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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6035524
(24)【登録日】2016年11月11日
(45)【発行日】2016年11月30日
(54)【発明の名称】嗅覚障害治療剤
(51)【国際特許分類】
A61K 38/28 20060101AFI20161121BHJP
A61P 11/02 20060101ALI20161121BHJP
A61P 27/00 20060101ALI20161121BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20161121BHJP
【ＦＩ】
A61K37/26ZMD
A61P11/02
A61P27/00
A61K9/08
【請求項の数】4
【全頁数】19
(21)【出願番号】特願2016-28504(P2016-28504)
(22)【出願日】2016年2月18日
(65)【公開番号】特開2016-155816(P2016-155816A)
(43)【公開日】2016年9月1日
【審査請求日】2016年2月18日
(31)【優先権主張番号】特願2015-30755(P2015-30755)
(32)【優先日】2015年2月19日
(33)【優先権主張国】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 第５４回日本鼻科学会総会・学術講演会（平成２７年１０月 ２日）の学会発表資料 ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊｓｔａｇｅ．ｊｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｊｊｒｈｉ／５４／３／５４＿３８０／＿ｐｄｆ
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】515047699
【氏名又は名称】久保木 章仁
(73)【特許権者】
【識別番号】515047703
【氏名又は名称】菊田 周
(74)【代理人】
【識別番号】100149032
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 敏明
(72)【発明者】
【氏名】久保木 章仁
(72)【発明者】
【氏名】菊田 周
【審査官】
石井 裕美子
(56)【参考文献】
【文献】
Lacroix MC et al.，Insulin, a survival factor for olfactory epithelium，Chem. Senses，２０１１年，Vol. 36，p. E75
【文献】
Chem. Senses，２０００年，Vol. 25，pp. 93-101
【文献】
Neurosci. Res.，２００９年，Vol. 65 Supplement 1，p. S165，P2-f25
【文献】
J. Neuroendocrinol.，２０１１年，Vol. 23，pp. 627-640
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８
Ａ６１Ｋ ９／０８
Ａ６１Ｐ １１／０２
Ａ６１Ｐ ２７／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
インスリン及び、インスリンアルパルト、インスリンリスプロ、インスリングルリジン、インスリンデグルデク、インスリングラルギン、インスリンデテミル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選ばれるインスリン類縁体からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含有し、かつ、投与期間が７日間以上である、嗅覚障害治療剤。
【請求項2】
前記嗅覚障害治療剤は、その形態が点鼻剤である、請求項１に記載の嗅覚障害治療剤。
【請求項3】
前記嗅覚障害治療剤は、嗅覚障害を有し、かつ、インスリン分泌障害若しくはインスリン抵抗性を有する者又はそのリスクのある者に使用される、請求項１又は２に記載の嗅覚障害治療剤。
【請求項4】
インスリン及び、インスリンアルパルト、インスリンリスプロ、インスリングルリジン、インスリンデグルデク、インスリングラルギン、インスリンデテミル及びこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選ばれるインスリン類縁体からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含有する、嗅覚障害治療剤であって、
前記嗅覚障害治療剤は、嗅上皮障害後の７〜１４日目に少なくとも投与される、前記嗅覚障害治療剤。
前記嗅覚障害治療剤は、嗅上皮障害後の７〜１４日目に少なくとも投与される、前記嗅覚障害治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、嗅覚障害治療剤に関する。
【背景技術】
【0002】
