特許 6042834 抗ＣＳ１抗体の治療的使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6042834

(24)【登録日】2016年11月18日

(45)【発行日】2016年12月14日

(54)【発明の名称】抗ＣＳ１抗体の治療的使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20161206BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20161206BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20161206BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20161206BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20161206BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20161206BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/28ZNA

   C07K16/46

   A61P35/00

   A61K39/395 N

   !C12N15/00 A

   !C12P21/08

【請求項の数】19

【外国語出願】

【全頁数】95

(21)【出願番号】特願2014-30549(P2014-30549)

(22)【出願日】2014年2月20日

(62)【分割の表示】特願2011-207654(P2011-207654)の分割

【原出願日】2004年5月10日

(65)【公開番号】特開2014-139187(P2014-139187A)

(43)【公開日】2014年7月31日

【審査請求日】2014年3月19日

(31)【優先権主張番号】60/469,211

(32)【優先日】2003年5月8日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】60/557,622

(32)【優先日】2004年3月29日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】60/557,621

(32)【優先日】2004年3月29日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】60/557,620

(32)【優先日】2004年3月29日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509189086

【氏名又は名称】アッヴィ・バイオセラピューティクス・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】特許業務法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】マーナ・ウィリアムス

(72)【発明者】

【氏名】ユン・ジェイ・ツォ

(72)【発明者】

【氏名】ニコラス・エフ・ランドルフィ

【審査官】 小金井 悟

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第０１／０４６２６０（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 J. Immunol.，２００１年１１月１５日，Vol.167, No.10，pp.5517-5521

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＣＡ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１でコードされるタンパク質に結合する、単離抗ＣＳ１抗体であって、
配列番号１５で表される重鎖ＣＤＲ１、配列番号９５で表される重鎖ＣＤＲ２および配列番号１７で表される重鎖ＣＤＲ３の重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変領域；ならびに配列番号１８で表される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１９で表される軽鎖ＣＤＲ２および配列番号２０で表される軽鎖ＣＤＲ３の軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、前記単離抗ＣＳ１抗体。

【請求項2】

重鎖可変領域が配列番号４７を含む、請求項１に記載の単離抗ＣＳ１抗体。

【請求項3】

軽鎖可変領域が配列番号５０を含む、請求項１または２に記載の単離抗ＣＳ１抗体。

【請求項4】

モノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離抗ＣＳ１抗体。

【請求項5】

ヒト化抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離抗ＣＳ１抗体。

【請求項6】

ＩｇＧ_１である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離抗ＣＳ１抗体。

【請求項7】

細胞傷害薬にコンジュゲートされた請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離抗ＣＳ１抗体を含む、コンジュゲート化合物。

【請求項8】

請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離抗ＣＳ１抗体および許容し得るキャリアを含む薬学的組成物。

【請求項9】

請求項７に記載のコンジュゲート化合物および許容し得るキャリアを含む薬学的組成物。

【請求項10】

必要とする患者における形質細胞性癌を治療するための、請求項８〜９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項11】

形質細胞性癌が多発性骨髄腫である、請求項１０に記載の薬学的組成物。

【請求項12】

必要とする患者における多発性骨髄腫を治療するための、請求項８〜９のいずれか一項に記載の薬学的組成物であって、前記患者が多発性骨髄腫の臨床症状が発症していない、前記薬学的組成物。

【請求項13】

患者に免疫抑制薬がさらに投与される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項14】

免疫抑制薬が投与された後、抗ＣＳ１抗体またはコンジュゲート化合物が投与される、請求項１３に記載の薬学的組成物。

【請求項15】

免疫抑制薬と組み合わせて、抗ＣＳ１抗体またはコンジュゲート化合物が投与される、請求項１３に記載の薬学的組成物。

【請求項16】

患者に免疫調節薬がさらに投与される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項17】

免疫調節薬が投与された後、抗ＣＳ１抗体またはコンジュゲート化合物が投与される、請求項１６に記載の薬学的組成物。

【請求項18】

免疫調節薬と組み合わせて、抗ＣＳ１抗体またはコンジュゲート化合物が投与される、請求項１６に記載の薬学的組成物。

【請求項19】

患者に免疫抑制薬がさらに投与される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、疾患（自己免疫および癌に関する疾患が含まれる）の治療におけるアンタゴニストおよび抗体の分野に関する。本発明は、さらに、これらの疾患を検出、同定、および調整する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

免疫グロブリン発現の増加は、多数の疾患の特徴である。免疫グロブリンの高レベル分泌により、種々の障害（過粘稠血症候群（倦怠感、頭痛、息切れ、精神錯乱、胸痛、腎臓損傷および腎不全、視覚問題、およびレイノー現象（血液循環（特に、指、つま先、鼻、および耳）の減少）を引き起こす消耗性障害が含まれる）が引き起こされる。寒冷凝集素病、混合性クリオグロブリン血症、シェーグレン症候群、粘液水腫性苔癬、およびゴーシェ病は、免疫グロブリン発現の増加に関連する疾患の例である。

【0003】

自己タンパク質を標的とする免疫グロブリン発現の増加は、自己免疫疾患を代表する特
徴である。自己免疫疾患は、自己抗原を自己として認識するための免疫系の不全である。自己免疫疾患では、免疫が誤って細胞、組織、および器官を標的として自己を攻撃し、最終的に生理系が破壊する。自己免疫および自己免疫疾患は、元来は多因子性であり、遺伝性素因、宿主因子（例えば、免疫調節の脆弱性、抑制性Ｔ細胞の欠失、または調節に対するＢ細胞のポリクローナル刺激）、環境因子、および抗原駆動機構が自己免疫の産生および自己抗原に対する自己抗体の産生に関与する。

【0004】

胃腸管障害および全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）は、自己免疫疾患の２つの例である。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（胃腸管障害の亜群）は、全世界で約４００万人の個体が罹患している不治の障害群である。再発性炎症性腸疾患の病因は現在のところ知られていない。胃腸管細胞（リンパ球が含まれる）の自己免疫媒介破壊という説がある。遺伝性炎症性腸疾患モデルにおける異常な同型凝集が以前に証明されており、ＮＯＤ２（自己免疫障害に関与する遺伝子）の変異が患者をクローン病にかかりやすくすることが示されている。Ｎｉ，Ｊ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ ｉｎ Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：７−１５（１９９６）；Ｏｇｕｒａ，Ｙ．ら，Ａ ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ＮＯＤ２ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ Ｃｒｏｈｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：６０３−６０６（２００１）。

【0005】

ＩＢＤは、小腸および結腸で最も頻繁に発症するが、胃腸管の任意の部分が関与し得る。米国のみで１００万人以上がＩＢＤと診断されており、年間で１０，０００人以上が新たに診断されている。ＩＢＤ患者の生活の質の劇的な影響のために幾万時間も喪失し、これは年間１０億ドルの労働時間の損失に値する。

【0006】

ＩＢＤは、一定範囲の胃腸管および腸外症状（下痢、直腸出血、腹痛、体重減少、皮膚および眼の障害、および成長遅延、および小児における性的成熟遅延が含まれる）を引き起こす。ＩＢＤの２つの型は、類似の症状および生理学的徴候を示すが、消化管に影響を与える様式が異なる潰瘍性大腸炎およびクローン病である。潰瘍性大腸炎は、結腸粘膜（最も頻繁には直腸で起る）の全部または一部の潰瘍性炎症によって特徴づけられる。その症状には、直腸出血および尿意ひっ迫、テネスムス、および下痢が含まれる。潰瘍性大腸
炎は、重篤な短期および長期合併症を伴う。最も重篤な短期合併症は、激症潰瘍、中毒性巨大結腸、および穿孔である。重症性長期合併症には、骨粗鬆症および結腸直腸癌が含まれる。

【0007】

クローン病は、口腔から肛門までの任意の胃腸管部分で罹患し得る慢性貫壁性炎症である。クローン病は、１つまたは複数の関連領域の間に非罹患領域が存在する不連続疾患である。疾患後期では、粘膜は、介在正常粘膜が混在した深部縦走潰瘍形成に起因する敷石像を示す。

【0008】

ほとんどのクローン病患者は、腹痛および腹部圧通、慢性もしくは夜間下痢、直腸出血、体重減少、および熱を伴う。クローン病は、長期にわたり原発性炎症性疾患から以下の２つの臨床パターンの１つに進行する：狭窄（閉塞性）または貫通性（瘻管性）。狭窄形成では、貫壁性炎症により、腸壁中の線維筋が増殖し、その後管腔が狭まる。閉塞の症状は、ＣＤの進行につれて共通になる。貫通形態では、炎症通路として腸壁を介して洞管を形成し、漿膜表面を突破し、隣接組織を閉塞し、皮膚も貫通する。

【0009】

潰瘍性大腸炎およびクローン病は、一般に、臨床、内視鏡、および組織学的基準を使用して診断する。しかし、今までのところ、１つの所見である疾患と別の疾患を絶対的に診断する伝統的な診断技術は確立されていない。さらに、約２０％の患者がクローン病と潰瘍性大腸炎を含む臨床像を有する。このプロフィールに適合する患者は、不定型潰瘍を有すると言われる。

【0010】

ＩＢＤの症状は、患者の福祉、生活の質、および機能する能力に非常に影響を与え得る。炎症期間が長期化し、頻度が増し、重症度によっては生活が大打撃を受ける。ＩＢＤは慢性であり、且つ３０歳までに発症するので、患者は一般的に生涯にわたる治療が必要である。潜在的標的および診断マーカーの同定のための疾患状態での新規のタンパク質および化合物の役割の解明は、炎症性腸疾患患者の現在の治療の改良に有益である。

【0011】

ＳＬＥは、皮膚、腎臓、脳、および心臓を含む多数の器官および組織の損傷を含む病原的結果を含み得る種々の遍在分子に対する自己抗体の産生によって特徴づけられる。現在承認されているＳＬＥの治療方法は、ステロイド、免疫抑制薬、免疫調節薬、および抗マラリア薬を介した非特異的免疫抑制および症状の制御を含む。しかし、これらの治療アプローチは、腎臓毒性および早死のリスクがある。したがって、リンパ球活性化および自己抗体産生を特異的に妨害する新規のアプローチを開発することが望ましい。

【0012】

免疫グロブリンおよび／またはＢ細胞発現の増加が重要な役割を果たす他の自己免疫疾患には、特発性血小板減少症、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫性溶血性貧血、および重症筋無力症が含まれる。Ｂ細胞および／または免疫グロブリンの増加の役割の証明は、ステロイド、免疫抑制薬、および／または抗ＣＤ２０抗体（Ｂ細胞を標的する）で治療した患者を使用した研究に由来する。これらの疾患の症状の改善は、Ｂ細胞および／または血清免疫グロブリンの減少と相関し、Ｂ細胞が種々の自己免疫疾患で果たす極めて重要な役割が強調される。

【0013】

免疫グロブリン発現の増加は、悪性疾患でも認められる。自己免疫障害と同様に、癌の病因は同様に元来多因子性である。米国で２番目の死因である癌は、細胞成長が制限されなくなるＤＮＡの変異に関係している。遺伝性素因は、喫煙および化学的変異誘発などの環境因子と組み合わせて、多数の癌発症で大きな役割を果たす。

【0014】

癌は、身体の任意の組織または器官で発症し得る。形質細胞性新生物（多発性骨髄腫、「孤立性」骨髄腫、髄外性形質細胞種、形質細胞性白血病、マクログロブリン血症（ワルデンシュトレームマクログロブリン血症が含まれる）、重鎖疾患、原発性アミロイドーシス、意義不明のモノクローナル免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）が含まれる）は、免疫グロブリン発現の増加に関連する。慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、非形質細胞性新生物も免疫グロブリンの高レベル発現に関連する。

【0015】

骨髄腫（すなわち、カーレル病）は、典型的には二次リンパ組織を起源とし、その後骨髄組織に転移して存在する単一クローン由来の形質細胞の腫瘍である。骨髄腫は、一般に、骨髄および周辺骨構造に影響を与え、骨痛および病的骨折もしくは病変（骨溶性病変）、異常出血、貧血、および感染感受性の増加を一次症状とする。疾患の進行段階には、腎不全、骨格の変形、脊髄の圧迫、および高カルシウム血症が含まれる。骨髄腫は、骨の破骨細胞再吸収の誘導、それによる骨構造の破壊および血漿中のカルシウム濃度の増加によって骨細胞に影響を与える。骨髄腫の病因は現在知られていない。放射線損傷、腫瘍遺伝子の変異、家族性の原因、および異常なＩＬ６発現との関連が主張されている。

【0016】

多発性骨髄腫は、複数の起源を有する形質細胞性腫瘍である。多発性骨髄腫は、全形質細胞性悪性腫瘍の約１０％を占め、成人で最も一般的な骨腫瘍であり、年間発症率は１００，０００人に３〜４人である。米国では、多発性骨髄腫は、非ホジキンリンパ腫に次いで２番目に多い血液悪性腫瘍であり、米国のみでの症例数は約５０，０００であり、毎年約１３，５００例が新規に報告されている。多発性骨髄腫と診断された患者の予後は悪く、疾患が進行した患者では数ヵ月から１年間でしかない。

【0017】

骨髄腫および多発性骨髄腫（以後「骨髄腫」と呼ぶ）の伝統的な治療計画は、化学療法、放射線療法、および手術からなる。さらに、その他の点では健康な患者には骨髄移植が推奨される。治癒率は３０％に達し、骨髄腫が治癒し得ることが公知の唯一の方法である。しかし、高齢であるか骨髄移植手順に耐えることができない個体には、化学療法が最も適切である。

【0018】

現在の診断手順は、Ｘ線、骨髄穿刺、血液検査および尿検査（ベンスジョーンズタンパク質の存在の検出のため）、ならびに赤血球沈降速度アッセイを含む。骨髄腫性形質細胞の潜在的な細胞表面マーカーも同定されており、ＣＤ３８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ２０が含まれる。Ｒｕｉｚ−Ａｒｕｇｅｌｌｅｓ ＧＪ ａｎｄ Ｓａｎ Ｍｉｇｕｅｌ ＪＦ，Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．６９：６８４−９０（１９９４）。他の非Ｂ細胞系列のマーカーには、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３９、ＣＤｗ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ５４、ＣＤ５６、およびＣＤ７１、ならびに非凝集抗原（Ｒｌ−３、ＰＣＡ−１、ＰＣＡ−２、ＰＣ１、６２Ｂ１、８Ａ、８Ｆ６、およびＭＭ４）が含まれる。Ｒｕｉｚ−Ａｒｕｇｅｌｌｅｓ，前出；Ｌｅｏ Ｒら，Ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌｓ，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．６４：１３２−９（１９９２）。さらに、Ｍタンパク質として公知の異常な抗体の外観は、多発性骨髄腫の指標である。Ｍタンパク質産生の増加は、消耗性副作用（倦怠感、頭痛、息切れ、精神錯乱、胸痛、腎臓損傷および腎不全、視覚問題、およびレイノー現象（血液循環（特に、指、つま先、鼻、および耳）の減少が含まれる）を引き起こす多発性骨髄腫の過粘稠血症候群に関与している。低温条件下で血中Ｍタンパク質が粒子を形成した場合にクリオグロブリン血症が起こる。これらの粒子は、微小血管を遮断し、寒冷気候において痛みならびにつま先、指、および他の先端のしびれを引き起こし得る。染色体欠失、β−２ミクログロブリンの上昇、血清クレアチニンレベル、およびＩｇＡイソ型化（ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ）などの予後指標も研究されている。Ｔｒｉｃｏｔ Ｇら，Ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ，Ｂｌｏｏｄ ８６：４２５０−２（１９９５）。

【0019】

ＣＳ１（ＳＬＡＭＦ７，１９Ａ；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２１１８１．３，Ｒｅｆ．Ｂｏｌｅｓ ａｎｄ Ｍａｔｈｅｗ（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５２：３０２−３０７；Ｂｏｕｃｈｏｎら，（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：５５１７−５５２１；Ｍｕｒｐｈｙら，（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６１：４３１−４３６）は、免疫グロブリンスーパーファミリーのＣＤ２サブセットのメンバーである。ＣＤ２ファミリーの分子は、リンパ球の同時活性化増殖、分化、および付着、ならびに免疫グロブリン分泌、サイトカイン産生、およびＮＫ 細胞の細胞傷害性などの広範な免疫調節機能に関与する。ＣＤ２、ＣＤ５８、およびＣＤ１５０などのＣＤ２ファミリーのいくつかのメンバーは、乾癬、関節リウマチ、および多発性硬化症などの多数の自己免疫疾患および炎症性疾患で役割を果たすか役割を果たすと提案されている。

【0020】

ＣＳ１（ＣＲＡＣＣ、１９Ａ、ＡＰＥＸ−１、およびＦＯＡＰ１２としても公知）は、Ｂｏｌｅｓ，Ｋ．ら（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５２：３０２−３０７（２００１）を参照のこと）によって単離およびクローン化された。ＣＳ１がＮＫ細胞媒介細胞傷害性およびリンパ球の付着で役割を果たすことが報告されている（Ｂｏｕｃｈｏｎ，Ａ．ら，Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ．５５１７−５５２１（２００１）；Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６１：４３１−４３６（２００２））。

【0021】

ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４９６３号は、ＡＰＥＸ−１の組換え細胞外ドメインの産生を検出するためのＡＰＥＸ−１に対する抗体およびその使用を開示している。しかし、Ｂ細胞によって免疫グロブリンの産生および／または増殖および／または骨髄腫の発症を阻害することができる抗体は開発されておらず、上記の参照刊行物にも開示されていない。また、自己免疫疾患または癌におけるＣＳ−１の過剰発現は、上記の参照刊行物で立証も開示もされていない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0022】

【非特許文献1】Ｎｉ，Ｊ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ ｉｎ Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：７−１５（１９９６）

【非特許文献2】Ｏｇｕｒａ，Ｙ．ら，Ａ ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ＮＯＤ２ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ Ｃｒｏｈｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：６０３−６０６（２００１）

【非特許文献3】Ｒｕｉｚ−Ａｒｕｇｅｌｌｅｓ ＧＪ ａｎｄ Ｓａｎ Ｍｉｇｕｅｌ ＪＦ，Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．６９：６８４−９０（１９９４）

【非特許文献4】Ｌｅｏ Ｒら，Ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌｓ，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．６４：１３２−９（１９９２）

【非特許文献5】Ｔｒｉｃｏｔ Ｇら，Ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ，Ｂｌｏｏｄ ８６：４２５０−２（１９９５）

【非特許文献6】ＳＬＡＭＦ７，１９Ａ；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２１１８１．３，Ｒｅｆ．Ｂｏｌｅｓ ａｎｄ Ｍａｔｈｅｗ（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５２：３０２−３０７

【非特許文献7】Ｂｏｕｃｈｏｎら，（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：５５１７−５５２１

【非特許文献8】Ｍｕｒｐｈｙら，（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６１：４３１−４３６

【非特許文献9】Ｂｏｌｅｓ，Ｋ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５２：３０２−３０７（２００１）

【非特許文献10】Ｂｏｕｃｈｏｎ，Ａ．ら，Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ．５５１７−５５２１（２００１）

【非特許文献11】Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６１：４３１−４３６（２００２）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0023】

（発明の要旨）
潜在的な標的および診断マーカーの同定のための病状における新規のタンパク質および化合物の役割の解明は、自己免疫疾患患者および癌患者（ＩＢＤ、ＳＬＥ、ＲＡ、および骨髄腫を罹患した患者が含まれる）の現在の治療の改良に有益である。したがって、これらの疾患（特に、ＣＳ１）の治療および診断のための分子標的を本明細書中に提供する。さらに、ＣＳ１に結合して中和するアンタゴニスト（抗ＣＳ１抗体などの中和抗体が含まれる）を本明細書中に提供する。

【0024】

本発明は、血小板、赤血球、内皮細胞（ＨｕＶＥＣ）、腎臓細胞、気管支細胞、末梢気道細胞、前立腺細胞、肝細胞、または乳房細胞で有意なＣＳ１タンパク質発現は検出されないという本発明者らの発見に一部基づく。ＣＳ１発現はリンパ球特異的であり、患者由来の細胞（多発性骨髄腫由来の形質細胞が含まれる）および形質細胞性白血病患者由来の細胞で検出される。形質細胞のみで発現が検出され、骨髄サンプル由来の他の細胞型では有意なレベルで検出不可能である。したがって、本発明は、癌（多発性骨髄腫、「孤立性」骨髄腫、髄外性形質細胞種、形質細胞性白血病、マクログロブリン血症（ワルデンシュトレームマクログロブリン血症が含まれる）、重鎖疾患、原発性アミロイドーシス、意義不明のモノクローナル免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ））の治療薬としての抗ＣＳ１抗体の使用実現可能性を証明した。さらに、免疫グロブリン発現の増加に関連する非形質細胞性新生物（慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）が含まれる）も、抗ＣＳ１療法から恩恵を受ける。

【0025】

さらに、以前の研究では、インビトロでのＰＷＭ（ヤマゴボウマイトジェン）活性化末梢血Ｂリンパ球細胞、記憶／エフェクター対ナイーブ末梢血Ｂリンパ球およびＴリンパ球のサブセット、または末梢血由来のＣＤ１４^＋単球／マクロファージでのＣＳ１タンパク質の発現が明らかになっていない。以前の研究は、免疫グロブリン産生におけるＣＳ１の役割も明らかにされていなかった。結果として、ＣＳ１と自己免疫疾患との相関は以前には確立されていなかった。本発明はまた、ＣＳ１ ＲＮＡおよびタンパク質発現は活性化末梢血Ｂ細胞（自己抗体産生を担い、自己免疫疾患の発症で有意な役割を果たすと考えられている細胞サブセット）によって強力に上方制御されるという本発明者らの発見に基づく。さらに、本発明は、ＩＢＤで苦しむ患者と同様に、ＳＬＥ患者の末梢血Ｂリンパ球におけるＣＳ１ ＲＮＡの発現も年齢適合健常成人由来のＢ細胞と比較して増加することを明らかにした。本発明により、関節リウマチ（ＲＡ）滑膜中の浸潤性形質細胞でＣＳ−１が発現することが明らかになる。本発明により、ＣＳ１が抗体産生に関与し、ＣＳ１に対する抗体により健常な成人および狼瘡患者由来のＢ細胞によって分泌されたＩｇＭおよびＩｇＧが減少することも明らかとなった。その後、本発明のデータにより、ＣＳ１が自己免疫疾患（特に、ＳＬＥ、ＩＢＤ、およびＲＡ）の確立に重要な役割を果たすことが示唆される。免疫グロブリン、Ｂ細胞、および／またはＢ細胞産物の増加に関連する他の疾患（寒冷凝集素病、免疫水疱性疾患（水胞性類天疱瘡、天疱瘡、疱疹性皮膚炎、線状ＩｇＡ疾患、および後天性表皮水疱症が含まれる）、混合性クリオグロブリン血症、高ガンマグロブリン血症、シェーグレン症候群、自己免疫性貧血、喘息、重症筋無力症、多発性硬化症、心筋または心膜の炎症、アトピー性皮膚炎、乾癬、粘液水腫性苔癬、およびゴーシェ病が含まれる）も抗ＣＳ１治療から恩恵を受ける。

【0026】

さらに、以前に自己免疫疾患および形質細胞癌（骨髄腫および形質細胞性白血病が含まれる）の治療のための抗ＣＳ−１抗体の使用実現可能性を試験するための研究は行われていなかった。理想的な治療抗体は、主に標的細胞に結合すべきである。他の細胞および組織への結合により、これらの細胞および組織に潜在的損傷が与えられ、そして／または治療抗体が枯渇し得るので、所望の治療有効性を達成するために過剰量の抗体が患者に送達される必要があった。より重要には、血小板に結合する抗体は、血小板活性化（過剰な凝
血を引き起こし得る）または血小板枯渇（血液凝固障害）などの副作用を有し得る。したがって、通常、抗体が複数の細胞および組織と結合する場合、特に、血小板と結合する場合には、治療薬として抗体を使用することは実現不可能である。本発明は、血小板、赤血球、ＨｕＶＥＣ、腎臓細胞、気管支細胞、末梢気道細胞、前立腺細胞、肝細胞、または乳房細胞で有意なＣＳ１タンパク質発現は検出されないという本発明者らの発見に一部基づく。したがって、本発明により、自己免疫疾患および形質細胞性癌（骨髄腫および形質細胞性白血病が含まれる）の治療のための治療薬としての抗ＣＳ１抗体の使用実現可能性が証明された。

【0027】

したがって、本発明は、ＣＳ１に結合するアンタゴニストに関する。このような実施形態の例示的実施形態には、抗ＣＳ−１抗体および抗体フラグメントの中和が含まれる。抗体は、ＣＳ１の少なくとも１つの生物活性を中和し、この抗体はＣＳ１と結合し、（ａ）免疫グロブリン分泌および／またはリンパ球による産生の阻害ならびに（ｂ）ＣＳ１を発現する細胞の溶解の誘導からなる群から選択される少なくとも１つの活性が可能である。本発明の抗体または抗体フラグメントは、配列番号３〜２６の任意の１つと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む。本発明はまた、配列番号３〜２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む抗体の実質的に同一のエピトープに結合する抗体または抗体フラグメントに関する。

【0028】

本発明はまた、抗体が配列番号３のアミノ酸配列を含む成熟重鎖可変領域および配列番号４のアミノ酸配列を含む成熟軽鎖可変領域を含む抗体または抗体フラグメントに関する。

【0029】

本発明はまた、抗体が配列番号５のアミノ酸配列を含む成熟重鎖可変領域および配列番号６のアミノ酸配列を含む成熟軽鎖可変領域を含む抗体または抗体フラグメントに関する。

【0030】

本発明はまた、抗体が配列番号７のアミノ酸配列を含む成熟重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む成熟軽鎖可変領域を含む抗体または抗原結合フラグメントに関する。

【0031】

本発明はまた、配列番号８、９、１０、１４、１５、１６、２０、２１、または２２のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に関する。

【0032】

本発明はまた、配列番号１１、１２、１３、１７、１８、１９、２３、２４、２５のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に関する。

【0033】

本発明はまた、抗体が配列番号２７のアミノ酸配列を含む成熟重鎖可変領域および配列番号２８のアミノ酸配列を含む成熟軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。

【0034】

本発明はまた、配列番号２９および３０のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に関する。本発明はまた、配列番号３０のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に関する。

【0035】

本発明はまた、抗体が配列番号２７または３４のアミノ酸配列を含む成熟重鎖可変領域および配列番号２８または３９のアミノ酸配列を含む成熟軽鎖可変領域を含むヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。本発明はまた、配列番号３１のアミノ酸配列を含むヒト化抗体の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に関する。

【0036】

本発明はまた、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−５０９１のハイブリドーマ細胞株Ｌｕｃ９０によって産生されたモノクローナル抗体の実質的に同一のエピトープに結合するか、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−５０９１のハイブリドーマ細胞株によって産生されたモノクローナル抗体の非重複エピトープに結合する、抗体に関する。

【0037】

本発明はまた、２００４年５月６日にＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株Ｌｕｃ６３によって産生されたモノクローナル抗体の実質的に同一のエピトープに結合するか、ハイブリドーマ細胞株Ｌｕｃ６３によって産生されたモノクローナル抗体の非重複エピトープに結合する抗体に関する。

【0038】

本発明はまた、特許請求の範囲に記載の抗体および薬学的キャリアを含む薬学的組成物に関する。

【0039】

本発明はまた、白血球またはリンパ球を有効量の抗ＣＳ１抗体に接触させる工程を含む、リンパ球による免疫グロブリンの分泌を減少させる方法に関する。

【0040】

本発明はまた、細胞を有効量のＣＳ１に対する抗体に接触させる工程を含む、ＣＳ１発現細胞の細胞傷害性を誘導する方法に関する。

【0041】

本発明はまた、被験体に有効量のＣＳ１のアンタゴニストを投与する工程を含むＳＬＥおよびＩＢＤなどの自己免疫疾患ならびに骨髄腫などの癌を予防または治療するための必要とする被験体への抗ＣＳ１抗体または抗体フラグメントなどの本発明のアンタゴニストの使用方法に関する。好ましくは、これらの抗体は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−５０９１またはＬｕｃ６３のハイブリドーマ細胞株によって産生されたモノクローナル抗体の実質的に同一のエピトープに結合する。

【0042】

本発明はまた、患者の生体サンプル中の表２に記載の配列（以後ＣＳ１と呼ぶ）と少なくとも８０％同一、好ましくは９０％同一、より好ましくは９５％同一の配列を含む核酸を検出する工程と、それによって病的細胞の有無を決定する工程とを含む、自己免疫疾患および癌に関連する患者の病的細胞の有無を決定する方法を提供する。生物サンプルは、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、または他の核酸であり得る単離核酸を含む。生体サンプルは、病変（ＳＬＥ、ＲＡ、およびＩＢＤが含まれる自己免疫疾患ならびに骨髄腫および形質細胞性白血病などの癌が含まれる）に罹患した器官由来の組織である。さらなる工程では、核酸検出工程前に核酸増幅を組み込むことができる。検出は、ＣＳ１を含む核酸によってコードされるタンパク質の検出である。標識核酸プローブの使用によって検出工程を実施することができる。検出工程は、ＣＳ１配列と少なくとも８０％同一、好ましくは９０％同一、より好ましくは９５％同一の配列を含むバイオチップを使用するか核酸によってコードされるポリペプチドを検出することができる。生体サンプルは、病変を治療するために治療計画を受けたか、自己免疫疾患または癌（骨髄腫および形質細胞性白血病が含まれる）を罹患していると疑われる患者に由来し得る。

【0043】

組成物（例えば、ＣＳ１配列（例えば、標識されたもの）を含む単離核酸分子；このような核酸を含む発現ベクター；このような発現ベクターを含む宿主細胞；ＣＳ１配列を含むこのような核酸分子によってコードされる単離ポリペプチド；またはポリペプチドに特異的に結合する抗体）も提供する。特定の実施形態では、抗体は、エフェクター化合物と抱合しているか、検出可能な標識（例えば、蛍光標識、放射性同位体、または細胞傷害性化学物質が含まれる）と抱合しているか、ヒト化抗体である。

【0044】

（表）
表１は、ＣＳ１モノクローナル抗体のパネルの特異的結合活性を示す結果を提供する。

【0045】

表２は、ＣＳ−１の核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。

【0046】

表３Ａおよび３Ｂは、インビトロでの活性化Ｂ細胞リンパ球によるＩｇＧ産生の減少における抗ＣＳ１治療の結果を示す。

【0047】

表４は、Ｌｕｃ９０の重鎖可変領域（配列番号３）および軽鎖可変領域（配列番号４）のアミノ酸配列；Ｌｕｃ６３の重鎖可変領域（配列番号５）および軽鎖可変領域（配列番号６）のアミノ酸配列；ならびにＬｕｃ３４の重鎖可変領域（配列番号７）および軽鎖可変領域（配列番号８）のアミノ酸配列を提供する。配列番号９、１０、および１１は、それぞれＬｕｃ９０の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。配列番号１２、１３、および１４は、それぞれＬｕｃ９０の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。配列番号１５、１６、および１７は、それぞれＬｕｃ６３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。配列番号１８、１９、および２０は、それぞれＬｕｃ６３の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。配列番号２１、２２、および２３は、それぞれＬｕｃ３４の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。配列番号２４、２５、および２６は、それぞれＬｕｃ３４の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。

【0048】

表５は、Ｌｕｃ６３の重鎖可変領域（配列番号２７）および軽鎖可変領域（配列番号２８）のアミノ酸配列を提供する。配列番号２９〜３７は、それぞれ重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＣＤＲを示す。配列番号３３は、Ｌｕｃ６３の重鎖可変領域のＣＤＲ３におけるＮＹＴからＮＹＡへの１アミノ酸変異を示す（イタリック体）。

【0049】

表６は、マウス重鎖Ｌｕｃ６３（配列番号３７）、ヒト重鎖可変領域ｃＤＮＡ（配列番号３９）、ヒトＪＨ１ｃＤＮＡ（配列番号４０）、およびヒト化Ｌｕｃ６３重鎖可変領域（配列番号４１）のアミノ酸配列を提供する。マウス軽鎖可変領域（配列番号４２）、ヒト軽鎖可変領域ｃＤＮＡ（配列番号４３）、およびヒト化Ｌｕｃ６３軽鎖可変領域（配列番号４４）のアミノ酸配列も提供する。

【0050】

表７は、ＶＨ領域アミノ酸配列のアラインメントを提供する。ＭｕＬｕｃ６３およびＨｕＬｕｃ６３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号４５および４７）およびヒトｃＤＮＡ Ｅ５５ ３−１４およびＪＨ１セグメントのアミノ酸配列（配列番号４６）を、一文字表記で示す。ＭｕＬｕｃ６３ＶＨ配列中のＫａｂａｔの定義（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））に基づくＣＤＲ配列に下線を引き、番号づけもＫａｂａｔに従う。ヒトＶＨセグメント中のＣＤＲ配列を図中では省略する。ＨｕＬｕｃ６３ＶＨ配列中の一重の下線を引いたアミノ酸は、ＣＤＲ配列に接触すると予想されるので、対応するマウス残基に置換する。潜在的なＮ結合グリコシル化部位（ＮＹＴ）を排除するためのトレオニン（Ｔ）からアラニン（Ａ）への変異を二重下線で示す。

【0051】

表８は、ＶＬ領域アミノ酸配列のアラインメントを提供する。ＭｕＬｕｃ６３およびＨｕＬｕｃ６３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号４８および５０）およびヒトｃＤＮＡＩＩＩ−２Ｒ配列（配列番号４９）を、一文字表記で示す。ＭｕＬｕｃ６３ＶＬ配列中のＫａｂａｔの定義（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））に基づくＣＤＲ配列に下線を引き、番号づけもＫａｂａｔに従う。ヒトＶＬセグメント中のＣＤＲ配列を図中では省略する。ＨｕＬｕｃ６３ＶＬ配列中の一重の下線を引いたアミノ酸は、ＣＤＲ配列に接触すると予想されるので、対応するマウス残基に置換する。

