特許 6041288 ホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6041288

(24)【登録日】2016年11月18日

(45)【発行日】2016年12月7日

(54)【発明の名称】ホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマー

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/115 20100101AFI20161128BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20161128BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20161128BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20161128BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20161128BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20161128BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20161128BHJP

   C12N 9/16 20060101ALN20161128BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 HZNA

   A61K48/00

   A61K31/7125

   A61K31/7105

   A61P9/00

   A61P9/04

   A61P43/00 111

   !C12N9/16

【請求項の数】8

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2012-28555(P2012-28555)

(22)【出願日】2012年2月13日

(65)【公開番号】特開2013-162771(P2013-162771A)

(43)【公開日】2013年8月22日

【審査請求日】2015年1月15日

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】304020177

【氏名又は名称】国立大学法人山口大学

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(72)【発明者】

【氏名】乾 誠

(72)【発明者】

【氏名】田中 貴絵

(72)【発明者】

【氏名】酒井 大樹

(72)【発明者】

【氏名】池田 安宏

(72)【発明者】

【氏名】松崎 益徳

【審査官】 植原 克典

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００９−１８９２９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５１２０９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／１４３７１４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００７−５２７２４６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列からなるホスホランバンに特異的な結合性を有する１本鎖ＲＮＡであって、硫黄修飾されていることを特徴とするホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマー。
（ａ）配列番号１０又は２０で示される塩基配列；
（ｂ）配列番号１０又は２０で示される塩基配列のＮ末端側あるいはＣ末端側の１０塩基を欠失した塩基配列；
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に示される塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列；
（ｄ）前記（ａ）又は（ｂ）に示される塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列。

【請求項2】

配列番号１０又は２０で示される塩基配列が、配列番号２０で示される塩基配列であることを特徴とする請求項１記載のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマー。

【請求項3】

１本鎖ＲＮＡが、配列番号２０で示される塩基配列のＣ末端側の１０塩基を欠失した塩基配列からなる、ホスホランバンに特異的な結合性を有する１本鎖ＲＮＡであることを特徴とする請求項１記載のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマー。

【請求項4】

血中で少なくとも２４時間安定であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマー。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれかに記載のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーを有効成分とする、カルシウムイオンポンプＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）の活性増強剤。

【請求項6】

請求項１〜４のいずれかに記載のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーを有効成分とする心筋の収縮及び弛緩機能増強剤。

【請求項7】

請求項１〜４のいずれかに記載のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーを有効成分とする心不全治療及び予防薬。

【請求項8】

請求項１〜４のいずれかに記載のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーを心不全治療及び予防薬を調製するために使用する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ホスホランバンに特異的に結合してホスホランバン機能を阻害する、ホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーや、該修飾ＲＮＡアプタマーを含有する心不全治療薬等に関する。

【背景技術】

【0002】

心臓の収縮力制御には、心筋細胞内のＣａ^２＋（カルシウムイオン）が中心的役割を果たすことが明らかになっている。心筋細胞内のＣａ^２＋量は、主として細胞内のＣａ^２＋貯蔵部位である心筋小胞体（ＳＲ）へのＣａ^２＋輸送と、心筋小胞体からのＣａ^２＋の遊離によって制御されている（図１、Ａ）。心筋小胞体へのＣａ^２＋輸送により細胞質Ｃａ^２＋濃度が低下すると心筋弛緩が起こり、心筋小胞体からのＣａ^２＋遊離によって細胞質Ｃａ^２＋濃度が上昇すると収縮が起こる。

【0003】

心筋細胞内のＣａ^２＋動態では、細胞内のＣａ^２＋を制御している心筋小胞体のＣａ^２＋ポンプＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）タンパク質と、その調節タンパク質のホスホランバン（ＰＬＮ）のはたらきが重要である。ホスホランバンは、心筋小胞体のＣａ^２＋輸送を司るＳＥＲＣＡの抑制因子として働く。ホスホランバンはｃＡＭＰ依存性リン酸化酵素（ＰＫＡ）にリン酸化されることによってＳＥＲＣＡから解離し、Ｃａ^２＋輸送が促進されることが明らかにされ、両タンパク質の結合部位も特定されている（非特許文献１、２）（図１、Ｂ）。

【0004】

正常な心筋細胞内Ｃａ^２＋動態は、カテコラミンからβ１受容体、アンデニル酸シクラーゼ、ｃＡＭＰ、ＰＫＡを介したシグナルを経て、電位依存性カルシウムチャネル（ＶＤＣＣ）のリン酸化、リアノジン受容体（ＲｙＲ）のリン酸化、ホスホランバンのリン酸化などを介して、最終的に心筋の収縮力の増強及び弛緩の促進をもたらす。ここでホスホランバンのリン酸化はカテコラミンの心筋作用において主要な役割を果たしている（図２、Ｉ）。それに対し、不全心の心筋細胞内Ｃａ^２＋動態は、Ｎａ−Ｃａ交換（ＮＣＸ）の異常による細胞外へのＣａ^２＋排出機能の低下、ＲｙＲの異常による心筋小胞体から細胞質へのＣａ^２＋漏出、ＳＥＲＣＡ−ＰＬＮ系の異常によるＳＲへのＣａ^２＋取り込み能の低下から、細胞質のＣａ^２＋のオーバーロードが引き起こされ、さらにＳＥＲＣＡの発現が減少し、ホスホランバンの発現が上昇し、リン酸化ホスホランバンが減少することによりホスホランバンによるＳＥＲＣＡ抑制が増強されている（図２、II）。

【0005】

従来、強心薬を主とした心不全治療薬の開発には、動物への投与や取り出した拍動心臓への投与実験による心筋収縮力増強を指標にしたスクリーニング方法が用いられてきた。この方法で得られた強心薬は、細胞外から細胞内へのＣａ^２＋流入を増加させる作用を有するため、弛緩時の細胞質Ｃａ^２＋濃度が充分に低下せず、充分な弛緩が得られないために、重症心不全をむしろ悪化させる方向に働くという問題があった。

