特許 6044923 新規ＰＩポリアミド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6044923

(24)【登録日】2016年11月25日

(45)【発行日】2016年12月14日

(54)【発明の名称】新規ＰＩポリアミド

(51)【国際特許分類】

   C07D 403/14 20060101AFI20161206BHJP

   A61K 31/4178 20060101ALI20161206BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20161206BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20161206BHJP

   A61P 13/08 20060101ALI20161206BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20161206BHJP

【ＦＩ】

   C07D403/14CSP

   A61K31/4178ZNA

   A61P43/00 111

   A61P35/00

   A61P13/08

   !C12N15/00 A

【請求項の数】4

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2012-106382(P2012-106382)

(22)【出願日】2012年5月8日

(65)【公開番号】特開2013-234135(P2013-234135A)

(43)【公開日】2013年11月21日

【審査請求日】2015年5月1日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 「第７回 日本大学先端バイオフォーラム プログラム・抄録集」 「２７ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ＥＡＵ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ２０１２」掲載アドレス（平成２４年１月２４日掲載） ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｒｏｗｅｂ．ｏｒｇ／ｅｖｅｎｔｓ／ａｂｓｔｒａｃｔｓ−ｏｎｌｉｎｅ／？ＡＩＤ＝３６３０５ 「第２１回 泌尿器科分子・細胞研究会 プログラム・抄録集」 私立大学戦略的研究基盤形成支援事業「ゲノム化学に基づく先進医療開発研究拠点」平成２３年度報告会 プログラム 「日本泌尿器科学会雑誌 Ｖｏｌ．１０３ Ｎｏ．２ 総会特集号 ＭＡＲＣＨ ２０１２」（平成２４年３月２０日 社団法人日本泌尿器科学会 発行）

(73)【特許権者】

【識別番号】899000057

【氏名又は名称】学校法人日本大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000774

【氏名又は名称】特許業務法人 もえぎ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】大日方 大亮

(72)【発明者】

【氏名】高橋 悟

(72)【発明者】

【氏名】福田 昇

(72)【発明者】

【氏名】藤原 恭子

【審査官】 伊藤 佑一

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００９／００４２９６５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Christian DOSE et al.，Next Generation Hairpin Polyamides with (R)-3,4-Diaminobutyric Acid Turn Unit，Journal of the American Chemical Society，２００８年，Vol.130，pp.6859-6866

【文献】 Nicholas G. NICKOLS et al.，Suppression of Androgen Receptor-mediated Gene Expression by a Sequence-specific DNA-bindig Polyamid，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，２００７年，Vol.104, No.25，pp.10418-10423

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ

Ａ６１Ｋ

Ｃ０８Ｇ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

次の式１〜４のいずれかに示されるピロール−イミダゾール ポリアミド。
［式１］

［式２］

［式３］

［式４］

【請求項2】

請求項１に記載のピロール−イミダゾール ポリアミドを有効成分として含む、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子の発現抑制剤。

【請求項3】

請求項１に記載のピロール−イミダゾール ポリアミドを有効成分として含むＥＺＨ２遺伝子の発現抑制剤。

【請求項4】

請求項１に記載のピロール−イミダゾール ポリアミドを有効成分として含む前立腺癌の予防または治療剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規のピロール−イミダゾール ポリアミド（以下、ＰＩポリアミドと示す場合がある）に関する。さらに詳しくは、アンドロゲン応答遺伝子であるＴＭＰＲＳＳ２遺伝子と、転写制御因子であるＥＴＳ ｆａｍｉｌｙに属するＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子の発現を抑制する新規のＰＩポリアミドに関する。

【背景技術】

【0002】

ステロイドホルモンのひとつとであるアンドロゲンと、この受容体であるアンドロゲンレセプター（Ａｎｄｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＡＲ（以下、ＡＲと示す場合がある））は、前立腺細胞において、その増殖、さらには癌化に密接に関与していることが知られている。
そこで、前立腺癌の治療法のひとつとして、アンドロゲン除去療法が行われてきた。アンドロゲン除去療法は、ＡＲの作用を抑制することにより、前立腺癌の進行を抑制させる方法である。しかし、この治療法では、治療が進むに従って、癌化した前立腺細胞の形質が変化するため効果がなくなり、その後の治療が困難であるという問題があった。

【0003】

近年、正常な前立腺細胞において発現しているアンドロゲン応答遺伝子のＴＭＰＲＳＳ２遺伝子が、細胞増殖・分化に関与するとともに、細胞の癌化に重要な役割を果たしているＥＴＳ ｆａｍｉｌｙの遺伝子と融合することによって、前立腺細胞におけるアンドロゲン感受性を変化させ、細胞の癌化や癌の悪性度の進行等に影響を与えていることが報告されている（非特許文献１）。ＥＴＳ ｆａｍｉｌｙの遺伝子としては、ＥＲＧ遺伝子、ＥＴＶ１遺伝子、ＥＴＶ４遺伝子またはＥＴＶ５遺伝子等が知られており、これらの遺伝子によってコードされるタンパク質は細胞の増殖、細胞周期、アポトーシス等の調節に作用する。