【0052】

表９は、ＨｕＬｕｃ６３のＶＨおよびＶＬ遺伝子のクローニングで使用されたオリゴヌクレオチドを列挙する。

【図面の簡単な説明】

【0053】

【図1A】図１Ａは、形質細胞および記憶Ｂ細胞中での優先的なＣＳ１発現を示す。

【図1B】図１Ｂは、腎臓、心臓、リンパ節、肝臓、小腸、脳、骨髄、骨格筋、脾臓、および肺の組織サンプルにおけるＣＳ１発現を示す。

【図2A】図２Ａは、白血球および他の成体組織におけるＣＳ１発現を示す。

【図2B】図２Ｂは、複数の活性化白血球集団におけるＣＳ１発現の増加を示す。

【図3】図３は、抗ＣＳ１モノクローナル抗体の競合アッセイの結果を示す。

【図4】図４は、抗ＣＳ１モノクローナル抗体の相対親和性を示す。

【図5A】図５Ａは、３つの抗ＣＳ１モノクローナル抗体でのＣＳ１発現細胞の免疫組織学的染色を示す（Ｌｕｃ２３、Ｌｕｃ３８、およびＬｕｃ６３）。

【図5B】図５Ｂは、抗ＣＳ１および抗ＣＤ１３８モノクローナル抗体での炎症扁桃腺の免疫組織学的染色を示す。

【図5C】図５Ｃは、抗ＣＳ１および抗ＣＤ１３８モノクローナル抗体での関節リウマチ患者由来の滑膜性連結組織の免疫組織学的染色を示す。

【図6】図６は、非刺激末梢欠単核細胞と比較したヤマゴボウマイトジェン処理末梢血単核細胞の３つのＣＳ１モノクローナル抗体（Ｌｕｃ６３、Ｌｕｃ３４、およびＬｕｃ３８）での細胞表面染色を示す。

【図7】図７は、ＥＬＩＳＡベースのＣＳ１結合アッセイにおけるヒト化Ｌｕｃ６３（野生型ＮＹＴ対脱グリコシル化ＮＹＡ変異）の結合活性を示す。

【図8】図８は、ヒト化Ｌｕｃ６３の可変領域の三次元モデルを示す。

【図9】図９は、リアルタイムＰＣＲ分析によってアッセイされた活性化末梢欠Ｂリンパ球およびＴリンパ球におけるＣＳ１発現の上方制御を示す。

【図10】図１０は、リアルタイムＰＣＲ分析によってアッセイされた年齢適合健常成体と比較したＳＬＥ患者の末梢血Ｂリンパ球におけるＣＳ１発現の増加を示す。

【図11】図１１は、マイクロアレイ実験における正常な成体結腸上皮細胞と比較したＣＳ−１発現のグラフを示す。ＣＳ−１発現は、正常な成体結腸上皮細胞と比較して潰瘍性大腸炎（ｎ＝４）患者およびクローン病（ｎ＝５）患者で増加する。バー上の数字は、各サンプルについての正常な成体結腸上皮細胞と比較した倍数を示す。

【図12】図１２は、リアルタイムＰＣＲ分析を使用した炎症性腸疾患患者におけるＣＳ１発現の上方制御を示す。ＣＳ−１発現は、プールした正常な成体大腸組織サンプルと比較して潰瘍性大腸炎（ｎ＝２）患者およびクローン病（ｎ＝３）患者で増加する。バー上の数字は、各サンプルについての正常な成体大腸組織と比較した倍数を示す。

【図13】図１３は、骨髄腫細胞におけるＣＳ１の顕著な発現を示す。

【図14A】図１４Ａ〜１４Ｈは、多発性骨髄腫患者由来の骨髄形質細胞におけるＣＳ１発現を示す。

【図14B】図１４Ａ〜１４Ｈは、多発性骨髄腫患者由来の骨髄形質細胞におけるＣＳ１発現を示す。

【図14C】図１４Ａ〜１４Ｈは、多発性骨髄腫患者由来の骨髄形質細胞におけるＣＳ１発現を示す。

【図14D】図１４Ａ〜１４Ｈは、多発性骨髄腫患者由来の骨髄形質細胞におけるＣＳ１発現を示す。

【図14E】図１４Ａ〜１４Ｈは、多発性骨髄腫患者由来の骨髄形質細胞におけるＣＳ１発現を示す。

【図14F】図１４Ａ〜１４Ｈは、多発性骨髄腫患者由来の骨髄形質細胞におけるＣＳ１発現を示す。

【図14G】図１４Ａ〜１４Ｈは、多発性骨髄腫患者由来の骨髄形質細胞におけるＣＳ１発現を示す。

【図14H】図１４Ａ〜１４Ｈは、多発性骨髄腫患者由来の骨髄形質細胞におけるＣＳ１発現を示す。

【図14I】図１４Ｉは、形質細胞性白血病患者由来の末梢血細胞におけるＣＳ１発現を示す。

【図15】図１５は、骨髄細胞サブタイプにおけるＣＳ１発現を示す。

【図16】図１６は、抗ＣＳ１モノクローナル抗体による活性化ＰＢＭＣのインビトロＩｇＭ分泌の阻害を示す。

【図17】図１７は、抗ＣＤ２モノクローナル抗体と比較した抗ＣＳ１モノクローナル抗体によるリンパ球のインビトロＩｇＭ分泌の阻害を示す。

【図18】図１８は、抗ＣＳ１モノクローナル抗体による健常な成体および自己免疫疾患のリンパ球のインビトロＩｇＧ分泌の阻害を示す。

【図19A】図１９Ａは、抗ＣＳ１モノクローナル抗体によるＳＣＩＤ−ＨｕＰＢＭＣマウスモデルにおけるインビボヒトＩｇＧ産生の阻害を示す。

【図19B】図１９Ｂは、抗ＣＳ１モノクローナル抗体Ｌｕｃ９０および６３によるＳＣＩＤ−ＨｕＰＢＭＣマウスモデルにおけるインビボヒトＩｇＧ産生の阻害の比較を示す。

【図19C】図１９Ｃは、抗ＣＳ１モノクローナル抗体によるＳＣＩＤ−ＨｕＰＢＭＣマウスモデルにおけるインビボヒトＩｇＧ産生の阻害のまとめを示す。

【図20】図２０は、抗ＣＳ１モノクローナル抗体Ｌｕｃ９０およびＬｕｃ６３による抗体依存性細胞の細胞傷害性の誘導を示す。

【図21A】図２１Ａは、フコースレベルが減少したキメラ抗体によって増強された抗ＣＳ１キメラＬｕｃ９０モノクローナル抗体による抗体依存性細胞の細胞傷害性の誘導を示す。

【図21B】図２１Ｂは、抗ＣＳ１キメラＬｕｃ９０モノクローナル抗体による多発性骨髄腫ＯＰＭ２細胞の抗体依存性細胞の細胞傷害性の誘導を示す。

【図21C】図２１Ｃは、抗ＣＳ１キメラＬｕｃ９０モノクローナル抗体による多発性骨髄腫Ｌ３６３細胞の抗体依存性細胞の細胞傷害性の誘導を示す。

【図22】図２２は、イソ型コントロール抗体と比較した抗ＣＳ１抗体Ｌｕｃ９０およびＬｕｃ６３で処置したマウス異種移植多発性骨髄腫モデルにおける腫瘍体積の減少を示す。

【発明を実施するための形態】

【0054】

（発明の詳細な説明）
上記概説の目的にしたがって、本発明は、種々の障害（例えば、自己免疫障害および種々の定義した癌性病態（種々の形態の骨髄腫が含まれる））の新規の治療方法を提供する。このような障害の診断および予後評価方法ならびにこのような病態を調整する組成物のスクリーニング方法も提供する。本発明はまた、前記障害で選択的に発現するマーカーのモニタリングおよびスクリーニングを含む、このような治療の治療有効性をモニタリングする方法を提供する。

【0055】

特に、ＳＬＥ、ＲＡ、およびＩＢＤなどの自己免疫障害ならびに骨髄腫および形質細胞性白血病などの癌性病態で選択的に発現するマーカーの発現を、診断、予後、または治療方法において使用することが可能である。したがって、本発明は、これらのマーカーを選択的に同定するのに有用な種々の組成物（例えば、核酸、ポリペプチド、抗体、および小分子アゴニスト／アンタゴニスト）を定義する。マーカーは、サブセットが実際に非常に異なる治療に必要であり得る疾患のサブセットの分子特徴づけに有用であり得る。さらに、マーカーはまた、例えば、このような病態の場合に類似の組織に影響を与えるか、類似の誘導／維持機構を有する自己免疫障害、骨髄腫、および形質細胞性白血病に関連する疾患で重要であり得る。例えば、腫瘍のプロセスまたは特徴をターゲティングすることもできる。診断および予後を、例えば、関連するが異なる疾患のサブセット、自己免疫障害、骨髄腫、もしくは形質細胞性白血病の悪性度の識別、またはこのような病態の治療ストラテジーの決定に利用可能である。検出方法は、核酸（例えば、ＰＣＲまたはハイブリッド形成技術）またはタンパク質（例えば、ＥＬＩＳＡ、画像化、ＩＨＣなど）に基づき得る。診断は定性的または定量的であってよく、発現レベルの増減を検出することができる。

【0056】

（定義）
用語「ＣＳ１タンパク質」または「ＣＳ１ポリヌクレオチド」または「ＣＳ１関連転写物」は、（１）ＣＳ１遺伝子（表２）のヌクレオチド配列もしくはこれと会合する（ＣＳ１遺伝子（表２）のヌクレオチド配列またはこれと会合するヌクレオチド配列およびその保存改変変異型によってコードされるアミノ酸配列を含む免疫原に対して惹起された結合パートナー（例えば、ポリクローナル抗体）へのＣＳ１遺伝子（表２）の結合）ヌクレオチド配列に対して、約６０％を超えるヌクレオチド配列が同一、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは約９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のヌクレオチド配列が同一のヌクレオチド配列と好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００、またはそれ以上のヌクレオチド領域を有するか、（３）ストリンジェントなハイブリッド形成条件下でＣＳ１（表２）およびその保存的改変変異型の核酸配列またはその相補物と特異的にハイブリッド形成するか、（４）ＣＳ１遺伝子（表２）のヌクレオチド配列もしくはこれと会合するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に対して、約６０％を超えるアミノ酸配列が同一、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のアミノ酸配列と好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００、またはそれ以上のアミノ酸領域が同一のアミノ酸配列を有する核酸ならびにポリペプチドの多型変異型、対立遺伝子、変異体、および種間ホモログをいう。ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、典型的には、哺乳動物（霊長類（例えば、ヒト）、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター）、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、または他の哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない）に由来する。「ＣＳ１ポリペプチド」および「ＣＳ１ポリヌクレオチド」には、天然形態または組換え形態の両方が含まれる。

【0057】

「全長」ＣＳ１タンパク質または核酸は、通常、１つまたは複数の天然に存在する野生型ＣＳ１ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列中に含まれるエレメントを含むＣＳ１ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列をいう。「全長」は、翻訳後プロセシング
またはスプライシング（選択的スプライシングが含まれる）の種々の段階の前後であり得る。

【0058】

本明細書中で使用される、「生体サンプル」は、例えば、ＣＳ１タンパク質、ポリヌクレオチド、または転写物の核酸またはポリペプチドを含む生体組織または流動物のサンプルである。このようなサンプルには、霊長類（例えば、ヒト）またはげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）から単離された組織が含まれるが、これらに限定されない。生体サンプルには、生検サンプルおよび剖検サンプルなどの組織切片、組織学的目的のために採取した凍結切片、記録用サンプル、血液、血漿、血清、唾液、便、涙、粘液、毛髪、皮膚なども含まれ得る。生体サンプルには、外植片ならびに患者の組織由来の初代および／または形質転換細胞培養物も含まれる。生体サンプルを、典型的には、真核生物（最もの好ましくは、霊長類（例えば、チンパンジーまたはヒト）、ウシ、イヌ、ネコ、げっ歯類（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ）などの哺乳動物、またはトリ、爬虫類、または魚類）の器官から得る。家畜およびペットも目的とする。

【0059】

「生体サンプルの提供」は、本発明に記載の方法で使用するための生体サンプルを得る
ことを意味する。ほとんどの場合、動物からの細胞サンプルの取出しによってこれを行う
が、以前に単離した細胞の使用（例えば、別のヒト、別の時間、および／または別の目的
のために単離）または本発明のインビボでの実施によって行うことができる。治療または
結果の経緯を有する記録用の組織または材料は特に有用である。

【0060】

２つまたはそれ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における用語、「同一」または「同一」率は、例えば、下記のデフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを使用するか、マニュアルアラインメントおよび目視によって測定したところ、同一であるか特定の比率でアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である（例えば、比較ウィンドウまたは指定された領域に関して最大に対応するように比較およびアラインメントを行った場合に、特定の領域について約７０％同一、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一である）２つまたはそれ以上の配列またはサブシーケンスをいう。以後、このような配列を、「実質的に同一」であるという。この定義はまた、試験配列の相補物をいうか、これに適用することができる。この定義には、欠失および／または挿入、置換、および天然に存在する変異型（例えば、多型または対立遺伝子変異型）、および人為的変異型も含まれる。下記のように、好ましいアルゴリズムにより、ギャップなどを計算することができる。好ましくは、少なくとも約２５アミノ酸長またはヌクレオチド長の領域、より好ましくは約５０〜１００アミノ酸長またはヌクレオチド長の領域について同一である。

【0061】

配列比較のために、典型的には、１つの配列を試験配列と比較する基準配列の役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用した場合、試験配列および基準配列をコンピュータに入力し、サブシーケンス座標を指定し、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。好ましくは、デフォルトプログラムパラメータを使用するか、別のパラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、基準配列と比較した試験配列の配列同一率を計算する。

【0062】

本明細書中で使用される、「比較ウィンドウ」には、２つの配列を最適に整列させた後に同数の連続位置の基準配列と比較することができる、典型的には約２０〜６００、通常約５０〜２００、より通常には約１００〜１５０からなる群から選択される連続部分のセグメントに対する基準が含まれる。比較のための配列アラインメント法は周知である。比較のための最適な配列アラインメントを、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２
４４４−２４４８の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、またはマニュ
アルアラインメントおよび目視（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（ｅｄｓ．１９９５ ａｎｄ
ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙを参照のこと）によって行うことができる。

【0063】

配列同一率および配列類似率の決定に適切なアルゴリズムの好ましい例には、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載のＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが含まれる。本発明の核酸およびタンパク質の配列同一率を決定するために、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を本明細書中に記載のパラメータと共に使用する。ＢＬＡＳＴ分析の実行ソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さのワードと整列させた場合に、いくつかの正の数閾値スコアＴに適合するかこれを満たす、クエリー配列中の長さＷのショートワードの同定による高スコアリング配列対（ＨＳＰ）の最初の同定を含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値をいう（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前出）。これらの最初の隣接ワードのヒットを、これらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索開始の元として使用する。累積アラインメントスコアを増加することができる限り、各配列に沿って両方向にワードヒットを伸長する。累積スコアを、例えば、ヌクレオチド配列についてはパラメータＭ（適合残基対についてのリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列については、スコアリング行列を使用して、累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘ低下した場合、１つまたは複数の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積に起因して累積スコアがゼロまたはそれ以下になった場合、またはいずれかの配列が末端に達した場合に各方向でのワードヒットの伸長を中止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルト値として、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルト値として、ワード長３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−９１９を参照のこと）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。

【0064】

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２配列間の類似性の統計的分析も行う。例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照のこと。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供された類似性の１つの基準は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の適合が偶然に起こる確率の目安を提供する最小確率和（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と基準核酸との比較における最小確率和が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は基準配列に類似すると見なす。Ｌｏｇ値は、負の多数（例えば、
５、１０、２０、３０、４０、４０、７０、９０、１１０、１５０、１７０など）であり得る。

【0065】

２つの核酸配列が実質的に同一である目安は、第１の核酸によってコードされたポリペプチドが、第２の核酸によってコードされたポリペプチドに対して惹起した抗体と免疫学的に交差反応性を示すことである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同
一である。２つの核酸配列が実質的に同一である別の目安は、２つの分子またはその相補物がストリンジェントな条件下で互いにハイブリッド形成することである。２つの核酸配列が実質的に同一であるさらに別の目安は、同一のプライマーを使用して配列を増幅することができることである。

【0066】

「宿主細胞」は、発現ベクターを含み、発現ベクターの複製または発現を支持する天然に存在する細胞または形質転換細胞である。宿主細胞は、培養細胞、外植片、およびインビボでの細胞などであり得る。宿主細胞は、Ｅ．コリなどの原核細胞、酵母、昆虫、両生類などの真核細胞、またはＣＨＯおよびＨｅＬａなどの哺乳動物細胞であり得る（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｃａｔａｌｏｇまたはウェブサイトを参照のこと）。

【0067】

用語「単離」、「精製」、または「生物学的に純粋」は、その天然の状態で見出される通常含まれる成分を実質的にまたは本質的に含まない物質をいう。典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィなどの分析化学的技術を使用して、純度および均一性を決定する。調製物中に存在する主要な種であるタンパク質または核酸を実質的に精製する。特に、単離核酸を、天然に遺伝子に隣接し、この遺伝子によってコードされるタンパク質以外のタンパク質をコードするいくつかの読み取り枠から単離する。いくつかの実施形態では、用語「精製」は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルに本質的に１つのバンドを生じることを示す。好ましくは、核酸またはタンパク質は、少なくとも純度約８５％、より好ましくは少なくとも純度９５％、最も好ましくは少なくとも純度９９％であることを意味する。他の実施形態では、「純度」または「精製」は、精製すべき組成物からの少なくとも１つの夾雑物または成分の除去を意味する。この意味では、精製された化合物が均一である（例えば、純度１００％）ように精製する必要はない。

【0068】

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいうために相互交換可能に使用される。この用語を、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人為的化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマー、修飾残基を含むもの、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用する。

【0069】

用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸ならびにその後修飾されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸（例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）に結合するα炭素）と基本的化学構造が同一である化合物をいう。このようなアナログは、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）また
は修飾ペプチド骨格を有し得るが、天然に存在するアミノ酸のいくつかの基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、あるアミノ酸の一般的な化学構造と異なるが、別のアミノ酸と同様に機能する構造を有する化合物をいう。

【0070】

本明細書中で、その一般的に公知の三文字表記またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｎｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する一文字表記によってアミノ酸をいうことができる。同様に、一般に受け入れられている一文字表記によってヌクレオチドをいうことができる。

【0071】

「保存的修飾変異型」を、アミノ酸配列および核酸配列に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的修飾変異型は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一または会合した（例えば、天然に連続した）配列をいう。遺伝コードの縮重により、非常に多数の機能的に同一の核酸がほとんどのタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはそれぞれアミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定される各位置では、コドンを、コードされるポリペプチドを変更することなく記載の対応する別のコドンに変更することができる。このような核酸の変異は、「サイレント変異」であり、保存的修飾変異型の１種である。ポリペプチドをコードする本明細書中に記載の各核酸配列はまた、核酸のサイレント変異を記載する。一定の文脈では、核酸中の各コドン（通常メチオニンのみのコドンであるＡＵＧおよび通常トリプトファンのみのコドンであるＴＧＧを除く）を、機能的に類似の分子が得られるように修飾することができる。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異は、発現産物に関して記載の配列中に隠れているが、必ずしも実際のプローブ配列に関してではない。

【0072】

アミノ酸配列に関して、当業者は、コード配列中の１つのアミノ酸または少数のアミノ酸を変更、付加、または欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列の各置換、欠失、または付加は、変化によりアミノ酸が化学的に類似のアミノ酸と置換される場合、「保存的修飾変異型」であることを認識する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は周知である。このような保存的置換変異型に本発明の多型変異型、種間ホモログ、および対立遺伝子が加えられ、これらを除外しない。典型的には、保存的置換には、以下の数字内の相互置換が含まれる：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）シトシン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｆｒｅｅｍａｎを参照のこと）。

【0073】

ポリペプチド構造などの高分子構造を、種々の組織化レベルで記載することができる。この組織化の一般的考察については、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら（ｅｄｓ．２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（４ｔｈ ｅｄ．）Ｇａｒｌａｎｄ；およびＣａｎｔｏｒ ａｎｄ Ｓｃｈｉｍｍｅｌ（１９８０）Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＰａｒｔＩ：Ｔｈｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｆｒｅｅｍａｎを参照のこと。「一次構造」は、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造」は、ポリペプチド内の局所的に整列された三次元構造をいう。これらの構造は、一般にドメインとして公知である。ドメインは、たいていポリペプチドの小型の単位を形成し、典型的には、２５〜約５００アミノ酸長であるポリペプチドの一部である。典型的なドメインは、βシートおよびαヘリックスなどのストレッチなどの低組織化部分から構成される。「三次構造」は、ポリペプチド単量体の完全な三次元構造をいう。「四次構造」は、通常、独立した三次元単位の非共有結合によって形成された三次元構造をいう。

【0074】

本明細書中で使用される、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、もしくは「ポリヌクレオチド」、または文法上の等価物は、少なくとも２つの互いに共有結合したヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドは、典型的には、約５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２５、３０、４０、５０、またはそれ以上のヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長までである。核酸およびポリヌクレオチドは、より長い任意の長さ（２００、３００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、７０００、１０，０００など）のポリマーである。本発明の核酸は、一般に、ホスホジエステル結合を含むが、いくつかの場合、少なくとも１つの異なる結合（例えば、ホスホラミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはＯ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９９２）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓを参照のこと））ならびにペプチド核酸骨格および結合を有し得る核酸アナログが含まれる。他のアナログ核酸には、正の骨格（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｋｂｏｎｅ）、非イオン性骨格、および非リボース骨格を有するアナログが含まれる（米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号，およびＣｈａｐｔｅｒｓ ６ ａｎｄ ７ ｏｆ Ｓａｎｇｈｖｉ ａｎｄ Ｃｏｏｋ（ｅｄｓ．１９９４）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０に記載のアナログが含まれる）。１つまたは複数の炭素環式糖を含む核酸も核酸の１つの定義に含まれる。種々の理由のために（例えば、生理学的環境下においてこのような分子の安定性および半減期を増加させるためまたはバイオチップにおけるプローブとして）、リボース−ホスフェート骨格を修飾することができる。天然に存在する核酸とアナログとの混合物を作製することができ、あるいは、異なる核酸アナログの混合物および天然に存在する核酸とアナログとの混合物を作製することができる。

【0075】

種々の参考文献が、このような核酸アナログを開示しており、例えば、ホスホラミデート（Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９：１９２５−１９６３およびその参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ（１９７０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００−３８０３；Ｓｐｒｉｎｚｌら（１９７７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９−５８９；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：３４８７−４９９；Ｓａｗａｉら（１９８４）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０−４４７１；およびＰａｕｗｅｌｓら（１９８６）Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ ２６：１４１−１４９）、ホスホロチオエート（Ｍａｇら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：１４３７−４４１；および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｌｌら（１９８９）Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１−２３２２）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９９２）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓを参照のこと）、ならびにペプチド核酸骨格および結合（Ｅｇｈｏｌｍ（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５−１８９７；Ｍｅｉｅｒら（１９９２）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８−１０１０；Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６５：５６６−５６８；Ｃａｒｌｓｓｏｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：２０７（これら全てが参考として援用される）を参照のこと）が含まれる。他のアナログ核酸には、正の骨格（Ｄｅｎｐｃｙら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６０９７−１０１；非イオン性骨格（米国特許第５，３８６，０２３号，同第５，６３７，６８４号，同第５，６０２，２４０号，同第５，２１６，１４１号および同第４，４６９，８６３号；Ｋｉｅｄｒｏｗｓｋｉら（１９９１）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ ３０：４２３−４２６；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０−４４７１；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ １３：１５９７；Ｃｈａｐｔｅｒｓ ２ ａｎｄ ３ ｉｎ Ｓａｎｇｈｖｉ ａｎｄ Ｃｏｏｋ（ｅｄｓ．１９９４）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５−３９８；Ｊｅｆｆｓら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ ３４：１７；Ｈｏｒｎら（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７：７４３）、および非リボース骨格（米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号およびＣｈａｐｔｅｒｓ ６ ａｎｄ ７ ｉｎ Ｓａｎｇｈｖｉ ａｎｄ Ｃｏｏｋ（ｅｄｓ．１９９４）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ５８０に記載のものが含まれる）を有するものが含まれる。
１つまたは複数の炭素環式糖を含む核酸も核酸の１つの定義に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら（１９９５）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．ｐｐ １６９−１７６を参照のこと）。いくつかの核酸アナログは、Ｒａｗｌｓ（ｐａｇｅ３５，Ｊｕｎｅ ２，１９９７）Ｃ ＆ Ｅ Ｎｅｗｓに記載されている。

【0076】

ペプチド核酸アナログを含むペプチド核酸（ＰＮＡ）が特に好ましい。ペプチド核酸は、ペプチド結合によって結合した反復Ｎ−（２−アミノイエチル）−グリシン単位から作製された骨格を有する。異なる塩基（プリンおよびピリミジン）は、メチレンカルボニル結合によって骨格に結合している。これらの骨格は、天然に存在する核酸の高荷電ホスホジエステル骨格と比較して、中性条件下で実質的に非イオン性である。これにより、少なくとも２つの利点が得られる。ＰＮＡ骨格はハイブリッド形成速度が改善されており、その結果ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖との間よりもＰＮＡ／ＤＮＡ鎖の間の結合が強くなる。ＰＮＡは、ミスマッチと完全に適合した塩基対では融点（Ｔ_ｍ）がより大きく異なる。ＤＮＡおよびＲＮＡは、典型的には、内部ミスマッチのためにＴ_ｍは２〜４℃低下する。非イオン性ＰＮＡ骨格では、低下は７〜９℃付近である。同様に、その非イオン性のために、これらの骨格に結合した塩基のハイブリッド形成は、塩濃度に比較的感受性を示す。さらに、ＰＮＡは、細胞酵素によって分解されないので、より安定であり得る。

【0077】

核酸は、基底されるように、一本鎖または二本鎖であり得るか、二本鎖配列または一本鎖配列の一部を含み得る。一本鎖の描写は相補鎖の配列も定義するので、本明細書中に記載の配列はまた配列の相補物を提供する。核酸は、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方）、ＲＮＡ、または核酸がデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組み合わせおよび塩基（ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどが含まれる）の組み合わせを含み得るハイブリッドであり得る。「転写物」は、典型的には、天然に存在するＲＮＡ（例えば、プレｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、またはｍＲＮＡ）をいう。本明細書中で使用される、用語「ヌクレオシド」には、ヌクレオチドならびにヌクレオシドおよびヌクレオチドのアナログ、ならびにアミノ修飾ヌクレオシドなどの修飾ヌクレオシドが含まれる。さらに、「ヌクレオシド」には、天然に存在しないアナログ構造が含まれる。したがって、例えば、それぞれ塩基を含むペプチド核酸の各単位を、本明細書中ではヌクレオシドという。

【0078】

「標識」または「検出可能な部分」は、顕微鏡手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、生理学的手段、化学的手段、または他の物理的手段によって検出可能な組成物である。一般に、標識は、以下の３つのクラスに分類される：ａ）放射性同位体または重同位体であり得る同位体標識、ｂ）抗体、抗原、またはエピトープタグであり得る免疫標識、ｃ）着色または蛍光色素。標識を、ＣＳ１の核酸、タンパク質、および抗体に組み込むことができる。例えば、標識は、直接または間接的に検出可能なシグナルを産生することができるはずである。検出可能な部分は、放射性同位体（^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、または^１２５Ｉなど）、高電子密度試薬、蛍光もしくは化学発光化合物（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリンなど）、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般的に使用されているもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテンおよびタンパク質、またはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼなどの検出可能にすることができる他の物質であり得る。抗体と標識との抱合方法は公知である。例えば、Ｈｕｎｔｅｒら（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５；Ｄａｖｉｄら（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４−１０２１；Ｐａｉｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９−２３０；およびＮｙｇｒｅｎ（１９８２）Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄＣｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７−４１２を参照のこと。

【0079】

「エフェクター」、「エフェクター部分」、または「エフェクター成分」は、抗体とリンカーまたは化学結合を介して供給結合するか（結合または抱合）、イオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合、または水素結合を介して非共有結合する分子である。「エフェクター」は、種々の分子（例えば、放射性化合物、蛍光化合物、酵素もしくは基質、タグ（エピトープタグなど）、毒素を含む検出部分；活性化可能な部分、化学療法薬；リパーゼ；抗生物質；化学誘因部分、免疫調節物質（ｍｉｃＡ／Ｂ）、または例えば、「硬」β放射線を放射する放射性同位体が含まれる）であり得る。

【0080】

「標識核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、プローブに結合した標識の存在の検出によってプローブの存在を検出することができるように、例えば、リンカーもしくは化学結合を介して共有結合するか、イオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合、または水素結合を介して非共有結合するものである。あるいは、高親和性相互作用を使用した方法により、結合パートナー対の一方が他方（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン）に結合する同一の結果を得ることができる。

【0081】

本明細書中で使用される、「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、１つまたは複数の化学結合型を介して（通常は相補性塩基対合を介して（例えば、水素結合形成を介して））相補配列の標的核酸に結合することができる核酸である。本明細書中で使用される、プローブには、天然（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）または修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）が含まれ得る。さらに、ホスホジエステル結合以外の結合（好ましくは、ハイブリッド形成を機能的に妨害しないもの）によってプローブ中の塩基を結合することができる。したがって、例えば、プローブは、ホスホジエステル結合よりもむしろペプチド結合によって構成性塩基を結合するペプチド核酸であり得る。プローブは、ハイブリッド形成条件のストリンジェンシーに依存してプローブ配列との完全な相補性を欠く配列をターゲティングすることができる。プローブを、好ましくは、例えば、同位体、発色団、ルミフォア、色原体で直接標識するか、例えば、後にストレプトアビジン複合体と結合することができるビオチンで間接的に標識する。プローブの有無についてのアッセイにより、選択した配列またはサブシーケンスの有無を検出することができる。診断または予後は、ゲノムレベルまたはＲＮＡもしくはタンパク質の発現レベルに基づき得る
。

【0082】

用語「組換え」は、例えば、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用する場合、異種核酸もしくはタンパク質の移入または天然の核酸もしくはタンパク質の変更によって細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが修飾されていることを示すか、細胞がこのようにして修飾された細胞に由来する。したがって、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）形態の細胞内で見出されない遺伝子を発現するか、天然の遺伝子を別に異常に発現するか、過小発現するか、全く発現しない。本明細書中の用語「組換え核酸」は、一般に、核酸の操作（例えば、ポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを使用）によって元はインビトロで形成された天然で見出されない形態の核酸を意味する。この様式では、異なる配列は作動可能に連結される。したがって、線状形態の単離核酸または通常は連結しないＤＮＡ分子のライゲーションによってインビトロで形成された発現ベクターは共に本発明目的のための組換えと見なされる。一旦組換え核酸が作製されて宿主細胞または生物に再移入されると、例えば、インビトロ操作よりもむしろインビボでの宿主細胞の細胞機構を使用して非組換え的に複製されるが、一旦組換えで産生されるがその後非組換え的に複製されると、このような核酸は本発明の目的のための組換えと見なされることが理解される。

【0083】

同様に、「組換えタンパク質」は、例えば、上記の組換え核酸の発現による組換え技術を使用して作製されたタンパク質である。少なくとも１つまたは複数の特徴によって、組換えタンパク質は、天然に存在するタンパク質と区別される。タンパク質を、その野生型宿主中で通常は会合しているタンパク質および化合物のいくつかまたはほとんどから単離または精製することができるので、実質的に純粋であり得る。単離タンパク質は、所与のサンプル中の総タンパク質の好ましくは少なくとも約０．５重量％、より好ましくは少なくとも約５重量％を構成するその天然状態で通常は会合している物質の少なくともいくつかを含んでいない。実質的に純粋なタンパク質は、総タンパク質の少なくとも約７５重量％を占め、少なくとも約８０重量％が好ましく、少なくとも約９０重量％が特に好ましい。この定義には、異なる生物または宿主細胞におけるある生物からのＣＳ１タンパク質の産生が含まれる。あるいは、タンパク質濃度レベルが増加するように誘導プロモーターまたは高発現プロモーターの使用によって通常認められるよりも有意に高い濃度でタンパク質を作製することができる。あるいは、以下で考察するように、タンパク質は、エピトープタグの付加またはアミノ酸の置換、挿入、および欠失の目的のために通常は天然で見出されない形態であり得る。

【0084】

核酸の一部に関して使用する場合の用語「異種」は、核酸が天然での相互の同一の関係で通常は見出されない２つまたはそれ以上のサブシーケンスを含むことを示す。例えば、新規の機能的核酸を作製するように配置された無関係の遺伝子（例えば、ある起源由来のプロモーターおよび別の起源由来のコード領域）から２つまたはそれ以上の配列を有する核酸を典型的に組換え的に産生する。同様に、異種タンパク質は、たいてい、天然では互いに同一の関係で見出されない２つまたはそれ以上のサブシーケンス（例えば、融合タンパク質）をいう。

【0085】

「プロモーター」は、典型的には、核酸の転写を指示する核酸調節配列のアレイである。本明細書中で使用される、「プロモーター」には、転写開始部位付近の必要な核酸配列（ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメントなど）が含まれる。プロモーターには、任意選択的に、転写開始部位から数千塩基対も離れて存在することができる遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含まれる。「構成性」プロモーターは、ほとんどの環境条件および発生条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境または発生調節下で活性である。用語「作動可能に連結された」は、例えば、発現調節配列が第２の配列に対応する核酸の転写を指示する、核酸発現調節配列（プロモーターまたは転写因子結合部位のアレイなど）と第２の核酸配列との間の機能的結合をいう。

【0086】

「発現ベクター」は、宿主細胞中で特定の核酸を転写させる一連の特定の核酸エレメントを有する組換えまたは合成によって生成された核酸構築物である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸フラグメントの一部であり得る。典型的には、発現ベク
ターは、プロモーターに操作可能に連結された転写されるべき核酸を含む。

【0087】

句「〜と選択的に（または特異的に）ハイブリッド形成する」は、配列が複合混合物（例えば、全細胞またはライブラリーＤＮＡまたはＲＮＡ）中に存在する場合のストリンジェントなハイブリッド条件下での特定のヌクレオチド配列への選択的な分子の結合、二本鎖形成、またはハイブリッド形成をいう。

