特許 6042968 パーキンソン病の処置方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6042968

(24)【登録日】2016年11月18日

(45)【発行日】2016年12月14日

(54)【発明の名称】パーキンソン病の処置方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/5377 20060101AFI20161206BHJP

   A61K 31/454 20060101ALI20161206BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20161206BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/5377

   A61K31/454

   A61P25/16

【請求項の数】5

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2015-506258(P2015-506258)

(86)(22)【出願日】2013年4月19日

(65)【公表番号】特表2015-514739(P2015-514739A)

(43)【公表日】2015年5月21日

(86)【国際出願番号】EP2013058212

(87)【国際公開番号】WO2013156614

(87)【国際公開日】20131024

【審査請求日】2016年2月2日

(31)【優先権主張番号】61/636,054

(32)【優先日】2012年4月20日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507073918

【氏名又は名称】ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ミシェル、アンヌ

(72)【発明者】

【氏名】ダウニー、パトリック

(72)【発明者】

【氏名】モンテル、フロリアン

(72)【発明者】

【氏名】シェラー、ディエター

(72)【発明者】

【氏名】クリストフ、ベルナール

【審査官】 安藤 公祐

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／０３８９８０（ＷＯ，Ａ２）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ａ６１Ｋ ３１／１９８

Ａ６１Ｋ ３１／４５１

Ａ６１Ｋ ３１／４５４

Ａ６１Ｋ ３１／４９７

Ａ６１Ｋ ３１／５０１

Ａ６１Ｋ ３１／５０６

Ａ６１Ｋ ３１／５１９

Ａ６１Ｋ ３１／５２

Ａ６１Ｋ ３１／５２２

Ａ６１Ｋ ３１／５３７７

Ａ６１Ｐ ２５／１６

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１の薬剤及び第２の薬剤を含む、哺乳動物におけるパーキンソン病（ＰＤ）を治療するための医薬組成物であって、第１の薬剤がアデノシン受容体２（Ａ_２Ａ）のアンタゴニストであるトザデナント（Ｔｏｚａｄｅｎａｎｔ）であり、第２の薬剤が、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体サブタイプＮＲ２Ｂのアンタゴニストであるラジプロジル（Ｒａｄｉｐｒｏｄｉｌ）である、上記医薬組成物。

【請求項2】

Ａ_２Ａアンタゴニスト対ＮＲ２Ｂアンタゴニストの比が、３０：１〜１：３０の間で変動する、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

両方の薬剤が、Ｌ−ドーパと一緒に投与される、請求項１又は２に記載の組成物。

【請求項4】

１日１回、投与される、請求項１から３までのいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

（ａ）治療有効量のトザデナント（Ｔｏｚａｄｅｎａｎｔ）を含む医薬製剤を収容している第１の収容容器と、
（ｂ）治療有効量のラジプロジル（Ｒａｄｉｐｒｏｄｉｌ）を含む医薬製剤を収容している第２の収容容器と
を含むキットオブパーツの形態である、請求項１〜４までのいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、パーキンソン病を処置するための又はパーキンソン病の症状を抑えるための組成物及び方法に関する。

【背景技術】

【0002】

パーキンソン病（ＰＤ）は、中枢神経系の変性障害である。パーキンソン病の運動症状は、中脳領域である黒質におけるドーパミン産生細胞の死に起因する。この細胞死の原因は未知である。ＰＤの臨床症状が明確になる時までに、線条体ドーパミン作動性ニューロンの約７０〜８０％が失われる。この疾患の初期経過において、最も明白な症状が運動に関連するものである。その後、認知及び行動上の問題が発生する恐れがあり、該疾患の進行期において、認知症が一般に起こる。しかし、ドーパミン作動性処置は、該疾患の初期段階における運動症状を効果的に処置することが可能であるが、その有効性は疾患の後期段階において徐々に消失し、且つその長期使用は運動合併症をもたらすので、満足する処置ではない。

【0003】

パーキンソン病（ＰＤ）の基本的な運動症状である運動緩徐、運動不能、及び安静時振戦は、神経回路における平衡失調を引き起こす線条体ＤＡ含有量の減少に起因している。

【0004】

ＤＡ前駆体であるＬ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ドーパ；Ｌ−ｄｏｐａ）又はドーパミン（Ｄ）２／３受容体アゴニストを使用するＤＡ（ドーパミン）代替療法が、現在の処置戦略の要である。しかし、こうした処置は、原発性疾患の臨床症状のみを管理するものであり、該疾患の根底にある原因、すなわちドーパミン作動性細胞の進行性喪失を処置するためには何もしない。代わりに、上記の処置は、異常不随意運動（ＡＩＭ）又はジスキネジアの誘発により、状態を複雑にする恐れがある。さらに、Ｌ−ドーパによる長期処置は、その効果の予測不能な変動を伴う。したがって、新規な戦略には、運動症状の処置、ジスキネジアの改善又は防止、やはりまたドーパミン作動性ニューロンの喪失の遅延、防止、又は反転を行うことが必要である。したがって、これらの事象の１つを阻止する又は理想的にはいくつかを阻止する治療剤は、ＰＤに関する疾患修飾性特性をおそらく有する新規なクラスの薬物をもたらす可能性があり得る。これらの新規な薬物は、Ｌ−ドーパと同程度に有効であることが期待されるが、運動変動を誘発すべきではなく、又はドーパミン作動性処置と交差感作するべきではない。

【0005】

ＰＤの初期段階では、Ｌ−ドーパはドーパミンに代謝され、このドーパミンは、線条体（貯蔵庫及び緩衝剤として作用する）における生存シナプス前ドーパミン作動性終末に貯蔵される。その放出は、フィードバックループ（ｆｅｅｄ−ｂａｃｋ ｌｏｏｐ）が無傷の場合には制御される。しかし、終末が喪失すればする程、ドーパミンのための貯蔵及び緩衝容量が失われて、Ｌ−ドーパの効果期間が短縮する。したがって、経口摂取及びその後の、大脳基底核の拍動性暴露は、ピークドーズジスキネジア（ｐｅａｋ−ｄｏｓｅ ｄｙｓｋｉｎｅｓｉａ）及び／又は運動変動を惹起する。一旦、運動症状が起こるレベルにまで黒質変性が発達すると、Ｌ−ドーパの単回注入は、「プライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）」と呼ばれる応答を確立するのに十分である（Ｍｏｒｅｌｌｉら、１９８７年；Ｄｅｌｆｉｎｏら、２００４年）。一旦、Ｌ−ドーパが投与されてジスキネジアが惹起されると、数週間投与されていない場合でさえ、その後の各薬物曝露により、その応答が誘発されることになろう。弱いＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）受容体アンタゴニストであるアマンタジンは、ジスキネジアの強度を低下させることが可能であり、このことは、プライミング及びジスキネジアに、大脳基底核におけるグルタミン酸作動性入力の過剰活性が関与していることを示唆している（Ｂｌａｎｃｈｅｔら、１９９８年）。臨床及び前臨床試験により、ジスキネジアの動物及び患者における線条体中のグルタミン作動性機能（グルタミン酸受容体の発現、リン酸化、及びシナプス構成の変化を含む）が変質している証拠が提示されている（Ｃｈａｓｅら、２０００年）。さらに、ＮＲ２Ｂサブユニットを含有しているＮＭＤＡ受容体は、線条体において豊富に存在しており、且つＡＭＰＡ（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾールプロピオン酸）受容体アンタゴニストもやはりジスキネジアを抑制することができるという証拠が存在している（Ｂｉｂｂｉａｎｉら、２００５年）。これらのデータは、ジスキネジアが異常なグルタミン酸作動性皮質線条体入力と関係することを示しているように思われる。

【0006】

確立したジスキネジアを反転するために又は最初の段階でジスキネジアが起こるのを防止するために、１つの手法は、治療法の早い時期にドーパミン作動性処置を置きかえることであろう。大脳基底核内部におけるドーパミンの特異な分布、及びドーパミンとドーパミン関連性細胞内シグナル伝達カスケードとの相互作用により、Ａ_２Ａアンタゴニスト及びＮＲ２Ｂサブユニット選択的ＮＭＤＡアンタゴニストが開発されてきた。しかし、ＰＤ患者における処置としての、Ａ_２Ａアンタゴニスト（イストラデフィリン、Ｍｉｚｕｎｏら、２０１０年）又はＮＲ２Ｂアンタゴニスト（トラキソプロジル、Ｎｕｔｔら、２００８年）による臨床試験は、期待した有効性を示さなかった。

【0007】

既に記載したとおり、プライミングとは、ドーパミン療法の実施により、その後のドーパミン作動性処置に対する応答を改変するよう、それにより脳が感作するようになる過程として、古典的に定義されている。プライミングは、除神経脳における急性ドーパミン処置により誘発される。

【0008】

６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）片側損傷ラットモデルは、プライミングの定量的モデルとなり得る。ドーパミン作動薬（Ｌ−ドーパ又はドーパミンアゴニスト）により慢性的に処置された、こうした６−ＯＨＤＡ損傷ラットは、徐々に増加する、「行動感作」と呼ばれる対側性回転（すなわち、損傷側から離れた）を発症する。このモデルにおいて、ＤＡ受容体アゴニストのいわゆる「プライミング」用量の投与により、動物はＤＡアゴニストによるその後の接種作用に感作される。

【0009】

「交差感作」の現象は、対象が既に感作されている物質とは異なる物質に感作されるようになる場合に観察されることがある。

【0010】

交差感作は、片側パーキンソン病マウスにおいて、カフェインとｌ−ドーパの誘発性行動の間で既に観察されている（Ｙｕら、２００６年）。

【0011】

アデノシン受容体は、プリン受容体として知られている、プリンヌクレオチド及びヌクレオシドＧタンパク質共役型受容体からなる群のサブクラスを表す。薬理学的に異なる主なアデノシン受容体サブタイプは、Ａ_１、Ａ_２Ａ、Ａ_２Ｂ、及びＡ_３として知られている。脳中の主なアデノシン受容体サブタイプは、Ａ_１及びＡ_２Ａである。Ａ_１アデノシン受容体サブタイプは、脳全体に高密度で見いだされているが、Ａ_２Ａ受容体の分布はより限定的である。Ａ_２Ａ受容体は、線条体淡蒼球系出力ニューロン上のドーパミンＤ２受容体が共局在している、線条体（尾状核−被殻、側坐核、嗅結節）において高密度で見いだされている。線条体内部のＡ_２Ａ受容体の離散的な局在化、及びＤ２受容体の作用を機能的に拮抗するＡ_２Ａ受容体の能力は、Ａ_２Ａ受容体アンタゴニストがパーキンソン病（ＰＤ）の対症処置に潜在的に有用であるという示唆につながった。

