧまたはＵＧＡに改変できる。

【0071】

他方、Ｍｅｔ（ＡＵＧ）およびＴｒｐ（ＵＧＧ）のコドンは、配列の改変をすることができない。

【0072】

上記で挙げた置換は、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡのＧ／Ｃ含量を、対応する野生型（ｍ）ＲＮＡ（すなわち、オリジナルの配列）と比べて増加させるために、それぞれ単体で、あるいは考えられる全ての組み合わせとして用いることができる。したがって、例えば、野生型配列にあるＴｈｒの全てのコドンをＡＣＣ（またはＡＣＧ）に改変することができる。しかしながら、例えば上述の考えられる置換の組み合わせを用いることが好ましい：
オリジナル配列（野生型（ｍ）ＲＮＡ）において、Ｔｈｒをコードする全てのコドンをＡＣＣ（またはＡＣＧ）に置換し、そして
もともとＳｅｒをコードする全てのコドンをＵＣＣ（またはＵＣＧまたはＡＧＣ）に置換する；
オリジナル配列において、Ｉｌｅをコードする全てのコドンをＡＵＣに置換し、
もともとＬｙｓをコードする全てのコドンをＡＡＧに置換し、そして
もともとＴｙｒをコードする全てのコドンをＵＡＣに置換する；
オリジナル配列において、Ｖａｌをコードする全てのコドンをＧＵＣ（またはＧＵＧ）に置換し、
もともとＧｌｕをコードする全てのコドンをＧＡＧに置換し、
もともとＡｌａをコードする全てのコドンをＧＣＣ（またはＧＣＧ）に置換し、そして
もともとＡｒｇをコードする全てのコドンをＣＧＣ（またはＣＧＧ）に置換する；
オリジナル配列において、Ｖａｌをコードする全てのコドンをＧＵＣ（またはＧＵＧ）に置換し、
もともとＧｌｕをコードする全てのコドンをＧＡＧに置換し、
もともとＡｌａをコードする全てのコドンをＧＣＣ（またはＧＣＧ）に置換し、
もともとＧｌｙをコードする全てのコドンをＧＧＣ（またはＧＧＧ）に置換し、そして
もともとＡｓｎをコードする全てのコドンをＡＡＣに置換する；
オリジナル配列において、Ｖａｌをコードする全てのコドンをＧＵＣ（またはＧＵＧ）に置換し
もともとＰｈｅをコードする全てのコドンをＵＵＣに置換し、
もともとＣｙｓをコードする全てのコドンをＵＧＣに置換し、
もともとＬｅｕをコードする全てのコドンをＣＵＧ（またはＣＵＣ）に置換し、
もともとＧｌｎをコードする全てのコドンをＣＡＧに置換し、そして
もともとＰｒｏをコードする全てのコドンをＣＣＣ（またはＣＣＧ）に置換する；等。

【0073】

本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含量は、本明細書に規定した抗原、抗原タンパク質もしくは抗原ペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体をコードする、野生型（ｍ）ＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含量と比べて、少なくとも７％、より好ましくは少なくとも１５％、特に好ましくは少なくとも２０％、増加していることが好ましい。特定の実施形態によれば、本明細書に規定した抗原、抗原タンパク質もしくは抗原ペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体をコードする領域における置換可能なコドン、または野生型（ｍ）ＲＮＡ配列の配列全体における置換可能なコドンの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％そして最も好ましくは少なくとも９０％、９５％または１００％が置換されており、そのことによって上記配列のＧ／Ｃ含量が増加している。

【0074】

本明細書において、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡのＧ／Ｃ含量を、野生型配列と比べて最大限（すなわち、置換可能コドンの１００％）にまで増やすこと、特にタンパク質をコードする領域において増やすことは、とりわけ好ましい。

【0075】

本発明によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡのさらに好ましい変更例は、細胞内におけるｔＲＮＡの出現頻度の違いによっても翻訳効率が定まるという知見に基づいている。したがって、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡにおいていわゆる「希少コドン」の量が増加している場合、対応する改変された少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡ配列は、比較的「頻度の高い」ｔＲＮＡをコードするコドンが存在する場合に比べてはるかに低い程度で翻訳される。

【0076】

本発明によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の改変された少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡにおいて、アジュバントタンパク質をコードする領域は、細胞内において比較的希少であるｔＲＮＡに対応する野生型配列の少なくとも１つのコドンが、細胞内に比較的よく出現するｔＲＮＡであって、上記の比較的希少であるｔＲＮＡと同一のアミノ酸を運ぶｔＲＮＡに対応するコドンと交換されるように、野生型（ｍ）ＲＮＡの対応する領域と比較して改変されている。この改変によって、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡの配列は、出現頻度が高いｔＲＮＡが利用されるコドンが挿入されるように改変されている。言い換えると、本発明によれば、この改変によって、細胞内で比較的希少なｔＲＮＡに対応する野生型配列の全てのコドンを、細胞内で比較的高頻度に出現するｔＲＮＡであって、同一のアミノ酸を運ぶｔＲＮＡに対応するコドンと交換することができる。

【0077】

細胞内にどのｔＲＮＡが比較的高頻度で出現するか、また対照的にどれが比較的希少かは、当業者に公知のことである。例えば、Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11(6): 660-666を参照のこと。特定アミノ酸のために最も高頻度で出現するｔＲＮＡを用いるコドンがとくに好ましく、例えば、（ヒト）細胞において最も高頻度で出現するｔＲＮＡを用いるＧｌｙコドンが挙げられる。

【0078】

本発明によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの改変（ｍ）ＲＮＡにおいて増加している、特に最大化されている、結果として生じるＧ／Ｃ含量を、（ｍ）ＲＮＡのコード領域でコードされているタンパク質のアミノ酸配列を改変させることなく、「高頻度」コドンに関連させることが好ましい。この好ましい実施形態によって、とりわけ効果的に翻訳され、かつ安定化された、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（改変）（ｍ）ＲＮＡを用意することができる。

【0079】

（Ｇ／Ｃ含量が増加しており、ｔＲＮＡを交換した）上述の本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの改変（ｍ）ＲＮＡの決定は、本発明にその全範囲が組み込まれるＷＯ０２／０９８４４３に記載されているコンピュータプログラムを用いて実施し得る。このコンピュータプログラムを用いることで、最大Ｇ／Ｃ含量において、細胞内で起こり得る限り高頻度に出現するｔＲＮＡに対応するコドンを用いることと共に、少なくとも一つの改変（ｍ）ＲＮＡにコードされているアミノ酸配列が非改変配列と比較して好ましくは改変されていないという結果となるように、遺伝暗号またはその縮重性質を活用して、任意の所望の（ｍ）ＲＮＡのヌクレオチド配列を改変し得る。あるいは、オリジナル配列と比較して、Ｇ／Ｃ含量またはコドン使用のみを改変することもできる。Ｖｉｓｕａｌ
Ｂａｓｉｃ ６．０（使用開発環境：Microsoft Visual Studio Enterprise 6.0 with Servicepack 3）のソースコードは、ＷＯ０２／０９８４４３にも記載されている。

【0080】

本発明のさらに好ましい実施形態では、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡのリボソーム結合部位の環境におけるＡ／Ｕ含量が、対応する野生型（ｍ）ＲＮＡのリボソーム結合部位の環境におけるＡ／Ｕ含量と比べて増加している。この改変（リボソーム結合部位周囲におけるＡ／Ｕ含量の増加）は、少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡにおけるリボソーム結合の効率を向上させる。リボソームがリボソーム結合部位（Ｋｏｚａｋ配列：ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧ（配列番号２７）、ＡＵＧは開始コドンを形成）と効果的に結合することによって、少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡの効率的な翻訳がもたらされる。

【0081】

本発明のさらなる実施形態によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡは、潜在的に不安定化させる配列要素に応じて改変されてもよい。特に、少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡのコード領域および／または５’ならびに／もしくは３’非翻訳領域は、対応する野生型（ｍ）ＲＮＡと比較して、不安定配列要素を含まないように改変されてもよく、少なくとも１つの改変（ｍ）ＲＮＡにコードされたアミノ酸配列は対応する野生型（ｍ）ＲＮＡと比較して改変されていないことが好ましい。例えば、真核ＲＮＡの配列内に不安定配列要素（ＤＳＥ）があると、シグナルタンパク質がそれに結合してｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡの酵素分解を制御することが知られている。少なくとも１つの改変（ｍ）ＲＮＡをさらに安定化させるには、必要に応じて本明細書に規定した抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドをコードする領域内で、野生型（ｍ）ＲＮＡの対応する領域と比べて１以上の改変を行い、不安定化配列要素が含まれないようにしてもよい。本発明によれば、このような改変をすることによって、非翻訳領域（３’−および／または５’−ＵＴＲ）に存在するＤＳＥを本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡから排除することができる。

【0082】

このような不安定配列は、例えばＡＵリッチ配列（ＡＵＲＥＳ）であり、多くの不安定ＲＮＡの３’−ＵＴＲ部分に生じる（Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986,83:1670-1674）。したがって、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡは、少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡがこのような不安定配列を含まないように、野生型（ｍ）ＲＮＡと比べて改変されることが好ましい。これは、例えばトランスフェリン受容体（Binder et al., EMBO J. 1994,13:1969―1980）をコードする遺伝子の３’−ＵＴＲ断片に含まれる配列ＧＡＡＣＡＡＧのような、エンドヌクレアーゼによって認識される配列モチーフにも適用される。これらの配列モチーフも、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡから取り除かれていることが好ましい。

【0083】

また、本発明によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡは、例えばリボソーム結合を促進するか本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（バイシストロン性または多シストロン性）ＲＮＡ上にコードされた異なる抗原を発現させるべく、上記で規定した少なくとも１つのＩＲＥＳおよび／または少なくとも１つの５’および／または３’安定化配列を、改変した形態で有していてもよい。

【0084】

本発明によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡは、さらに少なくとも１つの５’および／または３’安定化配列を有していることが好ましい。これら５’および／または３’非翻訳領域における安定化配列は、細胞質ゾル内の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡの半減期を大きくする効果を有する。これらの安定化配列は、ウイルス、バクテリアおよび真核生物にある天然の配列と１００％の配列相同性を有していてもよく、また部分的もしくは完全に合成されたものであってもよい。例えばヒト（Homo sapiens）またはアフリカツメガエル（Xenopus laevis）から得られたグロビン遺伝子の非翻訳配列（ＵＴＲ）は、本発明において安定化ＲＮＡを得るために用いることができる安定化配列の一例である。安定化配列の別の例として、グロビン、（Ｉ）−コラーゲン、１５−リポキシゲナーゼまたはチロシンヒドロキシラーゼをコードする、非常に安定なＲＮＡに含まれる一般式（Ｃ／Ｕ）ＣＣＡＮ_ｘＣＣＣ（Ｕ／Ａ）Ｐｙ_ｘＵＣ（Ｃ／Ｕ）ＣＣ（配列番号２８）が挙げられる（Holcik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997,94:2410-2414を参照）。このような安定化配列は、もちろん単独で用いることができ、他と組み合わせて用いることもでき、また当業者に公知の他の安定化配列と組み合わせて用いることもできる。したがって、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡは、グロビンＵＴＲ（非翻訳領域）安定化ＲＮＡ、特にグロビンＵＴＲ安定化ＲＮＡとして存在していることが好ましい。

【0085】

それでもなお、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡの塩基の置換、付加、または欠失は、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡを調製するためのＤＮＡマトリクスを用いて、周知の部位特異的突然変異誘発法もしくはオリゴヌクレオチド連結法によって行われるのが好ましい（例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd ed.,Cold Spring Harbor,NY,2001を参照）。このようなプロセスでは、少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡを調製するのに、対応するＤＮＡ分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写してもよい。このＤＮＡマトリクスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用に、例えばＴ７またはＳＰ６プロモーターのような適切なプロモーターを有することが好ましく、その後に、調製すべき少なくとも１つのＲＮＡの所望のヌクレオチド配列、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用終結シグナルを有することが好ましい。所望の少なくとも１つのＲＮＡのマトリクスを形成するＤＮＡ分子は、バクテリア内で自己複製し得るプラスミドの一部として、発酵増殖およびその後の単離によって調製することができる。本発明に好適なプラスミドは、例えば、ｐＴ７Ｔｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ２６４０４；Lai et al., Development 1995,121:2349-2360）、例えばｐＧＥＭ−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６５３００；プロメガ社製）などのｐＧＥＭシリーズ、およびｐＳＰ６４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６５３２７）等が挙げられる；また、Mezei and Storts,Purification ofPCR Products:Griffin and Griffin(ed.),PCR Technology:Current Innovation,CRC Press,Boca Raton,FL,2001.も参照のこと。