【0004】

また、前立腺細胞において、ＡＲがＴＭＰＲＳＳ２遺伝子およびＥＲＧ遺伝子の塩基配列上に存在するＡＲ結合配列（ＡＲ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ；ＡＲＥ（以下、ＡＲＥと示す場合がある））と結合する際に、ＡＲＥに隣接する共通の塩基配列（Ｂｒｅａｋ ｆｕｓｉｏｎ ｓｉｔｅｓ）で切断が起こり、互いに結合することで、遺伝子転座が起こることも近年報告されている（非特許文献２）。
すなわち、ＡＲは、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子の発現をアンドロゲン依存的に促進させるだけでなく、前立腺癌細胞の発生、増殖に有利な環境を作っている可能性が考えられる。

【0005】

そこで、これらの融合遺伝子や、融合遺伝子の発現によって起こる、ＥＲＧ遺伝子の過剰発現の有無を調べることにより、前立腺癌を検出する方法や、干渉性ＲＮＡやアンチセンス核酸を投与して、これらの遺伝子の発現を不安定化することによって前立腺癌を治療する方法、癌化した細胞に細胞毒性遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを投与することによって前立腺癌を治療する方法等が開示されている（特許文献１〜４）。
しかし、干渉性ＲＮＡやアンチセンス核酸は生体内で分解され易く、安定性が低い。また、生体内において細胞毒性遺伝子産物を発現させる方法は、必ずしも安全とはいえず、これらの治療方法は前立腺癌の治療において十分な方法とはいえなかった。

【0006】

本発明者らは、本発明において、前立腺癌の治療に有効であり、かつ、安定で安全な物質を得るためにＰＩポリアミドに着目した。
ＰＩポリアミドとは、芳香族アミノ酸であるＮ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｅ（Ｎ−メチルピロール（以下、Ｐｙと示す場合がある））、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ（Ｎ−メチルイミダゾール（以下、Ｉｍと示す場合がある））で構成される、ＤＮＡに配列特異的に結合する物質のことである（非特許文献３）。
このうちＩｍ／ＰｙペアはＤＮＡにおけるＧ・Ｃを認識し、Ｐｙ／ＰｙペアはＴ・ＡおよびＡ・Ｔを認識する。ＰＩポリアミドはＤＮＡに高い親和性を有し、Ｉｍ／ＰｙとＰｙ／Ｐｙの組み合わせ次第で、多様な配列のＤＮＡに結合させることができる。また、生体内において分解されず、干渉性ＲＮＡ等と比べて安定性が高いという利点もある。

【0007】

そこで、腫瘍で高発現している遺伝子を標的とした様々なＰＩポリアミドが開発されており、抗腫瘍効果を示すことが確認されている（非特許文献４）。
例えば、ヒトの悪性腫瘍において過剰発現が報告されているオーロラキナーゼＡおよびオーロラキナーゼＢの遺伝子を標的として、これらの発現量を制御することを目的とした、ＰＩポリアミドを含む薬剤等も開示されている（特許文献５）。この文献において、この薬剤の対象となり得る悪性腫瘍のひとつとして前立腺癌を挙げている。しかし、ここで示されている薬剤は、前立腺癌に特異的な遺伝子の発現を制御することを目的とするものではない。従って、前立腺癌の予防、治療等において、より有効かつ安全で安定した薬剤の提供が望まれている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特表２０１０−５０５４４６号公報

【特許文献2】特表２０１１−５１８５５２号公報

【特許文献3】特表２００９−５０７４９２号公報

【特許文献4】特表２０１０−５３２６６３号公報

【特許文献5】特開２０１１−２６２０３号公報

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｔｏｍｌｉｎｓ ＳＡ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０：６４４−６４８， ２００５

【非特許文献2】Ｌｉｎ Ｃ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ １３９：１０４７−１０４９， ２００９

【非特許文献3】Ｃｈｏ Ｊ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ９２：１０３８９−１０３９２， １９９５

【非特許文献4】Ｗａｎｇ Ｘ，ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ １０１：７５９−７６６，２０１０

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

前立腺癌の予防、治療に有用かつ安全で安定した薬剤の提供を課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、アンドロゲン応答遺伝子であるＴＭＰＲＳＳ２遺伝子と、転写制御因子であるＥＴＳ ｆａｍｉｌｙに属するＥＲＧ遺伝子との融合を抑制する新規のＰＩポリアミドを得るに至った。
本発明者らは、本発明において、このＰＩポリアミドが、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子の発現を抑制し、また、この融合遺伝子の発現に伴って起こるＥＺＨ２遺伝子の発現も抑制できるＰＩポリアミドであることを確認するとともに、前立腺癌の予防、治療等に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0012】

すなわち、本発明は次の（１）〜（５）のＰＩポリアミド、該ＰＩポリアミドを有効成分とする融合遺伝子の発現抑制剤等に関する。
（１）配列表配列番号１に示される塩基配列の全部または一部に結合するＰＩポリアミド。
（２）次の式１〜４のいずれかに示される、上記（１）に記載のＰＩポリアミド。
［式１］

