特許 6042425 肺傷害、喘息、アナフィラキシー、血管性浮腫、全身性血管透過性症候群および鼻閉を処置するためのペプチド組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6042425

(24)【登録日】2016年11月18日

(45)【発行日】2016年12月14日

(54)【発明の名称】肺傷害、喘息、アナフィラキシー、血管性浮腫、全身性血管透過性症候群および鼻閉を処置するためのペプチド組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/705 20060101AFI20161206BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20161206BHJP

   C07K 7/06 20060101ALI20161206BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20161206BHJP

   A61K 47/48 20060101ALI20161206BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20161206BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20161206BHJP

   A61P 7/10 20060101ALI20161206BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20161206BHJP

   A61P 11/02 20060101ALI20161206BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/705ZNA

   C07K7/08

   C07K7/06

   A61K37/02

   A61K47/48

   A61P11/00

   A61P11/06

   A61P7/10

   A61P37/08

   A61P11/02

【請求項の数】27

【全頁数】33

(21)【出願番号】特願2014-515930(P2014-515930)

(86)(22)【出願日】2012年6月13日

(65)【公表番号】特表2014-518211(P2014-518211A)

(43)【公表日】2014年7月28日

(86)【国際出願番号】US2012042118

(87)【国際公開番号】WO2012174028

(87)【国際公開日】20121220

【審査請求日】2015年4月21日

(31)【優先権主張番号】61/496,409

(32)【優先日】2011年6月13日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】503060525

【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ イリノイ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】コマロバ， ユリア エー．

(72)【発明者】

【氏名】サキブ， ウズマ

(72)【発明者】

【氏名】ボーゲル， スティーブン エム．

(72)【発明者】

【氏名】マリック， アスラー ビー．

【審査官】 松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／０１９０６９１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００８／０３１７７７３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０１１１７５４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／０７２８４３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 LolC/E family lipoprotein releasing system, transmembrane protein [Rhodopirellula baltica WH47]，NCBI Protein database [オンライン]，２０１１年 ４月 ６日，ACCESSION EGF28231， [検索日 2016.02.16],インターネット: <URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/327541710/>

【文献】 ITPR3 protein, partial [Homo sapiens]，NCBI protein database，２００７年 ７月２５日，ACCESSION AAI46647， [検索日 2016.02.16],インターネット: <URL：http://http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAI46647.1>

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １４／７０５

Ｃ０７Ｋ ７／０６

Ｃ０７Ｋ ７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１および配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチド。

【請求項2】

前記ペプチドが担体ペプチドに連結されている、請求項１に記載のペプチド。

【請求項3】

前記担体ペプチドがアンテナペディアペプチド（ＡＰ）である、請求項２に記載のペプチド。

【請求項4】

前記ペプチドがミリストイル化されている、請求項３に記載のペプチド。

【請求項5】

薬学的に許容され得る賦形剤および請求項１に記載のペプチドを含む薬学的製剤。

【請求項6】

肺傷害を処置するための組成物であって、請求項１に記載のペプチドを含む組成物。

【請求項7】

前記肺傷害が水腫である、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

前記肺傷害が炎症媒介性血管漏出である、請求項６に記載の組成物。

【請求項9】

前記肺傷害が喘息である、請求項６に記載の組成物。

【請求項10】

前記喘息がアレルギー性喘息である、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

前記喘息が慢性または急性である、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

全身性血管透過性症候群を処置するための組成物であって、請求項１に記載のペプチドを含む組成物。

【請求項13】

前記全身性血管透過性症候群が内毒血症による、請求項１２に記載の組成物。

【請求項14】

前記全身性血管透過性症候群が外傷による、請求項１２に記載の組成物。

【請求項15】

前記全身性血管透過性症候群が複数回の輸注による、請求項１２に記載の組成物。

【請求項16】

前記全身性血管透過性症候群が薬物処置の副作用として発生する、請求項１２に記載の組成物。

【請求項17】

前記薬物処置が、癌を処置するためのＩＬ−２の全身性使用である、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

血管性浮腫を処置するための組成物であって、請求項１に記載のペプチドを含む組成物。

【請求項19】

前記血管性浮腫が、アレルゲン誘導性血管性浮腫および非アレルゲン誘導性血管性浮腫からなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。

【請求項20】

前記アレルゲン誘導性血管性浮腫が喉頭血管性浮腫である、請求項１９に記載の組成物。

【請求項21】

前記喉頭血管性浮腫が食物アレルギーまたはハチ類刺傷毒注入の後に起こる、請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

前記非アレルゲン誘導性血管性浮腫が補体因子１インヒビター欠乏誘導性または画像化造影色素誘導性血管性浮腫である、請求項１９に記載の組成物。

【請求項23】

アナフィラキシーを処置するための組成物であって、請求項１に記載のペプチドを含む組成物。

【請求項24】

前記アナフィラキシーが、アレルゲン誘導性反応および非アレルギー性アナフィラキシー様反応からなる群から選択される、請求項２３に記載の組成物。

【請求項25】

前記非アレルギー性アナフィラキシー様反応が造影色素による、請求項２４に記載の組成物。

【請求項26】

アレルギー性鼻炎または非アレルギー性鼻炎に関連した鼻閉を処置するための組成物であって、請求項１に記載のペプチドを含む組成物。

【請求項27】

前記鼻閉が刺激物に関連するものであるかまたは呼吸器系ウイルスに関連するものである、請求項２６に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、炎症媒介性血管漏出および浮腫の発生を始めとする肺傷害を処置するためのペプチドに関する。本発明はまた、このペプチドを用いて、喘息、アナフィラキシー、血管性浮腫、全身性血管透過性症候群、および鼻閉（ｎａｓａｌ ｃｏｎｇｅｓｔｉｏｎ）を処置することに関する。

【背景技術】

【0002】

背景
微小管（ＭＴ）細胞骨格は、内皮バリア制御の重要なコントロールポイントを提供する；しかしながら、この鍵となる細胞骨格要素の役割は十分には研究されていない。ＭＴ安定化薬のタキソールは、マウスモデルにおいて肺傷害を軽減することが示されており、そのことは、ＭＴが、肺血管透過性の増加を媒介することにおいて重要である可能性があることを示唆している。しかしながら、タキソールは、一般的毒性を示し、そのことにより、医師および彼らの患者にとって不都合な薬物となっている。

【0003】

微小管末端結合タンパク質は、伸長中の微小管（ＭＴ）に結合し、かつＭＴ崩壊事象を抑制する、高度に保存された、微小管プラス端トラッキングアクセサリー因子（ｐｌｕｓ−ｅｎｄ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）である。２つのそのような末端結合タンパク質である、ＥＢ１およびＥＢ３は、内皮バリアの透過性の主要な決定要因である、内皮細胞骨格の動態および細胞形状変化を制御することに役割を果たす。

【0004】

Ｃａ２＋は、内皮透過性および血管恒常性を制御する、非常に万能のセカンドメッセンジャーである。ＰＡＲ−１活性化の下流のホスホリパーゼＣβ（ＰＬＣβ）の活性化は、ホスファチジル（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌ）イノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）のイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）とジアシルグリセロール（ＤＡＧ）への加水分解を媒介する。ＩＰ３は、ＩＰ３感受性細胞内ストア、すなわち小胞体（ＥＲ）からのＣａ２＋放出を刺激する。ＥＲストアからのＣａ２＋の枯渇は、ＥＲ膜上のＩＰ３Ｒの活性化によって媒介され、細胞内Ｃａ２＋の一過性増加をもたらす。Ｃａ２＋移入または「流入」は、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含む様々な陽イオンに対して透過性である一過性受容器電位カノニカル（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃａｎｏｎｉｃａｌ；ＴＲＰＣ）チャネルによって媒介される。ＴＲＰＣ１およびＴＲＰＣ４は、ＥＲからの枯渇によって活性化される、内皮肺微小血管細胞におけるストア作動性Ｃａ２＋チャネル（ｓｔｏｒｅ−ｏｐｅｒａｔｅｄ Ｃａ２＋ ｃｈａｎｎｅｌ；ＳＯＣ）である。

【0005】

Ｃａ２＋の細胞内濃度の増加は、プロテインキナーゼＣα（ＰＫＣα）の活性を上方制御する。ＰＫＣαは、マルチメディエータに対する内皮透過性応答の重要な制御因子である（２）。ＰＫＣαは、ｐ１２０−カテニンをリン酸化し、それのＶＥ−カドヘリンからの解離を媒介し、それにしたがって、ＶＥ−カドヘリン内部移行を生じる。ＰＫＣαはまた、ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦおよびＧＤＩ−１をリン酸化することによってＲｈｏＡ活性化の上流で働く。次に、ＲｈｏＡは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）を活性化することによってミオシン軽鎖ホスファターゼ（ＭＬＣＰ）のリン酸化誘導性阻害を促進する。ＭＬＣＰの阻害は、ＭＬＣＫのＣａ２＋／カルモジュリン依存性活性化を伴い、その活性化は、ＭＬＣのリン酸化をもたらし、トロンビンおよびヒスタミンなどの炎症促進性メディエーターに応答したアクトミオシン収縮を誘導する。

【0006】

ＭＴ細胞骨格の完全性は、ＥＲストアからのＩＰ３誘導性Ｃａ２＋放出に必要とされる。ＭＴ不安定化剤またはＭＴ安定化剤ノコダゾール、コルヒチン、およびタキソールによるＭＴ動態の変化は、Ｃａ２＋のＩＰ３ゲート化放出を阻害し、ＭＴ動態が、ＩＰ３Ｒの完全活性化に必要とされることを示唆している。ＭＴ細胞骨格は、ＥＲのリモデリングに関与し、したがって、外部刺激に応答したＣａ２＋波の組織化および伝播を確実にする。ＥＲは、ＥＢ１およびＥＢ３と間質相互作用分子１（ＳＴＩＭ１）との直接的相互作用を通して、ＭＴ伸長末端に付着し、一緒に伸びる。ＨｅＬａ（ＨｅＬａ細胞はＥＢ３を発現しない）におけるＥＢ１の枯渇は、ＥＲ突出事象を減少させるが、タプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）によるＳＯＣの活性化を阻害せず、このことは、上皮細胞におけるＳＯＣの活性化およびカルシウムシグナル伝達の伝播に何らかの他の機構が関与していることを示唆する。内皮細胞において、カベオラにおけるＩＰ３Ｒの局在化は、ＥＲ Ｃａ２＋ストア枯渇およびＳＯＣ活性化の両方にとって重要な意味をもつ。これは、ＩＰ３Ｒの活性化および／またはそれのＩＰ３に対する応答性が、カルシウムシグナル伝達の重要な要素であることを示す。ＭＴ細胞骨格は、ＩＰ３に応答してＩＰ３Ｒ活性化を正に制御し、したがって、細胞中に細胞外シグナルを伝達し、生理的応答を誘発すると提唱される。

【0007】

米国における支持療法の進歩にも関わらず、敗血症の間の好中球浸潤およびサイトカインと炎症促進性メディエーターの放出に関連した複合性炎症応答である、急性肺傷害（ＡＬＩ）により毎年約１００，０００人の患者が死亡している。その疾患の特性である、肺血管の透過性亢進は、肺水腫の形成をもたらす。内皮バリアの機能障害を予防または処置するための新規の治療が必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

発明の概要
本明細書に、単離されたペプチドが提供されている。そのペプチドは、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、それらの断片、またはそれらのバリアントを含んでもよい。そのペプチドはまた、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、それらの断片、またはそれらのバリアントからなってもよい。バリアントは、保存的置換を含んでもよい。バリアントは、最小ＥＢ結合コンセンサスモチーフ配列である、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−ｘ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ配列を含有する任意のペプチド配列を含んでもよい。そのペプチドは、ミリストイル化されてもよいし、または担体ペプチドに連結されてもよい。担体ペプチドは、アンテナペディアペプチド（ＡＰ）であってもよい。ペプチドは、薬学的製剤の一部であってもよく、その製剤は、薬学的に許容され得る賦形剤を含んでもよい。

【0009】

肺傷害を処置する方法もまた本明細書で提供されており、その方法は、そのペプチドを含む組成物を、それを必要とする患者に、投与することを含み得る。肺傷害は、水腫、炎症媒介性血管漏出、または喘息であってもよく、喘息はアレルギー性喘息であってもよい。アレルギー性喘息は、慢性でも急性でもよい。

