特許 6040464 作用持続期間が増大し、免疫原性が減少した操作されたポリペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6040464

(24)【登録日】2016年11月18日

(45)【発行日】2016年12月7日

(54)【発明の名称】作用持続期間が増大し、免疫原性が減少した操作されたポリペプチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20161128BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20161128BHJP

   C07K 14/575 20060101ALI20161128BHJP

   C07K 1/04 20060101ALI20161128BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20161128BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20161128BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20161128BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20161128BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20161128BHJP

   A61K 38/22 20060101ALI20161128BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20161128BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C07K19/00

   C07K14/575

   C07K1/04

   C12P21/02 C

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61K37/24

   A61P3/10

【請求項の数】15

【全頁数】144

(21)【出願番号】特願2014-520216(P2014-520216)

(86)(22)【出願日】2012年7月3日

(65)【公表番号】特表2014-528917(P2014-528917A)

(43)【公表日】2014年10月30日

(86)【国際出願番号】US2012045398

(87)【国際公開番号】WO2013009539

(87)【国際公開日】20130117

【審査請求日】2014年5月30日

(31)【優先権主張番号】61/506,001

(32)【優先日】2011年7月8日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/540,422

(32)【優先日】2011年9月28日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】516311526

【氏名又は名称】アエゲリオン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ａｅｇｅｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100081422

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 光雄

(74)【代理人】

【識別番号】100084146

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 宏

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(72)【発明者】

【氏名】メアリー・エリクソン

(72)【発明者】

【氏名】デイビッド・シー・リッツィンガー

(72)【発明者】

【氏名】スーミトラ・エス・ゴッシュ

(72)【発明者】

【氏名】ジジエン・グオ

(72)【発明者】

【氏名】キャロライン・エクブラッド

(72)【発明者】

【氏名】ジョナサン・デイビッド・ロス

【審査官】 川合 理恵

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／１００２５５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１０−５３４４８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０５４６９９（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アルブミン結合ドメインポリペプチド（ＡＢＤ）と、レプチンを含む第１のペプチドホルモンドメイン（ＨＤ１）とを含む操作されたポリペプチドであって、
前記ＡＢＤは、配列番号３１３、配列番号４５５、配列番号４５６、配列番号４５７、配列番号４５８、配列番号４５９、配列番号４６０、配列番号４６１、および配列番号４６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、操作されたポリペプチド。

【請求項2】

前記ＨＤ１と共有結合によって連結している第１のリンカー（Ｌ１）をさらに含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。

【請求項3】

前記ＨＤ１が、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３３、配列番号６６４、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の操作されたポリペプチド。

【請求項4】

配列番号５９４、配列番号５９５、配列番号６０２、配列番号６０３、配列番号６０５、配列番号６３４、配列番号６４１、配列番号６４８、配列番号６５７、配列番号６５８、配列番号６５９、配列番号６６０、配列番号６６１、配列番号６６２、配列番号６６３、および配列番号６８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。

【請求項5】

必要とする対象における疾患または障害を治療するための、請求項１から４のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドを含む、医薬組成物。

【請求項6】

前記疾患または障害が、脂肪異栄養症、脂質異常症、高脂血症、過体重、肥満症、視床下部性無月経、アルツハイマー病、レプチン欠乏症、脂肪肝疾患、糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、メタボリックシンドロームＸまたはハンチントン舞踏病である、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項7】

請求項１から４のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドおよび医薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物。

【請求項8】

請求項１から４のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

【請求項9】

請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【請求項10】

請求項９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。

【請求項11】

請求項１から４のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドを製造する方法であって、前記操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させること、または前記操作されたポリペプチドを非生物学的ペプチド合成により合成することを含む方法。

【請求項12】

ＡＢＤが、配列番号４６３または配列番号３１３である、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。

【請求項13】

前記ＨＤ１が、配列番号３３である、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。

【請求項14】

配列番号５９５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。

【請求項15】

配列番号６５７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含有し、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。２０１２年７月３日に作製された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１３２０ＵＳＰＲ．ｔｘｔと名づけられ、４５０，３７７バイトの大きさである。

【背景技術】

【0002】

本願は、良好な作用持続期間、高い効力および／または好都合な投与レジメンを有する化合物ならびにその使用方法に関する。アルブミン結合ドメインを、生物学的に活性なペプチドと組み合わせて組み込む操作されたポリペプチドが、本明細書において提供される。何らかの理論に拘束されようとは思わないが、本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、アルブミンと結合し得るので、化合物が捕捉され得（例えば、アルブミンと結合され）、一方で、例えば、腎クリアランスおよび／または分解の減少のために、循環における作用持続期間の増大につながると考えられる。このような治療を受け入れられる疾患として、脂肪異栄養症、脂質異常症、高脂血症、過体重、肥満症、視床下部性無月経、アルツハイマー病、レプチン欠乏症、脂肪性肝疾患、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型を含む）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、メタボリックシンドロームＸおよびハンチントン舞踏病またはそれらの組合せが挙げられる。

【発明の概要】

【0003】

上記の代謝疾患、状態および障害において有用なポリペプチドを開発する必要性が依然としてある。したがって、本発明の目的は、上記の状態を治療するのに有用な、半減期が延長された操作されたポリペプチドならびにそれらを製造および使用する方法を提供することである。

【0004】

各特許、特許出願および本明細書に引用された刊行物は、参照によりその全文が、すべての目的のために本明細書に組み込まれる。

【0005】

アルブミンに対する結合親和性およびさらなる治療上の有用性を有する、操作されたポリペプチド化合物が提供される。化合物は、アルブミンと結合できるアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）ポリペプチドと、ホルモンドメイン（ＨＤ）ポリペプチドとを含む、操作されたポリペプチドであり、ＨＤポリペプチドは、生物学的に活性であり、ＡＢＤとの共有結合において有益な生物学的応答を発揮できる。本明細書に記載されたＡＢＤまたはＨＤポリペプチドのいずれも、リンカーＬ、例えば、本明細書に記載のＬ１を介して、操作されたポリペプチド中で共有結合によって結合されていてもよい。何らかの理論に拘束されようとは思わないが、本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、アルブミンと結合し得るので、化合物が、対象において捕捉され得、対象における作用持続期間の増大につながると考えられる。

【0006】

第１の態様において、本明細書に記載されるような操作されたポリペプチドが提供される。操作されたポリペプチドは、アルブミン結合ドメインポリペプチド（ＡＢＤ）と、ホルモンドメイン（ＨＤ１）とを含む。ホルモンドメインは、レプチン、レプチンの類似体またはその活性断片であるポリペプチドを含む。

【0007】

別の態様では、治療を必要とする対象において、疾患または障害を治療する方法が提供される。方法は、本明細書に記載されるような操作されたポリペプチドを、対象に投与することを含む。

【0008】

さらに別の態様では、本明細書に記載された操作されたポリペプチド化合物を、医薬上許容される賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物が提供される。

【0009】

さらに別の態様では、操作されたポリペプチドおよびその中間体をコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを有する発現ベクター、このようなポリヌクレオチドを発現する宿主細胞ならびにそれらの発現、合成、翻訳後修飾および単離のための手段である。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１は、本明細書に開示された操作されたポリペプチド、Ｎ末端グリシン残基によって延長されたストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）株Ｇ１４８（配列番号４５３）のプロテインＧに由来するＧＡ３ドメインおよびJonsson et al（Protein Eng. Design & Selection, 2008, 21:515-527；配列番号４５４）によってこれまでに記載されたようなＧ１４８−ＧＡ３に由来するアルブミン結合ポリペプチドにおいて有用な、アルブミン結合ポリペプチド（配列番号３０１〜４５２、配列番号４５４〜４６３、配列番号５００〜５９３）の例のアミノ酸配列の一覧である。

【図2】図２は、アルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０７９１２（配列番号４５６）の、ヒト血清アルブミンとの結合を調べるためにＢｉａｃｏｒｅ機器において実施された結合分析の結果を示す。３種の異なる濃度の精製タンパク質（４０ｎＭ、太い灰色の線；１０ｎＭ、黒色の線および２．５ｎＭ、灰色の線）を、固定化されたヒト血清アルブミンの９５５ＲＵを有する表面上に注入した。

【図3】図３Ａ〜Ｃは、１２６種の個々の正常ヒト血清中に存在する、アルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０７９１３（配列番号４５３）、ＰＥＰ０６９２３（配列番号４５４）、ＰＥＰ０７２７１（配列番号４５５）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号４５７）、ＰＥＰ０７５５４（配列番号４５６）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号４５８）、ＰＥＰ０７９６８（すなわち、ＰＥＰ０７９１１（配列番号４５９）とコンジュゲートしているＤＯＴＡ）およびＰＥＰ０７８４４（配列番号４６１）の、ＩｇＧ分子との結合を調べるためのＥＬＩＳＡによって実施された結合分析の結果を示し、Ａ）は、平均ＯＤ値を示し、Ｂ）は、陰性血清（ＯＤ＜０．１５として定義される）のパーセンテージを示し、Ｃ）は、陽性血清（ＯＤ＞１．０として定義される）のパーセンテージを示す。

【図4】図４Ａ〜Ｃは、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖アッセイにおける、アルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０７９１３（配列番号４５３）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号４５７）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号４５８）およびＰＥＰ０７９６８（すなわち、ＰＥＰ０７９１１（配列番号４５９）とコンジュゲートしているＤＯＴＡ）の免疫原性評価を示す図である。Ａ）は、５２人のコーカサス人種のドナーのコホートにおける、組換えヒトアルブミンと比較したアルブミン結合ポリペプチドに反応する個体数を示す。Ｂ）は、組換えヒトアルブミンを含有する陰性対照と比較した、ＰＥＰ０７９１３、ＰＥＰ０７９１２、ＰＥＰ０７９１４およびＰＥＰ０７９６８の平均刺激指数（ＳＩ）を示す。Ｃ）は、バッファー対照と比較される、研究においてすべてのタンパク質に対して反応する個体数を示す。

【図5】図５は、実施例７に記載のとおり、アルブミンの存在下で化合物２によって生じるレプチン機能活性を表す。

【図6】図６Ａ〜６Ｂは、実施例８に記載されるようなラットへの投与の際の、食物摂取および体重の変化（媒体補正された％）に対する、示された本明細書に記載された操作されたポリペプチドの単回投与の効果を表す。図６Ａ：食物摂取。図６Ｂ：体重の変化（媒体補正された％）。

【図7】図７Ａ〜７Ｂは、実施例９に記載されるようなラットへの投与の際の、食物摂取および体重の変化（媒体補正された％）に対する、示された本明細書に記載された操作されたポリペプチドの単回投与の効果を表す。図７Ａ：食物摂取。図７Ｂ：体重の変化（媒体補正された％）。

【図8】図８は、実施例１０に記載されるようなラットへの投与の際の、体重の変化（媒体補正された％）に対する、示された本明細書に記載された操作されたポリペプチドの単回投与の効果を表す。

【図9】図９は、実施例１１に記載されるようなラットへの投与の際の、体重の変化（媒体補正された％）に対する、示された本明細書に記載された操作されたポリペプチドの単回投与の効果を表す。

【図10】図１０は、２群のラット：極めて肥満のラットの一方の群および中等度肥満症の範囲にカロリー制限されて下げられたもう一方の群における、単独でか、または組み合わせた、レプチン（１２５μｇ／ｋｇ／日）およびアミリン（１５００μｇ／ｋｇ／日）の投与の体重に対する効果を表すグラフである。

【図11】図１１は、４週間にわたる、単独でか、または組み合わせた、化合物６４（１２０ｎｍｏｌ／ｋｇ）およびＰＥＧ−ラットアミリン（Ｄｅｓ−Ｌｙｓ１−［Ｌｙｓ２６（ｍＰＥＧ４０Ｋ）］−ラットアミリン（配列番号１４８）（１２５ｎｍｏｌ／ｋｇ）の投与の体重に対する効果を表すグラフである。

【図12】図１２は、実施例１６に記載されるようなＳＴＺ誘導性Ｔ１ＤＭマウスへの投与の際の、血糖に対する示された本明細書に記載された操作されたポリペプチドの効果を表す。

【図13】図１３は、実施例１６に記載されるようなＳＴＺ誘導されたＴ１ＤＭマウスへの投与の際の、ヘモグロビンＡ１Ｃに対する示された本明細書に記載された操作されたポリペプチドの効果を表す。

【図14】図１４は、実施例１６に記載されるようなＳＴＺ誘導されたＴ１ＤＭマウスへの投与の際の、食物摂取および体重に対する示された本明細書に記載された操作されたポリペプチドの効果を表す。

【図15】図１５は、実施例１６に記載されるようなＳＴＺ誘導されたＴ１ＤＭマウスへの投与の際の、血糖に対する、低用量のインスリンを伴うおよび伴わない、示された本明細書に記載された操作されたポリペプチドの効果を表す。

【図16】図１６は、実施例１６に記載されるようなＳＴＺ誘導されたＴ１ＤＭマウスへの投与の際の、ヘモグロビンＡ１Ｃに対する、低用量のインスリンを伴うおよび伴わない、示された本明細書に記載された操作されたポリペプチドの効果を表す。

【図17】図１７は、実施例１６に記載されるようなＳＴＺ誘導されたＴ１ＤＭマウスへの投与の際の、食物摂取（媒体補正された％）および体重の変化（媒体補正された％）に対する、低用量のインスリンを伴うおよび伴わない、示された本明細書に記載された操作されたポリペプチドの効果を表す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

１．定義
「肥満症」および「過体重」とは、普通に予測されるものよりも多い体重を有する哺乳類を指し、例えば、外見、当技術分野で公知の肥満度指数（ＢＭＩ）、ウエストとヒップ周りの比率、皮下脂肪厚、ウエスト周りなどによって決定され得る。疾病管理予防センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）（ＣＤＣ）は、過体重を、２５〜２９．９のＢＭＩを有する成人ヒトとして定義しており；肥満を、３０以上のＢＭＩを有する成人ヒトとして定義している。肥満症の決定のためにはさらなる測定基準が存在する。例えば、ＣＤＣは、１．０より大きいウエストとヒップの比率を有するヒトは過体重であると述べている。

【0012】

「除脂肪体重」とは、脂肪を含まない体重を指し、すなわち、総体重−体脂肪重量が、除脂肪体重である。除脂肪体重は、当技術分野で公知の、流体静力学的計量、コンピュータ化チャンバー、二重エネルギーＸ線吸収測定法、皮膚ノギス、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）および生体電気インピーダンス法（ＢＩＡ）などの方法によって測定できる。

【0013】

「哺乳類」とは、一般に、毛皮または毛を有し、生児出生をその後代に与え、その後代に乳を与える温血動物を指す。哺乳類は、ヒト、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）、野生動物などを含む。一実施形態では、哺乳類は、雌である。一実施形態では、哺乳類は、女性のヒトである。一実施形態では、哺乳類は、ネコまたはイヌである。一実施形態では、哺乳類は、糖尿病哺乳類、例えば、２型糖尿病を有するヒトである。一実施形態では、哺乳類は、肥満糖尿病哺乳類、例えば、２型糖尿病を有する肥満哺乳類である。用語「対象」とは、本明細書に記載された方法との関連で、哺乳類を指す。

【0014】

「断片」とは、ポリペプチドとの関連において、本明細書において、通常の化学的意味で、ポリペプチドの一部を指す。例えば、断片は、親ポリペプチドの１個または複数の残基のＮ末端欠失またはＣ末端欠失に起因し得、および／または断片は、親ポリペプチドの１個または複数の残基の内部欠失に起因し得る。「断片」とは、抗体との関連において、可溶性、対象内での分布などを調節するために生物学的に活性な分子と連結され得る抗体の一部を指す。例えば、本明細書に記載されたレプチンＡ２００は、当技術分野で公知の、Ｆｃ抗体断片のレプチンとのコンジュゲートである。例えば、ＷＯ９８／２８４２７およびＵＳ２００７／００２０８４を参照のこと。用語「親」とは、ポリペプチドとの関連において、通常の意味で、修飾、例えば、挿入、欠失および／または置換の前に参照構造として働くポリペプチドを指す。用語「コンジュゲート」とは、本明細書に記載された操作されたポリペプチドとの関連において、成分ポリペプチド、例えば、ＡＢＤ、ＨＤ１などの間の共有結合を指す。用語「融合」とは、本明細書に記載された操作されたポリペプチドとの関連において、ペプチド主鎖の末端アミノまたはカルボキシ官能基のいずれか、または両方を介した、成分ポリペプチド、例えば、ＡＢＤ、ＨＤ１などの間の共有結合を指す。操作されたポリペプチドは、合成によってか、または組換えによって製造され得る。典型的には、融合物は、組換えバイオテクノロジーを使用して製造されるが、当技術分野で公知の化学合成およびコンジュゲーション法によっても製造され得る。

【0015】

本明細書において「類似体」とは、ポリペプチドとの関連において、親化合物に対して、アミノ酸の挿入、欠失および／または置換を有する化合物を指す。類似体は、優れた安定性、溶解度、有効性、半減期などを有し得る。いくつかの実施形態では、類似体は、親化合物に対して、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはさらに高い配列同一性を有する化合物である。

【0016】

「同一性」、「配列同一性」などは、２種以上の核酸またはポリペプチド配列の比較の関連において、同一であるか、または当技術分野で公知の配列比較アルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０を使用して測定されるような、特定のパーセンテージの同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチド（すなわち、比較ウィンドウまたは指定された領域にわたって、最大一致を求めて比較およびアラインされた場合の、特定の領域にわたる、約５０％の同一性、好ましくは、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性）を有する２種以上の配列または部分配列を指す。この定義は、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有するもの、ならびに天然に存在するもの、例えば、多型または対立遺伝子変異体および人為的変異体を含む。好ましいアルゴリズムでは、当技術分野で公知のように、ギャップなどについて考慮される。配列比較のためには、典型的には、１種の配列が参照配列として作用し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用できるか、または代替パラメータを指定できることが好ましい。次いで、配列比較アルゴリズムによって、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する、試験配列の配列同一性パーセントが算出される。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith & Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, 1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似法の検索によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗｅｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ,５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実施によって、または手作業によるアラインメントおよび目視検査によって実施できる。例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement))を参照のこと。配列同一性および配列類似性パーセントを決定するのに適しているアルゴリズムの好ましい例として、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが挙げられ、これらは、Altschul et al., 1977, Nuci. Acids Res. 25:3389-3402およびAltschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、当技術分野で公知のように、本発明の核酸およびタンパク質の配列同一性パーセントを決定するために使用される。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを介して市販されている。このアルゴリズムは、まず、クエリー配列において、データベース配列中の同一の長さのワードとアラインされた場合に幾分か正の値の閾値スコアＴにマッチするか、またはそれを満たす短いワード長Ｗを同定することによって高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al., Id.）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。ワードヒットは、累積的アラインメントスコアが増大され得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。例えば、ヌクレオチド配列についての累積的スコアは、パラメータＭ（１対のマッチング残基についてのリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を使用して算出される。アミノ酸配列については、累積的スコアを算出するためにスコアリングマトリックスが使用される。各方向におけるワードヒットの伸長は、累積的アラインメントスコアが、最大達成値から量Ｘだけ減少する；１つまたは複数の負のスコアを示す残基のアラインメントの蓄積のために累積的スコアが０以下になる；またはいずれかの配列の末端に到達する時点で停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のための）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列のためには、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長および１０の期待値（Ｅ）および５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff, 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915を参照のこと）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。

【0017】

別に明確に示されない限り、用語「約」とは、数値との関連において、数値の＋／−１０％を指す。

【0018】

用語「ペプチド」および「ポリペプチド」とは、本明細書に記載された操作されたポリペプチドの成分との関連において、同義である。

【0019】

ＩＩ．化合物
第１の態様において、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）ポリペプチドと、少なくとも１種のポリペプチドホルモンドメイン（ＨＤ１）とを含む操作されたポリペプチド化合物が提供される。用語「アルブミン結合ドメイン」、「ＡＢＤ」などは、本明細書に記載されようなアルブミンと結合できるポリペプチドを指す。用語「ホルモンドメイン」、「ホルモンドメインポリペプチド」などは、対象において生物学的応答を誘発できるポリペプチドを指す。例示的ホルモンドメインとして、それだけには限らないが、レプチン、レプチンの類似体またはその活性断片が挙げられるが、ＰＥＧ化誘導体などのレプチン誘導体であってもよい。

【0020】

驚くべきことに、レプチン、レプチン類似体、活性レプチン断片またはそのレプチン誘導体は、十分なレプチン生物活性を保持し、例えば、ヒト対象では少なくとも１週間以上の期間に変換される、げっ歯類において少なくとも３日、さらには５日の延長された作用持続期間を有しながら、本明細書に記載された細菌タンパク質のアルブミン結合ドメインに由来する極めて高親和性のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）と融合され得ることがわかった。このようなＡＢＤペプチドが、治療的タンパク質担体として頑強なプラットフォームであることは広く実証されておらず、それらは、比較的疎水性であり、付いている治療用ペプチドと悪い相互作用をする可能性があり、少なくとも１ファミリーのペプチドホルモンの担体として作用できなかったので、これは幾分か驚くべきことであった。ラットアミリン化合物（例えば、配列番号１０８）は、例えば、本明細書に記載されたＡＢＤとコンジュゲートされるか、融合される場合には、本発明の種々のレプチン操作されたポリペプチドコンストラクトが活性であり、長い作用持続期間を有するとわかった同じげっ歯類モデルにおいて、大きな、または長時間作用性のインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）活性を全く示さなかった。

【0021】

さらに、本明細書における治療用コンジュゲートまたは融合化合物は、驚くべきことに、低い免疫原性およびレプチン治療活性を有しながら、アルブミン結合親和性および特異性を保持していた。化合物は、驚くべきことに、レプチン、レプチン類似体、活性レプチン断片またはレプチン誘導体とＡＢＤの間に血漿−プロテアーゼ切断部位がないにもかかわらず、活性である。さらに驚くべきことに、治療用化合物は、アルブミンと結合している場合でさえも活性であると考えられる。本明細書に記載されたＡＢＤ化合物は、これまでに記載されたＡＢＤ化合物よりも低い免疫原性を有しながら、ストレプトコッカスのプロテインＧ株１４８（Ｇ１４８）の、およびJonsson et al.(Protein Eng. Design & Selection, 2008, 21:515-527)中のアルブミン結合領域に基づいた、アルブミン結合親和性および特異性を提供する。最近、ストレプトコッカスのプロテインＧ株１４８（Ｇ１４８）のアルブミン結合領域内で、２、３のＴおよびＢ細胞エピトープが実験によって同定された（Goetsch et al, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10:125-32, 2003）。著者らは、ワクチンにおけるＧ１４８のＴ細胞エピトープの利用、すなわち、アルブミン結合領域の固有の免疫刺激特性を利用することに興味があった。Goetsch et al.は、さらに、Ｇ１４８の配列中のＢ細胞エピトープ、すなわち、免疫処置後に抗体によって結合される領域を見出した。ヒト投与のための医薬組成物では、免疫反応は望まれない。したがって、アルブミン結合ドメインＧ１４８は、その上記の免疫刺激特性のために、このような組成物における使用には、そのようなものとして好ましくない。

【0022】

生物学的に活性な成分。本明細書に記載された化合物および方法における使用が考慮される生物学的に活性な化合物成分として、レプチンが挙げられる。用語「生物学的に活性な化合物」などは、通常の意味で、生物学的応答を誘発し得る化合物、例えば、ポリペプチドなどを指す。

【0023】

レプチン。「レプチン（複数形）」および「レプチン（単数形）」とは、それぞれ、レプチン（複数形）、レプチン活性断片（複数形）、レプチン類似体（複数形）およびレプチン誘導体（複数形）ならびにレプチン（単数形）、レプチン活性断片（単数形）、レプチン類似体（単数形）およびレプチン誘導体（単数形）を意味する。したがって、特に別に記載のない限り、「レプチン（複数形）」への言及は、本明細書に開示されるような、レプチン（複数形）、レプチン活性断片（複数形）、レプチン類似体（複数形）およびレプチン誘導体（複数形）を包含することを意味する。同様に、特に別に記載のない限り、「レプチン（単数形）」への言及は、本明細書に開示されるような、レプチン（単数形）、レプチン活性断片（単数形）、レプチン類似体（単数形）およびレプチン誘導体（単数形）を包含することを意味する。本明細書に開示された操作されたポリペプチドの設計、調製および使用において使用され得る例示的なこのようなレプチンとして、食物摂取の減少、体重の減少、体重増加の減少、満腹の誘導、カロリー利用能の減少、カロリー効率の減少、代謝プラトーの低減、インスリン感受性の増大、高脂血症の減少、脂質異常症の是正、高トリグリセリド血症の減少、肥満症の回復、過体重の回復、真性糖尿病（Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病および妊娠性糖尿病を含む）の回復、インスリン抵抗性の回復、それと関連している脂肪異栄養症状態の回復ならびにレプチンの投与の際に誘発されるはずである当技術分野で公知のその他の生物学的応答（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００７／００２０２８４号および第ＵＳ２００８／０２０７５１２号、米国特許第６，３０９，８５３号および第ＵＳ７，１８３，２５４号およびＰＣＴ公開出願第ＷＯ９６／００５３０９号、第ＷＯ９８／２８４２７号および第ＷＯ２００９／０６４２９８号を参照のことなどの、レプチンが対象に投与されると誘発されるはずである、当技術分野で公知の１種または複数の生物学的応答を誘発するものが挙げられる（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００７／００２０２８４号および第ＵＳ２００８／０２０７５１２号、米国特許第６，３０９，８５３号および第ＵＳ７，１８３，２５４号およびＰＣＴ公開出願第ＷＯ９６／００５３０９号、第ＷＯ９８／２８４２７号および第ＷＯ２００９／０６４２９８号を参照のこと）。

【0024】

本明細書に記載された操作されたポリペプチドの設計、調製および使用に適した例示的レプチンとして、それだけには限らないが、各々、その全文が、すべての目的のために本明細書に組み込まれる、米国特許第ＵＳ５，５９４，１０１号、第ＵＳ５，８５１，９９５号、第ＵＳ５，６９１，３０９号、第ＵＳ５，５８０，９５４号、第ＵＳ５，５５４，７２７号、第ＵＳ５，５５２，５２３号、第ＵＳ５，５５９，２０８号、第ＵＳ５，７５６，４６１号、第ＵＳ６，３０９，８５３号、米国特許出願公開第ＵＳ２００７／００２０２８４号およびＰＣＴ公開出願第ＷＯ９６／２３５１７号、第ＷＯ９６／００５３０９号、第ＷＯ９８／２８４２７号、第ＷＯ２００４／０３９８３２号、第ＷＯ９８／５５１３９号、第ＷＯ９８／１２２２４号および第ＷＯ９７／０２００４号に記載された化合物が挙げられる。インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）およびインビボでの、レプチン活性ならびに満腹、食物摂取阻害活性および体重減少活性を含めた生物学的応答についてアッセイするための方法は、当技術分野では公知であり、本明細書に、および上記の参考文献および本明細書に引用されたその他の参考文献に記載されている。

【0025】

本明細書を通じて開示された操作されたポリペプチドを調製および使用するために、当技術分野で公知の任意のレプチン、レプチン類似体、レプチン活性断片またはレプチン誘導体を使用してもよい。操作されたポリペプチドおよび本明細書に記載された方法において使用するために考慮される代表的なレプチン、レプチン類似体、レプチン活性断片およびレプチン誘導体としてまた、以下が挙げられる：

【0026】

成熟マウスレプチン：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa-SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC、（配列中、位置２８のＸａａは、Ｑであるか、または存在しない）（配列番号１）。

【0027】

成熟マウスレプチン１型：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVYQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC（配列番号１４３）。

【0028】

成熟マウスレプチン２型：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVYQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC（配列番号１４４）。

【0029】

Ｎ末端メチオニンを有する成熟マウスレプチン：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa-SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC、（配列中、位置２９のＸａａは、Ｑであるか、または存在しない）（配列番号２）。

【0030】

Ｎ末端メチオニンを有する成熟マウスレプチン１型：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVYQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC（配列番号１４５）。

【0031】

Ｎ末端メチオニンを有する成熟マウスレプチン２型：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVYQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC（配列番号１４６）。

【0032】

成熟ブタレプチン：
VPIWRVQDDTKTLIKTIVTRISDISHMQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLSLSKMDQTLAIYQQILTSLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLASSKSCPLPQARALETLESLGGVLEASLYSTEVVALSRLQGALQDMLRQLDLSPGC（配列番号３）。

【0033】

Ｎ末端メチオニンを有する成熟ブタレプチン：
MVPIWRVQDDTKTLIKTIVTRISDISHMQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLSLSKMDQTLAIYQQILTSLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLASSKSCPLPQARALETLESLGGVLEASLYSTEVVALSRLQGALQDMLRQLDLSPGC（配列番号４）。

【0034】

成熟ウシレプチン：
VPICKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa-SVSSKQRVTGLDFIPGLHPLLSLSKMDQTLAIYQQILTSLPSRNVVQISNDLENLRDLLHLLAASKSCPLPQVRALESLESLGVVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDMLRQLDLSPGC、（配列中、位置２８のＸａａは、Ｑであるか、または存在しない）（配列番号５）。

【0035】

Ｎ末端メチオニンを有する成熟ウシレプチン：
MVPICKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa-SVSSKQRVTGLDFIPGLHPLLSLSKMDQTLAIYQQILTSLPSRNVVQISNDLENLRDLLHLLAASKSCPLPQVRALESLESLGVVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDMLRQLDLSPGC、（配列中、位置２９のＸａａは、Ｑであるか、または存在しない）（配列番号６）。

【0036】

プロセシングされていない全長ヒトレプチン（すなわち、２１残基Ｎ末端シグナル配列を含む）：
MHWGTLCGFLWLWPYLFYVQAVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC（配列番号７）

【0037】

成熟ヒトレプチン（Ｎ末端２１アミノ酸シグナル配列が除去されている）：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISH-Xaa-Xaa-SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC、（配列中、位置２７のＸａａは、ＴまたはＡであり；位置２８のＸａａは、Ｑであるか、または存在しない）（配列番号８）。

【0038】

Ｎ末端メチオニンを有する成熟ヒトレプチン：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISH-Xaa-Xaa-SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC、（配列中、位置２８のＸａａは、ＴまたはＡであり；位置２９のＸａａは、Ｑであるか、または存在しない）（配列番号９）。

【0039】

成熟アカゲザルレプチン：
VPIQKVQSDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLTLSQMDQTLAIYQQILINLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLAFSKSCHLPLASGLETLESLGDVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC（配列番号１０）。

【0040】

Ｎ末端メチオニンを有する成熟アカゲザルレプチン：
MVPIQKVQSDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLTLSQMDQTLAIYQQILINLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLAFSKSCHLPLASGLETLESLGDVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC（配列番号１１）。

【0041】

成熟ラットレプチン：
VPIHKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSARQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVYQQILTSLPSQNVLQIAHDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTRGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC（配列番号１２）。

【0042】

Ｎ末端メチオニンを有する成熟ラットレプチン：
MVPIHKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSARQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVYQQILTSLPSQNVLQIAHDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTRGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC（配列番号１３）。

【0043】

成熟カモノハシレプチン：成熟カモノハシレプチン配列は、以下のとおりである：
ISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLDFIPGNQQFQNLADMDQTLAVYQQILSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFTRSDGLDTMEIWGGIVEESLYSTEVVTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQG（配列番号１４）。

【0044】

プロセシングされていない全長カモノハシレプチン（すなわち、２１残基のＮ末端シグナル配列を含む）：２１残基のＮ末端シグナル配列を含むカモノハシレプチンの全長配列は、以下のとおりである：
MRCILLYGFLCVWQHLYYSHPISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLDFIPGNQQFQNLADMDQTLAVYQQILSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFTRSDGLDTMEIWGGIVEESLYSTEVVTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQG（配列番号１５）。

【0045】

成熟ヒトレプチン１型：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC（配列番号１６）。

【0046】

成熟ヒトレプチン２型：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHAQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC（配列番号１７）。

【0047】

成熟ヒトレプチン３型：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC（配列番号１８）。

【0048】

成熟ヒトレプチン４型：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHASVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC（配列番号１９）。

【0049】

Ｎ末端メチオニンを有する成熟ヒトレプチン１型（メトレレプチンまたはＡ１００としても知られる）：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC（配列番号２０）。

【0050】

Ｎ末端メチオニンを有する成熟ヒトレプチン２型：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHAQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC（配列番号２１）。

【0051】

Ｎ末端メチオニンを有する成熟ヒトレプチン３型：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC（配列番号２２）。

【0052】

Ｎ末端メチオニンを有する成熟ヒトレプチン４型：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHASVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC（配列番号２３）。

【0053】

アザラシ（Ｓｅａｌ）レプチン：
PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC（配列番号２４）。

【0054】

それぞれ、メトレレプチンのアミノ酸７３〜９４（ヘリックス３）で置換されたアミノ酸７１〜９２を有するアザラシレプチン：
PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC（配列番号２５）。

【0055】

それぞれ、メトレレプチンのアミノ酸３２および７３〜９４（ヘリックス３）で置換されたアミノ酸３０および７１〜９２を有するアザラシレプチン：
PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC（配列番号２６）。

【0056】

Ｎ末端メチオニンを有するアザラシレプチン：
MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC（配列番号２７）。

【0057】

Ｎ末端メチオニンを有し、それぞれ、メトレレプチンのアミノ酸７３〜９４（ヘリックス３）で置換されたアミノ酸７１〜９２を有するアザラシレプチン：
MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC（配列番号２８）。

【0058】

Ｎ末端メチオニンを有し、それぞれ、メトレレプチンのアミノ酸３２および７３〜９４（ヘリックス３）で置換されたアミノ酸３０および７１〜９２を有するアザラシレプチン：
MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC（配列番号２９）。

【0059】

それぞれ、メトレレプチンのアミノ酸７３〜９４（ヘリックス３）で置換されたアミノ酸７１〜９２を有し、メトレレプチンのアミノ酸２５〜５１（ＡＢループ）で置換されたアミノ酸２３〜４９を有するアザラシレプチン：
PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC（配列番号６８０）

【0060】

レプチンＡ２００：レプチンＡ２００は、当技術分野で公知の、レプチンとのＦｃ抗体断片縮合生成物である。例えば、Lo et al., 2005, Protein Eng. Design & Selection, 18:1-10を参照のこと。Ａ２００のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC（配列番号３０）

【0061】

レプチンＡ３００：レプチンＡ３００は、置換Ｗ１０１ＱおよびＷ１３９Ｑ（残基１としてカウントされるＮ末端^１Ｍｅｔ）を有するメトレレプチンである：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC（配列番号３１）。

【0062】

レプチンＡ４００：レプチンＡ４００は、以下に示されるような、システイン残基で置換された位置７８のセリン残基を有するメトレレプチンである：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQICNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC（配列番号３２）；これに、位置７８のシステイン残基を介して２０キロダルトン（ｋＤａ）ＰＥＧ部分が付いている。

【0063】

レプチンＡ５００：本発明者らを含めた何人かの研究者による研究は、レプチンにおける残基置換の集合に対する効果に重点をおいてきた。例えば、参照により、すべての目的のために本明細書に組み込まれる、Ricci et al., 2006.“Mutational approach to improve physical stability of protein therapeutics susceptible to aggregation: Role of altered conformation in irreversible precipitation”, Book Chapter. In: MISBEHAVING PROTEINS: PROTEIN (MIS)FOLDING, AGGREGATION, AND STABILITY, Murphy RM, Tsai AM, Eds., New York. Springer. pp. 331-350を参照のこと。したがって、本明細書に記載された特定の化合物および方法では、以下の配列を有するレプチンＡ５００が使用されている：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC（配列番号３３）。

【0064】

レプチンＡ１００変異体：以下の残基置換を有するレプチンＡ１００の変異体は以下のとおりである：
Ｄ４１Ｅ、Ｈ９８Ｓ、Ｗ１０１Ｑ、Ｄ１０９Ｅ、Ｇ１１３Ｅ、Ｍ１３７Ｉ、Ｗ１３９ＱおよびＧ１４６Ｅ: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLESLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC（配列番号６６４）。
Ｈ９８Ｓ、Ｗ１０１Ｑ、Ａ１０２Ｔ、Ｇ１１３Ｅ、Ｍ１３７Ｉ、Ｗ１３９Ｑ、およびＧ１４６Ｅ：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC（配列番号６６５）。
Ｈ９８Ｓ、Ｗ１０１Ｑ、Ｇ１１３Ｅ、Ｍ１３７Ｉ、Ｗ１３９Ｑ、およびＧ１４６Ｅ：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC（配列番号６６６）。
Ｗ１０１Ｑ、Ｇ１１３Ｅ、Ｍ１３７Ｉ、Ｗ１３９Ｑ、およびＧ１４６Ｅ：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC（配列番号６６７）。
Ｈ９８Ｓ、Ｗ１０１Ｑ、Ｍ１３７Ｉ、Ｗ１３９Ｑ、およびＧ１４６Ｅ：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC（配列番号６６８）。
Ｗ１０１Ｑ、Ｇ１１３Ｅ、Ｍ１３７Ｉ、Ｗ１３９Ｑ、Ｌ１４３Ｖ、およびＧ１４６Ｅ：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC（配列番号６６９）。
Ｈ９８Ｓ、Ｗ１０１Ｑ、Ａ１０２Ｔ、Ｍ１３７Ｉ、Ｗ１３９Ｑ、およびＧ１４６Ｅ：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQTSGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC（配列番号６７０）。
Ｈ９８Ｓ、Ｗ１０１Ｑ、Ｄ１０９Ｅ、Ｇ１１３Ｅ、およびＧ１４６Ｅ：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLESLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPEC（配列番号６７１）。
Ｗ１０１Ｑ、Ｍ１３７Ｉ、Ｗ１３９Ｑ、およびＧ１４６Ｅ：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC（配列番号６７２）。
Ｗ１０１Ｑ、Ｍ１３７Ｉ、Ｗ１３９Ｑ、Ｌ１４３Ｖ、およびＧ１４６Ｅ：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC（配列番号６７３）。
Ｈ９８Ｓ、Ｗ１０１Ｑ、Ａ１０２Ｔ、Ｍ１３７Ｉ、Ｗ１３９Ｑ、Ｌ１４３Ｖ、およびＧ１４６Ｅ：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQTSGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC（配列番号６７４）。
Ｈ９８Ｓ、Ｗ１０１Ｑ、Ａ１０２Ｔ、Ｇ１１３Ｅ、およびＧ１４６Ｅ：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQTSGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPEC（配列番号６７５）。
Ｗ１０１Ｑ、Ｇ１１３Ｅ、およびＷ１３９Ｑ：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC（配列番号６７６）。
Ｗ１０１Ｑ、Ｇ１１３Ｅ、Ｗ１３９Ｑ、およびＧ１４６Ｅ：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPEC（配列番号６７７）。

【0065】

上記のレプチン、レプチン類似体またはその活性断片ならびに以下に記載されるようなレプチンのいずれも、ＡＢＤとのリンカーを有するか、有さない、本操作されたポリペプチドにおける使用に適している。

【0066】

アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）ペプチド。ストレプトコッカスのプロテインＧ株１４８（Ｇ１４８）に由来するこれまでに開示されたアルブミン結合ドメインについて、またアルブミンに対して高親和性を有するいくつかの変異体、例えば、ＷＯ０９／０１６０４３について、熱安定性の低下を犠牲にしてより高い親和性が達成された。さらに、Ｔ細胞およびＢ細胞エピトープが、Ｇ１４８のアルブミン結合領域内で実験的に同定されたことが報告された（Goetsch et al, Clin Diagn Lab Immunol 10:125-32, 2003）。この研究を行った著者らは、ワクチンにおけるＧ１４８のＴ細胞エピトープの使用、すなわち、アルブミン結合領域の固有の免疫刺激特性を利用することに関心をもった。Goetsch et alは、さらに、Ｂ細胞エピトープ、すなわち、Ｇ１４８の配列中の、免疫処理後に抗体によって結合される領域を見出した。したがって、アルブミン結合ドメインＧ１４８およびＧ１４８に由来するポリペプチドおよびひいては、それらを含有する融合物／コンジュゲート、上記の免疫刺激特性のリスク。ヒト投与用の医薬組成物では、免疫応答がないこと（または低減）が望まれる。

【0067】

このような融合物および／またはコンジュゲートの上記の欠点および欠乏は、本発明の操作されたポリペプチドにおいて使用するための本明細書に開示されたアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）ペプチドの使用によって克服または低減される。したがって、一実施形態では、本明細書に記載された長期間の操作されたポリペプチドコンジュゲートまたは融合物を含むアルブミン結合ドメインポリペプチドは、アルブミン結合モチーフと、３ヘリックス立体配置を含むさらなる配列とを含む３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインである。このようなＡＢＤは、アルブミンに対して比較的高親和性を有するものであり、ストレプトコッカス株Ｇ１４８の細菌タンパク質Ｇのアルブミン結合ドメインに由来し、望ましい免疫学的特性、例えば、低減された免疫原性をさらに提供するよう本明細書に記載されるようにさらに修飾されている。このようなＡＢＤは、参照によりその全文が、すべての目的のために本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開出願第ＷＯ２０１２／００４３８４号に記載されている。そのようなものとして、本明細書に記載された操作されたポリペプチドについて考慮されるＡＢＤペプチドは、Jonsson et al.(Protein Eng. Design & Selection, 2008, 21:515-527)によって記載されたようなアルブミン結合配列を有するものおよびＰＣＴ公開出願第ＷＯ２００９／０１６０４３号にさらに記載されるＡＢＤペプチドよりも優れている。本明細書に記載された操作されたポリペプチドを製造するには、本明細書に記載されたアルブミン結合ドメインポリペプチドに、レプチンまたは類似体またはその活性断片が融合される。レプチン化合物とのコンジュゲーションまたは融合に適したアルブミン結合ドメインポリペプチドは、以下から選択された配列を含むＡＢＤアミノ酸配列を含み得る：
式（ｉ）
LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLI X26 KAKT VEGVEALK X39 X40 IL X43 X44 LP（配列番号３００）
（配列中、各々独立に、
Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され；
Ｘ６は、Ｅ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ１０は、Ａ、ＳおよびＲから選択され；
Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され；
Ｘ２６は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ３９は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ４０は、ＡおよびＥから選択され；
Ｘ４３は、ＡおよびＫから選択され；
Ｘ４４は、Ａ、ＳおよびＥから選択され；
位置４５のロイシンは、存在するか、または存在せず；
位置４６のプロリンは、存在するか、または存在しない）および
式（ｉｉ）（ｉ）において定義される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（ただし、Ｘ_７は、Ｌ、ＥまたはＤではないか；
または代わりに、
アミノ酸配列は、ＰＣＴ公開出願番号ＷＯ２００９／０１６０４３において定義されるような以下の配列：
LAEAK X_a X_b A X_c X_d EL X_e KY GVSD X₅ YK X₈ X₉ I X₁₁ X₁₂ A X₁₄ TVEGV X₂₀ AL X₂₃ X₂₄ X₂₅ ILAALP（配列番号６７９）
によって定義されず、配列中、
互いに独立して、
Ｘ_ａは、ＶおよびＥから選択され；
Ｘ_ｂは、Ｌ、ＥおよびＤから選択され；
Ｘ_ｃは、Ｎ、ＬおよびＩから選択され；
Ｘ_ｄは、ＲおよびＫから選択され；
Ｘ_ｅは、ＤおよびＫから選択され；
Ｘ_５は、ＹおよびＦから選択され；
Ｘ_８は、Ｎ、ＲおよびＳから選択され；
Ｘ_９は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ_１１は、Ｎ、Ｓ、ＥおよびＤから選択され；
Ｘ_１２は、Ｒ、ＫおよびＮから選択され；
Ｘ_１４は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ_２０は、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｓ、ＲおよびＫから選択され；
Ｘ_２３は、Ｋ、ＩおよびＴから選択され；
Ｘ_２４は、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、ＬおよびＤから選択され；
Ｘ_２５は、Ｈ、ＥおよびＤから選択される）。