［式２］

［式３］

［式４］

（３）上記（１）または（２）に記載のＰＩポリアミドを有効成分として含む、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子の発現抑制剤。
（４）上記（１）または（２）に記載のＰＩポリアミドを有効成分として含むＥＺＨ２遺伝子の発現抑制剤。
（５）上記（１）または（２）に記載のＰＩポリアミドを有効成分として含む前立腺癌の予防および／または治療剤。

【発明の効果】

【0013】

本発明のＰＩポリアミドを提供することによって、前立腺癌の予防、治療に有用かつ安全で安定した薬剤を開発することが容易となる。生体内での安定性が高く、組織、細胞への移行性も高い、本発明のＰＩポリアミドを有効成分とする薬剤は、前立腺癌の予防、治療に効果的な薬剤となり得る。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子およびＥＲＧ遺伝子における共通の塩基配列（配列表配列番号１）に対するＰＩポリアミド（１）の結合の様子を模式的に示した図である。

【図2】ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子における共通の塩基配列（配列表配列番号１）に対するＰＩポリアミド（２）〜（４）の結合の様子を模式的に示した図である。

【図3】ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子およびＥＲＧ遺伝子における共通の塩基配列（配列表配列番号１）、ＡＲＥの塩基配列（配列表配列番号２）および各ＰＩポリアミドの結合部位を示した図である（実施例）。

【図4】ＰＩポリアミドにおけるＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙの結果を示した図である（実施例）。

【図5】ＰＩポリアミドを導入した細胞における融合遺伝子またはＥＲＧ遺伝子の発現の検討結果を示した図である（試験例１）。

【図6】ＰＩポリアミドを導入した細胞における細胞増殖能の評価結果を確認した図である（試験例２）。

【図7】細胞遊走能の評価における各ＰＩポリアミドを導入した細胞の顕微鏡写真を示した図である（試験例３）。

【図8】ＰＩポリアミドを導入した細胞における細胞遊走能の評価結果を確認した図である（試験例３）。

【図9】ＰＩポリアミドを導入した細胞におけるＥＺＨ２遺伝子の発現量の検討結果を示した図である（試験例４）。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明の「ＰＩポリアミド」には、配列表配列番号１に示される塩基配列の全部または一部を認識して結合するＰＩポリアミドであればいずれのものも含まれる。
この配列表配列番号１に示される塩基配列は、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子に含まれる塩基配列、およびＥＲＧ遺伝子に含まれる塩基配列であって、これらの遺伝子に共通の塩基配列である。

【0016】

本発明の「ＰＩポリアミド」は、例えば、配列表配列番号１に示される塩基配列がＴＭＰＲＳＳ２遺伝子上に２つ以上複数連続して、または、複数近接して存在する場合に、５’側に存在する配列表配列番号１に示される塩基配列の全部または一部と、その下流に存在する配列表配列番号１に示される塩基配列の全部または一部とをいずれも認識して結合するＰＩポリアミドであってもよい。

【0017】

このような本発明の「ＰＩポリアミド」は、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子に含まれる配列表配列番号１に示される塩基配列の全部または一部および／またはＥＲＧ遺伝子に含まれる配列表配列番号１に示される塩基配列の全部または一部を認識して結合することにより、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子の発現を抑制するためのＰＩポリアミドとして利用することもできる。
また、本発明の「ＰＩポリアミド」は、本発明の「ＰＩポリアミド」が結合する前に、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子が融合してしまった場合でも融合遺伝子に結合することで、その後のＥＲＧ遺伝子の過剰発現を抑制することも可能である。

【0018】

このような本発明の「ＰＩポリアミド」として、例えば、次の式１〜式４に示されるＰＩポリアミドを挙げることができる。このうち式１に示されるＰＩポリアミド（１）は、配列表配列番号１に示される塩基配列の全部を認識して結合するＰＩポリアミドである。図１に、このＰＩポリアミド（１）のＴＭＰＲＳＳ２遺伝子およびＥＲＧ遺伝子における共通の塩基配列（配列表配列番号１）に対する結合の様子を模式的に示した。

【0019】

また、式２に示されるＰＩポリアミド（２）、式３に示されるＰＩポリアミド（３）および式４に示されるＰＩポリアミド（４）はいずれも配列表配列番号１に示される塩基配列の一部を認識して結合するＰＩポリアミドである。これらのポリアミドはいずれもＴＭＰＲＳＳ２遺伝子上に２つ並んで存在する配列表配列番号１の塩基配列を１分子で認識できるＰＩポリアミドである。図２に、これらのＰＩポリアミドのＴＭＰＲＳＳ２遺伝子における共通の塩基配列（配列表配列番号１）に対する結合の様子をそれぞれ模式的に示した。
本発明の「ＰＩポリアミド」は、これらの式１〜式４に示されるＰＩポリアミドに限らず、上記のような特性を有する「ＰＩポリアミド」であればいずれのものであってもよく、従来知られている方法により、独自に設計して作製した「ＰＩポリアミド」も含まれる。