【0086】

本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、少なくとも１つのＲＮＡとカチオン化合物、特に、例えば（ポリ）カチオンペプチドまたはタンパク質等のポリカチオン化合物とを会合化もしくは複合化、または結合させることで安定化できる。特に、ＲＮＡに対するポリカチオン性、核酸結合タンパク質として、プロタミン、ヌクレオリン、スペルミンまたはスペルミジンを用いることが特に効果的である。さらに、ポリ−Ｌ−リジンまたはヒストンといった他のカチオンペプチドもしくはタンパク質を用いることも同様に可能である。このＲＮＡを安定化させる方法は、参照によって本発明に組み込まれているＥＰ−Ａ−１０８３２３２に記載されている。本発明の活性（免疫賦活）組成物のＲＮＡを安定化させるのに使用可能なさらに好ましいカチオン物質は、キトサン、ポリブレン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）等のカチオン多糖が挙げられる。本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡを、脂質系複合化試薬としてのオリゴフェクタミン（oligofectamine）などのカチオンタンパク質またはカチオン脂質といったカチオン化合物と会合または複合させることで、薬学的に活性な成分として存在する少なくとも１つのＲＮＡにおける、治療すべき細胞または治療すべき生物への移入を好ましくは増加させる。また、複合化による、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡに対する安定化効果についても本明細書の記載を参照する。これは、ＲＮＡの安定化にも適用される。

【0087】

他の特に好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくともＲＮＡは、分泌シグナルペプチドを付加的にまたは代替的にコードし得る。このようなシグナルペプチドは、一般的におよそ１５〜３０のアミノ酸長であり、好ましくはコードペプチドのＮ末端に位置する配列であるが、これに特に限定されない。本明細書に規定したシグナルペプチドは、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡにコードされる抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドを、決められた細胞内コンパートメント、好ましくは細胞表面、小胞体（ＥＲ）またはエンドソーム−リソソームコンパートメントに運ぶことが好ましい。本明細書に規定した分泌シグナルペプチド配列の例として、特にこれに限定されないが、古典的または非古典的ＭＨＣ分子のシグナル配列（例えば、ＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１等のＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩ分子のシグナル配列）、本明細書に規定したサイトカインまたは免疫グロブリンのシグナル配列、本明細書に規定した免疫グロブリンまたは抗体のインバリアント鎖のシグナル配列、Ｌａｍｐ１、Ｔａｐａｓｉｎ、Ｅｒｐ５７、カルレティキュリン、カルネキシンおよびさらなる膜会合タンパク質のシグナル配列、または小胞体（ＥＲ）もしくはエンドソーム−リソソームコンパートメントと会合するタンパク質のシグナル配列などが挙げられる。特に、本発明によれば、ＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１のシグナル配列を用いることが好ましい。

【0088】

上記のいずれの改変も、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡ、さらに本発明で用いられる任意の（ｍ）ＲＮＡに適用することができ、適切な場合もしくは必要に応じて、その少なくとも１つのＲＮＡにおいて互いに改変の妨げとならない組み合わせであれば、これらを任意の組み合わせによって組み合わせてもよい。その選択は、当業者が適宜選択することができる。

【0089】

他の実施形態によれば、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物は、アジュバントを含み得る。本明細書の記載内容において、アジュバントは本発明に係る活性（免疫賦活）組成物の投与および送達をサポートするのに適した、任意の化合物として理解され得る。さらに、このようなアジュバントは、先天的な免疫システムの免疫反応、すなわち非特異的免疫反応を誘導または向上し得るが、これに制限されない。言い換えると、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物を投与した際、一般的に、本発明の活性（免疫賦活）組成物は、含まれる少なくとも１つのＲＮＡがコードする少なくとも２つの抗原によって、獲得免疫反応を誘導する。さらに、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物は、本明細書に規定したアジュバントを加えることによって、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物に（支持療法的な）先天的免疫反応を起こし得る。このようなアジュバントは、当業者に公知であって、本件に適した、すなわち哺乳類の免疫反応の誘導を支持する、任意のアジュバントから選択され得る。アジュバントは特に限定されないが、以下からなる群より選択されることが好ましい：ＴＤＭ、ＭＤＰ、ムラミルジペプチド、プルロニックス、ミョウバン液、水酸化アルミニウム、ＡＤＪＵＭＥＲ^ＴＭ（ポリホスファゼン）；リン酸アルミニウムゲル；藻類由来グルカン；アルガムリン；水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）；高タンパク質吸着水酸化アルミニウムゲル；低粘性水酸化アルミニウムゲル；ＡＦまたはＳＰＴ（スクアラン（５％）、Ｔｗｅｅｎ８０（０．２％）、プルロニックＬ１２１（１．２５％）、リン酸緩衝生理食塩水のエマルジョン、ｐＨ７．４）；ＡＶＲＩＤＩＮＥ^ＴＭ（プロパンジアミン）；ＢＡＹ Ｒ１００５^ＴＭ（（Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−ｂ−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシル−ドデカノイル−アミデヒドロアセテート）；ＣＡＬＣＩＴＲＩＯＬ^ＴＭ（１−α，２５−ジヒドロキシ−ビタミンＤ３）；リン酸カルシウムゲル；ＣＡＰＴＭ（リン酸カルシウムナノ粒子）；コレラホロトキシン、コレラ−トキシン−Ａ１−タンパク質−Ａ−Ｄ−フラグメント融合タンパク質、コレラトキシンのサブユニットＢ；ＣＲＬ １００５（ブロック共重合体Ｐ１２０５）；サイトカイン含有リポソーム；ＤＤＡ（臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム）；ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）；ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）；ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）；ＤＯＣ／ミョウバン錯体（デオキシコール酸ナトリウム塩）；フロイント完全アジュバント；フロイント不完全アジュバント；ガンマイヌリン；ゲルブアジュバント（（ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミニル−（Ｐ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン（ＧＭＤＰ）、（ｉｉ）塩化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、（ｉｉｉ）亜鉛−Ｌ−プロリン塩複合体（ＺｎＰｒｏ−８）の混合体；ＧＭ−ＣＳＦ）；ＧＭＤＰ（Ｎ−アセチルグルコサミニル−（ｂ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン）；イミキモド（１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン）；ＩｍｍＴｈｅｒ^ＴＭ（Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−グリセロールジパルミテート）；ＤＲＶ（脱再水小胞から得られる免疫リポゾーム）；インターフェロン−ガンマ；インターロイキン１ベータ；インターロイキン２；インターロイキン７；インターロイキン１２；ＩＳＣＯＭＳ^ＴＭ；ＩＳＣＯＰＲＥＰ７．０．３．^ＴＭ；リポソーム；ＬＯＸＯＲＩＢＩＮＥ^ＴＭ（７−アリル−８−オキソグアノシン）；ＬＴ経口アジュバント（大腸菌不安定エンテロトキシン−プロトキシン）；任意の組成物の小球体および微粒子；ＭＦ５９^ＴＭ；（スクアレン水乳剤）；ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ ５１^ＴＭ（精製不完全フロイントアジュバント）；ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ ７２０^ＴＭ（代謝性油アジュバント）；ＭＰＬ^ＴＭ（３−Ｑ−脱アシル化−４’−モノホスホリルリピッドＡ）；ＭＴＰ−ＰＥおよびＭＴＰ−ＰＥリポソーム（（Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ヒドロキシホスホリルオキシ））−エチルアミド，モノナトリウム塩）；ＭＵＲＡＭＥＴＩＤＥ^ＴＭ（Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｎ−ＯＣＨ_３）；ＭＵＲＡＰＡＬＭＩＴＩＮＥ^ＴＭおよびＤ−ＭＵＲＡＰＡＬＭＩＴＩＮＥ^ＴＭ（Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｄ−ｉｓｏＧＩｎ−ｓｎ−グリセロールジパルミトイル）；ＮＡＧＯ（ノイラミニダーゼガラクトースオキシダーゼ）；任意の組成物のナノ球体またはナノ粒子；ＮＩＳＶ（非イオン界面活性小胞）；ＰＬＥＵＲＡＮ^ＴＭ（β−グルカン）；ＰＬＧＡ、ＰＧＡおよびＰＬＡ（乳酸およびグリコール酸の単独および共重合体；小球体／ナノ球体）；ＰＬＵＲＯＮＩＣ
Ｌ１２１^ＴＭ；ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）；ＰＯＤＤＳ^ＴＭ（プロテノイド小球体）；ポリエチレンカルバメート誘導体；ｐｏｌｙ−ｒＡ：ｐｏｌｙ−ｒＵ（ポリアデニル酸−ポリウリジル酸錯体）；ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）；タンパク質コクリエート（protein cochleate）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）；ＳＴＩＭＵＬＯＮ^ＴＭ（ＱＳ−２１）；Ｑｕｉｌ−Ａ（Ｑｕｉｌ−Ａサポニン）；Ｓ−２８４６３（４−アミノ−ｏｔｅｃ−ジメチル−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５ｃ］キノリン−１−エタノール）；ＳＡＦ−１^ＴＭ（“Ｓｙｎｔｅｘ ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ”）；センダイ蛋白リポソームおよびセンダイ含有脂質マトリクス；スパン−８５（ソルビタントリオレアート）；スぺコール（Ｍａｒｃｏｌ５２、スパン８５およびＴｗｅｅｎ８５のエマルジョン）；スクアレンまたはＲｏｂａｎｅ（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチルテトラコサンおよび２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン）；ステアリルチロシン（オクタデシルチロシン塩酸塩）；Ｔｈｅｒａｍｉｄ（Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド）；スレオニル−ＭＤＰ（Ｔｅｒｍｕｒｔｉｄｅ^ＴＭまたは［ｔｈｒ １］−ＭＤＰ；Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン）；Ｔｙ粒子（Ｔｙ−ＶＬＰまたはウイルス様粒子）；特にＡｄｊｕ−ｐｈｏｓ、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、Ｒｅｈｙｄｒａｇｅｌ等の、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、特にアルミニウム塩を含むＷａｌｔｅｒ−Ｒｅｅｄリポソーム（水酸化アルミニウムに吸着しているリピッドＡを含むリポソーム）、およびリポペプチド；ＣＦＡ、ＳＡＦ、ＩＦＡ、ＭＦ５９、Ｐｒｏｖａｘ、ＴｉｔｅｒＭａｘ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ等の乳剤；Ｏｐｔｉｖａｘ（ＣＲＬ１００５）、Ｌ１２１、Ｐｏｌｏａｘｍｅｒ４０１０）等の共重合体；ＢＩＯＲＡＬ等の、リポソーム（Ｓｔｅａｌｔｈを含む）コクリエート；ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ Ａ、Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘ、ＩＳＣＯＭ等の植物由来アジュバント；ＰＬＧ、ＰＭＭ、Ｉｎｕｌｉｎ等のトマチン、生体高分子を含む、同時刺激に適したアジュバント；ロムルチド、ＤＥＴＯＸ、ＭＰＬ、ＣＷＳ、マンノース、ＣｐＧ核酸配列、ＣｐＧ７９０９、ヒトＴＬＲ１−１０のリガンド、マウスＴＬＲ１−１３のリガンド、ＩＳＳ−１０１８、ＩＣ３１、イミダゾキノリン、Ａｍｐｌｉｇｅｎ、Ｒｉｂｉ５２９、ＩＭＯｘｉｎｅ、ＩＲＩＶｓ、ＶＬＰｓ、コレラトキシン、熱不安定毒素、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、フラジェリン、ＧＰＩアンカー、ＬＮＦＰＩＩＩ／Ｌｅｗｉｓ Ｘ、抗菌ペプチド、ＵＣ−１Ｖ１５０、ＲＳＶ融合タンパク質、ｃｄｉＧＭＰ；およびＣＧＲＰニューロペプチドを含むアンタゴニストに好適なアジュバント。

