特許 6042211 ポリペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6042211

(24)【登録日】2016年11月18日

(45)【発行日】2016年12月14日

(54)【発明の名称】ポリペプチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20161206BHJP

   C07K 2/00 20060101ALI20161206BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20161206BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20161206BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20161206BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20161206BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   C07K2/00ZNA

   C07K14/47

   A61P35/00

   A61K37/02

   A61K48/00

【請求項の数】19

【全頁数】40

(21)【出願番号】特願2012-553234(P2012-553234)

(86)(22)【出願日】2011年2月15日

(65)【公表番号】特表2013-519385(P2013-519385A)

(43)【公表日】2013年5月30日

(86)【国際出願番号】EP2011000980

(87)【国際公開番号】WO2011101173

(87)【国際公開日】20110825

【審査請求日】2014年1月27日

(31)【優先権主張番号】10250265.5

(32)【優先日】2010年2月16日

(33)【優先権主張国】EP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】516070210

【氏名又は名称】ウルティモバックス エーエス

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】ガウダーナック，ガスタフ

(72)【発明者】

【氏名】ラスムセン，アン−マリー

(72)【発明者】

【氏名】スソ，エルス，マリット，インダーベルグ

【審査官】 市島 洋介

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第０３／０３８０４７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００２−５２０２９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Nucleic Acids Res.，２００９年１２月３０日，Vol.38, No.6，pp.1982-1996，電子版

【文献】 J. Vet. Med. Sci.，２００３年，Vol.65, No.5，pp.573-577

【文献】 Database DDBJ/EMBL/GeneBank [online]，Accession No. AB094676，<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ab094676>, 26-JUN-2003, Yazawa, M. et al., DEFINITION: Felis catus mRNA for telomerase reverse transcriptase (TERT), partial cds.

【文献】 Database DDBJ/EMBL/GeneBank [online]，Accession No. AB094677，<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/40316435?sat=34&satkey=5721024>, 23-DEC-2003, Yazawa, M. et al., DEFINITION: Canis familiaris mRNA for telomerase reverse transcriptase (TERT), partial cds.

【文献】 Cancer Immunol. Immunother.，２００６年，Vol.55，pp.1553-1564

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ポリペプチドであって、
ｉ）配列番号：２；
ｉｉ）少なくとも８個のアミノ酸を含むｉ）の免疫原性断片の配列であって、該免疫原性断片が配列番号：６又は１１〜１６のいずれでもない配列；又は
ｉｉｉ）ｉ）又はｉｉ）と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列、から選択される配列を含み、
前記ポリペプチドの長さがアミノ酸１００個未満であり、かつ前記ポリペプチドが配列番号：１０、４６、５６、５７又は５９〜６２のいずれの配列も含まず、かつ配列番号：５８の配列からなるものではない、ポリペプチド。

【請求項2】

前記ポリペプチドが、
ｉ）配列番号：１；
ｉｉ）少なくとも８個のアミノ酸を含むｉ）の免疫原性断片の配列であって、該免疫原性断片が配列番号：６、１１〜１６又は５６のいずれでもない配列；及び
ｉｉｉ）ｉ）又はｉｉ）と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列、から選択される配列を含み、
前記ポリペプチドの長さがアミノ酸１００個未満であり、かつ配列番号：５８の配列からなるものではない、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

前記免疫原性断片が、配列番号：２０、２３、２４、２６、２８〜３０、３２、３６、３７及び３９のいずれか１つの配列を有する、請求項１又は２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

前記ポリペプチドの長さが、アミノ酸８０個、５０個、３０個、２０個又は１１個以下である、請求項１から３のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項5】

請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子。

【請求項6】

少なくとも第１及び第２の異なるポリペプチドを含むポリペプチドカクテルであって、
前記第１のポリペプチドが請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドであり、
前記第２のポリペプチドが、
ｉ）配列番号：２〜７；
ｉｉ）少なくとも８個のアミノ酸を含むｉ）の免疫原性断片の配列；及び
ｉｉｉ）ｉ）又はｉｉ）と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列、
からなる群から選択される配列を含み、
前記各ポリペプチドの長さが、アミノ酸１００個未満である、ポリペプチドカクテル。

【請求項7】

少なくとも１つのポリペプチドが、
ｉ）配列番号：１、７、８、９又は１０；
ｉｉ）少なくとも８個のアミノ酸を含むｉ）の免疫原性断片の配列；及び
ｉｉｉ）ｉ）又はｉｉ）と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列、
からなる群から選択される配列を含み、
前記ポリペプチドの長さが、アミノ酸１００個未満である、請求項６に記載のポリペプチドカクテル。

【請求項8】

前記少なくとも第１及び第２の異なるポリペプチドが、
ｉ）配列番号：１の配列又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含むその免疫原性断片を含むポリペプチドと、配列番号：７の配列又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含むその免疫原性断片を含むポリペプチドと、配列番号：９の配列又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含むその免疫原性断片を含むポリペプチドとのカクテル；
ｉｉ）配列番号：１の配列又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含むその免疫原性断片を含むポリペプチドと、配列番号：８の配列又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含むその免疫原性断片を含むポリペプチドと、配列番号：９の配列又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含むその免疫原性断片を含むポリペプチドとのカクテル；及び
ｉｉｉ）配列番号：１の配列又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含むその免疫原性断片を含むポリペプチドと、配列番号：８の配列又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含むその免疫原性断片を含むポリペプチドと、配列番号：１０の配列又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含むその免疫原性断片を含むポリペプチドとのカクテル、
からなる群から選択されるポリペプチドカクテルを含み、
前記各ポリペプチドの長さが、アミノ酸１００個未満である、請求項６又は７に記載のポリペプチドカクテル。

【請求項9】

前記第２のポリペプチドの前記各免疫原性断片が、配列番号：１７〜４０のいずれか１つの配列を有する、請求項６〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドカクテル。

【請求項10】

少なくとも第１及び第２の異なる核酸分子を含む核酸分子カクテルであって、
前記第１の核酸分子が請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列からなり、
前記第２の核酸分子が、
ｉ）配列番号：２〜７；
ｉｉ）少なくとも８個のアミノ酸を含むｉ）の免疫原性断片の配列；及び
ｉｉｉ）ｉ）又はｉｉ）と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列、
からなる群から選択される配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列からなり、
前記ポリペプチドの長さが、アミノ酸１００個未満である、核酸分子カクテル。

【請求項11】

少なくとも１つの前記第１及び第２の核酸分子が、
ｉ）配列番号：１、７、８、９又は１０；
ｉｉ）少なくとも８個のアミノ酸を含むｉ）の免疫原性断片の配列；及び
ｉｉｉ）ｉ）又はｉｉ）と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列、
からなる群から選択される配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列からなり、
前記ポリペプチドの長さが、アミノ酸１００個未満である、請求項１０に記載の核酸分子カクテル。

【請求項12】

前記少なくとも第１及び第２の異なる核酸分子が、
ｉ）配列番号：１で表される第一配列又は第一配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する第二配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含む第一配列又は第二配列の免疫原性断片を含むポリペプチドをコードする核酸配列からなる核酸分子と、配列番号：７で表される第一配列又は第一配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する第二配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含む第一配列又は第二配列の免疫原性断片を含むポリペプチドをコードする核酸配列からなる核酸分子と、配列番号：９で表される第一配列又は第一配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する第二配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含む第一配列又は第二配列の免疫原性断片を含むポリペプチドをコードする核酸配列からなる核酸分子とのカクテル；
ｉｉ）配列番号：１で表される第一配列又は第一配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する第二配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含む第一配列又は第二配列の免疫原性断片を含むポリペプチドをコードする核酸配列からなる核酸分子と、配列番号：８で表される第一配列又は第一配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する第二配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含む第一配列又は第二配列の免疫原性断片を含むポリペプチドをコードする核酸配列からなる核酸分子と、配列番号：９で表される第一配列又は第一配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する第二配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含む第一配列又は第二配列の免疫原性断片を含むポリペプチドをコードする核酸配列からなる核酸分子とのカクテル；及び
ｉｉｉ）配列番号：１で表される第一配列又は第一配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する第二配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含む第一配列又は第二配列の免疫原性断片を含むポリペプチドをコードする核酸配列からなる核酸分子と、配列番号：８で表される第一配列又は第一配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する第二配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含む第一配列又は第二配列の免疫原性断片を含むポリペプチドをコードする核酸配列からなる核酸分子と、配列番号：１０で表される第一配列又は第一配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する第二配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含む第一配列又は第二配列の免疫原性断片を含むポリペプチドをコードする核酸配列からなる核酸分子とのカクテル、
からなる群から選択される核酸分子カクテルを含み、
各ポリペプチドの長さが、アミノ酸１００個未満である、請求項１０又は１１に記載の核酸分子カクテル。

【請求項13】

前記第２の核酸分子の核酸配列によりコードされる前記ポリペプチドの前記各免疫原性断片が、配列番号：１７〜４０のいずれか１つの配列を有する、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の核酸分子カクテル。

【請求項14】

請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項５に記載の核酸分子、請求項６〜９のいずれか１項に記載のポリペプチドカクテル、又は請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の核酸分子カクテル、及び薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤若しくは賦形剤を含む、医薬組成物。

【請求項15】

前記医薬組成物が、別の治療成分を含む、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記ポリペプチド、核酸分子、ポリペプチドカクテル又は核酸分子カクテルが、５０〜２００μｇの量で存在する、請求項１４又は１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

医療上使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項５に記載の核酸分子、請求項６〜９のいずれか１項に記載のポリペプチドカクテル、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の核酸分子カクテル、又は請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項18】

癌の治療又は予防に使用するための、請求項１７に記載のポリペプチド、核酸分子、ポリペプチドカクテル、核酸分子カクテル又は医薬組成物。

【請求項19】

請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項５に記載の核酸分子、請求項６〜９のいずれか１項に記載のポリペプチドカクテル、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の核酸分子カクテル、又は請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用であって、癌の治療又は予防のための医薬を製造するための使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、ポリペプチドカクテル及び核酸分子カクテルに関する。本発明はさらに、上記ポリペプチド、核酸分子又はそれらのカクテルを含む医薬組成物に関する。さらに本発明は、患者へのポリペプチド、核酸分子又はカクテルの投与を含む該患者の癌の治療又は予防方法に関する。

【背景技術】

【0002】

癌は、個体内での細胞の新規かつ異常な成長を特徴とする疾病である。癌は、癌細胞、すなわち浸潤性及び転移性を呈する細胞を増殖させる幾つかの突然変異イベントを伴う多段階のプロセスを経て進行する。一般的には、突然変異が発生して癌を惹起し得る遺伝子には、癌遺伝子と癌抑制遺伝子の２種類がある。癌遺伝子の活性化は、異常に活発な成長及び分裂、プログラム細胞死への抵抗性、正常組織境界の尊重の喪失、多様な組織環境中で定着する能力などの新たな属性を細胞にもたらす。癌抑制遺伝子が不活性化されると、それによってＤＮＡの正確な複製、細胞周期の制御、指向性、及び組織内接着並びに免疫系保護細胞との相互作用などの細胞内での正常な機能が喪失され得る。