【0010】

全身性血管透過性症候群を処置する方法もまた本明細書で提供されており、その方法は、そのペプチドを含む組成物を、それを必要とする患者に、投与することを含み得る。その症候群は、内毒血症、外傷、または複数回の輸注（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ）によるものであってもよい。その症候群はまた、薬物処置の副作用として発生したものであってもよく、その薬物処置は、癌を処置するためのＩＬ−２の全身性使用であってもよい。

【0011】

血管性浮腫を処置する方法が本明細書で提供されており、その方法は、そのペプチドを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含み得る。血管性浮腫は、アレルゲン誘導性血管性浮腫でも非アレルゲン誘導性血管性浮腫でもよい。アレルゲン誘導性血管性浮腫は、喉頭血管性浮腫であってもよく、それは、食物アレルギーまたはハチ類（ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａｎ）刺傷毒注入の結果として起こってもよい。非アレルゲン誘導性血管性浮腫は、補体因子１インヒビター欠乏誘導性または画像化造影色素（ｉｍａｇｉｎｇ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｄｙｅ）誘導性の血管性浮腫であってもよい。

【0012】

アナフィラキシーを処置する方法もまた本明細書で提供されており、その方法は、そのペプチドを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含み得る。アナフィラキシーは、アレルゲン誘導性反応でも非アレルギー性アナフィラキシー様反応でもよい。非アレルギー性アナフィラキシー様反応は、造影色素によるものであってもよい。

【0013】

全身性血管透過性を処置する方法が本明細書で提供されており、その方法は、そのペプチドを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含み得る。全身性血管透過性は、内毒血症に関連してもよい。

【0014】

鼻閉を処置する方法もまた本明細書で提供されており、その方法は、そのペプチドを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含み得る。鼻閉は、アレルギー性鼻炎または非アレルギー性鼻炎に関連してもよい。鼻閉は、刺激物に関連するものであってもよく、または呼吸器系ウイルスに関連するものであってもよい。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、それらの断片、およびそれらのバリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチド。
（項目２）
前記ペプチドが担体ペプチドに連結されている、項目１に記載のペプチド。
（項目３）
前記担体ペプチドがアンテナペディアペプチド（ＡＰ）である、項目２に記載のペプチド。
（項目４）
前記ペプチドがミリストイル化されている、項目３に記載のペプチド。
（項目５）
薬学的に許容され得る賦形剤および項目１に記載のペプチドを含む薬学的製剤。
（項目６）
肺傷害を処置する方法であって、項目１に記載のペプチドを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
（項目７）
前記肺傷害が水腫である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記肺傷害が炎症媒介性血管漏出である、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記肺傷害が喘息である、項目６に記載の方法。
（項目１０）
前記喘息がアレルギー性喘息である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記喘息が慢性または急性である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
全身性血管透過性症候群を処置する方法であって、項目１に記載のペプチドを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
（項目１３）
前記全身性血管透過性症候群が内毒血症による、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記全身性血管透過性症候群が外傷による、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記全身性血管透過性が複数回の輸注による、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記全身性血管透過性症候群が薬物処置の副作用として発生する、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
前記薬物処置が、癌を処置するためのＩＬ−２の全身性使用である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
血管性浮腫を処置する方法であって、項目１に記載のペプチドを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
（項目１９）
前記血管性浮腫が、アレルゲン誘導性血管性浮腫および非アレルゲン誘導性血管性浮腫からなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記アレルゲン誘導性血管性浮腫が喉頭血管性浮腫である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記喉頭血管性浮腫が食物アレルギーまたはハチ類刺傷毒注入の後に起こる、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記非アレルゲン誘導性血管性浮腫が補体因子１インヒビター欠乏誘導性または画像化造影色素誘導性血管性浮腫である、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
アナフィラキシーを処置する方法であって、項目１に記載のペプチドを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
（項目２４）
前記アナフィラキシーが、アレルゲン誘導性反応および非アレルギー性アナフィラキシー様反応からなる群から選択される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記非アレルギー性アナフィラキシー様反応が造影色素による、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
アレルギー性鼻炎または非アレルギー性鼻炎に関連した鼻閉を処置する方法であって、項目１に記載のペプチドを含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
（項目２７）
前記鼻閉が刺激物に関連するものであるかまたは呼吸器系ウイルスに関連するものである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
配列番号１、配列番号３、それらの断片、およびそれらのバリアントからなる群から選択される配列を含む単離されたペプチド。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１は、ＥＢ３の枯渇が、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）−１の活性化に応答してのストアからのＣａ^２＋放出を阻害することを示す。Ａ．ＥＢ１、ＥＢ３、およびルシフェラーゼのいずれかに対するｓｈＲＮＡを発現するＨＭＶＥＣに、Ｆｕｒａ ２−ＡＭをローディング（ｌｏａｄ）し、細胞外Ｃａ^２＋の非存在下（−［Ｃａ^２＋］_０）および存在下（１．５ｍＭ［Ｃａ^２＋］_０）でトロンビン（５０ｎＭ）での細胞の刺激後、３４０（Ｃａ^２＋結合型）Ｆｕｒａ／３８０（遊離Ｆｕｒａ）比を計算した。矢印、トロンビン添加の時点。ＥＢ３の欠失が、細胞内Ｃａ^２＋濃度の増加を著しく低下させたことに注目されたい。Ｂ．プロットは、基礎値に対する最大増加として計算されたトロンビン誘導性のＣａ^２＋の放出および移入についての平均±ＳＤを示す。増加は、同じカバーガラスからの対照の非トランスフェクション細胞に対して正規化されている（ｎ＝９）。

【図2】図２は、肺の炎症の関連におけるＥＢ３のＩＰ３Ｒ３およびＴＲＰＣ１との相互作用を示す。ＷＴマウスおよびＴＬＲ４ ＫＯマウスは、内毒素リポ多糖（ＬＰＳ）（グラム陰性細菌の外膜の成分）の単回の腹腔内注射（ｉ．ｐ．）を受け、そのＬＰＳは、１０ｍｇ／体重ｋｇで哺乳動物において強い免疫応答を誘発する。肺を、示された時点において単離した。ＥＢ３を全肺ホモジネートから免疫沈降した。生じた沈殿物を、ＴＲＰＣ１、ＩＰ_３Ｒ_３、およびＥＢ３についてプローブ（ｐｒｏｂｅ）した。ＴＬＲ４（ＬＰＳ受容体）の欠失はＥＢ３のＴＲＰＣ１との相互作用を変化させることに注目されたい。それはまた、ＩＰ_３Ｒ_３への結合の増加を阻止する。ＴＬＲ４^−／−肺におけるＥＢ３のＩＰ_３Ｒ_３への結合は、ＷＴに匹敵することに注目されたい。データは、２つの独立した実験を代表する。

【図3】図３は、ＥＢ結合モチーフ（赤色で強調）を有するヒトＩＰ_３受容体（ＩＰ３Ｒ ３型のアミノ酸７９４〜８１４）のアラインメントを示す。ＩＰ_３Ｒ_３ペプチド（配列番号１）は下部に緑色で示されている。

【図4】図４は、ＥＢ３構造のリボン表示（マゼンタ色）およびＥＢ３の疎水性結合グルーブ（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｒｏｏｖｅ）へドッキングされたＩＰ３Ｒ３由来ペプチド（配列番号１）（緑色の球と棒）を示す；１８０°回転が示されている。ＩＰ３Ｒ３誘導体ペプチドを、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ３．０ソフトウェアと共にＺ−Ｄｏｃｋプログラムを用いてドッキングさせた。そのペプチドとＥＢ３との間の結合エネルギーは、−６８．８８２ｋｃａｌ／ｍｏｌであると計算された。

【図5】図５は、ＩＰ_３Ｒ_３ペプチド（配列番号１）が、ＰＡＲ−１活性化に応答してのＥＲからのＣａ^２＋放出を阻害することを示す。Ａ．ＡＰ付着ＩＰ_３Ｒ_３ペプチドまたは対照（ＡＰ）ペプチドで前処理されたＨＭＶＥＣに、Ｆｕｒａ ２−ＡＭをローディングし、細胞外Ｃａ^２＋の非存在下および存在下で、トロンビン（５０ｎＭ）での細胞の刺激後、３４０／３８０比を計算した。矢印、トロンビン添加の時点。Ｂ．プロットは、基礎値に対する最大増加として計算されたトロンビン誘導性のＣａ^２＋の放出および移入についての平均±ＳＤを示す。増加は、同じ実験からの対照の未処理細胞に対して正規化されている（ｎ＝４）。

【図6】図６は、ＩＰ_３Ｒ_３ペプチド（配列番号１）が、エクスビボ肺調製物において、ＥＢ３とＩＰ_３Ｒ_３との間の相互作用を阻害することを示す。単離された肺は、２０分間の平衡灌流、その後、１０μＭ ＡＰ−ＩＰ_３Ｒ_３ペプチドでの３０分間の灌流を受けた。その５分後において、３０μＭ ＰＡＲ−１アゴニストペプチドＴＦＬＬＲＮ−ＮＨ２（ＰＡＲ−１ ａ．ｐ．）を２０分間、注入した（群ＩＰ_３Ｒ_３＋ＰＡＲ−１）。別の群に、３０μＭ ＰＡＲ−１アゴニストペプチドだけを注入した（群ＰＡＲ−１）。その後、肺を用いて肺ホモジネートを調製し、それを用いて、ＩＰ_３Ｒ_３ペプチドのＥＢ３／ＩＰ_３Ｒ_３相互作用への効果を決定した。ＥＢ３を、特異的抗体で免疫沈降し、生じた沈殿物を、ＥＢ３およびＩＰ_３Ｒ_３についてプローブした。ＰＡＲ−１受容体の活性化は、ＥＢ３／ＩＰ_３Ｒ_３相互作用を基礎レベル（対照群）と比較して有意に増加させたが（群ＰＡＲ−１）、多量（ｐｒｏｆｕｓｉｏｎ）のＩＰ_３Ｒ_３ペプチドは、活性化された肺微小血管系においてこの相互作用を阻害することに注目されたい。

【図7】図７は、ＩＰ_３Ｒ_３ペプチド（配列番号１）が、ＰＡＲ−１活性化に応答しての肺血管透過性（Ｋ_ｆ，ｃ、微小血管濾過係数）の増加を緩和することを示す。エクスビボ肺調製物は、２０分間の平衡灌流、その後、１０μＭ ＡＰ−ＩＰ_３Ｒ_３ペプチドでの３０分間の灌流を受けた。その５分後において、３０μＭ ＰＡＲ−１アゴニストペプチドＴＦＬＬＲＮ−ＮＨ２（ＰＡＲ−１ ａ．ｐ．）を、Ｋ_ｆ，ｃ測定前に２０分間、注入した。１群あたりｎ＝３〜５。バー±ＳＤ、ＡＮＯＶＡにより^＊ｐ＜０．０５。ＡＰ−ＩＰ_３Ｒ_３で灌流された肺においてＰＡＲ−１活性化に応答した血管透過性の有意な変化はないことに注目されたい。

【図8】図８は、ＬＰＳ誘導性炎症の関連において、ＩＰ_３Ｒ_３ペプチド（配列番号１）が、肺における好中球の浸潤を緩和することを示す。マウスは、ＬＰＳ（３０ｍｇ／体重ｋｇ；大腸菌ＬＰＳ ０１１１：Ｂ４；ＬＤ５０用量）の単回腹腔内注射を受け、２時間目および６時間目に、分析のために用いられた。肺をＰＢＳで灌流し、重量を計り、凍結し、肺における肺好中球（ＰＭＮ）の尺度である、肺ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を測定するために用いた。ｎ＝６マウス／群。

【図9】図９は、ＩＰ_３Ｒ_３ペプチド（配列番号１）がＬＰＳ誘導性敗血症における死亡を防ぐことを示す。ＬＰＳ注射前にＩＰ_３Ｒ_３ペプチドで処理されたマウスは、ＬＤ５０（３０ｍｇ／ｋｇ ＬＰＳ、Ａ）でチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）した対照マウスおよびＬＤ９０（５０ｍｇ／ｋｇ ＬＰＳ、Ｂ）でチャレンジした対照マウスにおける死亡率の低下を示した。（ｎ＝１１〜１５マウス／群、ＡＮＯＶＡにより対照処理（ＡＰ対照）に対してＡＰ−ＩＰ_３Ｒ_３がｐ＜０．００１）。マウスを、ＩＰ_３Ｒ_３の後眼窩静脈内注射の前に、ケタミン、１０ｍｇ／ｍｌ；キシラジン、０．２５ｍｇ／ｍｌ、およびアセプロマジン、０．２５ｍｇ／ｍｌの混合物で麻酔した。

