特許 6041279 植物組織の培養用培地の製造方法及び植物組織の培養方法並びに滅菌処理剤、殺菌処理剤、及び植物組織培養用培地組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6041279

(24)【登録日】2016年11月18日

(45)【発行日】2016年12月7日

(54)【発明の名称】植物組織の培養用培地の製造方法及び植物組織の培養方法並びに滅菌処理剤、殺菌処理剤、及び植物組織培養用培地組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/04 20060101AFI20161128BHJP

   A01H 4/00 20060101ALI20161128BHJP

   A61L 2/23 20060101ALI20161128BHJP

   A01N 25/12 20060101ALI20161128BHJP

   A01N 43/90 20060101ALI20161128BHJP

   A01N 37/44 20060101ALI20161128BHJP

   A01N 61/00 20060101ALI20161128BHJP

   A01N 63/00 20060101ALI20161128BHJP

   A01N 37/36 20060101ALI20161128BHJP

   A01N 59/08 20060101ALI20161128BHJP

   A01N 47/04 20060101ALI20161128BHJP

   A01N 37/02 20060101ALI20161128BHJP

   A01N 25/00 20060101ALN20161128BHJP

   A61L 101/06 20060101ALN20161128BHJP

   A61L 101/36 20060101ALN20161128BHJP

   A61L 101/44 20060101ALN20161128BHJP

   A61L 101/52 20060101ALN20161128BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/04

   A01H4/00

   A61L2/23

   A01N25/12

   A01N43/90 101

   A01N43/90 106

   A01N37/44

   A01N61/00 D

   A01N63/00 A

   A01N37/36

   A01N59/08 A

   A01N43/90 102

   A01N47/04 101

   A01N37/02

   !A01N25/00 102

   A61L101:06

   A61L101:36

   A61L101:44

   A61L101:52

【請求項の数】7

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2015-506539(P2015-506539)

(86)(22)【出願日】2013年9月20日

(86)【国際出願番号】JP2013075495

(87)【国際公開番号】WO2014147869

(87)【国際公開日】20140925

【審査請求日】2015年9月17日

(31)【優先権主張番号】特願2013-61064(P2013-61064)

(32)【優先日】2013年3月22日

(33)【優先権主張国】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 園芸学会、園芸学研究 第１１巻 別冊２、第５０１頁、平成２４年９月２２日 〔刊行物等〕 園芸学会平成２４年度秋季大会、福井県立大学福井キャンパス 平成２４年９月２３日

【早期審査対象出願】

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】513070059

【氏名又は名称】水田 洋一

(74)【代理人】

【識別番号】110001069

【氏名又は名称】特許業務法人京都国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】水田 洋一

【審査官】 原 大樹

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１２−５０５６４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 水田洋一ほか，食品添加物と煮沸を併用して培地を滅菌すると長期間の植物培養でも微生物汚染されない，園芸学会雑誌，２００６年，第７５巻別冊２，第３１１頁

【文献】 水田洋一ほか，抗菌物質処理後に外植体を塩素溶液でぬらせばクリーンベンチ不要で一度に多数置床できる，園芸学会雑誌，２００６年，第７５巻別冊１，第１８８頁

【文献】 Journal of Applied Microbiology，１９９８年，Vol.85，p.1013-1022

【文献】 水田洋一ほか，非加熱滅菌法を用いた簡易液体培養における微生物汚染の低減と植物の生育促進，園芸学研究，２００９年，第８巻別冊２，第３０８頁

【文献】 水田洋一ほか，オートクレーブとクリーンベンチを用いない簡易組織培養における微生物汚染率の低減，園芸学研究，２０１０年，第９巻別冊２，第２９８頁

【文献】 水田洋一ほか，滅菌容器と低濃度の殺菌剤を用いたオートクレーブ滅菌不要簡易培養法，園芸学会雑誌，２００１年，第７０巻別冊２，第１４０頁

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０

Ａ０１Ｈ １／００−１７／００

Ａ０１Ｎ １／００−５５／０８

５７／００−６５／４８

Ａ０１Ｐ １／００−２３／００

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ／ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

培地を煮沸する工程と、
煮沸途中で該培地に複数種の粉末状の薬剤から成る、第１滅菌処理剤を、１回のみ添加する工程と、
煮沸終了時に該培地に１種類の薬剤から成る第２滅菌処理剤を添加し、該培地を培養容器に分注する工程と、
分注した培地を冷却する工程と
を順に行う植物組織の培養用培地の製造方法であって、
前記第１滅菌処理剤を構成する１種又は複数種の薬剤が、少なくともショ糖脂肪酸エステル類及びナイシンを含み、前記第２滅菌処理剤を構成する薬剤が次亜塩素酸の有効塩素を含む
ことを特徴とする植物組織の培養用培地の製造方法。

