特許 6043894 アミノピリジルオキシピラゾール化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6043894

(24)【登録日】2016年11月18日

(45)【発行日】2016年12月14日

(54)【発明の名称】アミノピリジルオキシピラゾール化合物

(51)【国際特許分類】

   C07D 401/12 20060101AFI20161206BHJP

   C07D 401/14 20060101ALI20161206BHJP

   A61K 31/444 20060101ALI20161206BHJP

   A61K 31/501 20060101ALI20161206BHJP

   A61K 31/506 20060101ALI20161206BHJP

   A61K 31/497 20060101ALI20161206BHJP

   A61K 31/4439 20060101ALI20161206BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20161206BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20161206BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20161206BHJP

   C07D 405/14 20060101ALI20161206BHJP

【ＦＩ】

   C07D401/12

   C07D401/14CSP

   A61K31/444

   A61K31/501

   A61K31/506

   A61K31/497

   A61K31/4439

   A61P35/00

   A61P1/16

   A61P13/12

   C07D405/14

【請求項の数】12

【全頁数】51

(21)【出願番号】特願2016-526891(P2016-526891)

(86)(22)【出願日】2015年9月30日

(65)【公表番号】特表2016-535745(P2016-535745A)

(43)【公表日】2016年11月17日

(86)【国際出願番号】US2015053098

(87)【国際公開番号】WO2016057278

(87)【国際公開日】20160414

【審査請求日】2016年4月27日

(31)【優先権主張番号】62/060,724

(32)【優先日】2014年10月7日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】594197872

【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100147131

【弁理士】

【氏名又は名称】今里 崇之

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】ベイト，ダグラス ダブリュ．

(72)【発明者】

【氏名】コーツ，デイビッド エー．

(72)【発明者】

【氏名】ジョセフ，サジャン

(72)【発明者】

【氏名】マクミレン，ウィリアム ティー．

(72)【発明者】

【氏名】パーササラシー，サラバナン

(72)【発明者】

【氏名】ペイ，フアシン

(72)【発明者】

【氏名】ソーヤー，ジェイソン スコット

(72)【発明者】

【氏名】ウルフエンジェル，クレイグ ディー．

(72)【発明者】

【氏名】ツァオ，ゲイイン

【審査官】 早川 裕之

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／０２２１７１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００４／１１１０３６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／０８６３９７（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ ４０１／１２

Ａ６１Ｋ ３１／４４３９

Ａ６１Ｋ ３１／４４４

Ａ６１Ｋ ３１／４９７

Ａ６１Ｋ ３１／５０１

Ａ６１Ｋ ３１／５０６

Ａ６１Ｐ １／１６

Ａ６１Ｐ １３／１２

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ｃ０７Ｄ ４０１／１４

Ｃ０７Ｄ ４０５／１４

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式：

【化1】

（式中、
Ｒ^１が、水素、イソプロピル、ジフルオロメチル、ジフルオロエチル、もしくはシクロプロピルであり；
Ｒ^２が、エチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ピリジン−２−イル、テトラヒドロピラン−４−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、シクロプロピル、もしくはシクロブチルであり；
Ｒ^３が、カルバモイルフェニル、ピリジン−２−イル、（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジニル、１−メチル−２−オキソ−１Ｈ−ピリジン−４−イル、１−メチルピラゾリル、ピラジン−２−イル、２−メトキシピリミジン−４−イル、１−メチル−２−オキソ−１Ｈ−ピリミジン−４−イル、ピリダジン−３−イル、６−クロロピリダジン−３−イル、６−メチルピリダジン−３−イル、もしくは６−メトキシピリダジン−３−イルである）
の化合物または医薬的に許容可能なその塩。

【請求項2】

２−｛４−［（４−｛［１−シクロプロピル−３−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ｝ピリジン−２−イル）アミノ］ピリジン−２−イル｝プロパン−２−オールである請求項１に記載の化合物または医薬的に許容可能なその塩。

【請求項3】

２−｛４−［（４−｛［１−シクロプロピル−３−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ｝ピリジン−２−イル）アミノ］ピリジン−２−イル｝プロパン−２−オール４−メチルベンゼンスルホネートである請求項１または２に記載の化合物または塩。

【請求項4】

結晶性２−｛４−［（４−｛［１−シクロプロピル−３−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ｝ピリジン−２−イル）アミノ］ピリジン−２−イル｝プロパン−２−オール４−メチルベンゼンスルホネートである請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または塩。

【請求項5】

１９．７°、１８．４°、および２２．０°（２θ±０．２°）からなる群より選択される一または複数のピークを組み合わせる、少なくとも一つのピークが１７．８°を含む結晶性２−｛４−［（４−｛［１−シクロプロピル−３−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ｝ピリジン−２−イル）アミノ］ピリジン−２−イル｝プロパン−２−オール４−メチルベンゼンスルホネートである請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物または塩。

【請求項6】

請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物または塩および、一若しくは複数の医薬的に許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤を含む、医薬組成物。

【請求項7】

治療を必要とする患者のがんを治療するための、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

前記塩が４−メチルベンゼンスルホネートである、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

前記がんが、大腸がん、メラノーマ、肝細胞がん、腎臓がん、膠芽腫、膵臓がん、骨髄異形成症候群、肺がん、および胃がんからなる群より選択される、請求項７または８に記載の組成物。

【請求項10】

治療を必要とする患者の線維症を治療するための、請求項６に記載の組成物。

【請求項11】

前記塩が４−メチルベンゼンスルホネートである、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記線維症が、肝線維症および慢性腎疾患からなる群より選択される、請求項１０または１１に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、トランスフォーミング増殖因子β受容体１（ＴＧＦβＲ１）の活性を阻害する新規アミノピリジルオキシピラゾール化合物、その化合物を含む医薬組成物、ならびにその化合物を使用して、がん（好ましくは、大腸がん、メラノーマ、肝細胞がん（ＨＣＣ）、腎臓がん、膠芽腫（ＧＢＭ）、膵臓がん、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、肺がん、および胃がん）および／または線維症（好ましくは、肝線維症および慢性腎疾患）を治療する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−ベータまたはＴＧＦβ）は、多機能性サイトカインであって、ヘテロ複合体のＴＧＦβＩ型およびＩＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体に結合し、そのＴＧＦβ受容体複合体を活性化し、そして、その複合体はＳＭＡＤ２とＳＭＡＤ３をリン酸化および活性化し、その後、それらＳＭＡＤはＳＭＡＤ４と会合し核内に移行して、様々な標的遺伝子の発現を制御する。ＴＧＦβ受容体シグナル伝達経路の鍵となる因子には、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＳＭＡＤｓ、ＳｎｏＮ、ＳＡＲＡ、ＳＫＩ、ＤＡＢ、ＴＲＡＰ、ＴＡＫ１、ＳＭＩＦ、Ｅ２Ｆ４、Ｅ２Ｆ５、ＲＢＬ１、ＲＢＬ２、ＲＢ１、ＴＦＤＰ１、ＴＦＤＰ２、ＳＭＵＲＦ１、ＳＭＵＲＦ２、Ｐ３００、ＣＢＰ、およびＪＵＮが含まれる。ＳＭＡＤが媒介するＴＧＦβ受容体経路は、各種細胞プロセスおよび生理学的プロセス（例えば、増殖、分化、成長、移動、ミエリン形成、細胞周期停止、アポトーシス、および発生）を制御する。

【0003】

ＴＧＦβＲ１の小分子阻害剤は、がんおよび／または線維症の治療に関する当該技術分野では既に知られている。例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、および特許文献４を参照されたい。しかしながら、多くの型のがん又は線維症のための根治的治療として知られたものはない。がん（好ましくは、大腸がん、メラノーマ、肝細胞がん（ＨＣＣ）、腎臓がん、膠芽腫（ＧＢＭ）、膵臓がん、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、肺がん、および胃がん）および／または線維症（好ましくは、肝線維症および慢性腎疾患）の治療用の、ＴＧＦβＲ１の小分子阻害剤（特に、ＴＧＦβＲ１により選択的な化合物）をさらに有することが望ましいと考えられる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】国際公開第２０１２／００２６８０号

【特許文献2】国際公開第２００９／０２２１７１号

【特許文献3】国際公開第２００４／０４８３８２号

【特許文献4】国際公開第２００２／０９４８３３号

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明は、式：

【化1】

（式中、
Ｒ^１が、水素、イソプロピル、ジフルオロメチル、ジフルオロエチル、もしくはシクロプロピルであり；
Ｒ^２が、エチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ピリジン−２−イル、テトラヒドロピラン−４−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、シクロプロピル、もしくはシクロブチルであり；
Ｒ^３が、カルバモイルフェニル、ピリジン−２−イル、（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジニル、１−メチル−２−オキソ−１Ｈ−ピリジン−４−イル、１−メチルピラゾリル、ピラジン−２−イル、２−メトキシピリミジン−４−イル、１−メチル−２−オキソ−１Ｈ−ピリミジン−４−イル、ピリダジン−３−イル、６−クロロピリダジン−３−イル、６−メチルピリダジン−３−イル、もしくは６−メトキシピリダジン−３−イルである）
の化合物または医薬的に許容可能なその塩を提供する。

【0006】

本発明はまた、２−｛４−［（４−｛［１−シクロプロピル−３−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ｝ピリジン−２−イル）アミノ］ピリジン−２−イル｝プロパン−２−オールまたは医薬的に許容可能なその塩を提供する。

【0007】

本発明はまた、２−｛４−［（４−｛［１−シクロプロピル−３−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ｝ピリジン−２−イル）アミノ］ピリジン−２−イル｝プロパン−２−オール４−メチルベンゼンスルホネートを提供する。

【0008】

本発明はまた、結晶性２−｛４−［（４−｛［１−シクロプロピル−３−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ｝ピリジン−２−イル）アミノ］ピリジン−２−イル｝プロパン−２−オール４−メチルベンゼンスルホネートを提供する。本発明はさらに、結晶性２−｛４−［（４−｛［１−シクロプロピル−３−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ｝ピリジン−２−イル）アミノ］ピリジン−２−イル｝プロパン−２−オール４−メチルベンゼンスルホネートであって、１９．７°、１８．４°、および２２．０°（２θ±０．２°）からなる群より選択される一又は複数のピークと共に１７．８°のピークを含む粉末Ｘ線回折パターン（Ｃｕ線源、λ−１．５４０６０Å）を特徴とするものを提供する。

【0009】

本発明はまた、治療を必要とする患者のがん、好ましくは、大腸がん、メラノーマ、肝細胞がん（ＨＣＣ）、腎臓がん、膠芽腫（ＧＢＭ）、膵臓がん、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、肺がん、および胃がんを治療する方法であって、前記患者に有効量の本発明の化合物または塩を投与する工程を含む方法を提供する。

【0010】

本発明はまた、治療を必要とする患者の線維症、好ましくは、肝線維症および慢性腎疾患を治療する方法であって、前記患者に有効量の本発明の化合物または塩を投与する工程を含む方法を提供する。

【0011】

本発明はまた、本発明の化合物または塩および一若しくは複数の医薬的に許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤を含む、医薬組成物を提供する。