【図10】図１０は、ＩＰ_３Ｒ_３ペプチド（配列番号１）が多微生物性敗血症における死亡を防ぐことを示す。ＩＰ_３Ｒ_３ペプチドで処理されたマウスは、ＣＬＰ後の１２０時間の期間における死亡率の低下が認められる。６〜８週齢のＣＤ−１マウスに、ＣＬＰ手術の３０分前、ならびに２４時間後および４８時間後に、ＩＰ_３Ｒ_３ペプチド（１μＭ／体重ｋｇ）を静脈内注射した。盲腸をそれの中間点で結紮し、盲腸内容物を、遠位部分の方へ優しく押した。１６ゲージの針を用いて、盲腸を、盲腸の結紮部と先端との中間で、腸間膜から対腸間膜の方向（ｍｅｓｅｎｔｒｉｃ−ｔｏ−ａｎｔｉ−ｍｅｓｅｎｔｒｉｃ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）へ穿刺した。腸間膜側および対腸間膜側の両方の貫通穴から少量の糞が押し出された。偽手術（ｓｈａｍ）対照において、開腹手術のみを実施した。マウスを麻酔した。生存は、対照よりＩＰ_３Ｒ_３ペプチド群において有意により高かった（ｎ＝１０マウス／群）。死亡率の差を、ログランク検定によって評価した（ｐ＜０．０５）。

【図11】図１１は、マウス生存におけるＩＰ_３Ｒ_３ペプチドの用量反応を示す。示された用量のＩＰ_３Ｒ_３ペプチドで処理されたＣＤ−１マウスに、ＬＤ８０用量（５０ｍｇ／ｋｇ ＬＰＳ）でのＬＰＳを腹腔内注射し、５日間、モニターした。生存率（％）を、対数スケールのペプチド用量に対してプロットした。Ｓ字形用量反応曲線をデータ点に当てはめた。ｎ＝１０マウス／群。マウスを、ペプチドの後眼窩注射前に、麻酔導入チャンバー内の室内空気中２．５％イソフルランで麻酔した。同軸チューブを有する特別に設計された齧歯類フェイスマスク（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、ＡＨ ７２−３０２６）を用いて、静脈内注射中、麻酔を維持した。

【図12】図１２は、ＥＢＩＮ（配列番号３）（緑色の棒）およびＩＰ_３Ｒ_３ペプチド（黄色の棒）（配列番号１）との複合体におけるＥＢ３のリボン表示（マゼンタ色）を示す。計算された結合エネルギーは、ＩＰＲおよびＥＢＩＮについて、それぞれ、−６８．８８２および−６０．２５１である。

【図13】図１３は、ＥＢＩＮ（配列番号３）がＩＰ３Ｒ３とＥＢ３との間の相互作用を阻害することを示す。１μＭのＡＰ−ＥＢＩＮまたは対照ペプチド（ＡＰ）で前処理されたＨＰＡＥＣを、５０ｎＭのトロンビンでチャレンジした。ＥＢ３とＩＰ_３Ｒ_３との間の相互作用を、トロンビン刺激後の種々の時点で分析した。ＥＢ３を特異的抗体で免疫沈降させ、生じた沈殿物を、ＥＢ３およびＩＰ_３Ｒ_３についてプローブした。ＥＢＩＮは、基礎において、およびトロンビン処理後において、ＥＢ３−ＩＰ_３Ｒ_３相互作用を著しく低下させた。

【図14】図１４は、Ｍｙｒ−ＥＢＩＮ（配列番号３）が、細胞内カルシウムにおけるアゴニスト誘導性増加を緩和することを示す。５０ｎＭトロンビン（Ａ）または９０μＭヒスタミン（Ｂ）でのＨＰＡＥＣ単層の刺激後の［Ｃａ２＋］ｉトランジェント（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）。平均値；ｎ＝２０細胞。矢印、刺激の時点。ＥＢＩＮ（青色トレーサー）が、対照ペプチド（結合性喪失；ＦＡＥＩＰＴＩ（配列番号４））処理細胞（赤色トレーサー）における［Ｃａ^２＋］ｉトランジェントを著しく低下させたことに注目されたい。

【図15】図１５は、ＥＢＩＮ（配列番号３）がアゴニスト誘導性内皮傍細胞透過性亢進を軽減することを示す。５０ｎＭのａ−トロンビン（Ａ）および５０μＭのヒスタミン（Ｂ）に応答した、ＨＰＡＥＣ単層の経内皮電気抵抗（ＴＥＲ）における変化。ＴＥＲ値を、ベースライン抵抗に対して正規化した。Ｍｙｒ−ＥＢＩＮ（赤色プロット）は、対照ペプチドで処理された細胞（青色プロット）において観察されるような、トロンビンおよびヒスタミンに応答した細胞形状変化および傍細胞透過性亢進を阻止した。

【図16】図１６は、ＥＢＩＮ（配列番号３）がアゴニスト誘導性ＮＯ産生を阻害することを示す。ＨＰＡＥＣを、対照ペプチド（活性喪失）またはＭｙｒ−ＥＢＩＮで前処理し、基礎ＮＯ産生（Ａ、Ｌ−アルギニンの添加への応答）およびアゴニスト誘導性ＮＯ産生（Ｂ、トロンビンおよびヒスタミン）を、最初の２０分間の刺激の間、測定した。ＥＢＩＮは、基礎ＮＯレベルに影響しなかったが、アゴニスト誘導性ＮＯを有意に軽減した。^＊、ｐ＜０．０１および^＊＊、ｐ＜０．０１。

【図17】図１７は、ＥＢＩＮ（配列番号３）が、インビボでヒスタミン誘導性血管拡張を阻止することを示す。マウスにおける覚醒血圧測定 − マウスを麻酔し、動脈（頸動脈）および静脈（外頸）カテーテルの留置のために外科的に準備した。手術から１時間後、血圧を、圧力トランスデューサを用いて直接、モニターした。その後のＡＰ−ＥＢＩＮペプチド（１μＭ／体重ｋｇ；緑色）または対照ＡＰペプチド（赤色）およびヒスタミン（１０ｍｇ／体重ｋｇ）の静脈内（ｉ．ｖ．）注射を、頸静脈カテーテルを通して実施した；矢印は、注射の時点を示す。ＥＢＩＮはベースライン血圧への効果を生じなかったが、ヒスタミンに応答した血圧降下を阻止したことに注目されたい。ｎ＝６マウス／群。

【図18】図１８は、ＥＢＩＮ（配列番号３）がＬＰＳ誘導性敗血症による死亡を防止することを示す。ＥＢＩＮで処理されたマウスは、ＬＤ９０用量（５０ｍｇ／ｋｇ；大腸菌ＬＰＳ ０１１１：Ｂ４）でのＬＰＳ注射後１２０時間の間、死亡率の低下が認められる。雄ＣＤ１マウスを、ＬＤ９０用量のＬＰＳの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によってチャレンジした。実験群および対照群は、１μＭ／ｋｇの濃度での細胞浸透性アンテナペディアペプチド（ＡＰ）のＣ末端に付着したＥＢＩＮまたはＡＰ単独の後眼窩の静脈内（ｉ．ｖ．）注射を受けた。マウスに、ＬＰＳ投与の３０分前、ならびに１時間後および２４時間後の３回、注射した。マウスを、後眼窩注射前に、ケタミン（１０ｍｇ／ｍｌ）、キシラジン（０．２５ｍｇ／ｍｌ）、およびアセプロマジン（０．２５ｍｇ／ｍｌ）の混合物で麻酔した。

【図19】図１９は、ＥＢＩＮ（配列番号３）での前処理および後処理の、ＬＰＳ誘導性敗血症による死亡率への効果を比較する。ＥＢＩＮで処理されたマウスは、ＬＤ９０用量（５０ｍｇ／ｋｇ；大腸菌ＬＰＳ ０１１１：Ｂ４）でのＬＰＳ注射後１２０時間の間、死亡率の低下が認められる。雄ＣＤ１マウスを、ＬＤ９０用量のＬＰＳの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によってチャレンジさせた。実験群および対照群は、１μＭ／ｋｇの濃度で、ＬＰＳの３０分前（前処理）または３０分後（後処理）にＭｙｒ−ＥＢＩＮ、またはＭｙｒ−対照結合性喪失ペプチドの尾静脈（ｉ．ｖ．）注射を受けた。前処理群のマウスには、ＬＰＳ投与の３０分前、ならびに１時間後および２４時間後の３回、注射した；処理群のマウスには、ＬＰＳ投与の３０分後および２４時間後の２回、注射した。マウスを、後眼窩注射前に、ケタミン（１０ｍｇ／ｍｌ）、キシラジン（０．２５ｍｇ／ｍｌ）、およびアセプロマジン（０．２５ｍｇ／ｍｌ）の混合物で麻酔した。ＥＢＩＮでの後処理は、生存の若干の、しかし有意ではない向上を示している。

【図20】図２０は、ＥＢＩＮ（配列番号３）が、ＩｇＥ媒介性アナフィラキシー反応後の皮下血管漏れを予防することを示す。マウスは、耳（Ａ）および背中（Ｂ）においてＩｇＥ−ＨＳＡの皮内注射を受け、２４時間後、エバンスブルーおよびＨＳＡ（１〜３）または食塩水（４〜５）の静脈内注射を受けた。ＨＳＡの３０分前に、群１と４は食塩水、群２は対照ペプチド（結合性喪失）、群３と５はＭｙｒ−ＥＢＩＮの静脈内注射（１μＭ／ｋｇ）を受けた。ＨＳＡの注射は局所的血管漏れを生じ、それは、ＥＢＩＮによって有意に軽減された（群３）ことに注目されたい。Ｃ．棒プロットは、エバンスブルーの血管漏れを示している。エバンスブルーを、耳組織から抽出し、エバンスブルー濃度を、λ＝６２０ｎｍで測定し、組織重量に対して正規化した。^＊、ｐ＜０．０５、ｎ＝６マウス／群。

【図21】図２１は、内皮バリアの炎症誘導性透過性亢進におけるＥＢ３の役割を示す。ＥＢ３は、炎症中、伸長中のＭＴ末端とＩＰ_３Ｒ_３との一過性相互作用を確立し、ＩＰ_３Ｒ_３をＩＰ_３に対してより敏感にし、ストアからのＣａ^２＋放出と、ＳＯＣ依存性Ｃａ^２＋移入との両方を正に制御する。これは、Ｃａ^２＋シグナル伝達の増幅、ならびにｐ１２０−カテニンのＰＫＣα媒介性リン酸化およびアクトミオシン収縮性を通しての透過性の増加を生じる。

【発明を実施するための形態】

【0016】

詳細な説明
本発明者らは、イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）受容体３型（ＩＰ_３Ｒ_３）のＥＢ３相互作用ドメイン由来のペプチドが、末端結合タンパク質３（ＥＢ３）とＩＰ_３Ｒ_３との間の相互作用を低下させ、細胞形状変化に関連した内皮透過性応答の増加を緩和するという驚くべき発見をしている。

【0017】

理論によって縛られないが、下記に示された実施例に基づけば、内皮バリアの炎症誘導性透過性亢進におけるＥＢ３の役割は、伸長中のＭＴ末端とＩＰ_３Ｒ_３との一過性相互作用を確立するその能力を中心とする。結果として、ＥＢ３は、ＩＰ_３Ｒ_３をＩＰ３に対してより敏感にし、小胞体（ＥＲ）からのＣａ^２＋放出を正に制御する。これは、ＳＯＣ依存性Ｃａ^２＋移入およびＣａ^２＋シグナル伝達の増幅をもたらす。細胞質Ｃａ^２＋濃度の上昇は、ｐ１２０−カテニンのＰＫＣα媒介性リン酸化を誘導し、それは、結果として、ＶＥ−カドヘリン接着の解体を生じる。それはまた、ＲｈｏＡ依存性アクトミオシン収縮性を促進し、結果として、細胞形状変化を生じる。図２１参照。

【0018】

下記の方法および材料は、細胞形状変化に関連した内皮透過性応答の増加を緩和し、したがって、肺傷害（肺における炎症媒介性血管漏出および水腫の発生が挙げられる）または敗血症、アナフィラキシー反応、もしくは急性免疫応答に関連し得る任意の他の器官の浮腫を処置するのに有用である。この方法および材料はまた、慢性炎症、癌、喘息、およびアテローム発生（ａｒｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）などの病理過程中の慢性血管漏れを軽減するために用いられてもよい。