【請求項2】

前記第１滅菌処理剤を構成する薬剤が、さらに、グリセリン脂肪酸エステル類、ナタマイシン、εポリリジン、プロタミン酸、クエン酸塩から選択される１ないし複数の成分を含むことを特徴とする請求項１に記載の植物組織の培養用培地の製造方法。

【請求項3】

ショ糖脂肪酸エステル類、ナイシン、及びオキソリニック酸を含有する粉末状の薬剤から成る、植物組織の培養用培地の滅菌処理剤。

【請求項4】

さらに、ナタマイシンを含有することを特徴とする請求項３に記載の滅菌処理剤。

【請求項5】

培養用培地に添加したときに、ナイシンの濃度が0.1〜10mg/L、オキソリニック酸の濃度が0.1〜100mg/L、ナタマイシンの濃度が1〜1000mg/Lの範囲となるように調製されていることを特徴とする請求項４に記載の滅菌処理剤。

【請求項6】

サルミン、卵白リゾチーム、キャプタンのうちの少なくとも一種をさらに含むことを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載の植物組織の培養用培地の滅菌処理剤。

【請求項7】

請求項３〜６のいずれかに記載の滅菌処理剤と、粉末状の培地成分とを含む植物培養用培地組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、植物組織の培養に用いられる培地の製造方法及び植物組織の培養方法並びに滅菌処理剤、殺菌処理剤、及び植物組織培養用培地組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

通常、植物組織の培養には、アガロースやゲランガム等のゲル化剤を培養液に添加したゲル状或いは固体状の培地、もしくはゲル化剤を含まない液体状の培地が用いられる。培地は培養容器に収容された状態で滅菌処理が施され、その後、無菌環境下で培地に植物組織が植え付けられた（以下、「置床」という）後、培養室内で植物組織の培養が行われる。これは、培養容器内に雑菌が混入すると、培地に含まれる糖等の栄養分により雑菌が繁殖し、その結果、植物組織の生育が妨げられるからである。

【0003】

通常、培地及び培養容器の滅菌処理には高圧蒸気滅菌器（オートクレーブ）が用いられ、植物組織の置床作業は無菌室（クリーンベンチ）内で行われる。従って、滅菌処理後の培地等を高圧蒸気滅菌器から取り出して無菌室に移動させる際に雑菌が混入しないよう、注意深く作業を行わなければならず、手間がかかる。また、培養可能な量は高圧蒸気滅菌器や無菌室の容量に制限されるため、一度に大量の植物組織を培養することができない。
そこで、高圧蒸気滅菌器や無菌室を用いることなく簡便に、且つ、屋外でも植物組織を培養できる方法の研究・開発が進められている。

【0004】

例えば、非特許文献１は本願発明者を著者に含む学術論文であり、塩素系殺菌剤を含む複数種の薬剤を用いた、簡便な植物組織の培養方法を開示している。この方法は、培地を加熱し、沸騰させて溶解させた培地に薬剤を複数回添加して滅菌すると共に、薬剤を含む液体に培養容器及び植物体を浸漬して殺菌した後、通常の環境下で培養を行う方法であり、高圧蒸気滅菌器や無菌室を用いた場合と同程度の滅菌・殺菌効果が得られることが非特許文献１において報告されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】水田洋一、宮坂清昭、村石悠介、土井元章、2010年9月、オートクレーブとクリーンベンチを用いない簡易組織培養における微生物汚染率の低減、園芸学研究第９巻 別冊２、p. 298

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

ところが、上記方法に用いられる複数種の薬剤は予め混合しておくことができないため、培地に添加したり、培養容器及び植物体を液体に浸漬する直前に別個に秤量したりしなければならない。このため、作業が繁雑で面倒であるという問題があった。

【0007】

本発明が解決しようとする課題は、簡便に滅菌処理や殺菌処理を行うことができ、しかも、オートクレーブやクリーンベンチを使った場合と同程度に植物組織を生育することができる植物組織の培養用培地の製造方法及び植物組織の培養方法並びに植物組織の培養用培地の滅菌処理剤、植物体の殺菌処理剤、及び植物組織培養用培地組成物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上記課題を解決するために成された本発明に係る植物組織の培養用培地の製造方法は、
培地を煮沸する工程と、
煮沸途中で該培地に複数種の粉末状の薬剤から成る、第１滅菌処理剤を、１回のみ添加する工程と、
煮沸終了時に該培地に１種類の薬剤から成る第２滅菌処理剤を添加し、該培地を培養容器に分注する工程と、
分注した培地を冷却する工程と
を順に行うことを特徴とする。

【0009】

本発明は、培地の煮沸途中に添加する第１滅菌処理剤を複数種の粉末状の薬剤から構成した点、及び煮沸終了時に添加する第２滅菌処理剤を１種類の薬剤から構成した点に特徴を有する。粉末状の薬剤同士を混ぜ合わせても変性しないため、予め第１滅菌処理剤を調製しておくことができる。

