特許 6040987 改変型アルカリホスファターゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6040987

(24)【登録日】2016年11月18日

(45)【発行日】2016年12月7日

(54)【発明の名称】改変型アルカリホスファターゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/16 20060101AFI20161128BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20161128BHJP

   G01N 33/535 20060101ALI20161128BHJP

【ＦＩ】

   C12N9/16 BZNA

   C12N15/00 A

   G01N33/535

【請求項の数】4

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2014-523743(P2014-523743)

(86)(22)【出願日】2013年7月2日

(86)【国際出願番号】JP2013068085

(87)【国際公開番号】WO2014007229

(87)【国際公開日】20140109

【審査請求日】2014年9月30日

(31)【優先権主張番号】特願2012-152219(P2012-152219)

(32)【優先日】2012年7月6日

(33)【優先権主張国】JP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】000003160

【氏名又は名称】東洋紡株式会社

(72)【発明者】

【氏名】相場 洋志

(72)【発明者】

【氏名】岸本 高英

(72)【発明者】

【氏名】柳谷 周作

【審査官】 高山 敏充

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００８−００５７３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平０２−５０２６４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Protein Engineering，１９９１年，Vol. 4, No. 7，pp.801-804

【文献】 Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry，２００５年，Vol. 69, No. 2，pp.364-373

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、１６１番目リジン及び／又は１８４番目リジンが他のアミノ酸に置換され、かつ、アルカリホスファターゼ活性を有する、改変型アルカリホスファターゼ。

【請求項2】

請求項１に記載のアルカリホスファターゼを標識してなるコンジュゲート。

【請求項3】

請求項２に記載のコンジュゲートを用いる免疫測定方法。

【請求項4】

請求項２に記載のコンジュゲートを含む免疫測定試薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、改変型アルカリホスファターゼ並びにアルカリホスファターゼの改変方法に関する。

【背景技術】

【0002】

アルカリホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．１、以下ＡＰとも称する）は、リン酸モノエステルを加水分解し、アルコールと無機リン酸を生じる反応を触媒する酵素であり、原核生物・真核生物を問わず広く分布することが知られる。ＡＰは、遺伝子工学用酵素として利用されるほか、酵素免疫測定（ＥＩＡ）法における標識酵素として広く利用されている。現在、このＥＩＡに用いられるＡＰはほとんどがウシ小腸由来ＡＰ（以下ＣＩＡＰとも称する）である。ＣＩＡＰが重宝される理由のひとつは、その比活性の高さである。市販のＣＩＡＰの比活性はメーカーやグレードにより様々であるが、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質とした場合に高比活性タイプで６０００Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎを超えるものも存在する。また、１，２−ジオキセタンもくしはアクリダンを基本骨格に含むＣＩＡＰ用の各種高感度発光基質も多数販売され、免疫測定における測定感度の高さを実現している。

【0003】

免疫測定における重要な課題のひとつは、感度の高さを実現することである。高感度を実現するための試みとして、抗原一分子あたりに吸着する標識酵素の分子数を増やす、また標識酵素の高感度基質を開発するという方法によりこれまで進歩を遂げてきた。しかしながら、今日における免疫診断法の感度はその要求を必ずしも十分に満たすものではなく、たとえば免疫診断によるインフルエンザ検出キットにおいては、その結果が陰性であろうとも感染の疑いを完全に排除できない場合があることも事実である。測定対象によっては、検体中の濃度が１ｐＭ以下である場合も少なくなく、また診断に要する時間の短縮という目的からも、感度の向上は永遠のテーマであるともいえる。

【0004】

感度上昇を目的として、これまで複数のアイソザイムが存在するＣＩＡＰのうち高比活性のものを精製の過程で単離する、あるいは高比活性型ＣＩＡＰの遺伝子を特定してこれを組換え生産する、さらには高比活性の実現に重要な部位特異的アミノ酸変異の導入により比活性を高めるなどして当業者らは高感度の要望に応えている（特許文献１など）。
一方、発明者らは、シェワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属細菌に由来し、ＣＩＡＰに匹敵する高比活性を有し、かつ、免疫測定において汎用される各種発光基質に対する反応性の高いＡＰを見出した。発明者らは、また、そのＡＰをコードする遺伝子を取得し、この遺伝子を形質転換した微生物を培養することでＡＰの生産にも成功した。これらの発明については、ＰＣＴ／ＪＰ２０１２／０５３９２４で国際出願されている。

【0005】

ＡＰは免疫測定において、多くの場合還元ＩｇＧやＦａｂ等の形態を含む抗体や抗原となりうるタンパク質を標識する酵素として用いられる。ここで標識する方法としては、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法が好適に使用されるが、抗体の標識には、抗原抗体反応に実質的な影響を与えないＩｇＧのヒンジ部を標識ターゲットとして利用できるマレイミド法が最も好適に使用される。この方法は、まずＡＰをＮ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（以下ＥＭＣＳとも称する）やＮ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド（以下ＧＭＢＳとも称する）といったマレイミド基導入試薬で修飾してマレイミド化し、標識対象のＳＨ基とカップリングさせることによりコンジュゲートとする。この際、コンジュゲートとしてのＡＰ活性は、未標識のＡＰと比べて大幅に低下することが従来指摘されており、その比率は文献により異なるが、５０〜６０％の活性残存率ともいわれている（非特許文献１）。しかしながら、このような活性の低下が起こる原因およびそれを解消するための手立てについては、これまで報告例がない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特許第４２９５３８６号

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】「超高感度酵素免疫測定法」（石川榮治著、学会出版センター刊、１９９３年）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の目的は、免疫測定に際し、修飾を行った以降も修飾前と同等の活性を有しうるアルカリホスファターゼを提供することである。より具体的には、免疫測定に際し、アルカリホスファターゼコンジュゲートの作製に用いられる各種マレイミド化試薬によりマレイミド基を導入後も活性の低下を生じないアルカリホスファターゼを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ＡＰ活性中心近傍に位置するリジン残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、酵素標識のためのマレイミド化処理後も活性が低下しないアルカリホスファターゼを作製することに成功し、本発明を完成するに至った。

