特許 6042869 粘度の表現型が変化した糸状菌

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6042869

(24)【登録日】2016年11月18日

(45)【発行日】2016年12月14日

(54)【発明の名称】粘度の表現型が変化した糸状菌

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/15 20060101AFI20161206BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20161206BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/15ZNA

   C12N15/00 A

【請求項の数】20

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2014-506566(P2014-506566)

(86)(22)【出願日】2012年4月20日

(65)【公表番号】特表2014-513532(P2014-513532A)

(43)【公表日】2014年6月5日

(86)【国際出願番号】US2012034405

(87)【国際公開番号】WO2012145596

(87)【国際公開日】20121026

【審査請求日】2015年4月20日

(31)【優先権主張番号】61/478,162

(32)【優先日】2011年4月22日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/478,160

(32)【優先日】2011年4月22日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/480,602

(32)【優先日】2011年4月29日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/480,629

(32)【優先日】2011年4月29日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/480,610

(32)【優先日】2011年4月29日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509240479

【氏名又は名称】ダニスコ・ユーエス・インク

(74)【代理人】

【識別番号】100071010

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 行造

(74)【代理人】

【識別番号】100118647

【弁理士】

【氏名又は名称】赤松 利昭

(74)【代理人】

【識別番号】100138438

【弁理士】

【氏名又は名称】尾首 亘聰

(74)【代理人】

【識別番号】100138519

【弁理士】

【氏名又は名称】奥谷 雅子

(74)【代理人】

【識別番号】100123892

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 忠雄

(74)【代理人】

【識別番号】100169993

【弁理士】

【氏名又は名称】今井 千裕

(74)【代理人】

【識別番号】100161539

【弁理士】

【氏名又は名称】武山 美子

(74)【復代理人】

【識別番号】100185535

【弁理士】

【氏名又は名称】逢坂 敦

(72)【発明者】

【氏名】ボディ、エリザベス・エー

(72)【発明者】

【氏名】プラット セカンド、ロバート・ジェームス

【審査官】 大久保 智之

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１４−５１３５２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１４−５１３５３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１４−５１３５３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１４−５１３５３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５３３７５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Applied and Environmental Microbiology，２００３年，69, 8，4383-4389

【文献】 J Bacteriol.，１９９８年，180, 6，1418-1424

【文献】 Eukaryot Cell. ，２００９年，8, 11，1677-1691

【文献】 Eukaryot Cell.，２００８年，7, 4，584-601

【文献】 Molecular and Cellular Biochemistry，２００４年，256/257，319-327

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

親菌株に由来する糸状菌の変異菌株であって、
前記変異菌株が、前記変異菌株の細胞に、前記親菌株の細胞と比較して、機能性Ｃｒｚ１タンパク質の生成を減少させる、遺伝子変化を含み、
前記変異菌株が、ｓｆｂ３遺伝子及びｔｐｓ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の破壊を更に含み、並びに
前記変異菌株の細胞が、深部培養における好気性発酵の間に（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌量を必要とする、及び／又は、（ｉｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する、
変異菌株。

【請求項2】

（ａ）前記遺伝子変化が、前記親菌株中に存在するｃｒｚ１遺伝子の破壊を含む、
（ｂ）前記遺伝子変化が前記親菌株中に存在するｃｒｚ１遺伝子の破壊を含み、かつ、前記ｃｒｚ１遺伝子の破壊が前記ｃｒｚ１遺伝子の全て又は一部の欠失の結果である、
（ｃ）前記遺伝子変化が前記親菌株中に存在するｃｒｚ１遺伝子の破壊を含み、かつ、前記ｃｒｚ１遺伝子の破壊が前記ｃｒｚ１遺伝子を含むゲノムＤＮＡの一部の欠失の結果である、又は
（ｄ）前記遺伝子変化が前記親菌株中に存在するｃｒｚ１遺伝子の破壊を含み、かつ、前記ｃｒｚ１遺伝子の破壊が前記ｃｒｚ１遺伝子の突然変異誘発の結果である、
請求項１に記載の変異菌株。

【請求項3】

前記ｃｒｚ１遺伝子の破壊が、部位特異的組み換えを用いて行われる、又は
前記ｃｒｚ１遺伝子の破壊が、前記ｃｒｚ１遺伝子の遺伝子座に選択マーカーの導入と共に行われる、
請求項２に記載の変異菌株。

【請求項4】

前記変異菌株が、機能性Ｃｒｚ１タンパク質を生成しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異菌株。

【請求項5】

前記変異菌株が、Ｃｒｚ１タンパク質を生成しない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異菌株。

【請求項6】

前記変異菌株が、前記変異菌株において生成させることが所望されるタンパク質をコード化する遺伝子を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異菌株。

【請求項7】

ｓｆｂ３遺伝子の破壊を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異菌株。

【請求項8】

前記変異菌株が、バイオマス単位量当たり、前記親菌株と実質的に同量、又はそれ以上の前記変異菌株において生成させることが所望されるタンパク質を生成する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異菌株。

【請求項9】

前記糸状菌が、チャワンタケ亜門（Pezizomycotina）の種である、又は
前記糸状菌が、トリコデルマ属（Trichoderma）の種である、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の変異菌株。

【請求項10】

前記糸状菌が、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）である、請求項９に記載の変異菌株。

【請求項11】

糸状菌細胞の変異菌株の作製方法であって、
遺伝子変化を糸状菌細胞の親菌株に導入する工程であり、前記遺伝子変化が、前記親菌株の細胞と比較して機能性Ｃｒｚ１タンパク質の生成を低下させるか又は抑制する、該工程、
それにより、深部培養における好気性発酵の間に（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌量を必要とする、及び／又は、（ｉｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する、変異糸状菌細胞を製造する工程、
を含み、並びに
前記遺伝子変化が、ｓｆｂ３遺伝子及びｔｐｓ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の破壊と共に行われる
方法。

【請求項12】

（ａ）前記遺伝子変化が、遺伝子操作を使用して親糸状菌細胞のｃｒｚ１遺伝子を破壊することを含む、
（ｂ）前記遺伝子変化が、遺伝子操作を使用して親糸状菌細胞においてｃｒｚ１遺伝子を欠失させることを含む、又は
（ｃ）前記遺伝子変化が、部位特異的遺伝子組み換えを使用して行われる、
請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

（ａ）前記ｃｒｚ１遺伝子の破壊が、前記ｃｒｚ１遺伝子の遺伝子座に選択マーカーの導入と共に行われる、又は
（ｂ）前記ｃｒｚ１遺伝子の破壊が、ｓｆｂ３遺伝子の破壊と共に行われる、
請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記変異菌株が、バイオマス単位量当たり、前記親菌株と実質的に同量、又はそれ以上の前記変異菌株において生成させることが所望されるタンパク質を生成する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記糸状菌が、チャワンタケ亜門の種である、又は
前記糸状菌が、トリコデルマ属の種である、
請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記糸状菌が、トリコデルマ・リーゼイである、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記親菌株が、前記変異菌株において生成させることが所望されるタンパク質をコード化する遺伝子を更に含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記変異菌株において生成させることが所望されるタンパク質をコード化する遺伝子が、機能性Ｃｒｚ１タンパク質の産生を低下させるか又は抑制する遺伝子変化を導入する前に前記親菌株内に存在する、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

親菌株に由来する糸状菌の変異菌株であって、
前記変異菌株が、
（ａ）前記親菌株中に存在するｃｒｚ１遺伝子の破壊を含む遺伝子変化であって、（ｉ）深部培養において、前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌の必要性、及び／又は、（ｉｉ）深部培養において、前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量の維持、をもたらす遺伝子変化、を含み、
更に、前記変異菌株が、
（ｂ）前記変異菌株において生成させることが所望されるタンパク質をコード化する遺伝子であって、前記遺伝子は（ａ）における遺伝子変化の前に前記変異菌株中に存在する遺伝子、を含み、
ここで、前記ｃｒｚ１遺伝子の破壊が、ｓｆｂ３遺伝子及びｔｐｓ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の破壊と共に行われる、
変異菌株。

【請求項20】

前記ｃｒｚ１遺伝子の破壊が、前記ｃｒｚ１遺伝子の遺伝子座に選択マーカーの導入と共に行われる、請求項１９に記載の変異菌株。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（優先権）
本願は、共に２０１１年４月２２日に出願された米国仮出願第６１／４７８，１６２号及び同第６１／４７８，１６０号、並びにそれぞれ２０１１年４月２９日に出願された同第６１／４８０，６１０号、同第６１／４８０，６０２号、及び同第６１／４８０，６２９号に対する優先権を主張し、これらの全文を参照により本明細書に援用する。

【0002】

（発明の分野）
本発明の菌株及び方法は、生育特性が変化した菌株変異体を生じさせる、糸状菌における遺伝子突然変異に関する。このような変異体は、例えば、商業的用途のための酵素及び他のタンパク質又は代謝物の大量生産のための、深部培養での生育に非常に好適である。

【背景技術】

【0003】

糸状菌は、天然及び異種タンパク質を高レベルで発現させることができるので、工業、製薬、動物の健康、及び飲食品の用途のために酵素及び他のタンパク質を大量生産するのに非常に適している。糸状菌は、典型的には、培養培地（すなわち、ブロス）の中に酸素及び栄養素を導入し分配するのに適合しているバイオリアクター内での深部培養により、菌糸体として生育する。菌糸の形態的特徴は、ブロスのレオロジー特性に影響し、ひいてはバイオリアクターの性能に影響する。

【0004】

一般に、ブロスの粘性が高くなるほど酸素及び栄養素の分布は均一でなくなり、また培地を撹拌するのに必要とされるエネルギーは大きくなる。場合により、ブロスの粘度は、酸素及び栄養素の溶存に有意に干渉するほど高くなり、これにより真菌の生育に悪影響を与える。加えて、粘稠なブロスを混合及び通気するのに必要とされる電力は、生成コストを有意に押し上げ、モーター及び電力供給にかかる支出を大きくする恐れがある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

粘度の表現型を変化させる遺伝子変化を有する糸状菌に関する菌株及び方法を記載する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

一態様では、親菌株に由来する糸状菌の変異菌株であって、前記変異菌株が、前記変異菌株の細胞に、前記親菌株の細胞と比較して、変更された量の機能性Ｃｒｚ１タンパク質を生成させる、遺伝子変化を含み、前記変異菌株の細胞が、深部培養における好気性発酵の間に、（ｉ）親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、変更された撹拌量を必要とする、及び／又は、（ｉｉ）親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、変更された溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する、変異菌株を提供する。

【0007】

幾つかの実施形態では、機能性Ｃｒｚ１タンパク質の前記変更された量が、減少された量であり、前記変異菌株は、深部培養における好気性発酵の間に、（ｉ）親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌を必要とする、及び／又は、（ｉｉ）親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する。

【0008】

幾つかの実施形態では、遺伝子変化は、親菌株内に存在するｃｒｚ１遺伝子の破壊を含む。幾つかの実施形態では、ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、ｃｒｚ１遺伝子の全て又は一部の欠失の結果である。幾つかの実施形態では、ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、ｃｒｚ１遺伝子を含むゲノムＤＮＡの一部の欠失の結果である。幾つかの実施形態では、ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、ｃｒｚ１遺伝子の突然変異誘発の結果である。

【0009】

幾つかの実施形態では、ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、部位特異的組み換えを用いて行われる。幾つかの実施形態では、ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、ｃｒｚ１遺伝子の遺伝子座に選択マーカーを導入することと共に行われる。

【0010】

幾つかの実施形態では、変異菌株は、機能性Ｃｒｚ１タンパク質を生成しない。幾つかの実施形態では、変異菌株は、Ｃｒｚ１タンパク質を生成しない。

【0011】

幾つかの実施形態では、変異菌株は、対象タンパク質をコード化する遺伝子を更に含む。幾つかの実施形態では、変異菌株は、ｓｆｂ３遺伝子の破壊を更に含む。幾つかの実施形態では、変異菌株は、ｓｅｂ１遺伝子の破壊を更に含む。幾つかの実施形態では、変異菌株は、ｓｆｂ３及びｓｅｂ１遺伝子の破壊を更に含む。幾つかの実施形態では、変異菌株は、ｓｆｂ３遺伝子、ｓｅｂ１遺伝子、ｍｐｇ１遺伝子、ｇａｓ１遺伝子、及びｔｐｓ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の破壊を更に含む。幾つかの実施形態では、変異菌株は、バイオマス単位量当たり、親菌株と実質的に同量、又はそれ以上のタンパク質を生成する。

【0012】

幾つかの実施形態では、糸状菌は、チャワンタケ亜門（Pezizomycotina）の種である。幾つかの実施形態では、糸状菌は、トリコデルマ属（Trichoderma）の種、アルペルギルス属（Aspergillus）の種、フサリウム属（Fusarium）の種、スケドスポリウム属（Scedosporium）の種、ペニシリウム属（Penicillium）の種、クリソスポリウム属（Chrysosporium）の種、セファロスポリウム属（Cephalosporium）の種、タラロマイセス属（Talaromyces）の種、ゲオスミチア属（Geosmithia）の種、及びニューロスポラ属（Neurospora）の種である。幾つかの実施形態では、糸状菌としては、限定するものではないが、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）（かつてはトリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）及びハイポクレア・ジェコリーナ（Hypocrea jecorina）として分類されていた）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・イタコニカス（Aspergillus itaconicus）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）、スケドスポリウム・プロリフィカンス（Scedosporium prolificans）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・フニクロスム（Penicillium funiculosum）、ペニシリウム・クリゾゲナム（Penicillium chrysogenum）、タラロマイセス（Talaromyces）（ゲオスミチア（Geosmithia））・エマーソニイ（emersonii）、フザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、及びクリソスポリウム・ロックンオウンズ（Chrysosporium lucknowense）を挙げることができる。幾つかの実施形態では、糸状菌は、トリコデルマ・リーゼイである。