【0003】

癌の治療及び予防のために、多数のアプローチが提案されてきた。１つのアプローチは、腫瘍特異抗原の断片を含む抗原性ペプチドの使用である。上記抗原性ペプチドは、個体へ投与されると、腫瘍特異抗原を提示する細胞に対し、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩの拘束性Ｔ細胞応答を誘発する。

【0004】

上記Ｔ細胞応答が起きるには、抗原性ポリペプチドがＭＨＣ分子上に提示されていなければならないと理解される。ヒト個体群のＭＨＣ分子には広範な変異性がある。とりわけ、異なる個体は、ポリペプチドに対して、そのポリペプチドのアミノ酸配列に応じて異なる様々な結合親和性を有する異なるＨＬＡ対立遺伝子を有する。このため、特定の１つのＨＬＡ対立遺伝子を有する個体は特定の配列のポリペプチドと結合するＭＨＣ分子を持ち得る一方、上記ＨＬＡ対立遺伝子を持たない他の固体は、上記ポリペプチドと結合し、これを提示することのできない（又は少なくともそれらのＭＨＣ分子は上記ポリペプチドとの親和性が非常に低く、そのため比較的低いレベルでこれを提示する）ＭＨＣ分子を有する。

【0005】

また、上記抗原性ペプチドをコードする核酸分子を含むワクチンの供給も提案されてきた。上記ワクチンは、治療を要する個体へのワクチン投与後に上記核酸分子が転写され（それがＤＮＡ分子の場合）、翻訳されてペプチドを合成し、続いて上述のように上記ペプチドがＭＨＣ分子と結合し提示されることを除いては、同様の原理に従って作用する。

【0006】

テロメラーゼは、真核細胞内の線状ＤＮＡ鎖のテロメア領域の３’末端を複製する機能を有する酵素である。この領域はＤＮＡポリメラーゼ酵素による通常の方法では延長できない。テロメラーゼ酵素は、テロメラーゼ逆転写酵素サブユニット（ヒトでは「ＴＥＲＴ」又は「ｈＴＥＲＴ」）とテロメラーゼＲＮＡを含む。テロメラーゼ逆転写酵素サブユニットは、テロメラーゼＲＮＡを鋳型として使用し、反復配列を真核細胞の染色体の３’末端に付加してＤＮＡ鎖の３’末端を延長する。

【0007】

すべてのヒト腫瘍の大多数において、テロメラーゼ酵素が活性化されることが観察されている。これは、テロメラーゼ酵素の発現がないと一細胞の細胞分裂のたびに細胞のテロメアが徐々に失われ、染色体の完全性が低下し、最終的に細胞のアポトーシスに到るためであると考えられる。このように、テロメラーゼ酵素の発現がなければプログラム細胞死が起きるのが通常であるため、一般に癌細胞の成長にはこの酵素の発現が必要である。癌におけるテロメラーゼ活性化の役割を考慮して、テロメラーゼは腫瘍特異抗原とみなされ、したがって癌治療の潜在的な標的とされてきた。

【0008】

ＷＯ０３／０３８０４７は、健康なドナーの細胞から増殖性Ｔ細胞応答を誘発すると報告されたＴ６７２と称するペプチドを開示する。ｈＴＥＲＴの他の様々なペプチドも開示されているが、これらについては実験的試験がされていない。

【0009】

ＷＯ００／０２５８１は、ＭＨＣクラスＩ及び／又はクラスＩＩの拘束性Ｔ細胞応答を誘発するテロメラーゼのポリペプチドを開示する。開示されたポリペプチドの一つ（アミノ酸配列ＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫを有し、ＧＶ１００１としても知られている）は、英国で膵臓癌患者に対するワクチン治療として第ＩＩＩ相臨床試験（Ｔｅｌｏ Ｖａｃ）を実施中である。

【0010】

ＷＯ０２／０９４３１２は、ｈＴＥＲＴ由来の特定のポリペプチドを開示する。

【0011】

Liu JPら（２００９年 癌免疫療法におけるテロメラーゼ Biochim Biophys Acta.９月１２日号）は、ｈＴＥＲＴ陽性腫瘍細胞に有効な免疫応答を起こすことが示された２６のｈＴＥＲＴペプチドを検討した。

【0012】

ｈＴＥＲＴのｍＲＮＡをトランスフェクトされた樹状細胞も、以前から転移性前立腺癌患者の治療に採用されている（Su et al、２００５年、「Telomerase mRNA-transfected dendritic cells stimulate angigen-specific CD8+ and CD4+ T cell responses in patients with metastatic prostate cancer」J Immunol. 174(6): 3798-807）。Suらは、ＩＦＮγを分泌するＣＤ８陽性Ｔ細胞とＣＴＬの仲介によるｈＴＥＲＴ標的の死滅で評価し、ｈＴＥＲＴ特異的Ｔ細胞応答の生成に成功したことを明らかにした。しかし、これらの研究ではｈＴＥＲＴのエピトープの特徴は明らかになっていない。

【0013】

個体内でより有効な免疫応答を誘発できるポリペプチド、及び／又は集団中により多くの割合で存在するＨＬＡ対立遺伝子によって提示されるポリペプチドなどの、癌の治療のためのさらなる抗原性ポリペプチド（及び上記ポリペプチドをコードする核酸分子）は常に必要とされている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

本発明の目的は、上記問題点の一つ又は複数を解決することである。

【課題を解決するための手段】

【0015】

本発明の第１の態様によれば、
ｉ）配列番号：２、３、４、７、８又は９
ｉｉ）少なくとも８個のアミノ酸を含むｉ）の免疫原性断片の配列であって、該免疫原性断片が配列番号：６又は１１〜１６のいずれでもない配列、又は
ｉｉｉ）ｉ）又はｉｉ）と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、
から選択される配列を含み、
上記ポリペプチドの長さがアミノ酸１００個未満であり、かつ上記ポリペプチドが配列番号：１０又は５６のいずれの配列も含まないポリペプチドが提供される。

【0016】

上記ポリペプチドは、配列番号：４６、５７又は５９〜６２のいずれの配列も含まず、かつ配列番号：５８の配列からなるものでないことが好ましい。

【0017】

上記ポリペプチドは単離されたものであり、すなわちそれが自然発生するタンパク質（ｈＴＥＲＴ）の一部分を形成するものではない。

【0018】

上記ポリペプチドは、上記ポリペプチドの提示に適したＨＬＡ対立遺伝子を持つ健康な患者にＴ細胞応答を誘発する能力を有する。

【0019】

便宜的に、本発明の第１の態様によるポリペプチドの配列を、
ｉ）配列番号：１、
ｉｉ）少なくとも８個のアミノ酸を含むｉ）の免疫原性断片の配列であって、該免疫原性断片が配列番号：６、１１〜１６、又は５６のいずれでもない配列、及び
ｉｉｉ）ｉ）又はｉｉ）と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、
から選択される配列であって、上記ポリペプチドの長さがアミノ酸１００個未満の配列と定義する。すなわち、上記ポリペプチドは、配列番号：２及び３の配列を組み入れた配列番号：１の配列を含むことができ、配列番号：２及び３の配列と別のものである必要はない。

【0020】

上記ポリペプチドは、配列番号：５８の配列からなるものでないことが好ましい。

【0021】

好ましくは、上記免疫原性断片は配列番号：１７〜４０のいずれか１つの配列を含む。

【0022】

好適には、上記ポリペプチドの長さは、アミノ酸８０個、５０個、３０個、２０個又は１１個以下である。

【0023】

本発明の第２の態様によれば、発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子が提供される。

【0024】

上記核酸分子は単離されたものであり、すなわちそれが自然発生する遺伝子（テロメラーゼ遺伝子）の一部分を形成するものではない。

【0025】

本発明の第３の態様によれば、
ｉ）配列番号：２〜７、
ｉｉ）少なくとも８個のアミノ酸を含むｉ）の免疫原性断片の配列、及び
ｉｉｉ）ｉ）又はｉｉ）と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、
からなる群から選択される配列を含む、少なくとも２つの異なるポリペプチドを含むポリペプチドカクテルであって、
各ポリペプチドの長さがアミノ酸１００個未満のものが提供される。上記少なくとも２つのポリペプチドは、ｉ）で定義される配列が各ポリペプチドについてそれぞれ異なるという意味と同じ意味で異なることが好ましい。

【0026】

便宜的に、少なくとも１つのポリペプチドの配列を、
ｉ）配列番号：１、７、８、９又は１０
ｉｉ）少なくとも８個のアミノ酸を含むｉ）の免疫原性断片の配列、及び
ｉｉｉ）ｉ）又はｉｉ）と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、
からなる群から選択される配列を含み、
上記ポリペプチドの長さがアミノ酸１００個未満の配列と定義する。例えば、ポリペプチドの一つは、配列番号：２及び３を組み入れた配列番号：１の配列を含むことができ、また配列番号：２及び３の配列と別のものである必要はない。

【0027】

好適には、上記少なくとも２つの異なるポリペプチドは、
ｉ）配列番号：１の配列又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含むその免疫原性断片を含むポリペプチドと、配列番号：７の配列又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含むその免疫原性断片を含むポリペプチドと、配列番号：９の配列又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含むその免疫原性断片を含むポリペプチドとのカクテル、
ｉｉ）配列番号：１の配列又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含むその免疫原性断片を含むポリペプチドと、配列番号：８の配列又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含むその免疫原性断片を含むポリペプチドと、配列番号：９の配列又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含むその免疫原性断片を含むポリペプチドとのカクテル、及び
ｉｉｉ）配列番号：１の配列又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含むその免疫原性断片を含むポリペプチドと、配列番号：８の配列又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含むその免疫原性断片を含むポリペプチドと、配列番号：１０の配列又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含むその免疫原性断片を含むポリペプチドとのカクテル、
からなる群から選択されるポリペプチドカクテルを含み、各ポリペプチドの長さはアミノ酸１００個未満である。

【0028】

好ましくは、上記又は各免疫原性断片は配列番号：１７〜４０のいずれか１つの配列を含む。

【0029】

本発明の第４の態様によれば、
ｉ）配列番号：２〜７、
ｉｉ）少なくとも８個のアミノ酸を含むｉ）の免疫原性断片の配列、及び
ｉｉｉ）ｉ）又はｉｉ）と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、
からなる群から選択される配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列からなる少なくとも２つの異なる核酸分子を含む核酸分子カクテルであって、上記ポリペプチドの長さがアミノ酸１００個未満のものが提供される。上記少なくとも２つの核酸分子は、ｉ）で定義される配列が各核酸分子について異なるという意味と同じ意味で異なることが好ましい。