【0010】

すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）
アルカリホスファターゼの活性中心近傍に位置するリジン残基を、他のアミノ酸残基に置換してなる改変型アルカリホスファターゼ。
（２）
アルカリホスファターゼが細菌由来である、（１）に記載の改変型アルカリホスファターゼ。
（３）
細菌がシェワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属である、（２）に記載の改変型アルカリホスファターゼ。
（４）
アルカリホスファターゼが哺乳類由来である、（１）に記載の改変型アルカリホスファターゼ。
（５）
アルカリホスファターゼがウシ小腸由来である、（１）に記載の改変型アルカリホスファターゼ
（６）
配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、１６１番目リジン及び／又は１８４番目リジンに相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されてなる、（１）に記載の改変型アルカリホスファターゼ。
（７）
配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、１６１番目リジン及び／又は１８４番目リジンに相当するアミノ酸が、セリンもしくはアルギニンに置換されてなる、（１）に記載の改変型アルカリホスファターゼ。
（８）
配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、１６１番目リジン及び／又は１８４番目リジンに相当するアミノ酸が、セリンに置換されてなる、（１）に記載の改変型アルカリホスファターゼ。
（９）
配列番号１１に示すアミノ酸配列のうち、１００番目リジンに相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されてなる、（１）に記載の改変型アルカリホスファターゼ。
（１０）
配列番号１２に示すアミノ酸配列のうち、８１番目リジンに相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されてなる、（１）に記載の改変型アルカリホスファターゼ。
（１１）
配列番号１３に示すアミノ酸配列のうち、１００番目リジンに相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されてなる、（１）に記載の改変型アルカリホスファターゼ。
（１２）
配列番号１４に示すアミノ酸配列のうち、１００番目リジン及び／又は１２７番目リジンに相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されてなる、（１）に記載の改変型アルカリホスファターゼ。
（１３）
配列番号１６に示すアミノ酸配列のうち、１５７番目リジン及び／又は１８０番目リジンに相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されてなる、（１）に記載の改変型アルカリホスファターゼ。
（１４）
配列番号１８に示すアミノ酸配列のうち、１５７番目リジン及び／又は１８０番目リジンに相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されてなる、（１）に記載の改変型アルカリホスファターゼ。
（１５）
配列番号１０に示すアミノ酸配列のうち、８１番目リジン及び／又は８７番目リジンに相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されてなる、（１）に記載の改変型アルカリホスファターゼ。
（１６）
（１）〜（１５）のいずれかに記載のアルカリホスファターゼを標識してなるコンジュゲート。
（１７）
（１６）に記載のコンジュゲートを用いる免疫測定方法。
（１８）
（１６）に記載のコンジュゲートを含む免疫測定試薬。
（１９）
以下、（Ａ）〜（Ｄ）の工程を含む、改変型アルカリホスファターゼの作製方法。
（Ａ）アルカリホスファターゼの活性中心近傍に位置するリジン残基を特定または推定する工程。
（Ｂ）（Ａ）で特定または推定されたリジン残基をコードするアルカリホスファターゼ遺伝子上のコドンを、別のアミノ酸をコードするコドンに置換する工程。
（Ｃ）（Ｂ）で作製した遺伝子を宿主細胞に形質転換し、該形質転換体を培養して遺伝子を発現させる工程。
（Ｄ）（Ｃ）における発現産物である改変型アルカリホスファターゼを精製する工程。
（２０）
以下、（Ａ）〜（Ｄ）の工程を含む、（１９）の改変型アルカリホスファターゼの作製方法。
（Ａ）改変しようとするアルカリホスファターゼのアミノ酸配列と配列番号２に示すアミノ酸配列とのアライメントにより、配列番号２に示すアミノ酸配列のうち１６１番目リジン及び／又は１８４番目リジンに相当するアミノ酸残基を推定する工程。
（Ｂ）（Ａ）で推定されたリジン残基をコードするアルカリホスファターゼ遺伝子上のコドンを、別のアミノ酸をコードするコドンに置換する工程。
（Ｃ）（Ｂ）で作製した遺伝子を宿主細胞に形質転換し、該形質転換体を培養して遺伝子を発現させる工程。
（Ｄ）（Ｃ）における発現産物である改変型アルカリホスファターゼを精製する工程。

【発明の効果】

【0011】

本発明により、免疫測定の標識酵素として有用なアルカリホスファターゼ、並びに対象物質を高感度に検出可能なアルカリホスファターゼ標識抗体を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】Ｔ３−３株由来ＡＰの野生型および改変型酵素をマレイミド化した際の、マレイミド基導入数と比活性残存率の関係を示す。

【図2】Ｔ３−３株由来変異型ＡＰおよびウシ小腸由来ＡＰ（ＣＩＡＰ）をマレイミド化した際の、マレイミド基導入数と単位タンパク質量あたりの発光基質に対する反応性の関係を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

（１）
本発明は、活性中心近傍に位置するリジン残基を他のアミノ酸に置換してなるアルカリホスファターゼである。

【0014】

（１−１）アルカリホスファターゼ
変異を行おうとするアルカリホスファターゼとしては、免疫測定に利用可能な限りにおいては特に限定されない。例えば哺乳類由来、細菌由来のものが挙げられる。
哺乳類由来のものとして、好適な例としてはウシ由来アルカリホスファターゼ、ホッコクアカエビ由来アルカリホスファターゼなどが例示される。ウシ由来の中でも仔牛小腸より単離されるアルカリホスファターゼが好適な例として挙げられる。
細菌由来のものとして、バチルス属細菌由来アルカリホスファターゼ、シェワネラ属細菌由来アルカリホスファターゼなどが例示される。中でもシェワネラ属細菌由来アルカリホスファターゼもより好適な例として挙げられる。シェワネラ属細菌としては、シェワネラ・フォディナエ（例えばＮＢＲＣ１０５２１６株）、シェワネラ・チリケンシス（例えばＮＢＲＣ１０５２１７株）、シェワネラ・バルティカ（例えばＯＳ１８５株）、シェワネラ・エスピーＴ３−３株、シェワネラ・エスピーＷ３−１８−１株などが例示できる。これらのうち、ＮＢＲＣ番号が付与されているものについては、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター生物資源課に保管された菌株であり、所定の手続を経ることによってその分譲を受けることができる。

【0015】

変異を行おうとするＡＰが由来する他の生物としては、例えば、土壌や河川・湖沼などの水系又は海洋に存在する微生物や各種動植物の表面または内部に常在する微生物等を挙げることができる。低温環境、火山などの高温環境、深海などの無酸素・高圧・無光環境、油田など特殊な環境に生育する微生物を単離源としてもよい。

【0016】

変異を行おうとするＡＰには、微生物から直接単離されるＡＰだけでなく、単離されたＡＰを蛋白質工学的な方法によりアミノ酸配列等を改変したものや、遺伝子工学的手法により改変したものも含まれる。例えば、前述の、シェワネラ属細菌等から取得した酵素に改変を加えたものに、さらに本発明の変異を加えた酵素であってもよい。

【0017】

本発明が、アルカリホスファターゼの由来生物を限定しない理由としては以下のとおりである。マレイミド化試薬であるＥＭＣＳやＧＭＢＳは、酵素表面のリジン残基とこれら試薬の活性エステルとがカップリングすることにより酵素表面に導入される。上述の活性低下の原因として、発明者らは活性中心近傍のリジン残基とマレイミド化試薬がカップリングすることにより、導入された側鎖が基質の活性中心への接触を妨げることにより起こるのではと推定した。後述の実施例のとおり、野生型ＡＰと比して活性中心近傍のリジン残基を置換した変異型ＡＰのほうがマレイミド化後の活性維持率が高いことが示され、これはすなわち発明者らの上記推定が正しいことを強く示唆する結果である。このようなマレイミド化後の活性低下は、活性中心近傍にリジン残基が存在すれば理論上どのＡＰにも起こりうることであり、このリジン残基を他のアミノ酸残基に置換することによるこうした活性低下の回避も同様にあらゆるＡＰに対して有効であると考えられる。こうした修飾・標識後のアルカリホスファターゼの活性低下を回避する方策については、これまでその可能性にすら触れられたことがなかった。

【0018】

（１−２）アルカリホスファターゼの活性中心近傍に位置するリジン残基の特定
アルカリホスファターゼの活性中心近傍に位置するリジン残基の特定は、本書では原則として、３次元立体構造および活性中心が既知のＡＰの立体構造情報を利用して行う。このようなＡＰとして、シェワネラ・エスピー・ＡＰ１株（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ． ＡＰ−１）由来ＡＰ（ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ登録番号：３Ａ５２）が例示できる。

【0019】

この場合、まず３次元立体構造が既知のＡＰについて活性中心近傍のアミノ酸残基を特定し、次に３次元立体構造が既知のＡＰと変異を導入しようとするＡＰとでアミノ酸配列のアライメントを行うことで、変異を導入しようとするＡＰの活性中心近傍に位置するアミノ酸残基を推定することができる。これら残基の中でリジンが存在すれば、すなわちそれが活性中心近傍のリジン残基と推定できる。