【0019】

１．定義
本明細書で用いられる専門用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的とし、限定することを意図するものではない。本明細書および添付の特許請求の範囲に用いられる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎｄ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈がそうでないことを明らかに指示していない限り、複数の言及を含む。

【0020】

本明細書における数の範囲の記載について、同じ精度（ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）のその間に介在するそれぞれの数が明確に企図される。例えば、６〜９の範囲について、７および８の数が、６および９に加えて企図され、範囲６．０〜７．０について、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０の数が明確に企図される。

【0021】

ａ．断片
本明細書で用いられる場合、「断片」は、参照のペプチドまたはポリペプチドまたは核酸の配列の一部を意味し得る。

【0022】

ｂ．同一の
２つまたはそれより多くのポリペプチド配列またはヌクレオチド配列の関連において、本明細書で用いられる場合の「同一の」または「同一性」とは、それらの配列が、特定された領域にわたって同じである、特定されたパーセンテージの残基またはヌクレオチドを有することを意味し得る。パーセンテージは、２つの配列を最適に整列させ、特定された領域にわたって２つの配列を比較し、両方の配列において同一の残基が存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得、その一致した位置の数を、特定された領域における位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算され得る。２つの配列が異なる長さのものであるか、またはアラインメントが１つもしくはより多くの互い違いの末端を生じ、かつ特定された比較領域が単一の配列のみを含む場合、単一の配列の残基は、計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。

【0023】

ｃ．ペプチド
本明細書で用いられる場合、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結した配列を指し得、天然のもの、合成のもの、または天然のものおよび合成のものの改変物もしくは組み合わせであってもよい。

【0024】

ｄ．実質的に同一
本明細書で用いられる場合、「実質的に同一」とは、第１および第２のタンパク質配列またはヌクレオチド配列が、６〜１００個またはそれより多くのアミノ酸またはヌクレオチド（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）の領域にわたって、少なくとも５０％〜９９％同一であることを意味し得る。

【0025】

ｅ．処置
「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処置」、または「処置すること（ｔｏ ｔｒｅａｔ）」それぞれは、一時的に、または永久的に、状態または障害の症状、臨床徴候、または根底にある病態の出現を軽減し、抑制し、抑圧し、除去し、予防し、または遅くすることを意味し得る。状態または障害を予防することは、その疾患の発症前に被験体に本発明の作用物質を投与することを含む。状態または障害を抑制することは、その状態または障害の誘導後、しかしそれの臨床的出現の前に、被験体に本発明の作用物質を投与することを含む。状態または障害を抑圧することは、その疾患の臨床的出現後、被験体に本発明の作用物質を投与することを含む。

【0026】

ｆ．バリアント
「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持する、ペプチドまたはポリペプチドを意味し得る。「生物活性」の代表的な例としては、末端結合タンパク質、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に結合する能力、および特異的抗体によって結合される能力が挙げられる。バリアントはまた、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を含む、参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味してもよい。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、類似した性質（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸と置き換えることは、典型的には、マイナーな変化を含むと当該技術分野において認識されている。これらのマイナーな変化は、当該技術分野において理解されているように、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することによって、ある程度、同定することができる。Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５〜１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指標は、それの疎水性および電荷の考慮に基づいている。類似した疎水性親水性指標のアミノ酸が置換されてもなおタンパク質機能を保持することができることは当該技術分野において知られている。１つの態様において、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性もまた、生物学的機能を保持するタンパク質を生じる置換を明らかにするために用いることができる。ペプチドの関連におけるアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最大の局所平均親水性の計算を可能にし、その計算は、抗原性および免疫原性とよく相関することが報告されている有用な尺度である。参考として本明細書に完全に援用されている米国特許第４，５５４，１０１号。当該技術分野において理解されているように、類似した親水性値を有するアミノ酸の置換は、生物活性、例えば、免疫原性を保持するペプチドを生じ得る。置換は、お互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸に関して実施され得る。アミノ酸の疎水性（ｈｙｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）指標および親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響される。その観察と一致して、生物学的機能に適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、および他の性質によって明らかにされるような、アミノ酸（特にそれらのアミノ酸の側鎖）の相対的類似性に依存すると理解されている。

【0027】

２．ペプチド
ペプチドが本明細書で提供されており、そのペプチドは、アミノ酸配列ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＫＦＡＲＬＷＡＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号２）（ＩＰ_３Ｒ_３ペプチドとも本明細書で呼ばれている）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）（末端結合阻害ペプチドまたは「ＥＢＩＮ」とも本明細書で呼ばれている）、本明細書の表３に開示されたペプチド、それらの断片、またはそれらのバリアントを含み得る。バリアントは、保存的置換を含んでもよい。ペプチドは、ＩＰ_３Ｒ_３のＥＢ結合コンセンサス配列などのＥＢ結合コンセンサスモチーフ配列またはその断片を含み得る。ＩＰ_３Ｒ_３のＥＢ結合コンセンサス配列は、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−ｘ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏであり得る。ペプチドは、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）、ＫＦＡＲＬＷＡＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号２）、ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３）、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−ｘ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏを含むコンセンサス配列、本明細書の表３に開示されたペプチド、前述のものの断片、または前述のものの保存的バリアントからなり得る。バリアントは、最小ＥＢ結合コンセンサスモチーフ配列である、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−ｘ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ配列を含有する任意のペプチド配列を含み得る。

【0028】

ペプチドは、コンジュゲートされてもよいし、ミリストイル化されてもよいし、または担体ペプチドなどの別のペプチドに連結されてもよい。ペプチドはアンテナペディアペプチドであってもよい。

【0029】

３．処置の方法
肺傷害を処置する方法が本明細書で提供されている。肺傷害は肺炎症であってもよく、それは、炎症媒介性血管漏出および／または水腫の発生であってもよい。肺傷害は、急性肺傷害であってもよい。肺傷害はまた、喘息を有する患者において観察されるような慢性血管漏れであってもよい。処置は、慢性血管漏れを軽減し得る。肺傷害は、内毒血症においてなどの、全身性血管透過性を含む、肺における血管の透過性亢進であってもよい。肺傷害は、敗血症、炎症、重症の多発外傷、唾液／胃内容吸引、誤嚥性肺炎（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、ショック、溺水、複数回の輸注、刺激物もしくは有毒フュームの吸入、アテローム発生（ａｒｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）、機械的傷害（人工呼吸器誘導性傷害）、または放射線曝露に関連してもよい。喘息を処置し、ならびに／または喘息を有する患者の肺機能および全般的健康を改善する方法もまた本明細書で提供されている。喘息は、アレルギー性喘息であってもよく、それは慢性でも急性でもよい。

【0030】

アレルゲン誘導性アナフィラキシーなどのアナフィラキシー、および造影色素に対するなどの非アレルギー性アナフィラキシー様反応を処置する方法もまた本明細書で提供されている。食物アレルギーまたはハチ類刺傷毒注入の結果として起こり得る喉頭浮腫などのアレルゲン誘導性血管性浮腫を含む血管性浮腫を処置する方法がさらに本明細書で提供されている。血管性浮腫はまた、補体因子１インヒビター欠乏誘導性または画像化造影色素誘導性アナフィラキシー様反応においてなどの非アレルゲン誘導性血管性浮腫であってもよい。

【0031】

全身性血管透過性症候群を処置する方法が本明細書で提供されている。その症候群は、内毒血症、外傷、または複数回の輸注によるものであってもよい。その症候群はまた、薬物処置の副作用として発生したものであってもよい。その薬物処置は、癌を処置するためのＩＬ−２の全身性使用であってもよい。鼻閉を処置する方法もまた提供されている。その鼻閉は、アレルギー性または非アレルギー性鼻炎に関連してもよい。その鼻閉は、刺激物に関連するのであってもよく、または呼吸器系ウイルスに関連するものであってもよい。

【0032】

方法は、治療的有効量のそのペプチドを含む組成物を哺乳動物に投与することを含み得る。組成物は薬学的製剤であってもよい。そのペプチドを含む組成物は、肺傷害を処置するのに有用な１つまたはそれより多くの他のペプチド、化合物、および／または薬学的組成物と組み合わせて投与されてもよい。その１つまたはそれより多くの他のペプチド、化合物、および／または薬学的組成物は、肺傷害を処置する任意の作用物質であってもよく、それには、ニトログリセリンなどの前負荷軽減剤（ｐｒｅｌｏａｄ ｒｅｄｕｃｅｒ）およびフロセミド（Ｌａｓｉｘ）などの利尿剤が挙げられるが、それらに限定されない。そのような薬剤は、肺および身体の他の部分において静脈を拡張し、そのことは、心臓および肺に入る流圧を減少させる。他の１つまたはそれより多くの化合物としては、後負荷軽減剤（ａｆｔｅｒｌｏａｄ ｒｅｄｕｃｅｒ）が挙げられる。これらの薬物は、末梢血管を拡張し、圧負荷を左心室から取り除く。後負荷軽減薬剤のいくつかの例としては、ニトロプルシド（Ｎｉｔｒｏｐｒｅｓｓ）、エナラプリル（Ｖａｓｏｔｅｃ）、およびカプトプリル（Ｃａｐｏｔｅｎ）が挙げられる。

【0033】

ａ．被験体
被験体は哺乳動物であってもよく、哺乳動物はヒトであってもよい。診断前に、被験体は、心臓の異常などの１つまたはそれより多くのリスク因子への曝露により肺傷害のリスクがあってもよい。１つまたはそれより多くのリスク因子としては、例えば、癌の家族歴を有する被験体、年齢、タバコの喫煙、アルコール飲料の飲用、および／または食事での摂取不足が挙げられ得る。被験体は、有毒フュームまたは放射線、機械的人工呼吸に曝されていてもよい。被験体は、熱傷創、炎症、重症の多発外傷、唾液／胃内容物の吸引、誤嚥性肺炎、敗血症、ショック、溺水、複数回の輸注を有してもよい。

【0034】

ｂ．投与
本明細書に記載された方法を用いるペプチドの投与は、全身性に、経口で、非経口で、舌下に、経皮で、直腸性に、経粘膜で、局所的に、吸入で、バッカル投与で、経鼻で、またはそれらの組み合わせであってもよい。非経口投与としては、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、髄腔内、および関節内が挙げられるが、それらに限定されない。投与はまた、皮下、静脈内、気道内経由、または腫瘍内であってもよい。獣医学的用途については、ペプチドは、通常の獣医学的実践に従って、適切に許容され得る製剤として投与されてもよい。獣医師は、特定の動物に最も適切である投与レジメンおよび投与経路を容易に決定することができる。ペプチドは、ヒト患者、ネコ、イヌ、大型動物、またはトリに投与されてもよい。

【0035】

ペプチドは、単剤治療として、または他の処置と同時にもしくはメトロノームのように、投与されてもよく、その他の処置は、腫瘍の手術または除去であってもよい。本明細書で用いられる場合、用語「同時の」または「同時に」とは、ペプチドと他の処置とが、お互いに４８時間以内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、さらにより好ましくは６時間以内、最も好ましくは、３時間以下以内に投与されることを意味する。本明細書で用いられる場合、用語「メトロノームのように」とは、他方の処置とは異なる時点であって、かつ投与を繰り返すことに関して一定の頻度での、ペプチドの投与を意味する。

【0036】

ペプチドは、約１２０時間前、１１８時間前、１１６時間前、１１４時間前、１１２時間前、１１０時間前、１０８時間前、１０６時間前、１０４時間前、１０２時間前、１００時間前、９８時間前、９６時間前、９４時間前、９２時間前、９０時間前、８８時間前、８６時間前、８４時間前、８２時間前、８０時間前、７８時間前、７６時間前、７４時間前、７２時間前、７０時間前、６８時間前、６６時間前、６４時間前、６２時間前、６０時間前、５８時間前、５６時間前、５４時間前、５２時間前、５０時間前、４８時間前、４６時間前、４４時間前、４２時間前、４０時間前、３８時間前、３６時間前、３４時間前、３２時間前、３０時間前、２８時間前、２６時間前、２４時間前、２２時間前、２０時間前、１８時間前、１６時間前、１４時間前、１２時間前、１０時間前、８時間前、６時間前、４時間前、３時間前、２時間前、１時間前、５５分前、５０分前、４５分前、４０分前、３５分前、３０分前、２５分前、２０分前、１５分前、１０分前、９分前、８分前、７分前、６分前、５分前、４分前、３分前、２分前、および１分前を含む、別の処置より前の任意の時点で投与されてもよい。ペプチドは、約１２０時間前、１１８時間前、１１６時間前、１１４時間前、１１２時間前、１１０時間前、１０８時間前、１０６時間前、１０４時間前、１０２時間前、１００時間前、９８時間前、９６時間前、９４時間前、９２時間前、９０時間前、８８時間前、８６時間前、８４時間前、８２時間前、８０時間前、７８時間前、７６時間前、７４時間前、７２時間前、７０時間前、６８時間前、６６時間前、６４時間前、６２時間前、６０時間前、５８時間前、５６時間前、５４時間前、５２時間前、５０時間前、４８時間前、４６時間前、４４時間前、４２時間前、４０時間前、３８時間前、３６時間前、３４時間前、３２時間前、３０時間前、２８時間前、２６時間前、２４時間前、２２時間前、２０時間前、１８時間前、１６時間前、１４時間前、１２時間前、１０時間前、８時間前、６時間前、４時間前、３時間前、２時間前、１時間前、５５分前、５０分前、４５分前、４０分前、３５分前、３０分前、２５分前、２０分前、１５分前、１０分前、９分前、８分前、７分前、６分前、５分前、４分前、３分前、２分前、および１分前を含む、ペプチドの２回目の処置より前の任意の時点で投与されてもよい。