【0090】

好適なアジュバントは、カチオンまたはポリカチオン化合物から選択することもでき、この場合、好ましくは、アジュバントは本発明の活性（免疫賦活組成物）の少なくとも１つのＲＮＡとカチオンまたはポリカチオン化合物とを複合化することによって調製される。本明細書において活性（免疫賦活）組成物のＲＮＡと本明細書に規定したカチオンまたはポリカチオン化合物とを会合化もしくは複合化することで、好ましくはアジュバント特性を与え、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡが安定化する。特に、このようなカチオンまたはポリカチオン化合物は、プロタミン、ヌクレオリン、スペルミンもしくはスペルミジン等のカチオンまたはポリカチオンのペプチドまたはタンパク質から選択され、あるいは、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン、塩基性ポリペプチド、ＨＩＶ結合ペプチド等の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰｓ）、Ｔａｔ、ＨＩＶ−１ Ｔａｔ（ＨＩＶ）、Ｔａｔ由来ペプチド、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、ＶＰ２２由来もしくはＶＰ２２類似体ペプチド、ＨＳＶ ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡもしくはタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ、ＰｐＴ６２０、プロリンリッチペプチド、アルギニンリッチペプチド、リジンリッチペプチド、ＭＰＧペプチド、Ｐｅｐ−１、Ｌ−オリゴマー、カルシトニンペプチド、アンテナペディア由来ペプチド（特にショウジョウバエアンテナペディア由来）、ｐＡｎｔｐ、ｐＩｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブホリン２、Ｂａｃ７１５−２４、ＳｙｎＢ、ＳｙｎＢ（１）、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来ペプチド、ＳＡＰ、プロタミン、スペルミン、スペルミジン、またはヒストン等の他のカチオンペプチドまたはタンパク質から選択される。さらに好ましいカチオンまたはポリカチオン化合物は、例えばキトサンといったカチオン多糖類、ポリブレン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等のカチオンポリマー、ＤＯＴＭＡ：塩化［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム，ＤＭＲＩＥ，ジ−Ｃ１４−アミジン，ＤＯＴＩＭ，ＳＡＩＮＴ，ＤＣ−Ｃｈｏｌ，ＢＧＴＣ，ＣＴＡＰ，ＤＯＰＣ，ＤＯＤＡＰ，ＤＯＰＥ：ジオレイルホスファチジルエタノールアミン，ＤＯＳＰＡ，ＤＯＤＡＢ，ＤＯＩＣ，ＤＭＥＰＣ，ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン，ＤＩＭＲＩ：臭化ジミリストオキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウム，ＤＯＴＡＰ：ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン，ＤＣ−６−１４：塩化Ｏ，Ｏ−ジテトラデカノイル−Ｎ−（ａ−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミン，ＣＬＩＰ１：塩化ｒａｃ−［（２，３−ジオクタデシルオキシプロピル）（２−ヒドロキシエチル）］−ジメチルアンモニウム，ＣＬＩＰ６：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシロキシプロピル−オキシメチルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ＣＬＩＰ９：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシロキシプロピル−オキシスクシニルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム），オリゴフェクタミン等のカチオン脂質、または、β−アミノ酸ポリマーもしくは逆ポリアミド等の修飾ポリアミノ酸、ＰＶＰ（ポリ（臭化Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウム））等の修飾ポリエチレン、ｐＤＭＡＥＭＡ（ポリ（ジメチルアミノエチルメチルアクリレート））等の修飾アクリレート、ｐＡＭＡＭ（ポリ（アミドアミン））等の修飾アミドアミン、ジアミン端が修飾された１，４ブタンジオールジアクリレート−ｃｏ−５−アミノ−１−ペンタノールポリマー等の修飾ポリベータアミノエステル（ＰＢＡＥ）、ポリプロピルアミンデンドリマーまたはｐＡＭＡＭ系デンドリマー等のデンドリマー、ＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン），ポリ（プロピレンイミン）等のポリイミン、ポリアリルアミン、シクロデキストリン系ポリマー，デクストラン系ポリマー，キトサン等の糖バックボーン系ポリマー、ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ共重合体等のシランバックボーン系ポリマー、１つ以上の（例えば、上述のカチオンポリマーから選択された）カチオンブロックと、１つ以上の親水性もしくは親油性ブロック（例えば、ポリエチレングリコール）との組み合わせからなるブロックポリマー、などのカチオンもしくはポリカチオンポリマーなどが挙げられる。

【0091】

さらに、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡと複合させることでアジュバントとして使用するのに好ましいカチオンもしくはポリカチオンタンパク質またはペプチドは、以下の合計式（Ｉ）を満たすタンパク質またはペプチドから選択され得る：（Ａｒｇ）_ｌ；（Ｌｙｓ）_ｍ；（Ｈｉｓ）_ｎ；（Ｏｒｎ）_ｏ；（Ｘａａ）_ｘ、式中、ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｘは８〜１５、およびｌ，ｍ，ｎまたはｏはそれぞれ独立して、Ａｒｇと、Ｌｙｓと、Ｈｉｓと、Ｏｒｎとの総量がオリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも５０％を示すように、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５から選択され任意の数字を示し、ＸａａはＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＯｒｎを除くネイティブ（すなわち、天然）または非ネイティブアミノ酸から選択される任意のアミノ酸であり、ｘはＸａａの総量がオリゴオペプチドの全アミノ酸の５０％を超えない範囲で０、１、２、３または４から選択される。本明細書において特に好ましいオリゴアルギニンは、Ａｒｇ_７、Ａｒｇ_８、Ａｒｇ_９、Ａｒｇ_７、Ｈ_３Ｒ_９、Ｒ_９Ｈ_３、Ｈ_３Ｒ_９Ｈ_３、ＹＳＳＲ_９ＳＳＹ、（ＲＫＨ）_４、Ｙ（ＲＫＨ）_２Ｒ等である。

【0092】

好適なアジュバントはまた、一般式（ＩＩ）を有する核酸から選択されてもよい：Ｇ_ｌＸ_ｍＧ_ｎ、式中、Ｇはグアノシン、ウラシルまたはグアノシンもしくはウラシルの類似体であり、Ｘはグアノシン、ウラシル、アデノシン、チミジン、シトシンまたは上述のヌクレオチドの類似体であり、ｌは１〜４０の整数であり、ｌ＝１のとき、Ｇはグアノシンまたはその類似体であり、ｌ＞１のときはヌクレオチドの少なくとも５０％がグアノシンまたはその類似体であり、ｍは少なくとも３の整数であり、ｍ＝３のとき、Ｘはウラシルまたはその類似体であり、ｍ＞３のときは少なくとも３つの連続するウラシルまたはウラシル類似体があり、ｎは１〜４０の整数であり、ｎ＝１のとき、Ｇはグアノシンまたはその類似体であり、ｎ＞１のときはヌクレオチドの少なくとも５０％がグアノシンまたはその類似体である。

【0093】

他の適切なアジュバントは、一般式（ＩＩＩ）を有する核酸からさらに選択されてもよい：Ｃ_ｌＸ_ｍＣ_ｎ、式中、Ｃはシトシン、ウラシルまたはシトシンもしくはウラシルの類似体であり、Ｘはグアノシン、ウラシル、アデノシン、チミジン、シトシンまたは上述のヌクレオチドの類似体であり、ｌは１〜４０の整数であり、ｌ＝１のとき、Ｃはシトシンまたはその類似体であり、ｌ＞１のときはヌクレオチドの少なくとも５０％がシトシンまたはその類似体であり、ｍは少なくとも３の整数であり、ｍ＝３のとき、Ｘはウラシルまたはその類似体であり、ｍ＞３のときは少なくとも３つ連続するウラシルまたはウラシル類似体があり、ｎは１〜４０の整数であり、ｎ＝１のとき、Ｃはシトシンまたはその類似体であり、ｎ＞１のときはヌクレオチドの少なくとも５０％がシトシンまたはその類似体である。

【0094】

ある好ましい実施形態によれば、本発明はさらに本発明に係る活性（免疫賦活）組成物を含有するワクチンを提供し得る。本発明のワクチンは、付加的に薬学的に許容されるキャリアおよび／またはさらなる補助剤ならびに添加物および／またはアジュバントを含み得る。特に好ましい実施形態によれば、本発明のワクチンに含まれる活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡによってコードされている抗原は、上述のグループまたはサブグループから選択される。さらに好ましい実施形態によれば、タンパク質抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ１［アクセッション番号ＮＭ＿００１３２７］、ｈＴＥＲＴ［アクセッション番号ＮＭ＿１９８２５３］、ｓｕｒｖｉｖｉｎ［アクセッション番号ＡＦ０７７３５０］、５Ｔ４［アクセッション番号ＮＭ＿００６６７０］およびＷＴ１［アクセッション番号ＮＭ＿０００３７８］を含むサブグループの抗原のいずれか、および／または本明細書に規定したような、ＭＡＧＥ−Ｃ１およびＭＡＧＥ−Ｃ２を含む以下のサブグループの抗原のいずれか、および／または本明細書に規定したような、ＭＡＧＥ−Ａ２およびＭＡＧＥ−Ａ３を含む以下のサブグループの抗原のいずれかから選択される。

【0095】

本発明のワクチンは、典型的に、上記で規定した少なくとも２つの抗原、好ましくは上記のグループまたはサブグループから選択される少なくとも２つの抗原を、最も好ましくは示した組み合わせのいずれかでコードする、上記で規定した活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡを、安全かつ効果的な量で含んでいる。本明細書における「安全かつ効果的な量」とは、肺癌、好ましくは治療対象の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）関連状態、より好ましくは肺扁平上皮癌、腺癌、および肺大細胞癌を含む（ただし、これに特に制限されない）非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の３つの主要サブタイプに関連した状態に対して正の変化を著しく引き起こし得る、ワクチンに含まれる上記で規定した活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡの量を意味する。また一方で、「安全かつ効果的な量」は重度の副作用を回避し得る、すなわち利益とリスクとの関係を適切に保つ程度の少なさである。これらの制限の決定は、一般的に、思慮のある医療判断の範囲内で行われる。本発明のワクチンと関連して、「安全かつ効果的な量」は、過剰または有害な免疫反応がもたらされることなく、しかし好ましくは測定可能レベルより低い免疫反応でもなく、獲得免疫システムを刺激するのに適切なＲＮＡ（そしてコードされる少なくとも２つの抗原）の量である。上記で規定したような、ワクチンに含まれる活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡの「安全かつ効率的な量」は、さらに単シストロン性、バイシストロンまたは多シストロン性ＲＮＡ等、ＲＮＡの種類に応じて選択されてもよい。なぜなら、バイシストロンまたは多シストロン性ＲＮＡは、単シストロン性ＲＮＡを同量使うのに比べて、コードされた抗原が非常に多く発現し得るからである。本発明のワクチンに含まれる、上記で規定した活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡの「安全かつ効率的な量」は、治療対象の特定状態、および治療対象患者の年齢、身体的状態、重症度、治療の期間、付随治療の種類、用いられる特定の薬学的に許容されるキャリアの種類、および担当医の知識ならびに経験の範囲内における同様の要因によって変化する。本発明に係るワクチンは、薬学的組成物またはワクチンとして、ヒトおよび獣医療目的で用いることができる。