【0068】

第１の態様の上記の式（ｉ）または（ｉｉ）のアルブミン結合ポリペプチドのさらなる実施形態では、Ｘ６はＥである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ３はＳである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ３はＥである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ７はＡである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ１４はＳである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ１４はＣである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ１０はＡである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ１０はＳである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ１０はＲである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ２６はＤである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ３９はＤである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ３９はＥである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ４０はＡである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ４３はＡである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ４４はＡである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ４４はＳである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、位置４５のロイシンは、存在するか、または存在しない。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、位置４６のプロリンが存在しない。

【0069】

さらなる好ましい実施形態では、レプチン化合物とのコンジュゲーションまたは融合に適したアルブミン結合ドメインポリペプチドは、
式（ｉｉｉ）
LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP（配列番号６７８）
（配列中、互いに独立して、
Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され；
Ｘ６は、Ｅ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ１０は、Ａ、ＳおよびＲから選択され；
Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され；
位置４５のロイシンは、存在するか、または存在せず；
位置４６のプロリンは、存在するか、または存在しない）および
式（ｉｖ）（ｉｉｉ）において定義される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（ただし、Ｘ_７は、Ｌ、ＥまたはＤではないか；
または代わりに、
アミノ酸配列は、ＰＣＴ公開出願番号ＷＯ２００９／０１６０４３において定義されるような以下の配列：
LAEAK X_a X_b A X_c X_d EL X_e KY GVSD X₅ YK X₈ X₉ I X₁₁ X₁₂ A X₁₄ TVEGV X₂₀ AL X₂₃ X₂₄ X₂₅ ILAALP（配列番号６７９）
によって定義されず、配列中、
互いに独立して、
Ｘ_ａは、ＶおよびＥから選択され；
Ｘ_ｂは、Ｌ、ＥおよびＤから選択され；
Ｘ_ｃは、Ｎ、ＬおよびＩから選択され；
Ｘ_ｄは、ＲおよびＫから選択され；
Ｘ_ｅは、ＤおよびＫから選択され；
Ｘ_５は、ＹおよびＦから選択され；
Ｘ_８は、Ｎ、ＲおよびＳから選択され；
Ｘ_９は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ_１１は、Ｎ、Ｓ、ＥおよびＤから選択され；
Ｘ_１２は、Ｒ、ＫおよびＮから選択され；
Ｘ_１４は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ_２０は、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｓ、ＲおよびＫから選択され；
Ｘ_２３は、Ｋ、ＩおよびＴから選択され；
Ｘ_２４は、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、ＬおよびＤから選択され；
Ｘ_２５は、Ｈ、ＥおよびＤから選択される）
から選択されたＡＢＤアミノ酸配列を含み得る。

【0070】

この態様の式（ｉｉｉ）または（ｉｖ）のアルブミン結合ポリペプチドのさらなる実施形態では、Ｘ６はＥである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ３はＳである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ３はＥである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ７はＡである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ１４はＳである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ１４はＣである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ１０はＡである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ１０はＳである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、Ｘ１０はＲである。この態様のアルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、位置４５のロイシンは、存在するか、または存在しない。さらなる実施形態では、Ｃ末端プロリンが存在する。さらなる実施形態では、このプロリンが存在しない。

【0071】

式（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１種のさらなる実施形態では、ＡＢＤは、１個または複数のＮ末端ヘリックスキャッピングアミノ酸を含み、さらなる実施形態では、ヘリックスキャッピングアミノ酸は、セリンであり得るか、またはグリシン−セリンであり得る。したがって、図および配列表中のものを含めて、本明細書に開示された各アルブミン結合ドメイン配列について、その中に含有される式（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１種のＡＢＤに対応するアルブミン結合ドメイン、そのＳｅｒ−ＡＢＤ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡＢＤ、Ｇｌｙ−ＡＢＤ、Ａｌａ−ＡＢＤおよびそのデス−Ｃ末端−プロリン配列が、操作されたポリペプチドにおいて本明細書に開示されるように、すべての態様について具体的に考慮される。

【0072】

したがって、得られた配列が、（ｉ）または（ｉｉｉ）によって定義されるクラスに属する配列と少なくとも９５％同一であるようなものである（ｉ）または（ｉｉｉ）の修飾された変異体も包含される。例えば、アミノ酸残基の特定の官能基分類（例えば、疎水性、親水性、極性など）に属するアミノ酸残基は、同一官能基群に由来する別のアミノ酸残基と交換され得る可能性がある。

【0073】

アルブミンに対する結合親和性を有するＡＢＤポリペプチドと関連する配列の上記で定義されたクラスは、３αヘリックスバンドルドメインにフォールディングされる共通の親ポリペプチド配列に由来する。より詳しくは、上記のポリペプチドは、血清アルブミンとアルブミン結合ドメインＧ１４８−ＧＡ３間の複合体の構造に基づくモデルビルディング（Lejon et al, J. Biol. Chem. 279:42924-8, 2004）ならびに共通の親ポリペプチド配列のいくつかの突然変異による変異体の結合および構造特性の分析から導かれる。式（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１種の上記で定義されたアミノ酸配列は、親ポリペプチド配列と比較して、ほとんど同一である３ヘリックスバンドルドメインにフォールディングされると予測されるポリペプチドのクラスをもたらすアミノ酸置換を含む。親ポリペプチド配列は、アルブミンとの相互作用のための結合表面をすでに含んでいるが、その結合表面は、上記の定義の置換の一部によって修飾される。上記の定義の置換は、親ポリペプチド配列と比較して、改善されたアルブミン結合能を提供する。重要で、驚くべきことに、上記の定義の置換は、アルブミンに対する強力な親和性の保持および／または改善に加えて、免疫学的特性の増強を提供する。

【0074】

したがって、開示内容の第１の態様のアルブミン結合ポリペプチドは、例えば、ヒト投与のための治療分子の融合またはコンジュゲートパートナーとして使用するのに適したものにする一連の特徴を示す。重要で、驚くべきことに、本開示内容のアルブミン結合ポリペプチドは、例えばアルブミン結合ドメインＧ１４８−ＧＡ３およびＷＯ０９／０１６０４３に開示されたアルブミン結合ポリペプチドなどの関連アルブミン結合ポリペプチドとの比較において、以下の６つの特徴のうち少なくとも５つを実証する。

【0075】

（１）ポリペプチドは、例えば、Ｇ１４８−ＧＡ３およびその他の細菌由来のアルブミン結合ドメインと比較して異なる表面を示す。相違は、このような細菌タンパク質に対して先に曝露されているヒトなどの対象における抗体反応の任意のリスクを低減または排除し得る

【0076】

（２）ポリペプチドは、例えば、Ｇ１４８−ＧＡ３および共通の親ポリペプチド配列のその他の関連するが異なる突然変異による変異体よりも、少ない可能性あるＴエピトープしか含まず、したがって、ヒトなどの対象に投与された場合に低いおよび／またはより低い免疫原性を示す。

【0077】

（３）ポリペプチドは、ヒトなどの対象に投与された場合に、循環抗体と、より低い反応性を示す。したがって、循環抗体に曝露されたポリペプチドの表面における、すなわち、アルブミンとの結合相互作用に関与していないポリペプチド表面におけるアミノ酸置換によって、抗体交差反応性は、例えば、ヒト血清の試験セットにおいて測定されるような、Ｇ１４８−ＧＡ３によって引き起こされる抗体交差反応性と比較して低下する。

【0078】

（４）ポリペプチドは、Ｋ_Ｄ値によって定義されるような、より高い結合親和性の点で、およびｋｏｆｆ値によって定義されるような、より遅い解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）の点の両方で、例えば、細菌タンパク質由来のアルブミン結合ドメインなどの既知の天然に存在するアルブミン結合ポリペプチドよりも高いアルブミン結合能を有する。

【0079】

（５）ポリペプチドは、例えば、細菌タンパク質由来のアルブミン結合ドメインなどの既知の天然に存在するアルブミン結合ポリペプチドよりも少ない、ポリペプチドの安定性の問題と関連しているアミノ酸残基を含む。したがって、ポリペプチドは、例えば、酸化傾向のあるメチオニンまたはトリプトファンを含まず、１個しかアスパラギンを含まない。

【0080】

（６）ポリペプチドは、５５℃を超える融点によって定義されるような、ＷＯ０９／０１６０４３に開示されるものなどのこれまでのアルブミン結合ポリペプチドよりも高い構造的安定性を有する。

【0081】

一実施形態では、第１の態様のコンジュゲート／融合物のアルブミン結合ポリペプチドは、上記で列挙された特徴のうち６つすべてを示す。別の実施形態では、第１の態様のアルブミン結合ポリペプチドは、アルブミンと結合している場合に、例えば、ＷＯ０９／０１６０４３に開示されるものなどのこれまでのアルブミン結合ポリペプチドよりもより親水性のプロフィールを示す。ポリペプチドがアルブミンと相互作用する場合に周囲に曝露されるアルブミン結合ポリペプチドの表面は、表面疎水性を付与する、より少ないアミノ酸残基を含む。

【0082】

ＡＢＤペプチドは、最大で１×１０^−６Ｍである相互作用のＫ_Ｄ値で、さらにより好ましくは、最大で１×１０^−９Ｍ（さらにより密接な親和性）でアルブミンと結合する。より好ましくは、最大で１×１０^−１０Ｍである相互作用のＫ_Ｄ値で、いっそうより好ましくは、最大で１×１０^−１１Ｍであり、なおいっそうより好ましくは、最大で１×１０^−１２Ｍであり、いっそうさらには、最大で１×１０^−１３Ｍである。値は、最も好ましくは、ヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）に対する親和性のものである。

【0083】

モチーフが「３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する」本発明の実施形態では、アルブミン結合モチーフの配列が、天然に存在する（またはそうでなければ、本来の）３ヘリックスバンドルドメインの配列中に「挿入されている」か、またはそれに「グラフトされている」か、またはそれに「融合されており」、その結果、モチーフが、本来のドメイン中の類似構造のモチーフと置換していることを意味すると理解される。例えば、理論によって拘束されようとは思わないが、モチーフは、３ヘリックスバンドルの３つのヘリックスのうち２つを構成すると考えられ、任意の３ヘリックスバンドル内のこのような２ヘリックスモチーフを置換し得る。３ヘリックスバンドルドメインの２つのヘリックスの、本明細書に開示された２つのモチーフヘリックスによる置換は、ポリペプチドの基本構造に影響を及ぼさないように実施される。すなわち、本発明のこの実施形態のポリペプチドの主鎖のフォールディング全体は、同一要素の二次構造を同じ順序で有する部分などを形成するものの３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインのものと実質的に同一である。したがって、この実施形態のポリペプチドが、元のドメインと同一のフォールディングを有する場合には、本明細書における操作されたポリペプチドに有用なモチーフは、３ヘリックスバンドルドメインの一部を形成し得、これは、基本構造特性、例えば、同様のＣＤスペクトルをもたらす特性が共有されることを暗示する。

【0084】

本明細書において使用される用語「アルブミン結合」および「アルブミンに対する結合親和性」とは、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ機器などにおける表面プラズモン共鳴技術の使用によって試験され得るポリペプチドの特性を指す。例えば、以下の実施例に記載されるように、アルブミン結合親和性は、アルブミンまたはその断片が、機器のセンサーチップ上に固定化されており、試験されるべきポリペプチドを含有するサンプルがチップ上を通過する実験において試験され得る。あるいは、試験されるべきポリペプチドが、機器のセンサーチップ上に固定化されており、アルブミンまたはその断片を含有するサンプルがチップ上を通過する。アルブミンは、この関連では、ヒト血清アルブミンなどの哺乳類に由来する血清アルブミンであり得る。当業者ならば、このような実験によって得られた結果を解釈して、アルブミンに対するポリペプチドの結合親和性の少なくとも定性的測定を確立し得る。定量的測定が望まれる場合には、例えば、相互作用のＫ_Ｄ値を調べるために、表面プラズモン共鳴法を使用してもよい。結合値は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において定義され得る。アルブミンは、適宜、測定のセンサーチップ上に固定化されており、その親和性が調べられるポリペプチドのサンプルは、段階希釈によって調製され、注入される。次いで、例えば、機器製造業者（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって提供されたＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ソフトウェアの１：１ラングミュア結合モデルを使用して、結果からＫ_Ｄ値が算出され得る。

【0085】

一実施形態では、この態様のアルブミン結合ポリペプチドは、相互作用のｋ_ｏｆｆ値が、最大で５×１０^−５ｓ^−１、例えば、最大で５×１０^−６ｓ^−１であるようにアルブミンと結合する。

【0086】

別の実施形態では、アルブミン結合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３０１〜４５２、配列番号４５５〜４６３および配列番号５００〜５９３のいずれか１種から選択される。さらに詳しくは、アミノ酸配列は、配列番号３０４〜３０５、配列番号３０７〜３０８、配列番号３１０〜３１１、配列番号３１３〜３１４、配列番号３１６〜３１７、配列番号３１９〜３２０、配列番号３２２〜３２３、配列番号３２５〜３２６、配列番号３２８〜３２９、配列番号３３１〜３３２、配列番号３３４〜３３５、配列番号３３７〜３３８、配列番号３４１〜３４２および配列番号３４９〜３５０から選択される。

【0087】

一実施形態では、この態様のアルブミン結合ポリペプチドは、（ｉ）または（ｉｉｉ）において定義される配列のＮ末端および／またはＣ末端に位置する１個または複数のさらなるアミノ酸残基をさらに含む。これらのさらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドによるアルブミンの結合の増強およびフォールディングされたアルブミン結合ドメインのコンホメーション的安定性の改善において役割を果たし得るが、例えば、ポリペプチドの製造、精製、インビボまたはインビトロでの安定化、カップリング、標識または検出のうち１つまたは複数ならびにそれらの任意の組合せと関連するその他の目的に等しく十分に役立ち得る。このようなさらなるアミノ酸残基は、化学的カップリングの目的のために、例えば、ＨＤ１に付加された１個または複数のアミノ酸残基を含み得る。

【0088】

したがって、一実施形態では、アミノ酸配列（ｉ）または（ｉｉｉ）のＮまたはＣ末端のαヘリックスの直前または直後のアミノ酸は、コンホメーションの安定性に影響を及ぼし得る。コンホメーションの安定性の改善に寄与し得るアミノ酸残基の一例として、上記で定義されるアミノ酸配列（ｉ）または（ｉｉｉ）のＮ末端に位置するセリン残基がある。Ｎ末端セリン残基は、いくつかの場合には、セリン側鎖のγ酸素とグルタミン酸残基のポリペプチド主鎖ＮＨの間に水素結合を含むことによって基準のＳ−Ｘ−Ｘ−Ｅキャッピングボックスを形成し得る。このＮ末端キャッピングは、本開示内容の第１の態様のアルブミン結合ポリペプチドを構成する３ヘリックスドメインの第１のαヘリックスの安定化に寄与し得る。

【0089】

したがって、一実施形態では、さらなるアミノ酸は、ポリペプチドのＮ末端に少なくとも１個のセリン残基を含む。言い換えれば、１個または複数のセリン残基がアミノ酸配列に先行する。アルブミン結合ポリペプチドの別の実施形態では、さらなるアミノ酸は、ポリペプチドのＮ末端にグリシン残基を含む。１、２、３、４または任意の適した数のアミノ酸残基がアミノ酸配列（ｉ）または（ｉｉｉ）に先行し得るということが理解される。したがって、単一のセリン残基、単一のグリシン残基またはグリシン−セリン（ＧＳ）組合せもしくはグリシン−セリン−セリン（ＧＳＳ）組合せなどの２種の組合せがアミノ酸配列に先行し得る。Ｎ末端にさらなるアミノ残基を含むアルブミン結合ポリペプチドの例は、配列番号４４５〜４６３に、例えば、配列番号４４５〜４４８および配列番号４６２〜４６３に示されている。さらに別の実施形態では、さらなるアミノ酸残基は、配列式（ｉ）または（ｉｉｉ）によって定義されるようなポリペプチドのＮ末端にグルタミン酸を含む。

【0090】

同様に、Ｃ末端キャッピングは、アルブミン結合ポリペプチドを構成する３ヘリックスドメインの第３のαヘリックスの安定性を改善するために利用され得る。（ｉ）または（ｉｉｉ）において定義されるアミノ酸配列のＣ末端に存在するＣ末端プロリン残基は、少なくとも部分的に、キャッピング残基として機能し得る。Ｃ末端のプロリン残基の後ろのリシン残基は、リシン残基のεアミノ基とポリペプチド主鎖中のリシンの２および３残基前に位置するアミノ酸のカルボニル基、例えば、（ｉ）または（ｉｉｉ）において定義されるアミノ酸配列のロイシンおよびアラニン残基のカルボニル基の間に水素結合を形成することによって、アルブミン結合ポリペプチドの第３のヘリックスのさらなる安定化に寄与し得る。したがって、一実施形態では、さらなるアミノ酸は、ポリペプチドのＣ末端にリシン残基を含む。

【0091】

上記で論じられたように、さらなるアミノ酸は、アルブミン結合ポリペプチドの製造と関連し得る。第１の態様のアルブミン結合ポリペプチドが化学的ペプチド合成によって製造される場合には、特に、Ｃ末端プロリンの後ろの１個または複数のオプショナルなアミノ酸残基が利点を提供し得る。このようなさらなるアミノ酸残基は、例えば、ジケトピペラジンなどの望ましくない物質の形成を、合成のジペプチド段階で防ぎ得る。このようなアミノ酸残基の一例として、グリシンがある。したがって、一実施形態では、さらなるアミノ酸は、上記で説明されるように、プロリン残基の直後またはさらなるリシンおよび／またはグリシン残基の後ろに、ポリペプチドのＣ末端にグリシン残基を含む。

【0092】

Ｃ末端にさらなるアミノ酸残基をさらに含むアルブミン結合ポリペプチドの例は、配列番号４４５〜４５２に、例えば、配列番号４４９〜４５０に示される。当業者ならば、異なる種類のペプチド合成のための予め作られたマトリックスによってＣ末端修飾を達成する方法を承知している。

【0093】

別の実施形態では、さらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドのＮおよび／またはＣ末端にシステイン残基を含む。このようなシステイン残基は、（ｉ）または（ｉｉｉ）において定義されるようなアミノ酸配列の直前および／もしくは直後にあってもよく、または上記のような任意のその他のさらなるアミノ酸残基の前および／もしくは後ろであってもよい。ポリペプチド鎖のＮおよび／またはＣ末端のシステイン残基を含むアルブミン結合ポリペプチドの例は、配列番号４４９〜４５０（Ｃ末端）および配列番号４５１〜４５２（Ｎ末端）に示されている。ポリペプチド鎖へのシステイン残基の付加によって、アルブミン結合ポリペプチドの部位指定コンジュゲーションのためのチオール基を得ることができる。あるいは、部位特異的コンジュゲーションを促進するために、セレノシステイン残基が、システイン残基の導入についてと同様の方法でポリペプチド鎖のＣ末端に導入されてもよい（Cheng et al, Nat Prot 1:2, 2006）。

【0094】

一実施形態では、アルブミン結合ポリペプチドは、２個以下のシステイン残基を含む。別の実施形態では、アルブミン結合ポリペプチドは、１個以下のシステイン残基を含む。

【0095】

別の実施形態では、アルブミン結合ポリペプチドのさらなるアミノ酸残基は、ヘキサヒスチジル（Ｈｉｓ_６）タグ、（配列番号３４）などのポリペプチドの精製または検出のための「タグ」またはタグに対して特異的であり、および／もしくは精製において使用される抗体との相互作用のための「ｍｙｃ」（「ｃ−Ｍｙｃ」）タグもしくは「ＦＬＡＧ」タグを含む。当業者ならばその他の代替物も承知している。

【0096】

アルブミン結合モチーフの存在のために、ＡＢＤペプチドは、最大で１×１０^−６Ｍ、いっそうより好ましくは、最大で１×１０^−９Ｍ（いっそうより密接な親和性）である相互作用のＫ値でアルブミンと結合する。より好ましくは、最大で１×１０^−１０Ｍである相互作用のＫ値、いっそうより好ましくは、最大で１×１０^−１１Ｍであり、なおいっそうより好ましくは、最大で１×１０^−１２Ｍであり、いっそうさらには、最大で１×１０^−１３Ｍである。

【0097】

本明細書に記載された活性ホルモンドメインペプチドとの融合に適した個々のアルブミン結合ドメインポリペプチドの配列は、Jonsson et al.（Id.）およびＷＯ０９／０１６０４３において示されたものよりも優れている。選択された化合物は、以下の表１に開示されている。ＰＣＴ公開出願第ＷＯ２０１２／００４３８４号も参照のこと。また、配列番号３０１〜４５２、配列番号４５４〜４６３および配列番号５００〜５９３から選択された配列に対して９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するアルブミン結合ポリペプチドも、本発明によって包含される。特定の実施形態では、アルブミン結合ポリペプチドの配列は、配列番号３１３、配列番号４４８、配列番号４６３、配列番号５００、配列番号５０１、配列番号５０２およびそれらに対して９５％以上の同一性を有する配列から選択される。本発明のその他の実施形態では、アルブミン結合ポリペプチドの配列は、配列番号４５４〜４６３およびそれらに対して９５％以上の同一性を有する配列から選択される。なおさらなる実施形態では、アルブミン結合ポリペプチドの配列は、配列番号５００〜５９３およびそれらに対して９５％以上の同一性を有する配列から選択される。

【0098】

例示的ＡＢＤ種として、それだけには限らないが、以下の表１および実施例において示される化合物が挙げられる。

【0099】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【0100】

好ましい操作されたポリペプチド実施形態では、ＡＢＤは、
LAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号３１３）、
および
SLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号５００）およびGSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP（配列番号４６３；ＰＥＰ０７９８６）を含めたそのＮ末端が伸長されたＡＢＤ配列形態を含む。位置２のセリンは、配列をキャップしており、この位置にグリシンまたはアラニンを有することと比較してＴｍをおよそ２℃上げている。

【0101】

Ｃｙｓ−コンジュゲーションが望ましい、好ましい操作されたポリペプチド実施形態では、好ましいＡＢＤは、
LAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALPG（配列番号５０１）および
SLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALPG（配列番号５０２）およびGSLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALPG（配列番号４４８；ＰＥＰ０８１８５）を含めたそのＮ末端が伸長されたＡＢＤ配列形態を含む。

【0102】

本明細書に記載された操作されたポリペプチドの一実施形態、特に、そのＣ末端がプロリンまたはペプチド合成の間にラセミ化することが知られているその他のアミノ酸で終わるものでは、Ｃ末端アミノ酸残基のラセミ化に関する可能性ある問題に対抗するためにＣ末端にグリシンが付加され得る。あるいは、Ｃ末端アミノ酸は、その（αアミノ基）アミド化形態にあり得る、例えば、グリシンで終わるよりもむしろ、プロリンに対してプロリンアミド。しかし、アミド化ポリペプチドは、化学合成よりも組換えによって製造されることが望ましく、次いで、Ｃ末端アミノ酸のアミド化が、当技術分野で公知のいくつかの方法、例えば、アミド化ＰＡＭ酵素の使用によって実施され得る。

【0103】

本明細書においてＡＢＤは、完全に可逆的にフォールディングする、すなわち、それらは、変性され得、所望の活性三次構造に自発的に再フォールディングする。これは、２０℃でとられたスペクトル（フォールディングされた状態）および９０℃に加熱した後にとられた第２のスペクトル（加熱変性）２０℃に戻った後にとられた第３のスペクトル（再フォールディングされた状態）を比較する、例えば、ＡＢＤ配列番号４６３の円偏光二色性スペクトル分析によって評価された。この手順の間に、Ｔｍを求めることができる。

【0104】

操作されたポリペプチドの別の態様は、ＡＢＤが、難溶性または低溶解性レプチン変異体の水溶液における溶解性の増大を提供し得るということである。この特性は、ＡＢＤ自体によってか、またはその会合が水溶液における操作されたポリペプチドの溶解度を高める、インビボもしくはインビトロで高度に可溶性のアルブミンと結合している操作されたポリペプチドの結果として生じる複合体のために付与され得る。したがって、このさらなる態様の実施形態では、本明細書に記載された融合タンパク質またはコンジュゲートとしてアルブミン結合ドメインと共有結合によってカップリングしている、それ自体、１ｍｇ／ｍｌ以下または２ｍｇ／／ｍｌ以下または５ｇ／ｍｌ以下の水における溶解度を有するレプチンまたはレプチン類似体化合物を含む組成物が提供され、これでは、化合物およびアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートは、共有結合によってカップリングしており、操作されたポリペプチドの溶解度は、融合していない（またはコンジュゲートしていない）天然レプチンまたはレプチン類似体化合物のものよりも高い。

【0105】

アルブミンとの結合。血清アルブミンは、哺乳類血清中に最も豊富にあるタンパク質であり（４０ｇ／Ｌ；ヒトでは、およそ０．７ｍＭ）、ここでは、それは、それだけには限らないが、脂質およびビリルビンを含めたさまざまな分子と結合する（Peters T, 1985, Advances in Protein Chemistry 37:161）。血清アルブミンの半減期は、動物の大きさに正比例し、これでは、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、１９日の半減期を有し、ウサギ血清アルブミンは、約５日の半減期を有するということが観察されてきた（McCurdy TR et al., J. Lab. Clin. Med. 143:115,2004）。ヒト血清アルブミンは、体中に広く、特に、腸および血液の区画において分布しており、ここでは、主に、浸透圧の維持に関与している。構造的に、アルブミンは、３つの相同なドメインを含み、合計５８４または５８５個のアミノ酸になる一本鎖タンパク質である（Dugaiczyk L et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:71）。アルブミンは、１７のジスルフィド橋および単一の反応性チオール、Ｃ３４を含有するが、Ｎ結合型およびＯ結合型炭水化物部分を欠く（Peters, 1985, Id.;Nicholson JP et al., 2000, Br J Anaesth 85:599）。グリコシル化がないことは、アルブミンの組換え発現を単純化する。アルブミンのこの特性は、その三次構造が知られているという事実と一緒になって（He, XM and Carter, DC, Nature 358:209 1992）、それを組換え融合タンパク質において使用するための魅力的な候補にしている。このような融合タンパク質は、一般に、単一ポリペプチド鎖において、治療用タンパク質（タンパク質それ自体の投与の際に身体から迅速に排除される）と血漿タンパク質（天然の遅いクリアランスを示す）を組み合わせる。例えば、Sheffield WP, 2001, Curr. Drug Targets Cardiovacs. Haematol. Disord. 1:1を参照のこと）。このようなタンパク質は、あまり頻繁な注射を必要としないという点およびインビボにおけるより高いレベルの治療用タンパク質において臨床的有用性を提供し得る。しかし、本明細書における操作されたポリペプチドは、アルブミンとコンジュゲートしていないが、代わりに、アルブミンとの非共有結合を可能にするモチーフを含有する。

【0106】

アルブミン半減期。種々の種におけるアルブミンの半減期は、一般に、動物体重に基づいた相対成長率に忠実であると観察されている。例えば、マウス、ラット、ウサギおよびヒトにおけるアルブミン半減期は、それぞれ、１、１．９、５．６および１９日と推定されている。実際、累乗フィッティング解析（Davies & Morris, 1993, Pharm. Res. (N.Y.) 10:1093-1095）は、以下の方程式を提供する：
アルブミン半減期（日）＝３．７５＊体重（ｋｇ）^{０．３６８}。

【0107】

さらなる実施形態。本明細書に開示された各ポリペプチドはまた、（適宜）その天然に生じる第１のアミノ酸とインフレームでＮ末端にメチオニンを含むよう考慮されるということは理解される。例えば、メトレレプチン（レプチンＡ１００）は、配列番号２０に開示されるように、Ｎ末端メチオニンが付加された成熟ヒトレプチンからなる。同様に、メチオニン残基は、本明細書を通じて開示されるアミノ酸配列および式のいずれかのＮ末端に含まれ得る。本明細書に示された操作されたポリペプチド配列中にＣ末端Ｇｌｙが現れる場合には、その残基は、その後のアミド化の間に失われ得るということがさらに理解される。

【0108】

いくつかの実施形態では、レプチン、レプチン類似体、レプチン活性断片またはレプチン誘導体は、親レプチンに対して少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはさらにより高い配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、親レプチンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７または配列番号６８０に示されるレプチンである。したがって、いくつかの実施形態では、レプチン、レプチン類似体、レプチン活性断片またはレプチン誘導体は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、および配列番号２３からなる群から選択される任意のレプチンに対して少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはさらにより高い配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、レプチン、レプチン類似体、レプチン活性断片またはレプチン誘導体は、配列番号２０に示されるレプチンに対して少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはさらにより高い配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、レプチン、レプチン類似体、レプチン活性断片またはレプチン誘導体は、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８または配列番号２９からなる群から選択される任意のレプチンに対して、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはさらにより高い配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、レプチン類似体は、配列番号２０に示されるレプチンに対して、少なくとも９０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、レプチン類似体は、配列番号１、配列番号２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７または配列番号６８０に示されるレプチンに対して、少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、レプチン類似体は、配列番号１、配列番号２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７または配列番号６８０に示されるレプチンに対して、少なくとも９０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、レプチン類似体は、配列番号１４または配列番号１５に示されるレプチンに対して、少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、レプチン類似体は、配列番号１４または配列番号１５に示されるレプチンに対して、少なくとも９０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、レプチン類似体は、配列番号３２に示されるレプチンに対して、少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、レプチン類似体は、配列番号３２に示されるレプチンに対して、少なくとも９０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、レプチン類似体は、配列番号３３に示されるレプチンに対して、少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、レプチン類似体は、配列番号３３に示されるレプチンに対して、少なくとも９０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、レプチン類似体は、配列番号１０または配列番号１１に示されるレプチンに対して、少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、レプチン類似体は、配列番号１０または配列番号１１に示されるレプチンに対して、少なくとも９０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、レプチン類似体は、配列番号１２または配列番号１３に示されるレプチンに対して、少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、レプチン類似体は、配列番号１２または配列番号１３に示されるレプチンに対して、少なくとも９０％の配列同一性を有し得る。さらに、レプチンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるレプチンの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはさらに２１個のアミノ酸が、保存的アミノ酸または非保存的アミノ酸などの別のアミノ酸で置換されているか、そうでなければ、変更されている本発明に従って設計、調製および使用され得る。当技術分野で通例のように、用語「保存的」とは、アミノ酸置換との関連において、荷電の種類（例えば、アニオン性、カチオン性、中性、極性など）、疎水性もしくは親水性、バルク（例えば、ファンデルワールス接触など）および／または官能性（例えば、ヒドロキシ、アミン、スルフヒドリル（ｓｕｌｈｙｄｒｙｌ）など）の特性を維持する置換を指す。

【0109】

さらに、当技術分野で理解されるように、例えば、本明細書に開示されたものなどのマウスレプチン、ラットレプチン、ウシレプチン、ブタレプチンおよびアカゲザルレプチンは、ヒトレプチンに対して各々実質的に相同であり、特に、これらのレプチンの成熟型は、成熟レプチン、さらに、特に、タンパク質のＮ末端部分付近に対して実質的に相同である。成熟ヒトレプチン１型（配列番号１６）およびメトレレプチン（配列番号２０）などのこのようなレプチンの類似体は、対応する成熟マウス、ラット、ウシ、ブタまたはアカゲザルサルレプチン中で不一致であることが観察される場合には、このような配列中の１つまたは複数の位置のアミノ酸残基を置換、そうでなければ、変更することなどによって調製できる。例えば、成熟ヒトレプチン（例えば、配列番号２０）は、例えば、マウス、ラットおよびサルにおいて生物学的応答を誘発する）。例えば、ＷＯ９８／２８４２７、ＷＯ２００９／０６４２９８、ＵＳ２００７／００２０２８４、ＵＳ２００８／０２０７５１２およびMurakami et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Comm. 209: 944-952を参照のこと。ヒト成熟レプチンは、例えば、このような種において生物活性を有するので、１種または複数のこのような種から得たレプチンにおいて、対応する位置で不一致である位置の１個または複数のアミノ酸が、このような対応する不一致の位置のアミノ酸で置換されているレプチンが、設計および調製され得る。

【0110】

例えば、第１のアミノ酸がバリンであり、位置１４６のアミノ酸がシステインである配列番号１６のヒト成熟レプチンタンパク質を使用して、配列番号１４３中の対応する位置で見られる対応するアミノ酸を有する位置３２、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７、８９、９７、１００、１０１、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５のアミノ酸のうちの１個または複数を、別のアミノ酸で置換して、本発明に従う操作されたポリペプチドを設計、調製および使用してもよい。さらに、保存的アミノ酸または非保存的アミノ酸などの別のアミノ酸を、例えば、配列番号１６の位置３２、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７、８９、９７、１００、１０１、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５のうちの１つまたは複数に置換して、本発明に従う操作されたポリペプチドを設計、調製および使用してもよい。

【0111】

成熟ラットレプチンタンパク質配列（配列番号１２）に基づいたさらなるレプチンをさらに調製してもよい。参照によりその全文が、すべての目的のために本明細書に組み込まれる、例えば、ＷＯ９８／２８４２７、ＵＳ２００７／００２０２８４およびMurakami et al., 1995, Id.を参照のこと。成熟ラットレプチンは、以下の位置４、３２、３３、３５、５０、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０１、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８および１４５で成熟ヒトレプチン１型（配列番号１６）とは異なる。したがって、配列番号１６中のこのような位置のうち１つまたは複数で、成熟ラットレプチン（配列番号１２）中に見られる対応する位置に見られるアミノ酸を置換して、本発明に従う操作されたポリペプチドを設計、調製および使用してもよい。さらに、保存的アミノ酸または非保存的アミノ酸などの別のアミノ酸を、例えば、配列番号１６の位置４、３２、３３、３５、５０、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０１、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８および１４５のうち１つまたは複数に置換して、本発明に従う操作されたポリペプチドを設計、調製および使用してもよい。

【0112】

成熟ヒトレプチン１型（配列番号１６）とは不一致である、成熟ラットレプチン（配列番号１２）および成熟マウスレプチン１型（配列番号１４３）の両方に由来する位置は、４、３２、３３、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５である。したがって、配列番号１６中のこのような位置のうちの１つまたは複数で、成熟ラットレプチン配列（配列番号１２）または成熟マウス１型配列（配列番号１４３）中に見られる対応する位置に見られるアミノ酸を置換して、本発明に従う操作されたポリペプチドを設計、調製および使用してもよい。さらに、保存的アミノ酸または非保存的アミノ酸などの別のアミノ酸を、位置４、３２、３３、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５のうち１つまたは複数に置換して、本発明に従う操作されたポリペプチドを設計、調製および使用してもよい。

【0113】

さらに、成熟ヒトレプチン１型（配列番号１６）とは不一致であるアカゲザル成熟レプチン（配列番号１０）に見られるアミノ酸は（一文字アミノ酸略語でアミノ酸残基が括弧内に記載されている）、８（Ｓ）、３５（Ｒ）、４８（Ｖ）、５３（Ｑ）、６０（Ｉ）、６６（Ｉ）、６７（Ｎ）、６８（（Ｌ）、８９（Ｌ）、１００（Ｌ）、１０８（Ｅ）、１１２（Ｄ）および１１８（Ｌ）である。ヒト成熟レプチンは、サルの生物学的応答を誘発するので、括弧内のアミノ酸などの別のアミノ酸で置換されたアカゲザルサル不一致アミノ酸のうちの１個または複数を有する成熟ヒトレプチン１型（配列番号１６）などのレプチンを、本発明に従う操作されたポリペプチドの設計、調製および使用に用いてもよい。特定のアカゲザル不一致アミノ酸はまた、例えば、上記の成熟マウスレプチン１型（位置３５、６８、８９、１００および１１２）に見られるものであるということは留意されなければならない。したがって、例えば、成熟ヒトレプチン１型（配列番号１６）の位置４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の１個または複数のアミノ酸が、マウスまたはアカゲザルレプチン（例えば、配列番号１４３および／または配列番号１０）中のこのような位置の対応するアミノ酸によって置換されているレプチンを調製してもよい。

【0114】

このようなレプチンアミノ酸配列が、生物学的応答を誘発し得るという条件で、レプチンアミノ酸配列の一部を欠失させることによって、その他のレプチンを調製してもよい。このようなレプチンアミノ酸配列は、レプチン活性断片である。例えば、成熟マウスレプチン、成熟アカゲザルレプチン、成熟ヒトレプチンおよび成熟ラットレプチンおよびその他のレプチンはすべて、プロセシングされていない、このようなレプチンの全長型中に存在するＮ末端の２１個のアミノ酸シグナル配列を欠く。

【0115】

このような成熟レプチンの以下の活性レプチン断片を調製してもよい：
（ａ）アミノ酸９８〜１４６
（ｂ）アミノ酸１〜３２
（ｃ）アミノ酸４０〜１１６
（ｄ）アミノ酸１〜９９および（接続された）１１２〜１４６
（ｅ）アミノ酸９９と１１２の間に位置するアミノ酸１００〜１１１のうちの１個または複数を有するアミノ酸１〜９９および（接続された）１１２〜１４６。

【0116】

さらに、例えば、成熟ヒトレプチン１型中の位置のアミノ酸の１個または複数が、例えば、上記で開示されたラット、マウス、サル、ブタおよび／またはウシ成熟レプチン中に見られる対応する位置に見られるアミノ酸で置換されている、このような活性レプチン断片を調製してもよい。さらに、任意の置換または変更が、ペプチドミメティックまたはＤ−アミノ酸などの変更されたアミノ酸の形態であり得る。

【0117】

さらに、本発明は、レプチン、レプチン類似体、レプチン活性断片またはレプチン誘導体が
（ａ）異なるアミノ酸が、以下の位置：４、３２、３３、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５のうち１つまたは複数で置換されており、同じ番号付けを保持する（位置２８にグルタミニル残基がない場合であっても）、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、および配列番号６７７からなる群から選択されるレプチンのアミノ酸配列１〜１４６；
（ｂ）位置２８のグルタミニル残基が存在しない下位区分（ａ）のアミノ酸配列；
（ｃ）メチオニル残基が、Ｎ末端に付加されている下位区分（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列；
（ｄ）（ｉ）アミノ酸９８〜１４６；
（ｉｉ）アミノ酸１〜３２；
（ｉｉｉ）アミノ酸４０〜１１６；
（ｉｖ）アミノ酸１〜９９および１１２〜１４６；
（ｖ）アミノ酸１００〜１１１のうち１個または複数が、アミノ酸９９から１１２の間に入っている、アミノ酸１〜９９および１１２〜１４６；ならびに
（ｖｉ）アミノ酸１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５のうち１個または複数が、別のアミノ酸で置換されている、下位区分（ｉ）のアミノ酸配列；
（ｖｉｉ）アミノ酸４、８および３２のうち１個または複数が、別のアミノ酸で置換されている、下位区分（ｉｉ）のアミノ酸配列；
（ｖｉｉｉ）アミノ酸５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１および１１２のうち１個または複数が、別のアミノ酸で置換されている、下位区分（ｉｉｉ）のアミノ酸配列；
（ｉｘ）アミノ酸４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５のうち１個または複数が、別のアミノ酸で置換されている、下位区分（ｉｖ）のアミノ酸配列；ならびに
（ｘ）アミノ酸４、３２、３３、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５のうち１個または複数が、別のアミノ酸で置換されている、下位区分（ｖ）のアミノ酸配列；
（ｘｉ）Ｎ末端にメチオニンが付加されている、下位区分（ｉ）〜（ｘ）のいずれかのレプチン、
（ｅ）化学部分が付いている、下位区分（ａ）から（ｅ）のいずれかのレプチン、
（ｆ）前記化学部分が水溶性ポリマー部分である、下位区分（ｇ）のレプチン、
（ｇ）前記水溶性ポリマー部分がポリエチレングリコールである、下位区分（ｆ）のレプチン、
（ｈ）前記水溶性ポリマー部分がポリアミノ酸部分である、下位区分（ｆ）のレプチン、および
（ｉ）前記部分が前記タンパク質部分のＮ末端のみに付いている、下位区分（ｅ）から（ｈ）のいずれか１種のレプチン
から選択される、上記のようなレプチン、レプチン類似体、レプチン活性断片またはレプチン誘導体を含む操作されたポリペプチドを包含する。

【0118】

上記に関しては、化学部分が付いているレプチンは、レプチン誘導体である。１種または複数の化学部分を付けることによるレプチンの誘導体化は、治療用タンパク質の安定性および循環時間の増大ならびに免疫原性および例えば、中和抗体が生じる傾向および／または注射部位反応の発生率の低減など、特定の状況下でいくつかの利点を提供することがわかっている。例えば、ＷＯ９８／２８４２７、ＵＳ２００７／００２０２８４、１９７９年１２月１８日に発行された米国特許第４，１７９，３３７号、Davis et al.を参照のこと。概説については、Abuchowski et al., in ENZYME AS DRUGS.[J. S. Holcerberg and J. Roberts, eds. pp. 367-383 (1981)]; Francis et al. Id.を参照のこと。したがって、誘導体化レプチンおよびＡＢＭまたはＡＢＤを使用する場合には、両実体によって提供される利点を有する本発明の操作されたポリペプチドを作製することが有利であり得る。

【0119】

レプチン誘導体は、そのアミノ酸側鎖、α−炭素原子、末端アミノ基または末端カルボン酸基のうちの１つまたは複数の化学修飾がなされているレプチンを構成し得る。化学修飾として、それだけには限らないが、１つまたは複数の化学部分を付けること、新規結合を作製することおよび１つまたは複数の化学部分を除去することが挙げられる。アミノ酸側鎖の修飾として、制限するものではないが、アルキル化、アシル化、エステル形成、アミド形成、マレイミドカップリング、リシンε−アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジンまたはリシンのＮ−アルキル化、グルタミン酸またはアスパラギン酸カルボン酸基のアルキル化およびグルタミンまたはアスパラギンの脱アミド化が挙げられる。末端アミノの修飾として、制限するものではないが、デスアミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ−低級アルキルおよびＮ−アシル修飾が挙げられる。末端アミノの修飾として、制限するものではないが、アルキルアシル、分岐アルキルアシル、アルキルアリール−アシルなどの、デスアミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ−低級アルキルおよびＮ−アシル修飾が挙げられる。末端カルボキシ基の修飾として、制限するものではないが、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド、アリールアミド、アルキルアリールアミドおよび低級アルキルエステル修飾が挙げられる。低級アルキルは、Ｃ_１−Ｃ_４アルキルである。さらに、１個もしくは複数の側鎖または末端基が、合成化学の当業者に公知の保護基によって保護されてもよい。アミノ酸のα−炭素は、一メチル化または二メチル化されてもよい。

