特許 6046032 ＰＩ１６に結合するタンパク質とその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6046032

(24)【登録日】2016年11月25日

(45)【発行日】2016年12月14日

(54)【発明の名称】ＰＩ１６に結合するタンパク質とその利用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20161206BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20161206BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20161206BHJP

   C12N 5/20 20060101ALI20161206BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20161206BHJP

   C12N 15/02 20060101ALI20161206BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20161206BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20161206BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20161206BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20161206BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20161206BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/28ZNA

   C07K16/46

   C12N5/10

   C12N5/20

   C12N15/00 A

   C12N15/00 C

   A61K39/395 P

   A61P17/00

   A61P29/00

   A61P43/00 111

   G01N33/53 D

   G01N33/53 Y

【請求項の数】16

【全頁数】113

(21)【出願番号】特願2013-504067(P2013-504067)

(86)(22)【出願日】2011年4月18日

(65)【公表番号】特表2013-527836(P2013-527836A)

(43)【公表日】2013年7月4日

(86)【国際出願番号】AU2011000498

(87)【国際公開番号】WO2011127543

(87)【国際公開日】20111020

【審査請求日】2014年4月8日

(31)【優先権主張番号】61/426,019

(32)【優先日】2010年12月22日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/325,093

(32)【優先日】2010年4月16日

(33)【優先権主張国】US

【微生物の受託番号】ATCC  PTA-10685

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】515292901

【氏名又は名称】メドヴェット・サイエンス・ピーティーワイ・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】サイモン・バリー

(72)【発明者】

【氏名】ドリーン・クルムビーゲル

(72)【発明者】

【氏名】ニコラ・ガ−リング・イースタッフ−レウン

(72)【発明者】

【氏名】イアン・キャメロン・ニコールソン

(72)【発明者】

【氏名】ヘディー・ゾラ

【審査官】 原 大樹

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００５−５２３７２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／１４０４７２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Endocrine Reviews，２００８年，Vol.29, No.7，p.865-897

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １／００−５／２８

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ／ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）

ＪＳＴｐｌｕｓ／ＪＭＥＤｐｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ペプチダーゼインヒビター１６（ＰＩ１６）と結合することができる２つのモノクローナル抗体可変領域を含む単離タンパク質であって、前記可変領域のうちの１つが抗体重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）でありもう一つが抗体軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）であり、前記タンパク質がまた、ＰＴＡ−１０６８５の受託番号でＡＴＣＣに寄託されたＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマにより産生された抗体のＰＩ１６への結合を競合的に阻害することができ、且つ
（ｉ）前記可変領域が、非ヒト可変領域であり、ＰＴＡ−１０６８５の受託番号でＡＴＣＣに寄託されたＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマにより産生された抗体のものと同一の、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む；または
（ｉｉ）前記可変領域が、配列番号８に記載された配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びに配列番号１０に記載された配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む
単離タンパク質。

【請求項2】

キメラ抗体、脱免疫化抗体、またはヒト化抗体である、請求項１に記載のタンパク質。

【請求項3】

ＰＴＡ−１０６８５の受託番号でＡＴＣＣに寄託されたＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマにより産生された抗体である、単離タンパク質。

【請求項4】

前記タンパク質と複合体化する化合物を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項5】

前記化合物が、放射性同位体、検出可能な標識物質、治療用化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象中で前記タンパク質の半減期を増加させる化合物、および、それらのうちの２つ以上の混合物からなる群より選択される、請求項４に記載のタンパク質。

【請求項6】

請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質と薬剤的に許容可能な担体とを含む組成物。

【請求項7】

請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質をその上に固定化する固形担体または半固形担体。

【請求項8】

請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質を発現する単離細胞。

【請求項9】

ＰＴＡ−１０６８５の受託番号でＡＴＣＣに寄託されたＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマである請求項８に記載の細胞。

【請求項10】

試料中のペプチダーゼインヒビター１６（ＰＩ１６）またはＰＩ１６発現細胞を検出する方法であって、前記方法は、試料を請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項６に記載の組成物または請求項７に記載の固形担体もしくは半固形担体に接触させて、タンパク質が試料中の、もし存在するならば、ＰＩ１６に結合するようにすること、および、結合タンパク質を検出することを含む方法。

【請求項11】

前記細胞が制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記Ｔｒｅｇ細胞が内在性Ｔｒｅｇ細胞である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