【0020】

［式１］

【0021】

［式２］

【0022】

［式３］

【0023】

［式４］

【0024】

本発明の「ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子の発現抑制剤」とは、本発明のＰＩポリアミドを有効成分として含む剤であって、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子と、ＥＲＧ遺伝子との融合を抑制し、これらの融合遺伝子の発現を抑制する剤のことをいう。
ここで、「発現抑制」とは、例えば、前立腺癌細胞等の「ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子の発現」が起こる細胞に本発明の該発現抑制剤を付与した場合に、本発明の該発現抑制剤を付与しない場合と比べて、これらの融合遺伝子の発現が低下する状態のことをいう。この融合遺伝子の発現の低下には、融合遺伝子がまったく発現しない場合も含まれる。
このような本発明の「ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子の発現抑制剤」は、本発明のＰＩポリアミドを有効成分として含む剤であればよく、本発明のＰＩポリアミドのみからなる剤でも、その他薬学的に許容される成分等を含む剤であっても良い。
有効成分として含まれるＰＩポリアミドは、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子に含まれる配列表配列番号１に示される塩基配列の全部または一部および／またはＥＲＧ遺伝子に含まれる配列表配列番号１に示される塩基配列の全部または一部を認識して結合するＰＩポリアミドであることが特に好ましい。

【0025】

本発明の「ＥＺＨ２遺伝子の発現抑制剤」とは、本発明のＰＩポリアミドを有効成分として含む剤であって、ＥＺＨ２遺伝子の発現を抑制する剤のことをいう。
ＥＺＨ２遺伝子は、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子が発現することにより、ＥＲＧ遺伝子が過剰発現したことことに伴って、発現量が増加する遺伝子であり、アンドロゲン非依存的に前立腺癌細胞の増殖に作用することが示唆されている。
ここで、「発現抑制」とは、例えば、前立腺癌細胞等の「ＥＺＨ２遺伝子の発現」が起こる細胞に本発明の該発現抑制剤を付与した場合に、本発明の該発現抑制剤を付与しない場合と比べて、ＥＺＨ２遺伝子の発現が低下する状態のことをいう。このＥＺＨ２遺伝子の発現の低下には、ＥＺＨ２遺伝子がまったく発現しない場合も含まれる。
このような本発明の「ＥＺＨ２遺伝子の発現抑制剤」は、本発明のＰＩポリアミドを有効成分として含む剤であればよく、本発明のＰＩポリアミドのみからなる剤でも、その他薬学的に許容される成分等を含む剤であっても良い。

【0026】

本発明の「前立腺癌の予防および／または治療剤」とは、本発明のＰＩポリアミドを有効成分として含む剤であって、前立腺癌の予防、前立腺癌の治療、または前立腺癌の予防および治療に有用な剤のことをいう。
このような本発明の「前立腺癌の予防および／または治療剤」は、本発明のＰＩポリアミドを有効成分として含む剤であればよく、本発明のＰＩポリアミドのみからなる剤でも、その他薬学的に許容される成分等を含む剤であっても良い。
このような本発明の剤は、前立腺癌を発症する可能性が高いヒトに発症前に投与したり、前立腺癌を発症した後に、癌の進行を抑制したり、癌を完寛させたりすることを目的として投与することができる。

【0027】

以下、実施例、試験例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【実施例】

【0028】

＜ＰＩポリアミドの作製＞
１．ＰＩポリアミドの設計
ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子およびＥＲＧ遺伝子に存在する共通の塩基配列（Ｂｒｅａｋ ｆｕｓｉｏｎ ｓｉｔｅｓ）（配列表配列番号１）の全部または一部に結合するように、次の（１）〜（４）の４つのＰＩポリアミドをそれぞれ設計した。
また、これらとの比較のために、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子およびＥＲＧ遺伝子に存在する共通の塩基配列（配列表配列番号１）の全部または一部に結合しないＰＩポリアミド（コントロール）も設計した。

【0029】

図３にＴＭＰＲＳＳ２遺伝子およびＥＲＧ遺伝子の塩基配列における共通の塩基配列、ＡＲＥの塩基配列（配列表配列番号２）および各ＰＩポリアミドの結合部位を示した。
図３において、赤色のアンダーラインで示された箇所がＴＭＰＲＳＳ２遺伝子およびＥＲＧ遺伝子の塩基配列における共通の塩基配列であり、青色のアンダーラインで示された箇所がＡＲＥの塩基配列であり、緑色のアンダーラインで示された箇所が各ＰＩポリアミドの結合部位である。
また、下式における各記号は次の意味を示す（Ａｃ：アセチル、Ｐｙ：ピロール、Ｉｍ：イミダゾール、β：β−アラニン、γ：γ−酪酸、Ｄｐ：Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン）。