【0013】

別の態様では、糸状菌細胞の変異菌株の作製方法であって、遺伝子変化を糸状菌細胞の親菌株に導入する工程であり、前記遺伝子変化が、前記親菌株の細胞と比較して機能性Ｃｒｚ１タンパク質の生成量を変更させる、該工程、それにより、深部培養における好気性発酵の間に、（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、変更された撹拌量を必要とする、及び／又は、（ｉｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、変更された溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する、変異糸状菌細胞を生成する工程、を含む、方法を提供する。

【0014】

幾つかの実施形態では、前記遺伝子変化は、機能性Ｃｒｚ１タンパク質の生成量を低下させるか又は防ぎ、それにより、深部培養における好気性発酵の間に、（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌を必要とする、及び／又は、（ｉｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する、変異糸状菌細胞を生成する。

【0015】

幾つかの実施形態では、前記遺伝子変化は、遺伝子操作を使用して、親糸状菌細胞中のｃｒｚ１遺伝子を破壊することを含む。幾つかの実施形態では、前記遺伝子変化は、遺伝子操作を使用して、親糸状菌細胞中のｃｒｚ１遺伝子を欠失させることを含む。幾つかの実施形態では、前記遺伝子変化は、部位特異的遺伝子組み換えを使用して行われる。

【0016】

幾つかの実施形態では、ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、ｃｒｚ１遺伝子の遺伝子座に選択マーカーを導入することと共に行われる。幾つかの実施形態では、変異菌株は、バイオマス単位量当たり、親菌株と実質的に同量、又はそれ以上のタンパク質を生成する。幾つかの実施形態では、ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、ｓｆｂ３遺伝子の破壊と共に行われる。幾つかの実施形態では、ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、ｓｆｂ３遺伝子、ｓｅｂ１遺伝子、ｍｐｇ１遺伝子、ｇａｓ１遺伝子、及びｔｐｓ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の破壊と共に行われる。

【0017】

幾つかの実施形態では、変異菌株は、バイオマス単位量当たり、親菌株と実質的に同量、又はそれ以上のタンパク質を生成する。

【0018】

幾つかの実施形態では、糸状菌は、チャワンタケ亜門（Pezizomycotina）の種である。幾つかの実施形態では、糸状菌は、トリコデルマ属（Trichoderma）の種、アルペルギルス属（Aspergillus）の種、フサリウム属（Fusarium）の種、スケドスポリウム属（Scedosporium）の種、ペニシリウム属（Penicillium）の種、クリソスポリウム属（Chrysosporium）の種、セファロスポリウム属（Cephalosporium）の種、タラロマイセス属（Talaromyces）の種、ゲオスミチア属（Geosmithia）の種、及びニューロスポラ属（Neurospora）の種である。幾つかの実施形態では、糸状菌としては、限定するものではないが、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）（かつてはトリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）及びハイポクレア・ジェコリーナ（Hypocrea jecorina）として分類されていた）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・イタコニカス（Aspergillus itaconicus）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）、スケドスポリウム・プロリフィカンス（Scedosporium prolificans）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・フニクロスム（Penicillium funiculosum）、ペニシリウム・クリゾゲナム（Penicillium chrysogenum）、タラロマイセス（Talaromyces）（ゲオスミチア（Geosmithia））・エマーソニイ（emersonii）、フザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、及びクリソスポリウム・ロックンオウンズ（Chrysosporium lucknowense）を挙げることができる。幾つかの実施形態では、糸状菌は、トリコデルマ・リーゼイである。

【0019】

幾つかの実施形態では、親菌株は、対象タンパク質をコード化する遺伝子を更に含む。幾つかの実施形態では、対象タンパク質をコード化する遺伝子は、機能性Ｃｒｚ１タンパク質の生成を低下させるか又は防ぐ遺伝子変化を導入する前に、親菌株内に存在する。幾つかの実施形態では、親菌株内の対象タンパク質は、内因性遺伝子又は異種遺伝子によってコード化されている。

【0020】

別の態様では、前述の変異菌株のいずれかによって生成される対象タンパク質を提供する。

【0021】

更に別の態様では、前述の方法のいずれかによって生成され、且つ前述の特性のいずれかを有する糸状菌を提供する。

【0022】

別の態様では、親菌株に由来する糸状菌の変異菌株であって、（ａ）（ｉ）深部培養において、前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌の必要性、及び／又は、（ｉｉ）深部培養において、前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量の維持、をもたらす遺伝子変化、並びに（ｂ）（ａ）における遺伝子変化の前に前記変異菌株中に存在する対象タンパク質をコード化する遺伝子、を含む、変異菌株を提供する。

【0023】

幾つかの実施形態では、得られる変異菌株の遺伝子変化は、親菌株中に存在するｃｒｚ１遺伝子の破壊を含む。幾つかの実施形態では、ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、ｃｒｚ１遺伝子の遺伝子座に選択マーカーを導入することと共に行われる。幾つかの実施形態では、ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、ｓｆｂ３遺伝子の破壊と共に行われる。幾つかの実施形態では、ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、ｓｅｂ１遺伝子の破壊と共に行われる。幾つかの実施形態では、ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、ｓｆｂ３遺伝子、ｓｅｂ１遺伝子、ｍｐｇ１遺伝子、ｇａｓ１遺伝子、及びｔｐｓ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の破壊と共に行われる。

【0024】

本発明の変異菌株及び方法のこれらの及び他の態様及び実施形態は、添付の図を含む明細書から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】実施例１に記載のｃｒｚ１破壊ベクターｐＲＡＴＴ２６１−ｃｒｚ１Ｄのマップ。

【発明を実施するための形態】

【0026】

Ｉ．概要
本発明の菌株及び方法は、形態及び生育特性に影響する遺伝子改変のなされた糸状菌細胞の変異菌株に関する。変異細胞を深部培養で生育した場合、これらは、親菌株の細胞を含む細胞ブロスと比較して、異なるレオロジー特性を有する細胞ブロスを生成する。これらの変異菌株のうちの一部は、酵素及び他の商業的に重要なタンパク質の大量生産に非常に好適である。

【0027】

ＩＩ．用語の定義
本発明の菌株及び方法を詳細に説明するのに先立ち、明確性のために以下の用語を定義する。定義されていない用語は、関連技術において使用されるように、それらの通常の意味に従うべきである。

【0028】

本明細書で使用するとき、「トリコデルマ・リーゼイ」は、子嚢菌門（Ascomycota）チャワンタケ亜門の糸状菌を指す。この生物は、かつて、トリコデルマ・ロンギブラキアタムとして、又はハイポクレア・ジェコリーナとして分類されていた。

【0029】

本明細書で使用するとき、語句「糸状菌細胞の変異菌株」又は同様の語句は、例えば、遺伝子操作により、チャワンタケ亜門に属する親（若しくは参照）菌株に由来する（すなわち、親若しくは参照菌株から得られる又はこれらの菌株から入手可能である）糸状菌細胞の菌株を指す。本明細書では、親菌株及び変異菌株が、遺伝子改変、発現表現型、形態等の特定の特性を有すると記載する場合があるが、当業者は、それが、技術的には、このような特性を有する親菌株又は変異菌株の細胞であり、便宜上「菌株」と呼ばれることを理解するであろう。

【0030】

本明細書で使用するとき、用語「対象タンパク質」は、糸状菌において発現させることが所望されるポリペプチドを指す。このようなタンパク質は、酵素、基質結合タンパク質、界面活性タンパク質、構造タンパク質等であってよく、高レベルで発現することができ、且つ商業的目的のためのタンパク質であってよい。対象タンパク質は、変異体菌株及び／又は親菌株に対して内因性遺伝子又は異種遺伝子によってコード化され得る。対照タンパク質は、細胞内で発現してもよく、分泌タンパク質として発現してもよい。

【0031】

本明細書で使用するとき、語句「実質的に活性を有さない」又は同様の語句は、特定の活性が混和物中で検出不可能であるか又は混和物に意図された目的に干渉しない量で存在するかのいずれかであることを意味する。

【0032】

本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」（及び／又はこれらの複数形）は、ペプチド結合によって結合されているアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを指すために互換的に用いられる。アミノ酸残基については従来の一文字又は三文字コードが本明細書でも使用される。ポリマーは直鎖又は分枝鎖であってよく、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断され得る。この用語は、自然に又は介在によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば、標識成分との共役によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の１以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸等を含む）を含有するポリペプチド、並びに当該技術分野において既知の他の修飾物も定義内に含まれる。

【0033】

本明細書で使用するとき、機能的及び／又は構造的に類似するタンパク質は「関連タンパク質」であるとみなされる。このようなタンパク質は、異なる属及び／又は種の生物、あるいは更には異なる綱の生物（例えば、細菌と真菌）に由来してもよい。関連タンパク質は、一次配列分析によって決定されるか、二次若しくは三次構造分析によって決定されるか、又は免疫学的交差反応性によって決定される、ホモログも包含する。

【0034】

本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド／タンパク質誘導体」は、Ｎ−末端及びＣ−末端のいずれか若しくは両方に１つ又はそれ以上のアミノ酸を付加することにより、アミノ酸配列中の１つ若しくは多数の異なる部位で１つ又はそれ以上のアミノ酸を置換することにより、タンパク質のいずれか若しくは両方の末端で又はアミノ酸配列中の１つ又はそれ以上の部位で１つ又はそれ以上のアミノ酸を欠失させることにより、及び／又は、アミノ酸配列中の１つ又はそれ以上の部位で１つ又はそれ以上のアミノ酸を挿入することにより、タンパク質から誘導される又は誘導可能であるタンパク質を指す。タンパク質誘導体の調製は、天然タンパク質をコード化するＤＮＡ配列を改変し、このＤＮＡ配列により好適な宿主を形質転換させ、改変されたＤＮＡ配列を発現させてタンパク質誘導体を形成することにより達成することができる。

【0035】

関連タンパク質（及び誘導体）は、「変異タンパク質」を含む。変異タンパク質は、少数のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入により参照／親タンパク質（例えば、野生型タンパク質）と異なる。変異体と親タンパク質との間で異なるアミノ酸残基の個数は１又はそれ以上であり得、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０又はそれ以上のアミノ酸残基が異なり得る。変異タンパク質は、参照タンパク質と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を共有し得る。変異タンパク質は、選択したモチーフ、ドメイン、エピトープ、保存領域等においても参照タンパク質とは異なる。

【0036】

本明細書で使用するとき、用語「類似配列」は、対象タンパク質（すなわち、元々の対象タンパク質）と同様の機能、三次構造及び／又は保存残基を提供するタンパク質を構成する配列を指す。例えば、α−へリックス又はβ−シート構造を含有するエピトープ領域では、類似配列中の置換アミノ酸は、好ましくは、同一の特異的構造を維持する。この用語は、ヌクレオチド配列並びにアミノ酸配列も指す。幾つかの実施形態では、類似配列は、置き換えアミノ酸が、類似する機能又は改善された機能を示す変異酵素を生じるように開発される。幾つかの実施形態では、所望のタンパク質におけるアミノ酸の三次構造及び／又は保存残基は、所望のセグメント若しくは断片に位置するか、又はその付近に位置する。それゆえに、目的とする部分又は断片が例えば、α−へリックス又はβ−シート構造を含有する場合、置換アミノ酸は好ましくはその特異的構造を維持する。

【0037】

本明細書で使用するとき、用語「相同タンパク質」は、参照タンパク質と同様の活性及び／又は構造を有するタンパク質を指す。ホモログは、必ずしも進化的に関連している訳ではない。したがって、この用語は、異なる生物から得られる（例えば、構造及び機能の観点で）同一、類似、又は対応する酵素を包含することが意図される。幾つかの実施形態では、比較タンパク質に類似する四次、三次、及び／又は一次構造を有するホモログを同定することが望ましい。幾つかの実施形態では、相同タンパク質は、比較タンパク質に類似する免疫学的応答を惹起する。幾つかの実施形態では、相同タンパク質は、所望の活性を有する酵素を生成するように遺伝子操作される。

【0038】

配列間の相同性の程度は、当該技術分野において既知である任意の好適な方法を用いて決定することができる（例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３；Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ等のプログラム；並びにＤｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７〜９５を参照されたい）。

【0039】

例えば、ＰＩＬＥＵＰは、配列相同性レベルを決定する有用なプログラムである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブペアワイズアラインメントを用いて、一群の関連する配列から複数の配列のアラインメントを行う。ＰＩＬＥＵＰは、アラインメントを行うのに使用されるクラスタリング関係を示す系統樹をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅのプログレッシブアラインメント法の簡略化したものを使用する（Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜６０）．この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ（１９８９）により記載されるものと類似のものである（ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１〜５３）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターとしては、３．００のデフォルトギャップ重みづけ（default gap weight）、０．１０のデフォルトギャップ伸長重みづけ（default gap length weight）及び重みつき末端ギャップ（weighted end gaps）が挙げられる。有用なアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０）及びＫａｒｌｉｎら（（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３〜８７）に記載されている。１つの特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０〜８０を参照されたい）。パラメーター「Ｗ」、「Ｔ」及び「Ｘ」は、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１の語長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照されたい）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ’５、Ｎ’−４、及び両菌株の比較を用いる。

