特許 6042866 粘度の表現型が変化した糸状菌

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6042866

(24)【登録日】2016年11月18日

(45)【発行日】2016年12月14日

(54)【発明の名称】粘度の表現型が変化した糸状菌

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/15 20060101AFI20161206BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20161206BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/15ZNA

   C12N15/00 A

【請求項の数】20

【全頁数】47

(21)【出願番号】特願2014-506563(P2014-506563)

(86)(22)【出願日】2012年4月20日

(65)【公表番号】特表2014-513529(P2014-513529A)

(43)【公表日】2014年6月5日

(86)【国際出願番号】US2012034379

(87)【国際公開番号】WO2012145584

(87)【国際公開日】20121026

【審査請求日】2015年4月20日

(31)【優先権主張番号】61/478,162

(32)【優先日】2011年4月22日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/478,160

(32)【優先日】2011年4月22日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509240479

【氏名又は名称】ダニスコ・ユーエス・インク

(74)【代理人】

【識別番号】100071010

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 行造

(74)【代理人】

【識別番号】100118647

【弁理士】

【氏名又は名称】赤松 利昭

(74)【代理人】

【識別番号】100138438

【弁理士】

【氏名又は名称】尾首 亘聰

(74)【代理人】

【識別番号】100138519

【弁理士】

【氏名又は名称】奥谷 雅子

(74)【代理人】

【識別番号】100123892

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 忠雄

(74)【代理人】

【識別番号】100169993

【弁理士】

【氏名又は名称】今井 千裕

(74)【代理人】

【識別番号】100161539

【弁理士】

【氏名又は名称】武山 美子

(74)【復代理人】

【識別番号】100185535

【弁理士】

【氏名又は名称】逢坂 敦

(72)【発明者】

【氏名】ボディ、エリザベス・エー

(72)【発明者】

【氏名】プラット セカンド、ロバート・ジェームス

【審査官】 大久保 智之

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１４−５１３５３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１４−５１３５３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１４−５１３５３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１４−５１３５３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５３３７５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Applied and Environmental Microbiology，２００３年，69, 8，4383-4389

【文献】 J Bacteriol.，１９９８年，180, 6，1418-1424

【文献】 Eukaryot Cell.，２００９年，8, 11，1677-1691

【文献】 Eukaryot Cell.，２００８年，7, 4，584-601

【文献】 Molecular and Cellular Biochemistry，２００４年，256/257，319-327

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

親菌株に由来する糸状菌の変異菌株であって、
前記変異菌株が、前記変異菌株の細胞に、前記親菌株の細胞と比較して、機能性Ｍｐｇ１タンパク質の生成を減少させる、遺伝子変化を含み、
前記変異菌株が、ｓｆｂ３遺伝子、ｓｅｂ１遺伝子、ｇａｓ１遺伝子、ｃｒｚ１遺伝子、及びｔｐｓ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の破壊を更に含み、並びに、
前記変異菌株の細胞が、深部培養における好気性発酵の間に（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌量を必要とする、及び／又は、（ｉｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する、
変異菌株。

【請求項2】

（ａ）前記遺伝子変化が、前記親菌株中に存在するｍｐｇ１遺伝子の破壊を含む、
（ｂ）前記遺伝子変化が前記親菌株中に存在するｍｐｇ１遺伝子の破壊を含み、かつ、前記ｍｐｇ１遺伝子の破壊が前記ｍｐｇ１遺伝子の全て又は一部の欠失の結果である、
（ｃ）前記遺伝子変化が前記親菌株中に存在するｍｐｇ１遺伝子の破壊を含み、かつ、前記ｍｐｇ１遺伝子の破壊が前記ｍｐｇ１遺伝子を含むゲノムＤＮＡの一部の欠失の結果である、又は
（ｄ）前記遺伝子変化が前記親菌株中に存在するｍｐｇ１遺伝子の破壊を含み、かつ、前記ｍｐｇ１遺伝子の破壊が前記ｍｐｇ１遺伝子の突然変異誘発の結果である、
請求項１に記載の変異菌株。

【請求項3】

前記ｍｐｇ１遺伝子の破壊が、部位特異的組み換えを用いて行われる、又は
前記ｍｐｇ１遺伝子の破壊が、前記ｍｐｇ１遺伝子の遺伝子座に選択マーカーを導入することと共に行われる、
請求項２に記載の変異菌株。

【請求項4】

前記変異菌株が、機能性Ｍｐｇ１タンパク質を生成しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異菌株。

【請求項5】

前記変異菌株が、Ｍｐｇ１タンパク質を生成しない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異菌株。

【請求項6】

前記変異菌株が、前記変異菌株において生成させることが所望されるタンパク質をコード化する遺伝子を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異菌株。

【請求項7】

ｓｆｂ３遺伝子の破壊を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異菌株。

【請求項8】

前記変異菌株が、バイオマス単位量当たり、前記親菌株と実質的に同量以上の前記変異菌株において生成させることが所望されるタンパク質を生成する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異菌株。

【請求項9】

前記糸状菌が、チャワンタケ亜門（Pezizomycotina）の種である、又は
前記糸状菌が、トリコデルマ属（Trichoderma）の種である、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の変異菌株。

【請求項10】

前記糸状菌が、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）である、請求項９に記載の変異菌株。

【請求項11】

糸状菌細胞の変異菌株の作製方法であって、
遺伝子変化を糸状菌細胞の親菌株に導入する工程であり、前記遺伝子変化が、前記親菌株の細胞と比較して機能性Ｍｐｇ１タンパク質の生成を低下させるか又は抑制する、該工程、
それにより、深部培養における好気性発酵の間に（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌量を必要とする、及び／又は、（ｉｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する、変異糸状菌細胞を製造する工程、
を含み、並びに
前記遺伝子変化が、ｓｆｂ３遺伝子、ｓｅｂ１遺伝子、ｇａｓ１遺伝子、ｃｒｚ１遺伝子、及びｔｐｓ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の破壊と共に行われる、
方法。

【請求項12】

（ａ）前記遺伝子変化が、遺伝子操作を使用して親糸状菌細胞のｍｐｇ１遺伝子を破壊することを含む、
（ｂ）前記遺伝子変化が、遺伝子操作を用いて親糸状菌細胞においてｍｐｇ１遺伝子を欠失させることを含む、又は
（ｃ）前記遺伝子変化が、部位特異的遺伝子組み換えを用いて行われる、
請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

（ａ）前記ｍｐｇ１遺伝子の破壊が、前記ｍｐｇ１遺伝子の遺伝子座に選択マーカーの導入と共に行われる、又は
（ｂ）前記ｍｐｇ１遺伝子の破壊が、ｓｆｂ３遺伝子の破壊と共に行われる、
請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記変異菌株が、バイオマス単位量当たり、前記親菌株と実質的に同量、又はそれ以上の前記変異菌株において生成させることが所望されるタンパク質を生成する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記糸状菌が、チャワンタケ亜門の種である、又は
前記糸状菌が、トリコデルマ属の種である、
請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記糸状菌が、トリコデルマ・リーゼイである、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記親菌株が、前記変異菌株において生成させることが所望されるタンパク質をコード化する遺伝子を更に含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記変異菌株において生成させることが所望されるタンパク質をコード化する遺伝子が、機能性Ｍｐｇ１タンパク質の生成を低下させるか又は抑制する遺伝子変化を導入する前に前記親菌株内に存在する、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

親菌株に由来する糸状菌の変異菌株であって、
前記変異菌株が、
（ａ）前記親菌株中に存在するｍｐｇ１遺伝子の破壊を含む遺伝子変化であって、（ｉ）深部培養において、前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌の必要性、及び／又は、（ｉｉ）深部培養において、前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量の維持、をもたらす遺伝子変化、を含み、
更に、前記変異菌株が、
（ｂ）前記変異菌株において生成させることが所望されるタンパク質をコード化する遺伝子であって、前記遺伝子は（ａ）における遺伝子変化の前に前記変異菌株中に存在する遺伝子、を含み、
ここで、前記ｍｐｇ１遺伝子の破壊が、ｓｆｂ３遺伝子、ｓｅｂ１遺伝子、ｇａｓ１遺伝子、ｃｒｚ１遺伝子、及びｔｐｓ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の破壊と共に行われる、
変異菌株。

【請求項20】

（ａ）前記ｍｐｇ１遺伝子の破壊が、前記ｍｐｇ１遺伝子の遺伝子座に選択マーカーの導入と共に行われる、及び／又は
（ｂ）前記ｍｐｇ１遺伝子の破壊が、ｓｅｂ１遺伝子の破壊と共に行われる、
請求項１９に記載の変異菌株。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（優先権）
本願は、共に２０１１年４月２２日に出願された米国仮出願第６１／４７８，１６２号、同第６１／４７８，１６０号に対する優先権を主張し、これらの全文を参照により本明細書に援用する。

【0002】

（発明の分野）
本発明の菌株及び方法は、生育特性が変化した菌株変異体を生じさせる、糸状菌における遺伝子突然変異に関する。このような変異体は、（例えば、商業的用途のための酵素及び他のタンパク質又は代謝物の大量生産のための）深部培養での生育に非常に好適である。

【背景技術】

【0003】

糸状菌は、天然及び異種タンパク質を高レベルで発現させることができるので、工業、製薬、動物の健康、及び飲食品の用途のために酵素及び他のタンパク質を大量生産するのに非常に適している。糸状菌は、典型的には、培養培地（すなわち、ブロス）の中に酸素及び栄養素を導入し分配するのに適合しているバイオリアクター内での深部培養により、菌糸体として生育する。菌糸の形態的特徴は、ブロスのレオロジー特性に影響し、ひいてはバイオリアクターの性能に影響する。

【0004】

一般に、ブロスの粘度が高くなるほど酸素及び栄養素の分布が不均一になり、また培養物を撹拌するのに必要とされるエネルギーは大きくなる。場合により、ブロスの粘度は、酸素及び栄養素の溶存に有意に干渉するほど高くなり、これにより真菌の生育に悪影響を与える。加えて、粘稠なブロスを混合及び通気するのに必要とされる電力は、生成コストを有意に押し上げ、モーター及び電力供給にかかる支出を大きくする恐れがある。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

粘度の表現型を変化させる遺伝子変化を有する糸状菌に関する菌株及び方法を記載する。

【0006】

一態様では、親菌株に由来する糸状菌の変異菌株であって、前記変異菌株が、前記変異菌株の細胞に、前記親菌株の細胞と比較して、変更された量の機能性Ｍｐｇ１タンパク質を生成させる、遺伝子変化を含み、前記変異菌株の細胞が、深部培養における好気性発酵の間に（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、変更された撹拌量を変更する必要とする、及び／又は、（ｉｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、変更された溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する変異菌株を提供する。

【0007】

幾つかの実施形態では、機能性Ｍｐｇ１タンパク質の変更された量が、減少された量であり、前記変異菌株が、深部培養における好気性発酵の間に（ｉ）親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌を必要とする、及び／又は、（ｉｉ）親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する。

【0008】

幾つかの実施形態では、遺伝子変化が、親菌株内に存在するｍｐｇ１遺伝子の破壊を含む。幾つかの実施形態では、ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、ｍｐｇ１遺伝子の全て又は一部の欠失の結果である。幾つかの実施形態では、ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、ｍｐｇ１遺伝子を含むゲノムＤＮＡの一部の欠失の結果である。幾つかの実施形態では、ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、ｍｐｇ１遺伝子の突然変異誘発の結果である。

【0009】

幾つかの実施形態では、ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、部位特異的組み換えを用いて行われる。幾つかの実施形態では、ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、ｍｐｇ１遺伝子の遺伝子座に選択マーカーを導入することと共に行われる。

【0010】

幾つかの実施形態では、変異菌株は、機能性Ｍｐｇ１タンパク質を生成しない。幾つかの実施形態では、変異菌株は、Ｍｐｇ１タンパク質を生成しない。

【0011】

幾つかの実施形態では、変異菌株は、対象タンパク質をコード化する遺伝子を更に含む。幾つかの実施形態では、変異菌株は、ｓｆｂ３遺伝子の破壊を更に含む。幾つかの実施形態では、変異菌株は、ｓｅｂ１遺伝子の破壊を更に含む。幾つかの実施形態では、変異菌株は、ｓｆｂ３及びｓｅｂ１遺伝子の破壊を更に含む。幾つかの実施形態では、変異菌株は、ｓｆｂ３遺伝子、ｓｅｂ１遺伝子、ｇａｓ１遺伝子、ｃｒｚ１遺伝子、及びｔｐｓ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の破壊を更に含む。幾つかの実施形態では、変異菌株は、バイオマス単位量当たり、親菌株と実質的に同量、又はそれ以上のタンパク質を生成する。

【0012】

幾つかの実施形態では、糸状菌は、チャワンタケ亜門（Pezizomycotina）の種である。幾つかの実施形態では、糸状菌は、トリコデルマ属（Trichoderma）の種、アルペルギルス属（Aspergillus）の種、フサリウム属（Fusarium）の種、スケドスポリウム属（Scedosporium）の種、ペニシリウム属（Penicillium）の種、クリソスポリウム属（Chrysosporium）の種、セファロスポリウム属（Cephalosporium）の種、タラロマイセス属（Talaromyces）の種、ゲオスミチア属（Geosmithia）の種、及びニューロスポラ属（Neurospora）の種である。幾つかの実施形態では、糸状菌としては、限定するものではないが、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）（かつてはトリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）及びハイポクレア・ジェコリーナ（Hypocrea jecorina）として分類されていた）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・イタコニカス（Aspergillus itaconicus）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）、スケドスポリウム・プロリフィカンス（Scedosporium prolificans）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・フニクロスム（Penicillium funiculosum）、ペニシリウム・クリゾゲナム（Penicillium chrysogenum）、タラロマイセス（Talaromyces）（ゲオスミチア（Geosmithia））・エマーソニイ（emersonii）、フザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、及びクリソスポリウム・ロックンオウンズ（Chrysosporium lucknowense）を挙げることができる。幾つかの実施形態では、糸状菌は、トリコデルマ・リーゼイである。

【0013】

別の態様では、糸状菌細胞の変異菌株の作製方法であって、遺伝子変化を糸状菌細胞の親菌株に導入する工程であり、遺伝子変化が、親菌株の細胞と比較して機能性Ｍｐｇ１タンパク質の生成量を変化させる、該工程、それにより、深部培養における好気性発酵の間に（ｉ）親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、変更された撹拌量を必要とする、及び／又は、（ｉｉ）親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、変更された溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する、変異糸状菌細胞を製造する工程を含む、方法を提供する。

【0014】

幾つかの実施形態では、前記遺伝子変化が、機能性Ｍｐｇ１タンパク質の生成を低下させるか又は防ぎ、それにより、深部培養における好気性発酵の間に（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌を必要とする、及び／又は、（ｉｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する、変異糸状菌細胞を製造する。

【0015】

幾つかの実施形態では、前記遺伝子変化は、遺伝子操作を使用して、親糸状菌細胞中のｍｐｇ１遺伝子を破壊することを含む。幾つかの実施形態では、前記遺伝子変化は、遺伝子操作を使用して、親糸状菌細胞中のｍｐｇ１遺伝子を欠失させることを含む。幾つかの実施形態では、前記遺伝子変化は、部位特異的遺伝子組み換えを使用して行われる。

【0016】

幾つかの実施形態では、ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、ｍｐｇ１遺伝子の遺伝子座に選択マーカーを導入することと共に行われる。幾つかの実施形態では、ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、ｓｆｂ３遺伝子の破壊と共に行われる。幾つかの実施形態では、ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、ｓｆｂ３遺伝子、ｓｅｂ１遺伝子、ｇａｓ１遺伝子、ｃｒｚ１遺伝子、及びｔｐｓ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の破壊と共に行われる。

【0017】

幾つかの実施形態では、変異菌株は、バイオマス単位量当たり、親菌株と実質的に同量、又はそれ以上のタンパク質を生成する。

【0018】

幾つかの実施形態では、糸状菌は、チャワンタケ亜門（Pezizomycotina）の種である。幾つかの実施形態では、糸状菌は、トリコデルマ属（Trichoderma）の種、アルペルギルス属（Aspergillus）の種、フサリウム属（Fusarium）の種、スケドスポリウム属（Scedosporium）の種、ペニシリウム属（Penicillium）の種、クリソスポリウム属（Chrysosporium）の種、セファロスポリウム属（Cephalosporium）の種、タラロマイセス属（Talaromyces）の種、ゲオスミチア属（Geosmithia）の種、及びニューロスポラ属（Neurospora）の種である。幾つかの実施形態では、糸状菌としては、限定するものではないが、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）（かつてはトリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）及びハイポクレア・ジェコリーナ（Hypocrea jecorina）として分類されていた）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・イタコニカス（Aspergillus itaconicus）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）、スケドスポリウム・プロリフィカンス（Scedosporium prolificans）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・フニクロスム（Penicillium funiculosum）、ペニシリウム・クリゾゲナム（Penicillium chrysogenum）、タラロマイセス（Talaromyces）（ゲオスミチア（Geosmithia））・エマーソニイ（emersonii）、フザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、及びクリソスポリウム・ロックンオウンズ（Chrysosporium lucknowense）を挙げることができる。幾つかの実施形態では、糸状菌は、トリコデルマ・リーゼイである。

【0019】

幾つかの実施形態では、親菌株は、対象タンパク質をコード化する遺伝子を更に含む。幾つかの実施形態では、対象タンパク質をコード化する遺伝子は、機能性Ｍｐｇ１タンパク質の生成を低下させるか又は防ぐ遺伝子変化を導入する前に、親菌株内に存在する。幾つかの実施形態では、親菌株内の対象タンパク質は、内因性遺伝子又は異種遺伝子によってコード化されている。

【0020】

別の態様では、前述の変異菌株のいずれかによって生成される対象タンパク質を提供する。

【0021】

更に別の態様では、前述の方法のいずれかによって生成され、且つ前述の特性のいずれかを有する糸状菌を提供する。

【0022】

別の態様では、親菌株に由来する糸状菌の変異菌株であって、（ａ）（ｉ）深部培養において、前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌の必要性、及び／又は、（ｉｉ）深部培養において、前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量の維持、をもたらす遺伝子変化、並びに（ｂ）（ａ）における遺伝子変化の前に前記変異菌株中に存在する、対象タンパク質をコード化する遺伝子、を含む、変異菌株を提供する。