【0012】

本発明はまた、治療に使用するための本発明の化合物または塩を提供する。さらに、本発明は、がん（好ましくは、大腸がん、メラノーマ、肝細胞がん（ＨＣＣ）、腎臓がん、膠芽腫（ＧＢＭ）、膵臓がん、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、肺がん、および胃がん）および／または線維症（好ましくは、肝線維症および慢性腎疾患）の治療に使用するための、本発明の化合物または塩を提供する。さらにまた、本発明は、がん（好ましくは、大腸がん、メラノーマ、肝細胞がん（ＨＣＣ）、腎臓がん、膠芽腫（ＧＢＭ）、膵臓がん、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、肺がん、および胃がん）および／または線維症（好ましくは、肝線維症および慢性腎疾患）を治療するための医薬の製造における本発明の化合物または塩の使用を提供する。

【0013】

以下の段落は、本発明の好ましい種類を説明する。
ａ）Ｒ^１がジフルオロメチル、ジフルオロエチル、またはシクロプロピル；
ｂ）Ｒ^２がピリジン−２−イル、テトラヒドロピラン−４−イル、またはシクロプロピル；
ｃ）Ｒ^３がカルバモイルフェニルまたは（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジニル；
ｄ）Ｒ^１がシクロプロピル、およびＲ^２がテトラヒドロピラン−４−イル；
ｅ）Ｒ^１がシクロプロピル、およびＲ^２がシクロプロピル；
ｆ）Ｒ^１がジフルオロエチル、およびＲ^２がテトラヒドロピラン−４−イル；
ｇ）Ｒ^１がジフルオロメチル、およびＲ^２がピリド−２−イル；
ｈ）Ｒ^１がシクロプロピル、Ｒ^２がテトラヒドロピラン−４−イル、およびＲ^３が（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジニル；
ｉ）Ｒ^１がシクロプロピル、Ｒ^２がシクロプロピル、およびＲ^３が（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジニル；
ｊ）Ｒ^１がジフルオロエチル、Ｒ^２がテトラヒドロピラン−４−イル、およびＲ^３が（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジニル；ならびに
ｋ）Ｒ^１がジフルオロメチル、Ｒ^２がピリジン−２−イル、およびＲ^３がカルバモイルフェニル。

【発明を実施するための形態】

【0014】

当該技術分野の読者により理解されるのは、遊離塩基形態の本発明の化合物が塩を形成可能であり、そのような塩も本発明の一部となると考えらえることである。本発明の遊離塩基の化合物はアミンであり、従って、任意の各種無機および有機酸と反応して、医薬的に許容可能な酸付加塩を形成する。そのような医薬的に許容される酸付加塩とそれら酸付加塩を調製するための一般的方法論は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ（医薬塩のハンドブック）：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ（特性、選択、及び使用）、（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００８年）；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ（医薬塩）」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖｏｌ．６６、Ｎｏ．１、１９７７年１月を参照されたい。当業者により理解されるのは、塩のストイキオメトリが容易に決定可能であることである。例えば、Ｄ．Ｒｉｓｌｅｙら、Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｕｎｔｅｒｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｍｅｔｈｏｄ（親水性相互作用クロマトグラフィー法を使用する、陽および陰対イオンの同時定量）、ＬＣＧＣ ＮＯＲＴＨ ＡＭＥＲＩＣＡ、Ｖｏｌ２４、Ｎｏ．８、２００６年８月、７７６〜７８５ページを参照されたい。

【0015】

本発明の化合物のあるものは結晶性である。結晶学技術分野において周知なのは、任意の所定の結晶形に関して、回折ピークの相対強度が、複数因子（例えば、結晶形態および晶癖）から生じる優先配向に起因して異なる可能性があることである。優先配向の効果が存在する場所では、ピーク強度が変化するが、多形体の特徴的ピーク位置は変化しない。例えば、Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（米国薬局方）＃２３，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ＃１８、１８４３〜１８４４ページ、１９９５年を参照されたい。さらに、任意の所定の結晶形に関して、ピーク角度位置が若干変化する場合があるということも結晶学技術分野では周知である。例えば、サンプルを解析する温度若しくは湿度の変動、サンプル変位、または内部標準の存在若しくは非存在に起因して、ピーク位置はシフト可能である。本件では、２θでの±０．２のピーク位置変動は、記載される結晶形の明白な同定を妨げることなく、これらの潜在的変動を考慮にいれることにする。結晶形の確認は、区別可能な（（２θ）°単位での）複数ピーク、典型的にはより顕著な複数ピークの任意のユニークな組み合わせに基づいて実行する。外気温および相対湿度で得られる結晶形回折パターンを、８．８５３および２６．７７４°（２θ）でのＮＩＳＴ６７５標準ピークに基づいて調整する。

【0016】

本発明の化合物は、当該技術分野で周知かつ認められている方法により、以下の合成スキームに従って調製可能である。これらスキームの工程のための適切な反応条件は当該技術分野で周知であり、溶媒や共に用いる試薬の適切な代替品も当該技術分野の技術の範囲内である。同様に、合成中間体を、必要または所望されるならば、各種周知技術により単離および／または精製可能であること、そして、ほとんど又は全く精製することなしに次の合成工程に各種中間体を直接使用することをしばしば可能にすることが当業者により理解される。さらにまた、当業者が理解するのは、いくつかの状況では、部分（ｍｏｉｅｔｙ）が導入される順序が重要でないことである。本発明の化合物を製造するのに必要な工程の特定の順序は、合成途中の特定化合物、出発化合物、および置換部分の相対的特性に依存し、それらは当該技術分野の化学者により十分理解される。他に記載しない限りは、全ての置換基は上に定義されたものであり、全ての試薬は当該技術分野で周知かつ理解されるものである。

【0017】

いくつかの中間体または本発明の化合物は、一又は複数のキラル中心を有する場合がある。本発明は、全ての個々のエナンチオマーまたはジアステレオマーと共に、前記化合物のエナンチオマーとジアステレオマーの混合物（ラセミ体を含む）を考慮に入れる。少なくとも一つのキラル中心を含む本発明の化合物は、単一エナンチオマーまたはジアステレオマーとして存在するのが好ましい。単一エナンチオマーまたはジアステレオマーは、キラル試薬とともに調製開始するか、または立体選択的もしくは立体特異的合成技術により調製可能である。また、単一エナンチオマーまたはジアステレオマーを、標準的キラルクロマトグラフィー技術または結晶化技術により、混合物から単離してもよい。当業者が理解するのは、いくつかの状況では、エナンチオマーまたはジアステレオマーの溶出順序が、互いに異なるクロマトグラフィーカラムおよび移動相に起因して異なる場合があることである。

【0018】

化合物名中の「異性体１」の記載は、本発明の化合物または対応する中間体が、エナンチオマーのペアの混合物をキラルクロマトグラフィーにより分離する場合、二つの溶出されるエナンチオマーの内最初のものを表す。化合物名中の「異性体２」の記載は、本発明の化合物または対応する中間体が、エナンチオマーのペアの前記混合物をキラルクロマトグラフィーにより分離する場合、二つの溶出されるエナンチオマーの内二番目のものを表す。

【0019】

本発明の化合物は、以下のスキーム（Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３は上で定義されたもの）中に解説されるように合成可能である。

【化2】

【0020】

スキーム１：式Ｉの化合物の合成
スキーム１は、式Ｉの化合物の合成全体を説明する。化合物１を、適切な溶媒（例、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはアセトン）中で、適切な塩基（例、炭酸セシウムまたは炭酸カリウム）を用いて、室温または温度を上昇させて、２−クロロピリジン−４−オールと反応させて、化合物２を得る。化合物２を、１，１−ジメトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−メタンアミンと温度を上昇させて反応させて、化合物３が形成する。化合物３を精製するか又はさらなる精製なしに使用して、酢酸中でヒドラジンと反応させて化合物４を得てもよい。化合物４を、Ｃｈａｎ−Ｌａｍカップリング条件下で、適切なアルキル化試薬（例、アルキルトリフルオロホウ酸カリウムまたはアルキルボロン酸（ａｌｋｙｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ））と反応させて、化合物５が形成する。より具体的には、まず、適切な溶媒（例、１，２−ジクロロエタン）中の２，２’−ビピリジンおよび酢酸銅（ＩＩ）の懸濁液を、より高い温度に加熱し、窒素でパージする。その後、反応混合物をろ過する。そして、そのろ液を、適切な溶媒（例、１，２−ジクロロエタン）中の、化合物４、適切なボロン酸エステル（例、アルキルトリフルオロホウ酸カリウムまたはアルキルボロン酸）、および適切な塩基（例、炭酸ナトリウム）の混合物へと加える。反応混合物をより高い温度へと過熱し、化合物５を得る。化合物４はまた、適当な溶媒（例、ＤＭＦまたはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ））中で、適切な塩基（例、水素化ナトリウム）と適切なアルキルハロゲン化物（例、アルキルヨウ化物、アルキル臭化物、またはアルキル塩化物）と反応させて、化合物５を得てもよい。化合物５は、周知のＢｕｃｈｗａｌｄカップリング条件下で適切なアミンと反応させて、式Ｉの化合物を得る。より具体的には、化合物５を、適当な溶媒（例、１，４−ジオキサン）中で、適切な塩基（例、炭酸セシウム）、適切なリガンド試薬（例、４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン）、および適切な触媒（例、酢酸パラジウム（ＩＩ））の存在下、より高い温度で、適切なアミンと反応させて、式Ｉの化合物を得る。

【化3】

【0021】

スキーム２：Ｒ^１がＨである式Ｉの化合物の合成
スキーム２は、Ｒ^１がＨである式Ｉの化合物の合成全体を説明する。スキーム１の工程４に説明されるように、アルキル化試薬が２−（トリメチルシリル）エトキシメチルクロリドである場合、化合物６を、工程４のアルキル化および工程５のＢｕｃｈｗａｌｄカップリングにより得ることができる。化合物６を、トリフルオロ酢酸中で、トリエチルシランと反応させて、Ｒ^１がＨである式Ｉの化合物を得ることができる。Ｒ^１がＨである場合、式Ｉの化合物は、水素がピラゾリル環上の二つの窒素間に移動可能な互変異性体のペアとして存在する場合があることが当業者に知られている。

【化4】

【0022】

スキーム３：Ｒ^３が（カルバモイル）フェニルである式Ｉの化合物の合成
スキーム３は、Ｒ^３が（カルバモイル）フェニル基である式Ｉの化合物の合成全体を説明する。化合物７は、Ｒ^３が適切に置換されたベンゾニトリルであるスキーム１の工程５に説明される方法により製造可能である。化合物７を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で、過酸化水素および適切な塩基（例、炭酸カリウム）と反応させて、Ｒ^３が（カルバモイル）フェニル基である式Ｉの化合物を得る。