【0020】

一次配列のアライメントは、アミノ酸の同一性を計算するために用いられる各種アルゴリズムが利用可能であり、例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、アライメントを行う。

【0021】

３次元立体構造から活性中心近傍に位置するアミノ酸を特定する方法は、該ＡＰを構成する全原子ならびに基質アナログとしての無機リン酸の座標情報を含むＰＤＢファイルから原子間の距離を計算可能な各種ソフトを利用可能であり、本書では、ファイアラックス社製のＭｏｌＦｅａｔを用いることとする。活性中心近傍であることの判断は、基質アナログとしての無機リン酸のリン酸基を構成するリン原子から１５オングストローム以内にアミノ酸残基の少なくとも一部が位置することを基準になされる。配列番号２に示す、シェワネラ・エスピーＴ３−３株由来ＡＰの１８４番目リジンがちょうど基質から１５オングストロームの距離にあると推定され、実施例に示すように、この残基を置換することで修飾後の活性残存率が向上している。このことから、少なくとも１５オングストローム以内の距離にあるリジン残基であれば、他のアミノ酸への置換によりマレイミド化による活性低下を回避する効果が期待できることが理解される。

【0022】

上記の方法で活性中心近傍に位置するリジン残基が特定できない場合は、変異を行おうとするＡＰの３次元立体構造情報より特定することが出来る。変異を行おうとするＡＰの高純度精製品に無機リン酸もしくは基質アナログを加えたものを常法に従って結晶化し、Ｘ線結晶構造解析を行うことで３次元立体構造情報が得られ、基質のリン酸基もしくはリン酸基に相当する官能基の座標およびＡＰを構成する原子の座標から、活性中心近傍のリジン残基を特定できる。また、変異を行おうとするＡＰのアミノ酸配列から３次元立体構造を各種構造予測ソフトを用いて構造を予測し、この情報から同様に活性中心近傍に位置するリジン残基を推定することが可能である。利用可能な立体構造予測ソフトとしては、例えばＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ （ａｃｃｅｌｒｙｓ製）、ＭＯＥ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇｕ Ｇｒｏｕｐ製）、Ｄｅｓｅｒｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｎｆｏｃｏｍ製）、あるいはＳｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓがオンラインで無償公開しているＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬなどが例示される。

【0023】

上記のいずれかの方法で、あるＡＰの活性中心近傍に位置するリジン残基が特定できた場合、今度はそのＡＰを基準に、さらに他のＡＰの活性中心近傍に位置するリジン残基を特定することが出来る。

【0024】

アルカリホスファターゼの配列上に位置する、活性中心近傍に位置すると特定されるリジン残基を以下具体的に例示する。
上述のＰＣＴ／ＪＰ２０１２／０５３９２４に記載されている、シェワネラ・エスピー・Ｔ３−３株由来ＡＰ（配列番号２）の場合、１６１番目および１８４番目リジンが該当する。これは、後述の実施例５に示すように、３次元立体構造および活性中心が既知のシェワネラ・エスピー・ＡＰ１株由来のＡＰとの構造比較によって特定された。

【0025】

他のシェワネラ属由来もしくはシェワネラ属と近縁の属由来ＡＰなどＴ３−３株と高い同一性を有する配列にあっては、Ｔ３−３株由来ＡＰ配列との一次配列アライメントの結果、これら１６１番目および１８４番目のリジンに相当するリジン残基がこれに該当する。例えば、配列番号１６に示すシェワネラ・フォディナエ ＮＢＲＣ１０５２１６株由来のＡＰにあっては１５７番目および１８０番目リジンが、また配列番号１８に示すシェワネラ・チリケンシス ＮＢＲＣ１０５２１７株由来のＡＰも同様に１５７番目および１８０番目リジンが、活性中心近傍に位置すると推定される。
また例えば、配列番号１１〜１４に示す、ウシ小腸由来アルカリホスファターゼの場合、配列番号１１のＣＩＡＰ Ｉにあっては１００番目リジンが、配列番号１２に示すＣＩＡＰ ＩＩにあっては８１番目リジンが、配列番号１３のＣＩＡＰ ＩＩＩにあっては１００番目リジンが、配列番号１４のＣＩＡＰ ＩＶにあっては１００番目および１２７番目リジンが、活性中心近傍に位置すると特定される。
さらに配列番号１０に示すヒト由来アルカリホスファターゼにあっては、８１番目および８７番目リジンが、活性中心近傍に位置すると特定される。
ヒトやウシ小腸由来ＡＰのアミノ酸配列と高い同一性を有するＡＰにあっては、上記ヒトもしくはウシ小腸由来ＡＰ配列との一次配列アライメントの結果、上記リジンに相当するリジン残基がこれに該当する。

【0026】

（１−３）置換アミノ酸
活性中心近傍のリジン残基を置換する他のアミノ酸とは、リジン以外であってアルカリホスファターゼ活性を維持しうるものであれば特に限定しないが、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンなどの脂肪族アミノ酸、グリシン、セリン、スレオニン、メチオニン、プロリンなどの親水性アミノ酸、グルタミン酸、アスパラギン酸などの酸性アミノ酸、アルギニン、ヒスチジンなどリジン以外の塩基性アミノ酸などが例示される。これらの中で、疎水性が低くかつ側鎖の小さいグリシン、アラニン、セリン、もしくはリジン残基と同じ塩基性アミノ酸であり、特性に大きな影響を及ぼさないと推定されるアルギニンが好適な例として挙げられる。これらの中で、セリンおよびアルギニンがさらに好適な例として挙げられ、この中でセリンが最も好適な例として挙げられる。

【0027】

（２）改変型アルカリホスファターゼの作製方法
また本発明の別の態様は、改変型アルカリホスファターゼの作製方法である。その方法は、（Ａ）アルカリホスファターゼの活性中心近傍に位置するリジン残基を特定する工程、
（Ｂ）（Ａ）で特定または推定されたリジン残基をコードするアルカリホスファターゼ遺伝子上のコドンを、別のアミノ酸をコードするコドンに置換する工程、
（Ｃ）（Ｂ）で作製した遺伝子を宿主細胞に形質転換し、該形質転換体を培養して遺伝子を発現させる工程、
（Ｄ）（Ｃ）における発現産物である改変型アルカリホスファターゼを精製する工程、
を含むものである。

【0028】

（２−１）
アルカリホスファターゼの活性中心近傍に位置するリジン残基を特定する工程は、既に（１−１）で述べた方法で実施することができる。

【0029】

（２−２）
特定されたリジン残基をコードするアルカリホスファターゼ遺伝子上のコドンの、別のアミノ酸をコードするコドンへの置換は、アルカリホスファターゼ遺伝子配列上における上述のリジン残基をコードするコドンを別のコドンに置き換えた遺伝子を作製し、これを宿主細胞に形質転換し、該形質転換体を培養して遺伝子を発現させ、発現産物である改変型アルカリホスファターゼを精製することにより実施することが出来る。このような変異型アルカリホスファターゼ遺伝子の作製は、設計した改変型ＡＰ遺伝子配列全長を化学合成により行うことも可能であり、また、野生型アルカリホスファターゼ遺伝子を鋳型にミスマッチプライマーを使用してＤＮＡを複製することによっても可能である。

【0030】

（２−３）
本発明のＡＰは、好ましくは、該蛋白質をコードする遺伝子を担持する発現ベクターを含んでなるか、もしくは該遺伝子をゲノムＤＮＡ中に挿入してなる形質転換体の培養物から単離精製することにより製造することができる。