【0006】

それに対して、ホスホランバンを標的とした医薬品は、ホスホランバンが心臓特異的に発現していることから心臓特異的に作用し、さらに、心臓においてホスホランバンの発現は心房筋と比較して心室筋で多いことから、頻脈を引き起こしにくいと予想される。従来の強心薬等が細胞外から細胞内へのＣａ^２＋流入を増加させることとは異なり、ホスホランバンの阻害剤はＳＥＲＣＡによる心筋小胞体へのＣａ^２＋輸送を促進することから、細胞質Ｃａ^２＋濃度が充分に低下して充分な弛緩が得られるだけでなく、心筋小胞体からのＣａ^２＋放出をも増加させることにより最終的に心筋収縮力が増強される。したがって、ホスホランバンを標的とした医薬品は、従来の強心薬と比べて副作用が少なく効果が高い、優れた心疾患治療薬となりうる。また、β１受容体やｃＡＭＰのシグナルと独立した作用機序であることから、これらのシグナルに作用する薬剤と併用することもできる利点がある。

【0007】

上記のようなＳＥＲＣＡ−ＰＬＮ系が関与する機序に基づいた心不全治療の安全性と有効性は、遺伝子操作によりホスホランバンを欠損させたマウスの実験（非特許文献３、４）や、ウイルスを用いて不活性なホスホランバンを大量に発現させたラットの実験（非特許文献５）からも示されている。これらの心臓では心筋小胞体のＳＥＲＣＡ活性が顕著に増強され、Ｃａ^２＋動態の異常が是正されている。しかしながら、これらの遺伝子操作やウイルスによる遺伝子発現を治療方策として臨床で用いることは、安全性や技術的な観点から極めて困難である。

【0008】

特許文献１では、心筋細胞内でのホスホランバンと筋小胞体ＳＥＲＣＡの相互作用を阻害することにより、不全心臓における収縮能を高める心不全治療薬として、２つのペプチド複合体と、ホスホランバンの変異タンパク質を明らかにしている。しかしながら、ペプチド複合体や変異タンパク質などは抗原性を有するため、副作用や生体へ投与した場合に十分な効果が得られない可能性が高いという問題がある。また、ホスホランバンとの結合部位を含むＣａ^２＋ポンプ遺伝子組み換えタンパク質と、Ｃａ^２＋ポンプとの結合部位を含むホスホランバン遺伝子組み換えタンパク質とを用いて、Ｃａ^２＋ポンプとホスホランバンとの結合量を指標として心筋小胞体のＣａ^２＋輸送調節機構（Ｃａ^２＋ポンプ−ホスホランバン系）に作用点を有する薬物のスクリーニング方法が開示されているが（特許文献２）、スクリーニング方法が開示されるにとどまり、そのような薬物は見いだされていない。

【0009】

酵素や受容体に結合する短い１本鎖のＤＮＡやＲＮＡであるアプタマーは、医薬品としての利用可能性を有するため種々の分野で注目されている。特定のタンパク質に結合するアプタマーは、ＳＥＬＥＸ（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment）法を用いて同定することができ、ＳＥＬＥＸ法により取得したアプタマーとして、プリオンタンパク質と特異的に結合するＲＮＡアプタマー（特許文献３）の他、ビトロネクチンアプタマー（特許文献４）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）に特異的に結合するアプタマー（特許文献５）があり、それぞれ、プリオン病の診断薬、抗癌剤、癌転移抑制剤としての用途が開示されている。本願発明者らは、心臓でホスホランバンに作用し心筋小胞体のＳＥＲＣＡ活性を促進するＤＮＡアプタマーを同定し、開示しているが（特許文献６）、さらに安定性に優れ、ＳＥＲＣＡ活性化効果が高いアプタマーの開発が望まれていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】特表２００２−５２８５１２号公報

【特許文献2】特開２００２−６２２９６号公報

【特許文献3】特開２００６−０４２６４５号公報

【特許文献4】特開２００２−５８４９１号公報

【特許文献5】特開２００６−１４９３０２号公報

【特許文献6】特開２００９−１８９２９２号公報

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】James, P. et al., Nature 342: 90-92 (1989)

【非特許文献2】Sasaki, T. et al., J. Biol, Chem. 267: 1674-1679 (1992)

【非特許文献3】Minamisawa, S. et al., Cell 99: 312-322 (1999)

【非特許文献4】Luo, W. et al., Circ. Res. 75: 401-409 (1994)

【非特許文献5】Iwanaga, Y. et al., J. Clin. Invest. 113: 727-736 (2004)

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

本発明は、ホスホランバンに特異的に結合してホスホランバン機能を阻害する、ホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーや、該修飾ＲＮＡアプタマーを含有する心不全治療薬や予防薬等を提供することをその主課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明者らは、ホスホランバンに結合する修飾ＲＮＡアプタマーを同定し、かかる修飾ＲＮＡアプタマーがホスホランバン機能を阻害することを確認した。そして、ホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーが、従来技術のホスホランバン標的ＤＮＡアプタマーよりも安定性に優れ、さらに効果的にホスホランバンを阻害してＳＥＲＣＡを活性化することを見いだし、本発明を完成するに至った。

【0014】

すなわち、本発明は、〔１〕（ａ）配列番号１〜１３、１５〜２０のいずれかで示される塩基配列；（ｂ）配列番号１〜１３、１５〜２０のいずれかで示される塩基配列のＮ末端側あるいはＣ末端側、又はＮ末端側及びＣ末端側が全体の０〜６０％欠失した塩基配列；（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に示される塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列；（ｄ）前記（ａ）又は（ｂ）に示される塩基配列との相同性が９０％以上である塩基配列；の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列からなるホスホランバンに特異的な結合性を有する１本鎖ＲＮＡであって、硫黄修飾されていることを特徴とするホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーや、〔２〕血中で少なくとも２４時間安定であることを特徴とする前記〔１〕記載のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーや、〔３〕硫黄修飾が、アデニンの硫黄修飾であることを特徴とする前記〔１〕又は〔２〕記載のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーからなる。

【0015】

また、本発明は、〔４〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーを有効成分とする、ホスホランバンとカルシウムイオンポンプＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）の結合阻害剤や、〔５〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーを有効成分とする、カルシウムイオンポンプＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）の活性増強剤や、〔６〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーを有効成分とする心筋の収縮及び弛緩機能増強剤や、〔７〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーを有効成分とする心不全治療及び予防薬や、〔８〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーを心不全治療及び予防薬を調製するために使用する方法からなる。