【0023】

本明細書においては、以下の用語は示される意味を有する。「ＡＣＮ」は、アセトニトリルを指す。「ＢＳＡ」は、ウシ血清アルブミンを指す。「ＤＣＭ」は、ジクロロメタンを指す。「ＤＭＦ」は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを指す。「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを指す。「ＤＴＴ」は、ジチオトレイトールを指す。「ＥＤＴＡ」は、エチレンジアミン四酢酸を指す。「ＥＧＴＡ」は、エチレングリコール四酢酸を指す。「ＥＬＩＳＡ」は、酵素結合免疫吸着測定法を指す。「ＥｔＯＡｃ」は、酢酸エチルを指す。「ＥｔＯＨ」は、エタノールを指す。「ＦＢＳ」は、ウシ胎児血清を指す。「ＨＥＣ」は、ヒドロキシエチルセルロースを指す。「ＨＰＬＣ」は、高速液体クロマトグラフィーを指す。「ＩＶＴＩ」は、イン・ビボ・ターゲット阻害を指す。「ＭＳ」は、質量分析を指す。「ＭｅＯＨ」は、メタノールを指す。「ＮＭＲ」は、核磁気共鳴を指す。「ＴＨＦ」は、テトラヒドロフランを指す。「ＴＢＳ」は、トリス緩衝液を指す。「ＴＥＤ」は、有効用量閾値を指す。「ＵＶＷ」は、紫外線波長を指す。および、「ＸＲＤ」は、Ｘ線回折を指す。

【0024】

異なるように示されない限り、本明細書中で説明される化合物を、ＡＣＤＬＡＢＳまたはＡｃｃｅｌｒｙｓ Ｄｒａｗ４．１のいずれかを使用して命名および番号付けする。

【実施例】

【0025】

調製例１
２−（４−ブロモ−２−ピリジル）プロパン−２−オール

【化5】

【0026】

添加漏斗付き３Ｌ三口丸底フラスコ、還流冷却器、窒素導入口、および温度プローブを設置する。臭化メチルマグネシウム（２−メチルテトラヒドロフラン中の３．２Ｍ、２３９．０７ｍＬ、７６５．０１ｍｍｏｌ）を篭めて、氷浴中で冷却する。添加漏斗に、ＴＨＦ（８００．０ｍＬ）中のエチル−４−ブロモピリジン−２−カルボキシレート（８０．０ｇ、３４７．７３ｍｍｏｌ）溶液を加える。内部温度を２５℃以下に保ちながら、その溶液を臭化メチルマグネシウム溶液に滴下する。冷却浴を取り外し、２５℃で３０分間撹拌する。反応混合物を５℃に冷却し、内部温度を３０℃以下に保ちながら、塩酸水溶液（１Ｍ）を慎重に滴下して反応停止する。さらに、塩酸水溶液（１Ｍ）を、混合物のｐＨが約７に到達するまで加える。冷却浴を取り外し、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ、２００ｍＬ）で希釈する。有機層を分離して、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ＣＥＬＩＴＥ（登録商標）を通してろ過し、そしてＥｔＯＡｃでゆすぐ。ろ液を濃縮してオレンジ色のオイルを得る。ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（３／１）で溶出するシリカゲルプラグを使用して精製し、標題の化合物（６３．１５ｇ、収率８４．０％）を無色オイルとして得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２１６／２１８（Ｍ＋１／Ｍ＋３）。

【0027】

基本的には調製例１の方法により、次の化合物を調製する。

【0028】

【表1】

【0029】

調製例３
２−（４−アミノ−２−ピリジル）プロパン−２−オール

【化6】

【0030】

撹拌子を使って、２ＬのＰａｒｒ反応炉に、銅（パウダーメッシュ、１２．６ｇ、１９８．６ｍｍｏｌ）、２−（４−ブロモ−２−ピリジル）プロパン−２−オール（６３．１ｇ、２９２．０ｍｍｏｌ）および水酸化アンモニウム（水中で２８ｗｔ／ｗｔ％、７５７．２ｍＬ）を篭める。反応混合物を、濃い青色になるまで３０分間外気へ開放下で撹拌する。撹拌子を取り除き、機械式撹拌用天板を装着し、密封し、そして、攪拌器を設置する。混合物を１００℃（内部、１２０℃の加熱浴）に加熱し、一晩撹拌する。反応混合物を室温へと冷却し、２−メチルテトラヒドロフラン（６００ｍＬ）を加える。ＣＥＬＩＴＥ（登録商標）プラグを通してろ過し、２−メチルテトラヒドロフランでゆすぐ。有機層を分離し、２−メチルテトラヒドロフラン（２００ｍＬ）を使って水層を抽出する。有機層を合わし、無水硫酸ナトリウム上で乾燥する。ろ過、濃縮、一晩真空下で乾燥させて、標題の化合物（３１．３ｇ、収率７０．４％）を黄色オイルとして得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１５３（Ｍ＋１）。

【0031】

基本的には調製例３の方法により、次の化合物を調製する。

【0032】

【表2】

【0033】

調製例５
２−ブロモ−１−テトラヒドロピラン−４−イル−エタノン

【化7】

【0034】

方法１：
ＤＣＭ（２５０ｍＬ）およびＤＭＦ（１５滴）中のテトラヒドロピラン−４−カルボン酸（３９．１３ｇ，３００．６７ｍｍｏｌ）混合物へ、塩化オキサリル（２８．６９ｍＬ、３３０．７３ｍｍｏｌ）を滴下する。反応物を、窒素下にて２．５時間室温で撹拌する。減圧濃縮し、そして、ＤＣＭ（２５０ｍＬ）中に残渣を溶解する。−１０℃で（トリメチルシリル）ジアゾメタン（ヘキサン中２Ｍ、４５０ｍＬ、９００．００ｍｍｏｌ）へ、得られる溶液を滴下し、混合物を一晩室温で撹拌する。混合物を０℃へと冷却し、臭化水素酸（水中で４８ｗｔ／ｗｔ％、５２ｍＬ、４６２．７３ｍｍｏｌ）を滴下する。混合物を、２時間室温で撹拌する。混合物を０℃へと冷却し、臭化水素酸（水中で４８ｗｔ／ｗｔ％、２６ｍＬ、２３１．３６ｍｍｏｌ）を滴下する。混合物を、２時間室温で撹拌する。水（２５０ｍＬ）、ＤＣＭ（２５０ｍＬ）を加え、有機層を分離する。水層をＤＣＭ（２×２５０ｍＬ）で抽出する。有機層を合わせ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和塩化ナトリウム水溶液とで洗浄する。無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で濃縮して、標題の化合物（５８．２ｇ、収率９３．４８％）を褐色固形物として得る。^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ４．００（ｍ，２Ｈ），３．９５（ｓ，２Ｈ），３．４５（ｍ，２Ｈ），２．９８（ｍ，１Ｈ），１．７８（ｍ，４Ｈ）。

【0035】

方法２：
メタノール（ＭｅＯＨ、５０ｍＬ）中の１−テトラヒドロピラン−４−イルエタノン（１０ｇ、７８．０２ｍｍｏｌ）溶液を−１０℃に冷却する。臭素（４．０１ｍＬ、７８．０２ｍｍｏｌ）を滴下する。混合物を０℃で４５分間、その後、１０℃で４５分間撹拌する。硫酸水溶液（１１Ｍ、２７．５ｍＬ、３０２．５０ｍｍｏｌ）を加え、得られる混合物を一晩室温で撹拌する。水を加え、３回ジエチルエーテルで抽出する。有機層を合わせる。炭酸水素ナトリウム水溶液と水で洗浄する。無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で濃縮して、標題の化合物（１２ｇ、収率７４．２８％）を白色固形物として得る。^１ＨＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ４．００（ｍ，２Ｈ），３．９５（ｓ，２Ｈ），３．４５（ｍ，２Ｈ），２．９８（ｍ，１Ｈ），１．７８（ｍ，４Ｈ）。

【0036】

調製例６
２−［（２−クロロ−４−ピリジル）オキシ］−１−テトラヒドロピラン−４−イル−エタノン

【化8】

【0037】

方法１：
ＤＭＦ（５０ｍＬ）中の２−ブロモ−１−テトラヒドロピラン−４−イル−エタノン（２４．３５ｇ、１１７．６０ｍｍｏｌ）溶液を、ＤＭＦ（３８０ｍＬ）中の２−クロロピリジン−４−オール（１３．８５ｇ、１０６．９１ｍｍｏｌ）と炭酸セシウム（６９．６７ｇ、２１３．８２ｍｍｏｌ）との撹拌溶液へと室温で滴下する。得られる混合物を２．５時間９０℃で撹拌する。室温へと冷却して、粗混合物を得る。上記したような、別の２．８５ｇ（２−クロロピリジン−４−オール）容量の反応実施物の粗混合物と合わせる。合わせた混合物を水（２００ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で希釈する。有機層を分離し、ＥｔＯＡｃ（３×２５０ｍＬ）を使って水層を抽出する。有機層を合わせ、水（１００ｍＬ）と飽和塩化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）で洗浄する。無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧濃縮して、標題の化合物（２９．３２ｇ、収率８８．９６％）を褐色オイルとして得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２５６（Ｍ＋１）。

【0038】

方法２：
２−ブロモ−１−テトラヒドロピラン−４−イル−エタノン（１０．０３ｇ、４８．４２ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１０．１４ｇ、７２．６２ｍｍｏｌ）を、アセトン（１５０ｍＬ）中の２−クロロピリジン−４−オール（６．４０ｇ、４８．４２ｍｍｏｌ）溶液に加え、得られる混合物を一晩室温で撹拌する。ろ過して固形物を除去し、その固形物をＤＣＭで洗浄する。ろ液を減圧濃縮して標題の化合物を定量的に得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２５６（Ｍ＋１）。

【0039】

基本的には調製例６の方法２により、次の化合物を調製する。

【0040】

【表3】

【0041】

調製例１３
２−クロロ−４−［（３−テトラヒドロピラン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）オキシ］ピリジン

【化9】

【0042】

２−［（２−クロロ−４−ピリジル）オキシ］−１−テトラヒドロピラン−４−イル−エタノン（２９．３ｇ、１１４．５９ｍｍｏｌ）と１，１−ジメトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−メタンアミン（６５ｍＬ、４８６．８３ｍｍｏｌ）との混合物を、１００℃で２時間撹拌する。室温へと冷却し、減圧濃縮し、ＥｔＯＡｃ（４００ｍＬ）中に残渣を溶解する。水（１００ｍＬ）と飽和塩化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）で洗浄する。無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で濃縮して、褐色固形物を得る。酢酸（３５０ｍＬ）中に溶解させて、０℃へと冷却する。ヒドラジン一水和物（１６．８ｍＬ、３４５．６６ｍｍｏｌ）を加え、窒素下で一晩室温で撹拌する。混合物を氷／水混合物（２５０ｍＬ）に注ぎ入れ、そして、ＥｔＯＡｃ（４×２００ｍＬ）で抽出する。有機層を合わせ、水（２００ｍＬ）と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）と飽和塩化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）とで洗浄する。無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮して、褐色オイルを得る。その褐色オイルを、ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルプラグを使用して、精製する。適切な画分を合わせて、減圧濃縮する。真空下で乾燥させて、標題の化合物（２４．４３ｇ、収率７６．２２％）を黄色固形物として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：２８０（Ｍ＋１）。