【0011】

第１滅菌処理剤を構成する薬剤は、ショ糖脂肪酸エステル類、ナイシン、ナタマイシン、εポリリジン、プロタミン類、クエン酸塩、次亜塩素酸塩から選択される１ないし複数の成分を含むことが好ましく、特に、ショ糖脂肪酸エステル類、ナイシンを含むことが好ましい。また、ショ糖脂肪酸エステル類に加えて又は代えてグリセリン脂肪酸エステル類を含むものとしてもよい。

【0012】

また、第２滅菌処理剤を構成する薬剤は、キャプタン、オキソリニック酸、次亜塩素酸塩から選択される１ないし複数の成分を含むことが好ましい。これら第１及び第２滅菌処理剤には、食品添加物や農薬として指定を受けている薬剤或いは成分を用いることが好ましい。

【0013】

また、上記課題を解決するために成された本発明に係る植物組織の培養方法は、
固体状または半固体状の培地を収容してなる培養容器を、塩素系殺菌剤を含む第１殺菌組成液に所定時間浸漬する工程と、
植物組織を第２殺菌組成液に所定時間浸漬する工程と、
前記第１殺菌組成液から取り出した培養容器内の培地に、前記第２殺菌組成液から取り出した植物組織を置床し、培養する工程と
を含むことを特徴とする。

【0014】

上記第１殺菌組成液に浸漬する培養容器内の培地は、上述の製造方法により製造された培地を用いると良い。

【0015】

前記第１殺菌組成液は、塩素系殺菌剤の他に、ショ糖脂肪酸エステル類を含有する薬剤を含むことが好ましい。また、第２殺菌組成液は、ショ糖脂肪酸エステル類、キャプタン、オキソリニック酸、ナタマイシンをそれぞれ含有する薬剤を含むことが好ましい。この場合、ショ糖脂肪酸エステル類、ナタマイシンを含有する薬剤は、食品添加物として指定を受けていることが好ましく、キャプタンを含有する薬剤、オキソリニック酸を含有する薬剤は、いずれも、農薬として指定を受けていることが好ましい。

【0016】

さらにまた、第１殺菌組成液には、上記した以外にCMIT（ZonenC、ケーソンなど）を含めることができる。

【0017】

本発明に係る植物組織の培養用培地の滅菌処理剤は、少なくともショ糖脂肪酸エステル類とナイシンを含有する粉末状の薬剤から成ることを特徴とする。

【0018】

また、本発明に係る植物組織培養用培地組成物は、上記滅菌処理剤と、粉末状の培地成分とを含むことを特徴とする。

【0019】

さらに、本発明に係る植物組織の培養に用いられる殺菌処理剤は、植物体又は培養容器の殺菌処理に用いられるものであって、複数の粉末状の薬剤を混合して成ることを特徴とする。

【発明の効果】

【0020】

本発明に係る植物組織の培養用培地の製造方法によれば、第１滅菌処理剤及び第２滅菌処理剤を予め調製しておくことができるため、面倒な作業を行うことなく簡便に培養容器及び培地を殺菌することができ、しかも、得られた培養用培地を用いれば、オートクレーブやクリーンベンチを使った場合と同程度に植物組織を生育させることができる。

【0021】

本発明に係る植物組織の培養方法によれば、培地を第１殺菌組成液に、植物組織を第２殺菌組成液にそれぞれ浸漬するだけで簡単に殺菌処理を行うことができる。また、この培養方法で培養した植物組織は、オートクレーブやクリーンベンチを使った場合と同程度に生育させることができる。

【0022】

また、本発明に係る植物組織の培養用培地の滅菌処理剤及植物体の殺菌処理剤並びに培養用培地組成物は、培地の滅菌処理や植物体の殺菌処理に必要な成分が予め混合されているため、培地及び植物体を簡便に滅菌・殺菌処理することができる。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】固体培地の滅菌手順の説明図（２回添加型）。

【図2】固体培地の滅菌手順の説明図（１回添加型）。

【図3】固体培地の滅菌手順の説明図（培地成分混合型）。

【図4】固体培地を用いた培養手順の説明図。

【図5】液体培地を用いた培養手順の説明図。

【図6】薬剤濃度の植物の生育におよぼす影響を示す実験結果。

【図7】薬剤濃度と組み合わせの培地滅菌に及ぼす影響を示す実験結果。

【図8】培地中薬剤濃度と組合せが固化後の微生物再汚染に及ぼす影響を示す実験結果。

【図9】置床時の薬剤の濃度と組合せが滅菌効果に及ぼす影響を示す実験結果。

【図10A】微生物汚染の発生率を示す実験結果。

【図10B】微生物汚染の発生率を示す実験結果。

【図11】外植体の成長の比較実験結果。

【図12】液体培地の滅菌処理の違いによる外植体の成長の比較実験結果。

【図13】液体培養における微生物汚染の発生率の違いの実験結果。

【図14】液体培地の滅菌処理後の微生物汚染の発生率の実験結果。

【図15】実施例及び比較例の実験結果。

【発明を実施するための形態】

【0024】

以下に、本発明に係る植物組織の培養方法及び培養用培地の製造方法について具体例を挙げて説明する。まずは、培地の滅菌処理方法、培養容器の殺菌処理方法について説明する。なお、以下の表１〜表５は、滅菌実施例等で用いた薬剤、培養容器、培地の組成、接種菌、外植体の種類を示している。