【0088】

句「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」は、プローブが典型的には複合混合物中でその標的サブシーケンスとハイブリッド形成するが他の配列とはハイブリッド形成しない条件下をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる環境下では異なる。より長い配列が特異的により高い温度でハイブリッド形成する。核酸のハイブリッド形成に関する詳細なガイドは、Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ”ｉｎ Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（ｖｏｌ．２４）Ｅｌｓｅｖｉｅｒで見出される。一般に、定義されたイオン強度、ｐＨでの特定の配列についてのストリンジェントな条件は、融点（Ｔ_ｍ）よりも約５〜１０℃低い温度が選択される。Ｔ_ｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリッド形成する（定義されたイオン強度、ｐＨ、よび核酸濃度での）温度である（標的配列が過剰に存在するので、Ｔ_ｍでは、５０％のプローブが平衡状態である）。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度が約１．０Ｍのナトリウムイオン未満、典型的には約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が短いプローブ（例えば、約１０〜１５ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチド超）では少なくとも６０℃である条件である。ホルムアミドなどの脱安定剤の添加によってストリンジェントな条件を達成することもできる。選択的または特異的ハイブリッド形成のために、正のシグナルは、典型的には、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくは、バックグラウンドハイブリッド形成の１０倍である。ストリンジェントなハイブリッド条件の例は以下であり得る：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ（４２℃でインキュベーション）または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ（６５℃でインキュベーション）および６５℃で０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳでの洗浄。ＰＣＲについて、低ストリンジェンシー増幅では約３６℃が典型的であるが、アニーリング温度はプライマーの長さに依存して約３２℃〜４８℃の間で変化し得る。高ストリンジェンシーＰＣＲ増幅について、約６２℃が典型的であるが、高ストリンジェンシーのアニーリング温度は、プライマーの長さおよび特異性に依存して約５０〜６５℃の範囲であり得る。高いまたは低いストリンジェンシーでの増幅のための典型的なサイクル条件は、９０〜９５℃で３０〜１２０秒の変性段階、３０〜１２０秒持続させるアニーリング段階、および約７２℃で１〜２分間の伸長段階を含む。低および高ストリンジェンシーでの増幅反応についてのプロトコールおよびガイドラインは、例えば、Ｉｎｎｉｓら（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹに提供されている。

【0089】

ストリンジェントな条件下で互いにハイブリッド形成しない核酸は、これらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、以前として実質的に同一である。例えば、遺伝コードによって可能な最大コドン縮重を使用して核酸のコピーを作製した場合にこれが起こる。このような場合、核酸は、典型的には、中程度のストリンジェントのハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する。「中程度のストリンジェントなハイブリッド形成条件」の例には、３７℃での４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液中でのハイブリッド形成および４５℃で１×ＳＳＣでの洗浄が含まれる。正のハイブリッド形成は、典型的には、バックグラウンドの少なくとも２倍である。別のハイブリッド形成および洗浄条件を使用して、類似のストリンジェンシー条件を得ることができる。ハイブリッド形成パラメータを決定するためのさらなるガイドラインは、多数の参考文献（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（ｅｄｓ．１９９１ ａｎｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ）で提供されている。

【0090】

句「細胞形態学の変化」または「細胞の特徴の変化」は、細胞の生存度、細胞成長、成長因子もしくはケモカイン因子の分泌、細胞形態学の変化、炎症特異的マーカーの増加もしくは喪失、適切な動物宿主に注射した場合の炎症の誘導もしくは抑制能力、および／または適切な宿主における病態（例えば、自己免疫障害および癌性病態）の誘導などのインビトロまたはインビボでの細胞の形態学または増殖特性の任意の変化をいう。例えば、ｐｐ．２３１−２４１ ｉｎ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（２ｄ ｅｄ．）Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓを参照のこと。

【0091】

「疾患細胞」は、新規の遺伝物質の取り込みを必ずしも含まない自発的または誘導性の表現型の変化をいう。例えば、骨髄腫形成が形質転換ウイルスの感染および新規の遺伝子ＤＮＡの組み込みまたは外因性ＤＮＡの取り込みから惹起され得るにもかかわらず、自発的または薬剤への曝露後にも惹起され、それにより既存遺伝子の発現を誘導するか変化させることができる。腫瘍成長は、形態学的変化、異常な細胞成長、および／または非形態学的変化などの表現型およびタンパク質発現の変化に関連する。Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２０００）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（４ｔｈ ｅｄ．）Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓを参照のこと。同様に、自己免疫疾患プロセスの影響を受けた細胞も、表現型およびタンパク質発現の変化に関連する。

【0092】

「有効」量の分子、抗体、薬物、薬学的に活性な薬剤、または薬学的処方物は、所望の効果を得るのに十分な量の分子、抗体、薬物、薬剤、または処方物を意味する。

【0093】

「被験体」または「患者」を、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトをいうために本明細書中で交換可能に使用する。

【0094】

本明細書中で使用される、用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質をいう。認識されている免疫グロブリンには、κ、λ、α、γ（ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４）、δ、ε、およびμ定常領域ならびに無数の免疫グロブリン可変Ｖ領域遺伝子（下に示すように、Ｈ（重）およびＬ（軽）鎖の両方にＶ遺伝子は存在する）が含まれる。全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５Ｋｄまたは２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端（約１１０アミノ酸）で可変領域遺伝子（Ｖ−κまたはＶ−λ）、ＣＯＯＨ末端でκまたはλ定常領域遺伝子によってそれぞれコードされる。全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０Ｋｄまたは４４６アミノ酸）は、同様に、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）および他の上記定常領域遺伝子の１つ（例えば、γ）（約３３０アミノ酸をコードする）に
よってコードされる。

【0095】

免疫グロブリンの１つの形態は、抗体の基本構造単位を構成する。この形態は四量体であり、免疫グロブリン鎖の２つの同一の対（各対は１つの軽鎖および１つの重鎖を有する）からなる。各対では、軽鎖および重鎖の可変領域は合わせて抗原への結合を担い、定常領域は抗体エフェクター機能を担う。四量体抗体に加えて、免疫グロブリンは、種々の他の形態（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、および（Ｆａｂ’）_２ならびに二機能性ハイブリッド抗
体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））および一本鎖（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，５８７９−５８８３（１９８８）およびＢｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６（１９８８）（本明細書中で参考として援用される））が含まれる）で存在し得る（一般に、Ｈｏｏｄら，”Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎ．Ｙ．，２ｎｄ ｅｄ．（１９８４），ａｎｄ Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｏｄ，Ｎａｔｕｒｅ，３２３，１５−１６（１９８６）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。

【0096】

抗体はまた、例えば、種々のペプチダーゼでの消化によって産生された多数の十分に特徴づけられたフラグメントとして存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域中のジスルフィド結合の下で抗体を消化して、Ｆ（ａｂ）’_２（それ自体がジスルフィド結合によってＶ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１に結合した軽鎖であるＦａｂの二量体）が得られる。穏やかな条件下でＦ（ａｂ）’_２を還元してヒンジ領域中のジスルフィド結合を破壊し、それにより、Ｆ（ａｂ）’_２二量体をＦａｂ’単量体に変換することができる。Ｆａｂ’単量体は、本質的に、ヒンジ領域の一部を含むＦａｂである（Ｐａｕｌ（ｅｄ．１９９９）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（４ｔｈ ｅｄ．）Ｒａｖｅｎを参照のこと）。インタクトな抗体の消化に関して種々の抗体フラグメントを定義するが、当業者は、このようなフラグメントを、化学的または組換えＤＮＡ法の使用によってｄｅ ｎｏｖｏで合成することができることを認識する。したがって、本明細書中で使用される、用語「抗体」には、全抗体の修飾によって産生された抗体フラグメント、組換えＤＮＡ法を使用してｄｅ ｎｏｖｏで合成した抗体フラグメント（例えば、単鎖Ｆｖ）、またはファージディスプレイライブラリーを使用して同定した抗体フラグメントも含まれる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４を参照のこと）。

【0097】

「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）がキメラ抗体に新規の性質を付与する異なるまたは変化したクラスおよび／または種または完全に異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物、エフェクター機能、化学誘因物質、免疫調節薬など）の定常領域に結合するように定常領域またはその一部が変化、置換、または交換されているか、（ｂ）異なるまたは変化した抗原特異性を有する可変領域で可変領域またはその一部が変化、置換、または交換された抗体分子である。

【0098】

用語「ヒト化抗体」または「ヒト化免疫グロブリン」は、ヒトフレームワーク、非ヒト抗体由来の少なくとも１つ、好ましくは全ての相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、存在する任意の定常領域がヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一である（すなわち、少なくとも約８５〜９０％同一、好ましくは少なくとも９５％同一）免疫グロブリンをいう。したがって、おそらくＣＤＲを除くヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、１つまたは複
数の天然のヒト免疫グロブリン配列の対応部分と実質的に同一である。例えば、Ｑｕｅｅｎら，米国特許第５，５３０１，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号；および同第６，１８０，３７０号（これらおよび他の米国特許／特許出願全体が、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。

【0099】

抗体（例えば、組換え抗体、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体）の調製のための多数の技術が公知である。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７；Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２；Ｃｏｌｅら（１９８５）ｐｐ．７７−９６ ｉｎ Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ａｎｄ Ｓｅｌｌ（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｌｉｓｓ；Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ；およびＧｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｄ ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。単鎖抗体の産生技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明のポリペプチドに対する抗体の産生に適合することができる。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物などの他の生物を使用して、ヒト化抗体を発現することができる。あるいは、ファージディスプレイテクノロジーを使用して、選択した抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーＦａｂフラグメントを同定することができる。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５４；Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３を参照のこと。

【0100】

用語「エピトープ」は、免疫応答を誘発して抗体によって特異的に結合することができるタンパク質の任意の部分（決定基）をいう。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸またはＧＡＧ側鎖などの分子の活性表面集団からなり、通常、特異的三次元構造特性および特異的電荷特性を有する。一方の抗体の結合を減少または消滅させるタンパク質中のアミノ酸変異が他の抗体の結合も減少または消滅させる場合および／または抗体がタンパク質への結合を競合する場合（すなわち、一方の抗体のタンパク質への結合が他の抗体の結合を減少または消滅させる場合）、２つの抗体は、実質的に同一のタンパク質のエピトープ（またはタンパク質の重複エピトープ）に結合するといわれている。２つの抗体が同一のエピトープに実質的に結合するかどうかの決定を、競合アッセイなどの当該分野で公知の方法によって行う。コントロール抗体（例えば、本明細書中に記載の抗ＣＳ１抗体の１つ）と任意の試験抗体との間の抗体競合研究の実施では、その後の同定を可能にするために、コントロール抗体を、ビオチン、酵素標識、放射性標識、または蛍光標識などの検出可能な標識で最初に標識することができる。コントロール（標識）抗体と同一のエピトープに実質的に結合する試験（非標識）抗体は、コントロール抗体の結合を遮断することができるはずであり、それによりコントロール抗体の結合が減少するはずである。

【0101】

例示的実施形態では、抗体がＬｕｃモノクローナル抗体の同一のエピトープに実質的に結合する場合（Ｌｕｃモノクローナル抗体は本発明の産生された抗ＣＳ１モノクローナル抗体をいう）、抗体は、Ｌｕｃモノクローナル抗体が結合するＣＳ１エピトープと重複するＣＳ１のエピトープと結合するはずである。重複領域は、１つのアミノ酸残基から数百のアミノ酸残基までの範囲であり得る。次いで、この抗体は、ＣＳ１へのＬｕｃモノクローナル抗体の結合を競合および／または遮断し、それにより、競合アッセイにおいてＣＳ１へのＬｕｃモノクローナル抗体の結合を好ましくは少なくとも約５０％減少させるはずである。

【0102】

用語「〜に由来する」は、「〜から得られる」、「〜によって産生される」、または「〜伝わる」を意味する。

【0103】

（ＣＳ１抗原および抗体）
配列番号２は、全長野生型ヒトＣＳ１のアミノ酸配列を示す。「機能的に活性な」ＣＳ１フラグメントまたは誘導体は、抗原活性、免疫原性活性、天然の細胞基質に結合する能力などの全長野生型ＣＳ１タンパク質に関連する１つまたは複数の機能活性を示す。ＣＳ１タンパク質、誘導体、およびフラグメントの機能活性を、当業者に公知の種々の方法によってアッセイすることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｏｌｉｇａｎら，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９８））。本明細書中の目的のために、機能的に活性なフラグメントには、結合ドメインなどのＣＳ１ポリペプチドの１つまたは複数の構造ドメインを含むフラグメントが含まれる。ＰＦＡＭプログラムを使用して、タンパク質ドメインを同定することができる（Ｂａｔｅｍａｎ Ａ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２６０−２（１９９９））。

【0104】

ＣＳ１ポリペプチド誘導体は、典型的には、配列番号２またはそのフラグメントと一定の程度の配列同一性または配列類似性を有する。当該分野で公知の種々の方法によって、ＣＳ１誘導体を産生することができる。操作により、遺伝子またはタンパク質レベルで産生することができる。例えば、クローン化ＣＳ１遺伝子配列（例えば、配列番号１）を、制限エンドヌクレアーゼを使用して適切な部位で切断し（Ｗｅｌｌｓら，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｔ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ ３１７：４１５（１９８６））、その後さらに酵素修飾を行い、所望ならば、その後単離し、インビトロでライゲーションし、発現させて所望の誘導体を産生することができる。あるいは、ＣＳ１遺伝子をインビトロで変異させて翻訳配列、開始配列、および／または終止配列を作製および／または破壊するか、コード領域を変異させ、そして／または新規の制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するか、先在するエンドヌクレアーゼ部位を破壊してさらなるインビトロ修飾を促進することができる。化学的変異誘発、インビトロ部位特異的変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６））またはＴＡＢリンカー（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．から市販されている）の使用などの種々の変異誘発技術が当該分野で公知である。

【0105】

１つの態様では、本発明の抗体は、ＣＳ１の生物活性の少なくとも１つ、好ましくは全てを中和する。ＣＳ１の生物活性には、以下が含まれる：１）そのリガンドなどのその細胞基質の結合活性（例えば、これらの中和抗体は、そのリガンドの少なくとも１つ、好ましくは全てへのＣＳ１の結合と競合するか完全に遮断することができるはずである）、２）シグナル伝達活性、および３）ＣＳ１によって誘導された細胞応答。

【0106】

本発明は、以下のハイブリドーマ細胞株を提供する：Ｌｕｃ２、Ｌｕｃ３、Ｌｕｃ１５、Ｌｕｃ２２、Ｌｕｃ２３、Ｌｕｃ２９、Ｌｕｃ３２、Ｌｕｃ３４、Ｌｕｃ３５、Ｌｕｃ３７、Ｌｕｃ３８、Ｌｕｃ３９、Ｌｕｃ５６、Ｌｕｃ６０、Ｌｕｃ６３、またはＬｕｃ９０。ハイブリドーマ細胞Ｌｕｃ９０は、アクセッション番号ＰＴＡ５０９１としてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）ａｔ Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８に受託された。このハイブリドーマ細胞株の寄託は、２００３年３月２６日にＡＴＣＣに認められた。ハイブリドーマ細胞株Ｌｕｃ６３もまた上記列挙の住所のＡＴＣＣで受託された。Ｌｕｃ６３抗体の寄託は、２００４年５月６日に認められた。

【0107】

本発明は、以下のハイブリドーマ細胞株によって産生されたモノクローナル抗体を提供する：Ｌｕｃ２、Ｌｕｃ３、Ｌｕｃｌ５、Ｌｕｃ２２、Ｌｕｃ２３、Ｌｕｃ２９、Ｌｕｃ３２、Ｌｕｃ３４、Ｌｕｃ３５、Ｌｕｃ３７、Ｌｕｃ３８、Ｌｕｃ３９、Ｌｕｃ５６、Ｌｕｃ６０、Ｌｕｃ６３、またはＬｕｃ９０（ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ５０９１）。これらのモノクローナル抗体を、今後それぞれ以下の抗体として命名する：Ｌｕｃ２、Ｌｕｃ３、Ｌｕｃ１５、Ｌｕｃ２２、Ｌｕｃ２３、Ｌｕｃ２９、Ｌｕｃ３２、Ｌｕｃ３４、Ｌｕｃ３５、Ｌｕｃ３７、Ｌｕｃ３８、Ｌｕｃ３９、Ｌｕｃ５６、Ｌｕｃ６０、Ｌｕｃ６３、およびＬｕｃ９０。

【0108】

本発明は、本明細書中に記載のＬｕｃモノクローナル抗体の任意の１つと同一のエピトープに実質的に結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を提供する。

【0109】

本発明は、１つまたは複数の上記Ｌｕｃモノクローナル抗体と同一のエピトープに実質的に結合しない抗体、好ましくはモノクローナル抗体を提供する。

【0110】

抗体競合の評価のための種々の免疫学的スクリーニングアッセイを使用して、本発明の抗体と同一のエピトープと実質的に結合するか本発明の抗体と異なるエピトープに結合する抗体を同定することができる。

【0111】

コントロール抗体と任意の試験抗体（種またはイソ型に無関係）との間の抗体競合研究の実施では、その後の同定を可能にするために、コントロール抗体を、ビオチンまたは酵素（または放射性）標識などの検出可能な標識で最初に標識することができる。この場合、非標識抗体をＣＳ１タンパク質を発現する細胞と予め混合するかインキュベートする。次いで、標識抗体を、予備インキュベーション細胞に添加する。結合標識の強度を測定する。標識抗体が重複エピトープへの結合によって非標識抗体と競合する場合、負のコントロールである非標識抗体（ＣＳ１に結合しない既知の抗体）による結合と比較して強度が減少する。

【0112】

アッセイは、抗体競合に基づいた一定範囲の免疫学的アッセイの任意の１つであってよく、コントロール抗体をその標識の検出手段（例えば、ビオチン化抗体の場合のストレプトアビジンの使用、酵素標識と結合した発色基質の使用（ペルオキシダーゼを含む３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質など）、または放射性標識または蛍光標識の単純な検出）によって検出する。コントロール抗体と同一のエピトープに結合する抗体は、効果的にに結合を競合することができ、それにより、結合標識の減少によって証明したところ、コントロール抗体の結合を有意に（例えば、少なくとも５０％）減少させることができる。

【0113】

完全に無関係抗体の非存在下での（標識）コントロール抗体の反応性は、コントロール高値である。コントロール低値は、非標識試験抗体のＣＳ１発現細胞とのインキュベーションによって得られ、その後、標的抗体の結合と競合して減少する場合、正確に同型の標
識コントロール抗体との細胞／抗体混合物をインキュベートする。試験アッセイでは、試験抗体の存在下での標識抗体の反応性の有意な減少は、実質的に同一のエピトープを認識する試験抗体の指標である。

【0114】

全種の供給源のＣＳ１に対する抗体が本発明に含まれる。天然抗体の非限定的な例には、ヒト、ニワトリ、ヤギ、およびげっ歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター、およびウサギ）（ヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたトランスジェニックげっ歯類が含まれる）由来の抗体が含まれる（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｗ０９３／１２２２７；米国特許第５，５４５，８０６号；およびＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら，Ｗ０９１／１０７４１；米国特許第６，１５０，５８４号を参照のこと（その全体が本明細書中で参考として援用される））。天然の抗体は、ポリペプチド、好ましくはヒトポリペプチドなどの抗原での免役化後に宿主動物によって産生された抗体である。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＣＳ１に結合し、そして／または中和する単離天然抗体である。

【0115】

遺伝的に変化した抗ＣＳ１抗体は、上記天然抗体と機能的に等価なはずである。安定性および／または治療有効性が改善された修飾抗体が好ましい。修飾抗体の例には、アミノ酸残基の保存的置換および抗原結合での使用後に有意に有害ではないアミノ酸の１つまたは複数の欠失または付加が行われた抗体が含まれる。置換は、治療有用性が維持される限り、１つまたは複数のアミノ酸残基の変更または修飾から領域の完全な再デザインまでの範囲であり得る。本発明の抗体を翻訳後に修飾することができるか（例えば、アセチル化および／またはリン酸化）、合成によって修飾することができる（例えば、標識基の結合）。好ましい遺伝子を変更した抗体は、キメラ抗体およびヒト化抗体である。

【0116】

キメラ抗体は、２つの異なる抗体、好ましくは別の種由来の可変領域および定常領域を有する抗体である。好ましくは、キメラ抗体の可変領域はマウスに由来し、定常領域はヒトに由来する。

【0117】

１つの実施形態では、マウス可変領域は、本明細書中に記載の任意の１つのモノクローナル抗体に由来する。キメラ抗体を産生するために、２つの異なる種由来の部分（例えば、ヒト定常領域およびマウス可変領域または結合領域）を従来技術によって互いに化学的に連結するか、遺伝子操作技術を使用して、１つの連続タンパク質として調製することができる。キメラ抗体の軽鎖部分および重鎖部分の両方のタンパク質をコードするＤＮＡ分子を、連続タンパク質として発現することができる。キメラ抗体の作製方法は、米国特許第５，６７７，４２７号；米国特許第６，１２０，７６７号；および米国特許第６，３２９，５０８号（それぞれその全体が本明細書中で参考として援用される）に開示されている。

【0118】

本発明で使用される遺伝子改変抗体には、ＣＳ１を中和するヒト化抗体が含まれる。１つの実施形態では、ヒト化抗体は、マウスドナー免疫グロブリンのＣＤＲ、重鎖および軽鎖フレームワーク、ならびにヒトアクセプター免疫グロブリンの定常領域を含む。１つの例では、ヒト化抗体は、本明細書中に記載の任意の１つの抗体のヒト化異形（ｖｅｒｓｉｏｎ）である。ヒト化抗体の作製方法は、米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号；および同第６，１８０，３７０号（それぞれその全体が本明細書中で参考として援用される）に開示されている。

【0119】

抗ＣＳ１全ヒト抗体も本発明に含まれる。本発明の好ましい実施形態では、完全ヒト抗体は、本明細書中に記載のＣＳ１活性を中和する単離ヒト抗体である。

【0120】

ＣＳ１に対する完全ヒト抗体を種々の技術によって産生する。１つの例は、トリオーマ法である。このアプローチで使用される基本アプローチおよび細胞融合パートナーの例（ＳＰＡＺ−４）は、Ｏｅｓｔｂｅｒｇら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２：３６１−３６７（１９８３）；Ｏｅｓｔｂｅｒｇ，米国特許第４，６３４，６６４号；およびＥｎｇｌｅｍａｎら，米国特許第４，６３４，６６６号（それぞれその全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。

【0121】

ＣＳ１に対するヒト抗体を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくともセグメントをコードする導入遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物から産生することもできる。これらの性質を有する動物の産生および性質は、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｗ０９３／１２２２７；米国特許第５，５４５，８０６号；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら，Ｗ０９１／１０７４１；米国特許第６，１５０，５８４号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に詳述されている。

【0122】

種々の組換え抗体ライブラリーテクノロジーを使用して、完全ヒト抗体を産生することもできる。例えば、１つのアプローチは、Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）に概説の一般的プロトコールにしたがってヒトＢ細胞からＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。ＣＳ１またはそのフラグメントに結合する抗体を選択する。次いで、このような抗体をコードする配列（またはその結合フラグメント）をクローン化し、増幅する。Ｈｕｓｅによって記載されたプロトコールは、ファージディスプレイテクノロジーと組み合わせてより有効になる。例えば、Ｄｏｗｅｒら，ＷＯ ９１／１７２７１およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，ＷＯ ９２／０１０４７；米国特許第５，９６９，１０８号（それぞれその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。これらの方法では、メンバーがそのディスプレイに異なる抗体を表示するファージライブラリーを産生する。抗体は、通常、ＦｖまたはＦａｂフラグメントとして表示される。所望の特異性を有する抗体を表示するファージを、ＣＳ１またはそのフラグメントの親和性富化によって選択する。

【0123】

Ｃｏｉａ Ｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １：２５４（１−２）：１９１−７（２００１）；Ｈａｎｅｓ Ｊ．ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８（１２）：１２８７−９２（２０００）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５（２４）：１４１３０−５（１９９８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４（１０）：４９３７−４２（１９９７）（それぞれその全体が本明細書中で参考として援用される）に記載のように、真核生物リボゾームを、ＣＳ１などの標的抗原のスクリーニングよって抗体ライブラリーを表示して結合ヒト抗体を単離するための手段として使用することもできる。

【0124】

酵母系はまた、抗体などの哺乳動物細胞表面タンパク質または分泌タンパク質のスクリーニングに適切である。標的抗原に対するヒト抗体を得る目的で、抗体ライブラリーを、酵母細胞の表面上に表示することができる。このアプローチは、Ｙｅｕｎｇら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１８（２）：２１２−２０（２００２）；Ｂｏｅｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（６）：５５３−７（１９９７）（それぞれその全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。あるいは、ヒト抗体ライブラリーを細胞内で発現させ、酵母２ハイブリッド系によってスクリーニングすることができる（ＷＯ０２００７２９Ａ２（その全体が本明細書中で参考として援用される））。

【0125】

ＣＳ１への特異的結合を保持する抗ＣＳ１抗体のフラグメントも本発明に含まれる。これらの抗原結合フラグメントの例には、本明細書中に記載の任意の抗ＣＳ１抗体の部分的もしくは全ての重鎖もしくは軽鎖、可変領域、またはＣＤＲ領域が含まれるが、これらに限定されない。

【0126】

本発明の好ましい実施形態では、抗体フラグメントは、短縮鎖である（カルボキシル末端で切断）。好ましくは、これらの短縮鎖は、１つまたは複数の免疫グロブリン活性（例えば、補体結合活性）を有する。短縮鎖の例には、Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる）；Ｆｄフラグメント（ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる）；Ｆｖフラグメント（抗体の単鎖のＶＬおよびＶＨドメインからなる）；ｄａｂフラグメント（ＶＨドメインからなる）；単離ＣＤＲ領域；（Ｆａｂ’）_２フラグメント、二価フラグメント（ジスルフィド結合によってヒンジ領域で結合した２つのＦａｂフラグメントを含む）が含まれるが、これらに限定されない。従来の生化学的技術（酵素切断など）または組換えＤＮＡ技術（それぞれ当該分野で公知）によって短縮鎖を産生することができる。当該分野で周知の方法によるインタクトな抗体のタンパク質分解性切断または部位特異的変異誘発を使用したベクター中の所望の位置（Ｆａｂフラグメントを産生するためのＣＨ１または（Ｆａｂ’）_２フラグメントを産生するためのヒンジ領域の後など）での終止コドンの挿入によって、これらのポリペプチドフラグメントを産生することができる。Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈコード領域とＶＬおよびＶＨタンパク質フラグメントを連結するペプチドリンカーをコードするＤＮＡとの連結によって単鎖抗体を産生することができる。

【0127】

免疫グロブリン関連遺伝子は、個別の機能的領域（それぞれ１つまたは複数の異なる生物活性を有する）を含むので、抗体フラグメントの遺伝子を、他の遺伝子由来の機能的領域（例えば、酵素、米国特許第５，００４，６９２号（その全体が本明細書中で参考として援用される））と融合して、新規の性質を有する融合タンパク質（例えば、免疫毒素）または抱合体を産生することができる。

【0128】

本発明は、免疫毒素における抗ＣＳ１抗体の使用を含む。抗体を含む免疫毒素である抱合体は、当該分野で広範に記載されている。従来のカップリング技術によって毒素を抗体にカップリングすることができるか、タンパク質毒素部分を含む免疫毒素を融合タンパク質として産生することができる。本発明の抱合体を、このような免疫毒素を得るための対応する方法で使用することができる。このような免疫毒素の例は、Ｂｙｅｒｓ，Ｂ．Ｓ．ら，Ｓｅｍｉｎａｒｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２：５９−７０（１９９１）およびＦａｎｇｅｒ，Ｍ．Ｗ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １２：５１−５４（１９９１）に記載されている。

【0129】

組換えＤＮＡ技術を使用して、任意の発現系（細菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、および哺乳動物細胞（例えば、ＮＳＯ細胞）などの原核生物および真核生物発現系が含まれる）で組換え抗ＣＳ１抗体ならびにキメラもしくはヒト化抗ＣＳ１抗体または任意の他の抗ＣＳ１遺伝子改変抗体、およびそのフラグメントもしくは抱合体を産生することができる。

【0130】

一旦産生されると、本発明の全抗体、その二量体、各軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態を、当該分野で標準的な手順（硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動などが含まれる）にしたがって精製することができる（一般に、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，１９８２）を参照のこと）。薬学的使用では少なくとも約９０〜９５％均一な実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％またはそれ以上均一であることが最も好ましい。一旦精製されると（部分的、望ましくは均一）、ポリペプチドを、治療（体外が含まれる）またはアッセイ手順、免疫蛍光染色などの開発および実施で使用することができる（一般に、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｓ．Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ａｎｄ Ｐｅｒｎｉｓ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９７９ ａｎｄ １９８１を参照のこと）。実施例に記載のように、単離または精製抗ＣＳ１抗体を、そのＣＳ１の生物活性を中和する能力についてさらにスクリーニングすることができる。

【0131】

（ＣＳ１核酸の使用）
上記のように、実質的な核酸および／またはアミノ酸配列の相同性または表２のＣＳ１配列への結合によってＣＳ１配列を最初に同定する。このような相同性は、全核酸またはアミノ酸配列に基づくことができ、一般に、相同性プログラムまたはハイブリッド形成条件のいずれかを使用して決定する。典型的には、ｍＲＮＡ上の結合配列は、同一分子上に見出される。

【0132】

ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用して、配列の同一率を決定することができる。好ましい方法は、デフォルトパラメータを設定し、重複スパンおよび重複画分をそれぞれ１および０．１２５に設定したＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを使用する。アラインメントには、整列させる配列へのギャップの導入が含まれ得る。さらに、記載の核酸よりも多いか少ないヌクレオチドを含む配列のために、総ヌクレオシド数に対する相同ヌクレオシド数に基づいて相同率を決定することができる。したがって、例えば、より短い配列中のヌクレオシド数を使用して、同定した配列相同性よりも短い配列相同性を決定する。

【0133】

１つの実施形態では、ハイブリッド形成研究によって核酸相同性を決定する。したがって、例えば、高ストリンジェンシー下で記載の核酸またはその相補物とハイブリッド形成するか、天然に存在するｍＲＮＡでも見出される核酸を、相同配列と見なす。別の実施形態では、より低いストリンジェントなハイブリッド形成条件を使用し、例えば、中程度または低ストリンジェンシー条件を使用することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ，前出およびＴｉｊｓｓｅｎ，前出を参照のこと）。

【0134】

本発明のＣＳ１核酸配列（例えば、表２中の配列）は、より大きな遺伝子のフラグメントであり得る（例えば、これらは核酸セグメントである）。本文脈中の「遺伝子」には、コード領域、非コード領域、ならびにコード領域および非コード領域の混合物が含まれる。したがって、本明細書中に提供した配列を使用し、より長い配列または全長配列の周知のクローニング技術を使用して、ＣＳ１遺伝子のいずれかの方向への伸長配列を得ることができる（Ａｕｓｕｂｅｌら，前出を参照のこと）。インフォマティクスによってマッチングを行い、１つの遺伝子に対応する複数の配列を含むように多数の配列を集団化することができる（ＵｎｉＧｅｎｅなどのシステム）。

【0135】

本発明のＣＳ１核酸をいくつかの方法で使用する。１つの実施形態では、ＣＳ１の核酸プローブを作製し、以下に概説のスクリーニング法および診断法または投与（例えば、遺伝子療法、ワクチン、ＲＮＡｉ、および／またはアンチセンス適用）のために使用されるバイオチップに付着する。あるいは、スクリーニングまたは患者への投与のために、ＣＳ１タンパク質のコード領域を含むＣＳ１核酸を、再度ＣＳ１タンパク質発現用の発現ベクターに移入することができる。

【0136】

別の実施形態では、ＣＳ１核酸（図に概説の両核酸配列および／またはその相補物）の核酸プローブを作製する。バイオチップに付着した核酸プローブを、ＣＳ１核酸（例えば、標的配列（例えば、サンドイッチアッセイにおけるサンプルの標的配列または他のプローブ配列のいずれか））と実質的に相補的になるようにデザインし、それにより、標的配列と本発明のプローブとがハイブリッド形成する。下記概説のように、この相補性は完全である必要はなく、標的配列と本発明の一本鎖核酸との間のハイブリッド形成を妨害する任意の数の塩基対ミスマッチが存在し得る。しかし、変異数が非常に多いので、最小ストリンジェントのハイブリッド形成条件下でさえハイブリッド形成は起こらず、配列は相補的標的配列ではない。したがって、本明細書中の「実質的に相補的な」は、本明細書中に概説のように、通常の反応条件下（特に、高ストリンジェンシー条件）でプローブが標的配列とハイブリッド形成するのに十分に相補的であることを意味する。

【0137】

核酸プローブは、一般に、一本鎖であるが、部分的一本鎖および部分的二本鎖であり得る。プローブの鎖形成性を、標的配列の構造、組成、および性質によって予想する。一般に、核酸プローブは、約８〜１００塩基長の範囲であり、約１０〜８０塩基が好ましく、約３０〜５０塩基が最も好ましい。すなわち、一般に全遺伝子を使用しない。いくつかの実施形態では、数百塩基までの遥かに長い核酸を使用することができる。

【0138】

別の実施形態では、配列あたり１つを超えるプローブを使用し、重複プローブまたは標的の異なる部分に対するプローブを使用する。すなわち、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のプローブ（３つが好ましい）を使用して、特定の標的について冗長に構築する。プローブは、重複（例えば、共通のいくつかの配列を有する）または個別であり得る。いくつかの場合、感度をより高くするためにＰＣＲプライマーを使用してシグナルを増幅することができる。