内在性制御性Ｔ（ｎＴｒｅｇ）細胞を誘導性Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）細胞と区別する方法であって、前記方法がＴｒｅｇ細胞を含む試料を請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項６に記載の組成物または請求項７に記載の固形担体もしくは半固形担体に接触させて、タンパク質が試料中のＰＩ１６発現Ｔｒｅｇ細胞に結合するようにすること、および、ＰＩ１６発現Ｔｒｅｇ細胞を検出することを含み、前記ＰＩ１６発現Ｔｒｅｇ細胞がｎＴｒｅｇ細胞である方法。

【請求項14】

細胞を単離する方法であって、前記方法が、請求項１１または１２に記載の方法を実施することにより細胞を検出すること、および、検出した細胞を単離することまたは請求項１３に記載の方法を実施することによりｎＴｒｅｇ細胞を区別して、前記区別したｎＴｒｅｇ細胞を単離することを含む方法。

【請求項15】

ＰＩ１６発現細胞が濃縮されている細胞集団を産生する方法であって、前記方法がＰＩ１６発現細胞を含む細胞集団を請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質または請求項６に記載の組成物または請求項７に記載の固形担体もしくは半固形担体に接触させて、タンパク質が試料中のＰＩ１６発現細胞に結合するようにすること、および、前記タンパク質と結合する細胞を選択することを含む方法。

【請求項16】

前記濃縮細胞が制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞である、請求項１４または１５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

参照による援用
本願は、２０１０年４月１６日に出願された「ＰＩ１６に結合するタンパク質とその利用法」という表題の米国仮出願第６１／３２５０９３号、および、２０１０年１２月２２日に出願された「ＰＩ１６に結合するタンパク質とその利用法２」という表題の米国仮出願第６１／２４６０１９号からの優先権を主張する。これらの出願の両方の全体を参照により本明細書に援用する。

【0002】

技術分野
本発明は、ＰＩ１６に結合するタンパク質とその利用に関する。本開示はまた制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞に関係する症状の診断／予後予測／治療／予防の方法に関する。

【背景技術】

【0003】

制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞はＣＤ４とＣＤ２５の両方の発現、および、フォークヘッド／ウィングド転写因子であるＦｏｘＰ３の発現を特徴とする。マウスで最初に特徴が調べられたのだが、マウスではそれらはリンパ節と脾臓のＣＤ４^＋Ｔ細胞集団の約６〜１０％を構成し、ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞の約５〜１０％がＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞である（ＷｉｎｇおよびＳａｋａｇｕｃｈｉ，２０１０年）。以下で詳細に考察するように、Ｔｒｅｇ細胞はＣＤ４^＋Ｔ細胞、および、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活動を抑制する能力を有する。

【0004】

Ｔｒｅｇ細胞をいくつかのサブセットに分けることができる（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅら，２０００年）。Ｔｒｅｇ細胞の１つのサブセットは胸腺で発生する（内在性Ｔｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）細胞としても知られる）。そして、これらの胸腺由来Ｔｒｅｇ細胞はサイトカイン非依存的な機構により機能し、その機構には細胞間の接触が関与する（Ｓｈｅｖａｃｈ，２００２年）。これらの細胞は自己免疫寛容の誘導と維持、および、自己免疫状態の防止に必須である（Ｓｈｅｖａｃｈ，２０００年、Ｓａｌｏｍｏｎら，２０００年、Ｓａｋａｇｕｃｈｉら，２００１年）。これらの制御性細胞は、胸腺による除去を免れた、または、胸腺外抗原を認識する自己反応性Ｔ細胞の活性化と増殖を防ぎ、そして、結果として、恒常性の維持、および、免疫制御、ならびに、自己免疫状態の発生に対する宿主の防御に重要である（Ｓｕｒｉ−Ｐａｙｅｒら，１９９６年、Ａｓａｎｏ，１９９６年、Ｗｉｌｌｅｒｆｏｒｄら，１９９５年、Ｓａｌｏｍｏｎら，２０００年）。

【0005】

成熟した末梢ＣＤ４^＋Ｔ細胞を活性化することによりＴｒｅｇ細胞を作製することもできる（これらの細胞は誘導性Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）細胞として知られる。）。生体外で、例えば、成長因子に曝露することにより、および、インビボで、例えば、胃腸管でこれらの細胞を作製することができる。末梢血由来Ｔｒｅｇ細胞は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、および、ＩＬ−１０のような免疫抑制性サイトカインを産生することによりそれらの細胞の阻害的活性を媒介することが研究により示されている（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ，２００２年、Ｎａｋａｍｕｒａ，２００１年）。これらのＴｒｅｇ細胞は、抗原特異的活性化の後、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、または、ＣＤ８^＋Ｔ細胞のどちらかの増殖を非特異的に抑制することができる（Ｂａｅｃｈｅｒ−Ａｌｌａｎ，２００１年）。自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）と共に培養されるとき、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞は抗ＣＤ３抗体によるＴ細胞の刺激を阻害することができることが研究により示されている（例えば、Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，２００１年、Ｔａａｍｓ，２００１年）。