【0037】

ペプチドは、約１分後、２分後、３分後、４分後、５分後、６分後、７分後、８分後、９分後、１０分後、１５分後、２０分後、２５分後、３０分後、３５分後、４０分後、４５分後、５０分後、５５分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、１６時間後、１８時間後、２０時間後、２２時間後、２４時間後、２６時間後、２８時間後、３０時間後、３２時間後、３４時間後、３６時間後、３８時間後、４０時間後、４２時間後、４４時間後、４６時間後、４８時間後、５０時間後、５２時間後、５４時間後、５６時間後、５８時間後、６０時間後、６２時間後、６４時間後、６６時間後、６８時間後、７０時間後、７２時間後、７４時間後、７６時間後、７８時間後、８０時間後、８２時間後、８４時間後、８６時間後、８８時間後、９０時間後、９２時間後、９４時間後、９６時間後、９８時間後、１００時間後、１０２時間後、１０４時間後、１０６時間後、１０８時間後、１１０時間後、１１２時間後、１１４時間後、１１６時間後、１１８時間後、および１２０時間後を含む、別の処置後の任意の時点で投与されてもよい。ペプチドは、約１２０時間前後、１１８時間前後、１１６時間前後、１１４時間前後、１１２時間前後、１１０時間前後、１０８時間前後、１０６時間前後、１０４時間前後、１０２時間前後、１００時間前後、９８時間前後、９６時間前後、９４時間前後、９２時間前後、９０時間前後、８８時間前後、８６時間前後、８４時間前後、８２時間前後、８０時間前後、７８時間前後、７６時間前後、７４時間前後、７２時間前後、７０時間前後、６８時間前後、６６時間前後、６４時間前後、６２時間前後、６０時間前後、５８時間前後、５６時間前後、５４時間前後、５２時間前後、５０時間前後、４８時間前後、４６時間前後、４４時間前後、４２時間前後、４０時間前後、３８時間前後、３６時間前後、３４時間前後、３２時間前後、３０時間前後、２８時間前後、２６時間前後、２４時間前後、２２時間前後、２０時間前後、１８時間前後、１６時間前後、１４時間前後、１２時間前後、１０時間前後、８時間前後、６時間前後、４時間前後、３時間前後、２時間前後、１時間前後、５５分前後、５０分前後、４５分前後、４０分前後、３５分前後、３０分前後、２５分前後、２０分前後、１５分前後、１０分前後、９分前後、８分前後、７分前後、６分前後、５分前後、４分前後、３分前後、２分前後、および１分前後を含む、ペプチドの２回目の処置の前後（ｐｒｉｏｒ ａｆｔｅｒ）の任意の時点で投与されてもよい。

【0038】

ｃ．製剤
方法は、ペプチドを投与することを含み得る。本明細書で提供されるペプチドは、従来の様式で製剤化された錠剤またはトローチ剤の形をとってもよい。例えば、経口投与用の錠剤およびカプセルは、結合剤、充填剤、滑沢剤、崩壊剤、および湿潤剤であり得る、従来の賦形剤を含有してもよい。結合剤としては、シロップ、アラビアゴム（ａｃｃａｃｉａ）、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントゴム、デンプンの粘質物、およびポリビニルピロリドンが挙げられるが、それらに限定されない。充填剤は、乳糖、糖、微結晶性セルロース、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、およびソルビトールであってもよい。滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコール、およびシリカが挙げられるが、それらに限定されない。崩壊剤は、ジャガイモデンプン、およびデンプングリコール酸ナトリウムであってもよい。湿潤剤は、ラウリル硫酸ナトリウムであってもよい。錠剤は、当該技術分野においてよく知られた方法に従ってコーティングされてもよい。

【0039】

本明細書で提供されるペプチドはまた、水性または油性の懸濁液、溶液、乳濁液、シロップ、およびエリキシルなどの液体製剤であってもよい。ペプチドはまた、使用前に、水または他の適切な媒体での構成のための乾燥製造物として製剤化されてもよい。そのような液体調製物は、懸濁化剤、乳化剤、非水性媒体、および保存剤などの添加剤を含有してもよい。懸濁化剤は、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、ブドウ糖／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、および硬化食用脂であってもよい。乳化剤は、レシチン、モノオレイン酸ソルビタン、およびアラビアゴムであってもよい。非水性溶媒は、食用油、アーモンドオイル、分留ヤシ油（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｃｏｃｏｎｕｔ ｏｉｌ）、油性エステル、プロピレングリコール、およびエチルアルコールであってもよい。保存剤は、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、およびソルビン酸であってもよい。

【0040】

本明細書で提供されるペプチドはまた、坐剤として製剤化されてもよく、それは、カカオバターまたはグリセリドなどの坐剤基剤を含有してもよい。本明細書で提供されるペプチドはまた、吸入用に製剤化されてもよく、それは、乾燥粉末として投与され得る溶液、懸濁液、または乳濁液などの形、またはジクロロジフルオロメタンまたはトリクロロフルオロメタンなどの噴射剤を用いるエアゾールの形をとってもよい。本明細書で提供されるペプチドはまた、クリーム、軟膏、ローション、ペースト、薬用プラスター、パッチ、または膜などの水性または非水性の媒体を含む経皮製剤として製剤化されてもよい。

【0041】

本明細書で提供されるペプチドはまた、注射、腫瘍内注射、または持続注入によるなどの非経口投与用に製剤化されてもよい。注射用製剤は、油性または水性溶媒における懸濁液、溶液、または乳濁液の形をとってもよく、調合剤を含有してもよく、それには、懸濁剤、安定化剤、および分散剤が挙げられるが、それらに限定されない。ペプチドはまた、適切な溶媒での再構成のための粉末の形で提供されてもよく、その溶媒には、発熱物質を含まない滅菌水が挙げられるが、それに限定されない。

【0042】

本明細書で提供されるペプチドはまた、デポー調製物として製剤化されてもよく、それは、埋め込みにより、または筋肉内注射により投与されてもよい。ペプチドは、適切な高分子材料または疎水性材料（例えば、許容され得る油中の乳濁液として）、イオン交換樹脂と共に、または難溶性誘導体として（例えば、難溶性塩として）製剤化されてもよい。

【0043】

ｄ．投与量（ｄｏｓａｇｅ）
方法は、治療的有効量のペプチドを、それを必要とする患者に投与することを含み得る。治療に用いるのに必要とされる治療的有効量は、処置されることになっている状態の性質、ＴＬＲ活性を活性化するために望まれる時間の長さ、および患者の年齢／状態によって異なる。しかしながら、一般的に、成人の処置に用いられる用量（ｄｏｓｅ）は、典型的には、１日あたり０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇの範囲である。用量は、１日あたり約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｇ／ｋｇであってもよい。望ましい用量は、便利には、単一用量で、または適切な間隔で投与される複数回用量として、例えば、１日あたり２回、３回、４回、またはそれより多くの部分用量として投与されてもよい。複数回用量が望まれるかまたは必要とされる場合がある。

【0044】

投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２２５ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、２７５ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、３２５ｍｇ／ｋｇ、３５０ｍｇ／ｋｇ、３７５ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、４２５ｍｇ／ｋｇ、４５０ｍｇ／ｋｇ、４７５ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、５２５ｍｇ／ｋｇ、５５０ｍｇ／ｋｇ、５７５ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、６２５ｍｇ／ｋｇ、６５０ｍｇ／ｋｇ、６７５ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、７２５ｍｇ／ｋｇ、７５０ｍｇ／ｋｇ、７７５ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、８２５ｍｇ／ｋｇ、８５０ｍｇ／ｋｇ、８７５ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、９２５ｍｇ／ｋｇ、９５０ｍｇ／ｋｇ、９７５ｍｇ／ｋｇ、１ｇ／ｋｇ、２ｇ／ｋｇ、３ｇ／ｋｇ、４ｇ／ｋｇ、５ｇ／ｋｇ、６ｇ／ｋｇ、７ｇ／ｋｇ、８ｇ／ｋｇ、９ｇ／ｋｇ、または１０ｇ／ｋｇなどの任意の投与量であってもよい。

【0045】

４．キット
肺傷害を処置するために用いられ得るキットが本明細書で提供されている。キットは、これらのペプチドのうちの１つまたはそれより多くを含み得る。ペプチドは、薬学的組成物の一部であってもよい。キットは、キットを用いて、ペプチドまたは製剤を投与することを行うための使用説明書をさらに含んでもよい。

【0046】

キットはまた、バイアルまたは瓶などの１つまたはそれより多くの容器を含んでもよく、各容器が別々の試薬を含有する。キットは、本明細書に記載された方法をどのように実施するかまたは解釈するかを記載し得る、書面の使用説明書をさらに含んでもよい。

【0047】

本発明は、以下の非限定的実施例によって例証される、複数の態様を有する。

【実施例】

【0048】

実施例１
ＥＢ３の枯渇が、ストアからのＣａ２＋放出を阻害する

【0049】

前の研究は、ＥＲストアからのＣａ^２＋のＩＰ３ゲート化放出を制御することにおけるＭＴ細胞骨格の役割を示唆した。ＰＡＲ−１シグナル伝達の下流のＩＰ３感受性ストアからのＣａ^２＋の放出を制御するＥＢ３の能力を試験した。ＰＡＲ−１活性化に応答した、ＥＢ１に対するｓｈＲＮＡを発現するＨＭＥＣ、ＥＢ３に対するｓｈＲＮＡを発現するＨＭＥＣ、およびルシフェラーゼに対するｓｈＲＮＡを発現するＨＭＥＣにおける細胞内Ｃａ^２＋濃度の変化を決定した（図１）。本発明者らのベクターに基づいたｓｉＲＮＡ構築物をＧＦＰ−Ｃ１ベクターにクローニングしたため、本発明者らは、同じカバーガラスから非トランスフェクション細胞とトランスフェクション細胞における変化を比較することができた。ＥＢ１の枯渇は、対照の非トランスフェクション細胞またはルシフェラーゼに対するｓｈＲＮＡを発現する細胞と比較して、ストアからのＣａ^２＋の放出に少しの影響も有さなかった。対照的に、ＥＢ３の枯渇は、Ｃａ^２＋放出の著しい阻害をもたらし、したがって、Ｃａ^２＋流入の減少を生じた。ＥＢ１およびＥＢ３の同時枯渇の影響は、ＥＢ３単独の枯渇に匹敵した（図１Ｂ）。これらのデータは、ＥＢ３がＥＲ Ｃａ^２＋枯渇に必要とされることを示唆している。

【0050】

実施例２
Ｃａ２＋のＩＰ３ゲート化放出の機構におけるＥＢ３とＩＰ３Ｒとの相互作用の役割

【0051】

活性が、ＥＣにおけるＣａ^２＋のトロンビン誘導性放出にとって重要な意味をもつＩＰ_３Ｒ ３型と、ＥＢ３は相互作用するかどうかを決定した。マウスを致死量未満の用量のＬＰＳでチャレンジし、ＥＢ３とＩＰ_３Ｒ_３およびＴＲＰＣ１（ＳＯＣ）チャネルとの関連を決定した。図２に示されているように、ＥＢ３は、休止内皮微小血管系においてＩＰ_３Ｒ_３と相互作用し、この相互作用のレベルは、ＬＰＳ誘導性肺炎症中、増加する。興味深いことに、ＴＲＰＣ１もまた、炎症を起こしている（３時間のＬＰＳチャレンジ）肺に沈殿するＥＢ３内に見出された。これらの変化は、ＴＬＲ４（ＬＰＳ受容体）ＫＯマウスにおいて観察されなかった。このことは、これらの相互作用と炎症との因果関係を示している。