【発明の効果】

【0016】

本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーは、従来技術のホスホランバンＤＮＡアプタマーよりも安定性に優れ、さらに効果的にホスホランバンとＳＥＲＣＡの結合を阻害してＳＥＲＣＡを活性化することができ、心不全時の心筋細胞内Ｃａ^２＋動態を改善し、心筋の収縮及び弛緩機能を改善するため、心不全治療薬として使用することができる。また、本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーは心臓特異的に作用し、心拍数を変化させず、抗原性も低く、従来の強心薬のような副作用がないことから、心不全予防薬としても使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】心筋細胞内のＣａ^２＋シグナリング（Ａ）、並びに心筋細胞内におけるＰＬＮ及びＳＥＲＣＡのＣａ^２＋シグナリング制御（Ｂ）の概略を表す図である。

【図2】正常心臓（Ｉ）及び不全心臓（II）におけるＣａ^２＋シグナリングの概略を表す図である。

【図3】硫黄修飾アデノシンの構造と、ＳＥＬＥＸ法により同定したホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマー１９種類のＣａ^２＋依存性ＡＴＰａｓｅ活性（ＳＥＲＣＡ活性）への効果を示す図である。

【図4】ホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーが、ホスホランバン標的ＤＮＡアプタマーより、血中安定性に優れることを示す図である。

【図5】Ａｐｔ−ＲＮＡ−１９の心筋細胞のａ）細胞長、ｂ）収縮速度、ｃ）弛緩速度、ｄ）細胞内最大Ｃａ^２＋濃度、ｅ）細胞内Ｃａ^２＋低下の時定数、への効果を示す図である。各グラフにおける右の棒グラフのscrambは、スクランブルを表す。＊＊＊はｐ＞０．００１、＊＊はｐ＞０．０１、＊はｐ＞０．１（t-test）を表す。

【図6】Ａｐｔ−ＲＮＡ−１９の全長体（１−４０）、Ｎ末端１０塩基欠失体（１１−４０）、Ｃ末端１０塩基欠失体（１−３０）、Ｎ末端及びＣ末端１０塩基欠失体（１１−３０）それぞれのＳＥＲＣＡ活性への効果を示す図である。

【図7】Ａｐｔ−ＲＮＡ−３０の全長体（１−４０）、Ｎ末端１０塩基欠失体（１１−４０）、Ｃ末端１０塩基欠失体（１−３０）、Ｎ末端及びＣ末端１０塩基欠失体（１１−３０）それぞれのＳＥＲＣＡ活性への効果を示す図である。

【図8】Ａｐｔ−ＲＮＡ−１９のＮ末端及びＣ末端１０塩基欠失体（１１−３０）とホスホランバンの細胞内領域との結合を調べた結果を示す図である。

【図9】Ａｐｔ−ＲＮＡ−３０のＣ末端１０塩基欠失体（１−３０）とホスホランバンの細胞内領域との結合を調べた結果を示す図である。

【図10】Ａｐｔ−ＲＮＡ−１９のＮ末端及びＣ末端１０塩基欠失体（１１−３０）のＳＥＲＣＡ活性へのアプタマー量依存的効果を示す図である。

【図11】Ａｐｔ−ＲＮＡ−３０のＣ末端１０塩基欠失体（１−３０）のＳＥＲＣＡ活性へのアプタマー量依存的効果を示す図である。

【図12】Ａｐｔ−ＲＮＡ−３０のＣ末端１０塩基欠失体（１−３０）が、抗ホスホランバン抗体と同様に、ホスホランバンによるＳＥＲＣＡ抑制を解除し、ＳＥＲＣＡのＣａ^２＋感受性を増強することを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマー（以下、単に「標識ＲＮＡアプタマー」や「ホスホランバン修飾ＲＮＡアプタマー」ということもある。）は、心筋小胞体のＳＥＲＣＡに作用するホスホランバンに結合し、ホスホランバンによるＳＥＲＣＡ活性の抑制を解除する機能を有するものである。ホスホランバンは、心臓、骨格筋の遅筋及び平滑筋に存在する低分子タンパク質であり、例えば、アクセッション番号AAA60109、バージョンAAA60109.1、GI:190019に登録される５２個のアミノ酸からなるタンパク質を例示することができる。ホスホランバンの細胞質ドメインは、ホスホランバンとＣａ^２＋−ＡＴＰａｓｅとの機能的な結合にとって必須な領域であるとされている。心筋小胞体のＳＥＲＣＡの阻害因子であるホスホランバンは、ＳＥＲＣＡと結合することによりＳＥＲＣＡ活性を抑制し、必要に応じてＳＥＲＣＡから解離することによりＳＥＲＣＡを活性化する。心筋小胞体のＳＥＲＣＡが活性化されると、心筋小胞体へのＣａ^２＋輸送が増加し心筋弛緩が促進され、それに引き続く心筋収縮力が増強される。

【0019】

本発明の修飾ＲＮＡアプタマーは、ホスホランバンに特異的な結合性を有し、ＳＥＲＣＡからホスホランバンを解離させ、ＳＥＲＣＡ活性を促進することが出来る物質であり、ＳＥＬＥＸ法により得ることができる。本発明において「ホスホランバンに特異的な結合性を有する」とは、ホスホランバンをターゲットとしたＳＥＬＥＸ法により得ることができることや、化学架橋、ゲルシフトアッセイ、pull down法などの常法によりホスホランバンとの有意な結合を検出できることを意味する。本発明の修飾ＲＮＡアプタマーは、ホスホランバンのＳＥＲＣＡ活性の抑制機能を阻害することができることが好ましく、ホスホランバンの細胞質ドメイン、具体的には、アクセッション番号AAA60109、バージョンAAA60109.1、GI:190019に登録される５２個のアミノ酸からなるアミノ酸配列の１番目〜３２番目のアミノ酸や１番目〜２６番目のアミノ酸からなるタンパク質と特異的に結合することが好ましい。

【0020】

ＳＥＬＥＸ法とは、タンパク質などのターゲットに特異的に結合する物質を得るための操作法である。本発明で行うＳＥＬＥＸ法は、ランダム配列をもつＤＮＡ又はＲＮＡのプールの中からターゲットに結合する配列をもつものを選択し、ＰＣＲ（Polymerase chain reaction）法又はＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction：逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）法での増幅を行い、それにより得られた１本鎖ＤＮＡ又は転写したＲＮＡの中から再び結合する配列を選択する。このサイクルを繰り返すことによって結合する核酸の配列を収束させる。それぞれのサイクルにおいて、選択の際にタンパク質とＤＮＡ又はＲＮＡプールの濃度比、競合剤などの結合条件を厳しくすることにより、結合特異性の高い配列を得ることができる。