【0040】

本明細書で使用するとき、少なくとも２つの核酸又はポリペプチドの文脈における語句「実質的に同様である」及び「実質的に同一である」は典型的には、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、参照（例えば、野生型）配列と比較して、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約７５％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、又は更には少なくとも約９９％の同一性又はそれ以上の同一性を有する配列を含むことを意味する。配列同一性は、標準的なパラメーターを用いて、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ及びＣＬＵＳＴＡＬ等の既知のプログラムを使用して決定され得る。（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５；Ｋａｒｉｎら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３；及びＨｉｇｇｉｎｓら（１９８８）Ｇｅｎｅ ７３：２３７〜２４４を参照されたい）。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）より公的に入手可能である。また、データベースは、ＦＡＳＴＡを用いてサーチすることができる（Ｐｅａｒｓｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４〜４８）。２つのポリペプチドが実質的に同一である一つの指標は、第一のポリペプチドが第二のポリペプチドと免疫学的に交差反応することである。典型的には、保存アミノ酸置換によって異なるポリペプチドは免疫学的に交差反応する。したがって、例えば、２つのポリペプチドが保存置換のみが異なるポリペプチド場合は、実質的に第二ポリペプチドと同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である他の指標は、２つの分子が互いにストリンジェントな条件（例えば、中程度から高度にストリンジェントな条件の範囲内）において互いにハイブリッドすることである。

【0041】

本明細書で使用するとき、用語「遺伝子」は、タンパク質又はＲＮＡをコード化し、発現を方向づける核酸を指すという点で、用語「対立遺伝子」と同義である。糸状菌の栄養型は一般に半数体であり、したがって、特定の表現型を付与するのに特定の遺伝子の単一コピー（すなわち、単一対立遺伝子）で十分である。

【0042】

本明細書で使用するとき、用語「野性型」及び「ネイティブ」は、互換的に用いられ、自然界でみられる遺伝子、タンパク質、又は菌株を指す。

【0043】

本明細書で使用するとき、「遺伝子の欠失」は、宿主細胞のゲノムから遺伝子が除去されることを指す。遺伝子が、遺伝子のコード配列に直に隣接して位置しない制御エレメント（例えば、エンハンサーエレメント）を含む場合、遺伝子の欠失は、コード配列の欠失、並びに、任意で隣接するエンハンサーエレメント（プロモーター及び／又はターミネーター配列を含むが、これらに限定されない）の欠失を指す。

【0044】

本明細書で使用するとき、「遺伝子の破壊」は、細胞が宿主内で例えばタンパク質等の機能性遺伝子産物の生成を実質的に防ぐ任意の遺伝子操作又は化学操作、すなわち、突然変異を広く指す。破壊の方法の例としては、ポリペプチドをコード化する配列、プロモーター、エンハンサー、又は他の制御エレメントを含む遺伝子の任意の部分の完全な又は部分的な欠失、あるいはその突然変異誘導が挙げられ、突然変異誘導は、置換、挿入、欠失、逆位及びこれらの組み合わせ並びに変形を包含し、これら突然変異はいずれも機能性遺伝子産物の生成を実質的に防ぐ。また、遺伝子は、ＲＮＡｉ、アンチセンス、又は遺伝子発現を消失させる任意の他の方法を用いて破壊してもよい。

【0045】

本明細書で使用するとき、用語「遺伝子操作」及び「遺伝子変化」は、互換的に用いられ、核酸配列の変更／変化を指す。変化は、核酸配列中の少なくとも１つの核酸の置換、欠失、挿入、又は化学的修飾を含んでよいが、これらに限定されない。

【0046】

本明細書で使用するとき、「好気性発酵」は、酸素の存在下での生育を指す。

【0047】

本明細書で使用するとき、用語「細胞ブロス」は、総じて、液体／深部培養における培地及び細胞を指す。

【0048】

本明細書で使用するとき、用語「細胞集団」は、液体／深部培養において存在する細胞成分（インタクトな細胞及び溶解細胞を包含する）を指す。細胞集団は、乾燥又は湿潤重量で表され得る。

【0049】

本明細書で使用するとき、用語「レオロジー」は、物質の変形及び流動に関連する物理学の一分野を指す。

【0050】

本明細書で使用するとき、「粘度」は、剪断応力又は引張応力等の機械的応力による変形に対する流体の抵抗の尺度である。本明細書の文脈では、粘度は、例えば、ローター／インペラによりもたらされるような機械的応力に対する、糸状菌を含む細胞ブロスの抵抗を指し得る。細胞ブロスの粘度は直接測定するのが困難であり得るため、予め選択された量で撹拌した場合の培養ブロスの溶存酸素量、予め選択された溶存酸素量を維持するのに必要とされる撹拌量、予め選択された溶存酸素量を維持するために細胞ブロスを撹拌するのに必要とされる電力量、又は更には固体培地上のコロニー形態といった、粘度の間接的尺度を用いてもよい。

【0051】

本明細書で使用するとき、糸状菌細胞の「粘度を変化させる」変異菌株は、親菌株により生成される等価な細胞ブロスと比較して、粘度が低下した又は増加した（すなわち、剪断又は引張応力に対する抵抗が低下した又は増加した）細胞ブロスを生成する変異菌株を指す。一般に、同等の細胞ブロス又は等価な細胞ブロスは、同等の細胞集団を含む。好ましくは、粘度を変化させる変異菌株と親菌株との間の差異は、粘度の任意の直接又は間接的尺度に関して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は更には少なくとも５０％、又はそれ以上である。糸状菌細胞ブロスの粘性を比較するための方法が本明細書に記載される。

【0052】

本明細書で使用するとき、糸状菌細胞の「粘度を低下させる」変異菌株は、親菌株により生成される等価な細胞ブロスと比較して、粘度が低下した（すなわち、剪断又は引張応力に対する抵抗が低下した）細胞ブロスを生成する変異菌株を指す。好ましくは、粘度を変化させる変異菌株と親菌株との間の差異は、粘度の任意の直接又は間接的尺度に関して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は更には少なくとも５０％、又はそれ以上である。

【0053】

本明細書で使用するとき、「溶存酸素」（ＤＯ）は、体積／体積単位で測定した場合の、液体培地中に存在する酸素（Ｏ_２）の量を指す。溶存酸素レベルは、高レベル、例えば、発酵全体を通して１７０−１００％〜２０％、１００−８０％〜２０％、７０％〜２０％、６５％〜２０％、６０％〜２０％、５５％〜２０％、５０％〜２０％、４５％〜２０％、４４％〜２０％、４３％〜２０％、４２％〜２０％、４１％〜２０％、４０％〜２０％、３５％〜２０％、３０％〜２０％、及び２５％〜２０％で維持され得る。特に、溶存酸素は、発酵の開始時において高く、発酵が進行するにつれて減少してよい。溶存酸素レベルは、発酵の撹拌量及び／又は空気若しくは酸素の添加速度によって制御することができる。培養物は、４００〜７００ｒｐｍで撹拌してよく、溶存酸素レベルは、空気又は酸素の流速及びインペラ速度を変化させることによって、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、及び５５％超で維持される。

【0054】

本明細書で使用するとき、「主要な遺伝的決定基」は、他の遺伝子又はその遺伝子操作の不在下で、特定の表現型を付与するのに必要且つ十分である遺伝子又はその遺伝子操作を指す。しかし、特定の遺伝子が特定の表現型を付与するのに必要且つ十分であることは、更なる遺伝子操作によって表現型に追加の効果が達成され得る可能性を除外するものではない。

【0055】

本明細書で使用するとき、「機能性ポリペプチド／タンパク質」は、酵素活性、結合活性、表面活性特性等の活性を保有するタンパク質であって、突然変異誘導、切頭ないしは別の方法で改変されてその活性が消失又は低下していないタンパク質である。機能性ポリペプチドは、指定に従って、熱安定性又は熱不安定性であり得る。

【0056】

本明細書で使用するとき、「機能性遺伝子」は、活性な遺伝子産物を、典型的にはタンパク質等を生成するために、細胞成分により使用可能な遺伝子である。機能性遺伝子は、活性遺伝子産物を生成するために細胞成分によって用いられ得ない、又は活性遺伝子産物を生成するために細胞成分によって用いられる可能性が低いように改変されている破壊遺伝子の反対語である。

【0057】

本明細書で使用するとき、変異細胞は、変異菌株と親菌株の間のタンパク質発現の差異が約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約７％未満、約５％未満、又は更には約３％未満であるならば、親菌株と比較して「高レベルのタンパク質発現及び／又は分泌を維持又は保持している」。

【0058】

本明細書で使用するとき、宿主細胞は、これらが、野生型タンパク質に特徴的な活性、特に菌糸の伸張を促進するないしは別の方法で液体培地において糸状菌の粘度を増加させる活性を呈する機能性タンパク質／ポリペプチドの生成を防ぐように遺伝子的又は化学的に変更されているならば、「特定のタンパク質の生成を防ぐように改変」されている。このような改変としては、限定するものではないが、タンパク質をコード化する遺伝子の欠失又は破壊、コード化されるポリペプチドが上記活性を失うような遺伝子の改変、翻訳後プロセシング又は安定性に影響を与える遺伝子の改変、及びこれらの組み合わせが挙げられる。

【0059】

本明細書で使用するとき、「対象タンパク質」は、糸状菌細胞の深部培養において生成されることが所望されるタンパク質である。一般的に、対象タンパク質は、工業、製薬、動物の健康、及び飲食品用途のために商業的に重要であるので、大量に生産することが望ましい。対象のタンパク質は、糸状菌により発現される多種多様な他のタンパク質とは区別されるものであり、こうした他のタンパク質は一般に製品としての関心の対象とはならず、主にバックグラウンドのタンパク質混入物と見なされる。

【0060】

本明細書で使用するとき、変異菌株は、変異菌株により生成されるタンパク質量の低下が、親菌株により生成されるタンパク質量と比較して２０％以下、１５％以下、１０％以下、更には５％以下であるならば、バイオマス単位量当たり、親菌株と「実質的に同量」のタンパク質を生成することになり、ここで、タンパク質量は、タンパク質生成が測定される細胞のバイオマスの合計量に対して正規化され、バイオマスは湿潤（例えば、細胞ペレットの）又は乾燥重量のいずれかで表現され得る。

【0061】

本明細書で使用するとき、変異菌株は、変異菌株により生成されるタンパク質量の増加が、親菌株と比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％以上であるならば、親菌株よりも「バイオマス単位量当たり、実質的に多くのタンパク質」を生成することになり、ここで、タンパク質量は、タンパク質生成が測定される細胞のバイオマスの合計量に対して正規化され、バイオマスは湿潤（例えば、細胞ペレットの）又は乾燥重量のいずれかで表現され得る。

【0062】

本明細書で使用するとき、「蛍光色素」は、蛍光染料である。好ましい蛍光色素は、真菌の細胞壁中のセルロース及び／又はキチンに結合する。

【0063】

本明細書で使用するとき、単数形の冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容的に明らかに示されていない限り、複数の対象物も包含する。本明細書に引用される参考文献は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。以下の省略形／頭字語は、特に定めのない限り、以下の意味を有する。

【0064】

【表1】

【0065】

ＩＩＩ．Ｃｒｚ１タンパク質生成量が変化した糸状菌株
一態様では、親菌株に由来する糸状菌の変異菌株であって、前記変異菌株が、前記変異菌株の細胞に、前記親菌株の細胞と比較して、変更された量の機能性Ｃｒｚ１タンパク質を生成させる、遺伝子変化を含む、変異菌株を提供する。変異菌株の細胞は、続いて、深部培養における好気性発酵の間に親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、変更された撹拌量を必要とする、又は親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、変更された溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する。

【0066】

場合により、この遺伝子変化は、変異菌株の細胞の機能性Ｃｒｚ１タンパク質の変更された量が、親菌株の細胞と比較して、減少された量であり、得られた細胞ブロスは、親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌を必要とする、又は予め選択された撹拌量でより高い溶存酸素量を維持する。このような場合には、この変異菌株の細胞集団は、親菌株の細胞集団と比較して粘度の低下を呈するものと考えられ、このことは、実施例に記載の通り、溶存酸素量及び撹拌に関する観察を説明する。

【0067】

機能性Ｃｒｚ１タンパク質の量の減少された量は、親菌株中に存在するｃｒｚ１遺伝子を破壊することで生じ得る。ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、粘度を低下させる表現型を変異菌株に対して付与する主要な遺伝的決定基であるため、このような変異菌株は、ｃｒｚ１遺伝子が破壊されてさえいればよく、その一方で他の全ての遺伝子が無傷のままであってもよい。場合により、変異菌株は任意選択で、これらが由来する親菌株と比較して、追加の遺伝子変化を含み得る。このような追加の遺伝子変化は、粘度を低下させるために必須ではないが、更に粘度を低下させたり、変異菌株に他の利点を付与したりすることができる。