【0043】

基本的には調製例１３の方法により、次の化合物を調製する。

【0044】

【表4】

【0045】

調製例２０
２−クロロ−４−（１−シクロプロピル−３−テトラヒドロピラン−４−イル−ピラゾール−４−イル）オキシ−ピリジン

【化10】

【0046】

方法１：
１，２−ジクロロエタン（２４４．３ｍＬ）中の２，２’−ビピリジン（１３．７３ｇ、８７．９０ｍｍｏｌ）と酢酸銅（ＩＩ）（１５．９７ｇ、８７．９０ｍｍｏｌ）との混合物を、７５℃で２５分間還流し、その後、室温へと冷却する。１，２−ジクロロエタン（３３５．３０ｍＬ）中の２−クロロ−４−［（３−テトラヒドロピラン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）オキシ］ピリジン（２４．４３ｇ、７９．９１ｍｍｏｌ）溶液を加え、その後、シクロプロピルボロン酸（１３．７３ｇ、１５９．８２ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（１６．９４ｇ、１５９．８２ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を７５℃で２時間酸素環境下で加熱し、そして室温へと冷却する。ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、シリカゲルプラグを通してろ過し、そして、ＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）でゆすぐ。ろ液を、水（２００ｍＬ）と飽和塩化ナトリウム水溶液（２００ｍＬ）で洗浄する。無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、残渣を真空下、室温で一晩乾燥させる。ＤＣＭ中の６〜２７％ＥｔＯＡｃを用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、標題の化合物（２０．７５ｇ、収率８１．２％）を黄色固形物として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３２０（Ｍ＋１）。

【0047】

方法２：
１，２−ジクロロエタン（５０ｍＬ）中の２，２’−ビピリジン（２８．８ｇ、５６．５ｍｍｏｌ）と酢酸銅（ＩＩ）（８．２ｇ、４５．２ｍｍｏｌ）との懸濁物を、７０℃に加熱し、３分間窒素でパージする。ろ過し、そのろ液を、１，２−ジクロロエタン（５０ｍＬ）中の２−クロロ−４−［（３−テトラヒドロピラン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）オキシ］ピリジン（８ｇ、２２．６ｍｍｏｌ）、シクロプロピル（トリフルオロ）ホウ酸カリウム（６．７ｇ、４５．２ｍｍｏｌ）、および炭酸ナトリウム（４．８ｇ、４５．２ｍｍｏｌ）の混合物へと加える。反応混合物を、４日間７０℃で加熱する。室温へと冷却する。ろ過し、ＤＣＭでゆすぐ。ろ液を、飽和塩化アンモニウム水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液とで洗浄する。無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮する。ＤＣＭ中の１〜１０％ＭｅＯＨを用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、標題の化合物（６．０ｇ、収率８２．２％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３２０（Ｍ＋１）。

【0048】

基本的には調製例２０の方法１により、次の化合物を調製する。作業過程における変更点を示す。

【0049】

【表5】

【0050】

基本的には調製例２０の方法２により、次の化合物を調製する。

【0051】

【表6】

【0052】

調製例２７
２−クロロ−４−（１−シクロプロピル−３−テトラヒドロフラン−３−イル−ピラゾール−４−イル）オキシ−ピリジン、異性体１

【化11】

【0053】

キラルクロマトグラフィーを使って、２−クロロ−４−（１−シクロプロピル−３−テトラヒドロフラン−３−イル−ピラゾール−４−イル）オキシ−ピリジン（調製例２５）のラセミ混合物を精製し、第一溶出エナンチオマーを標題化合物として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３０６（Ｍ＋１）。

【0054】

精製条件：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＩＣ、移動相：二酸化炭素中の２０％エタノール（ＥｔＯＨ）、流速：３００ｇ／分、ＵＶＷ：２４０ｎｍ、保持時間：２．４４分。

【0055】

調製例２８
２−クロロ−４−（１−シクロプロピル−３−テトラヒドロフラン−３−イル−ピラゾール−４−イル）オキシ−ピリジン、異性体２

【化12】

【0056】

キラルクロマトグラフィーを使って、２−クロロ−４−（１−シクロプロピル−３−テトラヒドロフラン−３−イル−ピラゾール−４−イル）オキシ−ピリジン（調製例２５）のラセミ混合物を精製し、第二溶出エナンチオマーを標題化合物として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３０６（Ｍ＋１）。

【0057】

精製条件：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＩＣ、移動相：二酸化炭素中の２０％ＥｔＯＨ、流速：３００ｇ／分、ＵＶＷ：２４０ｎｍ、保持時間：２．９３分。

【0058】

調製例２９
２−クロロ−４−［１−（ジフルオロメチル）−３−（２−ピリジル）ピラゾール−４−イル］オキシ−ピリジン

【化13】

【0059】

ＤＭＦ（７３．３４ｍＬ）中の２−クロロ−４−［［３−（２−ピリジル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ］ピリジン（２．０ｇ、７．３３ｍｍｏｌ）溶液を氷浴中で冷却し、水素化ナトリウム（鉱油中で６０％、８８０．０２ｍｇ、２２．００ｍｍｏｌ）をポーションとして加えた。混合物を０℃で１０分間撹拌し、室温へと温まるようにし、そして、１０分間撹拌する。ジフルオロヨードメタン（ＴＨＦ中で１０ｗｔ％、２７．１９ｍＬ、３６．６７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を４５℃で一晩撹拌する。室温へと冷却し、そして、ＥｔＯＡｃで希釈する。まず、５％塩化リチウム水溶液で洗浄し、次に、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄する。無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮する。残渣を、ＤＣＭ中の０〜５０％ＥｔＯＡｃを使ってシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製する。適切な画分を合わせて、減圧濃縮する。残渣を、ＤＣＭ中の０〜１０％ＥｔＯＡｃを用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、標題の化合物（１．５６ｇ、収率６５．９％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３２３（Ｍ＋１）。

【0060】

基本的には調製例２９の方法により、次の化合物を調製する。溶媒、塩基、および／または反応温度の変更点を示す。

【0061】

【表7-1】

【表7-2】

【0062】

調製例４１
２−クロロ−４−｛［３−（ピリジン−２−イル）−１−｛［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ｝ピリジン

【化14】

【0063】

水素化ナトリウム（鉱油中で６０％の懸濁物、４８４ｍｇ、１２．１０ｍｍｏｌ）を、０℃のＴＨＦ（１１０ｍＬ）中の２−クロロ−４−［［３−（２−ピリジル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ］ピリジン（３．０ｇ、１１．００ｍｍｏｌ）溶液へと加える。１５分間０℃で撹拌し、そして、２−（トリメチルシリル）エトキシメチルクロリド（２．０２ｇ、１２．１０ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を室温で一晩撹拌する。混合物を濃縮する。残渣をＤＣＭと水との間に分離する。有機層を単離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥する。混合物をろ過し、そのろ液を減圧下で濃縮する。残渣を、ヘキサン中の０〜３０％ＥｔＯＡｃを用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、標題の化合物（３．６４ｇ、収率８２．１％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４０３（Ｍ＋１）。

【0064】

調製例４２
４−［［４−（１−シクロプロピル−３−テトラヒドロピラン−４−イル−ピラゾール−４−イル）オキシ−２−ピリジル］アミノ］ベンゾニトリル

【化15】

【0065】

１，４−ジオキサン（１５ｍＬ）中の２−クロロ−４−（１−シクロプロピル−３−テトラヒドロピラン−４−イル−ピラゾール−４−イル）オキシ−ピリジン（４００ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ｐ−アミノベンゾニトリル（２１９．９ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（５６８．５ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）、４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン（１３４．６ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液を、５分間窒素でパージする。得られる混合物を酢酸パラジウム（ＩＩ）（２６．１ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）で処理し、そして、５分間窒素でパージする。バイアルを閉じ、１００℃で２時間、その後、８０℃で週末をまたいで撹拌する。室温へと冷却し、ＣＥＬＩＴＥ（登録商標）プラグを通してろ過し、そして、ＤＣＭ中の５％ＭｅＯＨで洗浄する。ろ液を濃縮して標題の化合物（４６７ｍｇ、収率１００％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４０２（Ｍ＋１）。

【0066】

基本的には調製例４２の方法により、次の化合物を調製する。触媒および／または溶媒の変更点を示す。

【0067】

【表8-1】

【表8-2】

【0068】

実施例１
２−｛４−［（４−｛［１−シクロプロピル−３−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ｝ピリジン−２−イル）アミノ］ピリジン−２−イル｝プロパン−２−オール

【化16】

【0069】

方法１：
１，４−ジオキサン（４５６ｍＬ）中の２−クロロ−４−（１−シクロプロピル−３−テトラヒドロピラン−４−イル−ピラゾール−４−イル）オキシ−ピリジン（４５．６ｇ、１４２．６ｍｍｏｌ）、２−（４−アミノ−２−ピリジル）プロパン−２−オール（２６．０ｇ、１７１．１ｍｍｏｌ）、およびナトリウムフェナート（２６．５ｇ、２２８．２ｍｍｏｌ）の溶液を、２０分間窒素でパージする。得られる混合物を、４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン（８．２５ｇ、１４．３ｍｍｏｌ）およびビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム（４．１０ｇ、７．１３ｍｍｏｌ）で処理する。２１時間還流する。反応物を室温に冷却し、そして、一晩撹拌する。ＣＥＬＩＴＥ（登録商標）プラグを通してろ過し、ＤＣＭ（５００ｍＬ）で洗浄する。ろ液をシリカゲル上に濃縮する。ＥｔＯＡｃ中の０〜１０％ＭｅＯＨを使ってシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製する。適切な画分を濃縮、一晩真空下で乾燥させて、標題の化合物（５８．７ｇ、収率９１．７％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４３６（Ｍ＋１）。生成物のいくつかのバッチを、上記方法を使用して作製する。標題の化合物（９２．４ｇ）のバッチを合わせたものをＥｔＯＨ（１Ｌ）に溶解する。その溶液を、ＱＵＡＤＲＡＳＩＬ（登録商標）ＭＰ（１００ｇ、１．０〜１．５ｍｍｏｌ／ｇ）で処理し、１時間６０℃で激しく撹拌する。室温へと冷却し、そしてろ過して固形物を除去する。濃縮して、溶媒を除去する。残渣を、１００℃で加熱しながら、ＥｔＯＨ（５００ｍＬ）中に溶解する。その後、混合物をゆっくり室温へと冷却し、そして、水（５００ｍＬ）をゆっくり加える。混合物を、撹拌しながら５℃へと冷却する。ろ過により固形物を回収し、４５℃で一晩真空下で乾燥させて、標題の化合物（８１．８ｇ）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４３６（Ｍ＋１）。

【0070】

方法２：
２−クロロ−４−（１−シクロプロピル−３−テトラヒドロピラン−４−イル−ピラゾール−４−イル）オキシ−ピリジン（４００ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を、バイアル中の１，４−ジオキサン（１５ｍＬ）に溶解する。２−（４−アミノ−２−ピリジル）プロパン−２−オール（２６６．５ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（５６８．５ｍｇ，１．７ｍｍｏｌ）、４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン（１３４．６ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を加えて、５分間窒素でパージする。酢酸パラジウム（ＩＩ）（２６．１ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を加え、そして、５分間窒素でパージする。バイアルを密封して、１００℃で一晩撹拌する。反応物を室温へと冷却し、ＣＥＬＩＴＥ（登録商標）プラグを通してろ過し、そして、ＤＣＭ中の５％ＭｅＯＨで洗浄する。濃縮し、そして、逆相クロマトグラフィー（Ｒｅｄｉｓｅｐ Ｒｆ Ｇｏｌｄ高速Ｃ１８逆相カラム、ギ酸／水中のギ酸／アセトニトリル（ＡＣＮ）が０〜１００％）により精製する。適切な画分を濃縮、真空下で乾燥させて、標題の化合物（３４１ｍｇ、収率６７．３％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４３６（Ｍ＋１）。