【0025】

【表1】

【0026】

【表2】

【0027】

【表3】

【0028】

【表4】

【0029】

【表5】

【0030】

[固体培地の滅菌処理]
（１）培地固化時の滅菌処理
以下の（１−１）〜（１−３）の方法により固体培地を滅菌した。なお、これらの方法により得られる固体培地を「滅菌済み固体培地」という。
（１−１）培地固化時に滅菌処理剤を２回に分けて添加し、滅菌処理する方法（以下「２回添加型」という。図１参照）
１．培地を加熱して沸騰（煮沸）させる。
２．溶解した培地に第１滅菌処理剤（成分は後述する）を添加する。
３．３分間沸騰状態を継続する。
４．第２滅菌処理剤（成分は後述する）を添加した後、培地を培養容器に分注し、室温で冷却して培地を固化する。

【0031】

（１−２）培地固化時に滅菌処理剤を１回添加して滅菌処理する方法（以下、「１回添加型」という。図２参照）
１．培地を加熱して沸騰（煮沸）させる。
２．溶解した培地に第１滅菌処理剤（成分は後述する）を添加した後、培地を培養容器に分注し、室温で冷却する。

【0032】

（１−３）培地成分に予め滅菌処理剤を混入しておく方法（以下、「培地成分混合型」という。図３参照）
１．水道水を加熱し、沸騰させる。
２．滅菌処理剤と全培地成分の混合物に90℃以上の湯を注いで溶解する。
３．培地が完全に溶解した後、培養容器に分注し、室温で冷却する。

【0033】

[外植体の置床（培養）方法]
（１）固体培地における培養（図４参照）
１．外植体を第１殺菌処理液（P-1670を2000mg/L（SE-P2000）、ニサプリンを2000 mg/L（Nisin2000）、スターナ水和剤を500 mg/L（Ox500）、ナタマイシンを10000 mg/L（Nata10000）、オーソサイド80を10000 mg/L（Cap1000）、インパクト・Nを20000 mg/L（Imp20000）から選択されたいずれか一つ或いは複数を水道水に溶解したもの)に浸漬した後、取り出して水を切る。
２．培養容器に収容された滅菌済み固体培地を第２殺菌処理液（P-1670を2000mg/L（SE-P2000）、ケミクロンＧを1400mg/L（Cl1400）から選択されたいずれか一つ或いは両方を含む）に浸漬する。
３．第２殺菌処理組成液から培養容器を取り出した後、倒置して余剰液を排出する。
４．手順３で得られた培養容器内の培地に、手順１で得られた外植体を置床し、通常の実験室内で培養する。

【0034】

（２）液体培地における培養（図５参照）
１．プラスチックケース内にポリエチレン袋を入れ、該ポリエチレン袋に培養液を注入する。
２．殺菌処理剤（P-1670を10 mg/L（SE-P10）、ニサプリンを10 mg/L（Nisin10）、スターナ水和剤を2 mg/L（Ox2）、ナタマイシンを50 mg/L（Nata50）、オーソサイド80を50 mg/L（Cap50）、インパクト・Nを100 mg/L（Imp100）、卵白リゾチームを100 mg/L（Ly100）、ケミクロンＧを7 mg/L（Cl7）)を培養液に投入し、溶解する。
３．手順２で得られた培養液内に無菌の外植体を置床し、通常の実験室内で培養する。

【0035】

次に、具体的な実験結果を説明する。
[薬剤濃度の植物の生育におよぼす影響]
培地の滅菌に用いる薬剤の濃度を変えて植物の生育に及ぼす影響を調べた。その結果を図６に示す。この実験の培養条件は次の通りである。
培地成分 ：大塚A処方固形培地
培養期間 ：３０日
植物体数 ：１０
数値 ：平均値±標準誤差
滅菌方法 ：１回添加型
置床方法（培養方法）：図４に示す方法で行い、第１殺菌処理液／第２殺菌処理液をSE-P2000Cll40／SE-P2000Cll40とした。
なお、図６中、「オートクレーブ（従来法）」は比較例を示し、オートクレーブにて殺菌処理を行った外植体を液体培地にて、クリーンベンチ内で培養した。