【0120】

このような誘導体として、ポリ−ｈｉｓ、ポリ−ａｒｇ、ポリ−ｌｙｓおよびポリ−ａｌａなどのポリアミノ酸の付加によって、または短いアルキルおよび制限されたアルキル（例えば、分岐、環状、融合、アダマンチル）および芳香族基を含む小分子置換基の付加によって、１つまたは複数の、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）などの水溶性ポリマー分子または種々の長さの脂肪酸鎖（例えば、ステアリル、パルミトイル、オクタノイル）とコンジュゲートしているレプチンが挙げられる。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマー分子は、約５００ダルトン〜約６０，０００ダルトンの範囲の分子量を有することとなる。

【0121】

このようなポリマー−コンジュゲーションは、Ｎ−もしくはＣ−末端で、または本明細書に開示されたレプチンの配列内のアミノ酸残基の側鎖で単独で起こり得る。あるいは、このようなレプチンのアミノ酸配列に沿って複数の部位の誘導体化があり得る。１種または複数のアミノ酸の、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステインでの置換は、誘導体化のためのさらなる部位を提供し得る。例えば、米国特許第５，８２４，７８４号および同５，８２４，７７８号を参照のこと。いくつかの実施形態では、レプチンは、１つ、２つまたは３つのポリマー分子とコンジュゲートされ得る。

【0122】

いくつかの実施形態では、水溶性ポリマー分子は、アミノ、カルボキシルまたはチオール基と連結され、ＮもしくはＣ末端によって、またはリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸もしくはシステインの側鎖で連結され得る。あるいは、水溶性ポリマー分子は、ジアミンおよびジカルボキシル基と連結され得る。いくつかの実施形態では、レプチンは、リシンアミノ酸上のεアミノ基によって１個、２個または３個のＰＥＧ分子とコンジュゲートされる。

【0123】

レプチン誘導体としてまた、１個または複数のアミノ酸残基への化学変化を有するレプチンが挙げられる。このような化学変化として、アミド化、グリコシル化、アシル化、硫酸化、リン酸化、アセチル化および環化が挙げられる。化学変化は、Ｎ−もしくはＣ−末端で、またはレプチンの配列内のアミノ酸残基の側鎖で単独で起こり得る。一実施形態では、これらのペプチドのＣ−末端は、遊離−ＯＨまたは−ＮＨ_２基を有し得る。別の実施形態では、Ｎ末端は、イソブチルオキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、ｎ−ブチルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、イソカプロイル基（「ｉｓｏｃａｐ」）、オクタニル基、オクチルグリシン基（「Ｇ（Ｏｃｔ）」または「ｏｃｔｙｌＧｌｙ」と表される）、８−アミノオクタン酸基、ダンシルおよび／またはＦｍｏｃ基を用いてキャップされ得る。いくつかの実施形態では、環化は、ジスルフィド橋の形成によるものであり得る。あるいは、レプチンアミノ酸配列に沿って複数の部位の化学変化があり得る。

【0124】

特定の実施形態では、レプチンは、ボルトン−ハンター基を含むよう化学的変化される。ボルトン−ハンター試薬は、当技術分野で公知であり（“Radioimmunoassay and related methods”, A. E. Bolton and W. M. Hunter, Chapter 26 of HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, VOLUME I, IMMUNOCHEMISTRY, edited by D. M. Weir, Blackwell Scientific Publications, 1986）、リシンのアミノ末端αアミノ基またはεアミノ基を介した中性結合を用いてチロシン様部分を導入するために使用され得る。いくつかの実施形態では、レプチンのＮ末端が、ボルトン−ハンター基で修飾される。いくつかの実施形態では、内部リシン残基が、ボルトン−ハンター基で修飾される。いくつかの実施形態では、レプチンアミノ酸配列に沿って複数の部位のボルトン−ハンター修飾があり得る。ポリペプチド修飾のために使用されるボルトン−ハンター試薬は、市販されており、それだけには限らないが、水溶性ボルトン−ハンター試薬、スルホスクシンイミジル−３−［４−ヒドロフェニル］プロピオネート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）およびボルトン−ハンター試薬−２、Ｎ−スクシンイミジル３−（４−ヒドロキシ−３−ヨードフェニル）プリオピオネート（Ｐｒｉｏｐｉｏｎａｔｅ）（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．、Ｊａｐａｎ、カタログ番号１９９−０９３４１）を挙げることができる。アミド結合によってレプチンとコンジュゲートしている例示的ボルトン−ハンター基を以下に例示し、配列中、破線は、アミド結合を通っている：

【0125】

【化1】

【0126】

レプチンは、ボルトン−ハンター修飾の前後でヨウ化され得る（^１２５Ｉで放射標識されるなど）。

【0127】

本発明に従って、操作されたポリペプチドを調製するために、このようなものの調製において使用するためのレプチン誘導体は、「非必須」アミノ酸残基の１つまたは複数の修飾を含み得る。本発明との関連で、「非必須」アミノ酸残基とは、レプチンの活性（例えば、アゴニスト活性）を無効にするか、または実質的に低減することなく、変更、例えば、誘導体化され得る残基である。本発明の操作されたポリペプチドは、レプチン部分の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のアミノ酸残基の誘導体化を含み得、これらのうち、１個または複数のアミノ酸残基が、非必須アミノ酸残基であり得る。さらに、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの活性を無効にするか、または実質的に低減することなく、レプチン部分の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のアミノ酸の付加を含むよう誘導体化され得る。さらに、このような非必須アミノ酸残基は、本明細書を通じて記載されるような誘導体化を受け入れられるアミノ酸残基で置換され得る。

【0128】

「アミノ酸」、「アミノ酸残基」などは、本明細書を通じて使用されるように、天然アミノ酸、非天然アミノ酸および修飾されたアミノ酸を指す。反対に記載されない限り、アミノ酸への任意の言及は、一般的に、または名称によって具体的に、その構造がこのような立体異性形を可能にする場合には、ＤおよびＬ立体異性体の両方への言及を含む。天然アミノ酸として、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）およびバリン（Ｖａｌ）が挙げられる。非天然アミノ酸として、それだけには限らないが、ホモリシン、ホモアルギニン、ホモセリン、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸（ａｍｉｎｏｉｓｂｕｔｙｒｉｃ）、２−アミノピメリン酸、ｔ−ブチルグリシン、２，４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリシン、アロ−ヒドロキシリシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシン、Ｎ−メチルバリン、ナフトアラニン（ｎａｐｈｔｈａｌａｎｉｎｅ）、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸およびチオプロリンが挙げられる。さらなる非天然アミノ酸として、可逆的にか、もしくは不可逆的に、化学的にブロックされているか、または例えば、側鎖官能基が別の官能基に化学的に修飾されているＮ−メチル化ＤおよびＬアミノ酸または残基のような、Ｎ末端アミノ基またはその側鎖基で、化学的に修飾されている修飾されたアミノ酸残基が挙げられる。例えば、修飾されたアミノ酸として、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、アスパラギン酸−（β−メチルエステル）、アスパラギン酸の修飾されたアミノ酸、Ｎ−エチルグリシン、グリシンの修飾されたアミノ酸またはアラニンカルボキサミド、アラニンの修飾されたアミノ酸が挙げられる。組み込まれ得るさらなる残基は、Sandberg et al., J. Med. Chem. 41: 2481-91, 1998に記載されている。

【0129】

上記で記載したように、レプチンおよびその他のポリペプチドのこのような誘導体化に適した化学部分として、例えば、種々の水溶性ポリマーがある。好ましくは、最終産物製剤の治療的使用のためには、ポリマーは、医薬上許容されるものとなる。当業者ならば、ポリマー／タンパク質コンジュゲートが、治療的に使用されるかどうか、そのような場合には、所望の投与量、循環時間、タンパク質分解に対する抵抗性といった考慮およびその他の考慮に基づいて所望のポリマーを選択できるであろう。操作されたポリペプチドおよびレプチンについて、誘導体化の有効性は、所望の形態で（すなわち、浸透圧ポンプによって、またはより好ましくは、注射または注入によって、または例えば、経口、肺もしくは鼻腔デリバリー用にさら製剤されて）、誘導体化されたレプチンまたは誘導体化された操作されたポリペプチドを投与することならびに本明細書に記載された生物学的効果および生物学的応答を観察することによって確認され得る。

【0130】

このような水溶性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群から選択され得る。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために製造において利点を有し得る。また、コハク酸塩、スチレンおよびヒドロキシエチルデンプンも使用され得る。

【0131】

本発明に従う操作されたポリペプチドの設計および調製において使用されるレプチン誘導体は、レプチン部分にポリアミノ酸または分岐点アミノ酸を付けることによって調製され得る。例えば、ポリアミノ酸は、ＡＢＭまたはＡＢＤを付けることによって達成される利点に加えて、レプチンまたは操作されたポリペプチドの循環半減期を増大するようにも働き得るＦｃ部分などのさらなる担体タンパク質であり得る。さらに、このようなポリアミノ酸は、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）、さらなる抗体またはその一部（例えば、Ｆｃ領域）またはその他のポリアミノ酸、例えば、ポリリシンからなる群から選択され得る。以下に示されるように、ポリアミノ酸を付ける位置は、レプチン部分のＮ末端またはＣ末端または間のその他の場所であり得、また、ペプチド性リンカーまたは非ペプチド性リンカーなどの化学的「リンカー」部分によってレプチンに接続され得る。

【0132】

ポリマーは、任意の分子量のものであり得、分岐していても、分岐していなくてもよい。ポリエチレングリコールについて、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造の容易性のために、約２キロダルトン（ｋＤａ）から約１００ｋＤａの間である（用語「約」とは、ポリエチレングリコールの調製物において、いくつかの分子が、提示された分子量を上回る重量となるか、または幾分か少ない重量となることを示す）。特定の実施形態では、ポリエチレングリコールは、約２ｋＤａから約６０ｋＤａの間である。特定の実施形態では、ポリエチレングリコールは、約２ｋＤａから約４０ｋＤａの間である。特定の実施形態では、ポリエチレングリコールは、約５ｋＤａから約４０ｋＤａの間である。特定の実施形態では、ポリエチレングリコールは、約１０ｋＤａから約４０ｋＤａの間である。特定の実施形態では、ポリエチレングリコールは、約５ｋＤａから約３０ｋＤａの間である。特定の実施形態では、ポリエチレングリコールは、約５ｋＤａから約２０ｋＤａの間である。特定の実施形態では、ポリエチレングリコールは、約１０ｋＤａから約２０ｋＤａの間である。所望の治療プロフィール（例えば、所望の持続放出期間、溶解度特徴、あるとすれば、生物活性に対する効果、取り扱いの容易性、レプチンおよび／または本発明の操作されたポリペプチドに付いているポリエチレングリコールの抗原性およびその他の公知の効果の程度または欠如）に応じて、その他の大きさも使用され得る。本発明に従ってレプチンに付けられてレプチン誘導体を生じ得る特定の分子量のＰＥＧの選択に影響を及ぼし得るさらなる考慮は、このような分子量のＰＥＧが、医薬上許容される組成物もしくは製剤中に存在する場合に、または対象への投与（注射などによる）の際に生理学的流体もしくは組織に曝露される場合に、凝集を軽減し得る、および／またはレプチンおよび／または操作されたポリペプチドの溶解度を高め得る；注射による対象への投与の際に、レプチンもしくは操作されたポリペプチドの投与によって引き起こされる注射部位反応の発生率を軽減し得る；対象へのこのようなレプチンもしくは操作されたポリペプチドの投与の結果として、レプチンもしくは操作されたポリペプチドに対して産生され得る中和抗体の生成を軽減し得る程度などを含む。

【0133】

そのように付けられるポリマー分子の数は、変わる場合があり、当業者ならば、機能に対する結果として得られる効果を確認できるであろう。モノ誘導体化し得るか、または同一もしくは異なる化学部分（例えば、ポリマー、種々の重量のポリエチレングリコールなど）を有する、ジ−、トリ−、テトラ−誘導体化またはいくつかの組合せの誘導体化を提供し得る。誘導体化されるレプチン分子または操作されたポリペプチド分子に対するポリマー分子の割合は、反応混合物中のその濃度と同様に変わる。一般に、最適比は、過剰の未反応のレプチン（または場合によっては操作されたポリペプチド）またはポリマーがない反応の効率の点で、所望の程度の誘導体化（例えば、モノ、ジ−、トリ−など）、選択されたポリマーの分子量、ポリマーが分岐しているか、分岐していないか、および反応条件などの因子によって決定される。

【0134】

化学部分は、レプチンおよび／または操作されたポリペプチドの機能ドメインまたは抗原ドメインに対する効果を考慮してレプチンおよび／または操作されたポリペプチドに付けるべきである。当業者に利用可能ないくつかの取付け方法がある。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＥＰ０４０１３８４（Ｇ−ＣＳＦとＰＥＧをカップリングする）、Malik et al., 1992, Exp. Hematol. 20:1028-1035（塩化トレシルを使用するＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告する）も参照のこと。例えば、ポリエチレングリコールは、遊離アミノまたはカルボキシル基などの反応性基を介してアミノ酸残基によって共有結合によって結合され得る。反応性基とは、活性化ポリエチレングリコール分子が結合され得るものである。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基は、リシン残基およびＮ末端アミノ酸残基を含み得る。遊離カルボキシル基を有するものとして、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびＣ末端アミノ酸残基を挙げることができる。スルフヒドリル基もまた、ポリエチレングリコール分子を付けるための反応性基として使用され得る。治療目的にとって好ましいのは、Ｎ末端またはリシン基での取付けなど、アミノ基での取付けである。受容体結合にとって重要である残基での取付けは、受容体結合が望まれる場合には避けられなければならない。

【0135】

特定の実施形態では、１〜３０個またはそれより少ないアミノ酸が、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択される。さらなる実施形態では、受容体結合が望まれる。

【0136】

具体的に、本発明の操作されたポリペプチドの調製において使用するためのＮ末端が化学修飾されたレプチンを設計および調製することを望むことができる。本組成物の例示としてポリエチレングリコールを使用して、さまざまなポリエチレングリコール分子（分子量、分岐などによって）から、レプチンまたは操作されたポリペプチド分子に対するポリエチレングリコール分子の割合、反応混合物中では、場合によっては、実施されるペグ化反応の種類および選択されたＮ末端がペグ化されたタンパク質を得る方法を選択することができる。Ｎ末端がペグ化された調製物を得る（すなわち、必要に応じて、この部分をその他のモノペグ化部分と分離する）方法は、ペグ化されたタンパク質分子の集団からのＮ末端がペグ化された物質の精製によってであり得る。選択的Ｎ末端化学修飾は、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な、異なる種類の第１級アミノ基の異なった反応性（リシン対Ｎ末端）を利用する還元的アルキル化によって達成され得る。適当な反応条件下で、カルボニル基含有ポリマーを用いるＮ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。例えば、リシン残基のεアミノ基とタンパク質のＮ末端残基のαアミノ基のものの間のｐＫ_ａの相違を利用することを可能にするｐＨで反応を実施することによって、タンパク質を選択的にＮ末端でペグ化できる。このような選択的誘導体化によって、タンパク質への水溶性ポリマーの取付けが制御され、ポリマーとのコンジュゲーションは、タンパク質のＮ末端でほとんどが起こり、リシン側鎖アミノ基などのその他の反応性基の大幅な修飾は起こらない。還元的アルキル化を使用することで、水溶性ポリマーは、上記の種類のものであり得、タンパク質とのカップリングのために単一の反応性アルデヒドを有さなくてはならない。単一の反応性アルデヒドを含有するポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドが使用され得る。

【0137】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドホルモンドメインを、ＡＢＤペプチドと共有結合によって連結するリンカー、例えば、本明細書に記載されたＬ１を有する化合物が提供される。いくつかの実施形態では、第１のリンカー（Ｌ１）は、操作されたポリペプチド内のＨＤ１を共有結合によって連結する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドホルモンドメイン（例えば、本明細書に記載されたＨＤ１））は、ペプチドリンカーを介してＡＢＤペプチドと共有結合によって連結され得る。任意のリンカーがオプショナルである；すなわち、任意のリンカーが単に結合であり得る。存在する場合には、リンカーは主にスペーサー機能を果たすので、その化学構造は重要なものではない。一実施形態では、リンカーは、ペプチド結合によって連結している１〜３０個またはそれより少ないアミノ酸を含む。アミノ酸は、２０種の天然に存在するアミノ酸から選択され得る。あるいは、非天然アミノ酸は、化学合成、翻訳後化学修飾によってか、または宿主細胞における組換え発現によるインビボ組込みのいずれかによって組み込まれ得る。これらのアミノ酸のうちいくつかは、グリコシル化され得る。

【0138】

特定の実施形態では、１〜３０個またはそれより少ないアミノ酸が、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択される。さらなる実施形態では、リンカーは、過半数の立体障害のないアミノ酸、例えば、グリシン、アラニンおよび／またはセリンで構成されている。ポリアラニン、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、ポリ（Ｇｌｙｎ−Ｓｅｒ）、ポリ（Ｇｌｙ_ｎ−Ｇｌｕ）、ポリ（Ｇｌｙ_ｎ−Ｌｙｓ）、ポリ（Ｇｌｙ_ｎ−Ａｓｐ）およびポリ（Ｇｌｙ_ｎ−Ａｒｇ）モチーフと同様に、ポリグリシンは、特に有用である、例えば、（Ｇｌｙ）_３、（Ｇｌｙ）_４（配列番号１１６）、（Ｇｌｙ）_５（配列番号１１７）。リンカーのその他の特定の例として、（Ｇｌｙ）_３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）_４（配列番号１１８）；（Ｇｌｙ）_３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）_２（配列番号１１９）；（Ｇｌｙ）_３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）_４（配列番号１２０）；およびＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号１２１）がある。ＧｌｙおよびＳｅｒの組合せと同様に、ＧｌｙおよびＡｌａの組合せは、特に有用である。したがって、さらなる実施形態では、ペプチドリンカーは、グリシンリッチペプチド、例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ；配列［Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］_ｎ（配列番号１２２）、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］_ｎ（配列番号１２３）、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］_ｎ（配列番号１２４）および［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］_ｎ（配列番号１２５）（配列中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である、例えば、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ Ｓｅｒ］_１（配列番号１４９）、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ Ｓｅｒ］_１（配列番号１５０）、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ Ｓｅｒ］_４（配列番号１５１）または［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ Ｓｅｒ］_３（配列番号１５２））からなる群から選択される。

【0139】

特定の実施形態では、荷電を有するリンカーが使用され得る。このような荷電リンカーは、相当な数の酸性残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕなど）を含有し得るか、または相当な数の塩基性残基（例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇなど）を含有し得、その結果、リンカーは、それぞれ、７より低いか、または７より大きいｐＩを有する。技術者には理解されるように、すべてのその他の事柄が等しいとして、所与のリンカー中の酸性または塩基性残基の相対量が多いほど、リンカーのｐＩは、それぞれ、より低く、またはより高くなる。このようなリンカーは、本明細書に開示された操作されたポリペプチドに、生理学的ｐＨ（例えば、境界も含めたｐＨ７．２からｐＨ７．６の間）またはこのようなポリペプチドを含む医薬組成物のｐＨなどの特定のｐＨでの、このようなポリペプチドの溶解度および／または安定性特徴の改善などの利点を付与し得る。

【0140】

例えば、「酸性リンカー」とは、７未満；境界も含めた６から７の間；境界も含めた５から６の間；境界も含めた４から５の間；境界も含めた３から４の間；境界も含めた２から３の間；または境界も含めた１から２の間のｐＩを有するリンカーである。同様に、「塩基性リンカー」とは、７より大きい；境界も含めた７から８の間；境界も含めた８から９の間；境界も含めた９から１０の間；境界も含めた１０から１１の間；境界も含めた１１から１２の間または境界も含めた１２から１３の間のｐＩを有するリンカーである。特定の実施形態では、酸性リンカーは、［Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］_ｎ（配列番号１２６）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］_ｎ（配列番号１２７）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］_ｎ（配列番号１２８）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］_ｎ（配列番号１２９）、［Ｇｌｙ−Ａｓｐ］_ｎ（配列番号１３０）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ］_ｎ（配列番号１３１）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ］_ｎ（配列番号１３２）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ］_ｎ（配列番号１３３）［配列中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上である；例えば、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］_６（配列番号１５３）］からなる群から選択される配列を含有する。特定の実施形態では、塩基性リンカーは、［Ｇｌｙ−Ｌｙｓ］_ｎ（配列番号１３４）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ］_ｎ（配列番号１３５）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ］_ｎ（配列番号１３６）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ］_ｎ（配列番号１３７）、［Ｇｌｙ−Ａｒｇ］_ｎ（配列番号１３８）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ］_ｎ（配列番号１３９）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ］_ｎ（配列番号１４０）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ］_ｎ（配列番号１４１）［配列中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上である；例えば、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ］_６（配列番号１５４）］からなる群から選択される配列を含有する。

【0141】

さらに、特定の構造的モチーフまたは特徴、例えば、αヘリックスを有するリンカーが、調製され得る。例えば、このようなリンカーは、［Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ］_ｎ（配列番号１４２）［配列中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上である；例えば、［Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ］_３（配列番号１５５）、［Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ］_４（配列番号１５６）または［Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ］_５（配列番号１５７）］からなる群から選択される配列を含有し得る。

【0142】

さらに、非ペプチド性リンカーは、本明細書に開示された操作されたポリペプチドのＬ１部分として働くよう使用され得る。例えば、当技術分野で理解されるように、ＰＥＧリンカーなどの例示的非ペプチドリンカーが、そのように使用され得る。例えば、ＷＯ２００００２４７８２を参照のこと。特定の実施形態では、このようなＰＥＧリンカーは、１００Ｄａ〜１０００ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態では、このようなＰＥＧリンカーは、１００Ｄａ〜５００ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態では、このようなＰＥＧリンカーは、１００Ｄａ〜１００ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態では、このようなＰＥＧリンカーは、１００Ｄａ〜５０ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態では、このようなＰＥＧリンカーは、１００Ｄａ〜１０ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態では、このようなＰＥＧリンカーは、１００Ｄａ〜５ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態では、このようなＰＥＧリンカーは、１００Ｄａ〜１ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態では、このようなＰＥＧリンカーは、１００Ｄａ〜５００Ｄａの分子量を有する。

【0143】

本発明に従う使用に適したリンカーは、上記の特徴およびモチーフのうちの１つまたは複数を有し得るということも理解される。例えば、リンカーは、酸性リンカーならびに構造的モチーフ、例えば、αヘリックスを含み得る。同様に、リンカーは、塩基性リンカーおよび構造的モチーフ、例えば、αヘリックスを含み得る。リンカーは、酸性リンカー、塩基性リンカーおよびαヘリックスなどの構造的モチーフを含み得る。さらに、本発明に従う操作されたポリペプチドは、２以上のリンカーを有することもあり、このような各リンカーは、上記の特徴のうち１以上を有し得るということも理解される。

【0144】

本明細書に記載されたリンカーは、例示的なものであり、本発明の範囲内のリンカーは、より長いものであり得、その他の残基を含み得る。一実施形態では、レプチン化合物が、リンカーを伴わずにＡＢＤと直接連結している操作されたポリペプチドは、明確に排除される。

【0145】

いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、Ｎ末端にＡＢＤを、Ｃ末端にＨＤ１を含む。反対に、いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、Ｃ末端にＡＢＤを、Ｎ末端にＨＤ１を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかが、レプチン、レプチン断片またはレプチン類似体である。好ましくは、ＡＢＤは、レプチン化合物のＮ末端にある。ＡＢＤおよびＨＤ１を含む実施形態に加えて、操作されたポリペプチドは、構造ＡＢＤ−ＨＤ１またはＨＤ１−ＡＢＤ（両方ともＮ末端からＣ末端配向に読まれる）を有し得る。

【0146】

本明細書に示された操作されたポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端の明確な指示がない場合には、操作されたポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端配向で読まれるということは理解される。例えば、ＨＤ１が、レプチンまたはその類似体である場合には、用語ＨＤ１−ＡＢＤ、ＨＤ１−Ｌ１−ＡＢＤ、ＨＤ１−ＡＢＤなどは、Ｎ末端および／またはＣ末端の明確な指示がない場合には、レプチン化合物が操作されたポリペプチドのＮ末端にあり、ＡＢＤがＣ末端にあることを意味する。反対に、Ｎ末端および／またはＣ末端が明確に指示される場合には、操作されたポリペプチドは、末端の明確な指示に従って読まれる。例えば、用語ＨＤ１_{Ｃ−ｔｅｒｍ}−ＡＢＤ、ＨＤ１−Ｌ１−ＡＢＤ_{Ｎ−ｔｅｒｍ}などは、ＡＢＤが操作されたポリペプチドのＮ末端にあり、ＨＤ１がＣ末端にあることを意味する。

【0147】

上記の操作されたポリペプチドのいくつかの実施形態では、ＨＤ１は、ヒトレプチンまたはメトレレプチンである。いくつかのさらなる実施形態では、ＨＤ１は、本明細書に記載されるようなレプチン類似体である。いくつかの実施形態では、レプチン類似体は、レプチンＡ１００、Ａ３００またはＡ５００である。

【0148】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、ＡＢＤポリペプチド単独、すなわち、コンジュゲートされたホルモンドメインがない場合の親和性とは異なる、血清アルブミンに対する親和性を有する。効果的な会合を得るために、操作されたポリペプチドは、解離定数Ｋ_Ｄが、例えば、約１０^−６Ｍ、１０^−７Ｍ、１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍ、１０^−１０Ｍ、１０^−１１Ｍ、１０^−１２Ｍ、１０^−１３Ｍ、１０^−１４Ｍまたはさらに１０^−１５Ｍ未満であるような、血清アルブミンに対する結合親和性を有し得る。いくつかの実施形態では、親和性は、操作されたポリペプチドが、アルブミンから解離し、生物学的応答、例えば、受容体、例えば、レプチン受容体との結合を誘発し得るような過度に堅固なものではない。好ましくは、ヒト血清アルブミンに対する親和性は、制限するものではないが、アッセイおよび合成法を含め、参照によりその全文が、すべての目的のために本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開出願第ＷＯ２００９／０１６０４３号に記載されるように測定され得る。

【0149】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、ホルモンドメインとコンジュゲートしている、血漿半減期を延長し得る種々の部分（例えば、ＰＥＧまたはＦｃまたはアルブミン）を有する対応する化合物よりも優れている。これに関連して、用語「優れた」とは、疾患または障害の治療の評価において検討され得るさまざまな機能特性を指す。例えば、本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、ホルモンドメインとコンジュゲートしている種々の部分を有する対応する化合物よりも少ない、例えば、１×、２×、３×、４×、５×、またはいっそう少ない生物学的に活性な（ホルモンドメイン）成分しか必要とない場合がある。さらなる例のために、本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、より高い効力、例えば、１．５×、２×、３×、４×、５×、１０×、２０×、５０×またはいっそう高い効力を有し得る。

【0150】

本明細書において考慮される操作されたポリペプチド化合物として、以下の表２に示される化合物が挙げられる。

【0151】

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【表2-6】

【表2-7】

【表2-8】

【表2-9】

【表2-10】

【表2-11】

【表2-12】

【0152】

具体的には、Ｎ末端メチオニンが存在しない上記の配列の化合物、例えば、例えば、レプチン化合物の、Ｎ末端が、ＶＰＩＱＫＶ（配列番号１５８）またはＬＡＥＡＫ（配列番号１５９）またはＧＳＬＡＥＡＫ（配列番号３５）で始まる場合が考慮される。Ｎ末端メチオニンは、細菌発現にとって好都合なものとして主に存在する。しかし、本発明のコンジュゲートペプチドは、真核細胞の宿主細胞［例えば、酵母（例えば、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ））、哺乳類、バキュロウイルス］または所望のホルモンまたはＡＢＤ配列の天然に存在する成熟ペプチド対応物において見られるようなＮ末端アミノ酸をもたらす翻訳後Ｎ末端タンパク質分解プロセシングを有するその他の宿主細胞において発現され得る。あるいは、発現および／または分泌に使用されるＮ末端配列は、例えば、ＴＥＶなどのプロテアーゼの使用によってのように、翻訳後に除去され得るものであり得る。

【0153】

ＩＩＩ．設計および製造方法
コンストラクトの設計。本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、アミノ酸レベルで設計され得る。次いで、これらの配列は、当技術分野で公知のさまざまなソフトウェア製品を使用して、例えば、タンパク質発現、コドン最適化、制限部位含量に基づいて、ヌクレオチド配列が、所望の発現宿主にとって最適化されるように逆翻訳され得る。例えば、ヌクレオチド配列は、タンパク質発現に基づいて、および制限部位含量について、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にとって最適化され得る。対象とするヌクレオチド配列に基づいて、当技術分野で公知の多段階ＰＣＲのために重複するオリゴヌクレオチドが、提供され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、対象とするタンパク質をコードするｃＤＮＡを構築するための当技術分野で周知の条件下で多重ＰＣＲ反応において使用され得る。一例については、１×Ａｍｐｌｉｔａｑバッファー、１．３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００ｕＭ ｄＮＴＰ、４Ｕ Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ、０．２ｕＭの各プライマー（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ、ＡＢＩ）であり、サイクリングパラメータ：（９４Ｃ：３０秒、５８Ｃ：１分、７２Ｃ：１分）、３５サイクルを用いる。

【0154】

制限部位が、当技術分野で公知のベクター連結において使用されるためのＰＣＲ産物の末端に付加されてもよい。特定の部位は、ｃＤＮＡが、次いで、ｐＥＴ４５ｂ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）において適切なリーディングフレームにあり得るように、Ｎｄｅ１およびＸｈｏ１を含み得る。これらの部位を使用することによって、このベクターにおいて、翻訳開始部位として除去され得る任意のＮ末端Ｈｉｓタグが、タグの下流となる。発現コンストラクトが完了されると、例えば、当技術分野で公知のＴ７プロモータープライマー、Ｔ７ターミネータープライマーおよび標準ＡＢＩ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍ ｖ３．１プロトコールを使用して配列決定することによって、検証が実施され得る。配列情報は、例えば、ＡＢＩ ３７３０ ＤＮＡ分析器から得ることができ、ベクターＮＴＩ ｖ．１０ソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して分析され得る。発現コンストラクトは、当技術分野で公知の、リンカー配列が容易に切断除去され、変更され得るモジュラー法で設計され得る。

【0155】

当技術分野で公知の、または本明細書に記載されたプロテアーゼ認識部位は、本明細書に記載された組換え操作ポリペプチドの設計、構築、操作および製造にとって有用なコンストラクト中に組み込まれ得る。

【0156】

一般的な製造方法。本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、当技術分野で公知の、生物学的、化学的および／または組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。例示的方法は、本明細書ならびにその開示内容が参照によりその全文で、すべての目的のために本明細書に組み込まれる米国特許第６，８７２，７００号；ＷＯ２００７／１３９９４１；ＷＯ２００７／１４０２８４；ＷＯ２００８／０８２２７４；ＷＯ２００９／０１１５４４；および米国公開第２００７／０２３８６６９号に記載されている。化合物を調製するためのその他の方法は本明細書に示されている。

【0157】

本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、自動化または半自動化ペプチドシンセサイザーなどの標準的な固相ペプチド合成技術を使用して調製され得る。手短には、一般に、ＡＢＤおよび治療用ホルモンペプチドは、別個に製造され、次いで、一緒にコンジュゲートされ得るか、または単一ポリペプチドとして製造され得る。したがって、アルブミン結合ポリペプチド、治療用ホルモンまたは操作されたポリペプチドは、別法として、保護された反応性側鎖を有するアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体を使用する非生物学的ペプチド合成、保護された反応性側鎖を有する第１の態様のポリペプチドを形成するためのアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体の段階的カップリングを含む非生物学的ペプチド合成、ポリペプチドの反応性側鎖から保護基を除去することおよび水溶液中でのポリペプチドのフォールディングによって製造され得る。したがって、正常なアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシンおよびバリン）および予め保護されたアミノ酸誘導体が、溶液中または有機溶媒中、固相支持体上でポリペプチド配列を逐次構築するために使用される。完全なポリペプチド配列が構築されると、保護基が除去され、ポリペプチドは、水溶液中でフォールディングすることが許される。本開示内容に従う各ポリペプチドは、可逆的にフォールディングし、ＡＢＤドメインは、因子が付加されることなく３ヘリックスバンドルドメインに可逆的にフォールディングし、ひいては、自発的にフォールディングする。操作されたコンジュゲートは、例えば、本明細書に記載されるような任意の方法に従って、例えば、非生物学的ペプチド合成によって、アルブミン結合ポリペプチドを製造することおよび製造されたＡＢＤポリペプチドを、本明細書において定義された治療用ホルモンとコンジュゲートすることを含む方法によって製造され得る。完全に可逆的にフォールディングする本明細書におけるＡＢＤ。これを、円二色性スペクトル分析：２０℃でとられた１つのスペクトルおよび９０℃に加熱し、続いて、２０℃に戻った後の第２のスペクトルによって評価した。この手順の間に、Ｔｍを求め、変性ポリペプチドのフォールディング後に変化しないことがわかった。典型的には、このような技術を使用して、α−Ｎ−カルバモイル保護されたアミノ酸および樹脂上で伸長中のペプチド鎖に付いているアミノ酸が、塩基（例えば、ジイソプロピルエチルアミンなど）の存在下、カップリング剤（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−ヒドロキシベンゾ−トリアゾールなど）の存在下、不活性溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリジノン、塩化メチレンなど）中、室温でカップリングされる。α−Ｎ−カルバモイル保護基は、試薬（例えば、トリフルオロ酢酸、ピペリジンなど）を使用して、得られたペプチド樹脂から除去され、カップリング反応が、ペプチド鎖に付加されるべき次の所望のＮ保護アミノ酸を用いて反復される。ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）などといった適したＮ保護基が、当技術分野で周知である。ペプチドシンセサイザーにおいて使用される溶媒、アミノ酸誘導体および４−メチルベンゾヒドリル−アミン樹脂は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）から購入することができる。

【0158】

一般に、固相合成は、商業的スケールへの優れた拡張性を有する直接的なアプローチであり、一般的に、比較的長い操作されたポリペプチドに適合するので、操作されたポリペプチドの化学合成には、固相ペプチド合成が使用され得る。固相ペプチド合成は、自動化ペプチドシンセサイザー（モデル４３０Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）を用い、ＮＭＰ／ＨＯＢｔ（オプション１）システムおよびキャッピングを用いるｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学（ＡＢＩ ４３０Ａ ペプチドシンセサイザー、バージョン１．３ＢのApplied Biosystems User's Manual Jul. 1, 1988, section 6, pp. 49-70、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．を参照のこと）を使用して実施され得る。Ｂｏｃ−ペプチド−樹脂は、ＨＦ（−５℃〜０℃、１時間）を用いて切断され得る。ペプチドは、水および酢酸を交互に用いて樹脂から抽出され得、濾液を凍結乾燥した。Ｆｍｏｃ−ペプチド樹脂は、標準法に従って切断され得（例えば、Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc., 1990, pp. 6-12）。ペプチドはまた、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈシンセサイザー（モデル ＭＰＳ ３５０、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、Ｋｙ．）を使用してアセンブルされ得る。

【0159】

本明細書に記載された化合物はまた、Sambrook et al., 1989, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d Ed., Cold Spring Harborなど、当技術分野で公知の方法を使用する組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。非ペプチド化合物は、当技術分野で公知の方法によって調製され得る。例えば、リン酸含有アミノ酸およびこのようなアミノ酸を含有するペプチドは、Bartlett et al, 1986, Biorg. Chem. 14:356-377に記載されるものなどの当技術分野で公知の方法を使用して調製され得る。

【0160】

操作されたポリペプチドは、別法として、当技術分野で周知の組換え技術によって製造され得る。例えば、Sambrook et al., 1989（Id.）を参照のこと。組換え技術によって製造されたこれらの操作されたポリペプチドは、ポリヌクレオチドから発現され得る。当業者ならば、このような操作されたポリペプチドをコードする、ＤＮＡおよびＲＮＡを含めたポリヌクレオチドを、コドン使用の縮重を考慮して、野生型ｃＤＮＡ、例えば、ヒトレプチンから得ることができ、示された置換を組み込むよう望まれるように、さらに操作できることは理解するであろう。これらのポリヌクレオチド配列は、微生物宿主においてｍＲＮＡの転写および翻訳を促進するコドンを組み込み得る。このような製造配列は、当技術分野で周知の方法に従って容易に構築され得る。例えば、参照によりその全文が、すべての目的のために本明細書に組み込まれるＷＯ８３／０４０５３を参照のこと。上記のポリヌクレオチドはまた、適宜、Ｎ末端メチオニル残基をコードし得る。本発明において有用な非ペプチド化合物は、当技術分野で公知の方法によって調製され得る。例えば、リン酸含有アミノ酸およびこのようなアミノ酸を含有するペプチドは、当技術分野で公知の方法を使用して調製され得る。例えば、Bartlett and Landen, 1986, Bioorg. Chem. 14: 356-77を参照のこと。

【0161】

操作されたポリペプチドコード配列を含有し、発現するために、さまざまな発現ベクター／宿主系が使用され得る。これらとして、それだけには限らないが、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターを用いて形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を用いてトランスフェクトされたか、もしくは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）を用いて形質転換された植物細胞系；または動物細胞系が挙げられる。組換えタンパク質製造において有用である哺乳類細胞として、それだけには限らないが、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−７など）、ＷＩ３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２および２９３細胞が挙げられる。タンパク質の組換え発現の例示的プロトコールは、本明細書に記載されており、および／または当技術分野で公知である。

【0162】

そのようなものとして、新規の、有用なウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクター、新規の有用な形質転換され、トランスフェクトされた原核生物および真核生物の宿主細胞（培養で増殖した細菌、酵母および哺乳類細胞を含む）の作製ならびに本操作されたポリペプチドを発現できるこのような宿主細胞の培養された増殖のための新規の、有用な方法において、ポリヌクレオチド配列は有用である。本明細書において、操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、操作されたポリペプチドの産生不足が軽減される場合またはこのようなものの増大したレベルを必要とすることが満たされる場合において、遺伝子療法にとって有用であり得る。

【0163】

本発明はまた、本操作されたポリペプチドの組換えＤＮＡ製造のプロセスを提供する。（ａ）ＤＮＡ分子の発現を促進する条件下で、操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を培養することと、（ｂ）操作されたポリペプチドを得ることとを含む、操作されたポリペプチドをコードする核酸を含有する宿主細胞から、操作されたポリペプチドを製造するプロセスが提供される。

【0164】

宿主細胞は、原核生物または真核生物のものであり得、細菌、哺乳類細胞（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、癌細胞またはその他の細胞）、酵母細胞および昆虫細胞などが挙げられる。

【0165】

組換えタンパク質の発現のための哺乳類宿主系もまた、当業者には周知である。宿主細胞株は、発現されたタンパク質をプロセシングし、タンパク質活性を提供するのに有用となる特定の翻訳後修飾をもたらす特定の能力について選択され得る。ポリペプチドのこのような修飾として、それだけには限らないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が挙げられる。タンパク質の「プレプロ」型を切断する翻訳後プロセシングはまた、正しい挿入、フォールディングおよび／または機能にとって重要であり得る。ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８などといった種々の宿主細胞が、このような翻訳後活性のための特定の細胞機構および特徴的な機構を有し、導入された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするよう選択され得る。

【0166】

あるいは、本発明の操作されたポリペプチドを作製するために、酵母系が使用され得る。操作されたポリペプチドＤＮＡのコーディング領域は、ＰＣＲによって増幅される。酵母プレ−プロ−αリーダー配列をコードするＤＮＡは、α接合因子遺伝子のヌクレオチド１〜２０を含有する１種のプライマーおよびこの遺伝子のヌクレオチド２５５〜２３５と相補的である別のプライマーを使用するＰＣＲ反応において、酵母ゲノムＤＮＡから増幅される（Kurjan and Herskowitz, 1982, Cell, 30:933-43）。プレ−プロ−αリーダーコード配列および操作されたポリペプチドコード配列断片は、プロモーターが、成熟した操作されたポリペプチドと融合しているプレ−プロ−α因子からなる融合タンパク質の発現を指示するよう、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）プロモーターを含有するプラスミド中にライゲーションされる。Rose and Broach, Meth. Enz. 185: 234-79, Goeddel ed., Academic Press, Inc., San Diego, California (1990)によって教示されるように、ベクターは、クローニング部位の下流のＡＤＨ２転写ターミネーター、酵母「２−ミクロン」複製起点、酵母ｌｅｕ−２ｄ遺伝子、酵母ＲＥＰ１およびＲＥＰ２遺伝子、大腸菌β−ラクタマーゼ遺伝子および大腸菌複製起点をさらに含む。β−ラクタマーゼおよびｌｅｕ−２ｄ遺伝子は、それぞれ、細菌および酵母における選択を提供する。ｌｅｕ−２ｄ遺伝子はまた、高レベルの発現を誘導する酵母中のプラスミドのコピー数の増大を促進する。ＲＥＰ１およびＲＥＰ２遺伝子は、プラスミドコピー数の調節に関与しているタンパク質をコードする。

【0167】

前述の段落において記載されたＤＮＡコンストラクトは、公知の方法、例えば、酢酸リチウム処理（Steams et al., 1990,. Meth. Enz. 185: 280-297）を使用して酵母細胞に形質転換される。ＡＤＨ２プロモーターは、増殖培地におけるグルコースの消耗の際に誘導される（Price et al., 1987, Gene 55:287）。プレ−プロ−α配列は、細胞からの融合タンパク質の分泌を達成する。同時に、酵母ＫＥＸ２タンパク質が、成熟した操作されたポリペプチドからプレ−プロ配列を切断する（Bitter et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330-5334）。

【0168】

本発明の操作されたポリペプチドはまた、市販の発現系、例えば、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用し、製造業者の使用説明書に従って、酵母、例えば、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）において組換えによって発現され得る。この系はまた、分泌を指示するプレ−プロ−α配列に頼るものであるが、挿入断片の転写は、メタノールによる誘導の際にアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターによって駆動される。分泌された操作されたポリペプチドは、例えば、細菌および哺乳類細胞上清から前記の操作されたポリペプチドを精製するために使用される方法によって酵母増殖培地から精製される。

【0169】

あるいは、操作されたポリペプチドをコードするＤＮＡは、バキュロウイルス発現ベクター、例えば、ｐＶＬ１３９３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）中にクローニングされ得る。この操作されたポリペプチドをコードするベクターは、次いで、製造業者の指示書（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）または例えば、ｓＦ９タンパク質を含まない培地で増殖させたスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞に感染させる公知の技術に従って使用され、組換えタンパク質を製造する。タンパク質は、精製され、当技術分野で公知の方法、例えば、ヘパリン−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）およびその後の分子サイジングカラム（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して培地から濃縮され、適当な溶液、例えば、ＰＢＳ中に再懸濁される。全アミノ酸アミノ酸配列分析、例えば、Ｐｒｏｔｏｎ ２０９０ペプチドシークエンサーでのエドマン分解またはそのＮ末端配列の確認ができるように、例えば、所望の操作されたポリペプチドの大きさが確認される単一バンドを示すことによってタンパク質を特性決定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が使用され得る。