嗅覚障害は、障害部位によって様々な原因で生じ得るところ、その多くが嗅上皮組織において腫脹や分泌異常などが発生することによって生じ得る嗅上皮性嗅覚障害及び嗅上皮性と他の原因によって生じ得る混合性嗅覚障害である。
【0003】
このような嗅覚障害の治療法としては、ツムラ漢方当帰芍薬などの内服療法やナゾネックス（モメタゾンフランカルボン酸エステル水和物）、点鼻用リンデロンＡ液（硫酸フラジオマイシン及びリン酸ベタメサゾンの合剤）などのステロイド剤による点鼻療法が挙げられる。
【0004】
しかし、点鼻用リンデロンＡ液などの高力価なステロイド剤には副作用の問題があり、例えば、満月様顔貌、肥満、動脈硬化、高脂血症、高血圧症に加えて、血糖値の上昇や副腎皮質ホルモンバランスへの影響、Ｂ型肝炎ウイルス感染者におけるウイルス再賦活化などが起こり得るため、しばしば臨床現場でも問題となっており、特に罹患患者数の多い糖尿病患者に対する使用には注意を要する。そこで、これらの副作用が抑えられたものとして、プレドニゾロン誘導体を有効成分とする嗅覚障害治療剤が知られている（特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特許第４２６３７８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかし、プレドニゾロン誘導体はいわゆるソフトステロイド剤に属するものであり、長期間の投与によって、他のステロイド剤と同様の副作用が生じる危険性がある。
【0007】
そこで、本発明は、傷などの障害を受けた嗅上皮を修復又は再生する作用を有し、かつ、長期間の投与が可能である嗅覚障害治療剤を提供することを、発明が解決しようとする課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を積み重ねたところ、驚くべきことに、マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験から、インスリンが格別顕著な嗅上皮再生作用を示し、嗅覚障害の改善に有用であることを突き止めることに成功した。
【0009】
インスリンは糖代謝のみならず中枢神経に対する作用としての記憶力の向上や認知障害の改善を導き得ることが報告されている。しかし、インスリンが嗅上皮の修復や再生に良好な影響を及ぼすことについては、これまでに全く知られていないことであり、本発明者らによって初めて見出されたことである。
【0010】
特に、嗅上皮の組織恒常性は、様々な因子によって制御されており、終生にわたり巧妙に維持されるものである。インスリンは神経成長因子として神経の生理機能維持に重要な役割を果たす可能性があることが明らかになりつつあるが、インスリンを介するシグナル伝達が嗅上皮細胞動態にどのような影響を与えるのかについては全く不明である。したがって、本発明者らが初めて見出したインスリンと嗅上皮再生との関係は、薬学的及び医学的な観点からも非常に意義のあることである。本発明は、このような成功例や知見に基づき、完成された発明である。
【0011】
したがって、本発明によれば、インスリン、インスリン類縁体及びインスリン分泌促進物質からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含有する、嗅覚障害治療剤が提供される。
【0012】
好ましくは、前記嗅覚障害治療剤は、その形態が点鼻剤である。
【0013】
好ましくは、前記嗅覚障害治療剤は、嗅覚障害を有し、かつ、インスリン分泌障害若しくはインスリン抵抗性を有する者又はそのリスクのある者、又は嗅覚障害治療としての長期ステロイド使用による医原性の血糖値上昇や副腎皮質ホルモンバランスの乱れが懸念される者に使用される。
【発明の効果】
【0014】
本発明の嗅覚障害治療剤は、成熟嗅神経細胞を増加させることにより、障害を受けた嗅上皮の修復又は再生を促進して、欠失又は低下した嗅覚を回復させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の嗅覚障害治療剤は、インスリン、インスリン類縁体及びインスリン分泌促進物質からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を有効量で含有するものである。本発明の嗅覚障害治療剤は、有効成分として、インスリン、インスリン類縁体及びインスリン分泌促進物質のいずれか１種、２種又は全部を含むものであり得る。
【0017】
本発明の嗅覚障害治療剤は、使用者に外因性のインスリンやインスリン類縁体を投与することにより、及び／又は使用者の内因性のインスリンの分泌を促進するためにインスリン分泌促進物質を投与することにより、使用者の脳内のインスリン濃度を高め、未熟嗅神経細胞から成熟細胞へ分化、再生を促進して成熟嗅神経細胞数の増加を介して嗅上皮を修復や再生することにより、使用者の嗅覚障害を治療や予防することができる。ここで、治療や予防とは、使用者における疾患や症状の発症の防止及び遅延；使用者の疾患や症状の発症の危険性の低下；疾患、症状及び状態の好転；疾患、症状及び状態の悪化の防止や遅延；疾患や症状の進行の逆転、防止及び遅延などを包含する。
【0018】