【0139】

核酸を、広範な種々の方法で固体支持体に付着するか固定することができる。「固定」および本明細書中の文法上の等価物は、概説の結合、洗浄、分析、および除去条件下で十分に安定な核酸プローブと固体支持体との間の会合または結合を意味する。結合は、典型的は、共有結合または非共有結合であり得る。「非共有結合」および本明細書中の文法上の等価物は、１つまたは複数の静電気的、親水性、および疎水性の相互作用を意味する。非共有結合には、分子（例えば、ストレプトアビジン）の支持体への共有結合およびビオチン化プローブのストレプトアビジンの非共有結合が含まれる。「共有結合」および本明細書中の文法上の等価物は、２つの部分（固体支持体およびプローブ）が少なくとも１つの結合（σ結合、π結合、および配位結合が含まれる）によって結合することを意味する。共有結合を、プローブと固体支持体との間で直接形成することができるか、架橋リンカーまたは固体支持体もしくはプローブもしくは両分子への特定の反応基の封入によって形成することができる。固定化はまた、共有性および非共有性相互作用の組み合わせを含み得る。

【0140】

一般に、広範な種々の方法においてプローブをバイオチップに付着することができる。本明細書中に記載のように、核酸を最初に合成してその後バイオチップに付着させるか、バイオチップ上で直接合成することができる。

【0141】

バイオチップは、適切な固体基質を含む。「基質」、「固体支持体」、または本明細書中の他の文法上の等価物は、核酸プローブの付着または会合のために修飾することができ、且つ少なくとも１つの検出方法を使用することができる物質を意味する。たいてい、基質は、それぞれの区画化および同定に適切な個別の各部位を含み得る。可能な基質数は非常に多く、ガラスおよび修飾または機能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、およびスチレンと他の物質とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）Ｊなどが含まれる）、多糖、ナイロンもしくはニトロセルロース、樹脂、シリカもしくはシリカベースの物質（シリコンおよび修飾シリコンが含まれる）、カーボン、金属、無機ガラス、プラスチックなどが含まれるが、これらに限定されない。一般に、基質により最適に検出可能であり、感知可能に蛍光を発しない。ＷＯ ００５５６２７を参照のこと。

【0142】

一般に、基質は平面であるが、他の基質形状を同様に使用することができる。例えば、サンプル体積を最小にするために、プローブを流入サンプル用チューブの内面に配置することができる。同様に、基質は軟質である（軟質フォーム（特定のプラスチックから作製された独立気泡フォームが含まれる）など）。

【0143】

１つの実施形態では、バイオチップおよびプローブの表面を、その後の２者の付着のために化学官能基で誘導体化することができる。したがって、例えば、バイオチップを、化学官能基（アミノ基、カルボキシル基、オキソ基、およびチオール基が含まれるが、これらに限定されない）で誘導体化し、アミノ基が特に好ましい。これらの官能基を使用して、プローブをプローブ上の官能基を使用して付着することができる。例えば、アミノ基を含む核酸を、例えば、周知のリンカー（例えば、周知のホモまたはヘテロ二官能性リンカー）を使用して、アミノ基を含む表面に付着することができる（１９９４ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ｃａｔａｌｏｇ，ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓ，ｐａｇｅｓ １５５−２００を参照のこと）。さらに、いくつかの場合、アルキル基（置換およびヘテロアルキル基が含まれる）などのさらなるリンカーを使用することができる。

【0144】

この実施形態では、オリゴヌクレオチドを合成し、その後固体支持体表面に付着する。５’または３’末端のいずれかを、固体支持体に付着させるか、結合を介して内部ヌクレオシドに付着することができる。別の実施形態では、固体支持体への固定は非常に強力であり得るが、非共有性である。例えば、ストレプトアビジンで共有結合的にコーティングされた表面に結合し、その結果付着するビオチン化オリゴヌクレオチドを作製することができる。

【0145】

あるいは、表面上にオリゴヌクレオチドを合成することができる。例えば、光重合化合物および技術を利用する光活性化技術を使用する。別の実施形態では、ＷＯ ９５／２５１１６；ＷＯ ９５／３５５０５；米国特許第５，７００，６３７号および同第５，４４５，９３４号ならびに引用文献（その全てが明白に参考として援用される）などに記載の公知のフォトリソグラフィ技術を使用して核酸を合成することができ、これらの付着技術は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）（ＤＮマイクロアレイチップ）テクノロジーを基礎とする。

【0146】

たいてい、ＣＳ１関連配列の発現レベルを測定するために、増幅ベースのアッセイを行う。これらのアッセイを、典型的には、逆転写と組み合わせて行う。このようなアッセイでは、ＣＳ１会合核酸配列は、増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応すなわちＰＣＲ）においてテンプレートとして作用する。定量的増幅では、増幅産物量は、元のサンプル中のテンプレート量に比例する。適切なコントロールとの比較により、ＣＳ１会合ＲＮＡ量を測定する。増幅の定量方法は周知である。定量的ＰＣＲの詳細なプロトコールは、例えば、Ｉｎｎｉｓら（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載されている。

【0147】

いくつかの実施形態では、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（蛍光オリゴヌクレオチドプローブ）ベースのアッセイを使用して、発現を測定する。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ベースのアッセイは、５’蛍光色素および３’消光剤を含む蛍光性オリゴヌクレオチドプローブを使用する。プローブは、ＰＣＲ産物とハイブリッド形成するが、３’末端の遮断剤によってそれ自体が伸長できない。次のサイクルでＰＣＲ産物増幅する場合、ポリメラーゼ（例えば、ＡＭＰＬＩＴＡＱ（登録商標）（ＤＮＡポリメラーゼ））の５’ヌクレアーゼ活性により、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブが切断される。この切断によって５’蛍光色素と３’消光剤が分離し、それにより、増幅の関数として蛍光が増加する（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒによって提供された文献を参照のこと）。

【0148】

他の適切な増幅方法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０−５６９，Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０およびＢａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ８９：１１７−１２２を参照のこと）、転写増幅（Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１１７３−１１７７）、自律配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：１８７４−１８７８）、ドットＰＣＲ、リンカーアダプターＰＣＲなどが含まれるが、これらに限定されない。

【0149】

（核酸からのＣＳ１タンパク質の発現）
１つの実施形態では、例えば、ＣＳ１タンパク質をコードするＣＳ１核酸を使用して、ＣＳ１タンパク質を発現させ、その後下記の診断アッセイ用の試薬の開発に使用することができる種々の発現ベクターを作製する。タンパク質を発現するための発現ベクターおよび組換えＤＮＡ技術は周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，前出およびＦｅｒｎａｎｄｅｚ ａｎｄ Ｈｏｅｆｆｌｅｒ（ｅｄｓ．１９９９）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。発現ベクターは、自律複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。一般に、これらの発現ベクターには、ＣＳ１タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された転写および翻訳調節核酸が含まれる。用語「調節配列」は、特定の宿主生物中での作動可能に連結されたコード配列の発現に使用されるＤＮＡ配列をいう。原核生物に適切な調節配列には、例えば、プロモーター、任意選択的にはオペレーター配列、およびリボゾーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを使用することが公知である。

【0150】

核酸は、別の核酸配列と機能的関係におかれた場合に「作動可能に連結する」。例えば、プレシーケンスまたは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結し、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合にコード配列に作動可能に連結し、リボゾーム結合部位は、翻訳を促進するように配置された場合にコード配列と作動可能に連結する。一般に、「作動可能に連結された」は、連結したＤＮＡ配列が連続し、分泌リーダーの場合、連続し、且つ読み取り相に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは連続する必要はない。典型的には、従来の制限部位でのライゲーションによって連結する。このような部位が存在しない場合、従来の慣例にしたがって、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。転写および翻訳調節核酸は、一般に、ＣＳ１タンパク質の発現のための使用される宿主細胞に適切である。種々の宿主細胞のための多数の適切な発現ベクター型および適切な調節配列が公知である。

【0151】

一般に、転写および翻訳調節配列には、プロモーター配列、リボゾーム結合部位、転写開始および終止配列、転写開始および終止配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が含まれ得るが、これらに限定されない。１つの実施形態では、調節配列には、プロモーター配列ならびに転写開始および終止配列が含まれる。

【0152】

プロモーター配列は、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターのいずれかであり得る。プロモーターは、天然に存在するプロモーターまたはハイブリッドプロモーターのいずれかである。１つを超えるプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターも公知であり、本発明で有用である。

【0153】

発現ベクターは、さらなるエレメントを含み得る。例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有することができるので、２つの生物中（例えば、発現のための哺乳動物または昆虫細胞およびクローニングおよび増幅用の原核宿主）で保持可能である。さらに、発現ベクターの組み込みのために、発現ベクターは、たいてい、宿主細胞ゲノムに相同な少なくとも１つの配列、好ましくは発現構築物に隣接した２つの相同配列を含む。ベクター中の封入のための適切な相同配列の選択によって、組み込みベクターを宿主細胞中の特定の遺伝子座に指向させることができる。組み込みベクター用の構築物が利用可能である。例えば、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ａｎｄ Ｈｏｅｆｆｌｅｒ，前出；およびＫｉｔａｍｕｒａら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９１４６−９１５０を参照のこと。

【0154】

さらに、別の実施形態では、発現ベクターは、形質転換宿主細胞を選択するための選択マーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は周知であり、使用する宿主細胞によって変化する。

【0155】

通常、ＣＳ１タンパク質の発現を誘導するか生じさせるのに適切な条件下でのＣＳ１タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞の培養によって、本発明のＣＳ１タンパク質を産生する。ＣＳ１タンパク質発現に適切な条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって変化し、日常的な実験または最適化によって容易に確認される。例えば、発現ベクター中での構成性プロモーターの使用には宿主細胞の成長および増殖を至適化する必要がある一方で、誘導性プロモーターの使用には誘導のための適切な成長条件が必要である。さらに、いくつかの実施形態では、採取のタイミングが重要である。例えば、昆虫細胞発現で使用されるバキュロウイルス系は溶菌ウイルスであるので、採取期間の選択は産物の収率に極めて重要であり得る。

【0156】

適切な宿主細胞には、酵母、細菌、古細菌、真菌、昆虫、および動物の細胞（哺乳動物細胞が含まれる）が含まれる。サッカロミセス・セレビシエおよび他の酵母、Ｅ．コリ、バチルス・ズブチリス、Ｓｆ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、アカパンカビ、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ細胞、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈内皮細胞）、ＴＨＰ１細胞（マクロファージ細胞株）、ならびに種々の他のヒト細胞および細胞株は特に興味深い。

【0157】

１つの実施形態では、哺乳動物細胞中でＣＳ１タンパク質を発現する。哺乳動物発現系を使用することができ、これにはレトロウイルス系およびアデノウイルス系が含まれる。１つの発現ベクター系は、一般に、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９およびＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０４８などに記載のレトロウイルスベクター系である。ウイルス遺伝子はたいてい高度に発現され、広範な宿主範囲を有するので、哺乳動物ウイルス遺伝子由来のプロモーターが哺乳動物プロモーターとして特に使用される。例には、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス哺乳動物腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、およびＣＭＶプロモーター（例えば、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ａｎｄ Ｈｏｅｆｆｌｅｒ，前出を参照のこと）が含まれる。典型的には、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列およびポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンに対して３’側に存在し、それによりプロモーターエレメントと共にコード配列に隣接する調節領域である。転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルの例には、ＳＶ４０由来のものが含まれる。

【0158】

哺乳動物宿主ならびに他の宿主への異種核酸の移入方法が利用可能であり、使用される宿主細胞によって変化する。この技術には、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス感染、リポソームへのポリヌクレオチドのカプセル化、および核へのＤＮＡの直接微量注入が含まれる。

【0159】

別の実施形態では、ＣＳ１タンパク質を、細菌系で発現させる。バクテリオファージ由来のプロモーターを使用することもできる。さらに、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターも有用であり、例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーター配列のハイブリッドである。さらに、細菌プロモーターには、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合して転写を開始する能力を有する天然に存在する非細菌起源のプロモーターが含まれ得る。機能的プロモーター配列に加えて、有効なリボゾーム結合部位が望ましい。発現ベクターには、細菌中でＣＳ１タンパク質を分泌するシグナルペプチド配列が含まれ得る。タンパク質は、成長培地（グラム陽性菌）または細胞の内膜と外膜との間に存在する細胞膜周辺腔に分泌される（グラム陰性菌）。細菌発現ベクターには、形質転換された細菌株の選択を可能にするための選択マーカー遺伝子も含まれ得る。適切な選択遺伝子には、細菌にアンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、およびテトラサイクリンなどに対する薬物耐性を付与する遺伝子が含まれる。選択マーカーには、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシンの生合成経路などにおける生合成遺伝子も含まれる。これらの成分を、発現ベクターにアセンブリする。細菌用の発現ベクターは周知であり、特に、バチルス・ズブチリス、Ｅ．コリ、ストレプトコッカス・クレモリス、およびストレプトコッカス・リビダンス用のベクターが含まれる（例えば、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ａｎｄ Ｈｏｅｆｆｌｅｒ，前出）。塩化カルシウム処理およびエレクトロポレーションなどの技術を使用して、細菌発現ベクターを細菌宿主細胞に形質転換する。

【0160】

１つの実施形態では、例えば、昆虫細胞の形質転換用発現ベクター（特に、バキュロウイルスベースの発現ベクター）を使用して、昆虫細胞中にＣＳ１タンパク質を産生する。

【0161】

別の実施形態では、酵母細胞中にＣＳ１タンパク質を産生する。酵母発現系は周知であり、サッカロミセス・セレビシエ、カンジダ・アルビカンス、Ｃ．マルトサ、ハンセヌラ・ポリモルファ、クルイベロマイセス・フラギリス、Ｋ．ラクチス、ピキア・グイレリモンジイ、およびＰ．パストリス、シゾサッカロマイセス・ポンベ、およびヤロウィア・リポリチカ用の発現ベクターが含まれる。

【0162】

利用可能な技術を使用して、ＣＳ１タンパク質を融合タンパク質として作製することもできる。したがって、例えば、モノクローナル抗体の作製のために、所望のエピトープが小さい場合、ＣＳ１タンパク質をキャリアタンパク質と融合して、免疫原を形成することができる。あるいは、発現を増加させるためまたは他の理由のために、ＣＳ１タンパク質を融合タンパク質として作製することができる。例えば、ＣＳ１タンパク質がＣＳ１ペプチドである場合、発現させるためにペプチドをコードする核酸を他の核酸に連結することができる。検出エピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ６、ｍｙｃ、ＨＡなど）と融合することができる。

【0163】

さらに別の実施形態では、ＣＳ１タンパク質を発現後に精製または単離する。どのような他の成分がサンプル中に存在するかおよび精製産物の要件（例えば、天然の高次構造または変性）に依存して、ＣＳ１タンパク質を種々の方法で単離または精製することができる。標準的な精製方法には、硫酸アンモニウム沈殿、電気泳動技術、分子技術、免疫学的技術、およびクロマトグラフィ技術（イオン交換、疎水性、親和性、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィが含まれる）、およびクロマトフォーカシングが含まれる。例えば、標準的な抗ＣＳ１タンパク質抗体カラムを使用してＣＳ１タンパク質を精製することができる。タンパク質濃縮と組み合わせた限外濾過およびダイアフィルトレーションも有用である。例えば、Ｗａｌｓｈ（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ；Ｈａｒｄｉｎら（ｅｄｓ．２００１）Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ；Ｗｉｌｓｏｎら（ｅｄｓ．２０００）Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびＳｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照のこと。必要な精製度は、ＣＳ１タンパク質の使用に依存して変化する。いくつかの例では、精製は必要ない。

【0164】

一旦発現され、必要に応じて精製されると、ＣＳ１タンパク質および核酸は、多数の用途において有用である。これらを、免疫選択薬、ワクチン試薬、スクリーニング剤、治療物質として使用することができるか、抗体産生のための転写または翻訳インヒビターとして使用することができる。

【0165】

（ＣＳ１タンパク質の変異型）
本明細書中で決定したところ、天然に存在する配列のアミノ酸変異型もＣＳ１タンパク質の１つの実施形態に含まれる。好ましくは、変異型は、好ましくは野生型配列の約７５％を超えて相同であり、より好ましくは約８０％超、さらにより好ましくは約８５％超、最も好ましくは９０％超が相同である。いくつかの実施形態では、相同性は約９３〜９５％または９８％もの高さである。核酸に関しては、この文脈における相同性は、配列類似性または同一性を意味し、同一性が好ましい。核酸相同性について上記で概説のように、標準手異な技術を使用してこの相同性を決定する。

【0166】

本発明のＣＳ１タンパク質は、野生型アミノ酸配列よりも短くても長くてもよい。したがって、１つの実施形態では、本明細書中の野生型配列の一部またはフラグメントは、ＣＳ１タンパク質の定義の範囲内に含まれる。さらに、上記概説のように、本発明のＣＳ１核酸を使用して、さらなるコード領域およびそれによるさらなるタンパク質配列を得ることができる。

【0167】

１つの実施形態では、ＣＳ１タンパク質は、野生型配列と比較して誘導体または変異ＣＳ１タンパク質である。すなわち、以下により完全に概説するように、誘導ＣＳ１ペプチドは、たいてい、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含み、アミノ酸の置換が特に好ましい。ＣＳ１ペプチド内の多数の残基位置でアミノ酸の置換、挿入、または欠失が起こり得る。

【0168】

アミノ酸配列変異型も本発明のＣＳ１タンパク質の１つの実施形態に含まれる。これらの変異型は、典型的には、以下の３つのクラスの１つまたは複数に含まれる：置換、挿入、または欠失変異型。これらの変異型を、通常、上記に概説するように、変異型をコードするＤＮＡを産生するためのカセットもしくはＰＣＲ変異誘発または他の技術を使用したＣＳ１タンパク質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的変異誘発およびその後の組換え細胞培養におけるＤＮＡの発現によって調製する。しかし、確立された技術を使用したインビトロ合成によって、約１００〜１５０残基までを有する変異ＣＳ１タンパク質フラグメントを調製することができる。アミノ酸配列変異型を、変異型の所定の性質（ＣＳ１タンパク質のアミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子または種間変異とは別の特徴）によって特徴づける。変異型は、典型的には、天然に存在するアナログに類似の定性的生物活性を示すが、特徴が改変された変異型を選択することもできる。

【0169】

アミノ酸配列の移入部位または移入領域はたいてい予め決定されるが、変異自体は予め決定する必要はない。例えば、所与の部位での変異能力を最適にするために、標的コドンまたは領域でランダム変異誘発を行い、発現したＣＳ１変異型を所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングすることができる。既知の配列を有するＤＮＡ中の所定の部位での置換変異のための技術は周知である（例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発）。ＣＳ１タンパク質活性のアッセイを使用して、変異をスクリーニングする。

【0170】

アミノ酸置換は、典型的には１残基であり、挿入は約１〜２０アミノ酸の規模であるにもかかわらず、非常に大きな挿入も許容することができる。欠失は、一般に、約１〜２０残基の範囲であるが、いくつかの場合、欠失はさらに大きくてよい。

【0171】

置換、欠失、挿入、またはその組み合わせを使用して、最終的な誘導体に到達することができる。一般に、分子の変化を最小にするために、これらの変化を少数のアミノ酸で行う。しかし、一定の環境下では、より大きな変化を許容することができる。ＣＳ１タンパク質の特徴の変化が小さい方が良い場合、一般に、記載のアミノ酸置換関係に従って置換する。

【0172】

変異型は、典型的には、本質的に同一の定量的生物活性を示し、天然に存在するアナログと同一の免疫応答を誘発するにもかかわらず、変異型はまた必要に応じてＣＳ１タンパク質の特徴を改変するように選択する。あるいは、ＣＳ１タンパク質の生物活性が変化するように変異型をデザインすることができる。例えば、グリコシル化部位を、付加、変更、または除去することができる。

【0173】

機能または免疫学的同一性を、時折、上記よりも保存されない置換の選択によって実質的に変化させる。例えば、変化領域のポリペプチド骨格構造（例えば、αヘリックス構造またはβシート構造）、標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または側鎖の大部分により有意に影響を与える置換を行うことができる。一般に、ポリペプチドの性質を最も変化させると予想される置換は、以下の置換である：（ａ）親水性残基（例えば、セリンまたはトレオニン）を、疎水性残基（例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、またはアラニン）に置換すること（またはその逆）、（ｂ）システインまたはプロリンを別の残基に置換すること（またはその逆）、（ｃ）正電荷の側鎖を有する残基（例えば、リジン、アルギニン、またはヒスチジン）を、負電荷の残基（例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸）に置換すること（またはその逆）、（ｄ）かさ高い側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）を、側鎖を含まない残基に置換すること（またはその逆）、または（ｅ）ペプチド結合の回転自由度を変化させるプロリン残基を組み込むか置換すること。

【0174】

変異型は、典型的には、類似の定性的生物活性を示し、天然に存在するアナログと同一の免疫応答を誘発するにもかかわらず、変異型はまた、必要に応じて皮膚ＣＳ１タンパク質の特徴を改変するために選択される。あるいは、ＣＳ１タンパク質の生物活性が変化するように変異型をデザインすることができる。例えば、グリコシル化部位を変化させるか除去することができる。

【0175】

ＣＳ１ポリペプチドの共有結合の改変は本発明の範囲内に含まれる。１つの共有結合修飾の型には、ＣＳ１ポリペプチドのターゲティングアミノ酸残基とＣＳ１ポリペプチドの選択された側鎖またはＮ末端残基もしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤との反応が含まれる。二官能性剤での誘導体化は、例えば、抗ＣＳ１ポリペプチド抗体の精製方法またはスクリーニングアッセイでの使用のためのＣＳ１ポリペプチドの水溶液支持マトリクスまたは表面への架橋に有用である。一般的に使用されている架橋剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル）、ホモ二官能性イミドエステル（３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルが含まれる）、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミド、ならびにメチル−３−（（ｐ−アジドフェニル）ジチオ）プロピロイミデートなどの薬剤が含まれる。

【0176】

他の修飾には、グルタミニル残基およびアスパラギニル残基の対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリニル残基、トレオニル残基、またはチロシル残基の水酸基のリン酸化、リジン側鎖、アルギニン側鎖、およびヒスチジン側鎖のアミノ基のメチル化（例えば、ｐｐ．７９−８６，Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｆｒｅｅｍａｎ）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびにＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。

【0177】

本発明の範囲内に含まれるＣＳ１ポリペプチドの別の共有結合修飾型は、ポリペプチドの天然のグリコシル化パターンが変化している。「天然のグリコシル化パターンの変化」は、本明細書中での目的のために、天然のＣＳ１ポリペプチド配列で見出される１つまたは複数の炭水化物部分の欠失および／または天然のＣＳ１ポリペプチド配列中に存在しない１つまたは複数のグリコシル化部位の付加を意味することを意図する。多数の方法でグリコシル化パターンを変化させることができる。ＣＳ１関連配列を発現するための異なる細胞型により、異なるグリコシル化パターンを得ることができる。

【0178】

ＣＳ１ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加を、そのアミノ酸配列の変化によって行うこともできる。例えば、（Ｏ結合グリコシル化部位について）天然のＣＳ１ポリペプチド配列への１つまたは複数のセリン残基またはトレオニン残基の付加または置換によって変化させることができる。特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるように予め選択した塩基でＣＳ１ポリペプチドをコードするＤＮＡを変異することによるＤＮＡレベルでの変化によって、ＣＳ１アミノ酸配列を任意選択的に変化させることができる。

【0179】

ＣＳ１ポリペプチドの炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的または酵素的カップリングによるものである。例えば、ＷＯ８７／０５３３０；ｐｐ．２５９−３０６ ｉｎ Ａｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ（１９８１）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．を参照のこと。

【0180】

ＣＳ１ポリペプチドに存在する炭水化物部分を、化学的もしくは酵素的またはグリコシル化の標的として作用するアミノ酸残基をコードするコドンの変異置換によって除去することができる。化学的脱グリコシル化技術が適用可能である。例えば、Ｓｏｊａｒ ａｎｄ Ｂａｈｌ（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２−５７およびＥｄｇｅら（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１−１３７を参照のこと。種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって、ポリペプチドの炭水化物部分の酵素的切断を行うことができる。例えば、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０−３５９を参照のこと。

【0181】

ＣＳ１ポリペプチドの別の共有結合修飾型は、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に記載の様式での種々の非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）の１つへのＣＳ１ポリペプチドの結合を含む。

【0182】

本発明のＣＳ１ポリペプチドを、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合したＣＳ１ポリペプチドを含むキメラ分子を形成するための方法で修飾することもできる。１つの実施形態では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体と選択的に結合することができるエピトープを提供するタグポリペプチドとのＣＳ１ポリペプチドの融合を含む。エピトープタグを、一般に、ＣＳ１ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に配置する。ＣＳ１ポリペプチドのこのようなエピトープタグ化形態を、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出することができる。また、エピトープタグの提供により、抗タグ抗体またはエピトープタグに結合する別の親和性マトリクス型を使用した親和性精製によってＣＳ１ポリペプチドを容易に精製することができる。別の実施形態では、キメラ分子は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域とのＣＳ１ポリペプチドの融合を含み得る。キメラ分子の二価形態のために、このような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域への融合であり得る。

【0183】

種々のタグポリペプチドおよびその各抗体が利用可能である。例には、ポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ＨＩＳ６および金属キレート化タグ、ｆｌｕＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２１５９−２１６５）；ｃ−ｍｙｃタグならびにその８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７、および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎら（１９８５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：３６１０−３６１６）；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙら（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３（６）：５４７−５５３）が含まれる。他のタグポリペプチドには、Ｆｌａｇ−ペプチド（Ｈｏｐｐら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４−１２１０）；ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１９２−１９４）；チューブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１５１６３−１５１６６）；ならびにＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６３９３−６３９７）が含まれる。

【0184】

下記概説のようにクローン化および発現した他の生物由来のＣＳ１タンパク質も含まれる。したがって、プローブまたは縮重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列を使用して、ヒトまたは他の生物由来の他の関連ＣＳ１タンパク質を見出すことができる。特に有用なプローブおよび／またはＰＣＲプライマー配列には、ＣＳ１核酸配列の固有の領域が含まれる。好ましいＰＣＲプライマーは、約１５〜３５ヌクレオチド長であり、約２０〜３０ヌクレオチド長が好ましく、必要に応じてイノシンを含むことができる。ＰＣＲの反応条件は十分に記載されている（例えば、Ｉｎｎｉｓ，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，前出）。

【0185】

さらに、例えば、伸長配列の解明、エピトープまたは精製タグの付加、他の融合配列の付加などによって、表２の核酸によってコードされるものよりも長いＣＳ１タンパク質を作製することができる。

【0186】

ＣＳ１核酸によってコードされるＣＳ１タンパク質を同定することもできる。したがって、本明細書中に概説のように、ＣＳ１タンパク質は、配列表の配列またはその相補物とハイブリッド形成する核酸によってコードされる。

【0187】

（ＣＳ１タンパク質への結合パートナー）
（ＣＳ１抗体）
本発明のＣＳ１抗体は、ＣＳ１タンパク質に特異的に結合する。本明細書中の「特異的に結合する」は、抗体が、タンパク質に少なくとも０．１ｍＭ、より通常には少なくとも約１μＭ、好ましくは少なくとも約０．１μＭまたはそれ以下、最も好ましくは０．０１μＭまたはそれ以下のＫｄで結合することを意味する。特異的標的に結合するが関連配列に結合しない選択性もたいてい重要である。

【0188】

１つの実施形態では、結合パートナー（例えば、免疫グロブリンの抗体）の生成にＣＳ１タンパク質を使用する場合、ＣＳ１タンパク質は、全長タンパク質と少なくとも１つのエピトープまたは決定基を共有しなければならない。本明細書中の「エピトープ」または「決定基」は、典型的には、ＭＨＣの文脈で、抗体またはＴ細胞受容体を生成および／または結合するタンパク質部分を意味する。したがって、ほとんどの場合、より小さなＣＳ１タンパク質に対して作製した抗体は、全長タンパク質（特に、線状エピトープ）に結合することができる。別の実施形態では、エピトープは固有である。したがって、固有のエピトープに対して生成した抗体は、交差反応性をほとんどまたは全く示さない。さらに別の実施形態では、エピトープを、表に記載のタンパク質配列から選択する。

【0189】

ポリクローナル抗体の調製方法が存在する（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，前出およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，前出）。ポリクローナル抗体を、例えば、１回または複数回の免役化剤および（所望ならば）アジュバントの注射によって哺乳動物中で惹起することができる。典型的には、免役化剤および／またはアジュバントを、複数回の皮下注射または腹腔内注射によって哺乳動物に注射する。免役化剤には、表２の核酸によってコードされるタンパク質またはそのフラグメントもしくは融合タンパク質が含まれ得る。これは、免役化される哺乳動物で免疫原性を示すことが公知のタンパク質への免役化剤の抱合に有用であり得る。このような免疫原性タンパク質の例には、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、およびダイズトリプシンインヒビターが含まれるが、これらに限定されない。使用することができるアジュバントの例には、フロイント完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコレート）が含まれる。種々の免疫化プロトコールを使用することができる。

【0190】

あるいは、抗体は、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体を、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５などに記載のハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を、典型的には、免役化剤に特異的に結合する抗体を産生するか産生することができるリンパ球を誘発するための免役化剤で免役化する。あるいは、リンパ球をインビトロで免役化することができる。免役化剤には、典型的には、表の核酸によってコードされたポリペプチドまたはそのフラグメントまたは融合タンパク質が含まれる。一般に、ヒト起源の細胞が望ましい場合にいずれかの末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）を使用するか、非ヒト哺乳動物起源が望ましい場合に脾臓細胞またはリンパ節細胞を使用する。次いで、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用して、リンパ球を不死化細胞株と融合してハイブリドーマ細胞を形成する（例えば、ｐｐ．５９−１０３ ｉｎ Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。不死化細胞株は、通常、哺乳動物細胞（特に、げっ歯類、ウシ、またはヒト起源の細胞）である。通常、ラット細胞またはマウス細胞を使用する。ハイブリドーマ細胞を、好ましくは非融合不死化細胞の成長または生存を阻害する１つまたは複数の物質を含む適切な培養培地で培養することができる。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防止するヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含む。

【0191】

１つの実施形態では、抗体は二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に結合特異性を有するか、同一抗原上の２つのエピトープに結合特異性を有するモノクローナル抗体（好ましくは、ヒト抗体またはヒト化抗体）である。１つの実施形態では、一方の結合特異性は、表の核酸によってコードされるタンパク質またはそのフラグメントに対する特異性であり、他方は、別の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質、受容体、または受容体サブユニット、好ましくはＣＳ１に特異的なものに対する特異性である。あるいは、四量体型技術により、多価試薬を作製することができる。

【0192】

別の実施形態では、抗体は、低レベルのフコースを有するか、フコースを欠く。フコースを欠く抗体は、特に低用量で、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害性）活性と相関していた。Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら，（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ，Ｔ．ら，（２００３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６。無フコース抗体の調製方法には、ラット骨髄腫ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）での成長が含まれる。ＹＢ２／０細胞は、ポリペプチドのフコシル化に必要な酵素（α１，６−フコシルトランスフェラーゼ）をコードする低レベルのＦＵＴ８ｍＲＮＡを発現する。