【0052】

興味深いことに、ＩＰ_３Ｒ_３は、ＥＢ結合コンセンサスモチーフであるＳｅｒ／Ｔｈｒ−ｘ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ＳｘＩＰ）を含有する。ＩＰ_３Ｒ_３配列（ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ − 配列番号１）（図３）に基づいた短いペプチドは、−６８．８８２ｋｃａｌ／ｍｏｌの自由エネルギー結合を有する、ＥＢ３に対する高い結合活性を示す（図４）。細胞浸透性アンテナペディアペプチド（ＡＰ）のＣ末端に付着したＩＰ_３Ｒ_３配列（１０ｎＭ）での細胞の前処理は、トロンビンに応答したストアからのＣａ２＋の放出を著しく減少させた（図５Ａ）。このことは、ＩＰ_３Ｒ_３とＥＢ３との間の相互作用が、ＩＰ_３Ｒ活性化の機構において重要な意味をもつことを示唆している。ＩＰ_３Ｒペプチドおよびタキソールの影響を、Ｃａ^２＋放出の制御において比較した。トロンビン刺激前の２０分間の５μｇ／ｍｌのタキソールでの細胞の前処理は、ＩＰ_３Ｒ_３ペプチドと同じ程度で、ＥＲからのＣａ^２＋の放出を阻害することが見出された（図５Ｂ）。

【0053】

実施例３
ＩＰ_３Ｒ_３ペプチドは、敗血症における炎症誘導性肺血管漏出および死亡を防止する

【0054】

血管内皮透過性を制御することにおけるＥＢ３／ＩＰ３Ｒ相互作用の役割に取り組むために、本発明者らは、エクスビボ肺調製物を用いた。ペプチドを、ＰＡＲ−１アゴニストペプチドの注入前の３０分間、肺へ注入し、ＥＢ３とＩＰ_３Ｒ_３との間の相互作用を、ＩＰアッセイによって決定した（図６）。ＰＡＲ−１の受容体の活性化は、基礎レベルと比較してＥＢ３／ＩＰ_３Ｒ_３相互作用を有意に増加させ、一方、多量（ｐｒｏｆｕｓｉｏｎ）のＩＰ_３Ｒ_３ペプチドは、活性化された肺微小血管系におけるこの相互作用を阻害した。結果的に、ＩＰ_３Ｒ_３ペプチドは、微小血管濾過係数Ｋｆ，ｃの変化によって測定したところ、肺血管透過性の増加を緩和した。図７は、ＩＰ_３Ｒ_３ペプチドが、ＰＡＲ−１活性化に応答した微小血管透過性の増加を著しく軽減したことを示す。これらのデータは、ＥＢ３とＩＰ３Ｒとの間の相互作用が、肺における炎症誘導性血管漏出および水腫の発生にとって重要である可能性があることを示唆している。

【0055】

最近の研究により、血管漏出が、敗血症における死亡に寄与する重要な因子であることが実証された。ＩＰ_３Ｒ_３ペプチドの薬理学的効果を、敗血症のＬＰＳ誘導性マウスモデルにおいて試験した。雄ＣＤ１マウスをＬＰＳ（３０ｍｇ／体重ｋｇ）の腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によってチャレンジし、肺炎症の尺度である、肺における好中球の浸潤を決定した。肺をＰＢＳで灌流し、重量を計り、凍結し、活性化好中球のサインである肺ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を測定するために用いた。図８に示されているように、ＬＰＳチャレンジの３０分前のＩＰ_３Ｒ_３ペプチドでのマウスの処置は、対照ペプチドで処理された群と比較して、ＬＰＳチャレンジ後２時間目および６時間目において肺における好中球の浸潤を有意に低下させた。この観察は、ＩＰ_３Ｒ_３ペプチドが、ＬＰＳ誘導性肺炎症および傷害を軽減したことを示唆している。結果的に、ＬＰＳ投与の３０分前および１時間後にＩＰ_３Ｒ_３ペプチドでの処置を受けたマウスは、ＬＤ５０チャレンジおよびＬＤ８０チャレンジの両方において対照群の生存率における著しい向上を示した（図９）。さらに、ＩＰ_３Ｒ_３ペプチドが、盲腸結紮穿孔（ＣＬＰ）によって誘導される多微生物性敗血症から保護するかどうかを決定した。ＣＬＰは、急性肺傷害（ＡＬＩ）を伴う致死性腹膜炎を引き起こす。それは、実験齧歯類における、よく受け入れられた（ｗｅｌｌ−ｅｘｃｅｐｔｅｄ）臨床的に関連した方法である。図１０は、ＩＰ_３Ｒ_３ペプチドが、ＣＬＰ後の動物の生存を向上させたことを示している。９０％の対照マウスが最初の４８時間以内に死亡したが、手術前、ならびに手術後２４時間目および４８時間目にＩＰ_３Ｒ_３を注射された動物は、有意により高い生存率を示した。

【0056】

これらのデータは、ＩＰ_３Ｒ_３ペプチド誘導体ペプチドが、肺透過性亢進を予防するために、ならびに炎症およびアテローム発生（ａｒｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）などの病理過程中に慢性血管漏れを軽減するために用いることができる可能性があることを示唆している。ＩＰ_３Ｒ_３ペプチドの用量応答を、敗血症のＬＰＳ誘導性マウスモデルにおいてさらに試験した。雄ＣＤ１マウスを、ＬＤ８０用量でのＬＰＳのｉ．ｐ．注射によってチャレンジした。マウスは、体重の１ｋｇあたり０．０１μＭ、０．０３３μＭ、０．１μＭ、０．３３μＭ、１．０μＭ、３．３μＭ、および１０μＭの用量におけるＩＰ_３Ｒ_３ペプチドの後眼窩ｉ．ｖ．注射を受けた。マウスに、ＩＰ_３Ｒ_３ペプチドを、ＬＰＳ投与の３０分前、ならびに１時間後および２４時間後の３回、注射した。各群における生存している動物のパーセントを、ＩＰ_３Ｒ_３用量の関数としてプロットした。図１１は、ＩＰ_３Ｒ_３ペプチドが対照群の生存率を向上させ、それは０．０３３μＭ／ｋｇから始まって１μＭ／ｋｇで最高効力に達したことを示している。ＩＰ_３Ｒ_３用量の増加は、さらなる向上をもたらさなかったが、重要なことには、それは動物に死もまた引き起こさなかった。これらのデータは、ＩＰ_３Ｒ_３ペプチドが、この用量範囲内では毒性が低いことを示唆している。８０ｎＭ／ｋｇとしてのＥＤ_５０（有効用量、５０％）を、以下の３パラメータロジスティック方程式を用いて計算した：
ｙ＝最低＋（最高＋最低）／１＋１０^{ＬｏｇＥＤ５０−ｘ}
式中、最低および最高は、応答の最低および最高である。提示されたデータは、ＩＰ_３Ｒ_３が、高い効力および低い毒性を有する有望な薬物であることを示唆している。タキソールと対照的に、この薬物は、一般的な毒性を示すとは予想されない。

【0057】

ＥＢ３はＥＲストアからのＣａ^２＋の放出を正に制御し、それによって、炎症促進性刺激に応答して内皮バリア透過性を増加させる。ＥＢ３とＩＰ_３Ｒとの間の相互作用は、Ｃａ^２＋のＩＰ３ゲート化放出の機構において重要である。ＩＰ_３Ｒ_３ペプチドは、肺における炎症媒介性血管漏出および水腫の発生を予防し、敗血症の２つの異なるモデルにおいてマウスの生存を著しく向上させる。

【0058】

実施例４
内皮透過性増加および肺水腫形成の機構におけるＣａ２＋シグナル伝達のＥＢ３制御の役割の決定

【0059】

本発明者らは、ＭＴ末端におけるＥＢ３とＥＲとの動力学的相互作用が、Ｃａ^２＋波の伝播、および炎症促進性メディエーターに応答した内皮バリア透過性の増加に必要とされることを仮定する。

【0060】

仮説：ＥＲからのＣａ^２＋のＩＰ３ゲート化放出のＥＢ３制御が、内皮透過性におけるＭＴ依存性増加に必要とされる。本発明者らは、伸長中のＭＴ末端におけるＥＢ３の蓄積が、ＥＢ３とＩＰ３Ｒとの一過性相互作用を促進し、（図２１におけるモデルによって仮定されているように）ストアからのＣａ^２＋の放出を正に制御し、したがって、ＳＯＣ依存性Ｃａ^２＋移入、Ｃａ^２＋依存性ＰＫＣαアイソフォームの活性化、ｐ１２０−カテニンのＰＫＣα媒介性リン酸化、およびＶＥ−カドヘリンの内部移行を生じるという考えに取り組む。

【0061】

実施例５
持続性ＭＴ伸長およびＩＰ３Ｒ活性化を制御することにおけるＥＢ３の役割

【0062】

ＭＴ不安定化剤およびＭＴ安定化剤は、ＩＰ３誘導性Ｃａ２＋放出を阻害する（１１〜１３）。本発明者らの予備的データは、内皮細胞におけるＥＢ３の枯渇もまた、ストアからのＣａ２＋のＰＡＲ−１媒介性放出を阻害するが、内皮細胞におけるＥＢ１の枯渇はストアからのＣａ２＋のＰＡＲ−１媒介性放出を阻害しないことを実証している。本発明者らは、ＥＢ３が、ＥＲからのＩＰ３誘導性Ｃａ２＋放出を、ＭＴ動態の制御を通して間接的に制御するかどうかを決定する。本発明者らは、本発明者らによって示されているように（２０）、人工的ＥＢ３二量体を発現することによるＥＢ３枯渇細胞におけるＭＴ持続性伸長の回復がまた、ＥＲからのＣａ２＋のＰＡＲ−１媒介性放出を回復することができるかどうかを決定する。人工的二量体ＥＢ３−ＮＬ−ＬＺは、既知のＥＢパートナーへの結合に関与するいずれのドメインも完全に欠いているため、ＥＢ３とＩＰ３Ｒとの間の相互作用がＩＰ３Ｒの活性化にとって重要な意味をもつならば、ＩＰ３誘導性Ｃａ２＋放出を回復させることは予想されない。したがって、本発明者らが人工的ＥＢ３二量体を発現する細胞においてＩＰ３Ｒ活性の回復を観察するならば、本発明者らは、ＥＢ３が、ＥＲからのアゴニスト誘導性Ｃａ２＋放出を、ＭＴ動態を介して間接的に制御すると結論づけるであろう。この実験は、ＨＭＬＶＥＣにおけるＦｕｒａ２−ＡＭの３４０／３８０レシオメトリック画像化によって評価されているように、ＥＲからのＣａ２＋のトロンビン媒介性放出および細胞外Ｃａ２＋の流入を扱う。本発明者らの仮説の妥当性に基づいて、本発明者らは、ＥＢ３−ＮＬ−ＬＺの発現が、ＥＲからのＣａ２＋のアゴニスト誘導性放出を回復しないであろうと予測する。

【0063】

実施例６
ＩＰ３Ｒの細胞内分布におけるＥＢ３のＩＰ３Ｒとの相互作用の役割

【0064】

本発明者らのデータを前提として、本発明者らは、ＥＢ３とＩＰ３Ｒ ３型との相互作用が、受容体活性化の機構において重要である可能性があると提案した。ＩＰ３Ｒは、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−ｘ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ＳｘＩＰ）コンセンサスモチーフを含有し（図１７）、そのモチーフは、ＥＢ相互作用パートナーの特異的サインである。このモチーフの近くのＳｅｒまたはＴｈｒのリン酸化は、ＥＢ１のその既知のパートナーに対する親和性を著しく減少させる。本発明者らは、ＡＰ配列と融合した短いＩＰ３Ｒ配列ペプチド（７９８〜８１１；ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１））がＩＰ３ＲとＥＢ３との間の相互作用を破壊するかどうか、およびそれが、Ｃａ２＋のトロンビン誘導性ＩＰ３ゲート化放出を阻害するかどうかを決定する。そのペプチドが細胞においてリン酸化され得る可能性がいくらかあるため、本発明者らは、Ａｖｉタグ付きＩＰ３Ｒペプチドを発現し、そのリン酸化をオートラジオグラフィによって決定する。本発明者らが、ペプチドがリン酸化を受けることを見出したならば、本発明者らは、全ての他の研究についてもより強力であるように、最初のＴｈｒがＡｌａで置換されたリン酸化欠損ペプチド（リン酸化欠損ペプチド；ＫＦＡＲＬＷＡＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号２））を用いるだろう。そのペプチドのＥＢ３への結合は、免疫共沈降およびプルダウンアッセイによって細胞において、およびインビトロで確認されるであろう。本発明者らは、このペプチドを用いて、細胞におけるＥＢ３とＩＰ３Ｒとの間の相互作用を破壊する。ＩＰ３Ｒペプチドが、トロンビンに応答したストアからのＣａ２＋の放出を阻害するだろうということが、本発明者らの予想である。