【0030】

好適には、少なくとも１つの核酸分子は、
ｉ）配列番号：１、７、８、９又は１０、
ｉｉ）少なくとも８個のアミノ酸を含むｉ）の免疫原性断片の配列、及び
ｉｉｉ）ｉ）又はｉｉ）と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、
からなる群から選択される配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列で構成され、
上記ポリペプチドの長さがアミノ酸１００個未満のものと定義される。例えば、核酸分子は、配列番号：２及び３を組み入れた配列番号：１を含むポリペプチドをコードする核酸配列からなることができ、また上記ポリペプチドは、配列番号：２及び３の配列を別に含む必要がない。

【0031】

好ましくは、上記少なくとも２つの異なる核酸分子は、
ｉ）配列番号：１で表される第一配列又は第一配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する第二配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含む第一配列又は第二配列の免疫原性断片を含むポリペプチドをコードする核酸配列からなる核酸分子と、配列番号：７で表される第一配列又は第一配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する第二配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含む第一配列又は第二配列の免疫原性断片を含むポリペプチドをコードする核酸配列からなる核酸分子と、配列番号：９で表される第一配列又は第一配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する第二配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含む第一配列又は第二配列の免疫原性断片を含むポリペプチドをコードする核酸配列からなる核酸分子とのカクテル、
ｉｉ）配列番号：１で表される第一配列又は第一配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する第二配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含む第一配列又は第二配列の免疫原性断片を含むポリペプチドをコードする核酸配列からなる核酸分子と、配列番号：８で表される第一配列又は第一配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する第二配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含む第一配列又は第二配列の免疫原性断片を含むポリペプチドをコードする核酸配列からなる核酸分子と、配列番号：９で表される第一配列又は第一配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する第二配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含む第一配列又は第二配列の免疫原性断片を含むポリペプチドをコードする核酸配列からなる核酸分子とのカクテル、及び、
ｉｉｉ）配列番号：１で表される第一配列又は第一配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する第二配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含む第一配列又は第二配列の免疫原性断片を含むポリペプチドをコードする核酸配列からなる核酸分子と、配列番号：８で表される第一配列又は第一配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する第二配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含む第一配列又は第二配列の免疫原性断片を含むポリペプチドをコードする核酸配列からなる核酸分子と、配列番号：１０で表される第一配列又は第一配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する第二配列又は少なくとも８個のアミノ酸を含む第一配列又は第二配列の免疫原性断片を含むポリペプチドをコードする核酸配列からなる核酸分子とのカクテル、
からなる群から選択される核酸分子カクテルを含み、
各ポリペプチドの長さはアミノ酸１００個未満である。

【0032】

便宜的に、上記又は各免疫原性断片は配列番号：１７〜４０のいずれか１つの配列を含む。

【0033】

本発明の第５の態様によれば、本発明のポリペプチド、本発明の核酸分子、本発明のポリペプチドカクテル又は本発明の核酸分子カクテル、及び薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤又は賦形剤、並びに任意で別の治療成分を含む医薬組成物が提供される。

【0034】

好ましくは、上記ポリペプチド、核酸分子、ポリペプチドカクテル又は核酸分子カクテルは、５０〜２００μｇの量で存在する。

【0035】

本発明の第６の態様によれば、本発明のポリペプチド、本発明の核酸分子、本発明のポリペプチドカクテル、本発明の核酸分子カクテル、又は本発明の医薬組成物の患者への投与を含む、患者の癌の治療法又は予防法が提供される。

【0036】

本発明の第７の態様によれば、医療で使用するための本発明のポリペプチド、本発明の核酸分子、本発明のポリペプチドカクテル、本発明の核酸分子カクテル、又は本発明の医薬組成物が提供される。

【0037】

好適には、上記ポリペプチド、核酸分子、ポリペプチドカクテル、核酸分子カクテル又は医薬組成物は、癌の治療又は予防の用途に供される。

【0038】

本発明の第８の態様によれば、本発明のポリペプチド、本発明の核酸分子、本発明のポリペプチドカクテル、本発明の核酸分子カクテル、又は本発明の医薬組成物の、癌の治療又は予防のための薬剤の製造の用途が提供される。

【0039】

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書において、アミノ酸残基のポリマーを指して互換的に使用される。この用語は、一又は複数のアミノ酸残基が修飾残基であるアミノ酸ポリマー、又は対応する自然発生アミノ酸の人工的化学的模倣物などの非自然発生残基であるアミノ酸ポリマー、並びに自然発生アミノ酸ポリマーに適用される。

【0040】

用語「アミノ酸」は、本明細書で使用される場合、自然発生アミノ酸及び合成アミノ酸、並びに自然発生アミノ酸類似の機能を有するアミノ酸アナログ及びアミノ酸模倣物をいう。自然発生アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、並びに細胞内での翻訳後に修飾されるアミノ酸である（例えばヒドロキシプロリン、γカルボキシグルタミン酸塩、及びＯホスホセリン）。句「アミノ酸アナログ」は、自然発生アミノ酸と同一の基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、及びＲ基に結合したアルファ炭素）を有するが、修飾されたＲ基又は修飾された骨格を有する合成物をいう（例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）。句「アミノ酸模倣物」は、自然発生アミノ酸と構造は異なるが類似の機能を有する化合物をいう。

【0041】

用語「断片」は、本明細書でポリペプチドに関連して使用される場合、ポリペプチドの一部分を形成する連続した一組のアミノ酸をいう。ポリペプチドの「免疫原性断片」は、すでに定義されたように、個体に投与された場合にＴ細胞応答などの免疫応答を誘発する能力のある断片である。

【0042】

用語「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」は、本明細書において、複数のヌクレオチドのポリマーを指して互換的に使用される。核酸分子は、自然発生核酸を含んでもよいし、又はペプチド核酸、モルホリン及びロックド核酸、並びにグリコール核酸及びトレオース核酸などの人工核酸を含んでもよい。

【0043】

用語「ヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、細胞酵素によって認識される自然発生ヌクレオチド及び合成ヌクレオチドアナログをいう。

【0044】

用語「治療」は、本明細書で使用される場合、任意の部分的又は全面的な治療をいい、疾病又は症状の抑制、すなわちその進行の阻止と、疾病又は症状の緩和、すなわち上記疾病又は症状の退行の惹起とを含む。

【0045】

本明細書において、２つの配列間の「同一性」の比率は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのバージョン２．２．２（Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden,Alejandro A. Sch■ffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman(1997)、「Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs」、Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）を用い、デフォルトパラメータを用いて決定する。詳細には、ＢＬＡＳＴのアルゴリズムは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/のＵＲＬを用いてインターネット上でアクセスできる。

【図面の簡単な説明】

【0046】

【図1】ｈＴＥＲＴのｍＲＮＡをトランスフェクトされたＤＣをワクチン接種した膵臓癌患者で検出されたｈＴＥＲＴのＴ細胞応答をまとめた棒グラフである。ワクチン接種計画全期間の様々な時点の標本において、２４件のオーバーラップするｈＴＥＲＴの１５−ｍｅｒペプチドに対してＴ細胞応答が検出された。ペプチドを取り込んだＰＢＭＣに呼応した増殖は、３Ｈチミジンの取込みによって測定された。刺激指数が２を超えるものを免疫応答とみなす。

【図2】ワクチン接種した癌患者におけるフロー・サイトメトリーによる、ｈＴＥＲＴ特異的なＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の検出を示す一連のグラフである。ＰＢＭＣは、事前に抗原刺激をせずに分離した後、直接染色した。ＣＤ８陽性ＣＤ３陽性細胞にゲートを設定した細胞に五量体染色が見られる。バックグラウンドの染色を無関係五量体（ＨＩＶペプチド）のプロットで示し、ｈＴＥＲＴ五量体のプロットは、膵臓癌患者での２つの新規ｈＴＥＲＴペプチド（Ａ）（配列番号：３に対応する７２０ＧＬＬと称するペプチド、配列番号：６に対応する７２８ＲＬＴと称するペプチド）と、肺癌患者で検出された第３のｈＴＥＲＴペプチド（Ｂ）（配列番号：５に対応する６１３ＲＰＡと称するペプチド）の染色を示す。後者は、５年を隔てた異なる２時点のデータである。４５０００個のＣＤ８陽性のＴ細胞を分析した。

【図3】ＧＶ１００１ペプチド（配列番号：１０）、６６３−６７７（１５−ｍｅｒ）（配列番号：２）及び６６０−６８９（３０−ｍｅｒ）（配列番号：１）に対応したＴ細胞の増殖を示すグラフである。刺激指数は、上記ペプチド特異的な増殖がバックグラウンドの何倍かを示す尺度である。

【図4】ペプチド濃度の低下に対応してペプチド特異的な増殖を示すＣＤ４陽性Ｔ細胞クローンの結果を示すグラフである。２を超える値を陽性反応とみなす。

【図5】患者の血液標本由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）内で直接に、配列番号：３、４及び６の９−又は１０−ｍｅｒのペプチドに特異的なＣＤ８陽性Ｔリンパ球の検出結果を示すグラフである。６１５−６２４のペプチド（配列番号：４）は、後２者の患者では試験を行わなかった。患者はＨＬＡ−Ａ２陽性である。無関係五量体のバックグラウンド染色は０．０５％未満だった。

【図6】ＧＶ１００１ワクチン接種（配列番号：１０）の後数年間完全寛解にある肺癌患者における、９−ｍｅｒのペプチド６１３−６２１（配列番号：５）に特異的なＣＤ８陽性Ｔリンパ球の検出結果を示すグラフである。患者はＨＬＡ−Ｂ７陽性である。患者はその後、６カ月ごとにワクチン接種を受けており、上記患者が完全寛解に到ってから６年後も、依然として安定した数のｈＴＥＲＴペプチド６１３−６２１に特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞が検出できる。別のＣＴＬエピトープである６７２−６８１（配列番号：２５）に特異的な第２の少数のＣＴＬ集団が、幾つかの時点で検出された。

【図7】ＧＶ１００１ワクチン接種（配列番号：１０）後の黒色腫患者におけるｈＴＥＲＴオーバーラップペプチドライブラリーに対するＴ細胞応答を示すグラフである。

【図8】ＧＶ１００１ワクチン接種（配列番号：１０）後の肺癌患者におけるｈＴＥＲＴオーバーラップペプチドライブラリーに対するＴ細胞応答を示すグラフである。

【図9】ＧＶ１００１ワクチン接種（配列番号：１０）後の結腸癌患者におけるｈＴＥＲＴオーバーラップペプチドライブラリーに対するＴ細胞応答を示すグラフである。

【図10】ＧＶ１００１ワクチン接種（配列番号：１０）後の第２の黒色腫患者におけるｈＴＥＲＴオーバーラップペプチドライブラリーに対するＴ細胞応答を示すグラフである。

【図11】ｈＴＥＲＴのｍＲＮＡをトランスフェクトされたＤＣワクチン接種後の膵臓癌患者におけるｈＴＥＲＴオーバーラップペプチドライブラリーに対するＴ細胞応答を示すグラフである。表示の結果は、図１と同一の患者のものである。