【0193】

ＡＤＣＣ活性の別の増加方法には、ＣＳ１抗体のＦｃ部分の変異、特に、ＦｃγＲ受容体の抗体親和性を増加させる変異が含まれる。ＦｃγＲ結合の増加と変異Ｆｃとの間の相関は、ターゲティング細胞傷害性ベースのアッセイを使用して証明されている。Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１−６６０４；Ｐｒｅｓｔａら（２００２），Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：４８７−４９０。特異的Ｆｃ領域変異によるＡＤＣＣ活性の増加方法には、２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０および３３２（Ｆｃ領域中の残基の番号づけは、ＫａｂａｔなどのＥＵインデックスの番号づけである）からなる群から選択される位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＦｃ変異型が含まれる。好ましい実施形態では、Ｆｃ変異型は、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｎ、Ｌ２３４Ｑ、Ｌ２３４Ｔ、Ｌ２３４Ｈ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｎ、Ｌ２３５Ｑ、Ｌ２３５Ｔ、Ｌ２３５Ｈ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｆ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｆ、Ｓ２３９Ｔ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｙ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２４０Ｔ、Ｖ２４０Ｍ、Ｆ２４１Ｗ、Ｆ２４１Ｌ、Ｆ２４１Ｙ、Ｆ２４１Ｅ、Ｆ２４１Ｒ、Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｙ、Ｆ２４３Ｒ、Ｆ２４３Ｑ、Ｐ２４４Ｈ、Ｐ２４５Ａ、Ｐ２４７Ｖ、Ｐ２４７Ｇ、Ｖ２６２Ｉ、Ｖ２６２Ａ、Ｖ２６２Ｔ、Ｖ２６２Ｅ、Ｖ２６３Ｉ、Ｖ２６３Ａ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６３Ｍ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｗ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｒ、Ｖ２６４Ｆ、Ｖ２６４Ｍ、Ｖ２６４Ｙ、Ｖ２６４Ｅ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２６５Ｑ、Ｄ２６５Ｙ、Ｄ２６５Ｆ、Ｄ２６５Ｖ、Ｄ２６５Ｉ、Ｄ２６５Ｌ、Ｄ２６５Ｈ、Ｄ２６５Ｔ、Ｖ２６６Ｉ、Ｖ２６６Ａ、Ｖ２６６Ｔ、Ｖ２６６Ｍ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｌ、Ｅ２６９Ｈ、Ｅ２６９Ｙ、Ｅ２６９Ｆ、Ｅ２６９Ｒ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ２９６Ｑ、Ｙ２９６Ｄ、Ｙ２９６Ｎ、Ｙ２９６Ｓ、Ｙ２９６Ｔ、Ｙ２９６Ｌ、Ｙ２９６Ｉ、Ｙ２９６Ｈ、Ｎ２９７Ｓ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｅ、Ａ２９８Ｈ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ２９９Ｖ、Ｔ２９９Ｈ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｅ、Ｗ３１３Ｆ、Ｎ３２５Ｑ、Ｎ３２５Ｌ、Ｎ３２５１、Ｎ３２５Ｄ、Ｎ３２５Ｅ、Ｎ３２５Ａ、Ｎ３２５Ｔ、Ｎ３２５Ｖ、Ｎ３２５Ｈ、Ａ３２７Ｎ、Ａ３２７Ｌ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｎ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｆ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｔ、Ｌ３２８Ｈ、Ｌ３２８Ａ、Ｐ３２９Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｉ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｒ、Ａ３３０Ｈ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｉ３３２Ｔ、Ｉ３３２Ｈ、Ｉ３３２Ｙ、およびＩ３３２Ａ（Ｆｃ領域中の残基の番号づけは、ＫａｂａｔなどのＥＵインデックスの番号づけである）からなる群から選択される少なくとも１つの置換を含む。Ｆｃ変異型を、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４１Ｗ、Ｆ２４１Ｌ、Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４１Ｌ／Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６２Ｉ／Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４１Ｗ／Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４１Ｗ／Ｆ２４３Ｗ／Ｖ２６２Ａ／Ｖ２６４Ａ、Ｆ２４１Ｌ／Ｖ２６２Ｉ、Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６２Ｉ／Ｖ２６４Ｗ、Ｆ２４ｌＹ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｔ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｒ／Ｖ２６２Ｅ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｅ、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２３８Ｍ／Ｉ３３２Ｅ、Ｐ２４４Ｈ、Ｐ２４５Ａ、Ｐ２４７Ｖ、Ｗ３１３Ｆ、Ｐ２４４Ｈ／Ｐ２４５Ａ／Ｐ２４７Ｖ、Ｐ２４７Ｇ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｒ／Ｖ２６２Ｅ／Ｖ２６４Ｒ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｇ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｑ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ２９６Ｑ、Ｔ２９９Ｉ、Ａ３２７Ｎ、Ｓ２６７Ｑ／Ａ３２７Ｓ、Ｓ２６７Ｌ／Ａ３２７Ｓ、Ａ３２７Ｌ、Ｐ３２９Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｙ、１３３２Ｄ、Ｎ２９７Ｓ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｓ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｄ２６５Ｙ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｄ２６５Ｙ／Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｄ２６５Ｆ／Ｎ２９７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｆ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２６３Ｉ、Ｖ２６６Ｉ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ２９９Ｖ、Ｎ３２５Ｑ、Ｎ３２５Ｌ、Ｎ３２５１、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｆ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｑ、Ｙ２９６Ｄ、Ｙ２９６Ｎ、Ｆ２４１Ｙ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｔ／Ｎ２８７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｎ、Ｌ２３４Ｑ、Ｌ２３４Ｔ、Ｌ２３４Ｈ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｎ、Ｌ２３５Ｑ、Ｌ２３５Ｔ、Ｌ２３５Ｈ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｆ、Ｓ２３９Ｔ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｙ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２４０Ｔ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２６３Ａ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６３Ｍ、Ｖ２６４Ｍ、Ｖ２６４Ｙ、Ｖ２６６Ａ、Ｖ２６６Ｔ、Ｖ２６６Ｍ、Ｅ２６９Ｈ、Ｅ２６９Ｙ、Ｅ２６９Ｆ、Ｅ２６９Ｒ、Ｙ２９６Ｓ、Ｙ２９６Ｔ、Ｙ２９６Ｌ、Ｙ２９６Ｉ、Ａ２９８Ｈ、Ｔ２９９Ｈ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｉ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｒ、Ａ３３０Ｈ、Ｎ３２５Ｄ、Ｎ３２５Ｅ、Ｎ３２５Ａ、Ｎ３２５Ｔ、Ｎ３２５Ｖ、Ｎ３２５Ｈ、Ｌ３２８Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｎ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｖ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｈ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ａ、Ｉ３３２Ｔ、Ｉ３３２Ｈ、Ｉ３３２Ｙ、Ｉ３３２Ａ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９３Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９３Ｄ／Ｄ２６５Ｖ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９３Ｄ／Ｄ２６５Ｉ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９３Ｄ／Ｄ２６５Ｌ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９３Ｄ／Ｄ２６５Ｆ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９３Ｄ／Ｄ２６５Ｙ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９３Ｄ／Ｄ２６５Ｈ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９３Ｄ／Ｄ２６５Ｔ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｄ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｎ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｑ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｈ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｔ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｖ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｆ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｈ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、およびＳ２３９Ｄ／２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ（Ｆｃ領域中の残基の番号づけは、ＫａｂａｔなどのＥＵインデックスの番号づけである）からなる群から選択することもできる。ＰＣＴＷＯ２００４／０２９２０７，Ａｐｒｉｌ８，２００４（本明細書中で参考として援用される）も参照のこと。

【0194】

抗体関連ＡＤＣＣ活性を、損傷時に原形質膜に急速に放出される上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出の測定によってモニタリングおよび定量することができる。

【0195】

抗体処置を使用した細胞の細胞傷害性を促進するための別の実施形態には、細胞死に至る抗体結合細胞へのシグナル伝達カスケードの抗体媒介刺激が含まれる。さらに、（例えば、ＮＫ細胞による）先天性免疫系の抗体媒介刺激により、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞を死滅させることもできる。

【0196】

（診断への適用のためのＣＳ１配列の検出）
１つの態様では、自己免疫障害または癌（例えば、骨髄腫）の表現型における異なる細胞状態についての遺伝子のＲＮＡ発現レベルを決定する。発現プロフィールを得るために、正常組織（例えば、障害を罹患していない）および罹患組織の遺伝子の発現レベル（および、いくつかの場合、以下に概説のように、予後に関する障害の重症度の変化について）を評価する。特定の細胞状態または発生時点の遺伝子発現プロフィールは、本質的に、細胞の状態の「フィンガープリント」である。２つの状態は、同様に発現した特定の遺伝子を有し得るが、多数の遺伝子の評価により、細胞状態を反映する遺伝子発現プロフィールを同時に作製可能である。異なる状態の細胞の発現プロフィールの比較により、これらの各状態での遺伝子の重要な情報（遺伝子の上方および下方制御が含まれる）が得られる。次いで、組織サンプルが正常組織または罹患組織の遺伝子発現プロフィールを有するかどうかを診断または確認することができる。これにより、関連病態の分子診断が得られる。

【0197】

「異なる発現」または本明細書中で使用される文法上の等価物は、細胞および組織内およびその間の一過性および／または細胞遺伝子発現の定性的または定量的相違をいう。したがって、異なって発現した遺伝子は、例えば、正常組織と罹患組織との間でその発現が定性的に変化し得る（活性化または不活化が含まれる）。遺伝子は、別の状態と比較して特定の状態でオンまたはオフになり得るので、２またはそれ以上の状態を比較することができる。定量的に調節された遺伝子は、状態内または細胞型内で標準的な技術で検出可能な発現パターンを示す。いくつかの遺伝子は、一方の状態または細胞型で発現するが、その両方では発現しない。あるいは、例えば、発現が増減する（例えば、遺伝子発現が上方制御される場合は転写物量が増加し、下方制御される場合は転写物量が減少する）という点で、発現の相違は定量的であり得る。発現が異なる程度は、以下に概説のように、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）（ＤＮＡマイクロチップアレイ）発現アレイなどの使用による標準的な特徴づけ技術による定量に十分な大きさであればよい。Ｌｏｃｋｈａｒｔ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：１６７５−１６８０を参照のこと。他の技術には、定量的逆転写酵素ＰＣＲ、ノーザン分析、およびＲＮアーゼ保護が含まれるが、これらに限定されない。上記概説のように、好ましくは、発現の変化（例えば、上方制御または下方制御）は、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約１００％、より好ましくは少なくとも約１５０％、より好ましくは少なくとも約２００％であり、３００％から少なくとも１０００％までが特に好ましい。

【0198】

遺伝子転写物またはタンパク質レベルで評価することができる。遺伝子発現量を遺伝子転写物のＲＮＡまたはＤＮＡ等価物の核酸プローブを使用してモニタリングすることができ、遺伝子発現レベルまたは最終遺伝子産物自体（タンパク質）の量を、例えば、ＣＳ１タンパク質に対する抗体および標準的な免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡなど）または他の技術（質量分析、二次元ゲル電気泳動アッセイなどが含まれる）を使用してモニタリングすることができる。ＣＳ１に対応するタンパク質（例えば、疾患表現型において重要であると同定されたタンパク質）を、疾患診断試験で評価することができる。別の実施形態では、多数の遺伝子について同時に遺伝子発現のモニタリングを行う。複数のタンパク質発現を同様にモニタリングすることができる。

【0199】

この実施形態では、特定の細胞中のＣＳ１配列の検出および定量のために、ＣＳ１核酸プローブを、本明細書中に概説のようにバイオチップに付着させる。アッセイを、以下の実施例にさらに記載する。ＰＣＲ技術を使用して、より高い感度を得ることができる。

【0200】

１つの実施形態では、ＣＳ１をコードする核酸を検出する。ＣＳ１タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを検出することができるにもかかわらず、ＣＳ１タンパク質をコードするｍＲＮＡを検出する方法が特に興味深い。ｍＲＮＡを検出するためのプローブは、ｍＲＮＡと相補的であり、且つハイブリッド形成するヌクレオチド／デオキシヌクレオチドプローブであり、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。プローブはまた、本明細書中に定義の検出可能な標識を含まなければならない。１つの方法では、ナイロンメンブレンなどの固体支持体上への試験すべき核酸の固定およびプローブとサンプルとのハイブリッド形成の後にｍＲＮＡを検出する。非特異的結合プローブを除去するための洗浄後、標識を検出する。別の方法では、ｉｎ ｓｉｔｕでｍＲＮＡの検出を行う。この方法では、浸透した細胞または組織サンプルを、プローブと標的ｍＲＮＡとのハイブリッド形成に十分な時間検出可能に標識された核酸プローブと接触させる。非特異的結合プローブを除去するための洗浄後、標識を検出する。例えば、骨髄腫タンパク質をコードするｍＲＮＡと相補的なジゴキシゲニン標識リボプローブ（ＲＮＡプローブ）を、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン二次抗体との結合によって検出し、ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートで発色させる。

【0201】

別の実施形態では、本明細書中に記載の３つのタンパク質クラス由来の種々のタンパク質（分泌タンパク質、膜貫通タンパク質、または細胞内タンパク質）を、診断アッセイで使用する。ＣＳ１タンパク質、抗体、核酸、修飾タンパク質、およびＣＳ１配列を含む細胞を、診断アッセイで使用する。各遺伝子レベルまたは対応するポリペプチドレベルでこれを行うことができる。１つの実施形態では、好ましくは発現プロフィール遺伝子および／または対応するポリペプチドをモニタリングするための高処理スクリーニング技術と組み合わせて発現プロフィールを使用する。

【0202】

本明細書中に記載および定義するように、ＣＳ１タンパク質は、ＳＬＥ、ＲＡ、およびＩＢＤなどの自己免疫障害、ならびに骨髄腫および形質細胞性白血病などの癌の疾患マーカーとして適用される。さらに、ＣＳ１は、予後または診断目的のマーカーとして適用される。推定罹患組織中のこれらのタンパク質の検出により、このような病態を検出、予後、または診断ならびに治療ストラテジーの選択が可能である。１つの実施形態では、抗体を使用してＣＳ１を検出する。好ましい方法は、ゲル（典型的には、変性および還元タンパク質ゲルであるが、別のゲル型（等電点電気泳動ゲルなどが含まれる）も可能である）での電気泳動によってサンプルからタンパク質を分離する。タンパク質の分離後、例えば、ＣＳ１に対して惹起された抗体での免疫ブロッティングによってＣＳ１を検出する。

【0203】

別の方法では、ＣＳ１に対する抗体は、ｉｎ ｓｉｔｕ画像化技術（例えば、組織学）で適用される。例えば、Ａｓａｉら（ｅｄｓ．１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｌ．３７）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。この方法では、細胞を、骨髄腫タンパク質に対する１つから多数の抗体と接触させる。非特異的抗体結合を除去するための洗浄後、抗体の存在を検出する。１つの実施形態では、検出可能な標識を含む二次抗体とのインキュベーションによって抗体を検出する。別の方法では、ＣＳ１に対する一次抗体は、検出可能な標識（例えば、基質上で作用することができる酵素マーカー）を含む。別の実施形態では、各一次抗体はそれぞれ異なる検出可能な標識を含む。この方法は、特に、ＣＳ１と上記病態の他のマーカーとの同時スクリーニングで適用される。多数の他の組織学的画像化技術も本発明で提供する。

【0204】

１つの実施形態では、異なる波長の放射を検出および区別する能力を有する蛍光光度計で標識を検出する。さらに、この方法では蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を使用することができる。

【0205】

別の実施形態では、血液、血清、血漿、便、および他のサンプル由来の抗体は、ＳＬＥ、ＲＡ、およびＩＢＤなどの自己免疫障害ならびに骨髄腫および形質細胞性白血病などの癌の診断で適用される。したがって、このようなサンプルは、ＣＳ１の存在を探索または試験すべきサンプルとして有用である。抗体を使用して、以前に記載の免疫アッセイ技術（ＥＬＩＳＡ、免疫ブロッティング（ウェスタンブロッティング）、免疫沈降、およびＢＩＡＣＯＲＥテクノロジーなどが含まれる）によってＣＳ１を検出することができる。逆に、抗体の存在は、内因性ＣＳ１タンパク質に対する免疫応答を示し得る。

【0206】

別の実施形態では、標識ＣＳ１核酸プローブの組織アレイへのｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成を行う。例えば、組織サンプルのアレイ（罹患組織および／または正常組織が含まれる）を作製する。次いで、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，前出を参照のこと）を行う。個体と標準との間のフィンガープリントを比較する場合、診断、予後、または予想は所見に基づき得る。診断を示す遺伝子は予後を示す遺伝子と異なっていてよく、細胞状態の分子プロファイリングによって反応性病態と難治性病態とを区別することができるか、結果を予想することができることがさらに理解される。

【0207】

１つの実施形態では、ＣＳ１タンパク質、抗体、核酸、修飾タンパク質、およびＣＳ１配列を含む細胞を、予後アッセイで使用する。上記のように、長期予後に関する病態、臨床、病理学的、または他の情報に相関する遺伝子発現プロフィールを作製することができる。また、タンパク質または遺伝子レベルでこれを行うことができ、遺伝子の使用が好ましい。１つまたは複数の遺伝子が種々の組み合わせで有用であり得る。上記のように、組織または患者におけるＣＳ１配列の検出および定量のためにＣＳ１プローブをバイオチップに付着させることができる。診断のために上記概説のようにアッセイを進める。ＰＣＲ法により、より高感度且つ正確に定量することができる。

【0208】

予後アッセイで有用な遺伝子は、患者の疾患悪性度によって異なって発現する遺伝子である。１つの実施形態では、遺伝子は、患者の悪性度によって固有に発現し得る。別の実施形態では、患者の悪性度によって異なるレベルで発現し得る。例えば、骨髄腫では、疾患の範囲および位置にしたがって以下の３つの異なる悪性度に分類される：悪性度Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ。悪性度Ｉでは、症状が軽微であるか存在せず、多数の患者は骨髄腫の症状を示さない。腫瘍細胞の存在で陽性と診断される。しかし、赤血球数は正常であるか正常範囲よりわずかに低く、血中カルシウムの増加は検出不可能であり、血中および尿中のＭタンパク質レベルは非常に低く、Ｘ線では検出可能な骨画像は認められない。悪性度ＩＩでは、より多数の癌細胞が蔓延している。腎機能が影響を受け、ほとんどの患者の予後診断は悪化する。悪性度ＩＩＩでは、貧血、高カルシウム血症、骨損傷の進行、および高レベルの血中および尿中Ｍタンパク質が認められる。自己免疫障害におけるタンパク質発現と異なる悪性度との相関はまた、このような障害の予後の決定で有用であることが明らかであり得る。固有に発現するか悪性度によって異なる発現レベルを有する、異なる悪性度で発現した遺伝子の相関を使用して、患者の寛解誘導の実現可能性を決定することができる。骨髄腫患者がほとんど症状を示さないより初期の悪性度でこれは特に有用である。さらに、β−２ミクログロブリン（腎臓損傷の指標）ならびに高レベルの血清アルブミンおよび乳酸デヒドロゲナーゼなどの長期合併症の発症を示す発現遺伝子も予後ツールとして有用であり得る。

【0209】

固有に発現するか悪性度によって異なる発現レベルを有する、異なる悪性度で発現した遺伝子の相関を、本発明に開示した治療法を使用した治療有効性を決定するためにモニタリングすることもできる。例えば、本発明のアンタゴニストで治療した患者を、マーカー（例えば、ＣＳ１が含まれる）または障害特異的マーカーと組み合わせたＣＳ１のモニタリング（例えば、骨髄腫治療についてのＭタンパク質のモニタリング）によって、アンタゴニストの治療有効性をモニタリングすることができる。これらの特異的マーカーのモニタリングは、本発明の治療有効性の決定ならびに本発明の異なる指標についての投薬量および治療方法の検討で重要である。

【0210】

（インビボモデル系としての疾患の誘導）
（炎症性腸疾患）
炎症性腸疾患の病理学的プロセスの調査のためのインビボ実験モデルは開発されている。Ｓａｒｔｏｒ ＲＢ，Ａｌｉｍｅｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：８９−９６（１９９７）。例えば、炎症性腸疾患遺伝子が破壊されているか、炎症性腸疾患遺伝子が挿入されているノックアウトトランスジェニックマウスを作製することができる。相同組換えによるマーカー遺伝子または他の異種遺伝子のマウスゲノム中の内因性炎症性腸疾患遺伝子部位への挿入によってノックアウトトランスジェニックマウスを作製することができる。このようなマウスを、内因性炎症性腸疾患遺伝子の炎症性腸疾患遺伝子の変異体との置換または内因性炎症性腸疾患遺伝子の変異（例えば、発癌物質への曝露）によって作製することもできる。

【0211】

ＤＮＡ構築物を、胚幹細胞の核に移入する。新たに操作した遺伝子損傷を含む細胞を、宿主マウスの胚に注射し、レシピエント雌に再移植する。いくつかのこれらの胚は、部分的に変異細胞株に由来する生殖細胞を有するキメラマウスに成長する。したがって、キメラマウスの交配によって、移入された遺伝子損傷を含む新規のマウス系統を得ることが可能である（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２を参照のこと）。キメラターゲティングマウスは、Ｈｏｇａｎら（１９８８）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ（ｅｄ．１９８７）Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．に由来し得る。

【0212】

動物モデルの非遺伝子操作を使用して他のモデルを構築することができる。特に、小分子スクリーニングにおいて１つのモデルが広範に使用されている。このモデルは、ハプテン２，４−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）溶液での単回結腸内攻撃誘発によって、ラットまたはマウスに大腸炎を誘導する。Ｍｏｒｒｉｓ ＧＰら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９６：７９５−８０３（１９８９）；Ｂｏｕｇｈｔｏｎ−ＳｍｉｔｈＮＫ，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．９４：６５−７２（１９８８）。ＴＮＢＳでの処置により激症性局所炎症反応が得られ、これは２〜３日目にピークに達し、２１日目まで持続し得るが、攻撃誘発の強さに依存する。

【0213】

ＴＮＢＳ処置によって得られた炎症反応は、クローン病の多数の巨視的、組織学的、および免疫学的特性を再現すると考えられる。Ｇｒｉｓｈａｍ ＭＢら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １０１：５４０−５４７（１９９１）；Ｙａｍａｄａ Ｙら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １０２：５２４−５３４（１９９２）；Ｔｏｒｒｅｓ ＭＩら，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ ４４：２５２３−２９（１９９９）；Ｎｅｒｕａｔｈ Ｍ，ＦｕｓｓＩ，Ｓｔｒｏｂｅｒ Ｗ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：５１−６２（２０００）。貫壁性炎症および腸壁の肥厚を伴う開放性潰瘍形成が認められる。組織学的特徴には、陰窩構造の歪み、陰窩萎縮、肉芽腫、巨細胞、基底リンパ球凝集、および炎症性浸潤の存在が含まれる。

【0214】

結腸炎症を研究および立証し、炎症性腸疾患の局面に取り組むためにモデルが使用されている。Ｈｏｆｆｍａｎ Ｐ ｅｔａｌ．，Ｇｕｔ ４１：１９５−２０２（１９９７）；Ｊａｃｏｂｓｏｎ Ｋ，ＭｃＨｕｇｈＫ，Ｃｏｌｌｉｎｓ ＳＭ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１２：１５６−６２（１９９７）。

【0215】

他の動物モデルには、ＨＬＡ−Ｂ２７ トランスジェニックラット（Ｈａｍｍｅｒ ＲＥら，Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｎｉｃ ｒａｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＨＬＡ−Ｂ２７ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ ｂ２Ｍ：Ａｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＨＬＡ−Ｂ２７ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｃｅｌｌ ６３：１０８８−１１１２（１９９０））、トランスジェニックＩＬ−２欠損マウス（Ｂａｕｍｇａｒｔ ＤＣら，Ｍｅｃｈａｎｓｉｓｍｓ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８７：５２−６６（１９９８））、ｍｄｒｌａ欠損マウス（Ｐａｎｗａｌａ ＣＭら，Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｍｉｃｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ，ｍｄｒｌａ，ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐ ｃｏｌｉｔｉｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５７３３−４４（１９９８））、およびＩＬ１０欠損マウス（Ｆｒｅｅｍａｎ ＨＪ，Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０ ｇｅｎｅ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｃｏｌｉｔｉｓ，Ｃａｎａｄｉａｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２００３））が含まれる。

【0216】

（骨髄腫）
骨髄腫の病理学的プロセスの調査のためのインビボ実験モデルは開発されている。Ｓａｒｔｏｒ ＲＢ，Ａｌｉｍｅｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：８９−９６（１９９７）。例えば、骨髄腫遺伝子が破壊されているか、骨髄腫遺伝子が挿入されているノックアウトトランスジェニックマウスを作製することができる。相同組換えによるマーカー遺伝子または他の異種遺伝子のマウスゲノム中の内因性骨髄腫遺伝子部位への挿入によってノックアウトトランスジェニックマウスを作製することができる。このようなマウスを、内因性骨髄腫遺伝子の骨髄腫遺伝子の変異体との置換または内因性骨髄腫遺伝子の変異（例えば、発癌物質への曝露）によって作製することもできる。

【0217】

ＤＮＡ構築物を、胚幹細胞の核に移入する。新たに操作した遺伝子損傷を含む細胞を、宿主マウスの胚に注射し、レシピエント雌に再移植する。いくつかのこれらの胚は、部分的に変異細胞株に由来する生殖細胞を有するキメラマウスに成長する。したがって、キメラマウスの交配によって、移入された遺伝子損傷を含む新規のマウス系統を得ることが可能である（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２を参照のこと）。キメラターゲティングマウスは、Ｈｏｇａｎら（１９８８）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ（ｅｄ．１９８７）Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．に由来し得る。

【0218】

動物モデルの非遺伝子操作を使用して他のモデルを構築することができる。例えば、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスへのＢ細胞腫瘍（例えば、ＬＬＣ細胞）の注射により、肺転移を誘導することができる。他の動物モデルは、ＳＣＩＤマウスを使用し、骨髄腫様特徴を誘導するために、Ｂ細胞腫瘍株（例えば、ＨｓＳｕｌｔａｎ細胞（ＡＴＣＣ）または多発性骨髄腫株（例えば、Ｌ３６３、ＬＰ−１、ＯＰＭ−２、またはＲＰＭＩ８２２６であるが、これらに限定されない）を注射する。さらに他の動物モデルには、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの皮下部位へのヒト胎児骨（ＦＢ）の移植およびその後の多発性骨髄腫患者から得た原発性骨髄腫単核細胞とＦＢとのインキュベーションによって作製されたヒト多発性骨髄腫のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスモデルが含まれる。Ｓｈａｎｇ−Ｙｉ Ｈ．ら，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｐａｔｈｏｌ．１６４：７４７−７５６（２００４）を参照のこと。マウス形質細胞腫モデル（その形成はプリスタンオイル（２，６，１０，１２−テトラメチルペンタデカン）処理によって誘導される）も使用することができる。さらに、ＳＣＩＤ、ＳＣＩＤ／ベージュ、またはＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの骨髄腫細胞が骨髄に直接注射されたマウスモデル（同所注射モデル）も使用することができる。

【0219】

骨髄腫細胞などの形質転換された細胞は、その正常な対応物よりも大量の一定の因子（以後、「骨髄腫特異的マーカー」）を放出する。例えば、骨髄腫細胞の発現において、ＣＤ３８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ２０が増加する。Ｒｕｉｚ−Ａｒｕｇｅｌｌｅｓ ＧＪ ａｎｄ Ｓａｎ Ｍｉｇｕｅｌ ＪＦ，Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．６９：６８４−９０（１９９４）。

【0220】

これらの因子の放出を測定する種々の技術は、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９８），前出に記載されている。Ｕｎｋｅｌｅｓｓら（１９７４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：４２９５−４３０５；Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ａｎｄ Ｂｅｅｒｓ（１９７６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：５６９４−５７０２；Ｗｈｕｒら（１９８０）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４２：３０５−３１２；Ｇｕｌｌｉｎｏ”Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｔｕｍｏｒ ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒｇｒｏｗｔｈ”ｐｐ．１７８−１８４ ｉｎ Ｍｉｈｉｃｈ（ｅｄ．１９８５）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｌｅｎｕｍ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：１１１−１３０も参照のこと。

【0221】

（治療方法）
（自己免疫疾患の治療）
１つの態様では、本発明は、白血球を本明細書中に記載のＣＳ１のアンタゴニストに接触させる工程を含む、白血球の増殖、付着、分化、活性化、および／または同時活性化を減少させる方法に関する。

【0222】

別の態様では、本発明は、白血球を本明細書中に記載のＣＳ１のアンタゴニストに接触させる工程を含む、リンパ球（Ｂ細胞など）による免疫グロブリンの分泌（または産生）を減少させる方法に関する。本発明のアンタゴニストは、免疫グロブリン（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥなど）の産生を少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％減少させることができる。第１の用量の抗体の投与前（０日目）の免疫グロブリン濃度を投与後（ｘ日目）の免疫グロブリン濃度から引き、これを第１の用量前（０日目）の免疫グロブリン濃度で割り、１００を掛けることにより変化率を計算する（例えば、［（ｘ日目−０日目）／０日目］×１００）。

【0223】

さらに別の態様では、本発明は、細胞を本明細書中に記載のＣＳ１に対する抗体と接触させる工程を含む、ＣＳ１を発現する細胞のアポトーシスまたは細胞溶解を誘導する方法に関する。好ましい実施形態では、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介して誘導される。一般に、本発明の抗体は、エフェクター細胞（ナチュラルキラー細胞またはマクロファージなど）の存在下で標的細胞（ＣＳ１を発現する細胞）の表面上の抗原に結合する。エフェクター細胞上のＦｃ受容体は、結合した抗体を認識する。Ｆｃ受容体の架橋は、エフェクター細胞に細胞溶解またはアポトーシスによって標的細胞を死滅させるように合図する。溶解細胞からの標識または乳酸デヒドロゲナーゼの放出の検出または標的細胞の生存性の減少の検出（例えば、アネキシンアッセイ）によって細胞溶解を検出することができる。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイによってアポトーシスアッセイを行うことができる（Ｌａｚｅｂｎｉｋら，Ｎａｔｕｒｅ：３７１，３４６（１９９４））。Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の細胞傷害性検出キットなどの当該分野で公知の検出キットによって細胞傷害性を直接検出することもできる。好ましくは、本発明の抗体は、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または８０％の細胞傷害性を誘導する。実施例に開示の方法によって比率を計算する。

【0224】

アンタゴニストを、インビトロ（白血球を培養する細胞培養環境へのアンタゴニストの添加など）、エキソビボ、またはインビボ（例えば、被験体へのアンタゴニストの投与）で白血球と接触させることができる。

【0225】

好ましい実施形態では、白血球は、ａ）活性化リンパ球（Ｂ細胞および／またはＴ細胞、好ましくはＣＤ１９^＋Ｂ細胞および／またはＣＤ３^＋Ｔ細胞など）、ｂ）ＣＤ１４^＋活性化細胞および／またはナイーブ細胞、ｃ）活性化および／または非活性化樹状細胞、および／またはｃ）ＣＤ５６^＋ＮＫおよび／またはＮＫＴ細胞である。

【0226】

好ましい態様では、本発明は、被験体に有効量のＣＳ１のアンタゴニストを投与する工程を含む、必要とする被験体のＢ細胞による免疫グロブリン分泌を減少させる方法を提供する。

【0227】

別の好ましい態様では、本発明は、被験体に有効量のＣＳ１のアンタゴニストを投与する工程を含む、必要とする被験体のＣＳ１発現細胞の細部傷害性、細胞溶解、および／またはアポトーシスを誘導する方法を提供する。

【0228】

アンタゴニスト、好ましくは本発明の抗体を、自己免疫疾患（アジソン病、耳の自己免疫疾患、眼の自己免疫疾患（ブドウ膜炎など）、自己免疫性肝炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、乾癬、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、潰瘍性大腸炎、および／または血管炎が含まれるが、これらに限定されない）の予防または治療に使用することができる。

【0229】

好ましい実施形態では、本発明の方法で予防および／または治療することができる自己免疫疾患は、ＳＬＥ、ＲＡ、またはＩＢＤである。ＳＬＥ、ＲＡ、またはＩＢＤの症状が発症した被験体への投与後、抗ＣＳ１抗体が症状の重症度を軽減することができるはずである。あるいは、被験体がＳＬＥ、ＲＡ、またはＩＢＤの任意の臨床症状が発症する前に抗ＣＳ１抗体を被験体に投与することができる。このような抗体の予防的投与により、任意のＳＬＥ、ＲＡ、またはＩＢＤを発症する被験体を完全に予防するか、少なくとも抗体治療を行わない病態ほど重篤な症状から被験体が予防されるはずである。当該分野で公知のＳＬＥ、ＲＡ、またはＩＢＤの標準的な臨床試験（抗ＤＮＡ抗体、タンパク尿、および患者の死亡率など）によって、ＳＬＥ、ＲＡ、またはＩＢＤの症状の重症度を測定することができる。

【0230】

治療方法を、通常、ヒト患者に適用するが、他の哺乳動物に適用することができる。

【0231】

（癌治療）
骨髄腫細胞を骨髄腫タンパク質のアンタゴニスト、好ましくは抗体または他のアンタゴニスト（本明細書中に記載のＣＳ１抗体など）と接触させる工程を含む、骨髄腫細胞の増殖減少させるための治療方法も含まれる。例えば、抗体を、インビトロ（骨髄腫細胞を培養する細胞培養環境へのアンタゴニストの添加など）、エキソビボ、またはインビボ（例えば、被験体へのアンタゴニストの投与）で骨髄腫細胞と接触させることができる。別の態様では、本発明は、有効量の骨髄腫タンパク質アンタゴニストを被験体に投与する工程を含む、骨髄腫細胞の増殖を減少させる方法を提供する。

【0232】

１つの態様では、好ましくは本発明の抗体を、骨髄腫の予防または治療に使用することができる。骨髄腫の症状が発症した被験体への投与後、抗体またはアンタゴニストが症状の重症度を軽減することができるはずである。あるいは、被験体が骨髄腫の任意の臨床症状が発症する前に本発明の抗体を被験体に投与することができる。当該分野で公知の骨髄腫の標準的な臨床試験（骨密度Ｘ線分析、β−２ミクログロブリンレベル、または高カルシウム血症など）によって、骨髄腫の症状の重症度を測定することができる。治療方法を、通常、ヒト患者に適用するが、他の哺乳動物に適用することができる。

【0233】

さらに別の態様では、本発明は、細胞を本明細書中に記載のＣＳ１に対する抗体に接触させる工程を含む、ＣＳ１を発現する細胞のアポトーシスまたは細胞溶解を誘導する方法に関する。好ましい実施形態では、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）によって誘導する。一般に、本発明の抗体は、エフェクター細胞（ナチュラルキラー細胞またはマクロファージなど）の存在下で標的細胞（ＣＳ１を発現する細胞）の表面上の抗原に結合する。エフェクター細胞上のＦｃ受容体は、結合した抗体を認識する。Ｆｃ受容体の架橋は、エフェクター細胞に細胞溶解またはアポトーシスによって標的細胞を死滅させるように合図する。溶解細胞からの標識または乳酸デヒドロゲナーゼの放出の検出のまたは標的細胞の生存性の減少の検出（例えば、アネキシンアッセイ）によって細胞溶解を検出することができる。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイによってアポトーシスアッセイを行うことができる（Ｌａｚｅｂｎｉｋら，Ｎａｔｕｒｅ：３７１，３４６（１９９４））。Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の細胞傷害性検出キットなどの当該分野で公知の検出キットによって細胞傷害性を直接検出することもできる。好ましくは、本発明の抗体は、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または８０％の細胞傷害性を誘導する。実施例に開示の方法によって比率を計算する。

【0234】

アンタゴニストを、インビトロ（白血球を培養する細胞培養環境へのアンタゴニストの添加など）、エキソビボ、またはインビボ（例えば、被験体へのアンタゴニストの投与）で白血球と接触させることができる。

【0235】

好ましい実施形態では、白血球は、ａ）活性化リンパ球（Ｂ細胞および／またはＴ細胞、好ましくはＣＤ１９^＋Ｂ細胞および／またはＣＤ３^＋Ｔ細胞など）、ｂ）ＣＤ１４^＋活性化細胞および／またはナイーブ細胞、ｃ）活性化および／または非活性化樹状細胞、および／またはｃ）ＣＤ５６^＋ＮＫおよび／またはＮＫＴ細胞である。

【0236】

好ましい態様では、本発明は、被験体に有効量のＣＳ１のアンタゴニストを投与する工程を含む、必要とする被験体のＢ細胞による免疫グロブリン分泌を減少させる方法を提供する。このようなＢ細胞による免疫グロブリン分泌の減少は、骨髄腫の合併症（過粘稠血症候群が含まれる）の寛解の一助となり得る。

【0237】

本発明の別の好ましい態様は、有効量のＣＳ１の抗体を被験体に投与する工程を含む、必要な被験体のＣＳ１を発現する細胞の細胞傷害性、細胞溶解、および／またはアポトーシスの誘導方法を提供する。

【0238】

（治療薬の投与）
アンタゴニスト（例えば、本発明の抗体）の種々の投与方法が存在する。非経口投与が好ましい。抗体を、ボーラスとして患者に静脈内に投与するか、長期間の連続注入によるか、筋肉内、皮下、腹腔内、または脳脊髄内に投与することができる。経口経路、局所経路、吸入経路、または当業者に公知の他の送達手段も本発明に含まれる。