【0031】

本発明のＡＰをコードするＤＮＡを導入する宿主細胞は、後述するように組換え発現系が確立しているものであれば、特に制限されないが、好ましくは大腸菌、枯草菌などのバクテリア、放線菌、麹菌、酵母といった微生物宿主並びに昆虫細胞、動物細胞、高等植物等が挙げられる。

【0032】

ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（-）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）など、酵母由来プラスミドとして、例えばｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５など、枯草菌由来プラスミドとして、例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４などが挙げられる。また、ウイルスとして、λファージなどのバクテリオファージや、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等のパポバウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）等のレトロウイルス、アデノウイルス（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニヤウイルス、バキュロウイルスなどの動物および昆虫のウイルスが例示される。

【0033】

特に、目的の宿主細胞内で機能的なプロモーターの制御下にＡＰをコードするＤＮＡが配置されたＡＰ発現ベクターを使用することが好ましく、使用されるベクターとしては、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で機能して、その下流に配置された遺伝子の転写を制御し得るプロモーター領域（例えば宿主が大腸菌の場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌｅｃＡプロモーター等、宿主が枯草菌の場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母の場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等、宿主が哺乳動物細胞の場合、ＳＶ４０由来初期プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ由来ロングターミナルリピート、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター）と、該遺伝子の転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有し、該プロモーター領域と該ターミネーター領域とが、少なくとも１つの制限酵素認識部位、好ましくは該ベクターをその箇所のみで切断するユニークな制限部位を含む配列を介して連結されたものであれば特に制限はないが、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有していることが好ましい。さらに、挿入されるＡＰをコードするＤＮＡが開始コドンおよび終止コドンを含まない場合には、開始コドン（ＡＴＧまたはＧＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡ）を、それぞれプロモーター領域の下流およびターミネーター領域の上流に含むベクターが好ましく使用される。
宿主細胞として細菌を用いる場合、一般に発現ベクターは上記のプロモーター領域およびターミネーター領域に加えて、宿主細胞内で自律複製し得る複製可能単位を含む必要がある。また、プロモーター領域は、プロモーターの近傍にオペレーターおよびＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列を包含する。
宿主として酵母，動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは、エンハンサー配列、ＡＰ ｍＲＮＡの５’側および３’側の非翻訳領域、ポリアデニレーション部位等をさらに含むことが好ましい。

【0034】

作成した組換えベクターを導入する宿主生物としては、組換え発現系が確立している大腸菌、枯草菌などのバクテリア、放線菌、麹菌、酵母といった微生物宿主並びに昆虫細胞、動物細胞、高等植物等を挙げることができるが、中でもタンパク質発現能力に優れている大腸菌を用いるのが好ましい。組換えプラスミドを導入する方法としてはエレクトロポレーションによる導入のほか、塩化カルシウム等薬品処理によりコンピテント化した宿主であればヒートショックによる導入も可能である。宿主ベクターへの目的組換えプラスミドの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの各種薬剤耐性遺伝子に代表されるマーカーとＡＰ活性とを同時に発現する微生物を検索すればよく、例えば薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＡＰを発現する微生物を選択すればよい。

【0035】

本発明のＡＰは、上記のようにして調製されるＡＰ発現ベクターを含む形質転換体を培地中で培養し、得られる培養物からＡＰを回収することによって製造することができる。

【0036】

使用される培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源，無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース，デキストラン，可溶性デンプン，ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類，硝酸塩類，アミノ酸，コーンスチープ・リカー，ペプトン，カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素〔例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウム，塩化マグネシウム），ビタミン類，抗生物質（例えばテトラサイクリン，ネオマイシン，アンピシリン，カナマイシン等）など〕を含んでいてもよい。

【0037】

培養は当分野において知られている方法により行われる。下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、本発明における培養条件はこれらに何ら限定されるものではない。
宿主が細菌，放線菌，酵母，糸状菌等である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜９である培地である。宿主が大腸菌の場合、好ましい培地としてＬＢ培地，Ｍ９培地［Ｍｉｌｌｅｒ． Ｊ．， Ｅｘｐ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ， ｐ．４３１， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７２）］等が例示される。培養は、必要により通気・攪拌をしながら、通常１４〜４３℃で約３〜７２時間行うことができる。宿主が枯草菌の場合、必要により通気・攪拌をしながら、通常３０〜４０℃で約１６〜９６時間行うことができる。宿主が酵母の場合、培地として、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最少培地 ［Ｂｏｓｔｉａｎ． Ｋ．Ｌ． ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７， ４５０５ （１９８０）］が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
宿主が動物細胞の場合、培地として、例えば約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）［Ｓｃｉｅｎｃｅ， １２２， ５０１ （１９５２）］、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ８， ３９６ （１９５９）］、ＲＰＭＩ１６４０培地［Ｊ． Ａｍ． Ｍｅｄ． Ａｓｓｏｃ．， １９９， ５１９ （１９６７）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ．， ７３， １ （１９５０）］ 等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
宿主が昆虫細胞の場合、培地として、例えばウシ胎仔血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２， ８４０４ （１９８５）］等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。

【0038】

これら培地には、ＡＰを安定化させるための金属塩を添加してもよく、そのような金属塩としては、好ましくはマグネシウム塩および／又は亜鉛塩が用いられる。これら金属塩は、培養する細胞に毒性を示さない範囲において設定すればよく、マグネシウム塩であれば終濃度０．００１ｍＭ〜１０ｍＭ、亜鉛塩であれば０．００１ｍＭ〜１ｍＭが好ましい添加量の範囲として例示されるが、この範囲に限定されない。

【0039】

（２−４）
ＡＰの精製は、ＡＰ活性の存在する画分に応じて、通常使用される種々の分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。
培養物の培地中に存在するＡＰは、培養物を遠心または濾過して培養上清（濾液）を得、該培養上清から、例えば、塩析、溶媒沈澱、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの公知の分離方法を適当に選択して行うことにより得ることができる。

【0040】

一方、細胞質に存在するＡＰは、培養物を遠心または濾過して細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波処理、リゾチーム処理、凍結融解、浸透圧ショック、および／またはトライトン−Ｘ１００等の界面活性剤処理などにより、細胞およびオルガネラ膜を破砕（溶解）した後、遠心分離や濾過などによりデブリスを除去して可溶性画分を得、該可溶性画分を、上記と同様の方法で処理することにより単離精製することができる。

【0041】

組換えＡＰを迅速且つ簡便に取得する手段として、ＡＰのコード配列のある部分（好ましくはＮまたはＣ末端）に、金属イオンキレートに吸着し得るアミノ酸配列（例えば、ヒスチジン、アルギニン、リシン等の塩基性アミノ酸からなる配列、好ましくはヒスチジンからなる配列）をコードするＤＮＡ配列を、遺伝子操作により付加して宿主細胞で発現させ、該細胞の培養物のＡＰ活性画分から、該金属イオンキレートを固定化した担体とのアフィニティーによりＡＰを分離回収する方法が好ましく例示される。金属イオンキレートに吸着し得るアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、例えば、ＡＰをコードするＤＮＡをクローニングする過程で、ＡＰのＣ末端アミノ酸配列をコードする塩基配列に該ＤＮＡ配列を連結したハイブリッドプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行ったり、あるいは該ＤＮＡ配列を終止コドンの前に含む発現ベクターにＡＰをコードするＤＮＡをインフレームで挿入することにより、ＡＰコード配列に導入することができる。また、精製に使用される金属イオンキレート吸着体は、遷移金属、例えばコバルト、銅、ニッケル、鉄の二価イオン、あるいは鉄、アルミニウムの三価イオン等、好ましくはコバルトまたはニッケルの二価イオン含有溶液を、リガンド、例えばイミノジ酢酸（ＩＤＡ）基、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）基、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ）基等を付着したマトリックスと接触させて該リガンドに結合させることにより調製される。キレート吸着体のマトリックス部は通常の不溶性担体であれば特に限定されない。
あるいは、タグとしてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＨＡ、ＦＬＡＧペプチドなどを用いてアフィニティー精製することもできる。