【0006】

ｎＴｒｅｇ細胞とｉＴｒｅｇ細胞の両方が制御性活性を持つ一方、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ、Ｋｏｅｎｅｃｋｅら，２００９年）の最近の研究において、ｉＴｒｅｇ細胞がインビボでこの活性を失うことが示された。対照的に、ｎＴｒｅｇ細胞はその制御性活性を維持し、そして、ＧＶＨＤの発生を防ぐ。したがって、ｎＴｒｅｇ細胞集団の同定／単離が可能であることが望ましい。

【0007】

Ｔｒｅｇ細胞の免疫調節性活性は接触依存的であり得る、または、Ｔｒｅｇ細胞はパーフォリン、もしくは、グランザイム依存的な方法で、または、免疫抑制性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１０、および／もしくは、ＴＧＦ−βの分泌によりＣＤ４^＋Ｔ細胞、および、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を殺すことができる（Ｄｅｊａｃｏら，２００５年に概説される。）。

【0008】

Ｔｒｅｇ細胞、および、自己免疫状態／自己免疫寛容
様々なマウス系統からＴｒｅｇ細胞を除去することで甲状腺炎、卵巣炎、胃炎、または、炎症性腸疾患を含む様々な組織特異的自己免疫疾患になることが示されている（Ａｓａｎｏ，１９９６年、Ｓｕｒｉ−Ｐａｙｅｒ，１９９８年、および、ＭｃＨｕｇｈ，２００２年）。さらに、ＦｏｘＰ３遺伝子に変異を持つヒトの患者はＴｒｅｇ細胞を産生することができず、そして、自己免疫性多腺性内分泌障害（特に、１型糖尿病、および、甲状腺機能低下症）、および、（免疫調節不全、多腺性内分泌障害、腸疾患、伴性（ＩＰＥＸ）症候群として集約される）腸疾患を発生する。ＦｏｘＰ３の多型は自己免疫性糖尿病に関係する（Ｂａｓｓｕｎｙら，２００３年）。さらに、ＦｏｘＰ３欠損マウスはＩＰＥＸ様の症候群を発生する（Ｄｅｊａｃｏら，２００５年を参照のこと。）。

【0009】

表１に示されるように、様々な疾患を患う対象で循環血液中のＴｒｅｇ細胞のレベルが減少している。さらに、これらの細胞のレベルが低くなるほど、疾患活動性が高く、および／または、予後が悪い。

【表1】

【0010】

ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞のレベルの上昇が炎症部位で、例えば、若年性特発性関節炎、リウマチ性関節炎、脊椎関節炎、および、感染を患う対象で観察される（Ｄｅｊａｃｏら，２００５年に概説される。）。これらの細胞は局所的な免疫反応を調節して、例えば、付随組織損傷を防ぐとされている。

【0011】

ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の養子移入がこれらの疾患の発生を防ぎ、そして、いくつかのモデルでは発症後にこれらの疾患を治すことができる（Ｍｏｔｔｅｔら，２００３年）。Ｓｕｒｉ−Ｐａｙｅｒら（１９９８年）はまた、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞が自己抗原特異的Ｔ細胞クローンにより誘導される自己免疫状態を防ぐことができ得ることを発見した。ヌードマウスへのＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞の移入はまた自己免疫疾患を発生することになるが、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の共移入によりその自己免疫疾患を防ぐことができる（Ｓａｋａｇｕｃｈｉら，１９９５年）。

【0012】

Ｔａｎｇら（２００４年）は、Ｔｒｅｇ細胞はまた自己免疫疾患の治療に有用であることを証明した。筆者らは非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスからＴｒｅｇ細胞を単離し、自己抗原に特異的なＴＣＲ遺伝子導入細胞を増殖させた。ＮＯＤマウスへのこれらの細胞の養子移入は新規の形質移入マウスの糖尿病を好転させた。

【0013】

Ｔｒｅｎａｄｏによる研究（２００２年）はまた、生体外で活性化し、そして、増殖させたＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の点滴によりマウスでの急性致死移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）がかなり抑制されることを証明した。Ｔｒｅｇ細胞はまたげっ歯類で同種移植片拒絶を抑制し、心臓同種移植片（Ｖａｎ Ｍａｕｒｉｋ，２００２年）、または、膵島同種移植片（Ｇｒｅｇｏｒｉ，２００１年）を長期にわたり生存させることが示された。