【0096】

本発明にかかるワクチンは、一般的に、薬学的に許容されるキャリアを含む。ここでの「薬学的に許容されるキャリア」という表現は、本発明のワクチンの液状または非液状主成分を含むことが好ましい。本発明のワクチンが液状である場合、キャリアは一般的にピロゲンを含まない水、例えばリン酸またはクエン酸緩衝液等の等張生理食塩水または緩衝（水）溶液を示す。特に本発明のワクチンを注射する場合、ナトリウム塩、好ましくは少なくとも５０ｍＭのナトリウム塩、カルシウム塩、好ましくは少なくとも０，０１ｍＭのカルシウム塩、および必要に応じてカリウム塩、好ましくは少なくとも３ｍＭのカリウム塩、を含む水または好ましくは緩衝剤、より好ましくは緩衝液を用いることができる。好ましい実施形態によれば、ナトリウム塩、カルシウム塩、および必要に応じてカリウム塩は、例えば、塩化物、ヨウ化物または臭化物等のハロゲン化物の形態、水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩または硫酸塩等の形態であり得る。ナトリウム塩の例として、例えばＮａＣｌ、ＮａＩ、ＮａＢｒ、Ｎａ_２ＣＯ_３、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＳＯ_４があり、必要に応じてのカリウム塩の例としては、例えばＫＣｌ、ＫＩ、ＫＢｒ、Ｋ_２ＣＯ_３、ＫＨＣＯ_３、Ｋ_２ＳＯ_４があり、カルシウム塩の例としては、例えばＣａＣｌ_２、ＣａＩ_２、ＣａＢｒ_２、ＣａＣＯ_３、ＣａＳＯ_４、Ｃａ（ＯＨ）_２が挙げられるが、これらに特に限定されない。さらに、緩衝剤は上記カチオンの有機アニオンも含み得る。より好ましい実施形態によれば、上記で規定した注射用途に好適な緩衝剤は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）、および必要に応じて塩化カリウム（ＫＣｌ）から選択される塩を含むことができ、塩化物に加えてさらにアニオンも存在し得る。ＣａＣｌ_２は、ＫＣｌ等の他の塩と入れ替えられてもよい。一般的に、注射緩衝剤に含まれる塩は少なくとも５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、少なくとも３ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）および少なくとも０，０１ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）の濃度である。注射緩衝剤は特定の参照媒体を基準にして高張、等張、または低張であってよい。すなわち、緩衝剤は、特定参照媒体を基準にして、塩含量がより多いか、同等か、または少なくてもよく、そして浸透または濃度による他の影響によって細胞が損傷することがない上記塩濃度の緩衝剤が用いられることが好ましい。参照媒体は、例えば血液、リンパ、細胞質液、またはその他体液等の「ｉｎ ｖｉｖｏ」の方法にて生成される液体、または例えば共通緩衝剤または液体等の、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」の方法で参照媒体として用いられる液体が挙げられる。このような共通緩衝剤または液体は、当業者に公知である。特に、液体主成分としてリンゲル乳酸溶液が好ましい。

【0097】

また一方、ヒトに好適に投与可能な、１つ以上の相溶性固体もしくは液体フィラーもしくは希釈剤または封入化合物を同様に用いてもよい。本明細書において「相溶性」の表現は、本発明のワクチンの成分が、一般的な使用条件下で本発明のワクチンの薬学的効果を実質的に低下させる相互作用を起こすことなく上記規定の少なくとも２つの抗原をコードする活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡと混合し得ることを意味する。薬学的に許容されるキャリア、フィラーおよび希釈剤は、当然ながら、これらが治療すべき人への投与に適切なものとなるように、充分に高純度であって、充分に低毒素でなければならない。薬学的に許容されるキャリア、フィラーまたはそれらの成分として使用可能な化合物の例として、ラクトース、グルコースおよびショ糖等の糖類、コーンスターチまたはジャガイモデンプン等のデンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩、エチルセルロース、アセチルセルロース等のセルロースおよびその誘導体、トラガント末、モルト、ゼラチン、獣脂、ステアリン酸およびステアリン酸マグネシウム等の固体流動促進剤、硫酸カルシウム、落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびカカオ脂等の植物油、ポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール等の多価アルコール、ならびにアルギン酸が挙げられるが、これに限定されない。

【0098】

薬学的に許容されるキャリアは、原則的に本発明のワクチンがどのようにして投与されるかに応じて選択される。本発明のワクチンは、例えば、全身的にまたは局所的に投与され得る。全身投与の経路は一般的に、例えば皮下、静脈、筋肉、動脈、皮内および腹腔内注射および／または鼻腔内投与を含む、経皮、経口、および非経口の経路が挙げられる。局所投与は一般的に、例えば皮内、経皮、皮下、または筋肉の経路の局所的に投与する注射、または、病巣内、頭蓋内、肺内、心内および舌下注射等が挙げられる。ワクチンは、皮内、皮下、または筋肉経路で投与するのが好ましい。したがって、組成物／ワクチンは液状または固体状で作製されるのが好ましい。本発明のワクチンの適切な投与量は、動物モデルを用いた所定の手順に沿った実験によって決定できる。用いられるモデルには、ウサギ、ヒツジ、マウス、ラット、イヌ、および非ヒト霊長類モデル等があるが、これに限定されない。注射する単位投与量形態は、水の滅菌溶液、生理食塩水またはその混合物を含むことが好ましい。このような溶液のｐＨはおよそ７．４に調整される。注射用の好適なキャリアには、ヒドロゲル、放出制御または遅延放出用具、ポリ乳酸およびコラーゲンマトリクス等が挙げられる。局所投与に好適な薬学的に許容されるキャリアは、ローション、クリーム、ゲル等に用いられるのに適したものが挙げられる。もし本発明のワクチンが経口で投与されるようであれば、錠剤、カプセル等が投与単位として好ましい。経口投与用の投与単位を作製するための薬学的に許容されるキャリアは従来公知である。どれを選択するかは、味、コスト、保存性等の二次考慮によるものとなり、本発明の課題に対して重要でなく、当業者が容易に作製することができる。

【0099】

本発明のワクチンは、さらに免疫原性を向上させるべく、１つ以上の補助剤を付加的に含むことができる。上記規定の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡと、上記のとおり、本発明のワクチンに必要に応じて含まれる補助剤との相乗作用は、免疫原性を向上させることによって得られることが好ましい。この点において、種々の補助剤の種類に応じて、様々な機構が考慮され得る。樹状細胞（ＤＣ）を成熟させる化合物、例えば、リポ多糖類、ＴＮＦ−アルファまたはＣＤ４０リガンド等は第一種の好適な補助剤となる。一般的に、「危険信号」として免疫システムに影響を与える任意の薬剤（ＬＰＳ、ＧＰ９６等）、または、本発明に係る免疫刺激アジュバントによって引き起こされた免疫反応を目標程度に増強させおよび／または影響を与えるサイトカイン（ＧＭ−ＣＦＳ等）を、補助剤として用いることができる。特に好ましい補助剤は、コードされた少なくとも２つの抗原によって獲得免疫反応が引き起こされるのに加え、先天的な免疫反応を促進する、モノカイン、リンフォカイン、インターロイキンまたはケモカイン等のサイトカインであり、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＮＦ−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＴ−ベータまたはＴＮＦ−アルファ、およびｈＧＨ等の成長因子がその例として挙げられる。

【0100】

本発明のワクチンに加え得るさらなる添加物は、Ｔｗｅｅｎ等の乳化剤、ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤、着色剤、味付与剤、薬学的に許容されるキャリア、錠剤形成剤、安定剤、酸化防止剤、保存剤などが挙げられる。

【0101】

本発明のワクチンはまた、ヒトＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０との（リガンドとしての）結合親和力、またはマウスＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２もしくはＴＬＲ１３との（リガンドとしての）結合親和力のために免疫を刺激することが知られている、他の任意の化合物を付加的に含んでもよい。

【0102】

本明細書において本発明のワクチンに付加可能な他のクラスの化合物として、ＣｐＧ核酸、特にＣｐＧ−ＲＮＡまたはＣｐＧ−ＤＮＡが挙げられる。ＣｐＧ−ＲＮＡまたはＣｐＧ−ＤＮＡは一本鎖ＣｐＧ−ＤＮＡ（ｓｓ ＣｐＧ−ＤＮＡ）、二本鎖ＣｐＧ−ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＣｐＧ−ＲＮＡ（ｓｓ ＣｐＧ−ＲＮＡ）、または二本鎖ＣｐＧ−ＲＮＡ（ｄｓ ＣｐＧ−ＲＮＡ）であり得る。ＣｐＧ核酸はＣｐＧ−ＲＮＡであるのが好ましく、一本鎖ＣｐＧ−ＲＮＡ（ｓｓ ＣｐＧ−ＲＮＡ）であるのがより好ましい。ＣｐＧ核酸は少なくとも１つまたはそれ以上の（分裂促進性）シトシン／グアニンジヌクレオチド配列（ＣｐＧモチーフ）を含むことが好ましい。第一の好ましい代替案によれば、これらの配列に含まれる少なくとも１つのＣｐＧモチーフ、すなわちＣｐＧモチーフのＣ（シトシン）およびＧ（グアニン）は、メチル化されていない。これらの配列に必要に応じて含まれる他のシトシンまたはグアニンは全て、メチル化されていてもメチル化されていなくてもよい。一方で、さらに好ましい代替案では、ＣｐＧモチーフのＣ（シトシン）およびＧ（グアニン）は、メチル化された形態でもあり得る。

【0103】

本発明のさらに好ましい課題によれば、本発明に記載の上記活性（免疫賦活）組成物または少なくとも２つの（好ましくは）異なる抗原をコードする上記少なくとも１つのＲＮＡは、肺癌の治療、好ましくは治療対象の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）関連状態、より好ましくは肺扁平上皮癌、腺癌、および肺大細胞癌を含む（ただし、これに特に制限されない）非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の３つの主要組織型に関連した状態の治療（のための本発明に係るワクチンの作製）に用いられてもよい。

【0104】

本発明のさらに好ましい目的によれば、本発明のワクチンまたは本明細書に規定した少なくとも２つの（好ましくは）異なる抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡは、肺癌、好ましくは治療対象の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）関連状態、より好ましくは肺扁平上皮癌、腺癌、および肺大細胞癌を含む（ただし、これに特に制限されない）非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の３つの主要サブタイプに関連した状態の治療に用いられてもよい。

【0105】

本明細書の記載内容において、肺癌、好ましくは治療対象の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）関連状態、より好ましくは肺扁平上皮癌、腺癌および肺大細胞癌を含む（ただし、これに特に制限されない）非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の３つの主要サブタイプに関連した状態の治療が必要な患者に対して、本発明のワクチンの薬学的に効果的な量、または本発明の活性（免疫賦活）組成物の薬学的に効果的な量を投与することによる、これらを治療する方法も本発明に含まれる。このような方法は、一般的に、本発明の活性（免疫賦活）組成物または本発明のワクチンを作製する任意の第一工程と、投与を必要とする患者に対して本発明の活性（免疫賦活）組成物または本発明のワクチンを（薬学的に効果的な量で）投与する第二工程とを含む。投与を必要とする患者は任意の哺乳類から一般的に選択される。本発明の記載内容において、哺乳類は、一般的に肺癌、好ましくは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）関連状態、より好ましくは肺扁平上皮癌、腺癌および肺大細胞癌を含む（ただし、これに特に制限されない）非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の３つの主要サブタイプに関連した状態に罹患している、例えば、これに限定されないが、ヤギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ロバ、サル、類人猿、およびマウス、ハムスター、ウサギ等のげっ歯類、ならびに特にヒトからなる群より選択されることが好ましい。

【0106】

本発明はまた、本明細書で規定した本発明の活性（免疫賦活）組成物または少なくとも２つの（好ましくは）異なる抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡの使用（本発明のワクチンの調製のための使用）に関し、好ましくは哺乳類における免疫反応の誘発、好ましくは肺癌の治療に、より好ましくは本明細書に規定した非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）関連状態の治療における使用に関する。

【0107】

同様に、本発明はまた、哺乳類において獲得免疫反応を誘発する、好ましくは肺癌の治療用、より好ましくは本明細書に記載の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）関連状態の治療用に、本発明のワクチン自体もしくは本明細書に記載の少なくとも２つの（好ましくは）異なる抗原をコードする上記少なくとも１つのＲＮＡの使用に関する。