【図12】ｈＴＥＲＴのｍＲＮＡをトランスフェクトされたＤＣワクチン接種後の肺癌患者におけるｈＴＥＲＴオーバーラップペプチドライブラリーに対するＴ細胞応答を示すグラフである。

【図13】ワクチン接種をしていない第３の黒色腫患者におけるｈＴＥＲＴオーバーラップペプチドライブラリーに対する自然発生Ｔ細胞応答を示すグラフである。

【図14】選択されたｈＴＥＲＴペプチドについての図７〜図１３の結果のまとめを示すグラフである。

【図15】肺癌患者４名における選択されたｈＴＥＲＴペプチドに対するＴ細胞応答を示すグラフである。

【図16】黒色腫患者６名における選択されたｈＴＥＲＴペプチドに対するＴ細胞応答を示すグラフである。

【図17】免疫応答を誘発するペプチドの数に対する各患者の生存月数を示す散布図である。

【図18】選択されたｈＴＥＲＴペプチドについて別の患者で試験を行い、ペプチド配列に対する患者の免疫応答に応じて２群に分けたときの生存状況を示すグラフである。ＧＶ１００１のほかに０〜１個のペプチドに対して反応したものを１群とし、２個以上のペプチドに反応したものを別の群とした。この２つの群について、生存状況を独立した一群のｔ検定を用いて分析した。生存の同等性についての予備検定は、２つの群の生存が有意に異なることを示唆する。このため、生存の同等性を仮定しない２標本のｔ検定を実施した。異分散ｔ検定を用い、ｔ（６，１）＝−３．２２、ｐ＝０．０１８であった。ＷＩＮＫＳ ＳＤＡソフトウェア（Ｔｅｘａｓｏｆｔ、テキサス州シダーヒル）を用いて統計を実施した。統計的決定は、ｐ＝０．０５で行った。これらのデータについて、０−１ペプチドの群の生存の平均（標準偏差）は１０．７（３．９４５５）、Ｎ＝１０、また２個以上ペプチドの群の平均（標準偏差）は、５１．５７１４（３３．３９０９）、Ｎ＝７である。

【発明を実施するための形態】

【0047】

一般的には、本発明は、配列番号：２、３、４、７、８及び９から選択された配列であって、上記ポリペプチドの長さがアミノ酸１００個未満である配列を含み、かつポリペプチドＧＶ１００１（すなわち配列番号：１０）の配列、配列番号：５６（Schroers他、２００２によって報告されたもの）、配列番号：４６、５７又は５９〜６１のいずれか（ＷＯ０３／０３８０４７で報告されたもの）、又は配列番号：６２（ＷＯ００／０２５８１で報告されたもの）を含まないテロメラーゼタンパク質のポリペプチドに関する。上記ポリペプチドはまた、配列番号：５８の配列（ＷＯ０３／０３８０４７で報告されたもの）で構成されない。

【0048】

特に好ましいポリペプチドは、配列番号：１（配列番号：２及び３の配列を組み込んでいるもの）、配列番号：６（配列番号：８及び９の配列を組み込んでいるもの）、及び配列番号：７の配列を含む。

【0049】

幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号：１〜９のうちの一つで開始する配列からなる。他の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号：１〜９のうちの一つで開始する配列のうちの一つを含み、Ｎ末端及び／又はＣ末端に付加されるアミノ酸は、自然発生のテロメラーゼ酵素に存在するものとは異なる。

【0050】

他の実施形態では、上記ポリペプチドの免疫原性断片であって、その断片が少なくとも８個のアミノ酸を含み、その断片は配列番号：６又は１１〜１６のポリペプチドのいずれでもなく、また配列番号：５６の配列を有する断片ポリペプチドでもない免疫原性断片が提供される。例示の免疫原性断片は、配列番号：１７〜４０に提示される断片を含み、それは一定のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子のＭＨＣ分子への結合親和性を有すると予想される。配列番号：１７〜４０のポリペプチドはすべて、配列番号：１のポリペプチドの免疫原性断片であることを理解されたい。

【0051】

ヒトテロメラーゼ酵素（ｈＴＥＲＴ）の配列は、アクセッション番号ＡＦ０１５９５０番でＧｅｎＢａｎｋに登録されている。配列番号：１〜９のそれぞれは、上記テロメラーゼ酵素の６６０〜７０５ポジションのアミノ酸内に存在することに留意されたい。これは、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素サブユニットの活性部位に対応する。逆転写酵素サブユニットのこの領域にあるエピトープへの免疫応答が誘発されると、テロメラーゼ遺伝子のこの領域をコードする部分が変異しており、そのため免疫応答を回避し得る腫瘍内の任意の細胞もまた、上記コードされたテロメラーゼタンパク質の酵素活性を損なうと考えられる。したがって、テロメラーゼ酵素がこの領域を標的にすることにより、癌細胞コロニーがテロメラーゼ遺伝子の変異によって生き残れる可能性は低下する。

【0052】

幾つかの実施形態では、上に定義した複数のポリペプチドが、相互に共有結合し、大型ポリペプチド又は環状ポリペプチドさえ形成する。

【0053】

本発明の上記実施形態では、単一配列のポリペプチドが提供される。しかし、他の実施形態ではポリペプチドカクテル（すなわち混合物）が提供され、そこでは上記カクテルは、配列番号：２〜７の配列を含む少なくとも２つの異なるポリペプチドを含む。幾つかの実施形態では、カクテルは上記ポリペプチドの免疫原性断片を含み、該免疫原性断片は少なくとも８個のアミノ酸を含む。上記ポリペプチドの長さは、アミノ酸１００個未満である。

【0054】

カクテル中のポリペプチドは、配列番号：１、７、８又は９の配列を含むことが特に好ましい。カクテル中のポリペプチドは、配列番号：１、７及び９の配列、配列番号：１、８及び９の配列、又は配列番号：１、８及び１０の配列を含むことが、とりわけ好ましい。したがって、カクテル中のポリペプチドの一つが配列番号：１０の配列（すなわちＧＶ１００１と称するペプチドの配列）を含むことは、本発明の範囲内である。免疫原性断片は、配列番号：１７〜４０の免疫原性断片であることが好ましい。

【0055】

少なくとも２つのポリペプチドは、配列番号：１〜１０から選択された異なる配列に基づくものであるという意味で異なっていることが好ましい。

【0056】

ポリペプチドカクテルにおいて、上記カクテル中のポリペプチドは２個以上のＨＬＡ対立遺伝子のＭＨＣ分子と結合し得ることが特に好ましい。例えば１つの実施形態では、カクテルは、対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ*０２０１のＭＨＣ分子と結合し得る第１のポリペプチドと、対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ−Ａ*０３のＭＨＣ分子と結合し得る第２のポリペプチドとを含む。幾つかの実施形態では、カクテルが異なる配列を有する３つ以上のポリペプチドを含むことも理解されたい（例えば３個、４個又は５個のポリペプチド）。

【0057】

他の実施形態では、提供される上記又は各ポリペプチドは、上記ポリペプチドの一つとの厳密な配列同一性を有しない。むしろ、上記ポリペプチドは、上記のポリペプチドとの少なくとも８０％の配列同一性を有する。上記配列が上記配列と、少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有することが特に好ましい。また、アミノ酸配列を付加又は置換しても原アミノ酸側鎖の性質が保存されることも好ましい。すなわち、置換又は修飾は「保存的」である。

【0058】

機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当技術分野で周知である。アミノ酸側鎖の性質の例には、疎水性アミノ酸（Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｗ，Ｙ，Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ，Ｄ，Ｎ，Ｃ，Ｅ，Ｑ，Ｇ，Ｈ，Ｋ，Ｓ，Ｔ）、及び以下の官能基又は特徴を共通して有する側鎖がある：脂肪族側鎖（Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｐ）；ヒドロキシル基を含む側鎖（Ｓ，Ｔ，Ｙ）；イオウ原子を含む側鎖（Ｃ，Ｍ）；カルボン酸及びアミドを含む側鎖（Ｄ，Ｎ，Ｅ，Ｑ）；塩基を含む側鎖（Ｒ，Ｋ，Ｈ）；及び芳香族を含む側鎖（Ｈ，Ｆ，Ｙ，Ｗ）。さらに、以下の８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換物であるアミノ酸を含む（例えばCreighton, Proteins（１９８４）を参照）。
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。

【0059】

幾つかの実施形態では、上記又は各ポリペプチドの配列は、特定のＨＬＡ対立遺伝子のＭＨＣ分子へのポリペプチドの結合親和性を変更する（例えば高める）ために変性される。他の実施形態では、ポリペプチドは、そのＮ末端及び／又はＣ末端に、上記アミノ酸に加えてさらなるアミノ酸を有する。上記付加アミノ酸は、ポリペプチドのＭＨＣ分子への結合親和性を変性する（例えば高める）ために使用することもできる。

【0060】

上記又は各ポリペプチド（特にその配列が上述のように変性されたポリペプチド）は、細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）の応答を誘発し得ることが必要である。すなわちポリペプチドは、該ポリペプチドが抗原提示細胞（例えば樹状細胞）によって提示されたときにＣＴＬを誘導し得るべきである。

【0061】

ＣＴＬ誘導性の確認は、ヒトＭＨＣ抗原を持つ抗原提示細胞（例えばＢリンパ球、マクロファージ又は樹状細胞）、又はより具体的にはヒト末梢血単核白血球由来の樹状細胞を誘導し、かつ上記ポリペプチドによる刺激後にＣＤ８陽性細胞と混合し、その後、ＣＴＬが標的細胞に対して産生し放出したＩＦＮ−γを測定することによって、達成され得る。反応系として、ヒトＨＬＡ抗体を発現するように作られている遺伝子組み換え動物（例えば、BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 61(8):764-79、２０００年８月号、関連記事、書籍、リンクアウト、「ＨＬＡ Ａ*０２０１／ＤＲ１遺伝子組み換えマウスにおける最小エピトープ・ワクチンによるＣＴＬ応答の誘導：ＨＬＡクラスＩＩ拘束性Ｔ（Ｈ）応答への依存性」に記述されているもの）が使用できる。例えば、標的細胞は、^５１Ｃｒを使って放射性同位体による標識付けを行い、標的細胞から放出される放射能から細胞傷害性を計算することができる。あるいは代替として、固定化したペプチドを運ぶ抗原提示細胞の存在下でＣＴＬが産生し放出したＩＦＮ−γを測定し、かつ抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を用いて媒体上の抑制地帯を視覚化することによって、ＣＴＬ誘導性を検査することができる。

【0062】

本発明の幾つかの実施形態では、上記又は各ポリペプチドを、そのＣＴＬ応答誘導能力を保持しつつ他の物質と連結する。上記他の物質としては、脂質、糖質及び糖鎖、アセチル基、天然及び合成のポリマーなどが挙げられる。ある実施形態では、ポリペプチドは、グリコキシル化、側鎖酸化又はリン酸化などの修飾を含む。