【0239】

本発明の薬学的組成物は、一般に、許容可能なキャリア、好ましくは水性キャリアに溶解したアンタゴニスト（例えば、抗体）またはそのカクテルの溶液を含む。種々の水性キャリア（例えば、注射用の水（ＷＦＩ）またはリン酸、クエン酸、酢酸などで典型的にはｐＨ５．０〜８．０、最も頻繁には６．０〜７．０に緩衝化し、そして／または等張にするために塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩を添加した水）を使用することができる。キャリアはまた、活性タンパク質を保護するためのヒト血清アルブミン、ポリソルベート８０、糖、またはアミノ酸などの賦形剤を含み得る。これらの処方物中のアンタゴニスト（例えば、抗体）の濃度は、約０．１〜１００ｍｇ／ｍｌで広範に変化するが、たいてい１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲である。処方されたモノクローナル抗体は、非経口投与に特に有用であるが、静脈内注入、皮下、筋肉内、または静脈内注射によって投与することができる。非経口投与可能な組成物の実際の調製方法は当業者に公知であるか自明であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１５ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）（本明細書中で参考として援用される）により詳細に記載されている。本発明は、本明細書中に記載の抗体の任意の１つ含む薬学的組成物を提供する。

【0240】

ＣＳ１とその細胞基質との間の相互作用の阻害、罹患細胞の付着の阻害、または上記障害の臨床症状の防止および／または軽減を含む予防および／または治療上の処置のために組成物を投与することができる。これらの所望の効果の任意の１つを達成するための適量を、「有効量」と定義する。単回または複数回投与によって抗体を送達させることができる。

【0241】

疾患治療の目的で、アンタゴニスト（例えば、抗体）の適切な投薬量は、疾患の重症度および経路、患者の病歴および反応、抗体の毒性、および主治医の判断に依存する。１回または一連の治療で患者にアンタゴニストを適切に投与する。最初の候補投薬量を患者に投与することができる。当業者に公知の従来技術を使用した治療の進行状態のモニタリングによって適切な投薬量および治療計画を確立することができる。

【0242】

さらに、アンタゴニスト（抗体など）を、実質的に純粋な形態で単独で使用するか、当業者に公知の自己免疫疾患用治療薬と共に使用することができる。抗体での治療と組み合わせて使用することができる他の治療には、アンチセンス核酸分子または生物製剤（さらなる治療抗体など）の投与が含まれる。したがって、本発明の治療薬を、自己免疫疾患の別の治療薬を連続的または組み合わせて投与可能な様式で処方する。自己免疫疾患および骨髄腫の治療のために、たいてい抗体を１つまたは複数の他の免疫抑制薬および免疫調節薬の投与後または組み合わせて投与する。

【0243】

（診断および／または予後適用で使用するためのキット）
上記で示唆した診断および研究で使用するために、本発明はキットも提供する。診断および研究への適用では、このようなキットには、少なくとも１つの以下を含む：アッセイ試薬、緩衝液、ＣＳ１特異的核酸もしくは抗体、ハイブリッド形成プローブおよび／またはプライマー、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ドミナントネガティブなＣＳ１ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、ＣＳ１関連配列の分子インヒビターなど。

【0244】

さらに、キットは、本発明の方法の実施のための説明書（例えば、プロトコール）を含む説明書類を含み得る。説明書類は、典型的には、文書または印刷物を含むが、これらに限定されない。本発明は、このような説明書を保存してエンドユーザーに伝達する媒体を意図する。このような媒体には、電子保存媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）および光媒体（例えば、ＣＤＲＯＭ）などが含まれるが、これらに限定されない。このような媒体は、このような説明書類を提供するインターネットサイトのアドレスを含み得る。

【0245】

本発明はまた、ＣＳ１関連配列のモジュレーターのスクリーニング用キットを提供する。このようなキットを、容易に利用可能な材料および試薬から調製することができる。例えば、このようなキットは、１つまたは複数の以下の材料を含み得る：ＣＳ１会合ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、反応チューブ、およびＣＳ１関連活性試験のための説明書。任意選択的に、キットは、生物活性ＣＳ１タンパク質を含む。意図するキットのユーザーおよびユーザーの特定のニーズに依存して、本発明にしたがって広範なキットおよび成分を調製することができる。診断は、典型的には、複数の遺伝子または産物の評価を含む。典型的には、遺伝子を、病歴または転帰データで同定することができる疾患の重要なパラメータとの相関に基づいて選択する。

【実施例】

【0246】

（実施例１：ＣＳ１の単離および同定）
正常な健常成体の末梢血由来のＢ細胞サブセット（ナイーブ対記憶細胞＋血漿Ｂ細胞（ｐｌａｓｍａ Ｂ ｃｅｌｌｓ））のｃＤＮＡサブトラクションライブラリーからＣＳ１を同定した。ＣＳ１は、記憶細胞および血漿Ｂ細胞の間で優先的に発現する。下記のプロトコールによってサブトラクションライブラリーを作製した。

【0247】

（Ｂ細胞サブセットの単離：）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的なＦｉｃｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ勾配を使用して９人の健常な成人ドナーから単離した。下記の標準的な陰性選択プロトコールによりＰＢＭＣからＢ細胞を単離した。精製マウス抗ヒトＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６６、およびグリコホリンＡの抗体カクテル中でＰＢＭＣをインキュベートした。インキュベーションおよび洗浄後、ヤギ抗マウス磁性Ｄｙｎａｌビーズを、７〜１０ビーズ／細胞で添加した。その後、上清中の富化Ｂ細胞を遊離するために標準的なＤｙｎａｌ磁性ホルダーを使用して抗体結合細胞を単離した。次いで、回収した上清を、ＲＰＭＩ＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で洗浄した。

【0248】

（Ｂ細胞サブセット（ナイーブ対記憶細胞＋血漿Ｂ細胞（ｐｌａｓｍａ Ｂ ｃｅｌｌｓ））の分取：）
Ｄｙｎａｌ富化Ｂ細胞を、ＩｇＤ−ＦＩＴＣ、ＣＤ３８−ｃｙｃｈｒｏｍｅ、ＣＤ１９−ＡＰＣ、およびＣＤ２７−ＰＥで染色し、その後標準的な染色プロトコールで染色した。ナイーブＢ細胞（ＩｇＤ^＋ＣＤ１９^＋ＣＤ３８^{ｉｎｔ／−}ＣＤ２７⁻）対記憶細胞および血漿Ｂ細胞（ＩｇＤ⁻ＣＤ１９^＋ＣＤ３８^{ｉｎｔ／＋}ＣＤ２７^＋）の２つの個別の集団を、ｓｐｅｃｔｒａ ｐｈｙｓｉｃｓ社製の空冷アルゴンレーザ（４８８ｎｍ）および６３５ｎｍのダイオードレーザならびにＦＩＴＣ（５３０／４０ｎｍ）、ＰＥ（５８０／３０ｎｍ）、ＡＰＣ（６７０／２０ｎｍ）、およびサイクローム（ＰＥ−Ｃｙ５）（６７０／３０ｎｍ）検出用のフィルターを備えたＭｏＦｌｏ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ−ＭＬＳで分取した。分取したＢ細胞を、純度についてＭｏＦｌｏ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで分析し、９７％（記憶細胞および血漿Ｂ細胞）および９８％（ナイーブＢ細胞）の純度であることが見出された。分取した細胞を、Ｔｒｉｚｏｌ中に入れ、−７０℃で保存した。

【0249】

（ｃＤＮＡライブラリーの産生）
ｃＤＮＡサブトラクションライブラリーを、標準的なＲＤＡ法（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）であるサブトラクションハイブリッド形成プロトコールの使用によって分取Ｂ細胞サブセットから作製した。サブトラクションライブラリーは、ナイーブｃＤＮＡを２回差し引く場合は記憶細胞＋血漿Ｂ細胞ｃＤＮＡライブラリーを含み、記憶＋血漿ｃＤＮＡを２回差し引く場合はナイーブＢ細胞ｃＤＮＡライブラリーを含む。標準的な分子生物学技術を使用して、ｃＤＮＡサブトラクションライブラリーを標準的なプラスミドベクターにライゲーションし、エレクトロコンピテントＥ．コリ（ＤＨ−１０Ｂ）細胞に形質転換する。形質転換Ｅ．コリ細胞を、分泌抗体の存在下でＬＢ寒天プレートにプレートした。１つの細菌コロニー（それぞれ１つの特異的インサートを示す）を、標準的なコロニーＰＣＲを使用して増幅した。

【0250】

（差分発現のスクリーニングおよび確認）
ｃＤＮＡサブトラクションライブラリーインサートを変性し、２つの同一のナイロンフィルターにブロッティングし、２つの異なる標識された変性プローブ−（記憶＋血漿）−（ナイーブｃＤＮＡ）（２回差し引く）およびナイーブ−（記憶＋血漿）ｃＤＮＡ（２回差し引く）と個別にハイブリッド形成した。インサートが２つのプローブのうちの１つに選択的にハイブリッド形成する場合、サブトラクションライブラリーｃＤＮＡインサートを陽性と見なした。ＣＳ１のｃＤＮＡクローンは、（記憶＋血漿）−ナイーブｃＤＮＡプローブ（２回差し引く）と選択的にハイブリッド形成した。

【0251】

（ＣＳ１の同定）
陽性クローンで形質転換した細菌細胞を成長させ、製造者のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｆｏｒｎｉａ）にしたがって、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐキット（インビトロ診断調製物）を使用してＤＮＡを単離した。精製プラスミドを配列決定し、ＤＮＡ配列の同一性を、ＮＣＢＩデータベース検索によって決定した。

【0252】

（ＣＳ１遺伝子発現の特徴づけおよび確認）
ドットブロット分析によって選択した陽性クローン（ＣＳ１が含まれる）の優先的発現を確認した。ナイロンフィルターにスポットして分取したナイーブ対記憶細胞＋血漿Ｂ細胞から単離した等量の（非サブトラクション）ｃＤＮＡ（２０ｎｇ）を、陽性クローンのために標識ｃＤＮＡインサートとハイブリッド形成した。これらのアッセイでは、２つの個別のソート（ｎ＝９（健常成体）およびｎ＝１０健常成体、それぞれ純度は９７％超および９８％超）から得た末梢血Ｂ細胞サブセットからｃＤＮＡを合成した。フィルターを洗浄し、ハイブリッド形成プローブ由来のシグナルをオートラジオグラフィによって検出した。ｃＤＮＡが分取したナイーブ対記憶細胞＋血漿Ｂ細胞の両セットを超えて記憶細胞＋血漿Ｂ細胞ｃＤＮＡに選択的にハイブリッド形成する場合、クローンを陽性と見なす。図１Ａに示すように、データは、血漿および記憶Ｂ細胞中でＣＳ１が選択的に発現することを示した。

【0253】

（ＣＳ１はリンパ組織で主に発現する）
ドットブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入し、以下の組織：脾臓、リンパ節、骨髄、小腸、脳、肺、骨格筋、心臓、腎臓、および肝臓から作製したｐｏｌｙＡ^＋ＲＮＡから合成したｃＤＮＡから調製した。製造者の説明書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＤＩＧキット）にしたがって、ドットブロットをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＣＳ１ ＤＮＡを使用して探索し、化学発光（アルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体およびＣＤＰ−Ｓｔａｒ）によって視覚化した。図１Ｂに示すように、結果は、ＣＳ１は主にリンパ組織（脾臓、リンパ節、骨髄、および小腸−おそらくパイエル板中の残存リンパ球による）で発現し、他の非リンパ器官（脳、肺、骨格筋、心臓、腎臓、および肝臓）では存在しないか発現が低いことを示す。

【0254】

（実施例２：ＣＳ１の差分発現）
（ヒト細胞：）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的なＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ勾配からの単離によって得た。次いで、単離ＰＢＭＣを、新鮮な培養培地に２×１０^６細胞／ｍｌで再懸濁した。ＰＢＭＣを、３μｇ／ｍｌの濃度で３日間フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）または１０μｇ／ｍｌの濃度で８日間ヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）で刺激した。非
刺激コントロールＰＢＭＣを、いかなる刺激も与えずに調製した。細胞を、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびグルコース添加剤を含むＲＰＭＩ培地中、３７℃の７％ＣＯ_２中で培養した。

【0255】

（マウス細胞）
２匹のＢａｌｂ／ｃマウスから脾臓を得た。脾臓を、１００ミクロンのフィルターに入れた。細胞をばらばらにし、ＰＢＳで洗浄し、１，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。赤血球を、２ｍｌの溶解緩衝液にて３７℃で２分間溶解した。細胞を２回洗浄し、１０ｍｌの培地に再懸濁し、計数した。非刺激細胞の一部を直接凍結した。残りの細胞を、５μｇ／ｍｌの濃度のｃｏｎＡで３日間または１μｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳで３日間刺激した。細胞を、１０％ＦＢＳ、抗生物質、およびグルコース添加剤を含むＤＭＥＭ培地中で培養した。

【0256】

（狼瘡患者対年齢適合健常個体由来のＢリンパ球：）
ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ１９抗体での細胞の染色によって、狼瘡患者および健常な個体の末梢血単核細胞からＢ細胞を分取した。実施例１に記載のように、ＭｏＦＬｏ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ−ＭＬＳで細胞を分取した。ＲＮＡ分析のために、細胞を滅菌培地に回収した。

【0257】

（リアルタイムＰＣＲのための総ＲＮＡ単離：）
細胞を１回洗浄し、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）に入れ、製造者のプロトコールにしたがって総ＲＮＡを単離した。総ＲＮＡを、ＲＮアーゼ無含有ＤＮアーゼ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ）で処理した。ＤＮアーゼ消化ＲＮＡを、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで一晩沈殿させた。ＲＮＡを、７５％エタノールで洗浄し、無ヌクレアーゼ水に溶解した。単離ＲＮＡを定量し、その完全性をアガロースゲルで分析した。

【0258】

（リアルタイムＰＣＲ：）
標準的なＴａｑｍａｎ逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の使用によって、１００μｌの反応混合物中の狼瘡患者対健常な個体の分取Ｂリンパ球から総ＲＮＡ（２μｇ）を逆転写した。Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックスを使用して、ＰＣＲ反応を準備した。狼瘡患者および健常個体のｃＤＮＡ中でのＣＳ１の発現レベルを試験するために、ＣＳ１プライマーをミックス中に組み込んだ。公開された配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＭ−００１６３５、ＡＦ３９０８９４）からＣＳ１プライマーをデザインした。正規化のコントロールとしてβ−アクチンおよび１８ＳｒＲＮＡプライマーを使用した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入したＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して、プライマーをデザインした。ＰＣＲ増幅産物は、ＣＳ１プライマーについては８５ｂｐであり、β−アクチンプライマーについては８４ｂｐであり、１８ＳｒＲＮＡプライマーについては６１ｂｐであった。推奨プロトコールを使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのｇｅｎｅＡｍｐ５７００ＳＤＳでリアルタイムＰＣＲを行った。

【0259】

（新規のマウスＬｙ９のリアルタイムＰＣＲ：）
標準的なＴａｑｍａｎ逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、１００μｌの反応混合物中でｃｏｎＡ、ＬＰＳ、および非刺激サンプルから総ＲＮＡ（２μｇ）を逆転写した。Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックスを使用して、ＰＣＲ反応を準備した。公開された配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ４６７９０９）から新規のマウスＬｙ９に特異的なプライマーをデザインし、刺激対非刺激ｃＤＮＡサンプル中の発現レベルを試験するために、混合物に組み込んだ。正規化のために１８ＳｒＲＮＡプライマーを使用した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入したＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して、プライマーをデザインした。ＰＣＲ増幅産物は、マウスＬｙ９プライマーについては６５ｂｐであり、１８ＳｒＲＮＡプライマーについては６１ｂｐであった。推奨プロトコールを使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＧｅｎｅＡｍｐ５７００配列検出システムでリアルタイムＰＣＲを行った。

【0260】

（マイクロアレイアッセイ：サンプル調製、標識マイクロチップ、およびフィンガープリント）
遺伝子チップを使用して、活性化および非活性化白血球集団の発現プロフィールを決定および分析した。Ｃｕｓｔｏｍ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）オリゴヌクレオチドマイクロアレイにより、約３５，０００個の固有のｍＲＮＡ転写物を調査可能である。

【0261】

記載のようにＲＮＡを単離し、遺伝子チップ分析を行った（Ｈｅｎｓｈａｌｌら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６３：４１９６−４２０３；Ｈｅｎｓｈａｌｌら（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：６００５−１２；Ｇｌｙｎｎｅら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０３：６７２−６７６；Ｚｈａｏら（２０００）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４：９８１−９９３（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。

【0262】

・ＱｉａｇｅｎのＲＮＥＡＳＹ（登録商標）キットでの総ＲＮＡからのｐｏｌｙＡ^＋ｍＲＮＡの精製または総ＲＮＡの浄化）（総ＲＮＡからのｐｏｌｙＡ^＋ｍＲＮＡの精製
Ｏｌｉｇｏｔｅｘ懸濁液を３７℃に加熱し、ＲＮＡ添加の直前に混合した。溶離緩衝液を７０℃でインキュベートした。緩衝液中に沈殿が存在する場合、２×結合緩衝液を６５℃に加熱することに留意のこと。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ Ｈａｎｄｂｏｏｋの１６ページの表２にしたがって、総ＲＮＡを、ＤＥＰＣ処理水、２×結合緩衝液、およびＯｌｉｇｏｔｅｘと混合した。混合物を６５℃で３分間インキュベートし、その後室温で１０分間インキュベートした。

【0263】

チューブを、１４，０００〜１８，０００ｇで２分間遠心分離した。遠心分離器が「ソフトな設定」を有する場合、これを使用すべきであることに留意のこと。Ｏｌｉｇｏｔｅｘペレットを破壊することなく上清を除去した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘの喪失を減少させるために少量の溶液を静置することができる。一定の満足な結合およびｐｏｌｙＡ^＋ｍＲＮＡの溶離が認められるまで、上清を保持しなければならない。

【0264】

ペレットを洗浄緩衝液ＯＷ２にゆっくりと再懸濁し、スピンカラムでピペッティングする。フルスピード（可能な場合、ソフト設定）で１分間スピンカラムを遠心分離した。遠心分離後、スピンカラムを新規の回収チューブに移し、洗浄緩衝液ＯＷ２にゆっくりと再懸濁し、本明細書中に記載のように再度遠心分離した。

【0265】

スピンカラムを新規のチューブに移し、２０〜１００μｌの予め加熱した（７０℃）溶離緩衝液で溶離した。上下のピペッティングでＯｌｉｇｏｔｅｘ樹脂をゆっくりと再懸濁し、上記のように遠心分離した。新鮮な溶離緩衝液を使用して、溶離手順を繰り返した。さもなければ、溶離体積を小さくする必要がある場合、第１の溶離のみを使用することができる。

【0266】

ブランクとして希釈溶離緩衝液を使用して、吸光度を読み取った。

【0267】

・エタノール沈殿
ｃＤＮＡ合成を進行させる前に、ｍＲＮＡを沈殿させた。いくつかの残存成分またはＯｌｉｇｏｔｅｘ精製手順由来の溶離緩衝液は、ｍＲＮＡの下流の酵素反応を阻害する。

【0268】

０．４倍体積の７．５Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃ＋２．５倍体積の冷１００％エタノールを溶離物に添加した。溶液を、−２０℃で１時間から一晩（または−７０℃で２０〜３０分間）沈殿させた。沈殿溶液を、１，４０００〜１６，０００×ｇにて４℃で３０分間遠心分離した。ペレットを０．５ｍｌの８０％エタノール（−２０℃）で洗浄し、１４，０００〜１６，０００×ｇにて室温で５分間遠心分離した。８０％エタノール洗浄を１回繰り返した。ペレットをフードで乾燥させた。（急激に吸引しないこと）。ペレットを、１μｇ／μｌの濃度のＤＥＰＣ・Ｈ_２Ｏに懸濁した。

【0269】

・ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙキットを使用した総ＲＮＡの浄化
わずか１００μｇのＲＮＡをＲＮｅａｓｙカラムに添加すればよい。無ＲＮアーゼ水でサンプル体積を１００μｌに調整し、３５０μｌの緩衝液ＲＬＴおよびその後２５０μｌエタノール（１００％）をサンプルに添加した。ピペッティング（遠心分離しないこと）によって溶液を混合し、その後サンプルをＲＮｅａｓｙミニスピンカラムに適用した。ミニスピンカラムを、１０，０００ｒｐｍ超で１５秒間遠心分離した。収率が心配な場合、カラムへの流入を繰り返して再度遠心分離することができる。

【0270】

カラムを新規の２ｍｌ回収チューブに移し、５００μｌの緩衝液ＲＰＥを添加し、１０，０００ｒｐｍ超で１５秒間遠心分離した。フロースルーを破棄した。５００μｌの緩衝液ＲＰＥをミニスピンカラムに再度添加し、１０，０００ｒｐｍ超で１５秒間遠心分離した。フロースルーを再度破棄し、最大速度で２分間遠心分離して、カラムのメンブレンを乾燥させた。カラムを新規の１．５ｍｌ回収チューブに移し、３０〜５０μｌの無ＲＮアーゼ水をカラムメンブレンに直接アプライした。カラムを１０，０００ｒｐｍ超で１分間遠心分離し、溶離を繰り返した。

【0271】

吸光度を読み取った。必要に応じて、溶離液を酢酸アンモニウムおよび２．５倍体積の１００％エタノールで沈殿させることができる。

【0272】

（Ｇｉｂｃｏの「ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」キットを使用したｃＤＮＡの作製）
・第１のｃＤＮＡ鎖の合成
出発物質として５μｇの総ＲＮＡまたは１μｇのｐｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡを使用した。総ＲＮＡのために、２μｌのＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＲＴ（ｃＤＮＡ合成のために逆転写酵素を使用するキット）を使用した（ｐｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡのために１μｌのＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＲＴを使用する）。第１の鎖合成混合物の最終体積は、２０μｌにすべきである。ＲＮＡの体積は、１０μｌを超えてはならない。ＲＮＡを、１μｌの１００ｐｍｏｌＴ７−Ｔ２４オリゴと７０℃で１０分間インキュベートした。氷上で、７μｌの（４μｌの５×第１の鎖の緩衝液、２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、および１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ）混合物を添加した。混合物を３７℃で２分間インキュベートし、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＲＴを添加した。

【0273】

混合物を３７℃で１時間インキュベートした。

【0274】

・第２の鎖の合成
第１の鎖の反応物を氷上においた。
混合物に以下を添加した。
９１μｌ ＤＥＰＣ Ｈ_２０
３０μｌ５×第２の鎖の緩衝液
３μｌ ｌＯｍＭ ｄＮＴＰ混合物
１μｌ１０Ｕ／μｌＥ．コリ ＤＮＡリガーゼ
４μｌ１０Ｕ／μｌＥ．コリ ＤＮＡポリメラーゼ
１μｌ２Ｕ／μｌＲＮアーゼＨ
２つを超えるサンプルが存在する場合、上記を混合物にすべきである。添加した混合物を、１６℃で２時間インキュベートした。

【0275】

２μｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを添加し、１６℃で５分間さらにインキュベートした。反応停止のために１０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加した。

【0276】

・ｃＤＮＡの浄化
ゲルチューブ中でのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）精製を使用して、ｃＤＮＡを浄化した。

【0277】

ＰＬＧ（フェーズロックゲル）チューブを、最大速度で３０秒間遠心分離し、新規のＰＬＧチューブに移した。同体積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを添加し、強く振った（ボルテックスしないこと）。チューブを最大速度で５分間遠心分離した。上部の水相の溶液を新規のチューブに移した。水溶液を、７．５倍体積５ＭのＮＨ４Ｏａｃおよび２．５倍体積の１００％エタノールの添加によってエタノール沈殿を行った。その直後にチューブを最大速度にて室温で２０分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを８０％冷エタノールで２回洗浄した。できるだけエタノールを除去し、ペレットを風乾した。ペレットを、３μｌの無ＲＮアーゼ水に再懸濁した。

【0278】

・インビトロ転写（ＩＶＴ）およびビオチンでの標識
１．５μｌのｃＤＮＡを、薄壁ＰＣＲチューブにピペッティングした。ＮＴＰ標識混合物を室温でＰＣＲチューブに添加した。
ＮＴＰ標識混合物：
２μｌ Ｔ７ １Ｏ×ＡＴＰ（７５ｍＭ）（Ａｍｂｉｏｎ）
２μｌ Ｔ７ １０×ＧＴＰ（７５ｍＭ）（Ａｍｂｉｏｎ）
１．５μｌ Ｔ７ ｌＯ×ＣＴＰ（７５ｍＭ）（Ａｍｂｉｏｎ）
１．５μｌ Ｔ７ ｌＯ×ＵＴＰ（７５ｍＭ）（Ａｍｂｉｏｎ）
３．７５μｌ １０ ｍＭ Ｂｉｏ−１１−ＣＴＰ
０．７５μｌ １０ ｍＭ Ｂｉｏ−１６−ＵＴＰ
２μｌ ｌＯ×Ｔ７転写緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）
２μｌ １０×Ｔ７酵素混合物（Ａｍｂｉｏｎ）
全反応の最終体積は２０μｌであった。チューブをＰＣＲ機器中、３７℃で６時間インキュベートした。

【0279】

（ＩＶＴ産物のＲＮｅａｓｙの浄化）
手順については上記を参照のこと。

【0280】

標識ｃＲＮＡをエタノール沈殿させ、断片化ステップに適合する体積に再懸濁した。

【0281】

・断片化
以下の技術を使用して、約１５μｇの標識ＲＮＡを断片化した。ハイブリッド形成緩衝液のマグネシウムが沈殿する問題のために、断片化反応体積を約１０μｌの体積に最小化するが、２０μｌを超えないようにした。

【0282】

１×断片化緩衝液中での９４℃で３５分間のインキュベーションによってＲＮＡを断片
化した。
５×断片化緩衝液：
２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ８．１）
５００ｍＭ ＫＯＡｃ
１５０ｍＭ ＭｇＯＡｃ
断片化の前後に標識ＲＮＡ転写物を分析した。サンプルを６５℃で１５分間加熱し、転写物のサイズ範囲をほぼ把握するために１％アガロース／ＴＢＥゲルで電気泳動を行った。

【0283】

・マイクロチップアレイ
全実験で使用したＥＯＳ ＨｕＯ３マイクロチップアレイは、ヒトゲノムの第１のドラフトに基づいた既知のエクソンおよびＦＧＥＮＥＳＨ推定エクソンを含む４６，０００個の固有の配列を示す５９，６８０個のプローブセットを含むカスタマイズしたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｃ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）オリゴヌクレオチドアレイである。Ｈｕ０３プローブセットは、完全適合プローブのみからなり、ほとんどのプローブセットは６〜７個のプローブを有する。

【0284】

・マイクロチップアレイ上へのハイブリッド形成
２００μｌ（１０μｇのｃＲＮＡ）のハイブリッド形成混合物を、チップ上にピペッティングした。複数のハイブリッド形成を行う場合（５チップセットによるサイクリングなど）、３００μｌまたはそれ以上の最初のハイブリッド形成混合物を作製することを勧める。
ハイブリッド形成混合物：断片化標識ＲＮＡ（最終濃度５０ｎｇ／μｌ）
５０ｐＭ ９４８−ｂコントロールオリゴ
１．５ｐＭ ＢｉｏＢ
５ｐＭ ＢｉｏＣ
２５ｐＭ ＢｉｏＤ
１００ｐＭ ＣＲＥ
０．ｌｍｇ／ｍｌ ニシン精子ＤＮＡ
０．５ｍｇ／ｍｌ アセチル化ＢＳＡ
上記をｌ×ＭＥＳハイブリッド形成緩衝液で３００μｌにする
フィコエリトリン抱合ストレプトアビジンを使用して、ハイブリッド形成シグナルを視覚化した。

【0285】

・遺伝子発現データの正規化
所望のγ分布に実験による強度の累積分布をマッピングするための逆γ関数を使用して、固定γ分布に対する各アレイ由来のプローブレベル強度の適合によって、遺伝子発現データを正規化した。この手順は、１つまたは複数のパラメータよりもむしろ強度の全分布を固定するという点でストリンジェントであること以外は、標準値への各チップの平均およびＳＤの固定などの他のチップあたりの正規化手順に類似する。チップあたりの正規化の目的は、非生物因子（すなわち、技術上のノイズ）に起因するという想定の下にチップ間の変動を除去することである。任意の平均値３００を含む分布が得られるように分布についてのスケールパラメータを選択し、良好なサンプル中で認められる経験分布の典型的な形状を再現するために０．８１の形状パラメータを選択した。

【0286】

平均強度の１つの基準を、構成性プローブの強度のテューキーの３項平均を使用して各プローブセットについて計算した。３項平均は、外れ値の影響に耐える中心傾向の基準である。最後に、非特異的ハイブリッド形成を補正するために各平均強度基準からバックグラウンドを差し引いた。乱雑な配列を含む４９１プローブセットからなる「ヌル」プローブセットの平均強度基準を、チップ上の他の全プローブセットから差し引いた。

【0287】

本明細書中で使用した産物についての解説書は、その全体が本明細書中で参考として援用される。

【0288】

（本明細書中に提供される標識化プロトコール）
ハイブリッド形成反応：
非ビオチン化ＩＶＴ（ＲＮｅａｓｙカラムで精製）から開始する（組織からＩＶＴへのステップについては実施例１を参照のこと）
ＩＶＴアンチセンスＲＮＡ；４μｇ： μｌ
ランダム六量体（１μｇ／μｌ）： ４μｌ
Ｈ_２０： μｌ
全体積： １４μｌ
−７０℃で１０分間インキュベートする。氷上に置く。

【0289】

逆転写：
５×第１の鎖の緩衝液（ＢＲＬ）： ６μｌ
０．１Ｍ ＤＴＴ： ３μｌ
５０×ｄＮＴＰ混合物： ０．６μｌ
Ｈ_２０： ２．４μｌ
Ｃｙ３またはＣｙ５ ｄＵＴＰ（１ｍＭ）： ３μｌ
ＳＳ ＲＴ ＩＩ（ＢＲＬ）： １μｌ
全体積： １６μｌ
−ハイブリッド形成反応物に添加する。
−４２℃で３０分間インキュベートする。
−１μｌＳＳＩＩを添加し、さらに１時間静置する。
氷上に置く。
−５０×ｄＮＴＰ混合物（２５ｍＭの冷ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ、ｌＯｍＭのｄＴＴＰ：２５μｌの各１００ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ；１０μｌの１００ｍＭ ｄＴＴＰ、Ｈ２０で１５μｌにする）
ＲＮＡ分解：
−１．５μｌ１Ｍ ＮａＯＨ／２ｍＭ ＥＤＴＡを添加し、６５℃で１０分間インキュベートする。
Ｈ^２０ ８６μｌ
１０Ｎ ＮａＯＨ １０μｌ
５０ｍＭ ＥＤＴＡ ４μｌ
Ｕ−Ｃｏｎ３０
５００μｌのＴＥ／サンプルを７０００ｇで１０分間スピンし、精製のためにフロースルーを保存する。

【0290】

Ｑｉａｇｅｎ精製：
−ｕ−ｃｏｎ回収物質を５００μｌの緩衝液ＰＢに懸濁する。
−ｗ／ノーマルＱｉａｇｅｎプロトコールを進める。

【0291】

ＤＮアーゼ消化：
−１μｌの１００倍希釈のＤＮアーゼ／３０μｌ Ｒｘを添加し、３７℃で１５分間インキュベートする。
−９５℃で５分間酵素を変性させる。

【0292】

サンプル調製：
−以下を添加する：
Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ： １０μｌ
５０×ｄＮＴＰｓ： １μｌ
２０×ＳＳＣ： ２．３μｌ
ピロリン酸ナトリウム： ７．５μｌ
１０ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ（１μｌの１０倍希釈物）
最終体積： ２１．８μｌ
−高速吸引で乾燥させる。
−１５μｌＨ^２Ｏに再懸濁する。
−０．３８μｌの１０％ＳＤＳを添加する。
−９５℃で２分間加熱する。
−室温で２０分間ゆっくり冷却する。
スライドに置き、６４℃で一晩ハイブリッド形成させる。

【0293】

ハイブリッド形成後の洗浄：
３×ＳＳＣ／０．０３％ＳＤＳ：３７．５ｍｌの２０×ＳＳＣ＋０．７５ｍｌの１０％ＳＤＳを含む２５０ｍｌのＨ_２０で２分間。
１×ＳＳＣ：１２．５ｍｌの２０×ＳＳＣを含む２５０ｍｌのＨ_２０で５分間。
０．２×ＳＳＣ：２．５ｍｌの２０×ＳＳＣを含む２５０ｍｌのＨ_２０で５分間。
スライドを、１０００ＲＰＭで１分間の遠心分離で乾燥させる。

【0294】

適切な行電子増倍管設定および蛍光チャネルでスキャンする。
ＣＳ１は白血球中で過剰発現するが、種々の非リンパ組織型では過剰発現しない
ＣＳ１の発現プロフィールを評価するために、白血球および他の組織から単離したｍＲＮＡを、リアルタイムＰＣＲによって分析した。図２Ａに示すように、ｍＲＮＡ発現レベルは、ほとんどの他の正常な成体組織よりも白血球が遥かに高い。ベースラインを超えるＣＳ１発現を示さない他の正常生体組織には、脂肪、副腎、大動脈、大動脈弁、虫垂、冠状動脈、膀胱、骨、骨髄、乳房、気管支、子宮頸部、脳、脊髄、横隔膜、子宮内膜、精巣上体、食道、胆嚢、神経節、心臓、喉頭、唇、肝臓、肺、筋肉、子宮筋層、迷走神経、網、口腔粘膜、卵巣、膵臓、副甲状腺、咽頭粘膜、胎盤、前立腺、網膜、唾液線、皮膚、胃、滑膜、精巣、胸腺、甲状腺、舌、気管、臍帯、尿管、子宮、膣、または静脈が含まれていた。ＣＳ１ ｍＲＮＡは、結腸（２／１１）、腎臓（１／２０）、小腸（１／３）、脾臓、および扁桃腺（２／４）の選択されたサンプル中で発現した。結果は、ＣＳ１は白血球で主に発現し、自己免疫疾患の良好な標的であることを示した。
ＣＳ１発現は複数の活性化白血球集団で増加する
ＣＳ１発現と白血球の活性化との間の相関を評価するために、複数の活性化および非活性化白血球集団におけるＣＳ１ｍＲＮＡ発現を分析した。図２Ｂに示すように、対応する非活性化コントロール集団と比較して、活性化Ｂ細胞、成熟ＤＣ細胞、活性化ＣＤ３細胞（低レベルから中程度の増加）、活性化ＣＤ４細胞（低レベルの増加）、および活性化ＣＤ８細胞（低レベルから中程度の増加、ドナーによる）でＣＳ１発現が増加した。これらの結果は、ＣＳ１の過剰発現はいくつかの白血球サブセットの活性化と相関することを示した。