【0042】

上記精製工程において、必要に応じて膜濃縮、減圧濃縮、活性化剤および安定化剤添加等の処理を行うこともできる。これら工程に用いる溶媒としては特に限定されないが、ｐＨ６〜９程度の範囲において緩衝能を有するＫ−リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ＧＯＯＤの緩衝液等に代表される各種緩衝液が好ましい。また、ＡＰの安定性を担保するために、これら緩衝液中に金属塩を添加してもよく、そのような金属塩としては、好ましくはマグネシウム塩および／又は亜鉛塩が用いられる。これら金属塩は、ＡＰの安定化に奏効する範囲において設定すればよく、マグネシウム塩であれば終濃度０．００１ｍＭ〜１０ｍＭ、亜鉛塩であれば０．００１ｍＭ〜１ｍＭが好ましい添加量の範囲として例示されるが、この範囲に限定されない。

【0043】

かくして得られるＡＰが遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって該遊離体を塩に変換することができ、該タンパク質が塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。

【0044】

精製酵素は液状で産業利用に供することも可能であるが、粉末化し、あるいはさらに造粒することもできる。液状酵素の粉末化は定法により凍結乾燥することでなされる。また、液状で提供する場合、緩衝剤、金属塩、防腐剤を含むのが好ましく、また必要に応じて凍結防止剤、界面活性剤等を含むのが好ましい。緩衝剤としてはリン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、トリエタノールアミン塩酸塩、ＧＯＯＤの緩衝剤などが好適に選択されるがこれらに限定されない。緩衝剤の濃度は、溶液のｐＨを一定に保持しうる濃度であればよく特に限定されないが、好ましくは１ｍＭ〜５００ｍＭの範囲であり、より好ましくは２ｍＭ〜２００ｍＭの範囲である。また、溶液のｐＨは、ＡＰの活性を安定に維持しうる範囲であることが好ましく、好ましくはｐＨ６〜９の範囲である。また、金属塩としては好ましくはマグネシウム塩および／又は亜鉛塩が用いられ、濃度はＡＰの安定化に奏効する範囲において設定すればよく、マグネシウム塩であれば終濃度０．００１ｍＭ〜１０ｍＭ、亜鉛塩であれば０．００１ｍＭ〜１ｍＭが好ましい添加量の範囲として例示されるが、この範囲に限定されない。防腐剤としては、アジ化物や抗生物質、プロクリン１５０、プロクリン３００等が挙げられるが、これらに限定されない。また、凍結防止剤としてはグリセリンやジメチルスルフオキシドなど非タンパク質のものが好ましい。さらに界面活性剤を加える場合にあっては、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００， Ｔｗｅｅｎ２０， Ｔｗｅｅｎ８０， エマルゲンＡ６０， エマルゲン４３０， Ｂｒｉｊ３５等が好ましく選択される。

【0045】

（３）改変型アルカリホスファターゼを標識してなるコンジュゲート、および、該コンジュゲートを用いる免疫測定方法、該コンジュゲートを含む免疫測定試薬
また、本発明の別の態様は、上述のアルカリホスファターゼによって標識されてなるコンジュゲートであり、標識の対象となる物質はたとえば核酸プローブ、ビオチンなどの生体物質、ポリペプチド・アビジン・抗体などのタンパク質などが好適に選択される。標識の方法は、マレイミド法が好ましく選択される。ＥＬＩＳＡや免疫診断試薬において使用されるＡＰ標識抗体・ＡＰ標識抗原の作製方法並びにそれらを用いた免疫測定の方法については「超高感度酵素免疫測定法」（石川榮治著、学会出版センター刊）などに詳しい。

【0046】

典型的な免疫測定方法の一例は、まず測定対象となる物質の一次抗体を含む溶液を添加・インキュベートすることにより固相に吸着させる。この固相は反応層として用いる容器であってもよく、また反応層とは別に用意した磁性ビーズ等であってもよい。一次抗体を吸着させた後、溶液を除いて洗浄バッファーで数回リンスして非吸着物質を除く。洗浄バッファーは抗体が安定に存在しうる中性付近のｐＨ領域で緩衝能を有するものを利用可能であり、また洗浄能を高めるために界面活性剤を含んでいてもよい。洗浄後の固相は、さらにウシ血清アルブミンや不活性化型ＡＰ等のタンパク質を含んだ液に浸漬され、インキュベートすることによりブロッキングを行う。ブロッキング後の固相は前出の洗浄バッファーで洗浄の後、測定対象となるサンプルに接触させ、一定時間インキュベートすることで、測定対象物を一次抗体に吸着させる。サンプル溶液を完全に除き、前出の洗浄バッファーで洗浄ののち、ＡＰ標識二次抗体を含む溶液を添加し一定時間インキュベートすることにより、固相上の一次抗体に捕捉された測定対象物にＡＰ標識二次抗体を吸着させる。溶液を完全に除き、前出の洗浄バッファーで洗浄ののち、ＡＰの基質を添加して活性を検出する。ＡＰの基質としては、活性の検出方法が比色法であればｐ−ニトロフェニルリン酸や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸が、蛍光法であれば４−メチルウンベリフェリルリン酸が、発光法であれば１，２−ジオキセタン系もしくはアクリダン系発光基質からなる各種発光基質を利用可能である。これらの中で、本発明のＡＰは特に発光基質に対する反応性に優れており、これを用いる方法がより好適に選択される。発光基質としては、たとえばＡＭＰＰＤ、ＣＳＰＤ、ＣＤＰ−ｓｔａｒ、Ｌｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤ、Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ５３０、ＡＰＳ−５などが挙げられるが、これらに限定されない。あらかじめ測定対象物質の標準液を用いて作成した検量線より、測定対象物質を定量する。

【0047】

典型的な免疫測定試薬の構成の一例は、反応層、一次抗体が固定化され、かつウシ血清アルブミンや不活性化型ＡＰ等のタンパク質でブロッキングされた固相、測定対象である抗原の標準液、ＡＰが標識された二次抗体、反応層中でサンプルや二次抗体を反応させた後に洗浄するための洗浄液、ＡＰの基質溶液、使用マニュアルを含む。ＡＰの基質としては、活性の検出方法が比色法であればｐ−ニトロフェニルリン酸や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸が、蛍光法であれば４−メチルウンベリフェリルリン酸が、発光法であれば１，２−ジオキセタン系もしくはアクリダン系発光基質からなる各種発光基質を利用可能である。これらの中で、本発明のＡＰは特に発光基質に対する反応性に優れており、これを用いる方法がより好適に選択される。発光基質としては、たとえばＡＭＰＰＤ、ＣＳＰＤ、ＣＤＰ−ｓｔａｒ、Ｌｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤ、Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ５３０、ＡＰＳ−５などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0048】