【0065】

本発明者らは、ＥＢ３枯渇、またはブロッキングペプチドでのＥＢ３とＩＰ３Ｒとの間の相互作用の阻害が、ＩＰ３Ｒの細胞内分布を変化させるかどうかを調べる。ＩＰ３Ｒ ２型および３型は、主に、肺内皮微小血管系において発現している。ＩＰ３Ｒ ３型のカベオラへの動員が、ストアからのアゴニスト誘導性Ｃａ２＋放出に必要とされる。ＩＰ３の固有のＩＰ３Ｒ ３型親和性が相対的に低いことを考慮すれば、ＩＰ３発生の部位に近接したその受容体の局在化は、Ｃａ２＋のＩＰ３ゲート化放出にとって重要な意味をもつ可能性がある。したがって、本発明者らは、ＥＢ３が、ＩＰ３Ｒ３／ＴＲＰＣ１／ＴＲＰＣ４複合体の形成を通してＥＲ膜のカベオラへのテザリングを制御するかどうかを試験する。本発明者らは、トロンビン刺激の時間経過において、免疫蛍光染色により、および生細胞画像化により、ＩＰ３Ｒ３受容体の細胞内分布を決定する。ＥＢ３がＩＰ３Ｒ３のカベオラへのテザリングによってＣａ２＋のＩＰ３ゲート化放出を制御することを本発明者らが見出すならば、本発明者らは、ＥＢ３が、ＩＰ３Ｒ３とＴＲＰＣ１／ＴＲＰＣ４との間の相互作用を促進するかどうかを決定するだろう。

【0066】

実施例７
アゴニスト誘導性ＩＰ３Ｒリン酸化の機構におけるＥＢ３の役割

【0067】

ＩＰ３Ｒは、ＣａＭキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）に対する１６個の可能性のある部位を含有し（２６〜２８）、ＣａＭＫＩＩ媒介性リン酸化は、ＩＰ３に対する受容体感受性を増加させる。予測されるＣａＭＫＩＩリン酸化部位である、Ｔｈｒ８０４（図１７）は、６５１〜１１３０の領域内に位置し、ＩＰ３結合とチャネル開口との間の機能的共役にとって重要な意味をもつ。したがって、Ｔｈｒ８０４のリン酸化は、ＩＰ３誘導性チャネル開口の機構において重要である可能性がある。ＥＢ３はＣａＭに結合し、ＣａＭＫＩＩの空間的かつ時間的活性化およびその受容体のリン酸化を指示する可能性がある。この考えに取り組むために、本発明者らは、ＥＢ３の枯渇、または特定のペプチドでのＥＢ３とＩＰ３Ｒとの間の相互作用の破壊が、ＩＰ３Ｒリン酸化を阻害するかどうかを決定する。ＩＰ３Ｒリン酸化のレベルを、オートラジオグラフィーによって評価する。本発明者らは、ＥＢ３枯渇およびＩＰ３Ｒペプチドの両方が、ＩＰ３Ｒリン酸化のレベルを低下させるだろうと予想する。リン酸化の部位を、ホスホプロテオーム分析によって決定する。内因性ＩＰ３Ｒを、コンカナバリン（ｃｏｎｃｏｎａｖａｌｉｎ）Ａビーズを用いて、トロンビン処理の前および後にＨＬＭＶＥＣから精製する。ＣａＭＫＩＩ部位の特異性を、ＣａＭＫＩＩ阻害剤有りで得られるリン酸化のプロファイルと、ＣａＭＫＩＩ阻害剤なしで得られるリン酸化のプロファイルとの比較によって決定する。本発明者らは、ＣａＭＫＩＩ部位を変異させ、ＩＰ３Ｒ３の細胞内分布における、およびＣａ２＋のＩＰ３ゲート化放出の機構におけるそれらの意義を決定する。

【0068】

別の一連の実験は、ＩＰ３ＲのＣａＭＫＩＩ依存性リン酸化が、原形質膜におけるＴＲＰＣ１／４へのその受容体の結合に共役しているかどうかを決定する。リン酸化は、伸長中のＭＴ先端からＩＰ３Ｒを放出し、ＴＲＰＣ１／４へのその結合を誘導する可能性がある。ＣａＭＫＩＩとＩＰ３Ｒ３の共局在は、腸管の腸細胞、膵臓の腺房細胞、および表層粘液細胞の頂端領域に観察される。したがって、内皮細胞の管腔表面におけるＣａＭＫＩＩとＩＰ３Ｒ３の共分布が生じる可能性がある。本発明者らは、まず、休止ＨＬＭＶＥＣおよびトロンビン刺激ＨＬＭＶＥＣにおけるＩＰ３Ｒ３とＣａＭＫＩＩとの共局在を確認する。本発明者らはまた、ＦＲＥＴ分析により受容体とキナーゼとの間の相互作用を決定する。ＣａＭＫＩＩの活性を、ＦＲＥＴに基づいたバイオセンサーであるＣａｍｕｉ３３（Ｙａｓｕｎｏｒｉ Ｈａｙａｓｈｉ、Ｊａｐａｎから入手した）を用いて評価する。ＣａＭＫＩＩの空間的活性化におけるＥＢ３の役割を、同じアプローチを用いて決定する。

【0069】

実施例８
ＳＯＣ誘起性Ｃａ２＋移入の機構におけるＥＢ３とＩＰ３Ｒとの相互作用の役割

【0070】

ＥＲストアの枯渇は、ＳＯＣ活性化およびＣａ２＋移入の重要な機構である（３４〜３６）。一貫して、本発明者らは、ＥＢ３の枯渇はＣａ２＋流入を低下させるが、ＥＢ１の枯渇はＣａ２＋流入を低下させないことを見出した。本発明者らの予備的データを前提として、本発明者らは、ＥＢ３枯渇が、内皮細胞における主要なＳＯＣチャネルである、ＴＲＰＣ１およびＴＲＰＣ４のトロンビン誘導性活性化を阻害すると仮定した。この可能性に直接取り組むために、ＥＢ３ ｓｉＲＮＡまたはＩＰ３Ｒ３ペプチドで処理されたＨＬＭＶＥＣを、ホールセルパッチクランプアッセイにおいて用いて、−５０ｍＶにおけるトロンビン誘導性内向き電流およびＬａ３＋感受性内向き電流を測定する。本発明者らはまた、活性化チャネルの逆転電位を示すために電流−電圧（Ｉ−Ｖ）関係（−１００〜＋１００ｍＶ）を評価する。この結果を、ＩＰ３Ｒ３がｓｉＲＮＡで枯渇されるか、またはＩＰ３Ｒアンタゴニストである２−アミノエトキシジフェニルボレート（２−ＡＰＢ）で阻害されるＨＬＭＶＥＣにおいて得られるデータと比較する。補完的な実験は、特異的抗体またはｓｉＲＮＡによる、ＴＲＰＣ１およびＴＲＰＣ４の別々のまたは同時の不活性化が、ＥＢ３の枯渇と比較して、ホールセルコンダクタンスへ類似した効果を生じるかどうかに取り組む。本発明者らの仮説の妥当性において、本発明者らは、ＥＢ３枯渇がＣａ２＋移入をＴＲＰＣ１／４チャネルを通して阻害するだろうと予測する。これらの実験は、Ｆｕｒａ２−ＡＭレシオメトリック画像化による細胞内Ｃａ２＋濃度の変化の測定を伴う。

【0071】

別のセットの実験は、ＥＢ３の枯渇が、ＳＯＣおよびＣａ２＋移入のタプシガルギン（ＴＧ）誘導性またはＩＰ３誘導性（マイクロインジェクションによる細胞内送達）活性化を阻害することができるかどうかを決定する。ＴＧは、筋／小胞体Ｃａ２＋ ＡＴＰアーゼを阻害し、結果として、ＩＰ３Ｒ活性化とは無関係に、ＥＲからのＣａ２＋の枯渇を生じる。両方のアプローチは、対照ｓｉＲＮＡ処理細胞においてＳＯＣ誘起性Ｃａ２＋移入の活性化を誘導することが予想されるが、ＥＢ３の枯渇は、ＩＰ３ＲのＩＰ３誘導性活性化の場合のみＣａ２＋移入を阻害する可能性がある。この実験は、ＳＯＣ誘起性Ｃａ２＋移入を、ＩＰ３Ｒの活性化を通して間接的に制御することと、もしＥＢ３（またはＭＴ動態変化）がＳＯＣチャネルそれ自体の活性化にいくらかの影響を及ぼすならば、直接的に制御することにおけるＥＢ３の関与を区別するであろう。本発明者らは、これらの実験においてＴＲＰＣ１／４チャネルの活性を示すために、ホールセルコンダクタンスおよび電流−電圧（Ｉ−Ｖ）関係を評価する。

【0072】

実施例９
内皮透過性増加および水腫形成の機構におけるＥＢ３とＩＰ３Ｒとの相互作用の役割

【0073】

本発明者らは、Ｃａ２＋シグナル伝達の伝播を生じるＥＢ３とＩＰ３Ｒとの間の相互作用が、ＰＡＲ−１活性化に対する透過性応答の増加を増強するかどうかを決定する。この関連において、本発明者らは、ＩＰ３Ｒブロッキングペプチドで処理された細胞および肺において透過性バリアの増加に取り組む。本発明者らは、内皮バリアの変化の機能性尺度としてＴＥＲおよび経内皮アルブミン流束における変化を測定することによって内皮透過性増加を評価する。ＡＪの完全性および細胞内ギャップの形成を、免疫染色により、（ビオチン化アッセイを用いる）ＶＥ−カドヘリン内部移行の定量的分析により、ＶＥ−カドヘリンとｐ１２０−カテニンとの間の相互作用により、決定する。本発明者らの仮説が妥当なものとして、本発明者らは、細胞内Ｃａ２＋濃度の増加の阻害が、結果として、より少ない細胞内ギャップ形成およびより安定したＶＥ−カドヘリン接着によって反映される透過性応答の低下を生じるであろうことを予想する。細胞内Ｃａ２＋の増加は、ｐ１２０−カテニンをリン酸化することによってＡＪの解体を媒介するＰＫＣαを活性化するので、本発明者らは、ＰＫＣα活性化のレベル、およびＰＫＣα特異的部位であるＳｅｒ８７９におけるｐ１２０−カテニンリン酸化のレベルを決定する。ＰＡＲ−１媒介性細胞収縮性もまた、ＥＢ３枯渇細胞において、またはＩＰ３Ｒ３ペプチドで前処理された細胞において阻害されるかどうかを決定するために、本発明者らは、ＲｈｏＡおよびＭＬＣＫ−Ｌ活性化のレベルを分析する。ＩＰ３Ｒ３枯渇細胞またはＩＰ３Ｒ３−／−マウス（３７）から単離された肺微小血管内皮細胞を比較のために用いる。

【0074】

ＥＢ３とＩＰ３Ｒとの間の相互作用が、微小血管透過性および肺水腫におけるアゴニスト誘導性増加を増強するかどうかを決定するために、本発明者らは、肺エクスビボモデルを用いる。マウスの灌流された肺調製物を用いて、細胞浸透性ＩＰ３Ｒペプチドが、肺血管透過性のＰＡＲ−１媒介性増加を阻害するかどうかを決定する。内皮微小血管透過性を、ＰＡＲ１アゴニストペプチドの注入後、毛細血管濾過係数（Ｋｆ，ｃ）および肺経血管１２５Ｉ−アルブミン流束を測定することによって評価する。本発明者らはまた、（Ｋａｔｓｕｈｉｋｏ Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ、Ｊａｐａｎから入手した）ＩＰ３Ｒ３−／−マウス、またはＩＰ３Ｒ３がｓｉＲＮＡによって枯渇しているだろうマウスを用いて、ペプチドで得られた結果を検証する。もし、ＩＰ３ＲとＥＢ３との間の相互作用が肺微小血管透過性のアゴニスト誘導性増加を制御するのに必須であるという本発明者らの仮説が妥当であるならば、本発明者らは、ＩＰ３ＲペプチドおよびＩＰ３Ｒ３−／−の両方が、ＰＡＲ−１活性化に応答した微小血管透過性の増加の部分的阻害を明らかにする、匹敵する結果を生じるだろうと予想する。