【0071】

基本的には実施例１の方法２により、次の化合物を調製する。塩基、触媒、リガンド、および／または溶媒の変更点を示す。

【0072】

【表9-1】

【表9-2】

【表9-3】

【表9-4】

【表9-5】

【表9-6】

【表9-7】

【表9-8】

【表9-9】

【表9-10】

【0073】

実施例６２
４−［（４−｛［１−シクロプロピル−３−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ｝ピリジン−２−イル）アミノ］ベンズアミド

【化17】

【0074】

炭酸カリウム（８０．４ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（５ｍＬ）中の４−［［４−（１−シクロプロピル−３−テトラヒドロピラン−４−イル−ピラゾール−４−イル）オキシ−２−ピリジル］アミノ］ベンゾニトリル（４６７ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）溶液に加える。３０％過酸化水素（１．７７ｍＬ、１７．４５ｍｍｏｌ）を加え、そして、反応混合物を外気温で一晩撹拌する。水で希釈し、そして、ＤＣＭで４回抽出する。有機層を合わせ、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄する。無水硫酸ナトリウム上で乾燥する。混合物をろ過し、そのろ液を減圧下で濃縮する。残渣を、逆相クロマトグラフィー（Ｒｅｄｉｓｅｐ Ｒｆ Ｇｏｌｄ高速Ｃ１８逆相カラム、ギ酸／水中のギ酸／アセトニトリル（ＡＣＮ）が０〜１００％）により精製して、標題の化合物（２２０ｍｇ、収率４５．９％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４２０（Ｍ＋１）。

【0075】

基本的には実施例６２の方法により、次の化合物を調製する。

【0076】

【表10】

【0077】

実施例７０
２−｛４−［（４−｛［３−シクロプロピル−１−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ｝ピリジン−２−イル）アミノ］ピリジン−２−イル｝プロパン−２−オール

【化18】

【0078】

ＴＨＦ（６ｍＬ）中のメチル４−［［４−（３−シクロプロピル−１−イソプロピル−ピラゾール−４−イル）オキシ−２−ピリジル］アミノ］ピリジン−２−カルボキシレート（２９８ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）溶液を、密封バイアル中、窒素でパージする。臭化メチルマグネシウム（ジエチルエーテル中の３Ｍ、１．０１ｍＬ、３．０３ｍｍｏｌ）を滴下し、そして、混合物を室温で２時間撹拌する。混合物を減圧下で濃縮し、そして、残渣をＤＣＭと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で希釈する。有機層を分離し、ＤＣＭを使って水層を抽出する。有機層を合わせ、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄する。硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そしてろ液を濃縮する。ＤＣＭ中の５〜１０％ＭｅＯＨを用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、標題の化合物（１６０ｍｇ、収率５３．６９％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３９４（Ｍ＋１）。

【0079】

実施例７１
２−｛５−［（４−｛［３−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ｝ピリジン−２−イル）アミノ］ピリジン−２−イル｝プロパン−２−オール

【化19】

【0080】

トリフルオロ酢酸（３ｍＬ）中の２−［５−［［４−［３−（２−ピリジル）−１−（２−トリメチルシリルエトキシ−メチル）ピラゾール−４−イル］オキシ−２−ピリジル］アミノ］−２−ピリジル］プロパン−２−オール（５００ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）溶液を、氷浴中で０℃へと冷却する。トリエチルシラン（１ｍＬ、６．２４ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を室温で一晩撹拌する。濃縮し、そして、残渣を逆相クロマトグラフィー（Ｒｅｄｉｓｅｐ Ｒｆ Ｇｏｌｄ高速Ｃ１８逆相カラム、０〜１００％の１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ＡＣＮ中））により精製する。適切な画分を濃縮して、ＡＣＮを除去する。残った水性混合物を、ＤＣＭで抽出し、有機層を単離し、そして、硫酸ナトリウム上で乾燥させる。ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮して標題の化合物（１６８ｍｇ、収率４４．９％）を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３８９（Ｍ＋１）。

【0081】

実施例７２
Ｎ−［４−（｛１−（ジフルオロメチル）−３−（テトラヒドロフラン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル｝オキシ）ピリジン−２−イル］ピリダジン−３−アミン、異性体１

【化20】

【0082】

キラルクロマトグラフィーを使って、Ｎ−［４−［１−（ジフルオロメチル）−３−テトラヒドロフラン−３−イル−ピラゾール−４−イル］オキシ−２−ピリジル］ピリダジン−３−アミン（調製例４９）のラセミ混合物を精製し、第一溶出エナンチオマーを標題化合物として得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：３７５（Ｍ＋１）。

【0083】

精製条件：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＩＣ、移動相：二酸化炭素中の０．２％イソプロピルアミン含有３０％イソプロパノール、流速：７０ｇ／分、ＵＶＷ：２８０ｎｍ、保持時間：３．９３分。

【0084】

基本的には実施例７２の方法により、次の化合物を調製する。代わりの精製条件を示す。

【0085】

【表11】

【0086】

実施例７７〜７９用の粉末Ｘ線回折収集手順
結晶性固形物のＸＲＤパターンを、ＣｕＫａ源（λ＝１．５４０６０Å）とＶａｎｔｅｃ検出器を備えたＢｒｕｋｅｒ Ｄ４ Ｅｎｄｅａｖｏｒ粉末Ｘ線回折装置上で３５ｋＶおよび５０ｍＡで稼働しながら得る。サンプルを、４〜４０°の範囲の２θにて、２θのステップサイズ０．００９°及びスキャン速度０．５秒／ステップを用い、並びに０．６ｍｍの発散、５．２８の固定アンチスキャッターおよび９．５ｍｍの検出器スリットを用いてスキャンする。乾燥粉末を石英サンプルホルダーに詰め、そして、ガラススライドを使用して平滑面を得る。外気温および相対湿度での結晶形の回折パターンを収集する。

【0087】

実施例７７
２−｛４−［（４−｛［１−シクロプロピル−３−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ｝ピリジン−２−イル）アミノ］ピリジン−２−イル｝プロパン−２−オール、（２Ｚ）−ブト−２−エン二酸（１：１）

【化21】

【0088】

ＡＣＮ（２ｍＬ）中に、２−｛４−［（４−｛［１−シクロプロピル−３−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ｝ピリジン−２−イル）アミノ］ピリジン−２−イル｝プロパン−２−オール（１４２ｍｇ）を加える。固形物は、８０℃／１０００ｒｐｍで撹拌させて完全に溶解する。マレイン酸（４８ｍｇ、１．２０当量（８０℃の１ｍＬのＡＣＮ中））を、得られた溶液に加える。混合物は初期には濁っているが、すぐに澄んだ溶液となる。加熱と撹拌を中止する。溶液を室温へと冷却する。さらに２ｍＬのＡＣＮを加え、固形物を懸濁する。白色固形物を真空ろ過により単離し、その固形物をフィルタの上で、１５分間空気流の下で乾燥する。得られる固形物を６５℃の真空オーブン中で一晩乾燥させて、標題の化合物（１３２ｍｇ、収率７３．４％）を得る。単塩に対する形成塩中のマレイン酸イオンの理論的パーセンテージは、２１．０％である。ＨＰＬＣによる対イオン解析は、形成塩中のマレイン酸イオンの実測パーセンテージは１７．２％であることを確認する。対イオン解析は、単塩であることを示す。

【0089】

実施例７７の粉末Ｘ線回折
実施例７７の調製サンプルをＣｕＫａ線源を使用してＸＲＤパターンにより特徴解析したところ、以下の表１３に示すような回折ピーク（２θ値）を有している。特に、１２．５°、１７．５°、および１６．９°からなる群より選択される一又は複数のピークと組み合わせて９．６°のピークを有している。回折角度の許容誤差は、０．２°である。

【表12】

【0090】

実施例７８
２−｛４−［（４−｛［１−シクロプロピル−３−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ｝ピリジン−２−イル）アミノ］ピリジン−２−イル｝プロパン−２−オール、メタンスルホネート（１：１）

【化22】

【0091】

アセトン（２ｍＬ）中に、２−｛４−［（４−｛［１−シクロプロピル−３−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ｝ピリジン−２−イル）アミノ］ピリジン−２−イル｝プロパン−２−オール（１１３ｍｇ）を加える。固形物は、６０°Ｃ／１０００ｒｐｍで撹拌させて完全に溶解する。メタンスルホン酸（２１μＬ、１．２４当量）を得られた溶液に加える。加熱と撹拌を中止する。溶液を室温へと冷却する。さらに３ｍＬのアセトンを加え、固形物を懸濁する。白色固形物を真空ろ過により単離し、その固形物をフィルタの上で、１５分間空気流の下で乾燥する。得られる固形物を６５℃の真空オーブン中で一晩乾燥させて、標題の化合物（８７ｍｇ、収率６３．０８％）を得る。単塩に対する形成塩中のメタンスルホン酸イオンの理論的パーセンテージは、１８．１％である。ＨＰＬＣによる対イオン解析は、形成塩中のメタンスルホン酸イオンの実測パーセンテージは１６．２％であることを確認する。対イオン解析は、単塩であることを示す。

【0092】

実施例７８の粉末Ｘ線回折
実施例７８の調製サンプルをＣｕＫα線源を使用してＸＲＤパターンにより特徴解析したところ、以下の表１４に示すような回折ピーク（２θ値）を有している。特に、１４．１°、１０．８°、および１８．６°からなる群より選択される一又は複数のピークと組み合わせて７．０°のピークを有している。回折角度の許容誤差は、０．２°である。

【0093】

【表13】

【0094】

実施例７９
２−｛４−［（４−｛［１−シクロプロピル−３−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ｝ピリジン−２−イル）アミノ］ピリジン−２−イル｝プロパン−２−オール、４−メチルベンゼンスルホネート（１：１）

【化23】

【0095】

ＥｔＯＡｃ（２ｍＬ）中に、２−｛４−［（４−｛［１−シクロプロピル−３−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］オキシ｝ピリジン−２−イル）アミノ］ピリジン−２−イル｝プロパン−２−オール（１２２ｍｇ）を加える。固形物を、８０℃／１０００ｒｐｍで撹拌させて完全に溶解させる。ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（１．２３当量（８０℃の１ｍＬのＥｔＯＡｃ中））を、得られた溶液に加える。混合物を８０℃／１０００ｒｐｍで３０分間スラリー状にする。加熱を止め、そして、混合物が室温へ冷めるように、混合物を１０００ｒｐｍで撹拌を維持する。得られる白色固形物を真空ろ過により単離し、その固形物をフィルタの上で、１５分間空気流の下で乾燥する。得られる固形物を６５℃の真空オーブン中で一晩乾燥させて、標題の化合物（１５９ｍｇ、収率９３．４０％）を得る。単塩に対する形成塩中のｐ−トルエンスルホン酸イオンの理論的パーセンテージは、２９．３％である。ＨＰＬＣによる対イオン解析は、形成塩中のｐ−トルエンスルホン酸イオンの実測パーセンテージは２８．３％であることを確認する。対イオン解析は、単塩であることを示す。