【0170】

例えば、予測された成熟した操作されたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、所望のプロモーターおよび、適宜、リーダー配列（例えば、Better et al., 1988, Science 240:1041-1043を参照のこと）を含有するプラスミド中にクローニングされ得る。このコンストラクトの配列は、自動化配列決定によって確認され得る。次いで、プラスミドは、細菌のＣａＣｌ２インキュベーションおよび熱ショック処理を使用する標準手順を使用して大腸菌、ＭＣ１０６１株に形質転換される（Sambrook et al., Id.）。形質転換された細菌は、カルベニシリンを補給したＬＢ培地で増殖され、適した培地における増殖によって発現されたタンパク質の製造が誘導される。リーダー配列は、存在する場合には、成熟した操作されたポリペプチドの分泌に影響を及ぼし、分泌の際に切断される。分泌された組換え操作されたポリペプチドは、本明細書に記載された方法によって細菌培養培地から精製される。

【0171】

あるいは、操作されたポリペプチドは、昆虫系において発現され得る。タンパク質発現のための昆虫系は、当業者に周知である。１つのこのような系では、スポドプテラ・フルギペルダ細胞において、またはトリコプルシア幼虫（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅ）において外来遺伝子を発現するためのベクターとして、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が使用される。操作されたポリペプチドコード配列は、ポリヘドリン遺伝子などのウイルスの非必須領域中にクローニングされ、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれる。操作されたポリペプチドの挿入の成功は、ポリヘドリン遺伝子を不活性にし、コートタンパク質コートを欠く組換えウイルスを製造する。次いで、組換えウイルスを使用して、Ｓ．フルギペルダ細胞またはトリコプルシア幼虫に感染させ、そこで、本発明の操作されたポリペプチドが発現される（Smith et al., 1983, J. Virol. 46:584; Engelhard et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227）。

【0172】

別の例では、操作されたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ＰＣＲによって増幅され、適当なベクター、例えば、ｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）中にクローニングされ得る。ｐＧＥＸベクターは、ベクターによってコードされるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と、ベクターのクローニング部位中に挿入されたＤＮＡ断片によってコードされるタンパク質とを含む融合タンパク質を製造するよう設計される。ＰＣＲのプライマーは、例えば、適当な切断部位を含むよう作製され得る。次いで、組換え融合タンパク質は、融合タンパク質のＧＳＴ部分から切断され得る。ｐＧＥＸ−３Ｘ／操作されたポリペプチドコンストラクトは、大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中に形質転換され、個々の形質転換体が単離され、ＬＢ培地（カルベニシリンを補給した）中、０．４の波長６００ｎｍでの光学濃度に３７℃で増殖され、続いて、０．５ｍＭ イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）の存在下で４時間さらにインキュベートされる。個々の形質転換体からプラスミドＤＮＡが精製され、自動シークエンサーを使用して部分配列決定され、適切な配向での所望の操作されたポリペプチドをコードする遺伝子挿入断片の存在が確認される。

【0173】

融合タンパク質は、細菌中で不溶性封入体として製造されると予測される場合には、上記のように、または以下のように精製され得る。細胞を、遠心分離によって収穫し、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡで洗浄し、０．１ｍｇ／ｍＬ リゾチーム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を用いて室温で１５分間処理する。溶解物を、超音波処理によって切断し、１２，０００ｘｇで１０分間の遠心分離によって細胞片をペレットにする。融合タンパク質を含有するペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８および１０ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁し、５０％ グリセロール上に層にし、６０００ｘｇで３０分間遠心分離する。ペレットを、Ｍｇ＋＋およびＣａ＋＋を含まない標準リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）に再懸濁する。変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Sambrook et al., Id.）において再懸濁されたペレットを分画することによって融合タンパク質をさらに精製する。ゲルを０．４Ｍ ＫＣｌ中に浸漬して、タンパク質を可視化し、これを切り出し、ＳＤＳを欠くゲル−ランニングバッファー中で電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅｄ）する。ＧＳＴ／操作されたポリペプチド融合タンパク質が、細菌中で可溶性タンパク質として製造される場合には、ＧＳＴ精製モジュール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して精製してもよい。

【0174】

融合タンパク質は、消化に付して、成熟した操作されたポリペプチドからＧＳＴを切断しもよい。消化反応物（２０〜４０μｇ融合タンパク質、２０〜３０ユニットヒトトロンビン［０．５ｍＬ ＰＢＳ中、４０００Ｕ／ｍｇ（Ｓｉｇｍａ）］を室温で１６〜４８時間インキュベートし、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードして、反応生成物を分画する。ゲルを０．４Ｍ ＫＣｌ中に浸漬し、タンパク質バンドを可視化する。操作されたポリペプチドの予測される分子量に対応するタンパク質バンドの同定は、自動シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ モデル４７３Ａ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用する部分アミノ酸配列分析によって確認され得る。

【0175】

本発明の操作されたポリペプチドの組換え発現の特に例示的な方法では、２９３細胞が、リン酸カルシウム法によって、ｐＣＭＶベクター（５’ＣＭＶプロモーター、３’ＨＧＨポリＡ配列）中の操作されたポリペプチドｃＤＮＡおよびｐＳＶ２ｎｅｏ（ｎｅｏ耐性遺伝子を含有する）を含有するプラスミドを用いて同時トランスフェクトされ得る。一実施形態では、ベクターは、トランスフェクションに先立ってＳｃａＩを用いて直線化されなければならない。同様に、ｎｅｏ遺伝子が組み込まれた同様のｐＣＭＶベクターを使用する代替コンストラクトも使用され得る。０．５ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８（ネオマイシン様抗生物質）を含有する増殖培地での１０〜１４日間の制限希釈による単細胞クローンから、安定な細胞株が選択される。細胞株は、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットによって、操作されたポリペプチドの発現についてスクリーニングされ、高発現細胞株が、大規模増殖のために増やされる。

【0176】

形質転換された細胞は、長期間の、高収率タンパク質製造のために使用されることが好ましく、そのようなものとして、安定な発現が望ましい。このような細胞が、所望の発現カセットとともに選択マーカーを含有するベクターで形質転換されると、細胞を、強化培地で１〜２日間増殖させ、その後、選択培地に交換する。選択マーカーは、選択に対する耐性を付与するよう設計され、その存在によって、導入された配列を成功裏に発現する細胞の増殖および回収が可能になる。安定に形質転換された細胞の耐性凝集塊は、細胞にとって適当な組織培養技術を使用して増殖され得る。

【0177】

組換えタンパク質製造のために形質転換された細胞を回収するためには、いくつかの選択システムが使用され得る。このような選択として、それだけには限らないが、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞における、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられる。また、抗代謝産物耐性も、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ、アミノグリコシド、Ｇ４１８に対する耐性を付与し、また、クロルスルフロンに対する耐性を付与するｎｅｏおよびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏの選択の基準として使用され得る。有用であり得るさらなる選択可能な遺伝子として、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するのを可能にするｔｒｐＢまたはヒスチジンの代わりにヒスチノール（ｈｉｓｔｉｎｏｌ）を利用するのを可能にするｈｉｓＤが挙げられる。形質転換体の同定のための可視指示を与えるマーカーとして、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質、ＧＵＳならびにルシフェラーゼおよびその基質、ルシフェリンが挙げられる。

【0178】

本発明の操作されたポリペプチドは、自動化ペプチド合成および組換え技術の両方の組み合わせを使用して製造され得る。本明細書に開示されたような操作されたポリペプチドの調製において使用される、例えば、レプチン、レプチン類似体、活性レプチン断片またはレプチン誘導体およびＡＢＤのいずれかまたは両方ならびに、適宜、リンカーは、合成によって、または組換えによって製造され、次いで、「天然の化学的ライゲーション」などの当技術分野で公知の方法および親化合物を連結するアミド結合が形成される公知のその変法を使用して一緒にライゲーションされ得る。例えば、参照により、すべての目的のために本明細書に組み込まれる米国特許第６，３２６，４６８号を参照のこと。あるいは、例えば、本発明の操作されたポリペプチドは、欠失、置換、挿入およびペグ化による誘導体化（またはその他の部分、例えば、ポリマー、脂肪酸アシル鎖、Ｃ末端アミド化）を含めた修飾の組合せを含有し得る。このような操作されたポリペプチドは、段階的に製造され得る。最初の段階では、欠失、置換、挿入およびそれらの任意の組合せの修飾を含有する中間体の操作されたポリペプチドは、記載されるような組換え技術によって製造され得る。次いで、本明細書に記載されるようなオプショナルな精製工程の後、中間体の操作されたポリペプチドは、適当なＰＥＧ化試薬（例えば、ＮｅＫｔａｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＳａｎＣａｒｌｏｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ製）を用いる化学修飾によってＰＥＧ化され（またはその他の化学的誘導体化、例えば、アシル化、Ｃ末端アミド化に付され）、所望の操作されたポリペプチド誘導体が得られる。当業者ならば、上記の手順は、欠失、置換、挿入から選択される修飾、誘導体化および当技術分野で周知の修飾のその他の手段の組合せを含有し、本発明によって考慮される操作されたポリペプチドに適用するよう一般化され得るということは理解されよう。

【0179】

ペプチドは、本明細書に記載されるものを含め、任意の数の当技術分野で公知の方法によって精製され得る。一方法では、ペプチドは、Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐｒｅｐ ３０００システムを使用してＲＰ−ＨＰＬＣ（分取用および分析用）によって精製される。ペプチドを単離するために、Ｃ４、Ｃ８またはＣ１８分取用カラム（１０μ、２．２×２５ｃｍ；Ｖｙｄａｃ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、Ｃａｌｉｆ．）が使用され得、純度は、Ｃ４、Ｃ８またはＣ１８分析用カラム（５μ、０．４６×２５ｃｍ；Ｖｙｄａｃ）を使用して決定され得る。溶媒（Ａ＝０．１％ ＴＦＡ／水およびＢ＝０．１％ ＴＦＡ／ＣＨ_３ＣＮ）が、分析用カラムに１．０ｍｌ／分の流速でおよび分取用カラムに１５ｍｌ／分で送達され得る。アミノ酸分析は、Ｗａｔｅｒｓ Ｐｉｃｏ Ｔａｇシステムで実施され、Ｍａｘｉｍａプログラムを使用して処理され得る。ペプチドは、気相酸加水分解（１１５℃、２０〜２４時間）によって加水分解され得る。加水分解物は、標準法によって誘導体化され、分析され得る[Cohen et al, THE PICO TAG METHOD: A MANUAL OF ADVANCED TECHNIQUES FOR AMINO ACID ANALYSIS, pp. 11-52, Millipore Corporation, Milford, Mass. (1989]。高速原子衝撃分析は、Ｍ−Ｓｃａｎ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、Ｐａ．）によって実施され得る。質量較正は、ヨウ化セシウムまたはヨウ化セシウム／グリセロールを使用して実施され得る。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏ−Ｉｏｎ ２０質量分析計で、飛行時間検出を使用するプラズマ脱離法イオン化分析が実施され得る。

【0180】

操作されたポリペプチド発現アッセイ。宿主細胞によるタンパク質発現のレベルをアッセイするための方法が利用可能である。宿主細胞によるタンパク質発現のレベルをアッセイするために有用な手順を以下の典型的なプロトコールにおいて例示する。約２５μｌのＢＬ２１大腸菌細胞を、２ｕｌのプラスミドＤＮＡ（操作されたポリヌクレオチドの発現ベクター）で形質転換する。細胞をプレーティングし、３７℃で一晩または室温で４８時間インキュベートしてもよい。単一コロニーを選択、使用して、４ｍｌの適当な抗生物質を有するＬＢ培地中で約６時間、種培養を増殖させてもよい。９００ｕｌのストックに１００ｕｌの８０％滅菌グリセロールを添加することによってグリセロールストックを調製してもよく、次いで、これを穏やかに混合し、−８０Ｃで保存してもよい。ＴＣＰ非誘導サンプルのために２５０μｌのサンプルを取り出してもよい。アリコート、例えば、２ｍｌの適当な抗生物質を含有するＭａｇｉｃ培地に、５μｌの種培養を用いて播種してもよく、次いで、これを、３７Ｃ、３００ｒｐｍで一晩（最大２４時間）インキュベートしてもよい。当技術分野で公知のように、Ｍａｇｉｃ培地は、自動誘導性である。あるいは、２５０ｍｌまたは１２５ｍｌのＴｈｏｍｐｓｏｎフラスコ中で６０ｍｌの適当な抗生物質を含有するＭａｇｉｃ培地に、６０μｌの種培養を用いて播種してもよく、次いで、これを、３０Ｃ、３００ｒｐｍで一晩（最大２４時間）インキュベートしてもよい。インキュベーション後、各試験管から２５０μｌの培養物を取り出し、細胞をペレットにしてもよい。細胞を１ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に再懸濁し、それに０．１容積（１００ｕｌ）のＰＯＰ培養試薬および１μｌのｒ−リゾチームを添加してもよい（ｒ−リゾチームバッファーでの１：７５０希釈）。混合物を十分に混合し、室温で少なくとも１０分間インキュベートしてもよい。次いで、調製物を、１４０００×Ｇで１０分間遠心分離してもよい。上清（可溶性画分）を取り出し、保持してもよく、ゲル分析のためのサンプルを調製してもよい（１５μｌ＋５μｌ ＬＤＳ）。残りの封入体ペレットを、超音波処理を用いて１ｍｌの１％ ＳＤＳに再懸濁してもよい。ゲル分析のためのサンプルを調製してもよい（１５ｕｌ＋５μｌ ＬＤＳ）。非誘導サンプルのために、１．０容積のＰＯＰ培養試薬および１μｌのｒ−リゾチーム（ｒ−リゾチームバッファーでの１：７５０希釈）を添加してもよい。混合物を十分に混合し、室温で少なくとも１０分間インキュベートしてもよい。これらのサンプルは、遠心分離される必要がない場合もある。次いで、ゲル分析のためにサンプルを調製してもよい（１５μｌ＋５μｌ ＬＤＳ）。１×ＭＥＳバッファー中で非還元性ＮＵ−ＰＡＧＥゲル（４〜１２％）を実施し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅマイクロ波プロトコールを用いて染色してもよい。当技術分野で公知のように、脱染を一晩実施してもよい。ゲルイメージを保持し、分析して、タンパク質発現レベルを調べてもよい。

【0181】

封入体調製物。封入体画分中に見られる操作されたポリペプチドについては、以下の手順が有益であり得る。細胞ペレットを、各５０ｍｌの培養物に対して最少で１００ｍｌの溶解バッファー中に再懸濁してもよい。３０ｍｌを添加した時点で、１０ｍｌピペットを使用して再懸濁してもよく、次いで、試験管をさらなる７０ｍｌで洗浄してもよい。再懸濁された細胞溶液を、全プロセスを通じてチャンバーを氷水に維持するよう注意しながら、１００ＰＳＩ（分）のマイクロフルイダイザーを通して複数回実施してもよい、例えば、４回通過させてもよい。流動化されたスラリーを、１４０００×ｇで２０分間遠心分離してもよい（例えば、２５０ｍｌ Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）ボトルを使用して、ＪＬＡ １０．５、１０，０００ｒｐｍ）。封入体ペレットを、ピペットチップを用いて破壊した後、撹拌子および撹拌プレートを用いて氷上で冷却した溶解バッファー中に、４Ｃで１時間再懸濁してもよい。ペレットを、ピペットチップを用いて破壊した後、撹拌子および撹拌プレートを用いて、蒸留Ｈ_２Ｏに、４Ｃで１時間、２回目の再懸濁をし、それに続いて、１４０００×ｇで１５分間遠心分離してもよい。上清を取り出し、廃棄してもよい。得られたものは、−８０Ｃで保存してもよい。

【0182】

タンパク質精製。本明細書に記載されるように、発現されたポリペプチドの単離のために多数の方法が知られている。以下は一例である。封入体ペレットは、適当な容量の可溶化バッファー（８Ｍ尿素または８Ｍグアニジン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．７５）中で、室温で１時間可溶化され得る。可溶化されたペレットを、２７０００ｇで２０分間遠心分離してもよい。濾過された（例えば、０．４ｕｍ）上清を、室温で、適当な容量の再フォールディングバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ尿素、０．８Ｍアルギニン、４ｍＭシステイン、１ｍＭシスタミン；ｐＨ８）中に１滴ずつ移してもよい。次いで、得られたものを、穏やかに混合しながら、４℃に一晩またはそれ以上置いてもよい。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＫＴＡＦＰＬＣ（商標）を使用して、サンプルを濃縮し、４Ｃ環境中、１〜２ｍｌ／分でゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５ ２６／６０）に流してもよい。適当なタンパク質を含有する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定し、プールし、第２のゲル濾過カラムを通して流してもよい。次いで、当技術分野で公知のように、プールされたタンパク質を、Ａｍｉｃｏｎフィルターで適当な濃度に濃縮し、例えば、Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）ＰＴＳリーダー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を使用してエンドトキシンレベルについてアッセイしてもよい。タンパク質サンプルがエンドトキシン判定基準を通ると、滅菌濾過し、アリコートに分配し、品質管理アッセイを通してもよい。品質管理アッセイは、およその質量を得るために分析用ＨＰＬＣ−ＳＥＣ、非還元性ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびＲＰ ＨＰＬＣ−ＭＳを含み得る。タンパク質は、１×ＰＢＳ（１３７ｍＭ 塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム、４．３ｍＭリン酸ナトリウム、１．４ｍＭリン酸一カリウム、ｐＨ７．２）中で得、アリコートに分配し、−７０〜−８０℃で急速冷凍することができる。

【0183】

ＩＶ．使用および疾患の治療方法
適応症。さまざまな疾患および障害が、本明細書に記載されたポリペプチド化合物および方法によって有益に治療されると考慮される。

【0184】

肥満症および過体重。肥満症および過体重を含めたその関連障害は、米国および世界中で、よく見られ、極めて重篤な公衆衛生問題である。上半身肥満症は、２型真性糖尿病について知られている最強のリスク因子であり、心血管疾患の強いリスク因子である。肥満症は、高血圧症、アテローム性動脈硬化症、鬱血性心不全、卒中、胆嚢疾患、変形性関節症、睡眠時無呼吸、多嚢胞性卵巣症候群などの生殖障害、乳房、前立腺および結腸の癌ならびに全身麻酔の合併症の頻度上昇の認識されているリスク因子である。例えば、Kopelman, 2000, Nature 404: 635-43を参照のこと。

【0185】

肥満症は、寿命を減少させ、上記で列挙された併存症、同様に、感染症、静脈瘤、黒色表皮腫、湿疹、運動不耐性、インスリン抵抗性、高血圧高コレステロール血症、胆石症、整形外科的傷害および血栓塞栓性疾患などの障害の深刻なリスクを伴う。例えば、Rissanen et al, 1990 Br. Med. J. 301: 835-7を参照のこと。肥満症はまた、インスリン抵抗性症候群または「シンドロームＸ」およびメタボリックシンドロームと呼ばれる状態の群のリスク因子である。肥満症および関連障害の世界的な医療費は、莫大である。

【0186】

肥満症の病理発生は、多因子性であると考えられている。問題は、肥満の対象では、過剰の脂肪組織が存在するまで栄養素利用性とエネルギー消費が釣り合うようにならないということである。中枢神経系（ＣＮＳ）は、エネルギーバランスを制御し、動物の代謝状態に適当な、さまざまな行動、自律神経および内分泌活性を調和させる。これらの活性を制御する機序またはシステムは、前脳（例えば、視床下部）、後脳（例えば、脳幹）および脊髄中に広く分布している。最終的に、これらのシステムからの代謝（すなわち、栄養利用性）および認知（すなわち、学習された好み）情報が統合され、欲求（食物を探すこと）および完了（経口摂取）行動をとる決意がスイッチが入れられる（食事の調達および開始）か、またはスイッチが切られる（食事の終了）。視床下部は、主に、これらのシグナルを統合すること、次いで、脳幹に指令を発することに関与していると考えられている。完了運動制御システムの要素（例えば、咀嚼および嚥下に関与している筋肉）を制御する脳幹核。そのようなものとして、これらのＣＮＳ核は、文字通り、摂食行動の「最終共通路」を構成するといわれている。

【0187】

神経解剖学的および薬理学的証拠は、エネルギーおよび栄養的ホメオスタシスのシグナルが前脳核において統合することおよび完了運動制御システムが脳幹核に、おそらくは、三叉神経運動核の周囲の領域中にあることを支持する。視床下部および脳幹間には大規模な相互接続がある。さまざまなＣＮＳに向けられた抗肥満症治療薬（例えば、小分子およびペプチド）は、主に、視床下部にある前脳基質に、および／または脳幹にある後脳基質に焦点をわせている。

【0188】

肥満症は、不十分にしか治療可能でなく、慢性的であり、本質的に難治性の代謝障害のままである。したがって、対象における体重減少および／または体重維持において有用な新規治療の必要性が存在する。このような治療は、対象の健康に対する著しい有益な効果につながる。本明細書に開示された操作されたペプチドを、単独でか、またはその他の抗肥満症剤（例えば、ＷＯ２００９０６４２９８およびＵＳ２００８０２０７５１２を参照のこと）と組み合わせて使用する方法および治療は、このような有益な効果を提供し得る。

【0189】

レプチン欠乏症。レプチン欠乏症は、肥満症をもたらすことがわかっている。レプチン欠乏症の１つの形態として、先天性レプチン欠乏症、稀な遺伝障害がある。Montaque et al., 1997, Nature 387: 903-908を参照のこと。いくつかのレプチン欠乏症は、インスリン分泌性β−細胞の破壊に起因する制御されないインスリン欠乏性真性糖尿病の結果であり得る。インスリンの欠如が、脂肪組織におけるトリグリセリドの合成および保存につながり、レプチンが脂肪組織において合成されるので、これが、体重増加を防ぎ、順に、血漿レプチンレベルを著しく低下させることが理論化される。これらのおよびその他のレプチン欠乏ならびにこのような欠乏に起因する疾患および障害は、毎日のレプチンまたはレプチンアゴニスト注射などのレプチン置換療法で治療され得る。本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、このような疾患および障害のより好都合な、有利な治療的処置を提供し得る。

【0190】

糖尿病および心血管疾患。真性糖尿病は、糖尿病患者の間のすべての致死のうち６０％〜７０％が、心血管合併症の結果である複雑な慢性疾患と認識されている。糖尿病は、冠動脈心疾患リスク相当物と考えられるだけでなく、再発性心筋梗塞、鬱血性心不全および心血管インシデント後の死亡を含めた有害事象の独立した予測因子としても同定されている。より密接なグルコース管理および心血管リスク因子の積極的な治療を採ることで、冠動脈心疾患合併症のリスクが低減され、糖尿病患者の間の全体的な生存が改善されると予測される。しかし、糖尿病患者は、非糖尿病患者よりも、２〜３倍、急性心筋梗塞を経験する可能性が高く、糖尿病患者は、非糖尿病患者よりも８〜１３年少なくしか生存しない。

【0191】

糖尿病性／急性心筋梗塞患者のハイリスク性を理解することで、不安定狭心症または非ＳＴ上昇型心筋梗塞（まとめて「ＡＣＳ」と呼ばれる）を有する入院患者の管理のための米国心臓病学会／米国心臓協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（「ＡＣＣ／ＡＨＡ」）臨床実践ガイドラインは、入院している糖尿病患者は、高血糖症の積極的な管理を必要とする特別な集団であるということを最近認識した。具体的には、ガイドラインは、入院している糖尿病／ＡＣＳ患者のグルコース低下治療は、１０ｍｇ／ｄＬ未満の摂食前グルコース、１８０ｍｇ／ｄＬ未満の最大１日標的および７％未満の退院後ヘモグロビンＡ１ｃを達成することを標的としなくてはならないと述べている。

【0192】

高齢のＡＣＳ患者の全国的なサンプルでは、糖尿病患者における３０日死亡率の増大は、病院に入院した時点で高グルコース値を有する患者と対応していることが実証された。“Diabetic Coronry Artery Disease & Intervention”, Coronary Therapeutics 2002, Oak Brook, IL, September 20, 2002を参照のこと。入院時に一時的に上昇したグルコースではなく持続した高血糖症は、重篤有害事象と関連しているという証拠はますます増えている。患者における高血糖症および血管リスクの理想的な測定基準は、容易にはわからないが、入院期間の間の平均グルコース値は、死亡率を最も予測するものであるようである。米国中の４０を超える病院から得られたＡＣＳ患者の別個の研究では、入院時のランダムなグルコース値とは対照的に、持続性高血糖症が、院内死亡率をより予測するものであるということがわかった。Acute Coronary Syndrome Summit: A State of the Art Approach, Kansas City, MO, September 21, 2002を参照のこと。入院時のグルコース値と比較して、全入院期間にわたるグルコース管理のロジスティック回帰モデルが、死亡率を最も予測するものであった。１２０ｍｇ／ｄＬを超えるグルコースの１０ｍｇ／ｄＬの増大ごとに、入院期間の間の死亡率のリスクがほぼ２倍の増大した。継続糖尿病／ＡＣＳ患者のより小さいコホートでは、入院時にグルコースレベルの増大を伴う場合には、１年で死亡率が段階的に増加した。病院環境では、ＡＣＣ／ＡＨＡガイドラインは、入院期間の間により低い血糖を達成するための積極的なインスリン治療の開始を示唆する。

【0193】

レプチンが、糖尿病、特に、肥満症の存在を伴うか、または伴わないＩ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病の治療に、より詳しくは、低血清レプチンの状態において直接的な利益を有し得ることが報告されている。レプチン補充が、付随する肥満症を伴うか、または伴わない１および２型糖尿病の種々の動物モデルにおいて高インスリン血症、インスリン抵抗性および高血糖症を低減するか、または防ぐことが報告されている。例えば、レプチンの薬理学的投与によってか、またはアデノウイルス遺伝子療法を用いてのいずれかによって生じた高レプチン血漿レベルは、持続的に低いインスリンレベルにもかかわらずＳＴＺ誘導性糖尿病において高血糖症および関連する血漿グルカゴンレベルの増大を低減させた。

【0194】

脂質調節疾患。当技術分野で公知のように、脂肪異栄養症は、身体の脂肪組織の異常なまたは変性状態を特徴とする。脂質異常症は、血液中の正常な脂質成分の破壊である。インスリンレベルの長期の上昇は、脂質異常症につながり得ると考えられる。高脂血症は、血液中の脂質および／またはリポタンパク質の上昇したまたは異常なレベルの存在である。視床下部性無月経は、数カ月の月経停止が、視床下部が関与する問題に起因する状態である。視床下部性無月経の女性におけるレプチン置換療法は、有害作用を引き起こさずに、生殖、甲状腺および成長ホルモン軸および骨形成のマーカーを改善することがわかった。例えば、Oral et al., N Engl J Med. 2004, 351: 959-962, 987-997を参照のこと。脂肪肝疾患、例えば、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）とは、単純な脂肪肝（脂肪症）から非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、さらに硬変（不可逆性、肝臓の進行した瘢痕）の範囲の広いスペクトルの肝臓疾患を指す。すべての段階のＮＡＦＬＤが、共通して、肝臓細胞（肝細胞）における脂肪の蓄積（脂肪浸潤）を有する。レプチンは、ＮＡＳＨを含めた種々の慢性肝臓疾患における炎症および繊維症の進行の重要な調節因子の１種であると考えられている。例えば、Ikejima et al., Hepatology Res. 33:151-154を参照のこと。

【0195】

さらに、何らかの理論に拘束されようとは思わないが、２型糖尿病における相対的インスリン欠乏、グルコース毒性および門脈を通る腹部脂肪組織内からのデリバリーの上昇による肝臓遊離脂肪酸負荷の増大が、脂肪肝障害における可能性ある原因と関与していると考えられている。実際、摂食行動が、ＮＡＳＨを含めた多数の当然の結果を伴う肥満症のメタボリックシンドロームを駆動する重要な因子であると仮説が立てられている。したがって、２型糖尿病においてすでに実証されているように、食物摂取の減少および少ない食事の数の増大を目的とする治療は、ＮＡＳＨを有効に治療し、予防し得る。インスリン分泌および体重減少を促進し、胃内容排出を遅延する薬物はまた、糖耐性の改善に有効であり、したがって、その付随する高インスリン血症を伴う脂肪肝を改善し得る。したがって、レプチン、レプチン類似体、例えば、メトレレプチンまたはその活性断片の使用は、この状態の治療法として十分に適したものであり得る。したがって、レプチン、レプチン類似体またはその活性断片を含む本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、脂肪肝障害の治療において有用であり得る。

【0196】

アルツハイマー病。アルツハイマー病（ＡＤ）は、当技術分野で公知のように、Ａ−βタンパク質の調節不全を含む脳中のプラークおよびもつれを伴う。脳脂質は、Ａ−β−関連発症経路に複雑に関与しており、脂質ホメオスタシスの重要なモジュレーターはレプチンであると考えられている。したがって、レプチンは、双方向性のＡ−β運動を調節し、そのレベルを細胞外で低下させ得る。実際、ＡＤ−トランスジェニック動物へのレプチンの慢性投与は、脳Ａ−β含量を低下させること、根底にある治療可能性が実証された。Fewlass et al., 2004, FASEB J., 18:1870-1878を参照のこと。さらに、２型真性糖尿病およびＡＤは、両方とも線維性コンホメーションを有する不溶性タンパク質凝集体−２型ＤＭ膵島中のアミリンおよびＡＤ脳中のＡβを特徴とするという点で疫学的および生化学的特徴を共有する。何らかの理論に拘束されようとは思わないが、同様の毒性機序は、２型ＤＭおよびＡＤを特徴とし得ると考えられる。Lim et al., FEBS Lett., 582:2188-2194を参照のこと。

【0197】

メタボリックシンドロームＸ。メタボリックシンドロームＸは、インスリン抵抗性、脂質異常症、高血圧症および脂肪組織の内臓分布を特徴とし、２型糖尿病の病態生理学において中心的な役割を果たす。また、ＮＡＳＨ、繊維症および肝臓の硬変と強力に相関しているとわかった。したがって、本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、メタボリックシンドロームＸの治療において有用であり得る。

【0198】

ハンチントン舞踏病。ハンチントン舞踏病は、常染色体優性、神経変性（ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）疾患である。この疾患の特徴として、運動障害、痴呆、精神医学的問題および意図的でない体重減少が挙げられる。本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、ハンチントン舞踏病の治療において有用であり得る。

【0199】

したがって、一態様では、対象において疾患または障害を治療する方法が提供される。対象は、疾患または障害の治療を必要とするものである。疾患または障害は、脂肪異栄養症、脂質異常症、高脂血症、過体重、肥満症、視床下部性無月経、アルツハイマー病、レプチン欠乏症、脂肪肝疾患または糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型を含む）であり得る。本明細書に記載された化合物および方法によって治療され得るさらなる疾患および障害として、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、メタボリックシンドロームＸおよびハンチントン舞踏病が挙げられる。治療法は、疾患または障害の治療に有効な量での対象への本明細書に記載されるような操作されたポリペプチドの投与を含む。操作されたポリペプチドは、ＨＤ１として、レプチン、レプチン断片またはレプチン類似体を含む。したがって、操作されたポリペプチドは、以下の構造のうち１種を有し得る：ＡＢＤ−ＨＤ１、ＨＤ１−ＡＢＤ、ＡＢＤ−Ｌ１−ＨＤ１またはＨＤ１−Ｌ１−ＡＢＤ。

【0200】

本明細書に記載された治療実施形態のすべてにおいて、レプチンは、ヒトレプチンまたはメトレレプチンであり得る。いくつかの実施形態では、レプチン類似体は、ヒトレプチンと、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはさらに高い同一性を有する。いくつかの実施形態では、レプチン類似体は、マウスレプチンと、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはさらに高い同一性を有する。いくつかの実施形態では、レプチン類似体は、ラットレプチンと、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはさらに高い同一性を有する。いくつかの実施形態では、レプチン類似体は、カモノハシレプチンと、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはさらに高い同一性を有する。いくつかの実施形態では、レプチン類似体は、アザラシレプチンと、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはさらに高い同一性を有する。いくつかの実施形態では、レプチン類似体は、レプチンＡ１００、Ａ３００またはＡ５００である。

【0201】

Ｖ．アッセイ
本明細書に記載された操作されたポリペプチドを製造およびアッセイする方法は、一般に、当業者に利用可能である。さらに、特定の方法は、本明細書に、ならびに参照により、このさらなる目的のために本明細書に組み込まれる、本明細書に引用された特許公報およびその他の参考文献に記載されている。

【0202】

食物摂取。何らかの理論に拘束されようとは思わないが、食物摂取は、本明細書に記載されるような化合物の有用性の評価において有用であると考えられる。例えば、いくつかの代謝病態は、食物摂取と関連していると知られている（例えば、糖尿病、肥満症）。したがって、食物摂取が、本明細書に記載された化合物の投与によって調節される程度を調べるために、初期スクリーニングが実施され得、陽性初期スクリーニングは、その後の化合物の開発において有用であり得る。

【0203】

さまざまな食物摂取アッセイが、当業者に利用可能である。例えば、食物摂取のいわゆる「ホームケージモデル」では、対象（例えば、ラット）は、そのホームケージ中で維持され、試験化合物の注射後に対象の総重量とともに食物摂取が測定される。食物摂取アッセイのいわゆる「給餌パターンモデル」では、対象（例えば、ラット）は、試験の前に給餌チャンバーおよび注射に慣らされる。試験化合物の投与後、対象は、給餌チャンバーに直ちに入れられ、食物摂取が、時間の関数として自動的に測定される（例えば、１分間隔）。両試験について、食物は、当技術分野で公知の標準固形飼料またはさまざまな固形飼料（例えば、高脂肪）のいずれかである。いわゆる「マウス食物摂取」アッセイでは、試験化合物は、食事誘導性肥満症（ＤＩＯ）マウスにおける食欲抑制について、または体重増加に対する効果について試験され得る。典型的なマウス食物摂取アッセイでは、雌のＮＩＨ／Ｓｗｉｓｓマウス（８〜２４週齢）が、０６００に明かりをつける１２：１２時間明暗周期で飼育される群である。水および標準のペレット化マウス固形飼料食は、記載されない限りは自由に利用可能とする。動物を、実験の１日前に、およそ１５００時に開始して絶食させる。実験の朝に、動物を実験群にわける。典型的な研究では、ｎ＝４ケージであり、３匹のマウス／ケージである。時間＝０分で、すべての動物に、典型的には、約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ〜７５ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲の量で、媒体または化合物の腹膜内注射を施し、直ちに、予め秤量した量（１０〜１５ｇ）の標準固形飼料を与える。種々の時間、典型的には、３０、６０および１２０分で食物を除去し、秤量して、消費された食物の量を調べる。例えば、Morley et al., 1994, Am. J. Physiol. 267:R178-R184）参照のこと。時間＝０で最初に提供された食物の重量から、例えば、３０、６０、１２０、１８０および／または２４０分の時点で残っている食物の重量を差し引くことによって食物摂取を算出する。ＡＮＯＶＡによって有意な治療効果が同定される（ｐ＜０．０５）。有意差が存在する場合には、ダネット検定を使用して試験平均を対照平均と比較する（Ｐｒｉｓｍ ｖ．２．０１、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）。本明細書に記載された任意の試験について、試験化合物の投与は、注射（例えば、皮下、腹腔内など）、経口または当技術分野で公知のその他の投与方法を含めた任意の手段によってであり得る。

【0204】

インビトロアッセイ。何らかの理論または作用機序に拘束されようとは思わないが、インビトロ（例えば、受容体）アッセイの結果と、代謝疾患および障害の治療のための薬剤の有用性の間に、相関関係が存在すると考えられる。したがって、インビトロアッセイ（例えば、細胞ベースのアッセイ）は、本明細書に記載されたものなどの可能性ある代謝剤のスクリーニング戦略として有用である。以下のように記載されるものを含めたさまざまなインビトロアッセイが、当技術分野で公知である。

【0205】

レプチン結合アッセイ。レプチン結合は、３２Ｄ ＯＢＥＣＡ細胞株によって提示されるキメラレプチン（Ｈｕ）−ＥＰＯ（Ｍｕ）受容体を発現する表面膜から^１２５Ｉ−組換えレプチン（マウス）を置換することにおける試験化合物の効力によって測定され得る（J Biol Chem 1998; 273(29): 18365-18373）。精製された細胞膜は、回収された３２Ｄ ＯＢＥＣＡ細胞のコンフルエントな細胞培養物からホモジナイゼーションによって調製され得る。膜は、９６ウェルポリスチレンプレート中で、^１２５Ｉ−ｒｅｃ−マウスレプチンおよび漸増濃度の試験化合物とともに周囲温度で３時間インキュベートされ得る。結合および非結合リガンド画分は、０．５％ ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）中で少なくとも６０分間、予めブロッキングされた９６ウェルＧＦ／Ｂプレートでの急速濾過によって分けられ得る。次いで、ガラスファイバープレートが乾燥され、シンチラントが添加され、ＣＰＭが放射標識されたヨウ素を読み取ることができるマルチウェルシンチレーションカウンターで読み取ることによって決定され得る。

【0206】

レプチン機能アッセイ。試験化合物を用いる、キメラＨｕ−レプチン／Ｍｕ−ＥＰＯ受容体を異所的に発現する３２Ｄ−ケプチン細胞の処理後に、リン酸化ＳＴＡＴ５（シグナル伝達性転写因子５）のレベルの増大が測定され得る。３２Ｄ−ケプチン細胞（３２Ｄ−ＯＢＥＣＡと同一であるが、レプチンとともに培養物で維持された）は、一晩レプチンをやめさせ、次いで、９６ウェルプレート中３７℃で３０分間、試験化合物で処理され、続いて、細胞抽出され得る。細胞溶解物中のｐＳＴＡＴ５レベルは、３８４ウェル形式（Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ（商標）３８４ Ｐｌｕｓ）中でＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）ｐＳＴＡＴ５アッセイキットを使用して決定され得る。試験化合物の有効性は、ヒトレプチンを用いて処理された細胞から得られた細胞溶解物における最大シグナルに対して決定され得る。

【0207】

ＶＩ．医薬組成物
一態様では、本明細書に記載された化合物を、医薬上許容される賦形剤（例えば、担体）と組み合わせて含む医薬組成物が提供される。本明細書において、用語「医薬上許容される担体」とは、医薬賦形剤、例えば、活性剤と有害に反応しない、腸内または非経口適用に適した医薬上、生理学上許容される有機または無機担体物質を指す。適した医薬上許容される担体として、水、塩溶液（例えば、リンガー溶液など）、アルコール、オイル、ゼラチンおよびラクトース、アミロースまたはデンプンなどの炭水化物、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチセルロース（ｍｅｔｈｙｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）およびポリビニルピロリジンが挙げられる。このような調製物は滅菌され得、必要に応じて、本発明の化合物と有害に反応しない滑沢剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、バッファー、着色料および／または芳香族物質などといった補助剤と混合され得る。

【0208】

さらなる態様において、本明細書に記載されるような操作されたポリペプチドを、医薬上許容される賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、持続性医薬組成物である。医薬組成物の投与と関連して用語「持続性」とは、作用持続期間を指す。したがって、持続性医薬組成物は、例えば、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、１カ月またはいっそう長い間隔で投与され得る。好ましい実施形態では、投与は、１日につき１回（すなわち、「１日１回」）である。より好ましい実施形態では、投与は、１週につき１回（すなわち、「週１回」）である。

【0209】

Ａ．方法
本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、対象に、単独で投与され得るか、または同時投与され得る。同時投与は、化合物の、個別のまたは組合せ（２種以上の化合物）での同時の投与または逐次投与を含むものとする。例えば、肥満症は、レプチン（例えば、メトレレプチン）および特定のその他の抗肥満症化合物を含む併用療法で有益に治療され得ることがわかっている。例えば、米国公開出願第２００８／０２０７５１２号を参照のこと。したがって、ＡＢＤおよびレプチンを含む本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、肥満症の治療にとって有用であり得る。あるいは、有する個々の操作されたポリペプチドは、エクセナチドまたはリラグルチドなどのその他の抗肥満症剤と同時投与され得る。

【0210】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載された製剤および方法は、レプチンまたはレプチン類似体操作されたポリペプチドが、抗高血糖症剤、例えば、インスリン、アミリン、プラムリンチド、メトホルミンなどの１種または複数の抗糖尿病剤と同時投与されることをさらに提供する。

【0211】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載された製剤および方法は、レプチンまたはレプチン類似体操作されたポリペプチドが、１種または複数のコレステロールおよび／またはトリグリセリド低下剤と同時投与されることをさらに提供する。例示的薬剤として、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（例えば、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン）；胆汁酸封鎖剤（ｂｉｌｅ ａｃｅ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｎｔｓ）（例えば、コレセベラム、コレスチラミン、コレスチポール）；フィブラート（例えば、フェノフィブラート、クロフィブラート、ゲムフィブロジル）、エゼチミブ、ニコチン酸、プロブコール、ロバスタチン／ナイアシン組合せ、アトルバスタチン／アムロジピン組合せ；およびシンバスタチン／エゼチミブ組合せが挙げられる。

【0212】

レプチン化合物は、治療上活性な化合物であり、驚くべきことに、ＡＢＤと融合されている場合に活性を保持するので、本開示内容は、医薬として使用するための、すなわち、治療において使用するための組成物を提供する。液体または乾燥形態いずれかの操作されたポリペプチドと、適宜、少なくとも１種の医薬上許容される担体および／または賦形剤とを含む組成物もまた、具体的に考慮され、本明細書に例示される。

【0213】

組成物は、インビボまたはインビトロで、アルブミンと結合する能力を有する。特定の場合には、生体外で組成物のアルブミンとの複合体を形成すること、すなわち、組成物に外因性アルブミンを添加することは有効であり得る。このような組成物は、凍結乾燥され得、周囲温度での保存に適している製剤を提供する。したがって、本開示内容はまた、ヒト血清アルブミンなどのアルブミンをさらに含み、適宜、乾燥形態であり得る上記で定義されるような組成物を提供する。

【0214】

同時投与は、レプチン、レプチン類似体またはレプチン類似体アゴニスト操作されたポリペプチドを、第２の薬剤と別個に投与することによってか、またはレプチン、レプチン類似体もしくはレプチン類似体アゴニスト操作されたポリペプチドおよび第２の薬剤を含む単一医薬製剤を投与することによって達成され得る。第２の薬剤の適当な投与レジメンは、一般に、当技術分野で公知である。

【0215】

調製物はまた、望ましい場合には、当技術分野で公知のその他の活性物質（例えば、代謝分解を低下させるよう）またはその他の治療上活性な薬剤と同時投与され得る。

【0216】

アミリン。アミリンは、栄養素の摂取に応じて、インスリンと同時分泌される、膵臓β−細胞によって合成されるペプチドホルモンである。アミリンの配列は、哺乳類種中で高度に保存されており、当技術分野で公知のカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、カルシトニン、インターメジンおよびアドレノメデュリンに対して構造上の類似性を有する。アミリンの血糖調節作用は、栄養素によって刺激されるグルカゴン分泌の抑制によって循環におけるグルコース出現速度を調節することおよび胃内容排出を減速することによって、インスリンの血糖調節作用を補完する。インスリンによって治療されている糖尿病患者では、プラムリンチド、ヒトアミリンの合成および等効力類似体が、不適切に上昇した食後グルカゴン分泌を抑制することおよび胃内容排出を減速することによって食後血糖変動幅を低減する。ラットアミリン、ヒトアミリンおよびプラムリンチドの配列は、それぞれ以下のとおりである：
ラットアミリン：KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY（配列番号１０８）；
ヒトアミリン：KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY（配列番号１０９）；
プラムリンチド：KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY（配列番号１１０）。

