特許 6043941 β−グルコシダーゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6043941

(24)【登録日】2016年11月25日

(45)【発行日】2016年12月14日

(54)【発明の名称】β−グルコシダーゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20161206BHJP

   C12N 9/42 20060101ALI20161206BHJP

   C12P 7/06 20060101ALI20161206BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N9/42

   C12P7/06

【請求項の数】2

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2012-112904(P2012-112904)

(22)【出願日】2012年5月16日

(65)【公開番号】特開2013-236601(P2013-236601A)

(43)【公開日】2013年11月28日

【審査請求日】2015年5月13日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 １．研究集会名 ：日本農芸化学会２０１２年度（平成２４年度）大会 開催日 ：平成２４年３月２４日 公開者 ：加藤 康夫，荻田 信二郎，野村 泰治，星野 一宏，高野 真希 ２．ウェブサイトのアドレス： ｈｔｔｐ：／／ｊｓｂｂａ．ｂｉｏｗｅｂ．ｎｅ．ｊｐ／ｊｓｂｂａ２０１２／ｄｏｗｎｌｏａｄ＿ｐｄｆ．ｐｈｐ？ｐ＿ｃｏｄｅ＝３Ｂ０３ｐ０５ 公開者 ：加藤 康夫，荻田 信二郎，野村 泰治，星野 一宏，高野 真希 公開日 ：平成２４年３月５日

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０−２３年度，独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構（ＮＥＤＯ），「新エネルギー技術研究開発／バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発（先導技術開発）」委託研究，産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】515157758

【氏名又は名称】公立大学法人 富山県立大学

(73)【特許権者】

【識別番号】305060567

【氏名又は名称】国立大学法人富山大学

(74)【代理人】

【識別番号】100114074

【弁理士】

【氏名又は名称】大谷 嘉一

(72)【発明者】

【氏名】加藤 康夫

(72)【発明者】

【氏名】荻田 信二郎

(72)【発明者】

【氏名】野村 泰治

(72)【発明者】

【氏名】星野 一宏

(72)【発明者】

【氏名】高野 真希

【審査官】 濱田 光浩

(56)【参考文献】

【文献】 Amygdalin degradation by MUCOR CIRCINELLOIDES and Penicillium aurantiogriseum: mechanisms of hydrolysis.，Archives of Microbiology，１９９８年，169(2)，106-112

【文献】 The LINAMARASE of MUCOR CIRCINELLOIDES LU M40 and its detoxifying activity on cassava.，Journal of Applied Microbiology，１９９９年，86(2)

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ１２Ｎ ５／００

Ｃ１２Ｐ ７／００

Ｃ１２Ｎ ９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

糸状菌Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ由来のβ−グルコシダーゼであって、下記（１）又は（２）のアミノ酸配列を有するβ−グルコシダーゼ。
（１）配列番号７又は１４で示されるアミノ酸配列を有するβ−グルコシダーゼ
（２）配列番号７又は１４で示されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列を有するβ−グルコシダーゼ

【請求項2】

請求項１記載のβ−グルコシダーゼとエタノール発酵糸状菌とを作用させることを特徴とするエタノールの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、β−グルコシダーゼ及びこの酵素をコードする遺伝子並びに組換え酵素に関する。

【背景技術】

【0002】

バイオマス資源を炭素源としてエタノールを生産することが研究・開発されている。
特に近年、食料と競合しない草本系バイオマス、木質系バイオマスを原材料とすることが盛んに検討されている。
本願発明者らは、バイオマス資源として稲わらを用いて糸状菌Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ によるエタノール生産の研究を進めていた過程（特許文献１参照）にて本菌が稲わらの構成糖である５炭糖及び６炭糖の双方を発酵原料として利用可能なことに加え、各種セルロース分解酵素群も産生することを見出した。
セルロースはグルコースがβ−１，４グルコシド結合したポリマーであり、植物等の細胞壁構成成分等として知られている多糖である。
セルロースは、エンドβ−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ等のセルラーゼが共同して分解される。
エタノール発酵糸状菌を用いて、バイオマス資源から糖化発酵同時進行プロセスによるエタノール生産を検討した場合に本菌はβ−グルコシダーゼの産生が特に少なく、現状では市販の酵素を添加せざるを得ない。
そこで、本発明者らはエタノール発酵糸状菌由来のβ−グルコシターゼをコードする遺伝子を単離し、組換え酵素を得ることができれば、セルロース系バイオマスの糖化が効率的になることから本発明に至った。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２０１０−４６０２４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、エタノール耐性に優れたエタノール発酵糸状菌由来のβ−グルコシダーゼ及びこれをコードする遺伝子、並びに組換え酵素の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明に係るβ−グルコシダーゼは、下記（１）又は（２）のアミノ酸配列を有するβ−グルコシダーゼである。
（１）配列番号７又は１４で示されるアミノ酸配列を有するβ−グルコシダーゼ
（２）配列番号７又は１４で示されるアミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列を有するβ−グルコシダーゼ