【0096】

実施例７９の粉末Ｘ線回折
実施例７９の調製サンプルをＣｕＫａ線源を使用してＸＲＤパターンにより特徴解析したところ、以下の表１５に示すような回折ピーク（２θ値）を有している。特に、１９．７°、１８．４°、および２２．０°からなる群より選択される一又は複数のピークと組み合わせて１７．８°のピークを有している。回折角度の許容誤差は、０．２°である。

【0097】

【表14】

【0098】

ＴＧＦβ経路を介する情報伝達は、いくつかの適応症のがん及び腫瘍の進行に関連している（Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ．ａｌ．（２００５）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３：２０７８；Ｌｅｖｙ ｅｔ．ａｌ．（２００６）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ＆Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ １７：４１−５８）。腫瘍微小環境中の間質または腫瘍により生産されるＴＧＦβリガンドが腫瘍の進行に関与する可能性のあるいくつかの型のがんがある。ＭＡＴＬｙＬｕラット前立腺がん細胞（Ｓｔｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｒａｃｋ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ６：１５−２５）およびＭＣＦ−７ヒト乳がん細胞（Ａｒｔｅａｇａ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒ．４：１９３−２０１）は、マウスＴＧＦβ１の発現ベクターをトランスフェクション後に、より腫瘍化しおよび転移性となる。ＴＧＦ−β１は、ヒト前立腺がんおよび進行胃がんにおける、血管新生、転移、および予後不良と関連する（Ｗｉｋｓｔｒｏｍ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３７：１９-２９；Ｓａｉｔｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ ８６：１４５５-１４６２）。乳がんでは、予後不良は、ＴＧＦ−βの上昇と関連する（Ｄｉｃｋｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：８３７−８４１；Ｋａｓｉｄ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：５７３３−５７３８；Ｄａｌｙ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．４３：１９９−２１１；Ｂａｒｒｅｔｔ−Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｒ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ６１：６１２−６１７；Ｋｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：１３３−１３８；Ｗｅｌｃｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：７６７８−７６８２；Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ２３８：６４１−６４４）。そして、タモキシフェン治療（Ｂｕｔｔａ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４２６１−４２６４）によるＴＧＦ−β１の誘導は、タモキシフェン治療が乳がんに効かないことと関連する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ６３：６０９−６１４）。抗ＴＧＦβ１抗体（すい臓のナチュラルキラー細胞活性の増加と相関する治療用のもの）は、胸腺欠損マウスにおけるＭＤＡ−２３１ヒト乳がん細胞の増殖を阻害する（Ａｒｔｅａｇａ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２５６９−２５７６）。潜在型のＴＧＦβ１をトランスフェクションしたＣＨＯ細胞をヌードマウス中に入れると、ＮＫ活性が減少し、腫瘍増殖が増加したことが示された（Ｗａｌｌｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１７７７−１７８４）。従って、乳がんにより分泌されるＴＧＦ−βは、内分泌性免疫抑制を引き起こす場合がある。ＴＧＦβ１の血漿中濃度が高いことは、進行型乳がん患者の予後不良を示唆することが示された（Ａｎｓｃｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２８：１５９２−１５９８）。高用量化学療法および骨髄自家移植前に循環ＴＧＦβが高い患者は、肝静脈閉塞性疾患（５０％までの死亡率を有する全患者の内１５〜５０％）および特発性間質性肺炎（全患者の内４０〜６０％）のリスクが高い。これらの所見の意味するところは、１）ＴＧＦβの血漿レベルの上昇を利用してリスクのある患者を同定可能であること、２）ＴＧＦβシグナリングの減少により、乳がん患者に対するこれら一般的治療による疾病率および死亡率を減少できるかもしれないことである。

【0099】

最近の文献はまた、ＴＧＦβシグナリングが、腫瘍の（化学療法を含む）標準的なケア治療に対する耐性および受容体型チロシンキナーゼ治療に対する耐性を促進するのに重要となる可能性があることを示唆している（ＷＯ２０１２１３８７８３）。具体的には、大腸がんでは、特定の遺伝子発現様式が、一般的第一治療に耐性となる患者群を選び出すことが示された。これらの腫瘍細胞は、ＴＧＦβＲＩ特異的小分子阻害剤を用いてＴＧＦβ経路をブロックした場合に、治療への感受性を再獲得する（Ｈｕａｎｇ，ｅｔ．ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ １５１：９３７−９５０；Ｓａｄａｎａｎｄａｍ ｅｔ．ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｍｅｄ １９：６１９−６２５；Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ ｅｔ．ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｍｅｄ １９：６１４−６１８；Ｒｏｅｐｍａｎ ｅｔ．ａｌ．（２０１４）１３４：５５２−５６２）。

【0100】

骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、骨髄区画中の造血系の疾患であって、骨髄系細胞の生産が非効率的となることを特徴とする。ＭＤＳは、ＴＧＦβ経路の変化（ＳＭＡＤ７レベルの減少に相当する）にリンクしている。ＳＭＡＤ７は、阻害性ＳＭＡＤであって、ＴＧＦβが媒介するＳＭＡＤ情報伝達を阻害するように機能し、そして、ＴＧＦβＲＩおよびＴＧＦβＲＩＩを介するリガンド活性化シグナリングの下流に位置している。ＳＭＡＤ７の過剰発現は、従って、ＭＤＳ中でのＴＧＦβ情報伝達の過剰活性化を導くと考えられている。この表現型は、ＴＧＦβＲＩ小分子阻害剤で処理することで逆転可能である（Ｚｈｏｕ ｅｔ．ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７１：９５５−９６３）。同様に、膠芽腫（ＧＢＭ）では、ＴＧＦβリガンドレベルが上昇し、疾患の進行と関連する。アンチセンスオリゴヌクレオチド治療剤ＡＰ１００２は、ある種のＧＢＭ患者に潜在的に作用があることが示された（Ｂｏｇｄａｈｎ ｅｔ．ａｌ．（２０１１）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）。メラノーマでは、ＴＧＦβ経路の情報伝達活性化は、ＢＲＡＦおよびＭＥＫ阻害剤への抵抗性にも関係していた（Ｓｕｎ ｅｔ．ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ．５０８：１１８−１２２）。

【0101】

多くの悪性細胞は、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）（強力な免疫抑制剤）を分泌する。このことは、ＴＧＦβの生産が宿主の免疫監視から腫瘍が逃れる重要なメカニズムとなる可能性を示唆する（Ｆｌａｖｅｌｌ ｅｔ．ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０：５５４−５６７；Ｋａｓｔ ｅｔ．ａｌ．（１９９９）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １３：１１８８−１１９９）。腫瘍を有する宿主においてＴＧＦβ情報伝達が攪乱された白血球亜集団を確立することにより、がんの免疫療法に関する潜在的手段を単独または一若しくは複数の他の免疫療法と組み合わせて（例、一若しくは複数のＰＤ−１阻害剤（例、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ））、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、がんワクチン、および両特異性免疫結合分子（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｅｎｇａｇｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（例、ＩＭＣｇｐ１００）と組み合わせて）提供する。リンパ球により生産されるＴＧＦβリガンドは、前臨床段階ではあるが、腫瘍の免疫監視と拮抗することが示されている（Ｄｏｎｋｏｒ ｅｔ．ａｌ．（２０１２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １：１６２−１７１，Ｄｏｎｋｏｒ ｅｔ．ａｌ．（２０１１）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３５：１２３−１３４）。この軸を攪乱することは、前臨床段階ではあるが、マウスモデルとイン・ビトロにおいて抗腫瘍作用を提供することも示されている（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ．ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １６：１１９１−１２０５；Ｐｅｔｒａｕｓｃｈ ｅｔ．ａｌ．（２００９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８３：３６８２−３６８９）；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ ｅｔ．ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １３：３２８−３４１）。Ｔ細胞中でＴＧＦβ情報伝達が攪乱したトランスジェニック動物モデルでは、通常、致死的レベルのＴＧＦβを過剰発現するリンパ腫瘍ＥＬ４を根絶可能である（Ｇｏｒｅｌｉｋ ａｎｄ Ｆｌａｖｅｌｌ，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７（１０）：１１１８−１１２２）。腫瘍細胞においてＴＧＦβの分泌をダウンレギュレーションすることにより、宿主中の免疫原性が回復する一方で、Ｔ細胞がＴＧＦβへ非感受性となることにより、分化と自己免疫（それらの構成要素は、腫瘍に寛容な宿主中の自己抗原発現腫瘍と闘うために必要な場合がある）が加速する。ＴＧＦβの免疫抑制作用は、ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞の数に基づいて予想されるより低い免疫応答をするＨＩＶ患者の亜集団においても関与が示唆されてもいる（Ｇａｒｂａ，ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２）１６８：２２４７−２２５４）。ＴＧＦβ中和抗体は、培養系で作用を逆転させることができ、ＴＧＦβ情報伝達阻害剤が、このＨＩＶ患者サブセットに存在する免疫抑制を逆転させるのに有用性がある場合があることを示す。

【0102】

発がん過程の初期段階中では、ＴＧＦβ１は強力ながん抑制分子として働くことができ、いくつかの化学防御剤の作用機構を媒介する場合がある。しかしながら、悪性新生物の発症および進行途中のある時点では、腫瘍細胞はＴＧＦβ依存性増殖阻害から逃れるのと並行して、生物学的活性のあるＴＧＦβが微小環境中に出現する。ＴＧＦβのがん抑制／がん促進という二面的役割は、角化細胞でＴＧＦβを過剰発現するトランスジェニック系において、最も明らかに解明された。トランスジェニック体は良性皮膚病変の形成に抵抗性がよりある一方で、そのトランスジェニック体内で転移性へと変化する率は劇的に増加した（Ｃｕｉ，ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｃｅｌｌ ８６（４）：５３１−４２）。原発腫瘍中の悪性細胞によるＴＧＦβ１の生産は、腫瘍進行のステージが進行するにつれて増加するように見える。多くの主要な上皮がんの研究は、ヒトがんによるＴＧＦβの生産の増加は、腫瘍進行中の比較的後期イベントとして起こるということを示唆している。さらに、この腫瘍関連ＴＧＦβは、腫瘍細胞に選択的優位性を与え、腫瘍進行を促進する。細胞／細胞相互作用および細胞／間質相互作用へのＴＧＦβの効果により、浸潤および転移傾向がより大きくなる。腫瘍関連ＴＧＦβは、腫瘍細胞が免疫監視から逃れることを可能にするかもしれない。なぜなら、それは活性化リンパ球のクローン増殖の強力な阻害剤であるからだ。ＴＧＦβは、アンジオスタチンの生産を阻害することも示された。がん治療様式（例、放射線療法および化学療法）は、腫瘍における活性化型ＴＧＦβの生産を誘導し、それにより、ＴＧＦβの増殖阻害効果に耐性のある悪性細胞の増生が選択される。従って、これらの抗がん治療は、増殖と浸潤性が高い腫瘍のリスクを増加させ、そして、その発生を早める。このような状況において、ＴＧＦβ媒介情報伝達を標的とする薬剤は、非常に効果的な治療戦略となり得る。ＴＧＦβへの腫瘍細胞の抵抗性は、放射線療法および化学療法の細胞毒性効果の多くを無いものとすることが示されている。そして、間質におけるＴＧＦβの治療依存的活性化は、有害でさえもある。というのは、それは、微小環境により腫瘍進行をさらに促し、そして、線維症につながる組織ダメージに資するからである。ＴＧＦβ情報伝達阻害剤の開発は、それ単独および他の療法と組み合わせると進行したがんの治療に役立つ可能性がある。

