特許 6033229 ＮＯＴＵＭペクチンアセチルエステラーゼと結合する抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6033229

(24)【登録日】2016年11月4日

(45)【発行日】2016年11月30日

(54)【発明の名称】ＮＯＴＵＭペクチンアセチルエステラーゼと結合する抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20161121BHJP

   C07K 16/40 20060101ALI20161121BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20161121BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20161121BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20161121BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20161121BHJP

   C12N 5/12 20060101ALI20161121BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20161121BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20161121BHJP

   A61P 19/10 20060101ALI20161121BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20161121BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C07K16/40

   C07K16/46

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/12

   A61K39/395 N

   A61P19/08

   A61P19/10

   !C12P21/08

【請求項の数】28

【全頁数】88

(21)【出願番号】特願2013-541012(P2013-541012)

(86)(22)【出願日】2011年11月22日

(65)【公表番号】特表2014-501513(P2014-501513A)

(43)【公表日】2014年1月23日

(86)【国際出願番号】US2011061785

(87)【国際公開番号】WO2012071381

(87)【国際公開日】20120531

【審査請求日】2014年11月6日

(31)【優先権主張番号】61/416,927

(32)【優先日】2010年11月24日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】508192566

【氏名又は名称】レクシコン ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ブロメイジ ロバート ジョセフ ジュニア

(72)【発明者】

【氏名】フォン シャオ

(72)【発明者】

【氏名】ホン ソクジュ

(72)【発明者】

【氏名】ランデス グレゴリー

(72)【発明者】

【氏名】リュウ ジェフ

(72)【発明者】

【氏名】ポッター デイビッド ジョージ

(72)【発明者】

【氏名】パウウェル デイビッド リード

【審査官】 坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００５／０１４８１８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５３９４６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Cancer Sci.，２００８年，Vol.99, No.6，p.1139-1146

【文献】 骨粗しょう症治療，２００９年，Vol.8, No.4，p.345-348

【文献】 Journal of Pathology，２００９年，Vol.218, No.2，p.201-209

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＮｏｔｕｍペクチンアセチルエステラーゼ（ＮＯＴＵＭ）と結合し；
ＮＯＴＵＭの少なくとも１つの活性を中和し；
ｉｎ ｖｉｔｒｏの８−オクタノイルオキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム（ＯＰＴＳ）アッセイにおいてＮＯＴＵＭ活性を減少させ、かつｉｎ ｖｉｔｒｏのＷｎｔシグナル伝達アッセイにおいてＮＯＴＵＭ活性を減少させ；かつ
ａ）配列番号９４のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する抗体の結合親和性よりも少なくとも５倍強力な結合親和性で、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する、及び／又は
ｂ）配列番号９９のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する抗体の結合親和性よりも少なくとも５倍強力な結合親和性で、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する；
モノクローナル抗体。

【請求項2】

マウスＮＯＴＵＭ、モルモットＮＯＴＵＭ、カニクイザルＮＯＴＵＭ、およびアカゲザルＮＯＴＵＭから選択されるＮＯＴＵＭと結合する、請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

対象に投与された際、ｉｎ ｖｉｖｏで血清ＰＩＮＰレベルを増加させ、ｉｎ ｖｉｖｏで骨塩密度を増加させ、ｉｎ ｖｉｖｏで大腿骨骨幹中央部の皮質厚を増加させ、ｉｎ ｖｉｖｏで大腿骨骨幹中央部の骨領域を増加させ、ｉｎ ｖｉｖｏで上腕骨骨幹中央部の皮質厚を増加させ、ｉｎ ｖｉｖｏで皮質内骨形成を増加させ、ｉｎ ｖｉｖｏでＬＶ５椎体における皮質骨体積の比率を増加させ、および／またはｉｎ ｖｉｖｏで大腿骨頸部総体積に対する大腿骨頚部骨体積の比率を増加させる、請求項１〜２のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項4】

配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、５０ｎＭ未満のＫ_Ｄで結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項5】

前記Ｋ_Ｄが２０ｎＭ未満である、請求項４に記載の抗体。

【請求項6】

前記Ｋ_Ｄが１０ｎＭ未満のＫ_Ｄである、請求項５に記載の抗体。

【請求項7】

以下から選択される、少なくとも１つの結合特性を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体：
ａ）配列番号８４のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する抗体の結合親和性よりも少なくとも５倍強力な結合親和性で、配列番号８３のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する；
ｂ）配列番号８６のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する抗体の結合親和性よりも少なくとも５倍強力な結合親和性で、配列番号８５のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する；
ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する抗体の結合親和性よりも少なくとも５倍強力な結合親和性で、配列番号９５のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する；
ｄ）ＮＯＴＵＭに対する結合において、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体と競合する；
ｅ）ＮＯＴＵＭに対する結合において、配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体と競合する；
ｆ）ＮＯＴＵＭに対する結合において、配列番号３１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体と競合する；
ｇ）ＮＯＴＵＭに対する結合において、配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号４０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体と競合する；ならびに
ｈ）ＮＯＴＵＭに対する結合において、配列番号５５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体と競合する。

【請求項8】

マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項9】

重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖が、以下から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体：
ａ）配列番号１７、２５、３３、４１、および９０から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；
ｂ）配列番号１８、２６、３４、及び４２から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；ならびに
ｃ）配列番号１９、２７、３５、４３、および９１から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３。

【請求項10】

前記重鎖が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含むセットを含み、前記セットが以下から選択される、請求項９に記載の抗体：
ａ）配列番号９０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号９１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；
ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；
ｃ）配列番号９０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；
ｄ）配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；
ｅ）配列番号９０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号９１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；
ｆ）配列番号３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；
ｇ）配列番号４１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号４３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；ならびに
ｈ）配列番号５７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号５９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット。

【請求項11】

前記重鎖が、配列番号１５、２３、３１、３９、６３、６７、７１、７５、および７９から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１０に記載の抗体。

【請求項12】

重鎖および軽鎖を含み、前記軽鎖が以下から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体：
ａ）配列番号２０、２８、３６、４４、６０、および９２から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；
ｂ）配列番号２１、２９、３７、４５、６１、および９３から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；ならびに
ｃ）配列番号２２、３０、３８、４６、および６２から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３。

【請求項13】

前記軽鎖がＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含むセットを含み、前記セットが以下から選択される、請求項１２に記載の抗体：
ａ）配列番号９２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号９３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；
ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；
ｃ）配列番号９２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号９３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；
ｄ）配列番号２８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；
ｅ）配列番号９２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号９３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；
ｆ）配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；
ｇ）配列番号４４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号４６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；ならびに
ｈ）配列番号６０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号６２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット。

【請求項14】

前記軽鎖が、配列番号１６、２４、３２、４０、５６、６５、６９、７３、７７、および８１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１３に記載の抗体。

【請求項15】

重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで：
ａ）前記重鎖可変領域が、配列番号９０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号９１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、ならびに前記軽鎖可変領域が、配列番号９２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号９３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むか；または
ｂ）前記重鎖可変領域が、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、ならびに前記軽鎖可変領域が、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むか；または
ｃ）前記重鎖可変領域が、配列番号９０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、ならびに前記軽鎖可変領域が、配列番号９２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号９３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むか；または
ｄ）前記重鎖可変領域が、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、ならびに前記軽鎖可変領域が、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むか；または
ｅ）前記重鎖可変領域が、配列番号９０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号９１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、ならびに前記軽鎖可変領域が、配列番号９２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号９３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むか；または
ｆ）前記重鎖可変領域が、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、ならびに前記軽鎖可変領域が、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３か；または
ｇ）前記重鎖可変領域が、配列番号４１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号４３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、ならびに前記軽鎖可変領域が、配列番号４４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号４６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むか；または
ｈ）前記重鎖可変領域が、配列番号５７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号５９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、ならびに前記軽鎖可変領域が、配列番号６０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号６２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む；
請求項１に記載の抗体。

【請求項16】

ａ）前記重鎖可変領域が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖可変領域が配列番号１６のアミノ酸配列を含むか；または
ｂ）前記重鎖可変領域が配列番号７１のアミノ酸配列み、および前記軽鎖可変領域が配列番号７３のアミノ酸配列を含むか；または
ｃ）前記重鎖が配列番号７２のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖が配列番号７４のアミノ酸配列を含むか；または
ｄ）前記重鎖可変領域が配列番号２３のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖可変領域が配列番号２４のアミノ酸配列を含むか；または
ｅ）前記重鎖可変領域が配列番号７５のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖可変領域が配列番号７７のアミノ酸配列を含むか；または
ｆ）前記重鎖が配列番号７６のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖が配列番号７８のアミノ酸配列を含むか；または
ｇ）前記重鎖可変領域が配列番号３１のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖可変領域が配列番号３２のアミノ酸配列を含むか；または
ｈ）前記重鎖可変領域が配列番号７９のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖可変領域が配列番号８１のアミノ酸配列を含むか；または
ｉ）前記重鎖が配列番号８０のアミノ酸配列を含むみ、および前記軽鎖が配列番号８２のアミノ酸配列を含むか；または
ｊ）前記重鎖可変領域が配列番号３９のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖可変領域が配列番号４０のアミノ酸配列を含むか；または
ｋ）前記重鎖可変領域が配列番号６７のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖可変領域が配列番号６９のアミノ酸配列を含むか；または
ｌ）前記重鎖が配列番号６８のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖が配列番号７０のアミノ酸配列を含むか；または
ｍ）前記重鎖可変領域が配列番号５５のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖可変領域が配列番号５６のアミノ酸配列を含むか；または
ｎ）前記重鎖可変領域が配列番号６３のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖可変領域が配列番号６５のアミノ酸配列を含むか；または
ｏ）前記重鎖が配列番号６４のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖が配列番号６６のアミノ酸配列を含む；
請求項１５に記載の抗体。

【請求項17】

請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体を含む、医薬組成物。

【請求項18】

請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体の重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含む、核酸分子。

【請求項19】

前記重鎖をコードする第１のポリヌクレオチド配列および前記軽鎖をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載の核酸分子。

【請求項20】

核酸分子がベクターである、請求項１８または請求項１９に記載の核酸分子。

【請求項21】

請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。

【請求項22】

重鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１の核酸分子および軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の核酸分子を含む、請求項２１に記載の宿主細胞。

【請求項23】

前記核酸分子が、前記重鎖をコードする第１のポリヌクレオチド配列および前記軽鎖をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の宿主細胞。

【請求項24】

請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体の作製方法であって、前記抗体を発現させるのに十分な条件下で、請求項２２または請求項２３に記載の宿主細胞をインキュベートすることを含む、前記方法。

【請求項25】

患者における皮質内骨形成促進用である、請求項１７に記載の医薬組成物。

【請求項26】

患者における骨損傷を特徴とする疾患または障害の治療、管理、または予防用である、請求項１７に記載の医薬組成物。

【請求項27】

前記疾患または障害が骨粗鬆症である、請求項１７に記載の医薬組成物。

【請求項28】

請求項１７に記載の医薬組成物を含む、単一の単位剤形。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１０年、１１月２４日に出願された、米国特許仮出願第６１／４１６，９２７号の利益を主張するものであり、その全体がすべての目的のために、参照により本明細書に組み込まれるものとする。

【0002】

本発明は、Ｎｏｔｕｍペクチンアセチルエステラーゼの抗体阻害剤、それらを含む組成物、およびそれらの使用方法に関する。

【背景技術】

【0003】

骨の健康は、骨を形成する骨芽細胞と骨を再吸収する破骨細胞の、強調した活動に依存する。「骨代謝は、これらの同化および異化の細胞機能間のバランスを反映し、成熟した骨格が、損傷した際、それ自体を修復することができ、かつその内分泌機能を、ミネラル類、例えばカルシウムおよび亜リン酸の血液循環中への放出により維持できることを確実にする。」Allen, J.G. et al., J. Med. Chem., 53 (June 10, 2010), pp. 4332 - 4353, 4332。多くの疾患状態はこのバランスを変化させ、結果として、骨質量の増加もしくは減少、または骨質の変化を引き起こす。骨塩密度の段階的な損失は骨減少症として知られ、重篤な骨の損失は骨粗鬆症として知られている。同文献。

【0004】

骨粗鬆症の治療および予防のための現在の標準治療においては、ビスホスホネートクラスの、経口、低分子の再吸収阻害薬が使用される。同文献、４３３３頁。ゾレドロン酸、ラロキシフェン、カルシウム、およびビタミンＤサプリメントもまた、骨粗鬆症治療において、一般的に使用される。同文献。再吸収阻害薬は、骨量減少の予防に寄与し得るが、同化剤「は、骨質量をより大幅に増加させることができ、…および骨質を改善し、骨強度を増加する能力をも有する」Guo, H., et al., J. Med. Chem., 53 (February 25, 2010), pp. 1819 - 1829, 1819。米国においては、ヒトＰＴＨが、ＦＤＡに認可された唯一の同化剤である。同文献；Ａｌｌｅｎ、４３３３頁。「骨粗鬆症治療のために利用可能な同化剤が不足しているため、この疾患を治療するための、非毒性で費用対効果が高く、かつ容易に投与できる低分子化合物を、至急開発する必要がある。」Ｇｕｏ、１８１９頁。

【0005】

「骨形成を促進する薬剤の開発は、再吸収抑制治療と比較して進歩が遅れているが、いくつかの経路が骨芽細胞の機能を促進することが知られている。」Ａｌｌｅｎ、４３３８頁。これらの経路としては、骨形態形成タンパク質、形質転換増殖因子β、副甲状腺ホルモン、インスリン様成長因子、線維芽細胞増殖因子、および無翅型ＭＭＴＶ統合部位（ＷＮＴ）のシグナル伝達が挙げられる。同文献。Ｇｕｏおよび共同研究者らは、最近、これら経路の最初のものに関する研究結果を報告した。Ｇｕｏ、上述の通り。より詳細には、彼らは、ある特定の置換ベンゾチオフェンおよびベンゾフラン化合物が、マウスおよびラットにおいて、骨形態形成タンパク質２の発現を促進することを報告した。報告によれば、該化合物のうちの２つは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける骨形成および小柱結合性の修復を促進するということである。同文献、１８１９頁。

【0006】

これらの経路のもう１つはＷＮＴ経路であり、これは多様な発達および再生プロセスに関わっている。Ａｌｌｅｎ、４３４０頁。しかしながら、この経路は複雑であり、その詳細およびその成分がどのように骨に影響を及ぼすかに関しては、不明のままである。例えば、ＬＲＰ−５（その変異がヒトにおける骨質量の増加と関連している）およびβ−カテニン（これを介して基準のＷＮＴシグナル伝達が発生する）「が、骨質量の制御に、ＷＮＴシグナル伝達を介して直接関連してはいない可能性がある」ということが、示唆されている。同文献。

【0007】

遺伝子発現データの最近の分析により、ＷＮＴシグナル伝達の新たな標的の特定に至っている。例えば、Torisu, Y., et al., Cancer Sci., 99(6):1139-1146, 1143 (2008)を参照のこと。１つのそのような標的は、ＮＯＴＵＭおよびＬＯＣ１７４１１１としても知られる、Ｎｏｔｕｍペクチンアセチルエステラーゼである。

【発明の概要】

【0008】

いくつかの実施形態において、ヒトＮｏｔｕｍペクチンアセチルエステラーゼ（ＮＯＴＵＭ）と結合し、少なくとも１つのＮＯＴＵＭの活性を中和するモノクローナル抗体が提供される。いくつかの実施形態において、抗体は、マウスＮＯＴＵＭ、モルモットＮＯＴＵＭ、カニクイザルＮＯＴＵＭ、およびアカゲザルＮＯＴＵＭから選択される、ＮＯＴＵＭと結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、以下から選択される、少なくとも１つの活性を有する：ｉｎ ｖｉｔｒｏの８−オクタノイルオキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム（ＯＰＴＳ）アッセイにおけるＮＯＴＵＭ活性を減少させること；およびｉｎ ｖｉｔｒｏのＷｎｔシグナル伝達アッセイにおけるＮＯＴＵＭ活性を減少させること。いくつかの実施形態において、抗体は、以下から選択される、少なくとも１つの活性を有する：ｉｎ ｖｉｖｏで血清ＰＩＮＰレベルを増加させること；ｉｎ ｖｉｖｏで骨塩密度を増加させること；ｉｎ ｖｉｖｏで大腿骨骨幹中央部の皮質厚を増加させること、ｉｎ ｖｉｖｏで大腿骨骨幹中央部の骨領域を増加させること；ｉｎ ｖｉｖｏで上腕骨骨幹中央部の皮質厚を増加させること；ｉｎ ｖｉｖｏで皮質内骨形成を増加させること；ｉｎ ｖｉｖｏでＬＶ５椎体における皮質骨体積の比率を増加させること；およびｉｎ ｖｉｖｏで大腿骨頸部総体積に対する、大腿骨頚部の骨体積の比率を増加させること。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭと結合する抗体は、５０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、または１０ｎＭ未満のＫ_Ｄで、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する。

【0009】

いくつかの実施形態において、抗体は、以下から選択される、少なくとも１つの結合特性を有する：ａ）配列番号８４のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する抗体の結合親和性よりも少なくとも５倍強力な結合親和性で、配列番号８３のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する；ｂ）配列番号８６のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する抗体の結合親和性よりも少なくとも５倍強力な結合親和性で、配列番号８５のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する；ｃ）配列番号９４のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する抗体の結合親和性よりも少なくとも５倍強力な結合親和性で、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する；ｄ）配列番号９９のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する抗体の結合親和性よりも少なくとも５倍強力な結合親和性で、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する；ｅ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する抗体の結合親和性よりも少なくとも５倍強力な結合親和性で、配列番号９５のアミノ酸配列を有するポリペプチドと結合する；ｆ）ＮＯＴＵＭに対する結合において、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体と競合する；ｇ）ＮＯＴＵＭに対する結合において、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体と競合する；ｈ）ＮＯＴＵＭに対する結合において、配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体と競合する；ｉ）ＮＯＴＵＭに対する結合において、配列番号３１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体と競合する；ｊ）ＮＯＴＵＭに対する結合において、配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号４０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体と競合する；ｋ）ＮＯＴＵＭに対する結合において、配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体と競合する；ならびにｌ）ＮＯＴＵＭに対する結合において、配列番号５５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体と競合する。

【0010】

いくつかの実施形態において、抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体から選択される。

【0011】

いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭと結合する抗体は、重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖は、以下から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む：ａ）配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９、および９０から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；ｂ）配列番号１０、１８、２６、３４、４２、および５０から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；ならびにｃ）配列番号１１、１９、２７、３５、４３、５１、および９１から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３。いくつかの実施形態において、重鎖はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含むセットを含み、前記セットは以下から選択される：ａ）配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；ｂ）配列番号９０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号９１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；ｃ）配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；ｄ）配列番号９０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；ｅ）配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；ｆ）配列番号９０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号９１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；ｇ）配列番号３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；ｈ）配列番号４１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号４３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；ｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号５１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；ならびにｊ）配列番号５７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号５９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット。いくつかの実施形態において、重鎖は、配列番号７、１５、２３、３１、３９、４７、６３、６７、７１、７５、および７９から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。

【0012】

いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭと結合する抗体は、重鎖および軽鎖を含み、前記軽鎖は、以下から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む：ａ）配列番号１２、２０、２８、３６、４４、５２、および９２から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；ｂ）配列番号１３、２１、２９、３７、４５、５３、６１、および９３から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；ならびにｃ）配列番号１４、２２、３０、３８、４６、５４、および６２から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３。いくつかの実施形態において、軽鎖はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含むセットを含み、ここで前記セットは、以下から選択される：ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；ｂ）配列番号９２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号９３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；ｄ）配列番号９２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号９３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；ｅ）配列番号２８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；ｆ）配列番号９２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号９３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；ｇ）配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；ｈ）配列番号４４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号４６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；ｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号５４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット；ならびにｊ）配列番号６０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号６２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むセット。いくつかの実施形態において、軽鎖は、配列番号８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６５、６９、７３、７７、および８１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0013】

いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭと結合する抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで：ａ）前記重鎖可変領域は、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、ならびに前記軽鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むか；またはｂ）前記重鎖可変領域は、配列番号９０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号９１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、ならびに前記軽鎖可変領域は、配列番号９２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号９３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むか；またはｃ）前記重鎖可変領域は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、ならびに前記軽鎖可変領域は、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列および配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むか；またはｄ）前記重鎖可変領域は、配列番号９０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、ならびに前記軽鎖可変領域は、配列番号９２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号９３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むか；またはｅ）前記重鎖可変領域は、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、ならびに前記軽鎖可変領域は、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むか；またはｆ）前記重鎖可変領域は、配列番号９０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号９１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、ならびに前記軽鎖可変領域は、配列番号９２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号９３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むか；またはｇ）前記重鎖可変領域は、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、ならびに前記軽鎖可変領域は、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むか；またはｈ）前記重鎖可変領域は、配列番号４１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号４３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、ならびに前記軽鎖可変領域は、配列番号４４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号４６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むか；またはｉ）前記重鎖可変領域は、配列番号４９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号５１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、ならびに前記軽鎖可変領域は、配列番号５２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号５４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むか；またはｊ）前記重鎖可変領域は、配列番号５７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号５９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、ならびに前記軽鎖可変領域は、配列番号６０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号６２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む。

【0014】

いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭと結合する抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで：ａ）前記重鎖可変領域は配列番号７のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖可変領域は配列番号８のアミノ酸配列を含むか；またはｂ）前記重鎖可変領域は配列番号１５のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖可変領域は配列番号１６のアミノ酸配列を含むか；またはｃ）前記重鎖可変領域は配列番号７１のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖可変領域は配列番号７３のアミノ酸配列を含むか；またはｄ）前記重鎖は配列番号７２のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖は配列番号７４のアミノ酸配列を含むか；またはｅ）前記重鎖可変領域は配列番号２３のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖可変領域は配列番号２４のアミノ酸配列を含むか；またはｆ）前記重鎖可変領域は配列番号７５のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖可変領域は配列番号７７のアミノ酸配列を含むか；またはｇ）前重鎖は配列番号７６のアミノ酸配列を含み、および軽鎖は配列番号７８のアミノ酸配列を含むか；またはｈ）前記重鎖可変領域は配列番号３１のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖可変領域は配列番号３２のアミノ酸配列を含むか；またはｉ）前記重鎖可変領域は配列番号７９のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖可変領域は配列番号８１のアミノ酸配列を含むか；またはｊ）前記重鎖は配列番号８０のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖は配列番号８２のアミノ酸配列を含むか；またはｋ）前記重鎖可変領域は配列番号３９のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖可変領域は配列番号４０のアミノ酸配列を含むか；またはｌ）前記重鎖可変領域は配列番号６７のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖可変領域は配列番号６９のアミノ酸配列を含むか；またはｍ）前記重鎖は配列番号６８のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖は配列番号７０のアミノ酸配列を含むか；またはｎ）前記重鎖可変領域は配列番号４７のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖可変領域は配列番号４８のアミノ酸配列を含むか；またはｏ）前記重鎖可変領域は配列番号５５のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖可変領域は配列番号５６のアミノ酸配列を含むか；またはｐ）前記重鎖可変領域は配列番号６３のアミノ酸配列を含み、および前記軽鎖可変領域は配列番号６５のアミノ酸配列を含むか；またはｑ）前記重鎖は配列番号６４のアミノ酸配列を含み、および前軽鎖は配列番号６６のアミノ酸配列を含む。