【0006】

本発明に係るβ−グルコシダーゼは、例えば稲わらに糸状菌Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ ＮＢＲＣ４５７２株（独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生産遺伝資源部門提供のＮＢＲＣ４５７２株）を植菌培養した培養物から抽出及び単離することで得られる。
精製酵素の諸性質については後述するが、２種類の酵素が単離できた。
本明細書では、この２種類の酵素をＢＧＬ１、ＢＧＬ２と称する。
本発明者らは、精製した酵素のＮ−末端アミノ酸配列の解析と、別途行った本菌のゲノム配列解析結果から、それぞれ１個のβ−グルコシダーゼホモログを見出した。
そこで、この情報を元にして菌体から抽出したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡをクローニングし、組換え酵素の検討をしたので以下説明する。

【0007】

ＢＧＬ１をコードする遺伝子のクローニングの詳細は後述するが、精製酵素標品のＮ−末端アミノ酸配列と、Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ ＮＢＲＣ４５７２株（以下、本菌ともいう。）のゲノム解析の結果に基づいて、下記のプライマーを用いた。
ＢＧＬ１−ｆｏｒｗａｒｄ１：ｔｇｃｔａｔｃｔｃｔ ａｔｇｃｔａｇｔａｇ ｃｔｇｃｃ（配列番号１）
ＢＧＬ１−ｆｏｒｗａｒｄ２：ａｔｇｃｔａｇｔａｇ ｃｔｇｃｃａａｔｇｃ ｔｇｃｔａ（配列番号２）
ＢＧＬ１−ｒｅｖｅｒｓｅ１：ａｇｃｃｔａｇｔａｇ ｔｔｔａｔｔａａｇ（配列番号３）
ＢＧＬ１−ｒｅｖｅｒｓｅ２：ｇａａａａｔａｔｃｔ ａｇａｇｇｇｔａａａ ｇ（配列番号４）
本菌を培養して得られた本菌由来のｍＲＮＡに対して、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）を行い、ｃＤＮＡを取得した。
この取得したｃＤＮＡに対してプライマーＢＧＬ１−ｆｏｒｗａｒｄ１、ＢＧＬ１−ｒｅｖｅｒｓｅ１の組み合せにて１ｓｔＰＣＲを行い、次でＰＣＲ反応液に対してＢＧＬ１−ｆｏｒｗａｒｄ２、ＢＧＬ１−ｒｅｖｅｒｓｅ２の組み合せにてｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行うことでコード領域全長を含むｃＤＮＡ断片を単離した。
その結果、本菌由来のｃＤＮＡを８クローン得、シークエンシングしたところ、全て同じｃＤＮＡ配列であった。
これにより、ＢＧＬ１をコードする遺伝子のｃＤＮＡ配列が得られ、その塩基配列を配列番号５に示す。
また、本発明に係る遺伝子は、β−グルコシダーゼ活性を有する範囲において、配列番号５に示される塩基配列のうち、１個又は数個の塩基が付加、欠失又は置換されてもよい。
ＢＧＬ１のコドン対応アミノ酸配列を配列番号６に示し、アミノ酸配列を配列番号７にそれぞれ示す。
また、本発明に係るＢＧＬ１酵素は、β−グルコシダーゼ活性を有するものであれば、配列番号７のアミノ酸配列のうち、１個又は数個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されたものが含まれる。

【0008】

ＢＧＬ２をコードする遺伝子のクローニングには、精製単離した標品のＮ−末端アミノ酸配列と本菌のゲノム解析の結果に基づいて、下記のプライマーを設計し用いた。
ＢＧＬ２−ｆｏｒｗａｒｄ１：ｇｃｔａｔｃｔｃｔｇ ｔａｃｔａｇｔｔｇｃ ｔｇｃａａ（配列番号８）
ＢＧＬ２−ｆｏｒｗａｒｄ２：ａｃｔａｇｔｔｇｃｔ ｇｃａａａｔｇｃｃｇ ｃｔａｃｔ（配列番号９）
ＢＧＬ２−ｒｅｖｅｒｓｅ１：ｇｔｔｔａａｇａｇｇ ｔａｔｇｇａｔｔｇｔ（配列番号１０）
ＢＧＬ２−ｒｅｖｅｒｓｅ２：ｇａｇｇｔａｔｇｇａ ｔｔｇｔｇｃａｇｔｇ（配列番号１１）
本菌由来のｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行い、ｃＤＮＡを取得し、この取得したｃＤＮＡに対して、ＢＧＬ２−ｆｏｒｗａｒｄ１、ＢＧＬ２−ｒｅｖｅｒｓｅ１の組み合せで１ｓｔＰＣＲを行い、次いでＰＣＲ反応液に対して、ＢＧＬ２−ｆｏｒｗａｒｄ２、ＢＧＬ２−ｒｅｖｅｒｓｅ２の組み合せにてｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行うことで、コード領域全長を含むｃＤＮＡ断片を単離した。
その結果、本菌由来のｃＤＮＡを８クローン得、シークエンシングしたところ、全て同じｃＤＮＡ配列であった。
これにより、ＢＧＬ２をコードする遺伝子のｃＤＮＡ配列が得られ、その塩基配列を配列番号１２に示す。
また、コドン対応アミノ酸配列を配列番号１３に示し、アミノ酸配列を配列番号１４に示す。
なお、塩基又はアミノ酸のうち、１個又は数個が付加、欠失又は置換されてもよい点は、ＢＧＬ１にて説明したのと同様である。