インスリンは通常当業者により知られる意味のものであれば特に限定されず、例えば、ＣＡＳ番号が９００４−１０−８であるものとして知られている。本発明に用いられるインスリンは、任意の種に由来するインスリンが挙げられ、例えば、ブタのインスリン、ウシのインスリン及びヒトのインスリンなどであり得る。また、インスリンは、インスリンの薬学的に許容される塩、例えば、亜鉛の塩及びプロタミンの塩などであってもよい。インスリンは、これらのうちの１種又は２種以上を組み合わせたものであり得る。
【0019】
インスリン類縁体は、インスリンと一部の構造が相違し、かつ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）受容体、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）受容体若しくはグルカゴンペプチド１（ＧＬＰ−１）受容体に結合してインスリンと同一のインスリン活性又はインスリンシグナルにより発動される複雑なインリンカスケードにおいて相互作用（クロストーク）を及ぼし得るものを示すものであれば特に限定されず、例えば、１個から複数個のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されたインスリン、１個から複数個のアミノ酸残基が欠失したインスリン、１個から複数個のアミノ酸残基が付加されたインスリンなどが挙げられる。「１個から複数個」の範囲は、例えば、１個、２個、３個、４個、５個及び６個であり、好ましくは１個、２個、３個、４個及び５個であり、より好ましくは１個、２個、３個及び４個であり、さらに好ましくは１個、２個及び３個である。インスリン類縁体の具体例は、インスリンアルパルト、インスリンリスプロ、インスリングルリジン、インスリンデグルデク、インスリングラルギン、インスリンデテミル及びこれらの薬学的に許容される塩などが挙げられるが、これらに限定されない。インスリン類縁体は、これらのうちの１種又は２種以上を組み合わせたものであり得る。【0020】
インスリン及びインスリン類縁体を取得する方法は特に限定されず、例えば、インスリンを分泌する生物の組織から分離及び精製することやインスリンのアミノ酸配列を参照するなどして遺伝子組換え技術によって製造することができる。インスリン及びインスリン類縁体は、市販されているものを用いてもよい。例えば、ノボラピッド、ノボリン、トレシーバ、レベミル、ノボペン、ユーマログ、ヒューマリン、ヒューマペン、アピドラ、ランタス、イタンゴ、イノレット（それぞれ登録商標）などの名称で市販されているインスリン製剤を、そのままで、又はその内容物を別の投与形態に適用して使用できる。インスリン及びインスリン類縁体は、インスリンの分泌を促進する作用やインスリンの作用を増強する作用を有する物質などであってもよく、例えば、グルカゴン様タンパク質（ＧＬＰ）などが挙げられる。
【0021】
インスリン分泌促進物質は、膵β細胞を剌激することや膵β細胞のスルホニル尿素受容体への結合を介してＡＴＰ感受性Ｋ＋チャネル電流を阻害することなどにより内因性のインスリンの分泌を促進する活性を有する物質であれば特に限定されず、例えば、ナテグリニド、ミチグリニド、レパグリニド、ランゲルハンス島活性化タンパク質、グルカゴン様ペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、インスリン分泌促進物質には、細胞内でインスリン−インスリン受容体間結合によって活性化されるチロシンキナーゼによって媒介されるシグナル伝達を導き得る物質を包含する。インスリン分泌促進物質は、これらのうちの１種又は２種以上を組み合わせたものであり得る。
【0022】
インスリン分泌促進物質を取得する方法は特に限定されず、例えば、その構造式やアミノ酸配列を参照して製造してもよいし、市販されているものを使用してもよい。
【0023】
本発明の嗅覚障害治療剤における有効成分の含有量は、本発明の嗅覚障害治療剤を投与した使用者の嗅上皮における成熟嗅神経細胞数が増加する程度の量であれば特に限定されないが、例えば、体重１ｋｇ当たり１日約０．００１国際単位（ＩＵ）〜１０００ＩＵであり、好ましくは約０．０１〜約５００ＩＵであり、より好ましくは０．１〜１０ＩＵである。また、本発明の嗅覚障害治療剤における有効成分の含有量は、例えば、１日約０．０１〜５００ＩＵ、好ましくは０．１〜２００ＩＵとすることができる。１ＩＵとは、ヒトインスリン（遺伝子組換え）の１国際単位を意味する。有効成分がインスリン類縁体である場合は、上記ＩＵに相当する量である。有効成分がインスリン分泌促進物質である場合は、上記ＩＵに相当する量のインスリンを生体内で分泌し得る量である。
【0024】
本発明の嗅覚障害治療剤は、インスリンやインスリン類縁体を含有するものである場合は、その形態は非経口投与される形態である。また、インスリン分泌促進物質を含有するものである場合は、その形態は、該物質の性質に合わせて経口又は非経口投与される形態である。
【0025】
本発明の嗅覚障害治療剤は、その投与経路について特に限定されないが、患部に近い方が投与量を少なくすることができ、低血糖などの副作用が生じることを回避することができることから、経鼻的に投与されることが好ましい。したがって、本発明の嗅覚障害治療剤は、その形態が点鼻剤又は点眼剤であることが好ましく、点鼻剤であることがより好ましい。
【0026】