【0217】

ダバリンチド（Ｄａｖａｌｉｎｔｉｄｅ）。ダバリンチドは、「ＡＣ−２３０７」としても知られ、さまざまな疾患適応症の治療において有用である強力なアミリンアゴニストである。各々、その全文が、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００６／０８３２５４およびＷＯ２００７／１１４８３８を参照のこと。ダバリンチドは、アミリンまたはカルシトニンおよびその類似体のＮ末端ループ領域、カルシトニンもしくはその類似体のα−ヘリックス領域の少なくとも一部のα−へリックス領域またはアミリンα−ヘリックス領域およびカルシトニンα−へリックス領域もしくはその類似体の一部を有するα−ヘリックス領域およびアミリンまたはカルシトニンのＣ末端テール領域を有するキメラペプチドである。ヒトカルシトニン、サケカルシトニンおよびダバリンチドの配列は以下のとおりである：
ヒトカルシトニン：CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP（配列番号１１１）；
サケカルシトニン：CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP（配列番号１１２）；
ダバリンチド：KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY（配列番号１１３）。

【0218】

何らかの理論に拘束されようとは思わないが、アミリンおよびダバリンチドおよびその断片および類似体は、完全な生物学的応答を誘発するのにＣ末端アミド化を必要とし得ると考えられる。アミリンおよび／またはダバリンチドおよびその断片および類似体を含む本明細書に記載されたものなどのアミリン化合物は、Ｃ末端でアミド化され得るということは理解される。

【0219】

「アミリンアゴニスト化合物」は、天然アミリンペプチド、アミリン類似体ペプチドおよびアミリンアゴニスト活性を有するその他の化合物（例えば、小分子）を含む。「アミリンアゴニスト化合物」は、天然供給源から誘導され得、合成であり得、または組換えＤＮＡ技術から誘導され得る。アミリンアゴニスト化合物は、アミリンアゴニスト受容体結合活性を有し、アミノ酸（例えば、天然、非天然またはそれらの組合せ）、ペプチドミメティクス、化学部分などを含み得る。当業者ならば、アミリン受容体結合アッセイを使用して、またはヒラメ筋アッセイにおけるアミリンアゴニスト活性を測定することによってアミリンアゴニスト化合物を認識されよう。一実施形態では、アミリンアゴニスト化合物は、本明細書に、その開示内容が、その全文で、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６８６，４１１号および米国公開第２００８／０１７６８０４号に記載されるものなどのアミリン受容体結合アッセイにおいて、約２００ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下または約５０ｎＭ以下のＩＣ_５０を有する。一実施形態では、アミリンアゴニスト化合物は、本明細書に、また米国特許第５，６８６，４１１号に記載されるものなどのヒラメ筋アッセイにおいて、約２０ｎＭ以下、約１５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下または約５ｎＭ以下のＥＣ_５０を有する。一実施形態では、アミリンアゴニスト化合物は、^{２５，２８，２９}Ｐｒｏ−ヒト−アミリン（配列番号５３）に対して少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有する。一実施形態では、アミリンアゴニスト化合物は、アミリン（例えば、ヒトアミリン、ラットアミリンなど）およびカルシトニン（例えば、ヒトカルシトニン、サケカルシトニンなど）のペプチドキメラである。適した、例示的アミリンアゴニスト化合物はまた、その開示内容が、その全文で、すべての目的のために、参照により本明細書に組み込まれる米国公開第２００８／０２７４９５２号に記載されている。

【0220】

本明細書において、「アミリン類似体」とは、ラットもしくはヒトのいずれか、または任意のその他の種に由来するアミリンの天然に生じる形態に対して少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミリンアゴニストを意味し、参照アミノ酸配列の挿入、置換、伸長および／または欠失を含めた修飾によってそれらから誘導される。

【0221】

アミリン類似体配列は、参照アミリンと少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％または９５％のアミノ酸配列同一性を有し得る。一態様では、類似体は、対照化合物に対して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはさらに１６のアミノ酸置換、挿入、伸長および／または欠失を有する。一実施形態では、アミリン類似体は、保存的または非保存的アミノ酸置換（非天然アミノ酸ならびにＬおよびＤ形態を含めた）を含み得る。これらの類似体は、好ましくは、ペプチド、ペプチド誘導体またはペプチドミミックである。典型的なアミリン類似体は、特に、３２〜３７個のアミノ酸の、例えば、２７〜４５個、特に、２８〜３８個さらには、３１〜３６個のペプチドとなる。

【0222】

ラットおよびヒトアミリンに対して同一性を有するアミリン類似体として、^{２５，２８，２９}Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（プラムリンチド）（配列番号１１０）；ｄｅｓ−^１Ｌｙｓ−ｈ−アミリン（配列番号１６１）；^２５Ｐｒｏ、^２６Ｖａｌ、^{２８，２９}Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１６２）；^１８Ａｒｇ、^{２５，２８}Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１６３）；ｄｅｓ−^１Ｌｙｓ、^１８Ａｒｇ、^{２５，２８}Ｐｒｏ−ｈ アミリン（配列番号１６４）；^１８Ａｒｇ、^{２５，２８，２９}Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１６５）；ｄｅｓ−^１Ｌｙｓ、^１８Ａｒｇ、^{２５，２８，２９}Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１６６）；ｄｅｓ−^１、Ｌｙｓ^{２５，２８，２９}Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１６７）；^２５Ｐｒｏ、^２６Ｖａｌ、^{２８，２９}Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１６８）；^２８Ｐｒｏ−ｈ−アミリン、２，７−Ｃｙｃｌｏ−［^２Ａｓｐ、^７Ｌｙｓ］−ｈ−アミリン（配列番号１６９）；^２−３７ｈ−アミリン（配列番号１７０）；^１Ａｌａ−ｈ−アミリン（配列番号１７１）；^２Ａｌａ−ｈ−アミリン（配列番号１７２）；^２，７Ａｌａ−ｈ−アミリン（配列番号１７３）；^１Ｓｅｒ−ｈ−アミリン（配列番号１７４）；^２９Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１７５）；^{２５，２８}Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１７６）；ｄｅｓ−^１Ｌｙｓ、^{２５，２８}Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１７７）；^２３Ｌｅｕ、^２５Ｐｒｏ、^２６Ｖａｌ、^{２８，２９}Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１７８）；^２３Ｌｅｕ^２５Ｐｒｏ^２６Ｖａｌ^２８Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１７９）；ｄｅｓ−^１Ｌｙｓ、^２３Ｌｅｕ、^２５Ｐｒｏ、^２６Ｖａｌ、^２８Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１８０）；^１８Ａｒｇ、^２３Ｌｅｕ、^２５Ｐｒｏ、^２６Ｖａｌ、^２８Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１８１）；^１８Ａｒｇ、^２３Ｌｅｕ、^{２５，２８，２９}Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１８２）；^１８Ａｒｇ^２３Ｌｅｕ、^{２５，２８}Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１８３）；^１７Ｉｌｅ、^２３Ｌｅｕ、^{２５，２８，２９}Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１８４）；^１７Ｉｌｅ、^{２５，２８，２９}Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１８５）；ｄｅｓ−^１Ｌｙｓ、^１７Ｉｌｅ、^２３Ｌｅｕ、^{２５，２８，２９}Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１８６）；^１７Ｉｌｅ、^１８Ａｒｇ、^２３Ｌｅｕ−ｈ−アミリン（配列番号１８７）；^１７Ｉｌｅ、^１８Ａｒｇ、^２３Ｌｅｕ、^２６Ｖａｌ、^２９Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１８８）；^１７Ｉｌｅ、^１８Ａｒｇ、^２３Ｌｅｕ、^２５Ｐｒｏ、^２６Ｖａｌ、^{２８，２９}Ｐｒｏ−ｈ−アミリン（配列番号１８９）；^１３Ｔｈｒ、^２１Ｈｉｓ、^２３Ｌｅｕ、^２６Ａｌａ、^２８Ｌｅｕ、^２９Ｐｒｏ、^３１Ａｓｐ−ｈ−アミリン（配列番号１９０）；^１３Ｔｈｒ、^２１Ｈｉｓ、^２３Ｌｅｕ、^２６Ａｌａ、^２９Ｐｒｏ、^３１Ａｓｐ−ｈ−アミリン（配列番号１９１）；ｄｅｓ−^１Ｌｙｓ、^１３Ｔｈｒ、^２１Ｈｉｓ、^２３Ｌｅｕ、^２６Ａｌａ、^２８Ｐｒｏ、^３１Ａｓｐ−ｈ−アミリン（配列番号１９２）；^１３Ｔｈｒ、^１８Ａｒｇ、^２１Ｈｉｓ、^２３Ｌｅｕ、^２６Ａｌａ、^２９Ｐｒｏ、^３１Ａｓｐ−ｈ−アミリン（配列番号１９３）；^１３Ｔｈｒ、^１８Ａｒｇ、^２１Ｈｉｓ、^２３Ｌｅｕ、^{２８，２９}Ｐｒｏ、^３１Ａｓｐ−ｈ−アミリン（配列番号１９４）；および^１３Ｔｈｒ、^１８Ａｒｇ、^２１Ｈｉｓ、^２３Ｌｅｕ、^２５Ｐｒｏ、^２６Ａｌａ、^{２８，２９}Ｐｒｏ、^３１Ａｓｐ−ｈ−アミリン（配列番号１９５）が挙げられる。

【0223】

適した例示的アミリンアゴニスト化合物はまた、ＰＣＴ特許公報ＷＯ２０１０／０８５７００に記載されている。

【0224】

アミリン類似体は、以下の式（Ｉ）の残基１〜３７のアミノ酸配列を含み、配列中、式（Ｉ）に示されるアミノ酸の最大２５％は、欠失されるか、または異なるアミノ酸で置換され得る：
X’-Xaa¹-Cys²-Asn³-Thr⁴-Ala⁵-Thr⁶-Cys⁷-Ala⁸-Thr⁹-Gln¹⁰-Arg¹¹-Leu¹²-Ala¹³-Asn¹⁴-Phe¹⁵-Leu¹⁶-Val¹⁷-His¹⁸-Ser¹⁹-Ser²⁰- Xaa²¹-Asn²²-Phe²³- Xaa²⁴- Xaa²⁵- Xaa²⁶- Xaa²⁷- Xaa²⁸- Xaa²⁹-Thr³⁰- Xaa³¹-Val³²-Gly³³-Ser³⁴-Asn³⁵-Thr³⁶-Tyr³⁷-X（配列番号８００） (I)。
式（Ｉ）中、Ｘ’は、水素、Ｎ末端キャッピング基または持続期間増強部分とのリンカーである。Ｘａａ^１は、Ｌｙｓまたは結合であり、Ｘａａ^２１は、Ｌｙｓ、ＣｙｓまたはＡｓｎであり、Ｘａａ^２４は、Ｌｙｓ、ＣｙｓまたはＧｌｙであり、Ｘａａ^２５は、Ｌｙｓ、ＣｙｓまたはＰｒｏであり、Ｘａａ^２６は、Ｌｙｓ、ＣｙｓまたはＩｌｅであり、Ｘａａ^２７は、Ｌｙｓ、ＣｙｓまたはＬｅｕであり、Ｘａａ^２８は、Ｌｙｓ、ＣｙｓまたはＰｒｏであり、Ｘａａ^２９は、Ｌｙｓ、ＣｙｓまたはＰｒｏであり、Ｘａａ^３１は、Ｌｙｓ、ＣｙｓまたはＡｓｎである。さらに、式（Ｉ）に関して、変数Ｘは、Ｃ末端官能性（例えば、Ｃ末端キャップ）を表す。Ｘは、置換または非置換アミノ、置換または非置換アルキルアミノ、置換または非置換ジアルキルアミノ、置換または非置換シクロアルキルアミノ、置換または非置換アリールアミノ、置換または非置換アラルキルアミノ、置換または非置換アルキルオキシ、置換または非置換アリールオキシ、置換または非置換アラルキルオキシまたはヒドロキシルである。式（Ｉ）の残基１〜３７の配列を有するポリペプチド成分のＣ末端が、官能性Ｘでキャップされている場合には、Ｘは、好ましくは、アミンであり、それによって、Ｃ末端アミドを形成する。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の残基１〜３７のアミノ酸の最大５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％またはさらに５０％が、式（Ｉ）のポリペプチド成分において欠失されるか、または置換される。いくつかの実施形態では、アミリン類似体成分は、式（Ｉ）に示されるアミノ酸配列に対して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはさらに１６のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、アミリン類似体は、式（Ｉ）のアミノ酸配列の残基１〜３７に関して定義された配列同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたアミリン類似体（ａｎａｌｇｏ）と式（Ｉ）の残基１〜３７の間の配列同一性は、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらに高い。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の残基１〜３７に示されるアミノ酸のうち最大５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％またはさらに少ないものが、欠失され得るか、または異なるアミノ酸で置換され得る。いくつかの実施形態では、配列同一性は、範囲７５％〜１００％内にある。いくつかの実施形態では、配列同一性は、範囲７５％〜９０％内にある。いくつかの実施形態では、配列同一性は、範囲８０％〜９０％内にある。いくつかの実施形態では、配列同一性は、少なくとも７５％である。いくつかの実施形態では、アミリン類似体は、式（Ｉ）の残基１〜３７の配列を有する。

【0225】

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のものを含めたアミリン類似体は、ポリペプチド成分の基礎を形成し、これに、適宜、リンカーを介して、１種または複数の持続期間増強部分が連結され、アミリンポリペプチドコンジュゲートを形成する。したがって、ポリペプチド成分は、好ましくは、共有結合によって、１種または複数の持続期間増強部分が付いている鋳型（「ポリペプチド鋳型」）として働く。持続期間増強部分のポリペプチド成分との連結は、本明細書に記載されるようなリンカーを介してであり得る。あるいは、持続期間増強部分の、ポリペプチド成分との連結は、直接共有結合によってであり得る。持続期間増強部分は、本明細書に記載されるような水溶性ポリマーであり得る。いくつかの実施形態では、複数の持続期間増強部分がポリペプチド成分に付いており、この場合には、各持続期間増強部分に対する各リンカーは、本明細書に記載されたリンカーから独立に選択される。

【0226】

本明細書に記載されたポリペプチド成分として有用であるアミリン類似体として、それだけには限らないが、以下の表３に提供される式（Ｉ）の残基１〜３７に示される化合物が挙げられる。それとは反対に示されない限り、明確に提供された配列を有するペプチドを含めた本明細書に記載されたすべてのペプチドが、遊離カルボキシレートおよびアミド化形態の両方で考慮される。

【0227】

【表3】

【0228】

用語「リンカー」などは、本明細書に記載されたアミリンポリペプチドコンジュゲートにおけるポリペプチド成分への持続期間増強部分の取付けに関連して、順に、結合に利用可能な結合価を有するポリペプチド成分と、結合に利用可能な結合価を有する持続期間増強部分と共有結合によって結合している二価の種（−Ｌ−）を意味する。ポリペプチド成分上の利用可能な結合部位は、側鎖残基（例えば、リシン、システイン、アスパラギン酸およびその相同体）であることが好都合である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド成分上の利用可能な結合部位は、リシンまたはシステイン残基の側鎖である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド成分上の利用可能な結合部位は、Ｎ末端アミンである。いくつかの実施形態では、ポリペプチド成分上の利用可能な結合部位は、Ｃ末端カルボキシルである。いくつかの実施形態では、ポリペプチド成分上の利用可能な結合部位は、その主鎖原子である。本明細書において、用語「連結アミノ酸残基」とは、適宜、リンカーを介して持続期間増強部分が付いている式（Ｉ）の残基１〜３７内のアミノ酸を意味する。

【0229】

いくつかの実施形態では、ポリペプチド成分を持続期間増強部分と共有結合によって連結するリンカーを有する化合物が提供される。リンカーはオプショナルである、すなわち、任意のリンカーは、簡単に、単結合であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、ポリペプチド成分の側鎖に付いている。いくつかの実施形態では、リンカーは、ポリペプチド成分の主鎖原子に付いている。

【0230】

別の態様では、配列番号１１０またはその類似体を有するプラムリンチドの誘導体であり、位置１のアミノ酸残基が存在せず（すなわち、ｄｅｓ−Ｌｙｓ^１）、位置２〜３７のアミノ酸残基がリシン残基またはシステイン残基で置換されており、前記リシン残基またはシステイン残基が、適宜、リンカーを介してポリエチレングリコールポリマーと連結しており、アミノ酸番号付けが配列番号１１０におけるアミノ酸番号と一致するアミリンポリペプチドコンジュゲートが提供される。

【0231】

別の態様では、本発明は、配列番号１１０またはその類似体を有するプラムリンチドの誘導体であり、位置１のアミノ酸残基が存在せず（すなわち、ｄｅｓ−Ｌｙｓ^１）、位置２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３１、３２、３３、３４、３５、３６または３７のうちいずれか１つにおけるアミノ酸残基が、リシン残基で置換されており、前記リシン残基が、適宜、リンカーを介してポリエチレングリコールポリマーと連結しているアミリンポリペプチドコンジュゲートに関する。

【0232】

別の態様では、本発明は、配列番号１１０またはその類似体を有するプラムリンチドの誘導体であり、位置１のアミノ酸残基が存在せず（すなわち、ｄｅｓ−Ｌｙｓ^１）、位置２１、２４〜２９、または３１のうちいずれか１つにおけるアミノ酸残基が、リシン残基で置換されており、前記リシン残基が、適宜、リンカーを介してポリエチレングリコールポリマーと連結しているアミリンポリペプチドコンジュゲートに関する。

【0233】

別の態様では、本発明は、配列番号１１０またはその類似体を有するプラムリンチドの誘導体であり、位置１のアミノ酸残基が存在せず（すなわち、ｄｅｓ−Ｌｙｓ^１）、位置２１のアミノ酸残基が、リシン残基で置換されており、前記リシン残基が、適宜、リンカーを介してポリエチレングリコールポリマーと連結しているアミリンポリペプチドコンジュゲートに関する。

【0234】

別の態様では、本発明は、配列番号１１０またはその類似体を有するプラムリンチドの誘導体であり、位置１のアミノ酸残基が存在せず（すなわち、ｄｅｓ−Ｌｙｓ^１）、位置２４のアミノ酸残基が、リシン残基で置換されており、前記リシン残基が、適宜、リンカーを介してポリエチレングリコールポリマーと連結しているアミリンポリペプチドコンジュゲートに関する。

【0235】

別の態様では、本発明は、配列番号１１０またはその類似体を有するプラムリンチドの誘導体であり、位置１のアミノ酸残基が存在せず（すなわち、ｄｅｓ−Ｌｙｓ^１）、位置２５のアミノ酸残基が、リシン残基で置換されており、前記リシン残基が、適宜、リンカーを介してポリエチレングリコールポリマーと連結しているアミリンポリペプチドコンジュゲートに関する。

【0236】

別の態様では、本発明は、配列番号１１０またはその類似体を有するプラムリンチドの誘導体であり、位置１のアミノ酸残基が存在せず（すなわち、ｄｅｓ−Ｌｙｓ^１）、位置２６のアミノ酸残基が、リシン残基で置換されており、前記リシン残基が、適宜、リンカーを介してポリエチレングリコールポリマーと連結しているアミリンポリペプチドコンジュゲートに関する。

【0237】

別の態様では、本発明は、配列番号１１０またはその類似体を有するプラムリンチドの誘導体であり、位置１のアミノ酸残基が存在せず（すなわち、ｄｅｓ−Ｌｙｓ^１）、位置２７のアミノ酸残基が、リシン残基で置換されており、前記リシン残基が、適宜、リンカーを介してポリエチレングリコールポリマーと連結しているアミリンポリペプチドコンジュゲートに関する。

【0238】

別の態様では、本発明は、配列番号１１０またはその類似体を有するプラムリンチドの誘導体であり、位置１のアミノ酸残基が存在せず（すなわち、ｄｅｓ−Ｌｙｓ^１）、位置２８のアミノ酸残基が、リシン残基で置換されており、前記リシン残基が、適宜、リンカーを介してポリエチレングリコールポリマーと連結しているアミリンポリペプチドコンジュゲートに関する。

【0239】

別の態様では、本発明は、配列番号１１０またはその類似体を有するプラムリンチドの誘導体であり、位置１のアミノ酸残基が存在せず（すなわち、ｄｅｓ−Ｌｙｓ^１）、位置２９のアミノ酸残基が、リシン残基で置換されており、前記リシン残基が、適宜、リンカーを介してポリエチレングリコールポリマーと連結しているアミリンポリペプチドコンジュゲートに関する。

【0240】

別の態様では、本発明は、配列番号１１０またはその類似体を有するプラムリンチドの誘導体であり、位置１のアミノ酸残基が存在せず（すなわち、ｄｅｓ−Ｌｙｓ^１）、位置３１のアミノ酸残基が、リシン残基で置換されており、前記リシン残基が、適宜、リンカーを介してポリエチレングリコールポリマーと連結しているアミリンポリペプチドコンジュゲートに関する。

【0241】

いくつかの実施形態では、持続期間増強部分は、水溶性ポリマーである。「水溶性ポリマー」とは、本明細書に記載された方法にとって有用であるよう、当技術分野で公知のように、例えば、温度、イオン濃度などの生理学的条件下で水に十分に可溶性であるポリマーを意味する。水溶性ポリマーは、このような水溶性ポリマーが付いているペプチドまたはその他の生体分子の溶解度を増大し得る。実際、このような取付けは、インビボで、投与されるタンパク質の循環寿命、水溶解度および／または抗原性を改善するための手段として提案されている。例えば、米国特許第４，１７９，３３７号、米国公開出願第２００８／００３２４０８号を参照のこと。この目的に向けて、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）などといった、多数の異なる水溶性ポリマーおよび取付け化学（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ）が使用されている。

【0242】

いくつかの実施形態では、連結される持続期間増強部分は、ポリエチレングリコールを含む。治療上使用可能なポリペプチドを得ようとして、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）が使用されてきた。例えば、Zalipsky, S., 1995、Bioconjugate Chemistry, 6:150-165; Mehvar, R., 2000, J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3:125-136を参照のこと。当業者には理解されるであろうが、ＰＥＧ主鎖［（ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−）_ｎ、ｎ：反復モノマーの数］は、可動性であり両親媒性である。何らかの理論または作用機序に拘束されようとは思わない、長い鎖のようなＰＥＧ分子または部分は、極度に水和しており、水性媒体中にある場合には、迅速に動くと考えられている。この迅速な動きが、ＰＥＧに大容量を一掃させ、その他の分子のアプローチおよび干渉を妨げさせる考えられている。結果として、ＰＥＧポリマー鎖は、別の化学実体（ペプチドなど）に付いている場合には、免疫応答およびその他のクリアランス機序からこのような化学実体を保護し得る。結果として、ペグ化は、薬物動態を最適にすること、バイオアベイラビリティを増大することならびに免疫原性および投薬頻度を低減することによって、薬物有効性および安全性の改善につながり得る。「ペグ化」とは、通常の意味で、ＰＥＧ部分の、別の化合物とのコンジュゲーションを指す。例えば、ＰＥＧを付けると、タンパク質がタンパク質分解から保護されることがわかっている。例えば、Blomhoff, H. K. et al., 1983, Biochim Biophys Acta, 757:202-208を参照のこと。それとは反対に明確に示されない限り、用語「ＰＥＧ」、「ポリエチレングリコールポリマー」などは、ポリエチレングリコールポリマーおよびメトキシ−ＰＥＧ（ｍＰＥＧ）を含めたその誘導体を指す。

【0243】

ＰＥＧおよび関連ポリマーなどのポリマー部分を、タンパク質上に見られる反応性基に付けるために、さまざまな手段が使用されてきた。例えば、米国特許第４，１７９，３３７号、同４，００２，５３１号；Abuchowski et al., 1981、in “Enzymes as Drugs”,J. S. Holcerberg and J. Roberts, (Eds.), pp. 367-383; Zalipsky, S., 1995, Bioconjugate Chemistry, 6:150-165を参照のこと。タンパク質を修飾するためのＰＥＧおよびその他のポリマーの使用は論じられている。例えば、Cheng, T.-L. et al., 1999m, Bioconjugate Chem., 10:520-528; Belcheva, N. et al.,1999, Bioconjugate Chem., 10:932-937; Bettinger, T. et al., 1998, Bioconjugate Chem., 9:842-846;Huang, S.-Y. et al., 1998, Bioconjugate Chem., 9:612-617; Xu, B. et al. 1998, Langmuir, 13:2447-2456; Schwarz, J. B. et al., 1999, J. Amer. Chem. Soc., 121:2662-2673; Reuter, J. D. et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10:271-278; Chan, T.-H. et al., 1997, J. Org. Chem., 62:3500-3504を参照のこと。タンパク質中の典型的な取付け部位として、リシン残基上またはＮ末端のものなどの一次アミノ基、システイン側鎖上のものなどのチオール基およびグルタミン酸またはアスパラギン酸残基上またはＣ末端のものなどのカルボキシル基が挙げられる。取付けの一般的な部位として、糖タンパク質の糖残基に対するもの、システインまたは標的ポリペプチドのＮ末端およびリシンに対するものがある。用語「ペグ化」などは、本明細書に記載されるような、および／または当技術分野で公知のような、ポリエチレングリコールの、適宜、リンカーを介したポリペプチドまたはその他の生体分子への共有結合による取付けを指す。

【0244】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたアミリンポリペプチドコンジュゲート中のＰＥＧ部分は、指定の範囲内の名目上の分子量を有する。当技術分野で通例であるように、ＰＥＧ部分の大きさは、典型的にはキロダルトン（ｋＤ）で提供される名目上の分子量への言及によって示される。分子量は、数、重量、粘度および「Ｚ」平均分子量を含めた当技術分野で公知のさまざまな方法で算出される。ＰＥＧなどといったポリマーは、名目上の平均値あたりの分子量の分布として存在するということは理解される。

【0245】

ＰＥＧの分子量についての技術用語の例示として、用語「ｍＰＥＧ４０ＫＤ」とは、４０キロダルトンの名目上の分子量を有するメトキシポリエチレングリコールポリマーを指す。その他の分子量のＰＥＧへの言及は、この慣例に従う。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、１０〜１００ＫＤ、２０〜８０ＫＤ、２０〜６０ＫＤまたは２０〜４０ＫＤの範囲の名目上の分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５またはさらに１００ＫＤの名目上の分子量を有する。ＰＥＧ部分は、２０、２５、３０、４０、６０または８０ＫＤの分子量を有することが好ましい。

【0246】

ポリペプチドの誘導体化に有用なＰＥＧ分子は、典型的には、当技術分野で公知のように、直鎖、分岐およびＷａｒｗｉｃｋ（すなわち、ＰｏｌｙＰＥＧ（登録商標））クラスのＰＥＧに分類される。それとは反対に明確に示されない限り、本明細書に記載されたＰＥＧ部分は、直鎖ＰＥＧである。さらに、用語「２アーム分岐」、「Ｙ型」などは、当技術分野で公知のように、分岐ＰＥＧ部分を指す。用語「Ｗａｒｗｉｃｋ」は、ＰＥＧとの関連において、「コーム」または「コーム型」ＰＥＧとしても知られ、当技術分野で公知のように、主鎖、典型的には、ポリ（メタクリレート）に付いているさまざまなマルチアームＰＥＧを指す。本明細書において提供された表中に使用された慣例を含めた命名法に関して、反対に表示がない場合には、ＰＥＧ部分は、ペプチドの主鎖に付いている。例えば、化合物１１９は、ｍＰＥＧ４０ＫＤの、化合物１０１のＮ末端窒素とのコンジュゲーションの結果である。同様に、化合物１２０は、ｍＰＥＧ４０ＫＤの、化合物１０２のＮ末端窒素とのコンジュゲーションの結果である。アミノ酸の標準的な一文字略語が使用され得、同様に三文字略語も使用され得る。例えば、化合物１２４は、化合物１０９の位置２６の残基が、リシンと置換されており、リシン２６（すなわち、Ｋ^２６）のペンダントアミン官能基が、ＰＥＧ４０ＫＤ部分とコンジュゲートされている化合物１１０の類似体である。例示的化合物が以下の表４中に提供されている。

【0247】

【表4】

【0248】

化学部分が付いているアミリンおよびアミリン類似体は、アミリン誘導体である。アミリン誘導体は、そのアミノ酸側鎖、α−炭素原子、末端アミノ基または末端カルボン酸基のうちの１つまたは複数の化学修飾がなされているアミリンを構成し得る。化学的修飾として、制限するものではないが、１つまたは複数の化学部分を付けること、新規結合を作製することおよび１つまたは複数の化学部分を除去することが挙げられる。アミノ酸側鎖の修飾として、制限するものではないが、アルキル化、アシル化、エステル形成、アミド形成、マレイミドカップリング、リシンε−アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジンまたはリシンのＮ−アルキル化、グルタミン酸またはアスパラギン酸カルボン酸基のアルキル化およびグルタミンまたはアスパラギンの脱アミド化が挙げられる。末端アミノの修飾として、制限するものではないが、デスアミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ−低級アルキルおよびＮ−アシル修飾が挙げられる。末端アミノの修飾として、制限するものではないが、デスアミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ−低級アルキルおよびアルキルアシル、分岐アルキルアシル、アルキルアリール−アシルなどのＮ−アシル修飾が挙げられる。末端カルボキシ基の修飾として、制限するものではないが、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド、アリールアミド、アルキルアリールアミドおよび低級アルキルエステル修飾が挙げられる。低級アルキルは、Ｃ_１−Ｃ_４アルキルである。さらに、１種または複数の側鎖または末端基は、合成化学の当業者に公知の保護基によって保護されてもよい。アミノ酸のα−炭素は、一メチル化または二メチル化されてもよい。

【0249】

アミリン誘導体は、ポリ−ｈｉｓ、ポリ−ａｒｇ、ポリ−ｌｙｓおよびポリ−ａｌａなどのポリアミノ酸の付加によってか、または短いアルキルおよび制限されたアルキル（例えば、分岐、環状、融合、アダマンチル）および芳香族基を含む小分子置換基の付加によって、１つまたは複数の、上記のようなポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）などの水溶性ポリマー分子または種々の長さの脂肪酸鎖（例えば、ステアリル、パルミトイル、オクタノイル）とコンジュゲートしているアミリンおよびアミリン類似体を含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマー分子は、約５００ダルトン〜約６０，０００ダルトンの範囲の分子量を有することとなる。抗肥満症剤として、本発明の操作されたポリペプチドと組み合わせて使用するのに適したアミリン誘導体については、例えば、ＰＣＴ特許公報ＷＯ２００７／１０４７８９、ＷＯ２００９／０３４１１９およびＷＯ２０１０／０４６３５７を参照のこと。

【0250】

このようなポリマー−コンジュゲーションは、Ｎ−もしくはＣ−末端で、または本明細書に開示されたアミリンまたはアミリン類似体の配列内のアミノ酸残基の側鎖で単独で起こり得る。あるいは、このようなアミリンまたはアミリン類似体のアミノ酸配列に沿って複数の部位の誘導体化があり得る。１種または複数のアミノ酸の、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステインでの置換は、誘導体化のためのさらなる部位を提供し得る。いくつかの実施形態では、アミリンまたはアミリン類似体は、１つ、２つまたは３つのポリマー分子とコンジュゲートされ得る。

【0251】

いくつかの実施形態では、水溶性ポリマー分子は、アミノ、カルボキシルまたはチオール基と連結され、ＮもしくはＣ末端によって、またはリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸もしくはシステインの側鎖で連結され得る。あるいは、水溶性ポリマー分子は、ジアミンおよびジカルボキシル基と連結され得る。いくつかの実施形態では、アミリンまたはアミリン類似体は、リシンアミノ酸上のεアミノ基によって１個、２個または３個のＰＥＧ分子とコンジュゲートされる。

【0252】

驚くべきことに、本発明の操作されたポリペプチドが、特定のその他の抗肥満症化合物と組み合わせて投与されると、中程度の肥満（３０以上のＢＭＩ）および重度の肥満（３５以上のＢＭＩ）の対象の両方に、有益な相乗的抗肥満症効果を提供することを発見した。例えば、米国公開出願第２００８／０２０７５１２号に先に記載されたように、肥満の対象には、レプチン抵抗性の状態が存在することがわかっている。例えば、Tenenbaum, D., HHMI Bulletin, pp. 25-27 (March 2003); Chicurel, M., Nature, Vol. 404, pp. 538-540 (2000); Scarpace et al., Diabetalogia, Vol. 48, pp. 1075-1083 (2005);およびBays et al., Obesity Research, Vol. 12,(8), pp. 1197-1211 (2004)も参照のこと。このレプチン抵抗性は、少なくとも一部は、肥満の対象における異常に高い血清レプチンレベルの存在を特徴とし、内因的に投与されようと、外因的に投与されようと、これらの対象をレプチンに対して効率的に反応できなくさせる。このレプチン抵抗性は、中程度の肥満の対象では、レプチン（例えば、メトレレプチン）および特定のその他の抗肥満症化合物を含めた併用療法を用いて克服され得ることがこれまでにわかっている。例えば、米国公開出願第２００８／０２０７５１２号を参照のこと。レプチン併用療法の相乗的抗肥満症効果は、おそらくは、重度のレプチン抵抗性のために重度の肥満の高ＢＭＩ対象では存在しないことがさらにわかった。本発明者らは、驚くべきことに、本発明の操作された化合物は、特定のその他の抗肥満症化合物と組み合わせて投与されると、重度のレプチン抵抗性さえも克服できることを発見した。したがって、一方の抗肥満症剤が、本発明の操作されたポリペプチドであり、もう一方の抗肥満症剤が、アミリン、アミリン類似体、アミリンアゴニストまたはアミリン誘導体（すなわち、アミリン剤）である少なくとも２種の異なる抗肥満症剤を投与することによって、高ＢＭＩ対象を含めた対象において、肥満症および肥満症関連状態、障害および疾患を治療する方法もまた本発明によって提供される。

【0253】

特定の実施形態では、本発明は、本発明の操作されたポリペプチドから選択される第１の抗肥満症剤の、アミリン、アミリン類似体、アミリンアゴニストまたはアミリン誘導体から選択される第２の抗肥満症剤と組み合わせた投与を含み、薬剤の投与が、いずれかの薬剤単独の投与と比較して相乗作用をもたらす、それを必要とする対象において肥満症を治療する方法を提供する。

【0254】

一態様では、本発明の方法は、投与された薬剤の間で相乗的抗肥満症効果を提供する。したがって、特定の実施形態では、抗肥満症剤の組合せの投与は、抗肥満症剤単独の投与（単剤療法）の結果の組合せよりも大きい効果、例えば、栄養素利用性の減少、体重の減少、食物摂取の減少、代謝の増大をもたらす。

【0255】

「低下した栄養素利用性」とは、身体が、脂肪として貯蔵するための身体にとって利用可能な栄養素を減少させる任意の手段を含むものとする。言い換えれば、栄養素利用性の減少は、それだけには限らないが、食欲を減少させること、満腹を増大すること、食物の選択／味覚嫌悪に影響を及ぼすこと、代謝の増大および／または食物吸収の低減もしくは阻害を含む手段によるものであり得る。影響を受け得る例示的機序として、胃内容排出の遅延または腸における食物の吸収の減少が挙げられる。

【0256】

本明細書において、「それを必要とする対象」とは、過体重、肥満であるか、または体重減少を望む対象を含む。肥満対象は、中程度の肥満、低ＢＭＩ集団および重度の肥満、高ＢＭＩ集団の両方を含む。さらに、インスリン抵抗性、グルコース不耐性であるか、または任意の形態の真性糖尿病（例えば、１型、２型または妊娠糖尿病）を有する対象が、本発明の方法から恩恵を受け得る。

【0257】

「代謝速度」とは、時間単位あたりの放散された／費やされたエネルギーの量を意味する。単位時間あたりの代謝は、食物消費、熱として放出されるエネルギーまたは代謝プロセスにおいて使用される酸素によって推定され得る。一般に、体重を減少させたい場合には、より高い代謝速度を有することが望ましい。例えば、高い代謝速度を有する人は、その活動について低い代謝速度を有する人よりも、多くのエネルギーを費やし（例えば、身体が、より多くのカロリーを燃やし）、活動を行うことができる可能性がある。

【0258】

本明細書において、「除脂肪質量」または「除脂肪体重」とは、筋肉および骨を指す。除脂肪体重は、必ずしも、脂肪を含まない質量を示すわけではない。除脂肪体重は、中枢神経系（脳および脊髄）、骨の骨髄および内臓内の小さいパーセンテージの脂肪（おおよそ３％）を含有する。除脂肪体重は、密度の点で測定される。脂肪質量および除脂肪質量を測定する方法として、それだけには限らないが、水中体重法、空気置換プレチスモグラフ、Ｘ線、ＤＥＸＡスキャン、ＭＲＩおよびＣＴスキャンが挙げられる。特定の実施形態では、脂肪質量および除脂肪質量は、当技術分野で公知の水中体重法を使用して測定される。

【0259】

「脂肪分布」とは、身体における脂肪沈着の位置を意味する。このような脂肪沈着の位置として、例えば、皮下、内臓および異所性脂肪貯蔵所が挙げられる。

【0260】

「皮下脂肪」とは、皮膚表面の直下の脂質の蓄積を意味する。対象における皮下脂肪の量は、皮下脂肪の測定のために利用可能な任意の方法を使用して測定され得る。皮下脂肪を測定する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、その全文が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５３０，８８６号に記載されるもの。

【0261】

「内臓脂肪」とは、内臓脂肪組織としての脂肪の蓄積を意味する。内臓脂肪は、重要な臓器を取り囲み、肝臓によって代謝されて、血液コレステロールを生成し得る。内臓脂肪は、多嚢胞性卵巣症候群、メタボリックシンドロームおよび心血管疾患などの状態のリスクの増大と関連している。

【0262】

「異所性脂肪貯蔵」とは、除脂肪体重（例えば、骨格筋、心臓、肝臓、膵臓、腎臓、血管）を構成する組織および臓器内の、およびそれらの周囲の脂質蓄積を意味する。一般に、異所性脂肪貯蔵とは、身体の古典的な脂肪組織貯蔵所の外側の脂質の蓄積である。

【0263】

本明細書において、当技術分野で十分に理解されるように、「治療」は、臨床結果を含めた、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。疾患、障害または状態を「治療すること」または「緩和すること」とは、障害を治療していないことと比較して、状態、障害もしくは病状の程度および／もしくは望ましくない臨床症状が減少することならびに／または進行の経時的推移が減速もしくは延長されることを意味する。例えば、肥満症の治療では、体重の減少、例えば、体重の少なくとも５％の減少が、望ましい治療結果の一例である。本発明の目的上、有益なまたは所望の臨床結果として、それだけには限らないが、１種または複数の症状の軽減または寛解、疾患の程度の減少、安定した（すなわち、悪化しない）病状、疾患進行の遅延または減速、病状の寛解または緩和および検出可能であろうと、検出不可能であろうと、緩解（部分的であろうと、全体的であろうと）が挙げられる。「治療」はまた、治療を受けていない場合に予測される生存と比較して生存を延長することを意味し得る。さらに、治療は、必ずしも１用量の投与によって起こるわけではなく、一連の用量の投与時に起こることが多い。したがって、１回または複数の投与において、治療上有効な量、緩和するのに十分な量または疾患、障害もしくは状態を治療するのに十分な量が投与され得る。

【0264】

本明細書において、用語「治療上有効な量」とは、治療されている障害の症状の軽減を含む、研究者、獣医、医師またはその他の臨床医によって捜し求められている組織、系、対象またはヒトにおける生物学的または医学的反応を誘発する組成物中の活性化合物の量を意味する。本発明の治療の新規方法は、当業者に公知の障害のためのものである。

【0265】

本明細書において、用語「予防的に有効な量」とは、肥満症または肥満症関連障害、状態または疾患のリスクとして、対象において肥満症または肥満症関連障害、状態または疾患の発症を防ぐための、研究者、獣医、医師またはその他の臨床医によって捜し求められている組織、系、対象またはヒトにおける生物学的または医学的反応を誘発する組成物中の活性化合物の量を意味する。

【0266】

本発明の別の態様では、代謝障害を発生するリスクを低減する方法が提供され、方法は、対象の体重を減少するのに有効な量の抗肥満症剤の組合せを対象へ投与することを含む。

【0267】

本発明のいくつかの実施形態では、対象において代謝速度を増大するために、対象において代謝速度の低減を減少させるために、または対象において代謝速度を保つために本発明の方法が使用される。特定の実施形態では、代謝速度は、除脂肪身体組織を上回る、エネルギー供給源としての身体の脂肪の優先的使用を含み得る。一態様では、除脂肪体重は、抗肥満症剤の組合せの投与後に減少しない。別の態様では、除脂肪体重の低減は、抗肥満症剤の組合せの投与後に減少されるか、防がれる。さらに別の態様では、除脂肪体重は、抗肥満症剤の組合せの投与後に増大する。エネルギー供給源としての脂肪のこのような優先傾向は、治療期間の開始および終了時に総体重および脂肪含量を測定することによって確認される、脂肪組織の量と除脂肪身体組織とを比較することによって決定され得る。代謝速度の増大は、一定期間にわたる対象によるカロリーまたは別のエネルギー供給源の、抗肥満症剤の組合せの投与を伴わない実質的に同様または同一である条件下での別の期間にわたる対象によるカロリーまたはその他のエネルギー供給源の使用のレベルと比較したより高レベルの使用である。特定の実施形態では、代謝速度は、抗肥満症剤の組合せの投与を伴わない実質的に同様または同一である条件下での別の期間にわたる対象によるカロリーまたはその他のエネルギー供給源の使用のレベルと比較して、対象において少なくとも約５％増大され、その他の実施形態では、代謝速度は、対象において少なくとも約１０％、１５％、２０％ ２５％、３０％または３５％増大される。代謝速度の増大は、例えば、呼吸熱量計を使用して測定され得る。これらの実施形態において使用されるような抗肥満症剤の有効量とは、薬剤を投与されていない対象または薬剤のうち１種のみを投与されている対象と比較して、組合せで投与された場合に、対象において代謝速度を増大するのに有効な各薬剤の量である。

【0268】

別の実施形態では、対象において代謝速度の低減を減少させる方法が提供される。このような代謝速度の低減は、例えば、カロリーを低下させた食事、制限食または体重減少による代謝速度の低下につながる任意の状態または栄養レジメンおよび理学レジメンの結果であり得る。制限食は、食物の種類もしくは食物の量の両方に関して許容または禁止を含み、または必ずしもカロリーに基づいてではなく、両方とも食事において許可される。例えば、個々の食事におけるように、身体は、カロリー摂取の低下に基づく代謝速度の低下を代償する。本質的には、身体は、食物の必要量を下方制御し、それによって、少ない食物で存続する。食事療法を継続するにつれ、カロリー摂取の閾値は低下する。食事制限を終了すると、低下したカロリー摂取閾値および低い基礎代謝速度のために、個体は、典型的には、正常な食事を取りながら体重が増大する（NIH Technology Assessment Conference Panel (1992) Ann. Intern. Med. 116:942-949; Wadden (1993) Ann. Intern. Med. 119:688-693）。一態様では、代謝速度の喪失が、カロリーの低下した食事または体重減少の結果である場合に、対象において代謝速度の喪失を低下させる方法が提供される。このような方法を使用することによって、対象の代謝速度の低下が、対象において、少なくとも約１０％、１５％、２０％ ２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％減少する。このような方法については、代謝速度の喪失または低下につながる状態または栄養的および理学レジメンが開始される時点で、抗肥満症剤の組合せを投与することが望ましいことであり得る。しかし、状態または栄養レジメンおよび理学レジメンが開始される前に、薬剤の投与は開始されることも考慮される。一例では、代謝速度は、呼吸熱量計を使用して測定される。この実施形態において使用される抗肥満症剤の有効量とは、組み合わせて投与される場合に、対象における代謝速度の低下を減少させるのに有効な各薬剤の量である。