【0009】

本発明に係るβ−グルコシダーゼＢＧＬ１、ＢＧＬ２の一次構造解析をした結果、両方とも糖質加水分析酵素のファミリー３に属していた。
ＢＧＬ１とＢＧＬ２との間の相同性は８１％であり、既知のタンパク質の中で最も相同性が高かったのは、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ由来のβ−グルコシターゼであったが、その値が５１％と低かった。
ＢＧＬ１とＢＧＬ２とは後述するが諸性質において相違する点があり、この２つの酵素はいずれも新規のβ−グルコシターゼである。
図９に上記３つの酵素間のマルチプルアラインメントを示す。網掛けしたアミノ酸残基は、ＢＧＬ１とＢＧＬ２とで異なっているものである。

【0010】

次に組換え酵素の発現を検討したので説明する。
ＢＧＬ１および２の全長アミノ酸配列と野生型精製酵素のＮ末端配列の比較によって推定されたシグナルペプチドを除いた成熟ポリペプチドを発現するように、当該配列を大腸菌発現ベクターｐＥＴ２８ａもしくはｐＣｏｌｄＩＩにサブクローニングした。
組換え酵素のＮ末端（ｐＥＴ２８ａおよびｐＣｏｌｄＩＩ）またはＣ末端側（ｐＥＴ２８のみ）にはヒスチジンタグ（６ｘＨｉｓ）を含むようにした。
組換えベクターを大腸菌ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ ＲＩＬ（ＤＥ３）（ｐＥＴ２８ａ使用の場合）またはＪＭ１０９（ｐＣｏｌｄＩＩ使用の場合）に導入し、得られた組換え大腸菌をＬＢ培地にてＯＤ_６６０＝０．６−０．８に達するまで３７℃、２００ｒｐｍで培養した後、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、１５℃、２００ｒｐｍで１８時間培養することで組換え酵素を発現させた。
発現誘導後の菌体を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に懸濁させて超音波処理を施し、得られた可溶性タンパク質画分をＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いたアフィニティークロマトグラフィーに供し、２００ｍＭのイミダゾールによって溶出された活性画分を精製組換え酵素とした。
精製した組換え酵素活性は、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、Ｇｌｕ−β−ｐＮＰ）を基質に用い、定法に従って測定した。
その結果、表１に示すようにＢＧＬ１およびＢＧＬ２の組換え酵素はいずれの場合にもβ−グルコシダーゼ活性を有していた。
なお、本発明に係る遺伝子を発現させ、宿主に導入することで形質転換体が得られるものであれば、大腸菌に限定されない。

【表1】

【発明の効果】

【0011】

本発明に係るβ−グルコシダーゼＢＧＬ１及びＢＧＬ２は、グルコース及びエタノールに対して耐性があり、例えば２０％エタノール存在下では、逆に活性化を示すことから例えばエタノール発酵菌を用いた同時糖化発酵システムの構築に有用である。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】ＢＧＬ１、ＢＧＬ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を示す。