【0108】

肺癌、好ましくは本明細書に規定した非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療または予防を必要とする患者に対する予防または治療は、例えば少なくとも１つの好ましくは異なる抗原を含有する部品のキットとして、一度にまたは時間差で、本発明の活性（免疫賦活）組成物および／または本発明のワクチンを投与することで行うことができる。上記で規定したように、投与する際に、投与経路のいずれも好適に用いられる。例えば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡによってコードされている少なくとも２つの（特異的に選択された）抗原によって獲得免疫反応を引き起こすか促進することで、肺癌、好ましくは本明細書に規定した非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）関連状態を治療することができる。本発明の活性（免疫賦活）組成物および／または本発明のワクチンを、異なる抗原をコードする他のＲＮＡの組み合わせを含み得る別の本発明の活性（免疫賦活）組成物および／または本明細書に規定した本発明のワクチンを投与する前に、投与と同時に、および／または投与の後に投与してもよい。なお、本発明の別の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡにコードされている各抗原は、肺癌の治療に好適であることが好ましく、本明細書に規定した非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）関連状態の治療に好適であることがより好ましい。本明細書の記載内容において、本明細書に規定した治療とは、肺癌に関連する疾患の調節、好ましくは本明細書に規定した非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に関連する疾患の調節をも含み得る。

【0109】

さらなる一実施形態によれば、本発明はさらに、上記規定の哺乳類の免疫反応を調節する、好ましくは免疫反応を引き起こすか促進する、より好ましくは肺癌の治療、特に本明細書に規定のＮＳＣＬＣの治療を補助する（（本発明の）ワクチンの作製用）活性（免疫賦活）組成物の使用を含む。本明細書の記載内容において、肺癌、特に本明細書に規定したＮＳＣＬＣの治療補助は、例えば放射線療法、化学療法、陽子線治療、ホルモン療法、抗体療法、アジュバント療法、本発明のワクチン以外のワクチンを用いる療法、キナーゼ阻害剤もしくはスモールヌクレオチドを用いる療法等、またはこれらを組み合わせた療法等、肺癌、特に本明細書に規定したＮＳＣＬＣに対する従来の癌治療と、本発明の活性（免疫賦活）組成物または本明細書に規定した本発明のワクチンを用いた療法との任意の組み合わせであってもよい。肺癌、特に本明細書に規定したＮＳＣＬＣの治療補助は、本明細書中に規定した他の実施形態のいずれにおいても考慮され得る。

【0110】

本発明の活性（免疫賦活）組成物または本明細書に規定した少なくとも２つの（好ましくは）異なる抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡ、または本発明のワクチンは、時間差治療で投与されてもよい。時間差治療とは、例えば肺癌、特に本明細書に規定したＮＳＣＬＣの治療の前に、治療と同時に、および／または治療の後に、本発明の活性（免疫賦活）組成物または本明細書に規定した少なくとも２つの（好ましくは）異なる抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡ、または本発明のワクチンを投与することであってよく、例えば、肺癌、特にＮＳＣＬＣの治療またはそれに好適な薬剤の投与の前に、投与と同時に、および／または投与の後に本発明の活性（免疫賦活）組成物、またはワクチンを投与することによって行われる。このような時間差治療は、例えばキット、好ましくは後述する部品のキットを用いて行われてもよい。

【0111】

時間差治療は、本発明の活性（免疫賦活）組成物またはワクチン、好ましくは上記規定の少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡの投与であって、好ましくは部分的に本発明の活性（免疫賦活）組成物またはワクチンを構成する上記規定の少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡを投与する前に、投与と同時に、または投与した後に、好ましくは同じ本発明の活性（免疫賦活）組成物またはワクチンを部分的に構成する別の上記規定の少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡを、付加的もしくは代替的に投与することを含み得る。（全ての少なくとも１つのＲＮＡ）は、１時間以内、より好ましく３０分以内、さらに好ましくは１５、１０、５、４、３、もしくは２分もしくはさらに１分以内に投与することが好ましい。このような時間差治療は、例えば、キット、好ましくは後述する部品のキットを用いて行われ得る。

【0112】

最後の実施形態によれば、本発明はさらに、活性な本発明の（免疫賦活）組成物および／または本発明のワクチン、ならびに必要に応じて、本発明の活性（免疫賦活）組成物および／または本発明のワクチンの投与および投与量に関する情報を載せた技術指示書を備えている、キット、特に部品のキットを提供する。技術指示書は、本発明の活性（免疫賦活）組成物および／または本発明のワクチンの投与および投与量についての情報を含み得る。このようなキット、好ましくは部品のキットは、例えば上述の応用または使用に適用することができ、肺癌、特に本明細書に規定したＮＳＣＬＣの治療のための（本発明のワクチン作製のための）少なくとも１つの本発明の活性（免疫賦活）組成物の使用にこのましくは適用できる。このキットはまた、肺癌、好ましくは本明細書に規定したＮＳＣＬＣを治療するための少なくとも一つの（本発明のワクチン作製用の）本発明の活性（免疫賦活）組成物の使用に適用することができ、本発明の活性（免疫賦活）組成物）および／またはワクチンは、コードされている少なくとも２つの抗原によって、上記規定の哺乳類において免疫反応を引き起こすかまたは促進し得る。このようなキットはさらに、上記規定の哺乳類における免疫反応を調節する、例えば引き起こすか促進するなどして誘発するため、そして好ましくは肺癌、特にＮＳＣＬＣの治療を補助するために、少なくとも１つの（本発明のワクチン作製のための）本発明の活性（免疫賦活）組成物の使用に適用され得る。特別な形式のキットとして、部品のキットは、キットの異なる部分において１以上の同一または異なる活性な本発明の（免疫賦活）組成物および／または１以上の同一または異なる本発明のワクチンを含んでいてもよい。部品のキットはまた、（例えば、１つの）活性な本発明の（免疫賦活）組成物、（例えば、１つの）本発明のワクチンおよび／または上記規定の少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡを、キットの異なる部品に含み得る。例えば、キットの各部品が、好ましくは異なる抗原をコードするＲＮＡを少なくとも１つ含み得る。さらに、部品のキットの両方の種類を組み合わせることもできる。例えばｉｎ ｖｉｖｏで同一治療を行っている最中に、異なる製剤を用いる場合ならびに／または活性な本発明の（免疫賦活）組成物、本発明のワクチンおよび／もしくは上記規定の少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡの濃度を高くする場合等の時間差治療などが検討されたときに、部品キットを用いることができる。部品のキットは、別の製剤または本発明の活性（免疫賦活）組成物の異なる抗原を（すなわち部分的に）投与することが（例えば技術的な理由により）想定されるか必要になったものの、例えばｉｎ ｖｉｖｏにおいて異なる抗原が組み合わされて存在しなければならない場合にも用いられ得る。特に、キットの特別な形式として、部品キットが検討され、キットの各部品は上記規定の少なくとも１つの好ましくは異なる抗原を含み、キットの全ての部品が活性な本発明の（免疫賦活）組成物または本明細書に規定した本発明のワクチンを構成していることが好ましい。このような特定の部品のキットは、例えば異なる抗原がキットの異なる部品として構成されているものの、同時または時間差でそれを必要とする哺乳類に投与される場合に特に好適である。後者の場合、そのようなキットの異なる部品の投与は、キットの最後の部品を投与した後でほとんど同時期に全ての抗原が哺乳類体内に存在するように、短い時間内で全ての投与がなされるのが一般的である。上記キットのいずれもが、上記規定の治療に用いられ得る。

【0113】

〔本発明の利点〕
本発明は、肺癌、特に非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療のための活性（免疫賦活）組成物を提供する。この組成物は、哺乳類の（獲得）免疫反応を引き起こし得るｈＴＥＲＴ、ＷＴ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、５Ｔ４、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＵＣ１、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＥＡ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＭＡＧＥ−Ｃ１、またはＭＡＧＥ−Ｃ２からなる群より選択される少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを含んでいる。このような活性（免疫賦活）組成物によって、肺癌、特に非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療、または従来の療法を用いる際の補助的な治療を効率的に行うことができる。さらに、ＲＮＡを治療方法として用いることによって、導入されたＤＮＡ配列が非制御下で増殖してしまう問題を回避することができる。本発明の活性（免疫賦活）組成物に用いられるＲＮＡは、例えば免疫反応、免疫処置またはワクチン接種において、ＤＮＡ発現システムよりも注目に値するさらなる利点を有している。これらの利点としては、とりわけ、細胞に導入されたＲＮＡがゲノムに組み込まれないという点が挙げられる。このことによって、その遺伝子が変異する危険性を回避することができ、その結果、完全もしくは部分的に活性化されない状態、または誤情報を引き起こしてしまう状態を避けることができる。これによってさらに、免疫反応を引き起こす薬剤（例えば、ワクチン）としてＤＮＡを用いる場合の他の危険性、例えば外来性ＤＮＡが導入されている患者の体内に病原性の抗ＤＮＡ抗体が誘発され、（おそらく致命的な）免疫反応を引き起こすこと等を避けることができる。対照的に、抗ＲＮＡ抗体はいまだ検出されていない。

【0114】

〔図面〕
以下の図面は本発明をさらに図示する目的で提供されており、本発明の対象がこれらに限定されることを意図するものではない。

【0115】

図１：ＭＵＣ１（ＨｓＭＵＣ１−５×ＶＮＴＲ（野生型配列は通常４０個のタンデムリピートであるが、クローニング上の理由により、５個のタンデムリピートまで減少。）をコードしており、ＧＣ含量：６１．２７％、長さ：１６６８ｂｐであるＲＮＡ配列（配列番号１）（野生型に基づく開始配列）を示す図である。

【0116】

図２：ＭＵＣ１（ＨｓＭＵＣ１ ＧＣ−５×ＶＮＴＲ、１．最大ＧＣ、２．コドン使用）をコードしており、ＧＣ含量：７３．５６％、長さ：１６６８ｂｐである（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号２）を示す図である。塩基配列（図１（配列番号１））との違いは、３９８／１６６８塩基＝２３．８６％である。

【0117】

図３：５Ｔ４（Ｈｓ５Ｔ４（栄養膜糖タンパク質ＴＰＢＧ）をコードしており、ＧＣ含量：６１．６０％、長さ：１２６３ｂｐであるＲＮＡ配列（配列番号３）（野生型に基づく開始配列）を示す図である。

【0118】

図４：５Ｔ４（Ｈｓ５Ｔ４ ＧＣ、１．最大ＧＣ、２．コドン使用）をコードしており、ＧＣ含量：７０．４７％、長さ：１２６３ｂｐである（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号４）を示す図であり、。塩基配列（図３（配列番号３））との違いは、２４７／１２６３塩基＝１９．５６％である。

【0119】

図５：Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（ＨｓＨｅｒ２／ｎｅｕ（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２））をコードしており、ＧＣ含量：６０．７８％、長さ：３７６８ｂｐであるＲＮＡ配列（配列番号５）（野生型に基づいた開始配列）を示す図である。

【0120】

図６：Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（ＨｓＨｅｒ２／ｎｅｕ ＧＣ、１．最大ＧＣ、２．コドン使用）をコードしており、ＧＣ含量：７０．５４％、長さは：３７６８ｂｐである（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号６）を示す図である。塩基配列（図５（配列番号５））との違いは、７７２／３７６８塩基＝２０．４９％である。

【0121】

図７：ｈＴＥＲＴ（ＨｓＴＥＲＴ（テロメラーゼ逆転写酵素）をコードしており、ＧＣ含量：６６．０８％、長さ：３３９９ｂｐであるＲＮＡ配列（配列番号７）（野生型に基づく開始配列）を示す図である。

【0122】

図８：ｈＴＥＲＴ（ＨｓＴＥＲＴ ＧＣ、１．最大ＧＣ、２．コドン使用）をコードしており、ＧＣ含量：７２．９６％、長さ：３３９９ｂｐである（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号８）を示す図である。塩基配列（図７（配列番号７））との違いは、５６６／３３９９塩基＝１６．６５％である。

【0123】

図９：ＷＴ１（ＨｓＷＴ１（ウィルムス腫瘍１））をコードしており、ＧＣ含量：６１．７８％、長さ：１５５４ｂｐであるＲＮＡ配列（配列番号９）（野生型に基づく開始配列）を示す図である。