【0023】

幾つかの実施形態では、得られる変異菌株の遺伝子変化は、親菌株中に存在するｍｐｇ１遺伝子の破壊を含む。幾つかの実施形態では、ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、ｍｐｇ１遺伝子の遺伝子座に選択マーカーを導入することと共に行われる。幾つかの実施形態では、ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、ｓｆｂ３遺伝子の破壊と共に行われる。幾つかの実施形態では、ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、ｓｅｂ１遺伝子の破壊と共に行われる。幾つかの実施形態では、ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、ｓｆｂ３遺伝子、ｓｅｂ１遺伝子、ｇａｓ１遺伝子、ｃｒｚ１遺伝子、及びｔｐｓ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の破壊と共に行われる。

【0024】

本発明の変異菌株及び方法のこれらの及び他の態様及び実施形態は、添付の図を含む明細書から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】アグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のｐＲＡＴＴ ２３６ベクターのマップ。

【図2】ｍｐｇ１破壊ベクターのマップ。

【図3】ｓｅｂ１破壊ベクターのマップ。

【発明を実施するための形態】

【0026】

Ｉ．概要
本発明の菌株及び方法は、形態及び生育特性に影響する遺伝子改変のなされた糸状菌細胞の変異菌株に関する。変異細胞を深部培養で生育した場合、これらは、親菌株の細胞を含む細胞ブロスと比較して、異なるレオロジー特性を有する細胞ブロスを生成する。これらの変異菌株のうちの一部は、酵素及び他の商業的に重要なタンパク質の大量生産に非常に好適である。

【0027】

ＩＩ．用語の定義
本発明の菌株及び方法を詳細に説明するのに先立ち、明確性のために以下の用語を定義する。定義されていない用語は、関連技術において使用されるように、それらの通常の意味に従うべきである。

【0028】

本明細書で使用するとき、「トリコデルマ・リーゼイ」は、子嚢菌門（Ascomycota）チャワンタケ亜門の糸状菌を指す。この生物は、かつて、トリコデルマ・ロンギブラキアタムとして、並びにハイポクレア・ジェコリーナとしても分類されていた。

【0029】

本明細書で使用するとき、語句「糸状菌細胞の変異菌株」又は同様の語句は、例えば、遺伝子操作により、チャワンタケ亜門に属する親（若しくは参照）菌株に由来する（すなわち、親若しくは参照菌株から得られる又はこれらの菌株から入手可能である）糸状菌細胞の菌株を指す。本明細書では、親菌株及び変異菌株が、遺伝子改変、発現表現型、形態等の特定の特性を有すると記載する場合があるが、当業者は、それが、技術的には、このような特性を有する親菌株又は変異菌株の細胞であり、便宜上「菌株」と呼ばれることを理解するであろう。

【0030】

本明細書で使用するとき、用語「対象タンパク質」は、糸状菌において発現させることが所望されるポリペプチドを指す。このようなタンパク質は、酵素、基質結合タンパク質、界面活性タンパク質、構造タンパク質等であってよく、高レベルで発現することができ、且つ商業的目的のためのタンパク質であってよい。対象タンパク質は、変異体菌株及び／又は親菌株に対して内因性遺伝子又は異種遺伝子によってコード化され得る。対象タンパク質は、細胞内で発現してもよく、又は分泌タンパク質として発現してもよい。

【0031】

本明細書で使用するとき、語句「実質的に活性を有さない」又は同様の語句は、特定の活性が混和物中で検出不可能であるか又は混和物に意図された目的に干渉しない量で存在するかのいずれかであることを意味する。

【0032】

本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」（及び／又はこれらの複数形）は、ペプチド結合によって結合されているアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを指すために互換的に用いられる。アミノ酸残基については従来の一文字又は三文字コードが本明細書でも使用される。ポリマーは直鎖又は分枝鎖であってよく、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断され得る。この用語は、自然に又は介在によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば、標識成分との共役によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の１以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸等を含む）を含有するポリペプチド、並びに当該技術分野において既知の他の修飾物も定義内に含まれる。

【0033】

本明細書で使用するとき、機能的及び／又は構造的に類似するタンパク質は「関連タンパク質」であるとみなされる。このようなタンパク質は、異なる属及び／又は種の生物、あるいは更には異なる綱の生物（例えば、細菌と真菌）に由来してもよい。関連タンパク質は、一次配列分析によって決定されるか、二次若しくは三次構造分析によって決定されるか、又は免疫学的交差反応性によって決定される、ホモログも包含する。

【0034】

本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド／タンパク質誘導体」は、Ｎ−末端及びＣ−末端のいずれか若しくは両方に１つ又はそれ以上のアミノ酸を付加することにより、アミノ酸配列中の１つ又は多数の異なる部位で１つ又はそれ以上のアミノ酸を置換することにより、タンパク質のいずれか若しくは両方の末端で又はアミノ酸配列中の１つ又はそれ以上の部位で１つ又はそれ以上のアミノ酸を欠失させることにより、及び／又はアミノ酸配列中の１つ又はそれ以上の部位で１つ又はそれ以上のアミノ酸を挿入することにより、タンパク質から誘導される又は誘導可能であるタンパク質を指す。タンパク質誘導体の調製は、天然タンパク質をコード化するＤＮＡ配列を改変し、このＤＮＡ配列により好適な宿主を形質転換させ、改変されたＤＮＡ配列を発現させてタンパク質誘導体を形成することにより達成することができる。

【0035】

関連タンパク質（及び誘導体）は、「変異タンパク質」を含む。変異タンパク質は、少数のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入により参照／親タンパク質（例えば、野生型タンパク質）と異なる。変異体と親タンパク質との間で異なるアミノ酸残基の個数は１又はそれ以上であり得、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０又はそれ以上のアミノ酸残基が異なり得る。変異タンパク質は、参照タンパク質と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を共有し得る。変異タンパク質は、選択したモチーフ、ドメイン、エピトープ、保存領域等においても参照タンパク質とは異なる。

【0036】

本明細書で使用するとき、用語「類似配列」は、対象タンパク質（すなわち、元々の対象タンパク質）と同様の機能、三次構造及び／又は保存残基を提供するタンパク質を構成する配列を指す。例えば、α−へリックス又はβ−シート構造を含有するエピトープ領域では、類似配列中の置換アミノ酸は、好ましくは、同一の特異的構造を維持する。この用語は、ヌクレオチド配列並びにアミノ酸配列も指す。幾つかの実施形態では、類似配列は、置き換えアミノ酸が、類似する機能又は改善された機能を示す変異酵素を生じるように開発される。幾つかの実施形態では、所望のタンパク質におけるアミノ酸の三次構造及び／又は保存残基は、所望のセグメント若しくは断片に位置するか、又はその付近に位置する。それゆえに、目的とする部分又は断片が例えば、α−へリックス又はβ−シート構造を含有する場合、置換アミノ酸は好ましくはその特異的構造を維持する。

【0037】

本明細書で使用するとき、用語「相同タンパク質」は、参照タンパク質と同様の活性及び／又は構造を有するタンパク質を指す。ホモログが必ず進化的に関連することは意図しない。したがって、この用語は、異なる有機体から得られる同一、類似、又は対応する酵素（すなわち、構造及び機能に関して）を包含することが意図される。幾つかの実施形態では、比較タンパク質に類似する四次、三次、及び／又は一次構造を有するホモログを同定することが望ましい。幾つかの実施形態では、相同タンパク質は、比較タンパク質に類似する免疫学的応答を惹起する。幾つかの実施形態では、相同タンパク質は、所望の活性を有する酵素を生成するように遺伝子操作される。

【0038】

配列間の相同性の程度は、当該技術分野において既知である任意の好適な方法を用いて決定することができる（例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３；Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ等のプログラム；並びにＤｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７〜９５を参照されたい）。

【0039】

例えば、ＰＩＬＥＵＰは、配列相同性レベルを決定する有用なプログラムである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブペアワイズアラインメントを用いて、一群の関連する配列から複数の配列のアラインメントを行う。ＰＩＬＥＵＰは、アラインメントを行うのに使用されるクラスタリング関係を示す系統樹をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｉｔｔｌｅのプログレッシブアラインメント法の簡略化したものを使用する（Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜６０）。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ（１９８９）により記載されるものと類似のものである（ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１〜５３）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターとしては、３．００のデフォルトギャップ重みづけ（default gap weight）、０．１０のデフォルトギャップ伸長重みづけ（default gap length weight）及び重みつき末端ギャップ（weighted end gaps）が挙げられる。有用なアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０）及びＫａｒｌｉｎら（（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３〜８７）に記載されている。１つの特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０〜８０を参照されたい）。パラメーター「Ｗ」、「Ｔ」及び「Ｘ」は、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１の語長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照されたい）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ’５、Ｎ’−４、及び両菌株の比較を用いる。

【0040】

本明細書で使用するとき、少なくとも２つの核酸又はポリペプチドの文脈における語句「実質的に同様である」及び「実質的に同一である」は典型的には、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、参照（すなわち、野生型）配列と比較して、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、又は更には少なくとも約９９％の同一性又はそれ以上の同一性を有する配列を含むことを意味する。配列同一性は、標準的なパラメーターを用いて、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ及びＣＬＵＳＴＡＬ等の既知のプログラムを使用して決定され得る。（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５；Ｋａｒｉｎら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３；及びＨｉｇｇｉｎｓら（１９８８）Ｇｅｎｅ ７３：２３７〜２４４を参照されたい）。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）より公的に入手可能である。また、データベースは、ＦＡＳＴＡを用いてサーチすることができる（Ｐｅａｒｓｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４〜４８）。２つのポリペプチドが実質的に同一である一つの指標は、第一のポリペプチドが第二のポリペプチドと免疫学的に交差反応することである。典型的には、保存アミノ酸置換によって異なるポリペプチドは免疫学的に交差反応する。したがって、例えば、２つのポリペプチドが保存置換のみが異なるポリペプチド場合は、実質的に第二ポリペプチドと同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である他の指標は、２つの分子が互いにストリンジェントな条件（例えば、中程度から高度にストリンジェントな条件の範囲内）において互いにハイブリッドすることである。

【0041】

本明細書で使用するとき、用語「遺伝子」は、タンパク質又はＲＮＡをコード化し、発現を方向づける核酸を指すという点で、用語「対立遺伝子」と同義である。糸状菌の栄養型は一般に半数体であり、したがって、特定の表現型を付与するのに特定の遺伝子の単一コピー（すなわち、単一対立遺伝子）で十分である。

【0042】

本明細書で使用するとき、用語「野性型」及び「ネイティブ」は、互換的に用いられ、自然界でみられる遺伝子、タンパク質、又は菌株を指す。

【0043】

本明細書で使用するとき、「遺伝子の欠失」は、宿主細胞のゲノムから遺伝子が除去されることを指す。遺伝子が、遺伝子のコード配列に直に隣接して位置しない制御エレメント（例えば、エンハンサーエレメント）を含む場合、遺伝子の欠失は、コード配列の欠失、並びに、任意で隣接するエンハンサーエレメント（プロモーター及び／又はターミネーター配列を含むが、これらに限定されない）の欠失を指す。

【0044】

本明細書で使用するとき、「遺伝子の破壊」は、細胞が宿主内で例えばタンパク質等の機能性遺伝子産物の生成を実質的に防ぐ任意の遺伝子操作又は化学操作、すなわち、突然変異を広く指す。破壊の代表的方法としては、ポリペプチドをコード化する配列、プロモーター、エンハンサー又は他の制御エレメントを含む遺伝子の任意の部分の完全な又は部分的な欠失、あるいはその突然変異誘導が挙げられ、突然変異誘導は、置換、挿入、欠失、逆位及びこれらの組み合わせ並びに変形を包含し、これら突然変異はいずれも機能性遺伝子産物の生成を実質的に防ぐ。また、遺伝子は、ＲＮＡｉ、アンチセンス、又は遺伝子発現を消失させる任意の他の方法を用いて破壊してもよい。

【0045】

本明細書で使用するとき、用語「遺伝子操作」及び「遺伝子変化」は、互換的に用いられ、核酸配列の変更／変化を指す。変化は、核酸配列中の少なくとも１つの核酸の置換、欠失、挿入、又は化学的修飾を含んでよいが、これらに限定されない。

【0046】

本明細書で使用するとき、「好気性発酵」は、酸素の存在下での生育を指す。

【0047】

本明細書で使用するとき、用語「細胞ブロス」は、総じて、液体／深部培養における培地及び細胞を指す。

【0048】

本明細書で使用するとき、用語「細胞集団」は、液体／深部培養において存在する細胞成分（インタクトな細胞及び溶解細胞を包含する）を指す。細胞集団は、乾燥又は湿潤重量で表され得る。

【0049】

本明細書で使用するとき、用語「レオロジー」は、物質の変形及び流動に関連する物理学の一分野を指す。

【0050】

本明細書で使用するとき、「粘度」は、剪断応力又は引張応力等の機械的応力による変形に対する流体の抵抗の尺度である。本明細書の文脈では、粘度は、例えば、ローター／インペラによりもたらされるような機械的応力に対する、糸状菌を含む細胞ブロスの抵抗を指し得る。細胞ブロスの粘度は直接測定するのが困難であり得るため、予め選択された量で撹拌した場合の培養ブロスの溶存酸素量、予め選択された溶存酸素量を維持するのに必要とされる撹拌量、予め選択された溶存酸素量を維持するために細胞ブロスを撹拌するのに必要とされる電力量、又は更には固体培地上のコロニー形態といった、粘度の間接的尺度を用いてもよい。

【0051】

本明細書で使用するとき、糸状菌細胞の「粘度を変化させる」変異菌株は、親菌株により生成される等価な細胞ブロスと比較して、粘度が低下した又は増加した（すなわち、剪断又は引張応力に対する抵抗が低下した又は増加した）細胞ブロスを生成する変異菌株を指す。一般に、等価な細胞ブロスは、同等の細胞集団を含む。好ましくは、粘度を変化させる変異菌株と親菌株との間の差異は、粘度の任意の直接又は間接的尺度に関して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は更には少なくとも５０％、又はそれ以上である。糸状菌細胞ブロスの粘度を比較するための方法が本明細書に記載される。一般に、同等の（又は等価な）細胞ブロスは、同等の細胞集団を含む。

【0052】

本明細書で使用するとき、糸状菌細胞の「粘度を低下させる」変異菌株は、親菌株により生成される等価な細胞ブロスと比較して、粘度が低下した（すなわち、剪断又は引張応力に対する抵抗が低下した）細胞ブロスを生成する変異菌株を指す。好ましくは、粘度を変化させる変異菌株と親菌株との間の差異は、粘度の任意の直接又は間接的尺度に関して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は更には少なくとも５０％、又はそれ以上である。

【0053】

本明細書で使用するとき、「溶存酸素」（ＤＯ）は、体積／体積単位で測定した場合の、液体培地中に存在する酸素（Ｏ_２）の量を指す。溶存酸素レベルは、高レベル、例えば、発酵全体を通して１７０−１００％〜２０％、１００−８０％〜２０％、７０％〜２０％、６５％〜２０％、６０％〜２０％、５５％〜２０％、５０％〜２０％、４５％〜２０％、４４％〜２０％、４３％〜２０％、４２％〜２０％、４１％〜２０％、４０％〜２０％、３５％〜２０％、３０％〜２０％、及び２５％〜２０％で維持され得る。特に、溶存酸素は、発酵の開始時において高く、発酵が進行するにつれて減少してよい。溶存酸素レベルは、発酵を撹拌する、すなわちかき混ぜる量及び／又は空気若しくは酸素の添加速度によって制御することができる。培養物は、４００〜７００ｒｐｍで撹拌、すなわちかき混ぜてよく、溶存酸素レベルは、空気又は酸素の流速及びインペラ速度を変化させることによって、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、及び５５％超で維持される。

【0054】

本明細書で使用するとき、「主要な遺伝的決定基」は、他の遺伝子又はその遺伝子操作の不在下で、特定の表現型を付与するのに必要且つ十分である遺伝子又はその遺伝子操作を指す。しかし、特定の遺伝子が特定の表現型を付与するのに必要且つ十分であることは、更なる遺伝子操作によって表現型に追加の効果が達成され得る可能性を除外するものではない。

【0055】

本明細書で使用するとき、「機能性ポリペプチド／タンパク質」は、酵素活性、結合活性、表面活性特性等の活性を保有するタンパク質であって、突然変異誘導、切頭ないしは別の方法で改変されてその活性が消失又は低下していないタンパク質である。機能性ポリペプチドは、指定に従って、熱安定性又は熱不安定性であり得る。

【0056】

本明細書で使用するとき、「機能性遺伝子」は、活性な遺伝子産物を、典型的にはタンパク質等を生成するために、細胞成分により使用可能な遺伝子である。機能性遺伝子は、活性遺伝子産物を生成するために細胞成分によって用いられ得ない、又は活性遺伝子産物を生成するために細胞成分によって用いられる可能性が低いように改変されている破壊遺伝子の反対語である。

【0057】

本明細書で使用するとき、変異細胞は、変異菌株と親菌株の間のタンパク質発現の差異が約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約７％未満、約５％未満、又は更には約３％未満であるならば、親菌株と比較して「高レベルのタンパク質発現及び／又は分泌を維持又は保持している」。

【0058】

本明細書で使用するとき、宿主細胞は、これらが、野生型タンパク質に特徴的な活性、特に菌糸の伸張を促進するないしは別の方法で液体培地において糸状菌の粘度を増加させる活性を呈する機能性タンパク質／ポリペプチドの生成を防ぐように遺伝子的又は化学的に変更されているならば、「特定のタンパク質の生成を防ぐように改変」されている。このような改変としては、限定するものではないが、タンパク質（本明細書に記載の通り）をコード化する遺伝子の欠失又は破壊、コード化されるポリペプチドが上記活性を失うような遺伝子の改変、翻訳後プロセシング又は安定性に影響を与える遺伝子の改変、及びこれらの組み合わせが挙げられる。