【0269】

別の態様では、組み合わせた抗肥満症剤の有効量を対象に投与することを含む、代謝プラトーを低下させる方法が提供される。特定の実施形態では、対象は、例えば、カロリーの低下した食事、運動の増大またはそれらの組合せのために、体重が減少しているか、体重が減少してしまっている。「代謝プラトー」とは、身体が、カロリーまたはエネルギー投入の変化に適応する定常代謝速度の時間間隔を意味する。カロリー投入または消費の変化は、例えば、カロリーを抑えた食事または身体活動の増大の結果であり得る。このようなプラトーは、例えば、体重減少が遅いか、または停止する場合に体重減少レジメンの間に観察され得る。特定の実施形態では、本発明の方法は、抗肥満症剤の組合せの投与を伴わない実質的に同様または同一である条件下での同一期間にわたる、そうでなければ同一である対象における代謝プラトーの期間と比較して、対象において代謝プラトーの期間を低減する。その他の実施形態では、本発明の方法は、抗肥満症剤の組合せの投与を伴わない実質的に同様または同一である条件下での同一期間にわたる、そうでなければ同一である対象における代謝プラトーの頻度と比較して、代謝プラトーの頻度を低減する。さらにその他の実施形態では、本発明の方法は、抗肥満症剤の組合せの投与を伴わない実質的に同様または同一である条件下での同一期間にわたる、そうでなければ同一である対象における代謝プラトーの発生と比較して、代謝プラトーの発生を遅延する。特定の実施形態では、代謝プラトーは、体重減少が減少したか、または体重減少がない期間を図で示すことによって同定される。特定の実施形態では、少なくとも１つの代謝プラトーが低減される。その他の実施形態では、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の代謝プラトーが低減される。別の態様では、代謝プラトーは、同一または同様の条件下で抗肥満症剤の組合せを投与されていない対象と比較して、１日遅延される。その他の態様では、代謝プラトーは、対象において２日、３日、４日、５日、６日、１週間、１０日、２週間または３週間遅延される。

【0270】

さらにその他の実施形態では、対象において代謝速度を保つ方法が提供される。特定の実施形態では、対象は、例えば、カロリーを抑えた食事、制限食または予測される体重減少の開始のために、代謝速度を喪失するリスクにあり得る。代謝速度を保つことは、抗肥満症剤の組合せの投与を伴わない実質的に同様または同一である条件下での同一期間にわたる、そうでなければ同一である対象によるカロリーまたはその他のエネルギー供給源の使用のレベルと比較して、一定期間にわたって対象によるカロリーまたは別のエネルギー供給源の使用のレベルを維持することである。一態様では、代謝速度は、代謝速度の低減をもたらす事象の開始前の対象の代謝速度の１５％以内に維持される。その他の態様では、代謝速度は、対象の代謝速度の１０％以内、７％以内、５％以内、３％以内またはそれより少なく維持される。一態様では、抗肥満症剤の組合せは、カロリーを抑えた食事、制限食または運動レジメンの開始時に投与される。

【0271】

代謝速度は、このような速度を調べるために利用可能な任意の方法を使用して、例えば、呼吸熱量計を使用して評価され得る。このような方法および代謝速度をアッセイするためのデバイスは、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第４，５７２，２０８号、第４，８５６，５３１号、第６，４６８，２２２号、第６，６１６，６１５号、第６，０１３，００９号および第６，４７５，１５８号に記載されている。あるいは、動物の代謝速度は、食事療法期間後に動物によって異化された除脂肪組織対脂肪組織の量を測定することによって評価され得る。したがって、総体重および脂肪含量は、食事療法期間の最後に測定され得る。ラットでは、総体脂肪を調べるために頻繁に使用される方法は、後腹膜脂肪パッド、後腹膜中に位置する脂肪体、腹部壁の後ろ側と壁側腹膜の後ろ側の間の領域を外科的に採取し、秤量することである。パッド重量は、動物の体脂肪パーセントと直接的に関連すると考えられている。ラットにおける体重と体脂肪の関係は、直線的であるので、肥満の動物は、相応して高いパーセントの体脂肪および後腹膜脂肪パッド重量を有する。

【0272】

本発明の別の態様では、対象の代謝速度を増大させることによって脂肪質量を減少させるのに有効な量の抗肥満症剤の組合せを投与することを含む、対象における代謝速度を増大させることによって脂肪質量を低減する方法が提供される。脂肪質量は、総体重のパーセンテージとして表され得る。いくつかの態様では、脂肪質量は、治療の経過にわたって、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％または少なくとも２５％低減される。一態様では、対象の除脂肪質量は、治療の経過にわたって低減されない。別の態様では、対象の除脂肪質量は、治療の経過にわたって維持されるか、または増大される。別の態様では、対象は、カロリーを抑えた食事または制限食にある。「カロリーを抑えた食事」とは、対象が、同一対象の正常な食事と比較して、１日あたりより少ないカロリーを摂取していることを意味する。一例では、対象は、１日あたり、少なくとも５０少ないカロリーを消費している。その他の例では、対象は、１日あたり、少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００少ないカロリーを消費している。

【0273】

本発明の特定の実施形態では、対象において脂肪分布を変更するのに有効な量の抗肥満症剤の組合せを投与することを含む、対象において脂肪分布を変更する方法が提供される。一態様では、変更は、対象における内臓または異所性脂肪または両方の代謝の増大に起因する。いくつかの実施形態では、方法は、皮下脂肪に対してよりも、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％または５０％大きい割合での内臓または異所性脂肪または両方の代謝を含む。一態様では、本方法は、好都合な脂肪分布をもたらす。特定の実施形態では、好都合な脂肪分布は、内臓脂肪、異所性脂肪または両方に対する皮下脂肪の割合の増大である。一態様では、本方法は、例えば、筋肉細胞質量の増大の結果としての除脂肪体重の増大を含む。

【0274】

その他の実施形態では、対象において皮下脂肪の量を低減するのに有効な量の抗肥満症剤の組合せを、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における皮下脂肪の量を低減する方法が提供される。一例では、対象において皮下脂肪の量は、少なくとも約５％低減される。その他の例では、皮下脂肪の量は、抗肥満症剤の投与の前の対象と比較して、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％ ４０％または５０％低減される。

【0275】

本明細書に記載された方法を使用して、対象において内臓脂肪の量を低減できる。一例では、内臓脂肪は、対象において少なくとも約５％低減される。その他の例では、内臓脂肪は、抗肥満症剤の組合せの投与前の対象と比較して、対象において少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％ ４０％または５０％低減される。内臓脂肪は、対象における内臓脂肪の量を調べるために利用可能な任意の手段によって測定され得る。このような方法として、例えば、ＣＴスキャニングおよびＭＲＩの手段による腹部断層撮影が挙げられる。内臓脂肪を調べるためのその他の方法は、例えば、米国特許第６，８６４，４１５号、同６，８５０，７９７号および同６，４８７，４４５号に記載されている。

【0276】

特定の実施形態では、対象において異所性脂肪の蓄積を防ぐ方法または異所性脂肪の量を低減する方法が提供され、この方法は、対象において異所性脂肪の蓄積を防ぐのに、または異所性脂肪の量を低減するのに有効な量の抗肥満症剤の組合せを、それを必要とする対象に投与することを含む。一例では、異所性脂肪の量は、抗肥満症剤の組合せの投与前の対象と比較して、対象において少なくとも約５％低減される。その他の例では、異所性脂肪の量は、対象において少なくとも約１０％または少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％ ４０％または５０％低減される。あるいは、異所性脂肪の量は、対象における皮下脂肪と比較して、比例的に５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％低減される。異所性脂肪は、異所性脂肪を測定するために利用可能な任意の方法を使用して対象において測定され得る。

【0277】

その他の実施形態では、対象においてより好都合な脂肪分布をもたらす方法が提供され、この方法は、対象に、好都合な脂肪分布をもたらすのに有効な量の抗肥満症剤の組合せを投与することを含む。特定の実施形態では、抗肥満症剤の組合せの投与は、対象において内臓脂肪または異所性脂肪または両方の量を低減する。例えば、抗肥満症剤の組合せ、食物摂取または体重調節または両方に関与している後脳構造に作用する少なくとも１種の抗肥満症剤の投与と組み合わせた、食物摂取または体重調節または両方に関与している前脳構造に作用する少なくとも１種の抗肥満症剤の投与。特定の実施形態では、本方法は、内臓または異所性脂肪または両方の組合せの量を、皮下脂肪の低減を上回って選択的に低減する。このような方法は、内臓脂肪または異所性脂肪に対して、より高い割合の皮下脂肪をもたらす。このような改善された割合は、心血管疾患、多嚢胞性卵巣症候群、メタボリックシンドロームまたはそれらの任意の組合せの発生のリスクの低下をもたらし得る。特定の実施形態では、異所性または内臓脂肪は、皮下脂肪よりも５％大きい割合で代謝される。その他の実施形態では、異所性または内臓脂肪は、皮下脂肪よりも少なくとも１０％ １５％、２０％、２５％、３０％ ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％大きい割合で代謝される。

【0278】

なお別の態様では、本発明の方法は、グルココルチコステロイドと組み合わせて投与された抗肥満症剤の組合せの治療上有効な量の使用を含む。グルココルチコステロイドは、脂肪質量を増大し、除脂肪質量を低減するという有害作用を有する。したがって、グルココルチコステロイド使用が有益である条件下で、抗肥満症剤の組合せをグルココルチコステロイドと併せて使用できると考慮される。

【0279】

なお別の態様では、本発明の方法は、オルリスタット、フェンテルミン、トピラメート、ＣＯＮＴＲＡＶＥおよびＱＮＥＸＡから選択される治療薬と組み合わせて投与された、１種の抗肥満症剤または抗肥満症剤の組合せの治療上有効な量の使用を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、オルリスタット、フェンテルミン、トピラメート、ＣＯＮＴＲＡＶＥおよびＱＮＥＸＡから選択された治療薬と組み合わせた、本発明の操作されたポリペプチドの治療上有効な量の使用を含む。その他の実施形態では、本発明の方法は、オルリスタット、フェンテルミン、トピラメート、ＣＯＮＴＲＡＶＥおよびＱＮＥＸＡから選択される治療薬と組み合わせた、アミリン、アミリン類似体、アミリンアゴニストまたはアミリン誘導体の治療上有効な量の使用を含む。その他の実施形態では、本発明の方法は、アミリン、アミリン類似体、アミリンアゴニストまたはアミリン誘導体ならびにオルリスタット、フェンテルミン、トピラメート、ＣＯＮＴＲＡＶＥおよびＱＮＥＸＡから選択される治療薬と組み合わせた本発明の操作された化合物の治療上有効な量の使用を含む。

【0280】

また、まず、対象の体重を、病的に肥満であるより低いレベルに低減すること、次いで、対象に、対象の体重をさらに低減するのに有効な量の抗肥満症剤の組合せを投与することによって、病的に肥満の対象において体重を低減する方法も提供される。対象の体重を病的肥満症のものより低く低減する方法は、カロリー摂取を低減すること、身体活動を増大すること、薬物療法、胃バイパス術などの肥満外科手術または前記の方法のいずれかの組合せを含む。一態様では、抗肥満症剤の組合せを投与することは、対象の体重をさらに低減する。その他の実施形態では、対象の体重をさらに低減するのに有効な量の抗肥満症剤の組合せを投与することによって、４０以下の肥満度指数を有する対象において肥満度指数を低下させる方法が提供される。

【0281】

体重を低減することとは、治療の経過が、数日、数週間、数カ月または数年であるかにかかわらず、治療の経過にわたって、対象が、その総体重の一部を喪失することを意味する。あるいは、体重を低減することは、除脂肪質量に対する脂肪質量の割合の低下として定義され得る（言い換えれば、対象は、脂肪質量を喪失したが、除脂肪質量を維持または増大し、必ずしも、総体重の対応する喪失は伴わない）。これらの実施形態において組み合わせて投与された抗肥満症剤の有効量とは、治療の経過にわたって対象の体重を低減するのに有効な量あるいは治療の経過にわたって対象の脂肪質量のパーセンテージを低下させるのに有効な量である。特定の実施形態では、対象の体重は、治療の経過にわたって少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％または少なくとも約２０％低減される。あるいは、対象の脂肪質量のパーセンテージは、治療の経過にわたって、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％または少なくとも２５％低下される。

【0282】

特定の実施形態では、体重を低減する方法は、体重維持への固守（ａｄｈｅｒｅｎｃｅ）の改善を含む。何らかの理論に拘束されようとは思わないが、本明細書に記載されるような抗肥満症剤の投与によって達成されるレプチン応答性の回復は、肥満対象の厳しい課題を克服する。先の体重減少法では、体重が低減してもレプチンレベルが、依然として、正常よりも高いままである場合があり、これが、対象が体重減少を維持することを困難にする。本明細書に記載された方法は、体重を低減する方法だけでなく、体重維持への固守の改善という構成要素も含む。

【0283】

特定の実施形態では、栄養素利用性を減少させる、例えば、対象において体重を低減する方法は、対象に、１日につき１回または複数回のボーラス用量の抗肥満症剤の有効量を投与することを含む。ボーラス用量とは、医薬の断続的投与量（連続注入とは対照的に）である。対象は、１日あたり１回または複数回のボーラス用量を投与され得る。ボーラス用量は、対象にいつ投与されても同一であり得るか、または１日のうちの特定の時点で、その他のものと比較して、より大きなボーラス用量を対象が投与されるよう調整され得る。特定の製剤、例えば、徐放性製剤中の薬剤の投与、ボーラス用量は、あまり頻繁に投与されなくてもよい、例えば、３日ごとに１回、週あたり１回、月に２回、月に１回。さらに、ボーラス用量間の時間は、これまでのボーラス用量で投与される薬物が、対象の血流をクリアにするのを可能にするよう十分に長いことが好ましい。

【0284】

その他の実施形態では、栄養素利用性を減少させる方法、例えば、対象において体重を低減する方法は、対象に抗肥満症剤の有効量を、連続用量で投与することを含む。連続用量とは、例えば、静脈内注射または経皮パッチによる薬物の連続注入を意味するものとする。あるいは、連続用量は、薬物を一定期間にわたって対象の系中に放出する制御放出カプセル剤または錠剤の形態で経口的に投与され得る。連続用量によって投与される場合には、薬物は、約１時間の期間にわたって放出され、いくつかの場合には、薬物は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８または２４時間の期間にわたって放出される。

【0285】

「組み合わせて投与された」とは、抗肥満症剤が、単回投与として、別個の用量として同時に投与されるか、または逐次投与されることを意味する。逐次投与とは、抗肥満症剤の１種を、抗肥満症剤の前または後のいずれかに投与することを指す。特定の実施形態では、第１の抗肥満症剤は、少なくとも１種のその他の抗肥満症剤の約３０分前または後に投与され、その他の実施形態では、少なくとも１種のその他の抗肥満症剤の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２時間前または後に投与される。投与される抗肥満症剤のいずれも、ボーラス用量として投与されても、または連続用量として投与されてもよい。

【0286】

さらに、特定の実施形態では、組み合わせた体重誘導剤（ｗｅｉｇｈｔ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）の投与は、本発明の態様のいずれにおいても相乗作用をもたらす。さらに、特定の実施形態では、組み合わせた体重誘導剤の投与は、同一効果を有する少なくとも１種の薬剤のより少ない必要用量をもたらす。

【0287】

したがって、一実施形態では、少なくとも２種の異なる抗肥満症剤の治療上有効な量を末梢性に投与することを含み、少なくとも１種の抗肥満症剤が、アミリン、アミリン類似体、アミリンアゴニストまたはアミリン誘導体であり、少なくとも１種の抗肥満症剤が、アルブミン結合ドメインポリペプチド（ＡＢＤ）と、レプチン、レプチン類似体またはその活性断片から選択される第１のペプチドホルモンドメイン（ＨＤ１）とを含む操作されたポリペプチドであり、対象が、体重を少なくとも１０％、１２％、１５％、２０％、３０％、４０％またはさらに５０％低減する、それを必要とする対象において、肥満症を治療する方法または体重を低減する方法である。

【0288】

さらなる実施形態として、以下が挙げられる：

【0289】

実施形態１．対象において肥満症を治療する方法であって、少なくとも２種の異なる抗肥満症剤の治療上有効な量を末梢性に投与することを含み、少なくとも１種の抗肥満症剤が、アミリン、アミリン類似体、アミリンアゴニストまたはアミリン誘導体（すなわち、アミリン剤）であり、少なくとも１種の抗肥満症剤が、アルブミン結合ドメインポリペプチド（ＡＢＤ）と、レプチン、レプチン類似体またはその活性断片から選択される第１のペプチドホルモンドメイン（ＨＤ１）とを含む操作されたポリペプチドであり、ＡＢＤが、配列番号３０１〜４５２、４５５〜４６３および５００〜５９３からなる群から選択されるペプチドのいずれか１種を含む、方法。

【0290】

実施形態２．対象において体重を低減する方法であって、少なくとも２種の異なる抗肥満症剤の治療上有効な量を末梢性に投与することを含み、少なくとも１種の抗肥満症剤が、アミリン、アミリン類似体、アミリンアゴニストまたはアミリン誘導体（すなわち、アミリン剤）であり、少なくとも１種の抗肥満症剤が、アルブミン結合ドメインポリペプチド（ＡＢＤ）と、レプチン、レプチン類似体またはその活性断片から選択される第１のペプチドホルモンドメイン（ＨＤ１）とを含む操作されたポリペプチドであり、ＡＢＤが、配列番号３０１〜４５２、４５５〜４６３および５００〜５９３からなる群から選択されるペプチドのいずれか１種を含む、方法。

【0291】

実施形態３．少なくとも１種の抗肥満症アミリン剤が、アミリンアゴニストである、実施形態１または２のいずれか１つに記載の方法。

【0292】

実施形態４．アミリンアゴニストが、アミリン類似体または誘導体を含む、実施形態１から３のいずれか１つに記載の方法。

【0293】

実施形態５．アミリン類似体または誘導体が、プラムリンチドを含む、実施形態１から４のいずれか１つに記載の方法。

【0294】

実施形態６．アミリン類似体または誘導体が、表４に開示される化合物を含む、実施形態１から５のいずれか１つに記載の方法。

【0295】

実施形態７．アミリン類似体または誘導体が、Ｄｅｓ−Ｌｙｓ１−［Ｌｙｓ２６（ｍＰＥＧ４０Ｋ）］−プラムリンチド（配列番号２１４）を含む、実施形態１から６のいずれか１つに記載の方法。

【0296】

実施形態８．ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から７のいずれか１つに記載の方法。

【0297】

実施形態９．ＨＤ１が、配列番号２９である、実施形態１から８のいずれか１つに記載の方法。

【0298】

実施形態１０．操作されたポリペプチドが、表２に開示される化合物を含む、実施形態１から９のいずれか１つに記載の方法。

【0299】

実施形態１１．操作されたポリペプチドが、配列番号５９４〜６６３および６８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１０のいずれか１つに記載の方法。

【0300】

実施形態１２．操作されたポリペプチドが、配列番号５９５のアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１のいずれか１つに記載の方法。

【0301】

実施形態１３．操作されたポリペプチドが、配列番号６５７のアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１のいずれか１つに記載の方法。

【0302】

実施形態１４．アミリン剤の有効量および操作されたポリペプチドの有効量が、アミリン剤が、操作されたポリペプチドと組み合わせて前記対象に投与される場合に、いずれかの薬剤が単独で投与される場合に達成される体重減少の量よりも多量の体重減少が達成されるような量を含む、実施形態１から１３のいずれか１つに記載の方法。

【0303】

実施形態１５．２種の薬剤が、同時に投与される、実施形態１から１４のいずれか１つに記載の方法。

【0304】

実施形態１６．２種の薬剤が、一緒に混合される、実施形態１から１５のいずれか１つに記載の方法。

【0305】

実施形態１７．対象のＢＭＩが、２５を超える、実施形態１から１６のいずれか１つに記載の方法。

【0306】

実施形態１８．対象のＢＭＩが、２５から３５である、実施形態１から１７のいずれか１つに記載の方法。

【0307】

実施形態１９．対象のＢＭＩが、２５から４０である、実施形態１から１８のいずれか１つに記載の方法。

【0308】

実施形態２０．対象のＢＭＩが、２５から４５である、実施形態１から１９のいずれか１つに記載の方法。

【0309】

実施形態２１．対象のＢＭＩが、３５から４５である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の方法。

【0310】

実施形態２２．対象のＢＭＩが、３０未満に低減される、実施形態１から２１のいずれか１つに記載の方法。

【0311】

実施形態２３．対象のＢＭＩが、２５未満まで低減される、実施形態１から２２のいずれか１つに記載の方法。

【0312】

実施形態２４．対象のＢＭＩが正常まで低減される、実施形態１から２３のいずれか１つに記載の方法。

【0313】

実施形態２５．体重減少が、４週間の治療内に達成される、実施形態１から２４のいずれか１つに記載の方法。

【0314】

実施形態２６．体重減少が、８週間の治療内に達成される、実施形態１から２５のいずれか１つに記載の方法。

【0315】

実施形態２７．体重減少が、１２週間の治療内に達成される、実施形態１から２６のいずれか１つに記載の方法。

【0316】

実施形態２８．体重減少が、２０週間の治療内に達成される、実施形態１から２７のいずれか１つに記載の方法。

【0317】

実施形態２９．体重減少が、２４週間の治療内に達成される、実施形態１から２８のいずれか１つに記載の方法。

【0318】

実施形態３０．対象が、ヒトである、実施形態１から２９のいずれか１つに記載の方法。

【0319】

実施形態３１．対象が、肥満のヒトである、実施形態１から３０のいずれか１つに記載の方法。

【0320】

実施形態３２．体重減少が、少なくとも１０％低減される、実施形態１から３１のいずれか１つに記載の方法。

【0321】

実施形態３３．体重減少が、少なくとも１２％低減される、実施形態１から３２のいずれか１つに記載の方法。

【0322】

実施形態３４．体重減少が、少なくとも１５％低減される、実施形態１から３３のいずれか１つに記載の方法。

【0323】

Ｂ．製剤
本発明の医薬化合物は、Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martinに開示されるものなどの従来の技術に従って、医薬上許容される担体または希釈剤ならびに任意のその他の公知のアジュバントおよび賦形剤を用いて製剤され得る。Wang et al. (1988) J. of Parenteral Sci. and Tech., Technical Report No. 10, Supp. 42:2 Sも参照のこと。

【0324】

一般に、操作されたポリペプチドは、患者へ投与するための、安定な、安全な医薬組成物に製剤され得る。本発明の方法において使用するために考慮される医薬製剤は、およそ０．０１〜１．０％（ｗ／ｖ）、特定の場合には、０．０５〜１．０％の操作されたポリペプチド、約３．０〜約７．０の最終組成物のｐＨを可能にするおよそ０．０２〜０．５％（ｗ／ｖ）の酢酸、リン酸、クエン酸またはグルタミン酸バッファー、およそ１．０〜１０％（ｗ／ｖ）の炭水化物または多価アルコール等張剤（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）、適宜、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、メチル、エチル、プロピルおよびブチルパラベンおよびフェノールからなる群から選択されるおよそ０．００５〜１．０％（ｗ／ｖ）の保存料を含み得る。このような保存料は、一般に、製剤されたペプチドが、複数回使用製品で含まれる場合に含まれる。

【0325】

特定の実施形態では、本操作されたポリペプチドの医薬製剤は、一定の範囲の濃度の化合物、例えば、約０．０１％〜約９８％ｗ／ｗの間または約１〜約９８％ｗ／ｗの間または好ましくは、８０％と９０％ｗ／ｗの間、または好ましくは、約０．０１％〜約５０％ｗ／ｗの間またはより好ましくは、これらの実施形態では、約１０％〜約２５％ｗ／ｗの間を含有し得る。十分な量の注射水を使用して、所望の濃度の溶液を得てもよい。

【0326】

塩化ナトリウムなどのさらなる等張剤（ｔｏｎｉｃｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）ならびにその他の公知の賦形剤も、必要に応じて、存在し得る。いくつかの場合には、このような賦形剤は、化合物の全体的な張力の維持において有用である。賦形剤は、目下記載されている製剤中に種々の濃度で含まれ得る。例えば、賦形剤は、約０．０２％〜約２０％ｗ／ｗ、好ましくは、約０．０２％と０．５％ｗ／ｗの間、約０．０２％〜約１０％ｗ／ｖまたは約１％〜約２０％ｗ／ｗの濃度範囲で含まれ得る。さらに、本製剤自体と同様に、賦形剤は、固体（粉末化されたものを含む）、液体、半固体またはゲルの形態で含まれ得る。

【0327】

医薬製剤は、種々の形態、例えば、固体、液体、半固体または液体からなり得る。用語「固体」とは、本明細書において、例えば、散剤および凍結乾燥製剤を含めた、この用語のすべての通常の使用を包含するものとする。目下記載されている製剤は、凍結乾燥され得る。

【0328】

用語バッファー、バッファー溶液および緩衝溶液は、水素イオン濃度またはｐＨに関して使用される場合には、酸またはアルカリの添加時の、または溶媒での希釈時のｐＨの変化に抵抗する、系、特に、水溶液の能力を指す。酸または塩基の添加時にｐＨの小さい変化を受ける緩衝溶液の特徴は、弱酸および弱酸の塩または弱塩基および弱塩基の塩のいずれかの存在である。前者の系の一例として、酢酸および酢酸ナトリウムがある。添加されるヒドロニウムまたはヒドロキシルイオンの量が、バッファー系のそれを中和する能力を超えない限り、ｐＨの変化はわずかである。

【0329】

本明細書に記載されるように、さまざまな液体媒体、例えば、水または水性／有機溶媒混合物または懸濁液が、操作されたポリペプチドの製剤における使用に適している。

【0330】

本明細書に記載される使用のために、操作されたポリペプチド製剤の安定性は、製剤のｐＨを、当技術分野で公知の方法によって決定される範囲に維持することによって増強される。特定の実施形態では、製剤のｐＨは、約３．５〜５．０または約３．５〜６．５、いくつかの実施形態では、約３．７〜４．３または約３．８〜４．２の範囲で維持される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約４．０、約５．０、約６．０、約７．０、約８．０、約９．０またはさらに高いものであり得る。いくつかの実施形態では、ｐＨは、生理学的範囲、ｐＨ６〜８、好ましくは、ｐＨ７〜７．６にあり得る。

【0331】

特定の実施形態では、操作されたポリペプチドを有するバッファーは、酢酸バッファー（好ましくは、約１〜５から約６０ｍＭの最終製剤濃度の）、リン酸バッファー（好ましくは、約１〜５から約３０ｍＭの最終製剤濃度の）またはグルタミン酸バッファー（好ましくは、約１〜５から約６０ｍＭの最終製剤濃度の）である。いくつかの実施形態では、バッファーは、酢酸（好ましくは、約５〜約３０ｍＭの最終製剤濃度の）である。

【0332】

製剤中に安定剤が含まれ得るが、必ずしも必要ではない。しかし、含まれる場合には、本発明の実施において有用な安定剤は、炭水化物または多価アルコールである。本発明の実施において有用な適した安定剤は、およそ１．０〜１０％（ｗ／ｖ）の炭水化物または多価アルコールである。多価アルコールおよび炭水化物は、その主鎖中に同一の特徴、すなわち、−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−を共有し、これは、タンパク質の安定化に関与している。多価アルコールとして、ソルビトール、マンニトール、グリセロールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの化合物が挙げられる。これらの化合物は、直鎖分子である。他方、マンノース、リボース、スクロース、フルクトース、トレハロース、マルトース、イノシトールおよびラクトースなどの炭水化物は、ケトまたはアルデヒド基を含有し得る環状分子である。これら２つのクラスの化合物は、温度上昇によって、また凍結−解凍または凍結−乾燥プロセスによって引き起こされる変性に対してタンパク質を安定化させることにおいて有効であると実証されている。適した炭水化物として、糖尿病患者に有害作用（ａｄｖｅｒｓｅ ａｆｆｅｃｔ）を有さない、すなわち、炭水化物が代謝されて、血液中でグルコースの許容されない高い濃度を形成することのない、ガラクトース、アラビノース、ラクトースまたは任意のその他の炭水化物が挙げられる。このような炭水化物は、糖尿病患者に適しているとして当技術分野で周知である。スクロースおよびフルクトースは、非糖尿病性適用（例えば、肥満症を治療すること）において化合物を用いる使用に適している。

【0333】

特定の実施形態では、安定剤が含まれる場合には、化合物は、ソルビトール、マンニトール、イノシトール、グリセロール、キシリトールおよびポリプロピレン／エチレングリコールコポリマーなどの多価アルコールならびに分子量２００、４００、１４５０、３３５０、４０００、６０００、８０００およびさらに高い種々のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて安定化される。マンニトールは、いくつかの実施形態では、好ましい多価アルコールである。本発明の凍結乾燥製剤の別の有用な特徴は、その安定性を維持するのに役立つ同一製剤成分を用いる、本明細書に記載された凍結乾燥製剤の張力の維持である。いくつかの実施形態では、マンニトールは、本目的のために使用される好ましい多価アルコールである。

【0334】

米国薬局方（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）（ＵＳＰ）には、静菌性または静真菌性濃度の抗菌剤が、複数回用量容器中に含有される調製物に添加されなければならないと述べられている。それらは、皮下針およびシリンジを用いて、またはペン型注射器などのデリバリーのためのその他の侵襲的手段を使用して内容物の一部を引き抜く間に、調製物中に不注意に導入された微生物の増殖を防ぐための使用の時点で適切な濃度で存在しなくてはならない。抗菌剤は、処方のすべてのその他の成分との適合性を確実にするよう評価されなくてはならず、その活性は、ある製剤において有効である特定の薬剤が別のものでは有効ではないことがないことを確実にするよう、処方全体において評価されなくてはならない。特定の抗菌剤が、ある製剤において有効であるが、別の製剤では有効でないことを見出すことは珍しいことではない。

【0335】

保存料は、一般的な製薬上の意味では、微生物増殖を防ぐか、または阻害し、この目的のために医薬製剤に添加され、微生物による製剤の結果として起こる腐敗を避けることができる物質である。保存料の量は多くはないが、それにもかかわらず、ペプチドの全体的な安定性に影響を及ぼすことがある。

【0336】

医薬組成物において使用するための保存料は、０．００５〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲であり得るが、いくつかの実施形態では、単独またはその他のものと組み合わせた各保存料の範囲は、ベンジルアルコール（０．１〜１．０％）またはｍ−クレゾール（０．１〜０．６％）またはフェノール（０．１〜０．８％）またはメチル（０．０５〜０．２５％）およびエチルもしくはプロピルもしくはブチル（０．００５％〜０．０３％）パラベンの組合せである。パラベンは、パラ−ヒドロキシ安息香酸の低級アルキルエステルである。各保存料の詳細な説明は、Remington's Phrmaceutical Sciences(Id．)に示されている。

【0337】

操作されたポリペプチドは、液体形態の場合には、ガラス容器中のガラス上に吸着する傾向を有さないこともあり、したがって、医薬製剤をさらに安定化するために界面活性剤が必要でないこともある。しかし、液体形態の場合に、このような傾向を有する化合物に関しては、その製剤中に界面活性剤が使用されなければならない。次いで、これらの製剤は、凍結乾燥され得る。界面活性剤は、疎水性破壊および塩橋分離によっての両方のタンパク質の変性を頻繁に引き起こす。界面活性剤部分とタンパク質上の反応性部位の間の強力な相互作用のために、比較的低い濃度の界面活性剤が、強力な変性活性を発揮し得る。しかし、この相互作用の賢明な使用により、界面または表面変性に対してタンパク質を安定化できる。操作されたポリペプチドをさらに安定化できる界面活性剤は、適宜、総製剤の約０．００１〜０．３％（ｗ／ｖ）の範囲で存在し得、これとして、ポリソルベート８０（すなわち、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、ＣＨＡＰＳ（登録商標）（すなわち、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］１−プロパンスルホネート）、Ｂｒｉｊ（登録商標）（例えば、（ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテルであるＢｒｉｊ（登録商標）３５）、ポロクサマーまたは別の非イオン性界面活性剤が挙げられる。

【0338】

選択された等張剤に応じて、医薬製剤の張力を調整するために塩化ナトリウムまたはその他の塩を添加することが望ましいこともある。しかし、これはオプショナルであり、選択された特定の製剤に応じて変わる。非経口製剤は、好ましくは、等張性または実質的に等張性であり得る。

【0339】

非経口製剤にとって好ましい媒体として、水がある。非経口投与に適した品質の水は、蒸留によってか、または逆浸透によってのいずれかによって調製され得る。注射水は医薬製剤における使用にとって好ましい水性媒体である。

【0340】

医薬製剤中にその他の構成成分が存在し得ることがあり得る。このようなさらなる構成成分として、例えば、湿潤剤、乳化剤、オイル、抗酸化物質、充填剤（ｂｕｌｋｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、張力修飾因子、キレート化剤、金属イオン、油性媒体、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチンまたはタンパク質）および両性イオン（例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リシンおよびヒスチジンなどのアミノ酸）を挙げることができる。さらに、ポリマー溶液またはポリマーとの混合物は、ペプチドの制御放出の機会を提供する。このようなさらなる構成成分は、もちろん、本発明の医薬製剤の全体的な安定性に有害に影響を与えてはならない。

【0341】

容器はまた、注射の製剤の不可欠な部分であり、完全に不活性であるか、特に、液体が水性である場合には、含有する液体にいくつかの点で影響を及ぼさない容器がないので、一成分と考えられ得る。したがって、特定の注射のための容器の選択は、容器の組成の、ならびに溶液の考慮およびそれが付される治療に基づいたものでなくてはならない。バイアルのガラス表面へのペプチドの吸着も、必要に応じて、ホウケイ酸ガラス、例えば、Ｗｈｅａｔｏｎ Ｉ型ホウケイ酸ガラス番号３３（Ｗｈｅａｔｏｎ Ｔｙｐｅ Ｉ−３３）またはその等価物（Ｗｈｅａｔｏｎ Ｇｌａｓｓ Ｃｏ．）の使用によって最小化され得る。製造に許容される、同様のホウケイ酸ガラスバイアルおよびカートリッジのその他の販売会社として、Ｋｉｍｂｅｌ Ｇｌａｓｓ Ｃｏ．、Ｗｅｓｔ Ｃｏ．、Ｂｕｎｄｅｒ Ｇｌａｓ ＧＭＢＨおよびＦｏｒｍ ａ Ｖｉｔｒｕｍが挙げられる。化合物の生物学的および化学的特徴は、Ｗｈｅａｔｏｎ Ｔｙｐｅ Ｉ−３３ ホウケイ酸血清バイアル中での、５％マンニトールおよび０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ８０の存在下での０．１ｍｇ／ｍｌおよび１０ｍｇ／ｍｌの化合物の終濃度への製剤および凍結乾燥によって安定化され得る。

【0342】

注射によって送達される製剤については、皮下シリンジからのニードルの、複数回用量バイアル中への導入を可能にし、ニードルが引き抜かれるや否や再密封を提供するために、各バイアルの解放端は、アルミニウムバンドによって適当な位置に止められたゴムストッパー封鎖で密封されることが好ましい。

【0343】

Ｗｅｓｔ ４４１６／５０、４４１６／５０（テフロン表面の）および４４０６／４０、Ａｂｂｏｔｔ ５１３９または任意の同等ストッパーなどのガラスバイアルのためのストッパーを、注射用医薬の封鎖として使用してもよい。ペプチド性抗肥満症剤を含む製剤については、これらのストッパーは、ペプチドならびに製剤のその他の成分と適合する。本発明者らはまた、これらのストッパーは、患者使用パターンを使用して試験される場合にストッパー完全性試験を通る、例えば、ストッパーは少なくとも約１００回の注射に持ちこたえることができることを発見した。あるいは、ペプチドは、その後の再構成のために、バイアル、シリンジまたはカートリッジ中に凍結乾燥され得る。本発明の液体製剤は、１もしくは２室カートリッジまたは１もしくは２室シリンジ中に充填され得る。

【0344】

上記の医薬製剤の各成分は、当技術分野で公知であり、参照によりその全文が、すべての目的のために本明細書に組み込まれるPHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS: PARENTERAL MEDICATIONS, Vol.1, 2nd ed., Avis et al. Ed., Mercel Dekker, New York, N.Y. 1992に記載されている。

【0345】

上記の液体製剤の製造プロセスは、一般に、配合、滅菌濾過および充填工程を含む。配合手順は、指定の順序での構成成分の溶解（保存料、それに続く、安定剤／等張剤、バッファーおよびペプチド）または同時の溶解を含む。

【0346】

代替製剤、例えば、非−非経口は、滅菌を必要としない場合もある。しかし、滅菌が望ましいか、または必須である場合には、本発明のペプチド医薬製剤の開発において任意の適した滅菌プロセスを使用してもよい。典型的な滅菌プロセスは、濾過、蒸気（湿式加熱）、乾式加熱、ガス（例えば、エチレンオキシド、ホルムアルデヒド、二酸化塩素、酸化プロピレン、β−プロピオラクトン（ｐｒｏｐｉｏｌａｃｃｔｏｎｅ）、オゾン、クロロピクリン、過酢酸メチルブロミドなど）、放射線源に対する曝露および無菌取り扱いを含む。濾過は、本発明の液体製剤の好ましい滅菌方法である。滅菌濾過は、順次、接続され得る０．４５ｕｍおよび０．２２ｕｍ（１または２）を通した濾過を含む。濾過後、溶液は、適当なバイアルまたは容器中に充填される。

【0347】

特定の実施形態では、本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、対象に末梢性に投与される。いくつかの実施形態では、本発明の液体医薬製剤は、非経口投与に意図される。適した投与経路として、筋肉内の、静脈内の、皮下、皮内、関節内、くも膜下腔内などが挙げられる。いくつかの実施形態では、皮下投与経路が好ましい。特定の実施形態では、粘膜デリバリーも好ましい。これらの経路として、それだけには限らないが、液体、半固体または固体形態のペプチドの投与を含み得る、経口、鼻腔、舌下、肺および頬側経路が挙げられる。操作されたポリペプチドを含む製剤については、これらの経路による投与は、非経口デリバリーと比較して、バイオアベイラビリティの低下のために、所望の生物学的効果を得るために実質的により多くの化合物を必要とし得る。さらに、非経口制御放出デリバリーは、高分子マイクロカプセル、マトリックス、溶液、インプラントおよびデバイスを形成することならびにそれらを非経口的にか、または外科的手段によって投与することによって達成され得る。制御放出製剤の例は、参照にいより本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３６８，６３０号、第６，３７９，７０４号および第５，７６６，６２７号に記載されている。これらの剤形は、ポリマーマトリックスまたはデバイス中にペプチドの一部が捕捉されるために、より低いバイオアベイラビリティを有し得る。例えば、各々、参照によりその全文が、すべての目的のために本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３７９，７０４号、第６，３７９，７０３号および第６，２９６，８４２号を参照のこと。

【0348】

化合物は、１用量または複数用量で有効となる操作されたポリペプチドの量を含有する投与単位形態形で提供され得る。

【0349】

当業者には認識されるであろうが、操作されたポリペプチドの有効量は、対象の年齢および体重、対象の身体状態、治療される状態および当技術分野で公知のその他の因子を含めた多数の因子につれて変わる。操作されたポリペプチドの有効量はまた、投与される特定の組合せにつれて変わる。本明細書に記載されるように、組み合わせた操作されたポリペプチドの投与は、投与される操作されたポリペプチドのいずれかの低減した量が、有効量であることを可能にし得る。

【0350】

操作されたポリペプチドの長い作用持続期間は、１日１回または１週間に１回の投与などの望まれる延長された作用持続期間を提供し得る。作用持続期間は、例えば、ＡＢＤおよびそのアルブミンに対する親和性の選択によって選択され得る。理論に拘束されようとは思わないが、アルブミンに対する親和性が高いほど、長い循環時間をもたらし、長い作用持続期間を提供すると考えられる。薬物血漿レベル、急性または慢性グルコースおよび／またはＨｂＡ１ｃ低下、インスリン血漿レベル、食物摂取阻害または体重減少などの、薬力学的（治療効果）および薬物動態（薬物特性）のいずれかまたは両方が、デリバリー後に経時的に測定され得る。

【0351】

Ｃ．有効投与量
本明細書において提供される医薬組成物は、有効成分が、治療上有効な量で、すなわち、その意図される目的を達成するのに有効な量で含有される組成物を含む。特定の適用にとって有効な実際の量は、とりわけ、治療される状態に応じて変わる。例えば、糖尿病を治療する方法において投与される場合には、このような組成物は、所望の結果（例えば、対象において空腹時血糖を低下させること）を達成するのに有効な有効成分の量を含有する。肥満症を治療するための方法において投与される場合には、このような組成物は、所望の結果（例えば、体重の減少）を達成するのに有効な有効成分の量を含有する。

【0352】

投与される化合物の投与量および頻度（単回または複数回用量）は、投与経路；レシピエントの大きさ、年齢、性別、健康状態、体重、肥満度指数および食事；治療されている疾患の症状の性質および程度（例えば、本明細書に記載された化合物に応答性の疾患）；その他の疾患またはその他の健康に関連する問題の存在；同時治療の種類；および任意の疾患または治療レジメンに由来する合併症を含めたさまざまな因子に応じて変わり得る。その他の治療レジメンまたは薬剤が、本発明の方法および化合物とともに使用され得る。

【0353】

ヒトにおいて使用するための治療上有効な量は、動物モデルから決定され得る。例えば、ヒトのための用量は、動物において有効であるとわかっている濃度を達成するよう処方され得る。ヒトにおける投与量は、上記のようにおよび当技術分野で公知のように、それだけには限らないが、血糖および体重を含めた１種または複数の生理学的パラメータをモニタリングすることおよび投与量を上方または下方に調整することによって調整され得る。

【0354】

投与量は、患者の要求および使用されている化合物に応じて変わり得る。本発明に関連して、患者に投与される用量は、患者における有益な治療反応に経時的に影響を及ぼすのに十分でなくてはならない。用量の大きさはまた、任意の有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。一般に、治療は、化合物の最適用量よりも少ないより少量の投与量で開始される。その後、投与量を、状況下で最適効果が到達されるまで小さい増分で増大させる。本発明の一実施形態では、投与量範囲は、０．００１％〜１０％ｗ／ｖである。別の実施形態では、投与量範囲は、０．１％〜５％ｗ／ｖである。

【0355】

しかし、典型的な用量は、１日あたりの医薬化合物の約０．１ｍｇの下限から約２００ｍｇの上限までを含有し得る。また、用量あたり１ｍｇ〜１００ｍｇの化合物および用量あたり３ｍｇ〜７０ｍｇなどのその他の用量範囲も考慮される。典型的には、長い作用持続期間を有する操作されたポリペプチドの用量が、例えば、毎日およびさらには週に１回投与される。１日あたりの用量は、２４時間の期間において連続して、またはその２４時間の任意の一部において提供される個別の単位用量で送達され得る。

【0356】

投与量の量および間隔は、治療されている特定の臨床適応症に有効な投与される化合物のレベルを提供するよう個別に調整され得る。これによって、個々の病状の重症度にふさわしい治療レジメンが提供される。