【0036】

図６から分かるように、P1670（SE-P）、LWA1570（SE-L）はいずれも培地中濃度が5g/L以下であれば植物の成育に悪影響がなかった。
ナタマイシン製剤（Nata）は100mg/L以下の濃度なら成育に影響がなかった。なお、ナタマイシン製剤と共にP1670（SE-P）を添加した理由は、ナタマイシンのみでは芽胞菌による汚染が無視できないためである。
ニサプリン（Nisin）は500mg/L以下の濃度なら成育に悪影響がなかった。
スターナ水和剤（Ox）は2mg/L以下の濃度なら成育に悪影響がなかった。
ケミクロンＧ（Cl）は14mg/L以下の濃度なら成育に悪影響がなかった。なお、ケミクロンＧ14mg/Lの有効塩素濃度は10mg/Lである。
以上の結果に基づき、各滅菌処理剤や殺菌処理液に用いる薬剤濃度の上限値を設定した。

【0037】

[薬剤濃度と組み合わせの培地滅菌に及ぼす影響]
固体培地に菌を接種したときの滅菌効果を調べた。培養条件は以下の次の通りである。
培養期間 ：３０日
培養条件 ：40℃ 暗黒
測定試験管数：50
数値 ：微生物汚染率微生物コロニーが形成された試験管の割合
接種量 ：培地１L当たり1mL

【0038】

その結果を図７に示す。図７より、LWA1570とP1670を比較するとP1670の方がより殺菌程度が上がることが分かる。また、薬剤の濃度を上げても培地によっては滅菌できないこと、LWA1570、P1670とケミクロンＧを同時に入れてはいけないこと、LWA1570、P1670よりもケミクロンＧを先に入れてはいけないことが分かる。
特に、培地作製手順はやや煩雑になるが、ケミクロンＧは、P1670やニサプリンを投入後、3〜15分の間に入れるべきであり、こうすると食品添加物のみで薬剤を構成可能となる。また、こうすれば植物に悪影響の大きいオキソリニック酸製剤（スターナ水和剤）を使用しなくて済む。さらに、P1670、ニサプリン、スターナ水和剤を組み合わせれば全ての薬剤を同時投入できる。

【0039】

[培地中薬剤濃度と組合せが固化後の微生物再汚染に及ぼす影響]
滅菌済み培地（大塚A固形培地）を試験管立てに５０本立てて、通常の実験台（１４〜２４℃）に放置したときの微生物コロニー形成程度の経時変化を調べた。
その結果を図８に示す。
図８より、P1670とニサプリン、ケミクロンＧで滅菌した培地は、容器を充分に封じ、微生物の再侵入を防止すればコロニーは形成されなかった（即ち、充分滅菌できる）。
しかし、容器を充分に封じない場合は多くの微生物が再侵入し、コロニーが形成された。
一方、P1670、ニサプリン、スターナ水和剤を用いた場合は、細菌の再侵入が減少した。 また、上記に加えナタマイシンを用いた場合は、糸状菌の再侵入も大幅に減少したが、開放貯蔵できるわけではなかった。
ただし、ZonenCをさらに加えることで開放貯蔵が可能になった。また、ナタマイシンを抜くとZonenCがあっても開放貯蔵はできないことがわかった。

【0040】

[置床時の薬剤の濃度と組合せが滅菌効果に及ぼす影響]
外植体の殺菌処理液及び培養容器の殺菌処理液に用いる薬剤の濃度及び組み合わせと、置床後の滅菌効果との関係を調べた。実験条件は下記の通りである。
固形培地 ：大塚A処方
滅菌方法 ：オートクレーブ
菌接種方法培：地表面 [B5、S3：菌懸濁液を培地表面に50μL /試験管滴下、An：分生子粉末，ないし分生子粉末をアルファー化デンプンで所定倍率に希釈した物を培地表面に10mg/試験管投入]、外植体 [B5、S3：菌懸濁液に浸漬（外植体当たり10μL付着）、An：分生子粉末、ないし分生子粉末をアルファー化デンプンで所定倍率に希釈した物を粉衣接種（外植体当たり5mg付着）]
外植体 ：ジャガイモ
置床方法 ：図４に示す方法
培養期間 ：１４日

【0041】

結果を図９に示す。外植体を置床しなかった場合のケミクロンＧ（Cl2800）で培養容器を処理した結果から、有効塩素濃度を2000mg/Lという高濃度にしてもAnのコロニー形成は防止できないことが分かった。
一方、P-1670（SE-P）を添加した場合は、ケミクロンＧが700mg/L（有効塩素500mg/L相当）以上の液に浸漬することによりコロニー形成を阻止できた。
さらに、オーソサイド（Cap）、スターナ水和剤（Ox）、ナタマイシン（Nata）などを低濃度で加えると、ケミクロンＧが140mg/Lの液でも（有効塩素100mg/L相当）コロニー形成を阻止できた。