【0059】

本明細書で使用するとき、「対象タンパク質」は、糸状菌細胞の深部培養において生成されることが所望されるタンパク質である。一般的に、対象タンパク質は、工業、製薬、動物の健康、及び飲食品用途のために商業的に重要であるので、大量に生産することが望ましい。対象タンパク質は、糸状菌により発現される多種多様な他のタンパク質とは区別されるものであり、こうした他のタンパク質は一般に製品として対象とはならず、主にバックグラウンドのタンパク質夾雑物と見なされる。

【0060】

本明細書で使用するとき、変異菌株は、変異菌株により生成されるタンパク質量の低下が、親菌株により生成されるタンパク質量と比較して２０％以下、１５％以下、１０％以下、更には５％以下であるならば、バイオマス単位量当たり、親菌株と「実質的に同量」のタンパク質を生成することになり、ここで、タンパク質量は、タンパク質生成が測定される細胞のバイオマスの合計量に対して正規化され、バイオマスは湿潤（例えば、細胞ペレットの）又は乾燥重量のいずれかで表現され得る。

【0061】

本明細書で使用するとき、変異菌株は、変異菌株により生成されるタンパク質量の増加が、親菌株と比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％以上、又はそれ以上、であるならば、親菌株よりも「バイオマス単位量当たり、実質的に多くのタンパク質」を生成することになり、ここで、タンパク質量は、タンパク質生成が測定される細胞のバイオマスの合計量に対して正規化され、バイオマスは湿潤（例えば、細胞ペレットの）又は乾燥重量のいずれかで表現され得る。

【0062】

本明細書で使用するとき、「蛍光色素」は、蛍光染料である。好ましい蛍光色素は、真菌の細胞壁中のセルロース及び／又はキチンに結合する。

【0063】

本明細書で使用するとき、単数形の冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容的に明らかに示されていない限り、複数の対象物も包含する。本明細書に引用される参考文献は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。以下の省略形／頭字語は、特に定めのない限り、以下の意味を有する。

【0064】

【表1】

【0065】

ＩＩＩ．Ｍｐｇ１タンパク質生成量が変化した糸状菌株
一態様では、親菌株に由来する糸状菌の変異菌株であって、前記変異菌株細胞に、前記親菌株の細胞と比較して、変更された量の機能性Ｍｐｇ１タンパク質を生成させる、遺伝子変化を含む、変異菌株を提供する。変異菌株の細胞は、続いて、深部培養における好気性発酵の間に親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、変更された撹拌量を必要とする、又は親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、変更された溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する。

【0066】

場合により、この遺伝子変化は、親菌株の細胞と比較して、変異菌株の細胞の機能性Ｍｐｇ１タンパク質の生成量を減少させ、得られた細胞ブロスは、親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌を必要とする、又は予め選択された撹拌量でより高い溶存酸素量を維持する。このような場合には、この変異菌株の細胞集団は、親菌株の細胞集団と比較して粘度の低下を呈するものと考えられ、このことは、実施例に記載の通り、溶存酸素量及び撹拌に関する観察を説明する。

【0067】

機能性Ｍｐｇ１タンパク質の量の減少は、親菌株中に存在するｍｐｇ１遺伝子を破壊することで生じ得る。ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、粘度を低下させる表現型を変異菌株に対して付与する主要な遺伝的決定基であるため、このような変異菌株は、ｍｐｇ１遺伝子が破壊されてさえいればよく、その一方で他の全ての遺伝子が無傷のままであってもよい。場合により、変異菌株は任意選択で、これらが由来する親菌株と比較して、追加の遺伝子変化を含み得る。このような追加の遺伝子変化は、粘度を低下させるために必須ではないが、更に粘度を低下させたり、変異菌株に他の利点を付与したりすることができる。

【0068】

ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、機能性ｍｐｇ１遺伝子産物、すなわち、Ｍｐｇ１タンパク質の発現を実質的に防ぐ任意の好適な方法を用いて行うことができる。当業者に知られている通り、破壊の代表的な方法としては、限定されないが、例えば、Ｍｐｇ１コード配列、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、又は別の制御エレメントの完全な又は部分的な欠失を含む、ｍｐｇ１遺伝子の完全な又は部分的な欠失；及びｍｐｇ１遺伝子の任意の部分を含む染色体の一部の完全な又は部分的な欠失が挙げられる。ｍｐｇ１遺伝子を破壊する特定の方法としては、ｍｐｇ１遺伝子の任意の部分−例えば、Ｍｐｇ１コード配列、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー又は別の制御エレメントにおけるヌクレオチドの置換又は挿入が挙げられる。好ましくは、欠失、挿入及び／又は置換（総じて、突然変異と称される）は、一般に特定の核酸配列を標的としない化学的変異誘導とは対照的な配列特異的分子生物学技術を用いる遺伝子操作により導入される。それにもかかわらず、化学的変異誘導をｍｐｇ１遺伝子を破壊するために用いることもできる。

【0069】

ｓｅｂ１遺伝子における突然変異は、ｍｐｇ１プロモーターの効率を低下させ、ｍｐｇ１エンハンサーの効率を低下させ、ｍｐｇ１ ｍＲＮＡのスプライシング又はエディティングに干渉し、ｍｐｇ１ ｍＲＮＡの翻訳に干渉し、Ｍｐｇ１コード配列に終止コドンを導入して完全長のＭｐｇ１タンパク質の翻訳を防ぎ、Ｍｐｇ１タンパク質のコード配列を変化させて、より活性の弱い若しくは不活性のタンパク質を生成するか又は他の核壁成分とＭｐｇ１との相互作用を低下させ、Ｍｐｇ１タンパク質のコード配列を変化させて、より不安定なタンパク質を生成させるために変化させるか又はＭｐｇ１タンパク質を破壊するための標的にし、Ｍｐｇ１タンパク質のミスフォールドを引き起こすか又は不正確に修飾をさせ（例えば、グリコシル化による）、あるいは、Ｍｐｇ１タンパク質の細胞輸送に干渉し得る。

【0070】

１つの実施形態では、これら及び他の遺伝子操作は、機能性Ｍｐｇ１タンパク質の発現を低下させるか又は防ぎ、あるいは、Ｍｐｇ１タンパク質の正常な生物活性を低下させるか又は防ぎ、それにより、粘度を低下させる表現型の生じる細胞内における形態変化を生み出す。

【0071】

他の場合には、遺伝子変化は、機能性Ｍｐｇ１タンパク質の発現を増加させ若しくは回復させ、あるいは、Ｍｐｇ１タンパク質の正常な生物活性を増加させ、それにより、粘度が増加又は回復する表現型の生じる細胞内における形態変化を生み出す。Ｍｐｇ１機能を増加又は回復させる代表的な遺伝子変化は、ｍｐｇ１遺伝子の追加のコピーｍｐｇ１を細胞中に導入する、ｍｐｇ１プロモーター、エンハンサー又は他の制御エレメントの効率を増加させる、Ｍｐｇ１タンパク質をコード化するｍＲＮＡの翻訳を増加させる、Ｍｐｇ１タンパク質をコード化するｍＲＮＡの安定性を増加させる、Ｍｐｇ１タンパク質の活性又は安定性を増加させる変化をｍｐｇ１遺伝子に導入する、他のタンパク質若しくは細胞壁成分等との相互作用を調節する変化をｍｐｇ１遺伝子に導入するものである。Ｍｐｇ１機能を増加又は回復させる他の遺伝子変化は、機能性Ｍｐｇ１タンパク質の発現を低下させるか又は防ぐ遺伝子変化の効果を逆転するものである。

【0072】

上記のように操作及び使用するための糸状菌細胞は一般に、子嚢菌門、チャワンタケ亜門からのものであり、特に栄養菌糸状態を有し且つｍｐｇ１遺伝子のホモログを含む真菌である。このような生物としては、商業的に重要な工業及び製薬タンパク質の生成に使用される糸状菌細胞が挙げられ、限定するものではないが、トリコデルマ属の種、アルペルギルス属の種、フサリウム属の種、スケドスポリウム属の種、ペニシリウム属の種、クリソスポリウム属の種、セファロスポリウム属の種、タラロマイセス属の種、ゲオスミチア属の種、及びニューロスポラ属の種が挙げられる。具体的な生物としては、限定するものではないが、トリコデルマ・リーゼイ（かつてはトリコデルマ・ロンギブラキアタム及びハイポクレア・ジェコリーナとして分類されていた）、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・フミガーツス、アスペルギルス・イタコニカス、アスペルギルス・オリザエ、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・テレウス、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ジャポニクス、スケドスポリウム・プロリフィカンス、ニューロスポラ・クラッサ、ペニシリウム・フニクロスム、ペニシリウム・クリゾゲナム、タラロマイセス（ゲオスミチア）・エマーソニイ、フザリウム・ベネナタム、及びクリソスポリウム・ロックンオウンズが挙げられる。

【0073】

Ｋｒｕｓｚｅｗｓｋａら（１９９８）Ｃｕｒ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４４５〜５０及びＺａｋｒｚｅｗｓｋａら（２００３）Ａｐｐｌｉｅｄ及びＥｎｖｉｒｏｍｎｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６９：４３８３〜８９）に記載されている通り、トリコデルマ・リーゼイ由来のＭｐｇ１（ＰＩＤ １２２５５１）は、ＧＴＰ：アルファ−Ｄ−マンノース−１−ホスフェートグアニルトランスフェラーゼをコード化する。ｍｐｇ１遺伝子の過剰発現は、タンパク質のグリコシル化の初期段階で主な調節的役割を果たし得るＧＤＰ−マンノースレベルを上昇させる。しかし、Ｍｐｇ１は、これまで形態変化、特に、低粘度表現型を生じさせる形態変化と関連していると記載されてはいない。本開示は、形態変化とＭｐｇ１との関連について実験的証拠を提供する。

【0074】

トリコデルマ・リーゼイのＭｐｇ１タンパク質（ｊｇｉ│Ｔｒｉｒｅ２│１２２５５１）のアミノ酸配列を、以下に配列番号１として示す：
ＭＫＧＬＩＬＶＧＧＦＧＴＲＬＲＰＬＴＬＴＬＰＫＰＬＶＥＦＣＮＫＰＭＩＶＨＱＩＥＡＬＶＡＡＧＶＴＤＩＶＬＡＶＮＹＲＰＥＩＭＥＫＦＬＡＥＹＥＥＫＹＮＩＮＩＥＦＳＶＥＳＥＰＬＤＴＡＧＰＬＫＬＡＥＲＩＬＧＫＤＤＳＰＦＦＶＬＮＳＤＶＩＣＤＹＰＦＫＥＬＬＥＦＨＫＡＨＧＤＥＧＴＩＶＶＴＫＶＥＥＰＳＫＹＧＶＶＶＨＫＰＮＨＰＳＲＩＤＲＦＶＥＫＰＶＥＦＶＧＮＲＩＮＡＧＭＹＩＦＮＰＳＶＬＫＲＩＥＬＲＰＴＳＩＥＫＥＴＦＰＡＭＶＡＤＮＱＬＨＳＦＤＬＥＧＦＷＭＤＶＧＱＰＫＤＦＬＳＧＴＣＬＹＬＳＳＬＴＫＫＧＳＫＥＬＴＰＰＴＥＰＹＶＨＧＧＮＶＭＩＨＰＳＡＫＩＧＫＮＣＲＩＧＰＮＶＴＩＧＰＤＶＶＶＧＤＧＶＲＬＱＲＣＶＬＬＫＧＳＫＶＫＤＨＡＷＶＫＳＴＩＶＧＷＮＳＴＶＧＲＷＡＲＬＥＮＶＴＶＬＧＤＤＶＴＩＧＤＥＩＹＶＮＧＧＳＶＬＰＨＫＳＩＫＡＮＶＤＶＰＡＩＩＭ
ニューロスポラ・クラッサのＭｐｇ１タンパク質のアミノ酸配列を、以下に配列番号２として示す：
ＭＫＡＬＩＬＶＧＧＦＧＴＲＬＲＰＬＴＬＴＭＰＫＰＬＶＥＦＧＮＫＲＭＩＬＨＱＩＥＡＬＡＡＡＧＶＴＤＩＶＬＡＶＮＹＲＰＥＩＭＥＫＹＬＡＥＹＥＫＱＦＧＩＮＩＴＩＳＩＥＳＥＰＬＧＴＡＧＰＬＫＬＡＥＤＶＬＲＫＤＤＴＰＦＦＶＬＮＳＤＶＴＣＥＹＰＦＫＥＬＡＡＦＨＫＡＨＧＤＥＧＴＩＶＶＴＫＶＥＥＰＳＫＹＧＶＶＶＨＫＰＮＨＰＳＲＩＤＲＦＶＥＫＰＶＱＦＶＧＮＲＩＮＡＧＬＹＩＦＮＰＳＶＩＤＲＶＥＬＲＰＴＳＩＥＱＥＴＦＰＡＭＶＲＤＧＱＬＨＳＦＤＬＥＧＦＷＭＤＩＧＱＰＫＤＦＬＴＧＴＣＬＹＬＳＳＬＴＫＫＧＳＫＥＬＡＰＴＴＬＰＹＩＨＧＧＮＶＬＩＤＰＳＡＫＩＧＫＮＣＲＩＧＰＮＶＴＩＧＰＮＶＶＶＧＤＧＶＲＬＱＲＣＶＬＬＥＧＳＫＶＫＤＨＡＷＶＫＳＴＩＶＧＷＮＳＴＶＧＫＷＡＲＬＥＮＶＴＶＬＧＤＤＶＴＩＧＤＥＩＹＶＮＧＧＳＩＬＰＨＫＴＩＫＡＮＶＤＶＰＡＩＩＭ
アスペルギルス・オリザエのマンノース−１−ホスフェートグアニルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を、以下に配列番号３として示す：
ＭＫＧＶＧＧＧＴＲＲＴＴＫＶＣＮＫＭＶＨＡＶＡＡＧＶＴＤＶＡＶＮＹＲＭＫＡＹＫＭＫＡＶＧＧＧＴＲＲＴＴＫＶＧＮＲＭＨＶＳＡＡＡＧＶＴＤＶＡＶＮＹＲＤＶＭＶＳＡＫＫＹＹＮＮＳＶＳＤＴＡＧＫＡＲＧＫＤＤＳＶＮＳＤＶＣＤＹＫＨＫＡＨＧＤＧＴＶＶＴＫＶＹＮＶＫＳＶＳＧＴＡＧＫＡＫＧＫＤＤＳＶＮＳＤＶＣＤＹＫＡＨＫＫＨＧＤＧＴＶＶＴＫＶＤＳＫＹＧＶＶＶＨＫＮＨＳＲＤＲＶＫＶＶＧＮＲＮＡＧＭＹＮＳＶＫＲＲＴＳＫＴＡＭＶＡＤＮＨＳＳＫＹＧＶＶＶＨＫＮＨＳＲＤＲＶＫＶＶＧＮＲＮＡＧＹＭＮＳＶＮＲＲＴＳＴＡＣＫＤＧＨＳＤＧＷＭＤＶＧＫＤＳＧＴＣＹＳＳＴＫＫＧＳＫＴＴＹＶＨＧＧＮＶＭＨＳＡＫＧＫＮＣＲＧＮＶＴＧＤＧＷＭＤＶＧＫＤＳＧＴＣＹＴＳＡＫＲＮＳＫＡＮＳＹＶＹＧＧＮＶＭＶＤＳＡＫＧＫＮＣＲＧＮＶＶＧＤＶＶＶＧＤＧＶＲＲＣＶＫＧＳＫＶＫＤＨＡＷＶＫＳＴＶＧＷＮＳＴＶＧＲＷＡＲＮＶＴＶＧＤＤＶＴＧＤＹＶＮＧＧＳＶＨＮＶＶＶＧＤＧＶＲＲＣＶＮＳＫＶＫＤＨＡＷＶＫＳＴＶＧＷＮＳＳＶＧＲＷＡＲＮＶＴＶＧＤＤＶＴＡＤＶＹＶＮＧＧＳＨＫＳＫＡＮＶＤＶＡＭＫＳＫＮＶＤＶＡＭ
本組成物及び方法の幾つかの実施形態では、生成レベルの変化したＭｐｇ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１、２、又は３のアミノ酸配列に対して特定の程度の全アミノ酸配列同一性、例えば、配列番号１、２、又は３に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には少なくとも約９９％の同一性を有する。それぞれのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列は、当業者に公知である通り、それぞれの対応するタンパク質に関するＢＬＡＳＴサーチから同定することができる。

【0075】

本組成物及び方法の幾つかの実施形態では、破壊されているｍｐｇ１遺伝子は、配列番号１、２、又は３のアミノ酸配列に対して特定の程度の全アミノ酸配列同一性、例えば、配列番号１、２、又は３に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には少なくとも約９９％の同一性を有するＭｐｇ１タンパク質をコード化する。

【0076】

本明細書に提供されるアミノ酸配列情報は、当業者が、任意の糸状菌におけるＭｐｇ１タンパク質及びＭｐｇ１タンパク質をコード化する核酸配列を同定したり、Ｍｐｇ１タンパク質の生成に影響を与えるためにｍｐｇ１遺伝子を適切に破壊したりすることを容易にする。配列番号１、２、及び３をコード化するポリヌクレオチド配列は、当業者に公知である通り、ＧｅｎＢａｎｋ又はＪＧＩデータベースに見出すことができる。

【0077】

別の態様では、糸状菌細胞の形態を変化させるための方法が提供される。変異糸状菌細胞は、固体培地において変化した生育形態を示し、親細胞の生育に比べて深部培養で生育させたとき異なる粘度を有する細胞集団、及び細胞ブロスの粘度を生成する。