【0068】

ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、機能性ｃｒｚ１遺伝子産物、すなわち、Ｃｒｚ１タンパク質の発現を実質的に防ぐ任意の好適な方法を用いて行うことができる。当業者に知られている通り、破壊の代表的な例としては、限定されないが、例えば、Ｃｒｚ１コード配列、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、又は別の制御エレメントの完全な又は部分的な欠失を含むｃｒｚ１遺伝子の完全な又は部分的な欠失；及びｃｒｚ１遺伝子の任意の部分を含む染色体の一部の完全な又は部分的な欠失が挙げられる。ｃｒｚ１遺伝子を破壊する特定の方法としては、ｃｒｚ１遺伝子の任意の部分、例えば、Ｃｒｚ１コード配列、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー又は別の制御エレメントにおけるヌクレオチドの置換又は挿入が挙げられる。好ましくは、欠失、挿入及び／又は置換（総じて、突然変異と称される）は、一般に特定の核酸配列を標的としない化学的変異誘導とは対照的な配列特異的分子生物学技術を用いる遺伝子操作により導入される。それにもかかわらず、化学的変異誘導をｃｒｚ１遺伝子を破壊するために用いることもできる。

【0069】

ｃｒｚ１遺伝子における突然変異は、ｃｒｚ１プロモーターの効率を低下させ、ｃｒｚ１エンハンサーの効率を低下させ、ｃｒｚ１ ｍＲＮＡのスプライシング又はエディティングに干渉し、ｃｒｚ１ ｍＲＮＡの翻訳に干渉し、Ｃｒｚ１コード配列に終止コドンを導入して完全長のＣｒｚ１タンパク質の翻訳を防ぎ、Ｃｒｚ１タンパク質のコード配列を変化させて、より活性の弱い若しくは不活性のタンパク質を生成するか又は他の核タンパク質成分とＣｒｚ１との相互作用を低下させ、Ｃｒｚ１タンパク質のコード配列を変化させて、より不安定なタンパク質を生成させるために変化させるか又はタンパク質を破壊するための標的にし、Ｃｒｚ１タンパク質のミスフォールドを引き起こすか又は不正確に修飾をさせ（例えば、グリコシル化による）、あるいは、Ｃｒｚ１タンパク質の細胞輸送に干渉し得る。

【0070】

１つの実施形態では、これら及び他の遺伝子操作は、機能性Ｃｒｚ１タンパク質の発現を低下させるか又は防ぐ、あるいは、Ｃｒｚ１タンパク質の正常な生物活性を低下させるか又は防ぎ、それにより粘度を低下させる表現型の生じる細胞内における形態変化を生み出す。

【0071】

他の場合には、遺伝子変異は、機能性Ｃｒｚ１タンパク質の発現を増加又は回復させ、あるいは、Ｃｒｚ１タンパク質の通常の生物活性を増加させ、それにより、粘性が増加又は回復する表現型を生じる形態変化を生み出す。Ｃｒｚ１機能を増加又は回復させる代表的な遺伝子変化は、ｃｒｚ１遺伝子の追加のコピーを細胞中に導入する、ｃｒｚ１プロモーター、エンハンサー又は他の制御エレメントの効率を増加させる、Ｃｒｚ１タンパク質をコード化するｍＲＮＡの翻訳を増加させる、Ｃｒｚ１タンパク質をコード化するｍＲＮＡの安定性を増加させる、Ｃｒｚ１タンパク質の活性又は安定性を増加させる変化をｃｒｚ１遺伝子に導入する、他のタンパク質若しくは核酸等との相互作用を調節する変化をｃｒｚ１遺伝子に導入するものである。Ｃｒｚ１の機能を増加又は回復させる他の遺伝子変化は、機能性Ｃｒｚ１タンパク質の発現を低下させるか又は防ぐ遺伝子変化の効果を逆転するものである。

【0072】

上記のように操作及び使用するための糸状菌細胞は一般に、子嚢菌門チャワンタケ亜門からのものであり、特に栄養菌糸状態を有し且つｃｒｚ１遺伝子のホモログを含む真菌である。このような生物としては、商業的に重要な工業及び製薬タンパク質の生成に使用される糸状菌が挙げられ、限定するものではないが、トリコデルマ属の種、アルペルギルス属の種、フサリウム属の種、スケドスポリウム属の種、ペニシリウム属の種、クリソスポリウム属の種、セファロスポリウム属の種、タラロマイセス属の種、ゲオスミチア属の種、及びニューロスポラ属の種が挙げられる。具体的な生物としては、限定するものではないが、トリコデルマ・リーゼイ（かつてはトリコデルマ・ロンギブラキアタム又はハイポクレア・ジェコリーナとして分類されていた）、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・フミガーツス、アスペルギルス・イタコニカス、アスペルギルス・オリザエ、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・テレウス、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ジャポニクス、スケドスポリウム・プロリフィカンス、ニューロスポラ・クラッサ、ペニシリウム・フニクロスム、ペニシリウム・クリゾゲナム、タラロマイセス（ゲオスミチア）・エマーソニイ、フザリウム・ベネナタム、及びクリソスポリウム・ロックンオウンズが挙げられる。

【0073】

真菌では、カルシニューリン媒介Ｃａ^２＋シグナル伝達が、多くの生物において生育、発生、及び毒性に必要であることが示されている。高カチオンレベル及びアルカリ性ｐＨを含む多様な環境条件に適応することが必須である。遺伝子ｃｒｚ１は、カルシニューリンによって制御される転写因子をコード化する。Ｃｒｚ１ｐ転写因子は、ホスファターゼカルシニューリンがＣａ^２＋／カルモジュリンによって活性化されたときに脱リン酸化される。次いで、それは核に入り、多数の遺伝子の発現を誘導するが、そのうち多くは、細胞壁に関連する機能を有するタンパク質をコード化する（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら，２００２；Ｌａｇｏｒｃｅら，２００３；Ｇａｒｃｉａら，２００４；Ｋａｒａｂａｂａら，２００６；Ｐａｒｄｉｎｉら，２００６，Ｍｕｎｒｏ，Ｃ．ら２００９）。ｃｒｚ１又はホモログの欠失によって、菌糸の形態が変化する場合がある（Ｋｏｔｈｅ，Ｇ．及びＦｒｅｅ，Ｓ．１９９８，Ｐｒｏｋｉｓｃｈ，Ｈ．ら１９９７）。

【0074】

本開示は、形態変化とＣｒｚ１との関連について実験的証拠を提供する。

【0075】

理論に縛られるものではないが、糸状菌におけるｃｒｚ１発現及び／又は活性の変化は、細胞壁を変化させ、それによりより短い菌糸を特徴とするより小さな細胞形態、及びより酵母に類似した外観をもたらすと考えられる。

【0076】

クエリーとしてＴ．リーゼイのＣｒｚ１アミノ酸配列を用いて糸状菌及び酵母の公的に入手可能なゲノム配列を検索するためにＢＬＡＳＴを使用したところ、ホモログは見つかったが、これらタンパク質の機能は未知である。Ｔ．リーゼイ（配列番号１）、Ｅ．ニデュランス（配列番号２）、Ｓ．セレヴィシエ（cerevisiae）（配列番号３）、Ａ．フミガーツス（配列番号４）、Ｐ．マルネッフェイ（marneffei）（配列番号５）、及びＡ．フラバス（flavus）（配列番号６）のＣｒｚ１タンパク質を以下に示す。