【0063】

幾つかの実施形態では、上記又は各ポリペプチドは、当技術分野で周知の従来のプロセスによって産生される。又は代替として、ポリペプチドは、例えば臭化シアンを用いた開裂及びその後の精製によって産生される、テロメラーゼタンパク質の断片である。酵素的開裂を使用してもよい。他の実施形態では、ポリペプチドは、遺伝子組み換え体発現ポリペプチドの形態である。例えば、発現可能な形態のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えばプロモーター配列に対応する調節配列の川下）を含む適切なベクターを作成し、適切な宿主細胞に形質転換を起こさせる。次に、宿主細胞を培養して問題のポリペプチドを産生する。他の実施形態では、ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの翻訳系を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで産生される。

【0064】

本発明の代替的な実施形態では、上記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子が提供される。

【0065】

本発明の他の実施形態では、核酸分子カクテル（すなわち混合物）が提供され、そこでは上記カクテルは、配列番号：２〜７の配列のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも２つの異なる核酸分子を含む。代替的な実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも８個のアミノ酸を含む、配列番号：２〜７のうちの１つの断片である。代替の変形形態では、ポリペプチドの配列は上述のものと同一ではなく、少なくとも８０％の配列同一性を有する。いずれの例でも、ポリペプチドの長さはアミノ酸１００個未満である。コードされたポリペプチドは、配列番号：１、７、８又は９の配列を含むことが好ましい。カクテル中のコードされたポリペプチドは、配列番号：１、７及び９の配列、配列番号：１、８及び９の配列、又は配列番号：１、８及び１０の配列を含むことが、とりわけ好ましい。したがって、幾つかの実施形態では、コードされた１つのポリペプチドが配列番号：１０の配列（すなわちＧＶ１００１ペプチドの配列）を含む。また、コードされた免疫原性断片は、配列番号：１７〜４０の配列であることも好ましい。少なくとも２つの核酸分子は、配列番号：１〜１０から選択された異なる配列に基づくものであるという意味で異なっていることが好ましい。

【0066】

遺伝暗号の縮重のため、特定のポリペプチドをコードする核酸分子が様々なポリヌクレオチド配列を有することがあることを理解されたい。例えばコドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＴは、いずれもアミノ酸アラニンをコードする。

【0067】

核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれか、又はそれらの派生物であってよい。

【0068】

本発明の他の実施形態では、上記ポリペプチド、核酸分子、又はポリペプチドもしくは核酸分子カクテルを含む医薬組成物がある。さらに、上記医薬組成物は、薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤又は賦形剤を含む。ある実施形態では、上記医薬組成物は、本発明のポリペプチドと本発明の核酸分子の混合物を含む。

【0069】

アジュバントの例には、フロイント社の完全アジュバント又は不完全アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素及びサルモネラ毒素などがある。特に好ましいアジュバントは、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子）である。希釈剤及び賦形剤の例には、滅菌水、生理食塩水、培養液及びリン酸緩衝液などがある。

【0070】

ある実施形態では、ポリペプチド又は核酸分子は、免疫原性担体と連結される。免疫原性担体の例には、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン及びトリ免疫グロブリンなどがある。

【0071】

幾つかの実施形態では、医薬組成物はまた、さらなる治療成分も含む。さらなる治療成分の例には、インターロイキン２（ＩＬ２）、インターロイキン１２（ＩＬ１２）、さらなるテロメラーゼ・ポリペプチド（すなわち上述のものを除いたテロメラーゼ酵素のポリペプチド）、化学療法薬、鎮痛剤、消炎剤、及び他の抗癌剤などがある。

【0072】

幾つかの実施形態では、ポリペプチドを含む医薬組成物は、高親和性細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発することが知られているリポペプチド接合体の形態で提供される（Deres, 1989, Nature 342）。

【0073】

医薬組成物の付加成分のさらなる詳細は、「Remington's Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopoeia」（1984年、Mack Publishing Company、米国ペンシルベニア州イーストン）に見られる。

【0074】

使用に当たっては、上記説明されたポリペプチド、核酸分子、ペプチドカクテル、核酸分子カクテル、又は医薬組成物（以下、「薬剤」という）は、治療の必要な患者に投与される。あるいは代替的に、癌に対する防御免疫を提供するために、癌の症状を呈する前の個体に製品を投与する。

【0075】

薬剤がポリペプチドを含む実施形態では、上記ポリペプチドは、エンドサイトーシスによって抗原提示細胞に取り込まれ、おそらく抗原処理を受け、その後、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩの分子との複合体として細胞表面に提示される。Ｔ細胞表面のＴ細胞受容体との相互作用を通じ、ＣＤ４陽性又はＣＤ８陽性のＴ細胞応答が誘発される。薬剤が核酸分子を含む実施形態では、上記核酸分子もエンドサイトーシスによって取り込まれ、その後（上記核酸分子がＤＮＡならば）転写され、コードされたポリペプチドが内生細胞の経路を通じて合成される。その後、上述したように、コードされたポリペプチドは処理され、Ｔ細胞応答を誘発するためにＭＨＣ細胞上に提示される。したがって、薬剤は、ＣＤ４陽性又はＣＤ８陽性のいずれかのＴ細胞免疫を誘導するためにワクチンとして使用してもよい。

【0076】

原理的には、いかなる薬剤投与形態を用いてもよいが、特に注射が好ましい。例えば薬剤を患者の腫瘍に直接注射してもよい。しかし、治療対象の癌が患者の鼻又は口にある場合、幾つかの実施形態では、薬剤を噴霧及び吸入によって投与する。

【0077】

薬剤の適切な投与量は５０〜２００μｇだが、場合によってはこの範囲外の投与量が必要なこともある（例えば１〜５００μｇ）。１００〜１５０μｇの間の投与量が特に好ましい。幾つかの実施形態では、薬剤は、週次又は月次で患者に投与される。ある実施形態では、治療第１週に３回の薬剤投与、その後１カ月間の毎週投与、その後６カ月間の毎月投与と、その後６カ月に１回の投与を含む、「積極的」治療の投与計画が追及される。

【0078】

原理的には、上記薬剤は、テロメラーゼ遺伝子が活性化している種類のいかなる癌患者にも投与してよい。上記癌には、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、肺癌、悪性黒色腫、白血病、リンパ腫、卵巣癌、子宮頸癌、及び胆道癌などがあるが、これらに限定されない。上述のように、テロメラーゼ酵素は大多数の癌で発現するため、本発明の薬剤の有効性は、特定の種類の癌に限定されない。

【0079】

誘発されるＴリンパ球応答のクラスに応じ、好ましいポリペプチドの長さが異なることを理解されたい。より明確には、ＣＤ８陽性Ｔ細胞応答を誘発するには、ポリペプチドは、通常は長さがアミノ酸残基８〜１０個のポリペプチドにのみ結合するＭＨＣクラスＩ分子上に提示されなければならない。他方、ＣＤ４陽性Ｔ細胞応答を誘発するには、ポリペプチドはＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示される必要があり、このためのポリペプチドは一般にはより長く、通常は長さがアミノ酸残基１５〜２４個の間である。本発明の幾つかのポリペプチド（例えば配列番号：１のポリペプチド）は、通常ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩのいずれかの分子に適応するものより長いことに留意されたい。この長さのペプチドは、例えばＨＰＶ及び子宮頸癌のワクチン接種作業を行っている群により、より強固な免疫応答を誘発することがわかっている（Welters他、２００８）。理論に拘束されることは望まないが、上記ポリペプチドは、患者に投与された後、エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれ、プロテアソーム内でタンパク質分解の減損を受け、その後、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩの分子上に提示されると考えられる。上記ポリペプチドは、こうしてＭＨＣクラスＩ及び／又はＭＨＣクラスＩＩ拘束性のＴ細胞応答を引き起こす可能性がある。また、より長いポリペプチドはより短いポリペプチドより長い期間患者の体内に存在し続け、したがって免疫応答を誘発できる期間がより長いことも理解されたい。このことは、ＭＨＣ結合親和性が比較的低いポリペプチドについてはとくに重要である。

【0080】

また、テロメラーゼ酵素が「自己タンパク質」である、すなわちこの酵素が人体内で自然に発生するタンパク質であることも理解されたい。その結果、個体には通常、上記ポリペプチドに反応するＴ細胞が、Ｔ細胞の発達中に個体の胸腺で破壊されるプロセスを通じ、上記テロメラーゼ酵素のポリペプチドに対するある程度の免疫耐性が現れる。このため、本発明の幾つかの実施形態では、ＭＨＣ結合親和性が比較的低い本発明のポリペプチドが所望される。これは、ＭＨＣ結合親和性が低めのポリペプチドは成熟中のＴ細胞に曝露される率が低めであり、そのため、上記ポリペプチドによる個体の全Ｔ細胞応答が個体のＴ細胞供給によって消去される可能性が低いためである。したがって、幾つかの実施形態におけるＭＨＣ結合親和性が比較的低いポリペプチドは、より容易に免疫耐性に打ち勝つことができる。

【0081】

本発明の幾つかの実施形態では、本発明のポリペプチドの１つの投与が「エピトープ拡散」を招き、それによって免疫応答が、テロメラーゼタンパク質中の投与されたポリペプチドに隣接する、テロメラーゼタンパク質の他のポリペプチドに対して誘発される。

【実施例】

【0082】

実施例例１
ｈＴＥＲＴをトランスフェクトされたＤＣのワクチン接種後に患者のＴ細胞によって認識されたｈＴＥＲＴエピトープの特徴を明らかにした。ワクチン接種は、ＣＤ４陽性Ｔｈ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞の両方に関わる多様かつ広範な免疫応答を引き起こした。この反応は、患者に観察された腫瘍の退縮及び長期生存の原因だと考えられる。

【0083】

方法と材料
患者
再発性膵管腺癌の６２歳女性に、ｈＴＥＲＴのｍＲＮＡを取り込んだ樹状細胞を、コンパッショネート・ユースとしてワクチン接種した。上記治療は、ノルウェー薬事局及び医学研究倫理地域委員会の承認を得た。これは、世界医師会ヘルシンキ宣言に従って実施された。患者より、インフォームド・コンセントの文書を得た。

【0084】

ｍＲＮＡをトランスフェクトされたＤＣの製造
ＤＣは、従来の説明のように生成された（Kyte他２００６及びMu LJ他、２００３）。簡単に述べると、白血球除去血輸血製品から得た単核白血球を、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びインターロイキン４（ＩＬ−４）で５日間培養した。生じた未成熟ＤＣに、矩形波電気穿孔法によってｈＴＥＲＴ−ｍＲＮＡをトランスフェクトし（Kyte他２００６、Saeboe-Larssen S他２００２）、その後、サイトカインで成熟を促進して２日間培養した（インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、及びプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２））。適切な対照ＤＣを得るために、ＤＣの画分をモック・トランスフェクト（ｍｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）した、すなわちｍＲＮＡ無しで電気穿孔した。ＤＣの表現型は、従来の説明のようにフロー・サイトメトリーによって評価した（Kyte他２００６）。上記ＤＣは、ＨＬＡクラスＩＩ、ＣＤ８６及びＣＤ８３を発現するが、ＣＤ１４を発現しない成熟ＤＣ表現型を有した。トリパンブルー染色によって評価したＤＣの生存性は、８５％超であった。