【0030】

ＰＩポリアミド（１）
図３に、ＰＩ ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（１）として緑色のアンダーラインで示した塩基配列（表１、ＰＩポリアミド（１））を標的塩基配列として認識するように、ＡｃＰｙＩｍβＩｍＩｍＩｍγＰｙＰｙＰｙβＩｍＰｙＰｙβＤｐのＰＩポリアミドを設計した。このＰＩポリアミドは以下の式（式１）に示されるものであり、化学式はＣ₇₅Ｈ₉₄Ｎ₃₁Ｏ₁₅、分子量は１６６９．７５であった。

【0031】

［式１］

【0032】

ＰＩポリアミド（２）
図３に、ＰＩ ｐｏｌｙａｍｉｄｅ （２）として緑色のアンダーラインで示した塩基配列（表１、ＰＩポリアミド（２））を標的塩基配列として認識するように、ＡｃＰｙＰｙＰｙβＰｙＰｙγＰｙＩｍβＩｍＩｍＩｍβＤｐのＰＩポリアミドを設計した。このＰＩポリアミドは以下の式（式２）に示されるものであり、の化学式はＣ₇₆Ｈ₉₅Ｎ₃₀Ｏ₁₅、分子量は１６６８．７６であった。

【0033】

［式２］

【0034】

ＰＩポリアミド（３）
図３に、ＰＩ ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（３）として緑色のアンダーラインで示した塩基配列（表１、ＰＩポリアミド（３））を標的塩基配列として認識するように、ＡｃＩｍＩｍＩｍβＰｙＩｍγＰｙＰｙβＰｙＰｙＰｙβＤｐのＰＩポリアミドを設計した。このＰＩポリアミドは以下の式（式３）に示されるものであり、化学式はＣ₇₆Ｈ₉₅Ｎ₃₀Ｏ₁₅、分子量は１６６８．７６であった。

【0035】

［式３］

【0036】

ＰＩポリアミド（４）
図３に、ＰＩ ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（４）として緑色のアンダーラインで示した塩基配列（表１、ＰＩポリアミド（４））を標的塩基配列として認識するように、ＡｃＰｙＰｙβＰｙＰｙＰｙγＩｍＩｍＩｍβＰｙＩｍβＤｐのＰＩポリアミドを設計した。このＰＩポリアミドは以下の式（式４）に示されるものであり、化学式はＣ₇₆Ｈ₉₅Ｎ₃₀Ｏ₁₅、分子量は１６６８．７６であった。

【0037】

［式４］

【0038】

ＰＩポリアミド（コントロール）
ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子およびＥＲＧ遺伝子に存在する共通の塩基配列（配列表配列番号１）の全部または一部に結合しないＰＩポリアミド（コントロール）として、表１、ＰＩポリアミド（コントロール）に示した塩基配列を標的塩基配列として認識するようにＡｃＰｙＰｙＰｙＩｍβＩｍγＰｙβＰｙＩｍβＩｍβＤｐのＰＩポリアミドを設計した。このＰＩポリアミドは以下の式（式５）に示されるものであり、化学式はＣ₇₃Ｈ₉₄Ｎ₂₉Ｏ₁₅、分子量は１６１７．７１であった。

【0039】

［式５］

【0040】

【表1】

【0041】

２．ＰＩポリアミドの合成
＜ＨＣＴＵを用いたピロールイミダゾールポリアミドの合成＞
ＨＣＴＵ（ペプチド研究所製）を縮合活性化剤として、上記１．で設計したＰＩポリアミド（１）〜（４）（４種）およびＰＩポリアミド（コントロール）をそれぞれ合成した。

【0042】

１）試薬の調製
（１）モノマー
ＦｍｏｃＰｙＣＯＯＨ（Ｗａｋｏ，２０ｍｇ）、ＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨ（Ｗａｋｏ，４０ｍｇ）、Ｆｍｏｃ−γ−Ａｂｕ−ＯＨ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１７．５ｍｇ）およびＦｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１７．５ｍｇ）をそれぞれ、合成するＰＩポリアミドごとに必要なカップリング分用意し、レジンに対してＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨを２当量、それ以外を４当量ずつ秤量し、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移した。さらにＨＣＴＵをＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨのチューブに４５ｍｇ、それ以外のチューブには２２．５ｍｇをそれぞれ加えた。また、ＮＭＰ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ製）をＦｍｏｃＩｍＣＯＯＨのチューブに５００μＬ、それ以外のチューブには２５０μＬ加えボルテックスおよび１時間静置し完全に溶解させた。
（２）合成用試薬
合成機による合成のために、表２に記載の試薬を調製して用いた。

【0043】

【表2】

【0044】

３．レジンの調製
Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｗａｎｇ−Ｒｅｓｉｎ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）をＳｍａｌｌ Ｌｉｂｒａ Ｔｕｂｅ（ＨｉＰｅｐ研究所製）に４０ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）取り、ペプチド合成機にセットした。これにＮＭＰ１ｍＬを加え、２０分間膨潤させた。