【0357】

本明細書において提供された教示を利用することで、実質的な毒性を引き起こさないが、特定の患者によって実証される臨床症状を治療するのに完全に有効である、有効な予防的または治療的治療計画を立てることができる。この計画を立てることは、化合物の効力、相対バイオアベイラビリティ、患者の体重、有害な副作用の存在および重症度、好ましい投与様式および選択された薬剤の毒性プロフィールなどの因子を考慮することによって、活性化合物の注意深い選択を含まなければならない。

【0358】

本明細書に記載された操作されたポリペプチドの驚くべき用量節約特性は、その驚くべき長い血漿半減期および薬理学的作用の持続期間とともに、優れた医薬品を提供する。用量節約を含めた優れた特性は、より少ない投薬、したがって、より少ないか、または重度がより低い副作用および商品原価の改善および／または親化合物単独によって現在は達成されていない１日１回または週に１回の投与のためのより費用効率の高い、より簡単な製剤を可能にする。

【0359】

Ｄ．毒性
特定の化合物の毒性および治療的効果間の比は、その治療係数であり、ＬＤ_５０（集団の５０％において致死的な化合物の量）とＥＤ_５０（集団の５０％において有効な化合物の量）の間の比として表され得る。高い治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイおよび／または動物研究から得られた治療係数データは、ヒトにおいて使用するための投与量の範囲の処方において使用され得る。このような化合物の投与量は、毒性がほとんどないか、または全くないＥＤ_５０を含む血漿濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変わり得る。例えば Fingl et al., In: THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, Ch.1, p.l, 1975を参照のこと。正確な処方、投与経路および投与量は、患者の状態および化合物が使用される特定の方法を考慮して個々の医師によって選択され得る。

【0360】

何らかの理論に拘束されようとは思わないが、ＡＢＤアルブミン結合ドメインの、本明細書に記載されるようなホルモンドメイとのコンジュゲーションは、ＡＢＤコンジュゲーションを伴わないホルモンドメインと比較して、免疫応答の低減によって判断されるような免疫原性の低減を提供し得ると考えられる。例えば、参照によりその全文が、すべての目的のために本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／０１６０４３を参照のこと。

【実施例】

【0361】

実施例１〜５は、その他の事柄の中でも、本明細書に記載されたＡＢＤの優れた特性、例えば、これまでのＡＢＤと比較して低減された免疫原性特性を例示するために提供される。

【0362】

実施例１
アルブミン結合ポリペプチドのクローニング、発現、精製および特性決定。
この実施例では、そのアミノ酸配列が図１に示されている８種の異なるアルブミン結合ポリペプチド、ＰＥＰ０７９１３（配列番号４５３）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号４５６）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号４５８）、ＰＥＰ０７９６８（すなわち、ＰＥＰ０７９１１、配列番号４５９とコンジュゲートしているＤＯＴＡ）、ＰＥＰ０６９２３（配列番号４５４）、ＰＥＰ０７２７１（配列番号４５５）、ＰＥＰ０７５５４（配列番号４５６）およびＰＥＰ０７８４４（配列番号４６１）をクローニングし、精製し、特性決定した。

【0363】

材料および方法
アルブミン結合ポリペプチド変異体のクローニング
コンストラクトを配列決定することによって検証した後、ベクターＤＮＡを精製し、発現宿主、典型的には、ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。シングルコロニーを選択して、４ｍｌのＬＢ培地中で約６時間種培養を増殖させた。

【0364】

Ｇ１４８−ＧＡ３の突然変異体を、適当なオリゴヌクレオチドを用い、部位特異的突然変異誘発を使用して作製し、所望のアルブミン結合ポリペプチド変異体を得た。特異的エンドヌクレアーゼ部位ならびにアルブミン結合ポリペプチド変異体の前のＮ末端ＭＧＳＳ（配列番号３６）配列を付加するプライマーを用い、ＰＣＲによって、遺伝子断片を増幅した。ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩを用いて断片を切断し、精製し、同一酵素で制限された、クローニングベクター、プラスミドｐＡＹ０２５５６（ｐＢＲ３２２由来の複製起点、カナマイシン耐性遺伝子および対象とする遺伝子の発現のためのＴ７プロモーターを含有する）にライゲーションした。ライゲーションをエレクトロコンピテント大腸菌ＴＯＰ１０細胞に形質転換した。形質転換された細胞を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補給した、ＴＢＡＢプレート（３０ｇ／ｌトリプトース（ｔｒｙｐｔｏｓｅ）血液寒天基礎培地）上に広げ、続いて、３７℃で一晩インキュベーションした。ＰＣＲを使用してコロニーをスクリーニングし、ビオチン化オリゴヌクレオチドおよび製造業者のプロトコールに従って使用されるＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して増幅した断片の配列決定を実施した。Ｍａｇｎａｔｒｉｘ ８０００（ＮｏｒＤｉａｇ ＡＢ）を使用して、磁性ストレプトアビジンコーティングされたビーズと結合させることによって配列決定反応物を精製し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。すべてのアルブミン結合ポリペプチド変異体を、モノマーとしてサブクローニングし、発現ベクターによってコードされるコンストラクトを、ＭＧＳＳ−［ＰＰ＃＃＃］た（配列番号３６として開示される「ＭＧＳＳ」）（ここで、ＰＰ＃＃＃は、アルブミン結合ポリペプチドの配列を構成する４６個のアミノ酸残基に対応する）。

【0365】

さらに、Ｇ１４８−ＧＡ３の遺伝子断片、ＰＰ００７（配列番号３０７）、ＰＰ０１３（配列番号３１３）およびＰＰ０３７（配列番号３３７）を、アルブミン結合ポリペプチドの配列を構成する４６個のアミノ酸残基の前に、特異的エンドヌクレアーゼ部位ならびにヘキサヒスチジン（配列番号３４）配列、ＴＥＶプロテアーゼ部位およびグリシン残基を付加するプライマーを用い、ＰＣＲによって増幅させた。ポリペプチドＰＥＰ０７９１３（配列番号４５３）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号４５７）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号４５８）およびＰＥＰ０７９６８（配列番号４５９）は、グリシン残基が付加された、アルブミン結合ポリペプチドＧ１４８−ＧＡ３、ＰＰ００７（配列番号３０７）、ＰＰ０１３（配列番号３１３）およびＰＰ０３７（配列番号３３７）に対応する。断片をＸｂａＩおよびＮｏｔＩで切断し、精製し、同一酵素で制限された、クローニングベクターであるプラスミドｐＡＹ０２５１２（ｐＢＲ３２２由来の複製起点、カナマイシン耐性遺伝子および対象とする遺伝子の発現のためのＴ７プロモーターを含有する。クローニング部位の前には、ヘキサヒスチジンタグ（配列番号３４）を含有するペプチドをコードする配列とそれに続くＴＥＶプロテアーゼの切断部位がある。）にライゲーションした。連結、形質転換および配列検証を、上記のように実施した。４種のアルブミン結合ポリペプチド変異体Ｇ１４８−ＧＡ３、ＰＰ００７、ＰＰ０１３およびＰＰ０３７を、モノマーとしてサブクローニングし、発現ベクターによってコードされるコンストラクトを、ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱＳＳＧＶＤＬＧＴＥＮＬＹＦＱＧ−［ＰＰ＃＃＃］（配列中、ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＬＱＳＳＧＶＤＬＧＴＥＮＬＹＦＱＧは、配列番号３７である）とした。

【0366】

タンパク質発現
アルブミン結合ポリペプチド変異体を、Ｎ末端ＭＧＳＳ伸長（配列番号３６として開示される「ＭＧＳＳ」）またはＮ末端Ｈｉｓ６−タグ（配列番号３４）とそれに続くＴＥＶ−プロテアーゼ認識部位およびグリシン残基のいずれかを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現させた。各アルブミン結合ポリペプチド変異体のコロニーを使用して、カナマイシンを５０μｇ／ｍｌの濃度に補給した、４ｍｌのＴＳＢ＋ＹＥ培地に播種した。培養物を、３７℃でおよそ５時間増殖させた。パラレルバイオリアクター（Ｇｒｅｔａ ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｅｌａｃｈ Ｂｉｏｔｅｋｎｉｋ ＡＢ）において、各培養物から得られた３ｍｌを使用して、カナマイシンを５０μｇ／ｍｌの濃度に補給した８００ｍｌのＴＳＢ＋ＹＥに播種した。培養を、８００ｍｌ／分のエアレーションおよび撹拌プロフィールを用い、３７℃で実施して、２のＯＤ６００まで３０％を上回る溶存酸素レベルを維持し、続いて、ＩＰＴＧを０．５ｍＭの終濃度に添加した。培養を５時間継続し、その後、培養物を１０℃に冷却し、エアレーションを停止し、撹拌を３００ｒｐｍに低下させた。遠心分離（１５６００×ｇ、４℃、２０分）によって細胞ペレットを回収し、精製まで、−２０℃で保存した。

【0367】

Ｈｉｓ６−タグ（配列番号３４）およびＴＥＶ−プロテアーゼ部位を用いるアルブミン結合ポリペプチド変異体の精製
可溶性ヘキサヒスチジンタグのついた（配列番号３４）ポリペプチドＰＥＰ０７９１３（配列番号４５３）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号４５６）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号４５８）およびＰＥＰ０７９６８（配列番号４５９）を有する凍結細胞ペレットを、３５ｍｌの結合バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）に懸濁し、１０００Ｕのベンゾナーゼ（登録商標）（１．０１６５４．００１、Ｍｅｒｃｋ）を添加し、超音波処理によって破壊した。各ポリペプチドについて、超音波処理した懸濁液を遠心分離（１時間、３７０００×ｇ、４℃）によって清澄化し、上清をＨｉｓ ＧｒａｖｉＴｒａｐＴＭカラム（１１−００３３−９９、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。カラムを１０ｍｌの洗浄バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、６０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で洗浄し、その後、３ｍｌの溶出バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍイミダゾール、ｐＨ７．４）を用いてポリペプチドを溶出した。バッファーを、ＰＤ−１０脱塩カラム（１７−０８５１−０１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して切断バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８）に交換した。２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって、ポリペプチド生成物の量を決定し、その後、ＤＴＴを５ｍＭの終濃度に添加した。切断バッファーに、Ｈｉｓ６タグをつけた（配列番号３４）ＴＥＶプロテアーゼをポリペプチド生成物に対して１：１０の質量比で添加した。切断を、４℃、緩徐な混合下で一晩実施した。切断混合物にイミダゾールを２０ｍＭの濃度に添加し、その後、混合物をＨｉｓ ＧｒａｖｉＴｒａｐＴＭカラム（１１−００３３−９９、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、切断されたＨｉｓ６タグ（配列番号３４）、Ｈｉｓ６−タグのついた（配列番号３４）ＴＥＶプロテアーゼおよびＨｉｓ６タグのついた（配列番号３４）未切断生成物を回収した。

【0368】

各変異体について、アルブミン結合ポリペプチド変異体を含有するフロースルーを、以下のように逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）によってさらに精製した。フロースルー画分を、ＲＰＣ Ａバッファー（水中、０．１％ ＴＦＡ）で先に平衡化させた１ｍｌのＲｅｓｏｕｒｃｅ １５ ＲＰＣカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。１０カラム容積（ＣＶ）のＲＰＣ Ａバッファーを用いるカラム洗浄後、結合しているポリペプチドを、１０ＣＶの間、０〜５０％ ＲＰＣ Ｂバッファー（アセトニトリル中、０．１％ ＴＦＡ）の直線勾配を用いて溶出した。流速を２ｍｌ／分とし、２８０ｎｍの吸光度をモニタリングした。アルブミン結合ポリペプチド変異体を含有する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって同定し、プールした。

【0369】

ＲＰＣ精製したアルブミン結合ポリペプチド変異体を、ＸＫ１６カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した１２０ｍｌのＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのゲル濾過によってさらに精製した。ランニングバッファーは、１×ＰＢＳとし、流速は２ｍｌ／分とした。純粋なアルブミン結合ポリペプチド変異体を含有する画分をプールし、およそ１．３ｍｇ／ｍｌに濃縮した。最後に、製造業者の推奨に従って、ＡｆｆｉｎｉｔｙＰａｋ Ｄｅｔｏｘｉ−ゲルエンドトキシン除去ゲル（Ｐｉｅｒｃｅ、ｐｒｏｄ番号２０３４４）の１ｍｌのカラムを使用することによって、微量の残存するエンドトキシンから濃縮物を精製した。

【0370】

以下のとおりに、ＲＰＣ−精製工程の前に、アルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＥＰ０７９１１を、Ｍａｌ−ＤＯＴＡとコンジュゲートした。ディスポーザブルＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＩＭＡＣ−ＦＴ精製工程からのフロースルー画分のバッファーを、０．２Ｍ ＮａＡｃ、ｐＨ５．５に交換した。マレイミド−モノ−アミド−ＤＯＴＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ、カタログ番号Ｂ−２７２）を５倍モル過剰で加え、連続振盪下、３０℃で６０分間インキュベートした。得られたポリペプチドをＰＥＰ０７９６８と表した。

【0371】

Ｈｉｓ６−タグ（配列番号３４）を含まないアルブミン結合ポリペプチド変異体の精製
可溶性アルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＥＰ０６９２３（配列番号４５４）、ＰＥＰ０７２７１（配列番号４５５）、ＰＥＰ０７５５４（配列番号４５６）およびＰＥＰ０７８４４（配列番号４６１）を有する凍結細胞ペレットを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８に懸濁し、超音波処理によって破壊した。各ポリペプチド変異体について、超音波処理された懸濁液を遠心分離（３０分、３２０００×ｇ、４℃）によって清澄化し、上清をＨＳＡ−セファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。ＴＳＴ−バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）、続いて、５ｍＭ ＮＨ４Ａｃ、ｐＨ５．５を用いて洗浄した後、０．５Ｍ ＨＡｃ、ｐＨ３．２を用いて結合しているアルブミン結合ポリペプチド変異体を溶出した。

【0372】

アルブミン結合ポリペプチド変異体を、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）によって以下のとおりにさらに精製した。各変異体について、ＨＳＡ−アフィニティー精製工程から得た溶出液を、ＲＰＣ Ａバッファー（水中、０．１％ ＴＦＡ）で先に平衡化させた１ｍｌのＲｅｓｏｕｒｃｅ １５ ＲＰＣカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。１０ＣＶのＲＰＣ Ａバッファーを用いるカラム洗浄後、結合しているポリペプチドを、１０ＣＶの間、０〜５０％ ＲＰＣ Ｂバッファー（アセトニトリル中、０．１％ ＴＦＡ）の直線勾配を用いて溶出した。流速を２ｍｌ／分とし、２８０ｎｍの吸光度をモニタリングした。アルブミン結合ポリペプチド変異体を含有する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって同定し、プールした。最後に、ディスポーザブルＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、１×ＰＢＳ（２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）にバッファーを交換した。

【0373】

精製アルブミン結合ポリペプチド変異体の特性決定
濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計を使用して、２８０ｎｍの吸光度を測定することによって評価した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣ−ＭＳを用いてタンパク質をさらに分析した。

【0374】

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために、各アルブミン結合ポリペプチド変異体のおよそ１０μｇを、ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、７０℃で１５分間インキュベートし、ＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にロードした。ゲルを、分子量マーカーとしてＳｈａｒｐ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、染色のためにＰｈａｓｔＧｅｌ ＢｌｕｅＲ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、ＸＣｅｌｌ ＩＩ ＳｕｒｅＬｏｃｋ 電気泳動セル（Ｎｏｖｅｘ）中で、ＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳ ＳＤＳランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて流した。

【0375】

アルブミン結合ポリペプチド変異体の同定を検証するために、ＡＰＩ−ＥＳＩおよびシングル四重極質量分析器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＬＣ／ＭＳＤシステムを使用してＬＣ／ＭＳ分析を実施した。およそ１０μｇの各精製アルブミン結合ポリペプチド変異体を、０．５ｍｌ／分の流速のＺｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ８ Ｎａｒｒｏｗ−Ｂｏｒｅカラム（２．１×１５０ｍｍ、３．５μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上にロードした。０．５ｍｌ／分で１５分間の１０〜７０％溶液Ｂの直線勾配を使用してポリペプチドを溶出した。分離を、３０℃で実施した。イオンシグナルおよび２８０および２２０ｎｍでの吸光度をモニｔリングした。精製アルブミン結合ポリペプチド変異体の分子量をＭＳによって確認した。

【0376】

結果
アルブミン結合ポリペプチド変異体の発現レベルは、１０〜３０ｍｇの生成物／１ｇの細胞ペレットであると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から推定された。

【0377】

すべての変異体について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定される純度は、９５％を超え、ＬＣ／ＭＳ分析は、正しい分子量を検証した。精製後、８種のアルブミン結合ポリペプチド変異体各々の、１から８ｍｇの間の純粋なポリペプチドが得られた。

【0378】

実施例２
アルブミン結合ポリペプチドの親和性決定。
この実施例では、実施例１において合成または発現および精製された、ＰＥＰ０６９２３（配列番号４５４）、ＰＥＰ０７２７１（配列番号４５５）、ＰＥＰ０７８４４（配列番号４６１）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号４５７）、ＰＥＰ０７９１３（配列番号４５３）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号４５８）およびＰＥＰ０７９６８、（すなわち、ＰＥＰ０７９１１、配列番号４５９とコンジュゲートしているＤＯＴＡ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ機器を使用して、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する親和性について特性決定した。ＰＥＰ０７９１３は、Ｎ末端グリシン残基が付加されたＧ１４８−ＧＡ３のアミノ酸配列と対応するのに対し、ＰＥＰ０７２７１、ＰＥＰ０７８４４、ＰＥＰ０７９１２、ＰＥＰ０７９１４およびＰＥＰ０７９６８は、種々のＮ末端アミノ酸が付加された、ＰＰ００１（配列番号３０１）、ＰＰ０４３（配列番号３４３）、ＰＰ００７（配列番号３０７）、ＰＰ０１３（配列番号３１３）およびＰＰ０３７（配列番号３３７）のアルブミン結合ポリペプチドに対応する。

【0379】

材料および方法
Ｂｉａｃｏｒｅ２０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのバイオセンサー分析を、製造業者の推奨に従って、ＣＭ−５チップ（研究等級；Ｂｉａｃｏｒｅ）の表面のカルボキシル化デキストラン層上にアミンカップリングによって固定化されたＨＳＡ（Ａｌｂｕｃｕｌｔ（登録商標）、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）を用いて実施した。チップの表面１を活性化し、不活性化し、注入の間の参照セル（ブランク表面）として使用したのに対し、表面２は、７３１レゾナンスユニット（ＲＵ）に固定化されたＨＳＡを含み、表面４は、９５５ＲＵに固定化されたＨＳＡを含んでいた。精製アルブミン結合ポリペプチド変異体を、ランニングバッファーＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で２．５ｎＭ、１０ｎＭおよび４０ｎＭに希釈し、５０μｌ／分の一定流速で５分間注入し、続いて、ＨＢＳ−ＥＰを６０分間注入した。表面を２５μｌ ＨＣｌ、１０ｍＭの１回の注入で再生した。２セットで親和性測定を実施し、第１のセットでは、ＨＢＳ−ＥＰ、ＰＥＰ０６９２３、ＰＥＰ０７２７１、ＰＥＰ０７９１２、ＰＥＰ０７９１３、ＰＥＰ０７９１４およびＰＥＰ０７９６８を注入し（チップ表面２）、第２のセットでは、ＨＢＳ−ＥＰ、ＰＥＰ０６９２３、ＰＥＰ０７８４４、ＰＥＰ０７９１２およびＰＥＰ０７９１４を注入した（チップ表面４）。対照として、各実施においてＰＥＰ０６９２３を２回注入した。ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて結果を解析した。ブランク表面の曲線を、リガンド表面の曲線から差し引いた。

【0380】

結果
Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００機器には、技術的な限界があり、極めて高親和性の測定を妨げる。したがって、Ｂｉａｃｏｒｅ研究の目的は、アルブミン結合ポリペプチド変異体のＨＳＡに対する親和性の正確な動態学パラメータを調べることではない。しかし、結果は、これらのポリペプチドのアルブミンに対する相対的親和性の定量的推定を提供する。参照表面およびバッファー注入を差し引いた後、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用し、質量移動について補正し、局所パラメータとしてＲＵｍａｘセットを用いて曲線を１：１（ラングミュア）結合モデルにフィッティングした。曲線は、図２に示されている。相対的Ｋ_Ｄ、ｋ_ａ（ｋ_ｏｎ）およびｋ_ｄ（ｋ_ｏｆｆ）値を推定し、以下の表に示されている。

【0381】

【表5】

【0382】

【表6】

【0383】

表Ｘ１およびＸ２に示されるように、ＰＥＰ０７２７１（配列番号４５５）、ＰＥＰ０７８４４（配列番号４６１）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号４５７）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号４５８）およびＰＥＰ０７９６８（ＤＯＴＡとコンジュゲートしているＰＥＰ０７９１１、配列番号４５９）はすべて、ＨＳＡに対して、親Ｇ１４８−ＧＡ３（ＰＥＰ０７９１３；配列番号４５３）の親和性を大きく超えるおおよそ同一の親和性を有するようである。これらのポリペプチドのＨＳＡ親和性は、ＰＥＰ０６９２３（配列番号４５４）と比較して、同様の解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）にもかかわらず、わずかに低い。

【0384】

実施例３
アルブミン結合ポリペプチドの融解温度（Ｔｍ）の決定
この実施例では、実施例１に記載のとおりに発現および精製された、アルブミン結合ポリペプチド変異体ＰＥＰ０７９１３（配列番号４５３）、ＰＥＰ０６９２３（配列番号４５４）、ＰＥＰ０７２７１（配列番号４５５）、ＰＥＰ０７５５４（配列番号４５６）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号４５７）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号４５８）、ＰＥＰ０７９６８（ＤＯＴＡとコンジュゲートしているＰＥＰ０７９１１、配列番号４５９）およびＰＥＰ０７８４４（配列番号４６１）ならびにアルブミンポリペプチド変異体ＰＥＰ０７９７５（すなわち、マレイミド−モノ−アミド−ＤＯＴＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ、カタログ番号Ｂ−２７２）を用いＣｙｓ１４を介してＤＯＴＡがコンジュゲートしているＰＥＰ０７８３４、配列番号４６０を、ＣＤ分析によって分析した。ＰＥＰ０７９１３は、Ｎ末端グリシン残基を有するＧ１４８−ＧＡ３の配列に対応し、ＰＥＰ０６９２３は、Jonsson et al、前掲によってこれまでに記載された操作された高親和性誘導体であるのに対し、ＰＥＰ０７２７１、ＰＥＰ０７５５４、ＰＥＰ０７９１２、ＰＥＰ０７９１４、ＰＥＰ０７９６８、ＰＥＰ０７８４４およびＰＥＰ０７９７５は、本開示内容に従って種々のＮ末端アミノ酸付加を有する、ＰＰ００１（配列番号３０１）、ＰＰ００７（配列番号３０７）、ＰＰ０１３（配列番号３１３）、ＰＰ０３７（配列番号３３７）およびＰＰ０４３（配列番号３４３）の４６個のアミノ酸残基のアルブミン結合ポリペプチドの例である。

【0385】

材料および方法
精製アルブミン結合ポリペプチド変異体を１×ＰＢＳで、０．４から０．５ｍｇ／ｍｌの間の終濃度に希釈した。円偏光二色性（ＣＤ）分析は、１ｍｍの光路長を有するセル中で、Ｊａｓｃｏ Ｊ−８１０分光偏光計で実施した。可変温度測定では、２０°〜９０℃で５℃／分の温度勾配を用い、２２１ｎｍの吸光度を測定した。

【0386】

結果
ＣＤ対温度プロットにおける遷移の中間点を求めることによって、種々のアルブミン結合ポリペプチド変異体の融解温度（Ｔｍ）を算出した。結果は、以下の表Ｘ３に要約されている。

【0387】

【表7】

¹⁾ ペプチドは、システインでマレイミド-DOTAとコンジュゲートしている
²⁾ ペプチドは、C末端でアミド化されている
³⁾ ロイシン(下線が引かれている)は、本開示内容の第1の態様において定義されるようなアルブミン結合ポリペプチドの46個のアミノ酸の配列の位置1の残基である
配列番号３８として開示される表Ｘ３中の「ＧＳＳＬ」。

【0388】

ポリペプチドＰＥＰ０７９６８は、ＰＥＰ０７９１２と、前者が、位置１４にシステイン残基を有し、これがマレイミドＤＯＴＡとコンジュゲートしており、後者が、セリン残基である点を除き同一である。したがって、ＤＯＴＡ修飾は、融解温度に影響を及ぼしてはならない。また、ＰＥＰ０７９７５は、Ｃｙｓ１４を使用してＤＯＴＡとマレイミドコンジュゲートしており、Ｃ末端アミド（ペプチド合成に起因する）およびグリシンの代わりにＮ末端アラニンを有する点を除いてＰＥＰ０７９６８と同一である。さらに、ＰＥＰ０７９１２およびＰＥＰ０７５５４を比較することで、Ｎ末端セリンが、同一位置のグリシンよりも高い融解温度をもたらす（Ｔｍにおける５℃の相違）ことが示される。したがって、ＰＥＰ０７９１２およびＤＯＴＡがコンジュゲートしている変異体を除く、本開示内容に従うすべてのアルブミン結合ポリペプチド変異体は、５５℃を上回るＴｍを示す。Ｎ末端部分の重要性を考慮して、すべての試験されたアルブミン結合ポリペプチドは、Jonsson et alの誘導体、例えば、ＰＥＰ０６９２３よりも優れている。

【0389】

実施例４
血清反応分析
本明細書に開示されるような一連のアルブミン結合ポリペプチドと結合できる、ＩｇＧを含有するヒト血清のパーセンテージを、ＥＬＩＳＡによって分析した。１２７の個体に対応する合計１４９種の血清サンプルをスクリーニングした。

【0390】

材料および方法
ＥＬＩＳＡプレート［９６ウェル、ハーフエリアプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３６９０）］を、コーティングバッファー（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号３０４１）で８μｇ／ｍｌに希釈した５０μｌ／ウェルのＡｌｂｕｃｕｌｔ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）を用いてコーティングした。プレートを、４℃で３日間オーバーナイトでコーティングした。分析の当日に、プレートを水道水で２回洗浄し、０．０５％のカゼイン（ＰＢＳＣ）を含有する１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて２時間ブロッキングした。プレートを空にし、ＰＢＳＣで２μｇ／ｍｌに希釈した、５０μｌ／ウェルのアルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０７９１３（配列番号４５３）、ＰＥＰ０６９２３（配列番号４５４）、ＰＥＰ０７２７１（配列番号４５５）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号４５７）、ＰＥＰ０７５５４（配列番号４５６）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号４５８）、ＰＥＰ０７９６８（ＤＯＴＡがコンジュゲートしているＰＥＰ０７９１１、配列番号４５９）およびＰＥＰ０７８４４（配列番号４６１）を、事前に作製したプレート配置に従って添加した。室温（ＲＴ）で２時間のインキュベーション後、自動化ＥＬＩＳＡ洗浄機を使用してプレートをＰＢＳＣで４回洗浄した。１２９の個体から得た１４９種の血清サンプルを、１１７４μｌのＰＢＳＣに、２４μｌの血清を添加することによって、ＰＢＳＣで５０倍希釈した。事前に作製したプレート配置に従って、ウェルあたり、希釈した血清のうち５０μｌを添加した。各血清サンプルを一連で試験した。各プレート上に、各アルブミン結合ポリペプチドの陽性および陰性対照が含まれる。アルブミン結合抗体（５０μｌ、ＰＥＰ０６９２３を用いて免疫処理した霊長類から得た血清から社内で調製された０．５μｌ／ｍｌ免疫グロブリン溶液）を陽性対照として添加し、５０μｌのＰＢＳＣを陰性対照として使用した。プレートを室温で１時間インキュベートし、続いて、自動化ＥＬＩＳＡ洗浄機を使用してＰＢＳＣで４回洗浄した。結合しているＩｇＧを、ＰＢＳＣで１００００倍希釈した５０μｌ／ウェルの抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０４０−０５）を用いて検出した。自動化ＥＬＩＳＡ洗浄機を使用してＰＢＳＣで４回洗浄した後、５０μｌ／ウェルの基質を添加した（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号３４０２１）。１０〜１５分後、各ウェルに５０μｌのＨ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止させ、その後、マルチウェルプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ３、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して吸光度を測定した。

【0391】

結果。
アルブミン結合ポリペプチドに対するＩｇＧ結合についてスクリーニングされた１４９種の血清のうち、２３種が、８種すべてのポリペプチドについて陰性であり（ＯＤ値＜０．１）、すなわち、ポリペプチドと結合しているＩｇＧを示さなかった。１種または複数のアルブミン結合ポリペプチドについて陽性であった１２６種の血清を用いて分析を実施した。平均吸光度を算出し（図３Ａ）、ＯＤ値を有する血清のパーセンテージは、＜０．１５（図３Ｂ）または＞１．０（図３Ｃ）のいずれかを評価する。ＩｇＧ結合を有する血清の最高平均ＯＤ値および最高パーセンテージが、ＰＥＰ０７９１３（配列番号４５３）、ＰＥＰ０６９２３（配列番号４５４）およびＰＥＰ０７８４４（配列番号４６１）を用いて得られたのに対し、ＰＥＰ０７９６８（ＤＯＴＡがコンジュゲートしているＰＥＰ０７９１１、配列番号４５９）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号４５８）およびＰＥＰ０７９５４（配列番号４５６）に対して最小の反応性が見られた。

【0392】

したがって、最も反応性のアルブミン結合ポリペプチドは、親のＧ１４８−ＧＡ３（ＰＥＰ０７９１３、配列番号４５３）およびＧ１４８−ＧＡ３から保持されたヘリックス１を有するこれまでに親和性が改善された誘導体（ＰＥＰ０６９２３、配列番号４５４）であった。第３のより反応性のポリペプチド（ＰＥＰ０７８４４、配列番号４６１）は、ヘリックス１中の位置１４に元のリシンを含有する。この残基はコンジュゲーションに意図され、したがって、そのようなものとして使用される場合に曝露されない。位置１４にアラニンを有する点を除いて同一であるアルブミン結合ポリペプチド変異体（ＰＥＰ０７５５４、配列番号４５６）は、最も反応性が低いものの１種である。

【0393】

実施例５
アルブミン結合ポリペプチドの免疫原性試験
ＰＥＰ０７９１３（配列番号４５３）、ＰＥＰ０７９１２（配列番号４５７）、ＰＥＰ０７９１４（配列番号４５８）およびＰＥＰ０７９６８（すなわち、ＤＯＴＡがコンジュゲートしているＰＥＰ０７９１１、配列番号４５９）を、５２人のヒトコーカサス人種の個体から得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（ＣＲＩ−Ｌａｂｏ Ｍｅｄｉｓｃｈｅ Ａｎａｌｙｓｅ、Ｇｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから入手）においてＴ細胞増殖を誘導するその能力についてスクリーニングした。ＰＥＰ０７９１３は、Ｎ末端グリシン残基を有するＧ１４８−ＧＡ３の配列に対応するのに対し、ＰＥＰ０７９１２、ＰＥＰ０７９１４およびＰＥＰ０７９６８は、本開示内容に従って種々のＮ末端アミノ酸付加を有する、ＰＰ００７（配列番号３０７）、ＰＰ０１３（配列番号３１３）およびＰＰ０３７（配列番号３３７）の４６個のアミノ酸残基のアルブミン結合ポリペプチドの例である。

【0394】

材料および方法
組織培養（ＴＣ）処理した９６ウェル丸底プレート（Ｆａｌｃｏｎ）に、標準細胞生物学的方法に従って調製されたＰＢＭＣを３０００００個ＰＢＭＣ／ウェルの量で添加した。９００μｇ／ｍｌの（３倍モル過剰）の組換えヒトアルブミン（Ａｌｂｕｃｕｌｔ（登録商標）、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）をさらに含有するＡＩＭＶ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の、アルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０７９１３、ＰＥＰ０７９１２、ＰＥＰ０７９１４およびＰＥＰ０７９６８、１００μｌ／ウェルの添加によって細胞を刺激した。これは、３０μｇ／ｍｌのアルブミン結合ポリペプチドの終濃度に対応していた。刺激を８連で行い、すなわち、同一量の同一アルブミン結合ポリペプチドを、同一条件下で、８つのウェルに添加した。陽性対照ウェルでは、３０μｇ／ｍｌのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）または３０μｇ／ｍｌ破傷風トキソイド（ＴＴ、Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ）のいずれかを用いて細胞を刺激した。陰性対照ウェルでは、９００μｇ／ｍｌのアルブミンを含むか含まないＡＩＭＶ培地のみを添加した。

【0395】

Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ ＥｄＵフローサイトメトリーアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、７日の培養後に細胞増殖を評価した。６日目に１μＭ／ウェルのＥｄＵ組み込みマーカーを添加した。７日目に、細胞を洗浄し、プレートから解離させ、再度洗浄し、抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ試薬（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）および抗ＣＤ４−Ａｌｅｘａ６４７試薬（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて３０分間染色した。染色後、細胞を洗浄し、固定し（ＢＤ ｃｅｌｌｆｉｘ、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、透過処理し（サポニンを使用して）、製造業者のプロトコールに従って（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ試薬を添加することによってＥｄＵについて染色した。染色が完了した後、細胞を再度洗浄し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。増殖細胞の数を評価するために、分析の前に各ウェルに固定された数のフルオスフェア（ｆｌｕｏｓｐｈｅｒｅｓ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。すべての染色手順および洗浄は、９６ウェルプレート中で直接的に実施した。

【0396】

生のＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩデータを、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に関して階層的にゲーティングし、ゲーティングされた細胞数ならびにＥｄＵ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８組み込みマーカーのその蛍光強度を記録した。増殖細胞数／８連のタンパク質処理ウェルの平均値を、陽性および陰性対照と比較し、刺激指数（ＳＩ）として記載される得られる比を算出した。ＳＩおよび複製間の変動に基づいて、刺激および阻害について閾値ＳＩ値をそれぞれ、２．０および０．５に設定した。

【0397】

結果
アルブミン結合ポリペプチドＰＥＰ０７９１３、ＰＥＰ０７９１２、ＰＥＰ０７９１４およびＰＥＰ０７９６８を、インビトロＰＢＭＣ増殖アッセイを使用して、標的ヒト集団における３倍過剰の組換えヒトアルブミンの存在下でのその免疫学的可能性について評価した。アルブミン対照と比較して、ＰＥＰ０７９１３は、５２ドナーのうち６において、ＰＥＰ０７９１２は、５２ドナーのうち５において、ＰＥＰ０７９１４およびＰＥＰ０７９６８は、５２ドナーのうち１においてＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を誘導した（図４Ａ）。

【0398】

５２ドナーすべての平均刺激指数（ＳＩ）は、組換えヒトアルブミンを含有する陰性対照と比較して、ＰＥＰ０７９１４およびＰＥＰ０７９６８について大きく異ならなかった（それぞれ、ｐ＝０．７９および０．４８、図４Ｂ）。ＰＥＰ０７９１３のＳＩは、大幅に高かった（ｐ＝０．００２）のに対し、ＰＥＰ０７９１２のＳＩは高かったが有意ではなかった（ｐ＝０．０３、図４Ｂ）。

【0399】

バッファーのみと比較して、反応する個体の数は、ＰＥＰ０７９１２について１０、ＰＥＰ０７９１２について７、ＰＥＰ０７９１４について２、ＰＥＰ０７９６８について１、組換えヒトアルブミンについて２であり、２つの陽性対照ＴＴおよびＫＬＨについてそれぞれ、４９および５１であった（図４Ｃ）。アルブミン結合ポリペプチドを、その免疫原性に従って以下の順序にランク付けした：ＰＥＰ０７９１３＞ＰＥＰ０７９１２＞ＰＥＰ０７９１４＞ＰＥＰ０７９６８。ＰＥＰ０７９１４およびＰＥＰ０７９６８は両方とも、非免疫原性と定義された。したがって、上記の結果は、本開示内容のアルブミン結合ポリペプチドの免疫原性の可能性が、陽性対照と比較して低いことを実証する。

【0400】

実施例６
レプチンインビトロ機能活性
方法。このアッセイは、修飾されたレプチン受容体を発現する細胞の処理後の受容体シグナル伝達を測定する。試験サンプルは、１００％純度と仮定され、刺激バッファーで１０×アッセイ濃度に再溶媒和した。各１０×化合物の合計９０ｕｌを深いウェルのｐｐプレート移し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｍｕｌｔｉｐｒｏｂｅ（登録商標）ＩＩを使用して刺激バッファーを用いて段階希釈した（３倍シリーズ）。希釈された化合物の各２００ｕｌを移し、細胞と混合するＭｕｌｔｉＭｅｋ試験プログラムを使用して、段階希釈したプレートを、当技術分野で公知の１８時間レプチンをやめさせたケプチン細胞の２．５×１０^５個細胞ペレットを含有する９６ウェル刺激プレート中に混ぜ合わせた。この時点で、プレートを接着性プレートカバーで密閉し、３７Ｃに３０分間置き、ｐＳＴＡＴ５の刺激を可能にした。例えば、Crouse et al., 1998, J. Biol. Chem., 273:18365-18373を参照のこと。インキュベーション後、刺激プレートを遠心分離して、細胞を再度ペレットにし、上清を除去し、残りの細胞ペレットを−８０Ｃで凍結した（＞３０分）。解凍した細胞ペレットに、１００ｕｌの１×溶解物を、周囲の室温で回転しながら２０分間添加することによって細胞溶解物を作製した（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ｐＳＴＡＴ５アッセイキット）。溶解物を２５００ｒｐｍで２０分間清澄化し、製造業者の使用説明書に従って、３８４ウェルＰｒｏｘｉｐｌａｔｅ（商標）中、４ｕｌ／ウェルとしてｐＳＴＡＴ５アッセイキットで調べた。αリードパラメーターに設定したＰａｃｋａｒｄ Ｆｕｓｉｏｎ α−ＦＰ ＨＴプレートリーダーを使用してｐＳＴＡＴ５シグナル（ＲＦＵ）を調べた。アッセイは、３８４ウェルＰｒｏｘｉｐｌａｔｅ（商標）プレート中、１１μｌの総容量で完了し、値は、用量点あたりｎ＝４アッセイウェルの平均を表す。

【0401】

結果
以下の表Ｘ４に示されるように、本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、Ｏｂｅｃａ ＳＴＡＴ５アッセイにおいて機能活性を示す。

【0402】

【表8】

【0403】

実施例７
アルブミンの存在下でのレプチンインビトロ機能活性
このアッセイでは、アルブミンの存在下での化合物２のレプチン機能を調べるために刺激バッファーにアルブミンが添加された点を除いて、実施例６に記載された方法を使用した。試験されたアルブミンは、０．１％または１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１％ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）または１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含んでいた。対照サンプルは、０．１％ ＢＳＡを有するＡ１００レプチンとした。

【0404】

結果。図５示されるように、レプチン機能アッセイにおいて化合物２によって生じたＥＣ５０活性に対する１％ウシ／ラット／ヒトアルブミンの効果はなかった。結果は驚くべきものであり、治療用化合物は、アルブミンと結合している場合でさえ活性であることを示す。

【0405】

実施例８
操作されたポリペプチドの単回投与後の体重および食物摂取の変化
方法。痩せたスプラーグドーリーラットを、研究の間、低脂肪食で維持した。平均体重は、研究の開始時に３１５〜３３０グラムであった。動物を６群に分けた（ｎ＝５／群）。各群を、以下のうち１種を投与されるよう割り当てた：媒体；１３．３３ｎｍｏｌ／ｋｇの化合物２；４０ｎｍｏｌ／ｋｇの化合物２；１２０ｎｍｏｌ／ｋｇの化合物２。各試験動物は、時間＝０で単回皮下注射を投与された。食物摂取および体重の変化（媒体補正された％）を７日間モニタリングし、結果を示されるように記録した（図６Ａおよび６Ｂ）。投与された化合物：媒体（丸）；１３．３３ｎｍｏｌ／ｋｇの化合物２（三角先端下）；４０ｎｍｏｌ／ｋｇの化合物２（菱形）；１２０ｎｍｏｌ／ｋｇ（星）。

【0406】

結果。図６Ａから６Ｂに表されるように、種々の用量の操作されたポリペプチドの投与は、媒体単独を投与された群と比較して、食物摂取および体重の低減をもたらした。

【0407】

実施例９
操作されたポリペプチドの単回投与後の体重および食物摂取の変化
方法。痩せたスプラーグドーリーラットを、研究の間、低脂肪食で維持した。平均体重は、研究の開始時に３１５〜３３０グラムであった。各試験動物（ｎ＝５／群）は、時間＝０で単回皮下注射を投与された。動物を５群に分けた。各群を、以下のうち１種を投与されるよう割り当てた：媒体または化合物６６。化合物６６は、１２０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で送達された。食物摂取および体重の変化（媒体補正された％）を７日間モニタリングし、結果を示されるように記録した（図７Ａおよび７Ｂ）。投与された化合物：媒体（丸）；１２０ｎｍｏｌ／ｋｇの化合物６６（三角先端下）。

【0408】

結果。図７Ａから７Ｂに表されるように、操作されたポリペプチドの投与は、媒体単独を投与された群と比較して、食物摂取および体重の低減をもたらした。

【0409】

実施例１０
操作されたポリペプチドの単回投与後の体重の変化
方法。痩せたスプラーグドーリーラットを、研究の間、低脂肪食で維持した。平均体重は、研究の開始時に３１５〜３３０ｇであった。動物を６群に分けた。各試験動物（ｎ＝５／群）は、時間＝０で単回皮下注射を投与された。各群を、以下のうち１種を投与されるよう割り当てた：媒体；化合物２；または化合物６７。化合物２および化合物６７は、１２０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で各々送達された。各群の体重の変化パーセントを７日間モニタリングし、結果を示されるように記録した（図８）。投与された化合物：媒体（丸）；化合物２（三角先端上）；化合物６７（菱形）。

【0410】

結果。図８に表されるように、試験された操作されたポリペプチドの１種の単回注射を投与された動物の各群は、媒体単独を投与された群と比較して、体重の大幅な、持続した低減を示した。

【0411】

実施例１１
操作されたポリペプチドの単回投与後の体重の変化
方法。痩せたスプラーグドーリーラットを、研究の間、低脂肪食で維持した。平均体重は、研究の開始時に３１５〜３３０ｇであった。動物を６群に分けた。各試験動物（ｎ＝５／群）は、時間＝０で単回皮下注射を投与された。各群を、以下のうち１種を投与されるよう割り当てた：媒体；化合物２；化合物１２；化合物１。化合物２、化合物１２および化合物１は、各々１２０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で送達された。各群の体重の変化パーセントを７日間モニタリングし、結果を示されるように記録した（図９）。投与された化合物：媒体（丸）；化合物２（三角先端上）；化合物１２（丸）；化合物１（三角先端下）。

【0412】

結果。図９に表されるように、試験された操作されたポリペプチドの１種の単回注射を投与された動物の各群は、媒体単独を投与された群と比較して、体重の大幅な、持続した低減を示した。

【0413】

実施例１１
アルブミン結合ポリペプチドの親和性測定
この実施例では、ＰＥＰ０７９８６（配列番号４６３）、ＰＥＰ０７９８６−中性リンカー−Ａ５００（化合物２、配列番号５９５）およびＰＥＰ０７９８６−陰性リンカー−Ａ５００（化合物１２、配列番号６０５）を、アルブミンの種々の変異体に対する親和性について特性決定した。