【0012】

Ｎ−メチル−Ｄ−アルパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体は、サブユニットの異種複合体である。２つの主要なサブユニットファミリーは、ＮＲ１及びＮＲ２と呼ばれる。ＮＲ２サブユニットファミリーは、４種のサブユニットタイプに分類される。それらは、ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ、ＮＲ２Ｃ、ＮＲ２Ｄであり、これらは、異なる生理的及び薬理学的特性（イオンゲーティング、マグネシウム感度、薬理学的プロファイル、及び解剖学的分布など）を示す。

【0013】

ＮＭＤＡ受容体阻害は、主として疼痛及び神経変性疾患の処置において治療的有用性を有しているが、重症な副作用を引き起こす可能性があり得るかなりのマイナス材料が、利用可能な多くのＮＭＤＡ受容体アンタゴニストに存在する。中枢神経系におけるＮＲ２Ｂサブユニットのより離散的な分布は、この部位において選択的に作用する作用剤の副作用プロファイルの低減を裏付けることができる。しかし、選択的ＮＲ２Ｂアンタゴニストでさえ、ＮＭＤＡ受容体のＮＲ２Ｂサブユニットに対する親和性は低いことを示し得る。また、ＮＲ２Ｂ選択的であると言われている一部のＮＲ２Ｂアンタゴニストは、完全に特異的ではないこともある。

【0014】

Ｈａｕｂｅｒ及びＭｕｎｋｌｅ（１９９６年）は、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストであるＣＧＰ３７８４９（競争的）及びジゾシルピン（ｄｉｚｏｃｉｌｐｉｎｅ）（ＭＫ−８０１、非競争的）の抗カタレプシー作用が、非選択的アデノシン受容体アンタゴニスト／ホスホジエステラーゼ阻害剤であるテオフィリンの共投与により増強され得ると主張した。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0015】

本発明は、パーキンソン病を処置するための、或いはパーキンソン病の症状若しくはそれに伴う症状を抑えるための又はパーキンソン病の処置の副作用を抑えるための組成物及び方法に関する。

【0016】

本発明の第１の態様は、哺乳動物におけるパーキンソン病（ＰＤ）を処置する方法であって、第１の薬剤及び第２の薬剤を投与することを含み、第１の薬剤がアデノシン受容体２（Ａ_２Ａ）のアンタゴニストであり、第２の薬剤が、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体サブタイプＮＲ２Ｂのアンタゴニストである、上記方法に関する。

【0017】

本発明の第２の態様は、パーキンソン病を処置する方法であって、Ａ_２Ａアンタゴニスト及びＮＲ２Ｂアンタゴニストが、Ｌ−ドーパと本質的に一緒に投与される、上記方法に関する。Ａ_２Ａアンタゴニスト及びＮＲ２Ｂアンタゴニストは、該疾患の早期段階及びＬ−ドーパの使用前か、又は一旦、Ｌ−ドーパの投与を開始した場合にはＬ−ドーパと一緒のいずれかで投与される。

【0018】

本発明の第３の態様は、アデノシンＡ_２Ａ受容体アンタゴニスト及びＮＲ２Ｂアンタゴニストの組合せの治療有効量を、薬学的に許容される担体又は添加剤中に含む医薬組成物に関する。

【0019】

本発明の第４の態様は、
（ａ）治療有効量のＡ_２Ａ受容体アンタゴニストを含む医薬製剤を収容している第１の収容容器（ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ）と、
（ｂ）治療有効量のＮＲ２Ｂアンタゴニストを含む医薬製剤を収容している第２の収容容器と
を含む、キットオブパーツに関する。

【0020】

本発明のさらなる態様は、詳細な本明細書から明白になろう。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】グラフ右：三元配置混合ＡＮＯＶＡ。ラジプロジル（Ｒａｄｉｐｒｏｄｉｌ）（３ｍｇ／ｋｇ）の有意な効果、Ｆ（１，２８）＝５１．４５、ｐ＜０．００１。トザデナント（Ｔｏｚａｄｅｎａｎｔ）（３０ｍｇ／ｋｇ）の有意な効果、Ｆ（１，２８）＝１７６．０、ｐ＜０．００１。時間の有意な効果、Ｆ（２３，６４４）＝４２．２８、ｐ＜０．００１。有意な≪ラジプロジル×トザデナント≫相互作用、Ｆ（１，２８）＝１４．８１、ｐ＜０．０１。 Ｔｕｋｅｙ事後検定（ｐ＜０．０５）：ＴＯＺ３０／ＲＡＤ３組合せにより処置されたラットは、ＶＥＨ／ＶＥＨ、ＴＯＺ３０／ＶＥＨ、及びＶＥＨ／ＲＡＤ３の群の由来のものよりも高い距離スコアを有している。 グラフ左：三元配置混合ＡＮＯＶＡ。ラジプロジル（３ｍｇ／ｋｇ）の有意な効果、Ｆ（１，２８）＝９．４０、ｐ＜０．０１。トザデナント（３０ｍｇ／ｋｇ）の有意な効果、Ｆ（１，２８）＝６４．６０、ｐ＜０．００１。時間の有意な効果、Ｆ（２３，６４４）＝１６．６７、ｐ＜０．００１。有意な≪ラジプロジル×トザデナント≫相互作用、Ｆ（１，２８）＝４．６０、ｐ＜０．０５。 Ｔｕｋｅｙ事後検定（ｐ＜０．０５）：ＴＯＺ３０／ＲＡＤ３組合せにより処置されたラットは、ＶＥＨ／ＶＥＨ、ＴＯＺ３０／ＶＥＨ、及びＶＥＨ／ＲＡＤ３の群の由来のものよりも高い立ち上がりスコアを有している。

【図2】処置効果は、有意な効果Ｆ（２，２１）＝４３．６８、ｐ＜０．００１を示している。時間の有意な効果（Ｆ（１７，３５７）＝２０．０５、ｐ＜０．００１）も観察され、また有意な相互作用（Ｆ（３４，３５７）＝１１．７４、ｐ＜０．００１）も同様である。追加的な事後比較検定により、これはあくまで、ビヒクル処置ラット（Ｔｕｋｅｙ、ｐ＜０．０５）と比べて有意に活性であるＬ−ドーパ／ベンセラジド（ｂｅｎｓｅｒａｚｉｄｅ）による効果であることが示される。

【図3】試験の最初の２０分間、及び最後の２０分間の、Ｌ−ドーパ／ベンセラジド処置ラットで観察されるものに等しい、運動量（距離）を生じるｃｏｍｂｏの能力を示す図である。

【図4】同側性ターンと対側性ターン（運動）の両方を誘発するｃｏｍｂｏの能力を示している一方、Ｌ−ドーパ／ベンセラジド処置ラットのみが、対側方向に向かわせる能力があることを示す図である。

【図5】Ｌ−ドーパ／ベンセラジドにより処置したラットと比べて、ｃｏｍｂｏ処置ラットでは、軌道と体位の両方が改善されていることを実証する図である。

【図6】１０回の取得セッションの間に、Ｌ−ドーパ／ベンセラジドにより処置されたラットは、対側性ターンのレベルが大きく向上すること（これは、Ｌ−ドーパ／ベンセラジド下で予期される）を示す一方、ｃｏｍｂｏ下では、これらのラットが、より低いレベルの対側性ターンしか示さないことを示す図である。

【図7】１０回の取得セッションの間に、Ｌ−ドーパ／ベンセラジドにより処置されたラットは、同側性ターンは示さない一方、ｃｏｍｂｏ下では、これらのラットが、ある程度のレベルの同側性ターンしか示さないことを示す図である。

【図8】Ｌ−ドーパ下のラットは重症なＡＩＭで過ごした時間が大きく増加する一方、一旦、ｃｏｍｂｏ下にあると、それらのラットにより過ごされた時間の大部分は、「ＡＩＭがない」姿勢にあることを示す図である。

【図9】Ｌ−ドーパ／ベンセラジド処置は、ラットを非常に刺激する。それらのラットにおいて測定された高いレベルの移動距離により反映される観察。しかし、ｃｏｍｂｏ下のラットは、Ｌ−ドーパ／ベンセラジド下で測定されたものと等しいレベルの移動距離を示している。

【図10】ｃｏｍｂｏにより刺激されたラットは、Ｌ−ドーパ／ベンセラジドにより処置された場合と比べて、「適切な体位」でより多くの時間を過ごしていることを示す図である。

【図11】Ｌ−ドーパ／ベンセラジドにより処置された場合に比べて、ｃｏｍｂｏ処置ラットの運動の回転運動半径は増加しているので、これらのラットはまた、Ｌ−ドーパ／ベンセラジド下での処置と比べて、かなり優れた空間占有及び軌道も示していることを示す図である。

【図12】二元配置ＡＮＯＶＡは、有意な処置効果（Ｆ３，２８）＝５．６２、ｐ＜０．０１、有意な時間効果（１１，３０８）＝２２．２１、ｐ＜０．００１、及び有意な処置×時間相互作用（Ｆ３３，３０８）＝４．７１、ｐ＜０．００１を示している。^＊、ｐ＜０．０５：ＳＣＨ１／ＣＯ１は、群ＶＥＨ／ＶＥＨ、ＳＣＨ１／ＶＥＨ及びＶＥＨ／ＣＯ１とは有意に異なっている（ＬＳＤ事後検定）。

【図13】有意な処置効果（Ｆ３，２８）＝７０．６０、ｐ＜０．０１、有意な時間効果（１７，７４６）＝２００．８９、ｐ＜０．００１、及び有意な処置×時間相互作用（Ｆ１７，４７６）＝２．８３、ｐ＜０．００１、＃、ｐ＜０．０５：群ＲＡＤ３／ＴＯＺ３０は、群ＶＥＨ／ＶＥＨ、ＶＥＨ／ＴＯＺ３０、及びＲＡＤ３／ＶＥＨとは有意に異なっている（ＬＳＤ事後検定）。