【図2】ＢＧＬ１、ＢＧＬ２の至適ｐＨを示す。

【図3】ＢＧＬ１、ＢＧＬ２の安定ｐＨを示す。

【図4】ＢＧＬ１、ＢＧＬ２の至適温度を示す。

【図5】ＢＧＬ１、ＢＧＬ２の安定温度を示す。

【図6】ＢＧＬ１、ＢＧＬ２のグルコース耐性及びエタノール耐性を示す。

【図7】ＢＧＬ１、ＢＧＬ２のグルコースによる阻害の形式を示す。

【図8】ＢＧＬ１、ＢＧＬ２の糖転移活性のＴＬＣによる確認結果を示す。

【図9】ＢＧＬ１、ＢＧＬ２とＲＨ：Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ由来ＢＧＬのマルチプルアラインメントを示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素タンパク質を精製し、諸性質を調査したので以下説明する。
数センチの長さに切断した乾燥稲わら（コシヒカリ、平成２３年秋収穫）５５ｇをプラスチック容器に入れ、培地（０．０５％ 酵母エキス（日本製薬）、０．３５％ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．１％ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．０７５％ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．２％ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）２７５ｍＬを加え良く撹拌し、Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ ＮＢＲＣ４５７２菌糸の生理食塩水懸濁液５０ｍｌを植菌後、３０℃にて３日間静置培養した。
このようにして、得られた培養物（容器６個分）に、５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む純水３Ｌを加えて、氷冷下ブレンダーにて撹拌することで、菌体外に生産された酵素を抽出した。
抽出液をざる、３重にしたガーゼ、珪藻土（ラジオライト＃１０００）にて順次濾過して、粗酵素液計１０ｌを得た。
酵素精製は全て４℃にて行い、緩衝液として５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含むリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）ｐＨ６．０を用いた。
大型バケツに粗酵素液（１０ｌ）を入れ、１Ｍ ＮａＯＨ、１０ｍＭ ＫＰＢで再生・平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（２００ｍｌ）を入れ、メカニカルスターラーで一晩撹拌し、バッチ法で酵素を吸着させた。
吸引濾過にて樹脂を分離してカラムにつめ、１００ｍＭ ＫＰＢ、１００ｍＭ ＫＰＢ＋１００ｍＭ ＮａＣｌ（各１ｌ）にて順次溶出した。
後者で溶出される活性画分を集め、４５％飽和硫安にした。
酵素液を４５％飽和硫安の１００ｍＭ ＫＰＢで平衡化したＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（ゲル量２０ｍｌ）にのせ、１００ｍＭ ＫＰＢ中４５‐０％の飽和硫安の直線的グラジエント条件にて溶出し、活性画分を集めた。
限外濃縮した酵素液を１０ｍＭ ＫＰＢで透析後、１Ｍ ＮａＯＨ、１０ｍＭ ＫＰＢで再生・平衡化したＳｕｐｅｒＱ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（２０ｍｌ）にのせ、１００ｍＭ ＫＰＢ‐１００ｍＭ ＫＰＢ＋１００ｍＭ ＮａＣｌの直線的グラジエント条件にて溶出し、活性画分を集めた。
１０ｍＭ ＫＰＢにて透析後、限外濃縮し、得られた酵素液をＲｅｓｏｕｒｃｅＱ カラム（ＧＥヘルスケア）にのせ、２ｍｌ／ｍｉｎの流速で１０ｍＭ ＫＰＢ−５０ｍＭ ＫＰＢ＋１Ｍ ＮａＣｌの直線的なグラジエント条件にて溶出した。
これにより、フラクション＃１および＃２の二種類の精製酵素標品を得た。
表２に精製過程表を、図１に精製酵素標品のＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を示す。
精製酵素標品のＮ−末端アミノ酸配列は、＃１（ＢＧＬ２）がＫＶＫＶＬ、＃２（ＢＧＬ１）がＫＶＮＶＬであった。

【表2】

【0014】

次に上記で得られた２つの酵素の諸性質を調査したので説明する。
なお、β−グルコシダーゼ活性は、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｇｌｕ−β−ｐＮＰ）を基質として酵素反応を行い、加水分解により等モル生成するグルコースとアルカリ条件で黄色く発色するｐ−ニトロフェノールのうち、後者を定量するものである。
酵素液、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）１２．５μｌ、５００ｍＭ Ｇｌｕ−β−ｐＮＰ（ＤＭＳＯ溶液）１．２５μｌからなる反応液（全量１２５μｌ）を調製し、４０℃で３０分間静置して酵素反応を行った。
０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を２５μｌ加えて反応を停止し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
１２５μｌのｐ−ニトロフェノールの０．０１〜８０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液または酵素無添加反応液に０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を２５μｌ加え、各々の濃度と吸光度の検量線を作成し、これをもとにして酵素液中のβ−グルコシダーゼ活性を算出した。
酵素活性の１Ｕ＝１μｍｏｌ／ｍｉｎの反応生成物を生成する酵素量とした。
また、タンパク質の定量は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準タンパク質としＢｒａｄｆｏｒｄ法に従い行った。
タンパク質溶液５μｌにＰｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ試薬（Ｂｉｏ-Ｒａｄ）２５０μｌを加えて１５分間静置し、５９５ｎｍの吸光度を測定した。
別途、５μｌの０、０．０１１６、０．０５８、０．２９ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ水溶液に試薬２５０μＬを加え、ＢＳＡ濃度と吸光度の検量線を作成し、これを元に酵素液中のタンパク質含量を求めた。