【0085】

第２回及び第３回のワクチン・バッチは、超短期培養成熟ＤＣであった（Alldawi他２００５、Tanaka他２００６、Ho他２００６）単核白血球をＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４で２日間培養し、その後、従来型ＤＣと同様の方法で１日間成熟させてから、電気穿孔した。その後、ＤＣを一晩静置した後凍結させた。

【0086】

ワクチン
ワクチンは、ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡを組み込んだ５×１０^６の自己単核白血球由来樹状細胞からなる。患者は、４回の週次接種の後、月次の追加免疫接種を受けた。

【0087】

臨床モニタリング
有害事象は、従来の説明のように、ＮＣＩ共通毒性基準に従って記録し、等級分類した（Kyte他、２００６「遺伝子治療」）。軽微な副作用のみが観察され、治療に関連してグレードＩＩＩ〜ＩＶの毒性はなかった。対象腫瘍の反応は、ワクチン接種開始前及びワクチン接種中３カ月ごとの臨床検査及びＣＴスキャンによって評価された。腫瘍の反応は、「Response Evaluation Criteria in Solid Tumors」（RECIST）（Therasse P他２０００）に従って分類した。

【0088】

ＤＴＨ
免疫モニタリング
４回の標準ワクチン接種前、５週間後、及び１２週間後に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取した。月次の追加免疫ワクチン接種の前にも毎回ＰＢＭＣを採取した。ＰＢＭＣは、従来の説明のように、分離し、凍結させた（Kyte他、２００５）。解凍したＰＢＭＣを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｔＤＣ（モックＤＣではなく）により１度刺激し、培養した後、従来の説明のように、Ｔ細胞増殖アッセイ（３Ｈチミジン）で検査した（Kyte他２００６）。Ｔ細胞を三重に検査した。放射線照射を受けたｔＤＣと対照のモック・トランスフェクトされたＤＣ（モックＤＣ）を用い、又はＡＰＣとしてｈＴＥＲＴペプチドを持つＰＢＭＣもしくはこれを持たないＰＢＭＣを用いた。Ｔ細胞のみは負の対照を含めた。

【0089】

様々な時点で採取したＰＢＭＣを、いずれもProImmune社のオーバーラップｈＴＥＲＴ １５−ｍｅｒペプチド・ライブラリー又は３０−ｍｅｒのｈＴＥＲＴペプチドで刺激し、（Bernhardt他２００６）で記述されるようにＡＰＣとして放射線照射ＰＢＭＣを用い、上記増殖アッセイで検査した。

【0090】

フロー・サイトメトリー
患者の新鮮ＰＢＭＣ又は凍結ＰＢＭＣについて、五量体染色を実施した。フィコエリトリン接合五量体はProImmune社が製造し、脈絡髄膜炎ウイルス（ＣＭＶ）のペプチドＮＬＶＰＭＴＡＴＶに特異的なＨＬＡ−Ａ２陽性Ｔ細胞系の非特異的染色検査を行った。製造者が推奨する作用濃度を使用した。ＨＩＶペプチドＳＬＹＮＴＶＡＴＬ−Ａ*０２０１を持つ五量体を、負の対照として使用した。細胞は、室温（ＲＴ）で１０分間五量体染色を行い、０．１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）からなる染色緩衝液で洗浄した。次に、細胞を、室温で１５分間、抗ＣＤ４フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣ（eBioscience社）、抗ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ及び抗ＣＤ３パシフィック・ブルー（ＰＢ）（eBioscience社）染色を行い、染色緩衝液で１回洗浄し、同じ緩衝液で再懸濁してから採取した。細胞内染色のために、１２日ペプチド刺激Ｔ細胞を、ブレフェルディンＡ（BD Bioscience社）１０μｇ／ｍｌ及びＢＤ Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ（BD Bioscience社）１／１０００希釈の存在下で、５：１の目標比率でＴ細胞にペプチドを組み込んだ自己エプスタイン・バル・ウイルスで形質転換されたＢリンパ芽球状細胞系列（ＥＢＶ−ＬＣＬ）によって、一晩刺激した。ペプチドを組み込んでいない標的細胞及びＴ細胞のみを、負の対照として使用した。次に、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキットを用い、製造者の指示に従って、ＣＤ３（eBioscience社）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＦＮ−（eBioscience社）、ＩＬ−２及びＴＮＦ−αについて細胞を染色した。最後に、１％パラホルムアルデヒドを含む染色緩衝液で細胞を再懸濁した。細胞内サイトカイン染色用のすべての抗体及びすべての試薬は、注記のあるものを除き、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社から購入した。ＢＤ ＬＳＲ ＩＩフロー・サイトメーターを用いて１標本につき２５０，０００個のリンパ球が得られ、データはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Treestar Inc.、米国オレゴン州アッシュランド）を用いて分析した。

【0091】

結果
患者はゲムシタビン治療で病勢安定を経験したが、５カ月後、副作用のために治療を中断した。その後、代替治療としてこの患者にＤＣワクチン接種が提供された。ワクチン接種の１８カ月後、患者は完全寛解を経験し、それがワクチン接種後３０カ月（診断後４４カ月）維持されている。患者は独立の病理学者による再診断と検査を受け、同病理学者は膵管腺癌の診断を確認した。

【0092】

手術不能の膵臓癌患者の生存期間中央値は８〜１０カ月で、この例はこの期間を大きく超過している。初回のワクチンのバッチは５×１０^６個の従来のＤＣ（Kyte他２００６）で構成され、患者は１５回のワクチン投与を受けた。ワクチンに対する免疫応答と病勢の安定が実証されたため、新たなワクチン・バッチが作成され、バッチ２とバッチ３は超短期培養成熟ＤＣで、ｈＴＥＲＴのｍＲＮＡを組み込んだ５×１０^６個のＤＣのワクチンが、それぞれ１０回及び１７回投与された。

【0093】

ＤＣワクチンに対する増殖性Ｔ細胞応答は、ワクチン接種後３カ月のｉｎ ｖｉｔｒｏで測定され、６カ月以降安定した。ｈＴＥＲＴをトランスフェクトされたＤＣに対する免疫応答の存在が明らかにされた後、どのｈＴＥＲＴエピトープが、上記免疫応答誘発の原因になったかの調査が所望された。これは、ｈＴＥＲＴペプチド・ライブラリーに対するＴ細胞増殖の測定（図１）、及びｅｘ ｖｉｖｏのＰＢＭＣの五量体染色によって検査された。

【0094】

増殖性Ｔ細胞応答は、オーバーラップペプチドライブラリーの１５−ｍｅｒ ｈＴＥＲＴペプチドのうち６個及び３０−ｍｅｒ ｈＴＥＲＴペプチド１個で検出された。ｈＴＥＲＴ五量体陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞の存在は、ワクチン接種の前後両方で、非刺激ＰＢＭＣＳ中０．１５％〜１．２５％の比率で検出された。ＣＤ８陽性Ｔ細胞の１．２５％の集団は、ワクチン接種後２４カ月（図２Ａ）の新鮮ＰＢＭＣ中で五量体陽性を示し、ｉｎ ｖｉｔｒｏのペプチド刺激後は約３％に増加した（データ表示なし）。

【0095】

７２０ＧＬＬ五量体中に少なくとも２つのＴヘルパー・エピトープ並びにＣＴＬエピトープを含む３０−ｍｅｒ ｈＴＥＲＴペプチドによるｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激を１回行った後、同じペプチドを組み込んだ自己ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞に応答してＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＴＮＦ−αを分泌する少数の多機能ＣＤ４陽性Ｔ細胞が検出できた。ペプチド組み込み標的細胞による刺激後のＣＤ８陽性Ｔ細胞の個体数は、非ペプチド組み込み標的による刺激後と比べて差がなかった（データ表示なし）。ＩＬ−２のバックグラウンド・レベルが高いのは、ｈＴＥＲＴを発現し得る形質転換Ｂ細胞系列によって与えられた多少の刺激のためかもしれない。残念ながら、各実験でのＴ細胞の数が限られていたため、追加の機能アッセイは実施できなかった。

【0096】

考察
この例では、化学療法による治療後にｈＴＥＲＴのｍＲＮＡをトランスフェクトされた自己ＤＣによるワクチン接種という異例の疾患経過をたどった、膵臓癌患者が報告されている。

【0097】

ここに記述された患者は、根治手術後の再発性膵管腺癌で４年以上生存している。当初の診断が正確だったことを確認するために、独立の病理学者によって一次腫瘍の再診断を受けた。

【0098】

患者は、２００６年１月の根治手術後、２００６年１２月に、ＣＴによる判定で肝臓門部、腸骨筋リンパ本管及び後腹膜腔にあるリンパ節の肥大が認められ、再発した。

【0099】

患者は化学療法によく反応し、ＣＴスキャンにより腫瘍の退縮が明らかになった。しかし、化学療法から５カ月後、患者は重篤な副作用を発症し、上記治療は停止された。

【0100】

このような臨床状況において、患者は、化学療法の有効性を固定するために、コンパッショネート・ユースとしてｈＴＥＲＴのｍＲＮＡを組み込んだ自己ＤＣのワクチン接種による治療を提供された。

【0101】

興味深いことに、化学療法の終了後、病勢の進行が起きず、長期の病勢安定と完全寛解の可能性が得られた。６カ月間隔をおいた２回の連続したＰＥＴスキャンで、膵臓及び転移性の病変部位の腫瘍組織は代謝の停止が明らかになった。これらの興味深い所見は、この患者では、使用された免疫治療戦略が臨床的に意味のある免疫応答を誘発したことを示唆する。したがって、上記患者のｈＴＥＲＴに対する免疫応答を記録し、詳細に研究することが重要であった。さらに、ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡの全長をワクチン接種に使用する研究でのｈＴＥＲＴへの詳細な免疫応答に関する情報が完全に欠落しているため、次世代のｈＴＥＲＴワクチンの開発のために、臨床的に意味のあるｈＴＥＲＴエピトープを特定することが重要である。