【0077】

Ｔ．リーゼイのＣｒｚ１タンパク質の予測アミノ酸配列を、以下の配列番号１として示す：
ＲＧＲＳＰＳＡＧＧＦＱＳＤＩＮＱＳＨＳＰＡＲＳＰＬＡＰＴＮＥＱＰＳＡＧＬＧＶＧＬＧＱＱＱＱＲＡＦＡＡＰＬＨＰＮＹＤＳＦＧＡＮＧＦＬＧＡＱＡＮＡＶＤＰＴＮＧＦＤＰＳＡＳＦＧＱＱＰＡＴＧＰＤＳＴＬＳＬＮＡＱＡＱＨＮＹＬＳＰＮＬＨＤＧＤＦＳＬＦＰＳＡＡＥＱＧＤＱＹＮＡＰＬＦＥＱＰＰＬＧＤＬＮＡＭＴＳＰＨＳＨＱＳＰＴＰＰＱＬＦＱＰＤＳＬＱＳＰＰＦＮＲＨＱＦＳＳＰＰＴＨＳＲＮＡＳＬＧＰＥＡＡＬＬＰＳＱＩＧＤＷＴＱＰＱＦＱＧＨＲＲＴＰＳＥＹＳＤＶＳＳＶＡＰＳＰＨＬＶＳＳＤＴＦＤＡＤＱＳＧＨＳＰＬＱＲＰＡＤＶＳＬＹＱＥＶＬＧＩＧＳＦＳＬＡＤＨＧＳＰＧＹＨＧＲＳＰＳＨＳＰＡＩＳＰＲＩＭＰＱＱＭＰＤＴＭＱＰＳＦＮＬＩＰＰＮＧＧＦＤＧＶＳＧＹＰＤＬＱＰＳＨＥＳＦＰＳＬＳＧＧＭＧＧＤＭＨＱＭＡＰＰＡＩＮＩＤＦＡＰＴＮＳＲＱＧＳＦＥＰＰＫＳＱＭＤＱＤＳＬＴＰＰＥＲＧＲＰＫＳＲＰＲＡＶＴＤＰＦＨＰＧＳＧＩＬＰＰＧＮＬＧＳＳＬＧＶＤＬＡＡＲＳＤＴＡＳＲＳＬＳＰＬＤＲＳＧＴＳＳＰＡＳＲＲＲＱＳＴＳＳＶＰＮＮＶＩＡＬＲＬＡＤＰＥＹＱＮＳＱＥＡＧＴＳＫＲＭＱＫＨＰＡＴＦＱＣＴＬＣＰＫＲＦＴＲＡＹＮＬＲＳＨＬＲＴＨＴＤＥＲＰＦＶＣＴＶＣＧＫＡＦＡＲＱＨＤＲＫＲＨＥＳＬＨＳＧＥＫＫＦＶＣＫＧＤＬＫＴＧＧＱＷＧＣＧＲＲＦＡＲＡＤＡＬＧＲＨＦＲＳＥＡＧＲＩＣＩＫＰＬＬＤＥＥＭＶＥＲＱＲＱＷＱＥＱＲＭＱＱＮＭＡＱＮＭＡＮＰＱＶＭＧＭＤＡＧＰＡＹＰＭＤＡＳＧＮＹＴＬＰＱＡＬＬＡＱＹＰＡＬＡＱＭＮＷＳＡＴＤＭＧＧＧＬＤＤＥＬＳＧＲＳＳＦＤＡＳＤＹＤＤＧＤＤＧＧＹ
エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）のＣｒｚ１タンパク質のアミノ酸配列を、以下の配列番号２として示す：
ＭＤＰＱＤＴＬＱＤＬＧＱＡＰＡＡＨＩＮＲＳＡＳＰＳＡＨＡＨＱＱＹＮＮＮＨＮＤＬＴＩＤＰＳＶＴＳＮＳＳＹＰＰＳＳＦＡＮＮＳＡＰＧＳＥＡＦＡＹＳＳＳＹＬＴＰＡＴＡＴＤＨＮＦＡＲＰＳＬＱＩＰＱＳＦＤＱＧＬＳＨＱＰＡＥＥＮＦＳＮＬＬＮＳＮＴＧＤＦＤＦＳＬＹＱＧＳＳＰＮＮＴＧＳＤＹＰＳＳＧＬＬＤＰＱＱＳＧＮＱＡＶＮＰＶＤＬＶＳＱＩＰＳＰＨＰＳＮＳＳＱＴＳＰＬＤＱＰＰＳＳＡＭＳＰＰＡＳＳＰＧＴＦＹＴＰＱＨＳＲＨＴＳＬＤＰＡＳＡＡＹＭＴＮＶＳＨＰＥＷＱＡＶＭＮＮＳＡＦＨＧＨＲＲＡＰＳＥＶＳＥＶＳＳＡＡＨＳＰＹＬＰＱＨＤＳＦＤＶＡＤＮＮＰＳＰＬＬＡＡＱＮＤＰＳＬＹＤＮＡＡＬＧＩＥＳＦＴＬＳＥＨＨＱＰＱＴＱＧＩＳＰＨＨＳＰＹＩＳＰＱＬＭＰＱＨＰＴＤＩＩＰＧＧＰＦＩＳＡＰＡＴＮＳＡＹＰＴＰＰＴＥＧＹＰＮＧＧＤＩＧＱＡＳＱＭＡＰＰＳＩＮＶＥＦＡＰＰＡＫＡＱＶＦＰＰＥＫＳＴＡＤＭＤＳＬＳＰＰＰＳＬＲＴＳＲＭＲＳＫＳＤＰＹＡＶＳＩＳＲＰＲＳＰＳＳＰＳＡＳＬＤＡＬＡＡＳＳＰＲＳＬＳＰＦＮＶＧＲＨＰＹＳＮＰＳＳＲＥＰＳＰＡＲＳＡＲＲＬＳＴＳＳＶＤＳＲＮＹＩＬＧＬＡＤＰＱＲＰＧＳＮＮＴＤＳＫＲＶＱＫＨＰＡＴＦＱＣＴＬＣＰＫＲＦＴＲＡＹＮＬＲＳＨＬＲＴＨＴＤＥＲＰＦＶＣＴＶＣＧＫＡＦＡＲＱＨＤＲＫＲＨＥＧＬＨＳＧＥＫＫＦＶＣＲＧＤＬＳＲＧＧＱＷＧＣＧＲＲＦＡＲＡＤＡＬＧＲＨＦＲＳＥＡＧＲＩＣＩＫＰＬＬＤＥＥＳＱＥＲＥＲＴＬＩＮＱＱＱＱＨＬＱＰＶＮＱＰＬＭＬＰＧＱＧＴＥＡＱＨＴＧＳＦＩＬＰＡＡＬＬＡＱＹＰＡＬＱＴＬＱＷＤＱＩＰＡＧＴＤＤＴＳＤＩＧＧＲＮＳＦＤＡＳＳＧＧＥＦＧＦＤＤＤＥＳＧＩＳＶＳＧＭＳＴＧＹＡＳＤＱＧＮＩＹＮＶＤＡＱＧＱＭＬＧＶＮＰＧＥＡＧＹＡＮＰＮＷＧＫ
サッカロマイセス・セレヴィシエのＣｒｚ１タンパク質のアミノ酸配列を、以下の配列番号３として示す：
ＭＳＦＳＮＧＮＭＡＳＹＭＴＳＳＮＧＥＥＱＳＩＮＮＫＮＤＩＤＤＮＳＡＹＲＲＮＮＦＲＮＳＳＮＳＧＳＨＴＦＱＬＳＤＬＤＬＤＶＤＭＲＭＤＳＡＮＳＳＥＫＩＳＫＮＬＳＳＧＩＰＤＳＦＤＳＮＶＮＳＬＬＳＰＳＳＧＳＹＳＡＤＬＮＹＱＳＬＹＫＰＤＬＰＱＱＱＬＱＱＱＱＬＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＫＱＴＰＴＬＫＶＥＱＳＤＴＦＱＷＤＤＩＬＴＰＡＤＮＱＨＲＰＳＬＴＮＱＦＬＳＰＲＳＮＹＤＧＴＴＲＳＳＧＩＤＳＮＹＳＤＴＥＳＮＹＨＴＰＹＬＹＰＱＤＬＶＳＳＰＡＭＳＨＬＴＡＮＮＤＤＦＤＤＬＬＳＶＡＳＭＮＳＮＹＬＬＰＶＮＳＨＧＹＫＨＩＳＮＬＤＥＬＤＤＬＬＳＬＴＹＳＤＮＮＬＬＳＡＳＮＮＳＤＦＮＮＳＮＮＧＩＩＮＴＡＤＴＱＮＳＴＩＡＩＮＫＳＫＶＧＴＮＱＫＭＬＬＴＩＰＴＳＳＴＰＳＰＳＴＨＡＡＰＶＴＰＩＩＳＩＱＥＦＮＥＧＨＦＰＶＫＮＥＤＤＧＴＬＱＬＫＶＲＤＮＥＳＹＳＡＴＮＮＮＮＬＬＲＰＤＤＮＤＹＮＮＥＡＬＳＤＩＤＲＳＦＥＤＩＩＮＧＲＫＬＫＬＫＫＳＲＲＲＳＳＱＴＳＮＮＳＦＴＳＲＲＳＳＲＳＲＳＩＳＰＤＥＫＡＫＳＩＳＡＮＲＥＫＬＬＥＭＡＤＬＬＰＳＳＥＮＤＮＮＲＥＲＹＤＮＤＳＫＴＳＹＮＴＩＮＳＳＮＦＮＥＤＮＮＮＮＮＬＬＴＳＫＰＫＩＥＳＧＩＶＮＩＫＮＥＬＤＤＴＳＫＤＬＧＩＬＬＤＩＤＳＬＧＱＦＥＱＫＶＧＦＫＮＤＤＮＨＥＮＮＤＮＧＴＦＳＶＫＫＮＤＮＬＥＫＬＤＳＶＴＮＮＲＫＮＰＡＮＦＡＣＤＶＣＧＫＫＦＴＲＰＹＮＬＫＳＨＬＲＴＨＴＮＥＲＰＦＩＣＳＩＣＧＫＡＦＡＲＱＨＤＲＫＲＨＥＤＬＨＴＧＫＫＲＹＶＣＧＧＫＬＫＤＧＫＰＷＧＣＧＫＫＦＡＲＳＤＡＬＧＲＨＦＫＴＥＳＧＲＲＣＩＴＰＬＹＥＥＡＲＱＥＫＳＧＱＥＳ
アスペルギルス・フミガーツスのＣｒｚ１タンパク質のアミノ酸配列を、以下の配列番号４として示す：
ＭＡＳＱＥＭＦＰＥＬＧＱＳＰＡＰＧＶＫＳＲＧＶＳＲＳＰＨＰＨＱＱＱＱＱＱＱＨＱＱＨＱＧＱＦＴＧＴＶＴＧＬＤＬＤＳＳＩＡＴＡＳＳＦＡＮＳＳＦＤＰＮＳＮＮＶＳＰＳＡＥＳＹＧＹＴＡＡＧＹＬＳＧＴＰＡＳＱＴＤＱＮＹＡＮＳＬＱＩＰＱＳＹＧＴＧＬＶＰＱＦＮＥＳＲＧＬＰＩＱＱＱＳＱＱＱＨＨＱＱＰＳＬＤＤＮＦＳＤＬＬＮＳＮＡＴＥＹＤＦＮＴＶＹＱＴＨＳＰＳＳＮＴＡＰＥＹＤＳＳＬＬＬＤＰＱＶＨＱＱＳＨＰＴＱＩＰＳＳＨＳＳＴＳＰＱＩＳＰＬＥＱＱＱＨＳＳＰＧＰＭＳＴＱＧＳＴＴＶＡＹＹＴＰＱＨＳＲＨＡＳＬＤＰＡＴＡＡＦＬＴＳＮＴＨＰＤＷＱＡＶＭＧＮＳＡＡＦＱＧＨＲＲＡＰＳＥＶＳＥＩＳＳＡＡＰＳＰＹＬＳＱＨＥＳＦＤＧＶＤＮＮＰＳＰＬＬＡＰＱＮＤＰＳＬＹＤＳＡＬＧＩＥＮＦＴＬＳＥＱＨＱＱＨＱＧＦＳＰＡＨＳＰＹＩＳＰＲＬＭＰＱＱＧＱＥＭＭＰＮＶＰＹＬＳＧＰＡＰＮＴＱＹＰＴＰＰＮＤＭＹＧＮＧＡＥＧＭＭＮＭＳＱＧＴＨＰＳＶＤＩＧＱＡＳＱＭＡＰＰＳＩＮＶＥＦＡＰＰＳＲＩＰＳＦＧＰＳＫＰＡＳＮＬＤＳＬＳＰＰＰＳＳＴＲＳＲＧＲＳＫＳＤＰＹＡＨＰＳＴＳＲＬＲＳＳＳＴＳＳＳＬＤＰＬＡＰＴＴＰＲＳＬＳＰＦＤＳＦＧＲＱＱＱＳＮＰＳＳＲＤＰＳＰＳＲＳＮＲＲＬＳＴＳＳＩＤＳＲＮＹＩＬＧＬＡＤＰＱＲＰＧＡＳＰＮＤＳＫＲＶＱＫＨＰＡＴＦＱＣＮＬＣＰＫＲＦＴＲＡＹＮＬＲＳＨＬＲＴＨＴＤＥＲＰＦＶＣＴＶＣＧＫＡＦＡＲＱＨＤＲＫＲＨＥＧＬＨＳＧＥＫＫＦＶＣＱＧＥＬＳＲＧＧＱＷＧＣＧＲＲＦＡＲＡＤＡＬＧＲＨＦＲＳＥＡＧＲＩＣＩＫＰＬＬＤＥＥＳＱＥＲＥＲＳＬＭＤＱＱＱＨＨＬＱＰＬＰＱＱＶＭＶＰＶＤＮＰＨＡＧＮＦＶＬＰＡＡＬＬＡＱＹＰＡＬＱＴＬＱＷＤＱＩＡＡＳＡＤＤＰＳＤＩＧＧＲＳＳＦＤＡＳＳＧＮＥＦＧＦＥＤＤＤＳＧＬＳＳＶＳＧＩＮＡＧＹＳＡＡＧＮＦＹ
ペニシリウム・マルネッフェイのＣｚｒ１タンパク質のアミノ酸配列を、以下の配列番号５として示す：
ＭＥＮＨＧＱＹＡＮＲＧＲＳＰＳＡＳＶＨＳＲＮＶＳＰＳＰＨＨＧＱＨＳＰＹＨＤＰＳＡＡＧＬＭＬＤＡＳＴＡＧＴＧＹＱＳＮＬＴＦＴＴＡＰＰＬＳＳＳＬＡＰＤＳＮＮＰＤＬＹＮＮＦＬＴＡＴＴＴＳＱＱＨＤＳＬＡＡＱＮＤＱＦＡＳＳＶＡＡＴＦＱＤＱＬＤＱＳＡＴＨＱＤＡＮＹＳＮＬＬＮＰＮＰＮＤＹＤＦＴＱＹＡＶＧＧＤＮＡＶＭＱＳＡＦＤＳＳＬＬＬＤＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＨＮＴＱＮＶＱＬＭＧＱＧＤＭＴＱＭＧＳＰＮＮＬＬＳＰＥＨＨＳＳＰＧＮＳＨＴＳＰＰＩＳＳＧＰＦＹＳＰＧＨＳＲＳＡＳＬＤＰＭＳＡＡＹＭＳＮＨＮＱＡＱＤＷＫＮＭＬＥＮＨＳＦＱＳＨＲＲＡＰＳＥＨＳＤＶＳＳＶＡＨＳＰＹＡＧＨＨＥＳＦＤＡＬＤＧＡＳＰＳＬＧＡＱＮＤＰＶＬＹＤＮＴＬＡＭＤＳＦＴＬＳＥＱＱＱＧＬＳＰＨＨＳＰＹＩＳＰＱＭＰＳＱＤＩＴＳＤＡＦＩＬＳＧＱＱＮＭＴＱＦＰＴＬＰＨＤＩＦＴＧＱＰＤＤＧＭＬＡＧＴＱＡＰＤＭＳＧＬＤＡＮＱＭＮＮＭＶＰＰＰＳＩＮＶＥＦＡＰＰＳＲＭＰＳＦＧＰＧＧＥＮＤＦＤＡＬＳＰＰＳＲＧＳＲＧＲＳＫＳＤＰＦＧＲＰＴＰＩＶＲＰＨＳＱＳＶＳＳＴＳＳＬＤＰＡＶＧＳＳＰＲＳＬＳＰＦＤＳＭＧＧＳＲＳＮＰＧＳＲＧＶＳＰＡＳＲＳＳＩＲＲＱＳＴＳＳＩＥＲＫＶＩＬＤＬＡＤＰＱＲＰＧＡＴＰＧＥＳＫＲＴＱＫＨＰＡＴＦＱＣＮＬＣＰＫＲＦＴＲＡＹＮＬＲＳＨＬＲＴＨＴＤＥＲＰＦＶＣＴＶＣＧＫＡＦＡＲＱＨＤＲＫＲＨＥＧＬＨＳＧＥＫＫＦＶＣＲＧＤＬＡＳＲＧＱＷＧＣＧＲＲＦＡＲＡＤＡＬＧＲＨＦＲＳＥＡＧＲＡＣＩＫＡＬＬＤＥＥＡＩＥＲＮＲＩＦＭＥＱＱＡＱＱＱＡＱＱＱＨＬＱＰＶＰＱＰＬＭＶＰＧＬＤＮＱＡＧＦＴＬＰＡＡＬＬＡＱＹＰＡＬＱＮＬＱＷＤＱＩＡＴＳＧＴＤＤＶＳＤＩＳＡＲＮＳＦＤＡＧＳＧＧＥＦＧＦＤＤＤＤＬＳＩＧＳＦＴＧＡＳＧＱＧＶＩＹＡＧＧＳＨＰＴＳＡＰＮＦＡＬＥＡＴＤＰＮＦＴＧＱＥＷＳＱ
アスペルギルス・フラバスのＣｒｚ１タンパク質のアミノ酸配列を、以下の配列番号６として示す：
ＭＡＳＱＤＴＬＲＤＡＧＱＳＴＡＤＶＫＮＲＳＶＳＰＳＡＨＰＱＨＱＹＮＮＡＳＰＧＬＴＬＤＰＳＦＴＶＳＳＦＱＮＳＡＳＦＮＡＮＰＮＳＮＳＰＧＡＤＳＹＳＹＴＡＧＧＹＬＳＰＴＳＡＱＴＬＡＰＰＤＱＡＦＳＨＳＬＱＬＱＳＦＤＰＧＬＶＮＱＬＤＨＳＳＧＬＳＭＱＰＱＬＱＱＨＱＱＰＨＥＥＮＦＳＴＬＬＮＳＮＰＴＤＦＤＦＳＬＹＰＮＨＳＰＮＳＴＴＡＳＥＹＤＳＳＬＭＬＤＴＱＭＱＧＨＰＱＱＶＮＱＡＶＮＰＶＤＬＩＧＱＭＰＳＰＨＳＶＴＳＰＱＭＳＰＱＥＱＱＰＨＨＳＳＰＧＰＭＳＰＰＮＳＴＰＧＡＹＹＴＰＱＨＳＲＨＴＳＬＤＰＡＳＡＡＹＭＴＧＮＡＰＰＤＷＱＳＭＭＧＮＡＡＦＱＧＨＲＲＡＰＳＥＶＳＥＶＳＳＡＡＰＳＰＹＭＳＨＨＥＳＦＤＧＶＤＮＮＰＳＰＬＬＡＰＱＮＤＰＧＬＹＤＳＳＬＧＩＥＳＦＴＬＳＥＱＱＱＱＱＱＨＱＱＧＩＳＰＩＨＳＰＹＩＳＰＱＬＭＰＱＱＧＮＤＬＩＰＮＭＰＹＩＳＡＰＡＧＮＲＹＳＣＰＰＴＤＩＹＧＮＧＡＥＧＶＩＳＭＰＱＧＴＡＭＶＧＤＩＧＱＡＳＱＭＡＰＰＳＩＮＶＥＦＡＰＰＡＫＮＰＩＦＰＰＡＫＰＡＡＤＬＤＳＬＳＰＰＰＳＴＲＲＭＲＳＫＳＤＰＹＡＨＰＡＳＲＳＲＳＰＶＳＶＳＳＳＬＥＰＬＡＰＳＳＰＲＳＬＳＰＦＤＳＴＧＲＱＰＨＳＮＰＳＳＲＥＰＳＰＳＲＳＲＲＬＳＴＳＳＩＤＮＲＮＹＩＬＧＬＡＤＰＱＲＰＧＡＳＰＮＤＳＫＲＶＱＫＨＰＡＴＦＱＣＨＬＣＰＫＲＦＴＲＡＹＮＬＲＳＨＬＲＴＨＴＤＥＲＰＦＶＣＴＶＣＧＫＡＦＡＲＱＨＤＲＫＲＨＥＧＬＨＳＧＥＫＫＦＶＣＲＧＤＬＳＲＧＧＱＷＧＣＧＲＲＦＡＲＡＤＡＬＧＲＨＦＲＳＥＡＧＲＩＣＩＫＰＬＬＤＥＥＳＱＥＲＥＲＴＬＭＤＱＱＮＱＱＨＡＧＨＬＱＰＶＰＱＰＬＭＶＰＧＭＤＧＱＨＡＮＧＦＶＬＰＡＡＬＬＡＱＹＰＡＬＱＮＬＱＷＤＱＩＴＡＡＡＥＤＰＳＤＩＧＧＲＳＳＦＤＡＳＳＧＧＥＦＧＦＥＤＤＥＳＮＬＳＳＶＳＧＭＳＧＹＧＳＰＱＤＮＬＹＶＭＮＮＱＮＱＭＬＮＶＮＰＧＤＳＧＹＡ
本組成物及び方法の幾つかの実施形態では、生成レベルの変化したＣｒｚ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１、２、３、４、５、又は６のアミノ酸配列に対して特定の程度の全アミノ酸配列同一性、例えば、配列番号１、２、３、４、５、又は６に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には少なくとも約９９％の同一性を有する。それぞれのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列は、当業者に公知である通り、それぞれの対応するタンパク質に関するＢＬＡＳＴサーチから同定することができる。