【0015】

＜精製酵素標品のｎａｔｉｖｅ分子質量測定＞
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥヘルスケア社）を用い、移動相として５０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）＋１５０ｍＭ ＮａＣｌを用いて（流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ）分析した。
Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＨＭＷ（ＧＥヘルスケア社）を標品として用い、溶出時間と分子質量との検量線を作成し、精製酵素標品の溶出時間からｎａｔｉｖｅ分子質量を算出した。
その結果、ＢＧＬ１は約９１．０ｋＤａ、ＢＧＬ２は約８３．０ｋＤａと算出された（表３）。
＜精製酵素標品のｓｕｂｕｎｉｔ分子質量測定＞
Ｌａｅｍｍｌｉ法にてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を標品として用い、移動度と分子質量の検量線を作成し、精製酵素標品の移動度からｓｕｂｕｎｉｔ分子質量を算出した。
タンパク質の染色はクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ Ｒ−２５０）で行った。
その結果、ＢＧＬ１は約７８．５ｋＤａ、ＢＧＬ２は約７８．６ｋＤａと算出された（表３）。
＜精製酵素標品の糖鎖染色＞
糖鎖染色はＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ キット（Ｓｉｇｍａ社）を用いた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをＦｉｘｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５０％メタノール）に３０分浸し、２回水洗繰後、Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（過ヨウ素酸溶液）に３０分浸し、２回水洗した。
Ｓｃｈｉｆｆ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔに１時間浸した後、Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（メタ重亜硫酸ナトリウム溶液）に１時間浸し、赤いバンドが見えるまで水洗した。
ＢＧＬ１、２ともにタンパク質のバンドと同じ箇所が赤く染色され、両酵素とも糖タンパク質であることが示された（表３）。
＜精製酵素標品の酵素的脱糖鎖実験＞
以下の３種類の手法にて脱糖鎖反応を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析し、各々の分子質量を求めた。
・Ｎ−結合型糖鎖の脱糖鎖（ＮＥＢ社のＰＮＧａｓｅＦ推奨の反応プロトコールに準拠）
精製酵素標品９μｌに１μｌのＤｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加え、１００℃にて１０分間加熱して熱変性させた。
このものに各２μｌのＧ７ｂｕｆｆｅｒ、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、ＰＮＧａｓｅＦを加え、総量を２０μｌにし、３７℃にて５時間酵素反応を行った。
分子質量（ｋＤａ） ＢＧＬ１：６８．３ ＢＧＬ２：６９．９
・Ｏ−結合型糖鎖の脱糖鎖（ＮＥＢ社のＮｅｕｒａｍｉｍｉｎｉｄａｓｅ、Ｏ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ推奨の反応プロトコールに準拠）
精製酵素標品９μｌに各１μｌのＧ１ｂｕｆｆｅｒおよびＮｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅを加え、３７℃にて１時間反応後、２μｌのＤｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加えて１００℃にて１０分間熱変性させた。
各２μｌのＧ７ｂｕｆｆｅｒ、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、Ｏ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅを加え、総量を２０μｌにし、３７℃にて５時間酵素反応を行った。
分子質量（ｋＤａ） ＢＧＬ１：７２．９ ＢＧＬ２：７６．０
（バンドのブロードニングにより正確な分子質量を現していない）
・Ｎ，Ｏ−結合型糖鎖の脱糖鎖（上記二つの組合せ）
精製酵素標品９μｌに各１μｌのＧ１ ｂｕｆｆｅｒおよびＮｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅを加え、３７℃にて１時間反応後、２μｌのＤｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加えて１００℃にて１０分間熱変性させた。
各２μｌのＧ７ｂｕｆｆｅｒ、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、Ｏ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ、ＰＮＧａｓｅＦを加え、総量を２０μｌにし、３７℃にて５時間酵素反応を行った。
分子質量（ｋＤａ） ＢＧＬ１：６８．３ ＢＧＬ２：６９．９
・これらの実験により、ＢＧＬ１、２ともに１０ｋＤａ程度のＮ−結合型およびＯ−結合型両方の糖鎖を含むことが分かった（表３）。
＜至適ｐＨ＞
酵素液２μｌ、各ｐＨの５００ｍＭ緩衝液１２．５μｌ、５００ｍＭ Ｇｌｕ−β−ｐＮＰ１．２５μｌからなる反応液（全量１２５μｌ）を調製し、４０℃で３０分間酵素反応させた。
５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ９．０）を２５μｌ加えて反応を停止後、酵素活性を算出した。
用いた緩衝液は、グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５、３．０、４．０）、酢酸−酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５、４．０、４．５、４．８、５．０、５．５）、ＫＰＢ（ｐＨ６．０、７．０、７．５、８．０）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０、８．５、９．０）である。
結果は、ｐＨ５．０における酵素活性を１００％とした相対値にて示した（表３、図２）。
＜安定ｐＨ＞
酵素液２μｌに各ｐＨの５００ｍＭ緩衝液５μｌを加え、全量を２５μｌとしてよく混和し、３０℃で３０分間保温した。
このものに５００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）１２．５μｌ、５００ｍＭ Ｇｌｕ−β−ｐＮＰ１．２５μｌを加え、全量を１２５μｌとして、４０℃で３０分間酵素反応させた。
５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を２５μｌ加えて反応を停止後、酵素活性を算出した。
緩衝液は至適ｐＨ測定時と同じものを使用した。
結果は、ｐＨ５．０中で保温したときの残存活性を１００％とした相対値にて示した（表３、図３）。
＜至適温度＞
５００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）１２．５μｌ、５００ｍＭ Ｇｌｕ−β−ｐＮＰ１．２５μｌ、酵素液１μｌからなる反応液（全量１２５μｌ）を調製し、４〜６５℃にて３０分間酵素反応させた。
ただちに氷水中で冷却後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を２５μｌ加えることで反応を停止し、酵素活性を算出した。
結果は、４０℃における酵素活性を１００％とした相対値にて示した（表３、図４）。
＜安定温度＞
酵素液１μｌに５００ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ６．０）２．５μｌを加え、全量を２５μｌとして４〜６５℃にて３０分保温し、ただちに氷水で冷却した。
３０℃に戻し、５００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）１２．５μｌ、５００ｍＭ Ｇｌｕ−β−ｐＮＰ１．２５μｌを加え、全量を１２５μｌとして、４０℃にて３０分間酵素反応させた。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）２５μｌを加えることで反応を停止し、酵素活性を算出した。
結果は、未処理の酵素の活性を１００％とした相対値にて示した（表３、図５）。