【0021】

本発明の修飾ＲＮＡアプタマーを得るためにＳＥＬＥＸ法で使用するターゲット物質として、ホスホランバンの細胞質ドメインの任意の領域を含むタンパク質を使用することができるが、ＳＥＬＥＸ法での精度を高めるために、かかるホスホランバン細胞質ドメインの領域の有するタンパク質に、リンカーを介してタグタンパク質など任意の適切なタンパク質が連結した融合タンパク質を用いることが望ましい。ホスホランバンの細胞質ドメインの任意の領域のアミノ酸配列としては、ホスホランバンタンパク質の第１番目のメチオニンから第３２番目のフェニルアラニンまでのアミノ酸配列や、第１番目のメチオニンから第２６番目のグルタミンまでのアミノ酸配列を挙げることができる。前記タグとしては、Ｍｙｃタグ、ヒスチジン（Ｈｉｓ_６）タグ、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｎｉタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、ＧＦＰタグ、ＥＧＦＰタグ等を挙げることができる。また、リンカーとしては、ホスホランバンの細胞質ドメインの任意の領域とタグタンパク質とを、それらの機能を阻害することなく互いに連結することができるものであればよい。また、前記リンカーはその融合タンパク質をＳＤＳ電気泳動で検出した場合に、かかる実験系において融合タンパク質を容易に確認できる程度の分子量を付加することができるリンカーであることが好ましい。かかるリンカーとしては、例えば、ＰＤＺなどを使用することができる。またこれらの細胞質ドメインの任意の領域、リンカー、タグ等は適宜任意の方法で連結することができ、適当なアミノ酸配列からなるペプチドを介して、又は架橋剤を用いて架橋することにより連結されていてもよく、その連結の順番も特に制限されない。

【0022】

本発明の修飾ＲＮＡアプタマーは、例えば、４０塩基のＤＮＡランダムライブラリーからＳＥＬＥＸ法で取得することができる。ＤＮＡランダムライブラリーは、それぞれ４種類のヌクレオチドをランダムに連結した４０塩基の１本鎖ＤＮＡを、例えば核酸合成用機器等を用いて化学的に合成して得られる。かかる１本鎖ＤＮＡを鋳型として１本鎖ＲＮＡを合成し、１本鎖ＲＮＡの両端にはＰＣＲで増幅するための配列を付加し、５’端にはＲＮＡポリメラーゼでＲＮＡを合成するための配列を付加する。かかるＲＮＡの合成には、ＤＮＡランダムライブラリーと修飾された核酸塩基（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）を用いて合成する。核酸塩基の修飾の種類や数、修飾された核酸塩基の種類や数、修飾部位等は、修飾ＲＮＡアプタマーがホスホランバンへの特異的結合能を有する限り特に制限されず、好ましくは硫黄修飾されたＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰを用いた合成、さらに好ましくは硫黄修飾のＡＴＰアナログであるdenosin-5’-O- (1-thiotriphosphate), Sp-isomerと、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰを用いた合成を挙げることができる。また、他の修飾がさらに１又は２種類以上組み合わされてもよく、核酸塩基における修飾の部位や数も特に制限されず、核酸塩基１分子に対して１箇所、あるいは２箇所以上が一種類の又は複数の種類の修飾をうけていてもよい。このような修飾された核酸塩基を用いる目的は、合成した修飾ＲＮＡの安定性の向上や、安全性等である。中でも、修飾ＲＮＡが血中で少なくとも２４時間以上安定であり、血中で２４時間経過後に、測定開始時の７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の量の修飾ＲＮＡが存在することが好ましい。前記血中安定性を向上させる修飾としては、硫黄修飾を好適に例示することができ、硫黄修飾のＡＴＰアナログ（例えばＡＴＰ−α−Ｓ、denosin-5’-O- (1-thiotriphosphate), Sp-isomer）、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰを用いた修飾ＲＮＡの合成を好適に例示することができる。合成した修飾ＲＮＡは、ビーズに固相化したホスホランバンの細胞質ドメインを含まない組み換え融合タンパク質（コントロール融合タンパク質）と混合し、非特異的に結合するＲＮＡを除く。コントロール融合タンパク質に結合しなかったＲＮＡをホスホランバンの細胞質ドメインを含む組み換え融合タンパク質を固相化したビーズと混合する。洗浄後、結合したＲＮＡを溶出、回収する。回収されたＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction：逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）に供し、２本鎖ＤＮＡを増幅し、これを鋳型に修飾ＲＮＡを合成する。これらの修飾ＲＮＡをもとに、前述のコントロール融合タンパク質による非特異的結合の除去、融合タンパク質への結合、ＲＴ−ＰＣＲによる増幅、ＲＮＡ合成のサイクルを繰り返す。ＰＣＲ法による増幅サイクルは７〜２０サイクル行うが、好ましくは９〜１５サイクル行う。

【0023】

上記ＲＴ−ＰＣＲで増幅した２本鎖ＤＮＡは、クローニング・ベクターに挿入し、そのＤＮＡ（アプタマー）の配列を決定する。かかるシークエンシングは、ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer（Applied biosystems社製）などの自動シークエンシング装置などを用いて行うことができる。得られた配列から、ＳＥＬＥＸ法実施の際と同じ修飾のＲＮＡを合成し、修飾ＲＮＡアプタマーを得ることができる。ホスホランバンの細胞質ドメインを含む組み換え融合タンパク質への、ホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーの結合能は、担体に結合したホスホランバンの細胞質ドメインを含む組み換え融合タンパク質に結合した修飾ＲＮＡアプタマーを検出することにより調べることができる。修飾ＲＮＡアプタマーの検出は、アプタマーの５’または３’端にビオチンを付加し、酵素標識したアビジンを用いて、結合したビオチン標識アプタマーを定量することにより求めることができる。