【0078】

本組成物及び方法の幾つかの実施形態では、破壊されているｃｒｚ１遺伝子は、配列番号１、２、３、４、５、又は６のアミノ酸配列に対して特定の程度の全アミノ酸配列同一性、例えば、配列番号１、２、３、４、５、又は６に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には少なくとも約９９％の同一性を有するＣｒｚ１タンパク質をコード化する。

【0079】

本明細書に提供されるアミノ酸配列情報は、当業者が、任意の糸状菌におけるＣｒｚ１タンパク質及びＣｒｚ１タンパク質をコード化する核酸配列を同定したり、Ｃｒｚ１タンパク質の生成に影響を与えるためにｃｒｚ１遺伝子を適切に破壊したりすることを容易にする。配列番号１、２、３、４、５及び６をコード化するポリヌクレオチド配列は、当業者に公知である通り、ＧｅｎＢａｎｋ又はＪＧＩデータベースに見出すことができる。

【0080】

別の態様では、糸状菌細胞の形態を変化させるための方法が提供される。変異糸状菌細胞は、固体培地において変化した生育形態を示し、親細胞の生育に比べて深部培養で生育させたとき異なる粘度を有する細胞ブロス、及び細胞ブロスの粘度を生成する。

【0081】

場合により、この方法は、好適な遺伝学的方法を用いて親菌株においてｃｒｚ１遺伝子を破壊することを含み、ここで、好気性発酵の間に、破壊されたｃｒｚ１変異菌株は、深部培養における好気性発酵の間に、親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌を必要とする、又は、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量を維持する細胞ブロスを生成する。このような方法は、上記の任意の方法で、また当業者に公知である他の方法でｃｒｚ１遺伝子を破壊するために用いることができる。好ましくは、ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、一般に特定の核酸配列を標的としない化学的変異誘導とは対照的な配列特異的分子生物学技術を用いる遺伝子操作により行われる。しかし、化学的突然変異誘発を用いて満足のいく結果を得ることもできる。

【0082】

幾つかの実施形態では、低粘度菌株を生じさせる粘度を低下させる表現型を導入される親菌株は、高レベルで発現させることが意図される対象の遺伝子を既に含んでいる。この方法によると、本発明の方法は、予め存在する粘度を低下させる菌株に、対象タンパク質を生成させるために遺伝子を導入する必要がなくなる。それゆえに、本発明の方法は、対象の遺伝子を既に含む親菌株から、粘度を低下させる糸状菌細胞の変異菌株を作製するために使用することができる。

【0083】

ＶＩ．有用性
粘度を低下させる糸状菌株を使用した場合、深部培養時の酸素及び栄養素の分布が改善し、深部培養物を撹拌するのに必要とされるエネルギー量が低下し、培養物中に存在する細胞集団を増加させ、タンパク質生成を増加させることが知られている。更に、糸状菌の本変異菌株は、既に記載されている低粘度菌株よりも著しい効果を提供する。

【0084】

第一に、本菌株は、完全に定義されたゲノムを有するため、後続の遺伝子操作、相補的操作、交配及びこれらに類する操作に非常に適する。第二に、本菌株は、例えば、付随する粘度変化を生じさせる（１つ又は複数の）操作によってタンパク質を高レベル生成することができる。第三に、粘度を低下させる菌株は、高レベルに発現させることを意図したタンパク質（すなわち、対象タンパク質）を既に生成している、選択マーカーを既にコード化している、又は生成宿主において望ましい他の特徴を既に含んでいる親菌株を含む本質的に任意の親菌株から生成することができる。それゆえに、本発明の菌株及び方法は、対象タンパク質をコード化する遺伝子を、粘度を低下させる既存の生成菌株の中に輸送する必要がない。

【0085】

本発明の菌株及び方法は、糸状菌の深部培養における商業的に重要なタンパク質の生成に利用される。商業的に重要なたんぱく質としては、例えば、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、リアーゼ、プロテアーゼ、キナーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ペルヒドロラーゼ、トランスフェラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、クロロフィラーゼ、ヒドロホビン、キモシン、炭酸脱水酵素、チミジル酸シンターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、チロシンキナーゼ、多剤耐性タンパク質（例えば、ＡＢＣ Ｐ−ｇｐタンパク質）、ＣＡＤ（カルミバル−Ｐシンターゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、ジヒドロオロターゼ）、トポイソメラーゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ、並びに抗体、並びに糸状菌で発現することができる他の酵素及び非酵素タンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、工業、製薬、動物の健康、及び飲食品用途に好適であり得る。

【0086】

以下の番号付き段落は、本組成物及び方法の様々な態様及び実施形態について更に記載する。番号付き段落のそれぞれの主題は、以下に示す通り、単独で用いてもよく、任意の他の番号付き段落の主題と組合せて用いてもよい。

【0087】

１．一態様では、親菌株に由来する糸状菌の変異菌株であって、前記変異菌株が、変異菌株の細胞に、前記親菌株の細胞と比較して、変更された量の機能性Ｃｒｚ１タンパク質を生成量させる、遺伝子変化を含み、前記変異菌株の細胞が、深部培養における好気性発酵の間に、（ｉ）親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、変更された撹拌量を必要とする、及び／又は、（ｉｉ）親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、変更された溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する、変異菌株を提供する。

【0088】

２．段落１に記載の幾つかの実施形態では、機能性Ｃｒｚ１タンパク質の前記変更された量が、減少された量であり、前記変異菌株は、深部培養における好気性発酵の間に、（ｉ）親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌を必要とする、及び／又は、（ｉｉ）親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する。

【0089】

３．段落１又は２に記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記遺伝子変化は、親菌株中に存在するｃｒｚ１遺伝子の破壊を含む。

【0090】

４．段落３に記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、ｃｒｚ１遺伝子の全て又は一部の欠失の結果である。

【0091】

５．段落３に記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、ｃｒｚ１遺伝子を含むゲノムＤＮＡの一部の欠失の結果である。

【0092】

６．任意の請求項３に記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、ｃｒｚ１遺伝子の突然変異誘発の結果である。

【0093】

７．段落３〜６のいずれかに記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、部位特異的組み換えを用いて行われる。

【0094】

８．段落３〜７のいずれかに記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、前記ｃｒｚ１遺伝子の遺伝子座に選択マーカーを導入と共に行われる。

【0095】

９．段落１〜８のいずれかに記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記変異菌株は、機能的Ｃｒｚ１タンパク質を生成しない。

【0096】

１０．段落１〜８のいずれかに記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記変異菌株は、Ｃｒｚ１タンパク質を生成しない。

【0097】

１１．段落１〜１０のいずれかに記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記変異菌株は、対象タンパク質をコード化する遺伝子を更に含む。

【0098】

１２．段落１〜１１のいずれかに記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、ｓｆｂ３遺伝子の破壊を更に含む。

【0099】

１３．段落１〜１２のいずれかに記載の幾つかの実施形態では、ｓｆｂ３遺伝子、ｓｅｂ１遺伝子、ｍｐｇ１遺伝子、ｇａｓ１遺伝子、及びｔｐｓ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の破壊を更に含む。

【0100】

１４．段落１〜１３のいずれかに記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記変異菌株は、バイオマスの単位量当たり、親菌株と実質的に同量、又はそれ以上のタンパク質を生成する。

【0101】

１５．段落１〜１４のいずれかに記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記糸状菌は、チャワンタケ亜門の種である。

【0102】

１６．段落１〜１５のいずれかに記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記糸状菌は、トリコデルマ属の種である。

【0103】

１７．段落１〜１６のいずれかに記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記糸状菌は、トリコデルマ・リーゼイである。

【0104】

１８．別の態様では、糸状菌細胞の変異菌株の作製方法であって、遺伝子変化を糸状菌細胞の親菌株に導入する工程であり、前記遺伝子変化が、前記親菌株の細胞と比較して機能性Ｃｒｚ１タンパク質の生成量を変更させる、該工程、それにより、深部培養における好気性発酵の間に、（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、変更された撹拌量を必要とする、及び／又は、（ｉｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、変更された溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する、変異糸状菌細胞を生成する工程、を含む、方法を提供する。

【0105】

１９．段落１８の方法の幾つかの実施形態では、前記遺伝子変化は、機能性Ｃｒｚ１タンパク質の生成を低下させるか又は防ぎ、それにより、深部培養における好気性発酵の間に、（ｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌を必要とする、及び／又は、（ｉｉ）前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量を維持する、細胞ブロスを生成する、変異糸状菌細胞を生成する。

【0106】

２０．段落１８又は１９に記載の方法の幾つかの実施形態では、前記遺伝子変化は、遺伝子操作を用いて親糸状菌細胞においてｃｒｚ１遺伝子を破壊することを含む。

【0107】

２１．段落１８〜２０のいずれかに記載の方法の幾つかの実施形態では、前記遺伝子変化は、遺伝子操作を用いて親糸状菌細胞においてｃｒｚ１遺伝子を欠失させることを含む。

【0108】

２２．段落１８〜２１のいずれかに記載の方法の幾つかの実施形態では、前記遺伝子変化は、部位特異的遺伝子組み替えを用いて行われる。

【0109】

２３．段落１８〜２２のいずれかに記載の方法の幾つかの実施形態では、前記ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、ｃｒｚ１遺伝子の遺伝子座に選択マーカーを導入と共に行われる。

【0110】

２４．段落１８〜２３のいずれかに記載の方法の幾つかの実施形態では、前記ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、ｓｆｂ３遺伝子の破壊と共に行われる。

【0111】

２５．段落１８〜２４のいずれかに記載の方法の幾つかの実施形態では、前記ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、ｓｆｂ３遺伝子、ｓｅｂ１遺伝子、ｍｐｇ１遺伝子、ｇａｓ１遺伝子、及びｔｐｓ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の破壊と共に行われる。

【0112】

２６．段落１８〜２５のいずれかに記載の方法の幾つかの実施形態では、前記変異菌株は、バイオマスの単位量当たり、親菌株と実質的に同量、又はそれ以上のタンパク質を生成する。

【0113】

２７．段落１８〜２６のいずれかに記載の方法の幾つかの実施形態では、前記糸状菌は、チャワンタケ亜門の種である。

【0114】

２８．段落１８〜２７のいずれかに記載の方法の幾つかの実施形態では、前記糸状菌は、トリコデルマ属の種である。

【0115】

２９．段落１８〜２８のいずれかに記載の方法の幾つかの実施形態では、前記糸状菌は、トリコデルマ・リーゼイである。

【0116】

３０．段落１８〜２９のいずれかに記載の方法の幾つかの実施形態では、前記親菌株は、対象タンパク質をコード化する遺伝子を更に含む。

【0117】

３１．段落３０に記載の方法の幾つかの実施形態では、前記対象タンパク質をコード化する遺伝子は、機能性Ｃｒｚ１タンパク質の生成を低下させるか又は防ぐ遺伝子変化を導入する前に、前記親菌株内に存在する。