【0016】

【表3】

【0017】

＜各種化合物の影響＞
１００ｍＭの各種化合物１．２５μｌ（終濃度１ｍＭ）、酵素液１μｌ、５００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）１２．５μｌ、５００ｍＭ Ｇｌｕ−β−ｐＮＰ１．２５μｌからなる反応液（全量１２５μｌ）を調製し、４０℃にて３０分間酵素反応させた。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）２５μｌを加えることで反応を停止し、酵素活性を算出した。
結果は、化合物無添加時の酵素活性を１００％とした相対値にて示した（表４）。

【0018】

【表4】

【0019】

＜基質特異性（ｐＮＰ型基質）＞
２５または２５０ｍＭの各基質２５μｌ、酵素液１または１０μｌ、５００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）１２．５μｌからなる反応液（全量１２５μｌ）を調製し、４０℃にて３０分間酵素反応させた。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）２５μｌを加えることで反応を停止し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、生成したｐ−ニトロフェノールを定量することで酵素活性を算出した。
結果は、終濃度５ｍＭのＧｌｕ−β−ｐＮＰを基質に用いたときの酵素活性を１００％とした相対値にて示した（表５）。

【0020】

【表5】

【0021】

＜基質特異性（ｐＮＰ以外のアリール型、アルキル型、サッカライド型基質）＞
２５または２５０ｍＭの各基質５μｌ、酵素液１または１０μｌ、５００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）２．５μｌからなる反応液（全量２５μｌ）を調製し、４０℃にて１〜２０時間酵素反応させた。
酵素反応液を２μｌとり、ラボアッセイグルコースキット（和光社）の発色試薬を３００μｌ加え、別途グルコース（０．６９５〜２７．８ｍＭ）溶液を用い、同様に発色させて作成した検量線から生成したグルコース量を定量し、酵素活性を測定した。
結果は、終濃度５ｍＭのＧｌｕ−β−ｐＮＰを基質に用いたときの酵素活性を１００％とした相対値にて示した（表５）。
＜速度定数（アリール型基質）＞
０．２５〜１００ｍＭのＧｌｕ−β−ｐＮＰもしくはｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド（Ｘｙｌ−β−ｐＮＰ）２５μｌ、酵素液１μｌ、５００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）１２．５μｌからなる反応液（全量１２５μｌ）を調製し、４０℃にて３０分間〜１４時間酵素反応させた。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）２５μｌを加えることで反応を停止し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、生成したｐ−ニトロフェノールを定量することで酵素活性を求め、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ Ｐｌｏｔから速度定数を算出した。
Ｇｌｕ−β−ｐＮＰに対する速度定数
Ｋ_ｍ（ｍＭ） ＢＧＬ１：０．２８３ ＢＧＬ２：０．９７５
Ｖ_ｍａｘ（Ｕ／ｍｇ） ＢＧＬ１：１３５ ＢＧＬ２：１５６
Ｘｙｌ−β−ｐＮＰに対する速度定数
Ｋ_ｍ（ｍＭ） ＢＧＬ１：１０．７ ＢＧＬ２：８．０３
Ｖ_ｍａｘ（Ｕ／ｍｇ） ＢＧＬ１：１４．３ ＢＧＬ２：１．６１
＜速度定数（セロビオース）＞
１．２５〜２５０ｍＭのセロビオース５μｌ、酵素液１μｌ、５００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）２．５μｌからなる反応液（全量２５μｌ）を調製し、４０℃にて４時間酵素反応させた。
酵素反応液を２μｌとり、ラボアッセイグルコースキット発色試薬を３００μｌ加え、生成したグルコース量を定量して酵素活性を求め、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ Ｐｌｏｔから速度定数を算出した。