活性測定例
本発明に述べるＡＰ活性は、特に断りがない限り以下の方法で測定されたものである。
まず、下記の溶液Ａ・Ｂを調製する。
Ａ：１Ｍジエタノールアミン緩衝液 （ｐＨ９．８）
Ｂ：０．６７Ｍ ｐ−ニトロフェニルリン酸 （溶液Ａに溶解する）
溶液Ａ２．９ｍｌと溶液Ｂ０．１ｍｌとをキュベット（光路長＝１．０ｃｍ）に調製し、３７℃で５分間予備加温する。ＡＰ溶液０．１ｍｌを添加してゆるやかに混和し、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で４０５ｎｍの吸光度変化を３〜５分間記録し、その直線部分から１分間あたりの吸光度変化を求める（ΔＯＤ_ＴＥＳＴ）。盲検は酵素の代わりに酵素を溶解しているバッファーを０．１ｍｌ加え、同様に１分間あたりの吸光度変化を求める（ΔＯＤ_{ＢＬＡＮＫ}）。これらの値を用いて、下記の式よりＡＰ活性を求める。
ＡＰ活性（Ｕ／ｍｌ）＝｛（ΔＯＤ_ＴＥＳＴ−ΔＯＤ_{ＢＬＡＮＫ}）×３．１｝／｛１８．２×１．０×０．１｝
３．１：ＡＰ溶液添加後の反応液量（ｍｌ）
１８．２：上記測定条件における、ｐ−ニトロフェノールのミリモル分子吸光係数（ｃｍ^２／μｍｏｌ）
１．０：光路長（ｃｍ）
０．１：酵素溶液の添加量（ｍｌ）

【0049】

タンパク質の定量および比活性の算出例
本発明に述べるタンパク質量は２８０ｎｍの吸光度を測定することにより測定したものである。すなわち、２８０ｎｍにおける吸光度が０．１〜１．０の範囲となるように酵素溶液を蒸留水で希釈し、蒸留水を用いてゼロ点補正を行った吸光度計を用いて２８０ｎｍの吸光度（Ａｂｓ）を測定する。本発明に述べるタンパク質濃度は、１Ａｂｓ≒１ｍｇ／ｍｌと近似し、吸光度の測定と測定した溶液の希釈倍率とを乗じた値で示したものである。また、本発明に述べる比活性とは、本測定方法によるタンパク質量として１ｍｇあたりのＡＰの活性（Ｕ／ｍｇ）であり、この際のＡＰ活性は、上記活性測定例に従って測定することにより得られる値である。

【0050】

マレイミド基定量方法例
本発明におけるマレイミド基の定量方法は、以下に示すものである。
まず、マレイミド化ＡＰ ５０μlを４００μlの０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）と混合し、さらに５０μlの０．５ｍＭ ２−ＭＥＡを加えて３０℃２０分インキュベートする。盲検として、４５０μl の０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）に５０μlの０．５ｍＭ ２−ＭＥＡを加えて３０℃２０分インキュベートする。さらに５ｍＭ ４−ＰＤＳを２０μl添加し、３０℃１０分インキュベートの後、３２４ｎｍにおける吸光度を測定する（Ａ３２４_{ｓａｍｐｌｅ}）。盲検は、４５０μl の０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）に５０μlの０．５ｍＭ ２−ＭＥＡを加えて同様の操作を行い、３２４ｎｍにおける吸光度を測定する（Ａ３２４_{ｂｌａｎｋ}）。これらの値を用いて、下記の式によりマレイミド基濃度を求める。
マレイミド基濃度（ｍＭ）＝ （Ａ３２４_{ｂｌａｎｋ}−Ａ３２４_{ｓａｍｐｌｅ}）×５２０／（１９．８×５０）
５２０：液全量のボリューム（μｌ）
１９．８：ミリモル分子吸光係数
５０：サンプルのボリューム（μｌ）
なお、ＡＰ１分子あたりのマレイミド基数は、測定に使用したＡＰ溶液について上述の方法でタンパク質濃度を測定し、ＡＰの分子量１０００００からＡＰのミリモル濃度を算出し、マレイミド基濃度をＡＰのミリモル濃度で割ることにより決定できる。

【0051】

以下、本発明を具体的に実施例として示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【実施例1】

【0052】

［ＡＰ産生菌株の取得］
福井県敦賀市の敦賀湾沿岸より採取した海中土砂サンプルを、５０μｇ／ｍｌ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）を含むＬＢ寒天培地（ｐＨ７．５）に塗布し、２５℃で培養した。培地上に形成されたコロニーのうち、ＢＣＩＰのリン酸エステルが加水分解されたことによる青色を呈しているコロニーを純化した。この菌株を、日本薬局方「遺伝子解析による微生物の迅速同定法」に記載される１０Ｆ／８００Ｒの各プライマーを用いてコロニーダイレクトＰＣＲにより１６ＳｒＲＮＡの配列を構成するＤＮＡ領域の一部を増幅した。この配列をＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴで検索したところ、シェワネラ属に属する細菌と推定されたため、この菌株をＳｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ． Ｔ３−３株と名づけた。

【実施例2】

【0053】

［野生型ＡＰ遺伝子のクローニング］
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ． Ｔ３−３株を試験管中の５ｍｌＬＢ培地に植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した。培養液を１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに入れ、冷却遠心機で１２０００ｒｐｍ５分遠心し、上清を吸引除去することにより、菌体を得た。この菌体より、ゲノムＤＮＡ抽出キット（ＴＯＹＯＢＯ製、ＮＰＫ−１）を用いて、該キットに添付のマニュアルに従ってゲノムＤＮＡを取得した。このゲノムＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩもしくはＢｇｌＩＩで消化させ、ＤＮＡ精製キット（ＴＯＹＯＢＯ製、ＮＰＫ−６）を用いて精製し、制限酵素を除いた。このＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩで消化し精製したｐＢＲ３２２と混合し、混合液と等量のライゲーション液（ＴＯＹＯＢＯ製、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ）を加えて１６℃で一晩インキュベートした。このライゲーション溶液を大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ製、コンピテントハイＪＭ１０９）に添加し、ヒートショックによりプラスミドを形質転換することで、Ｔ３−３株のゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。５０μｇ／ｍｌのＢＣＩＰおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にこのライブラリーを植菌して３０℃で培養し、形質転換コロニーを形成させた。形成されたコロニーをうち青色を呈したものを爪楊枝でつき、試験管中の５ｍｌＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）に植菌し、３０℃で１６時間振とう培養した。この培養液より、プラスミド抽出キット（ＴＯＹＯＢＯ製、ＮＰＫ−３）を用いてＴ３−３株由来ＡＰ遺伝子を含むプラスミド（ｐＢＲＴ３−３ＬＰＰ）を抽出、精製した。得られたプラスミドは、約６ｋｂのインサートを有しており、この配列をシーケンス解析することにより、ＡＰ遺伝子全長およびその隣接領域の配列を決定した。決定されたＡＰ遺伝子の塩基配列を配列番号１に、またこの塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。

【実施例3】

【0054】

［大腸菌宿主での野生型ＡＰの発現］
ＡＰ遺伝子全長並びにＴ３−３株ＡＰ遺伝子のプロモーター領域を含む配列をカバーし、かつそれぞれの５‘末端部にＢａｍＨＩサイトを有するようにプライマーを作製し（配列番号３、４）、このプライマーを用いてプラスミド（ｐＢＲＴ３−３ＬＰＰ）を鋳型にＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ断片は、１％アガロースを含むＴＡＥゲルにアプライし電気泳動を行い、ＵＶを照射しながら増幅断片のバンドを切り出し、ＤＮＡ精製キット（ＮＰＫ−６）を用いてゲルからのＤＮＡの抽出・精製を行った。このゲノムＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、同制限酵素処理したｐＢｌｕｅｓｃｐｒＳＫ（−）にライゲーションすることで発現プラスミド（ｐＢＳＴ３−３ＬＰＰ）を作製した。ライゲーション後のプラスミドを大腸菌Ｃ６００株にエレクトロポレーションにより導入し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布、３０℃で一晩培養することにより、形質転換コロニーを形成させた。この形質転換コロニーを５００ｍｌ容坂口フラスコ中の６０ｍｌＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）に一白金耳植菌し、３０℃１８０ｒｐｍで一晩振とう培養した。この培養液全量を１０Ｌ容ジャーファーメンター中の６Ｌ生産培地（１．２％ペプトン、２．４％酵母エキス、０．１％ＮａＣｌ、０．１ｍＭ硫酸亜鉛、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、ｐＨ７．０）に全量投入し、通気量２Ｌ／分、攪拌３８０ｒｐｍ、温度３０℃で４８時間攪拌通気培養した。これにより、８００Ｕ／ｍｌのＡＰを産生させた。