【0118】

３２．別の態様では、段落１１に記載の変異菌株により生成される対象タンパク質を提供する。

【0119】

３３．別の態様では、段落１８〜３１のいずれかに記載の方法によって生成される糸状菌の変異菌株を提供する。

【0120】

３４．別の態様では、親菌株に由来する糸状菌の変異菌株であって、
（ａ）（ｉ）深部培養において、前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために、減少した撹拌の必要性、及び／又は、（ｉｉ）深部培養において、前記親菌株の細胞と比較して、予め選択された撹拌量で、増加した溶存酸素量の維持、をもたらす遺伝子変化、並びに
（ｂ）（ａ）における遺伝子変化の前に前記変異菌株中に存在する対象タンパク質をコード化する遺伝子、を含む、変異菌株。

【0121】

３５．段落３４に記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記遺伝子変化は、前記親菌株に存在するｃｒｚ１遺伝子の破壊を含む。

【0122】

３６．段落３５に記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、前記ｃｒｚ１遺伝子の遺伝子座に選択マーカーを導入と共に行われる。

【0123】

３７．段落３５又は３６に記載の方法の幾つかの実施形態では、ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、ｓｆｂ３遺伝子、ｓｅｂ１遺伝子、ｍｐｇ１遺伝子、ｇａｓ１遺伝子、及びｔｐｓ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の破壊と共に行われる。

【0124】

３８．段落３５〜３７のいずれかに記載の変異菌株の幾つかの実施形態では、前記Ｃｒｚ１遺伝子の破壊は、ｓｅｂ１遺伝子の破壊と共に行われる。

【0125】

本発明の菌株及び方法の、これらの及び他の、態様及び実施形態は、本説明を見た当業者にとっては、明白であろう。以下の実施例は、菌株及び方法を更に例示することを意図するものであり、限定することを意図したものではない。

【実施例】

【0126】

実施例１．Ｔ．リーゼイの突然変異体Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７に由来するｃｒｚ１遺伝子の欠失
トリコデルマ・リーゼイのＭｏｒｐｈ菌株は、ｃｂｈＩ、ｃｂｈＩＩ、ｅｇＩＩ、及びｅｇＩＶを含む４つの主なセルラーゼ遺伝子が欠失しているので、セルラーゼバックグラウンドの非存在下で又は低下したセルラーゼバックグラウンド下で他のタンパク質を発現させるのに特に適している。国際公開第０５／００１０３６号を参照されたい。

【0127】

Ａ．ＴｒＧＡ生成菌株Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７
上記Ｍｏｒｐｈ菌株を、マーカーとしてａｍｄＳを用いて、ＣＢＨ１プロモータの制御下でネイティブのトリコデルマ・グルコアミラーゼ遺伝子（ＴｒＧＡ）で予め形質転換した。次いで、２つのタンデムなコピーのグルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ ２９−９）を含有する突然変異体を単離し、ランダムな化学的突然変異誘発を用いて、突然変異体（７７Ｂ７）を作製した。次いで、自然ｐｙｒ２突然変異体誘導体を、５−フルオロ−オロチン酸（ＦＯＡ）選択によって単離した。

【0128】

Ｂ．ｃｒｚ１破壊カセットの作製
トリコデルマ・リーゼイのｃｒｚ１（ＰＩＤ ３６３９１）を、突然変異体Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７から欠失させた。

【0129】

ｃｒｚ１破壊カセットプラスミドｐＲＡＴＴ２６１（図１）を、標準的な分子生物学的手順を用いて調製した。このプラスミドは、３番目のエキソンの一部及び隣接する上流配列（左隣接領域）にわたるＤＮＡ配列に相同な２．６Ｋｂの領域を有するＤＮＡ配列を含んでいた。また、プラスミド内には、ｃｒｚ１遺伝子の３番目のエキソンの一部及び隣接する下流配列（右隣接領域）にわたるＤＮＡ配列に相同な２．４Ｋｂの領域を有するＤＮＡ配列も含まれていた。これら配列は、ｃｒｚ１遺伝子を標的とし、介在カセット配列で左隣接領域と右隣接領域との間のゲノムの領域、スカフォールド４の領域１２２７０３〜１２３２７０を置換するよう設計した。これら介在配列は、形質転換される菌株のゲノムにおける内因性のＴ．リーゼイｐｙｒ２に対する相同性を最小限に抑えるためにトリコデルマ・アトロビリデに由来するｐｙｒ２選択マーカーを含んでいた。ｐｙｒ２選択マーカーの直上流は、マーカーの３’末端の直接反復複製であり、これは、マーカーのその後の喪失及び形質転換体／欠失体の有用なｐｙｒ２突然変異体誘導体の単離を促進した。このｃｒｚ１破壊カセットを、プライマーＲＰＧ４８６及びＲＰＧ４８９を用いてＰＣＲによって増幅させた。複数のＰＣＲ反応物をプールし、後続工程で用いるために標準的な分子生物学的手順を用いて清浄化した。

【0130】

ｃｒｚ１遺伝子の核酸配列は、ＪＧＩデータベースから入手した：タンパク質ＩＤ：３６３９１、名称：ｇｗ１．４．６９３．１、以下で入手可能：ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｄｉｓｐＧｅｎｅＭｏｄｅｌ？ｄｂ＝Ｔｒｉｒｅ２＆ｉｄ＝３６３９１，（Ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｏｒｔａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉ．Ｖ．Ｇｒｉｇｏｒｉｅｖ，Ｈ．Ｎｏｒｄｂｅｒｇ，Ｉ．Ｓｈａｂａｌｏｖ，Ａ．Ａｅｒｔｓ，Ｍ．Ｃａｎｔｏｒ，Ｄ．Ｇｏｏｄｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｋｕｏ，Ｓ．Ｍｉｎｏｖｉｔｓｋｙ，Ｒ．Ｎｉｋｉｔｉｎ，Ｒ．Ａ．Ｏｈｍ，Ｒ．Ｏｔｉｌｌａｒ，Ａ．Ｐｏｌｉａｋｏｖ，Ｉ．Ｒａｔｎｅｒｅ，Ｒ．Ｒｉｌｅｙ，Ｔ．Ｓｍｉｒｎｏｖａ，Ｄ．Ｒｏｋｈｓａｒ，及びＩ．Ｄｕｂｃｈａｋ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０１１ ０：ｇｋｒ９４７ｖ１−ｇｋｒ９４７）非翻訳領域はイタリック体で記載し、上流又は下流配列によって５’及び３’に隣接し、コード領域は太字で記載し、イントロンは小文字で記載する（配列番号１３）：

【配列表１】

【0131】

【0132】

Ｃ．菌株Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｃｒｚ１の作製
ＰＥＧ媒介形質転換を用いて菌株Ｍｏｒｐｈ ＴｒＧＡ ７７Ｂ７ Δｐｙｒ２をｃｒｚ１破壊カセットで形質転換し、ソルビトールを含有するＶｏｇｅｌ最少培地にプレーティングして、ｐｙｒ２マーカーによって獲得されるウリジン原栄養性に基づいて候補を選択した。個々の形質転換体を単離し、Ｖｏｇｅｌ最少培地に移すことによって増殖させた。ＰＣＲ解析を用いて、相同組み換えによってｃｒｚ１遺伝子座にｃｒｚ１破壊カセットが挿入されている形質転換体を同定した。ｃｒｚ１遺伝子座におけるΔｃｒｚ１破壊カセットの相同挿入は、２対のプライマーを用いて予測されるサイズのＤＮＡ断片を増幅することによって確認した。プライマー対ＲＰＧ４９２及びＲＰＧ２５３は、破壊カセット領域の５’末端の外側から始まって３’領域内で終わるＤＮＡ断片を増幅した。プライマー対ＲＰＧ４９１及びＲＰＧ２７３は、破壊カセット領域の５’領域内から始まって３’末端の外側で終わるＤＮＡ断片を増幅した。ｃｒｚ１破壊カセットの相同挿入が確認された、生成された菌株をＭｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｃｒｚ１と命名した。

【0133】

【表2】

【0134】

上記手順から得られたＭｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｃｒｚ１は、Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７親よりも短いフィラメントを有する液体培養物中で形態が変化していることが観察された。液体培地では、Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｃｒｚ１突然変異体を含有する培養物は、また、Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７親を含有する培養物に比べて、生育中の溶存酸素レベルがより高いことを示した（表２）。

【0135】

菌株Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７及びＭｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｃｒｚ１を深部（液体）培養にて同様の条件下で生育させ、これらの生育表現型を比較した。簡潔には、両面及び底部にバッフルを有する３Ｌフラスコ内の５００ｍＬの最少培地に、各菌株の胞子を別々に添加した。３０分間オートクレーブした後、滅菌６０％グルコースを最終濃度が２７．５ｇ／Ｌになるように添加した。培養物を振盪インキュベータ内で３４℃で４８時間生育させた。

【0136】

４８時間後、４．７ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４・７・Ｈ_２Ｏ、４．３ｇ／Ｌ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４及び２．５ｍＬ／Ｌの同様の微量元素溶液を含有する９．５Ｌの培地を含有する１４Ｌの発酵槽に各フラスコの内容物を別々に加えた。これらの成分を共に１２１℃にて３０分にわたって熱滅菌した。６０％グルコース及び０，４８％ ＣａＣｌ_２・２・Ｈ_２Ｏの溶液を別々にオートクレーブし、冷却し、最終濃度が７５ｇ／Ｌグルコース及び０．６ｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２・２・Ｈ_２Ｏになるように発酵槽に添加した。培地を２８％ ＮＨ_３を用いてｐＨ ３．５に調整し、全生育期間中温度を３４℃で維持した。

【0137】

ヘッドスペースへの圧力の印加がなかった場合の溶存酸素（ＤＯ）プローブを１００％に較正した（すなわち、０ｋＰａ（０ｂａｒ）のゲージ圧、１００ｋＰａ（１ｂａｒ）の絶対圧）。ヘッドスペース内の圧力を次に７０ｋＰａ（０．７ｂａｒ）（ゲージ圧）に設定した。その後、播種培地を添加する前に酸素プローブは１７０％の読み取り値を示した。この発酵槽は、５００ｒｐｍに初期設定された可変速度モーターにより混合を行う４枚ブレードタービンを２つ備えた。

【0138】

培養物が生育するにつれて、糸状菌菌糸の増殖によってブロスの粘度が上昇したことに少なくとも部分的に起因して、ＤＯ含量レベルは低下した。ＤＯ含量レベルが４０％未満に低下した場合には、撹拌量を増加させて、ＤＯ含量レベルを４０％に維持した。７５０ｒｐｍの撹拌に達したら、ＤＯ含量レベルを４０％未満に低下させる。ＤＯ含量レベルが４０％未満に低下しなかった場合には、発酵工程中の撹拌量を増加させる必要がなかったので、初期撹拌量は必要とされている量よりも速かった。グルコースが完全に消費された時点で、各発酵槽で生成されたバイオマスの量を測定したところ、両方の菌株について生成量が実質的に同じであったことが判明した。

【0139】

所与の撹拌量における各発酵槽のＤＯ含量濃度、並びに、所与のＤＯ含量レベルを維持するために必要とされる撹拌量は、複数の異なる菌株生育表現型により、複数の異なるブロスから得られる粘度の間接的尺度である。一方の変数（例えば、ＤＯ含量又は撹拌）のみを変更してもう一方を測定するのが理想であるが、各発酵槽において十分なバイオマスの生成を確保するためにＤＯ含量レベルが４０％未満に低下するのを防止して、それにより、異なる菌株の生育特性の中でもより有意な比較を可能にすることが望ましい。

【0140】

一般に、標的とするＤＯ含量レベルを維持するには、撹拌量を増加させる必要があるが、撹拌量は、ブロスの粘度に相関する基準を提供する発酵槽タービンを駆動するモーターに供給される電力の量により推定することができる。具体的には、懸濁した培地を撹拌するのに必要とされる割増電力は、撹拌量の三乗に比例する。

【0141】

表２に示す通り、Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｃｒｚ１は、親Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７に比べてブロス粘度が低下した。バッチ生育相の最後に、全てのグルコースが消費されたとき、両方の菌株が同様のバイオマス濃度に達した。バッチ生育相の最後に到達するために、Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７対照菌株のｓａｗ撹拌は、６１６ｒｐｍまで増加し、ｓａｗ ＤＯ含量レベルは、わずか４０％にまで低下した。菌株Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｃｒｚ１は、同じバイオマス濃度を得るために多くのエネルギーを必要としなかった。撹拌量は、５００ｒｐｍ超には増加せず、％ ＤＯは、１００未満には低下しなかった。

【0142】

【表3】

【0143】

実施例２．Ｓｆｂ３、Ｓｅｂ１、Ｍｐｇ１、Ｇａｓ１及びＴｐｓ２生成のうちの少なくとも１つを変化させることによって生じる追加の効果
Ａ．破壊されたｓｂｆ３における粘度低下
Ｓｆｂ３遺伝子（Ｌｓｔ１としても知られる）は、かつては、出芽酵母（すなわち、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae））においてのみ特徴付けれていたが、この遺伝子は、小胞体からゴルジ体へタンパク質を運搬する輸送小胞を囲むＣＯＰＩＩタンパク質コートに関連するタンパク質をコード化する。Ｓｆｂ３及びＳｆｂ２は、Ｓｅｃ２４のホモログであり、これらの遺伝子は全て、小胞の中に特定の積荷タンパク質をパッケージングすることと関連する。