【図14】トザデナント＋ラジプロジルと活性用量のＬ−ドーパ／ベンセラジドの組合せ投与に関する実験計画を示す図である。

【図15】二元配置混合ＡＮＯＶＡは、有意な処置効果（Ｆ３，２８）＝１５．０６；ｐ＜０．００１、取得セッションの有意な効果Ｆ（９，２５２）＝２９．２３、ｐ＜０．００１を示すが、処置×時間相互作用（ｐ＝０．１８）は示さない。さらなる事後検定により、ｃｏｍｂｏ群は、ｖｅｈ、ｔｏｚ、及びｒａｄ処置群と比べて、活動レベルが顕著に高いことが示された（Ｔｕｋｅｙ、ｐ＜０．０５）。

【図16】ｖｅｈ、ラジプロジル、トザデナント、又はｃｏｍｂｏ、並びにＬ−ドーパ／ベンセラジドにより処置したが、より広いオープンフィールドにて試験した場合の、ラットの行動プロファイルを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本発明の主な態様は、哺乳動物におけるパーキンソン病（ＰＤ）を処置する方法であって、第１の薬剤及び第２の薬剤を投与することを含み、第１の薬剤がアデノシン受容体２（Ａ_２Ａ）のアンタゴニストであり、第２の薬剤が、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体サブタイプＮＲ２Ｂのアンタゴニストである、上記方法に存する。

【0023】

Ａ_２Ａアンタゴニストは、オルソステリック相互作用若しくはアロステリック相互作用のどちらかにより、Ａ_２Ａ受容体の機能を遮断若しくは抑える化学化合物、又はペプチド、或いはタンパク質である。これは、内因性リガンドであるアデノシン又はＡ_２Ａ受容体アゴニストが、受容体を刺激する、及び作用を誘発するのを防止することになる作用剤である。重要なことに、本発明は、Ａ_２Ａアンタゴニスト、すなわち選択的なアデノシン受容体アンタゴニストの使用に基づいている。

【0024】

ＮＲ２Ｂアンタゴニストは、ＮＲ２Ｂ受容体の機能を遮断若しくは抑える化学化合物、又はペプチド、或いはタンパク質であり、これまで特定したすべてのＮＲ２Ｂ選択的アンタゴニストは、受容体上でアロステリック部位に結合することにより作用する。共アゴニストであるグルタミン酸及びグリシン（又は、ＮＭＤＡ）によるＮＲ２Ｂ受容体の活性化により、アンタゴニストによって防止され得るカルシウム流入がもたらされる。

【0025】

非常に様々なＡ_２Ａアンタゴニストが知られており、また、例えば、以下の国際特許出願において特許請求されており、これらの開示は、参照として本明細書に組み込まれている：WO 2012/03898、WO 2011/06152、WO 2011/06020、WO 2011/053507、WO 2010/040003、WO 2010/037122、WO 2009/055308、WO 2009/050198、WO 2008/055711、WO 2007/047293、WO 2007/038212、WO 2006/137527、WO 2006/129626、WO 2006/124770、WO 2006/083949、WO 2012/03898、WO 2011/06152、WO 2011/06020、WO 2011/05350、WO 2010/04000、WO 2010/03712、WO 2009/055308、WO 2009/050198、WO 2008/055711、WO 2007/047293、WO 2007/038212、WO 2006/137527、WO 2006/129626、WO 2006/124770、WO 2006/083949。

【0026】

公知のＡ_２Ａアンタゴニストとしては以下が挙げられるが、一部は臨床開発中である。
・イストラデフィリン（Ｉｓｔｒａｄｅｆｙｌｌｉｎｅ）（ＫＷ−６００２）
・ＭＳＸ−３
・プレラデナント（Ｐｒｅｌａｄｅｎａｎｔ）（ＳＣＨ−４２０，８１４）
・ＰＦＢ−５０９
・ＳＣＨ−５８２６１
・ＳＣＨ−４１２，３４８
・ＳＣＨ−４４２，４１６
・ＳＣＨ−８００９００
・ＳＴ−１５３５
・ＳＴ−４２０６
・カフェイン
・ＶＥＲ−６６２３
・ＶＥＲ−６９４７
・ＶＥＲ−７８３５
・Ｖ−８１４４４
・ビパデナント（Ｖｉｐａｄｅｎａｎｔ）（ＢＩＩＢ−０１４）
・ＺＭ−２４１，３８５

【0027】

好ましいＡ_２Ａアンタゴニストは、イストラデフィリン（Ｉｓｔｒａｄｅｆｙｌｌｉｎｅ）（ＫＷ−６００２）、ＡＳＰ５８５４、ビパデナント（Ｖｉｐａｄｅｎａｎｔ）（ＢＩＩＢ０１４）、ＳＴ−１５３５、プレラデナント（Ｐｒｅｌａｄｅｎａｎｔ）（ＳＣＨ４２０８１４）、ＳＹＮ−１１５、ＺＭ−２４１，３８５、Ｖ−８１４４４を含む群から選択される。

【0028】

イストラデフィリン（ＫＷ−６００２）の化学構造は、以下のとおりである。

【化1】

【0029】

ＡＳＰ５８５４（５−［５−アミノ−３−（４−フルオロフェニル）ピラジン−２−イル］−１−イソプロピルピリジン−２（１Ｈ）−オン）の化学構造は、以下のとおりである。

【化2】

【0030】

ビパデナント（ＢＩＩＢ０１４）の化学構造は、以下のとおりである。

【化3】

【0031】

ＳＴ−１５３５の化学構造は、以下のとおりである、

【化4】

【0032】

プレラデナント（ＳＣＨ４２０８１４）の化学構造は、以下のとおりである。

【化5】

【0033】

ＺＭ−２４１，３８５の化学構造は、以下のとおりである。

【化6】

【0034】

本発明の一実施形態では、本発明において有用なＡ_２Ａアンタゴニストは、式（Ｉ）のものであり、

【化7】

これは、４−ヒドロキシ−４−メチル−ピペリジン−１−カルボン酸（４−メトキシ−７−モルホリン−４−イル−ベンゾチアゾール−２−イル）−アミド、並びに薬学的に許容されるその酸付加塩及び共結晶である。

【0035】

非常に様々なＮＲ２Ｂアンタゴニストが知られており、また、例えば、以下の国際特許出願において特許請求されており、これらの開示は、参照として本明細書に組み込まれている：WO 2010/1221、WO 2009/118187、WO 2009/058261、WO 2009/025265、WO 2008/155778、WO 2007/099828、WO 2007/063839、WO 2007/063286、WO 2007/006157、WO 2006/137465、WO 2006/113471、WO 2006/017409、WO 2006/010967、WO 2006/010964、WO 2005/102390、WO 2005/080317、WO 2005/035522、WO 2005/030720、WO 2005/035523、WO 2005/019222、WO 2005/019221、WO 2004/108705、WO 2004/089366、WO 2004/048364、WO 2004/054579、WO 03/091241、WO 03/084931、WO 03/010159、WO 02/100352、WO 02/080928、WO 02/068409、WO 02/34718、WO 02/12892、WO 02/09736、WO 02/00629、WO 01/98262、WO 01/30330、WO 01/32634、WO 01/32171、WO 01/32177、WO 01/32615、WO 01/32179、WO 01/32174、WO 00/67803。

【0036】

公知のＮＲ２Ｂアンタゴニストとしては以下が挙げられるが、それらの一部は臨床開発中である。
・ＭＫ−０６５７
・トラキソプロジル（ＣＰ−１０１，６０６）
・ＥＶＴ−１０１
・ＥＶＴ−１０２
・ＥＶＴ−１０３
・ラジプロジル（ＲＧＨ８９６）
・ＲＧ−１
・ＥＤ−１５２９
・ＮｅｕｒＯｐ
・ＮｅｕｒＯｐ−２
・ＮｅｕｒＯｐ−３
・ＮｅｕｒＯｐ−４
・ＴＸＴ−０３００
・ＨＯＮ−０００１
・イフェンプロジル（Ｉｆｅｎｐｒｏｄｉｌ）
・サファプロジル（Ｓａｆａｐｒｏｄｉｌ）
・Ｎ−｛（１Ｓ，３Ｓ）−３−［３−（４−メチルベンジル）−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル］シクロペンチル｝−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン（以下及び表１において、「化合物１」とも呼ばれている）

【0037】

本明細書において言及されているＮＲ２Ｂアンタゴニスト又はＡ_２Ａアンタゴニストは、市販されているか、又は本明細書において言及されている参照特許を含めた、当業者に公知の方法論に従って調製することができる。

【0038】

好ましいＮＲ２Ｂアンタゴニストは、トラキソプロジル（ＣＰ−１０１，６０６）、ラジプロジル（ＲＧＨ８９６）、ＥＶＴ−１０１、ＥＶＴ−１０２、ＥＶＴ−１０３、イフェンプロジル、ＭＫ−０６５７、サファプロジル、又は化合物１と命名されているＮ−｛（１Ｓ，３Ｓ）−３−［３−（４−メチルベンジル）−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル］シクロペンチル｝−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミンを含む群から選択される。

【0039】

トラキソプロジル（ＣＰ−１０１，６０６）の化学構造は、以下のとおりである。

【化8】

【0040】

ラジプロジル（ＲＧＨ８９６）の化学構造は、以下のとおりである。

【化9】

【0041】

ＥＶＴ−１０１の化学構造は、以下のとおりである。

【化10】

【0042】

イフェンプロジルの化学構造は、以下のとおりである。

【化11】

【0043】

ＭＫ−０６５７の化学構造は、以下のとおりである。

【化12】

【0044】

サファプロジルの化学構造は、以下のとおりである。

【化13】

【0045】

Ｎ−｛（１Ｓ，３Ｓ）−３−［３−（４−メチルベンジル）−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル］シクロペンチル｝−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン（化合物１）の化学構造は、以下のとおりである。

【化14】

【0046】

本発明の一実施形態では、Ａ_２Ａアンタゴニストは、他のアデノシン受容体サブタイプＡ_１、Ａ_２Ｂ及びＡ_３の各々よりも、少なくとも１０倍、好ましくは３０倍、及び理想的には１００倍以上、選択性が高い。

【0047】

本発明の一実施形態では、ＮＲ２Ｂアンタゴニストは、他のＮＭＤＡ受容体サブタイプＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｃ、及びＮＲ２Ｄの各々よりも、少なくとも１０倍、好ましくは３０倍、及び理想的には１００倍以上、選択性が高い。