【実施例4】

【0055】

［大腸菌組換え野生型ＡＰの精製］
実施例３で得られた培養液を５００ｍｌ容遠心管に分注し、高速冷却遠心装置で８０００ｒｐｍ３０分遠心し、上清をデカントで除去することにより菌体を得た。菌体を１．５Ｌの２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）に懸濁し、フレンチプレス破砕機により圧力８０ＭＰａで破砕した。破砕液に５％（ｗ／ｖ）ポリエチレンイミンを対液３％添加し、生成した固形分を高速冷却遠心装置で８０００ｒｐｍ３０分遠心により沈降させ除いた。この液に０．１５飽和の硫酸アンモニウムを溶解させ、生じた固形分を高速冷却遠心装置で８０００ｒｐｍ３０分遠心することにより除いた。さらに、終濃度０．５５飽和となるように硫酸アンモニウムを追加して溶解させ、高速冷却遠心装置で８０００ｒｐｍ３０分遠心し、デカントにより上清を除いてＡＰを含む沈殿を得た。この沈殿を９０ｍｌの２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５、かつ１ｍＭの塩化マグネシウムを含む）を加えて溶解させた。この溶液を２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５、かつ１ｍＭの塩化マグネシウムを含む）で緩衝化したＧ−２５セファロースゲル（ＧＥヘルスケア製）を用いて脱塩した。この液を、２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５、かつ１ｍＭの塩化マグネシウムを含む）で緩衝化したＤＥＡＥセファロースゲル（ＧＥヘルスケア製）に吸着させ、同バッファーでＮａＣｌ濃度を０．５Ｍまで上昇させることによりグラジエント溶出を行った。ＡＰ活性を有する画分を集め、０．０５飽和となるよう硫酸アンモニウムを溶解した。この溶液を２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５、かつ０．０５飽和の硫酸アンモニウムおよび１ｍＭの塩化マグネシウムを含む）で緩衝化したＯｃｔｙｌセファロースゲル（ＧＥヘルスケア製）にアプライ、同バッファーを通液しつづけて非吸着画分を回収した。この溶液に終濃度０．２飽和となるように硫酸アンモニウムを追加溶解させ、２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５、かつ０．２飽和の硫酸アンモニウムおよび１ｍＭの塩化マグネシウムを含む）で緩衝化したＰｈｅｎｙｌセファロースゲル（ＧＥヘルスケア製）にアプライし、同バッファーで硫酸アンモニウム濃度を０まで下げることによりグラジエント溶出した。ＡＰを含む画分をあつめ、２０ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ７．５、かつ１ｍＭの塩化マグネシウムおよび０．１ｍＭの硫酸亜鉛を含む）で緩衝化したＧ−２５セファロースゲルで脱塩し、精製Ｔ３−３株由来組換えＡＰとした。このＡＰ溶液について比活性を測定したところ、６０９０Ｕ／ｍｇであった。

【実施例5】

【0056】

［Ｔ３−３株由来ＡＰの活性中心近傍に位置するリジン残基の推定］
シェワネラ・エスピー・ＡＰ１株 （Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ． ＡＰ−１）由来ＡＰの立体構造情報（ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ登録番号：３Ａ５２）の活性中心に位置する硫酸（基質であるリン酸エステルのアナログとして使用）から１５オングストローム以内に存在するアミノ酸残基を、ＭｏｌＦｅａｔ ｖ．３．６（フィアラックス社製）を用いて検索した。続いて、Ｔ３−３株由来ＡＰの配列である配列番号２に示すアミノ酸配列について、配列番号９に示すシェワネラ・エスピー・ＡＰ１株 （Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｐ． ＡＰ−１）由来ＡＰアミノ酸配列との一次配列アライメントにより、ＡＰ１株由来ＡＰの活性中心近傍に位置するアミノ酸残基に相当するＴ３−３株由来ＡＰ配列上の残基を決めた。これら挙げられた推定残基のうち、リジン残基が置換によりＡＰの改変に効果がある残基である。すなわち、配列番号２の中では１６１番目および１８４番目リジンが、活性中心近傍に位置するリジン残基と推定された。

【実施例6】

【0057】

［活性中心近傍に位置すると推定されるリジン残基を置換した改変型アルカリホスファターゼの作製］
まず、１８４番目リジンをセリンに置換するために、ｐＢＳＴ３−３ＬＰＰを鋳型に配列番号５、６に示すミスマッチプライマーおよびＰＣＲキット（東洋紡製ＫＯＤ ｐｌｕｓ）を用いて複製反応を行った。反応液組成および反応条件はキットに添付されているマニュアルに記載の通常のＰＣＲの推奨条件に従った。複製産物を含む反応液５０μＬに制限酵素ＤｐｎＩを２μＬ加えて３７℃２時間処理することにより、鋳型のｐＢＳＴ３−３ＬＰＰを消化し、消化産物を大腸菌ＪＭ１０９株（ＴＯＹＯＢＯ製コンピテントハイＪＭ１０９）にヒートショックにより形質転換を行い、ＳＯＣ培地を加えて３７℃１時間振とうした後１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布、３０℃で一晩培養することにより、形質転換コロニーを形成させた。形質転換コロニーを爪楊枝でついて１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地に植菌、３０℃一晩振とう培養した。この培養液より、プラスミド抽出キット（ＴＯＹＯＢＯ製、ＮＰＫ−３）を用いてプラスミドを抽出、精製した。プラスミド中のＡＰ遺伝子のシーケンスを解析した結果、１８４番目リジンをコードするコドンＡＡＧがセリンをコードするＴＣＧに変換（すなわち、配列番号１に示す塩基配列のうち５５０番目のＡがＴに、５５１番目のＡがＣにそれぞれ変換）されていることを確認し、このプラスミドをｐＢＳＴ３−３ＬＰＰ１８４Ｓと名づけた。さらに１６１番目のリジンをセリンに置換するために、ｐＢＳｐＢＳＴ３−３ＬＰＰ１８４Ｓを鋳型に配列番号７，８に示すミスマッチプライマーおよびＰＣＲキット（東洋紡製ＫＯＤ ｐｌｕｓ）を用いて複製反応を行った。反応液組成および反応条件はキットに添付されているマニュアルに記載の通常のＰＣＲの推奨条件に従った。複製産物を含む反応液５０μＬに制限酵素ＤｐｎＩを２μＬ加えて３７℃２時間処理することにより、鋳型のｐＢＳＴ３−３ＬＰＰを消化し、消化産物を大腸菌ＪＭ１０９株（ＴＯＹＯＢＯ製コンピテントハイＪＭ１０９）にヒートショックにより形質転換を行い、ＳＯＣ培地を加えて３７℃１時間振とうした後１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布、３０℃で一晩培養することにより、形質転換コロニーを形成させた。形質転換コロニーを爪楊枝でついて１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地に植菌、３０℃一晩振とう培養した。この培養液より、プラスミド抽出キット（ＴＯＹＯＢＯ製、ＮＰＫ−３）を用いてプラスミドを抽出、精製した。プラスミド中のＡＰ遺伝子のシーケンスを解析した結果、１６１番目リジンをコードするコドンＡＡＡがセリンをコードするＴＣＧに変換（すなわち、配列番号１に示す塩基配列のうち４８１番目のＡがＴに、４８２番目のＡがＣに、４８３番目のＡがＧにそれぞれ変換）されていることを確認し、このプラスミドをｐＢＳＴ３−３ＬＰＰ１６１Ｓ１８４Ｓと名づけた。これらプラスミドを用いて、実施例３および４に記載された方法に従って形質転換株の作製・培養およびＡＰの精製を行って改変ＡＰであるＫ１８４Ｓ単変異およびＫ１６１Ｓ＋Ｋ１８４Ｓ二重変異酵素を作製した。