【0078】

場合により、この方法は、好適な遺伝学的方法を用いて親菌株においてｍｐｇ１遺伝子を破壊することを含み、ここで、好気性発酵の間に、破壊されたｍｐｇ１変異菌株は、深部培養における好気性発酵の間に、親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少された撹拌を必要とする又は、予め選択された撹拌下で、増加された溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する。このような方法は、上記の任意の方法で、また当業者に公知である他の方法でｍｐｇ１遺伝子を破壊するために用いることができる。好ましくは、ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、一般に特定の核酸配列を標的としない化学的変異誘導とは対照的な配列特異的分子生物学技術を用いる遺伝子操作により行われる。しかし、化学的変異誘導を用いて満足のいく結果を得ることもできる。

【0079】

幾つかの実施形態では、低粘度菌株を生じさせる粘度を低下させる表現型を導入される親菌株は、高レベルで発現させることが意図される対象の遺伝子を既に含んでいる。この方法によると、本発明の方法は、予め存在する粘度を低下させる菌株に、対象タンパク質を生成させるために遺伝子を導入する必要がなくなる。それゆえに、本発明の方法は、対象の遺伝子を既に含む親菌株から、粘度を低下させる糸状菌細胞の変異菌株を作製するために使用することができる。

【0080】

ＩＶ．Ｓｅｂ１生成を変化させることによって生じる追加の効果
本組成物及び方法の幾つかの実施形態では、Ｍｐｇ１生成に影響を与える遺伝子変化は、Ｓｅｂ１生成に影響を与える遺伝子変化と組合せられる。トリコデルマ・アトロビリデ（Trichoderma atroviride）に由来するｓｅｂ１遺伝子は、ＳＴＲＥ−エレメント結合タンパク質であり、ｓｅｂ１遺伝子は、酵母のｍｓｎ２／４遺伝子及びアスペルギルス・ニデュランスのｍｓｎＡ遺伝子のオルソログであると考えられる。なお、ｓｅｂ１遺伝子は、酵母においてｍｓｎ２／４遺伝子を補完することはできないので、恐らく、機能的ホモログではない。Ｓｅｂ１は、浸透圧ストレス応答に関与しているが必須ではないが、形態変化に関連している、特に、低粘度表現型を生じさせるとは記載されていない。

【0081】

クエリーとしてＴ．アトロビリデのＳｅｂ１アミノ酸配列（配列番号４）を用いて実施したトリコデルマ・リーゼイの公的に入手可能なゲノムＤＮＡ配列のＢＬＡＳＴサーチによって、Ｔ．リーゼイのゲノムが、ｓｅｂ１と相同性の高い単一遺伝子を含むことが明らかになった。更なるホモログ又は類似配列は同定されておらず、これは、ｓｅｂ１が唯一のシングルコピー遺伝子であることを示唆する。Ｓｅｂ１タンパク質のホモログは、例えば、トリコデルマ・リーゼイ（配列番号５）、アスペルギルス・クラバーツス（Aspergillus clavatus）（配列番号６）、アスペルギルス・フミガーツスＡｆ９３（配列番号７）、及びネオサルトリア・フィシェリ（Neosartorya fischeri）ＮＲＲＬ １８１（配列番号８）において見出された。

【0082】

トリコデルマ・アトロビリデのＳｅｂ１タンパク質のアミノ酸配列を、以下に配列番号４として示す：
ＭＤＧＭＭＳＱＡＭＧＱＱＡＦＹＦＹＮＨＮＨＤＨＫＭＡＲＱＡＩＦＡＱＱＭＡＡＹＱＭＶＰＴＬＰＰＴＰＭＹＳＲＰＮＳＳＣＳＱＰＰＴＬＹＳＮＧＰＳＶＭＴＰＴＳＴＰＰＬＳＲＫＨＭＭＬＤＡＥＦＧＤＮＰＹＦＰＳＴＰＰＬＳＴＳＧＳＴＶＧＳＰＫＡＣＤＭＬＱＴＰＭＮＰＭＦＳＧＬＥＧＩＡＭＫＥＡＶＤＴＴＥＳＬＶＶＤＷＡＳＩＶＳＰＰＬＳＰＶＹＦＱＳＱＶＳＲＶＰＳＰＴＳＳＰＳＤＩＬＳＴＡＳＣＰＳＬＳＰＳＰＴＰＹＡＲＳＶＴＳＥＨＤＶＤＦＣＤＰＲＮＬＴＶＳＶＧＳＮＰＴＬＡＰＥＦＴＬＴＧＬＡＥＤＬＫＧＥＱＬＳＴＡＱＨＴＦＤＦＮＰＡＬＰＳＧＬＰＴＦＥＤＦＳＤＬＥＳＥＡＤＦＳＮＬＶＮＬＧＥＶＮＰＩＤＩＳＲＰＲＡＣＴＧＳＳＶＶＳＬＧＨＧＳＦＩＧＤＥＥＬＳＦＥＤＮＤＡＦＧＦＮＳＬＰＳＰＴＳＳＩＤＦＳＤＶＨＱＤＫＲＲＫＫＥＫＫＤＩＫＰＩＭＮＴＡＡＳＧＳＰＳＧＮＥＱＩＧＡＴＰＡＡＳＡＡＳＤＳＮＡＳＳＡＳＥＤＰＳＳＭＰＡＰＴＮＲＲＧＲＫＱＳＬＴＥＤＰＳＫＴＦＶＣＤＬＣＮＲＲＦＲＲＱＥＨＬＫＲＨＹＲＳＬＨＴＱＥＫＰＦＥＣＮＥＣＧＫＫＦＳＲＳＤＮＬＡＱＨＡＲＴＨＡＧＧＡＩＶＭＮＬＩＥＤＧＳＥＶＰＡＦＤＧＳＭＭＴＧＰＶＧＤＤＹＮＴＹＧＫＶＬＦＱＩＡＳＥＩＰＧＳＡＳＥＬＳＳＥＥＧＤＱＳＫＫＫＲＫＲＳＤ
トリコデルマ・リーゼイのＳｅｂ１タンパク質のアミノ酸配列を、以下に配列番号５として示す：
ＭＤＧＭＭＳＱＰＭＧＱＱＡＦＹＦＹＮＨＥＨＫＭＳＰＲＱＶＩＦＡＱＱＭＡＡＹＱＭＭＰＳＬＰＰＴＰＭＹＳＲＰＮＳＳＣＳＱＰＰＴＬＹＳＮＧＰＳＶＭＴＰＴＳＴＰＰＬＳＳＲＫＰＭＬＶＤＴＥＦＧＤＮＰＹＦＰＳＴＰＰＬＳＡＳＧＳＴＶＧＳＰＫＡＣＤＭＬＱＴＰＭＮＰＭＦＳＧＬＥＧＩＡＩＫＤＳＩＤＡＴＥＳＬＶＬＤＷＡＳＩＡＳＰＰＬＳＰＶＹＬＱＳＱＴＳＳＧＫＶＰＳＬＴＳＳＰＳＤＭＬＳＴＴＡＳＣＰＳＬＳＰＳＰＴＰＹＡＲＳＶＴＳＥＨＤＶＤＦＣＤＰＲＮＬＴＶＳＶＧＳＮＰＴＬＡＰＥＦＴＬＬＡＤＤＩＫＧＥＰＬＰＴＡＡＱＰＳＦＤＦＮＰＡＬＰＳＧＬＰＴＦＥＤＦＳＤＬＥＳＥＡＤＦＳＳＬＶＮＬＧＥＩＮＰＶＤＩＳＲＰＲＡＣＴＧＳＳＶＶＳＬＧＨＧＳＦＩＧＤＥＤＬＳＦＤＤＥＡＦＨＦＰＳＬＰＳＰＴＳＳＶＤＦＣＤＶＨＱＤＫＲＱＫＫＤＲＫＥＡＫＰＶＭＮＳＡＡＧＧＳＱＳＧＮＥＱＡＧＡＴＥＡＡＳＡＡＳＤＳＮＡＳＳＡＳＤＥＰＳＳＳＭＰＡＰＴＮＲＲＧＲＫＱＳＬＴＥＤＰＳＫＴＦＶＣＤＬＣＮＲＲＦＲＲＱＥＨＬＫＲＨＹＲＳＬＨＴＱＥＫＰＦＥＣＮＥＣＧＫＫＦＳＲＳＤＮＬＡＱＨＡＲＴＨＳＧＧＡＩＶＭＮＬＩＥＥＳＳＥＶＰＡＹＤＧＳＭＭＡＧＰＶＧＤＤＹＳＴＹＧＫＶＬＦＱＩＡＳＥＩＰＧＳＡＳＥＬＳＳＥＥＧＥＱＧＫＫＫＲＫＲＳＤ
アスペルギルス・クラバーツスのＳｅｂ１タンパク質のアミノ酸配列を、以下に配列番号６として示す：
ＭＤＴＴＹＴＭＶＧＴＰＶＱＧＱＰＳＦＡＹＹＴＴＮＤＳＱＳＲＱＱＨＦＴＳＨＰＳＥＭＱＡＦＹＧＱＭＱＰＹＰＱＱＱＱＱＴＣＭＰＤＱＱＳＩＹＡＡＱＰＭＬＮＭＨＱＭＡＴＡＮＡＦＲＧＡＬＳＭＴＰＩＶＳＰＱＰＴＨＬＫＰＴＩＩＶＱＱＤＳＰＭＬＭＰＬＤＴＲＦＶＳＳＤＹＹＡＦＰＳＴＰＰＬＳＴＳＧＳＴＩＳＳＰＰＳＳＧＲＳＬＨＴＰＩＮＤＣＦＦＳＦＥＫＶＥＧＶＫＥＧＣＥＳＤＶＨＳＥＬＬＡＮＡＤＷＳＲＳＤＳＰＰＬＴＰＶＦＩＨＰＰＳＬＴＡＳＱＳＳＤＬＬＳＡＨＳＳＣＰＳＬＳＰＳＰＳＰＶＳＳＴＦＩＡＰＰＨＳＧＬＳＶＥＰＳＧＴＤＦＣＤＰＲＱＬＴＶＥＳＳＶＤＳＳＴＥＬＰＰＬＰＴＬＳＣＮＥＥＥＰＫＶＶＬＧＳＡＴＶＴＬＰＶＨＥＳＬＳＰＡＹＴＳＳＴＥＤＰＬＧＳＬＰＴＦＤＳＦＴＤＬＤＳＥＤＥＦＶＮＮＬＶＤＦＨＰＧＧＮＰＹＦＬＧＤＫＲＱＲＬＧＳＹＬＬＥＥＤＥＦＬＳＤＲＳＦＤＤＬＤＤＨＥＡＦＡＨＳＧＬＰＳＬＥＰＳＥＬＩＳＶＱＧＤＶＡＥＶＳＥＥＭＲＳＫＫＲＴＴＳＲＲＴＬＫＲＴＮＳＳＤＳＳＳＥＳＬＡＴＳＧＫＲＴＱＡＳＡＮＧＲＳＧＨＳＥＡＴＳＳＳＡＱＱＳＴＴＰＳＲＱＮＳＴＡＮＡＳＳＳＳＥＡＰＳＡＰＶＳＶＮＲＲＧＲＫＱＳＬＴＤＤＰＳＫＴＦＶＣＴＬＣＳＲＲＦＲＲＱＥＨＬＫＲＨＹＲＳＬＨＴＱＤＫＰＦＥＣＨＥＣＧＫＫＦＳＲＳＤＮＬＡＱＨＡＲＴＨＧＧＧＳＩＶＭＧＶＩＤＴＮＡＳＬＱＡＳＹＥＥＲＥＰＲＬＬＧＡＡＬＹＥＡＡＮＡＡＡＮＫＳＴＴＳＤＳＳＤＧＴＩＳＤＴＳＳＶＥＧＲＰＩＫＫＲＲＲＥＤＨＡ
アスペルギルス・フミガーツスＡｆ９３のＳｅｂ１タンパク質のアミノ酸配列を、以下に配列番号７として示す：
ＭＤＡＴＹＴＭＡＱＴＰＶＱＧＱＰＳＦＡＹＹＰＴＥＳＱＳＲＱＱＨＦＴＳＨＰＦＥＭＱＹＹＧＱＶＳＳＹＰＱＱＱＡＱＱＱＨＳＭＰＥＱＱＰＶＹＡＡＱＰＭＬＮＭＨＱＭＡＴＴＮＡＦＲＧＡＬＳＭＴＰＩＡＳＰＱＰＴＨＬＫＰＴＩＩＶＱＱＤＳＰＡＬＭＰＬＤＴＲＦＶＳＮＤＦＹＧＦＰＳＴＰＰＬＳＴＳＧＳＴＩＳＳＰＰＳＳＮＧＳＬＨＴＰＩＮＤＣＦＦＳＦＥＫＶＥＧＶＫＥＧＣＥＳＤＶＨＣＥＬＬＡＮＴＤＷＳＲＳＤＳＰＰＬＴＰＶＦＩＱＰＱＳＬＴＡＳＱＳＳＤＬＬＳＡＱＩＰＣＰＳＬＳＰＳＰＳＰＤＳＡＴＦＩＳＨＰＱＳＩＬＳＡＥＰＳＧＳＤＦＣＤＰＲＱＬＴＶＥＳＳＶＧＡＰＡＥＬＰＰＬＰＴＬＳＣＮＥＥＥＰＫＶＶＬＧＳＡＴＶＴＬＰＶＨＥＧＬＳＰＳＦＳＳＳＳＥＤＰＬＧＳＬＰＴＦＤＳＦＳＤＬＤＳＥＤＥＦＡＮＫＬＶＤＦＨＰＩＧＮＴＹＦＱＧＤＫＲＱＲＬＧＴＹＬＬＤＥＤＥＦＬＳＥＲＳＬＥＤＬＤＤＱＥＡＦＡＱＳＧＬＰＳＶＥＳＴＤＦＬＡＶＥＧＤＡＴＱＳＴＥＥＭＳＳＫＫＲＶＴＳＲＲＳＬＫＫＡＳＴＳＥＳＳＳＤＳＬＡＫＫＴＱＡＳＡＴＳＲＳＧＨＳＤＴＴＳＴＶＱＱＳＴＡＳＳＲＱＮＳＴＡＮＴＳＮＳＥＳＰＡＡＰＶＳＶＮＲＲＧＲＫＱＳＬＴＤＤＰＳＫＴＦＶＣＳＬＣＳＲＲＦＲＲＱＥＨＬＫＲＨＹＲＳＬＨＴＱＤＫＰＦＥＣＨＥＣＧＫＫＦＳＲＳＤＮＬＡＱＨＡＲＴＨＧＧＧＳＩＶＭＧＶＩＤＴＮＳＳＮＴＱＰＡＦＤＥＰＥＰＲＡＬＧＬＡＬＹＥＡＡＮＡＡＴＳＫＳＴＴＳＥＳＳＤＧＴＩＳＤＴＳＳＶＧＧＲＰＡＫＫＲＲＲＤＤＨＶ
ネオサルトリア・フィシェリＮＲＲＬ １８１のＳｅｂ１タンパク質のアミノ酸配列を、以下に配列番号８として示す：
ＭＤＡＴＹＴＭＡＱＴＰＶＱＧＱＰＳＦＡＹＹＰＴＥＳＱＳＲＱＱＨＦＴＳＨＰＳＥＭＱＹＹＧＱＶＰＰＹＰＱＱＱＨＳＭＰＥＱＱＰＶＹＡＡＱＰＭＬＮＭＨＱＭＡＴＴＮＡＦＲＧＡＬＳＭＴＰＩＡＳＰＱＰＴＨＬＫＰＴＩＩＶＱＱＱＤＳＰＶＬＭＰＬＤＴＲＦＶＳＮＤＦＹＧＦＰＳＴＰＰＬＳＴＳＧＳＴＩＳＳＰＰＳＳＮＧＳＬＨＴＰＩＮＤＣＦＦＳＦＥＫＶＥＧＶＫＥＧＣＥＳＤＶＨＣＥＬＬＡＮＴＧＷＳＲＳＤＳＰＰＬＴＰＶＦＩＱＰＰＳＬＴＡＳＱＳＳＤＬＬＳＡＨＭＳＣＰＳＬＳＰＳＰＳＰＤＳＴＴＦＩＳＨＰＱＳＶＬＳＡＥＰＳＧＳＤＦＣＤＰＲＱＬＴＶＥＳＳＶＧＡＰＡＥＬＰＰＬＰＴＬＳＣＮＥＥＥＰＫＶＶＬＧＳＡＴＶＴＬＰＶＨＥＧＬＳＰＳＦＳＳＳＳＥＤＰＬＧＳＬＰＴＦＤＳＦＳＤＬＤＳＥＤＥＦＡＮＫＬＶＤＦＨＰＩＧＮＴＹＦＬＧＤＫＲＱＲＬＧＴＹＬＬＤＥＤＥＦＬＳＥＲＳＬＥＤＬＤＤＱＥＡＦＡＱＳＧＬＰＳＶＥＳＳＤＦＬＡＡＥＧＤＡＴＱＮＴＥＥＭＳＳＫＫＲＶＴＳＲＲＳＬＫＲＡＳＴＳＥＳＳＳＤＳＬＡＫＫＴＱＡＳＡＴＳＲＳＧＨＳＥＴＴＳＴＶＱＱＳＴＡＳＳＲＱＮＳＴＡＮＴＳＳＳＧＳＰＡＡＰＶＳＶＮＲＲＧＲＫＱＳＬＴＤＤＰＳＫＴＦＶＣＳＬＣＳＲＲＦＲＲＱＥＨＬＫＲＨＹＲＳＬＨＴＱＤＫＰＦＥＣＨＥＣＧＫＫＦＳＲＳＤＮＬＡＱＨＡＲＴＨＧＧＧＳＩＶＭＧＶＩＤＴＮＧＳＮＴＱＰＡＦＤＥＰＥＰＲＡＬＧＬＡＬＹＥＡＡＮＡＡＴＳＫＳＴＴＳＥＳＳＤＧＴＩＳＤＴＳＳＶＧＧＲＰＡＫＫＲＲＲＤＤＨＶ
本組成物及び方法の幾つかの実施形態では、生成レベルの変化したＳｅｂ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４、５、６、７、又は８のアミノ酸配列に対して特定の程度の全アミノ酸配列同一性、例えば、配列番号４、５、６、７、又は８に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には少なくとも約９９％の同一性を有する。配列番号４、５、６、７、又は８をコード化するポリヌクレオチド配列は、当業者に公知である通り、ＧｅｎＢａｎｋ又はＪＧＩデータベースに見出すことができる。