【0124】

図１０：図１０Ａ）は、ＷＴ１（ＨｓＷＴ１（ウィルムス腫瘍１））をコードしており、配列の領域３２５−４０８において野生型配列の対応する領域と比べてＧＣ含量が減少しているＲＮＡ配列（配列番号１０）を示す図であり、図１０Ｂ）、Ｃ）、およびＤ）は、以下の対応する領域３２５−４０８との比較結果を示している：Ｂ）では、図９（配列番号９）に係る野生型配列との比較、Ｃ）では、図１１（配列番号１１）に係るＧＣが最大化された配列との比較、およびＤ）では、図１０（配列番号１０）に係るＧＣが低減された配列との比較を示す。なお、これらは全て異なるＧＣパターンを示している。

【0125】

図１１：ＷＴ１（ＨｓＷＴ１ ＧＣ、１．最大ＧＣ、２．コドン使用）をコードしており、ＧＣ含量：７２．５９％、長さ：１５５４ｂｐである（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号１１）を示す図である。塩基配列（図９（配列番号９））との違いは、３２２／１５５４塩基＝２０．７２％である。

【0126】

図１２：ＣＥＡ（ＣＥＡ（癌胎児性抗原）ＨｓＣＥＡＣＡＭ５）をコードしており、ＧＣ含量：５２．２０％、長さ：２１０９ｂｐであるＲＮＡ配列（配列番号１２）（野生型に基づく開始配列）を示す図である。

【0127】

図１３：ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５ ＧＣ、１．最大ＧＣ、２．コドン使用、既に配置済み）をコードしており、ＧＣ含量：６６．２４％、長さ：２１０９ｂｐである（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号１３）を示す図である。塩基配列（図１２（配列番号１２）との違いは、４９５／２１０９塩基＝２３．４７％である。

【0128】

図１４：ＭＡＧＥ−Ａ２（ＨｓＭＡＧＥ−Ａ２（メラノーマ抗原ファミリーＡ，２）ＨｓＭＡＧＥ−Ａ２Ｂ）をコードしており、ＧＣ含量：５５．８７％、長さ：９４５ｂｐであるＲＮＡ配列（配列番号１４）（野生型に基づく開始配列）を示す図である。

【0129】

図１５：ＭＡＧＥ−Ａ２（ＨｓＭＡＧＥ−Ａ２Ｂ ＧＣ、１．最大ＧＣ、２．コドン使用）をコードしており、ＧＣ含量：６８．５７％、長さ：９４５ｂｐである（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号１５）を示す図である。塩基配列（図１４（配列番号１４））との違いは、１８７／９４５塩基＝１９．７９％である。

【0130】

図１６：ＭＡＧＥ−Ａ３（ＭＡＧＥ−Ａ３（メラノーマ抗原ファミリーＡ，３）ＭＡＧＥ−Ａ３）をコードしており、ＧＣ含量：５６．３０％、長さ：９４５ｂｐであるＲＮＡ配列（配列番号１６）（野生型に基づく開始配列）を示す図である。

【0131】

図１７：ＭＡＧＥ−Ａ３（ＭＡＧＥ−Ａ３ ＧＣ、１．最大ＧＣ、２．コドン使用、ＧＣに富んでいることは既知）をコードしており、ＧＣ含量：６９．００％、長さ：９４５ｂｐである（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号１７）を示す図である。塩基配列（図１６（配列番号１６））との違いは、１９０／９４５塩基＝２０．１１％である。

【0132】

図１８：Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（バキュロウイルスＩＡＰリピート含有５、ＢＩＲＣ５）ＨｓＳｕｒｖｉｖｉｎ（ｗｔ））をコードしており、ＧＣ含量：５２．６８％、長さ：４２９ｂｐであるＲＮＡ配列（配列番号１８）（野生型に基づく開始配列）を示す図である。

【0133】

図１９：Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（ＨｓＳｕｒｖｉｖｉｎ（ＧＣ）、１．最大ＧＣ、２．コドン使用、ＧＣに富んでいることは既知）をコードしており、ＧＣ含量：６５．２７％、長さ：４２９ｂｐである（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号１９）を示す図である。塩基配列（図１８（配列番号１８））との違いは、７２／４２９塩基＝１６．７８％である。

【0134】

図２０：ＮＹ−ＥＳＯ−１（ホモサピエンスＮＹ−ＥＳＯ−１（ＮＹ−ＥＳＯ−１（ｗｔ））をコードしており、ＧＣ含量：６７．４％であるＲＮＡ配列（配列番号２０）（野生型に基づく開始配列）を示す図である。

【0135】

図２１：ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＧＣ））をコードしており、ＧＣ含量７９．５６％、（ＧＣに富んでいることは既知）である（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号２１）を示す図である。ｗｔ（図２０（配列番号２０））との違いは、１１２／５４３塩基、２０．６３％である。

【0136】

図２２：ＭＡＧＥ−Ｃ１（ＨｓＭＡＧＥＣ１（メラノーマ抗原ファミリーＣ，１）ＨｓＭＡＧＥＣ１（ｗｔ））をコードしており、ＧＣ含量：５１．８６％、長さ：３４２９ｂｐであるＲＮＡ配列（配列番号２２）（野生型に基づく開始配列）を示す図である。

【0137】

図２３：ＭＡＧＥ−Ｃ１（ＨｓＭＡＧＥＣ１（ＧＣ）、１．最大ＧＣ、２．コドン使用）をコードしており、ＧＣ含量：６８．７３％、長さ：３４２９ｂｐである（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号２３）を示す図である。塩基配列（図２２（配列番号２２））との違いは、９６４／３４２９塩基＝２８．１１％である。

【0138】

図２４：短縮ＭＡＧＥ−Ｃ１（ＨｓＭＡＧＥＣ１（ＧＣ）、１．最大ＧＣ、２．コドン使用）をコードする（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号２４）を示す図である。塩基配列（図２２（配列番号２２））と比較して、繰り返し領域を欠失し、始めの開始コドン（ＡＴＧ）に続く図２４に係る配列は、ＧＣ最大化野生型配列（図２３（配列番号２３））の６１３番目のアミノ酸から始まる。

【0139】

図２５：ＭＡＧＥ−Ｃ２（ＨｓＭＡＧＥ−Ｃ２（メラノーマ抗原ファミリーＣ，２）ＨｓＭＡＧＥ−Ｃ２）をコードしており、ＧＣ含量：５０．８１％、長さ：１１２２ｂｐであるＲＮＡ配列（配列番号２５）（野生型に基づく開始配列）を示す図である。

【0140】

図２６：ＭＡＧＥ−Ｃ２（ＨｓＭＡＧＥ−Ｃ２ ＧＣ、１．最大ＧＣ、２．コドン使用）をコードしており、ＧＣ含量：６６．５８％、長さ：１１２２ｂｐである（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号２６）を示す図である。塩基配列（図２５（配列番号２５））との違いは、２６４／１１２２塩基＝２３．５３％である。

【0141】

図２７：質量比４：１でプロタミンを用いて製剤したＮＳＣＬＣ関連抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、および５Ｔ４）を１つコードするｍＲＮＡをそれぞれ含む５つの成分からなるｍＲＮＡワクチンをワクチン接種したマウスにおける、腫瘍抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１に特異的なＩｇＧ１抗体の有無を示す図である。

【0142】

図２８：質量比４：１でプロタミンを用いて製剤したＮＳＣＬＣ関連抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、および５Ｔ４）を１つコードするｍＲＮＡをそれぞれ含む５つの成分からなるｍＲＮＡワクチンをワクチン接種したマウスにおける、腫瘍抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１に特異的なＩｇＧ２ａ抗体の有無を示す図である。

【0143】

図２９：質量比４：１でプロタミンを用いて製剤したＮＳＣＬＣ関連抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、および５Ｔ４）を１つコードするｍＲＮＡをそれぞれ含む５つの成分からなるｍＲＮＡワクチンをワクチン接種したマウスにおける、腫瘍抗原ＭＡＧＥ−Ｃ１に特異的なＩｇＧ１抗体の有無を示す図である。

【0144】

図３０：質量比４：１でプロタミンを用いて製剤したＮＳＣＬＣ関連抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、および５Ｔ４）を１つコードするｍＲＮＡをそれぞれ含む５つの成分からなるｍＲＮＡワクチンをワクチン接種したマウスにおける、腫瘍抗原ＭＡＧＥ−Ｃ１に特異的なＩｇＧ２ａ抗体の有無を示す図である。

【0145】

図３１：質量比４：１でプロタミンを用いて製剤したＮＳＣＬＣ関連抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、および５Ｔ４）を１つコードするｍＲＮＡをそれぞれ含む５つの成分からなるｍＲＮＡワクチンをワクチン接種したマウスにおける、腫瘍抗原ＭＡＧＥ−Ｃ２に特異的なＩｇＧ１抗体の有無を示す図である。

【0146】

図３２：質量比４：１でプロタミンを用いて製剤したＮＳＣＬＣ関連抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、および５Ｔ４）を１つコードするｍＲＮＡをそれぞれ含む５つの成分からなるｍＲＮＡワクチンをワクチン接種したマウスにおける、腫瘍抗原ＭＡＧＥ−Ｃ２に特異的なＩｇＧ２ａ抗体の有無を示す図である。

【0147】

図３３：質量比４：１でプロタミンを用いて製剤したＮＳＣＬＣ関連抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、および５Ｔ４）を１つコードするｍＲＮＡをそれぞれ含む５つの成分からなるｍＲＮＡワクチンをワクチン接種したマウスにおける、腫瘍抗原５Ｔ４に対する抗原特異的Ｔリンパ球の誘発を示す図である。

【0148】

図３４：質量比４：１でプロタミンを用いて製剤したＮＳＣＬＣ関連抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、および５Ｔ４）を１つコードするｍＲＮＡをそれぞれ含む５つの成分からなるｍＲＮＡワクチンをワクチン接種したマウスにおける、腫瘍抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗原特異的Ｔリンパ球の誘発を示す図である。

【0149】

〔実施例〕
以下の実施例は、本発明をさらに図示するために例示されており、本発明の対象がこれら実施例に限定されることを意図するものではない。

【0150】

＜１．コーディングプラスミドの調製＞
以下の実験では、末端に以下の抗原をコードするそれぞれのｍＲＮＡ配列に対応するＤＮＡを調製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写およびトランスフェクション実験に用いた：
・ｈＴＥＲＴ、
・ＷＴ１、
・ＭＡＧＥ−Ａ２、
・５Ｔ４、
・ＭＡＧＥ−Ａ３、
・ＭＵＣ１、
・Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、
・ＮＹ−ＥＳＯ−１、
・ＣＥＡ、
・Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、
・ＭＡＧＥ−Ｃ１、または
・ＭＡＧＥ−Ｃ２。
これに関して、ネイティブ抗原をコードするｍＲＮＡに対応するＤＮＡ配列は、ＧＣ含量が増量させられ、コドンが最適化されている。そして、コーディング配列を、ポリＡタグおよびポリＣタグ（Ａ７０−Ｃ３０）によって既に修飾されているＲＮＡｃｔｉｖｅコンストラクト（ＣｕｒｅＶａｃ ＧｍｂＨ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内に移した。

【0151】

＜２．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写＞
実施例１で得た組換えプラスミドＤＮＡに基づいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によってＲＮＡ配列を調製した。これに関して、組換えプラスミドＤＮＡを直鎖状にして、次いでＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで転写した。次に、ＤＮＡの鋳型をＤＮａｓｅＩ消化によって分解した。ＲＮＡをＬｉＣｌ沈殿で回収し、さらにＨＰＬＣ抽出（ＰＵＲＥＭｅｓｓｅｎｇｅｒ，ＣｕｒｅＶａｃ ＧｍｂＨ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，ドイツ）によって不要なものを除去した。

【0152】

＜３．プロタミンとの複合化＞
ＲＮＡを細胞内および生物内にトランスフェクションするためには、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写で得られたＲＮＡを好ましくは複合化し、より好ましくはプロタミンとＲＮＡとを混合して複合化するのが好ましい。