【0295】

（実施例３：ＣＳ１に対するモノクローナル抗体の生成のための抗原の産生。
クローニング：）
ＣＳ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、ＣＳ１の細胞外ドメイン（ＣＳ１ ＥＣＤ）に隣接するプライマーを使用して、Ｒａｊｉ細胞から単離した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＩｇＧ３の定常領域（ヒトＦｃ−γ３）をコードするベクターにライゲーションした。ＣＳ１ ＥＣＤ−Ｆｃγ３を含むプラスミドを大量に精製し、ＤＮＡ配列決定によって確認した。

【0296】

（ＣＳ１ ＥＣＤ−Ｆｃγ３の安定なトランスフェクション：）
５０μｇのＣＳ１ ＥＣＤ−Ｆｃγ３プラスミドをＦｓｐ１酵素で線状化し、ＤＮＡをエタノール中に沈殿させ、洗浄し、５００μｌの滅菌ＰＢＳに再懸濁した。ＮＳＯ細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳあたり２×１０^７個を再懸濁した。１×１０^７個の細胞をトランスフェクションに使用した。

【0297】

５００μｌのＮＳＯ細胞を、５００μｌのＤＮＡを含むＰＢＳと合わせた。細胞を１．５Ｖおよび３μＦに設定したＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ ｐｕｌｅｒによるエレクトロポレーションに供した。細胞を１００ｍｌのＤＭＥＭ完全培地に添加し、１０個の９６ウェルプレートにプレートした。トランスフェクションから２４時間後に１μｇ／ｍｌのミコフェノール酸選択培地を添加した。１０日後に陽性トランスフェクタントをスクリーニングし、４８および２４ウェルプレートに拡大した。陽性トランスフェクタントを再度スクリーニングし、高産生のものをタンパク質精製のために拡大した。

【0298】

（ＣＳ１ ＥＣＤ−Ｆｃγ３タンパク質の精製：）
ＣＳ１−ＥＣＤＦｃγ３融合タンパク質を発現する安定なトランスフェクタントを、グルコース添加剤を含む６００ｍｌのＤＭＥＭ完全培地に５日間拡大した。融合タンパク質を、プロテインＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムで精製し、１×ＰＢＳに対して透析した。ＣＳ１ ＥＣＤ−Ｆｃγ３の還元および非還元形態を、クーマシーによって分析した。ＣＳ１ ＥＣＤＦｃγ３を抗ＨｕＩｇＧを使用したウェスタンブロットによっても分析し、Ｎ末端配列決定によって確認した。精製ＣＳ１−Ｆｃ−γ３融合タンパク質を使用してマ
ウスを免役化した。

【0299】

（ＣＳ１ ＥＣＤ−ｍｙｃ−ＧＰＩ融合タンパク質の産生：）
ＣＳ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、ＣＳ１の細胞外ドメインに隣接するプライマーを使用して、Ｒａｊｉ細胞から単離した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、細胞表面発現のためのｍｙｃタグおよびグリコシルホスファチジルイノシトール結合を発現するベクター（ｍｙｃ−ＧＰＩベクター）にライゲーションした。ＣＳ１ ＥＣＤ−ｍｙｃ−ＧＰＩを含むプラスミドを大量に精製し、ＤＮＡ配列決定によって確認した。

【0300】

（ＣＳ１ ＥＣＤ−ｍｙｃ−ＧＰＩの安定なトランスフェクション）
５０μｇのＣＳ１ ＥＣＤ−ｍｙｃ−ＧＰＩプラスミドをＦｓｐ１酵素で線状化し、ＤＮＡをエタノール中に沈殿させ、洗浄し、５００μｌの滅菌ＰＢＳに再懸濁した。ＮＳＯ細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳあたり２×１０^８個を再懸濁した。１×１０^８個の細胞をトランスフェクションに使用した。

【0301】

５００μｌのＮＳＯ細胞を、５００μｌのＤＮＡを含むＰＢＳと合わせた。細胞を１．５Ｖおよび３μＦに設定したＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ ｐｕｌｅｒによるエレクトロポレーションに供した。細胞を、１μｇ／ｍｌのミコフェノール酸選択培地と共に５％ＣＯ_２中にて３７℃で成長させ、その後９６ウェルプレートにサブクローン化した。陽性トランスフェクタントを抗ｍｙｃ抗体でスクリーニングした。高産生のＣＳ１ ＥＣＤ−ｍｙｃ−ＧＰＩトランスフェクタントを選択し、インビトロアッセイのために拡大した。

【0302】

（実施例３：抗ＣＳ１モノクローナル抗体の産生）
（ヒトＣＳ１の免疫原：）
精製組換えヒトＣＳ１ ＥＣＤ−γ３融合タンパク質を使用して、足蹠を介してＢａｌｂ／ｃマウスを免役化した（ＣＳ１ ＥＣＤは、上記のＣＳ１の細胞外ドメインをいう）。簡単に述べれば、マウスの後足蹠に全体積が２５μｌの同量のＲｉｂｉアジュバントを含む１０μｇのタンパク質で免役化した。足蹠免疫化を、４〜５日間隔で４回行った。

【0303】

ａ．細胞融合：
ＣＳ１−ＥＣＤ−γ３で免役化した２匹のマウスを屠殺した。マウスから大腿および仙骨のリンパ節を取出した。組織からリンパ球を単離し、標準的な手順によってハイブリドーマを作製した。簡単に述べれば、リンパ球とマウス骨髄腫細胞株（ＮＳＯ細胞）との間のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００媒介融合によってハイブリドーマを作製した。融合細胞を、１０^７細胞／プレートの密度で９６ウェルプレートにプレートした。ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地を使用して、融合細胞を選択した。

【0304】

ｂ．ハイブリドーマのスクリーニング
ハイブリドーマによって分泌された抗体の特異性を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）ベースのＣＳ１発現細胞への結合アッセイによって決定した。標準的なプロトコールを使用して、ＦＡＣＳアッセイを行った。表面ＣＳ１細胞外ドメインを発現するＮＳＯ安定トランスフェクタント（２×１０^５）を、５０μｌのハイブリドーマ培養上清を含む５０μｌの氷冷ＰＢＳに氷上で１時間再懸濁した。強い洗浄後、細胞を、フィコエリトリン抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ特異的抗体と氷上で１時間インキュベートした。細胞を再度洗浄し、細胞表面結合抗体を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎを使用したＦＡＣＳによって検出した。表１に示すように、抗体：Ｌｕｃ２、Ｌｕｃ３、Ｌｕｃｌ５、Ｌｕｃ２０、Ｌｕｃ２２、Ｌｕｃ２３、Ｌｕｃ２９、Ｌｕｃ３２、Ｌｕｃ３４、Ｌｕｃ３５、Ｌｕｃ３７、Ｌｕｃ３８、Ｌｕｃ３９、Ｌｕｃ５６、Ｌｕｃ６０、Ｌｕｃ６３、またはＬｕｃ９０は、ＣＳ１でトランスフェクトしたＮＳＯ−ＣＳ１細胞に強く結合するが、ＮＳＯ−ＦｃＲｎには結合しなかった。抗ヒトＣＳ１抗体は、Ｋ５６２およびＤａｕｄｉ細胞（天然のＣＳ１を発現することが公知）に結合したが、陰性コントロールであるＪｕｒｋａｔ細胞には結合しなかった。データは、産生された抗ＣＳ１抗体がＣＳ１と特異的に結合することができることを示す。ＣＳ１−γ３融合タンパク質対陰性コントロールであるＡＲ−Ｇ３（γ３融合タンパク質）へのＬｕｃ抗体の結合のアッセイ（ＥＬＩＳＡによる）由来の結果も表に示した。Ｌｕｃ抗体は、ＣＳ１−γ３に特異的に結合したが、陰性コントロールＡＲ−γ３融合タンパク質には結合しなかった。

【0305】

【表1】

（産生した抗ＣＳ１モノクローナル抗体のアミノ酸配列）
抗体重鎖および軽鎖可変領域を、標準的な技術を使用してクローン化した。簡単に述べれば、１〜５×１０^６個の細胞由来の総ＲＮＡを使用し、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥｃＤＮＡ増幅キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してｃＤＮＡを調製し、マウス重鎖および軽鎖定常領域に相補的な遺伝子特異的プライマーを使用して、可変領域をＰＣＲで増幅した。

【0306】

抗体Ｌｕｃ９０、Ｌｕｃ６３、およびＬｕｃ３４の成熟重鎖および成熟軽鎖のアミノ酸配列を、表４に示す。

【0307】

（実施例４：ＣＳ１抗体の特徴づけ）
フローサイトメトリー競合アッセイを使用して、１５の異なる抗ＣＳ１モノクローナル抗体のエピトープ特異性を決定した。表面ＣＳ１を発現するＮＳＯ安定トランスフェクタント（２×１０^５）を、５０μｌの抗ＣＳ１抗体（Ｌｕｃ２３、Ｌｕｃ２９、Ｌｕｃ３４、Ｌｕｃ３５、Ｌｕｃ３７、Ｌｕｃ３８、Ｌｕｃ６３、およびＬｕｃ９０の対合組み合わせ（ｐａｉｒｗｉｓｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が含まれる）と共に氷上で１時間インキュベートした。並行して、陰性コントロールとしてイソ型コントロール抗体（ＡＩＰ−１３）を使用した。１μｇ／ｍｌのビオチン化抗ＣＳ１モノクローナル抗体（Ｌｕｃ２３、Ｌｕｃ３４、Ｌｕｃ３７、Ｌｕｃ３８、Ｌｕｃ６３、およびＬｕｃ９０）を、細胞／抗体混合物と共に氷上でさらに３０分間インキュベートした。強い洗浄後、細胞を、フィコエリトリン抱合ストレプトアビジンと氷上で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、細胞表面結合ビオチン化抗体を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎを使用したＦＡＣＳによって検出した。

【0308】

非標識抗体（Ｌｕｃ２３、Ｌｕｃ３４、Ｌｕｃ３７、Ｌｕｃ３８、Ｌｕｃ６３、およびＬｕｃ９０）を、互いに１５μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、および０．６μｇ／ｍｌの濃度で競合する能力について試験し、１μｇ／ｍｌの競合抗体または遮断抗体を添加した。ＣＳ１と結合せず、且ついかなるＬｕｃ抗体とも競合しないので、ＡＩＰ−１３を陰性コントロールとして使用した。ビオチン化抗体の蛍光レベル（平均蛍光強度）（ＭＦＩ）を図に示す。ＭＦＩの有意な減少は、コントロール抗体のＭＦＩと比較して、Ｍａｂによるビオチン化抗ＣＳ１対非標識抗ＣＳ１ Ｍａｂによって細胞表面ＣＳ１を少なくとも５０％競合した。

【0309】

図３は、遮断Ｌｕｃモノクローナル抗体を１５μｇ／ｍｌおよび３μｇ／ｍｌの濃度で使用した場合のＬｕｃ抗体間の競合アッセイの結果の例を示す。競合アッセイは、いくつかのＬｕｃ抗体が異なるエピトープと接触することを示した。Ｌｕｃ３８は、Ｌｕｃ３７、２３、９０、および６３のエピトープと異なるエピトープと接触する。Ｌｕｃ６３は、Ｌｕｃ３７、２３、９０、および３８エピトープと異なる個別の非重複エピトープと接触する。Ｌｕｃ９０は、Ｌｕｃ３７、２３、６３、および３８のエピトープと異なる、異なる非重複エピトープと接触する。Ｌｕｃ２３は、Ｌｕｃ９０、６３、３８のエピトープと異なる別の非重複エピトープと接触する。Ｌｕｃ３７は、Ｌｕｃ９０、６３、３８と接触するエピトープと異なるさらなる非重複エピトープと接触する。Ｌｕｃ６３は、Ｌｕｃ３４と重複するエピトープに接触し、Ｌｕｃ９０はＬｕｃ３４と重複するエピトープと接触する。Ｌｕｃ３７は、Ｌｕｃ２３のエピトープと重複するエピトープと接触する。Ｌｕｃ３４は全Ｌｕｃ抗体の結合を遮断するか有意に減少させ、広範な露呈したエピトープと接触し得るか、ＣＳ１に対するより高い親和性を有し得る。Ｌｕｃ３７、Ｌｕｃ２３、およびＬｕｃ３８は、Ｌｕｃ３４抗体によるＣＳ１への結合を遮断しない。Ｌｕｃ３７、Ｌｕ
ｃ２３、およびＬｕｃ３８のエピトープを、ＣＳ１二次構造内に「埋め込む」ことができるか、ＣＳ１に対する親和性がＬｕｃ３４抗体の親和性よりも低い可能性がある。

【0310】

３つのモノクローナル抗体の相対親和性もＢｉａｃｏｒｅ分析によって試験した。ヒトＣＳ１−Ｆｃ融合タンパク質と抗ヒトＣＳ１モノクローナルマウス抗体Ｌｕｃ３４．１、６３．２、および９０Ｈ１との間のＳＰＲＫｉｎｅｔｉｃｓ測定のＣＳ１ ＭＡｂの速度分析を、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して行った。異なるフローセルへの１００００ＲＵの各抗体の固定および表面上へのＣＳ１−Ｆｃの注入およびその後の最良の緩衝液が各抗体からのＣＳ１−Ｆｃのクリアランスを最適にすることが認められるまでの一連の異なる緩衝液の試験によって再生条件を確立した。１０ｍＭグリシン（ｐＨ２．０）の緩衝液が、最適な再生緩衝液であることが見出され、その直後に１０サイクルのＣＳ１−Ｆｃ注入および緩衝液再生によってその再現性について試験した。この緩衝液は、抗体表面の再生可能な再生に適切であることが見出された。したがって、１０ｍＭグリシン（ｐＨ２．０）をＣＳ１−Ｆｃおよび抗チアＢＩＡｃｏｒｅ実験のための再生緩衝液に指定した。

【0311】

自家産生ＣＳ１抗体を、ＢＩＡｃｏｒｅアミンカップリング試薬（Ｎ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド、ＥＤＣ；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ＮＨＳ；および塩酸エタノールアミン（ｐＨ８．５））によって９９．４ＲＵ〜１３３．７ＲＵの範囲の低反応単位（ＲＵ）で研究グレードのＣＭ５センサーチップに固定した。室温で流速３０μｌ／分にてアッセイを行った。３分間のＣＳ１−Ｆｃの会合段階の後に、各結合サイクルの解離をモニタリングするために、サイクルあたり異なるＣＳ１−Ｆｃ濃度のランニング緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３００ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｐ−２０（ｐＨ７．４））を１０分間注入した。１０ｍＭグリシン（ｐＨ２．０）を使用して再生表面を再生させた。各ＣＳ−Ｆｃおよび抗体対の結合速度を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｅプログラムを使用して、１２種の異なる濃度ＣＳ１−Ｆｃ（１０２４ｎＭ、５１２ｎＭ、２５６ｎＭ、１２８ｎＭ、６４ｎＭ、３２ｎＭ、１６ｎＭ、８ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、ｌｎＭ、０．５ｎＭ）から２連で回収したセノルグラム（ｓｅｎｏｒｇｒａｍ）データの大域分析から計算した。基準表面および緩衝液のみのコントロール由来のバックグラウンド応答を排除するために各分析で二重参照（ｄｏｕｂｌｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｉｎｇ）を適用した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｅソフトウェアによる二価分析物モデルを使用した一連の分析物濃度由来のセンサーグラムの会合段階および解離段階の同時適合によって結合親和性（Ｋ_Ｄ）を得た。データの標準偏差を研究するために、実験を３回行った。

【0312】

Ｌｕｃ９０．Ｈ１、Ｌｕｃ６３．２、およびＬｕｃ４３．１の結合親和性を、図４にまとめる。Ｌｕｃ９０．Ｈ１の結合親和性は、これら３つの抗体の間で最も高い。Ｌｕｃ９０．Ｈ１の結合親和性は、Ｌｕｃ６３．２の５．５倍であり、Ｌｕｃ３４．１の２８倍である。

【0313】

（抗ＣＳ１抗体での免疫組織学的染色）
ＣＳ１トランスフェクション細胞も、抗ＣＳ１抗体での免疫組織学的染色について試験した。１０μｇ／ｍｌの一次モノクローナル抗ＣＳ１抗体を、ＣＳ１でトランスフェクトした細胞に添加した。次いで、細胞を血清でブロッキングし、ビオチン抗マウスＩｇとインキュベートした。次いで、アビジン−ペルオキシダーゼを細胞と混合し、ＡＥＣ（標準的なペルオキシダーゼ試薬）で発色させた。ＡＥＣによる赤色が陽性染色を示す一方で、試験細胞の核をヘマトキシリン（青色）で対比染色した。データは、ＣＳ１トランスフェクション細胞が抗ＣＳ１抗体で陽性染色されることを示し、このことは、産生された抗ＣＳ１抗体が細胞表面上に発現したＣＳ１に結合することができることを示す（図５Ａ）。したがって、抗ＣＳ１抗体は、溶液中の末梢血細胞表面上の発現の検出だけでなく、組織切片（例えば、患者のリンパ節または組織生検）の分析で典型的に使用される免疫組織化学（ＩＨＣ）による検出での使用に適切である。

【0314】

図５Ｂは、２つの抗ＣＳ１抗体（Ｌｕｃ９０およびＬｕｃ６０）での炎症扁桃腺の免疫組織学的染色を示す。図５Ｂ中のパネルＣおよびＤは、形質細胞および上皮細胞を染色するＣＤ１３８での染色を示す。上のパネル（図５ＢのパネルＡおよびＢ）は、抗ＣＳ１抗体で染色した一連の切片を示す。染色パターンの重複から、ＣＳ１抗体が炎症扁桃腺中の形質細胞を染色することが明らかである。

【0315】

図５Ｃは、関節リウマチ患者の関節由来の滑膜組織の抗ＣＳ１Ｌｕｃ６３での免疫組織学的染色を示す。形質細胞は、ＣＤ１３８での染色によって示すように、滑膜に浸潤した（右上のパネル）。重複染色パターンから（右上のパネルと左上のパネルとの比較）、抗ＣＤ１抗体は関節リウマチ患者の関節中の形質細胞を染色することが明らかである。

【0316】

（ＣＳ１タンパク質発現パターン：）
産生されたＬｕｃ抗体を使用して、ＦＡＣＳ分析によってＣＳ１タンパク質発現をさらに試験した（図６）。標準的なＦｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ濃度勾配手順によって、健常な個体および狼瘡患者からＰＭＢＣを単離した。以下の標準的な手順に示すように、抗体でＰＭＢＣを染色した。ＰＢＭＣのヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）活性化のために、１００倍希釈のＰＷＭをＰＢＭＣに添加し、その後７％ＣＯ_２中に３７℃で８日間おいた。ＰＷＭ刺激細胞を採取し、抗体染色前に洗浄した。本明細書中で使用したマウス抗ＣＳ１抗体は、Ｌｕｃ９０（ＩｇＧ_２ｂ）、Ｌｕｃ６３、Ｌｕｃ３８、および他の産生抗ＣＳ１ Ｌｕｃ抗体である。イソ型コントロール抗体は、イソ型適合マウスＩｇＧ抗体であった。

【0317】

結果は、活性化Ｂ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（活性化およびナイーブの両方）、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６^＋）、ＮＫＴ細胞（ＣＤ５６^＋ＣＤ３^＋）、ＣＤ１４^＋／ｌｏ白血球（単球および／またはマクロファージ）、およびＣＤ４^＋Ｔ細胞（インビトロ活性化細胞において低レベル）でＣＳ１が正に発現することを示した。ＣＳ１は、健常な成体および狼瘡患者の両方由来のこれらの細胞集団で発現した。健常な成体、血小板、ＨｕＶＥＣ、腎臓細胞、気管支細胞、末梢気道細胞、前立腺細胞、肝細胞、および乳房細胞由来の非活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞ではＣＳ１タンパク質は検出されなかった。

【0318】

活性化Ｂ細胞のサンプル染色を図６に示し、この図は、ＰＷＭ活性化ＰＢＭＣの染色を太線で示し、イソ型コントロール染色および非活性化ＰＢＭＣをその下に点線で示す。治療抗体が主に標的細胞に結合し、他の細胞および組織（特に、血小板）に結合しないので
、ＣＳ１発現パターンが有意である。データにより、抗ＣＳ１抗体が適切な候補治療抗体であることが示唆される。

【0319】

（実施例５：ＣＳ１抗体のヒト化）
この実施例は、マウス抗ＣＳ１モノクローナル抗体Ｌｕｃ６３（ＭｕＬｕｃ６３）のヒト化を記載する。本質的にＱｕｅｅｎ，Ｃ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３（１９８９））にしたがって、ＭｕＬｕｃ６３のヒト化を行った。第１に、それぞれＭｕＬｕｃ６３ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列と相同性の高いヒトＶＨおよびＶＬセグメントを同定した。次に、ＣＤＲの構造維持に重要なフレームワークアミノ酸を含むＣＤＲ配列を、選択したヒトフレームワーク配列にグラフティングした。得られたヒト化モノクローナル抗体（ＨｕＬｕｃ６３）は、マウス骨髄腫細胞株ＮＳＯで発現した。ヒト化ＨｕＬｕｃ６３抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて７０．１ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０値で組換えヒトＣＳ１に結合し、これは同一アッセイにおけるＭｕＬｕｃ６３について測定した６６．１ｎｇ／ｍｌと類似し、ＨｕＬｕｃ６３がヒトＣＳ１に対する結合親和性が保持されていることを示す。

【0320】

（ＭｕＬｕｃ６３可変領域ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定）
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して、約５×１０^７個のＭｕＬｕｃ６３産生ハイブリドーマ細胞から総ＲＮＡを抽出した。供給者のプロトコールにしたがってＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ＤＮＡ増幅キットに含まれるマウスγ鎖およびκ鎖のＣ領域にそれぞれアニーリングする３’プライマーおよび５’ユニバーサルプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、重鎖および軽鎖の可変領域ｃＤＮＡを増幅した。ＶＨＰＣＲについて、３’プライマーは、配列５’−ＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡＣＡＣ−３’（配列番号５１）を有する。ＶＬＰＣＲについて、３’プライマーは、配列５’−ＴＴＣＡＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡＴＣＴＴＣＣ−３’（配列番号５２）を有する。ＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを、配列決定のためにｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローン化した。製造者の説明書にしたがって、蛍光ジデオキシ鎖ターミネーター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用したＰＣＲサイクル配列決定反応によってＤＮＡ配列決定を行った。

【0321】

各重鎖および軽鎖について４つのプラスミドクローンを配列決定した。典型的なマウス重鎖および軽鎖可変領域に相同な固有の配列を同定した。ｃＤＮＡ配列を、ＭｕＬｕｃ６３の重鎖および軽鎖のＶ領域の推定アミノ酸配列と共に表５および６に示す。
ＨｕＬｕｃ６３Ｖ領域のデザイン
Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３（１９８９））に概説のように、抗体Ｖ領域をヒト化した。第１に、コンピュータプログラムＡＢＭＯＤおよびＥＮＣＡＤ（Ｌｅｖｉｔｔ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：５９５−６２０（１９８３））の支援の下でＭｕＬｕｃ６３可変領域の分子モデルを構築した。次に、ヒト抗体のｃＤＮＡ配列についての相同性検索に基づいて、ヒトＶＨ配列Ｅ５５ ３−１４（Ｃｕｉｓｉｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍ．２３：１１０−１１８（１９９３））およびＪセグメントＪＨ１（Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．ら，Ｃｅｌｌ ２７：５８３−５９１（１９８１））を、ＨｕＬｕｃ６３重鎖可変領域のフレームワークが得られるように選択した。ＨｕＬｕｃ６３軽鎖可変領域については、ｃＤＮＡのＶＬ配列ＩＩＩ−２Ｒ（Ｍａｎｈｅｉｍｅｒ−Ｌｏｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１６３９−１６５２（１９９１））を使用した。ＭｕＬｕｃ６３のＶＨとアクセプターヒトフレームワークとの間のフレームワークアミノ酸の同一性は、８１．６％であった（７１／８７．）、一方ＭｕＬｕｃ６３のＶＬとアクセプターヒトフレームワークとの間の同一性は、７６．３％であった（６１／８１）。

【0322】

コンピュータモデルによってＣＤＲとの有意な接触が示唆されるフレームワーク位置で、元のヒトフレームワークアミノ酸をＭｕＬｕｃ６３のＶ領域由来のアミノ酸と置換した。重鎖の残基２８、４８、４９、６６、および６８でこれを行った（表７）。軽鎖については、残基６０で置換を行った（表８）。本明細書中で使用した番号づけはＫａｂａｔのものであることに留意のこと（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））。

【0323】

さらに、ＭｕＬｕｃ６３アミノ酸配列の調査により、ＶＨ領域のＣＤＲ２中の潜在的なＮ結合グリコシル化が明らかとなった。このようなＮ結合グリコシル化部位は、一般的な配列Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓ（Ｎ＝アスパラギン、Ｘ＝任意のアミノ酸、およびＳ／Ｔ＝セリンまたはトレオニン）を有する。可変ドメイン中のＮ結合グリコシル化の存在は治療抗体としてのＨｕＬｕｃ６３の発生中に悪影響を与え得るので、ヒト化デザインにおいてトレオニンをアラニンに置換する変異（Ｎ−Ｙ−Ａ）によってＣＤＲ２中の潜在的グリコシル化部位（Ｎ−Ｙ−Ｔ）を除去した。

【0324】

ＶＨおよびＶＬについてのＭｕＬｕｃ６３、ＨｕＬｕｃ６３、およびヒトアクセプターアミノ酸配列のアラインメントを、それぞれ表７および８に示す。

【0325】

（ＨｕＬｕｃ６３のＶＨおよびＶＬ遺伝子の構築）
ＨｕＬｕｃ６３のＶＨおよびＶＬをそれぞれコードする遺伝子を、シグナルペプチド、スプライスドナーシグナル、および哺乳動物発現ベクターへのその後のクローニングに適切な制限酵素を含むミニエクソンとしてデザインした。ＶＨおよびＶＬミニエクソンのスプライスドナーシグナルは、それぞれ対応するヒト生殖系列ＪＨ６およびＪＫ４配列に由来していた。ＨｕＬｕｃ６３のＶＨおよびＶＬミニエクソン中のシグナルペプチド配列は、それぞれ対応するＭｕＬｕｃ６３のＶＨおよびＶＬ配列に由来していた。Ｌｕｃ６３のＶＨおよびＶＬ遺伝子のヌクレオチド配列を、推定アミノ酸配列とともに表５および６に示す。

【0326】

３３〜４３塩基長の範囲の重複合成オリゴヌクレオチドの伸長およびＰＣＲ増幅によってＨｕＬｕｃ６３のＶＨおよびＶＬ遺伝子を構築した（Ｓｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ １６４：４９−５３（１９９５））。ＨｕＬｕｃ６３のＶＨおよびＶＬ遺伝子の合成用のオリゴヌクレオチドを表９に列挙する。

【0327】

ＰＣＲ増幅フラグメントをＱｉａｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製し、ＭｌｕＩおよびＸｂａＩで消化した。ＨｕＬｕｃ６３のＶＨ遺伝子をｐＨｕＨＣｇｌ．Ｄにサブクローン化してｐＨｕＨＣｇｌ．Ｄ−ＨｕＬｕｃ６３を作製した。ＨｕＬｕｃ６３のＶＬ遺伝子をｐＨｕＣｋａｐｐａ．ｒｇｐｔ．ｄＥ（κ軽鎖発現ベクターｐＯＫＴ３．Ｖｋ．ｒｇの誘導体）（Ｃｏｌｅ，Ｍ．Ｓ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３６１３−３６２１（１９９７））にサブクローン化して、プラスミドｐＨｕＣｋａｐｐａ．ｒｇｐｔ．ｄＥ−ＨｕＬｕｃ６３を作製した。

【0328】

（ＨｕＬｕｃ６３の発現）
組織培養細胞の一過性トランスフェクションによってＨｕＬｕｃ６３ ＩｇＧ１／κ抗体を産生した。ヒト胚腎臓細胞株２９３−Ｈ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）および非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で維持した。標準的な培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋非必須アミノ酸）を使用して、トランスフェクションの前日に、１×１０^６細胞／ウェルで６ウェルプレートに２．５ｍｌの体積で２９３−Ｈ細胞をプレートした。トランスフェクションの当日に、ウェルあたり４μｇのプラスミドＤＮＡを、２５０μｌのハイブリドーマ−ＳＦＭ（Ｈ−ＳＦＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で希釈した。ウェルあたり１０μｌのリポフェクタミン２０００試薬（ＬＦ２０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、２５０μｌのＨ−ＳＦＭで希釈した。希釈ＤＮＡを希釈ＬＦ２０００と組み合わせ、２０分間インキュベートして、ＤＮＡ−ＬＦ２０００複合体を形成した。５００μｌのＤＮＡ−ＬＦ２０００複合体を各ウェルに添加し、プレートを前後に傾けることによって混合した。細胞を５日間インキュベートし、その後分析のために上清を回収した。

【0329】

ＨｕＬｕｃ６３の発現をサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。Ｉｍｍｕｌｏｎ４ＨＢＸプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）を、１００μｌ／ウェルの１．８μｌ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ鎖特異的ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を含む０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４）にて４℃で一晩コーティングし、洗浄緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄し、１５０μｌ／ウェルのｓｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング緩衝液を含むＴＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）にて室温で３０分間ブロッキングした。洗浄緩衝液での洗浄後、ＨｕＬｕｃ６３を含むサンプルを、ＥＬＩＳＡ緩衝液（１％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で適切に希釈し、１００μｌ／ウェルをＥＬＩＳＡプレートに適用した。標準として、ヒト化抗ＣＤ３３ＩｇＧ１／κモノクローナル抗体ＨｕＭ１９５（Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１１４９−１１５４（１９９２））を使用した。プレートの室温で１時間のインキュベーションおよび洗浄緩衝液での洗浄後、結合した抗体を、１００μｌ／ウェルの１０００倍希釈のＨＲＰ抱合ヤギ抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を使用して検出した。室温で１時間のインキュベーションおよび洗浄緩衝液での洗浄後、１００μｌ／ウェルのＡＢＴＳ基質（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の添加によって発色させた。１００μｌ／ウェルの２％シュウ酸の添加によって発色を停止させた。ＶｅｒｓａＭａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、４１５ｎｍでの吸光度を読み取った。

【0330】

（ＭｕＬｕｃ６３およびＨｕＬｕｃ６３の結合特性）
ヒトＣＳ１に対するＭｕＬｕｃ６３およびＨｕＬｕｃ６３の親和性を、直接結合ＥＬＩＳＡによって分析した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ ＨＢＸプレート、Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）のウェルを、１００μｌの１μｇ／ｍｌ可溶性ヒトＣＳ１−ヒトＦｃγ３融合タンパク質を含むＰＢＳにて室温で一晩コーティングした。洗浄緩衝液での洗浄後、ウェルを１５０μｌのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液にて室温で３０分間ブロッキングした。一過性に発現したＨｕＬｕｃ６３抗体または精製ＭｕＬｕｃ６３抗体を、ＥＬＩＳＡ緩衝液で適切に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに適用した（１００μｌ／ウェル）。ＥＬＩＳＡプレートを室温で１時間インキュベートし、ウェルを洗浄緩衝液で洗浄した。次いで、ＥＬＩＳＡ緩衝液で１０００倍希釈した１００μｌのＨＲＰ抱合ヤギ抗ヒトＣκ抗体またはＨＲＰ抱合ヤギ抗マウスＣκ抗体（共にｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、ＨｕＬｕｃ６３およびＭｕＬｕｃ６３プレートの各ウェルにそれぞれ添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄緩衝液での洗浄後、１００μｌのＡＢＴＳ基質（ＫＰＬ）を各ウェルに添加した。ウェルあたり１００μｌの２％シュウ酸の添加によって発色を停止させた。ＶＥＲＳＡｍａｘマイクロプレートリーダーを使用して、４１５ｎｍでの吸光度を読み取った。ＥＬＩＳＡ結合実験の結果を図７に示す。ＭｕＬｕｃ６３およびＨｕＬｕｃ６３は、ヒトＣＳ−１−Ｆｃγ３に濃度依存様式で結合する。コンピュータソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して得たＨｕＬｕｃ６３のＥＣ_５０値は７０．１ｎｇ／ｍｌであった。これは、ｍｕＬｕｃ６３について得られた６６．１ｎｇ／ｍｌのＥＣ_５０値と類似しており、マウス抗ＣＳ１モノクローナル抗体ＭｕＬｕｃ６３のヒト化が成功したことを示し、ＨｕＬｕｃ６３はヒトＣＳ１に対する高い結合親和性を保持した。ヒト化Ｌｕｃ６３可変領域モデルを図８に示す。

【0331】

（実施例６：自己免疫障害におけるＣＳ１の役割）
（ＣＳ１は非刺激細胞と比較して刺激Ｔ細胞およびＢ細胞で高度に発現する：）
ＣＳ１の発現を決定するために、ヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）およびフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）刺激を使用して末梢血Ｂリンパ球およびＴリンパ球を刺激するためのインビトロアッセイを準備した。刺激を行わない非刺激コントロール末梢血単核細胞を並行して調製した。ＰｏｌｙＡ^＋ｍＲＮＡを単離し、標準的な技術を使用して、これらのサンプルからｃＤＮＡを合成した。ＣＳ１特異的オリゴヌクレオチドプライマー（上記を参照のこと）を使用したＰＣＲによってＣＳ１遺伝子を増幅し、Ｂｉｏｒａｄ ＧｅｌＤｏｃ２０００を使用して発現を定量した。シグナル強度をコントロールヒトβ−アクチンに対して正規化した。リアルタイムＰＣＲ分析は、非刺激細胞と比較して、ＣＳ１が活性化末梢血Ｂ細胞で約２３倍上方制御され、活性化末梢血Ｔリンパ球で約３０倍上方制御されることを示した（図９）。