【0042】

外植体に菌を接種した場合は、外植体を置床しなかった場合と同様の殺菌処理液に外植体を浸漬してもコロニー形成を防止できなかった。
また、接種濃度を１０００倍に薄めてもコロニー形成を防げなかった。
一方、スターナ水和剤（Ox）を200mg/L以上を含む殺菌処理液で外植体を処理すればB5は滅菌できるが、An及びS3のコロニー形成を防げなかった。さらに、オーソサイド80（Cap）を10000mg/L以上を含む液で処理すればS3のコロニー形成をある程度は阻止できるが、An及びB5のコロニー形成は防止できなかった。また、ナタマイシン（Nata）を10000mg/L以上を含む液で処理すればAnのコロニー形成をある程度は阻止できるが、S3及びB5のコロニー形成を防げなかった。ただし、上記３種の薬剤を添加すると菌３種のコロニー形成を防止できた（Anは100倍以上に薄めて接種した場合）。この傾向は、培養容器の殺菌処理液を換えてもほとんど同じであった。
また、ニサプリン（Nisin）やサルミンを加えると、かえってAnの殺菌効果が低下した。

【0043】

[微生物汚染の発生率]
培地の滅菌処理方法や外植体の処理液、培養容器の処理液を変えて、置床後における外来の微生物の汚染発生率を調べた。各試験の滅菌処理組成物、殺菌処理液等の一覧を図１０Ａに、微生物汚染率を図１０Ｂに示す。
これらの図から、薬剤の濃度や組み合わせを工夫することにより、微生物汚染の発生を抑えることができることが分かる。特に、ジャガイモは置床時に微生物汚染が発生しやすいが、薬剤濃度を上げることで抑えることができた。

【0044】

[外植体の成長比較]
以上の結果に基づき、外植体の成長に悪影響を及ぼさない濃度に設定した薬剤を適宜組み合わせて滅菌処理組成物及び殺菌処理液を作成し、実際に培養したときの外植体の成長を比較した。培養条件は以下の通りである。
培養容器：試験管
培地：大塚A固形
培養条件：培養期間３０日
１試験管１外植体
測定数：１０試験管

【0045】

結果を図１１に示す。この図１１から分かるように、ほとんどの植物において、どの培養方法、培地滅菌方法を用いても成長に大差はなかったが、薬剤に敏感な植物であるセントポーリアとクジャクシダ前葉体はクリーンベンチなしでは置床できなかった。このような植物は、外植体の殺菌処理液だけではなく培地中のZonenCも害を及ぼすものと思われる。ただし、セントポーリアやクジャクシダ前葉体等においてもZonenCを培地中に入れないことや、外植体置床時の殺菌処理液を希釈することで対応することができた。

【0046】

[液体培地の滅菌処理の違いによる外植体の成長の比較]
液体培養について、液体培地の滅菌処理の違いによる外植体の成長の違いを調べた。液体培地には、大塚Ａ処方液体培地を用い、３０日間培養したときの結果を図１２に示す。図１２から、インパクト・Nは500mg/L以下の濃度なら成育に悪影響しない、オーソサイド80は50mg/L以下の濃度なら成育に悪影響しない、ケミクロンＧは7mg/L以下の濃度なら成育がオートクレーブ法と同程度以上の滅菌効果が得られることが分かった。

【0047】

[液体培養における微生物汚染の発生率の違い]
菌を培地に接種した場合及び外植体に接種した場合について微生物汚染率を比較した。
菌の接種濃度、植物体の種類等は下記の通りである。
培地：B5、S3は培地に1ml/L添加。Anは分生子粉末を0.1g/L添加
植物体：外植体（ジャガイモ苗条）をB5あるいはS3の培養液に浸漬後置床、あるいはAn分生子を希釈した物を粉衣後接種
測定数：各５袋
結果を図１３に示す。図１３から分かるように、液体培地の場合も、固体培地と同様、培地に接種したものよりも外植体に接種したものの方が微生物汚染率が高かった。特に、Anの微生物汚染率が高く、汚染防止が難しいことが分かる。

【0048】

[液体培地の滅菌処理後の微生物汚染の発生率]
液体培地を滅菌処理した後の外来の細菌の汚染率を調べた。いずれも、菌を接種せず通常の屋内で置床した場合の結果である。結果を図１４に示す。図１４から、卵白リゾチームは添加しなくとも微生物汚染は生じなかった。また、SE-P、Nisin、Ox、Nata、Cap、Imp10、Cl7のいずれを除いても微生物汚染率は上がった。