【0083】

本組成物及び方法の幾つかの実施形態では、ｓｅｂ１遺伝子が破壊されており、Ｓｅｂ１タンパク質をコード化するｓｅｂ１遺伝子は、配列番号４、５、６、７、又は８のアミノ酸配列に対して特定の程度の全アミノ酸配列同一性、例えば、配列番号４、５、６、７、又は８に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には少なくとも約９９％の同一性を有する。

【0084】

当業者は、Ｓｅｂ１生成に影響を与える遺伝子変化は、本明細書に詳述するＭｐｇ１生成に影響を与える遺伝子変化と同じ方法で作製できることを理解するであろう。粘度を変化させるＳｅｂ１タンパク質における変化は、参照により本明細書に援用される２０１１年４月２２日出願の仮特許出願第６１／４７８，１６０号に更に記載されている。

【0085】

Ｖ．Ｓｆｂ３生成を変化させることによって生じる追加の効果
本組成物及び方法の幾つかの実施形態では、Ｍｐｇ１生成又はＭｐｇ１及びＳｅｂ１生成に影響を与える遺伝子変化を、Ｓｆｂ３生成に影響を与える遺伝子変化と組合せる。Ｓｆｂ３遺伝子（Ｌｓｔ１としても知られる）は、かつては、出芽酵母（すなわち、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae））において前に特徴付けられていたが、この遺伝子は、小胞体からゴルジ体へタンパク質を運搬する輸送小胞を囲むＣＯＰＩＩタンパク質に関連するタンパク質をコード化する。Ｓｆｂ３及びＳｆｂ２は、Ｓｅｃ２４のホモログであり、これらの遺伝子は全て、小胞の中に特定の積荷タンパク質をパッケージングすることと関連する。

【0086】

Ｓｅｃ２４が酵母において必須の遺伝子であるのに対して、Ｓｆｂ３及びＳｆｂ２は必須の遺伝子ではないが、酵母におけるＳｆｂ３の欠失は、原形質膜輸送タンパク質（Ｐｍａ１ｐ）の輸送及び細胞壁合成に関連するグルカノシルトランスフェラーゼ（Ｇａｓ１ｐ）に影響することが知られている。

【0087】

クエリー配列としてＳ．セレヴィシエのＳｅｃ２４ｐ、Ｓｆｂ３ｐ又はＳｆｂ２ｐアミノ酸配列を用いて、ＢＬＡＳＴを使用して、トリコエデルマ・リーゼイの公的に入手可能なゲノム配列を検索すると、Ｔ．リーゼイが、酵母Ｓｅｃ２４に対して最も相同性の高い単一遺伝子と、酵母Ｓｆｂ３に対して最も相同性の高い単一遺伝子とを有することが明らかになる。他のホモログは同定されておらず、これは、Ｔ．リーゼイがＳｆｂ２に相当する遺伝子を有さないことを示唆している。更に、Ｓｆｂ３タンパク質のホモログは、例えば、Ｔ．リーゼイ（配列番号９）、Ａ．オリザエ（配列番号１０）、Ａ．ニガー（配列番号１１）、Ｐ．フニクロスム（配列番号１２）、Ｐ．クリソゲナム（配列番号１３）、Ｎ．クラッサ（配列番号１４）、及びＦ．オキシスポラム（F. oxysporum）（配列番号１５）で見出されている。

【0088】

トリコデルマ・リーゼイのＳｆｂ３のアミノ酸配列（配列番号９）：
ＭＤＹＴＱＹＨＡＬＧＨＧＥＶＬＤＰＮＤＰＮＫＴＳＡＰＡＡＰＱＦＱＰＰＳＳＰＹＶＰＰＧＳＰＹＧＡＰＰＹＨＧＧＨＱＡＰＰＭＡＭＰＰＰＳＴＰＧＹＧＰＰＱＧＱＳＦＰＧＳＰＭＰＳＱＤＡＧＬＡＡＱＦＧＧＭＳＬＧＡＤＡＧＧＡＡＡＲＫＫＫＫＤＲＨＡＹＨＳＶＥＰＴＧＳＳＱＡＦＮＧＬＰＰＧＴＰＡＥＱＦＬＮＶＮＮＰＱＧＩＰＡＬＧＧＱＦＧＳＰＬＡＳＰＭＧＴＰＨＭＡＮＰＧＱＦＰＡＰＴＳＰＦＴＰＳＡＰＶＳＰＡＥＦＡＳＲＦＧＳＰＤＡＡＴＳＩＧＳＡＧＰＳＱＶＳＰＤＤＭＰＳＩＰＡＳＲＤＡＩＱＥＨＦＦＫＮＶＹＰＴＦＥＲＨＶＰＰＰＡＴＶＳＦＶＡＦＤＱＧＮＡＳＰＫＦＴＲＬＴＬＮＮＩＰＴＴＡＥＧＬＨＡＴＧＬＰＬＧＭＬＩＱＰＬＡＰＬＱＡＧＥＡＥＩＰＶＬＤＦＧＤＡＧＰＰＲＣＲＲＣＲＡＹＩＮＰＦＭＭＦＲＳＧＧＮＫＦＶＣＮＬＣＳＹＰＮＥＴＰＰＥＹＦＣＡＶＳＰＱＧＶＲＬＤＲＤＱＲＰＥＬＨＲＧＴＶＥＦＶＶＰＫＥＹＷＴＲＥＰＶＧＬＲＷＬＦＶＩＤＶＴＱＥＳＹＮＫＧＦＭＥＴＦＣＥＧＩＬＡＡＬＹＧＧＮＤＥＥＮＤＥＤＧＥＰＫＲＲＩＰＫＧＡＫＶＧＦＩＴＹＤＫＤＩＨＦＹＮＩＮＰＨＬＤＱＡＨＭＭＩＭＰＤＬＥＤＰＦＬＰＬＧＥＧＬＦＶＤＰＹＥＳＫＡＩＩＴＳＬＬＴＲＬＰＥＭＦＳＴＩＫＮＰＥＰＡＬＬＡＴＬＮＡＡＶＡＡＬＥＡＴＧＧＫＶＶＣＳＣＳＴＬＰＴＷＧＰＧＲＬＦＭＲＤＤＧＮＨＰＧＧＥＬＤＫＫＬＹＴＴＥＨＰＡＷＫＫＶＳＥＫＭＡＳＳＧＩＧＶＤＦＦＬＡＡＰＳＧＧＹＬＤＩＡＴＩＧＨＶＡＡＴＴＧＧＥＴＦＹＹＰＮＦＩＡＰＲＤＧＡＲＬＳＭＥＩＴＨＡＩＴＲＥＴＧＦＱＡＬＭＫＶＲＣＳＴＧＬＱＶＡＡＹＨＧＮＦＶＱＨＴＦＧＡＤＬＥＩＧＶＩＤＡＤＫＡＬＧＶＳＦＳＨＤＧＫＬＤＰＫＬＤＡＨＦＱＴＡＬＬＹＴＴＡＳＧＱＲＲＶＲＣＳＮＶＩＡＳＶＳＤＴＳＫＥＳＮＴＫＥＬＡＩＲＱＣＬＫＦＶＤＱＤＡＶＶＧＩＦＡＫＥＡＳＴＫＬＡＴＴＳＡＮＬＱＤＶＲＮＷＬＴＥＲＴＩＤＩＭＡＹＹＫＫＨＳＡＮＱＦＰＰＳＱＬＶＭＰＥＲＬＫＥＦＣＭＹＭＬＧＭＬＫＣＲＡＦＫＧＧＩＥＮＳＤＲＲＶＨＥＬＲＭＶＲＳＭＧＰＬＥＬＳＬＹＬＹＰＲＭＩＡＬＨＮＬＱＰＥＥＧＦＡＤＰＥＴＧＨＬＫＭＰＰＳＶＲＴＳＦＳＲＶＥＰＧＧＶＹＬＶＤＮＧＱＱＣＬＬＷＦＨＡＱＴＳＰＮＬＩＴＤＬＦＧＥＧＨＤＳＬＫＧＬＤＰＹＴＳＴＬＰＶＬＥＴＨＬＳＡＱＶＲＮＩＩＥＦＬＫＳＭＲＧＳＫＧＭＴＩＱＬＡＲＱＧＩＤＧＡＥＹＥＦＡＲＭＬＶＥＤＲＮＮＥＡＫＳＹＶＤＷＬＶＨＩＨＲＧＶＱＬＥＬＳＧＱＲＫＫＥＧＤＧＥＡＴＡＶＭＡＮＦＡＧＬＲＰＡＹＷ
アスペルギルス・オリザエＲＩＢ４０のＳｆｂ３アミノ酸配列（ＧＩ：８３７６６０７４；配列番号１０）：
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アスペルギルス・ニガーのＳｆｂ３アミノ酸配列（配列番号１１）
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ペニシリウム・フニクロスムのＳｆｂ３アミノ酸配列（配列番号１２）
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ペニシリウム・クリゾゲナムのＳｆｂ３アミノ酸配列（配列番号１３）
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ネウロスポラ・クラッサのＳｆｂ３アミノ酸配列（配列番号１４）
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フザリウム・オキシスポラムのＳｆｂ３アミノ酸配列（配列番号１５）
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本組成物及び方法の幾つかの実施形態では、生成レベルの変化したＳｆｂ３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５のアミノ酸配列に対して特定の程度の全アミノ酸配列同一性、例えば、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には少なくとも約９９％の同一性を有する。それぞれのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列は、当業者に公知である通り、それぞれの対応するタンパク質に関するＢＬＡＳＴサーチから同定することができる。

【0089】

本組成物及び方法の幾つかの実施形態では、ｓｆｂ３遺伝子が破壊されており、Ｓｆｂ３タンパク質をコード化するｓｆｂ３遺伝子は、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５のアミノ酸配列に対して特定の程度の全アミノ酸配列同一性、例えば、配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には少なくとも約９９％の同一性を有する。

【0090】

およそ４０のチャワンタケ亜門の種のＳｆｂ３タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントから、特定のアミノ酸配列、すなわち、ＩＱＬＡＲＱＧＸＤＧＸＥＸＸＸＡＲＸＬＸＥＤＲＮＸＥＡＸＳＸＶＤＷＬ（配列番号１６、ここで、Ｘは任意のアミノ酸配列である）がＳｆｂ３タンパク質のＣ末端に近接し、且つＳｅｃ２４タンパク質内には見出されないことが明らかになった。このコンセンサス配列は、チャワンタケ亜門の他のメンバーにおけるＳｆｂ３タンパク質及びその変異体を同定するために用いることができる。

【0091】

当業者は、Ｓｆｂ３生成に影響を与える遺伝子変化は、本明細書に詳述するＭｐｇ１及び／又はＳｅｂ１生成に影響を与える遺伝子変化と同じ方法で作製できることを理解するであろう。粘度を変化させるＳｆｂ３タンパク質における変化は、参照により本明細書に援用される２０１１年８月２５日に国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４９１６４号として出願された２０１２年３月１日公開の国際公開第２０１２／０２７５８０ Ａ１号に更に記載されている。

【0092】

ＶＩ．有用性
粘度を低下させる糸状菌株を使用した場合、深部培養時の酸素及び栄養素の分布が改善し、深部培養物を撹拌するのに必要とされるエネルギー量が低下し、培養物中に存在する細胞集団を増加させ、タンパク質生成を増加させることが知られている。更に、糸状菌の本変異菌株は、既に記載されている低粘度菌株よりも著しい効果を提供する。

【0093】

第一に、本変異菌株は、完全に定義されたゲノムを有し得るため、後続の遺伝子操作、補完、交配等の操作に非常に適する。第二に、本菌株は、例えば、付随する粘度変化を生じさせる（１つ又は複数の）操作によってタンパク質の生成に有害な影響を与えない。第三に、粘度を低下させる菌株は、高レベルに発現させることを意図したタンパク質（すなわち、対象タンパク質）を既に生成している、選択マーカーを既にコード化している、又は生成宿主において望ましい他の特徴を既に含んでいる親菌株を含む本質的に任意の親菌株から生成することができる。それゆえに、本発明の菌株及び方法は、対象タンパク質をコード化する遺伝子を、粘度を低下させる既存の生成菌株の中に輸送する必要がない。

【0094】

本発明の菌株及び方法は、糸状菌の深部培養における商業的に重要なタンパク質の生成に利用される。商業的に重要なたんぱく質としては、例えば、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、リアーゼ、プロテアーゼ、キナーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ペルヒドロラーゼ、トランスフェラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、クロロフィラーゼ、ヒドロホビン、キモシン、炭酸脱水酵素、チミジル酸シンターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、チロシンキナーゼ、多剤耐性タンパク質（例えば、ＡＢＣ Ｐ−ｇｐタンパク質）、ＣＡＤ（カルミバル−Ｐシンターゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、ジヒドロオロターゼ）、トポイソメラーゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ、並びに抗体、並びに糸状菌で発現することができる他の酵素及び非酵素タンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、工業、製薬、動物の健康、及び飲食品用途に好適であり得る。

【0095】

以下の番号付き段落は、本組成物及び方法の様々な態様及び実施形態について更に記載する。番号付き段落のそれぞれの主題は、以下として示す通り、単独で用いてもよく、任意の他の番号付き段落の主題と組合せて用いてもよい。

【0096】

１．一態様では、親菌株に由来する糸状菌の変異菌株であって、前記変異菌株が、前記変異菌株の細胞に、前記親菌株の細胞と比較して、変更された量の機能性Ｍｐｇ１タンパク質を生成させる、遺伝子変化を含み、前記変異菌株の細胞が、深部培養における好気性発酵の間に（ｉ）親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、変更された撹拌量を必要とする、及び／又は、（ｉｉ）親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、変更された溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する、変異菌株を提供する。

【0097】

２．段落１に記載の幾つかの実施形態では、機能性Ｍｐｇ１タンパク質の前記変更された量が、減少された量であり、前記変異菌株が、深部培養における好気性発酵の間に、（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌量を必要とする、及び／又は、（ｉｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する。

【0098】

３．段落１又は２に記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記遺伝子変化は、親菌株中に存在するｍｐｇ１遺伝子の破壊を含む。

【0099】

４．段落３に記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、ｍｐｇ１遺伝子の全て又は一部の欠失の結果である。

【0100】

５．段落３に記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、ｍｐｇ１遺伝子を含むゲノムＤＮＡの一部の欠失の結果である。

【0101】

６．段落３に記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、ｍｐｇ１遺伝子の突然変異誘発の結果である。

【0102】

７．段落３〜６のいずれかに記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、部位特異的組み換えを用いて行われる。

【0103】

８．段落３〜７のいずれかに記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、前記ｍｐｇ１遺伝子の遺伝子座に選択マーカーを導入することと共に行われる。

【0104】

９．段落１〜８のいずれかに記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記変異菌株は、機能的Ｍｐｇ１タンパク質を生成しない。

【0105】

１０．段落１〜８のいずれかに記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記変異菌株は、Ｍｐｇ１タンパク質を生成しない。

【0106】

１１．段落１〜１０のいずれかに記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記変異菌株は、対象タンパク質をコード化する遺伝子を更に含む。

【0107】

１２．段落１〜１１のいずれかに記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、ｓｆｂ３遺伝子の破壊を更に含む。

【0108】

１３．段落１〜１２のいずれかに記載の幾つかの実施形態では、ｓｆｂ３遺伝子、ｓｅｂ１遺伝子、ｇａｓ１遺伝子、ｃｒｚ１遺伝子、及びｔｐｓ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の破壊を更に含む。

【0109】

１４．段落１〜１３のいずれかに記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記変異菌株は、バイオマスの単位量当たり、親菌株と実質的に同量、又はそれ以上のタンパク質を生成する。

【0110】

１５．段落１〜１４のいずれかに記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記糸状菌は、チャワンタケ亜門の種である。

【0111】

１６．段落１〜１５のいずれかに記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記糸状菌は、トリコデルマ属の種である。

【0112】

１７．段落１〜１６のいずれかに記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記糸状菌は、トリコデルマ・リーゼイである。

【0113】

１８．別の態様では、糸状菌細胞の変異菌株の作製方法であって、遺伝子変化を糸状菌細胞の親菌株に導入する工程であり、前記遺伝子変化が、前記親菌株の細胞と比較して機能性Ｍｐｇ１タンパク質の生成量を変化させる、該工程、それにより、深部培養における好気性発酵の間に（ｉ）親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、変更された撹拌量を必要とする、及び／又は、（ｉｉ）親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、変更された溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する、変異糸状菌細胞を製造する工程、を含む、方法を提供する。

【0114】

１９．段落１８に記載の方法の幾つかの実施形態では、前記遺伝子変化が、機能性Ｍｐｇ１タンパク質の生成を低下させるか又は防ぎ、それにより、深部培養における好気性発酵の間に（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌を必要とする、及び／又は、（ｉｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する、変異糸状菌細胞を製造する。

【0115】

２０．段落１８又は１９に記載の方法の幾つかの実施形態では、前記遺伝子変化は、遺伝子操作を使用して親糸状菌細胞においてｍｐｇ１遺伝子を破壊することを含む。

【0116】

２１．段落１８〜２０のいずれかに記載の方法の幾つかの実施形態では、前記遺伝子変化は、遺伝子操作を用いて親糸状菌細胞においてｍｐｇ１遺伝子を欠失させることを含む。

【0117】

２２．段落１８〜２１のいずれかに記載の方法の幾つかの実施形態では、前記遺伝子変化は、部位特異的遺伝子組み替えを用いて行われる。

【0118】

２３．段落１８〜２２のいずれかに記載の方法の幾つかの実施形態では、前記ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、ｍｐｇ１遺伝子の遺伝子座に選択マーカーを導入することと共に行われる。