本発明の嗅覚障害治療剤は、有効成分のみからなるものであってもよいし、有効成分とは異なるその他の成分を含有するものであってもよい。その他の成分としては、例えば、本発明の嗅覚障害治療剤が点鼻剤である場合には、これまでに当業者に知られている点鼻剤一般に用いられる添加物を挙げることができ、具体的には保存剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤、懸濁化剤などを挙げることができる。
【0027】
保存剤としては、例えば、パラベン類（パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピルなど）、逆性石ケン類（塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、塩化セチルピリジニウムなど）、アルコール誘導体（フェネチルアルコールなど）、有機酸及びその塩類（デヒドロ酢酸ナトリウム、ソルビン酸及びその塩など）、フェノール類（パラクロルメトキシフェノール、パラクロルメタクレゾールなど）及び有機水銀剤（チメロサール、硝酸フェニル水銀、ニトロメゾールなど）などが挙げられる。
【0028】
等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ソルビトール、濃グリセリン及びマンニトールなどが挙げられる。
【0029】
緩衝剤としては、例えば、ホウ酸及びその塩、リン酸塩、酢酸塩及びアミノ酸塩などが挙げられる。
【0030】
安定化剤としては、例えば、酸化防止剤（亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸水素ナトリウムなど）及びキレート剤（エデト酸ナトリウム、クエン酸及びその塩など）などが挙げられる。
【0031】
ｐＨ調整剤としては、例えば、塩酸、酢酸、水酸化ナトリウム、リン酸などが挙げられる。
【0032】
増粘剤としては、例えば、糖類（ソルビトール、マンニトール、ショ糖など）、セルロース類（メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）及び合成高分子（ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマーなど）などが挙げられる。
【0033】
懸濁化剤としては、例えば、上記セルロース類、合成高分子化合物、結晶セルロース・カルメロースナトリウム及び界面活性剤（第４級アンモニウム塩などの陽イオン界面活性剤、アルキル硫酸塩などの陰イオン界面活性剤、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、チロキサポールなどの非イオン界面活性剤及びレシチンなどの両性イオン界面活性剤など）などが挙げられる。
【0034】
上記添加物の使用量は当業者により適宜設定されるものであり、特に限定されない。本発明の嗅覚障害治療剤は、点鼻剤である場合、鼻の生理状態に近似させた状態（鼻汁と等張である状態）のものであることが好ましい。例えば、浸透圧は０．２〜４．０ｗ／ｖ％の食塩液に相当する範囲、好ましくは０．５〜２．０ｗ／ｖ％の食塩液に相当する範囲、より好ましくは０．８〜１．５ｗ／ｖ％の食塩液に相当する範囲であるものである。
【0035】
また、本発明の嗅覚障害治療剤を点鼻剤として使用する場合は、例えば、そのｐＨは一般的な点鼻剤に通常使用されるｐＨ範囲であり、具体的にはｐＨ５〜７であり；その浸透圧は一般的な点鼻に通常使用される浸透圧の範囲であり、具体的には１４０〜１１４０ｍＯｓｍ、好ましくは２００〜８７０ｍＯｓｍ、より好ましくは２８０〜３１０ｍＯｓｍであり；その粘度は一般的な点鼻剤に通常使用される粘度の範囲であり、具体的には２５，０００ｃｐｓ以下、好ましくは５，０００〜１ｃｐｓである。
【0036】
本発明の嗅覚障害治療剤は、その他の成分として、他の嗅覚障害治療剤、他の医薬製剤又はそれらの有効成分を含有することができる。例えば、非ステロイド系抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、抗アレルギー剤、抗生物質、血管収縮剤、降圧剤及びこれらの有効成分が挙げられる。
【0037】
本発明の嗅覚障害治療剤は、その投与量や投与形態によっては、使用者に対して有効成分の作用による低血糖のリスクを防止するために、糖や糖類似体を含有するものとすることができ、又は糖や糖類似体とともに用いられるものであり得る。
【0038】
本発明の嗅覚障害治療剤は、使用者に投与することにより、未熟嗅神経細胞の分化、成長及び／又は再生を促進し、結果として嗅上皮における成熟嗅神経細胞数の増加や嗅上皮の修復や再生を誘導し、嗅覚障害を治療し得る。また、本発明の嗅覚障害治療剤の有効成分はステロイド系化合物ではないことから、本発明の嗅覚障害治療剤は、ステロイド剤を投与することによって生じる副作用の問題がなく、長期的な投与に適したものである。
【0039】
本発明の嗅覚障害治療剤の使用方法は特に限定されず、その形態に準じて適宜使用することができ、例えば、点鼻剤である場合は、通常知られている点鼻剤一般に用いられている方法に従って使用することができる。この場合、例えば、滴下法によって使用することができる。具体的には、本発明の嗅覚障害治療剤を、懸垂頭位のままで両側鼻腔にそれぞれ２〜３滴ずつ滴下し、そのまま５〜１０分間保ち、これを朝と晩の１日２回行う方法などが挙げられる。