【0024】

本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーは、ホスホランバンによるＳＥＲＣＡ活性の抑制を解除することができ、かかる効果はＳＥＲＣＡ活性を測定することにより確認することができる。ＳＥＲＣＡ活性は、佐々木らの方法（Sasaki, T. et al., J. Biol. Chem. 267: 1674-1679 (1992)）でＣａ^２＋依存性ＡＴＰａｓｅ活性を測定することにより調べることができる。すなわち、イヌ心臓から調製した心筋小胞体濾胞におけるＳＥＲＣＡ活性（Ｃａ^２＋依存性ＡＴＰａｓｅ活性）を、修飾ＲＮＡアプタマー存在下及び非存在下で調べ比較することによって、修飾ＲＮＡアプタマーの効果を求めることができる。すなわち、修飾ＲＮＡアプタマー存在下及び非存在下におけるＳＥＲＣＡ活性比を求めることにより、修飾ＲＮＡアプタマーのＳＥＲＣＡ活性への効果の程度を知ることができる。また、コントロールとしてホスホランバンが存在しないウサギ骨格筋の筋小胞体濾胞におけるＳＥＲＣＡ活性を合わせて調べることもできる。骨格筋の筋小胞体濾胞においては、ホスホランバンが存在せず、ホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーによってＳＥＲＣＡ活性が変化しないことから、心筋小胞体濾胞と筋小胞体濾胞におけるＳＥＲＣＡ活性の比を求め、修飾ＲＮＡアプタマーのＳＥＲＣＡ活性への効果の程度を測定することもできる。

【0025】

本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーとしては、配列番号１〜２０、好ましくは配列番号１〜１３、１５〜２０の塩基配列からなる修飾ＲＮＡを具体的に例示することができ、中でもアデニンが硫黄により修飾された修飾ＲＮＡ、具体的にはAdenosin-5’-O-(1-thiotriphosphate), Sp-isomer、ＧＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰを用いて合成されたホスホランバン標的修飾ＲＮＡが好ましい。また、本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーは、ホスホランバンへの特異的結合能を有する限り、これらの修飾ＲＮＡに限定されるものではなく、置換、欠失、付加等の変異等を含むものでもよい。例えば、配列番号１〜１３、１５〜２０のいずれかで示される塩基配列のＮ末端側あるいはＣ末端側、又はＮ末端側及びＣ末端側が全体の０〜６０％欠失した塩基配列を挙げることができ、配列番号１〜１３、１５〜２０のいずれかで示される塩基配列のＮ末端側あるいはＣ末端側、又はＮ末端側及びＣ末端側が全体の長さの０〜６５％、好ましくは０〜５０％、好ましくは０〜４０％以上、好ましくは０〜３０％以上、好ましくは０〜２０％以上、さらに好ましくは０〜１０％が欠失した塩基配列を挙げることができる。例えば、配列番号１０又は配列番号２０の４０塩基からなる修飾ＲＮＡアプタマー（それぞれＡｐｔ−ＲＮＡ−１９又はＡｐｔ−ＲＮＡ−３０ともいう。）について、Ｎ末端側又はＣ末端側の１０塩基、すなわち全体の長さの２５％を欠失した塩基配列を挙げることができる。また、Ａｐｔ−ＲＮＡ−１９（配列番号１０）又はＡｐｔ−ＲＮＡ−３０（配列番号２０）の４０塩基からなる修飾ＲＮＡアプタマーについて、Ｎ末端側の１０塩基及びＣ末端側の１０塩基、すなわち全体の長さの５０％を欠失した塩基配列を挙げることができる。また、これらの塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列や、相同性が９０％以上である塩基配列を例示することができる。

【0026】

本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーは、ホスホランバンと結合し、ＳＥＲＣＡとホスホランバンの結合を阻害する機能を有することから、ホスホランバンとＳＥＲＣＡの結合阻害剤として用いることができる。また、かかるＳＥＲＣＡとホスホランバンの結合阻害により、ＳＥＲＣＡの活性を増強することができることから、本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーはＳＥＲＣＡの活性増強剤として用いることができる。さらに、ＳＥＲＣＡの活性が増強されると心筋の収縮及び弛緩機能が増強されることから、本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーは心筋の収縮及び弛緩機能増強剤として用いることができる。かかる心筋の収縮及び弛緩機能の増強によって、心不全を予防又は治療することができ、本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーは心不全治療又は予防薬として用いることができる。本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーは心臓特異的な作用であり、心拍数増加（頻脈）を引き起こさず、心筋細胞外から細胞内へのＣａ^２＋流入増加を伴わず心筋の収縮及び弛緩を促進しうることから、副作用が少なく、心不全の治療だけでなく、予防にも好適に利用することができる。さらに、本発明は、ホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーを、心不全治療及び予防薬を調製するために使用する方法を含む。

【0027】

本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーを有効成分とする、ＳＥＲＣＡの結合阻害剤や、ＳＥＲＣＡの活性増強剤や、心筋の収縮及び弛緩機能増強剤や、心不全治療又は予防薬（以下「本発明の修飾ＲＮＡアプタマーを有効成分とする剤」ともいう）は、ホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーを有効成分としていればよく、製剤化のために通常使用され薬学的に許容される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、着色剤、香味剤、緩衝剤等の添加物を含んでいてもよい。また、これら本発明の修飾ＲＮＡアプタマーを有効成分とする剤は、他の薬剤やサプリメント、治療薬を含有してもよく、また他の薬剤やサプリメント、治療薬と併用してもよい。本発明の修飾ＲＮＡアプタマーを心不全治療又は予防薬として用いる場合は、他の心不全治療薬や他の薬剤、サプリメント等と併用してもよく、手術等を併用してもよい。本発明の修飾ＲＮＡアプタマーを有効成分とする剤はその作用機序がβ１受容体やｃＡＭＰシグナルと関係がないため、β受容体遮断薬、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、アンギオテンシンII受容体遮断薬や、高血圧治療薬、不整脈治療薬、利尿薬等との併用が可能であり、併用によって修飾ＲＮＡアプタマーの効果を増強し、高い治療及び予防効果が得られると考えられる。また、本発明の修飾ＲＮＡアプタマーを有効成分とする剤は、細胞、組織、生体に投与することができ、その投与方法や投与形態、投与量は適宜選択することができる。また投与対象の細胞、組織の由来や生体は特に制限されず、好ましくは哺乳類であり、例えばヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ハムスターなどを例示することができ、好ましくはヒトを挙げることができる。投与方法としては、例えば、細胞内導入剤、細胞培養液や組織保存液等に添加することにより、細胞や組織に投与することができる。生体に投与する場合は、経口投与のほか、注射や点滴、塗布、坐剤、鼻腔内スプレー等による非経口投与とすることもでき、適宜任意の形態に製剤することができる。この場合、製剤化のために通常使用される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、着色剤、香味剤、緩衝剤等の添加物を使用することができる。