【0015】

いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭと結合し、かつＮＯＴＵＭの少なくとも１つの活性を中和する抗体の重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含む、核酸分子が提供される。いくつかの実施形態において、核酸分子は、重鎖をコードする第１のポリヌクレオチド配列、および軽鎖をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子はベクターである。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭと結合し、かつＮＯＴＵＭの少なくとも１つの活性を中和する抗体の重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含む、核酸分子を含む、宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態において、重鎖をコードする第１のポリヌクレオチド配列、および軽鎖をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む、宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、重鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１の核酸分子、および軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭと結合し、かつＮＯＴＵＭの少なくとも１つの活性を中和する抗体の作製方法が提供され、前記方法には、抗体を発現するために十分な条件下で宿主細胞をインキュベートすることが含まれる。

【0016】

いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭと結合し、かつＮＯＴＵＭの少なくとも１つの活性を中和する抗体を含む、医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態において、患者における皮質内骨形成を促進する方法が提供され、前記方法には、有効量の医薬組成物を投与することが含まれる。いくつかの実施形態において、患者における骨損失を特徴とする疾患または障害を治療、管理、または予防する方法が提供され、前記方法には、有効量の医薬組成物を投与することが含まれる。いくつかの実施形態において、疾患または障害は骨粗鬆症である。いくつかの実施形態において、医薬組成物を含む、単一の単位剤形が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１は、ＮＯＴＵＭホモ接合型ノックアウトマウス（「ＨＯＭ」）およびそれらの野生型同腹子（「ＷＴ」）における種々の骨部位の皮質厚間の差異をグラフで表示した図である。

【図2】図２は、ＮＯＴＵＭホモ接合型およびヘテロ接合型（「ＨＥＴ」）ノックアウトマウス両方において観察された皮質骨厚の増加を、それらの野生型同腹子と比較して、グラフで表示した図である。

【図3】図３は、雄性のＮＯＴＵＭホモ接合型およびヘテロ接合型ノックアウトマウスならびにそれらの野生型同腹子の骨で実施された、大腿骨破壊強度および脊椎圧迫試験から得た結果を、グラフで表示した図である。

【図4】図４は、雌性のＮＯＴＵＭホモ接合型およびヘテロ接合型ノックアウトマウスならびにそれらの野生型同腹子の骨で実施された、大腿骨破壊強度および脊椎圧迫試験から得た結果を、グラフで表示した図である。

【図5】図５は、実施例６．７に記載されるとおり、ある特定のヒト／マウスのキメラタンパク質をグラフで表示した図であり、Ｂｉｎ１において、ＮＯＴＵＭ中和抗体の結合に関与すると思われる領域を示す。

【図6】図６は、実施例６．９．１に記載されるとおり、モノクローナル抗体２．１０２９またはモノクローナル抗体２．７８を８週間投与した後のマウスにおいて得られた、大腿骨骨幹中央部の皮質厚の測定値を、グラフで表示した図である。

【図7】図７は、実施例６．９．２に記載されるとおり、種々の投与量によるモノクローナル抗体２．１０２９を４週間投与した後のマウスにおいて得られた、大腿骨骨幹中央部の皮質厚の測定値を、グラフで表示した図である。

【図8A】図８は、実施例６．９．３に記載されるとおり、種々の投与量によるモノクローナル抗体２．７８ｂを４週間投与した後のマウスにおいて得られた、大腿骨骨幹中央部の皮質厚の測定値を、グラフで表示した図である。図８Ａは、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および３０ｍｇ／ｋｇの、モノクローナル抗体２．７８ｂの投与量を示す。

【図8B】図８Ｂは、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、ａｎｄ３ｍｇ／ｋｇの、モノクローナル抗体２．７８ｂの投与量を示す図である。

【図9A】図９は、実施例６．９．４に記載されるとおり、ゾレドロン酸による前処置をした場合およびしない場合の、モノクローナル抗体２．７８ｂを４週間投与した後のマウスにおいて得られた、大腿骨骨幹中央部の皮質厚の測定値（Ａ）および血清ＰＩＮＰレベル（Ｂ）を、グラフで表示した図である。

【図9B】同上。

【図10】図１０は、実施例６．９．５に記載されるとおり、モノクローナル抗体２．７８ａを４週間投与した後のマウスにおいて得られた、大腿骨骨幹中央部の皮質厚の測定値を、グラフで表示した図である。

【図11A】図１１は、実施例６．９．６に記載されるとおり、モノクローナル抗体２．７８ａを１２週間投与した後マウスにおいて得られた、大腿骨骨幹中央部の皮質厚の測定値（Ａ）および上腕骨骨幹中央部の皮質厚の測定値（Ｂ）を、グラフで表示した図である。

【図11B】同上。

【図12A】図１２は、実施例６．９．６に記載されるとおり、モノクローナル抗体２．７８ａを２４週間投与した後のマウスにおいて得られた、大腿骨骨幹中央部の皮質厚の測定値（Ａ）、上腕骨骨幹中央部の皮質厚の測定値（Ｂ）、および第９肋骨の皮質厚（Ｃ）を、グラフで表示した図である。

【図12B】同上。

【図12C】同上。

【図13A】図１３は、実施例６．１０．３に記載されるとおり、ＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂまたは対照抗体を投与した、偽手術および卵巣切除マウスにおける、大腿骨骨幹中央部の皮質厚（Ａ）および大腿骨骨幹中央部の石灰化骨領域（Ｂ）を、グラフで表示した図である。

【図13B】同上。

【図14A】図１４は、実施例６．１０．３に記載されるとおり、ＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂまたは対照抗体を投与した、偽手術および卵巣切除マウスにおける、ＬＶ５椎体の総体積に対する骨体積の比率（Ａ）、ＬＶ５椎体の総体積に対する皮質骨体積の比率（Ｂ）、およびＬＶ５椎体の総体積に対する海綿骨体積の比率（Ｃ）を、グラフで表示した図である。

【図14B】同上。

【図14C】同上。

【図15】図１５は、実施例６．１０．３に記載されるとおり、ＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂまたは対照抗体を投与した、偽手術および卵巣切除マウスにおける、大腿骨頚部の総体積に対する骨体積の比率を、グラフで表示した図である。

【図16】図１６は、実施例６．１０．４に記載されるとおり、ＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂまたは対照抗体を投与した、偽手術および卵巣切除マウスにおける、カルセイン、アリザリン、およびテトラサイクリンで標識された大腿骨骨幹中央部横断面の皮質内表面の割合（％）を、グラフで表示した図である。

【図17A】図１７は、実施例６．１０．４に記載されるとおり、ＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂまたは対照抗体を投与した、偽手術および卵巣切除マウスにおける、骨石灰化速度（Ａ）および体積を参照対象とする骨形成速度（Ｂ）を、グラフで表示した図である。

【図17B】同上。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明は、１つには、ＮＯＴＵＭの阻害が皮質内骨形成に影響を及ぼす可能性があるという発見に基づく。本発明の特定の態様は、機能的ＮＯＴＵＭ遺伝子のないマウス（「ノックアウトマウス」）の研究、ＮＯＴＵＭを阻害する抗体の開発、およびそのような抗体を用いてマウスおよびラットにおける皮質骨形成を刺激することができるという発見に基づく。

【0019】

本明細書中で用いられるセクションの見出しは、統合の目的のためだけであって、記載される対象物を制限するものと見なされるべきではない。特許、特許出願、論文、書籍、および条約をはじめとする、本出願中で言及される全ての文書、または文書の一部は、任意の目的のために全体として参照することによって本明細書中に明確に組み込まれる。１以上の組み込まれた文献および類似の資料がある用語を本出願中のその用語の定義と矛盾するように定義する場合、本出願が支配する。

【0020】

５．１．定義
「抗体」という用語は、本明細書中で用いられる場合、インタクト抗体または抗原結合についてインタクト抗体と競合する抗体の断片を指す。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、二重特異性抗体、およびインタクト抗体の可変領域の少なくとも一部を保持する他の抗体断片が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、Hudson et al. (2003) Nat. Med.9:129-134を参照のこと。いくつかの実施形態において、抗体断片は、インタクト抗体の酵素的または化学的切断によって産生される。いくつかの実施形態において、抗体断片は、組換えＤＮＡ技術によって産生される。

【0021】

「抗原結合部位」という用語は、抗原と特異的に結合することができる抗体の部分を指す。いくつかの実施形態において、抗原結合部位は、１以上の抗体可変領域によって提供される。

【0022】

「結合親和性」という用語は、抗体が抗原と結合する強度の定性的または定量的決定を指す。いくつかの実施形態において、結合親和性は、抗原に対する抗体の解離定数（Ｋ_Ｄ）である。いくつかの実施形態において、抗原に対する抗体の結合親和性は、抗原に対する異なる抗体の結合親和性に対して、または異なる抗原（例えば、そのアミノ酸配列において１以上の変更を有する抗原）に対する同じ抗体の結合親和性に対してなど、定性的に決定される。第１抗原に対する抗体の結合親和性は、例えば、第１抗原に対する抗体のＫ_Ｄが第２抗原に対する抗体のＫ_Ｄよりも低い場合に、第２抗原に対するその親和性よりも「強力」であると見なされる。いくつかの実施形態において、第１抗原に対する抗体の結合親和性は、第１抗原に対する抗体のＫ_Ｄが、第２抗原に対する抗体のＫ_Ｄよりも少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍低い場合に、「より強力である」と見なされる。反対に、第１抗原に対する抗体の結合親和性は、例えば、第１抗原に対する抗体のＫ_Ｄが第２抗原に対する抗体のＫ_Ｄよりも高い場合に、第２抗原に対するその親和性よりも「弱い」と見なされる。いくつかの実施形態において、第１抗原に対する抗体の結合親和性は、第１抗原に対する抗体のＫ_Ｄが、第２抗原に対する抗体のＫ_Ｄよりも少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍高い場合に、「より弱い」と見なされる。

【0023】

「キメラ」抗体は、少なくとも２つの異なる源由来の成分で構成される抗体を指す。いくつかの実施形態において、キメラ抗体は、別の分子、例えば第２の種由来の抗体の一部と融合した第１の種由来の抗体の一部を含む。いくつかのそのような実施形態において、キメラ抗体は、ヒト由来の抗体の一部と融合した非ヒト動物由来の抗体の一部を含む。いくつかのそのような実施形態において、キメラ抗体は、ヒト抗体由来の定常領域と融合した非ヒト動物由来の抗体の可変領域の全部または一部を含む。

【0024】

「エピトープ」という用語は、イムノグロブリンまたはＴ細胞受容体と特異的に結合することができる任意のポリペプチド決定因子を指す。いくつかの実施形態において、エピトープは、抗体により特異的に結合される抗原の領域である。いくつかの実施形態において、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面基を含んでもよい。いくつかの実施形態において、エピトープは特定の３次元構造特性（例えば、「立体構造」エピトープ）および／または特定の電荷特性を有し得る。

【0025】

特定の抗体が両方のエピトープと特異的に結合するならば、１つのエピトープはもう１つのエピトープと「同じ」と定義される。いくつかの実施形態において、異なる一次アミノ酸配列を有するポリペプチドは、同じであるエピトープを含み得る。異なる抗体は、そのエピトープに対する特異的結合について競合するならば、同じエピトープと結合するといわれる。

【0026】

参照ポリペプチドの「断片」は、参照ポリペプチドの任意の部分由来の一続きのアミノ酸を指す。断片は、参照ポリペプチドの長さよりも短い任意の長さのものであり得る。いくつかの実施形態において、断片は、特定の活性を有するかまたは特定のエピトープを含有する参照ポリペプチドの任意の部分由来の一続きのアミノ酸である。

【0027】

「ヒト抗体」という用語は、ヒト抗体配列を含み、非ヒト動物由来の抗体配列を含まないモノクローナル抗体を指す。いくつかの実施形態において、ヒト抗体は、天然の抗体で見出されない合成配列を含む可能性がある。この用語は、抗体が作製される方法によって限定されない。例えば、様々な実施形態で、ヒト抗体は、トランスジェニックマウスにおいて、ファージディスプレイにより、ヒトＢリンパ球により、または組換え法により作製することができる。

【0028】

「ヒト化」抗体は、（アミノ酸配列において）ヒト抗体とより密接にマッチするように修飾された非ヒト化抗体を指す。ヒト化抗体はしたがって、一種のキメラ抗体である。いくつかの実施形態において、非ヒト抗体の可変領域の抗原結合残基の外側のアミノ酸残基は修飾されている。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト抗体の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）の全部または一部を、例えば所望の抗原結合特異性を有する非ヒト抗体などの別の抗体由来の１以上のＣＤＲの全部または一部で置換することによって構築される。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、ＣＤＲの全部または実質的に全部が非ヒト抗体のＣＤＲに相当し、フレームワーク領域（ＦＲ）の全部または実質的に全部がヒト抗体のＦＲに相当する可変領域を含む。いくつかの実施形態において、非ヒト抗体の１以上のＣＤＲ内の１以上のアミノ酸はヒト化抗体で、例えば親和性成熟のプロセスによって変更される。親和性成熟の例示的方法は当該技術分野で公知である。いくつかのそのような実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト抗体の定常領域（Ｆｃ）をさらに含む。

【0029】

他に指定のない限り、「含む（include、includes、including）」という用語は、「含むが、これらに限定されるものではない」と同じ意味を有する。同様に、「例えば」という用語は、「これらに限定されないが、例えば」という用語と同じ意味を有する。

【0030】

他に指定のない限り、「管理（manage、managingおよびmanagement）」という用語は、すでに特定の疾患または障害に苦しんでいる患者においてその疾患もしくは障害の再発を防止すること、および／またはその疾患もしくは障害に苦しんでいる患者が寛解期にある時間を延長することを包含する。この用語は、疾患もしくは障害の閾値、発症および／または期間を調節すること、あるいは患者が疾患もしくは障害に反応する方法を変更することを包含する。

【0031】

「モノクローナル抗体」という用語は、同じエピトープに特異的に結合する抗体の実質的に均一な集団由来の抗体を指す。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体はハイブリドーマによって分泌される。いくつかのそのような実施形態において、ハイブリドーマは当業者に公知のいくつかの方法にしたがって産生される。例えば、Kohler and Milstein (1975) Nature256: 495-499を参照のこと。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は組換えＤＮＡ法を用いて産生される（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、ファージディスプレイライブラリーから単離された抗体断片を指す。例えば、Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628、およびMarks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597を参照のこと。種々の他のモノクローナル抗体産生技術については、例えばHarlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）を参照のこと。

【0032】

「中和抗体」または「中和する抗体」という用語は、抗体が特異的に結合するエピトープを含むポリペプチドの少なくとも１つの活性を減弱する抗体を指す。いくつかの実施形態において、中和抗体はｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドの活性を減弱する。

【0033】

「ＮＯＴＵＭ」という用語は、特に明記しない限り、ヒト、ウシ、ニワトリ、齧歯類、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、霊長類、サル、およびモルモットをはじめとする脊椎動物またはほ乳類源由来のアミノ酸配列を有するノータム・ペクチンアセチルエステラーゼ（notum pectinaceylesterase）を指す。この用語はさらに、天然のＮＯＴＵＭの少なくとも１つのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を維持する天然のＮＯＴＵＭの断片および変異体も指す。この用語は、ＮＯＴＵＭの完全長未処理前駆体形態ならびにシグナルペプチドの翻訳後切断およびタンパク質分解処理の他の形態から生じる成熟形態を包含する。いくつかの実施形態において、完全長未処理ヒトＮＯＴＵＭは配列番号１で記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、完全長未処理マウスＮＯＴＵＭは配列番号２で記載されるアミノ酸配列を有する。

【0034】

「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書中では交換可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、天然に存在するアミノ酸を含有するアミノ酸ポリマーならびに１以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学アナログであるアミノ酸ポリマーに適用される。アミノ酸ポリマーは、任意の長さのものであり得る。「天然のポリペプチド」という用語は、天然に存在するポリペプチドを指す。

【0035】

他に指定のない限り、「防止（preventing、prevent、およびprevention）」という用語は、患者が特定の疾患または障害に苦しみ始める前に起こる作用であって、その疾患または障害の重症度を阻害または減少させる作用を想定する。言い換えれば、この用語は予防を包含する。

【0036】

他に指定のない限り、化合物の「予防有効量」は、疾患もしくは状態、または疾患もしくは状態に関連する１以上の症状を防止するため、またはその再発を予防するために十分な量である。化合物の「予防有効量」は、単独または他の薬剤との組み合わせで、疾患の防止において予防的利点を提供する治療薬の量を意味する。「予防有効量」という用語は、全体的な予防を改善するか、または別の予防薬の予防効果を増強する量を包含する可能性がある。

【0037】

抗体は、タンパク質および／または巨大分子の複合混合物中の抗原を優先的に認識する場合に、抗原と「特異的に結合する」。いくつかの実施形態において、抗体は、特定のエピトープと特異的に結合する抗原結合部位を含む。いくつかのそのような実施形態において、抗体は、異なる抗原が特定のエピトープを含む限り、異なる抗原と結合することができる。場合によっては、例えば、異なる種由来の相同タンパク質は同じエピトープを含む可能性がある。いくつかの実施形態において、抗体は、解離定数（Ｋ_Ｄ）が≦１μＭである場合に、いくつかの実施形態では解離定数が≦１００ｎＭである場合、そしていくつかの実施形態では解離定数が≦１０ｎＭである場合に、抗原と特異的に結合すると言われる。

【0038】

「対象」および「患者」という用語は、ヒトおよび動物の両方を含む。いくつかの実施形態において、対象または患者はほ乳類である。いくつかのそのような実施形態において、対象または患者はヒトである。

【0039】

他に指定のない限り、化合物の「治療有効量」は、疾患もしくは状態の治療もしくは管理において治療効果を提供するために、または疾患もしくは状態に関連する１以上の症状を遅延させるかまたは最小限に抑えるために有効な量である。化合物の「治療有効量」は、疾患または状態の治療または管理において治療効果を提供する、単独または他の治療薬と組み合わせた治療薬の量を意味する。「治療有効量」という用語は、全体的な治療を改善する、または疾患もしくは状態の症状もしくは原因を軽減もしくは回避する、または別の治療薬の治療効果を増強する量を包含する可能性がある。

【0040】

他に指定のない限り、「治療（treat、treatingおよびtreatment）」という用語は、患者が特定の疾患または障害に苦しんでいる間に起こる作用であって、疾患もしくは障害の重症度を軽減するか、または疾患もしくは障害の進行を遅延もしくは減速させる作用を想定する。

【0041】

５．２．抗体
５．２．１．抗体構造例
天然の抗体は、典型的には四量体構造を有する。四量体は、典型的にはポリペプチド鎖の２つの同じ対を含み、各対は、１つの軽鎖（いくつかの実施形態では、約２５ｋＤａ）および１つの重鎖（いくつかの実施形態では、約５０〜７０ｋＤａ）を有する。天然の抗体では、重鎖は、可変領域ＶＨ、および３つの定常領域ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。ＶＨドメインは重鎖のアミノ末端にあり、ＣＨ３ドメインはカルボキシ末端にある。天然の抗体では、軽鎖は可変領域ＶＬ、および定常領域ＣＬを含む。軽鎖の可変領域は、軽鎖のアミノ末端にある。天然の抗体では、軽鎖／重鎖対の可変領域は、典型的には抗原結合部位を形成する。定常領域は、典型的にはエフェクター機能の原因となる。

【0042】

天然のヒト軽鎖は、典型的にはカッパおよびラムダ軽鎖として分類される。天然のヒト重鎖は、典型的には、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンに分類され、抗体のイソ型をそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと定義する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むサブクラスを有する。ＩｇＡは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むサブクラスを有する。天然のヒト軽鎖および重鎖内で、可変および定常領域は、典型的には、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合され、重鎖は約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。例えば、Fundamental Immunology (1989) Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y.)を参照のこと。

【0043】

天然の抗体では、可変領域は典型的には、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）が、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる３つの超可変領域によって結合される、同じ一般的構造を示す。各対の２つの鎖由来のＣＤＲは、典型的には、特異的エピトープとの結合を可能にする可能性があるフレームワーク領域と並んでいる。Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖および重鎖可変領域はどちらも、典型的にはドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。重鎖上のＣＤＲはＨ１、Ｈ２、およびＨ３と称され、一方、軽鎖上のＣＤＲはＬ１、Ｌ２、およびＬ３と称される。典型的には、ＣＤＲ３は抗原結合部位内の分子多様性の最大の原因である。Ｈ３は、例えばある例では２個のアミノ酸残基程度の短さである可能性があるか、または２６個より長い可能性がある。アミノ酸の各ドメインへの帰属は、典型的には、Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Publication No. 91-3242, vols. 1-3, Bethesda, MD);Chothia, C., and Lesk, A.M. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917;またはChothia, C. et al. Nature 342:878-883 (1989)の定義にしたがう。本出願では、「ＣＤＲ」という用語は、特別の定めのない限り、軽鎖または重鎖のいずれかからのＣＤＲを指す。

【0044】

「Ｆａｂ」断片は、１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＣＨ１および可変領域を含む。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。Ａ「Ｆａｂ’」断片は、１つの軽鎖ならびにＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間のさらなる定常領域を含む１つの重鎖を含む。鎖間ジスルフィド結合をＦａｂ’断片の２つの重鎖間で形成して、「Ｆ（ａｂ’）２」分子を形成することができる。

【0045】

「Ｆｖ」断片は、重鎖および軽鎖由来の可変領域を含むが、定常領域が欠けている。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片は、可動性リンカーにより連結された重および軽鎖可変領域を含み、抗原結合領域を有するポリペプチド単鎖を形成する。例示的単鎖抗体は、国際公開第８８／０１６４９号ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２６０，２０３号で詳細に検討されている。ある例では、単一の可変領域（すなわち、重鎖可変領域または軽鎖可変領域）は、抗原を認識および結合する能力を有する可能性がある。