【0048】

本発明の一実施形態では、Ａ_２Ａアンタゴニスト対ＮＲ２Ｂアンタゴニストの用量比は、３０：１〜１：３０の間で変動し、別の実施形態では、その比は１０：１〜１：１０で変動し、別の実施形態では、３：１〜１：３で変動し、さらに別の実施形態では、その比は約１：１である。

【0049】

本発明の一実施形態では、本組成物は、ＮＲ２ＢアンタゴニストとしてラジプロジルとＡ_２Ａアンタゴニストとしてトザデナントとの組合せを含む。それらの２つの化合物の間の比は、３０：１〜１：３０で変動してもよく、別の場合、その比は１０：１〜１：１０で変動し、別の場合、３：１〜１：３で変動する。

【0050】

本発明による方法では、両方の薬剤、すなわちＡ_２ＡアンタゴニストとＮＲ２Ｂアンタゴニストが、本質的に同時に投与される。一実施形態では、それらは、ＰＤの処置のために、単独又はさらなる医薬品と組み合わせて、正確に同時投与される。

【0051】

さらなる実施形態では、Ａ_２Ａアンタゴニスト及びＮＲ２Ｂアンタゴニストは、一旦Ｌ−ドーパの投与を開始したら任意の時点で一緒に投与される。

【0052】

さらなる実施形態では、Ａ_２Ａアンタゴニスト及びＮＲ２Ｂアンタゴニストは、疾患の処置中の任意の時点でドーパミンアゴニストと一緒に投与される。

【0053】

さらなる実施形態では、Ａ_２Ａアンタゴニスト及びＮＲ２Ｂアンタゴニストは、Ｌ−ドーパと一緒に投与される。Ｌ−ドーパは、現在のところパーキンソン病を処置するための至適基準である。標準調製品（Ｓｉｎｅｍｅｔ、アタメット）は、レボドーパ（ｌｅｖｏｄｏｐａ）とカルビドーパ（ｃａｒｂｉｄｏｐａ）とを組み合わせたものであり、カルビドーパはレボドーパの作用を改善し、且つその副作用（特に、吐き気）をいくらか軽減する。その調製品は、１日あたり３分割又は４分割用量で、通常、摂取されるが、投与量は変動する。

【0054】

Ｌ−ドーパ／カルビドーパの典型的な投与量は、この疾患の初期段階中では、レボドーパ／カルビドーパが、１００／２５ｍｇで３回／日である。後期段階では、１日あたりカルビドーパ３０ｍｇを含んで最大１０００ｍｇのレボドーパを投与することができるが、現在の奨励は、レボドーパ４００〜６００ｍｇよりも多い用量は提案していない。

【0055】

ＰＤの処置のためのさらなる医薬品としては、アマンタジン（Ｓｙｍｍｅｔｒｅｌ（登録商標））、ベンズトロピン（Ｃｏｇｅｎｔｉｎ（登録商標））、ブロモクリプチン（Ｐａｒｌｏｄｅｌ（登録商標））、エンタカポン（Ｃｏｍｔａｎ（登録商標））、ペルゴリド（Ｐｅｒｍａｘ（登録商標））、プラミペキソール（Ｍｉｒａｐｅｘ（登録商標））、ロピニロール（Ｒｅｑｕｉｐ（登録商標））、セレジリン（Ｅｌｄｅｐｒｙｌ（登録商標））、Ｓｉｎｅｍｅｔ（登録商標）（カルビドーパ／レボドーパ）、トルカポン（Ｔａｓｍａｒ（登録商標））、ロチゴチン（Ｎｅｕｐｒｏ（登録商標））が挙げられる。

【0056】

本発明の一実施形態では、Ａ_２Ａアンタゴニスト及びＮＲ２Ｂアンタゴニストが１日１回、単独で又はＬ−ドーパと一緒に投与される。

【0057】

本発明のさらなる態様は、薬学的に許容される担体中に又は薬学的に許容される添加剤と混合されている、アデノシンＡ_２Ａ受容体アンタゴニスト及びＮＲ２Ｂアンタゴニストの組合せの治療有効量を含む医薬組成物に関する。

【0058】

本発明の一実施形態では、前記医薬組成物中のＡ_２Ａアンタゴニスト対ＮＲ２Ｂアンタゴニストの用量比は、３０：１〜１：３０の間で変動し、別の実施形態では、その比は１０：１〜１：１０で変動し、別の実施形態では、３：１〜１：３で変動し、さらに別の実施形態では、その比は約１：１である。

【0059】

本発明の一実施形態では、本組成物は、ＮＲ２ＢアンタゴニストとしてラジプロジルとＡ_２Ａアンタゴニストとしてトザデナントとの組合せを含む。それらの２つの化合物の間の比は、３０：１〜１：３０で変動してもよく、別の場合、その比は１０：１〜１：１０で変動し、別の場合、３：１〜１：３で変動する。

【0060】

本医薬組成物は、１つの錠剤中に、アデノシンＡ_２Ａ受容体アンタゴニストとＮＲ２Ｂアンタゴニストの両方を組み合わせた所定の組合せとすることができるか、又は本医薬組成物はキットオブパーツとすることができるかのいずれか一方である。

【0061】

本発明の一実施形態では、本医薬組成物は、
（ａ）治療有効量のＡ_２Ａ受容体アンタゴニストを含む医薬製剤を収容している第１の収容容器と、
（ｂ）治療有効量のＮＲ２Ｂアンタゴニストを含む医薬製剤を収容している第２の収容容器と
を含むキットオブパーツから形成される。

【0062】

本発明による組成物は、パーキンソン病の処置のための医薬組成物を製造するために使用することができる。こうした組成物は、通常、活性医薬成分、及び薬学的に許容される添加剤を含有している。

【0063】

適切な賦形剤及び担体は、所望の投与経路、例えば、経口、直腸、非経口又は鼻腔内に応じて、広範囲の形態をとることができる。

【0064】

経口投与に適した医薬組成物は、固体又は液体とすることができ、また例えば、錠剤、丸剤、糖衣剤、ゼラチンカプセル剤、溶液剤、シロップ剤、チューインガム剤などの形態とすることができる。

【0065】

本発明による化合物を含む医薬組成物は、例えば、経口的、非経口的（すなわち、静脈内、筋肉内若しくは皮下、髄膜下）、吸入により又は鼻腔内に投与することができる。

【0066】

この目的のため、活性成分は、不活性賦形剤、又はデンプン若しくはラクトースなどの非毒性の薬学的に許容される担体と混合してもよい。場合により、これらの医薬組成物はまた、結晶性セルロース、トラガントガム若しくはゼラチンなどの結合剤、アルギン酸などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロース若しくはサッカリンなどの甘味剤、又は着色剤、或いはペパーミント又はサリチル酸メチルなどの香味剤も含有することができる。

【0067】

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される塩」とは、その親化合物が、その酸性塩又は塩基塩の作製により修飾されている誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例としては、以下に限定されないが、アミンなどの塩基性残基の鉱酸塩又は有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩又は有機塩などが挙げられる。薬学的に許容される塩としては、例えば、非毒性無機酸又は有機酸から形成されるその親化合物の慣用的な非毒性塩又は四級アンモニウム塩が挙げられる。例えば、こうした慣用的な非毒性塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸由来のもの；及び酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタン二スルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸などの有機酸から調製される塩などが挙げられる。

【0068】

本発明はまた、制御様式で活性物質を放出することができる組成物も意図している。非経口投与に使用することができる医薬組成物は、アンプル、使い捨てシリンジ、ガラス製若しくはプラスチック製バイアル、又は注入用容器に一般に含有されている、水性又は油性溶液剤或いは懸濁剤などの慣用的な形態にある。

【0069】

活性成分に加えて、これらの溶液剤又は懸濁剤はまた、注射用水、生理食塩水溶液剤、油剤、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、若しくは他の合成溶媒などの滅菌賦形剤、ベンジルアルコールなどの抗菌剤、アスコルビン酸若しくは亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩若しくはリン酸塩などの緩衝剤、及び塩化ナトリウム若しくはデキシトロースなどの容量オスモル濃度を調節するための作用剤も場合により含むことができる。

【0070】

薬学的に許容される共結晶の形態の本発明の化合物を含有している医薬組成物も、本発明に含まれる。

【0071】

投与量は、広範な制限内で変動することができ、当然ながら、各特定の場合において個々の要件に調節しなければならないであろう。経口投与の場合、成人に関する投与量は式Ｉの化合物、又は薬学的に許容されるその塩の対応する量を１日あたり約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇで変動し得る。毎日の投与量は、単回用量として、又は分割用量で投与することができ、さらに、その上限は、これが指示されていると分かっている場合、上限値を超過することもできる。

【0072】

好ましくは、ヒト患者の処置のために投与される、Ａ_２Ａアンタゴニスト及びＮＲ２Ｂアンタゴニスト、又はそれらの薬学的に許容される塩の各々の量は、１日あたり約２ｍｇ〜約２００／１０００ｍｇに調節される。１日用量の合計は、単回用量又は分割用量として投与されてもよい。こうした１日の処置量、又は合計の１日用量は、約５ｍｇ〜約４５ｍｇ、約６ｍｇ〜約３５ｍｇ、約８ｍｇ〜約３０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約２５ｍｇ、約１２ｍｇ〜約２０ｍｇ、約１４ｍｇ〜約１８ｍｇ、約１５ｍｇ〜約１８ｍｇ、又は上で列挙した量のすべての中の任意の範囲とすることができる。例えば、１日の処置量は、約２ｍｇ、５ｍｇ、約６ｍｇ、約８ｍｇ又は約１０ｍｇから約１２ｍｇ、約１４ｍｇ、約１５ｍｇ、約１６ｍｇ、約１８ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ又は約３５ｍｇまでである。特に、１日の処置量は、約２ｍｇ又は約４ｍｇから約２０ｍｇ、約２５ｍｇ又は約３０ｍｇまでである。