【0045】

４．ペプチド合成（自動）
上記１．で調製したＤＩＥＡを縮合活性化剤として合成機（ＰＳＳＭ−８；島津製作所製）にインストールした。また、先に準備しておいた各モノマーの入ったチューブをＣ末端から順番通りに合成機内ラックに配置した。ＰＳＳＭ−８の合成プログラムをセットし、合成機をスタートさせ、Ｈ₂ＮＡｃＰｙＩｍβＩｍＩｍＩｍγＰｙＰｙＰｙβＩｍＰｙＰｙβ−Ｒｅｓｉｎ、Ｈ₂ＮＡｃＰｙＰｙＰｙβＰｙＰｙγＰｙＩｍβＩｍＩｍＩｍβ−Ｒｅｓｉｎ、Ｈ₂ＮＡｃＩｍＩｍＩｍβＰｙＩｍγＰｙＰｙβＰｙＰｙＰｙβ−Ｒｅｓｉｎ、Ｈ₂ＮＡｃＰｙＰｙβＰｙＰｙＰｙγＩｍＩｍＩｍβＰｙＩｍβ−ＲｅｓｉｎまたはＨ₂ＮＡｃＰｙＰｙＰｙＩｍβＩｍγＰｙβＰｙＩｍβＩｍβ−Ｒｅｓｉｎまで、次の（１）〜（４）の反応サイクルを繰り返すことで自動合成を行った。

【0046】

反応サイクル
（１）カップリング処理を、上記活性化剤を用いてＮＭＰ中で３０分間行った。
（２）余剰のモノマーおよび活性化剤を除くため、１ｍＬのＮＭＰによるレジンの洗浄を５回繰り返した。
（３）Ｆｍｏｃ脱保護溶液（３０％Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ／ＮＭＰ）を１ｍＬ加え３分間反応させ、溶液を除去後、再び同じサイクルを繰り返した。
（４）Ｆｍｏｃ脱保護溶液を除くため１ｍＬのＮＭＰによるレジンの洗浄を５回繰り返し（１）に戻った。目的産物が得られるまでこのサイクルを繰り返した。

【0047】

５．精製
合成機からレジンを取り出し、洗浄、乾燥の後、ネジ式キャップのエッペンドルフチューブに移した。これにＮ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅｄｉａｍｉｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ製，２ｍＬ）を５００μＬ加えてヒートブロックにより５５℃で一晩加熱することにより、レジンからポリアミドの切り出しを行った。反応液をＬｉｂｒａ Ｔｕｂｅに移し、濾過によりレジンを取り除き、レジンに付着している残りの反応液をＮＭＰ１ｍＬおよびメタノール１ｍＬで回収した。
溶媒を留去後、ＨＰＬＣ（０．１％ＡｃＯＨ：ＣＨ₃ＣＮ＝１００：０〜０：１００，３０ｍｉｎ）で分取精製した。分取精製の後、凍結乾燥をして、上記１．で設計したＰＩポリアミド（４種）およびＰＩポリアミド（コントロール）をそれぞれ得た。

【0048】

６．ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙ
上記５において生成したＰＩポリアミド（１）〜（４）（４種）について、次の１）および２）の工程によるＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙにより、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子およびＥＲＧ遺伝子への結合をそれぞれ確認した。また、ＰＩポリアミド（コントロール）についても同様に、各遺伝子への結合の有無を調べた。

【0049】

１）ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子およびＥＲＧ遺伝子の共通の塩基配列（配列表配列番号１）と同じ塩基配列を含むＴＭＰＲＳＳ２ オリゴＤＮＡにＦＩＴＣをラベルした分子（４７ｂｐ）、および同塩基配列を含むＥＲＧ オリゴＤＮＡにＦＩＴＣをラベルした分子（５９ｂｐ）を作成し、終濃度１μＭの各オリゴをアニーリングバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，２００ｍＭ ＮａＣｌ）中で１００℃に熱し、その後２時間かけて段階的に３０℃まで冷却した。これにより、各オリゴＤＮＡは自己アニーリングし、ヘアピン状の２本鎖を形成する。
２）上記１）のヘアピン状の２本鎖ＤＮＡを含む溶液１５μｌに０．２ｍＭのＰＩポリアミド（１）〜（４）またはＰＩポリアミド（コントロール）をそれぞれ５μｌ混合し、３７℃で１時間インキュベートして混合液を得た。
３）上記（２）の混合液を５−２０％ アクリルアミドゲル（ＴＢＥ バッファー）にて電気泳動しＬＡＳ ４０００（ＧＥヘルスケア・ジャパン製）にて泳動像を観察し、泳動度の違いから結合の有無を判定した。

【0050】

その結果、図４に示したようにＴＭＰＲＳＳ２ オリゴＤＮＡにおいても、ＥＲＧ オリゴＤＮＡにおいても、本発明のＰＩポリアミド（１）を加えた場合（図４、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（１））はＰＩポリアミド（コントロール）を加えた場合（図４、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ））やＰＩポリアミドを加えていない溶媒のみの場合（図４、Ｖｅｈｉｃｌｅ）と比べて泳動の遅れが見られ、ＰＩポリアミド（１）がＴＭＰＲＳＳ２ オリゴＤＮＡおよびＥＲＧ オリゴＤＮＡのいずれにもに結合することが確認できた。ＰＩポリアミド（２）、ＰＩポリアミド（３）およびＰＩポリアミド（４）においても、ＰＩポリアミド（１）の結果と同様の結果が得られた。