【0102】

新規のＣＴＬエピトープを持つ五量体と結合するＣＤ８陽性Ｔ細胞が、高い頻度で見られた。これら２つのエピトープは、ＨＬＡ−Ａ*０２０１拘束性であるが、従来記述されていない。興味深いことに、９−ｍｅｒのエピトープ（７２０ＧＬＬ、配列番号：３）は、Schroers他２００２ですでに記述されているペプチドＲ６７２（配列番号：５６）と同じ長さの１５−ｍｅｒのペプチド（７２０、ＰＧＬＬＧＡＳＶＬＧＬＤＤＩＨ−配列番号：５５）に埋め込まれているが、アミノ酸一つ分ｈＴＥＲＴのＣ末端寄りにずれている。したがって、１５−ｍｅｒの両ペプチド内の同じアミノ酸残基がＴ細胞応答の原因になっている可能性がある。重要なのは、増殖アッセイにおいて、同じ１５−ｍｅｒのペプチド（７２０）が本明細書で報告された患者のＴ細胞によっても認識されたことであり、この患者では、ｈＴＥＲＴのこのペプチド断片がＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性の両Ｔ細胞応答を誘発したかもしれないことを示唆する。さらに、他の５つの１５−ｍｅｒのペプチドが、この患者のＴ細胞によって認識された。これらのペプチドのうち３つは、従来報告されていない。これらを総合すると、この結果は、このワクチンがこの患者で少なくとも１０個の異なるｈＴＥＲＴエピトープにＴ細胞応答を誘発したことを示す。配列全体を網羅しないオーバーラップペプチドライブラリーのうち使用したペプチド数は限定的な数にすぎず、また五量体もＨＬＡ−Ａ*０２０１提示ペプチドに限定した少数であったため、エピトープ数は、これよりかなり多いかもしれない。

【0103】

これは、ｈＴＥＲＴペプチドに対する広範な耐性がないこと、及びｈＴＥＲＴのｍＲＮＡをトランスフェクトされたＤＣを用いるワクチン接種戦略が高度に有望であることを示唆する。

【0104】

上記結果は、２個の１５−ｍｅｒペプチドと１個の９−ｍｅｒペプチドを包含する３０−ｍｅｒのｈＴＥＲＴペプチドを認識できるこの患者のＴ細胞が、３つのＴｈ１関連サイトカインを同時に産生することも示す。この種の多機能性は、より高い感染防御能をもたらすことが、従来示されている。Darrah他２００７は、ワクチン接種マウスの大形リーシュマニアに対する感染防御度が、同時にインターフェロンγ（ＩＦＮ−、インターロイキン２及びＴＮＦ−α）を産生するＣＤ４陽性Ｔ細胞の頻度によって予測されることを示した。

【0105】

この患者の非常に特殊な臨床経過は、ワクチン接種及びその結果生じる免疫応答が腫瘍及び転移に影響しているかもしれないことを示唆する。ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡ ＤＣワクチンによってｈＴＥＲＴに対する広範かつ複合した免疫応答が誘発されたことが明らかにされているため、これは大いに考えられることである。その結果、残った腫瘍細胞への免疫攻撃には、ｈＴＥＲＴ特異的ＣＴＬ、ヘルパーＴ細胞サイトカイン産物（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α）の癌細胞、腫瘍結合ストロマや腫瘍新生血管への効果、及び腺癌内に存在する他の腫瘍抗原に対する継続的な自然発生免疫応答の増幅による腫瘍細胞の直接的死滅が関与しているかもしれない。これは、ｈＴＥＲＴ特異的Ｔｈ細胞がｉｎ ｓｉｔｕ又は腫瘍排出リンパ節で腫瘍抗原を手に入れたＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞に遭遇した時に発生し得る。

【0106】

実施例２
新たに治験第Ｉ／ＩＩ相を開始するに先立ち、安全性、認容性及び免疫学的反応を調査するために、肺癌ステージ４の患者１名に、ｈＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトした自己単核白血球由来のＤＣをワクチン接種した。患者は、５×１０^６のＤＣ皮内注射によるワクチン接種を、最初に週次で４回受け、続いて月次で追加免疫ワクチン接種を受けた。４回の標準ワクチン接種の前、５週間後、１２週間後及びその後の毎月に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取した。解凍したＰＢＭＣはトランスフェクトされたＤＣでｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激した。放射線照射とトランスフェクトを受けたＤＣと対照のモック・トランスフェクトされたＤＣを用い、Ｔ細胞増殖アッセイを実施した。さらに、ｈＴＥＲＴ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を五量体染色によってモニターした。治療はよく遂行され、副作用は軽微で、患者の生存期間は予想（１２週間）に比して延びた（７２週間）。患者は、ワクチン接種後のｉｎ ｖｉｔｒｏのｍＲＮＡ組み込みＤＣへの反応として、特異的なＴ細胞増殖を示した。ワクチン接種後の標本では、五量体染色によって、安定した数のｈＴＥＲＴ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞が検出された。ワクチン接種後の別の時点の標本を、２４のオーバーラップｈＴＥＲＴペプチドのパネルに対してさらに検査し、複数のペプチドに対するＴ細胞応答が検出された（図１２）。これらのエピトープへのＴ細胞応答は、ワクチンを接種していない癌患者及びＧＶ１００１テロメラーゼ・ペプチド（配列番号：１０）を以前にワクチン接種した癌患者の両方でも同定されており、このことは、高度の免疫原性とＨＬＡ無差別性を示唆する。実施例１及び２の臨床経験は、ｈＴＥＲＴ−ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＤＣが安全であり、ＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性の両Ｔ細胞の幾つかのテロメラーゼＴ細胞エピトープに対して強固な免疫応答を誘発できることを示す。

【0107】

実施例３
有用な抗腫瘍免疫応答を誘発することのできるペプチドを特定するために、Ｔ細胞応答の誘発に適したテロメラーゼ酵素のペプチドを同定し、数名のワクチン接種患者（ＧＶ１００１ペプチド又はｈＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトした樹状細胞によるワクチン接種）と非ワクチン接種癌患者の検査データに従って並べた。選択された患者、そのワクチン接種状況及び臨床応答の概要を表９に示した。ＧＶ１００１（配列番号：１０）をワクチン接種した患者１名において、ペプチド６６０〜６８９（３０−ｍｅｒ）（配列番号：１）へのＴ細胞応答は、一定の時点ではワクチンのペプチド自体への応答以上に強かったが（図３参照）、他の患者でもこのペプチドに対して強固な免疫応答を示した。同定されたペプチドを表１に示す。これらのペプチドに対するＴ細胞応答は、応答性の検査を行った６名の正常血液ドナーには見られなかった。

【表1】

【0108】

表１に示した１５−又は３０−アミノ酸のペプチドすべてに特異的なＴ細胞クローンは、患者からも採取されている。これらのクローンは、自然に処理されたペプチド（データ表示なし）を認識し、１０ｎｇ／ｍｌの非常に低濃度のペプチドにも応答することが示されたが（図４参照）、このことは、これらがその標的に対して高い親和性を有することを意味する。これは、ペプチド濃度がより低いｉｎ ｖｉｖｏで強力な免疫反応を誘発し得るために重要である。

【0109】

配列番号：１の３０−ｍｅｒポリペプチドは、検査対象のほぼすべての癌患者で反応性を示したため、非常に免疫原性が強いと思われる。このペプチドは、ＧＶ１００１ワクチン（配列番号：１０）のようなＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞によって認識され得るモチーフと、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識され得るモチーフの両方を含む。これらの反応型はいずれも、上記ペプチドで刺激された患者由来のＴリンパ球においてｉｎ ｖｉｔｒｏで検出された。

【0110】

上記９−又は１０−ｍｅｒペプチドに特異的なＣＤ８陽性Ｔリンパ球に結合できる蛍光色素でタグを付けた試薬（五量体）を使用し、主にＧＶ１００１（配列番号：１０）をワクチン接種した多数の癌患者でこれらの細胞の存在を検出した。これらの９−又は１０−ｍｅｒペプチドは、コーカサス系人種集団の約５０％に存在するＨＬＡ−Ａ２分子上に提示されたときに認識され（図５）、及び同集団の２０％に存在するＨＬＡ−Ｂ７分子上に提示されたときに認識され（図６）るが、このことは、両方を合わせるとコーカサス系人種集団の過半数をカバーすることを意味する。

【0111】

さらに、表１に列挙した１５−又は３０−ｍｅｒのペプチドは、検査対象のほぼすべての患者で反応性を示し、このことは、それらがそれらの提示されるＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子に関して無差別であり、集団のほぼすべてに適用可能であり、ＨＬＡスクリーニングの必要がないことを意味する（表２参照）。

【表2】

【0112】

これらのペプチドは、ＧＶ１００１（配列番号：１０）をワクチン接種した患者で反応性を誘発するほか、ｈＴＥＲＴのｍＲＮＡをトランスフェクトした樹状細胞によるワクチンを接種した肺癌患者１名及び膵臓癌患者１名由来の細胞でもＴ細胞応答を誘発した。使用されたｍＲＮＡはｈＴＥＲＴタンパク質の全長の翻訳はしないがその過半をカバーし、表１に列挙したペプチドはこれらの患者に幾つかの最強の応答を誘発する。

【0113】

実施例４
ｈＴＥＲＴペプチド・ライブラリー（表１のポリペプチドを含む）へのＴ細胞応答を、実施例１及び２で報告された患者のほかに５名の患者由来のＴ細胞について決定した。方法は、実施例１又はBernhardt他２００６での従来の説明と同一であった。簡単に述べると、ワクチン接種中の様々な時点で採取したＰＢＭＣを、増殖アッセイでの特異的Ｔ細胞応答の検査に先立ち、オーバーラップｈＴＥＲＴペプチド・ライブラリーで刺激した。結果は図７〜図１３に示す。ペプチドの全数表を表３に示す。

【表3-1】

【表3-2】

【0114】

図７〜図１３のヒストグラムは、７名の患者のオーバーラップｈＴＥＲＴペプチド・ライブラリーに対する応答を示す（膵臓癌患者は実施例１で報告した患者である）。

【0115】

ペプチド６１３−６２７は、ＧＶ１００１（配列番号：１０）に非常に似た配列を有し、ＧＶ１００１を認識する同一の細胞によって認識されると推定されるが、ペプチド６１３−６２７はワクチンのペプチドと同一ではない。

【0116】

最後の２名の患者は３０−ｍｅｒの６６０−６８９（配列番号：１）に対する応答の検査をしていないが、それはこのペプチドが検査後に合成されたためである。配列番号：１のペプチドは、ＧＶ１００１をワクチン接種した肺癌患者に非常に強い応答を起こした。このペプチドを含む培養物由来のＴ細胞クローンの７５％が特異性を有し、このことは、このクローンが、上記患者に高頻度で存在することを示す。これは、図６のヒストグラムに示したｈＴＥＲＴ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の肺がん患者と同一である。

【0117】

検査対象患者（表示の非ワクチン接種患者を除く）はその異例の臨床経過をもとに選定されているので、表１に列挙したペプチドに対して強力な応答が検出されたことは、これらのペプチドが臨床的に意味のあるエピトープであることを示す。

【0118】

実施例５
配列番号：１（３０−ｍｅｒ ６６０−６８９）のポリペプチドの配列を、異なるＨＬＡクラスＩ対立遺伝子と結合すると予測される免疫原性断片について分析した（予測は、ＭＨＣリガンドとペプチド・モチーフのＳＹＦＰＥＩＴＨＩデータベースを用いて実施した）。その結果を表４に示す。