【0073】

入手可能なデータは、本発明による組成物及び使用方法に関与する共作用が存在していることを示唆することになろう。

【実施例】

【0074】

パーキンソン病（ＰＤ）の古典的な運動症状は、黒質ドーパミン作動性細胞の喪失、及びドーパミン代償療法の導入に至らしめる尾状核−被殻のドーパミン含有量の低下を伴う。６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）を内側前脳束に片側定位注射すると、黒質線条体路の破壊、及び線条体へのドーパミン作動性入力の喪失を引き起こす。Ｕｎｇｅｒｓｔｅｄｔ（Ｕｎｇｅｒｓｔｅｄｔ１９７１年；Ｕｎｇｅｒｓｔｅｄｔ及びＡｒｂｕｔｈｎｏｔｔ１９７０年）により１９７０年に開発されたこのモデルは、進行性ＰＤの状態を模倣したものであり、対症薬物の試験に使用されている。１つの脳半球内のドーパミン作動性システムの大規模な損傷は両身体側間の感覚運動の平衡失調を生じ、特定の行動障害に至る。ドーパミン（例えば、ドーパミンアゴニスト又はＬ−ドーパ）により通常、標的とされるシナプス後部の受容体部位を刺激する薬物は、破壊側（向反側回転）の反対の方角にラットを回転させる。この回転応答は、ドーパミン作動性受容体の過感受性の結果であると考えられ、これは線条体（の一部）の除神経の後に起こる（総説に関しては、Ｓｃｈｗａｒｔｉｎｇ及びＨｕｓｔｏｎ１９９６年を参照されたい）。

【0075】

Ｌ−ドーパ−誘発性の対側性回転応答は、長い間、新しい抗パーキンソン病の薬物をスクリーニングするため、及びそれを特定するための有用な予測モデルであり、感覚運動の回復に対する薬物の効果を定量的に評価する。

【0076】

各アンタゴニスト単独に対するＡ_２Ａ／ＮＲ２Ｂアンタゴニストの併用は、以下の驚くほどの利点を実現することを示した。
・薬物未投与のパーキンソン病ラット（処置を何ら受けていないパーキンソン病ラット）における、単独処置（ＮＲ２Ｂ／Ａ_２Ａｃｏｍｂｏの単独投与）：運動症状に対する有効性が、完全有効用量のＬ−ドーパによって達成されるものと同等である／それと本質的に類似しているが、Ｌ−ドーパとは異なり、慢性ｃｏｍｂｏ処置は、運動合併症を生じなかったことを実証することができた。
・Ｌ−ドーパでプライミングされたラット、すなわち以前のＬ−ドーパ処置によりジスキネジアになったラットにおける単独処置（ＮＲ２Ｂ／Ａ_２Ａｃｏｍｂｏの単独投与）、異常運動の非存在下で運動活動性を完全に回復する能力。
・Ｌ−ドーパの非活性用量に対する追加処置：この組合せは、Ｌ−ドーパの非活性用量を有効にする；これは、異常運動の非存在下で起こる。Ｌ−ドーパの活性用量に対する追加処置：この組合せは、対側性回転に対するＬ−ドーパの効果を増強し、また慢性的処置におけるＬ−ドーパ誘発性のＡＩＭの発症を低減する（すなわち、抗Ｌ−ドーパプライミング効果）。

【0077】

方法
パーキンソン病の前臨床モデル：６−ＯＨＤＡ片側損傷ラットモデル
対象：手術時に２５０〜２７５ｇ、且つ薬物試験時に４００〜４５０ｇの体重がある雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｊａｎｖｉｅｒ社、フランス）を使用する。

【0078】

飼育者からの到着時、及び実験の前に、ラットを動物室内のホームケージ（１ケージあたり５匹のラット）中で、１週間、馴化させた。それらのラットを、６：００時に明かりをつけて１２：１２の明／暗周期に維持し、２０〜２１℃に維持した温度、及び湿度約４０％で収容する。動物はすべて、実験群に割り当てる前に、標準ペレット食物及び水に自由にアクセスさせた。

【0079】

６−ＯＤＨＡ損傷のための手術
到着の１週間後の手術の日に、ラットは右側の内側前脳束に６−ＯＨＤＡの片側注射を受けた。各ラットは、ノルエピネフリン作動性（ＮＥ）ニューロンを保護するための手術の１５分前に、イミプラミンＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ社）を投与された。ラットをケタミン（Ｃｅｖａ社、７５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（Ｂａｙｅｒ社、１０ｍｇ／ｋｇ）により麻酔をかけ、定位固定器（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）に置いた。注射部位の上の頭蓋骨に小さな穴を空けた後、前頂及び硬膜の表面に対して、以下の座標（ｍｍ）にある右上行内側前脳束に、６−ＯＨＤＡを注射した。ＡＰ＝−３．５、ＭＬ＝−１．５、ＤＶ＝−８．７。各ラットは、６−ＯＨＤＡ（４μｇ／μｌ）の注射を５分間（０．５μｌ／分）で、ラットあたり合計１０μｇで１回受けた。毒素の逆流を回避するため、ニードルは４分後に引き抜いた。次に、動物を熱源下のクリーンケージ内に入れ、食物及び水を自由に与えて回復させた。各ラットは、実験者及び環境に対する完全回復並びに順化を確実にするため、３週間、規則的にモニターして取り扱った。

【0080】

６−ＯＨＤＡ損傷の評価
首尾よく損傷した動物を選択するため、手術後２１日目に、ラットはすべて低用量のアポモルヒネ（Ｓｉｇｍａ社、０．０５ｍｇ／ｋｇ、ｓｃ）による接種を行った。４５分間の記録期間中に９０を超える向反側回転（３６０°）を示すラットを本研究に含めた。これらの基準を満たすラットは、ドーパミン作動性ニューロンの片側喪失、及び９５％を超える線条体ドーパミンの片側欠失を有することが以前に実証されている（内部データ）。

【0081】

使用したＡ_２Ａ及びＮＲ２Ｂアンタゴニスト
Ａ_２Ａアンタゴニスト及びＮＲ２Ｂアンタゴニスト参照化合物は、１ｋｇあたりビヒクル体積５ｍｌに溶解した。Ｌ−ドーパメチルエステル（Ｓｉｇｍａ社）及びベンセラジド（Ｓｉｇｍａ社）を５ｍｌ／ｋｇの体積で、生理食塩水溶液に溶解した。参照化合物のビヒクル溶液は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）５％、及びメチルセルロース１％を含有している蒸留水９５％から作製されている。損傷用の６−ＯＨＤＡ−ＨＢｒは、μｌあたり６−ＯＨＤＡ４μｇの濃度で、０．０２％アスコルバート−蒸留水に溶解する。

【0082】

以下のＡ_２Ａアンタゴニスト、ＳＣＨ−５８２６１を使用した：プレラデナント、トザデナント及びＫＷ−６００２。使用したＮＲ２Ｂアンタゴニストは、ラジプロジル、Ｃｏ−１０１２４４、化合物１であった。薬物は一般に、経口投与だけを行ったトザデナントを除いて、一般に腹腔内投与した。したがって、ラジプロジルをトザデナントと組み合わせて投与する場合、ラジプロジルは、そうした場合では、経口投与した。

【0083】

行動記録装置
回転活動（同側性／対側性回転）
回転行動は、自家製のコンピューターシステムを使用して記録した。ＰＣに直接接続した機械センサーにリンクしたハーネスにラットを固定した。最高でも最大２４０分間、各３６０°の時計回り又は反時計回りを自動的に記録した。この実験全体を通じて、個々の試験用ケージにラットを割り当てた。水平な透明ガラス製底部に置き、丈夫な固定器により保持されている、８つの透明なアクリル製チャンバ（５０×４０ｃｍ）の各々を、２５×２２ｃｍの４つの個別の四角型試験用ケージにさらに分類することができた。取り除きが可能なアクリル製プレートを蓋にする。これらのチャンバにより覆われる表面全体を観察するよう、各アリーナの真下に携帯用デジタルカメラ（Ｓａｍｓｕｎｇ社、ＳＣＢ−３００１ＰＨ）を直接設置した。この配置により、セッションあたり３２匹のラットの中から合計８匹について、１台のカメラにより、１匹又は４匹のラットの同時撮影が可能であった。電照は、固定器の各脚に単独で固定したネオン管により供給した。ビデオシークエンスは、保存用ハードディスクに記録して、その後、解析及び保存用ＰＣに転送した。

【0084】

一般的活動（距離及び立ち上がり）
一般的活動は、ＰＣに接続されており、水平及び垂直方向の運動を測定する広いオープンフィールド内で記録した。１２個のチャンバ（ＬＥ８８１１ＩＲ、Ｐａｎｌａｂ）中で、ラットを個別に試験し、各々は、底部を含まない、０．５ｃｍの透明アクリルシートから作製されている正方形の囲いからなっている（表面４５×４５ｃｍ×高さ４０ｃｍ）。各囲いは、床の役割をするステンレス鋼（ｉｎｏｘ社）の正方形プレート上に置いた。その板に、プラスチック被覆したシートを調節した。各装置は、高さ７３．５ｃｍの実験台に置いた。移動を検知して、高さ３ｃｍにある囲いの各側面上に位置している１６個の赤外光線センサーにより測定した。光線が表面全体に１５×１５の正方形マトリックスを形成するよう、センサーは互いに２．５ｃｍ、及び側面の各端から４．０ｃｍの間隔を設けた。活動数はパーソナルコンピュータにより記録した。Ａｃｔｉ−Ｔｒａｃｋソフトウェア（Ａｃｔｉｔｒａｃｋ°、Ｐａｎｌａｂ）を使用して、取得セッション中に生成した生データを統計的に解析可能なパラメータに変換した。パラメータ「移動距離」及び「立ち上がり数」は、関連従属変数として保持された。

【0085】

オープンフィールド内の行動プロファイル解析
６−ＯＨＤＡ片側損傷ラットの特定の行動プロファイルは、ビデオ取得システムに接続した８台のカメラにより記録した。処置下のラットは、狭い環境（ロトメータ、２５×２２ｃｍ）又は広いオープンフィールド（５０×４０ｃｍ）内で自由に置き、その行動を５５分間ビデオ記録した（合計で３３００秒）。狭い（ロトメータ）又は広い（オープンフィールド）環境における配置は、試験に依存し得る。回転活動に関係する項目において記載されているとおり、ラットは下から撮影した。

【0086】

生存データの記録後、続いて、このビデオを（Ｎｏｌｄｕｓ、バージョン９．０）製のＥｔｈｏｖｉｓｉｏｎプログラムによって解析する。動物、及びその運動、並びに転置は、３点（鼻部、中心部、及び尾部）に従い定義した。運動、身体の位置、及び空間占有は、プログラム中の特定の基準及び閾値により定義されるフィルター解析に準拠して設定した。様々な行動パラメータを解析し、関連性のあるものだけ（すなわち非相関性のもの）を最終的な行動説明のために保持した。