【0040】
本発明の嗅覚障害治療剤の投与間隔は、その投与量や投与形態などによって適宜選択され、特に限定されないが、例えば、０．１〜１０Ｕ／ｋｇ（０．１〜１０ＩＵ／ｋｇ）の有効成分を、１日２回、７日間以上、好ましくは１０日間以上、より好ましくは１４日間以上の期間で経鼻的に投与することが挙げられる。
【0041】
本発明の嗅覚障害治療剤の使用者は特に限定されず、例えば、乳児、幼児、小児、少年、成人などのヒトが挙げられる。また、本発明の嗅覚障害治療剤は、例えば、ネコ、イヌ、ウシ、ウマなどの哺乳動物に使用してもよい。
【0042】
インスリンは、本来健常者であれば、生体内に分泌されるものである。しかし、糖尿病罹患者のように、インスリンの分泌に障害がある者やインスリンに対して抵抗性のある者が存在する。そこで、本発明の嗅覚障害治療剤は、嗅覚障害を有し、かつ、インスリン分泌障害やインスリン抵抗性を有する者若しくはそのリスクのある者又は嗅覚障害治療としての長期ステロイド使用による医原性の血糖値上昇や副腎皮質ホルモンバランスの乱れが懸念される者に使用されることが好ましい。さらにいえば、本発明の嗅覚障害治療剤は、中高年者や２型糖尿病をはじめとするメタボリックシンドロームの危険性がある運動不足者に使用されることがより好ましい。
【0043】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
【実施例】
【0044】
以下のとおりに、マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験にて、インスリンが格別顕著な嗅覚障害改善作用を示すことを以下のとおりに実証した。
【0045】
［Ｉ．１型糖尿病モデルマウスを用いたインスリンによる嗅覚障害の改善効果（１）］１．１型糖尿病モデルマウス（ＤＭマウス又はＳＴＺマウス）の作成
１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（通常マウス；日本ＳＬＣ株式会社）にストレプトゾトシン（ＳＴＺ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）１２０ｍｇ／ｋｇを０日目（初回投与）、１日目及び２日目というように３日連続して腹腔内に投与し、７日目に空腹時血糖（ｆａｓｔｉｎｇ ｂｌｏｏｄ ｓｕｇａｒ ｌｅｖｅｌ：ＦＢＳ）２５０ｍｇ／ｄｌ以上の値を認めたものを、膵臓β細胞が特異的に障害されたＤＭマウスとした。また、以降の操作には、ＳＴＺ投与から約一週間後の随時血糖が２５０ｍｇ／ｄｌより大きいものを使用した。
【0046】
２．嗅覚障害モデルマウスの作成通常マウスに生理食塩水のみを投与した陽性対照マウス及びＤＭマウスのそれぞれにメチマゾール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）８０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与し嗅覚障害モデルマウスを作成した。嗅覚障害モデルマウスはメチマゾールの代謝産物が嗅上皮を選択的に傷害することにより作成される。嗅覚障害の機序としては、カスパーゼが活性化することにより、嗅細胞に対してアポトーシスを誘導すると考えられている。通常マウスにメチマゾールを投与した場合、障害された嗅上皮は投与後約２８日目にほぼ正常なレベルまで再生し得る。また、通常マウスに、メチマゾールの代わりに生理食塩水を投与したものをコントロールとした。体重及び尾部静脈の血糖値はメチマゾール注射後２８日目に測定した。
【0047】
３．免疫組織化学マウスの心臓内に０．１Ｍ リン酸緩衝液中の４％ パラホルムアルデヒドをかん流した。マウスを屠殺し、同一の固定剤を用いて２４時間後に固定した。ＯＥを含む鼻孔組織を、１０％ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ ７．０）を用いて脱灰し、次いでパラフィン中に埋入した。冠状切片（厚さ４μｍ）を切削し、シラン被覆スライドに載せた。脱パラフィン化した切片を、抗原回復のためにＴａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓ１７００；Ｄａｋｏ）内で１０分間オートクレーブした。免疫組織化学を、次の抗体のいずれか１つを使用して実施した：抗インスリン受容体、抗リン酸化インスリン受容体、抗嗅覚マーカータンパク質（ＯＭＰ、ヤギポリクローナル、１：４０００希釈；ワコーケミカルズ）、抗活性化カスパーゼ−３（ウサギポリクローナル、１：５０００；セルシグナリングテクノロジー）、抗Ｋｉ−６７（マウスモノクローナル、１：５００；ＢＤバイオサイエンス）及び抗ｃ−ｆｏｓ抗体（ウサギＩｇＧ、１：１０００；サンタクルーズバイオテクノロジー）。
【0048】
Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔａｉｎ ＭＡＸ−ＰＯ第２抗体システム（ニチレイ）を用いて、抗ＯＭＰ（ヤギ）、抗活性化カスパーゼ−３（ラット）、抗Ｋｉ−６７（マウス）及び抗ｃ−ｆｏｓ（ウサギ）について免疫反応を検出した。抗ＯＭＰ（抗ＯＭＰ抗体、ヤギポリクローナル、１：４０００；ワコーケミカルズ）及び抗カスパーゼ−３（抗活性化カスパーゼ−３抗体、ウサギポリクローナル、１：５０００；セルシグナリングテクノロジー）抗体を用いて二重免疫染色に対して第１次抗体を使用した。