またグラフから、最大活性の１／２にまで活性が低下するセロビオース濃度（基質阻害の度合い）をＢＧＬ１では＞５００ｍＭ、ＢＧＬ２では＞１２．５ｍＭと判定した（表３）。
セロビオースに対する速度定数
Ｋ_ｍ（ｍＭ） ＢＧＬ１：１０．１ ＢＧＬ２：４．５３
Ｖ_ｍａｘ（Ｕ／ｍｇ） ＢＧＬ１：５８３ ＢＧＬ２：５５１
＜グルコース、エタノールに対する耐性＞
０〜２００ｍＭのグルコース、または１〜５０％のエタノールの存在下、Ｇｌｕ−β−ｐＮＰを基質に用いて酵素反応を行い、酵素活性を算出した。
結果は、無添加時の酵素活性を１００％とした相対値にて示した。
グルコースの存在により活性が１／２に低下する濃度（生成物阻害）をＢＧＬ１では＞１２５ｍＭ、ＢＧＬ２では＞２５ｍＭと判定した。
また、２０％エタノール存在下では、ＢＧＬ１は１５０％、ＢＧＬ２は１２０％活性化されることが分かった（表３、図６）。
＜グルコースによる阻害形式＞
０〜８０ｍＭのグルコース存在下、１μｌの酵素液、５００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）１２．５μｌ、０．０５〜０．７５ｍＭのＧｌｕ−β−ｐＮＰを含む反応液（全量１２５μｌ）を調製し、４０℃にて３０分間酵素反応させた。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）２５μｌを加えることで反応を停止し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定して生成したｐ−ニトロフェノールを定量することで酵素活性を求め、各グルコース濃度におけるＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ Ｐｌｏｔの結果から、阻害の形式をＢＧＬ１、２ともに非拮抗型と判定した（表３、図７）。
＜界面活性剤に対する耐性＞
酵素に各種界面活性剤を終濃度１％加え、室温にて１．５もしくは２０時間保温後、Ｇｌｕ−β−ｐＮＰを基質に用いて酵素活性を測定した。
用いた界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、Ｂｒｉｄｇｅ ３５、ＳＤＳ、３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｅｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ（ＣＨＡＰＳ）、Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＣＴＡＢ）、Ｓｏｄｉｕｍ Ｎ−ｌａｕｒｙｌｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ （ＮＬＳ）、Ｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ、ｎ−Ｏｃｔｙｌ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅである。
結果は、無添加時の酵素活性を１００％とした相対値にて示した（表３、表６）。

【0022】

【表6】

【0023】

＜糖転移活性の検出＞
２００ｍＭのセロビオース３１．２５μｌ（終濃度５０ｍＭ）、酵素液５μｌ、５００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）１２．５μｌからなる反応液（全量１２５μｌ）を調製し、４０℃にて１〜２０時間酵素反応させた。
経時的にサンプリングしたものをシリカゲルＴＬＣにスポット後、ｎ−ｂｕｔｈａｎｏｌ／ＥｔＯＨ／水＝５／３／２にて展開し、１０％硫酸を含むＭｅＯＨを噴霧後、ホットプレートで加熱することで化合物を発色させ、セロビオース加水分解時の糖転移活性をみた。
ＢＧＬ１では反応開始後、糖転移活性により生じたセロオリゴ糖が若干蓄積するものの、セロオリゴ糖自身も良い基質となるため、反応を続けるとグルコースにまで分解された。
一方、ＢＧＬ２では、系内に蓄積したセロオリゴ糖の分解力が弱いためにセロオリゴ糖が系内に蓄積したままであった。
同じ組成の反応液を用い、ＥｔＯＨを１０および２０％共存下で酵素反応を行い、同様にＴＬＣにて反応生成物を定性的に分析することでＥｔＯＨへの糖転移活性をみた。
ＢＧＬ１、２ともにＥｔＯＨへの糖転移活性によりエチルグルコシド（Ｇｌｕ−ＯＥｔ）を生成するものの、両酵素ともにこの化合物を良い基質とし、最終的にはグルコースへと変換するため、エチルグルコシドの系内への著量蓄積は認められなかった（表３、図８）。