【0087】

異常不随意運動（「ＡＩＭ」）の解析は、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ９．０において定義されている特定のパラメータを用いて行った。パラメータ「身体の伸長」とは、ラットのジスキネジア（すなわち、ジストニア）位置の強度と頻度の両方を区別するために使用した。そうするために、３つのレベルを決める。
− 「萎縮」＝重症なＡＩＭ（閾値＜３０％）。このパラメータは、ラットが後脚で立ち（苛酷な身体のトランケーション（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）を伴う垂直方向の直立位）且つ非常に強いジストニア体位を示す姿勢で過ごした時間（秒）を指す。下からは、体形は円のように見える。
− 「正常」＝中程度のＡＩＭ（閾値、３０％＜正常＜５０％）。このパラメータは、ラットが３本の脚で立ち且つ中程度のジストニア位置（若干の身体のトランケーションを伴う水平体位）を示す姿勢で過ごした時間（秒）を指す。
− 「伸展」＝ＡＩＭがない（閾値＞５０％）。このパラメータは、ラットがより頻繁に４本の脚で立ち（水平位）且つ身体のトランケーションなしに若干の安定性を示す姿勢で過ごした時間を指す。

【0088】

解析に使用する最終的なパラメータの識別、及びその閾値に関する決定は、定着している決定的な解析における、最初の直接観察に基づいた。

【0089】

他のタイプの行動の解析は、視覚的に観察された行動をできる限り最良に説明して、その行動を定量化することができるよう、ビデオ解析プログラム（Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ９．０）において選択した特定のパラメータにより行った。パラメータ「距離」、「反時計方向の回転」「時計方向の回転」、「伸展」は、解析から抽出した。追加パラメータである「回転運動半径」は、このシステムにより得られた生データから計算する。
− 距離（＝「距離」）：動物が移動した合計距離（ｃｍ）
− 反時計方向（＝「同側性ターン」）：損傷の方向と同じ方向の、同側性回転の３６０°ターンの計数。
− 時計方向（＝「対側性ターン」）：損傷の方向とは逆の方向の、対側性回転の３６０°ターンの計数。
− 「伸展」：（＝「適切な体位」）：ラットが、屈曲した胴体の姿勢をとらずに、４本脚で立っている姿勢で過ごした時間。本プログラムでは、これは、適切な体位の強度及び頻度を区別するために使用されるパラメータ「身体の伸長」である。この閾値は７０％に固定する。
− 「回転運動半径」（＝「適切な軌道」）：特定の時間間隔に対する、動物の位置と、この特定の時間間隔内での平均位置との間の平均距離。このパラメータは、アリーナの全空間を使用するラットの能力を反映しており、センチメートルで測定する。

【0090】

統計解析
一般的活動（アクトメータ）及び回転（ロトメータ）：一般的活動（距離及び立ち上がり）、及び回転（対側性）に関する統計解析は、パラメトリック統計によって行った。

【0091】

アクトメータでの一般的活動（距離及び立ち上がり）測定のレベルは、群間因子としてＡ_２Ａアンタゴニスト（２レベル）及びＮＲ２Ｂアンタゴニスト（２レベル）、並びに対象内因子としての時間（６又は２４レベル）による、三元配置混合ＡＮＯＶＡにより評価した。これらの平均値間の多重対比較は、Ｔｕｋｅｙ事後検定により行った。

【0092】

Ｌ−ドーパ誘発性の対側性回転レベルに対するＡ_２Ａ及び／又はＮＲ２Ｂによる処置効果は、群間因子としての薬物処置（４レベル）、及び対象内因子としての時間（１２又は１８レベル）による、二元配置混合ＡＮＯＶＡにより評価した。これらの平均値間の多重対比較は、ＬＳＤ事後検定により行った。

【0093】

Ａ_２Ａ及び／又はＮＲ２ＢアンタゴニストとＬ−ドーパ／ベンセラジドによる処置下での取得セッションのデータは、対象内因子（１０セッションレベル）としての慢性セッションによる二元配置反復測定ＡＮＯＶＡにより解析した。平均間差の信頼性は、Ｆ統計量を使用する計画された対比により評価した。さらに、事後解析は、変数「処置」上で別々に行った（Ｔｕｋｅｙ、事後検定）。

【0094】

各試験について、Ｐ＜０．０５の場合、統計的に有意であると考えた。

【0095】

特定の行動解析：完全な行動解析に関して保持した５つの行動（すなわち、距離、対側性ターン、同側性ターン、適切な体位、及び適切な軌道）は、パラメトリック統計量を用いて解析したが、データに関する変数の均一性が信頼されない場合（等分散に関するＢａｒｔｌｅｔｔ’検定）、これら後者のデータは、ノンパラメトリック統計（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）によって解析した。両方の場合、一元配置ＡＮＯＶＡを実施し、各独立行動に対する様々な処置効果を区別した。有意な平均間差は、Ｐ＜０．０５を用いる、Ｔｕｋｅｙ事後検定又はＤｕｎｎ多重比較試験により決定した。

【0096】

略語リスト
Ｉｐ：腹腔内
Ｐｏ：経口の、経口投与
ｍｇ／ｋｇ：１キログラムあたりのミリグラム
ｓｅｃ：秒
ｃｍ：センチメートル
Ｒａｄ３：３ｍｇ／ｋｇの用量のラジプロジル
Ｔｏｚ３０：３０ｍｇ／ｋｇの用量のトザデナント
Ｃｏｍｂｏ：Ａ_２Ａ受容体アンタゴニスト及びＮＲ２Ｂ受容体アンタゴニスト、並びに具体的には、特定の場合にはトザデナント３０ｍｇ／ｋｇ＋ラジプロジル３ｍｇ／ｋｇの任意の組合せ
ＣＯ１：１ｍｇ／ｋｇの用量のＣｏ−１０１２４４
ＳＣＨ１：１ｍｇ／ｋｇの用量のＳＣＨ−５８２６１
Ｖｅｈ：ビヒクル
ＬＤ２５：Ｌ−ドーパ２５ｍｇ／ｋｇ
ＬＤ／ＢＺ：Ｌ−ドーパ＋ベンセラジド
ＡＩＭｓ：異常不随意運動

【0097】

実験項
Ａ．片側パーキンソン病ラットにおける、Ａ_２ＡアンタゴニストとＮＲ２Ｂアンタゴニストとを一緒にした単独処置
（例１）
６種の異なる実施形態間の活動量に対する、Ａ_２ＡアンタゴニストとＮＲ２Ｂアンタゴニストとの組合せの有効性
パーキンソン病の６−ＯＨＤＡ片側損傷ラットモデルにおいて、表１に従って、Ａ_２ＡアンタゴニストとＮＲ２Ｂアンタゴニストとの６種の異なる共投与（＝ＣＯＭＢＯ）を試験する。

【0098】

記録した行動パラメータは、「移動距離」及び「立ち上がり数」であった。この後者の立ち上がり数は、アクトメータで自動的に測定する。共投与のすべてが、該化合物単独で行った処置と比べて、活動レベル（距離及び／又は立ち上がり数）の著しい向上を示している。

【0099】

【表1】

【0100】

各組合せ（ｃｏｍｂｏ）において、片側パーキンソン病ラットの行動についてのこうした処置の付加値は著しく、予期しないものであった。すべてのｃｏｍｂｏ（適切な用量選択の場合）は、ビヒクル処置ラット及び化合物単独で処置したラットと比べると、活動レベルの向上により運動機能を回復することができた。さらに、この刺激行動は、現在のドーパミン作動性ＰＤ療法（すなわち、ＤＡアゴニスト又はＬ−ドーパ）で観察される、典型的な非対称的行動偏り、及び異常体位（すなわち、ジストニア体位）には関連するものではなかった。行動に対するこの特異的効果は、アクトメータでの試験中、目視観察された。

【0101】

（例２）
１つの具体例（トザデナント及びラジプロジル）により刺激された運動活動性の質に対する組合せ有効性の実証
ＮＲ２Ｂアンタゴニスト及びＡ_２Ａアンタゴニストの共投与は、６種の異なる交差ｃｏｍｂｏにより、活動レベル（移動距離及び立ち上がり数）が予期せず向上することを示した。動物が活動チャンバ（アクトメータ）に置かれている間に目視観察された、この予期しない行動プロファイル（すなわち、優れた体位を伴って運動活動性を向上させる）は、以下の例において詳細に説明され、また様々な行動パラメータの定量的測定により例示される。

【0102】

ラットの行動に対する、ラジプロジル（３ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ）とトザデナント（３０ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ）との経口共投与の効果を、以下：
１）別々に行うこれらの化合物の試験、
２）部分活性用量のＬ−ドーパ（２５ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）の試験、
３）完全活性用量のＬ−ドーパ／ベンセラジド（１６／４ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）の試験
と比較する。

【0103】

行動プロファイルは、ビデオ記録に基づいた自動行動解析システムにより詳細に解析した（説明に関する方法の項目を参照されたい）。さらに、行動の古典的測定（ロトメータ及びアクトメータ）も、運動量を評価するために使用する。

【0104】

運動量解析：刺激効果の期間
自動装置で試験した場合、ｃｏｍｂｏは長期持続作用を示した一方、活性用量のＬ−ドーパ／ベンセラジドは約３時間続き、また部分活性用量は約１時間続いた（非常に短時間作用性効果である）。ｃｏｍｂｏによる実験では、ラットは、化合物（すなわちトザデナント及び／又はラジプロジル）の経口投与の６０分後に試験アリーナに入れた一方、Ｌ−ドーパ２５ｍｇ／ｋｇを投与したラットはＬ−ドーパ投与（ｉｐ）の１０分後に、及びＬ−ドーパ／ベンセラジドによる処置ラットは腹腔内投与の１５分後に、ロトメータに入れた。