【0051】

［試験例］
次の試験例１〜４により、本発明のＰＩポリアミドによる、前立腺癌細胞（ＬＭＣａＰ）に対する効果を確認した。なお、各試験例における共通の試料として、次の試料を同様に調製して使用した。

【0052】

＜試料＞
１．ＰＩポリアミド
実施例と同様の方法によって合成したＰＩポリアミド（１）〜（４）（４種）およびＰＩポリアミド（コントロール）を使用した。
これらの各ＰＩポリアミドを蒸留水に溶解したものを、細胞を培養している培地に添加することで細胞への導入を行った。

【0053】

２．前立腺癌細胞ＬＮＣａＰ
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手したヒト前立腺癌細胞ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣナンバー：ＣＲＬ−１７４）を用いた。

【0054】

３．培地
（１）フェノールレッド含有培地
フェノールレッド含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、カタログナンバーＲ７５０９）５００ｍＬに、チャコール処理を行った牛血清（ＦＢＳ）を５０ｍｌ添加したものをフェノールレッド含有培地として用いた。
（２）フェノールレッド非含有培地
フェノールレッド非含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、カタログナンバーＲ８７５８）５００ｍに、チャコール処理を行った牛血清（ＦＢＳ）を１２．５ｍｌ添加したものをフェノールレッド非含有培地として用いた。

【0055】

４．ＤＨＴ（デヒドロテストステロン）（和光純薬）
エタノール（ＥｔＯＨ）で、１００ｎＭに溶解したＤＨＴをアンドロゲン刺激のために用いた。

【0056】

［試験例１］
融合遺伝子またはＥＲＧ遺伝子の発現の検討
ＲＴ−ＰＣＲにより、ＰＩポリアミド（１）〜（４）をそれぞれ導入した細胞における融合遺伝子の発現、およびＥＲＧ遺伝子の過剰発現の有無を検討した。比較として、ＰＩポリアミド（コントロール）を導入した細胞においても同様に検討した。
１）ＰＩポリアミドの導入およびｃＤＮＡの調製
各ＰＩポリアミドを１μＭまたは５μＭとなるように添加した上記３．（２）のフェノールレッド非含有培地でＬＮＣａＰ細胞を３日間培養した。その後、上記４．のＤＨＴ（１００ｎＭ）を培地内に添加し、アンドロゲン刺激を加えた。
この細胞から、アイソゲン（ニッポンジーン製）を用いてマニュアルに従って、ＲＮＡを抽出した後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴａＫａＲａ製）を用いてｃＤＮＡを調製した。

【0057】

２）ＲＴ−ＰＣＲ
上記１）で調製したｃＤＮＡをそれぞれ鋳型ＤＮＡとして、表３に示したプライマーにより、各ＰＩポリアミドを導入した前立腺癌細胞における融合遺伝子またはＥＲＧ遺伝子の発現の有無を調べた。このＲＴ−ｑＰＣＲにおいて、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステム製）を使用した。

【0058】

【表3】

【0059】

その結果、図５に示したように、本発明のＰＩポリアミド（１）を導入した細胞においては（図５、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（１）１μＭ、５μＭ）、アンドロゲン刺激を与えても、導入したＰＩポリアミドの濃度依存的にＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子（図５、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ）およびＥＲＧ遺伝子（図５、ＥＲＧ）の発現が抑制されることが確認できた。一方、ＰＩポリアミド（コントロール）を導入した細胞においては、いずれの遺伝子の発現も抑制されなかった（図５、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ））。ＰＩポリアミド（２）、ＰＩポリアミド（３）およびＰＩポリアミド（４）においても、ＰＩポリアミド（１）の結果と同様の結果が得られた。

【0060】

［試験例２］
細胞増殖能の評価
各ＰＩポリアミドを導入した細胞、および、比較としてＰＩポリアミド（コントロール）を導入した細胞を培養し、ＭＴＳアッセイによって各細胞の増殖能を検討した。
すなわち、このＬＮＣａＰ細胞を全部で５０００細胞となるように９６ウェルプレートに播き、各ＰＩポリアミドを１μＭまたは５μＭとなるように添加した上記３．（２）のフェノールレッド非含有培地で３日間培養した。その後、上記４．のＤＨＴ（１００ｎＭ）を培地内に添加し、アンドロゲン刺激を加えた。刺激後、それぞれ２４時間、４８時間または９６時間培養した。指定された刺激時間後、各細胞にＭＴＳ試薬（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を１０μｌ添加して１時間インキュベートした。その後、各細胞の吸光度（４９０ｎｍ）を測定し、培養後の細胞数を調べることで、細胞増殖能を評価した。