【0024】

次に酵素遺伝子の単離操作について説明する。
＜ＢＧＬ１の遺伝子単離操作＞
前述した方法にて培養したＭ．ｊａｖａｎｉｃｕｓの菌糸由来ｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行い、ｃＤＮＡを取得した。
このｃＤＮＡに対してＢＧＬ１−ｆｏｒｗａｒｄ１及びＢＧＬ１−ｒｅｖｅｒｓｅ１の組合せで１ｓｔＰＣＲを行い、次いでＰＣＲ反応液の５０倍希釈液に対してＢＧＬ１−ｆｏｒｗａｒｄ２及びＢＧＬ１−ｒｅｖｅｒｓｅ２の組合せでｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行い、コード領域全長を含むｃＤＮＡ断片を単離した。
その時の条件を下記に示す。
＜１ｓｔＰＣＲ反応液（２０μｌ）組成＞
鋳型ｃＤＮＡ １μｌ、１００ｐｍｏｌ／μｌプライマー（ＢＧＬ１−ｆｏｒｗａｒｄ１及びＢＧＬ１−ｒｅｖｅｒｓｅ１）各１μｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰ ２μｌ、１０ｘＢｌｅｎｄ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ、Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μｌ、水 １２．５μｌ
＜１ｓｔＰＣＲ反応サイクル＞
９４℃、９０秒の加熱の後、変性（９６℃、３０秒）→アニーリング（４５℃、１分）→伸長（７２℃、２分）の３ステップからなる反応サイクルを３５回行った。
＜ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ反応液（２０μｌ）組成＞
１ｓｔ−ＰＣＲ反応液（５０倍希釈）１μｌ、１００ｐｍｏｌ／μｌプライマー（ＢＧＬ１−ｆｏｒｗａｒｄ２、ＢＧＬ１−ｒｅｖｅｒｓｅ２）各１μｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰ ２μｌ、１０ｘＢｌｅｎｄ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ、Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μｌ、水 １２．５μｌ
＜ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ反応サイクル＞
９４℃、９０秒の加熱の後、変性（９６℃、３０秒）→アニーリング（６０℃、１分）→伸長（７２℃、２分）の３ステップからなる反応サイクルを３５回行った。
その結果、本菌由来のｃＤＮＡを８クローン得、シークエンシングしたところ全て同じｃＤＮＡ配列が得られた。
・ＢＧＬ１の遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号５に示す。
・また、コドン対応アミノ酸配列を配列番号６に示し、アミノ酸配列を配列番号７に示す。

【0025】

＜ＢＧＬ２の遺伝子単離操作＞
前述した方法にて培養したＭ．ｊａｖａｎｉｃｕｓの菌糸由来ｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行い、ｃＤＮＡを取得した。
このｃＤＮＡに対してＢＧＬ２−ｆｏｒｗａｒｄ１及びＢＧＬ２−ｒｅｖｅｒｓｅ１の組合せで１ｓｔＰＣＲを行い、次いでＰＣＲ反応液の５０倍希釈液に対してＢＧＬ２−ｆｏｒｗａｒｄ２及びＢＧＬ２−ｒｅｖｅｒｓｅ２の組合せでｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行い、コード領域全長を含むｃＤＮＡ断片を単離した。
その時の条件を下記に示す。
＜１ｓｔＰＣＲ反応液（２０μｌ）組成＞
鋳型ｃＤＮＡ １μｌ、１００ｐｍｏｌ／μｌプライマー（ＢＧＬ２−ｆｏｒｗａｒｄ１及びＢＧＬ２−ｒｅｖｅｒｓｅ１） 各１μｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰ ２μｌ、１０ｘＢｌｅｎｄ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ、Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μｌ、水 １２．５μｌ
＜１ｓｔＰＣＲ反応サイクル＞
９４℃、９０秒の加熱の後、変性（９６℃、３０秒）→アニーリング（５５℃、１分）→伸長（７２℃、２分）の３ステップからなる反応サイクルを３５回行った。
＜ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ反応液（２０μｌ）組成＞
１ｓｔ−ＰＣＲ反応液（５０倍希釈）１μｌ、１００ｐｍｏｌ／μｌプライマー（ＢＧＬ２−ｆｏｒｗａｒｄ２、ＢＧＬ２−ｒｅｖｅｒｓｅ２）各１μｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰ ２μｌ、１０ｘＢｌｅｎｄ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ、Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μｌ、水 １２．５μｌ
＜ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ反応サイクル＞
９４℃、９０秒の加熱の後、変性（９６℃、３０秒）→アニーリング（６０℃、１分）→伸長（７２℃、２分）の３ステップからなる反応サイクルを３５回行った。
その結果、本菌由来のｃＤＮＡを８クローン得、シークエンシングしたところ全て同じｃＤＮＡ配列が得られた。
・ＢＧＬ２の遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１２に示す。
・また、コドン対応アミノ酸配列を配列番号１３に示し、アミノ酸配列を配列番号１４に示す。

【0026】

このようにして単離したＢＧＬ１、ＢＧＬ２の遺伝子を用いた組換え酵素については、段落（００１０）にて説明したとおりである。

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図1】

【図8】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]