【0105】

図２中のデータ（すなわち、ビヒクル、Ｌ−ドーパ２５及びＬ−ドーパ／ベンセラジド群の比較）は、様々な実験由来のものであり、後の解析のために一緒に群分けをした。

【0106】

図１：
グラフ右：三元配置混合ＡＮＯＶＡ。ラジプロジル（３ｍｇ／ｋｇ）の有意な効果、Ｆ（１，２８）＝５１．４５、ｐ＜０．００１。トザデナント（３０ｍｇ／ｋｇ）の有意な効果、Ｆ（１，２８）＝１７６．０、ｐ＜０．００１。時間の有意な効果、Ｆ（２３，６４４）＝４２．２８、ｐ＜０．００１。有意な≪ラジプロジル×トザデナント≫相互作用、Ｆ（１，２８）＝１４．８１、ｐ＜０．０１。
Ｔｕｋｅｙ事後検定（ｐ＜０．０５）：ＴＯＺ３０／ＲＡＤ３組合せにより処置されたラットは、ＶＥＨ／ＶＥＨ、ＴＯＺ３０／ＶＥＨ、及びＶＥＨ／ＲＡＤ３の群の由来のものよりも高い距離スコアを有している。
グラフ左：三元配置混合ＡＮＯＶＡ。ラジプロジル（３ｍｇ／ｋｇ）の有意な効果、Ｆ（１，２８）＝９．４０、ｐ＜０．０１。トザデナント（３０ｍｇ／ｋｇ）の有意な効果、Ｆ（１，２８）＝６４．６０、ｐ＜０．００１。時間の有意な効果、Ｆ（２３，６４４）＝１６．６７、ｐ＜０．００１。有意な≪ラジプロジル×トザデナント≫相互作用、Ｆ（１，２８）＝４．６０、ｐ＜０．０５。
Ｔｕｋｅｙ事後検定（ｐ＜０．０５）：ＴＯＺ３０／ＲＡＤ３組合せにより処置されたラットは、ＶＥＨ／ＶＥＨ、ＴＯＺ３０／ＶＥＨ、及びＶＥＨ／ＲＡＤ３の群の由来のものよりも高い立ち上がりスコアを有している。

【0107】

図２：
処置効果は、有意な効果Ｆ（２，２１）＝４３．６８、ｐ＜０．００１を示している。時間の有意な効果（Ｆ（１７，３５７）＝２０．０５、ｐ＜０．００１）も観察され、また有意な相互作用（Ｆ（３４，３５７）＝１１．７４、ｐ＜０．００１）も同様である。追加的な事後比較検定により、これはあくまで、ビヒクル処置ラット（Ｔｕｋｅｙ、ｐ＜０．０５）と比べて有意に活性であるＬ−ドーパ／ベンセラジドによる効果であることが示される。

【0108】

運動の質の解析：様々なタイプの行動の詳細定量化及び定性
完全な行動解析により、ｃｏｍｂｏが片側パーキンソン病ラットの行動に対して予期せぬ効果を有することが示された。ラジプロジル及びトザデナントの組合せ（すなわち、「Ｃｏｍｂｏ」）は活性用量のＬ−ドーパ／ベンセラジドで観察されるものに匹敵する運動量を回復している（これは、個別に試験した化合物の場合ではない）。さらに、このｃｏｍｂｏは、行動の質を強く改善する。方向、軌道、及び体位は顕著に改善され、また非損傷ラットにおいて観察された行動に相当している。

【0109】

通常、Ｌ−ドーパ処置ラットは、（１）ステレオタイプの対側性回転（対側方向から同側方向に転じる能力が全くない）、（２）屈曲した体位、及び（３）非常に短時間の転置軌道（回転運動半径）（刺激の間、これらのラットは窮屈な対側性回転しかしないため）を示す。

【0110】

対照的に、ｃｏｍｂｏ処置ラットは、（１）対側方向から同側方向に転じる能力、（２）屈曲した体位ではない（胴体に何らゆがみなく４本の脚で上手に立つ非損傷ラットの姿勢について言及する場合、適切な体位）、及び（３）より大きな軌道（それらのラットはまっすぐ動き、Ｌ−ドーパ下で通常観察されるもののようなステレオタイプの窮屈な対側性回転を何ら示さないので）を示す。

【0111】

表２：３つの行動カテゴリー、すなわち（１）運動量、（２）方向を転じる能力、（３）軌道及び体位に分けたものを、ラジプロジル及びトザデナント単独、「トザデナント＋ラジプロジル」からなるｃｏｍｂｏ、及び部分活性用量のＬ−ドーパ（２５ｍｇ／ｋｇ）、並びに相当な活性用量のＬ−ドーパ／ベンセラジド（１６／４ｍｇ／ｋｇ）の効果を比較する。これらの結果は、ビヒクル処置片側パーキンソン病ラットと比べた、変化率を示している。この目的は、回復指数を測定することである。それらのデータは、試験の異なる２つの時間点について表される。

【0112】

この表は、ｃｏｍｂｏ処置ラットの運動量（距離）が、ビヒクル処置ラットで観察されたものよりも非常に優れていること、及びこの効果は、Ｌ−ドーパ／ベンセラジド処置ラットにより生じた効果と同等であることを示している。対照的に、「適切な体位」及び「適切な軌道」の割合は、ｃｏｍｂｏでは、化合物単独の試験、ビヒクル処置群、及びＬ−ドーパ／ベンセラジド処置群と比べて非常に増加している。Ｌ−ドーパ／ベンセラジド群はまた、ビヒクル処置ラットと比べて、対側方向への強い偏りも示している。こうした偏りは、ｃｏｍｂｏ又は化合物単独では、観察されない。

【0113】

【表2】

【0114】

図３は、試験の最初の２０分間、及び最後の２０分間の、Ｌ−ドーパ／ベンセラジド処置ラットで観察されるものに等しい、運動量（距離）を生じるｃｏｍｂｏの能力を示している。

【0115】

図４は、同側性ターンと対側性ターン（運動）の両方を誘発するｃｏｍｂｏの能力を示している一方、Ｌ−ドーパ／ベンセラジド処置ラットのみが、対側方向に向かわせる能力があることを示している。この観察は、（１）刺激を受けている間は、ｃｏｍｂｏ下にあるラットは、１つの方向からもう一方の方向に転じることができる能力があること、及び（２）ｃｏｍｂｏ処置ラットが刺激を受けている場合、それらは主要な対側性回転活動がないことをはっきりと実証した。

【0116】

図５は、Ｌ−ドーパ／ベンセラジドにより処置したラットと比べて、ｃｏｍｂｏ処置ラットでは、軌道と体位の両方が改善されていることを実証している。確かに、２つの期間の記録中に回転運動半径によって測定される軌道は、ｃｏｍｂｏ処置ラットの方が、他の群で観察されたものよりも大きい。この観察は、刺激を受けている間、ｃｏｍｂｏにより処置されたラットの方が、対側性回転をしている間、非常に窮屈な運動を行っているＬ−ドーパ／ベンセラジド処置ラットよりも、試験アリーナ中で大きな軌道を有することを定量的に反映している。ｃｏｍｂｏ下のラットの体位は、それらのラットが処置により刺激を受けている場合でさえも、４本の脚で立つことができ、且つ屈曲位を有さないことを示している。

【0117】

これらの予期しない観察及び説明は、組合せ処置により、６−ＯＨＤＡ片側損傷ラットにおけるドーパミン作動性療法に通常伴う異常な運動合併症なく、等価な刺激レベルを実現することが可能であることを実証している。

【0118】

（例３）
慢性処置後に任意の異常運動の発生がない運動症状に対する「トザデナント＋ラジプロジル」の組合せ投与の有効性
ｃｏｍｂｏによる１０日間の慢性処置は、Ｌ−ドーパで観察されるような異常運動合併症の発症ももたらさない。これらのラットは、一部の馴化過程が試験アリーナにまで現れたとしても、活動的なままである。この正常現象があるにもかかわらず、活動レベル及び運動の質に対するｃｏｍｂｏの有意な効果が依然として観察される。

【0119】

（例４）
Ｌ−ドーパによる以前の慢性処置により、以前に完全なジスキニアとなった片側パーキンソン病ラットに関する、運動症状に対するｃｏｍｂｏの有効性
「トザデナント＋ラジプロジル」の組合せ投与は、片側パーキンソン病ラットにおいて、向上した運動活動性を回復する能力を有する。しかし、この特定の共投与により、慢性Ｌ−ドーパ処置により完全なジスキニアにされており、Ｌ−ドーパによりプライミングされた片側パーキンソン病ラットにおいて、異常不随意運動なしに運動活動性が回復するので、この共投与は全く予期しない効果をやはり有している。

【0120】

１０回の取得セッションの間にＬ−ドーパ１４ｍｇ／ｋｇ及びベンセラジド３．５ｍｇ／ｋｇ下で処置された片側パーキンソン病ラットは、対側性回転と重症な異常不随意運動（ＡＩＭ）（すなわち、行動感作）の両方のレベル向上を発生させる。上記のラットは、その慢性Ｌ−ドーパ／ベンゼラジド（ｂｅｎｚｅｒａｚｉｄｅ）処置に続いて、オープンフィールドで試験した場合、この慢性処置の終わりでは、対側性回転及びＡＩＭのレベルが非常に高いことを示している。

【0121】

これらの高度のジスキニア片側パーキンソン病ラットからＬ−ドーパを切り離し、数日後（例えば、３日後）にｃｏｍｂｏにより処置した場合、発明者らは、いかなる異常不随意運動又はいかなる対側性回転レベルの向上もなしに、適切な運動活動性が完全に回復することを観察している。対側性回転及びＡＩＭ結果のレベルに関する交差感作がこのように無いことは、全く予期されないものであった。

【0122】

表３は、７つの行動について、同じラットではあるが、これらのラットを何日か前に活性用量のＬ−ドーパ／ベンセラジドにより処置した場合に示されるそれぞれの行動と比較した、ビヒクル、ラジプロジル３ｍｇ／ｋｇ、トザデナント３０ｍｇ／ｋｇ、又はｃｏｍｂｏにより処置された場合にラットにより表される変化率を示している。

【0123】

表３は、ｃｏｍｂｏ処置ラットについて、
（１）Ｌ−ドーパ／ベンセラジドにより処置されたものに匹敵する移動距離レベルである一方、化合物単独により処置されたラットは活動レベルの低下を示したこと、
（２）Ｌ−ドーパ／ベンセラジドにより処置されたラットと比べて、Ｌ−ドーパ誘発性の対側性回転が減少し、且つ同側性回転が増加すること、
（３）Ｌ−ドーパ／ベンセラジドにより処置されたラットと比べて、適切な体位で過ごした時間が増加し、且つ軌道が改善されていること、
（４）Ｌ−ドーパ／ベンセラジドにより処置されたラットと比べて、異常不随意運動（ＡＩＭ）を示して過ごしている時間がないこと
を示している。