【0049】
洗浄後、ロバ抗ヤギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８及びロバ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４（１：１００；インビトロジェン）とともに組織を室温で１時間培養した。
【0050】
４．分析マウス間及びマウス内での解剖学的変化（例えば、含気鼻甲介）によるデータ値のバラつきを抑えるために、ＯＥ分析を、鼻腔内の右側及び左側における鼻中隔及び鼻甲介上部のＯＥ（嗅上皮）に限定して解析を行った。
【0051】
切片を５００μｍ間隔で切削した。嗅神経上皮は次の二つの細胞系を含む：嗅神経細胞（ＯＳＮｓ）、及び基底幹細胞。ＯＥ中の固有層上にある矩形細胞を基底細胞と定義した。残りの細胞をＯＳＮｓとして定義した。固有層から表面までの距離である厚さを、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて測定した。抗ＯＭＰ、抗活性化カスパーゼ−３、及び抗Ｋｉ−６７抗体で標識したＯＳＮ数を、各抗原について単一的に免疫染色し、ヘマトキシリンで対比染色した切片を用いて、定量的に分析した。固有層下の結合性組織について、中間バックグラウンド強度の標準偏差の２倍を上回った細胞の免疫染色を陽性であるとみなした。ＯＳＮ及び免疫染色した細胞（ＯＭＰ陽性細胞、Ｋｉ−６７陽性細胞及びカスパーゼ−３陽性細胞）の数を、右側及び左側の両側に対して（正常群及びＳＴＺ群のそれぞれの）顕微鏡観察のイメージにおける鼻中隔の全長に沿って計測した。これらの計測値の平均値及び標準偏差は、ＯＳＮ、ＯＭＰ陽性細胞及びＫｉ−６７陽性細胞の数について、１００μｍの鼻中隔の長さあたりの各群について算出し；及びカスパーゼ−３陽性細胞の数は鼻中隔の長さあたりで定量した。
【0052】
鼻内の全ての嗅上皮における嗅細胞数を計測することは不可能に近いことから、全領域の嗅上皮から伸びる嗅神経は全て嗅球に収束するという事実から、嗅球の全領域を観察することにより嗅上皮の一部だけに起こっている現象ではなく、嗅上皮全体で同様な現象が起きているといえる。よって、嗅球全体の組織を観察した。
【0053】
各ＯＢに対して、１つの冠状断片をそのＯＢの中央領域から選択し、次いで７つの糸球体を、ＯＢの個々の切片においてランダムに選択した（図６ａを参照）。有意であるＯＭＰ染色領域は、染色がＯＢの外部網状層内のバックグラウンド強度の平均値の２倍の標準偏差を上回るものとして定義した。
【0054】
有意であるＯＭＰ染色領域のパーセンテージを、有意であるＯＭＰ染色領域の面積を糸球体（ＯＭＰ染色領域／糸球体領域×１００）の総面積で割ることにより、糸球体において計算した。免疫染色領域の分析を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて実施した。
【0055】
５．統計分析統計分析は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕテストを用いて行った（ＳＴＺマウスｖｓ通常マウス；障害後及び生理食塩水投与後）。エラーバーは平均値±ＳＤを示す。ｐ値＜０．０５は統計的に有意であるとみなした。
【0056】
６．通常マウス及びＤＭマウスの嗅覚障害の改善評価メチマゾール投与後３日目、７日目、１４日目及び２８日目のマウス（ｎ＝７）をウレタン麻酔下で屠殺し、嗅上皮組織を採取した。嗅上皮組織はマウス頭部から嗅球前端までの冠状断切片を作成した。作成した切片をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色することにより、鼻中隔及び鼻甲介上部における嗅上皮の厚み及び嗅神経細胞数（ＯＳＮｓ）を計測並びに評価した。また、嗅神経細胞数のうち、成熟嗅神経細胞数の評価には抗ＯＭＰ（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｍａｒｋｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）抗体を用い、基底細胞の分裂能の評価には抗Ｋｉ−６７抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて免疫染色を行った。なお、基底細胞の分裂能は、基底細胞が元となり成熟嗅神経細胞への分化及び増殖が起こることから、嗅上皮修復への予備能力及び潜在能力を評価している。
【0057】
結果として、メチマゾール投与後７日目までは通常マウスとＤＭマウスとにおいて、嗅上皮の厚み、ＯＳＮｓ、及び成熟嗅神経細胞数の各項目について有意差は認められなかった。しかし、メチマゾール投与後１４日目において、ＤＭマウスにおける嗅上皮の厚み、ＯＳＮｓ及び成熟嗅神経細胞数（ＯＭＰ陽性細胞数）が通常マウスと比較して明らかに減少していた（図１ａ及び１ｂ並びに３ａ〜３ｃを参照）。すなわち、図１ａは、ＯＭＰ陽性細胞（茶色染色部）がほとんど存在しておらず、成熟嗅神経細胞がほとんど無いことを示す。それに対して、図１ｂは、ＯＭＰ陽性細胞が多いことを示す。