【0332】

（ＣＳ１は年齢適合健常成体と比較して狼瘡患者の末梢血Ｂリンパ球で上方制御される：）
健常な個体と比較した狼瘡患者のＣＳ１発現を評価するために、ＣＤ１９^＋細胞の細胞分取によって、狼瘡患者対健常成体のプールから末梢血Ｂリンパ球を単離した。ＰｏｌｙＡ^＋ｍＲＮＡを単離し、標準的な技術の使用によってｃＤＮＡを合成した。ＣＳ１に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用したリアルタイムＰＣＲによってＳ１発現を評価した。リアルタイムＰＣＲデータは、ＣＳ１が健常な個体と比較して狼瘡患者由来のＢリンパ球で約２倍上方制御されることを示した。β−アクチンでの正規化により、ＣＳ１遺伝子は、健常な個体のｃＤＮＡと比較して狼瘡患者のＢリンパ球のｃＤＮＡで２．３倍に増加した。１８Ｓ ｒＲＮＡプライマーで正規化した場合、ＣＳ１は各ｃＤＮＡサンプ
ルで１．８倍に増加した（図１０）。

【0333】

（活性化Ｂ細胞および活性化Ｔ細胞における新規のマウスＬｙ９の上方制御：）
新規のマウスＬｙ９は、ヒトＣＳ１の推奨されるオルソログである（Ｔｏｖａｒら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５４：３９４−４０２（２００２））。活性化Ｂ細胞および活性化Ｔ細胞での新規のマウスＬｙ９の発現を、リアルタイムＰＣＲを使用して試験した。データは、新規のマウスＬｙ９が活性化Ｂ細胞および活性化Ｔ細胞中で上方制御されることを示した。

【0334】

新規のマウスＬｙ９の発現を、ＡＢＩ ＧｅｎｅＡｍｐ ５７００配列検出システムを使用して分析した（実施例２を参照のこと）。１８Ｓ ｒＲＮＡプライマーで正規化した場合、Ｌｙ９遺伝子は非刺激脾臓ｃＤＮＡと比較してｃｏｎＡ刺激ｃＤＮＡで３倍に増加し、ＬＰＳ刺激ｃＤＮＡで６倍に上方制御された。

【0335】

（炎症性腸疾患組織中でのＣＳ１の上方制御）
ＩＢＤ組織（クローン病および潰瘍性大腸炎の両方）対正常組織におけるＩＢＤモジュレータータンパク質の発現を、上記のマイクロチップアレイで決定した。オリゴヌクレオチドマイクロアレイを、複数の組織由来のｃＲＮＡを使用して調査した。より詳細には、インビトロ転写アッセイ（ＩＶＴ）によって、９つのＩＢＤおよび９つの適合隣接正常腸標本ならびに２４個の結腸上皮サンプルからｃＲＮＡを作製した。遺伝子の発現レベルと正比例する平均蛍光強度（ＡＩ）によって、オリゴヌクレオチドマイクロアレイへのｃＲ
ＮＡハイブリッド形成を測定した。

【0336】

ＩＢＤ中の遺伝子発現レベルと非罹患成体の組織および器官との比較によって、データを分析した。正常組織と比較した炎症性腸疾患組織中の遺伝子発現の有意な増加によって同定した遺伝子の１つはＣＳ１である。図１１は、健常な成体の結腸上皮細胞と比較してＣＳ１遺伝子発現が潰瘍性大腸炎およびクローン病で増加することを示すマイクロアレイ分析のグラフである。健常個体と比較した炎症性腸疾患患者におけるＣＳ１発現をさらに評価するために、２人のクローン病患者および３人の潰瘍性大腸炎患者由来の大腸の罹患切片由来のサンプル対３人の健常な成人由来の正常な大腸サンプルをばらばらにし、洗浄し、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）に入れた。製造者のプロトコールにしたがって、総ＲＮＡを単離した。総ＲＮＡを、ＲＮアーゼ無含有ＤＮアーゼ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）で処置した。Ｄｎアーゼ消化ＲＮＡを、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで一晩沈殿させた。ＲＮＡを７５％エタノールで洗浄し、無ヌクレアーゼ水に溶解した。ＲＮＡを定量し、ＲＮＡの完全性をアガロースゲルで分析した。リアルタイムＰＣＲデータ（図１２）は、健常な個体（ｎ＝３）由来のプールした正常な腸と比較してＣＳ１がクローン病患者（ｎ＝２）由来の罹患大腸で７倍および６倍に上方制御され、潰瘍性大腸炎患者（ｎ＝３）由来の罹患大腸で１３倍、１４倍、および４６倍に上方制御されたことを示した。

【0337】

（実施例７：癌細胞におけるＣＳ１発現）
（ＣＳ１タンパク質の発現パターン：）
産生されたＬｕｃ抗体を使用して、ＦＡＣＳ分析によってＣＳ１タンパク質発現をさらに試験した。細胞株を、抗ＣＳ１ Ｌｕｃ９０．Ｈ１抗体またはマウスＩｇＧ２ｂイソ型コントロール抗体と氷上で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、フィコエリトリン（ＰＥ）抱合抗マウスＩｇを細胞に添加し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリーによって分析した。Ｌｕｃ９０．Ｈ１抗体由来のシグナルを重複
した太線として示したヒストグラムプロットを図１３に示す。下線は、陰性コントロール（非染色細胞、二次抗体（一次抗体を含まない抗マウスＩｇ−ＰＥ）、またはイソ型コントロール抗体）を含む。これらのデータは、ＡＲＨ−７７白血病株細胞、ＣＥＳＳおよびＩＭ９ Ｂリンパ芽球腫細胞株、ならびにＬ３６３、ＬＰ１、およびＯＰＭ２骨髄腫細胞株でＣＳ１が発現することを示す。

【0338】

多発性骨髄腫患者（ｎ＝２１、骨髄腫サンプル）、ＭＧＵＳ患者（意義不明のモノクローナル免疫グロブリン血症；ｎ＝１）、形質細胞性白血病患者（ｎ＝１）、骨髄細胞から動員されたＣＤ３４＋幹細胞（ｎ＝５）、正常な骨髄細胞（ｎ＝３）、正常なリンパ節組織（ｎ＝１）、慢性リンパ芽球性白血病患者（ＣＬＬ；ｎ＝１５）、急性骨髄性白血病患者（ＡＭＬ；ｎ＝１１）、非ホジキンリンパ腫患者（ＮＨＬ；ｎ＝１）、およびホジキンリンパ腫患者（ｎ＝１）、由来のサンプルを、ＣＳ１（Ｌｕｃ９０またはＬｕｃ６０）、ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ、ＣＤ３８−ＰＥ、および／またはＣＤ１３８−ＰＥに対するＦＩＴＣ抱合抗体とインキュベートし、上記で詳述するように骨髄腫細胞のＦＡＣＳ分析のために処理した（図１４を参照のこと）。本明細書中で使用されたマウス抗ＣＳ１抗体は、Ｌｕｃ９０（ＩｇＧ_２ｂ）、Ｌｕｃ６３（ＩｇＧ２ａ）、Ｌｕｃ３８（ＩｇＧ２ｂ）、および他の産生された抗ＣＳ１抗体である。イソ型コントロール抗体は、イソ型適合マウスＩｇＧ抗体であった。

【0339】

Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃの多発性骨髄腫患者から骨髄穿刺液を得た。骨髄腫細胞株（ＬＰ１、Ｌ３６３、ＯＰＭ２、ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＲＰＭＩ ８２２６、およびＵ２６６Ｂ１）、白血病細胞株ＡＲＨ−７７、Ｂリンパ芽球腫株（ＩＭ９，ＣＥＳＳ）、および骨髄細胞を、標準的な染色プロトコールにしたがって、抗ＣＳ１モノクローナル抗体対イソ型コントロール抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で染色した。細胞を洗浄し、染色緩衝液（ヒト細胞については１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩまたは１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）に入れ、抗ＣＳ１対イソ型コントロール抗体を、最終体積０．１ｍｌで、１００万個の細胞あたり０．５〜１μｇ添加した。患者サンプルのために、赤血球を溶解し、遠心分離で細胞をペレット化し、染色緩衝液に再懸濁した。ＦＩＴＣに直接抱合しない抗体について、第２段階の抗体を、最終体積０．１ｍｌで、１００万個の細胞あたり０．５〜１μｇ添加した。細胞を洗浄し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用したＢｅｃｔｏｎ ＤｉｃｋｉｎｓｏｎＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒによるＦＡＣＳ分析のための染色緩衝液に再懸濁した。形質細胞を区別するために、多発性骨髄腫細胞を、抗ＣＤ４５、抗シンデカン１（ＣＤ１３８）、および抗ＣＤ３８モノクローナル抗体で染色した。抗シンデカン１（ＣＤ１３８）は、形質細胞を特異的に染色し、他の白血球は染色しない。

【0340】

結果は、ＣＳ１は、多発性骨髄腫患者由来の形質細胞（例えば、ＣＤ１３８＋細胞）、形質細胞性白血病患者（図１４Ｉ）、およびいくつかの骨髄腫細胞株（Ｌ３６３、ＬＰ１、およびＯＰＭ２；図１３を参照のこと）で高度に発現することを示す。多発性骨髄腫患者由来の２１種の全ての異なる骨髄サンプルをフローによって分析し、２１サンプルのうちの全て、実質的に全ての骨髄形質細胞がＣＳ１を発現する。ＡＲＨ−７７白血病細胞およびＢリンパ芽球腫細胞株（ＩＭ９およびＣＥＳＳ）においてもＣＳ１が発現する（図１３を参照のこと）。

【0341】

（実施例８：骨髄腫患者由来の形質細胞におけるＣＳ１の発現）
多発性骨髄腫患者由来の骨髄サンプルを、ＣＤ１３８−ＰＥ、ＣＤ４５ＰｅｒＣＰ、Ｌｕｃ９０−ＦＩＴＣ、および／またはＩｇＧ２ｂ−ＦＩＴＣ（イソ型コントロール抗体）で染色し、上記で詳述するようにＦＡＣＳによって分析した（実施例５を参照のこと）。ゲーティングした細胞は以下である：ゲートＲ１はリンパ球を含み（「Ｒ１」）、ゲートＲ２は単球を含み（「Ｒ２」）、ゲートＲ３は顆粒球を含み（「Ｒ３」）、ゲートＲ４は赤血球を含み（「Ｒ４」）、ゲートＲ５は形質細胞を含み（「Ｒ５」）、ゲートＲ６は芽球を含む（「Ｒ６」）。図１５は、ＣＳ１が多発性骨髄腫患者由来の形質細胞（例えば、ＣＤ１３８＋細胞）で発現することを示す。

【0342】

（実施例９：抗ＣＳ１モノクローナル抗体は活性化末梢血Ｂ細胞によるＩｇＭ分泌を減少させる）
正常成体由来の末梢血単核細胞を、標準的なＦｉｃｏｌｌ勾配によって単離し、１０μｇ／ｍｌのヤマゴボウマイトジェン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）とインキュベートし、１ｍｌの総体積で２４ウェルプレート中にプレートした。１００μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体（マウス抗ヒトＣＳ１（Ｌｕｃ６３）またはマウスＩｇＧイソ型コントロール）をサンプルウェルに添加した。細胞および抗体を、７％ＣＯ_２中にて３７℃で８日間インキュベートした。培養物由来の上清を単離し、ＩｇＭを上記のようにＥＬＩＳＡによってアッセイした。図１６に示すように、１００μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌの抗体Ｌｕｃ６３（それぞれＰｗＬｕｃ１００およびＰｗＬｕｃ１０）は、１００μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのイソ型コントロール（それぞれＰｗＩｇ１００およびＰｗＩｇ１０）または抗体を含めずに（Ｐｗ（−））インキュベートした細胞によるＩｇＭ分泌と比較して、末梢血単核細胞のＩｇＭ分泌を減少させた。

【0343】

（抗ＣＳ１モノクローナル抗体は自己免疫疾患患者によるＩｇＭ分泌を減少させる）
（活性化末梢血Ｂ細胞：）
末梢血単核細胞の細胞培養物由来の上清を上記に詳述のように単離し、ＥＬＩＳＡによってアッセイした。Ｉｍｍｕｌｏｎ−１プレートを、１００μｌの１μｇ／ｍｌマウス抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体（カタログ番号０５−４９００、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を含むＰＢＳでコーティングした。プレートをＥＬＩＳＡ緩衝液（「ＥＢ」＝ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１時間ブロッキングした。（ＥＢでの）種々の希釈率の培養上清を１００μｌ／ウェルで添加した。上清および標準的なヒトＩｇＭ（カタログ番号００９−０００−０１２，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）を、室温で１〜２時間インキュベートした。捕捉ヒトＩｇＭを、製造者のプロトコールにしたがって、ヤギ抗ヒトＩｇＭ−ＨＲＰポリクローナル抗体（カタログ番号２０２０−０５，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａｂａｍａ）およびＨＲＰ基質で発色させた。結合したＩｇＭを、標準的なＥＬＩＳＡプレートリーダーにおける分光測光法（４０５ｎｍ ＯＤ）によって視覚化した。図１７に示すように、狼瘡患者のＰＢＭＣの分泌ＩｇＭ量は、イソ型コントロールと比較して、抗ＣＳ１抗体（Ｌｕｃ９０Ｈ１）での処理によって減少した。陽性コントロールである抗ＣＤ２抗体（ＧＬＯ１）は、抗ＣＳ１が抗ＣＤ２抗体よりもさらによりＩｇＭ抗体産生を減少させることを示した。

【0344】

（抗ＣＳ１モノクローナル抗体は健常な成体および自己免疫疾患患者由来の末梢血Ｂ細胞によるＩｇＧ産生が減少させる）
健常な成体および自己免疫疾患（狼瘡）患者由来の末梢血Ｂ細胞によるＩｇＧ産生を、ＩｇＭ産生と同一の方法で分析した。図１８に示すように、抗ＣＳ１抗体（Ｌｕｃ９０Ｈ．１）での処置から９日後の健常な成体の末梢血単核細胞による全産生は、ＩｈＧ２ｂイソ型コントロールと比較して約２３％減少した。抗ＣＳ１抗体（Ｌｕｃ９０Ｈ．１）での処置から９日後の狼瘡患者の末梢血単核細胞によるＩｇＧの全産生は、ＩｇＧ２ｂイソ型コントロールと比較して約５６％減少した。表３ＡおよびＢは、多数の作製した抗ＣＳ１抗体によるＩｇＧ産生の阻害をまとめている。表３Ａに示すように、Ｌｕｃ９０．Ｈ１は、リポ多糖またはヤマゴボウマイトジェンで活性化したＰＢＭＣによるＩｇＧ産生を約４０％減少させた。Ｌｕｃ３４．１は、ヤマゴボウマイトジェンで活性化したＰＢＭＣによるＩｇＧ産生を約３８％減少させた。表３Ｂに示すように、Ｌｕｃ９０．Ｈ１は、健常な成体および成熟Ｂ細胞株（ＩＭ９細胞）のＰＢＭＣのＩｇＧ産生を約４８％減少させた。Ｌｕｃ３４．１は、健常な成体のＰＢＭＣのＩｇＧ産生を約５３％減少させた。Ｌｕｃ６３．２は、ＰＢＭＣおよびＩＭ９細胞のＩｇＧ産生を約４７％減少させた。これらの実験から、Ｌｕｃ９０Ｈ．１、Ｌｕｃ３４．１、およびＬｕｃ６３．２が最良の機能的抗体であることが明らかである。エピトープマッピングから、Ｌｕｃ９０およびＬｕｃ６３は、非重複エピトープを有する。

【0345】

【表2】

実験結果は、抗ＣＳ１抗体はインビトロでの末梢血Ｂ細胞によるＩｇＧおよびＩｇＭ産生の両方を減少させることを示した。

【0346】

（実施例１０：ＳＣＩＤ−ＨｕＰＢＭＣマウスモデルにおけるＣＳ１モノクローナル抗体によるＩｇＧのインビボでの減少）
（ＳＣＩＤ−ＨｕＰＢＭＣマウスモデル）
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的なＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）密度勾配によって単離し、２×１０^７ＰＢＭＣ／ｍｌでリン酸緩衝化溶液（ＰＢＳ）に再懸濁した。再懸濁したＰＢＭＣ（１ｍｌ）を、Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＰＢＭＣ注射から２〜３週間後、マウスから血清サンプルを採取し、ＥＬＩＳＡによってヒトＩｇＧについてアッセイした。グラフティングしたマウス（血清中に１μｇ／ｍｌを超えるヒトＩｇＧを産生する）を、治療群に無作為に分け、マウス抗ヒトＣＳ−１モノクローナル抗体（Ｌｕｃ９０．Ｈ１またはＬｕｃ６３．２．２２）、マウスイソ型コントロール抗体（それぞれＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ２ａ）、またはＰＢＳで処置した。マウスに２００μｇの抗体を含む５００μｌＰＢＳを３〜４日毎に３回または４回投与した。マウス血清を、標準的なプロトコールを使用したＥＬＩＳＡによってヒトＩｇＧについて分析した。

【0347】

投与後のヒトＩｇＧ濃度（ｘ日目）〜第１の抗体投与前のヒトＩｇＧ濃度（０日目）を差し引き、これを第１の投与前のヒトＩｇＧ濃度（０日目）で割り、１００を掛けることによって、各マウスについての血清ヒトＩｇＧの変化率を計算した（例えば、［（ｘ日目−０日目）／０日目］×１００）。データは、各マウス群についての標準誤差を含む平均変化率を示す。ヒトＩｇＧ濃度は、各マウス群について標準誤差を含む平均濃度である。Ｗｅｌｃｈの２サンプルｔ検定を使用して、治療群のヒトＩｇＧの変化率を比較した。
抗ＣＳ１抗体はインビボでのヒトＩｇＧ産生を減少させた
データは、本発明の抗ＣＳ１抗体がＳＣＩＤ−ＨｕＰＢＭＣ導入モデルにおけるヒト免疫グロブリン産生を実質的に減少させることを示した。図１９Ａに示すように、Ｌｕｃ９０．Ｈ１が早くも４日目にＰＢＳおよびイソ型コントロールにおけるＩｇＧ産生の減少を保持した（第１の抗体投与での治療から４日後）。この減少は、７週間（３２日目）の試験期間を通して維持された。例えば、１８日目では、ヒトＩｇＧ産生は、ＩｇＧ２ｂイソ型コントロールでは２２５％増加し、ＰＢＳコントロールでは１８１％増加する一方で、ヒトＩｇＧ産生はＬｕｃ９０Ｈ．１処置で１４％減少した。Ｌｕｃ９０Ｈ．１は、コントロール群でのヒトＩｇＧ産生の１８１〜２２５％の増加をなくすだけでなく、ＩｇＧ産生をさらに１４％減少させた。２５日目で、Ｌｕｃ９０Ｈ．１は、コントロール群でのヒトＩｇＧ産生の３倍増加をなくすだけでなく、ヒトＩｇＧ産生をさらに２４％減少させた。

【0348】

Ｌｕｃ６３．２はまた、インビボでのＩｇＧ産生を有効に減少させた。図１９Ｂに示すように、Ｌｕｃ６３．２は、コントロール群（ＰＢＳおよびＩｇＧ２ａイソ型コントロール）におけるヒトＩｇＧ産生の３７〜４６％の増加をなくし、ＩｇＧ産生をさらに５９％減少させる。この同一の研究では、Ｌｕｃ９０．Ｈ１をＬｕｃ６３．２と比較し、Ｌｕｃ９０．Ｈ１は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をグラフティングしたマウスにおいて、コントロール群（ＰＢＳおよびＩｇＧ２ｂイソ型コントロール）における３７〜１１４％の増加をなくし、ＩｇＧ産生をさらに１４％減少させた。

【0349】

図１９Ｃは、ＳＣＩＤ−ＨｕＰＢＭＣモデルのＬｕｃ９０およびＬｕｃ６３処置によるＩｇ産生の減少をさらにまとめている。イソ型およびＰＢＳコントロールで処置したマウスにおけるＩｇＧ産生の減少をなくす一方で、Ｌｕｃ９０はＩｇＧ産生を１４％、２２％、２４％、および３９％さらに減少させ、Ｌｕ６３はさらに４０％および５９％減少させた。したがって、ヒトＰＢＭＣをグラフティングしたＳＣＩＤマウス（ＳＣＩＤ−ＨｕＰＢＭＣ）の抗Ｌｕｃ処置はこれらの動物の血清で通常認められるヒト免疫グロブリンの増加を完全になくすだけでなく、前処置レベルと比較してさらに減少させると結論づけることができる。

【0350】

（実施例１１：抗ＣＳ１抗体のＡＤＣＣ活性化）
（エフェクター細胞の調製：）
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（エフェクター細胞）を、標準的な密度Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）勾配を使用して、全血から単離した。細胞を洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補足したＲＰＭＩ培地に再懸濁した。

【0351】

（標的細胞の調製：）
細胞表面ＣＳ−１を発現する安定なトランスフェクタント細胞（標的細胞）を洗浄し、１％ＢＳＡを補足したＲＰＭＩ培地に再懸濁した。１００，０００細胞／ウェルの細胞を５０μｌの全体積でプレートした。種々の濃度のマウス抗ヒトＣＳ−１モノクローナル抗体（Ｌｕｃ９０．Ｈ１またはＬｕｃ６３．２．２２）またはイソ型コントロール抗体（そ
れぞれマウスＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ２ａ）を、１００μｌの最終体積で標的細胞に添加し、室温で３０分間インキュベートした。

【0352】

インキュベーション後、１００μｌのエフェクターＰＢＭＣを、２００μｌの最終体積で標的細胞に２０：１の比率で添加した。標的細胞およびエフェクター細胞を、３７℃で５時間または一晩インキュベートした。細胞を３５０×ｇで５分間遠心分離し、１００μｌ／ウェルの上清を回収し、光学的に透明な９６ウェル平底マイクロタイタープレートに移した。

【0353】

（乳酸デヒドロゲナーゼアッセイ）
上清に含まれる乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を決定するために、細胞傷害性検出キット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に含まれる１００μｌの反応混合物を各ウェルに添加し、サンプルを１５〜２５℃で３０分間までインキュベートした。このインキュベーション期間に、マイクロタイタープレートを遮光した。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４９０ｎｍのサンプルの吸光度を測定した。

【0354】

細胞媒介細胞傷害性率を決定するために、以下の式を使用してサンプルの平均吸光度を計算し、バックグラウンドコントロールを差し引いた。

【0355】

【数1】

実験コントロールは、標的細胞のみまたはエフェクター細胞のみの自発的放出であった。標的細胞を、２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（１：１）溶液中でアッセイした。

【0356】

（抗ＣＳ１抗体は抗体由来細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導する）
実験は、抗ＣＳ１抗体であるＬｕｃ６３．２およびＬｕｃ９０がＰＢＭＣ（エフェクター細胞）の存在下でＣＳ１を発現する細胞の抗体由来細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導することを示した。図２０に示すように、Ｌｕｃ９０は投与量依存性様式で細胞傷害性を誘導する。５０μｇ／ｍｌのＬｕｃ９０は、標的細胞の細胞傷害性をほぼ５０％誘導した。Ｌｕｃ６３．２は、一般に、１０〜５０μｇ／ｍｌの用量範囲で標的細胞の細胞傷害性を６０〜８０％誘導した。２つのさらなるドナーを使用して行った実験から類似の結果が得られた。

【0357】

（実施例１２：低フコースＣＳ１抗体でのＡＤＣＣ活性）
（Ｌｕｃ９０可変領域ｃＤＮＡのクローニング）
マウス可変領域（配列番号３および４）を、標準的な方法によって、Ｌｕｃ９０ハイブリドーマ細胞株からクローン化した。簡単に述べれば、総ＲＮＡを抽出し、供給者のプロトコールにしたがって、ＳＭＡＲＴ ５’−ＲＡＣＥｃＤＮＡ増幅キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して二本鎖ｃＤＮＡを合成した。配列決定のために、可変領域ｃＤＮＡのＰＣＲフラグメントを、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローン化した。各重鎖および軽鎖についていくつかのプラスミドクローンを配列決定した。典型的なマウス重鎖および軽鎖の可変領域に相同な固有の配列を同定した。

【0358】

（キメラＬｕｃ９０ＶＨおよびＶＬ発現ベクターの構築）
各Ｌｕｃ９０のＶＨおよびＶＬをそれぞれコードする遺伝子を、シグナルペプチド、スプライスドナーシグナル、Ｋｏｚａｋ開始配列、および哺乳動物発現ベクターへのその後のクローニングに適切な制限酵素を含むミニエクソンとしてデザインした。ＶＨ遺伝子またはＶＬ遺伝子のいずれかを含むＴＯＰＯベクターから、ＰＣＲのための適切な制限部位および相補物を含むようにプライマーをデザインした。ＰＣＲ増幅フラグメントを、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製し、ＭｌｕＩおよびＸｂａＩで消化した。Ｌｕｃ９０ＶＨ遺伝子をｐＨｕＨＣｇｌ．Ｄ（野生型）またはｐＨｕＨＣｇｌ．Ｄ．ＡＡ（ＢＳ変異体）にサブクローン化して、プラスミドｐＣｈｉＨｕＨＣｇｌ．Ｄ−ＭｕＬｕｃ９０ＶＨおよびｐＣｈｉＨｕＨＣｇｌ．Ｄ．ＡＡ−ＭｕＬｕｃ９０ＶＨをそれぞれ作製した。ＢＳ変異体は、Ｆｃ受容体への結合がなくなるように、ＩｇＧ１のＣＨ２領域中に２つのアミノ酸が変化している（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）（Ｘｕら，（２０００）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００：１６−２６）。Ｌｕｃ９０ＶＬ遺伝子をｐＶｋにサブクローン化してプラスミドｐＣｈｉＶｋ−ＭｕＬｕｃ９０ＶＬを作製した。重鎖および軽鎖の遺伝子を１つのプラスミドから発現することができるように、単一のプラスミド発現ベクターを作製した。重鎖ベクターをＥｃｏＲＩで消化して全重鎖領域を除去し、軽鎖ベクター中の単一のＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化した。ＢＳ変異重鎖をｐＣｈｉＶｋ−ＭｕＬｕｃ９０ＶＬベクターフラグメントと組み合わせてプラスミドｐＣｈｉＬｕｃ９０−ＢＳＫを作製し、野生型重鎖をｐＣｈｉＶｋ−ＭｕＬｕｃ９０ＶＬベクターにサブクローン化してプラスミドｐＣｈｉＬｕｃ９０−ｇｌＫを作製した。

【0359】

（キメラＬｕｃ９０の発現）
ｐＣｈｉＬｕｃ９０−ｇｌＫおよびｐＣｈｉＬｕｃ９０−ＢＳＫベクターでのＳｐ２／０細胞の安定なトランスフェクションによって、キメラＬｕｃ９０ＩｇＧｌ／κ野生型およびＢＳを産生した。ｐＣｈｉＬｕｃ９０−ｇｌＫベクターでのＹＢ２／０細胞の安定なトランスフェクションによって、低フコース抗体を産生した。ミコフェノール酸培地で陽性クローンを選択し、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。野生型クローンＡＨ４、ＢＳ変異体ＨＧ１２、および低フコースクローン５Ｅ４を、高発現について選択し、２％低Ｉｇウシ胎児血清を含むＧｉｂｃｏハイブリドーマ無血清培地に馴化させた。精製用の回転ボトル中で２リットルの培養物を成長させた。標準的なプロテインＧアフィニティカラムクロマトグラフィによって抗体を精製した。

【0360】

図２１Ａ〜Ｃは、細胞傷害性アッセイにおける低フコース抗体の効果についてのデータを示す。ＣＳ１発現細胞（安定なトランスフェクタントおよびヒト多発性骨髄腫細胞株）を、抗ＣＳ１ Ｌｕｃ９０キメラ抗体（野生型および低レベルのフコースで修飾した抗体）で処置した。抗ＣＳ１ Ｌｕｃ９０キメラ抗体は、ＣＳ１を発現する細胞の抗体依存性細胞傷害性を刺激する（図２１ＡはヒトＣＳ１を発現する安定な細胞株の細胞傷害性を示し、図２１Ｂおよび２１Ｃは２つのヒト骨髄腫細胞株（ＯＰＭ２（図２１Ｂ）およびＬ３６３（図２１Ｃ））の細胞傷害性を示す。それぞれの場合、（上記で詳述のＹＢ２／０中での成長による）低レベルのフコースを有する抗体によって有意に増強される）。

【0361】

（実施例１３：抗ＣＳ１抗体での骨髄腫の治療）
試験被験体への抗体の腹腔内注射によって、骨髄腫マウス腫瘍をインビボにて抗ＣＳ１抗体で処置した。図２２に示すように、抗ＣＳ１抗体の処置（Ｌｕｃ６３およびＬｕｃ９０）により、イソ型コントロール処置動物と比較して腫瘍サイズが減少する。この研究では、１×１０^７個の骨髄腫細胞（Ｌ３６３骨髄腫細胞株）を、ＣＢ．１７ＳＣＩＤマウスに腹腔内注射した。２週間後、腫瘍サイズが約８０ｍｍ^３に達した時に、マウスを無作為に群あたり８匹で４群に分けた。マウスを抗ＣＳ１抗体（Ｌｕｃ６３またはＬｕｃ９０）またはイソ型コントロール抗体（マウスＩｇＧ２ａまたはマウスＩｇＧ２ｂ）で処置した。マウスに８回投与でマウスあたり２００μｇの抗体を１週間に３回投与した。結果は、抗ＣＳ１抗体で処置したマウスがイソ型コントロール抗体処置マウスと比較して腫瘍体積を有意に減少させたことを示す。研究２５日目（５回投与後）までに、Ｌｕｃ６３処置マウスの平均腫瘍サイズは、ＩｇＧ２ａイソ型コントロール抗体処置マウス（平均腫瘍サイズは約８００ｍｍ^３）と比較して約１００ｍｍ^３である。Ｌｕｃ９０処置マウスの平均腫瘍サイズは、ＩｇＧ２ｂイソ型コントロール抗体処置マウス（平均腫瘍サイズは約９５０ｍｍ^３）と比較して約４００ｍｍ^３である。抗ＣＳ１ Ｌｕｃ６３で処置したマウスでは、処置から２．５週間後までに測定可能な腫瘍は認められず、腫瘍形成性細胞の排除に対するこの抗体の顕著な効果を示す。

【0362】

骨髄腫のさらなるモデル系には、蛍光標識または非標識骨髄腫細胞株または成熟Ｂ細胞株（例えば、ＡＲＨ７７、ＣＥＳＳ、ＩＭ９、Ｌ３６３、ＬＰ１、およびＯＰＭ２）を静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）に移植するか、骨に直接注射した（同所的）ＳＣＩＤマウスが含まれる。これらの株を使用して、骨髄腫動物モデル系におけるアンタゴニスト処置の効果を試験する。これらの細胞株は、抗ヒトＣＳ１抗体によって認識される抗体を発現する。動物を無作為に群に分け、抗ヒトＣＳ１抗体またはコントロール抗体（例えば、イソ型コントロール抗体）を使用した治療計画に供する。抗体をいくつかの投与量レベルで投与する（例えば、全部で９〜１０回の投与で１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量を３〜４日毎に腹腔内に注射する）。腫瘍サイズを、各治療群について１週間に２回ずつ３５〜４０日間測定する。骨髄腫の臨床症状が認められる。各マウスの死亡日を記録する。

【0363】

抗ＣＳ１抗体治療と化学療法との潜在的相乗効果を決定するための動物実験も開始する。腫瘍の異種移植片を、５０〜１００ｍｍ^３の適切なサイズに到達するまで成長させ、ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．または同所に注射したマウスについて、癌細胞を動物にグラフティングする。その時、動物を無作為に群に分け、抗ヒトＣＳ１抗体またはコントロール抗体（例えば、イソ型コントロール抗体）を使用した治療計画に供する。あるいは、動物を、標準的な化学療法薬と組み合わせた抗ヒトＣＳ１抗体またはコントロール抗体（例えば、イソ型コントロール抗体）を使用した治療（プレドニゾンおよびメルファランまたは他のアルキル化剤（例えば、シクロホスファミドまたはクロランブシル）、またはビンクリスチンの組み合わせが含まれる）、ドキソルビシンおよび高用量デキサメタゾン（ＶＡＤ）治療、または当業者に公知の他の化学療法計画に供することができる。抗体を、いくつかの投与量レベル（例えば、９〜１０回の投与で１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量を３〜４日毎に腹腔内に投与する）で投与する。有効濃度（例えば、１ｍｇ／ｋｇまたは当業者に公知の他の有効用量）の化学療法薬を３〜４日毎に腹腔内に投与する。（ｓ．ｃ．注射マウスの）腫瘍サイズを、各治療群について１週間に２回ずつ３５〜４０日間測定する。骨髄腫の臨床症状が認められ、これには、ヒト免疫グロブリンを分泌する細胞株（ＩＭ９、ＣＥＳＳ、ＡＲＨ−７７、およびＬＰ−１）を注射したマウスにおける血清免疫グロブリンが含まれる。各マウスの死亡日を記録する。化学療法の有無における抗体治療の有効性を評価する。

【0364】

上記の実施例は本発明の真の範囲を決して制限することはなく、むしろ、例示の目的のために記載していることが理解される。全ての刊行物、アクセッション番号の配列、および本明細書中で引用された特許出願は、参考として援用するために各刊行物、アクセッション番号、または特許出願が具体的且つ個別に示されるかのように本明細書中で参考として援用される。

【0365】

【表3】

【0366】

【表4】

【0367】

【表5】

【0368】

【表6】

【0369】

【表7】

【0370】

【表8】

【0371】

【表9】

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図14E】

【図14F】

【図14G】

【図14H】

【図14I】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図22】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]