【0144】

表３に示す通り、菌株２９−９ Δｓｆｂ３由来のｓｆｂ３遺伝子の破壊により、生育相の最後に４０％の溶存酸素を維持するために必要な最高撹拌量が低下した菌株が得られた。これら生育条件下で、４０％のＤＯを維持し、且つバイオマスの量を生成するために、元の菌株２９−９は、７０Ｈ２（化学的に突然変異誘発された２９−９）又は２９−９ Δｓｆｂ３菌株よりも２．６倍多い力を必要としていた。菌株７０Ｈ２及び２９−９ Δｓｆｂ３は、同様の粘度特性を有しており、懸濁培養物中において同様のレベルの対象タンパク質（ＴｒＧＡ）を生成し、これは、粘度の低下した生育表現型が、ｓｆｂ３遺伝子の破壊によって糸状菌に付与され得ることを示す。粘度を変化させるＳｆｂ３タンパク質における変化は、参照により本明細書に援用される２０１１年８月２５日に国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４９１６４号として出願された２０１２年３月１日公開の国際公開第２０１２／０２７５８０ Ａ１号に更に記載されている。

【0145】

【表4】

【0146】

Ｂ．破壊されたｓｅｂ１における粘度低下
トリコデルマ・アトロビリデ（Trichoderma atroviride）に由来するＳｅｂ１は、ＳＴＲＥ−エレメント結合タンパク質であり、ｓｅｂ１遺伝子は、酵母のｍｓｎ２／４遺伝子及びアスペルギルス・ニデュランスのｍｓｎＡ遺伝子のオルソログであると考えられる。なお、ｓｅｂ１遺伝子は、酵母においてｍｓｎ２／４遺伝子を補完することはできないので、恐らく機能的ホモログではない（Ｐｅｔｅｒｂａｕｅｒ，Ｃ．ら（（２００２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２６８：２２３〜３１）。Ｓｅｂ１は、浸透圧ストレス応答に関与しているが必須ではない。しかし、形態変化に関連していること、特に、ｓｅｂ１遺伝子が破壊されたときに低粘度表現型を生じさせることは見出されている。ｓｅｂ１破壊の詳細は、２０１１年４月２２日出願の米国仮出願第６１／４７８，１６０号に見出すことができ、この全文を参照することによって本明細書に援用する。

【0147】

表４に示す通り、菌株Ｍｏｒｐｈ１／１ Δｋｕ８０に由来するｓｅｂ１遺伝子の欠失により、ブロス粘度を低下させる菌株が得られた。バッチ生育相の最後に、全てのグルコースが消費されたとき、両方の菌株が同様のバイオマス濃度に達した。そこに達するために、対照菌株のｓａｗ撹拌は、最高７５０ｒｐｍまで増加し、ｓａｗ ＤＯはわずか２９％にまで低下した。ｓｅｂ１欠失菌株は、バイオマス濃度を得るためにそれほど多くのエネルギーを必要としなかった。撹拌量は、５００ｒｐｍを超えて増加することなく、ＤＯは５５％までしか低下しなかった。

【0148】

【表5】

【0149】

Ｃ．破壊されたｍｐｇ１における粘度低下
ｍｐｇ１遺伝子は、ＧＴＰ：アルファ−Ｄ−マンノース−１−ホスフェートグアニルトランスフェラーゼをコード化する。ｍｐｇ１遺伝子の過剰発現は、タンパク質のグリコシル化の初期段階で主な調節的役割を果たし得るＧＤＰ−マンノースレベルを上昇させる。

【0150】

表５に示す通り、ＭＡＧＩ １０−８ｇ、ｍｐｇ１破壊変異体菌株は、親ＭＡＧＩに比べてブロス粘度が低下している。バッチ生育相の最後に、全てのグルコースが消費されたとき、両方の菌株が同様のバイオマス濃度に達した。そこに達するまでに、ＭＡＧＩ対照菌株のｓａｗ撹拌は、最高７５０ｒｐｍまで増加し、ｓａｗ ＤＯは３５％にまで低下した。菌株ＭＡＧＩ １０−８ｇは、同じバイオマス濃度を得るために多くのエネルギーを必要としなかった。撹拌量は、％ ＤＯが４０％まで低下したとき、５１３ｒｐｍまでわずかに増加した。タンパク質生成は、ＭＡＧＩに比べてＭＡＧＩ １０−８ｇにおいて有害な影響を受けなかった（図示せず）。ｍｐｇ１破壊の詳細は、２０１１年４月２２日出願の米国仮出願第６１／４７８，１６２号に見出すことができ、この全文を参照することによって本明細書に援用する。

【0151】

【表6】

【0152】

Ｄ．破壊されたｇａｓ１における粘度低下
菌類のβ（１，３）−グルカノシルトランスフェラーゼのＧｅｌ／Ｇａｓ／Ｐｈｒファミリーは、主成分であるβ（１，３）−グルカンを加工することによって細胞壁の生合成において重要な役割を果たす（Ｐｏｐｏｌｏら，２００８）。ｇａｓ１（ＰＩＤ ２２９１４）は、β−１，３−グルカンを破壊及び接合することができるＧＰＩ（及び／又はグルカン）アンカー型タンパク質であるβ−１，３−グルカノシルトランスフェラーゼをコード化する。５つを有するＴ．リーゼイを含む多くの真菌類のゲノムには複数のパラログが存在する。別の研究では、ｇａｓ１遺伝子（又はアスペルギルス・フミガーツフにおいて知られているｇｅｌ１遺伝子）の突然変異が、真菌類の細胞壁構造に影響を与え、また、形態変化、並びにカルコフロールホワイト、コンゴレッド、及びドデシル硫酸ナトリウムに対する過敏性を導き得ることが示されている（Ｓｃｈｉｒａｗｓｋｉ，Ｊ．ら２００５，Ｍｏｕｙｎａ，Ｉ．ら２００５）。

【0153】

トリコデルマ・リーゼイのＭｏｒｐｈ菌株は、ｃｂｈＩ、ｃｂｈＩＩ、ｅｇＩＩ、及びｅｇＩＶを含む４つの主なセルラーゼ遺伝子が欠失しているので、セルラーゼバックグラウンドの非存在下で又は低下したセルラーゼバックグラウンド下で他のタンパク質を発現させるのに特に適している。国際公開第０５／００１０３６号を参照されたい。Ｍｏｒｐｈ菌株を、マーカーとしてａｍｄＳを用いて、ＣＢＨ１プロモータの制御下でネイティブなトリコデルマ・グルコアミラーゼ遺伝子（ＴｒＧＡ）で予め形質転換した。次いで、２つのタンデムなコピーのグルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ ２９−９）を含有する突然変異体を単離し、ランダムな化学的突然変異誘発を用いて、突然変異体（７７Ｂ７）を作製した。次いで、自然ｐｙｒ２突然変異体誘導体を、５−フルオロ−オロチン酸（ＦＯＡ）選択によって単離した。トリコデルマ・リーゼイのｇａｓ１（ＰＩＤ ２２９１４）を、突然変異体Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７から欠失させた。

【0154】

ＰＥＧ媒介形質転換を用いて菌株Ｍｏｒｐｈ ＴｒＧＡ ７７Ｂ７ Δｐｙｒ２をｇａｓ１破壊カセットで形質転換し、ソルビトールを含有するＶｏｇｅｌ最少培地にプレーティングして、ｐｙｒ２マーカーによって獲得されるウリジン原栄養性に基づいて候補を選択した。表６に示す通り、Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｇａｓ１は、親Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７に比べてブロス粘度が低下する。バッチ生育相の最後に、全てのグルコースが消費されたとき、両方の菌株が同様のバイオマス濃度に達した。バッチ生育相の最後に到達するために、Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７対照菌株のｓａｗ撹拌は、６１６ｒｐｍまで増加し、ｓａｗ ＤＯ含量レベルは、わずか４０％にまで低下した。菌株Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｇａｓ１は、同じバイオマス濃度を得るために多くのエネルギーを必要としなかった（すなわち、撹拌におけるｒｐｍが増加した）。撹拌量は、５００ｒｐｍ超には増加せず、％ ＤＯは、１１５未満には低下しなかった。タンパク質生成は、Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７に比べてＭｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｇａｓ１には負の影響を与えなかった（データは示さない）。ｇａｓ１破壊の詳細は、２０１１年４月２９日出願の米国仮出願第６１，４８０，６０２号に見出すことができ、この全文を参照することによって本明細書に援用する。

【0155】

【表7】

【0156】

Ｅ．破壊されたｔｐｓ１における粘度低下
遺伝子ｔｐｓ２は、二糖類であるトレハロースの合成に関与するトレハロース−ホスフェートホスファターゼをコード化する。トレハロースは、細胞質及びＥＲにおける変性したタンパク質のリフォールディングを緩衝する、ストレスによって誘導される糖である（Ｓｉｎｇｅｒ，Ｍら１９９８，Ｓｉｍｏｌａ，Ｍら２０００）。この二糖類は、様々なストレスに応答して多様な生物によって大量に生成される。酵母では、トレハロースは、高温においてタンパク質を安定化させ、熱で損傷したタンパク質のリフォールディングに役立つ（Ｓｉｍｏｌａ，Ｍら２０００）。

【0157】

トリコデルマ・リーゼイのＭｏｒｐｈ菌株を上記の通り調製した。トリコデルマ・リーゼイのｔｐｓ２（ＰＩＤ ４８７０７）を、突然変異体Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７から欠失させた。ＰＥＧ媒介形質転換を用いて菌株Ｍｏｒｐｈ ＴｒＧＡ ７７Ｂ７ Δｐｙｒ２をｔｐｓ２破壊カセットで形質転換し、ソルビトールを含有するＶｏｇｅｌ最少培地にプレーティングして、ｐｙｒ２マーカーによって獲得されるウリジン原栄養性に基づいて候補を選択した。表７に示す通り、Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｔｐｓ２は、親Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７に比べてブロス粘度が低下した。バッチ生育相の最後に、全てのグルコースが消費されたとき、両方の菌株が同様のバイオマス濃度に達した。バッチ生育相の最後に到達するために、Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７対照菌株のｓａｗ撹拌は、６１６ｒｐｍまで増加し、ｓａｗ ＤＯ含量レベルは、わずか４０％にまで低下した。菌株Ｍｏｒｐｈ ７７Ｂ７ Δｔｐｓ２は、同じバイオマス濃度を得るために多くのエネルギーを必要としなかった。撹拌量は、５００ｒｐｍ超には増加せず、％ ＤＯは、１１０未満には低下しなかった。ｔｐｓ１破壊の詳細は、２０１１年４月２９日出願の米国仮出願第６１，４８０，６２９号に見出すことができ、この全文を参照することによって本明細書に援用する。

【0158】

【表8】

【0159】

上記の組成物及び方法は、理解を明瞭にする目的で例示及び実施例により幾分詳細に記載されてきたが、特定の変化及び修正がなされ得ることは当業者には明白であろう。したがって、本説明は、添付の特許請求の範囲により詳述される本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。

【0160】

本明細書に引用された全ての公刊物、特許及び特許明細書は、これによって、あらゆる目的のためにこれらの全体が参照により組み込まれ、各個別の公刊物、特許又は特許明細書が特定的に及び個々に示されている場合には参照により同程度そのように組み込まれる。

【0161】

参考文献
以下の参考文献及び本明細書に引用される追加の参考文献は、これによって参照により組み込まれる。

【0162】

Ｋｏｔｈｅ，Ｇ．及びＦｒｅｅ，Ｓ．（１９９８）Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ ２３：２４８〜２５８。

【0163】

Ｐｒｏｋｉｓｃｈ，Ｈ．，ら（１９９７）Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５６：１０４〜１１４。

【0164】

Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２７：３１０７９〜３１０８８。

【0165】

Ｌａｇｏｒｃｅら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２０３４５〜２０３５７。

【0166】

Ｇａｒｃｉａら（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１５１８３〜１５１９５。

【0167】

Ｋａｒａｂａｂａら（２００６）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１４２９〜１４５１。

【0168】

Ｐａｒｄｉｎｉら（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：４０３９９〜４０４１１。

【0169】

Ｍｕｎｒｏ，Ｃ．ら（２００９）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１３９９〜１４１３。

【0170】

Ｈｕｇｈｅｓ，Ｈ．及びＳｔｅｐｈｅｎｓ，Ｄ．Ｊ．（２００８）Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２９：１２９〜５１。

【0171】

Ｋａｒｈｉｎｅｎ，Ｌ．ら（２００５）Ｔｒａｆｆｉｃ ６：５６２〜７４。

【0172】

Ｐａｓｓｏｌｕｎｇｈｉ，Ｓ．ら（２０１０）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ ９：７〜１７。

【0173】

Ｐｅｎｇ，Ｒ．ら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１１５２１〜２８。

【0174】

Ｒｏｂｅｒｇ，Ｋ．Ｊ．ら（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４５：６５９〜７２。

【0175】

Ｓｈｉｍｏｎｉ，Ｙ．ら（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５１：９７３〜８４。

【0176】

Ｔｕｒｃｈｉｎｉ，Ａ．ら（２０００）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：１１６７〜７１。

【図1】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]