【0049】

次に具体的な実施例及び比較例について説明する。培養に用いた培地、培養容器、培養条件等は以下の通りである。
（１）培地
大塚A号処方等倍＋硫安0.5 g/L、ショ糖15 g/L、ゲランガム2 g/L
酵母エキスは2.5 g/L、ペプトンは5 g/L、それ以外はミキサー破砕物を75 g/Lを培地に添加
（２）培養容器
内径 23mm の試験管及びプラスチック製モルトン栓
（３）培地量
30 mL、１個の培養容器につき１個の外植体を置床

【0050】

（４）培養条件
20℃＋外植体：白色蛍光灯30 μmol/m²・s、16時間日長、昼／夜温=23℃/20℃、38℃：暗黒下で38〜40℃
（５）培養期間
培地作成１日後から３０日程度
（６）外植体
ジャガイモまたはキクの培養植物体の１〜２節の切片
（７）培養数
ジャガイモ25本、キク25本の計50本

【0051】

（８）接種耐熱芽胞とその密度
B5系統（Bacillus subtilis と推定）の耐熱芽胞を培地１L当り１×10¹⁰ CFU接種

【0052】

また、培養は１回添加型、２回添加型のいずれかで行った。
[実施例１]
以下の手順から成る。
１．培地を加熱して沸騰（煮沸）させた後、溶解した培地にSE-P：0.2g/Lとnisin ：0.2g/Lの混合物から成る第１滅菌処理剤を添加する。SE-Pとnisin はいずれも粉末状の薬剤である、
２．２分間沸騰状態を継続する。
３．第２滅菌処理剤として Cl：3mg/Lを添加した後、培地を培養容器に分注し、室温で冷却して培地を固化する。

【0053】

[実施例２]
沸騰の継続時間を５分にした以外は実施例１と同じであり、以下の手順から成る。
１．培地を沸騰させた後、SE-P：0.2g/Lとnisin ：0.2g/Lの混合物から成る第１滅菌処理剤を添加する。
２．５分間沸騰状態を継続する。
３．Cl：3mg/Lを添加した後、培地を培養容器に分注し、室温で冷却する。

【0054】

[実施例３]
沸騰の継続時間を１０分にした以外は実施例１と同じであり、以下の手順から成る。
１．培地を沸騰させた後、SE-P：0.2g/Lとnisin ：0.2g/L の混合物から成る第１滅菌処理剤を添加する。
２．１０分間沸騰状態を継続する。
３．Cl：3mg/Lを添加した後、培地を培養容器に分注し、室温で冷却する。

【0055】

[実施例４]
沸騰の継続時間を３０分にした以外は実施例１と同じであり、以下の手順から成る。
１．培地を沸騰させた後、SE-P：0.2g/Lとnisin ：0.2g/Lの混合物から成る第１滅菌処理剤を添加する。
２．３０分間沸騰状態を継続する。
３．Cl：3mg/Lを添加した後、培地を培養容器に分注し、室温で冷却する。

【0056】

次に比較例を説明する。比較例は、培地の沸騰後及び、沸騰継続後のいずれにおいても２種類の薬剤をそれぞれ秤量して添加した点以外は、実施例１〜４の手順とほぼ同じである。
＜比較例１＞
１．培地を加熱し、沸騰させた後、Cl：1.5mg/Lと、SE-L：0.5g/Lをそれぞれ秤量し、添加する。
２．３分間沸騰状態を継続する。
３．Cl：1.5 mg/L と、nisin：0.2g/L をそれぞれ秤量し、添加した後、培地を培養容器に分注し、室温で冷却する。

【0057】

＜比較例２＞
培地の沸騰後に添加する薬剤の一つであるSE-Lを同じショ糖脂肪酸エステル類を含むSE-Pに変更した以外は比較例１と同じであり、以下の手順から成る。
１．培地を加熱し、沸騰させた後、Cl：1.5mg/Lと、SE-P：0.2g/Lをそれぞれ秤量し、添加する。
２．３分間沸騰状態を継続する。
３．Cl：1.5 mg/L と、nisin：0.2g/L をそれぞれ秤量し、添加した後、培地を培養容器に分注し、室温で冷却する。

【0058】

＜比較例３＞
培地の沸騰後に４種類全ての薬剤を添加し、直ちに培養容器に分注した例であり、以下の手順から成る。
１．培地を加熱し、沸騰させた後、Cl：3mg/L、SE-P：0.2g/L、nisin：0.2g/ L をそれぞれ秤量し、添加する。
２．培地を培養容器に分注し、室温で冷却する。

【0059】

＜比較例４＞
Cl全量を先に添加し、SE-Pを後に添加した例であり、以下の手順から成る。
１．培地を加熱し、沸騰させた後、Cl：3mg/Lを秤量し、添加する。
２．５分間沸騰状態を継続する。
３．SE-P 0.2g/L と、nisin：0.2g/L をそれぞれ秤量し、添加した後、培地を培養容器に分注し、室温で冷却する。