【0119】

２４．段落１８〜２３のいずれかに記載の方法の幾つかの実施形態では、前記ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、ｓｆｂ３遺伝子の破壊と共に行われる。

【0120】

２５．段落１８〜２４のいずれかに記載の方法の幾つかの実施形態では、前記ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、ｓｆｂ３遺伝子、ｓｅｂ１遺伝子、ｇａｓ１遺伝子、ｃｒｚ１遺伝子、及びｔｐｓ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の破壊と共に行われる。

【0121】

２６．段落１８〜２５のいずれかに記載の方法の幾つかの実施形態では、前記変異菌株は、バイオマスの単位量当たり、親菌株と実質的に同量、又はそれ以上のタンパク質を生成する。

【0122】

２７．段落１８〜２６のいずれかに記載の方法の幾つかの実施形態では、前記糸状菌は、チャワンタケ亜門の種である。

【0123】

２８．段落１８〜２７のいずれかに記載の方法の幾つかの実施形態では、前記糸状菌は、トリコデルマ属の種である。

【0124】

２９．段落１８〜２８のいずれかに記載の方法の幾つかの実施形態では、前記糸状菌は、トリコデルマ・リーゼイである。

【0125】

３０．段落１８〜２９のいずれかに記載の方法の幾つかの実施形態では、前記親菌株は、対象タンパク質をコード化する遺伝子を更に含む。

【0126】

３１．段落３０に記載の方法の幾つかの実施形態では、前記対象タンパク質をコード化する遺伝子は、機能性Ｍｐｇ１タンパク質の生成を低下させるか又は抑制する遺伝子変化を導入する前に、前記親菌株内に存在する。

【0127】

３２．別の態様では、段落１１に記載の変異菌株により生成される対象タンパク質を提供する。

【0128】

３３．別の態様では、段落１８〜３１のいずれかに記載の方法によって生成される糸状菌の変異菌株を提供する。

【0129】

３４．別の態様では、親菌株に由来する糸状菌の変異菌株であって、
（ａ）（ｉ）深部培養において、前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌の必要性、及び／又は、（ｉｉ）深部培養において、前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量の維持、をもたらす遺伝子変化、並びに
（ｂ）
（ａ）における遺伝子変化の前に前記変異菌株中に存在する対象タンパク質をコード化する遺伝子、を含む、変異菌株を提供する。

【0130】

３５．段落３４に記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記遺伝子変化は、前記親菌株に存在するｍｐｇ１遺伝子の破壊を含む。

【0131】

３６．段落３５に記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、前記ｍｐｇ１遺伝子の遺伝子座に選択マーカーを導入することと共に行われる。

【0132】

３７．段落３５又は３６のいずれかに記載の方法の幾つかの実施形態では、ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、ｓｆｂ３遺伝子、ｓｅｂ１遺伝子、ｇａｓ１遺伝子、ｃｒｚ１遺伝子、及びｔｐｓ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の破壊と共に行われる。

【0133】

３８．段落３５〜３７のいずれかに記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、ｓｅｂ１遺伝子の破壊と共に行われる。

【0134】

本発明の菌株及び方法の、これらの及び他の、態様及び実施形態は、本説明を見た当業者にとっては、明白であろう。以下の実施例は、菌株及び方法を更に例示することを意図するものであり、限定することを意図したものではない。

【実施例】

【0135】

実施例１．糸状菌における形態変化に関与するｍｐｇ１遺伝子の同定
Ａ．概略
アグロバクテリウムツメファシエンス媒介形質転換を用いて、ｐｙｒ２遺伝子及びＴ．リーゼイのヒストンＨ１プロモーターを含有する核酸で、代表的な糸状菌、すなわち、トリコデルマ・リーゼイを形質転換することによって、糸状菌破壊ライブラリを調製した。この方法では、ｐｙｒ２遺伝子は、選択マーカー及び遺伝子タグの両方として機能した。また、ヒストンＨ１プロモーターは、遺伝子タグとして、また遺伝子の開始コドンの前に挿入された場合、遺伝子をアップレギュレートするためのプロモーターとして機能する。用いた具体的なＡ．ツメファシエンス菌株は、ＥＨＡ １０５であり、これは、強毒性であると考えられる（Ｈｏｏｄら，１９９３）。しかし、他のＡ．ツメファシエンス菌株、例えば、Ａ１３６及びＥＨＡ １０１も、Ｔ．リーゼイにおいて同様の形質転換効率が得られる。Ａ．リゾゲネス菌株、例えば、ＡＴＣＣ ４３０５７を用いてもよい。具体的な破壊ライブラリは、約５０，０００の形質転換体を含有していた。

【0136】

Ｂ．トリコデルマ・リーゼイＭＡＧＩ菌株
Ｔ．リーゼイのＭｏｒｐｈ １．１（すなわち、「Ｍｏｒｐｈ」）突然変異体は、４つの主なセルラーゼ遺伝子（すなわち、ｃｂｈＩ、ｃｂｈＩＩ、ｅｇｌＩ及びｅｇｌＩＩ）が欠失しており、これによって、セルラーゼのバックグラウンド活性の非存在下で他のタンパク質を発現させるのに有用である。ＭＡＧＩ菌株は、トリコデルマ・リーゼイのＭｏｒｐｈ １．１のオロチジン５’−モノホスフェートピロホスホリラーゼ（ｐｙｒ２）遺伝子座へのレポーターカセットの挿入を標的とすることによって作製した。このレポーターカセットは、プチロサルカス（Ptilosarcus）属の種に由来するコドンの最適化された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｔ．リーゼイのセロビオヒドロラーゼＩ（ｃｂｈＩ）プロモーターの制御下にあるアルファ−アミラーゼ、及び転写ターミネーター配列を含む。又はイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子は、ｐｙｒ２遺伝子座にレポーターが挿入される。レポーターカセットの挿入と一致して、ｐｙｒ２遺伝子の３’末端が欠失して、菌株がウリジン栄養要求性になった。

【0137】

Ｃ．ＤＮＡの調製
破壊に用いたベクターは、ＰＺＰ １００ベクターに基づくｐＲＡＴＴ ２３６であり、これは、左及び右のＴ−ＤＮＡ境界領域、大腸菌（E. coli）からアグロバクテリウムへの移動のためのｐＢＲ３２２ ｂｏｍ部位、それぞれ、大腸菌及びアグロバクテリウムにおけるＣｏｌＥ１及びｐＶＳ１プラスミド複製起点、並びにクロラムフェニコール耐性を付与するための細菌マーカーを含む（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｅｚ，Ｏ．ら，１９９４）。ベクターの図を図１として示す。

【0138】

挿入部位に外向きに転写するよう配向されたｈｉｓ１プロモーターに続き、トリコデルマ・アトロビリデのｐｙｒ２遺伝を含有する破壊カセットを、標準的な分子生物学的技術によって調製し、ライゲーションして、ｐＲＡＴＴ ２３６ベクターを作製した。得られたベクターを大腸菌ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）中で増殖させた。２５ｐｐｍのクロラムフェニコールを含むＬＡ寒天平板培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌ寒天）を用いて、大腸菌の形質転換体を選択した。ベクターを含有する大腸菌を、２５ｐｐｍのクロラムフェニコールを添加したＬＢ培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）中で生育させた。ベクターＤＮＡを、標準的な方法を用いて単離した。

【0139】

Ｄ．アグロバクテリウム細胞の形質転換
コンピテントなアグロバクテリウム細胞を以下の通り作製した。簡潔に述べると、２８℃で約３日間ＬＡ培地において生育させることによって、アグロバクテリウム細胞を冷凍保存から再生した。次いで、コロニーを選択し、生育が明らかになるまで、２８℃の２５０ｍＬ凹底フラスコ内にて０，１％グルコースを含有するＬＢ培地（体積５０ｍＬ）中で生育させた。あるいは、コロニーを５ｍＬの培養管で開始し、生育が明らかになったら２５０ｍＬのフラスコに移した。次いで、２５０ｍＬのフラスコの体積の約１０％を、同じ培地の入った新たなフラスコに移し、これをＯＤ（６００ｎｍ；ＯＤ_６００）が約０．４〜０．８になるまで生育させた（約５〜６時間生育）。１０，０００ｒｐｍで１０分間冷たい遠心分離機で遠心分離することによって細胞を収集し、次いで、１Ｍの冷ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．０）で３回洗浄した。次に、１０％グリセロールを含む１ｍＭの冷ＨＥＰＥＳで１回細胞を洗浄し、アリコートを−７０℃で冷凍させた。細胞の生存率を求めた（典型的に、冷凍後約１×１０^９ＣＦＵ／ｍＬ）。

【0140】

ベクターＤＮＡを用いて、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウム細胞を形質転換した。コンピテントなアグロバクテリウム細胞を氷上で解凍し、０．２ｃｍのエレクトロポレーションセル中で約４０μＬの細胞を約１μｇのＤＮＡと混合した（氷上）。Ｂｕｃｈｌｅｒ ３−１５０エレクトロポレーターを用いて、細胞を２．５ボルト（２００オーム、２５μＦ）でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの直後に、エレクトロポレーションセルにＳＯＣ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。あるいは、ライゲーション混合物を用いてエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム細胞を形質転換して、大腸菌においてベクターＤＮＡを増殖させる必要性をなくすこともできる。別の方法では、約１μＬのライゲーション混合物を形質転換に用いる。ＳＯＣをエレクトロポレーション混合物に添加した後、混合物の希釈物を、２５０ｐｐｍのクロラムフェニコールを添加したＬＡ培地の培養皿にプレーティングし、２８℃で４日間インキュベートした。１×１０^７ＣＦＵ／ｍＬのアグロバクテリウム形質転換体が得られ、ＰＣＲ解析によって求めたところ、約９０〜１００％がベクターＤＮＡを含有していた。わずか２５ｐｐｍのクロラムフェニコールを用いて短い時間でコロニーを得ることができるが、真実の形質転換体を同定するためには多数のコロニーをスクリーニングしなければならない。

【0141】

Ｅ．Ｔ．リーゼイのアグロバクテリウム媒介形質転換
２５０ｍＬのフラスコにおいて、２５ｍＬの最少培地（２．０５ｇ／Ｌ Ｋ_２ＨＰＯ_４、１．４５ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．１５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７・Ｈ_２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２・６・Ｈ_２Ｏ、０．００２５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ_４・７・Ｈ_２Ｏ、０．５ｇ／Ｌ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、及び２ｇ／Ｌグルコースに、滅菌後２５ｐｐｍのクロラムフェニコールを添加した）に、ベクターで形質転換されたアグロバクテリウムの凍結ストックを又は新たなＬＡプレートから直接接種した。次いで、最少培地培養物を、曇るまで（一晩から数日間）振盪しながら２８℃でインキュベートした。１０ｍＬの培養物を、２５０ｍＬのフラスコ中の５０ｍＬの誘導培地（２．０５ｇ／Ｌ Ｋ_２ＨＰＯ_４、１．４５ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．１５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７・Ｈ_２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２・６・Ｈ_２Ｏ、０．００２５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ_４・７・Ｈ_２Ｏ、０．５ｇ／Ｌ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１．８ｇ／Ｌグルコース、５ｇ／Ｌグリセロール、４０ｍＭ ＭＥＳ中で調製、ｐＨ ５．３、滅菌後１Ｍアセトシリンゴン２００μＬを添加）に移した。初期ＯＤ_６００は、約０．１であり、ベクターで形質転換されたアグロバクテリウム細胞をＯＤ_６００が約０．４〜０．８になるまで生育させた。

【0142】

Ｔ．リーゼイのＭＡＧＩ細胞の新たな培養物を、１０ｍＬの滅菌水に胞子を懸濁させることによって調製した。Ｔ．リーゼイのＭＡＧＩ細胞の形質転換を以下の通り実施した：約１００μＬのアグロバクテリウム全培養液（ＯＤ_６００＝０，４〜０，８）を、試験管中で１００μＬの菌胞子（１０^７ｓｆｕ／ｍＬ）と混合した（アグロバクテリウム細胞の菌胞子に対する別の比も満足のいく結果をもたらす）。約０．１〜１．０ｍＬのこの混合物を、ニトロセルロースフィルタの埋め込まれた誘導寒天平板培地（１５ｇ／Ｌの寒天及び０．２５ｍｇ／ｍＬのウリジンを含む誘導培地）にプレーティングした。プレートを約１８〜２８℃で約２４〜４８時間インキュベートして、Ｔ．リーゼイ細胞を生育させた。次に、ニトロセルロースフィルタを、２５０ｐｐｍのカルベニシリンを添加したＶｏｇｅｌ培地（Ｖｏｇｅｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｂｕｌｌ．１３：４２〜４３，１９５６）に移して、アグロバクテリウムを殺滅／生育を阻害した。次いで、フィルタ上における糸状菌（破壊ライブラリの形質転換体を表す）の生育が明らかになるまで、２８℃でインキュベートした。

【0143】

Ｆ．形態突然変異体のスクリーニング
破壊ライブラリにおける形質転換体を、光学顕微鏡を用いて固体及び液体培地における形態変化についてスクリーニングした。形質転換後、コロニーピッカーを用いてニトロセルロースフィルタから個々の形質転換体を取り出し、ジャガイモデキストロース寒天を含有する９６ウェルマイクロタイタープレート（ＣＰ−７００，Ｎｏｒｇｒｅｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＬＬＣ，Ｆａｉｒｌｅａ，ＷＶ，ＵＳＡ）に移した。あるいは、形質転換体に由来する胞子を合わせ、出芽させ、セルソーターを用いて単一胞子をマイクロタイターのウェルに添加した。セルスプレッダーを用いて２０ｍＬの滅菌蒸留水中にジャガイモデキストロース形質転換プレートに由来する胞子を懸濁させることによって胞子を収集した。５０ｍＬの最少培地を含有する２５０ｍＬのフラスコに胞子を接種し、生殖系列が得られるまで２４時間撹拌しながら２８℃でインキュベートした。７０μｍのノズルを用いて１５，０００事象／秒の事象速度、４１４ｋＰａ（６０ｐｓｉ）で、高速分別（ＭｏＦｌｏ ｓｏｒｔｅｒ，Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ，ＵＳＡ）を用いて、個々の生殖系列を、ジャガイモデキストロース寒天を含有するマイクロタイタープレート（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）に広げた。上記方法のいずれかによって得られた形質転換体を含有するマイクロタイタープレートを２８℃で７日間インキュベートした。個々の生殖系列胞子を、ＹＥＧ（水１Ｌ当たり酵母抽出物５ｇ、グルコース２０ｇ）を含有するガラス底を有する３８４ウェルの黒色ｓｅｎｓｏｐｌａｔｅ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に繰り返しプレーティングし、２０℃で２４時間インキュベートした。個々の形質転換体の形態を顕微鏡で調べた。

【0144】

あるいは、緩やかに生育する形質転換体を形質転換プレートから直接単離し、ジャガイモデキストロース寒天（Ｄｉｆｃｏ）に再度プレーティングした。ジャガイモデキストロースプレート上でコロニー状の生育を示す形質転換体を、２８℃、１５０ｒｐｍで２４時間振盪フラスコ中のＹＥＧ培地で生育させ、形質転換体の形態を顕微鏡で調べた。

【0145】

Ｇ．Ｔ．リーゼイのＭＡＧＩ １０−８ｇの単離及び特性評価
上記手順から得られた突然変異体ＭＡＧＩ １０−８ｇは、ＭＡＧＩ親よりも短いフィラメントを有する液体培養物中で形態が変化していることが観察された。液体培地では、ＭＡＧＩ １０−８ｇ突然変異体を含有する培養物は、また、ＭＡＧＩ親を含有する培養物に比べて、より高い生育中の溶存酸素レベルを示した（表１）。

【0146】

菌株ＭＡＧＩ及びＭＡＧＩ １０−８ｇを深部（液体）培養にて同様の条件下で生育させ、これらの生育表現型を比較した。簡潔には、両面及び底部にバッフルを有する３Ｌフラスコ内の５００ｍＬの最少培地に、各菌株の胞子を別々に添加した。３０分間オートクレーブした後、滅菌６０％グルコースを最終濃度が２７．５ｇ／Ｌになるように添加した。ＭＡＧＩ菌株はΔｐｙｒ２であるので、２ｍｇ／ｍＬウリジンを追加した。培養物を振盪インキュベータ内で３４℃で４８時間生育させた。

【0147】

４８時間後、４．７ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４・７・Ｈ_２Ｏ、４．３ｇ／Ｌ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４及び２．５ｍＬ／Ｌの同様の微量元素溶液を含有する９．５Ｌの培地を含有する１４Ｌの発酵槽に各フラスコの内容物を別々に加えた。これらの成分を共に１２１℃にて３０分にわたって熱滅菌した。６０％グルコース及び０，４８％ ＣａＣｌ_２・２・Ｈ_２Ｏの溶液を別々にオートクレーブし、冷却し、最終濃度が７５ｇ／Ｌグルコース及び０．６ｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２・２・Ｈ_２Ｏになるように発酵槽に添加した。培地を２８％ ＮＨ_３を用いてｐＨ ３．５に調整し、全生育期間中温度を３４℃で維持した。

【0148】

ヘッドスペースへの圧力の印加がなかった場合の溶存酸素（ＤＯ）プローブを１００％に較正した（すなわち、０ｋＰａ（０ｂａｒ）のゲージ圧、１００ｋＰａ（１ｂａｒ）の絶対圧）。ヘッドスペース内の圧力を次に７０ｋＰａ（０．７ｂａｒ）（ゲージ圧）に設定した。その後、播種培地を添加する前に酸素プローブは１７０％の読み取り値を示した。この発酵槽は、５００ｒｐｍに初期設定された可変速度モーターにより混合を行う４枚ブレードタービンを２つ備えた。