【0046】

本明細書中で用いられる場合、「重鎖」という用語は、軽鎖との組み合わせのいずれかで抗原特異性を付与するために十分な重鎖可変領域配列を含むポリペプチドを指す。

【0047】

本明細書中で用いられる場合、「軽鎖」という用語は、単独または重鎖との組み合わせのいずれかで抗原特異性を付与するために十分な軽鎖可変領域配列を含むポリペプチドを指す。

【0048】

５．２．２．例示的抗体
いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭと特異的に結合するモノクローナル抗体が提供される。いくつかのそのような実施形態において、モノクローナル抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでＮＯＴＵＭの少なくとも１つの活性を減弱させる中和抗体である。

【0049】

いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する中和抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの８−オクタノイルオキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム（ＯＰＴＳ）アッセイにおいてＮＯＴＵＭ活性を減弱する。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する中和抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＷｎｔシグナル伝達アッセイにおけるＮＯＴＵＭ活性を減弱する。

【0050】

いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する中和抗体は、対象に対して十分な量で十分な期間投与される場合に、ｉｎ ｖｉｖｏで血清ＰＩＮＰレベルを増大させる。十分な量を十分な期間投与するための例示的投薬量および投薬スケジュールは本明細書中で検討されている。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する中和抗体は、骨塩密度を増大させる。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する中和抗体はｉｎ ｖｉｖｏで大腿骨骨幹中央部の皮質厚を増大させる。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する中和抗体はｉｎ ｖｉｖｏで大腿骨骨幹中央部の骨領域を増大させる。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する中和抗体はｉｎ ｖｉｖｏで上腕骨骨幹中央部の皮質厚を増大させる。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する中和抗体はｉｎ ｖｉｖｏで皮質内骨形成を増大させる。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する中和抗体はｉｎ ｖｉｖｏでＬＶ５椎体中の皮質骨体積の割合を増大させる。「ＬＶ５椎体中の皮質骨体積の割合」により、ＬＶ５椎体の全体積に対する皮質骨体積の割合を意味する。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する中和抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで大腿骨頸部の全体積に対する大腿骨頸部骨体積の割合を増大させる。

【0051】

いくつかの実施形態において、マウスＮＯＴＵＭと特異的に結合する中和抗体が提供される。いくつかの実施形態において、ヒトＮＯＴＵＭと特異的に結合する中和抗体が提供される。いくつかの実施形態において、ヒトＮＯＴＵＭのＱ４７からＭ１７７までの領域に結合する中和抗体が提供される。いくつかの実施形態において、結合についてヒトＮＯＴＵＭのＱ４７からＭ１７７までの領域に依存する中和抗体が提供される。いくつかの実施形態において、異なる種由来のＮＯＴＵＭの同じ領域に特異的に結合する中和抗体（すなわち、交差反応性を示す抗体）が提供される。いくつかの実施形態において、ヒトＮＯＴＵＭならびに、マウス、ラット、モルモット、カニクイザル、マーモセット、およびアカゲザルから選択される少なくとも１種由来のＮＯＴＵＭと結合する中和抗体が提供される。いくつかのそのような実施形態において、抗体は、非ヒト霊長類ＮＯＴＵＭおよびヒトＮＯＴＵＭの両方に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗体はマウスＮＯＴＵＭおよびヒトＮＯＴＵＭの両方に特異的に結合する。

【0052】

いくつかの実施形態において、Ｑ４７からＭ１７７までのヒトＮＯＴＵＭの領域に結合する中和抗体が提供される。いくつかの実施形態において、結合についてＱ４７からＭ１７７までのヒトＮＯＴＵＭの領域に依存する中和抗体が提供される。いくつかの実施形態において、ヒト−マウスキメラＮＯＴＵＭ（配列番号８３）と、マウス−ヒトキメラＮＯＴＵＭ（配列番号８４）に対する親和性よりも少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍強力な親和性で結合するＮＯＴＵＭ中和抗体が提供される。いくつかの実施形態において、ヒト−マウス−ヒトキメラＮＯＴＵＭ（配列番号８５）と、マウス−ヒト−マウスキメラＮＯＴＵＭ（配列番号８６）に対する親和性よりも少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍強力な親和性で結合するＮＯＴＵＭ中和抗体が提供される。いくつかの実施形態において、ヒトＮＯＴＵＭ（配列番号１）と、ＮＯＴＵＭＤ１４１Ｓ（配列番号９４）に対する親和性よりも少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍強力な親和性で結合するＮＯＴＵＭ中和抗体が提供される。いくつかの実施形態において、マウスＮＯＴＵＭＳ１４８Ｄ（配列番号９５）と、マウスＮＯＴＵＭ（配列番号２）に対する親和性よりも少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍よりも強力な親和性で結合するＮＯＴＵＭ中和抗体が提供される。いくつかの実施形態において、ヒトＮＯＴＵＭ（配列番号１）と、ヒトＮＯＴＵＭＲ１４４Ａ／Ｒ１４５Ａ（配列番号９９）に対する親和性よりも少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍強力な親和性で結合するＮＯＴＵＭ中和抗体が提供される。

【0053】

いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する中和抗体は、ヒトＮＯＴＵＭ（配列番号１）と、実施例６．８で記載されるように測定して、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、３ｎＭ未満、または２ｎＭ未満の親和性（Ｋ_Ｄ）で結合する。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する中和抗体は、実施例６．４．１で記載されるようにして測定して、１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、または１０ｎＭ未満のＯＰＴＳアッセイでのＩＣ_５０を有する。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する中和抗体は、実施例６．４．２で記載されるようにして測定して、１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、または１０ｎＭ未満のＷｎｔシグナル伝達アッセイでのＩＣ_５０を有する。いくつかの実施形態において、ＩＣ_５０はヒトＮＯＴＵＭについてのものである。いくつかの実施形態において、ＩＣ_５０はマウスＮＯＴＵＭについてのものである。

【0054】

いくつかの実施形態において、中和抗体は非ヒトモノクローナル抗体である。いくつかのそのような実施形態において、中和抗体は齧歯類モノクローナル抗体である。いくつかのそのような実施形態において、中和抗体はマウスモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、中和抗体はキメラモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、中和抗体はヒト化モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、中和抗体はヒトモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、キメラ、ヒト化、および／またはヒトモノクローナル抗体はヒトにおける治療抗体として有用である。

【0055】

いくつかの実施形態において、中和抗体は抗体断片である。例示的抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、二重特異性抗体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0056】

非限定的例示的ＮＯＴＵＭ中和抗体は、ＭＡｂ１．７３１、１．８０２、１．８１５、１．８４６、２．１０２９、２．５５、および２．７８を含む。ＭＡｂ１．７３１、１．８０２、１．８１５、１．８４６、２．１０２９、２．５５、および２．７８のそれぞれは、ＮＯＴＵＭの少なくとも１つの活性を中和する。さらに、少なくともＭＡｂ１．８０２、１．８１５、１．８４６、および２．７８は、ＮＯＴＵＭに対する結合に関して、アミノ酸Ｑ４７〜Ｍ１７７により結合したヒトＮＯＴＵＭの領域の少なくとも一部に依存する。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、ＮＯＴＵＭに対する結合に関して、ＭＡｂ１．７３１、１．８０２、１．８１５、１．８４６、２．１０２９、２．５５、および２．７８から選択される少なくとも１つの抗体と競合する。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、ＭＡｂ１．７３１、１．８０２、１．８１５、１．８４６、２．１０２９、２．５５、および２．７８から選択される少なくとも１つの抗体によって結合されるエピトープと少なくとも部分的に重複するＮＯＴＵＭのエピトープと結合する。加えて、いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する結合についてＭＡｂ１．７３１、１．８０２、１．８１５、１．８４６、２．１０２９、２．５５、および２．７８から選択される少なくとも１つの抗体と競合する抗体は、ＮＯＴＵＭ中和抗体であると予想される。ＭＡｂ１．７３１、１．８０２、１．８１５、１．８４６、２．１０２９、２．５５、および２．７８のＣＤＲおよび可変領域の配列を以下のセクション７で示す。

【0057】

いくつかの実施形態において、ＭＡｂ１．７３１が結合する同じエピトープと結合するＮＯＴＵＭ中和抗体が提供される。いくつかの実施形態において、ＭＡｂ１．８０２が結合する同じエピトープと結合するＮＯＴＵＭ中和抗体が提供される。いくつかの実施形態において、ＭＡｂ１．８１５が結合する同じエピトープと結合するＮＯＴＵＭ中和抗体が提供される。いくつかの実施形態において、ＭＡｂ１．８４６が結合する同じエピトープと結合するＮＯＴＵＭ中和抗体が提供される。いくつかの実施形態において、ＭＡｂ２．１０２９が結合する同じエピトープと結合するＮＯＴＵＭ中和抗体が提供される。いくつかの実施形態において、ＭＡｂ２．５５が結合する同じエピトープと結合するＮＯＴＵＭ中和抗体が提供される。いくつかの実施形態において、ＭＡｂ２．７８が結合する同じエピトープと結合するＮＯＴＵＭ中和抗体が提供される。

【0058】

いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号７、１５、２３、３１、３９、および４７から選択される重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号８、１６、２４、３２、４０、および４８から選択される軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号３１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号３２を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号４０を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。

【0059】

いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９、および９０から選択される重鎖ＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号１０、１８、２６、３４、４２、および５０から選択される重鎖ＣＤＲ２を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号１１、１９、２７、３５、４３、５１、および９１から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号１７および９０から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、ならびに配列番号１９および９１から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号２５および９０から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号３３および９０から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、ならびに配列番号３５および９１から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号４１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号４３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号４９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号５１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号５７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号５９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、配列番号９０中のＸ_１は、ＹおよびＦから選択される。いくつかの実施形態において、配列番号９１中のＸ_２は、ＨおよびＮから選択される。

【0060】

いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号１２、２０、２８、３６、４４、５２、６０、および９２から選択される軽鎖ＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号１３、２１、２９、３７、４５、５３、６１、および９３から選択される軽鎖ＣＤＲ２を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号１４、２２、３０、３８、４６、５４、および６２から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号２０および９２から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２１および９３から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、ならびに配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号２８および９２から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２９および９３から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、ならびに配列番号３０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号３６および９２から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３７および９３から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号４４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号４６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号５２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号５４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号６０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号６２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、配列番号９２中のＸ_３はＩおよびＳから選択される；配列番号９２中のＸ_４はＴおよびＥから選択される；そして配列番号９２中のＸ_５はＭおよびＩから選択される。いくつかの実施形態において、配列番号９３中のＸ_６はＤおよびＮから選択される。

【0061】

いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖；ならびに配列番号１２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号１７および９０から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１９および９１から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖；ならびに配列番号２０および９２から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２１および９３から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、ならびに配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖；ならびに配列番号２０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号２５および９０から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖；ならびに配列番号２８および９２から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２９および９３から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、ならびに配列番号３０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖；ならびに配列番号２８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号３３および９０から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、ならびに配列番号３５および９１から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖；ならびに配列番号３６および９２から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３７および９３から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、ならびに配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖；ならびに配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号４１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号４３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖；ならびに配列番号４４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号４６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号４９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号５１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖；ならびに配列番号５２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号５４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号５７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号５９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖；ならびに配列番号６０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号６２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、配列番号９０中のＸ_１はＹおよびＦから選択される。いくつかの実施形態において、配列番号９１中のＸ_２はＨおよびＮから選択される。いくつかの実施形態において、配列番号９２中のＸ_３はＩおよびＳから選択される；配列番号９２中のＸ_４はＴおよびＥから選択される；そして配列番号９２中のＸ_５はＭおよびＩから選択される。いくつかの実施形態において、配列番号９３中のＸ_６はＤおよびＮから選択される。

【0062】

いくつかの実施形態において、ヒトＮＯＴＵＭと特異的に結合するＮＯＴＵＭ中和抗体が提供される。いくつかの実施形態において、異なる種由来のＮＯＴＵＭ中の同じエピトープに特異的に結合するＮＯＴＵＭ中和抗体（すなわち、交差反応性を示す抗体）が提供される。いくつかの実施形態において、ヒトＮＯＴＵＭと特異的に結合し、マウス、ラット、モルモット、カニクイザル、マーモセット、およびアカゲザルから選択されるＮＯＴＵＭの少なくとも１つの種とも特異的に結合するＮＯＴＵＭ中和抗体が提供される。いくつかの実施形態において、ヒトＮＯＴＵＭおよび少なくとも１種の非ヒト霊長類由来のＮＯＴＵＭと特異的に結合するＮＯＴＵＭ中和抗体が提供される。いくつかの実施形態において、ヒトＮＯＴＵＭおよびマウスＮＯＴＵＭと特異的に結合するＮＯＴＵＭ中和抗体が提供される。

【0063】

５．２．２．１．キメラ化およびヒト化モノクローナル抗体
いくつかの実施形態において、非ヒト抗体はキメラ化されている。いくつかの実施形態において、ヒトＮＯＴＵＭと特異的に結合するマウスモノクローナル抗体はキメラ化されている。キメラ抗体を作製するためのある例示的方法は、例えば、Morrison et al. (1984) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA81:6851-6855; Neuberger et al. (1984) Nature312:604-608; Takeda et al. (1985) Nature314:452-454；ならびに米国特許第６，０７５，１８１号および同第５，８７７，３９７号で提供されている。

【0064】

いくつかの実施形態において、非ヒト抗体は「ヒト化」される。いくつかの実施形態において、ヒトＮＯＴＵＭと特異的に結合するマウスモノクローナル抗体はヒト化される。いくつかの実施形態において、マウスＮＯＴＵＭに対するものであるが、ヒトＮＯＴＵＭと特異的に結合する（すなわち、交差反応する）マウスモノクローナル抗体は、ヒト化されている。いくつかの実施形態において、ヒトに投与された場合、ヒト化抗体はそれらの結合特異性を保持し、減少した免疫原性（例えば、減少したヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答）を有する。いくつかの実施形態において、ヒト化は、以下で詳細に記載するように、ＣＤＲグラフティングおよび人間工学をはじめとする方法によって達成される。

【0065】

ヒト化抗体のいくつかの実施形態において、所望の結合特異性（「ドナー」抗体）を有する抗体の軽鎖および重鎖可変領域由来の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）は「「アクセプター」抗体中のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）上にグラフトされる。例示的ＣＤＲグラフティングは、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５８５，０８９号、および同第５，５３０，１０１号；Queen et al. (1989) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA86:10029-10033で記載される。いくつかの実施形態において、軽鎖および重鎖可変領域由来の１以上のＣＤＲはアクセプター抗体中のコンセンサスヒトＦＲ上にグラフトされる。コンセンサスヒトＦＲを作製するために、いくつかの実施形態において、いくつかのヒト重鎖または軽鎖アミノ酸配列由来のＦＲを整列させて、コンセンサスアミノ酸配列を同定する。

【0066】

いくつかの実施形態において、アクセプター抗体中のあるＦＲアミノ酸は、ドナー抗体からのＦＲアミノ酸で置換される。あるそのような実施形態において、ＦＲドナー抗体からのアミノ酸は、標的抗原に対するドナー抗体の親和性に寄与するアミノ酸である。例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５８５，０８９号、および同第５，５３０，１０１号；Queen et al. (1989) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA86:10029-10033を参照のこと。いくつかの実施形態において、コンピュータープログラムは、ドナーおよび／またはアクセプター抗体をモデル化するために使用され、抗原の結合に関与および／または抗原結合部位の構造に寄与する可能性がある残基を特定し、かくしてドナー抗体において置換されるＦＲ残基などの残基の選択に役立つ。

【0067】

いくつかの実施形態において、ドナー抗体由来のＣＤＲは、ヒト定常領域を含むアクセプター抗体上にグラフトされる。いくつかのそのような実施形態において、ＦＲはアクセプター上にもグラフトされる。いくつかの実施形態において、ドナー抗体由来のＣＤＲは単鎖Ｆｖ抗体から誘導される。いくつかの実施形態において、ドナー抗体由来のＦＲは、単鎖Ｆｖ抗体から誘導される。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体中のグラフトされたＣＤＲを（例えば、アミノ酸置換、欠失、または挿入により）さらに修飾して、標的抗原に対するヒト化抗体の親和性を増大させる。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体中のグラフトされたＦＲを（例えば、アミノ酸置換、欠失、または挿入により）さらに修飾して、標的抗原に対するヒト化抗体の親和性を増大させる。

【0068】

いくつかの実施形態において、非ヒト抗体は、「人間工学」法を用いてヒト化することができる。例えば、米国特許第５，７６６，８８６号および同第５，８６９，６１９号を参照のこと。人間工学のいくつかの実施形態において、抗体可変ドメインの構造に関する情報（例えば、結晶構造および／または分子モデリングから得られる情報）を用いて、可変領域中の所定のアミノ酸残基が（ａ）抗原結合に関与する可能性、（ｂ）抗体表面上で曝露される（すなわち、溶媒に接近可能）可能性、または（ｃ）抗体可変領域内に埋め込まれている（すなわち、可変領域の構造の維持に関与する）可能性を評価する。さらに、いくつかの実施形態において、ヒト可変領域コンセンサス配列を生成させて、ヒト可変領域間で保存される残基を同定する。いくつかの実施形態において、その情報は、非ヒト抗体の可変領域中のアミノ酸残基が置換されるべきかどうかについての指針を提供する。

【0069】

いくつかの実施形態において、ヒト化ＮＯＴＵＭ中和抗体は、ＭＡｂ１．７３１、１．８０２、１．８１５、１．８４６、２．１０２９、２．５５、および２．７８から選択される抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の少なくとも１つを含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、ＭＡｂ１．７３１、１．８０２、１．８１５、１．８４６、２．１０２９、２．５５、および２．７８から選択される抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、ＭＡｂ１．７３１、１．８０２、１．８１５、１．８４６、２．１０２９、２．５５、および２．７８から選択される抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の少なくとも１つを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、ＭＡｂ１．７３１、１．８０２、１．８１５、１．８４６、２．１０２９、２．５５、および２．７８から選択される抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにＭＡｂ１．７３１、１．８０２、１．８１５、１．８４６、２．１０２９、２．５５、および２．７８から選択される抗体由来の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。

【0070】

いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号６３、６７、７１、７５、および７９から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号６４、６８、７２、７６、および８０から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号６５、６９、７３、７７、および８１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号６６、７０、７４、７８、および８２から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号６５を含むアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号７１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号７３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号７７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号６６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号７０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号７２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号７４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号７６のアミノ酸を含む重鎖および配列番号７８のアミノ酸を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体は、配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号８２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0071】

５．２．２．２．抗体イソ型
いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥから選択される任意のイソ型のものである。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する抗体は、ＩｇＧイソ型のものである。あるそのような実施形態において、抗体はサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のものである。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する抗体はＩｇＭイソ型のものである。あるそのような実施形態において、抗体はサブクラスＩｇＭ１またはＩｇＭ２のものである。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する抗体はＩｇＡイソ型のものである。あるそのような実施形態において、抗体はサブクラスＩｇＡ１またはＩｇＡ２のものである。ＮＯＴＵＭに対する抗体は、例えばヒトまたはマウス起源のラムダまたはカッパ軽鎖定常領域を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する抗体は、ヒトカッパ軽鎖定常領域およびヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４重鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する抗体はマウスカッパ軽鎖およびマウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２重鎖を含む。

【0072】

５．２．２．３．修飾抗体
いくつかの実施形態において、抗体を修飾して、１以上のその特定を改変する。いくつかの実施形態において、修飾抗体は、例えば安定性の増加、循環における時間の増加、または免疫原性の減少のなどの非修飾抗体よりすぐれた利点を有する可能性がある（例えば、米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと）。いくつかの実施形態において、抗体を非タンパク質様部分に対して連結することによって修飾する。いくつかの実施形態において、抗体は、例えば、抗体上の炭水化物鎖の数、タイプ、結合、および／または位置を変更することによって、抗体のグリコシル化状態を改変することにより修飾される。抗体のグリコシル化状態を改変することにより修飾される。いくつかの実施形態において、抗体はグリコシル化されないように変更される。

【0073】

いくつかの実施形態において、１以上の化学部分を抗体のアミノ酸骨格および／または炭水化物残基に結合させる。化学部分を抗体に結合させるためのある例示的な方法は当業者に公知である。そのような方法としては、アシル化反応またはアルキル化反応が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、欧州特許出願公開第０４０１３８４号；Malik et al. (1992), Exp. Hematol., 20:1028-1035; Francis (1992) Focus on Growth Factors3(2):4-10, published by Mediscript, Mountain Court, Friern Barnet Lane, London N20 OLD, UK；欧州特許出願公開第０１５４３１６号；欧州特許出願公開第０４０１３８４号；国際公開第９２／１６２２１号；国際公開第９５／３４３２６号；国際公開第９５／１３３１２号；国際公開第９６／１１９５３号；国際公開第９６／１９４５９号および国際公開第９６／１９４５９号を参照のこと。いくつかの実施形態において、これらの反応のいずれかを用いて、そのアミノ末端で化学的に修飾された抗体を生成させる。

【0074】

いくつかの実施形態において、抗体を検出可能な標識、例えば、酵素標識、蛍光標識、アイソトープ標識または親和性標識と結合させる。あるそのような実施形態において、検出可能な標識は、抗体の検出または単離を可能にする。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、抗体によって結合された抗原の検出を可能にする。

【0075】

いくつかの実施形態において、抗体を１以上のポリマーに連結させることによって修飾する。いくつかの実施形態において、抗体を１以上の水溶性ポリマーに連結させる。あるそのような実施形態において、水溶性ポリマーへの結合によって、抗体が生理学的環境などの水性環境中で沈殿する可能性は減少する。いくつかの実施形態において、治療抗体を水溶性ポリマーと連結させる。いくつかの実施形態において、当業者は、ポリマー／抗体結合体が患者の治療で用いられるかどうか、もし用いられる場合は抗体の薬理学的プロフィール（例えば、半減期、投薬量、活性、抗原性，および／または他の因子）をはじめとする検討項目に基づいて、好適な水溶性ポリマーを選択することができる。