【表4-1】

【表4-2】

【0119】

実施例６
実施例４の患者についての比較を実施した。簡単に述べると、癌の診断とｈＴＥＲＴワクチンのワクチン接種の後に７名の患者を臨床的レスポンダーと確認した。これらの患者は、生存期間の延長と臨床応答の組合せに基づき、レスポンダーと確認された。臨床応答は、病勢安定（ＳＤ）、部分反応（ＰＲ）、又は完全反応（ＣＲ）のいずれかである。ワクチンを接種した黒色腫の患者は、臨床試験への参加時にはステージＩＶと診断されたが、脳への転移はなかった。肺癌患者Ｐ５はステージＩＶで手術不能の肺癌と診断され、また結腸癌患者Ｐ１は後期の手術不能の結腸癌と診断された。肺癌患者Ｐ６は、ステージＩＶで平均余命１２週の肺癌患者であった。膵臓癌患者Ｐ１は、再発性の手術不能の膵臓癌で、平均余命は８〜１０カ月だった。４名の患者（黒色腫Ｐ７−Ｐ８、肺癌Ｐ５及び結腸癌Ｐ１）は、それぞれペプチドＧＶ１００１（配列番号：１０）のワクチン接種を受けた。５番目の患者（肺癌Ｐ６）と６番目の患者（膵臓癌１）は、ｈＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトした樹状細胞によるワクチン接種を受けた。７番目の黒色腫患者Ｐ９は、治験の際にワクチン接種を受けておらず、代わって癌の進行を受けて自然応答が展開した。（８番目及び最後の患者も臨床的レスポンダーと確認されたが、治験ではこの患者の標本は使用できなかった。）

【0120】

次に、実施例１で説明したように、一連のペプチドに対する各患者の増殖性Ｔ細胞応答を決定した。その結果を表５に示し、図１４にグラフで示す。ここでのペプチドの呼称の対応関係は表６に示す（ペプチド７２６とＧＶ１００１の結果はもっぱら比較のためにのみ表示する）。

【表5】

【表6】

【0121】

すべての患者がＧＶ１００１に反応したことが観察された（すなわち彼らはＳＩ＞２であった）。樹状細胞ワクチンを接種した患者では自己ＭＬＣによって惹起されるバックグラウンドが高いため（肺癌Ｐ７及び膵臓癌Ｐ１）、ＳＩ値は他の患者に比べて低い。

【0122】

実施例７
肺癌の診断とＧＶ１００１（配列番号：１０）ペプチドのワクチン接種の後に臨床的ノン・レスポンダーだった４名の患者を調査した。これらの患者はすべて、ＧＶ１００１のワクチン接種を受けたステージＩＶの肺癌患者であった。これらの患者は、ＧＶ１００１に対する免疫応答があるが、それでも病状の進行を経験し、上記ワクチンへの免疫応答のある他の患者に比べて生存期間が短かった患者の中から無作為に選択された。一連のペプチドに対する各患者の増殖性Ｔ細胞応答を一時点で実施例１と同じ方法で決定した。各患者がＧＶ１００１ワクチン接種に対して免疫学的に応答したことを確認する、治験期間中の各患者のＧＶ１００１ペプチドに対するピーク応答も示された。

【0123】

結果を表７に示し、図１５にグラフで示した。また、ペプチドの呼称の対応関係は表６に示す。

【表7】

４名の患者はすべて、配列番号：１、７、８及び９のペプチドへの応答が非常に少ないか又はゼロを示した。

【0124】

実施例８
黒色腫の診断とＧＶ１００１ペプチド（配列番号：１０）のワクチン接種の後に臨床的ノン・レスポンダーだった６名の患者を調査した。これらの患者はすべてステージＩＶの黒色腫患者で、長期生存者である黒色腫患者Ｐ７及びＰ８と同じＧＶ１００１ワクチン接種の治験に参加した（実施例６を参照）。これらの患者は、上記ワクチンに対する免疫応答があるが、それでも生存期間が短かった患者の中から無作為に選択された。このうち５名の患者は病勢の進行も経験し、また１名（黒色腫Ｐ３）の患者は多少の病勢安定を経験したが、それでも生存期間は短かった。一連のペプチドに対する各患者の増殖性Ｔ細胞応答を、一時点で実施例１と同じ方法で決定した。各患者がＧＶ１００１ワクチン接種に対して免疫学的に応答したことを確認する、治験期間中の各患者のＧＶ１００１ペプチドに対するピーク応答も示された。

【0125】

結果を表８に示し、図１６にグラフで示した。また、ペプチドの呼称の対応関係は表６に示す。

【表8】

６名の患者はすべて、配列番号：１、７、８及び９のペプチドへの応答が非常に少ないか又はゼロを示した。

【0126】

実施例１〜８の結論
実施例１〜８で調査した患者を表９にまとめる。すべての患者はＧＶ１００１ペプチドに対して免疫学的に応答した。各患者を、病勢安定（ＳＤ）、腫瘍退縮（ＰＲ又はＣＲ）及び予想外の長期生存などの臨床応答に基づいて、臨床的レスポンダー又は臨床的ノン・レスポンダーのいずれかに分類した。臨床的レスポンダーと臨床的ノン・レスポンダーは、いずれも同一又は類似のワクチンの治験から選択した。

【表9】

【0127】

ここで提示されたデータは、少なくとも一部の個体において、配列番号：１〜９のペプチドのいずれかの個体への投与が、投与されたペプチドに対するＴ細胞応答を誘発することを強く示唆する。他のｈＴＥＲＴペプチドワクチン又はトランスフェクトされた樹状細胞が投与された患者での配列番号：１〜９のペプチドに対するＴ細胞応答の存在は、配列番号：１〜９のペプチドに患者のＭＨＣ分子が結合してこれを提示し得ること、及び患者がその持ち駒として、上記ペプチドが提示された際にそれと結合できるＴ細胞を有することを示す。このため、配列番号：１〜９のペプチドが個体に投与された時に、上記ペプチドに対するＴ細胞応答が予想される。

【0128】

さらに、実施例６〜８で提供されたデータは、本明細書で記述される配列番号：１、７、８及び９のｈＴＥＲＴペプチドへのＴ細胞応答が、異なる形態の癌の患者における良好な臨床応答と結びついていることを明らかにする。ｈＴＥＲＴワクチンで同様に治療され、このワクチンに応答した数名の短期生存者では、配列番号：１、７、８及び９のｈＴＥＲＴペプチドへの応答が散発的にしか観察されなかった。また、これらの短期生存者の一部では、ＧＶ１００１ペプチドへの応答が強かったことも注目に値する。このペプチドへの免疫応答のある患者の過半数で生存期間が短かったことから、本発明者らは、この結果を、単一のペプチド（すなわちＧＶ１００１）のみへの反応では臨床応答／長期生存をもたらすには不十分なことを意味すると解する。

【0129】

このことは、患者が免疫応答を示したｈＴＥＲＴペプチドの数を患者の生存期間と比較する、図１７に示した散布図分析によって確認される。図１７に見られるように、生存期間の長期化と免疫応答をするｈＴＥＲＴペプチド数の多さとの間に明らかな相関がある。

【0130】

さらに、図１８に示す分析は、ＧＶ１００１のほかに２つ以上のｈＴＥＲＴペプチドに対して応答する患者は、ＧＶ１００１のほかに０又は１個のｈＴＥＲＴペプチドへの免疫応答を示す患者に比べ、統計的に有意に生存期間が延びたことを明らかにする。

【0131】

そのうえ、本明細書で開示されるデータは、有益な免疫応答における配列番号：１、７、８及び９のｈＴＥＲＴペプチドの重大な役割を示す強力な証拠を提供する。したがって、これらの新規ペプチドの免疫活性化は、より多くの患者に臨床的に意味のある免疫応答を誘発し、結果的に、ＧＶ１００１ペプチド単独のワクチン接種の場合よりも生存期間の伸びる患者数が増えるはずである。

【0132】

本発明者らは、臨床的に良好でない患者と異なり、臨床的レスポンダーでは無関係なペプチドのワクチン接種後に配列番号：１、７、８及び９のペプチドに対する応答が自然に起きることを実証している。この自然免疫の背後にあるメカニズムは、ｈＴＥＲＴを持っている死んだ腫瘍細胞を飲み込み、上記ｈＴＥＲＴタンパク質を自己のタンパク質分解機構で処理して、本明細書の配列番号：１、７、８及び９のペプチドに対応する自然処理による多量のｈＴＥＲＴペプチドの配列を産出した抗原提示細胞によるこれらのペプチドの提示であると考えられる。同ペプチドの多くがｈＴＥＲＴのｍＲＮＡをトランスフェクトされた抗原提示細胞（樹状細胞）によって免疫を得た患者から採取したＴ細胞によって認識され、またこれらの患者がワクチン接種後に異例の良好な経過をたどったという証明は、この概念をさらに強化する。本発明のペプチド又はこうしてすでに臨床的に効果が実証されたペプチドカクテルのワクチン接種を通じてこれらの応答を追加し、又は誘発することによって、はるかに多くの割合の患者の臨床応答及び生存期間の延長を誘発することが可能である。

【0133】

実施例９
ペプチドカクテルの製造のための混合に適するであろうペプチドの最も有効な組合せを求めて、実施例１〜８の結果を検討した。次の理由で、配列番号：１、７及び９のペプチドが相補効果を有することが観察された。

【0134】

配列番号：１、７及び９のそれぞれのＭＨＣ結合モチーフ並びに上記配列の免疫原性断片を表１０に示す。

【表10】

【0135】

表１０からわかるように、配列番号：１、７及び９のペプチド並びにその免疫原性断片は、Ｔｈ又はＣＴＬのいずれかのエピトープを提示する広範なＨＬＡ分子と結合できる。このため、これらのペプチドは非常に幅広い患者集団に対して免疫応答を起こすことができる。

【0136】

さらに、配列番号：１、７及び９のペプチドは、実施例６で報告した臨床的レスポンダーである患者について横断的に免疫原性が証明されており、また臨床的ノン・レスポンダーよりも臨床的レスポンダーにおいて比較的強い免疫応答が証明されている。

【0137】

より具体的には、配列番号：１のペプチドについて、臨床的ノン・レスポンダーでは１０名中１名に免疫応答があったのに対し、臨床的レスポンダーでは７名中７名に免疫応答があった。応答性のある長期生存者のうち数名は、五量体分析によりＣＴＬ応答も示した。

【0138】

配列番号：７のペプチドについては、臨床的ノン・レスポンダーでは１０名中１名に免疫応答があったのに対し、臨床的レスポンダーでは７名中５名に免疫応答があった。

【0139】

配列番号：９のペプチドについては、五量体分析で３名の患者（うち１名は増殖性応答を示す３名とは別人）が示したＣＴＬ応答に加え、臨床的ノン・レスポンダーでは１０名中０名に免疫応答があったのに対し、臨床的レスポンダーでは７名中３名に免疫応答があった。

【0140】

したがって、この結果分析から、配列番号：１、７及び９のペプチドカクテルは広範囲の人間集団について高レベルの有効性を有すると予想されることを実証する。

【0141】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]