【0103】

さらに、当該技術分野で既知なのは、ＴＧＦβシグナリングが、線維症（例、肝線維症および慢性腎疾患）の症状と関係があることである。例えば、Ｕｅｈａ Ｓ．，ｅｔ．ａｌ．２０１２．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：７１．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｏｒｇａｎ ｆｉｂｒｏｓｉｓ；Ｂｏｔｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．２００２．Ｊ Ａｍｅｒ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．１３：２６００．ＴＧＦ−β Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｒｅｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ；Ｔｒａｃｈｔｍａｎ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ７９：１２３６．Ａ ｐｈａｓｅ １， ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｓｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ， ａｎ ａｎｔｉ−ＴＧＦ−β ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｒｉｍａｒｙ ｆｏｃａｌ ｓｅｇｍｅｎｔａｌ ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；およびＲｏｓｅｎｂｌｏｏｍ Ｊ，ｅｔ．ａｌ．２０１０．Ｎａｒｒａｔｉｖｅ ｒｅｖｉｅｗ：ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ：ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １５２：１５９-１６６を参照されたい。

【0104】

以下のアッセイは、生化学アッセイにおいて、細胞レベルで、および動物モデルにおいて、例示化合物がＴＧＦβＲ１を阻害することを実証する。

【0105】

ＴＧＦβＲ１活性の生化学的アッセイ
このインビトロアッセイの目的は、ＴＧＦβＲ１を阻害する化合物を同定することである。

【0106】

タンパク質発現と精製
アミノ酸２０４位のＴｈｒをＡｓｐに変えたヒトＴＧＦβＲ１（ＮＭ＿００４６１２．２）のアミノ酸２００〜５０３番をコードするヌクレオチド配列を、ＰＦＡＳＴＢＡＣ（商標）１（インビトジェン、カタログ＃１０３６０−０１４）ベクターに、Ｎ末端にＨＩＳタグを付けて挿入した。ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（登録商標）バキュロウイルス発現システム（インビトロジェン、カタログ＃１０３５９−０１６）のプロトコルに従って、バキュロウイルスを作製する。１リットルの培養当たり、１５ｍＬのＰ１ウイルスを使用して１．５×１０^６細胞／ｍＬのＳｆ９に感染させ、２８℃で４８時間インキュベートする。細胞を回収し、引き続くタンパク質精製のために−８０℃で保管する。タンパク質精製を４℃で実施する。０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびＲｏｃｈｅコンプリートＥＤＴＡ不含有プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む１００ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのイミダゾール、１０％グリセロール）中に、２Ｌ培養物由来のペレットを懸濁し、ホモジェナイズする。４５分間、１６，５００ｒｐｍでベックマンＪＡ−１８ローターで遠心分離することにより、細胞溶解物を澄ませる。上清を、３時間、５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡメタルアフィニティー樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）とインキュベートする。その樹脂をカラムに充填し、緩衝液Ａで洗浄する。ＨＩＳ−ＴＧＦβＲ１（２００−５０３）（Ｔ２０４Ｄ）タンパク質を、緩衝液Ａ中の０〜４００ｍＭのイミダゾール勾配を使って溶出する。ＨＩＳ−ＴＧＦβＲ１（２００−５０３）（Ｔ２０４Ｄ）含有画分をプール、濃縮し、そして、ＨｉＬｏａｄ １６．６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上にロードする。カラムを、保存緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ）で溶出する。ＨＩＳ−ＴＧＦβＲ１（２００−５０３）（Ｔ２０４Ｄ）含有画分を溜めてし、濃縮する。タンパク質濃度をＵＶ２８０で測定する。タンパク質を分注し、−８０℃で保管する。

【0107】

ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイ条件
ハーフエリアブラックプレート（ｈａｌｆ−ａｒｅａ ｂｌａｃｋ ｐｌａｔｅ）中に、組換えＨｉｓ−ＴＧＦβＲ１（２００−５０３）（Ｔ２０４Ｄ）とＥｕ−抗ＨＩＳ検出抗体（インビトロジェン、カタログ＃ＰＶ５５９７）と共に化合物をプレインキュベートする。ＤＭＳＯ中の１ｍＭストック試験化合物から化合物の希釈系列を調製する。ＤＭＳＯ中に、ストック溶液の３倍希釈系列を作製して、化合物終濃度が２μＭ〜０．１ｎＭの範囲にある１０点希釈曲線を得る。このアッセイのＤＭＳＯの終濃度は、４％である。キナーゼトレーサー（Ｋｉｎａｓｅ Ｔｒａｃｅｒ １７８、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＰＲ９０８０Ａ、インビトロジェン）を添加して、反応を開始する。４５〜６０分後に、プレートリーダー上で蛍光を読み取る。

【0108】

最小阻害群（ＤＭＳＯ単独、未処理）に対する化合物処理群の阻害パーセンテージを計算する。ＩＣ_５０絶対値＝５０％阻害を生じる濃度であるとして、４−パラメータ非線形ロジスティック方程式を使用し、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅデータ解析ソフトウエアを使用して、ＩＣ_５０絶対値を計算する。これらのアッセイの結果は、例示化合物がＴＧＦβＲ１の効果的阻害剤であることを実証する。例えば、全ての例示化合物は、１μＭ未満のＩＣ_５０値を示す。具体的には、実施例１のＩＣ_５０値は０．０２７μＭである。

【0109】

ＴＧＦβＲ１活性用の細胞ベース・ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ
このアッセイの目的は、細胞ベースのアッセイ中でＳＭＡＤ２，３依存性遺伝子発現と選択的に干渉する化合物を同定し、その化合物が細胞レベルでＴＧＦβＲ１を阻害することを実証することである。

【0110】

ＴＧＦβ刺激に応答して、ＳＭＡＤ２，３応答性プロモーターからホタル・ルシフェラーゼを発現するようにＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５７３）を設計する。そのような細胞株をレンチウイルス粒子（ＳＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で感染して作製し、ピュロマイシン抵抗性に関して選抜する。アッセイ用に準備された凍結ストック由来のＨＥＫ２９３＿ＳＭＡＤ２／３細胞を、１０％ウシ胎児血清含有ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地中で、９６穴プレートの各ウエルに１５，０００細胞で蒔く。７２時間後、培地を、０．１％ウシ血清アルブミン含有ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地に変える。ＤＭＳＯ中の試験化合物を調製して、１０ｍＭのストック溶液を作製する。ＤＭＳＯ中に、ストック溶液の３倍希釈系列を作製して、化合物終濃度が２０μＭ〜１ｎＭの範囲にある１０点希釈曲線を得る。このアッセイのＤＭＳＯの終濃度は、０．５％である。試験化合物を加え、一時間の平衡化の後、ＴＧＦβ（終濃度＝２ｎＭ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加える。

【0111】

２４時間後、溶解緩衝液［Ｇｌｏ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ＃Ｅ２６６１）］およびルシフェラーゼ試薬［Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ＃Ｅ２６２０）］を各ウエルに加えて、ウエル容量を二倍にする。アリコート（８０μＬ）を、白色ソリッドボトムプレート（ｓｏｌｉｄ ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅ）に移し、プレートリーダー（エミッションフィルター：Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ７００、１秒読み取り）上で発光を測定する。最小阻害群（ＤＭＳＯ単独、未処理）に対する化合物処理群の阻害パーセンテージを計算する。用量反応試験から、各化合物の相対的ＩＣ_５０を計算し、５０％阻害を達成するのに必要な濃度を計算する。用量反応試験から得られたデータを、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅデータ解析ソフトウエアを使用して、４−パラメータロジスティック方程式に当てはめる。これらのアッセイの結果は、例示化合物が、ＴＧＦβで刺激したＨＥＫ２９３＿ＳＭＡＤ２／３細胞のルシフェラーゼレポーター活性の効果的阻害剤であることを実証する。例えば、全ての例示化合物は、１μＭ未満のＩＣ_５０値を示す。具体的には、実施例１のＩＣ_５０は０．０８２４μＭである（±０．００５、ｎ＝２）。

【0112】

ＩＶＴＩアッセイ
このアッセイの目的は、試験化合物が、ＥＭＴ６−ＬＭ２同一遺伝子型動物モデル内の腫瘍においてｐＳＭＡＤ２発現を阻害する能力を測定することである。換言すると、このアッセイは、試験化合物が、固形がん動物モデル中でＴＧＦβＲ１シグナリングを阻害する能力を測定する。

【0113】

ＥＭＴ６−ＬＭ２細胞作製
ＥＭＴ−６細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２７５５）（５×１０^５／動物）を、免疫機能のあるＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＨｓｄマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒｉｔｏｒｉｅｓ）のわき腹の皮下に移植する。腫瘍が約３０００ｍｍ^３に達すると、動物をＣＯ_２で窒息させて屠殺する。腫瘍を保持する動物から肺を取り出して、培養する。肺を穏やかにホモジェナイズして、単細胞の懸濁物を作製する。細胞を培養培地（ＩＭＤＭ、１０％ＦＢＳ）中で増殖させ、腫瘍細胞を単離してＥＭＴ６−ＬＭ１を得る。移植用のＥＭＴ６−ＬＭ１細胞を使用して上記プロセスを繰り返して、ＥＭＴ−ＬＭ２細胞を作製する。