【0076】

ある例示的な臨床的に許容される水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド；エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー；モノメトキシ−ポリエチレングリコール；カルボキシメチルセルロース；デキストラン；ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）；ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン；ポリ−１，３，６−トリオキサン；エチレン／無水マレイン酸コポリマー；ポリ−β−アミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）；ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール；ポリプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）および他のポリアルキレンオキシド；ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー；ポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＧ）（例えば、グリセロール）および他のポリオキシエチル化ポリオール；ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、コロン酸（colonic acid）または他の炭水化物ポリマー；ならびにフィコール、デキストラン、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ある例示的なＰＥＧとしては、抗体修飾で有用であることが当該技術分野で知られているある形態、例えば、モノ−（Ｃ_１−Ｃ_１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ＰＥＧが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、ＰＥＧプロピオンアルデヒドは、その水中安定性のために製造において利点を有する可能性がある。

【0077】

いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは任意の分子量のものである。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは分枝または非分枝である。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａ（この範囲の終点間の全ての点を含む）の平均分子量を有する。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは約５ｋＤａ〜約４０ｋＤａの平均分子量を有する。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは約１０ｋＤａ〜約３５ｋＤａの平均分子量を有する。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは約１５ｋＤａ〜約３０ｋＤａの平均分子量を有する。

【0078】

いくつかの実施形態において、抗体はポリエチレングリコールに連結される（ＰＥＧ；すなわち、抗体は「ペグ化」される）。様々な実施形態において、ＰＥＧはほ乳類において低い毒性を有する。Carpenter et al. (1971) Toxicol. Appl. Pharmacol.、18:35-40を参照のこと。特に、アデノシンデアミナーゼのＰＥＧ付加物は、米国で重度の複合免疫不全症候群の治療のためのヒトにおける使用に関して認可されている。様々な実施形態において、ＰＥＧは、抗体の免疫原性を減少させる可能性がある。例えば、いくつかの実施形態において、非ヒト配列を有する抗体に対するＰＥＧの連結は、ヒトに施された場合、その抗体の抗原性を減弱させる可能性がある。

【0079】

いくつかの実施形態において、ポリマーは抗体中の１以上の反応性アミノ酸残基に連結される。ある例示的な反応性アミノ酸残基としては、アミノ末端アミノ酸のアルファ−アミノ基、リジン側鎖のイプシロンアミノ基、システイン側鎖のスルフヒドリル基、アスパルチルおよびグルタミル側鎖のカルボキシル基、カルボキシ末端アミノ酸のアルファ−カルボキシル基、チロシン側鎖、およびあるアスパラギン、セリンまたはスレオニン残基に連結した活性化グリコシル鎖が挙げられるが、これらに限定されるものではない。タンパク質との反応をおこなうために好適な、ＰＥＧのある例示的な活性化形態（「ＰＥＧ試薬」）は、当業者に公知である。例えば、いくつかの実施形態において、アミノ基に対する連結に好適なＰＥＧ試薬としては、カルボン酸の活性エステルまたはＰＥＧのカーボネート誘導体、例えば、脱離基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、イミダゾールまたは１−ヒドロキシ−２−ニトロベンゼン−４−スルホネートであるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、マレイミドまたはハロアセチル基を含有するＰＥＧ試薬を使用して、スルフヒドリル基を修飾する。いくつかの実施形態において、アミノ、ヒドラジンおよび／またはヒドラジド基を含有するＰＥＧ試薬を、タンパク質中の炭水化物基の過ヨウ素酸塩酸化によって生成するアルデヒドとの反応で使用することができる。

【0080】

いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは少なくとも１つの反応性基を有する。いくつかの実施形態において、ＰＥＧなどの水溶性ポリマーの活性化誘導体は、水溶性ポリマーを活性化基と反応させることによって作製される。いくつかの実施形態において、活性化基は、一官能性、二官能性、または多官能性であってよい。水溶性ポリマーを２以上の抗体と連結させるために用いられるある例示的な活性化基としては、以下の基：スルホン（例えば、クロロスルホン、ビニルスルホンおよびジビニルスルホン）、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート（tresylate）、アジジリン（azidirine）、オキシランおよび５−ピリジルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ誘導体は、典型的には、加水分解に対して長期間にわたり約１１以下のｐＨの水性環境中で安定である。いくつかの実施形態において、抗体などの別の分子と連結したＰＥＧ誘導体は、分子に加水分解からの安定性を付与する。ある例示的なホモ二官能性ＰＥＧ誘導体としては、ＰＥＧ−ビス−クロロスルホンおよびＰＥＧ−ビス−ビニルスルホンが挙げられるが、これらに限定されるものではない（国際公開第９５／１３３１２号を参照のこと）。

【0081】

５．２．３．モノクローナル抗体を作製するある方法
５．２．３．１．あるハイブリドーマ法
いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は標準的技術によって産生される。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマベースの方法によって産生される。そのようなある方法は、当業者に公知である。例えば、Kohler et al. (1975) Nature256:495-497; Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual Ch. 6 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照のこと。あるそのような実施形態において、好適な動物、例えばマウス、ラット、ハムスター、サル、または他のほ乳類を免疫原で免疫化して、抗体分泌細胞を産生する。いくつかの実施形態において、抗体分泌細胞は、Ｂ細胞、例えばリンパ球または脾細胞である。いくつかの実施形態において、リンパ球（例えば、ヒトリンパ球）をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化して、抗体分泌細胞を生成させる。例えば、Borreback et al. (1988) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 85:3995-3999を参照のこと。

【0082】

いくつかの実施形態において、抗体分泌細胞を「不死化」細胞系、例えば骨髄型細胞系と融合させて、ハイブリドーマ細胞を産生する。いくつかの実施形態では、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えばＥＬＩＳＡによって同定される。いくつかの実施形態において、標準的方法を用いてそのような細胞を次いでサブクローン化することができ、培養することができる。いくつかの実施形態において、そのような細胞を好適な動物宿主における腹水腫瘍などｉｎ ｖｉｖｏで増殖させることもできる。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体をハイブリドーマ培養培地、血清、または腹水から、親和性クロマトグラフィーなどの標準的分離手順を用いて単離する。ある実施形態によるハイブリドーマの産生およびモノクローナル抗体の精製のための手引きは、例えば、Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual Ch. 8 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)で提供されている。

【0083】

いくつかの実施形態において、マウスモノクローナル抗体は、遺伝子改変マウスを免疫原で免疫化することによって産生される。あるそのような実施形態において、マウスはＮＯＴＵＭ欠損マウスであり、これはＮＯＴＵＭ機能が部分的または完全に欠けている。あるそのような実施形態において、マウスは、ＮＯＴＵＭをコードする遺伝子の全部または一部が欠けている「ノックアウト」マウスである。いくつかの実施形態において、そのようなノックアウトマウスをマウスＮＯＴＵＭで免疫化する。いくつかの実施形態において、そのようなノックアウトマウスをヒトＮＯＴＵＭで免疫化する。

【0084】

いくつかの実施形態において、ヒトモノクローナル抗体を、ヒト抗体を産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）において産生させる。例えば、米国特許第６，０７５，１８１Ａ号および同第６，１１４，５９８Ａ号；ならびに国際公開第９８／２４８９３Ａ２号を参照のこと。例えば、いくつかの実施形態において、ヒトイムノグロブリン遺伝子を、内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されたマウスに導入する（例えば、酵母人工染色体、ヒト染色体断片、または生殖細胞系組み込みを使用）。例えば、Jakobovits et al. (1993) Nature362:255-258; Tomizuka et al. (2000) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 97:722-727;およびMendez et al. (1997) Nat. Genet. 15:146-156（トランスジェニックマウスのXenoMouse II（登録商標）系を記載）を参照のこと。

【0085】

いくつかの実施形態において、そのようなトランスジェニックマウスを免疫原で免疫化する。あるそのような実施形態において、抗体を発現するマウスからのリンパ細胞（例えばＢ細胞）を得る。あるそのような実施形態において、そのような回収された細胞を骨髄型細胞系などの「不死化」細胞系と融合させて、ハイブリドーマ細胞を産生する。あるそのような実施形態において、ハイブリドーマ細胞をスクリーンし、選択して、関心のある抗原に特異的な抗体を産生するものを同定する。ヒトモノクローナル抗体の産生に好適なある例示的な方法およびトランスジェニックマウスは、例えば、Jakobovits et al. (1993) Nature362:255-258; Jakobovits (1995) Curr. Opin. Biotechnol.6:561-566; Lonberg et al. (1995) Int’l Rev. Immunol.13:65-93; Fishwild et al. (1996) Nat. Biotechnol.14:845-851; Mendez et al. (1997) Nat. Genet. 15:146-156; Green (1999) J. Immunol. Methods231:11-23; Tomizuka et al. (2000) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 97:722-727で記載され;Little et al. (2000) Immunol. Today21:364-370；および国際公開第９８／２４８９３号で概説されている。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対するヒトモノクローナル抗体は、治療抗体としての使用に好適である。以下のパートＶ．Ｇ．を参照のこと。

【0086】

５．２．３．２．あるディスプレイベースの方法
いくつかの実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、以下で記載するもののいずれかなどのディスプレイベースの方法を用いて産生される。

【0087】

いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は、ファージディスプレイ技術を用いて産生される。種々の抗体ファージディスプレイ法が当業者には知られており、例えば、Hoogenboom, Overview of Antibody Phage-Display Technology and Its Applications, from Methods in Molecular Biology: Antibody Phage Display: Methods and Protocols(2002) 178:1-37 (O’Brien and Aitken, eds., Human Press, Totowa, NJ)で記載されている。例えば、いくつかの実施形態において、抗体のライブラリーは、非溶解性繊維状ファージｆｄまたはＭ１３などの繊維状ファージの表面上で提示される。いくつかの実施形態において、抗体は、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ対を安定化させるために操作された分子間ジスルフィド結合を有するｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｖなどの抗体断片、および二重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、所望の結合特異性を有する抗体を次いで選択することができる。抗体ファージディスプレイ法の非限定的例示的実施形態を以下でさらに詳細に記載する。

【0088】

いくつかの実施形態において、抗体ファージ−ディスプレイライブラリーは、当業者に公知のある方法を用いて調製することができる。例えば、Hoogenboom, Overview of Antibody Phage Display Technology and Its Applications, from Methods in Molecular Biology: Antibody Phage Display: Methods and Protocols (2002) 178:1-37 (O’Brien and Aitken, eds., Human Press, Totowa, NJ)を参照のこと。いくつかの実施形態において、可変遺伝子レパートリーは、抗体分泌細胞のｍＲＮＡから誘導されるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって調製される。例えば、いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡはＢ細胞のｍＲＮＡから調製される。いくつかの実施形態において、重鎖および軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡは、例えば、ＰＣＲによって増幅される。

【0089】

いくつかの実施形態において、重鎖ｃＤＮＡおよび軽鎖ｃＤＮＡを好適なベクター中にクローン化する。いくつかの実施形態において、重鎖ｃＤＮＡおよび軽鎖ｃＤＮＡをクローニングプロセス中にランダムに組み合わせて、それによって多様なｓｃＦｖまたはＦａｂをコードするｃＤＮＡライブラリーのアセンブリを得る。いくつかの実施形態において、重鎖ｃＤＮＡおよび軽鎖ｃＤＮＡをライゲートした後、好適なベクター中にクローン化する。いくつかの実施形態において、重鎖ｃＤＮＡおよび軽鎖ｃＤＮＡを段階的クローニングによって好適なベクター中にライゲートする。

【0090】

いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡをファージディスプレイベクター、例えばファージミドベクター中にクローン化する。ある例示的なファージミドベクター、例えばｐＣＥＳ１は、当業者に公知である。いくつかの実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするｃＤＮＡが同じベクター上に存在する。例えば、いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖをコードするｃＤＮＡを、マイナーファージコートタンパク質ｐＩＩＩをコードする遺伝子ＩＩＩの全部または一部でフレーム中にクローン化する。あるそのような実施形態において、ファージミドはファージ表面上でｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合の発現をおこなう。別法として、いくつかの実施形態において、重鎖（または軽鎖）をコードするｃＤＮＡを遺伝子ＩＩＩの全部または一部でフレーム中にクローン化し、軽鎖（または重鎖）をコードするｃＤＮＡを同じベクター中のシグナル配列の下流でクローン化する。シグナル配列は、軽鎖（または重鎖）の宿主細胞のペリプラズムへの発現をおこない、この場合、重鎖および軽鎖を集めてＦａｂ断片を構築する。別法として、いくつかの実施形態において、重鎖をコードするｃＤＮＡおよび軽鎖をコードするｃＤＮＡが別のベクター上に存在する。あるそのような実施形態において、重鎖および軽鎖ｃＤＮＡを別々に、１つはファージミド中へ、もう１つはファージベクター中へクローン化し、どちらも宿主細胞でのｉｎ ｖｉｖｏ組換えに関するシグナルを含む。

【0091】

いくつかの実施形態において、組換えファージミドまたはファージベクターをイー・コリ（E. coli）などの好適な細菌宿主中に導入する。ファージミドを使用するいくつかの実施形態において、宿主はヘルパーファージに感染して、ファージ構造タンパク質を供給し、それによってファージ表面上に抗体−ｐＩＩＩ融合タンパク質を有するファージ粒子の発現が可能になる。

【0092】

いくつかの実施形態において、「合成」抗体ライブラリーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再配列される可変遺伝子のレパートリーを用いて構築される。例えば、いくつかの実施形態において、重鎖または軽鎖をコードする個々の遺伝子断片（それぞれＶ−Ｄ−ＪまたはＶ−Ｊ）を、ＰＣＲを用いてランダムに組み合わせる。いくつかの実施形態において、さらなる配列多様性を、ＣＤＲ、およびおそらくはＦＲに、例えばエラープローンＰＣＲによって導入することができる。いくつかのそのような実施形態において、さらなる配列多様性がＣＤＲ３、例えば重鎖のＨ３に導入される。

【0093】

いくつかの実施形態において、「ナイーブ」または「ユニバーサル」ファージディスプレイライブラリーを、免疫化されていない動物由来の核酸を用いて前述のようにして構築する。いくつかの実施形態において、免疫化されていない動物はヒトである。いくつかの実施形態において、「免疫化された」ファージディスプレイライブラリーを、免疫化された動物由来の核酸を用いて前述のようにして構築する。いくつかの実施形態において、免疫化された動物は、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、またはサルである。あるそのような実施形態において、動物を後述する免疫源のいずれかで免疫化する。

【0094】

ある例示的ユニバーサルヒト抗体ファージディスプレイライブラリーは、商業的供給源から入手可能である。ある例示的なライブラリーとしては、MorphoSys AG(Martinstreid/Munich, Germany)からのＨｕＣＡＬ（登録商標）シリーズのライブラリー；MAbstract（登録商標）技術を用いたCrucell(Leiden, the Netherlands)からのライブラリー；BioInvent (Lund, Sweden)からのn-CoDeR（商標）Ｆａｂライブラリー；およびCambridge Antibody Technology (Cambridge, UK)から入手可能なライブラリーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0095】

いくつかの実施形態において、ファージディスプレイライブラリーからの所望の結合特異性を有する抗体の選択は、連続パニングステップによって達成される。パニングのいくつかの実施形態において、ライブラリーファージ調製物を抗原に曝露する。あるそのような実施形態において、ファージ−抗原複合体を洗浄し、そして非結合ファージを捨てる。あるそのような実施形態において、結合ファージを回収し、続いてイー・コリを感染させることによって増幅させる。そのようなある実施形態において、モノクローナル抗体産生ファージは、単一のプラークを選択することによってクローン化することができる。いくつかの実施形態において、上記プロセスを繰り返す。

【0096】

いくつかの実施形態において、パニングで使用される抗原は、後述される免疫原のいずれかである。いくつかの実施形態において、抗原を固体支持体上に固定して、親和性クロマトグラフィーにより抗原結合ファージを精製する。いくつかの実施形態において、抗原をビオチニル化し、それによってストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを用いて非結合ファージから結合ファージを分離させる。いくつかの実施形態において、抗原を細胞（直接パニングのため）上、組織低温切開片中、または膜（例えば、ナイロンもしくはニトロセルロース膜）上に固定することができる。あるパニング手順の他のバリエーションは当業者が慣例的に決定することができる。

【0097】

いくつかの実施形態において、酵母ディスプレイシステムを用いてモノクローナル抗体を産生する。あるそのようなシステムにおいて、抗体を融合タンパク質として酵母ＡＧＡ２タンパク質の全部または一部で発現させ、これは酵母細胞壁の表面上に提示されるようになる。あるそのような実施形態において、所望の結合特異性を有する抗体を発現する酵母細胞を、次いで細胞を蛍光標識された抗原に曝露することによって同定することができる。あるそのような実施形態において、抗原に結合する酵母細胞を次いでフローサイトメトリーによって単離することができる。例えば、Boder et al. (1997) Nat. Biotechnol.15:553-557を参照のこと。

【0098】

５．２．３．３．ある親和性成熟法
いくつかの実施形態において、特定の抗原の抗体の親和性は、抗体をｉｎ ｖｉｔｒｏで親和性成熟（または「定向進化」）に付すことによって増大させる。ｉｎ ｖｉｖｏで、天然の抗体は体細胞超変異による親和性成熟と、それに続いて選択を受ける。いくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏ法はそのｉｎ ｖｉｖｏプロセスを模倣し、それによって、天然の抗体の親和性に等しいか、または上回る親和性を有する抗体を産生させる。

【0099】

親和性成熟のいくつかの実施形態において、所望の結合特異性を有する抗体の可変領域をコードする核酸配列に突然変異を導入する。例えば、Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134; Brekke et al. (2002) Nat. Reviews 2:52-62を参照のこと。いくつかの実施形態において、突然変異を重鎖、軽鎖、または両者の可変領域に導入する。いくつかの実施形態において、突然変異を１以上のＣＤＲに導入する。あるそのような実施形態において、突然変異をＨ３、Ｌ３、または両者に導入する。いくつかの実施形態において、突然変異を１以上のＦＲに導入する。いくつかの実施形態において、突然変異のライブラリーを、例えば、ファージ、リボソーム、または酵母ディスプレイライブラリーにおいて作製して、親和性が増大した抗体を、標準的スクリーニング法によって同定することができる。例えば、Boder et al. (2000) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA97:10701-10705; Foote et al. (2000) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA97:10679-10681; Hoogenboom, Overview of Antibody Phage Display Technology and Its Applications, from Methods in Molecular Biology: Antibody Phage Display: Methods and Protocols(2002) 178:1-37 (O’Brien and Aitken, eds., Human Press, Totowa, NJ);およびHanes et al. (1998) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA95:14130-14135を参照のこと。

【0100】

いくつかの実施形態において、抗体の構造、例えば抗原結合部位に関する情報に基づいた部位特異的突然変異によって突然変異を導入する。いくつかの実施形態において、ＣＤＲの組み合わせ突然変異誘発を用いて突然変異を導入する。いくつかの実施形態において、可変領域コード配列の全部または一部を、例えば、イー・コリミューテーター細胞、ホモローガスな遺伝子再構成、またはエラープローンＰＣＲを用いてランダムに突然変異させる。いくつかの実施形態において、突然変異を、「ＤＮＡシャッフリング」を用いて導入する。例えば、Crameri et al. (1996) Nat. Med.2:100-102; Fermer et al. (2004) Tumor Biol. 25:7-13を参照のこと。

【0101】

いくつかの実施形態において、「鎖シャッフリング」を使用して、親和性が増大した抗体を生成させる。鎖シャッフリングのいくつかの実施形態において、１つの鎖、例えば軽鎖は軽鎖のレパートリーで置換され、一方、他の鎖、例えば重鎖は変更されず、かくして特異性を提供する。あるそのような実施形態において、鎖シャッフルされた抗体のライブラリーを作製し、この場合、未変化の重鎖が軽鎖のレパートリーからの各軽鎖との組み合わせで発現される。いくつかの実施形態において、そのようなライブラリーを次いで親和性が増大した抗体についてスクリーンすることができる。いくつかの実施形態において、重鎖および軽鎖の両方が逐次置換される。いくつかの実施形態において、重および／または軽鎖の可変領域だけが置換される。いくつかの実施形態において、重および／または軽鎖の可変領域の一部分だけ、例えば、ＣＤＲが置換される。例えば、Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134; Brekke et al. (2002) Nat. Reviews2:52-62; Kang et al. (1991) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA88:11120-11123; Marks et al. (1992) Biotechnol.10:779-83を参照のこと。

【0102】

いくつかの実施形態において、ヒトＮＯＴＵＭと特異的に結合するマウスモノクローナル抗体（マウスＮＯＴＵＭに対するものであるが、ヒトＮＯＴＵＭと特異的に結合する（即ち、交差反応する）マウスモノクローナル抗体を含む）を、逐次鎖シャッフリングに付す。いくつかの実施形態において、例えば、所定のマウスモノクローナル抗体の重鎖をヒト軽鎖の新しいレパートリーと組み合わせ、そして所望の親和性を有する抗体を選択する。あるそのような実施形態において、選択された抗体の軽鎖を次いでヒト重鎖の新しいレパートリーと組み合わせ、そして所望の親和性を有する抗体を選択する。このように、いくつかの実施形態において、所望の抗原結合特異性および親和性を有するヒト抗体が選択される。

【0103】

別法として、いくつかの実施形態において、所定のマウスモノクローナル抗体の重鎖をヒト軽鎖の新しいレパートリーと組み合わせ、所望の親和性を有する抗体をこの第１ラウンドのシャッフリングから選択する。いくつかの実施形態において、もとのマウスモノクローナル抗体の軽鎖をヒト重鎖の新しいレパートリーと組み合わせ、そして所望の親和性を有する抗体をこの第２ラウンドのシャッフリングから選択する。いくつかの実施形態において、第１ラウンドのシャッフリングから選択される抗体由来のヒト軽鎖を次いで第２ラウンドのシャッフリングで選択された抗体由来のヒト重鎖と組み合わせる。かくして、いくつかの実施形態において、所望の抗原結合特異性および親和性を有するヒト抗体が選択される。

【0104】

いくつかの実施形態において、抗体選択と親和性成熟とが交互になった「リボソームディスプレイ」法を使用する。リボソームディスプレイ法のいくつかの実施形態において、抗体コード化核酸を選択ステップ間のＲＴ−ＰＣＲによって増幅させる。したがって、いくつかの実施形態において、エラープローンポリメラーゼを用いて突然変異を核酸に導入することができる。そのような方法の非限定的例は、Hanes et al. (1998) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA95:14130-14135で記載されている。