【0124】

図６及び図７は、１０回の取得セッションの間に、Ｌ−ドーパ／ベンセラジドにより処置されたラットは、対側性ターンのレベルが大きく向上すること（これは、Ｌ−ドーパ／ベンセラジド下で予期される）を示し、且つ同側性ターンは示さない一方、ｃｏｍｂｏ下では、これらのラットが、より低いレベルの対側性ターン及びある程度のレベルの同側性ターンしか示さないことを示している。この後者の観察は、ｃｏｍｂｏ下で刺激されたラットが、１つの方向からもう一方の方向に転じることができることを実証している。対側性回転が大きく増加することに平行して、Ｌ−ドーパ下のラットは重症なＡＩＭで過ごした時間が大きく増加する一方、一旦、ｃｏｍｂｏ下にあると、それらのラットにより過ごされた時間の大部分は、「ＡＩＭがない」姿勢にある（図８）。Ｌ−ドーパ／ベンセラジド処置は、ラットを非常に刺激する。それらのラットにおいて測定された高いレベルの移動距離により反映される観察。しかし、ｃｏｍｂｏ下のラットは、Ｌ−ドーパ／ベンセラジド下で測定されたものと等しいレベルの移動距離を示している（図９）。これにより、ｃｏｍｂｏ効果が、それ自体が対側性回転を何ら引き起こさない場合でさえも、動物を刺激する能力を依然として有していることが示された。非常に興味深いことに、ｃｏｍｂｏにより刺激されたラットは、Ｌ−ドーパ／ベンセラジドにより処置された場合と比べて、「適切な体位」でより多くの時間を過ごしている（図１０）。Ｌ−ドーパ／ベンセラジドにより処置された場合に比べて、ｃｏｍｂｏ処置ラットの運動の回転運動半径は増加しているので、これらのラットはまた、Ｌ−ドーパ／ベンセラジド下での処置と比べて、かなり優れた空間占有及び軌道も示している（図１１）。

【0125】

【表3】

【0126】

Ｂ．片側パーキンソン病ラットにおける、Ａ_２ＡアンタゴニストとＮＲ２Ｂアンタゴニストとを一緒にした追加処置
（例５）
準活性用量又は部分活性用量のＬ−ドーパに対して急性追加処置を施した際の行動観察
ＮＲ２ＢアンタゴニストとＡ_２Ａアンタゴニストとを組合せ投与すると、個別に試験した化合物に比べて、準活性用量又は部分活性用量のＬ−ドーパの有効性が増強される。

【0127】

ＣＯ−１０１２４４＋ＳＣＨ−５８２６１＋準活性用量のＬ−ドーパ
活性以下の用量のＬ−ドーパ（１５ｍｇ／ｋｇ）に対する追加処置として与えられる、１ｍｇ／ｋｇのＳＣＨ−５８２６１への１ｍｇ／ｋｇのＣｏ−１０１２４４の共投与により、ビヒクル処置ラット、及び化合物を単独で処置したラットと比べて（すべての群は、Ｌ−ドーパ１５ｍｇ／ｋｇにより処置されている）、対側性回転レベルが有意に向上している。

【0128】

図１２：二元配置ＡＮＯＶＡは、有意な処置効果（Ｆ３，２８）＝５．６２、ｐ＜０．０１、有意な時間効果（１１，３０８）＝２２．２１、ｐ＜０．００１、及び有意な処置×時間相互作用（Ｆ３３，３０８）＝４．７１、ｐ＜０．００１を示している。^＊、ｐ＜０．０５：ＳＣＨ１／ＣＯ１は、群ＶＥＨ／ＶＥＨ、ＳＣＨ１／ＶＥＨ及びＶＥＨ／ＣＯ１とは有意に異なっている（ＬＳＤ事後検定）。

【0129】

トザデナント＋ラジプロジル＋部分活性用量のＬ−ドーパ
部分活性用量のＬ−ドーパ（２５ｍｇ／ｋｇ）に対する追加処置として与えられる、３０ｍｇ／ｋｇのトザデナントへの３ｍｇ／ｋｇのラジプロジルの共投与により、ビヒクル処置ラット、及び化合物を単独で処置したラット（Ｌ−ドーパ２５ｍｇ／ｋｇに加えて）と比べて、対側性回転レベルが有意に向上している。

【0130】

図１３：有意な処置効果（Ｆ３，２８）＝７０．６０、ｐ＜０．０１、有意な時間効果（１７，７４６）＝２００．８９、ｐ＜０．００１、及び有意な処置×時間相互作用（Ｆ１７，４７６）＝２．８３、ｐ＜０．００１、＃、ｐ＜０．０５：群ＲＡＤ３／ＴＯＺ３０は、群ＶＥＨ／ＶＥＨ、ＶＥＨ／ＴＯＺ３０、及びＲＡＤ３／ＶＥＨとは有意に異なっている（ＬＳＤ事後検定）。

【0131】

（例６）
活性用量のＬ−ドーパ及びベンセラジドに対する慢性追加処置において与えられる場合の行動観察
予期しない観察として、これらのデータにより、ｃｏｍｂｏが、一部の運動欠陥の低下を伴って、Ｌ−ドーパのオンタイム効果を向上させる可能性を有することが示された。

【0132】

活性用量のＬ−ドーパ／ベンセラジドに対する付加療法において与えられる「トザデナント＋ラジプロジル」の慢性組合せ投与により、ビヒクル処置ラット及び単一化合物により処置されたラットと比べて、対側性回転に対するＬ−ドーパの効果がかなり向上する。その増加効果に加えて、より広いオープンフィールドにおける試験により、重症なＡＩＭレベルは、トザデナントにより処置されたラットと比べて、ｃｏｍｂｏ及びラジプロジルにより処置されたラットの場合に低下することが示された。

【0133】

トザデナント＋ラジプロジル＋活性用量のＬ−ドーパ／ベンセラジド
図１４：トザデナント＋ラジプロジルと活性用量のＬ−ドーパ／ベンセラジドの組合せ投与に関する実験計画

【0134】

【表4】

【0135】

ロトメータ中で測定した場合、ｖｅｈ、トザデナント、ラジプロジル、又は両化合物の組合せに対する共投与において与えられた、Ｌ−ドーパ（１４ｍｇ／ｋｇ）／ベンセラジド（３．５ｍｇ／ｋｇ）の１０回の取得セッション（１回／日）により、Ｌ−ドーパ誘発性の対側性回転レベルが徐々に向上している（図１５）。その効果は、ｃｏｍｂｏ処置ラットで一層際立っている。図１６は、ｖｅｈ、ラジプロジル、トザデナント、又はｃｏｍｂｏ、並びにＬ−ドーパ／ベンセラジドにより処置したが、より広いオープンフィールドにて試験した場合の、ラットの行動プロファイルを示している。ビデオ記録に基づく特有の自動行動解析により、Ｌ−ドーパ／ベンセラジドに加えてｃｏｍｂｏにより処置したラットは、刺激レベル（すなわち、距離及び対側性回転のレベルの顕著な増加により測定される）が一層高い。しかし、ｃｏｍｂｏ及びＬＤ／ＢＺにより処置されたそれらのラットはまた、トザデナント処置群よりも重症なＡＩＭを発現して過ごした時間が少ないことも示した。

【0136】

図１５：二元配置混合ＡＮＯＶＡは、有意な処置効果（Ｆ３，２８）＝１５．０６；ｐ＜０．００１、取得セッションの有意な効果Ｆ（９，２５２）＝２９．２３、ｐ＜０．００１を示すが、処置×時間相互作用（ｐ＝０．１８）は示さない。さらなる事後検定により、ｃｏｍｂｏ群は、ｖｅｈ、ｔｏｚ、及びｒａｄ処置群と比べて、活動レベルが顕著に高いことが示された（Ｔｕｋｅｙ、ｐ＜０．０５）。

【0137】

要約すると、以下の驚くほどの共作用が特定された。
１）６−ＯＨＤＡ片側損傷ラットにおいて、様々なＡ_２Ａ及びＮＲ２Ｂアンタゴニストを組み合わせることにより作製される異なる６種の組合せ（ｃｏｍｂｏ）により、ビヒクル処置ラット、及びＡ_２Ａアンタゴニスト又はＮＲ２Ｂアンタゴニストで単独処置されたラットと比べて、活動レベル（移動距離及び立ち上がり）が顕著に向上することが示される。
２）１種の具体的なＡ_２Ａ／ＮＲ２Ｂアンタゴニスト組合せ（トザデナント＋ラジプロジル）について実施した完全な行動解析により、活性用量のＬ−ドーパ／ベンセラジドで観察されたものに匹敵する活動レベルの顕著な向上の他に、ｃｏｍｂｏ下でのラットの行動は、Ｌ−ドーパ処置下で観察されるものと比べて、顕著に改善されている（ステレオタイプで窮屈な対側性回転もジストニア体位もない）ことが示される。
３）Ａ_２ＡアンタゴニストとＮＲ２Ｂアンタゴニストとの組合せによる慢性処置により、異常な運動合併症は何ら発生しない。
４）Ｌ−ドーパとｃｏｍｂｏとの間の交差感作効果はない。Ｌ−ドーパ処置によりジスキニアにされたラットであって、Ｌ−ドーパにより慢性的に処置されたラットにおけるＡ_２Ａ／ＮＲ２Ｂ組合せによる急性処置により、いかなる異常不随意運動もなしに、高い質の運動活動性を回復する能力があることが示される。
５）Ａ_２ＡアンタゴニストとＮＲ２Ｂアンタゴニストとの組合せによる急性処置が準活性用量又は部分活性用量のＬ−ドーパへの共投与で与えられた場合、ビヒクル処置ラット、又はＡ_２Ａアンタゴニスト若しくはＮＲ２Ｂアンタゴニスト単独で処置された及びそれに上記のアンタゴニスト＋ｃｏｍｂｏ群以外の投与を受けたものと等用量のＬ−ドーパを加えて処置されたラットと比べて、上記の急性処置は、Ｌ−ドーパ誘発性の対側性回転を有意に増加させることを示している。
６）活性用量のＬ−ドーパ／ベンセラジド（Ｌ−ドーパ誘発性の異常運動ＡＩＭを発症する原因となる用量）に共投与で与えられたＡ_２ＡアンタゴニストとＮＲ２Ｂアンタゴニストとの慢性処置は、Ａ_２Ａアンタゴニストにより処置されたラットと比べて、対側性回転レベルに対するＬ−ドーパ効果の相乗作用、及び同時に、重症なＡＩＭの低下をも示す。

【0138】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

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【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

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