【0153】

＜４．ワクチン実験＞
ワクチン接種として、上記のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写実験によって得られたＲＮＡ（実験２参照）を、好ましくはプロタミンと複合化したとき（実験３を参照）に、マウス（マウス：Ｃ５７ ＢＬ／６）にトランスフェクションした。トランスフェクションは相違する群において行った。各群につき５匹のマウス（Ｃ５７ ＢＬ／６）を、本発明のｍＲＮＡ混合液、すなわちプロタミンで複合化したｍＲＮＡの混合物を用いて、３週間以内に８回、皮内経由で免疫性を与えた。なお、ＲＮＡはｈＴＥＲＴ、ＷＴ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、５Ｔ４、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＵＣ１、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＥＡ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＭＡＧＥ−Ｃ１、またはＭＡＧＥ−Ｃ２の抗原を少なくとも２つコードしている。

【0154】

＜５．抗原特異的免疫反応（Ｂ細胞免疫反応）の検出＞
抗原特異的抗体を検出することで、抗原特異的免疫反応（Ｂ細胞免疫反応）を検出した。これに関して、ワクチン接種したマウスから、血液サンプルを、最終ワクチン接種から１週間後に採取し、血清を調製した。ＭａｘｉＳｏｒｂプレート（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、ｍＲＮＡ混合液（０．５μｇ／ウェル）によってコードされている抗原性タンパク質でコーティングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および１％ＢＳＡを含む１×ＰＢＳでブロッキングした後、希釈したマウス血清（１：３０，１：９０，１：２７０，１：８１０）と共にプレートをインキュベートした。その後、ビオチン結合二次抗体（Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ２ａ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を添加した。洗浄後、プレートをホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ−ストレプトアビジンでインキュベートし、続いてＡＢＴＳ基質（２，２’−アジノ−ビス（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸）の変換を測定した。

【0155】

＜６．ＥＬＩＳＰＯＴによる抗原特異的細胞性免疫反応（Ｔ細胞免疫反応）の検出＞
最後のワクチン接種から２週間後にマウスを屠殺し、脾臓を取り出して脾細胞を単離した。脾細胞を７日間、上記抗原（ペプチドライブラリー）からのペプチドの存在下で再刺激をするか、抗原をコードするＲＮＡを用いてエレクトロポレーションされた、野生型の同系マウスの骨髄細胞から生成された樹状細胞と共に共インキュベートした。抗原特異的細胞性免疫反応を判別するために、再刺激後にＩＮＦガンマ分泌を測定した。ＩＮＦガンマを検出するため、コートマルチスクリーンプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、ＩＮＦγに対する抗体を含む、コーティングバッファーである０．１Ｍの炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ９．６、１０．５９ｇ／ｌのＮａ_２ＣＯ_３、８．４ｇ／ｌのＮａＨＣＯ_３）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ドイツ）で一晩インキュベートした。刺激物質およびエフェクター細胞を１：２０の比率でプレート内で共に２４時間インキュベートした。プレートを１×ＰＢＳで洗浄し、ビオチン結合二次抗体でインキュベートした。１×ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄した後、プレートに基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム液体基質システム、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，ドイツ）を添加することで、視覚的に基質の変換を検出することができた。

【0156】

＜７．腫瘍チャレンジ＞
免疫化：
最後の免疫処置から１週間後に、１ Ｍｉｏ Ｂ１６メラノーマ細胞またはＴＲＡＭＰ−Ｃ１細胞をマウスの皮下に注射した。それぞれ２週間（Ｂ１６）または７週間（ＴＲＡＭＰ−Ｃ１）以内に、腫瘍の大きさを測定した。

【0157】

＜８．ｍＲＮＡワクチンの調製＞
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療用ワクチンとして用いられるための複数の抗原の組み合わせを含む本発明の活性（免疫賦活）組成物の特定の実施例を、上記記載に基づいて、以下のように調製した。例示されている本発明の活性（免疫賦活）組成物は、質量比４：１でプロタミンを用いて製剤したＮＳＣＬＣ関連抗原（配列番号４、１９、２１、２４、および２６（ＧＣに富む配列）に対応するＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、および５Ｔ４）を１つコードするｍＲＮＡをそれぞれ含む５つの成分からなる。

【0158】

（ワクチン接種）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、質量比４：１でプロタミンを用いて製剤したＮＳＣＬＣ関連抗原（配列番号４、１９、２１、２４、および２６（ＧＣに富む配列）に対応するＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、および５Ｔ４）を１つコードするｍＲＮＡをそれぞれ含む５つの成分からなるｍＲＮＡワクチンを、皮内にワクチン接種した（抗原毎、サイクル毎に６４μｇ、１サイクル毎に４回に分けて注射）。対照ワクチン接種は、ＬａｃＺをコードするＲＮＡ（コントロールｍＲＮＡ ｌａｃＺ）を、対応する合計投与量だけ用いて行った。ワクチン接種では、免疫処置を３サイクル（第１、第３、および第５週）で行った。群、マウスの数、およびマウスの種類は以下の表に示すとおりである。

【0159】

【表1】

【0160】

（抗原特異的抗体の検出）
最後のワクチン接種から６日後、血液サンプル（２００μｌ）を逆軌道で採取し、ＥＬＩＳＡを用いて血清を分析し、抗原特異的抗体サブタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの有無を調べた。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートを組換えタンパク質でコーティングし（コーティングバッファー中に１０μｇ／ｍｌの濃度でタンパク質が含まれており、３７°Ｃで４時間インキュベート）、ウェル毎に２００μｌのブロッキングバッファーを用いて、４°Ｃで一晩、ブロッキングを行った。その後、室温で４時間、サンプルを、各群のマウスから集めた血清でインキュベートし、１：３〜１：４８の範囲に希釈して、滴定した。マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａに対する特異的抗体（ブロッキングバッファにて１：３００）と共にインキュベートし、ＨＲＰ結合二次抗体（ブロッキングバッファ内に１：５００）と共にインキュベートした後、ＴＭＢ基質を加えた。比色反応はＥＬＩＳＡリーダ（Ｔｅｃａｎ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｃｒａｉｌｓｈｅｉｍ，ドイツ）を用いて、４５０ｎｍで測定した。

【0161】

（ＥＬＩＳＰＯＴ）
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を検出のために、特定刺激に対するエフェクターサイトカインＩＦＮ−γの分泌の分析は、ＥＬＩＳＰＯＴ技術を用いて単一細胞レベルで可視化することができる。

【0162】

抗原ワクチンを接種したマウスおよび対照マウスからの脾細胞を、最後のワクチン接種を行ってから６日後に単離し、抗ＩＦＮ−γ捕獲抗体（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングされた９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレートに移した。その後、細胞を、適切な抗原由来ペプチドライブラリーまたはＨＩＶ由来ライブラリーもしくはペプチドの溶媒であるＤＭＳＯの何れかによって、２４時間、３７°Ｃで刺激するか、あるいはコントロールとして純媒体でインキュベートした。ライブラリーは全て、１μｇ／ペプチド／ｍｌの濃度で用いた。インキュベート期間の後、細胞をプレートから洗い落として、細胞から分泌されたＩＦＮ−γを、マウスＩＦＮ−γ（１μｇ／ｍｌ）に対するビオチン化二次抗体、続いてストレプトアビジン−ＡＫＰを用いて検出した。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を用いてスポットを可視化し、自動化ＥＬＩＳＰＯＴリーダ（Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＣＴＬ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ ＬＬＣ）を用いて計測した。

【0163】

（統計分析）
Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて、統計分析を行った。全ての結果を平均（または中央値）±標準誤差で示した。Ｅｌｉｓｐｏｔ試験では、基底の活性が個々によって大きく異なることを踏まえ、マウス毎に、中間ウェルのスポットの数を他の全ての数値から差し引くバックグラウンド補正を行った。両側マン−ホイットニー検定法を用いて、有意水準を５％でテストグループの違いを分析した。

【0164】

（結果および考察）
マウスに、それぞれ個別にカチオンペプチドプロタミンを用いて質量比４：１で製剤した、ＮＳＣＬＣ関連抗原（配列番号４、１９、２１、２４、および２６（ＧＣに富む配列）に対応するＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、および５Ｔ４）を１つコードするｍＲＮＡをそれぞれ含む５つの成分からなるｍＲＮＡワクチンを用いて、ワクチン接種を行った。対照マウスは、ｍＲＮＡワクチンと同じ比率でプロタミンを用いて製剤された、ＬａｃＺをコードする非関連ＲＮＡで処理した。

【0165】

抗原ワクチン接種を受けたマウスおよび対照マウスから摂取した血液から単離された血清を用いて、抗原に対して特定の抗体が誘導されるかをテストした。分析した５つのタンパク質のうち、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、およびＮＹ−ＥＳＯ−１の３つでは、ｍＲＮＡワクチンを接種したマウスの血清から抗原特異的抗体を検出し、ｍＲＮＡがｉｎ
ｖｉｖｏにおいて機能的で免疫原性を有することを示した。抗体の検出に必要なタンパク質は、大腸菌で生成した。大腸菌でのタンパク質の生成が翻訳後修飾に影響を与えることがあり、用いられる抗原に関してこの点についてあまり記載がない。そのため、このことが残るタンパク質において反応がなかったことの原因となり得る。

【0166】

続いて、ｍＲＮＡワクチンの投与に対する細胞傷害性Ｔ細胞の活性を分析した。ＩＦＮ−γはＴｈ１反応の主要な媒介物であり、活性ＣＴＬから分泌される。したがって、ワクチン接種したマウスから採取した脾細胞内における抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の有無を、ＥＬＩＳＰＯＴ技術を用いて調べた。脾細胞の抗原性刺激として、制限ペプチドライブラリーを用いた。使用ヒト抗原における、マウスＭＨＣ（Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＨ−２Ｋ^ｂおよびＨ−２Ｄ^ｂ）にとって明確に識別可能なエピトープが知られていないため、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩデータベースを検索して、潜在的な結合親和力をもとに選択される、ペプチドの仮想選択を用いる必要があった。タンパク質の配列全体におよぶペプチドライブラリー（１１のアミノ酸が部分的に一致している１５ｍｅｒ）の中で、仮定的に最も良いエピトープを含む１５ｍｅｒを選択し、最大で１８ペプチドまで集めた。しかしながら、これらの種類は必ずしも正しいエピトープを含んでいるとは限らず、これらのツールを補助として用いた免疫反応の検出において、擬陰性の結果が容易に生じ得る。とはいうものの、ＮＹ−ＥＳＯ−１および５Ｔ４に由来するこれらライブラリーのうちの２つからの刺激は、ｍＲＮＡワクチン接種を受けたマウスの脾細胞においては高ＩＦＮ−γ分泌を引き起こし、非関連タンパク質であるβ−ガラクトシダーゼをコードするｍＲＮＡをワクチン接種した対照マウスの脾細胞では高ＩＦＮ−γ分泌を引き起こさなかった。いずれの脾細胞も、ＨＩＶ由来コントロールペプチドライブラリーには反応しなかった。媒体単独でインキュベートした脾細胞によるＩＦＮ−γスポットの数は、新しく単離された細胞の基底の活性を表す。基底の活性が個々によって大きく異なることを受け、中間ウェルのスポットの数を他の全ての数値から差し引くバックグラウンド補正を個々について行った。

【0167】

これらの実験の結果を図２７から図３４に示す。

【図面の簡単な説明】

【0168】

【図1】ＭＵＣ１（ＨｓＭＵＣ１−５×ＶＮＴＲ（野生型配列は通常４０個のタンデムリピートであるが、クローニング上の理由により、５個のタンデムリピートまで減少。）をコードしており、ＧＣ含量：６１．２７％、長さ：１６６８ｂｐであるＲＮＡ配列（配列番号１）（野生型に基づく開始配列）を示す図である。

【図2】ＭＵＣ１（ＨｓＭＵＣ１ ＧＣ−５×ＶＮＴＲ、１．最大ＧＣ、２．コドン使用）をコードしており、ＧＣ含量：７３．５６％、長さ：１６６８ｂｐである（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号２）を示す図である。塩基配列（図１（配列番号１））との違いは、３９８／１６６８塩基＝２３．８６％である。