【0060】

以上の実施例１〜４、比較例１〜４の方法で製造した培地を用いて、上述した培養方法により３０日間培養した結果を図１５に示す。
比較例１及び２は、本発明者が開発した従来の培地滅菌法であり、いずれも芽胞菌コロニーが形成された試験管はなく、十分な滅菌効果が得られることが分かる。ただし、これら比較例１及び２で用いた薬剤は、いずれも予め混合しておくことができない。具体的には、比較例１においてSE源として用いたSE-Lは粘稠性液体である。また、nisinは粉末であるが、同時に添加するClが強力な酸化性固体であるため、混合すると変性するおそれがある。一方、比較例２においてSE源として用いたSE-Pは粉末であるが、同時に添加するClが強力な酸化性固体であるため、やはり予め混合することができない。そのため、沸騰時、沸騰継続後に、それぞれ２種類の薬剤を秤量して添加する必要があり、手間がかかる。

【0061】

これに対して、比較例３は全ての薬剤を一度に添加することで、手間の軽減を図った例であるが、この例ではいくつかの培地で芽胞菌コロニーが形成され、比較例１、２に比べると滅菌効果が低下した。

【0062】

一方、実施例１〜４は、沸騰時に２種類の粉末状の薬剤（SE-Pとnisin）を添加したため、これらを予め混合しておくことができる。また、沸騰継続後に添加する薬剤を１種類にした。そのため、薬剤の秤量の回数や添加作業に着目すると、比較例１、２よりも優れる。また、芽胞菌コロニーが形成された試験管数でみると、沸騰時間が２分の実施例１では、比較例１、２には及ばないが、比較例３よりも良い滅菌効果が得られた。また、沸騰時間を５分、１０分、及び３０分にした実施例２、３及び４では、更に優れた滅菌効果が得られ、バナナの添加培地にしか芽胞菌コロニーが形成されなかった。特に、実施例２及び３では、バナナ添加培地の芽胞菌のコロニー形成率は5×10^-10程度であり、十分な滅菌効果が得られることが分かった。

【0063】

尚、上記の実施例では、食品添加物を培地の滅菌の薬剤に用いたが、農薬を用いても良い。さらに、以下に示す変形例でも可能である。

【0064】

＜変形例１＞
１．培地を沸騰させた後、P-1670：ニサプリン：ナタマイシン：スターナ水和剤（農薬）：デキストリンの重量比で100：100：10：1：39の混合物を0.25g/L添加する。
この変形例１によれば、冷却固化後の培地に対する菌侵入を低減することができ、培養容器を密閉保存する必要がない。

【0065】

＜変形例２＞
１． P-1670：ニサプリン：ナタマイシン：スターナ水和剤（農薬）：デキストリンの重量比で100：100：10：1：39の混合物を0.25g/L、グラニュー糖20g/L、ゲランガム2g/L、大塚ハウス1号1.5g/L、大塚ハウス２号1g/Lをさらに混合した物25gに沸騰した湯を１L注入しよく攪拌し溶解する。
この変形例２によれば、粉末に熱湯を注ぐだけで滅菌した培地が作成できる。

【0066】

＜変形例３＞
これは、常温で液体培養を行う場合に適した培地滅菌法であり、室温程度の培地にP-1670：ニサプリン：ナタマイシン：インパクト・N：オーソサイド80：スターナ水和剤（農薬）の重量比で4：4：20：51：20:1の混合物を0.25g/LとケミクロンＧを7mg/Lを添加して密閉する。
この方法によれば、耐熱芽胞が10000CFU/L程度までの汚染状況で、主要塩類・ビタミン・植物調節物質程度を含む単純な植物培養用培地を滅菌できる。

【0067】

＜変形例４＞
これは、植物組織（植物片或いは植物体）の滅菌法であり、農薬と食品添加物を使用している。具体的には、植物組織を、P-1670を1g/L、ナタマイシンを10g/L、スターナ水和剤を10g/L、オーソサイド80を10g/Lを含む水溶液に浸漬する。その後、上記の実施例５、変形例１で滅菌した培地に導入し、容器を密閉する。ただし実施例５の場合、培地は容器ごとP-1670を1g/L、ケミクロンＧ（次亜塩素酸塩）を1.43g/L含む液に浸漬する。
この方法を用いれば、ほぼあらゆる外部汚染状況の植物を滅菌できる。

【0068】

＜変形例５＞
これは、植物組織の滅菌法であり、食品添加物を使用した方法である。具体的には、植物をP-1670を1g/L、ナタマイシンを10g/L、ニサプリンを10g/Lを含む水溶液に浸漬し、その後に実施例５、或いは変形例２で滅菌した培地に導入し、容器を密閉する。ただし実施例５の場合、培地は容器ごとP-1670を1g/L、ケミクロンＧを1.43g/L含む液に浸漬する。
この方法は、クリーンベンチを用いずに外植体を無菌培養する分には十分な程度に滅菌できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】