【0061】

その結果、図６に示したように、ＰＩポリアミド（コントロール）を導入した細胞（図６、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ））に対し、本発明のＰＩポリアミド（１）を導入した細胞（図６、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（１）１μＭ、５μＭ）では、９６時間培養した段階で有意に増殖が抑制されることが確認できた（図６、^＊：ｐ＜０．０５）。ＰＩポリアミド（２）、ＰＩポリアミド（３）およびＰＩポリアミド（４）においても、ＰＩポリアミド（１）の結果と同様の結果が得られた。

【0062】

［試験例３］
細胞遊走能の評価
各ＰＩポリアミドを導入した細胞、および、比較としてＰＩポリアミド（コントロール）を導入した細胞を培養し、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｅｒ Ｉｎｓｅｒｔと、８．０μｍ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ ＰＥＴ ｆｉｌｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）を用いてＣｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ アッセイによって各細胞の遊走能を検討した。
すなわち、培養皿にＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈したフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ製）を３０分間作用させ、下層フィルターを作成した後、下層チャンバーに上記３．（１）のフェノールレッド含有培地ＲＰＭＩ １６４０培地を７００μｌ加えた。
各ＰＩポリアミドを５μＭとなるように添加した添加した上記３．（１）のフェノールレッド含有培地で３日間培養したＬＮＣａＰ細胞を５×１０⁴細胞ごとに分け、各細胞を３００μｌの上記３．（１）のフェノールレッド含有培地に懸濁したものをそれぞれ上層チャンバーに加えた。これを、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で２４時間培養した後、フィルターを剥がした。
下層フィルター上の細胞を３０分間メタノールで固定した後、ＰＢＳで洗浄し、Ｇｉｍｓａ’ｓ ｓｔａｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｕｔｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）で３０秒間インキュベートした。その後、細胞を２００倍率の顕微鏡で観察し、細胞数を数えることで、細胞遊走能を評価した。

【0063】

図７に各ＰＩポリアミドを添加した細胞の顕微鏡写真を示した。また、各ＰＩポリアミドを添加した細胞における遊走した細胞数を図８に示した。その結果、図７および図８に示したように、本発明のＰＩポリアミド（１）を導入した細胞においては（図７、８、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（１））、ＰＩポリアミド（コントロール）を導入した細胞（図７、８（Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ））に比べて、細胞の遊走能（浸潤能）が顕著に抑制されることが確認できた（図８、^＊＊＊：ｐ＜０．００００１）。ＰＩポリアミド（２）、ＰＩポリアミド（３）およびＰＩポリアミド（４）においても、ＰＩポリアミド（１）の結果と同様の結果が得られた。

【0064】

［試験例４］
ＥＺＨ２遺伝子の発現量の検討
前立腺癌の進行に作用するポリコーム群タンパク質であるＥＺＨ２をコードする遺伝子についても、本発明の各ＰＩポリアミドを導入した細胞における遺伝子の発現量を検討した。比較として、ＰＩポリアミド（コントロール）を導入した細胞においても同様に検討した。

【0065】

１）ＰＩポリアミドの導入およびｃＤＮＡの調製
各ＰＩポリアミドを１μＭまたは５μＭとなるように添加した上記３．（２）のフェノールレッド非含有培地でＬＮＣａＰ細胞を３日間培養した。その後、上記４．のＤＨＴ（１００ｎＭ）を培地内に添加し、アンドロゲン刺激を加えた後、さらに２日間（４８時間）培養した。
この細胞から、アイソゲン（ニッポンジーン製）を用いてマニュアルに従って、ＲＮＡを抽出した後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴａＫａＲａ製）を用いてｃＤＮＡを調製した。

【0066】

２）ＲＴ−ｑＰＣＲ
上記１）で調製したｃＤＮＡをそれぞれ鋳型ＤＮＡとして、配列表配列番号１９（ＥＺＨ２ ＲＴ−ｑＰＣＲ ｆｗ、フォワードプライマー）および配列表配列番号２０（ＥＺＨ２ ＲＴ−ｑＰＣＲ ｒｅｖ、リバースプライマー）に示したプライマーにより、各ＰＩポリアミドを導入した前立腺癌細胞におけるＥＺＨ２遺伝子の発現量を調べた。このＲＴ−ｑＰＣＲにおいて、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステム製）を使用した。

【0067】

その結果、図９に示したように、本発明のＰＩポリアミド（１）を導入した細胞においては（図９、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（１）１μＭ、５μＭ）、導入していない細胞（図９、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ））に比べてＥＺＨ２遺伝子の発現が抑制されることが確認できた。

【産業上の利用可能性】

【0068】

本発明のＰＩポリアミドを提供することによって、前立腺癌の予防、治療に有用かつ安全で安定した薬剤を開発することが容易となる。また、前立腺癌に限らず、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子とＥＲＧ遺伝子との融合遺伝子の発現を原因とする疾病や、ＥＺＨ２遺伝子の発現を原因とする疾病等に対し、これらの遺伝子の発現を制御できる効果的な薬剤の提供も可能となる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図5】

【図6】

【図8】

【図9】

【図4】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]