【0149】

培養物が生育するにつれて、糸状菌菌糸の増殖によってブロスの粘度が上昇したことに少なくとも部分的に起因して、ＤＯ含量レベルは低下した。ＤＯ含量レベルが４０％未満に低下した場合には、撹拌量を増加させて、溶存酸素を４０％に維持した。７５０ｒｐｍの撹拌に達したら、ＤＯ含量レベルを４０％未満に低下させる。ＤＯ含量が４０％未満に低下しなかった場合には、発酵工程中の撹拌量を増加させる必要がなかったので、初期撹拌量は必要とされている量よりも多かった。グルコースが完全に消費された時点で各発酵槽で生成されたバイオマスの量を測定したところ、全ての両方の菌株について生成量がほぼ同じであったことが判明した。

【0150】

所与の撹拌量における各発酵槽のＤＯ含量濃度、並びに、所与のＤＯ含量レベルを維持するために必要とされる撹拌量は、複数の異なる菌株生育表現型により、複数の異なるブロスから得られる粘度の間接的尺度である。一方の変数（すなわち、ＤＯ又は撹拌）のみを変更してもう一方を測定するのが理想であるが、各発酵槽において十分なバイオマスの生成を確保するためにＤＯが４０％未満に低下するのを防止して、それにより、異なる菌株の生育のより有意な比較を可能にすることが望ましい。

【0151】

一般に、対象とするＤＯ濃度を維持するには、撹拌量を上昇させる必要があるが、撹拌量は、ブロスの粘度に相関する基準を提供する発酵槽タービンを駆動するモーターに供給される電力の量により推定することができる。具体的には、懸濁した培地を撹拌するのに必要とされる割増電力は、撹拌量の三乗に比例する。

【0152】

ｍｐｇ１遺伝子の核酸配列は、ＪＧＩデータベースから入手した：タンパク質ＩＤ：１２２５５１，名称：ｅｓｔＥｘｔ＿ｆｇｅｎｅｓｈ５＿ｐｇ．Ｃ＿１３０１１５，以下で入手可能：ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｄｉｓｐＧｅｎｅＭｏｄｅｌ？ｄｂ＝Ｔｒｉｒｅ２＆ｉｄ＝１２２５５１，（Ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｏｒｔａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉ．Ｖ．Ｇｒｉｇｏｒｉｅｖ，Ｈ．Ｎｏｒｄｂｅｒｇ，Ｉ．Ｓｈａｂａｌｏｖ，Ａ．Ａｅｒｔｓ，Ｍ．Ｃａｎｔｏｒ，Ｄ．Ｇｏｏｄｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｋｕｏ，Ｓ．Ｍｉｎｏｖｉｔｓｋｙ，Ｒ．Ｎｉｋｉｔｉｎ，Ｒ．Ａ．Ｏｈｍ，Ｒ．Ｏｔｉｌｌａｒ，Ａ．Ｐｏｌｉａｋｏｖ，Ｉ．Ｒａｔｎｅｒｅ，Ｒ．Ｒｉｌｅｙ，Ｔ．Ｓｍｉｒｎｏｖａ，Ｄ．Ｒｏｋｈｓａｒ，及びＩ．Ｄｕｂｃｈａｋ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０１１ ０：ｇｋｒ９４７ｖ１−ｇｋｒ９４７）非翻訳領域はイタリック体で記載し、上流又は下流配列によって５’及び３’に隣接し、コード領域は太字で記載し、イントロンは小文字で記載する（配列番号３８）：

【配列表１】

【0153】

【0154】

表１として示す通り、ＭＡＧＩ １０−８ｇは、親ＭＡＧＩに比べてブロス粘度が低下した。バッチ生育相の最後に、全てのグルコースが消費されたとき、両方の菌株が同様のバイオマス濃度に達した。そこに達するまでに、ＭＡＧＩ対照菌株のｓａｗ撹拌は、最高７５０ｒｐｍまで増加し、ｓａｗ ＤＯは３５％にまで低下した。菌株ＭＡＧＩ １０−８ｇは、同じバイオマス濃度を得るために多くのエネルギーを必要としなかった。撹拌量は、％ ＤＯが４０まで低下したとき、５１３ｒｐｍまでわずかに増加した。タンパク質生成は、ＭＡＧＩに比べてＭＡＧＩ １０−８ｇにおいて有害な影響を受けなかった（図示せず）。

【0155】

【表2】

【0156】

逆ＰＣＲを用いて、Ｔ．リーゼイゲノム中にｐｙｒ２ ｈｉｓ１遺伝子を含有するＴ−ＤＮＡの挿入部位を同定した。簡潔に述べると、菌株ＭＡＧＩ １０−８ｇに由来する高分子量ゲノムＤＮＡを切断して、制限酵素ＳｐｅＩを用いて完成させた。酵素を熱で不活性化した後、反応物をライゲーションバッファで５倍希釈し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを添加した。一晩ライゲーション反応した後、リガーゼを熱で不活性化し、反応物を酢酸アンモニウム及びエタノールで沈殿させた。洗浄したＤＮＡペレットをＴＥに溶解させ、プライマーＲＰＧ２５３及びＲＰＧ２５５（表２を参照）を用いるＰＣＲ用のテンプレートとして用いた。得られたＰＣＲ産物を清浄化し、ネステッドプライマーＲＰＧ２３９及びＲＰＧ２０７を用いて配列決定して、Ｔ−ＤＮＡ挿入部位に隣接するヌクレオチド配列を決定した。ＪＧＩトリコデルマ・リーゼイｖ ２．０ゲノム配列に対するこの配列のＢＬＡＳＴｎ分析によって、Ｔ−ＤＮＡは、スカフォールド１３の領域３６９０８９〜３７０３２４が欠失していることが明らかになった。

【0157】

挿入部位は、挿入部位に隣接するゲノムＤＮＡに相同なプライマー、及びＴ−ＤＮＡに相同なプライマーを用いるＰＣＲによって確認した。具体的には、プライマーＲＰＧ２５６及びＲＰＧ２６８を用いてＴ−ＤＮＡの３’末端における配列を確認し、プライマーＲＰＧ２６８及びＲＰＧ２６９は、同定された部位における完全なＴ−ＤＮＡ挿入を増幅した。

【0158】

突然変異体ＭＡＧＩ １０−８ｇにおけるＴ−ＤＮＡ挿入の部位は、Ｔ．リーゼイＪＧＩゲノミックデータベースｖ２において３６９０８９〜３７０３２４のスカフォールド１３であった。この部位に見出された遺伝子は、ｍｐｇ１遺伝子（ＰＤＩ １２２５５１）であり、これは、アスペルギルス・クラバタス、アスペルギルス・フミガーツフ、及びネオサルトリア・フィシェリを含む他の真菌に見出されている。Ｋｒｕｓｚｅｗｓｋａら（１９９８）Ｃｕｒ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４４５〜５０及びＺａｋｒｚｅｗｓｋａら（２００３）Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６９：４３８３〜４３８９に記載の通り、トリコデルマ・リーゼイ由来のｍｐｇ１は、タンパク質のグリコシル化の初期段階で主な調節的役割を果たし得るＧＴＰ：アルファ−Ｄ−マンノース−１−ホスフェートグアニルトランスフェラーゼをコード化する。サザン解析は、この菌株がネイティブなコピーに加えてｐｙｒ２遺伝子を１コピーのみしか含有していないことを示し、これは、１回の破壊事象が生じたことを示唆する（図示せず）。

【0159】

この部位における挿入は、ＭＡＧＩ １０−８ｇ菌株において生じた唯一の遺伝子変化であることが示され、したがって、ｍｐｇ１遺伝子の破壊は、観察された形態変化に関与しているということである。

【0160】

【表3】

【0161】

実施例２．Ｔ．リーゼイの突然変異体７７Ｂ７に由来するｍｐｇ１遺伝子の欠失
Ａ．Ｍｏｒｐｈ菌株ＴｒＧＡ ７７Ｂ７
上記Ｍｏｒｐｈ菌株を、マーカーとしてａｍｄｓを用いて、ＣＢＨ１プロモーターの制御下でネイティブのトリコデルマ・グルコアミラーゼ遺伝子（ＴｒＧＡ）で予め形質転換した。次いで、２つのタンデムなコピーのグルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ ２９−９）を含有する突然変異体を単離し、ランダムな化学的突然変異誘発を用いて、突然変異体（７７Ｂ７）を作製した。次いで、自然ｐｙｒ２突然変異体誘導体を、５−フルオロ−オロチン酸（ＦＯＡ）選択によって単離した。

【0162】

Ｂ．ｍｐｇ１破壊カセットの作製
トリコデルマ・リーゼイのｍｐｇ１（（ｊｇｉ│Ｔｒｉｒｅ２│１２２５５１）を突然変異体Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７から欠失させた。

【0163】

ｍｐｇ１破壊カセットプラスミドｐＲＡＴＴ２４９（図２）を、標準的な分子生物学的手順を用いて調製した。このプラスミドは、５’非翻訳領域の一部及び隣接する上流配列（左隣接領域）にわたるＤＮＡ配列に相同な２．５Ｋｂの領域を有するＤＮＡ配列を含んでいた。また、プラスミド内には、ｍｐｇ１遺伝子の４番目のエキソンの一部及び隣接する下流配列（右隣接領域）にわたるＤＮＡ配列に相同な３．３Ｋｂの領域を有するＤＮＡ配列も含まれていた。これら配列は、ｍｐｇ１遺伝子を標的とし、介在カセット配列で左隣接領域と右隣接領域との間のゲノムの領域を置換するよう設計した。これら介在配列は、形質転換される菌株のゲノムにおける内因性のＴ．リーゼイｐｙｒ２に対する相同性を最小限に抑えるためにトリコデルマ・アトロビリデに由来するｐｙｒ２選択マーカーを含んでいた。ｐｙｒ２選択マーカーの直上流は、マーカーの３’末端の直接反復複製であり、これは、マーカーのその後の喪失及び形質転換体／欠失体の有用なｐｙｒ２突然変異体誘導体の単離を促進した。この完全ｍｐｇ１破壊カセットを、プライマーＲＰＧ３８８及びＲＰＧ３９１を用いてＰＣＲによって増幅させた。複数のＰＣＲ反応物をプールし、後続工程で用いるために標準的な分子生物学的手順を用いて清浄化した。

【0164】

Ｃ．菌株Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７Δｍｐｇ１の作製
ＰＥＧ媒介形質転換を用いて菌株Ｍｏｒｐｈ ＴｒＧＡ ７７Ｂ７ Δｐｙｒ２をｍｐｇ１破壊カセットで形質転換し、ソルビトールを含有するＶｏｇｅｌ最少培地にプレーティングして、ｐｙｒ２マーカーによって獲得されるウリジン原栄養性に基づいて候補を選択した。個々の形質転換体を単離し、Ｖｏｇｅｌ最少培地に移すことによって増殖させた。相同組み換えによってｍｐｇ１遺伝子座にｍｐｇ１破壊カセットが挿入されている形質転換体を同定するためにＰＣＲ解析を用いた。ｍｐｇ１遺伝子座におけるΔｍｐｇ１破壊カセットの相同挿入は、２対のプライマーを用いて予測されるサイズのＤＮＡ断片を増幅させることによって確認した。プライマー対ＲＰＧ３９４及びＲＰＧ２５３は、破壊カセット領域の５’末端の外側から始まって３’領域内で終わるＤＮＡ断片を増幅した。プライマー対ＲＰＧ３９５及びＲＰＧ２７３は、破壊カセット領域の５’領域内から始まって破壊カセットの３’末端の外側で終わるＤＮＡ断片を増幅した。ｍｐｇ１破壊カセットの相同挿入が確認された、生成された菌株をＭｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｍｐｇ１と命名した。プライマー配列を表４として示す。

【0165】

菌株Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７及びＭｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｍｐｇ１を深部（液体）培養にて同一条件下で生育させ、これらの生育表現型を比較した。簡潔には、両面及び底部にバッフルを有する３Ｌフラスコ内の５００ｍＬの培地に、各菌株の胞子を別々に添加した。培地は、５ｇ／Ｌ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、４．５ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７・Ｈ_２Ｏ、及び１４，４ｇ／Ｌクエン酸を含有しており、５％ ＮａＯＨでｐＨ ５．５に調整されていた。３０分間オートクレーブした後、滅菌６０％グルコースを、以下を含む２，５ｍＬ／Ｌの微量元素溶液：１７５ｇ／Ｌクエン酸、２００ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ_４・７・Ｈ２Ｏ、１６ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ_４・７・Ｈ_２Ｏ、３，２ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ_４・５・Ｈ_２Ｏ、１．４ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ、及び０．８ｇ／Ｌ Ｈ_３ＢＯ_３と共に、最終濃度が２７．５ｇ／Ｌになるように添加した。培養物を振盪インキュベータ内で３４℃で４８時間生育させた。

【0166】

４８時間後、４．７ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４・７・Ｈ_２Ｏ、４．３ｇ／Ｌ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４及び２．５ｍＬ／Ｌの同様の微量元素溶液を含有する９．５Ｌの培地を含有する１４Ｌの発酵槽に各フラスコの内容物を別々に加えた。これらの成分を共に１２１℃にて３０分にわたって熱滅菌した。６０％グルコース及び０，４８％ ＣａＣｌ_２・２・Ｈ_２Ｏの溶液を別々にオートクレーブし、冷却し、最終濃度が７５ｇ／Ｌグルコース及び０．６ｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２・２・Ｈ_２Ｏになるように発酵槽に添加した。培地を２８％ ＮＨ_３を用いてｐＨ ３．５に調整し、全生育期間中温度を３４℃で維持した。

【0167】

ヘッドスペースへの圧力の印加がなかった場合の溶存酸素（ＤＯ）プローブを１００％に較正した（すなわち、０ｋＰａ（０ｂａｒ）のゲージ圧、１００ｋＰａ（１ｂａｒ）の絶対圧）。ヘッドスペース内の圧力を次に７０ｋＰａ（０．７ｂａｒ）（ゲージ圧）に設定した。その後、播種培地を添加する前に酸素プローブは１７０％の読み取り値を示した。この発酵槽は、５００ｒｐｍに初期設定された可変速度モーターにより混合を行う４枚ブレードタービンを２つ備えた。

【0168】

培養物が生育するにつれて、糸状菌の増殖によりブロスの粘度が上昇したことに少なくとも部分的に起因して、ＤＯ濃度は低下した。ＤＯが４０％以下に低下した場合には、撹拌量を増加させて、溶存酸素を４０％に維持した。７５０ｒｐｍの撹拌に達したら、ＤＯを４０％未満に低下させるであろう。ＤＯが４０％未満に低下しなかった場合には、発酵工程中の撹拌量を増加させる必要はなく、初期撹拌量は必要とされている量よりも高いことになる。グルコースが完全に消費された時点で各発酵槽で生成されたバイオマスの量を測定したところ、全ての両方の菌株について生成量がほぼ同じであったことが判明した。

【0169】

所与の撹拌量における各発酵槽のＤＯ濃度、並びに、所与のＤＯレベルを維持するために必要とされる撹拌量は、複数の異なる菌株生育表現型により、複数の異なるブロスから得られる粘度の間接的尺度である。一方の変数（すなわち、ＤＯ又は撹拌）のみを変更してもう一方を測定するのが理想であるが、各発酵槽において十分なバイオマスの生成を確保するためにＤＯが４０％以下に低下するのを防止して、これにより、異なる菌株の生育のより有意な比較を可能にすることが望ましい。

【0170】

一般に、対象とするＤＯ濃度を維持するには、撹拌量を上昇させる必要があるが、撹拌量は、ブロスの粘度に相関する基準を提供する発酵槽タービンを駆動するモーターに供給される電力の量により推定することができる。具体的には、懸濁した培地を撹拌するのに必要とされる割増電力は、撹拌量の三乗に比例する。

【0171】

％ＤＯが４０％未満に低下しない菌株では、測定基準は、予め選択された撹拌量で維持された最低溶存酸素レベルに基づく。

【0172】

表３として示す通り、菌株Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７に由来するｍｐｇ１遺伝子の欠失により、ブロス粘度を低下させる菌株（Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｍｐｇ１）が得られた。バッチ生育相の最後に、全てのグルコースが消費されたとき、両方の菌株が同様のバイオマス濃度に達した。そこに達するまでに、ＤＯが４０％にまで低下したとき、対照菌株のｓａｗ撹拌は、６１６ｒｐｍまで増加した。ｍｐｇ１欠失菌株は、同じバイオマス濃度を得るために多くのエネルギーを必要としなかった。撹拌量は、５００ｒｐｍを超えて増加することなく、ＤＰはわずか１０２％までしか低下しなかった。

【0173】

【表4】

【0174】

【表5】

【0175】

実施例３．破壊されたｍｐｇ１及びｓｅｂ１遺伝子を有する突然変異体における更なる粘度低下
Ａ．上記Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｍｐｇ１菌株を、マーカーとしてａｍｄＳを用いて、ＣＢＨ１プロモーターの制御下でネイティブなトリコデルマ・グルコアミラーゼ遺伝子（ＴｒＧＡ）で予め形質転換した。次いで、２つのタンデムなコピーのグルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ ２９−９）を含有する突然変異体を単離し、ランダムな化学的突然変異誘発を用いて、粘度低下表現型に関連する形態の変化している突然変異体（７７Ｂ７）を得た。ｍｐｇ１遺伝子を上記の通り欠失させた。ｐｙｒ２遺伝子は、続いて、５−フルオロオロチン酸に対する耐性について選択することによって自然に欠失し、菌株Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｍｐｇ１、Δｐｙｒ２が生じた。

【0176】

Ｂ．ｓｅｂ１破壊カセットの作製
ｓｅｂ１破壊カセットプラスミドｐＲＡＴＴ２４０（図３）を、標準的な分子生物学的手順を用いて調製した。これら介在配列は、形質転換される菌株のゲノムにおける内因性のＴ．リーゼイｐｙｒ２に対する相同性を最小限に抑えるためにトリコデルマ・アトロビリデに由来するｐｙｒ２選択マーカーを含んでいた。ｐｙｒ２選択マーカーの直上流は、マーカーの３’末端の複製であり、この直接反復は、マーカーのその後の喪失及び形質転換体／欠失体の有用なｐｙｒ２突然変異体誘導体の単離を促進した。この完全ｓｅｂ１破壊カセットを、プライマーＲＰＧ２５７及びＲＰＧ２６４（表６を参照）を用いてＰＣＲによって増幅させた。複数のＰＣＲ反応物をプールし、後続工程で用いるために標準的な分子生物学的手順を用いて清浄化した。