【0105】

５．２．３．４．ある組換え法
いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体は組換え技術によって産生される。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと。あるそのような実施形態において、核酸コード化モノクローナル抗体鎖をクローン化し、好適な宿主細胞中で発現させる。例えば、いくつかの実施形態において、ＲＮＡは所望の抗体を発現する細胞、例えば成熟Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞から、標準的方法を用いて調製することができる。いくつかの実施形態において、標準的方法を用いてｃＤＮＡを作製するためにＲＮＡを次いで使用することができる。いくつかの実施形態において、重鎖または軽鎖ポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、例えばＰＣＲにより、特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅される。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡを好適な発現ベクター中にクローン化する。いくつかの実施形態において、発現ベクターを次いで、好適な宿主細胞、例えば内因的に抗体を産生しない宿主細胞などの好適な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトする。ある例示的な宿主細胞としては、イー・コリ、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、および骨髄腫細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。重鎖および軽鎖が同じ宿主中で同時発現されるいくつかの実施形態において、再構成された抗体を単離することができる。

【0106】

いくつかの実施形態において、重鎖または軽鎖をコードするｃＤＮＡを修飾することができる。例えば、いくつかの実施形態において、マウス重鎖または軽鎖の定常領域をヒト重鎖または軽鎖の定常領域で置換することができる。このようにして、いくつかの実施形態において、ヒト抗体定常領域を有するが、マウス抗体の結合特異性を保持するキメラ抗体を産生することができる。

【0107】

いくつかの実施形態において、核酸分子は、ＮＯＴＵＭ中和抗体の重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、単一の核酸分子は、ＮＯＴＵＭ中和抗体の重鎖をコードする第１ポリヌクレオチド配列およびＮＯＴＵＭ中和抗体の軽鎖をコードする第２ポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、例えば、抗体が単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である場合、重鎖のコード配列および軽鎖のコード配列は連続コード配列の一部であるので、単一ポリペプチドが発現され、これは抗体の重鎖および軽鎖の両方を含む。いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖の両方をコードする単一の核酸分子は、２つの鎖を別々のポリペプチドとして発現することができる。いくつかのそのような実施形態では、各鎖は別のプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、２つの鎖は同じプロモーターの制御下にある。当業者は、意図される適用にしたがってＮＯＴＵＭ中和抗体の重鎖および軽鎖の好適な立体配置および好適な制御要素を選択することができる。

【0108】

いくつかの実施形態において、核酸は、ベクター、例えば特定の宿主細胞中の重鎖および／または軽鎖を発現するために好適な発現ベクターである。当業者は、好適な発現ベクター（複数可）を発現のために用いられる宿主細胞に応じて選択することができる。そのようなベクターの多数の例は当該技術分野で公知である。

【0109】

いくつかの実施形態において、核酸分子は、ＭＡｂ１．７３１、１．８０２、１．８１５、１．８４６、２．１０２９、２．５５、２．７８、およびそのようなＭＡｂのヒト化バージョンから選択されるＮＯＴＵＭ中和抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、核酸分子は、配列番号１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１２、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３、１２４、１２７、および１２８から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、ＭＡｂ１．７３１、１．８０２、１．８１５、１．８４６、２．１０２９、２．５５、２．７８、およびそのようなＭＡｂのヒト化バージョンから選択されるＮＯＴＵＭ中和抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、核酸分子は、配列番号１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１３、１１４、１１７、１１８、１２１、１２２、１２５、１２６、１２９、および１３０から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、ＭＡｂ１．７３１、１．８０２、１．８１５、１．８４６、２．１０２９、２．５５、２．７８、およびそのようなＭＡｂのヒト化バージョンから選択されるＮＯＴＵＭ中和抗体の、重鎖をコードする第１ポリヌクレオチド配列および軽鎖をコードする第２ポリヌクレオチド配列を含む。

【0110】

いくつかの実施形態において、組換え抗体をある細胞系で発現させることができる。いくつかの実施形態において、特定の抗体をコードする配列を、好適なほ乳類宿主細胞の形質転換のために用いることができる。ある実施形態によれば、形質転換はポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入するための任意の公知方法によるものであり得る。ある例示的な方法としては、ポリヌクレオチドをウイルス中（またはウイルスベクター中）にパッケージングし、そして宿主細胞をウイルス（またはベクター）で、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号、および同第４，９５９，４５５号によって例示される当該技術分野で公知のあるトランスフェクション手順を用いて形質導入することが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、使用される形質転換手順は、形質転換される宿主に依存する可能性がある。ヘテロローガスなポリヌクレオチドをほ乳類細胞中に導入するためのある例示的な方法は当該技術分野で公知であり、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチド（複数可）のリポソーム中への封入、およびＤＮＡの核中への直接微量注入が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0111】

発現のための宿主として利用可能なある例示的ほ乳類細胞系は当該技術分野で公知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞ガン細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、および多くの他の細胞系をはじめとするAmerican Type Culture Collection (ATCC)から入手可能な多くの不死化細胞系が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、細胞系は、どの細胞系が、ＮＯＴＵＭと特異的に結合する高レベルの抗体を産生するかを決定することによって選択することができる。

【0112】

５．３．治療方法
本発明は、患者において皮質内骨形成を刺激する方法であって、それを必要とする患者に有効量の本発明の抗体を投与することを含む方法を包含する。本発明は、皮質骨厚みを増大させる方法であって、それを必要とする患者に有効量の本発明の抗体を投与することを含む方法も包含する。

【0113】

本発明は、骨量の減少に関連する疾患もしくは障害を治療、管理、または防止する方法であって、それを必要とする患者に治療有効量または予防有効量の本発明の抗体を投与することを含む方法を包含する。疾患および障害の例としては、骨粗鬆症（例えば、閉経後骨粗鬆症、ステロイドまたはグルココルチコイド誘発性骨粗鬆症、男性骨粗鬆症、および特発性骨粗鬆症）、オステオペニア、およびパジェット病が挙げられる。

【0114】

骨折を治療、管理、または防止する方法であって、それを必要とする患者に治療有効量または予防有効量の本発明の抗体を投与することを含む方法も本発明に含まれる。特定の骨折は、転移性骨疾患、すなたち、骨に転移したガンに関連する。骨に転移する可能性のあるガンの例としては、前立腺ガン、乳ガン、肺ガン、甲状腺ガン、および腎臓ガンが挙げられる。

【0115】

本発明はさらに、疾患もしくは障害に関連するか、または起因する骨量の減少を治療、管理、または防止する方法であって、それを必要とする患者に治療有効量または予防有効量の本発明の抗体を投与することを含む方法も包含する。疾患および障害の例としては、セリアック病、クローン病、クッシング症候群、副甲状腺機能亢進症、炎症性腸疾患、および潰瘍性大腸炎が挙げられる。

【0116】

本発明の方法から恩恵を受ける可能性がある非限定的患者としては、５５才以上の年齢の男性および女性、閉経後の女性、ならびに腎不全に苦しんでいる患者が挙げられる。

【0117】

本発明の抗体は、骨に影響を及ぼす疾患もしくは状態の治療、管理、または防止において有用であることが知られている他の薬物と組み合わせて（例えば、同時に、もしくは異なる時に）投与することができる。例としては：アンドロゲン受容体モジュレーター；ビスホスフェート；カルシトニン；カルシウム感知受容体アンタゴニスト；ＲＡＮＫＬ抗体、カテプシンＫ阻害剤；エストロゲンおよびエストロゲン受容体モジュレーター；インテグリンバインダー、抗体、および受容体アンタゴニスト；副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）ならびにそれらのアナログおよび模倣物；ならびにビタミンＤおよび合成ビタミンＤアナログが挙げられる。

【0118】

アンドロゲン受容体モジュレーターの例としては、フィナステリドおよび他の５α−リダクターゼ阻害剤、ニルタミド、フルタミド、ビカルタミド、リアロゾール、および酢酸アビラテロンが挙げられる。

【0119】

ビスホスフェートの例としては、アレンドロネート、シマドロネート（cimadronate）、クロドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、インカドロネート、ミノドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、パミドロネート、ピリドロネート（piridronate）、リセドロネート（risedronate）、チルドロネート、およびゾレンドロネート（ｚｏｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ）、ならびにそれらの薬剤的に許容される塩およびエステルが挙げられる。

【0120】

カテプシンＫ阻害剤の例としては、ＶＥＬ−０２３０、ＡＡＥ５８１（バリカチブ）、ＭＶ０６１１９４、ＳＢ−４６２７９５（レラカチブ）、ＭＫ−０８２２（オダナカチブ）、およびＭＫ−１２５６が挙げられる。

【0121】

エストロゲンおよびエストロゲン受容体モジュレーターの例としては、天然に存在するエストロゲン（例えば、７−エストラジオール、エストロン、およびエストリオール）、共役エストロゲン（例えば、共役ウマエストロゲン）、経口避妊薬、硫酸化エストロゲン、プロゲストゲン、エストラジオール、ドロロキシフェン、ラロキシフェン、ラソフォキシフェン、ＴＳＥ−４２４、タモキシフェン、イドキシフェン、ＬＹ３５３３８１、ＬＹ１１７０８１、トレミフェン、フルベストラント、４−［７−（２，２−ジメチル−１−オキソプロポキシ−４−メチル−２−［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル］−フェニル−２，２−ジメチルプロパノエート、４，４’−ジヒドロキシベンゾフェノン−２，４−ジニトロフェニル−ヒドラゾン、およびＳＨ６４６が挙げられる。

【0122】

インテグリンバインダー、抗体、および受容体アンタゴニストの例としては、ビタキシン（ＭＥＤＩ−５２２）、シレンジタイドおよびＬ−０００８４５７０４が挙げられる。

【0123】

５．４．医薬処方
本発明は、１以上の本発明の抗体、および場合によって１以上の他の薬物、例えば前述のものを含む医薬組成物を包含する。

【0124】

いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭ中和抗体を治療抗体として用いることができる。治療抗体として用いることができる例示的ＮＯＴＵＭ中和抗体としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。当業者は治療薬としての抗体の使用をよく知っている。

【0125】

いくつかの実施形態において、有効量のＮＯＴＵＭに対する抗体および薬剤的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存料および／またはアジュバントを含む医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態において、有効量のＮＯＴＵＭに対する抗体および有効量の少なくとも１つのさらなる治療薬を、薬剤的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存料および／またはアジュバントとともに含む医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療薬は、前述のものから選択される。

【0126】

いくつかの実施形態において、医薬組成物用の処方材料は用いられる投薬量および濃度で受容者に対して非毒性である。

【0127】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、例えば、組成物の、ｐＨ、オスモル濃度、粘度、透明性、色、等張性、臭い、滅菌性、安定性、溶解もしくは放出速度、吸着または浸透を修飾、維持または保存するための処方材料を含む。いくつかの実施形態において、好適な処方材料としては、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンおよびリジン）；抗菌剤；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムおよび亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝液（例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩おおび他の有機酸）；増量剤（例えば、マンニトールおよびグリシン）；キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、およびヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）；充填剤；モノサッカライド、ジサッカライド、および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースおよびデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンおよびイムノグロブリン）；着色剤、香味料、および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成カウンターイオン（例えば、ナトリウム）；保存料（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸および過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールおよびソルビトール）；懸濁化剤；界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０）、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、およびチロキサパル（tyloxapal））；安定性促進剤（例えば、スクロースおよびソルビトール）；張性増加剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物（例えば、塩化ナトリウムまたはカリウム）、マンニトール、およびソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤；ならびに医薬アジュバントが挙げられるが、これらに限定されるものではない。(Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18^th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1990)。

【0128】

いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する抗体または他の治療分子を半減期延長ビヒクルと結合させる。非限定的例示的半減期延長ビヒクルには、当該技術分野で公知のものが含まれる。そのようなビヒクルとしては、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール、およびデキストランが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例示的なそのようなビヒクルは、例えば、公開されたＰＣＴ出願国際公開第９９／２５０４４号で記載されている。

【0129】

いくつかの実施形態において、最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式、および所望の投薬量に応じて当業者によって決定されるであろう。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences（上出）を参照のこと。いくつかの実施形態において、そのような組成物は、中和抗体の物理状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、またはｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を及ぼす可能性がある。

【0130】

いくつかの実施形態において、医薬組成物中の一次ビヒクルまたは担体は、本来は水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、いくつかの実施形態において、好適なビヒクルまたは担体は、注射用水、生理食塩水、または人工脳脊髄液であって、おそらくは非経口投与用組成物で一般的な他の材料を添加したものであってよい。例示的ビヒクルとしては、中性緩衝食塩水および血清アルブミンと混合された食塩水が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ｐＨ約７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、またはｐＨ約４．０〜５．５の酢酸塩緩衝液を含み、これは、ソルビトールもしくはそれに対する好適な代替物をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療薬の有無を問わずＮＯＴＵＭに対する抗体を含む組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、任意の処方薬剤（Remington’s Pharmaceutical Sciences、上出）と混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で貯蔵用に調製することができる。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する抗体を、少なくとも１つのさらなる治療薬の有無を問わず含む組成物を、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として処方することができる。

【0131】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は非経口送達にために選択される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は吸入または経口などの消化管を通した送達のために選択される。薬剤的に許容される組成物を調製するための種々の技術は当業者の技術範囲内である。

【0132】

いくつかの実施形態において、処方成分は投与の部位に対して許容される濃度で存在する。いくつかの実施形態において、組成物を生理学的ｐＨまたは若干低いｐＨ、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲内に維持するために緩衝液を使用する。

【0133】

いくつかの実施形態において、非経口投与が想定される場合、医薬組成物は、さらなる治療薬の有無を問わず、薬剤的に許容されるビヒクル中にＮＯＴＵＭに対する所望の抗体を含むパイロジェンフリーな非経口的に許容される水溶液の形態であってよい。いくつかの実施形態において、非経口注射用ビヒクルは無菌蒸留水であり、この中で、ＮＯＴＵＭに対する抗体が、少なくとも１つのさらなる治療薬の有無を問わず、適切に保存される、無菌等張液として処方される。いくつかの実施形態において、製剤は、所望の分子の、製品の制御放出または持続放出のために提供することができる注射可能なミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物（例えばポリ乳酸もしくはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームなどの薬剤との処方を含む可能性があり、これを次いでデポー注射によって送達することができる。いくつかの実施形態において、ヒアルロン酸も用いることができ、循環中長時間促進効果を有し得る。いくつかの実施形態において、移植可能な薬物送達デバイスを用いて所望の分子を導入することができる。

【0134】

いくつかの実施形態において、医薬組成物を吸入用に処方することができる。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する抗体は、少なくとも１つのさらなる治療薬の有無を問わず、吸入用に乾燥粉末として処方することができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療薬の有無を問わずＮＯＴＵＭに対する抗体を含む吸入溶液を、エアロゾル送達のためのプロペラントと配合してもよい。いくつかの実施形態において、溶液を噴霧することができる。

【0135】

いくつかの実施形態において、処方を経口投与することができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療薬の有無を問わず、このように投与されるＮＯＴＵＭに対する抗体は、錠剤およびカプセルなどの固体投与形態の配合で、通例用いられる担体の有無を問わず用いることができる。いくつかの実施形態において、カプセルは、バイオアベイラビリティーが最大化され、前全身性分解が最小に抑えられる場合に、胃腸管中の場所で処方の有効成分を放出するように設計することができる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのさらなる薬剤を含めて、さらなる治療薬の有無を問わず、ＮＯＴＵＭへの抗体の吸収を促進することができる。いくつかの実施形態において、希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および／またはバインダーも用いることができる。

【0136】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１つのさらなる治療薬の有無を問わず、有効量のＮＯＴＵＭに対する抗体を、錠剤の製造に好適な非毒性賦形剤との混合物中に含む。いくつかの実施形態において、錠剤を無菌水、または別の適切なビヒクル中に溶解させることによって、溶液を単位剤形で調製することができる。例示的賦形剤としては、不活性希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ラクトース、およびリン酸カルシウム）；結合剤（例えば、デンプン、ゼラチン、およびアカシア）；ならびに潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、およびタルク）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0137】

少なくとも１つのさらなる治療薬の有無を問わずＮＯＴＵＭに対する抗体を持続送達または制御送達処方中に含む処方をはじめとするさらなる医薬組成物は、当業者には明かであろう。例示的持続送達または制御送達処方としては、リポソーム担体、生体内分解性微小粒子、多孔性ビーズ、およびデポー注射が挙げられるが、これらに限定されるものではない。処方を調製するための種々の技術が当業者には知られている。いくつかの実施形態において、持続放出製剤は、成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルなどの成形品の形態の半透性ポリマーマトリックスを含んでもよい。例示的持続放出マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（例えば、米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許出願公開第０５８，４８１号を参照のこと）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（例えば、Sidman et al. (1983) Biopolymers22:547-556を参照のこと）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（例えば、Langer et al. (1981) J. Biomed. Mater. Res.15:167-277およびLanger (1982) Chem. Tech.12:98-105を参照のこと）、エチレンビニルアセテート（Langer et al.、上出）、およびポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第１３３，９８８号）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、持続放出組成物はリポソームを含む可能性があり、これは、いくつかの実施形態において、当該技術分野で公知のいくつかの方法のうちのいずれかによって調製することができる。例えば、Eppstein et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692；欧州特許出願公開第０３６，６７６号；欧州特許出願公開第０８８，０４６号；および欧州特許出願公開第１４３，９４９号を参照のこと。

【0138】

いくつかの実施形態において、ｉｎ ｖｉｖｏ投与で使用される医薬組成物は、典型的には無菌である。いくつかの実施形態において、これは、無菌ろ過膜を通したろ過によって得ることができる。組成物が凍結乾燥されるいくつかの実施形態において、この方法を使用する殺菌を凍結乾燥および再構成の前または後のいずれかで実施することができる。いくつかの実施形態において、非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態または溶液中で貯蔵することができる。いくつかの実施形態において、非経口組成物は、一般的に、無菌点検口を有する容器、例えば、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液袋またはバイアル中に入れられる。

【0139】

いくつかの実施形態において、医薬組成物を処方したら、それは、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として無菌バイアル中で貯蔵することができる。いくつかの実施形態において、そのような処方は、すぐに使える形態または投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥品）のいずれかで貯蔵することができる。

【0140】

いくつかの実施形態において、単回投与単位を製造するためのキットが提供される。いくつかの実施形態において、キットは、それぞれ乾燥タンパク質を有する第１容器および水性処方を有する第２容器の両方を含有してもよい。いくつかの実施形態において、単一または複数のチャンバーを有するあらかじめ充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ（lyosyringe）を含むキットが含まれる。

【0141】

いくつかの実施形態において、治療的に用いられる、少なくとも１つのさらなる治療薬の有無にかかわらずＮＯＴＵＭに対する抗体を含む医薬組成物の有効量は、例えば、治療の背景および目的によって変わるであろう。当業者は、いくつかの実施形態による治療のための適切な投薬量レベルが、したがって、送達される分子、ＮＯＴＵＭに対する抗体が少なくとも１つのさらなる治療薬の有無にかかわらず使用される兆候、投与経路、ならびに患者のサイズ（体重、体表または器官のサイズ）および／または状態（年齢および全体的な健康）に応じて変わることを理解するであろう。いくつかの実施形態において、臨床医は投薬量を滴定し、投与経路を修飾して、最適の治療効果を得ることができる。いくつかの実施形態において、典型的な投薬量は、前述の因子によって、約０．１μｇ／ｋｇ患者体重から約１００ｍｇ／ｋｇ以上まで及ぶ可能性がある。いくつかの実施形態において、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで；１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで；または５μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで（前記終点の任意のものの間の全ての点（小数を含む）を含む）に及ぶ可能性がある。いくつかの実施形態において、投薬量は約１ｍｇ／ｋｇ体重〜約６０ｍｇ／ｋｇ体重である。いくつかの実施形態において、投薬量は約１ｍｇ／ｋｇ体重、約３ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約２０ｍｇ／ｋｇ体重、約３０ｍｇ／ｋｇ体重、約４０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、または約６０ｍｇ／ｋｇ体重である。

【0142】

いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する中和抗体のヒト用量は、例えばマウス、イヌ、サルなどの別の種における同じ抗体の有効用量に基づいて決定される。いくつかの実施形態において、ＮＯＴＵＭに対する中和抗体のヒト用量は、“Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers,”U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, and Center for Drug Evaluation and Research (CDER), July 2005 (Pharmacology and Toxicology)を用いて決定される。

【0143】

いくつかの実施形態において、好適な投薬量は、当業者が、例えば動物実験に基づいて決定することができる。

【0144】

様々な実施形態でＮＯＴＵＭに対する中和抗体を患者に対して、週２回、週１回、２週ごとに１回、１ヶ月に１回、隔月に１回、またはさらに低頻度で投与する。

【0145】

いくつかの実施形態において、投薬の頻度は、ＮＯＴＵＭに対する抗体の薬物動態パラメータおよび、該当する場合、使用される処方中の任意のさらなる治療薬を考慮する。いくつかの実施形態において、臨床医は、投薬量が所望の効果を達成する値に到達するまで、組成物を投与するであろう。いくつかの実施形態において、組成物は、したがって、単回投与として、または２以上の投与量（同じ量の所望の分子を含有してもよいし、または含有しなくてもよい）として長時間にわたり、または埋込デバイスもしくはカテーテルによる連続注入として、投与することができる。いくつかの実施形態において、適切な投薬量のさらなる改良は当業者によって慣例的におこなわれ、当業者が慣例的に実施する職務の範囲内である。いくつかの実施形態において、適切な投薬量は、適切な用量応答データの使用により確認することができる。いくつかの実施形態において、患者は、ＮＯＴＵＭに対する抗体を含む医薬組成物を１回投与される。いくつかの実施形態において、患者は、ＮＯＴＵＭに対する抗体を含む医薬組成物を１日につき１、２、３、または４回投与される。いくつかの実施形態において、患者は、ＮＯＴＵＭに対する抗体を含む医薬組成物を１週間につき１、２、３、４、５、または６回投与される。いくつかの実施形態において、患者は、ＮＯＴＵＭに対する抗体を含む医薬組成物を１月あたり１、２、３、または４回投与される。

【0146】

いくつかの実施形態において、医薬組成物の投与経路は、公知方法にしたがい、例えば、経口、皮下、静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内経路による注射による；持続放出システムによるかもしくは埋込デバイスによる。いくつかの実施形態において、組成物は、ボーラス注射によるかもしくは注入により連続的に、または埋込デバイスにより投与することができる。

【0147】

いくつかの実施形態において、組成物は、その上に所望の分子を吸収もしくは封入させた、膜、スポンジまたは別の適切な材料の埋め込みによって局所的に投与することができる。埋込デバイスが使用されるいくつかの実施形態において、デバイスは任意の好適な組織または器官中に移植することができ、所望の分子の送達は、拡散、持続放出ボーラス、または連続投与による可能性がある。