【0028】

本発明の修飾ＲＮＡアプタマーを有効成分とする心不全治療及び予防薬は、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、丸剤、トローチ錠などの固体形態、あるいは、坐剤、軟膏などの半固体形態、注射剤、乳剤、懸濁液、ローション、スプレーなどの液体形態などの製剤形態として製剤化することができる。これらの製剤形態では、剤形に好ましい、製剤上許容される添加物を用いうるが、例えば、乳糖、ブドウ糖、乳糖、果糖、マルトース、炭酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸アルキルエステル、シロップ、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、ワセリン、又は硬質油のような脂質成分、塩化ナトリウム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウム、クエン酸等が挙げられる。

【0029】

本発明の心不全治療又は予防薬の投与量は特に制限されず、被検者や被検動物の体調、病状、体重、年齢、性別等によって適宜調整することができ、例えば一日あたり、０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１μｇ〜１０ｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは１μｇ〜１ｇ／ｋｇ体重を投与することができる。本発明の心不全治療又は予防薬の投与回数や投与期間等も特に制限されず、１日あたりの投与量を１日１回又は数回に分けて投与することもできる。本発明の心不全治療又は予防薬におけるホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーの含有割合はその剤形に応じて異なるが、一般に固体及び半固体形態の場合には０．０１〜１０重量％の濃度で、液体形態の場合には０．００１〜１重量％の濃度で含有していることが望ましい。

【0030】

以下、本発明をさらに詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。

【実施例1】

【0031】

＜ＳＥＬＥＸ法によるホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーの選択＞
ホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーの選択は、以下の方法で行った。ホスホランバンの１〜３２番目のアミノ酸配列からなるタンパク質にＰＤＺドメイン、Ｍｙｃタグ、ヒスチジンタグタンパク質を順次連結したＰＬＮ^１−３２−ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ_６又は、ＰＤＺドメイン、Ｍｙｃタグ、ヒスチジンタグタンパク質が順次連結したＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ_６融合タンパク質の調製は、Kimuraらの方法（Kimura,Y.et al.,Mol.Pharmacol.61:667-673,2002）で行った。ＰＬＮ^１−３２−ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ_６又は、ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ_６を結合したＮｉ−ＮＴＡビーズの調製は、Ｎｉ−ＮＴＡビーズをＰＢＳ−Ｔ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸バッファー溶液）で平衡化した後に、５μｌのビーズにＰＬＮ^１−３２−ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ_６又は、ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ_６ １０μｇを含むＰＢＳ−Ｔ ２００μｌを加え、４℃で３０分間振とうした。反応させたビーズは、ＰＢＳ−Ｔ １ｍｌで３回洗浄した。１本鎖ＲＮＡライブラリーとしては、４０塩基の混合配列の５’端と３’にそれぞれＴ７プロモーターとＰＣＲ増幅用配列を含む配列Ｐ１（配列番号２１）とＰＣＲ増幅用のＰ２（配列番号２２）を付加した８０塩基の２本鎖ＤＮＡを合成し、これを鋳型にT7 RNA polymeraseを用いて１本鎖修飾ＲＮＡを合成した。かかるＲＮＡは、硫黄修飾ＡＴＰ（Adenosin-5’-O-(1-thiotriphosphate), Sp-isomer）、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰを使用して合成した。１ｎｍｏｌの１本鎖修飾ＲＮＡライブラリーをＰＢＳ−Ｔ １００μｌ中９８℃で３分間変性させ、直ちに４℃で冷却した。第１回目の選択では、１本鎖ＲＮＡライブラリーをＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ_６結合Ｎｉ−ＮＴＡビーズ ５μｌとＢＳＡ １μｇ／ｍｌを含むＰＢＳ−Ｔ １０ｍｌへ添加した。室温で３０分間振とうした後、混合物を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その上清をＰＬＮ^１−３２−ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ_６結合Ｎｉ−ＮＴＡビーズ ５μｌと、室温で３０分間混合した。ビーズは、ＰＢＳ−Ｔ １ｍｌで３回洗浄した。タンパク質に結合した修飾ＲＮＡアプタマーは、０．５Ｍのイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）５０μｌに溶出した。溶出液は、フェノール−クロロホルム混合液で抽出し、１本鎖修飾ＲＮＡをエタノールで沈殿させた。７０％のエタノールで洗浄した後、１本鎖修飾ＲＮＡは、２×ＲＴ−ＰＣＲ反応液 ２５μｌ、１０ｐｍｏｌのＰ１プライマー（配列番号２１）とＰ２プライマー（配列番号２２）、RT/Platina Taq polymerase（Invitrogen社製）１μｌを含むＰＣＲ混合液５０μｌに溶解した。５０℃で２０分間反応させた後、９５℃で２分間変性させた。９５℃で３０秒間の熱変性、５０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応を２５サイクルのＰＣＲ反応を行い、２本鎖ＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物の一部を４％アガロースゲルで電気泳動し、正しい長さの２本鎖ＤＮＡが増幅されていることを確認した。かかる２本鎖ＤＮＡを鋳型に、５×反応液 ２０μｌ、硫黄修飾ＡＴＰ（Adenosin-5’-O-(1-thiotriphosphate), Sp-isomer）、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ（各５ｍＭ）、T7 RNA polymerase（プロメガ社製）を含む反応液（１００μｌ）を調整し、３７℃で２時間反応を行った。さらに、５unitsのRNase-free DNaseを加え３７℃で１５分間反応させ鋳型ＤＮＡを除いた。

【0032】

かかる１本鎖修飾ＲＮＡの一部を４％アガロースゲルで電気泳動し、正しい長さの修飾ＲＮＡが得られていることを確認した。マイクロバイオスピンカラム（バイオラッド社製）で精製した１本鎖ＲＮＡは、エタノールで沈殿させ、７０％のエタノールで洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ １００μｌに溶解した。この１本鎖修飾ＲＮＡを用いて２回目以降のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーの選択も１回目の選択と同様に行ったが、２回目以降の選択ではＮｉ−ＮＴＡビーズに結合したＰＬＮ^１−３２−ＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ_６の量をビーズ５μｌ当たり５μｇとした。

【0033】

９回目の選択を行った後、得られた１本鎖修飾ＲＮＡは、Ｐ１プライマー（配列番号２１）とＰ２プライマー（配列番号２２）を使ってＰＣＲで増幅した。ＰＣＲで得られた２本鎖ＤＮＡは、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen社製）へ挿入、大腸菌（ＴＯＰ１０：Invitrogen社製）へ導入して形質転換した。生育した大腸菌のコロニーから任意に４５個のコロニーを選び、大腸菌からプラスミドを精製した。精製したプラスミドからＴ７プロモーターとＭ１３逆転写プライマーを使用して、挿入したＤＮＡ配列を決定し、アプタマーのＤＮＡ配列を決定した。その結果、２０種類のＤＮＡアプタマーが得られた。２０種類の配列は、表１の通りであった。