【0114】

精製リン酸化ＨＩＳ−ＳＭＡＤ２（ｐＳＭＡＤ２）
ヒトＳＭＡＤ２全長（ＮＭ＿００５９０１．５）をコードするヌクレオチド配列を、ＰＦＡＳＴＢＡＣＨＴＡ（商標）（インビトロジェン、カタログ＃１０５８４−０２７）に挿入し、ＨＩＳ−ＳＭＡＤ２タンパク質を発現するバキュロウイルス・コンストラクトを作る。アミノ酸２０４位のＴｈｒをＡｓｐに変えたヒトＴＧＦβＲ１（ＮＭ＿００４６１２．２）のアミノ酸１４８〜５０３番をコードするヌクレオチド配列を、ＰＦＡＳＴＢＡＣＨＴＡ（商標）（インビトロジェン、カタログ＃１０５８４−０２７）ベクターに挿入し、ＨＩＳ−ＴＧＦβＲ１（１４８−５０３）（Ｔ２０４Ｄ）タンパク質を発現するバキュロウイルス・コンストラクトを作る。ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（登録商標）バキュロウイルス発現システム（インビトロジェン）のプロトコルに従って、バキュロウイルスを作製する。１リットルの培養当たり、１０ｍＬのＨＩＳ−ＳＭＡＤ２のＰ１ウイルスとＨＩＳ−ＴＧＦβＲ１（１４８−５０３）（Ｔ２０４Ｄ）のＰ１ウイルスとを使用して１．５×１０^６細胞／ｍＬのＳｆ９に感染させ、２８℃で４５時間インキュベートする。オカダ酸を終濃度０．１μＭとなるように加える。さらに３時間インキュベーションした後、細胞を回収し、引き続くタンパク質精製のために−８０℃で保管する。タンパク質精製を４℃で実施する。０．１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００およびＲｏｃｈｅコンプリートＥＤＴＡ不含有プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む３００ｍＬの冷却緩衝液Ａ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、３００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのβ−メルカプトエタノール、５ｍＭのイミダゾール、１０％グリセロール、０．１μＭのオカダ酸）中で撹拌しながらインキュベートおよびホモジェナイズすることにより、６Ｌ培養物由来の凍結細胞ペレットを溶解する。４５分間、１６，５００ｒｐｍでベックマンＪＡ−１８ローターで遠心分離することにより、細胞溶解物を澄ませる。上清を、１０ｍＬのＴＡＬＯＮメタルアフィニティー樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ＃６３５５０４）と、２時間インキュベートする。そのバッチを、０．１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００含有緩衝液Ａの１００ｍＬで洗浄する。樹脂をカラムに充填し、緩衝液Ａで洗浄する。ＨＩＳ−ＳＭＡＤ２タンパク質を、緩衝液Ａ中の０〜１００ｍＭのイミダゾール勾配を使って溶出する。リン酸化ＨＩＳ−ＳＭＡＤ２を含む画分を溜め、０．１μＭオカダ酸と５ｍＭのＥＤＴＡとを添加する。ＢＳＡを標準として使用して、ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ ＤＣタンパク質アッセイキット＃５００−０１１６）により、タンパク質濃度を測定する。タンパク質を分注し、−８０℃で保管する。

【0115】

生体フェーズ
ＥＭＴ６−ＬＭ２細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘおよび０．１ｍＭ非必須アミノ酸を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＭＤＭ）中で培養し、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートする。細胞をトリプシン処理し、培養物から細胞を単離する。細胞を、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に再懸濁し、その後、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：１）と混ぜる。細胞（５×１０^５／動物）を、マウス（雌ＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｈａｒｌａｎ）のひ腹に皮下移植する。カリパスで腫瘍体積を測定し、体重を週に二回測定する。腫瘍体積が約２００〜２５０ｍｍ^３に達すると、動物をランダムに、ビヒクルコントロール群と化合物処置群にグループ分けする。化合物（１％ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、０．２５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、および０．０５％消泡剤中に処方したもの）およびビヒクルコントロール（１％ＨＥＣ、０．２５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、および０．０５％消泡剤）を、経口経管栄養により投与する。２．７、８．３、２５、７５、または１５０ｍｇ／ｋｇの単回投薬後、単一時点（２時間）において化合物を試用して、用量反応を生み出す。単回投薬後１時間〜１６時間の間の複数時点でマウスを屠殺して、用量反応試験から計算（方法は以下に記載）されたＴＥＤ_５０またはＴＥＤ_８０用量での時間推移（タイムコース）を求める。

【0116】

組織処理
腫瘍組織を回収し、以下に記載するように均質化する。腫瘍組織（各約１００ｍｇ）を液体窒素中で凍らせ、乳棒で粉末に砕く。粉末化組織を、ドライアイス上のチューブ（溶解用Ｍａｔｒｉｘ Ａチューブ、ＭＰＢｉｏ＃６９１０−１００）中に入れて、溶解緩衝液（各０．６ｍＬ）（１５０ｍＭのＮａＣｌ；２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５；１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；１ｍＭのエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）；１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００；プロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマＰ８３４０）；ホスファターゼ阻害剤カクテルＩＩ（シグマＰ５７２６）；ホスファターゼ阻害剤カクテルＩＩＩ（シグマＰ００４４））中で、２５秒間、Ｂｉｏ１０１ ＦＡＳＴＰＲＥＰ（登録商標）ＦＰ１２０ホモジナイザー（設定４．５）を使用して均質化する。細胞の破片とビーズを、４℃、１０分間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離してペレット化する。溶解物を新たな微量遠心管に移して、４℃、１０分間、１４，０００ｒｐｍで再度遠心分離する。遠心分離した溶解物を深いウエルの９６穴プレートに移し、氷上で保つ。以下のようにして、ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ ＤＣタンパク質アッセイキット＃５００−０１１６）を使用して、各溶解物のタンパク質濃度を測定する。キット試薬Ｓ（２０μＬ）を、アッセイに必要なキット試薬Ａの１ｍＬずつに加えることにより、作業用試薬を調製する。０．２ｍｇ／ｍＬ〜１．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質範囲のタンパク質標準の３〜５倍希釈液を調製して、検量線を作成する。５μＬの標準とサンプルをピペットで取り分けて、きれいで乾燥したマイクロタイタープレートに入れる。２５μＬの作業用試薬を各ウエルに加える。２００μＬの試薬Ｂを各ウエルに加え、５秒間激しく撹拌する。１５分後に、各ウエルの７５０ｎＭでの吸光度を読み取る。各ウエルのタンパク質レベルを、標準ウエル由来の検量線とサンプルウエルの吸光度を比較することにより決定する。以下に記載する方法であるＥＬＩＳＡによるｐＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ２／３全体の解析の準備で、腫瘍溶解物を溶解緩衝液で１０ｍｇ／ｍＬに標準化する。

【0117】

ＳＭＡＤのＥＬＩＳＡ
独立した複数のＥＬＩＳＡプレートを使用して、腫瘍溶解物をアッセイする。１つのプレートは、ＳＭＡＤ２／３全体レベルを測定するために使用し、別のプレートをリン酸化ＳＭＡＤ２レベルを測定するために使用する。コーティング抗体は、両方のプレートで同じであるが、二次抗体は、ＳＭＡＤ２／３全体またはリン酸化ＳＭＡＤ２に特異的である。これらのプレートは、総称的に「ＥＬＩＳＡプレート」と呼び、個別的には、それぞれ「トータルＥＬＩＳＡプレート」または「ホスホＥＬＩＳＡプレート」と呼ぶ。コーティング抗体を、ＢｕｐＨカーボネート−バイカーボネート緩衝液（抗ＳＭＡＤ２／３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃６１０８４３；ＢｕｐＨカーボネート−バイカーボネートは、Ｐｉｅｒｃｅ＃２８３８２）中に２．５μｇ／ｍＬで調製する。そして、各ウエル当たり１００μＬで９６穴イムノプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃４３９４５４）に加え、プラットフォーム振とう機上で４℃一晩インキュベートして、ＥＬＩＳＡプレートを作製する。次に、洗浄緩衝液（０．５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０をトリス緩衝液（ＴＢＳ）、ｐＨ８．０（シグマ＃Ｔ−９０３９）に入れたもの）で４回ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、それに引き続いて各ウエル当たり２００μＬのブロッキング緩衝液（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１×ＴＢＳに入れたもの）で、２時間プラットフォーム振とう機上で、室温にてブロッキングする。洗浄緩衝液で４回洗浄する。ホスホＳＭＡＤ ＥＬＩＳＡプレートの適当なウエルに、各ウエル当たり１０ｍｇ／ｍｌの腫瘍溶解物またはビヒクル溶解物を１００μＬ加える。トータルＥＬＩＳＡプレートの適当なウエルに、各ウエル当たり９８μＬの溶解緩衝液と各ウエル当たり２μＬの１０ｍｇ／ｍｌの腫瘍溶解物またはビヒクル溶解物を加える（最終的には０．０２ｍｇのタンパク質溶解物）。精製ｐＳＭＡＤ２を使用して、各ＥＬＩＳＡプレート（ホスホおよびトータルの両方とも）に検量線も追加する。一晩インキュベートする。洗浄緩衝液で、再度４回ＥＬＩＳＡプレートを洗浄する。１％ＢＳＡを添加した溶解緩衝液中に、１：５００希釈で、二次抗体（ミリポア抗リン酸化ＳＭＡＤ２ウサギモノクローナル抗体＃０４−９５３；ミリポア抗ＳＭＡＤ２／３ウサギポリクローナル抗体＃０７−４０８）を調製する。そして、適当なプレートに各ウエル当たり１００μＬを加える。２〜３時間室温で、プレートをインキュベートする。洗浄緩衝液で４回洗浄し、プレートに各ウエル当たり１００μＬのレポーター抗体（抗ウサギＨＲＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ＃ＮＡＶ９３４Ｖ、ブロッキング緩衝液中に１：１０，０００で希釈したもの）を加える。室温で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で、最終的に４回プレートを洗浄する。そして、室温の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ／ＢｉｏＦＸ＃ＴＭＢＷ−０１００−０１）を各ウエル当たり１００μＬ加える。最高３０分まで３７℃でプレートをインキュベートする。１００μＬの停止溶液（１ＮのＨ_２ＳＯ_４）を加えて、反応を停止させる。プレートリーダーで、４５０ｎｍでの吸光度（ＯＤ）を測定する。

【0118】

ビヒクル群のリン酸化ＳＭＡＤ（ｐＳＭＡＤ）に対するＳＭＡＤ全体（ｔＳＭＡＤ）の比率を利用して、ｐＳＭＡＤシグナルの最小阻害（０％）を決定する。ビヒクル群のｐＳＭＡＤ最小阻害に対する化合物処理群の阻害パーセンテージを計算する。ＳＡＳ（バージョン９．３、Ｃａｒｙ、ＮＣ）中でＮＬＩＮ法を使用して、用量反応試験からＴＥＤ_５０およびＴＥＤ_８０（それぞれ、この時点で５０％および８０％阻害を達成するのに必要な用量）を計算する。このアッセイが実証するのは、１回の投薬後２時間での実施例１のＴＥＤ_５０値が１０．８ｍｇ／ｋｇであり、ＴＥＤ_８０が２４．１ｍｇ／ｋｇであることである。ＴＥＤ_５０用量（１１ｐｍｋ）でのタイムコース試験では、実施例１は、投薬後１時間で４８％の阻害、２時間で３９％の阻害を示す。（２５ｍｐｋ）でのタイムコース試験では、実施例１は、投薬後１時間で７１％の阻害、２時間で７０％の阻害を示す。

【0119】

本発明の化合物は、広い投与量範囲に渡り全体的に効果がある。例えば、１日当たりの投与量は、通常、約１〜２０００ｍｇの一日当たり範囲内に収まる。好ましくは、そのような用量は、１０〜１０００ｍｇの一日当たり範囲内に収まる。より好ましくは、そのような用量は、１０〜１００ｍｇの一日当たり範囲内に収まる。さらにより好ましくは、そのような用量は、１０〜８０ｍｇの一日当たり範囲内に収まる。最も好ましくは、そのような用量は、１０〜５０ｍｇの一日当たり範囲内に収まる。いくつかの例では、前記した範囲の下限以下の投与量レベルが、充分以上である場合がある。一方で、他のケースでは、それよりずっと多い用量が採用される場合もある。従って、上記投与量範囲は、いかなる意味でも本発明の範囲を限定する意図はない。実際に投与される化合物量は、医師が適切な状況（治療される状態、選択される投与経路、投与される実際の化合物（複数可）、個々の患者の年齢、体重、および反応、ならびに患者の症状の重症度を含むもの）を鑑みて決定することになる。