【0177】

Ｃ．菌株Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｍｐｇ１Δｓｅｂ１及びＭｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｓｅｂ１の作製
ＰＥＧ媒介形質転換を用いて菌株Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｐｙｒ２及びＭｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｍｐｇ１ Δｐｙｒ２をｓｅｂ１破壊カセットで形質転換し、ソルビトールを含有するＶｏｇｅｌ最少培地にプレーティングして、ｐｙｒ２マーカーによって獲得されるウリジン原栄養性に基づいて候補を選択した。個々の形質転換体を単離し、Ｖｏｇｅｌ最少培地に移すことによって増殖させた。ＰＣＲ解析を用いて、相同組み換えによってｓｅｂ１遺伝子座にｓｅｂ１破壊カセットが挿入されている形質転換体を同定した。ｓｅｂ１遺伝子座におけるΔｓｅｂ１破壊カセットの相同挿入は、２対のプライマーを用いて予測されるサイズのＤＮＡ断片を増幅することによって確認した。プライマー対ＲＰＧ２９７及びＲＰＧ２５３は、破壊カセット領域の５’末端の外側から始まって３’領域内で終わるＤＮＡ断片を増幅した。プライマー対ＲＰＧ２９６及びＲＰＧ２７３は、破壊カセット領域の５’領域内から始まって３’末端の外側で終わるＤＮＡ断片を増幅した。破壊と一致して、第３のプライマー対ＲＰＧ１３３及びＲＰＧ２２０は、形質転換されていない親菌株由来のテンプレートＤＮＡを用いて挿入部位にわたる１．６ＫｂのＤＮＡ断片を増幅したが、ｓｅｂ１破壊菌株由来のテンプレートＤＮＡを用いるこの断片の増幅には失敗した。ｓｅｂ１破壊カセットの相同挿入が確認された、作製された菌株を、Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｓｅｂ１及びＭｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｍｐｇ１ Δｓｅｂ１と命名した。

【0178】

Ｄ．深部培養におけるＭｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｍｐｇ１ Δｓｅｂ１の生育
菌株Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｍｐｇ１及びＭｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｍｐｇ１ Δｓｅｂ１を、実施例２に記載の通り深部（液体）培養において同一条件下で生育させ、その生育表現型を比較した。表５として示す通り、Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｍｐｇ１菌株におけるｓｅｂ１遺伝子を破壊すると、（予め選択された撹拌量における溶存酸素レベルを維持する最低ｒｐｍに基づいて）粘度を更に低下させる菌株が得られ、これは、ｓｅｂ１遺伝子の破壊及びｍｐｇ１遺伝子の破壊が形態及び粘度低下に対して更なる影響を有することを示唆する。Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｍｐｇ１ Δｓｅｂ１のタンパク質生成は、Ｍｏｒｐｈ ＴｒＧＡ ７７Ｂ７及びＭｏｒｐｈ ＴｒＧＡ ７７Ｂ７Δｓｅｂ１の少なくとも８５％以上であった。

【0179】

【表6】

【0180】

【表7】

【0181】

実施例４．破壊されたｍｐｇ１及びｓｆｂ３遺伝子を有する突然変異体における更なる粘度低下
Ａ．Ｍｏｒｐｈ菌株ＴｒＧＡ ＃３２
上記Ｍｏｒｐｈ菌株を、マーカーとしてａｍｄｓを用いて、ＣＢＨ１プロモーターの制御下でネイティブのトリコデルマ・グルコアミラーゼ遺伝子（ＴｒＧＡ）で予め形質転換した。次いで、２つのタンドム（tandom）コピーのグルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ ２９−９）を含有する突然変異体を単離し、ランダムな化学的突然変異誘発を用いて、粘度低下表現型に関連する形態の変化している細胞壁突然変異体（７０Ｈ２）を得た。この粘度低下表現型は、後に、切頭型ｓｆｂ３遺伝子の結果であることが求められた（データは示さない）。ＴｒＧＡの更なるコピー（すなわち、ＴｒＧＡ ＃３２）で形質転換された７０Ｈ２菌株は、更に、ＴｒＧＡを過剰発現させるために有用であった。

【0182】

Ｂ．ｍｐｇ１破壊カセットの作製
菌株ＴｒＧＡ ＃３２ Δｍｐｇ１を作製するために実施例２に記載した通りｍｐｇ１遺伝子を破壊した。

【0183】

Ｃ．深部培養におけるＴｒＧＡ＃３２ Δｍｐｇ１の生育
菌株ＴｒＧＡ＃３２及びＴｒＧＡ＃３２ Δｍｐｇ１を、実施例２に記載の通り深部（液体）培養において同一条件下で生育させ、その生育表現型を比較した。表７として示す通り、ＴｒＧＡ＃３２菌株からｍｐｇ１遺伝子が欠失すると、（予め選択された溶存酸素のレベルを維持するために必要とされるｒｐｍに基づいて）粘度を更に低下させる菌株が得られ、これは、ｍｐｇ１遺伝子の破壊及びｓｆｂ３遺伝子の破壊が形態及び粘度低下に対して更なる影響を有することを示唆する。タンパク質生成は、ｍｐｇ１欠失によって影響を受けなかった（図示せず）。

【0184】

【表8】

【0185】

実施例５．破壊されたｍｐｇ１、ｓｅｂ１、及び／又はｓｂｆ３と共にｇａｓ１、ｃｒｚ１、及びｔｐｓ２遺伝子のうちの少なくとも１つが破壊された突然変異体における更なる粘度低下
Ａ．破壊されたｇａｓ１における粘度低下
菌類のβ（１，３）−グルカノシルトランスフェラーゼのＧｅｌ／Ｇａｓ／Ｐｈｒファミリーは、主成分であるβ（１，３）−グルカンを加工することによって細胞壁の生合成において重要な役割を果たす（Ｐｏｐｏｌｏら，２００８）。ｇａｓ１（ＰＩＤ ２２９１４）は、β−１，３−グルカンを破壊及び接合することができるＧＰＩ（及び／又はグルカン）アンカー型タンパク質であるβ−１，３−グルカノシルトランスフェラーゼをコード化する。５つを有するＴ．リーゼイを含む多くの真菌類のゲノムには複数のパラログが存在する。別の研究では、ｇａｓ１遺伝子（又はアスペルギルス・フミガーツフにおいて知られているｇｅｌ１遺伝子）の突然変異が、真菌類の細胞壁構造に影響を与え、また、形態変化、並びにカルコフロールホワイト、コンゴレッド、及びドデシル硫酸ナトリウムに対する過敏性を導き得ることが示されている（Ｓｃｈｉｒａｗｓｋｉ，Ｊ．ら２００５，Ｍｏｕｙｎａ，Ｉ．ら２００５）。

【0186】

トリコデルマ・リーゼイのＭｏｒｐｈ菌株は、ｃｂｈＩ、ｃｂｈＩＩ、ｅｇＩＩ、及びｅｇＩＶを含む４つの主なセルラーゼ遺伝子が欠失しているので、セルラーゼバックグラウンドの非存在下で又は低下したセルラーゼバックグラウンド下で他のタンパク質を発現させるのに特に適している。国際公開第０５／００１０３６号を参照されたい。Ｍｏｒｐｈ菌株を、マーカーとしてａｍｄＳを用いて、ＣＢＨ１プロモーターの制御下でネイティブのトリコデルマ・グルコアミラーゼ遺伝子（ＴｒＧＡ）で予め形質転換した。次いで、２つのタンデムなコピーのグルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ ２９−９）を含有する突然変異体を単離し、ランダムな化学的突然変異誘発を用いて、突然変異体（７７Ｂ７）を作製した。次いで、自然ｐｙｒ２突然変異体誘導体を、５−フルオロ−オロチン酸（ＦＯＡ）選択によって単離した。トリコデルマ・リーゼイのｇａｓ１（ＰＩＤ ２２９１４）を、突然変異体Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７から欠失させた。

【0187】

ＰＥＧ媒介形質転換を用いて菌株Ｍｏｒｐｈ ＴｒＧＡ ７７Ｂ７ Δｐｙｒ２をｇａｓ１破壊カセットで形質転換し、ソルビトールを含有するＶｏｇｅｌ最少培地にプレーティングして、ｐｙｒ２マーカーによって獲得されるウリジン原栄養性に基づいて候補を選択した。表８として示す通り、Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｇａｓ１は、親Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７に比べてブロス粘度が低下した。バッチ生育相の最後に、全てのグルコースが消費されたとき、両方の菌株が同様のバイオマス濃度に達した。バッチ生育相の最後に到達するために、Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７対照菌株のｓａｗ撹拌は、６１６ｒｐｍまで増加し、ｓａｗ ＤＯ含量レベルは、わずか４０％にまで低下した。菌株Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｇａｓ１は、同じバイオマス濃度を得るために多くのエネルギーを必要としなかった（すなわち、撹拌におけるｒｐｍが増加した）。撹拌量は、５００ｒｐｍ超には増加せず、％ ＤＯは、１１５未満には低下しなかった。タンパク質生成は、Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７に比べてＭｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｇａｓ１には負の影響を与えなかった（データは示さない）。ｇａｓ１破壊の詳細は、２０１１年４月２９日出願の米国仮出願第６１，４８０，６０２号に見出すことができ、この全文を参照することによって本明細書に援用する。

【0188】

【表9】

【0189】

Ｂ．破壊されたｃｒｚ１における粘度低下
真菌では、カルシニューリン媒介Ｃａ^２＋シグナル伝達が、多くの生物において生育、発生、及び毒性に必要であることが示されている。高カチオンレベル及びアルカリ性ｐＨを含む多様な環境条件に適応することが必須である。遺伝子ｃｒｚ１は、カルシニューリンによって制御される転写因子をコード化する。Ｃｒｚ１ｐ転写因子は、ホスファターゼカルシニューリンがＣａ^２＋／カルモジュリンによって活性化されたときに脱リン酸化される。次いで、それは核に入り、多数の遺伝子の発現を誘導するが、そのうち多くは、細胞壁に関連する機能を有するタンパク質をコード化する（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら，２００２；Ｌａｇｏｒｃｅら，２００３；Ｇａｒｃｉａら，２００４；Ｋａｒａｂａｂａら，２００６；Ｐａｒｄｉｎｉら，２００６，Ｍｕｎｒｏ，Ｃ．ら２００９）。ｃｒｚ１又はホモログの欠失によって、菌糸の形態が変化する場合がある（Ｋｏｔｈｅ，Ｇ．及びＦｒｅｅ，Ｓ．１９９８，Ｐｒｏｋｉｓｃｈ，Ｈ．ら１９９７）。

【0190】

トリコデルマ・リーゼイのＭｏｒｐｈ菌株を上記の通り調製した。トリコデルマ・リーゼイのｃｒｚ１（ＰＩＤ ３６３９１）を、突然変異体Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７から欠失させた。ＰＥＧ媒介形質転換を用いて菌株Ｍｏｒｐｈ ＴｒＧＡ ７７Ｂ７ Δｐｙｒ２をｃｒｚ１破壊カセットで形質転換し、ソルビトールを含有するＶｏｇｅｌ最少培地にプレーティングして、ｐｙｒ２マーカーによって獲得されるウリジン原栄養性に基づいて候補を選択した。表９として示す通り、Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｃｒｚ１は、親Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７に比べてブロス粘度が低下した。バッチ生育相の最後に、全てのグルコースが消費されたとき、両方の菌株が同様のバイオマス濃度に達した。バッチ生育相の最後に到達するために、Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７対照菌株のｓａｗ撹拌は、６１６ｒｐｍまで増加し、ｓａｗ ＤＯ含量レベルは、わずか４０％にまで低下した。菌株Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｃｒｚ１は、同じバイオマス濃度を得るために多くのエネルギーを必要としなかった。撹拌量は、５００ｒｐｍ超には増加せず、％ ＤＯは、１００未満には低下しなかった。ｃｒｚ１破壊の詳細は、２０１１年４月２９日出願の米国仮出願第６１，４８０，６１０号に見出すことができ、この全文を参照することによって本明細書に援用する。

【0191】

【表10】

【0192】

Ｃ．破壊されたｔｐｓ１における粘度低下
遺伝子ｔｐｓ２は、二糖類であるトレハロースの合成に関与するトレハロース−ホスフェートホスファターゼをコード化する。トレハロースは、細胞質及びＥＲにおける変性したタンパク質のリフォールディングを緩衝する、ストレスによって誘導される糖である（Ｓｉｎｇｅｒ，Ｍら１９９８，Ｓｉｍｏｌａ，Ｍら２０００）。この二糖類は、様々なストレスに応答して多様な生物によって大量に生成される。酵母では、トレハロースは、高温においてタンパク質を安定化させ、熱で損傷したタンパク質のリフォールディングに役立つ（Ｓｉｍｏｌａ，Ｍら２０００）。

【0193】

トリコデルマ・リーゼイのＭｏｒｐｈ菌株を上記の通り調製した。トリコデルマ・リーゼイのｔｐｓ２（ＰＩＤ ４８７０７）を、突然変異体Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７から欠失させた。ＰＥＧ媒介形質転換を用いて菌株Ｍｏｒｐｈ ＴｒＧＡ ７７Ｂ７ Δｐｙｒ２をｔｐｓ２破壊カセットで形質転換し、ソルビトールを含有するＶｏｇｅｌ最少培地にプレーティングして、ｐｙｒ２マーカーによって獲得されるウリジン原栄養性に基づいて候補を選択した。表１０として示す通り、Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｔｐｓ２は、親Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７に比べてブロス粘度が低下した。バッチ生育相の最後に、全てのグルコースが消費されたとき、両方の菌株が同様のバイオマス濃度に達した。バッチ生育相の最後に到達するために、Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７対照菌株のｓａｗ撹拌は、６１６ｒｐｍまで増加し、ｓａｗ ＤＯ含量レベルは、わずか４０％にまで低下した。菌株Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｔｐｓ２は、同じバイオマス濃度を得るために多くのエネルギーを必要としなかった。撹拌量は、５００ｒｐｍ超には増加せず、％ ＤＯは、１１０未満には低下しなかった。ｔｐｓ１破壊の詳細は、２０１１年４月２９日出願の米国仮出願第６１，４８０，６２９号に見出すことができ、この全文を参照することによって本明細書に援用する。

【0194】

【表11】

【0195】

上記の組成物及び方法は、理解を明瞭にする目的で例示及び実施例により幾分詳細に記載されてきたが、特定の変化及び修正がなされ得ることは当業者には明白であろう。したがって、本説明は、添付の特許請求の範囲により詳述される本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。

【0196】

本明細書に引用された全ての公刊物、特許及び特許明細書は、これによって、あらゆる目的のためにこれらの全体が参照により組み込まれ、各個別の公刊物、特許又は特許明細書が特定的に及び個々に示されている場合には参照により同程度そのように組み込まれる。

【0197】

参考文献
以下の参考文献及び本明細書に引用される追加の参考文献は、これによって参照により組み込まれる。

【0198】

Ｃａｒａｃｕｅｌ，Ｚ．ら（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ １８：１１４０〜４７。

【0199】

Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｅｚ，Ｐ．ら（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５：９８９〜９４。

【0200】

Ｈｏｏｄ，Ｅ．Ｅ．ら（１９９３）Ｔｒａｎｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２：２０８〜１８。

【0201】

Ｈｕｇｈｅｓ，Ｈ．及びＳｔｅｐｈｅｎｓ，Ｄ．Ｊ．（２００８）Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２９：１２９〜５１。

【0202】

Ｋａｒｈｉｎｅｎ，Ｌ．ら（２００５）Ｔｒａｆｆｉｃ ６：５６２〜７４。

【0203】

Ｍｏｕｙｎａ，Ｉ．ら（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５６：１６７５〜８８。

【0204】

Ｐａｓｓｏｌｕｎｇｈｉ，Ｓ．ら（２０１０）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ ９：７〜１７。

【0205】

Ｐｅｎｇ，Ｒ．ら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１１５２１〜２８。

【0206】

Ｐｏｐｏｌｏ，Ｌら（２００８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：１８５５３〜１８５６５
Ｋｒｕｓｚｅｗｓｋａら（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４４５〜４５０。

【0207】

Ｚａｋｒｚｅｗｓｋａら（２００３）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：４３８３〜４３８９。

【0208】

Ｒｏｂｅｒｇ，Ｋ．Ｊ．ら（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４５：６５９〜７２。

【0209】

Ｓｈｉｍｏｎｉ，Ｙ．ら（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５１：９７３〜８４。

【0210】

Ｓｃｈｉｒａｗｓｋｉ，Ｊ．ら（２００５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １７：３５３２〜３５４３。

【0211】

Ｔｕｒｃｈｉｎｉ，Ａ．ら（２０００）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：１１６７〜７１。

【0212】

Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２７：３１０７９〜３１０８８。

【0213】

Ｌａｇｏｒｃｅら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２０３４５〜２０３５７。

【0214】

Ｇａｒｃｉａら（２００４）Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２７９：１５１８３〜１５１９５。

【0215】

Ｋａｒａｂａｂａら（２００６）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１４２９〜１４５１。

【0216】

Ｐａｒｄｉｎｉら（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：４０３９９〜４０４１１。

【0217】

Ｍｕｎｒｏ，Ｃ．ら（２００９）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１３９９〜１４１３。

【0218】

Ｋｏｔｈｅ，Ｇ．及びＦｒｅｅ，Ｓ．（１９９８）Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ ２３：２４８〜２５８。

【0219】

Ｐｒｏｋｉｓｃｈ，Ｈ．，ら（１９９７）Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５６：１０４〜１１４。

【0220】

Ｓｉｍｏｌａ，Ｍら（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：４２〜５３。

【0221】

Ｓｉｎｇｅｒ，Ｍ．及びＬｉｎｄｑｕｉｓｔ Ｓ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．５：６３９〜４８。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]