【0058】
また、メチマゾール投与後２８日目において、同様の結果が得られた（図２ａ及び２ｂ並びに３ａ〜３ｃを参照）。すなわち、図２ａではほとんどＯＭＰ陽性細胞が少ないことを示すのに対して、図２ｂではほぼすべての嗅神経細胞においてＯＭＰ陽性となっていることを示す。
【0059】
メチマゾール投与１４日目を境に嗅上皮の厚み、ＯＳＮｓ及び成熟嗅細胞数（ＯＭＰ陽性細胞数）に関して、ＤＭマウスで有意な減少を認めた（図３ａ〜３ｃ）。この結果より、シナプス形成期に相当する障害１４日目を境に、嗅上皮の厚み及び嗅細胞数においてＤＭマウスで有意な減少が認められた。
【0060】
７．長期インスリン分泌不全を呈したＤＭマウスの評価通常マウスから嗅上皮組織を採取し、固定切片を作製した後、ＤＡＰＩ、Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒ及びＭｅｒｇｅを用いて組織学的に染色した（図４ａを参照）。図４ａから、通常マウス（ｐ−Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒ）の嗅上皮全体にインスリン受容体及びリン酸化されたインスリン受容体が発現していることが確認された。嗅上皮全域にインスリン受容体が発現しているという報告は無く、ここからは、嗅上皮の恒常性維持においてインスリンシグナルが何らかの重要な役割を担っている可能性が示唆される。
【0061】
ＤＭマウスについて、血糖値及び体重を調べた（図４ｂ及び４ｃを参照）。ＤＭマウス（ｐｏｓｔ−ＳＴＺ ａｄ．）は、通常マウス（ｐｒｅ−ＳＴＺ ａｄ．）に比べて、絶食時（ｆａｓｔｉｎｇ）及び通常時（ｃａｓｕａｌ）のいずれにおいて血糖値が有意に上昇していることがわかった（図４ｂを参照）。また、ＤＭマウスは、通常マウスに比べて、糖尿病による多尿の影響からか、体重が若干減少していることが確認された（図４ｃを参照）。
【0062】
長期のインスリン分泌不全自体が嗅上皮に影響を与え得るかを確認するためにＤＭマウスにメチマゾールを投与せずに生理食塩水を投与し（０日目）、２８日目及び９０日目に経過観察した。図４ｄ及び４ｅは、それぞれ２８日目及び９０日目の嗅上皮組織の冠状断切片について、ＨＥ染色結果及びＯＭＰ陽性細胞数の確認結果を示す。図４ｄ及び図４ｅに示すとおり、ＳＴＺマウスの嗅上皮は、約１カ月及び約３ヵ月経過した時点でも嗅上皮の厚み及び嗅細胞数について変化しなかった。結果として、約３ヶ月間のインスリン低下は、嗅上皮に対しては組織学的な変化を引き起こさなかった。
【0063】
図５ａは、メチマゾール投与後３日目、７日目及び１４日目の嗅覚障害モデルマウスについて、インスリン受容体抗体及びリン酸化インスリン受容体抗体で免疫染色した結果を示す。これらの結果より、嗅上皮障害直後から完全に成熟するまでの全ての時期においてインスリン受容体及びリン酸化インスリン受容体が基底幹細胞レベルで嗅上皮全体に発現していることが確認された。図５ｂは、メチマゾール投与後３日目、７日目、１４日目及び２８日目の嗅覚障害モデルマウスについて、ＨＥ染色した結果を示す。図５ｂが示すとおり、通常マウスにメチマゾールを投与したＭｅｔ群の方において嗅上皮組織は障害後２８日目に正常レベルの嗅上皮に回復した。なお、ＳＴＺ＋Ｍｅｔでは障害後２８日目においても嗅上皮はやや薄く、ＯＳＮｓも少なかった。図５ｂの結果を表したものが図３ａ及び３ｂである。図５ｃの結果を表したものが図３ｃである。
【0064】
図５ｃは、メチマゾール投与後７日目、１４日目及び２８日目の嗅覚障害モデルマウスについて、ＯＭＰ抗体で免疫染色した結果を示す。図５ｃが示すとおり、成熟嗅細胞マーカーであるＯＭＰ陽性細胞は、嗅上皮障害後２週目（嗅神経が嗅球とシナプスを形成する時期に相当）の時期を境に、ＳＴＺマウス群において有意な減少を認めた。その後もＳＴＺマウスにおいて再生遅延は継続した。図５ｄ及び５ｅは、メチマゾール投与後１４日目及び２８日目の嗅覚障害モデルマウスについてＯＭＰ陽性領域を分析した結果を示す。図５ｄ及び５ｅが示すとおり、図５ｃ及び図３ｃと同様の結果が嗅球におけるＯＭＰ陽性領域に関しても認められた。
【0065】
８．まとめ長期間のインスリン低下は、成熟した嗅細胞で占められた嗅上皮に対しては組織学的な変化を引き起こさなかった。しかし、嗅上皮が障害を受け、新生した未熟な嗅細胞による再生過程においては、嗅上皮の再生が著しく遅延するのが観察された。この結果は、インスリンシグナルは生理的な嗅上皮の恒常性維持ではなく、障害後の恒常的再生過程において極めて重要な役割を果たすことを示唆し、特に障害後約１４日目における神経のシナプス形成期において神経成長因子としてインスリンシグナルの依存度が高まる可能性を示す。インスリンシグナルは、未熟嗅細胞が成熟する上でキーシグナルとして作用し、このシグナルが不足すると嗅覚機能の再生も不完全に終わり、結果として嗅覚機能の低下を来たす可能性がある。
【0066】
［ＩＩ．嗅覚障害モデルマウスを用いたＯＢ中の臭気物質誘導ｃ−ｆｏｓ発現］０日目にメチマゾールを各群のマウスに腹腔内に注入した。メチマゾール投与２８日後に、各マウスを隔離箱に収容し、チャコール・フィルタに通して脱臭し清浄空気を供給した。マウスに臭気物質を適用する前に（ｎ＝３マウス）、４時間食物ペレットを与えずに新たなケージ中に維持した。