【0148】

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療薬の有無にかかわらず、ＮＯＴＵＭに対する抗体は、本明細書中に記載されるものなどの方法を用いて遺伝子操作されたある細胞を移植することによって送達され、ポリペプチドを発現し、分泌する。いくつかの実施形態において、そのような細胞は、動物またはヒト細胞であってよく、オートローガス、ヘテロローガス、またはキセノローガスであってよい。いくつかの実施形態において、細胞は不死化されていてもよい。いくつかの実施形態において、免疫応答の機会を減少させるために、細胞を封入して、周辺組織の侵入を回避することができる。いくつかの実施形態において、封入材料は、典型的には、タンパク質産物（複数可）の放出を許容するが、患者の免疫系または周辺組織からの他の有害因子による細胞の破壊を防止する生体適合性半透性ポリマーエンクロージャーまたは膜である。

【実施例】

【0149】

６.１. ノックアウトマウス
ヒトＮＯＴＵＭ遺伝子のマウスオルソログ中の遺伝的に操作された変異とホモ接合型であるマウスを、変異マウスＥＳ細胞クローンのＯＭＮＩＢＡＮＫコレクション由来の、対応する変異胚性幹（ＥＳ）細胞のクローンを使用して作製した（一般的には、米国特許第６，０８０，５７６号を参照のこと）。簡単に説明すると、マウスＮＯＴＵＭ遺伝子座への変異原性ウイルス挿入物を含むＥＳ細胞クローンを、胚盤胞に微量注入し、それを今度は偽妊娠の雌性宿主に移植し、出産に至らせた。その後、得られたキメラの子孫を、Ｃ５７黒色雌性マウス６匹により繁殖させ、その子孫における、ノックアウトＮＯＴＵＭ対立遺伝子の生殖系列の伝達に関して調査した。続いて、変異ＮＯＴＵＭ対立遺伝子に対してヘテロ接合型である動物を繁殖させ、変異ＮＯＴＵＭ対立遺伝子に対してホモ接合型である子孫、変異ＮＯＴＵＭ対立遺伝子に対してヘテロ接合型である子孫、または野生型の子孫を、約１：２：１の比率で得た。

【0150】

ＮＯＴＵＭ遺伝子の破壊に対してホモ接合型である（−／−）マウスを、ＮＯＴＵＭ遺伝子の破壊に対してヘテロ接合型である（＋／−）マウス、および野生型（＋／＋）同腹子とともに調査した。この分析の間、哺乳類対象における主要な器官系の機能を評価するために設計された、総合的な一連の医学的診断手順を使用して、マウスを医学的に精密検査した。ホモ接合型（−／−）の「ノックアウト」マウスを、記載される数で、ならびにヘテロ接合型（＋／−）および野生型（＋／＋）同腹子とともに調査することにより、より信頼性が高く、再現性のあるデータが得られた。

【0151】

図１に示す通り、ＮＯＴＵＭ遺伝子のホモ接合型の破壊を含む雄性マウス（「ｈｏｍ」）は、週齢１６週において、それらの野生型同腹子と比較して、種々の骨部位でより大きな皮質厚を示した（マウスの数Ｎ＝両群において１０）。マイクロＣＴ（スキャンコ社（Scanco） μＣＴ４０）により測定されたこれらの差異は：大腿骨骨幹中央部で２８％（ｐ＜０．００１）；上腕骨骨幹中央部で１９％（ｐ＜０．００１）；脛骨骨幹中央部で１７％（ｐ＜０．００１）；および脛骨−腓骨接合部で１１％（ｐ＜０．００１）であった。図２に示す通り、週齢１６週において、ＮＯＴＵＭ変異に対してヘテロ接合型であるマウス（「ｈｅｔ」）の大腿骨骨幹中央部の皮質骨厚もまた、それらの野生型同腹子のものより大きく：雄性ｈｅｔ（Ｎ＝５０）は、それらの野生型同腹子（Ｎ＝２３）と比較して、６％（ｐ＝０．００７）の増加を示し；および雌性ｈｅｔ（Ｎ＝５７）は、それらの野生型同腹子（Ｎ＝２２）と比較して、９％（ｐ＜０．００１）の増加を示した。

【0152】

ＮＯＴＵＭ動物において観察された骨形成再分布の実際的な徴候が、図３および４に示されており、これは、標準的な４点屈曲試験を使用した、大腿骨破壊強度試験（スケルテック社（SkeleTech）、現在はリセルカバイオサイエンス社（Ricerca Biosciences）、により実施）の結果を示す。図３は、週齢１６週の雄性マウスに関して得られた結果を示しており、ｈｅｔ（Ｎ＝２０）は、それらの野生型同腹子（Ｎ＝２３）と比較して、大腿骨破壊強度において５％（ｐ＝０．５４）の増加を示し、一方ｈｏｍ（Ｎ＝１７）は、２８％（ｐ＜０．００１）の増加を示した。これに対して、ＮＯＴＵＭ ｈｏｍおよびｈｅｔ両方の脊椎圧迫試験では、最大脊椎圧迫負荷において、野生型対照と比較して有意な減少はみられなかった。週齢１６週の雌性のマウスにおいても、類似した結果を得た。図４に示す通り、ｈｅｔ（Ｎ＝２０）は、それらの野生型同腹子（Ｎ＝２１）と比較して、大腿骨破壊強度において１２％（ｐ＝０．０４）の増加を示し、一方ｈｏｍ（Ｎ＝１８）は、２８％（ｐ＜０．００１）の増加を示した。これらおよび他のデータの分析により、皮質厚および大腿骨破壊強度間の、強力な相関関係が明らかになった。

【0153】

６．２． 組換え型ＮＯＴＵＭタンパク質の作製および精製
それぞれのＣ末端に６ＸＨｉｓエピトープタグを付けた、ヒト、触媒的に不活性なヒト（Ｓ２３２Ａ）、マウス、触媒的に不活性なマウス（Ｓ２３９Ａ）、ラット、モルモット、カニクイザルサル、およびアカゲザルのＮＯＴＵＭの完全長コード配列を、発現ベクターｐＩＲＥＳｐｕｒｏ２（クローンテック社（Clontech））中にサブクローニングした。発現構築体を使用して、一過性導入により、分泌されたＮＯＴＵＭタンパク質を含む馴化培地を作製することができ、または、例えば、その後のＮＯＴＵＭタンパク質精製のために、より多量の馴化培地を作製するための、安定したトランスフェクタントを作製することもできる。

【0154】

Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社（Invitrogeｎ））を使用してＨＥＫ２９３Ｆ細胞をトランスフェクトし、振盪フラスコ中の、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地（インビトロジェン社（Invitrogen））中の懸濁培養液中で培養した。一過性導入用には、トランスフェクションの４日後に馴化培地を収集し、無菌濾過し、４℃で保管した。安定にＮＯＴＵＭタンパク質を発現している細胞株を作製するために、ピューロマイシンの存在下で、発現プラスミドのゲノム挿入を選定した。

【0155】

抗Ｈｉｓ抗体を使用して、ＮＯＴＵＭタンパク質の発現および分泌を、細胞可溶化物および／または馴化培地のウエスタンブロットにより確認した。限界希釈による、ＮＯＴＵＭを産生する大量の安定したトランスフェクタントのサブクローニングは、ＮＯＴＵＭを発現している個々のクローンを、抗Ｈｉｓウエスタンブロットにより、比較的高レベルで同定することを可能にした。

【0156】

精製したマウスおよびヒトＮＯＴＵＭタンパク質を、１０〜２０ｍｇの規模で作製するため、マウスまたはヒトＮＯＴＵＭのどちらかを発現しているクローンのＨＥＫ２９３Ｆ細胞株を、懸濁培養液中で、体積３Ｌまで増加させた。この体積における細胞密度が、１×１０＾６生存細胞／ｍｌに達した時点で、細胞を遠心分離によりペレット化し、新鮮なＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地中に懸濁し、さらに９６時間、追加で培地を取り換えることなく、培養液中に維持した。９６時間後、培養液を収集し、細胞を遠心分離によりペレット化し、馴化培地を無菌濾過し、その後の処理のために、４℃で保管した。

【0157】

精製の直前に、ＮＯＴＵＭ含有馴化培地を３Ｌから１Ｌに濃縮し、次いで公称分画分子量１０ｋＤａの膜を使用したタンジェント流ろ過により、緩衝剤を、ニッケル固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）緩衝剤（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に交換した。その後、濃縮し緩衝剤を交換した馴化培地を、平衡化しニッケル荷電した、金属キレート化カラムに通した。結合したタンパク質を洗浄し、イミダゾールの濃度勾配を使用して溶出した。純粋なＮＯＴＵＭタンパク質を含む溶出画分をプールし、リン酸緩衝食塩水に対して透析して、溶出緩衝剤を除去した。精製し、透析したタンパク質を分割し、−８０℃で凍結した。

【0158】

タンパク質の各１回分として、１つの分割量を使用し、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（サーモサイエンティフィック社（Thermo Scientific）、イリノイ州、ロックフォード）によるタンパク質濃度の測定、ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびその後のクーマシィーまたは銀染色による純度の測定、無細胞ＯＰＴＳ酵素アッセイ（以下の実施例６．４．１に記載）および細胞ベースのＷｎｔシグナル伝達アッセイ（以下の実施例６．４．２に記載）の両方における活性の測定、ならびにリムルス変形細胞溶解物（ＬＡＬ）アッセイ（ロンザ社（Lonza）、スイス、バーゼル）による内毒素濃度の測定を行った。

【0159】

６．３． ＮＯＴＵＭに対するマウスモノクローナル抗体の作製
精製した組換え型ヒトおよびマウスＮＯＴＵＭタンパク質に対する抗体を、２つの別々の免疫化キャンペーンにおいて作成した。

【0160】

キャンペーン１において、ＮＯＴＵＭ遺伝子中の遺伝子トラップ挿入物に対してホモ接合型であり、そのため内在性のＮＯＴＵＭタンパク質を欠いているマウスを、以下の通り、ヒトＮＯＴＵＭタンパク質で免疫化した。フロイント完全アジュバント中２０μｇのヒトＮＯＴＵＭタンパク質を、腹腔内に注射することにより、マウスをプライミングした。フロイント不完全アジュバント中２０μｇのヒトＮＯＴＵＭタンパク質を、２〜３週に１回、腹腔内に注射することにより、マウスを追加免疫した。ＥＬＩＳＡによる測定において、ヒトＮＯＴＵＭに対して、強い血清力価を示しているマウスには、ＰＢＳ中１０μｇのヒトＮＯＴＵＭタンパク質を静脈内（ｉ．ｖ．）に注射することにより、最終の追加免疫を施した。

【0161】

キャンペーン２において、ＮＯＴＵＭ遺伝子中の遺伝子トラップ挿入物に対してホモ接合型のマウスを、ＣｐＧ ＤＮＡを含むＴｉｔｅｒＭａｘアジュバント中１０μｇマウスＮＯＴＵＭタンパク質による、後足蹠からのプライミング免疫化の後、ＣｐＧ ＤＮＡを含むミョウバンアジュバント中１０μｇのマウスＮＯＴＵＭタンパク質による、３日または４日おきの、１０回の追加免疫により、免疫化した。ＰＢＳ中１０μｇのマウスＮＯＴＵＭタンパク質による足蹠からの最終追加免疫の後、高力価マウスから鼠径部および膝窩リンパ節を収集した。

【0162】

静脈注射で追加免疫したマウス由来の脾臓または足蹠から免疫化したマウス由来のリンパ節を、最終の追加免疫の４日後に収集し、細かく刻んで漉し、細胞懸濁液を得た。赤血球を溶解させ、非Ｂ細胞集団に特異的な抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用した陰性選択により、細胞懸濁液のＢ細胞を濃縮した。濃縮したＢ細胞とマウスＮＳ１骨髄腫細胞の電気細胞融合によりハイブリドーマを作製し、９６ウェルプレート上の、ヒポキサンチンおよびアミノプテリンを含むハイブリドーマ培地中に播種して、生存Ｂ細胞／骨髄腫細胞ハイブリドーマを選択した。

【0163】

ハイブリドーマ馴化培地を、受動的に吸着されたＮＯＴＵＭタンパク質で、免疫反応性についてＥＬＩＳＡ型でアッセイすることにより、ハイブリドーマを、ＮＯＴＵＭ特異的抗体の作製のためにスクリーニングした。マウスおよび／またはヒトＮＯＴＵＭに特異的な抗体を分泌する、何百個ものハイブリドーマが、両免疫化キャンペーンから発見された。

【0164】

６．４． ＮＯＴＵＭ中和アッセイ
６．４．１． ＯＰＴＳアッセイ
ＯＰＴＳアッセイにおいては、エステラーゼおよびリパーゼの蛍光アッセイのための水溶性酵素基質である、８−オクタノイルオキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム（ＯＰＴＳ）を使用して、ＮＯＴＵＭ活性を測定する。ＯＰＴＳにおけるエステル結合の酵素的開裂により、蛍光生成物が生成される。

【0165】

ハイブリドーマ馴化培地が、一般的に、ＯＰＴＳアッセイに干渉したことが分かったが、これはおそらくは、同じくＯＰＴＳを切断することが出来る加水分解酵素が、瀕死の細胞から放出されることが原因である。この理由により、ＥＬＩＳＡにおいて当初から最高レベルの結合活性を示していた細胞株のための、追加のハイブリドーマ馴化培地を作製し、プロテインＡビーズを使用したアフィニティークロマトグラフィーにより、９６ウェル型中で、抗体を精製した。次いでこれらの精製された抗体を、前もって定量化することなく、ＯＰＴＳアッセイにおいて、４倍希釈で試験した。

【0166】

抗体を、３８４ウェルプレート中、４つ一組で試験した。４Ｘ反応緩衝液（２０ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）中１２５ｎｇの精製ＮＯＴＵＭを含む１２．５μｌを、１２．５μｌの精製抗体に添加した。混合後、抗体およびＮＯＴＵＭを、室温で２０分間インキュベートし、その後５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中の１．２５μＭ ＯＰＴＳ（シグマ社（Sigma）、カタログ番号：７４８７５）２５μｌを添加した。混合後、室温で１０分間酵素反応を進行させ、その後３％ＳＤＳ、２５μｌの添加により、反応を停止した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー上で、４８５ｎｍの励起波長および５３５ｎｍの発光波長でプレートを読み取り、切断産物の量を定量化した。

【0167】

キャンペーン１で得たヒトＮＯＴＵＭ免疫反応性ハイブリドーマ１，１３５個のスクリーニングにより、７０％超のヒトＮＯＴＵＭの阻害を示す３つの抗体を得た。クローンのハイブリドーマ由来の５０ｍｌの馴化培地を使用した、限界希釈およびプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる小規模の精製抗体作製により、これら３つの抗体とともに、ＯＰＴＳアッセイにおいてある程度の中和を示した追加の５つのハイブリドーマを、サブクローニングのために選択した。

【0168】

キャンペーン２で特定された１，０５６個のマウスＮＯＴＵＭ免疫反応性ハイブリドーマのＯＰＴＳアッセイスクリーニングにより、５０％超のマウスＮＯＴＵＭ阻害を示した６つの抗体を得た。クローンのハイブリドーマ由来の５０ｍｌの馴化培地を使用した、限界希釈およびプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる小規模の精製抗体作製により、これら６つの抗体とともに、ＯＰＴＳアッセイにおいてある程度の中和を示した追加の６つのハイブリドーマを、サブクローニングのために選択した。

【0169】

６．４．２． Ｗｎｔシグナル伝達アッセイ
ＮＯＴＵＭは、Ｗｎｔシグナル伝達の負の制御因子として作用し得る。ＣｅｌｌＳｅｎｓｏｒ（登録商標）技術および以下のとおり作製される馴化培地を使用するＷｎｔシグナル伝達アッセイにおいて、Ｗｎｔシグナル伝達における影響を介して測定された抗体中和活性を測定した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター中のプラスミド含有ヒトＮＯＴＵＭを、ＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトし、４００μｇ／ｍＬのＧ４１８の存在下で培養することにより、クローンを選択した。これらの細胞由来の馴化培地を、アッセイに使用した。馴化培地中にＷｎｔ３ａを過剰発現および分泌しているＬ細胞をＡＴＣＣから購入した。

【0170】

アッセイプロトコルは以下のとおりである。ＣｅｌｌＳｅｎｓｏｒ（登録商標）ＬＥＦ／ＴＣＦ−ｂｌａ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３Ｆ細胞（インビトロジェン社（Invitrogen））を、１０％ 透析ＦＢＳ、５μｇ／ｍｌ ブラストサイジン（インビトロジェン社（Invitrogen）、Ｒ２１０−０１）、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１×ＧＰＳを含むＤＭＥＭ中で、１５ｃｍプレート中、コンフルエント近くまで培養した。最初にＰＢＳで洗浄し、その後５ｍＬのトリプシンを添加し、プレートを室温で２分間インキュベートすることにより、細胞をトリプシン処理した。次いで、１５ｃｍプレートあたり、合計１０ｍＬのアッセイ培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、＋０．５％ 透析ＦＢＳ、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１×ＧＰＳ）を添加した。細胞をカウントし、５０，０００細胞／ｍＬで懸濁した。Ｂｉｏｃｏａｔ３８４ウェルプレート（フィッシャー社（Fisher）、カタログ番号：３５６６６３）中に、１００００細胞／２０μＬ／ウェルの密度で、細胞を播種した。細胞を３７℃で３時間インキュベートした後、アッセイ培地中３０ｍＭのＬｉＣｌ、１０μＬをウェルあたりに添加し、その後、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、ともにアッセイ培地中の、抗体１５μＬおよび精製ＮＯＴＵＭ１５μＬを、総体積４５μＬのアッセイ培地中、室温で３０分間、９６ウェルプレート中で共インキュベートした。アッセイにおいて、５０％阻害をもたらすことが予め測定された濃度、一般的に２５ｎＭ、のＮＯＴＵＭを使用した。３０分間のインキュベーションの後、１５μＬの未希釈のＬ−Ｗｎｔ３ａ馴化培地を、４５μＬの抗体／ＮＯＴＵＭ混合物に添加し、１０μｌの得られた混合物を、ＣｅｌｌＳｅｎｓｏｒ（登録商標）細胞を含む３８４ウェルプレートのウェル、４組に、添加した。対照には、いずれの細胞をも欠くウェル、ＮＯＴＵＭを欠くウェル、およびＬ−Ｗｎｔ３ａ馴化培地を欠くウェルが含まれた。アッセイプレートを３７℃で５時間インキュベートして、Ｗｎｔを介したβラクタマーゼ上方制御を可能にし、次いで８μｌのＬｉｖｅＢＬＡｚｅｒ（商標）−ＦＲＥＴ Ｂ／Ｇ基質（ＣＣＦ４−ＡＭ、インビトロジェン社（Invitrogen））を各ウェルに添加し、プレートを室温で３時間、暗所にてインキュベートした。次いで、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー上で、４００ｎｍの励起波長および４６０ｎｍのおよび５３５ｎｍの発光波長を使用して、プレートを読み取った。

【0171】

６．５． ＮＯＴＵＭ中和抗体の特徴付け
クローンのハイブリドーマから精製された抗体を、それらの種交差反応性に関してはＥＬＩＳＡにより、減少し変性したＮＯＴＵＭタンパク質を認識する能力に関してはウエスタンブロットにより、ならびにそれらの中和作用強度に関しては、ともに実施例６．４において上述された無細胞ＯＰＴＳアッセイおよび細胞ベースのＷｎｔシグナル伝達アッセイにおいて、特徴付けした。

【0172】

キャンペーン１由来のモノクローナル抗体の機能的試験により、ＯＰＴＳおよびＷｎｔシグナル伝達アッセイの両方において、１〜１０ｎＭの範囲のＩＣ_５０で、ヒトＮＯＴＵＭを中和する３つの抗体、１．８０２、１．８１５、１．８４６が明らかになった。これらの抗体は、マウスＮＯＴＵＭの活性にはいかなる影響も及ぼさず、ＥＬＩＳＡにより、ヒトＮＯＴＵＭには結合するが、マウスＮＯＴＵＭには結合しないことが示された。さらに、これらの抗体は、ＮＯＴＵＭタンパク質をアッセイプレートに受動的に吸着させた場合には、ごく弱くしかヒトＮＯＴＵＭを認識せず、および抗Ｈｉｓ提示ヒトＮＯＴＵＭタンパク質に対して、より一層感受性が高かった。

【0173】

表１は、キャンペーン１由来のある特定の抗体に対する、種々の特徴付け実験の結果を示す。「Ｂｉｎ」列中のデータは、以下の実施例６．６に記載される方法を用いて、作成された。

【0174】

【表1】

【0175】

キャンペーン２由来のモノクローナル抗体の機能的試験により、興味深い活性プロファイルが明らかになった。より詳細には、モノクローナル抗体２．７８は、ＯＰＴＳおよびＷｎｔシグナル伝達アッセイの両方において、マウスおよびヒトＮＯＴＵＭ両方を、３〜５０ｎＭの範囲のＩＣ_５０で中和した。一方モノクローナル抗体２．１０２９は、ＯＰＴＳアッセイにおいて、マウスおよびヒトＮＯＴＵＭの両方を５〜３０ｎＭの範囲のＩＣ_５０で中和したが、Ｗｎｔシグナル伝達アッセイにおいては、ヒトＮＯＴＵＭのみを１４ｎＭのＩＣ_５０で中和した。後者の観察結果は、組換え型のマウスおよびヒトＮＯＴＵＭタンパク質の質に、いくらかの差異が存在することに起因した。該タンパク質間の、１つの周知の差異は、組換え型マウスＮＯＴＵＭは、組換え型ヒトＮＯＴＵＭよりも、より一層大きな割合で、多量体／集合体として存在するということである。２．７８または２．１０２９のどちらも、ウエスタンブロットにおいて、減少し変性したＮＯＴＵＭタンパク質を認識せず、およびどちらも、受動的に吸着されたＮＯＴＵＭに比べて、抗Ｈｉｓ提示ＮＯＴＵＭに対し、実質的により免疫反応性が高かった。

【0176】

表２は、キャンペーン２由来のある特定の抗体についての、種々の特徴付け実験の結果を示す。「Ｂｉｎ」列中のデータは以下の実施例６．６に記載される方法を使用して、作成された。