【0034】

【表1】

【実施例2】

【0035】

＜ホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーの心筋小胞体ＳＥＲＣＡ活性への効果＞
イヌの心臓より調製した心筋小胞体濾胞（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を、２０ｍＭのイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ６．９）、１００ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、５ｍＭのＮａＮ_３、０．１ｍＭのＡＴＰ、０．３５μＭ Ｃａ^２＋（Ｃａ−ＥＧＴＡ buffer：０．５ｍＭのＣａＣｌ_２と１．３ｍＭのＥＧＴＡ）を含む反応液５０μｌに懸濁し、合成した配列番号１〜７及び配列番号９〜２０で示される塩基配列からなる１９種類のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマー（１μＭ）のいずれか１種類の存在下及び非存在下で、３７℃で４分間のＡＴＰａｓｅ活性を測定した。活性測定は、佐々木らの方法（Sasaki, T. et al., J. Biol. Chem. 267: 1674-1679 (1992)）を用いた。０．３５μＭ Ｃａ^２＋の代わりに２ｍＭのＥＧＴＡを加えたＣａ^２＋非存在下でも同様にＡＴＰａｓｅ活性を測定し、両者の量からＣａ^２＋依存性ＡＴＰａｓｅ活性（ＳＥＲＣＡ活性）を求めた。アプタマーのＳＥＲＣＡ活性への効果を見るために、アプタマー存在下と非存在下でのＳＥＲＣＡ活性の比を求めた。

【0036】

心筋小胞体１９種類のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーの存在下と非存在下でのＳＥＲＣＡ活性の比を求めた結果を図３に示す。縦軸は、アプタマーによるＳＥＲＣＡ活性の促進の程度をあらわす。アプタマーＮｏ．２４（Ａｐｔ−２４、配列番号１４）を除く１８種類のアプタマーで心筋小胞体のＳＥＲＣＡ活性が有意に促進されていた。これらの結果は、ホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーがホスホランバンに作用してＳＥＲＣＡに対する抑制を解除しＳＥＲＣＡ活性を促進していることを示す。データは、３−５回の測定の平均値と標準偏差を示す。

【実施例3】

【0037】

＜ホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーの血中安定性＞
本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーの血中安定性を調べるために、以下の実験を行った。ヒトの血清１ｍｌに、配列番号２３で示される塩基配列からなるホスホランバン標的ＤＮＡアプタマー（Ａｐｔ−ＤＮＡ−９）又はＡｐｔ−ＲＮＡ−１９（１１−３０）ホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーを２０μｇ添加し、３７℃で０、１、２、３、６、１２、又は２４時間インキュベートした。各サンプルをエタノール沈殿による濃縮後、アガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドにより染色した（図４）。Ａｐｔ−ＤＮＡ−９（１１−３０）がインキュベーション３時間から分解しはじめ、１２時間後にはほぼ完全に分解したのに対し、Ａｐｔ−ＲＮＡ−１９は２４時間後においても、インキュベーション開始時とほぼ同程度の量が分解されずに残っていることが示された。すなわち、本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーは、ホスホランバンＤＮＡアプタマーよりも血中安定性に優れており、体内に投与した場合に長時間分解されないためより効果が高いと考えられる。

【実施例4】

【0038】

＜ホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーの心筋細胞への効果＞
本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーの心筋細胞への効果を調べるために、以下の実験を行った。ラット成獣より心筋細胞を調製し、ホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーＡｐｔ−ＲＮＡ−１９（１１−３０）又はスクランブルの修飾ＲＮＡを細胞内導入試薬N-Ter（シグマ社製）と共に心筋細胞に添加した。５％ＣＯ_２、３７℃にて４時間培養した。スクランブルの修飾ＲＮＡは、Ａｐｔ−ＲＮＡ−１９と同じ４０塩基の修飾ＲＮＡからなり、塩基組成が同じでありながら塩基配列がランダムな塩基の並びからなる、ネガティブコントロールである。
細胞長の変化とFura-2を用いた細胞内Ｃａ^２＋濃度変化は、Iwanagaらの方法（Iwanaga, Y. et al. J. Clin. Invest. 113: 727-736 (2004)）により測定した。顕微鏡を用いた細胞長の測定結果を図５のａ−ｃに示す。Ａｐｔ−ＲＮＡ−１９（１１−３０）添加により、細胞長の短縮率（図５のａ）と収縮速度（図５のｂ）が有意に増加した。すなわち、Ａｐｔ−ＲＮＡ−１９添加により細胞収縮能が向上したことが示された。また、図５のｃに示すようにＡｐｔ−ＲＮＡ−１９（１１−３０）添加により、細胞弛緩速度が有意に増加し、Ａｐｔ−ＲＮＡ−１９（１１−３０）により細胞弛緩能が向上したことが示された。
蛍光顕微鏡による心筋細胞内Ｃａ^２＋濃度測定の結果を図５のｄ及びｅに示す。Ａｐｔ−ＲＮＡ−１９（１１−３０）添加により、細胞内最大Ｃａ^２＋濃度が有意に増加した（図５のｄ）。すなわち、Ａｐｔ−ＲＮＡ−１９による収縮力増大に対応した細胞内Ｃａ^２＋の増加が認められた。また、心筋細胞内Ｃａ^２＋濃度低下の時定数を測定した結果、Ａｐｔ−ＲＮＡ−１９（１１−３０）添加により、細胞内Ｃａ^２＋濃度低下の時定数への効果が有意に減少した（図５のｅ）。すなわち、Ａｐｔ−ＲＮＡ−１９（１１−３０）によりＳＥＲＣＡが活性化された結果、細胞内Ｃａ^２＋低下が速やかに行われ心筋細胞の弛緩能が亢進していることを示す。
これらの結果から、本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーは心筋細胞の収縮、弛緩能を増強し、また速やかかつ効果的な細胞内Ｃａ^２＋濃度変化に効果を有することが示された。