【0067】
３つの臭気物質として、アルデヒド（プロピルアルデヒド、ｎ‐バレルアルデヒド、Ｎ−ヘプチルアルデヒド、ベンズアルデヒド及びペリルアルデヒド）、ラクトン（γ−ブチロラクトン及びγ−ヘプタラクトン、σ−ヘキサラクトン、σ−ノナラクトン及びＹオクタラクトン）及びエステル（アミルヘキサノアート、ｂ−γ−ヘキセニル酢酸、酢酸テルピニル及び酢酸イソアミル）を鉱物油で１／１０濃度に希釈し、次いで得られた希釈溶液 １００μｌに浸漬したコットン紙をディッシュ中に置いた。
【0068】
臭気物質は、１０分間隔で１時間毎に２度、ケージ中にディッシュを置くことにより適用した。最後の臭気物質を適用した後、マウスを固定剤でかん流し、ＯＢ中のｃ−ｆｏｓ発現の分析に供した。ＯＢ中のｃ−ｆｏｓ発現の分析結果を、図６ｂ及び図６ｃに示す。
【0069】
図６ｂ及び６ｃが示すとおり、嗅上皮障害後１カ月の時点で、正常マウス及びＳＴＺマウスのｃ−ｆｏｓ陽性細胞数（嗅覚入力における最初期応答遺伝子であり、嗅覚機能を反映する）を比較した。ＳＴＺマウス群において有意にｃ−ｆｏｓ陽性細胞数の減少を認めた。このことから、嗅上皮組織の再生遅延と一致して嗅覚の機能低下もＳＴＺマウスで認められることがわかった。
【0070】
また、図７ａ及び７ｂは両群間の嗅上皮再生過程におけるＫｉ−６７陽性細胞数を比較した結果を示す。図７ａ及び７ｂは両群間においてＫｉ−６７陽性細胞数の有意な差は認めなかった。このことから両群間における嗅細胞の分裂能には差がないことが示唆された。
【0071】
さらに、図８ａ及び８ｂは、両群間の嗅上皮再生過程における活性化カスパーゼ−３陽性細胞数（アポトーシスを起こす直前に陽性となる）を比較した結果を示す。ＳＴＺマウス群において嗅上皮障害後の２週目に最も活性化カスパーゼ−３陽性細胞数が多いことがわかった（有意差あり）。図８ｃは、メチマゾール投与後１４日目における、ＯＭＰ、活性化カスパーゼ−３及びｍｅｒｇｏ陽性細胞数を比較した結果を示す。これらのことからシナプス形成時期に相当する嗅上皮障害後の２週目に、インスリンシグナルが不足したＳＴＺ群において未熟な嗅細胞はシナプスを形成できず、アポトーシスに入る細胞が多いことがわかった。
【0072】
［ＩＩＩ．１型糖尿病モデルマウスを用いたインスリン投与による嗅覚障害の改善効果（２）］ＤＭマウスにインスリン製剤を投与して、嗅上皮の再生及び成熟不良に対する改善効果を評価した。
【0073】
インスリン製剤には、「レベミル（登録商標）注フレックスペン」（以下、レベミルとよぶ。）を用いた。レベミルをインスリンデテミル２〜３Ｕ／ｋｇ単位で、ＤＭマウスに連日１回／日腹腔内投与した。この結果、ＤＭマウスの高血糖は是正され、血糖値は約１３０ｍｇ／ｄｌ前後の正常に近いレベルに血糖維持することができたため、本インスリン用量によりＤＭマウスのインスリン不足を適切に解消できる量とした。ＤＭマウスにメチマゾール投与後１４日目の嗅上皮組織を、インスリンを補充する時期別（ａ群、ｂ群及びｃ群）に観察した（図９ａ及び図９ｂを参照）。図９ａ及び９ｂのとおり、インスリンデテミル ３Ｕ／ｋｇをメチマゾール投与後の第１日目から第１３日まで連日腹腔内投与して補充した群をａ群、インスリンデテミル ３Ｕ／ｋｇをメチマゾール投与後の第１日目から第６日までのみ腹腔内投与した群をｂ群、第８日〜第１３日までのみ腹腔内投与した群をｃ群として分けた。メチマゾール投与１４日目にａ〜ｃ群全てのマウスをパラフィン固定し、上述の方法で各群における嗅上皮の嗅神経細胞数(ＯＳＮｓ)、嗅上皮の厚み及びＯＭＰ陽性細胞数をカウントした。結果を、図９ｃ〜９ｆに示す。【0074】
その結果、ａ群及びｃ群においてメチマゾール投与後１４日目において、ＤＭマウスにおける成熟嗅神経細胞数（ＯＭＰ陽性細胞数）は通常マウスとほぼ同定度であった。また、嗅上皮の厚み及び嗅神経細胞数についても通常マウスとＤＭマウスとで有意な差は認められなかった。
【0075】
図９ｃ〜９ｆに示すとおり、障害後１４日目においてｂ群のみ嗅上皮の厚み、ＯＳＮｓ及びＯＭＰ陽性細胞数において、ａ、ｃ群と比較して有意な減少を認めた。ａ群とｃ群においては嗅上皮の厚み、ＯＳＮｓ及びＯＭＰ陽性細胞数において有意な差を認めなかった。このことから、インスリンシグナルは嗅上皮障害後の０〜６日に重要なのではなく、嗅上皮障害後の７〜１４日目（シナプス形成時期に相当）に適切なインスリンシグナルが存在するかしないかで、その後の嗅上皮の分化、成熟が正常に行われるかが決まるという可能性が示唆された。このことから、インスリンシグナルの依存度はシナプス形成時期に、特に高まる可能性があることが示唆された。【0076】
以上の結果より、インスリンシグナルがシナプス形成時期にあるか無いかで、その後の嗅上皮再生の運命が決まるという事実を見出した（図１０ａを参照）。また、インスリンシグナルはシナプス形成時期にその依存度が高まる可能性が示唆された（図１０ｂを参照）。神経刺激因子は、従来、常に一定程度に作用していると思われていた。しかし、本発明者らによって、依存度が時期によって変化するという初めての知見が得られた。
【産業上の利用可能性】
【0077】
本発明の嗅覚障害治療剤は、嗅覚障害を被る者の健康と福祉に貢献でき、さらに嗅覚障害に纏わる医療費の低減や労働力低下の解消など、国民経済全体に資するものである。