【実施例7】

【0058】

［野生型および改変型ＡＰのマレイミド化後の残存活性比較］
実施例４および実施例６で作製した野生型および変異型ＡＰについて、それぞれ以下の要領でマレイミド化を行った。まず、各ＡＰ２ｍｇを含む５００μＬの溶液をセロファンチューブに入れ、透析バッファー（５０ｍＭホウ酸ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、ｐＨ＝７．６）を含むジョッキに入れ、バッファーを数回置換しながら一晩透析した。透析液に１０μＬのＥＭＣＳ溶液を加え、３０℃で３０分インキュベートした。なお、この際、ＡＰ分子のマレイミド基導入効率を変化させるためににＥＭＣＳ濃度を０．２〜１．０ｍＭの範囲で変化させた。この溶液を脱塩用スピンカラムを用いてバッファーを０．１Ｍトリス塩酸塩、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、ｐＨ＝７．６に置換してマレイミド化ＡＰ溶液とした。このマレイミド化ＡＰについて比活性およびマレイミド基導入数を測定した。結果を図１に示す。野生型ＡＰではマレイミド化によって比活性が低下し、Ｋ１８４Ｓ単変異酵素ではマレイミド化後のＡＰの比活性残存率が野生型よりも高く、さらにＫ１６１Ｓ＋Ｋ１８４Ｓ二重変異酵素ではマレイミド化後もほぼ完全に元の比活性を保っていることが示された。すなわち、活性中心近傍のリジン残基を置換することにより、マレイミド基導入後の活性低下が抑制されることが示された。

【実施例8】

【0059】

［改変型ＡＰと市販のウシ小腸由来ＡＰとのマレイミド化後の反応性比較］
実施例６で作製したＫ１６１Ｓ＋Ｋ１８４Ｓ二重変異酵素およびウシ小腸由来ＡＰ（Ｎａｔｉｖｅ酵素、比活性６０００Ｕ／ｍｇ）について、それぞれ実施例７の要領に従ってマレイミド化を行った。但し、マレイミド化反応中のＥＭＣＳ濃度を０．２５〜１ｍＭの範囲で変化させた。マレイミド化前およびマレイミド化後のＡＰについてそれぞれ濃度１０μｇ／ｍｌとなるよう希釈バッファー（３０ｍＭトリエタノールアミン塩酸塩、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、ｐＨ＝７．６）を用いて希釈し、あらかじめＢＳＡでコーティングした９６ウエルＥＬＩＳＡプレート（ｎｕｎｃ製９６Ｆ ＭＡＸＩＳＯＲＰ ＢＬＡＣＫ ＭＩＣＲＯＷＥＬＬ ＳＨ）に１０μＬずつを注入し、３７℃で予備加温した発光基質溶液（Ｌｕｍｉｇｅｎ製Ｌｕｍｉ−ｐｈｏｓ５３０）５０μＬを添加して発光量をルミノメーター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製Ｗａｌｌａｃ １４２０ ＡＲＶＯ ＭＸ）を用いて測定した。各ＡＰのマレイミド基導入数と相対発光強度（ウシ小腸由来ＡＰの非マレイミド化酵素を用いた際の発光強度を１００とした相対値）のプロットを図２に示す。現在標識用酵素として広く用いられているウシ小腸由来ＡＰではマレイミド基の導入数上昇に従って単位タンパク質あたりの発光量が減少しているのに対し、Ｋ１６１Ｓ＋Ｋ１８４Ｓ二重変異酵素ではマレイミド基の導入数にかかわらず一定の発光量を示した。

【実施例9】

【0060】

［哺乳類由来ＡＰにおける活性中心近傍のリジン残基の特定または推定］
立体構造が決定しているヒト由来ＡＰの立体構造情報（ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢｋａｎｋ登録番号：３Ａ５２）の活性中心に位置するリン酸基（基質であるリン酸エステルのアナログとして使用）から１５オングストローム以内に存在するアミノ酸残基を、ＭｏｌＦｅａｔ ｖ．３．６（フィアラックス社製）を用いて検索した。配列番号１０に示すヒト由来ＡＰにおける活性中心近傍に位置するリジン残基は、８１番目リジンおよび８７番目リジンである。また、ヒト由来ＡＰのアミノ酸残基のうち活性中心から１５オングストローム以内に位置するアミノ酸残基を特定し、該アミノ酸配列と各種ウシ小腸由来ＡＰアミノ酸配列（配列番号１１〜１４）とのアライメントを行うことにより、活性中心近傍に位置するアミノ酸残基を推定し、さらにこの中でリジン残基をピックアップした。このように推定されたウシ小腸由来ＡＰにおける活性中心近傍のリジン残基は、配列番号１１、１３にあっては１００番目リジンが、配列番号１２にあっては８１番目リジンが、配列番号１４にあっては１００番目リジンおよび１２７番目リジンがこれに該当する。これらリジン残基を他のアミノ酸に置換することにより、リジン残基を介したマレイミド化等の修飾を行った後も修飾前の活性を維持しうるＡＰに改変することが可能である。

【実施例10】

【0061】

［他のシェワネラ属細菌由来アルカリホスファターゼ遺伝子の取得と活性中心近傍のリジン残基の推定］
独立行政法人製品評価技術基盤機構より、シェワネラ・フォディナエ ＮＢＲＣ１０５２１６株およびシェワネラ・チリケンシス ＮＢＲＣ１０５２１７株を購入し、それぞれ実施例２の要領に従って菌体からゲノムＤＮＡを抽出し、ライブラリを作製、ＡＰ遺伝子を含むプラスミドを取得し、ＡＰ遺伝子配列を決定した。決定されたシェワネラ・フォディナエ ＮＢＲＣ１０５２１６株由来ＡＰ遺伝子の塩基配列を配列番号１５に、概ＡＰ遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１６に示す。また、決定されたシェワネラ・チリケンシス ＮＢＲＣ１０５２１７株由来ＡＰ遺伝子の塩基配列を配列番号１７に、概ＡＰ遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１８に示す。これらの配列について、実施例５の要領に従って活性中心近傍に位置するリジン残基の推定を行った。このように推定された残基は、配列番号１６に示すシェワネラ・フォディナエ ＮＢＲＣ１０５２１６株由来ＡＰにあっては１５７番目および１８０番目リジンが、また配列番号１８に示すシェワネラ・チリケンシス ＮＢＲＣ１０５２１７株由来ＡＰにあっても同様に１５７番目および１８０番目リジンがこれに該当する。Ｔ３−３株同様、これらアミノ酸残基を置換することで、リジン残基を介したマレイミド化等の修飾を行った後も修飾前の活性を維持しうるＡＰに改変することが可能である。

【産業上の利用可能性】

【0062】

本発明のアルカリホスファターゼは、免疫測定用標識酵素として有用であるほか、プローブハイブリダイゼーション、ウエスタンブロッティング用標識酵素として利用可能である。

【図1】

【図2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]