【実施例5】

【0039】

＜ホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーの長さについての検証＞
本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーの心筋細胞への効果に必要な長さを調べるために、以下の実験を行った。Ａｐｔ−ＲＮＡ−１９（配列番号１０）又はＡｐｔ−ＲＮＡ−３０（配列番号２０）について、全長（１−４０）、Ｎ末端側１０塩基欠失体（１１−４０）、Ｃ末端側１０塩基欠失体（１−３０）及びＮ末端及びＣ末端側１０塩基欠失体（１１−３０）を作製した。これらのアプタマーフラグメント０．１μＭ又は１μＭによるＳＥＲＣＡ活性化への効果を実施例２と同様の方法で調べた。その結果、Ａｐｔ−ＲＮＡ−１９はいずれのフラグメントも全長体と同程度のＳＥＲＣＡ活性化効果を有することが示された（図６）。また、Ａｐｔ−ＲＮＡ−３０は１１−３０フラグメントのＳＥＲＣＡ活性化効果が少々低かったものの、１１−４０フラグメント及び１−３０フラグメントは、全長よりも高いＳＥＲＣＡ活性化効果を有することが示された（図７）。したがって、本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーはＮ末端側又はＣ末端側が欠失したフラグメントの形であっても、４０塩基のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーと遜色なく高いＳＥＲＣＡ活性化効果を有することが示された。

【実施例6】

【0040】

＜ホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーとホスホランバン細胞質領域との結合＞
ビオチンでラベルした本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーとホスホランバン細胞質領域との結合を以下の方法で調べた。実施例１と同様の方法で作製した１０μｇのＰＤＺ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ_６結合Ｎｉ−ＮＴＡビーズと各濃度段階のＡｐｔ−ＲＮＡ−１９（１１−３０）又はＡｐｔ−ＲＮＡ−３０（１−３０）とを０．１％ Triton X-100と０．１ｍｇ／ｍｌを含むＰＢＳ中で室温、３０分間反応させ、結合させた。同液で洗浄後、ＨＲＰでラベルしたアビジンを結合させた。ＨＲＰの発色によりビオチンでラベルしたホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーの結合量を測定した。結果を図８及び図９に示す。ホスホランバン細胞質領域とホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーは、修飾ＲＮＡアプタマー濃度依存的に結合量が増加した。ホスホランバン細胞質領域とＡｐｔ−ＲＮＡ−３０（１１−３０）解離定数Ｋ_ｄは２７ｎＭ、ホスホランバン細胞質領域とＡｐｔ−ＲＮＡ−３０（１−３０）の解離定数Ｋ_ｄは１１ｎＭであった。

【実施例7】

【0041】

＜ホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーのＳＥＲＣＡ活性への効果＞
イヌの心臓より調製した心筋小胞体濾胞（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）に、各濃度段階のＡｐｔ−ＲＮＡ−１９（１１−３０）を加え、０．３５μＭのＣａ^２＋存在下で実施例２と同様の方法でＳＥＲＣＡ活性を測定した。同様に各濃度段階のＡｐｔ−ＲＮＡ−３０（１−３０）を加え、０．３５μＭのＣａ^２＋存在下で実施例２と同様の方法でＳＥＲＣＡ活性を測定した。結果を図１０及び図１１に示す。本発明の修飾ＲＮＡアプタマー濃度依存的にＳＥＲＣＡ活性が増加し、Ａｐｔ−ＲＮＡ−１９（１１−３０）のＥＣ_５０は０．３１μＭ、Ａｐｔ−ＲＮＡ−３０（１−３０）のＥＣ_５０は１８ｎＭであった。また、本発明者らが既に得ているホスホランバンＤＮＡアプタマー（Ｎｏ．９、配列番号２３；特開２００９−１８９２９２号公報参照）のＥＣ_５０は３．２μＭであったことから、本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーは濃度依存的にＳＥＲＣＡ活性を増強し、さらにいずれの濃度においても本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーは、ホスホランバンＤＮＡアプタマーよりもＳＥＲＣＡ活性を増強する効果が高いことが示された。

【実施例8】

【0042】

＜ホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーのＳＥＲＣＡ活性への効果＞
カルシウム依存的ＳＥＲＣＡ活性への本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーの作用メカニズムを調べるために、以下の実験を行った。イヌの心臓より調製した心筋小胞体濾胞（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）に、ＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ）（コントロール）又は合成したＡｐｔ−ＲＮＡ−３０（１−３０）を２μＭ、又は抗ホスホランバン抗体（ｍＡｂ−Ａ１、Kimura, Y. et al. J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 1223-1230 (1991)）を２５μｇ／ｍｌ添加したサンプルを調整した。各サンプルについて、種々のＣａ^２＋濃度段階におけるＳＥＲＣＡ活性を実施例２と同様の方法にて調べた。ＳＥＲＣＡ活性のＣａ^２＋濃度依存性は、最大のＳＥＲＣＡ活性を１００％としたパーセント表示で示した。結果を図１２に示す。

【0043】

ＳＥＲＣＡはＣａ^２＋依存性酵素であるが、心筋小胞体等のホスホランバン存在下では、Ｃａ^２＋感受性が低下したコントロール（黒丸）の様なＣａ^２＋濃度依存性曲線を示す。しかし、抗ホスホランバン抗体（ｍＡｂ−Ａ１）存在下では、抗ホスホランバン抗体がホスホランバンに結合することにより、ホスホランバンとＳＥＲＣＡの結合が阻害され、ＳＥＲＣＡ抑制がはずれてＳＥＲＣＡのＣａ^２＋感受性が増加し、図１２で示されるようなＣａ^２＋濃度依存性曲線となる。ホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーサンプル（白丸）でも、抗ホスホランバン抗体サンプル（黒三角）と同様に、ＳＥＲＣＡのＣａ^２＋感受性の増加が示された。すなわち、本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーは、抗ホスホランバン抗体と同程度のＳＥＲＣＡ抑制解除能を有し、したがって本発明のホスホランバン標的修飾ＲＮＡアプタマーはホスホランバンに作用することによりＳＥＲＣＡのＣａ^２＋感受性を増強することが示された。

【産業上の利用可能性】

【0044】

本発明は、心不全治療及び予防薬の分野や、心筋の収縮及び弛緩機能増強、ホスホランバンとＳＥＲＣＡの結合阻害やＳＥＲＣＡの活性増強にかかわる研究開発分野等において有用である。本発明は治療困難な重症の心不全患者に新たな予防及び治療手段を提供するものであり、その産業上の利用価値は極めて大きい。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]