【図3】５Ｔ４（Ｈｓ５Ｔ４（栄養膜糖タンパク質ＴＰＢＧ）をコードしており、ＧＣ含量：６１．６０％、長さ：１２６３ｂｐであるＲＮＡ配列（配列番号３）（野生型に基づく開始配列）を示す図である。

【図4】５Ｔ４（Ｈｓ５Ｔ４ ＧＣ、１．最大ＧＣ、２．コドン使用）をコードしており、ＧＣ含量：７０．４７％、長さ：１２６３ｂｐである（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号４）を示す図であり、。塩基配列（図３（配列番号３））との違いは、２４７／１２６３塩基＝１９．５６％である。

【図5】Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（ＨｓＨｅｒ２／ｎｅｕ（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２））をコードしており、ＧＣ含量：６０．７８％、長さ：３７６８ｂｐであるＲＮＡ配列（配列番号５）（野生型に基づいた開始配列）を示す図である。

【図6】Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（ＨｓＨｅｒ２／ｎｅｕ ＧＣ、１．最大ＧＣ、２．コドン使用）をコードしており、ＧＣ含量：７０．５４％、長さは：３７６８ｂｐである（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号６）を示す図である。塩基配列（図５（配列番号５））との違いは、７７２／３７６８塩基＝２０．４９％である。

【図7】ｈＴＥＲＴ（ＨｓＴＥＲＴ（テロメラーゼ逆転写酵素）をコードしており、ＧＣ含量：６６．０８％、長さ：３３９９ｂｐであるＲＮＡ配列（配列番号７）（野生型に基づく開始配列）を示す図である。

【図8】ｈＴＥＲＴ（ＨｓＴＥＲＴ ＧＣ、１．最大ＧＣ、２．コドン使用）をコードしており、ＧＣ含量：７２．９６％、長さ：３３９９ｂｐである（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号８）を示す図である。塩基配列（図７（配列番号７））との違いは、５６６／３３９９塩基＝１６．６５％である。

【図9】ＷＴ１（ＨｓＷＴ１（ウィルムス腫瘍１））をコードしており、ＧＣ含量：６１．７８％、長さ：１５５４ｂｐであるＲＮＡ配列（配列番号９）（野生型に基づく開始配列）を示す図である。

【図10】図１０Ａ）は、ＷＴ１（ＨｓＷＴ１（ウィルムス腫瘍１））をコードしており、配列の領域３２５−４０８において野生型配列の対応する領域と比べてＧＣ含量が減少しているＲＮＡ配列（配列番号１０）を示す図であり、図１０Ｂ）、Ｃ）、およびＤ）は、以下の対応する領域３２５−４０８との比較結果を示している：Ｂ）では、図９（配列番号９）に係る野生型配列との比較、Ｃ）では、図１１（配列番号１１）に係るＧＣが最大化された配列との比較、およびＤ）では、図１０（配列番号１０）に係るＧＣが低減された配列との比較を示す。なお、これらは全て異なるＧＣパターンを示している。

【図11】ＷＴ１（ＨｓＷＴ１ ＧＣ、１．最大ＧＣ、２．コドン使用）をコードしており、ＧＣ含量：７２．５９％、長さ：１５５４ｂｐである（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号１１）を示す図である。塩基配列（図９（配列番号９））との違いは、３２２／１５５４塩基＝２０．７２％である。

【図12】ＣＥＡ（ＣＥＡ（癌胎児性抗原）ＨｓＣＥＡＣＡＭ５）をコードしており、ＧＣ含量：５２．２０％、長さ：２１０９ｂｐであるＲＮＡ配列（配列番号１２）（野生型に基づく開始配列）を示す図である。

【図13】ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５ ＧＣ、１．最大ＧＣ、２．コドン使用、既に配置済み）をコードしており、ＧＣ含量：６６．２４％、長さ：２１０９ｂｐである（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号１３）を示す図である。塩基配列（図１２（配列番号１２）との違いは、４９５／２１０９塩基＝２３．４７％である。

【図14】ＭＡＧＥ−Ａ２（ＨｓＭＡＧＥ−Ａ２（メラノーマ抗原ファミリーＡ，２）ＨｓＭＡＧＥ−Ａ２Ｂ）をコードしており、ＧＣ含量：５５．８７％、長さ：９４５ｂｐであるＲＮＡ配列（配列番号１４）（野生型に基づく開始配列）を示す図である。

【図15】ＭＡＧＥ−Ａ２（ＨｓＭＡＧＥ−Ａ２Ｂ ＧＣ、１．最大ＧＣ、２．コドン使用）をコードしており、ＧＣ含量：６８．５７％、長さ：９４５ｂｐである（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号１５）を示す図である。塩基配列（図１４（配列番号１４））との違いは、１８７／９４５塩基＝１９．７９％である。

【図16】ＭＡＧＥ−Ａ３（ＭＡＧＥ−Ａ３（メラノーマ抗原ファミリーＡ，３）ＭＡＧＥ−Ａ３）をコードしており、ＧＣ含量：５６．３０％、長さ：９４５ｂｐであるＲＮＡ配列（配列番号１６）（野生型に基づく開始配列）を示す図である。

【図17】ＭＡＧＥ−Ａ３（ＭＡＧＥ−Ａ３ ＧＣ、１．最大ＧＣ、２．コドン使用、ＧＣに富んでいることは既知）をコードしており、ＧＣ含量：６９．００％、長さ：９４５ｂｐである（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号１７）を示す図である。塩基配列（図１６（配列番号１６））との違いは、１９０／９４５塩基＝２０．１１％である。

【図18】Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（バキュロウイルスＩＡＰリピート含有５、ＢＩＲＣ５）ＨｓＳｕｒｖｉｖｉｎ（ｗｔ））をコードしており、ＧＣ含量：５２．６８％、長さ：４２９ｂｐであるＲＮＡ配列（配列番号１８）（野生型に基づく開始配列）を示す図である。

【図19】Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（ＨｓＳｕｒｖｉｖｉｎ（ＧＣ）、１．最大ＧＣ、２．コドン使用、ＧＣに富んでいることは既知）をコードしており、ＧＣ含量：６５．２７％、長さ：４２９ｂｐである（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号１９）を示す図である。塩基配列（図１８（配列番号１８））との違いは、７２／４２９塩基＝１６．７８％である。

【図20】ＮＹ−ＥＳＯ−１（ホモサピエンスＮＹ−ＥＳＯ−１（ＮＹ−ＥＳＯ−１（ｗｔ））をコードしており、ＧＣ含量：６７．４％であるＲＮＡ配列（配列番号２０）（野生型に基づく開始配列）を示す図である。

【図21】ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＧＣ））をコードしており、ＧＣ含量７９．５６％、（ＧＣに富んでいることは既知）である（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号２１）を示す図である。ｗｔ（図２０（配列番号２０））との違いは、１１２／５４３塩基、２０．６３％である。

【図22】ＭＡＧＥ−Ｃ１（ＨｓＭＡＧＥＣ１（メラノーマ抗原ファミリーＣ，１）ＨｓＭＡＧＥＣ１（ｗｔ））をコードしており、ＧＣ含量：５１．８６％、長さ：３４２９ｂｐであるＲＮＡ配列（配列番号２２）（野生型に基づく開始配列）を示す図である。

【図23】ＭＡＧＥ−Ｃ１（ＨｓＭＡＧＥＣ１（ＧＣ）、１．最大ＧＣ、２．コドン使用）をコードしており、ＧＣ含量：６８．７３％、長さ：３４２９ｂｐである（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号２３）を示す図である。塩基配列（図２２（配列番号２２））との違いは、９６４／３４２９塩基＝２８．１１％である。

【図24】短縮ＭＡＧＥ−Ｃ１（ＨｓＭＡＧＥＣ１（ＧＣ）、１．最大ＧＣ、２．コドン使用）をコードする（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号２４）を示す図である。塩基配列（図２２（配列番号２２））と比較して、繰り返し領域を欠失し、始めの開始コドン（ＡＴＧ）に続く図２４に係る配列は、ＧＣ最大化野生型配列（図２３（配列番号２３））の６１３番目のアミノ酸から始まる。

【図25】ＭＡＧＥ−Ｃ２（ＨｓＭＡＧＥ−Ｃ２（メラノーマ抗原ファミリーＣ，２）ＨｓＭＡＧＥ−Ｃ２）をコードしており、ＧＣ含量：５０．８１％、長さ：１１２２ｂｐであるＲＮＡ配列（配列番号２５）（野生型に基づく開始配列）を示す図である。

【図26】ＭＡＧＥ−Ｃ２（ＨｓＭＡＧＥ−Ｃ２ ＧＣ、１．最大ＧＣ、２．コドン使用）をコードしており、ＧＣ含量：６６．５８％、長さ：１１２２ｂｐである（ＧＣ）安定化ＲＮＡ配列（配列番号２６）を示す図である。塩基配列（図２５（配列番号２５））との違いは、２６４／１１２２塩基＝２３．５３％である。

【図27】質量比４：１でプロタミンを用いて製剤したＮＳＣＬＣ関連抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、および５Ｔ４）を１つコードするｍＲＮＡをそれぞれ含む５つの成分からなるｍＲＮＡワクチンをワクチン接種したマウスにおける、腫瘍抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１に特異的なＩｇＧ１抗体の有無を示す図である。

【図28】質量比４：１でプロタミンを用いて製剤したＮＳＣＬＣ関連抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、および５Ｔ４）を１つコードするｍＲＮＡをそれぞれ含む５つの成分からなるｍＲＮＡワクチンをワクチン接種したマウスにおける、腫瘍抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１に特異的なＩｇＧ２ａ抗体の有無を示す図である。

【図29】質量比４：１でプロタミンを用いて製剤したＮＳＣＬＣ関連抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、および５Ｔ４）を１つコードするｍＲＮＡをそれぞれ含む５つの成分からなるｍＲＮＡワクチンをワクチン接種したマウスにおける、腫瘍抗原ＭＡＧＥ−Ｃ１に特異的なＩｇＧ１抗体の有無を示す図である。

【図30】質量比４：１でプロタミンを用いて製剤したＮＳＣＬＣ関連抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、および５Ｔ４）を１つコードするｍＲＮＡをそれぞれ含む５つの成分からなるｍＲＮＡワクチンをワクチン接種したマウスにおける、腫瘍抗原ＭＡＧＥ−Ｃ１に特異的なＩｇＧ２ａ抗体の有無を示す図である。

【図31】質量比４：１でプロタミンを用いて製剤したＮＳＣＬＣ関連抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、および５Ｔ４）を１つコードするｍＲＮＡをそれぞれ含む５つの成分からなるｍＲＮＡワクチンをワクチン接種したマウスにおける、腫瘍抗原ＭＡＧＥ−Ｃ２に特異的なＩｇＧ１抗体の有無を示す図である。

【図32】質量比４：１でプロタミンを用いて製剤したＮＳＣＬＣ関連抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、および５Ｔ４）を１つコードするｍＲＮＡをそれぞれ含む５つの成分からなるｍＲＮＡワクチンをワクチン接種したマウスにおける、腫瘍抗原ＭＡＧＥ−Ｃ２に特異的なＩｇＧ２ａ抗体の有無を示す図である。

【図33】質量比４：１でプロタミンを用いて製剤したＮＳＣＬＣ関連抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、および５Ｔ４）を１つコードするｍＲＮＡをそれぞれ含む５つの成分からなるｍＲＮＡワクチンをワクチン接種したマウスにおける、腫瘍抗原５Ｔ４に対する抗原特異的Ｔリンパ球の誘発を示す図である。

【図34】質量比４：１でプロタミンを用いて製剤したＮＳＣＬＣ関連抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、および５Ｔ４）を１つコードするｍＲＮＡをそれぞれ含む５つの成分からなるｍＲＮＡワクチンをワクチン接種したマウスにおける、腫瘍抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗原特異的Ｔリンパ球の誘発を示す図である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]