【0177】

【表2】

【0178】

６．６． ＮＯＴＵＭ中和抗体を使用した結合競合実験
両免疫化キャンペーン由来の抗体の、ＮＯＴＵＭタンパク質に対する互いの結合を妨げる能力について、エピトープ結合アッセイにおいて評価した。このアッセイは、抗Ｈｉｓで捕獲したＮＯＴＵＭタンパク質を使用して、ＥＬＩＳＡ型で実施した。捕獲したＮＯＴＵＭタンパク質を、過剰な量の、未標識のＮＯＴＵＭ特異的抗体（「遮断」抗体）とともにインキュベートし、その後ビオチン標識したＮＯＴＵＭ特異的抗体（「プローブ」抗体）を添加した。プローブ抗体の結合を、ストレプトアビジンに結合したＨＲＰを使用して測定した。２つの抗体が同一のエピトープ空間での結合において競合する場合、または遮断抗体が、例えばアロステリックな干渉などにより、プローブ抗体の結合能力に何らかの影響を与える場合、信号は生成されない。２つの抗体が互いに干渉しない場合は、遮断抗体の不存在下で試験されたビオチン標識抗体に類似する信号が生成される。抗体を、逆行列型で試験する。典型的に、一組の抗体は、２つのうちのどちらが遮断抗体でどちらがプローブ抗体であるかに関わらず、同レベルの干渉を示す。類似したプロファイルを示す抗体を、同一のエピトープ「ｂｉｎ」に割り当てる。

【0179】

この方法論を使用することにより、モノクローナル抗体、１．８０２、１．８１５、１．８４６、２．７８、および２．１０２９すべてが、ヒトＮＯＴＵＭに対する互いの結合に干渉するが、いくつかの他のより強力ではない中和剤または非中和剤の結合は干渉しないことが示された。

【0180】

６．７．ＮＯＴＵＭ中和抗体のエピトープマッピング
ヒトＮＯＴＵＭ特異的モノクローナル抗体、１．８０２、１．８１５、および１．８４６の結合に関与するアミノ酸のマッピングをするために、ＮＯＴＵＭのオープンリーディングフレームをコードする発現構築体のＨＥＫ２９３Ｆ中に、ヒトおよびマウス配列の混合物を一過性導入することにより、ヒト／マウスのキメラＮＯＴＵＭタンパク質を作製した。抗Ｈｉｓ抗体を用いたウエスタンブロットおよびＯＰＴＳアッセイにより、これらのトランスフェクション由来の馴化培地が、機能的なＮＯＴＵＭキメラを含有することが示された。

【0181】

図５は、この実験において使用されたヒト／マウスのキメラＮＯＴＵＭタンパク質の模式図である。これらのタンパク質の配列を、第７節（配列表）に示す。馴化培地をＥＬＩＳＡ型において使用し、抗体の特異性を測定した。ヒト特異的モノクローナル抗体の、特定のキメラに対する結合の損失に基づき、モノクローナル抗体１．８０２、１．８１５、および１．８４６（これらすべては「Ｂｉｎ１」抗体である）が、結合において、Ｑ４７〜Ｍ１７７間のヒトＮＯＴＵＭアミノ酸に依存するということが判明した。図５を参照のこと。この領域内で、マウスおよびヒトＮＯＴＵＭは、５つの位置（ヒト配列の番号付けに基づいて、Ｒ１１５Ｋ、Ｄ１４１Ｓ、Ｒ１５０Ｋ、Ｒ１５４Ｈ、およびＹ１７１Ｈ）において異なっている。ヒトＮＯＴＵＭを発現している構築体に、これらの５つの位置それぞれにおいてマウスアミノ酸を一過性導入することにより、ヒトＮＯＴＵＭ点変異体を作製し、ＯＰＴＳアッセイにおいて、点変異体がすべて、機能的であることが示された。ＥＬＩＳＡにより、モノクローナル抗体１．８０２、１．８１５、および１．８４６は、ヒトＮＯＴＵＭ Ｄ１４１Ｓを除くすべての点変異体と結合し、このアミノ酸が、それらのヒトＮＯＴＵＭに対する結合において重要であることを示した。一過性導入により、相互点変異を有するマウスＮＯＴＵＭである、マウスＮＯＴＵＭ Ｓ１４８Ｄを作製した。マウスＮＯＴＵＭ Ｓ１４８Ｄは、ＯＰＴＳアッセイにおいて活性であり、かつヒトＮＯＴＵＭ特異的モノクローナル抗体の結合を補助することが示された。従って、モノクローナル抗体１．８０２、１．８１５、および１．８４６の種特異性は、ヒトＮＯＴＵＭの位置１４１のアミノ酸に依存するようであり、そのアミノ酸は、未変性のヒトＮＯＴＵＭタンパク質においてはアスパラギン酸である。

【0182】

キメラ手法は、モノクローナル抗体２．７８または２．１０２９の結合に関与するアミノ酸をマッピングするためには使用することが出来ない。これらは、ヒトおよびマウスＮＯＴＵＭ両方と交差反応するからである。モノクローナル抗体１．８０２、１．８１５、１．８４６、２．７８、および２．１０２９が互いの結合に干渉するという発見に基づき、ヒトＤ１４１近傍の荷電アミノ酸残基のアラニン走査変異誘発を実施した。５つのヒトＮＯＴＵＭ変異体を、それぞれ、以下の、アラニンに変異した荷電残基のペアを用いて構築した：ヒトＮＯＴＵＭ Ｎ１３２Ａ／Ｒ１３３Ａ（配列番号９６）；ヒトＮＯＴＵＭ Ｅ１３４Ａ／Ｎ１３５Ａ（配列番号９７）；ヒトＮＯＴＵＭ Ｄ１３７Ａ／Ｒ１３９Ａ（配列番号９８）；ヒトＮＯＴＵＭ Ｒ１４４Ａ／Ｒ１４５Ａ（配列番号９９）；およびヒトＮＯＴＵＭ Ｒ１５０Ａ／Ｄ１５１Ａ（配列番号１００）。一過性導入の後、全ての５つのヒト変異体が、効果的に発現され、分泌された。５つの変異体のうち４つが、ＯＰＴＳアッセイにおいて有意な活性を示したが、５番目（ヒトＮＯＴＵＭ Ｄ１３７Ａ／Ｒ１３９Ａ）はわずかな活性を示すかまたは活性を示さなかった。キャンペーン１およびキャンペーン２のモノクローナル抗体のうちの少なくともいくつかにより、全ての５つの変異体が、ＥＬＩＳＡ型において検出された。モノクローナル抗体２．７８は、ヒトＮＯＴＵＭ Ｄ１３７Ａ／Ｒ１３９ＡおよびヒトＮＯＴＵＭ Ｒ１４４Ａ／Ｒ１４５Ａと結合することができず、一方モノクローナル抗体１．８０２、１．８１５、および１．８４６は、ＮＯＴＵＭ Ｒ１４４Ａ／Ｒ１４５Ａのみと結合できなかった。モノクローナル抗体２.１０２９は、アラニン変異体の全て５つと免疫反応性であった。

【0183】

６．８． ＮＯＴＵＭ中和抗体の結合親和性
ある特定の抗ＮＯＴＵＭモノクローナル抗体の結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００を使用して測定した。多量体のマウスＮＯＴＵＭタンパク質との結合に関する、意味のある親和性値を得るために、完全ＩｇＧをプロテアーゼのフィシンで消化し、その後未消化のＩｇＧおよびＦｃ断片をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで除去することにより、抗体ＦＡｂ断片を作製した。ＦＡｂおよび完全ＩｇＧのヒトＮＯＴＵＭとの結合に関する親和性値は一致し、およびそれらの親和性値は、表３に示す通り、一桁から低い二桁のｎＭの範囲にあった。

【0184】

【表3】

【0185】

６．９． マウスへのＮＯＴＵＭ中和抗体の投与
６．９．１． ＮＯＴＵＭ中和抗体の週１回、８週間の投与
週齢８週の雄性Ｆ１ハイブリッド（１２９×Ｃ５７）マウスに、ＮＯＴＵＭ中和抗体２．１０２９もしくは２．７８ｂ、または対照抗体を、３０ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射により、週１回、８週間投与した。群あたり、マウスは１２匹であった。実験終了時、マウスを屠殺した。剖検後、マイクロＣＴにより、骨質量および骨構造を測定した。測定には、Ｓｃａｎｃｏ μＣＴ４０を、閾値２４０、積分時間２００ミリ秒、およびＸ線管電圧５５ｋｅＶで使用した。

【0186】

図６に示す通り、大腿骨骨幹中央部の皮質厚は、対照抗体と比較して、ＮＯＴＵＭ中和抗体２．１０２９の投与により１２％（Ｐ＜０．００１）増加し、ＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂの投与により１６％（Ｐ＜０．００１）増加した。

【0187】

６．９．２． ＮＯＴＵＭ中和抗体２．１０２９の週１回、４週間の投与
週齢８週の雄性Ｆ１ハイブリッド（１２９×Ｃ５７）マウスに、ＮＯＴＵＭ中和抗体２．１０２９を、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または３０ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射により、週１回、４週間投与した。群あたり、マウスは１０匹であった。実験終了時、マウスを屠殺した。剖検後、マイクロＣＴにより、骨質量および骨構造を測定した。測定には、Ｓｃａｎｃｏ μＣＴ４０を、閾値２４０、積分時間２００ミリ秒、およびＸ線管電圧５５ｋｅＶで使用した。

【0188】

図７に示す通り、３０ｍｇ／ｋｇのＮＯＴＵＭ中和抗体２．１０２９の投与により、大腿骨骨幹中央部の皮質厚は、対照抗体の投与と比較して、５％（Ｐ＝０．１２）増加した。

【0189】

６．９．３． ＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂの週１回、４週間の投与
週齢８週の雄性Ｆ１ハイブリッド（１２９×Ｃ５７）マウスに、ＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂを、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または３０ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射により、週１回、４週間投与した。第１実験において、群あたり、マウスは１０匹であった。第２実験においては、ＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂを、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射により、週１回、４週間投与した。第２実験において、群あたり、マウスは１２匹であった。各実験終了時に、マウスを屠殺した。剖検後、マイクロＣＴにより、骨質量および骨構造を測定した。測定には、Ｓｃａｎｃｏ μＣＴ４０を、閾値２４０、積分時間２００ミリ秒、およびＸ線管電圧５５ｋｅＶで使用した。

【0190】

図８Ａに示す通り、第１実験において、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および３０ｍｇ／ｋｇのＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂの投与により、大腿骨骨幹中央部の皮質厚は、対照抗体の投与と比較して、それぞれ１３％（Ｐ＜０．００１）、１７％（Ｐ＜０．００１）、および１６％（Ｐ＜０．００１）増加した。図８Ｂに示す通り、第２実験において、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、および３ｍｇ／ｋｇのＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂの投与により、大腿骨骨幹中央部の皮質厚は、対照抗体の投与と比較して、それぞれ３％（Ｐ＝０．４６）、７％（Ｐ＝０．０１）、および１０％（Ｐ＜０．００１）増加した。

【0191】

６．９．４． ゾレドロン酸による前処置を伴う、ＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂの週１回、４週間の投与
週齢２８週の雄性Ｆ１ハイブリッドマウス（１２９×Ｃ５７）に、５０μｇ／ｋｇのゾレドロン酸一用量を、腹腔内注射により投与した。ゾレドロン酸の投与４週後、マウスに、１０ｍｇ／ｋｇのＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂを、腹腔内注射により、週１回、４週間投与した。各実験終了時に、マウスを屠殺した。群あたり、マウスは１１または１２匹であった。剖検後、マイクロＣＴにより、骨質量および骨構造を測定した。測定には、Ｓｃａｎｃｏ μＣＴ４０を、閾値２４０、積分時間２００ミリ秒、およびＸ線管電圧５５ｋｅＶで使用した。さらに、骨形成のマーカーであるＰＩＮＰの血清レベルを、モノクローナル抗体２．７８ｂの最初の投与から７日目に、市販のＥＬＩＳＡアッセイ（イミュノダイアグノスティックシステム社（Immunodiagnostic Systems）、アリゾナ州、スコッツデール）を使用して測定した。

【0192】

図９Ａに示す通り、ゾレドロン酸および対照抗体を投与したマウスにおける、大腿骨骨幹中央部の皮質厚は、生理食塩水および対照抗体を投与したマウスと比較して、１０μｍ、すなわち４％（Ｐ＝０．３１）増加した。ゾレドロン酸による前処置なしでＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂを投与したマウスにおける、大腿骨骨幹中央部の皮質厚は、生理食塩水および対照抗体を投与したマウスと比較して、２３μｍ、すなわち９％（Ｐ＜０．００１）増加し、およびゾレドロン酸の前処置とともにＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂを投与したマウスにおいては、ゾレドロン酸および対照抗体を投与したマウスと比較して、１４μｍ、すなわち５％（Ｐ＝０．０６）増加した。図９Ｂは、ゾレドロン酸処置および対照抗体の投与をしたマウスにおける血清ＰＩＮＰレベルが、生理食塩水および対照抗体を投与したマウスと比較して、１５ｎｇ／ｍＬ、すなわち５０％（Ｐ＜０．００１）減少したことを示す。ゾレドロン酸前処置なしでＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂを投与したマウスにおけるＰＩＮＰレベルは、生理食塩水および対照抗体を投与したマウスと比較して、１４ｎｇ／ｍＬ、すなわち４７％（Ｐ＜０．００１）増加し、およびゾレドロン酸前処置とともにＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂを投与したマウスにおいては、ゾレドロン酸および対照抗体を投与したマウスと比較して、１２ｎｇ／ｍＬ、すなわち７９％（Ｐ＜０．００１）増加した。

【0193】

６．９．５． ＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ａの４週間の投与
この実験においては、ＩｇＧ２ｂ抗体である、モノクローナル抗体２．７８（「２．７８ｂ」とも呼ばれる）を、ＩｇＧ２ａ抗体として再構成した（ＩｇＧ２ａ抗体はしばしば、ＩｇＧ２ｂ抗体よりも長い半減期を有する）。再構成したモノクローナル抗体２．７８を、「２．７８ａ」と呼ぶ。

【0194】

週齢１３週の雄性Ｆ１ハイブリッドマウス（１２９×Ｃ５７）に、ＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ａを、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射により、週１回、４週間投与した。群あたり、マウスは１０または１２匹であった。各実験の終了時に、マウスを屠殺した。剖検後、マイクロＣＴにより、骨質量および骨構造を測定した。測定には、Ｓｃａｎｃｏ μＣＴ４０を、閾値２４０、積分時間２００ミリ秒、およびＸ線管電圧５５ｋｅＶで使用した。

【0195】

図１０に示す通り、その実験において、大腿骨骨幹中央部の皮質厚は、０．３ｍｇ／kg、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇのＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ａの投与により、それぞれ３％（Ｐ＝０．５７）、７％（Ｐ＝０．０２）、９％（Ｐ＝０．００２）、および１０％（Ｐ＜０．００１）増加した。

【0196】

６．９．６． ＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ａの週１回または２週に１回、１２週間の投与
週齢１０週の雄性Ｆ１ハイブリッドマウス（１２９×Ｃ５７）に、対照抗体、０．３ｍｇ／ｋｇのＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ａを、腹腔内注射により、週１回で１２週間、または１ｍｇ／ｋｇのＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ａを、腹腔内注射により、１週おき（２週に１回）に１２週間もしくは２４週間投与した。投与群あたり、マウスは１２匹であった。各実験の終了時に、マウスを屠殺した。剖検後、マイクロＣＴにより、骨質量および骨構造を測定した。測定には、Ｓｃａｎｃｏ μＣＴ４０を、閾値２４０、積分時間２００ミリ秒、およびＸ線管電圧５５ｋｅＶで使用した。

【0197】

図１１Ａに示す通り、大腿骨骨幹中央部の皮質厚は、週１回、０．３ｍｇ／ｋｇおよび２週に１回、１ｍｇ／ｋｇのＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ａを１２週間投与したマウスにおいて、それぞれ、６％（Ｐ＜０．００１）および９％（Ｐ＜０．００１）増加した。同様に、図１１Ｂに示す通り、上腕骨骨幹中央部の皮質厚は、週１回、０．３ｍｇ／ｋｇおよび２週に１回、１ｍｇ／ｋｇのＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ａを１２週間投与したマウスにおいて、それぞれ、５％（Ｐ＝０．００７）および７％（Ｐ＜０．００１）増加した。

【0198】

図１２Ａに示す通り、大腿骨骨幹中央部の皮質厚は、週１回、０．３ｍｇ／ｋｇおよび２週に１回、１ｍｇ／ｋｇのＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ａを２４週間投与したマウスにおいて、それぞれ、７％（Ｐ＝０．００２）および９％（Ｐ＜０．００１）増加した。図１２Ｂに示す通り、上腕骨骨幹中央部の皮質厚は、週１回、０．３ｍｇ／ｋｇおよび２週に１回、１ｍｇ／ｋｇのＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ａを２４週間投与したマウスにおいて、それぞれ、３％（Ｐ＝０．０９）および８％（Ｐ＜０．００１）増加した。最後に、図１２Ｃに示す通り、第９肋骨の皮質厚は、週１回、０．３ｍｇ／ｋｇおよび２週に１回、１ｍｇ／ｋｇのＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ａを２４週間投与したマウスにおいて、それぞれ、７％（Ｐ＝０．０２）および９％（Ｐ＝０．００３）増加した。

【0199】

６．１０． 卵巣切除マウスへのＮＯＴＵＭ中和抗体の投与
６．１０．１． 卵巣切除
週齢１６週のアルビノＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウスに、卵巣切除または所与の偽手術を行った。骨形成のマーカーであるＰＩＮＰの血清レベル、および骨吸収のマーカーであるＣＴＸを、卵巣切除後およびＮＯＴＵＭ中和抗体投与前の期間に、市販のＥＬＩＳＡアッセイ（イミュノダイアグノスティックシステム社（Immunodiagnostic Systems）、アリゾナ州、スコッツデール）を使用して測定し、骨リモデリングの増加が、卵巣切除後に起きていることを確認した。

【0200】

表４に示す通り、手術後および治療開始前に、卵巣切除マウスは、偽手術マウスと比較して、骨リモデリングの増加を示した。海綿骨は、皮質骨よりもより多くの骨細胞を含有するため、これらのデータは、主に海綿骨リモデリングの増加を反映している可能性がある。

【0201】

【表4】

【0202】

６．１０．２． 卵巣切除マウスへのＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂの投与
ＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂまたは対照抗体を、手術後８週から、１０ｍｇ／ｋｇで週１回、４週間、腹腔内注射により投与した。実験には、表５に示す治療群も含まれた。

【0203】

【表5】

【0204】

新たな骨形成の場所および程度を評価するため、蛍光色素骨標識を、治療第７日目、１４日目、および２１日目（すなわち、第２、第３、および第４治療とともに）に投与した。緑色に蛍光を発するカルセインを第７日目に投与し；赤色に蛍光を発するアリザリンを第１４日目に投与し；および黄色に蛍光を発するテトラサイクリンを第２１日目に投与した。４週間の治療終了時に、マウスを屠殺した。剖検時の子宮の重量により、卵巣切除手術が成功であったことを確認した。（データ無し）

【0205】

６．１０．３． ＮＯＴＵＭ中和抗体で治療した卵巣切除マウスの骨質量および骨構造
剖検後、マイクロＣＴにより、骨質量および骨構造を測定した。測定には、Ｓｃａｎｃｏ μＣＴ４０を、閾値２４０、積分時間２００ミリ秒、およびＸ線管電圧５５ｋｅＶで使用した。大腿骨骨幹中央部、ＬＶ５椎体、および大腿骨頸部を走査した。

【0206】

図１３Ａに示す通り、ＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂを投与した偽手術マウスにおける、大腿骨骨幹中央部の皮質厚は、対照抗体を投与した偽手術マウスと比較して、２２μｍ、すなわち９％増加し、およびＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂを投与した卵巣切除マウスにおいては、対照抗体を投与した卵巣切除マウスと比較して、２６μｍ、すなわち１２％増加した。図１３Ｂに示す通り、ＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂを投与した偽手術マウスにおける、大腿骨骨幹中央部の石灰化骨領域は、対照抗体を投与した偽手術マウスと比較して、０．１ｍｍ^２、すなわち１１％増加し、およびＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂを投与した卵巣切除マウスにおいては、対照抗体を投与した卵巣切除マウスと比較して、０．０８ｍｍ^２、すなわち１０％増加した。

【0207】

図１４Ａに示す通り、ＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂを投与した偽手術マウスにおける、ＬＶ５椎体の、総体積に対する総骨体積（皮質骨＋海綿骨）の比率は、対照抗体を投与した偽手術マウスと比較して、９％増加し、およびＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂを投与した卵巣切除マウスにおいては、対照抗体を投与した卵巣切除マウスと比較して、３％増加した。図１４Ｂに示す通り、ＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂを投与した偽手術マウスにおける、ＬＶ５椎体の、総体積に対する皮質骨体積の比率は、対照抗体を投与した偽手術マウスと比較して、１３％増加し、およびＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂを投与した卵巣切除マウスにおいては、対照抗体を投与した卵巣切除マウスと比較して、９％増加した。図１４Ｃに示す通り、ＬＶ５椎体の、総体積に対する海綿骨体積の比率は、偽手術マウスまたは卵巣切除マウスのどちらにおいても、ＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂの投与により、有意に影響は受けなかった。

【0208】

最後に、図１５に示す通り、ＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂを投与した偽手術マウスにおける、総体積に対する大腿骨頚部の骨体積の比率は、対照抗体を投与した偽手術マウスと比較して、４％増加し、およびＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂを投与した卵巣切除マウスにおいては、対照抗体を投与した卵巣切除マウスと比較して、６％増加した。

【0209】

６．１０．４． ＮＯＴＵＭ中和抗体で治療した卵巣切除マウスにおける骨組織形態計測
大腿骨骨幹を、急速包埋プロトコル（rapid embedding protocol）を使用してメチルメタクリレート中に埋め込んだ。Brommage and Vafai, Calcified Tissue Int’l 67: 479 (2000)を参照のこと。Ｌｅｉｃａ ＳＰ１６００骨鋸を使用して、約８０μｍの厚さを有する骨幹中央部の横断面を準備した。次いで、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６０蛍光顕微鏡で、各部分を調査した。ＯｓｔｅｏＭｅａｓｕｒｅ（商標）ソフトウェア（オステオメトリックス社（OsteoMetrics）、ジョージア州、ディケーター）を使用して、種々の骨組織形態計測のパラメータを測定した。静的パラメータ（例えば骨領域および骨厚さ）ならびに動的パラメータ（例えば単一標識表面（ＳＬＳ）、骨石灰化速度（ＭＡＲ）、および骨形成速度（ＢＦＲ））の両方を、拡大率１００倍で測定した。