【0075】

これらの研究の目標は、ＥＲストアからのＣａ２＋のＩＰ３ゲート化放出を制御することにおけるＥＢ３の役割を決定することである。本発明者らは、ＩＰ３Ｒリン酸化およびＥＲの頂端部原形質膜への転位置の機構におけるＥＢ３とＩＰ３Ｒとの間の相互作用の意義を決定する。本発明者らは、本発明者らの仮説に基づいて、ＥＢ３とＩＰ３Ｒとの間の相互作用がＩＰ３Ｒ活性化のコントロールポイントを提供すると予測する。本発明者らの仮説が妥当であるならば、本発明者らは、細胞培養および肺において、ＥＢ３とＩＰ３Ｒとの相互作用の破壊が、ＥＲストアからのＣａ２＋の放出を阻害し、透過性応答の増加を抑止するだろうと予想する。本発明者らは、ＥＢ３／ＩＰ３Ｒ相互作用が、１）ＩＰ３Ｒ３の、ＩＰ３生成に近接したカベオラへのテザリングにより、および２）ＣａＭＫＩＩによるＩＰ３Ｒ３リン酸化を促進することにより、Ｃａ２＋のＩＰ３ゲート化放出を制御するという以下の機構モデルを調べる。このように、肺微小血管研究と共に細胞培養実験は、ＥＢ３がＩＰ３Ｒ３活性を制御する機構を同定するだろう。本発明者らは、その仮説の検証に基づいてこれらの研究からの新規な結論を引き出すことが可能であることに関して、問題を予見していない。全ての提案された技術は、本発明者らの研究室または共同研究者の研究室において確立され、それゆえに、実現可能である。

【0076】

ＭＴ細胞骨格は、休止細胞において内皮バリアの維持に重要な役割を果たし、炎症促進性刺激によって媒介されるような内皮透過性の増加を増強するための機構を提供する。持続性ＭＴ伸長を促進し、したがってＥＢ３の抗崩壊活性によりＭＴ動態を制御するＭＴ末端結合タンパク質である、ＥＢ３は、急性肺傷害（ＡＬＩ）および成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）などの炎症性疾患中のＭＴ細胞骨格の再組織化および内皮バリア機能の損失をコントロールする主要な機構であり得る。提案された研究は、内皮血管透過性の増加および水腫形成の機構におけるＰＡＲ−１活性化に応答したＥＲストアからのＣａ２＋のＩＰ３ゲート化放出を制御することにおけるＥＢ３の役割に取り組む。本発明者らは、ＰＫＣα媒介性ＡＪ解体およびＲｈｏＡ／ＭＬＣＫ−Ｌ作動性アクトミオシン収縮性を通して内皮透過性の増加を媒介するＣａ２＋波の組織化および伝播の機構におけるＥＢ３とＩＰ３Ｒ３との間の重要な可能性がある相互作用を定義する。

【0077】

実施例１０
ＩＰ_３Ｒ_３ペプチドの切り詰めの、ＥＢ３に対する結合への影響

【0078】

計算的なインシリコのモデリングを用いて、ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴペプチド（配列番号１）における各残基により提供される結合自由エネルギーへのエネルギー的寄与を推定した。アミノ酸配列：ＫＦＡＲＬＷＴＥＩＰＴＡＩＴ（配列番号１）の切り詰め型バリアントをＥＢ３界面へドッキングさせ、相互作用の自由エネルギーを計算した（表１）。データは、Ｔｈｒ−ｘ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏが最低の結合エネルギーを有し、隣接のアミノ酸が、ＥＢ３とペプチドとの間の相互作用を安定化することにおいて重要な役割を果たすことを示している。

【0079】

【表1】

【0080】

実施例１１
末端結合阻害ペプチド（ＥＢＩＮ）の構造に基づいた設計

【0081】

末端結合阻害ペプチド、すなわち、ＥＢＩＮを、計算的インシリコのアラニンスキャニングおよびＩＰＲペプチドのＥＢ結合ポケットへの完全に柔軟なドッキングに基づいて設計した（表２および３）。結合自由エネルギー（ΔＧ）を用いて、このペプチドとＥＢタンパク質との相互作用の安定化における各残基の寄与を決定した。
以下の基準を用いた：
ΔＧ値≧１＝安定化残基
ΔＧ値≧−１＝不安定化残基
ΔＧ値＜−１〜０〜＜１＝中立残基
アラニンスキャニングは、安定化残基（０．５０Ｋｊ／モル以上の正の結合エネルギーを有する；黒色で示されている）および不安定化残基（−１の負の結合エネルギーを有する；青色で示されている）を明らかにする。

【表2】

【表3】

【0082】

結果として、１４個のアミノ酸ＩＰＲペプチドは、７個のアミノ酸の末端結合阻害ペプチド（ＥＢＩＮ；ＦＴＥＩＰＴＩ（配列番号３））に減少した。図１２は、ＥＢ３とＥＢＩＮとの間の相互作用を示す。ＩＰ_３Ｒ_３（図１２において黄色の棒で示されている）と同様に、ＥＢＩＮは、ＥＢ酸性テイルとコイルドコイルドメイン（ｃｏｉｌ−ｃｏｉｌｅｄ ｄｏｍａｉｎ）との間の疎水性グルーブ（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｇｒｏｖｅ）に結合する。ＥＢＩＮのＥＢ３への計算されたエネルギー結合は−６０．２５１ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、それは、ＩＰＲとＥＢ３との間のエネルギー結合と類似している。ＥＢＩＮの２位におけるトレオニンは、ＥＢ３界面への結合において重要な役割を果たしている。なぜなら、この残基のアラニンへの変異がその結合を完全に消失させるからである。したがって、単一のアミノ酸変異Ｔ→Ａペプチド、ＦＡＥＩＰＴＩ（配列番号４）を、結合性喪失の対照として用いた。

【0083】

実施例１２
ＥＢＩＮは、ＥＢ３／ＩＰ_３Ｒ_３相互作用を阻害し、炎症促進性メディエーターに応答した細胞内カルシウム流束を軽減する

【0084】

細胞におけるＥＢＩＮの阻害性質を決定するために、１μＭの濃度のＥＢＩＮまたは対照ペプチドで前処理された、ヒト肺大動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）単層をトロンビンでチャレンジした。ＥＢ３とＩＰ_３Ｒ_３受容体との間の相互作用を、ウェスタンブロット分析を用いて分析した。図１３に示されているように、ＥＢＩＮ処理は、ＥＢ３とＩＰ_３Ｒ_３との間の基礎相互作用およびトロンビン誘導性相互作用を軽減した。ＩＰ_３Ｒ_３のＩＰ３に対する応答性を調節することにおけるＥＢ３の役割という考えと一致して、ＥＢＩＮは、トロンビンおよびヒスタミンに応答した細胞内カルシウム流束を有意に阻害した。図１４は、１μＭ Ｍｙｒ−ＥＢＩＮまたは対照ペプチド（ＦＡＥＩＰＴＩ）（配列番号４）で前処理され、かつ５０ｎＭトロンビンまたは９０μＭヒスタミンでチャレンジされたＨＰＡＥＣにおける３４０／３８０（結合型／遊離Ｆｕｒａ−２Ｍ）比における変化を示す。ＥＢＩＮは、炎症促進性サイトカインでのＨＰＡＥＣ単層の刺激後の細胞内カルシウムにおけるアゴニスト誘導性増加（［Ｃａ２＋］ｉトランジェント）を緩和したが、対照ペプチドは緩和しなかった。

【0085】

細胞形状変化および傍細胞透過性に対するＥＢＩＮの影響を決定するために、ＨＰＡＥＣ単層の経内皮抵抗性を測定した。図１５は、ＥＢＩＮが、両方の炎症促進性メディエーターに応答したＨＰＡＥＣ単層の細胞形状変化および傍細胞透過性亢進を阻害したが、結合性喪失ペプチドに関しては阻害しなかったことを示す。これらの結果は、ＥＢＩＮのバリア保護効果が、内皮のカルシウムシグナル伝達および細胞形状変化の阻害に関連していることを示す。

【0086】

実施例１３
ＥＢＩＮは、マウスにおいてＮＯ産生およびヒスタミン誘導性血管拡張を阻害する

【0087】

ＮＯを産生する内皮特異的酵素である一酸化窒素シンターゼ３（ｅＮＯＳ）の活性は、カルシウムシグナル伝達により、特にｅＮＯＳとカルモジュリンとの相互作用を通して、制御され、炎症中の内皮バリアの透過性亢進の既知の原因の１つである。ＥＢＩＮはカルシウムシグナル伝達を阻害するため、ＥＢＩＮのバリア保護効果は、部分的には、ｅＮＯＳの阻害によると仮定された。したがって、ＮＯの基礎産生およびアゴニスト誘導性産生に対するＥＢＩＮの影響を測定した。ＦＡＳ１フェムトスタット（ｆｅｍｔｏｓｔａｔ）および電気化学的ソフトウェアを有するパーソナルコンピュータと連結されたポルフィリンＮＯ電極（Ｇａｍｒｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、ＮＯ形成を測定した。ＮＯ濃度と比例する電極電流を、時間の関数として測定した。興味深いことに、ＥＢＩＮは、基礎ＮＯ産生に対する影響を示さなかった。このことは、ＥＢＩＮが構成的ｅＮＯＳ活性を阻害しないことを示唆している。しかしながら、ＥＢＩＮは、アゴニスト誘導性ＮＯ産生を有意に軽減した（図１６）。これらの結果と一致して、マウスにおけるＡＰ−ＥＢＩＮのｉ．ｖ．注射は、収縮期血圧に対する影響を示さなかったが、ＥＢＩＮは、ヒスタミン誘導性血管拡張を有意に阻害した（図１７）。これらのデータは、細胞培養実験において得られたデータに一致している。これらの結果は、ＥＢＩＮが、ヒスタミンに応答してＮＯ生成を阻害することにより血管拡張を軽減することを示している。

【0088】

実施例１４
ＥＢＩＮは、ＬＰＳ誘導性敗血症における死亡およびアナフィラキシー後の血管漏れを防止する

【0089】

ＬＰＳ誘導性敗血症による死亡率に対するＥＢＩＮの影響を決定した。マウスは、ＬＤ９０用量でのＬＰＳ投与の３０分前および１時間後に、ＡＰ−ＥＢＩＮまたはＡＰ対照ペプチドのｉ．ｖ．後眼窩注射を受けた。ＥＢＩＮで処理されたマウスは、対照群と比較して生存率の著しい向上を示した（図１８）。さらに、ＥＢＩＮの後処理もまた何らかの保護効果を示すかどうかを決定した。この実験において、Ｍｙｒ−ＥＢＩＮを、ＬＰＳチャレンジから３０分後および２４時間後に尾静脈内に注射した。図１９に示されているように、ＥＢＩＮでの後処理は、対照群（結合性喪失ペプチド）と比較して生存率においてわずかな向上しかもたらさない。Ａｐ−ＥＢＩＮに関する前の結果と一致して、Ｍｙｒ−ＥＢＩＮでの前処理は、生存率の有意な増加（ｐ＜０．０５）を示した（図１９）。全身性炎症前のＥＢＩＮの投与は、よりはるかに高い有益な結果を生じたと結論づけられる。

【0090】

血漿ＶＥＧＦの上昇の結果である気道微小血管透過性亢進は、典型的喘息およびその咳型を有する患者における異常な気道機能に寄与する重要な因子の一つである。急性アレルギー性喘息応答は、主にＩｇＥ媒介性過敏性によるため、本発明者らはまた、ＥＢＩＮが、ＩｇＥ媒介性アナフィラキシー反応後の皮下血管漏れから保護するかどうかを決定した。図２０は、ＥＢＩＮの静脈内注射が、耳（高い血管新生、Ａ）および背中（低い血管新生、Ｂ）において皮下血管漏れ（エバンスブルー（Ｅｖａｎ Ｂｌｕｅ）陽性領域のサイズおよび強度）を有意に軽減するが、対照の結合性喪失ペプチドはそれらを軽減しないことを示している。これらのデータは、ＥＢＩＮが、慢性型または急性型のアレルギー性喘息を有する患者の肺機能および全体的な健康を改善し、喘息性炎症性応答を抑えるために効果的に用いられ得ることを示している。

【図1】

【図3】

【図5】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図2】

【図4】

【図6】

【図13】

【図21】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]