【0414】

材料および方法
すべての研究を、２５℃でＧＬＣセンサーチップを使用してＢｉｏＲａｄ ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６システムで実施した。アミンカップリングのために、以下に示されるように最初のストックから水で３０倍希釈したスルホ−ＮＨＳ／ＥＤＣの１：１混合物を使用してＧＬＣチップを５分間活性化した。各アルブミンサンプルを１０ｍＭ酢酸Ｎａ ｐＨ５．０で２５ｕｇ／ｍｌに希釈し、別個のセンサー表面上に５分間注入した。次いで、１ＭエタノールアミンｐＨ８．５を用いて各表面をブロッキングした。各アルブミンをレゾナンスユニットにおいて２０００〜５０００の密度でカップリングした。

【0415】

３倍希釈シリーズにおいて最高濃度として５ｎＭを使用して、操作されたポリペプチドの結合を調べた。ランニングバッファーは、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．００５％ ｔｗｅｅｎ−２０を含有していた。３倍希釈シリーズを使用してすべてのサンプルを調べた。各濃度シリーズを２連で試験した。最高濃度の解離相を、３時間モニタリングした。

【0416】

結果
操作されたポリペプチドの測定された相対Ｋ_Ｄが、以下の表Ｘ５に示されている。結果は、アルブミン結合ポリペプチドが、血清アルブミン（ＳＡ）と高親和性で会合していることを示す。

【0417】

【表9】

【0418】

実施例１２
操作されたポリペプチドの溶解度
以下の表Ｘ６に示されるように、本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、中性ｐＨにおいて驚くべきことに高い溶解度を有する。

【0419】

溶解度は、以下のアッセイを用いて測定した：６〜１０ｍｇの精製タンパク質を、４℃で遠心分離フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５またはＵｌｔｒａ−４、３ＫＤａ ＭＷカットオフを有する；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、０．５ｍｌ未満の容量に濃縮した。それらを１４，０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離して、沈殿物を除去し、上清を新規試験管に移した。タンパク質を、室温、暗所で一晩平衡化し、次いで、０．２２ミクロンシリンジフィルター（Ｍｉｌｅｘ ＧＶ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濾過して、沈殿物を除去した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いてＯＤ２８０の吸光度を測定し、タンパク質の理論上のモル吸光係数を使用して濃度を算出した。

【0420】

【表10】

【0421】

実施例１３
操作されたポリペプチドの安定性
本明細書に記載された操作されたポリペプチドは、物理的に安定である。表Ｘ７は、Ａ１００およびＡＢＤ２−ＨｕＳｅａｌで実施されたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の結果を示す。操作されたポリペプチドは、Ａ１００と比較して、二量体／オリゴマーへの自己会合をほとんど示さないか、または全く示さない。

【0422】

【表11】

Pk1=単量体
Pk2=二量体
Pk3=オリゴマー(三量体/四量体)

【0423】

ＳＥＣ法：
カラム−Ｔｏｓｏｈ ＴＳＫゲルＧ３０００ ＳＷ×ｌ ７．８ｍｍ×３０ｃｍ（番号０８５４１）
移動相−１０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ７．４＋２３８ｍＭ ＮａＣｌ＋２．７ｍＭ ＫＣｌ
実施時間−２２分
流速−０．８ｍＬ／分
カラム温度−２５℃
サンプル温度−５℃
サンプルロード−４０ｕｇ
検出−２１４ｎｍ

【0424】

実施例１４
高ＢＭＩ対象では、アミリンおよびレプチンの相乗作用はない
これまでの研究は、５００〜５５０グラムの体重のラットにおいてアミリン／レプチン相乗作用を記載している。有効性およびＢＭＩの反比例関係が述べられた後、本発明者らは、極めて肥満のラット（７５０グラム）における、および中程度の肥満（５００〜５５０ｇ）の範囲へ食事制限され、その後、薬物治療を開始した極めて肥満のラットにおいて、組合せの効果を評価した。

【0425】

この研究では、極めて肥満のラット（７５０ｇ）の１群に自由摂取させ、アミリン、レプチンまたはアミリン＋レプチンの組合せで治療した。アミリンは有効であったが、レプチンを添加した場合に相乗作用の証拠はなかった。極めて肥満のラット（７５０ｇ）の第２群は、これまでに相乗作用が実証されている５００〜５５０ｇの範囲にカロリー制限された。次いで、これらの動物は、アミリン／レプチン治療を開始し、自由摂取させた。図１０は、研究の結果を示す。媒体およびレプチン単剤療法で治療されたラットにおいて、迅速な体重の再増加が明白であった。アミリン単剤療法を用いていくらかの体重維持が達成された。組合せを用いた場合に、さらなる体重維持は達成されなかった。これらの知見は、「高ＢＭＩ」げっ歯類における相乗作用の欠如は、食事主導によって簡単にレスキューされ得ないということを示唆する。

【0426】

実施例１５
操作されたポリペプチドのアミリンアゴニストとの相乗作用
この研究は、ＡＢＤ２−ＨｕＳｅａｌ（化合物６４）の週に１回の投与は、ＰＥＧ−ラットアミリン（Ｄｅｓ−Ｌｙｓ１−［Ｌｙｓ２６（ｍＰＥＧ４０Ｋ）］−ラットアミリン（配列番号１４８）、化合物１２４）の週に２回の投与と同時投与される場合に相乗作用にとって十分であることを示す。図１１は、操作されたポリペプチドおよびＰＥＧ−ラットアミリンの組合せが、各薬剤単独について観察された結果よりも多い体重減少をもたらすことを示す。ＡＢＤ２−ＨｕＳｅａｌは、５００ｇの平均体重の雄のＤＩＯ ＨＳＤラットに、１２０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与し、ＰＥＧ−アミリンは、１２５ｎｍｏｌ／ｋｇで投与した。

【0427】

実施例１６
非肥満、１型糖尿病マウスにおける操作されたポリペプチドの抗糖尿病効果
この研究の目的は、１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）の高用量ＳＴＺマウスモデルにおいて、操作されたポリペプチドの、重要な糖尿病エンドポイントおよび代謝エンドポイントに対するインビボ効果を評価することであった。Ｃ５７ ＢＬ／６雄マウスに、１型糖尿病を誘発するために２００ｍｇ／ｋｇのＳＴＺの単回腹腔内注射を投与した。化合物は、週に２回皮下に４週間投与した。測定されるエンドポイントは、ＨｂＡ１ｃレベル、グルコースレベル、体重および食物摂取を含んでいた。

【0428】

図１２は、化合物２が、ＳＴＺ誘発性糖尿病マウスにおける血糖の用量関連低減をもたらしたことを示す。図１３に示されるように、ヘモグロビンＡ１ｃレベルの用量関連低減も、また図１４に示されるように、体重および累積食物摂取の低減ももたらされた。

【0429】

治療のグルコース低下効果が、インスリン効果によるものではないことを確実にするために、レプチン治療を低用量のインスリンと組み合わせるための別の研究を実施した。化合物２を、Ｔ１ＤＭの高用量ＳＴＺマウスモデルにおいて、０．０５Ｕ／インスリンの１日用量の添加を伴うか、伴わないで投与した。Ｃ５７ ＢＬ／６雄マウスに、１型糖尿病を誘発するために、１７５ｍｇ／ｋｇのＳＴＺの単回腹腔内注射を投与した。化合物は、週に２回、皮下に６０ｎｍｏｌ／ｋｇで２週間投与した。測定されるエンドポイントは、ＨｂＡ１ｃレベル、グルコースレベル、体重および食物摂取を含んでいた。

【0430】

図１５は、化合物２の付加様式で低用量のインスリンで強化されるグルコース低下効果を示す。図１６に示されるように、ヘモグロビンＡ１ｃレベルも低減され、図１７に示されるように、体重および累積食物摂取も低減された。

【0431】

ＶＩＩＩ．実施形態
本明細書に記載される操作されたポリペプチド、その使用方法および医薬組成物のさらなる実施形態は、以下のとおりである：

【0432】

実施形態１．アルブミン結合ドメインポリペプチド（ＡＢＤ）と、レプチン、レプチン類似体またはその活性断片から選択される第１のペプチドホルモンドメイン（ＨＤ１）とを含む操作されたポリペプチドであって、
前記ＡＢＤは、
（ｉ）LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLI X26 KAKT VEGVEALK X39 X40 IL X43 X44 LP（配列番号３００）
（配列中、互いに独立して、
Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され；
Ｘ６は、Ｅ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ１０は、Ａ、ＳおよびＲから選択され；
Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され；
Ｘ２６は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ３９は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ４０は、ＡおよびＥから選択され；
Ｘ４３は、ＡおよびＫから選択され；
Ｘ４４は、Ａ、ＳおよびＥから選択され；
位置４５のロイシンは、存在するか、または存在せず；
位置４６のプロリンは、存在するか、または存在しない）と、
（ｉｉ）（ｉ）において定義される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（ただし、Ｘ_７は、Ｌ、ＥまたはＤではないか；
または代わりに、
アミノ酸配列は、ＰＣＴ公開出願番号ＷＯ２００９／０１６０４３において定義されるような以下の配列：LAEAK X_a X_b A X_c X_d EL X_e KY GVSD X₅ YK X₈ X₉ I X₁₁ X₁₂ A X₁₄ TVEGV X₂₀ AL X₂₃ X₂₄ X₂₅ ILAALP（配列番号６７９）
によって定義されず、配列中、
互いに独立して、
Ｘ_ａは、ＶおよびＥから選択され；
Ｘ_ｂは、Ｌ、ＥおよびＤから選択され；
Ｘ_ｃは、Ｎ、ＬおよびＩから選択され；
Ｘ_ｄは、ＲおよびＫから選択され；
Ｘ_ｅは、ＤおよびＫから選択され；
Ｘ_５は、ＹおよびＦから選択され；
Ｘ_８は、Ｎ、ＲおよびＳから選択され；
Ｘ_９は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ_１１は、Ｎ、Ｓ、ＥおよびＤから選択され；
Ｘ_１２は、Ｒ、ＫおよびＮから選択され；
Ｘ_１４は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ_２０は、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｓ、ＲおよびＫから選択され；
Ｘ_２３は、Ｋ、ＩおよびＴから選択され；
Ｘ_２４は、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、ＬおよびＤから選択され；
Ｘ_２５は、Ｈ、ＥおよびＤから選択される）と
を含むアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、操作されたポリペプチド。

【0433】

実施形態２．前記ＨＤ１と共有結合によって連結している第１のリンカー（Ｌ１）をさらに含む、実施形態１に記載の操作されたポリペプチド。

【0434】

実施形態３．Ｎ末端部分として前記ＡＢＤを含み、Ｃ末端部分として前記ＨＤ１を含む、実施形態１または２に記載の操作されたポリペプチド。

【0435】

実施形態４．Ｃ末端部分として前記ＡＢＤを含み、Ｎ末端部分として前記ＨＤ１を含む、実施形態１または２に記載の操作されたポリペプチド。

【0436】

実施形態５．構造：ＡＢＤ−ＨＤ１を含む、実施形態３に記載の操作されたポリペプチド。

【0437】

実施形態６．構造：ＡＢＤ−Ｌ１−ＨＤ１を含む、実施形態３に記載の操作されたポリペプチド。

【0438】

実施形態７．構造：ＨＤ１−ＡＢＤを含む、実施形態４に記載の操作されたポリペプチド。

【0439】

実施形態８．構造：ＨＤ１−Ｌ１−ＡＢＤを含む、実施形態４に記載の操作されたポリペプチド。

【0440】

実施形態９．前記ＨＤ１が、レプチン、レプチン類似体、レプチン活性断片またはレプチン誘導体である、実施形態１から８のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0441】

実施形態１０．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する、実施形態１から９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0442】

実施形態１１．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、実施形態１から１０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0443】

実施形態１２．前記ＨＤ１が、ヒトレプチンと少なくとも５０％の同一性を有する、実施形態１から１１のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0444】

実施形態１３．前記ＨＤ１が、ヒトレプチンと少なくとも９０％の同一性を有する、実施形態１から１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0445】

実施形態１４．前記ＨＤ１が、配列番号２０と少なくとも５０％の同一性を有する、実施形態１から１３のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0446】

実施形態１５．前記ＨＤ１が、配列番号２０と少なくとも９０％の同一性を有する、実施形態１から１４のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。
実施形態１６．前記ＨＤ１が、カモノハシレプチンと少なくとも５０％の同一性を有する、実施形態１から１５のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0447】

実施形態１７．前記ＨＤ１が、アザラシレプチンと少なくとも５０％の同一性を有する、実施形態１から１６のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0448】

実施形態１８．前記ＨＤ１が、挿入、欠失、付加および置換のうちいずれか１種またはそれらの組合せから独立に選択される１〜５個のアミノ酸修飾を有する、実施形態１から１７のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0449】

実施形態１９．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１８のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0450】

実施形態２０．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0451】

実施形態２１．前記ＨＤ１が、配列番号１である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0452】

実施形態２２．前記ＨＤ１が、配列番号２である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0453】

実施形態２３．前記ＨＤ１が、配列番号３である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0454】

実施形態２４．前記ＨＤ１が、配列番号４である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0455】

実施形態２５．前記ＨＤ１が、配列番号５である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0456】

実施形態２６．前記ＨＤ１が、配列番号６である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0457】

実施形態２７．前記ＨＤ１が、配列番号７である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0458】

実施形態２８．前記ＨＤ１が、配列番号８である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0459】

実施形態２９．前記ＨＤ１が、配列番号９である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0460】

実施形態３０．前記ＨＤ１が、配列番号１０である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0461】

実施形態３１．前記ＨＤ１が、配列番号１１である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0462】

実施形態３２．前記ＨＤ１が、配列番号１２である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0463】

実施形態３３．前記ＨＤ１が、配列番号１３である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0464】

実施形態３４．前記ＨＤ１が、配列番号１４である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0465】

実施形態３５．前記ＨＤ１が、配列番号１５である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0466】

実施形態３６．前記ＨＤ１が、配列番号１６である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0467】

実施形態３７．前記ＨＤ１が、配列番号１７である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0468】

実施形態３８．前記ＨＤ１が、配列番号１８である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0469】

実施形態３９．前記ＨＤ１が、配列番号１９である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0470】

実施形態４０．前記ＨＤ１が、配列番号２０である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0471】

実施形態４１．前記ＨＤ１が、配列番号２１である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0472】

実施形態４２．前記ＨＤ１が、配列番号２２である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0473】

実施形態４３．前記ＨＤ１が、配列番号２３である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0474】

実施形態４４．前記ＨＤ１が、配列番号２４である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0475】

実施形態４５．前記ＨＤ１が、配列番号２５である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0476】

実施形態４６．前記ＨＤ１が、配列番号２６である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0477】

実施形態４７．前記ＨＤ１が、配列番号２７である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0478】

実施形態４８．前記ＨＤ１が、配列番号２８である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0479】

実施形態４９．前記ＨＤ１が、配列番号２９である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0480】

実施形態５０．前記ＨＤ１が、配列番号３０である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0481】

実施形態５１．前記ＨＤ１が、配列番号３１である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0482】

実施形態５２．前記ＨＤ１が、配列番号３２である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0483】

実施形態５３．前記ＨＤ１が、配列番号３３である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0484】

実施形態５４．前記ＡＢＤが、
（ｉ）LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLI X26 KAKT VEGVEALK X39 X40 IL X43 X44 LP（配列番号３００）
（配列中、互いに独立して、
Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され；
Ｘ６は、Ｅ、ＳおよびＣから選択され；
Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；
Ｘ１０は、Ａ、ＳおよびＲから選択され；
Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され；
Ｘ２６は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ３９は、ＤおよびＥから選択され；
Ｘ４０は、ＡおよびＥから選択され；
Ｘ４３は、ＡおよびＫから選択され；
Ｘ４４は、Ａ、ＳおよびＥから選択され；
位置４５のロイシンは、存在するか、または存在せず；
位置４６のプロリンは、存在するか、または存在しない）
を含むアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から５３のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0485】

実施形態５５．前記ＡＢＤが、（ｉｉ）（ｉ）において定義される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む、実施形態１から５４のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0486】

実施形態５６．前記ＡＢＤが、
（ｉ）LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDA ILAALP（配列番号６７８）
（配列中、互いに独立して、Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され；Ｘ６は、Ｅ、ＳおよびＣから選択され；Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；Ｘ１０は、Ａ、ＳおよびＲから選択され；Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され；位置４５のロイシンは、存在するか、または存在せず；位置４６のプロリンは、存在するか、または存在しない）と
（ｉｉ）（ｉ）において定義される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
（ただし、Ｘ_７は、Ｌ、ＥまたはＤではないか；
または代わりに、
アミノ酸配列は、ＰＣＴ公開出願番号ＷＯ２００９／０１６０４３において定義されるような以下の配列によって定義されない：LAEAK X_a X_b A X_c X_d EL X_e KY GVSD X₅ YK X₈ X₉ I X₁₁ X₁₂ A X₁₄ TVEGV X₂₀ AL X₂₃ X₂₄ X₂₅ ILAALP（配列番号６７９）
（配列中、
互いに独立して、
Ｘ_ａは、ＶおよびＥから選択され；
Ｘ_ｂは、Ｌ、ＥおよびＤから選択され；
Ｘ_ｃは、Ｎ、ＬおよびＩから選択され；
Ｘ_ｄは、ＲおよびＫから選択され；
Ｘ_ｅは、ＤおよびＫから選択され；
Ｘ_５は、ＹおよびＦから選択され；
Ｘ_８は、Ｎ、ＲおよびＳから選択され；
Ｘ_９は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＦおよびＹから選択され；
Ｘ_１１は、Ｎ、Ｓ、ＥおよびＤから選択され；
Ｘ_１２は、Ｒ、ＫおよびＮから選択され；
Ｘ_１４は、ＫおよびＲから選択され；
Ｘ_２０は、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｓ、ＲおよびＫから選択され；
Ｘ_２３は、Ｋ、ＩおよびＴから選択され；
Ｘ_２４は、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、ＬおよびＤから選択され；
Ｘ_２５は、Ｈ、ＥおよびＤから選択される）と
を含むアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から５５のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0487】

実施形態５７．前記ＡＢＤが、
（ｉ）LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDA ILAALP（配列番号６７８）
（配列中、互いに独立して、Ｘ３は、Ｅ、Ｓ、ＱおよびＣから選択され；Ｘ６は、Ｅ、ＳおよびＣから選択され；Ｘ７は、ＡおよびＳから選択され；Ｘ１０は、Ａ、ＳおよびＲから選択され；Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、ＣおよびＫから選択され；位置４５のロイシンは、存在するか、または存在せず；位置４６のプロリンは、存在するか、または存在しない）を含むアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から５６のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0488】

実施形態５８．前記ＡＢＤが、（ｉｉ）（ｉ）において定義される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む、実施形態１から５７のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0489】

実施形態５９．Ｘ６が、ＡＢＤにおいてＥである、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0490】

実施形態６０．Ｘ３が、ＡＢＤにおいてＳである、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0491】

実施形態６１．Ｘ３が、ＡＢＤにおいてＥである、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0492】

実施形態６２．Ｘ７が、ＡＢＤにおいてＡである、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0493】

実施形態６３．Ｘ１４が、ＡＢＤにおいてＳである、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0494】

実施形態６４．Ｘ１４が、ＡＢＤにおいてＣである、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0495】

実施形態６５．Ｘ１０が、ＡＢＤにおいてＡである、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0496】

実施形態６６．Ｘ１０が、ＡＢＤにおいてＳである、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0497】

実施形態６７．位置４６のプロリンが存在しない、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0498】

実施形態６８．Ｘ２６が、ＡＢＤにおいてＤである、実施形態５６から５８のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0499】

実施形態６９．Ｘ３９が、ＡＢＤにおいてＤである、実施形態５６から５８のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0500】

実施形態７０．Ｘ４０が、ＡＢＤにおいてＡである、実施形態５６から５８のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0501】

実施形態７１．Ｘ４３が、ＡＢＤにおいてＡである、実施形態５６から５８のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0502】

実施形態７２．Ｘ４４が、ＡＢＤにおいてＡである、実施形態５６から５８のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0503】

実施形態７３．ＡＢＤが、相互作用のｋｏｆｆ値が最大で５×１０^−５ｓ^−１であるように、アルブミンと結合する、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0504】

実施形態７４．ＡＢＤが、相互作用のｋｏｆｆ値が最大で５×１０^−６ｓ^−１であるように、アルブミンと結合する、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0505】

実施形態７５．ＡＢＤが、配列番号３０１〜４５２、４５５〜４６３および５００〜５９３のいずれか１つから選択される、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0506】

実施形態７６．ＡＢＤが、配列番号３１３、配列番号４４８、配列番号４６３、配列番号５００、配列番号５０１および配列番号５０２のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列から選択される、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0507】

実施形態７７．ＡＢＤが、（ｉ）において定義される配列のＮおよび／またはＣ末端に位置する１個または複数のさらなるアミノ酸残基をさらに含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0508】

実施形態７８．１個または複数のさらなるアミノ酸残基が、ＡＢＤのＮ末端におけるセリン残基を含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0509】

実施形態７９．１個または複数のさらなるアミノ酸残基が、ＡＢＤのＮ末端におけるグリシン残基を含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0510】

実施形態８０．１個または複数のさらなるアミノ酸残基が、ＡＢＤのＮ末端におけるシステイン残基を含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0511】

実施形態８１．１個または複数のさらなるアミノ酸残基が、ＡＢＤのＣ末端におけるグリシン残基を含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0512】

実施形態８２．１個または複数のさらなるアミノ酸残基が、ＡＢＤのＣ末端におけるシステイン残基を含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0513】

実施形態８３．ＡＢＤが、配列番号４４５〜４５０および配列番号４６２〜４６３のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0514】

実施形態８４．ＡＢＤが、２個以下のシステイン残基を含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0515】

実施形態８５．ＡＢＤが、１個以下のシステイン残基を含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0516】

実施形態８６．ＨＤ１が、ポリペプチドの位置Ｘ_１４のシステイン残基のチオール基を介して、ＡＢＤとコンジュゲートしている、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0517】

実施形態８７．前記リンカーＬ１が、１〜３０個のアミノ酸または３０個未満のアミノ酸のペプチドである、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0518】

実施形態８８．前記リンカーＬ１が、２０種の天然に存在するアミノ酸から選択される、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0519】

実施形態８９．前記リンカーＬ１が、化学合成、翻訳後化学修飾によってか、または宿主細胞における組換え発現によるインビボ組み込みによって組み込まれる非天然アミノ酸である、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0520】

実施形態９０．前記リンカーＬ１アミノ酸が、セリン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびリシンから選択される、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0521】

実施形態９１．前記リンカーＬ１が、過半数の立体障害のないアミノ酸を含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0522】

実施形態９２．前記リンカーＬ１が、以下：酸性リンカー、塩基性リンカーおよび構造的モチーフのうち１つまたは複数を含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0523】

実施形態９３．前記リンカーＬ１が、ポリグリシン、ポリアラニン、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）またはポリ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0524】

実施形態９４．前記リンカーＬ１が、（Ｇｌｙ）_３、（Ｇｌｙ）_４（配列番号１１６）または（Ｇｌｙ）_５（配列番号１１７）のポリグリシンを含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0525】

実施形態９５．前記リンカーＬ１が、（Ｇｌｙ）_３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）_４（配列番号１１８）；（Ｇｌｙ）_３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）_２（配列番号１１９）；（Ｇｌｙ）_３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）_４（配列番号１２０）；およびＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号１２１）を含む、
前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0526】

実施形態９６．前記リンカーＬ１が、ＧｌｙおよびＡｌａの組合せを含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0527】

実施形態９７．前記リンカーＬ１が、ＧｌｙおよびＳｅｒの組合せを含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0528】

実施形態９８．前記リンカーＬ１が、ＧｌｙおよびＧｌｕの組合せを含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0529】

実施形態９９．前記リンカーＬ１が、ＧｌｙおよびＬｙｓの組合せを含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0530】

実施形態１００．前記リンカーＬ１が、［Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］_ｎ（配列番号１２２）、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］_ｎ（配列番号１２３）、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］_ｎ（配列番号１２４）および［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］_ｎ（配列番号１２５）；（配列中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）からなる群から選択される配列を含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0531】

実施形態１０１．前記リンカーＬ１が、［Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］_ｎ（配列番号１２６）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］_ｎ（配列番号１２７）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］_ｎ（配列番号１２８）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］_ｎ（配列番号１２９）、［Ｇｌｙ−Ａｓｐ］_ｎ（配列番号１３０）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ］_ｎ（配列番号１３１）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ］_ｎ（配列番号１３２）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ］_ｎ（配列番号１３３）（配列中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０である）からなる群から選択される配列を含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0532】

実施形態１０２．前記リンカーＬ１が、［Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］_ｎ（配列番号１２６）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］_ｎ（配列番号１２７）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］_ｎ（配列番号１２８）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］_ｎ（配列番号１２９）、［Ｇｌｙ−Ａｓｐ］_ｎ（配列番号１３０）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ］_ｎ（配列番号１３１）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ］_ｎ（配列番号１３２）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ］_ｎ（配列番号１３３）（配列中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０である）からなる群から選択される配列を含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0533】

実施形態１０３．前記リンカーＬ１が、［Ｇｌｙ−Ｌｙｓ］_ｎ（配列番号１３４）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ］_ｎ（配列番号１３５）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ］_ｎ（配列番号１３６）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ］_ｎ（配列番号１３７）、［Ｇｌｙ−Ａｒｇ］_ｎ（配列番号１３８）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ］_ｎ（配列番号１３９）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ］_ｎ（配列番号１４０）；［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ］_ｎ（配列番号１４１）（配列中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０である）からなる群から選択される配列を含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0534】

実施形態１０４．前記リンカーＬ１が、［Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ］_ｎ（配列番号１４２）、（配列中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０である）からなる群から選択される配列を含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0535】

実施形態１０５．前記リンカーＬ１が、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ］_６（配列番号１５３） ［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ］_６（配列番号１５４）、［Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ］_３（配列番号１５５）、［Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ］_４（配列番号１５６）、または［Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ］_５（配列番号１５７）からなる群から選択される配列を含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0536】

実施形態１０６．前記リンカーＬ１が、Ｎ末端ＴＧジペプチドを含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0537】

実施形態１０７．前記リンカーＬ１が、Ｃ末端ＡＳジペプチドを含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0538】

実施形態１０８．前記リンカーＬ１が、Ｎ末端ＴＧジペプチドおよびＣ末端ＡＳジペプチドを含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0539】

実施形態１０９．前記リンカーＬ１が、ＴＧ−（ＧＧＧＳ）_１（配列番号２１５）、ＴＧ−（ＧＧＧＳ）_２（配列番号２１６）、ＴＧ−（ＧＧＧＳ）_３（配列番号２１７）、ＴＧ−（ＧＧＧＳ）_４（配列番号２１８）、ＴＧ−（ＧＧＧＳ）_５（配列番号２１９）、（ＧＧＧＳ）_１−ＡＳ（配列番号２２０）、（ＧＧＧＳ）_２−ＡＳ（配列番号２２１）、（ＧＧＧＳ）_３−ＡＳ（配列番号２２２）、（ＧＧＧＳ）_４−ＡＳ（配列番号２２３）、（ＧＧＧＳ）_５−ＡＳ（配列番号２２４）、ＴＧ−（ＧＧＧＳ）_１−ＡＳ（配列番号２２５）、ＴＧ−（ＧＧＧＳ）_２−ＡＳ（配列番号２２６）、ＴＧ−（ＧＧＧＳ）_３−ＡＳ（配列番号２２７）、ＴＧ−（ＧＧＧＳ）_４−ＡＳ（配列番号２２８）、およびＴＧ−（ＧＧＧＳ）_５−ＡＳ（配列番号２２９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0540】

実施形態１１０．前記ＴＧジペプチドＴＧおよび／または前記ジペプチドＡＳが、存在しないか、またはＴ、Ａ、ＳおよびＧから選択されるアミノ酸の対によって置換されている、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0541】

実施形態１１１．１種または複数のさらなるリンカーをさらに含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0542】

実施形態１１２．配列番号５９４から６６３および６８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記の実施形態のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0543】

実施形態１１３．配列番号５９４に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0544】

実施形態１１４．配列番号５９５に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0545】

実施形態１１５．配列番号５９６に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0546】

実施形態１１６．配列番号５９７に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0547】

実施形態１１７．配列番号５９８に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0548】

実施形態１１８．配列番号５９９に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0549】

実施形態１１９．配列番号６００に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0550】

実施形態１２０．配列番号６０１に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0551】

実施形態１２１．配列番号６０２に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0552】

実施形態１２２．配列番号６０３に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0553】

実施形態１２３．配列番号６０４に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0554】

実施形態１２４．配列番号６０５に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0555】

実施形態１２５．配列番号６０６に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0556】

実施形態１２６．配列番号６０７に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0557】

実施形態１２７．配列番号６０８に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0558】

実施形態１２８．配列番号６０９に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0559】

実施形態１２９．配列番号６１０に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0560】

実施形態１３０．配列番号６１１に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド

【0561】

実施形態１３１．配列番号６１２に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0562】

実施形態１３２．配列番号６１３に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0563】

実施形態１３３．配列番号６１４に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0564】

実施形態１３４．配列番号６１５に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0565】

実施形態１３５．配列番号６１６に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0566】

実施形態１３６．配列番号６１７に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0567】

実施形態１３７．配列番号６１８に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0568】

実施形態１３８．配列番号６１９に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0569】

実施形態１３９．配列番号６２０に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0570】

実施形態１４０．配列番号６２１に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0571】

実施形態１４１．配列番号６２２に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0572】

実施形態１４２．配列番号６２３に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0573】

実施形態１４３．配列番号６２４に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0574】

実施形態１４４．配列番号６２５に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0575】

実施形態１４５．配列番号６２６に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0576】

実施形態１４６．配列番号６２７に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0577】

実施形態１４７．配列番号６２８に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0578】

実施形態１４８．配列番号６２９に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0579】

実施形態１４９．配列番号６３０に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0580】

実施形態１５０．配列番号６３１に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0581】

実施形態１５１．配列番号６３２に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0582】

実施形態１５２．配列番号６３３に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0583】

実施形態１５３．配列番号６３４に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0584】

実施形態１５４．配列番号６３５に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0585】

実施形態１５５．配列番号６３６に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0586】

実施形態１５６．配列番号６３７に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0587】

実施形態１５７．配列番号６３８に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0588】

実施形態１５８．配列番号６３９に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0589】

実施形態１５９．配列番号６４０に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0590】

実施形態１６０．配列番号６４１に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0591】

実施形態１６１．配列番号６４２に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0592】

実施形態１６２．配列番号６４３に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0593】

実施形態１６３．配列番号６４４に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0594】

実施形態１６４．配列番号６４５に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0595】

実施形態１６５．配列番号６４６に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0596】

実施形態１６６．配列番号６４７に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0597】

実施形態１６７．配列番号６４８に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0598】

実施形態１６８．配列番号６４９に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0599】

実施形態１６９．配列番号６５０に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0600】

実施形態１７０．配列番号６５１に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0601】

実施形態１７１．配列番号６５２に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0602】

実施形態１７２．配列番号６５３に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0603】

実施形態１７３．配列番号６５４に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0604】

実施形態１７４．配列番号６５５に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0605】

実施形態１７５．配列番号６５６に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0606】

実施形態１７６．配列番号６５７に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0607】

実施形態１７７．配列番号６５８に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0608】

実施形態１７８．配列番号６５９に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0609】

実施形態１７９．配列番号６６０に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0610】

実施形態１８０．配列番号６６１に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0611】

実施形態１８１．配列番号６６２に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0612】

実施形態１８２．配列番号６６３に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0613】

実施形態１８３．配列番号６８１に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から１１２のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0614】

実施形態１８４．約１０^−６ｍｏｌ／Ｌ未満の解離定数を有する、血清アルブミンに対する親和性を有する、実施形態から１８３のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0615】

実施形態１８５．約１０^−９ｍｏｌ／Ｌ未満の解離定数を有する、血清アルブミンに対する親和性を有する、実施形態１から１８４のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0616】

実施形態１８６．約１０^−１２ｍｏｌ／Ｌ未満の解離定数を有する、血清アルブミンに対する親和性を有する、実施形態１から１８５のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0617】

実施形態１８７．少なくとも１日間の作用持続期間を有する、実施形態１から１８６のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0618】

実施形態１８８．少なくとも３日間の作用持続期間を有する、実施形態１から１８７のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0619】

実施形態１８９．少なくとも５日間の作用持続期間を有する、実施形態１から１８８のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0620】

実施形態１９０．ヒト対象において少なくとも５日間の作用持続期間を有する、実施形態例１から１８９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0621】

実施形態１９１．対象において疾患または障害を治療する方法であって、実施形態１から１９０のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドを、それを必要とする対象に前記疾患または障害を治療するのに有効である量で投与することを含む、方法。

【0622】

実施形態１９２．前記疾患または障害が、脂肪異栄養症、脂質異常症、高脂血症、過体重、肥満症、視床下部性無月経、アルツハイマー病、レプチン欠乏症、脂肪肝疾患、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型を含む）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、メタボリックシンドロームＸおよびハンチントン舞踏病であり得る疾患または障害である、実施形態１９１に記載の方法。

【0623】

実施形態１９３．前記疾患または障害が、脂肪異栄養症、脂質異常症、高脂血症、過体重、肥満症、視床下部性無月経、アルツハイマー病、レプチン欠乏症、脂肪肝疾患または糖尿病である、実施形態１９１または実施形態１９２に記載の方法。

【0624】

実施形態１９４．前記疾患または障害が、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病である、実施形態１９１から１９３のいずれか１つに記載の方法。

【0625】

実施形態１９５．前記疾患または障害が、肥満症である、実施形態１９１から１９３のいずれか１つに記載の方法。

【0626】

実施形態１９６．前記疾患または障害が、脂肪異栄養症またはレプチン欠乏症である、実施形態１９１から１９３のいずれか１つに記載の方法。

【0627】

実施形態１９７．実施形態１から１９０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチドおよび医薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物。

【0628】

実施形態１９８．注射用医薬組成物である、実施形態１９７に記載の医薬組成物。

【0629】

実施形態１９９．徐放性または持続性医薬組成物である、実施形態１９７から１９８のいずれか１つに記載の医薬組成物。

【0630】

実施形態２００．１日１回の医薬組成物である、実施形態１９７から１９９のいずれか１つに記載の医薬組成物。

【0631】

実施形態２０１．週に１回の医薬組成物である、実施形態１９７から１９９のいずれか１つに記載の医薬組成物。

【0632】

実施形態２０２．対象において疾患または障害を治療するための、実施形態１９７から２０１のいずれか１つに記載の医薬組成物。

【0633】

実施形態２０３．前記疾患または障害が、脂肪異栄養症、脂質異常症、高脂血症、過体重、肥満症、視床下部性無月経、アルツハイマー病、レプチン欠乏症、脂肪肝疾患、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型を含む）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、メタボリックシンドロームＸおよびハンチントン舞踏病である、実施形態１９７から２０２のいずれか１つに記載の医薬組成物。

【0634】

実施形態２０４．前記疾患または障害が、脂肪異栄養症、脂質異常症、高脂血症、過体重、肥満症、視床下部性無月経、アルツハイマー病、レプチン欠乏症、脂肪肝疾患または糖尿病である、実施形態２０２または実施形態２０３に記載の医薬組成物。

【0635】

実施形態２０５．前記疾患または障害が、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病である、実施形態２０２から２０４のいずれか１つに記載の方法。

【0636】

実施形態２０６．前記疾患または障害が、肥満症である、実施形態２０２から２０４のいずれか１つに記載の方法。

【0637】

実施形態２０７．前記疾患または障害が、脂肪異栄養症またはレプチン欠乏症である、実施形態２０２から２０４のいずれか１つに記載の方法。

【0638】

実施形態２０８．前記ＨＤ１が、
（ａ）異なるアミノ酸が、以下の位置：４、３２、３３、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５のうち１つまたは複数で置換されており、同じ番号付けを保持する（位置２８にグルタミニル残基がない場合であっても）、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、および配列番号６７７からなる群から選択されるレプチンのアミノ酸配列１〜１４６；
（ｂ）位置２８のグルタミニル残基が存在しない下位区分（ａ）のアミノ酸配列；
（ｃ）メチオニル残基が、Ｎ末端に付加されている下位区分（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列；
（ｄ）（ｉ）アミノ酸９８〜１４６；
（ｉｉ）アミノ酸１〜３２；
（ｉｉｉ）アミノ酸４０〜１１６；
（ｉｖ）アミノ酸１〜９９および１１２〜１４６；
（ｖ）アミノ酸１００〜１１１のうち１個または複数が、アミノ酸９９から１１２の間に入っている、アミノ酸１〜９９および１１２〜１４６；
（ｖｉ）アミノ酸１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５のうち１個または複数が、別のアミノ酸で置換されている、下位区分（ｉ）のアミノ酸配列；
（ｖｉｉ）アミノ酸４、８および３２のうち１個または複数が、別のアミノ酸で置換されている、下位区分（ｉｉ）のアミノ酸配列；
（ｖｉｉｉ）アミノ酸５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１および１１２のうち１個または複数が、別のアミノ酸で置換されている、下位区分（ｉｉｉ）のアミノ酸配列；
（ｉｘ）アミノ酸４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５のうち１個または複数が、別のアミノ酸で置換されている、下位区分（ｉｖ）のアミノ酸配列；ならびに
（ｘ）アミノ酸４、３２、３３、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５のうち１個または複数が、別のアミノ酸で置換されている、下位区分（ｖ）のアミノ酸配列；
（ｘｉ）メチオニンがＮ末端に付加されている下位区分（ｉ）〜（ｘ）のいずれかのアミノ酸配列
からなる群から選択される（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列の断片からなるレプチン；
（ｅ）前記アミノ酸配列が化学部分に付いている、下位区分（ａ）から（ｄ）のいずれかのアミノ酸配列；
（ｆ）前記化学部分が、水溶性ポリマー部分である、下位区分（ｅ）のアミノ酸配列；
（ｇ）前記水溶性ポリマー部分が、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸ホモポリマー、ポリアミノ酸ランダムコポリマー、アルブミン、Ｆｃタンパク質、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｐｒｏｐｉｏｎａｄｅｈｙｄｅ）、スクシネート、スチレン、ヒドロキシエチルデンプンからなる群から選択される下位区分（ｆ）のアミノ酸配列；
（ｈ）前記水溶性ポリマー部分が、ポリエチレングリコールである下位区分（ｇ）のアミノ酸配列；ならびに
（ｉ）前記水溶性ポリマーが、アルブミン、抗体、Ｆｃタンパク質およびポリリシン部分からなる群から選択されるポリアミノ酸である、下位区分（ｇ）のアミノ酸配列
からなる群から選択される、実施形態１から１８のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0639】

実施形態２０９．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、１つまたは複数のアミノ酸置換が行われている、実施形態１から１８および２０８のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0640】

実施形態２１０．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、１つのアミノ酸置換が行われている、実施形態１から１８および２０９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0641】

実施形態２１１．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、２つのアミノ酸置換が行われている、実施形態１から１８および２０９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0642】

実施形態２１２．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、３つのアミノ酸置換が行われている、実施形態１から１８および２０９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0643】

実施形態２１３．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、４つのアミノ酸置換が行われている、実施形態１から１８および２０９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0644】

実施形態２１４．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、５つのアミノ酸置換が行われている、実施形態１から１８および２０９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0645】

実施形態２１５．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、６つのアミノ酸置換が行われている、実施形態１から１８および２０９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0646】

実施形態２１６．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、７つのアミノ酸置換が行われている、実施形態１から１８および２０９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0647】

実施形態２１７．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、８つのアミノ酸置換が行われている、実施形態１から１８および２０９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0648】

実施形態２１８．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、９つのアミノ酸置換が行われている、実施形態１から１８および２０９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0649】

実施形態２１９．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、１０のアミノ酸置換が行われている、実施形態１から１８および２０９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0650】

実施形態２２０．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、１１のアミノ酸置換が行われている、実施形態１から１８および２０９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0651】

実施形態２２１．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、１２のアミノ酸置換が行われている、実施形態１から１８および２０９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0652】

実施形態２２２．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、１３のアミノ酸置換が行われている、実施形態１から１８および２０９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0653】

実施形態２２３．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、１４のアミノ酸置換が行われている、実施形態１から１８および２０９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0654】

実施形態２２４．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、１５のアミノ酸置換が行われている、実施形態１から１８および２０９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0655】

実施形態２２５．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、１６のアミノ酸置換が行われている、実施形態１から１８および２０９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0656】

実施形態２２６．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、１７のアミノ酸置換が行われている、実施形態１から１８および２０９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0657】

実施形態２２７．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、１８のアミノ酸置換が行われている、実施形態１から１８および２０９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0658】

実施形態２２８．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、１９のアミノ酸置換が行われている、実施形態１から１８および２０９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0659】

実施形態２２９．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、２０のアミノ酸置換が行われている、実施形態１から１８および２０９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0660】

実施形態２３０．前記ＨＤ１が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号６６４、配列番号６６５、配列番号６６６、配列番号６６７、配列番号６６８、配列番号６６９、配列番号６７０、配列番号６７１、配列番号６７２、配列番号６７３、配列番号６７４、配列番号６７５、配列番号６７６、配列番号６７７、および配列番号６８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、２１のアミノ酸置換が行われている、実施形態１から１８および２０９のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0661】

実施形態２３１．前記ＨＤ１が、配列番号１４３である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0662】

実施形態２３２．前記ＨＤ１が、配列番号１４４である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0663】

実施形態２３３．前記ＨＤ１が、配列番号１４５である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0664】

実施形態２３４．前記ＨＤ１が、配列番号１４６である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0665】

実施形態２３５．前記ＨＤ１が、配列番号６６４である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0666】

実施形態２３６．前記ＨＤ１が、配列番号６６５である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0667】

実施形態２３７．前記ＨＤ１が、配列番号６６６である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0668】

実施形態２３８．前記ＨＤ１が、配列番号６６７である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0669】

実施形態２３９．前記ＨＤ１が、配列番号６６８である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0670】

実施形態２４０．前記ＨＤ１が、配列番号６６９である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0671】

実施形態２４１．前記ＨＤ１が、配列番号６７０である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0672】

実施形態２４２．前記ＨＤ１が、配列番号６７１である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0673】

実施形態２４３．前記ＨＤ１が、配列番号６７２である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0674】

実施形態２４４．前記ＨＤ１が、配列番号６７３である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0675】

実施形態２４５．前記ＨＤ１が、配列番号６７４である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0676】

実施形態２４６．前記ＨＤ１が、配列番号６７５である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0677】

実施形態２４７．前記ＨＤ１が、配列番号６７６である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0678】

実施形態２４８．前記ＨＤ１が、配列番号６７７である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0679】

実施形態２４９．前記ＨＤ１が、配列番号６８０である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の操作されたポリペプチド。

【0680】

前述の記載は、例示目的で提供された実施例を用いて本発明を開示するが、本発明の実施は、特許請求される本発明の範囲内にあるような通常の変法、適応または修飾のすべてを包含するということは理解されよう。したがって、記載および実施例は、添付の特許請求の範囲によって詳しく説明される本発明の範囲を制限すると解釈されてはならない。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図1-6】

【図1-7】

【図1-8】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]