【0210】

図１６は、第７日目に投与したカルセイン、第１４日目に投与したアリザリン、および第２１日目に投与したテトラサイクリンで標識した、大腿骨骨幹中央部横断面の皮質内表面の割合（％）を示す。表６は、図１６のデータの統計的分析を示す。ＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂを投与したマウスは、対照抗体を投与したマウスと比較して、第７日目および第１４日目に、有意により高い割合（％）の皮質内部標識を示した。

【0211】

【表6】

【0212】

図１７は、対照抗体またはＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂを投与した偽手術および卵巣切除マウスの、骨石灰化速度（Ａ）および体積を参照対象とする骨形成速度（Ｂ）を示す。カルセイン標識（第７日目）およびアリザリン標識（第１４日目）間の距離を測定し、７で除算して「第７日目〜第１４日目の速度」を得ることにより、ならびにアリザリン標識（第１４日目）およびテトラサイクリン標識（第２１日目）間の距離を測定し、７で除算して「第１４日目〜第２１日目の速度」を得ることにより、骨石灰化速度（図１７Ａ）を測定した。表７は、１７Ａのデータの統計的分析を示す。ＮＯＴＵＭ中和抗体２．７８ｂを投与したマウスは、第７日目〜第１４日目の期間において、対照抗体を投与したマウスよりも、より高い骨石灰化速度を示した。

【0213】

【表7】

【0214】

皮質内部石灰化表面率（図１６から得た、二重標識表面＋単一標識表面の１／２の割合（％））に、骨石灰化速度（図１７Ａを参照）を乗算することを含む、標準的な計算により、体積を参照対象とする骨形成速度（図１７Ｂ）を測定した。その結果は、骨形成速度を骨体積で除算したものであり、７日間あたりの割合（％）として表される。表８は、図１７Ｂのデータの統計的分析を示す。図１７Ｂにおいて明白なように、中和抗体２．７８ｂ抗体を投与したマウスにおける骨体積あたりの骨形成速度は、対照抗体を投与したマウスよりも、有意により高かった。

【0215】

【表8】

【0216】

６．１１． ＮＯＴＵＭ中和抗体の試験に好適な種の特定
公有財産から入手した多様な種のタンパク質の配列アライメントに基づき、モノクローナル抗体１．８０２、１．８１５、および１．８４６がモルモットＮＯＴＵＭに結合するだろうこと、従ってこの種が前臨床的実験に好適であり得ることが予測された。この仮説を試験するために、モルモットＮＯＴＵＭをクローニングし、一過性導入により発現させ、およびＯＰＴＳアッセイにおいて活性であることが示された。モノクローナル抗体１．８０２、１．８１５、および１．８４６は、ＥＬＩＳＡにより、モルモットＮＯＴＵＭに結合することが判明し、ならびにモノクローナル抗体１．８０２は、ＯＰＴＳアッセイにおいて、モルモットＮＯＴＵＭ活性を中和することが示された。モノクローナル抗体２．７８は、モノクローナル抗体１．８０２よりもより低い親和性でモルモットＮＯＴＵＭと結合し、およびＯＰＴＳアッセイにおいて、対応するより低い阻害活性を有した。モノクローナル抗体２．１０２９は、モルモットＮＯＴＵＭとごく弱くしか結合せず、ＯＰＴＳアッセイにおいて、モルモットＮＯＴＵＭを有意には阻害しなかった。

【0217】

カニクイザルおよびアカゲザルＮＯＴＵＭを、これらの種由来のｃＤＮＡ製剤からクローニングした。配列の分析により、ヒトＮＯＴＵＭ Ｄ１４１と同等の位置のアミノ酸が、アスパラギンであることが明らかになったが、これはマウスおよびヒトＮＯＴＵＭ両方におけるその位置のアミノ酸とは異なっている。活性の（ＯＰＴＳアッセイでの測定による）カニクイザルおよびアカゲザルＮＯＴＵＭタンパク質を、一過性導入により作製し、モノクローナル抗体１．８０２がどちらのタンパク質とも結合せず、どちらをも阻害しないことが判明した。活性のヒトＮＯＴＵＭ点変異体である、ヒトＮＯＴＵＭ Ｄ１４１Ｎを一過性導入により作製し、モノクローナル抗体１．８０２が、ヒトＮＯＴＵＭ点変異体とは結合しないことが判明した。

【0218】

モノクローナル抗体２．７８は、ＥＬＩＳＡにより、カニクイザルおよびアカゲザルＮＯＴＵＭと弱く結合したが、ＯＰＴＳアッセイにおいて、どちらのタンパク質をも有意に阻害しなかった。対照的に、モノクローナル抗体２．１０２９は、ＥＬＩＳＡにより、ヒトＮＯＴＵＭと結合するのと同様に、カニクイザルおよびアカゲザルＮＯＴＵＭの両方と結合し、およびＯＰＴＳアッセイにおいて、ヒトＮＯＴＵＭを阻害するのと同様に、両タンパク質をも阻害した。

【0219】

６．１２． 抗体の配列決定およびヒト化
重鎖および軽鎖可変領域の配列を、適切なハイブリドーマ細胞株由来の全ＲＮＡを使用する特異的ＲＴ−ＰＣＲ法により決定し、その後ＰＣＲ生成物の配列を決定した。４つのキャンペーン１の抗体：１．７３１、１．８０２、１．８１５、および１．８４６、ならびに３つのキャンペーン２の抗体：２．１０２９、２．５５、および２．７８由来の、重鎖および軽鎖可変領域の配列を決定した。これらの抗体それぞれの、シグナル配列を除く可変領域配列を、以下の第７節（配列表）に示す。第７節はまた、これらの抗体それぞれの重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列をも示す。以下の表は、これらの抗体それぞれの、重鎖および軽鎖可変領域、ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に対応する配列番号を示す。

【0220】

【表9】

【0221】

ある特定の重鎖および軽鎖ＣＤＲは、２つ以上の配列決定した抗体間で、高い相同性を有することが判明した。モノクローナル抗体１．８０２および１．８４６は、同一の重鎖ＣＤＲ１（ＧＦＴＦＳＤＹＧＭＨ；配列番号１７および３３）を有し、一方モノクローナル抗体１．８１５の重鎖ＣＤＲ１（ＧＦＴＦＳＤＦＧＭＨ；配列番号２５）は、モノクローナル抗体１．８０２および１．８４６と、ただ一つの保存アミノ酸置換（チロシン（Ｙ）の場所にフェニルアラニン（Ｆ））のみにより異なっている。従って、これらの抗体の重鎖ＣＤＲ１のコンセンサス配列はＧＦＴＦＳＤＸ_１ＧＭＨ（配列番号９０）であり、ここでＸ_１はＦまたはＹである。モノクローナル抗体１．８０２および１．８４６の重鎖ＣＤＲ３は、ただ一つの保存アミノ酸置換（ヒスチジン（Ｈ）対アスパラギン（Ｎ））により異なっている。従って、これらの抗体の重鎖ＣＤＲ３のコンセンサス配列はＫＸ_２ＹＮＧＧＹＦＤＶ（配列番号９１）であり、ここでＸ_２はＨまたはＮである。モノクローナル抗体１．８０２および１．８４６は、同一の軽鎖ＣＤＲ２（ＬＡＳＮＬＥＳ；配列番号２１および３７）を有し、一方モノクローナル抗体１．８１５の軽鎖ＣＤＲ２（ＬＡＳＤＬＥＳ；配列番号２９）は、モノクローナル抗体１．８０２および１．８４６と、ただ一つの保存アミノ酸置換（アスパラギン（Ｎ）の場所にアスパラギン酸（Ｄ））により異なっている。従って、これらの抗体の軽鎖ＣＤＲ２のコンセンサス配列はＬＡＳＸ_６ＬＥＳ（配列番号９３）であり、ここでＸ_６はＤまたはＮである。最後に、キャンペーン１由来の３つの抗体、１．８０２、１．８４６、および１．８１５の軽鎖ＣＤＲ１のコンセンサス配列はＲＡＳＫＸ_３ＶＳＸ_４ＳＧＹＳＹＸ_５Ｈ（配列番号９２）であり、ここでＸ_３はＩまたはＳであり、Ｘ_４はＴまたはＥであり、およびＸ_５はＭまたはＩである。

【0222】

公のデータベースに対してＢＬＡＳＴ探査を実施し、マウス重鎖および軽鎖可変領域のそれぞれと最も高い類似性を有する、ヒト生殖系列可変領域の配列を特定した。次いで、ＡｂＭ定義を使用して、ヒト生殖系列ＣＤＲのかわりに、マウス可変領域由来のＣＤＲを、コンピュータシミュレーション上で、これらのヒト生殖系列可変配列中に移植した。マウス抗体のうちの５つ（２．７８、２．１０２９、１．８０２、１．８１５、および１．８４６）の、得られたヒト化可変領域を、インフレームのシグナルペプチドをコードする５’リーダー配列とともに合成し、重鎖可変配列の場合はヒトＩｇＧ２定常領域、軽鎖可変配列の場合は、ヒトκ定常領域をコードする配列の上流にクローニングした。ヒト化可変領域それぞれの配列を、完全長のヒト化重鎖および軽鎖（シグナルペプチドを除く）の配列とともに、以下の第７節（配列表）に示す。

【0223】

完全長のヒト化重鎖および軽鎖のコード配列を、哺乳類の発現ベクター中にサブクローニングし、対応する重鎖および軽鎖構築体を、ＣＨＯ−Ｓ細胞中に同時導入した。得られた馴化培地を、抗ヒトニ次抗体で、ウエスタンブロットにより試験し、インタクトなヒト化抗体の発現および分泌を確認した。次いで馴化培地をＥＬＩＳＡ型において試験し、ヒト化抗体が、ヒトＮＯＴＵＭタンパク質と結合する能力を維持しているかどうかを測定した。ヒト化モノクローナル抗体１．８０２、１．８１５、１．８４６、および２．１０２９は、ヒトＮＯＴＵＭと結合し、一方ヒト化モノクローナル抗体２．７８は、ヒトまたはマウスＮＯＴＵＭのどちらともわずかに結合するかまたは全く結合しなかった。

【0224】

上述で引用されたすべての参考文献は、全ての目的のために、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
7. 配列表

【0225】

【表10】

【0226】

【0227】

【0228】

【0229】

【0230】

【0231】

【0232】

【0233】

【0234】

【0235】

【0236】

【0237】

【0238】

【0239】

【0240】

【0241】

【0242】

【0243】

【0244】

【0245】

【0246】

【0247】

【0248】

【0249】

【配列表フリーテキスト】

【0250】

配列番号１：ヒトＮＯＴＵＭ
配列番号２：マウスＮＯＴＵＭ
配列番号３：ヒトＮＯＴＵＭ Ｓ２３２Ａ
配列番号４：マウスＮＯＴＵＭ Ｓ２３９Ａ 変異体
配列番号５：モルモットＮＯＴＵＭ
配列番号６：アカゲザルＮＯＴＵＭ
配列番号７：合成：ＭＡｂ１．７３１重鎖可変領域
配列番号８：合成：ＭＡｂ１．７３１軽鎖可変領域
配列番号９：合成：ＭＡｂ１．７３１重鎖ＣＤＲ１
配列番号１０：合成：ＭＡｂ１．７３１重鎖ＣＤＲ２
配列番号１１：合成：ＭＡｂ１．７３１重鎖ＣＤＲ３
配列番号１２：合成：ＭＡｂ１．７３１軽鎖ＣＤＲ１
配列番号１３：合成：ＭＡｂ１．７３１軽鎖ＣＤＲ２
配列番号１４：合成：ＭＡｂ１．７３１軽鎖ＣＤＲ３
配列番号１５：合成：ＭＡｂ１．８０２重鎖可変領域
配列番号１６：合成：ＭＡｂ１．８０２軽鎖可変領域
配列番号１７：合成：ＭＡｂ１．８０２重鎖ＣＤＲ１
配列番号１８：合成：ＭＡｂ１．８０２重鎖ＣＤＲ２
配列番号１９：合成：ＭＡｂ１．８０２重鎖ＣＤＲ３
配列番号２０：合成：ＭＡｂ１．８０２軽鎖ＣＤＲ１
配列番号２１：合成：ＭＡｂ１．８０２軽鎖ＣＤＲ２
配列番号２２：合成：ＭＡｂ１．８０２軽鎖ＣＤＲ３
配列番号２３：合成：ＭＡｂ１．８１５重鎖可変領域
配列番号２４：合成：ＭＡｂ１．８１５軽鎖可変領域
配列番号２５：合成：ＭＡｂ１．８１５重鎖ＣＤＲ１
配列番号２６：合成：ＭＡｂ１．８１５重鎖ＣＤＲ２
配列番号２７：合成：ＭＡｂ１．８１５重鎖ＣＤＲ３
配列番号２８：合成：ＭＡｂ１．８１５軽鎖ＣＤＲ１
配列番号２９：合成：ＭＡｂ１．８１５軽鎖ＣＤＲ２
配列番号３０：合成：ＭＡｂ１．８１５軽鎖ＣＤＲ３
配列番号３１：合成：ＭＡｂ１．８４６重鎖可変領域
配列番号３２：合成：ＭＡｂ１．８４６軽鎖可変領域
配列番号３３：合成：ＭＡｂ１．８４６重鎖ＣＤＲ１
配列番号３４：合成：ＭＡｂ１．８４６重鎖ＣＤＲ２
配列番号３５：合成：ＭＡｂ１．８４６重鎖ＣＤＲ３
配列番号３６：合成：ＭＡｂ１．８４６軽鎖ＣＤＲ１
配列番号３７：合成：ＭＡｂ１．８４６軽鎖ＣＤＲ２
配列番号３８：合成：ＭＡｂ１．８４６軽鎖ＣＤＲ３
配列番号３９：合成：ＭＡｂ２．１０２９重鎖可変領域
配列番号４０：合成：ＭＡｂ２．１０２９軽鎖可変領域
配列番号４１：合成：ＭＡｂ２．１０２９重鎖ＣＤＲ１
配列番号４２：合成：ＭＡｂ２．１０２９重鎖ＣＤＲ２
配列番号４３：合成：ＭＡｂ２．１０２９重鎖ＣＤＲ３
配列番号４４：合成：ＭＡｂ２．１０２９軽鎖ＣＤＲ１
配列番号４５：合成：ＭＡｂ２．１０２９軽鎖ＣＤＲ２
配列番号４６：合成：ＭＡｂ２．１０２９軽鎖ＣＤＲ３
配列番号４７：合成：ＭＡｂ２．５５重鎖可変領域
配列番号４８：合成：ＭＡｂ２．５５軽鎖可変領域
配列番号４９：合成：ＭＡｂ２．５５重鎖ＣＤＲ１
配列番号５０：合成：ＭＡｂ２．５５重鎖ＣＤＲ２
配列番号５１：合成：ＭＡｂ２．５５重鎖ＣＤＲ３
配列番号５２：合成：ＭＡｂ２．５５軽鎖ＣＤＲ１
配列番号５３：合成：ＭＡｂ２．５５軽鎖ＣＤＲ２
配列番号５４：合成：ＭＡｂ２．５５軽鎖ＣＤＲ３
配列番号５５：合成：ＭＡｂ２．７８重鎖可変領域
配列番号５６：合成：ＭＡｂ２．７８軽鎖可変領域
配列番号５７：合成：ＭＡｂ２．７８重鎖ＣＤＲ１
配列番号５８：合成：ＭＡｂ２．７８重鎖ＣＤＲ２
配列番号５９：合成：ＭＡｂ２．７８重鎖ＣＤＲ３
配列番号６０：合成：ＭＡｂ２．７８軽鎖ＣＤＲ１
配列番号６１：合成：ＭＡｂ２．７８軽鎖ＣＤＲ２
配列番号６２：合成：ＭＡｂ２．７８軽鎖ＣＤＲ３
配列番号６３：合成：ヒト化Ａｂ（ＨｕｍＡｂ）２．７８重鎖可変領域
配列番号６４：合成：ヒト抗体２．７８重鎖
配列番号６５：合成：ヒト抗体２．７８軽鎖可変領域
配列番号６６：合成：ヒト抗体２．７８軽鎖
配列番号６７：合成：ヒト抗体２．１０２９重鎖可変領域
配列番号６８：合成：ヒト抗体２．１０２９重鎖
配列番号６９：合成：ヒト抗体２．１０２９軽鎖可変領域
配列番号７０：合成：ヒト抗体２．１０２９軽鎖
配列番号７１：合成：ヒト抗体１．８０２重鎖可変領域
配列番号７２：合成：ヒト抗体１．８０２重鎖
配列番号７３：合成：ヒト抗体１．８０２軽鎖可変領域
配列番号７４：合成：ヒト抗体１．８０２軽鎖
配列番号７５：合成：ヒト抗体１．８１５重鎖可変領域
配列番号７６：合成：ヒト抗体１．８１５重鎖
配列番号７７：合成：ヒト抗体１．８１５軽鎖可変領域
配列番号７８：合成：ヒト抗体１．８１５軽鎖
配列番号７９：合成：ヒト抗体１．８４６重鎖可変領域
配列番号８０：合成：ヒト抗体１．８４６重鎖
配列番号８１：合成：ヒト抗体１．８４６軽鎖可変領域
配列番号８２：合成：ヒト抗体１．８４６軽鎖
配列番号８３：合成：ヒト―マウスキメラＮＯＴＵＭ
配列番号８４：合成：マウス―ヒトキメラＮＯＴＵＭ
配列番号８５：合成：ヒト―マウス―ヒトキメラＮＯＴＵＭ
配列番号８６：合成：マウス―ヒト―マウスキメラＮＯＴＵＭ
配列番号８７：ヒトＮＯＴＵＭ（Ｄｅｌｔａ１−４６）
配列番号８８：ヒトＮＯＴＵＭ Ｎ９６Ｄ
配列番号８９：ヒトＮＯＴＵＭ Ｑ４７−Ｍ１７７
配列番号９０：合成：キャンペーン１重鎖ＣＤＲ１コンセンサス
ＸはＹまたはＦ
配列番号９１：合成：キャンペーン１重鎖ＣＤＲ３コンセンサス
ＸはＨまたはＮ
配列番号９２：合成：キャンペーン１軽鎖ＣＤＲ１コンセンサス
ＸはＩまたはＳ
ＸはＴまたはＥ
ＸはＭまたはＩ
配列番号９３：合成：キャンペーン１の軽鎖ＣＤＲ２コンセンサス
ＸはＤまたはＮ
配列番号９４：ヒトＮＯＴＵＭ Ｄ１４１Ｓ
配列番号９５：マウスＮＯＴＵＭ Ｓ１４８Ｄ
配列番号９６：ヒトＮＯＴＵＭ Ｎ１３２Ａ／Ｒ１３３Ａ
配列番号９７：ヒトＮＯＴＵＭ Ｅ１３４Ａ／Ｎ１３５Ａ
配列番号９８：ヒトＮＯＴＵＭ Ｄ１３７Ａ／Ｒ１３９Ａ
配列番号９９：ヒトＮＯＴＵＭ Ｒ１４４Ａ／Ｒ１４５Ａ
配列番号１００：ヒトＮＯＴＵＭ Ｒ１５０Ａ／Ｄ１５１Ａ
配列番号１０１：合成：１．８０２重鎖可変領域ポリヌクレオチド配列
配列番号１０２：合成：１．８０２軽鎖可変領域ポリヌクレオチド配列
配列番号１０３：合成：１．８１５重鎖可変領域ポリヌクレオチド配列
配列番号１０４：合成：１．８１５軽鎖可変領域ポリヌクレオチド配列
配列番号１０５：合成：１．８４６重鎖可変領域ポリヌクレオチド配列
配列番号１０６：合成：１．８４６軽鎖可変領域ポリヌクレオチド配列
配列番号１０７：合成：２．７８重鎖可変領域ポリヌクレオチド配列
配列番号１０８：合成：２．７８軽鎖可変領域ポリヌクレオチド配列
配列番号１０９：合成：２．１０２９重鎖可変領域ポリヌクレオチド配列
配列番号１１０：合成：２．１０２９軽鎖可変領域ポリヌクレオチド配列
配列番号１１１：合成：ヒト化Ａｂ（ＨｕｍＡｂ）２．７８重鎖可変領域ポリヌクレオチド配列
配列番号１１２：合成：ヒト抗体２．７８重鎖ポリヌクレオチド配列
配列番号１１３：合成：ヒト抗体２．７８軽鎖可変領域ポリヌクレオチド配列
配列番号１１４：合成：ヒト抗体２．７８軽鎖ポリヌクレオチド配列
配列番号１１５：合成：ヒト抗体２．１０２９重鎖可変領域ポリヌクレオチド配列
配列番号１１６：合成：ヒト抗体２．１０２９重鎖ポリヌクレオチド配列
配列番号１１７：合成：ヒト抗体２．１０２９軽鎖可変領域ポリヌクレオチド配列
配列番号１１８：合成：ヒト抗体２．１０２９軽鎖ポリヌクレオチド配列
配列番号１１９：合成：ヒト抗体１．８０２重鎖可変領域ポリヌクレオチド配列
配列番号１２０：合成：ヒト抗体１．８０２重鎖ポリヌクレオチド配列
配列番号１２１：合成：ヒト抗体１．８０２軽鎖可変領域ポリヌクレオチド配列
配列番号１２２：合成：ヒト抗体１．８０２軽鎖ポリヌクレオチド配列
配列番号１２３：合成：ヒト抗体１．８１５重鎖可変領域ポリヌクレオチド配列
配列番号１２４：合成：ヒト抗体１．８１５重鎖ポリヌクレオチド配列
配列番号１２５：合成：ヒト抗体１．８１５軽鎖可変領域ポリヌクレオチド配列
配列番号１２６：合成：ヒト抗体１．８１５軽鎖ポリヌクレオチド配列
配列番号１２７：合成：ヒト抗体１．８４６重鎖可変領域ポリヌクレオチド配列
配列番号１２８：合成：ヒト抗体１．８４６重鎖ポリヌクレオチド配列
配列番号１２９：合成：ヒト抗体１．８４６軽鎖可変領域ポリヌクレオチド配列
配列番号１３０：合成：ヒト抗体１．８４６軽鎖ポリヌクレオチド配列
配列番号１３１：カニクイザルＮＯＴＵＭ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]