【0014】

上で述べたことに基づくと、自己免疫疾患の治療、もしくは、予防、もしくは、対象における免疫寛容の誘導にとってＴｒｅｇ細胞は魅力的であること、または、Ｔｒｅｇ細胞の循環レベルを検出することがそれらの疾患の診断、もしくは、予後予測に有益であることは当業者にとって明らかであるであろう。しかしながら、Ｔｒｅｇ細胞の単離を可能にするマーカーが不十分であるため、動物モデルの結果をヒトの状況に移入させることに困難が生じている。今まで、他のＴ細胞からＴｒｅｇ細胞を明確に区別する唯一のマーカーはＦｏｘＰ３である。ＦｏｘＰ３は細胞内タンパク質であり、そして、その結果として、生きているＴｒｅｇ細胞を単離するためのマーカーとしては有用ではない。したがって、例えば、診断目的で、および／または、治療目的で、および／または、予防目的でＴｒｅｇ細胞の検出、および／または、単離を可能にするＴｒｅｇ細胞の新規のマーカー、好ましくは、細胞表面マーカーが当該技術分野において必要である。

【0015】

Ｔｒｅｇ細胞と免疫反応の誘導
Ｔｒｅｇ細胞はまた癌患者の腫瘍浸潤リンパ球、末梢血リンパ球、および／または、所属リンパ節リンパ球の中に著しく高い割合で存在する。細胞の頻度は腫瘍の進行度に関連し、治療効果と逆相関する。したがって、免疫反応を抑制するＴｒｅｇ細胞の能力は腫瘍細胞を殺す免疫系の能力を抑制するように見える。

【0016】

Ｗａｎｇら（２００４年）はＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）をヒトの黒色腫患者から単離した。このＴＩＬは腫瘍／自己抗原であるＬＡＧＥ−１を認識した。卵巣癌の患者の腹水からＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＴＩＬが単離されており、これらの細胞がＴ細胞活性を抑制し得ることが示された（Ｃｕｒｉｅｌら，２００４年）。

【0017】

Ｔｒｅｇ細胞集団を取り除くことがまた注入された腫瘍細胞の排除をかなり改善することも示されている。例えば、Ｊｏｎｅｓら（２００２年）では、モノクローナル抗体治療を用いるＣＤ２５発現Ｔ細胞の除去が黒色腫細胞に対する長期にわたるＣＤ４＋Ｔ細胞介在性免疫を促進した。その筆者らは、マウスが、抗ＣＤ２５抗体処理の後に、マウスにおける腫瘍増殖の阻害に付随する自己抗原（チロシナーゼ）に対する免疫反応を発達させたことを示した。

【0018】

Ｇｏｆｏｒｔｈら（２００８年）はまた、抗原性腫瘍溶解物および免疫刺激性ＣｐＧオリゴヌクレオチドで負荷された乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）粒子が抗原提示細胞を効率よく活性化し、それらはマクロファージと樹状細胞のリソソーム内小胞に取り込まれたことを示した。免疫刺激性抗原負荷粒子（ＩＳＡＰ）での免疫によりＴ細胞が顕著に増殖することとなったが、しかし、既存の黒色腫の腫瘍増殖はわずかに抑制されるだけであった。ＣＤ２５^＋細胞が抗ＣＤ２５抗体で抑制されるとき、ＩＳＡＰでの免疫は予防モデルにおいて完全な抗原特異的免疫状態を誘導した。これらの発見は、特に自己抗原に対する免疫の前に、および／または、免疫中にＴｒｅｇ細胞の活性を抑制することが必要である、または、抑制することが望ましい可能性があることを示唆する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0019】

【非特許文献1】Wing and Sakaguchi, Nature Immunology, 11: 7-13, 2010

【非特許文献2】Bluestone et al., Nat. Rev. Immunol., 3: 253, 2000

【非特許文献3】Shevach, Nature Rev. Immunol 2:389, 2002

【非特許文献4】Shevach, Annu. Rev. Immunol. 18:423-449, 2000

【非特許文献5】Salomon et al, Immunity 12:431-440, 2000

【非特許文献6】Sakaguchi et al, Immunol. Rev. 182:18- 32, 2001

【非特許文献7】Suri-Payer et al, J. Immunol. 157:1799-1805, 1996

【非特許文献8】Asano et al, J. Exp. Med. 184:387-396, 1996

【非特許文献9】Willerford et al, Immunity 3:521-530, 1995

【非特許文献10】Kingsley et al, J. Immunol. 168:1080, 2002

【非特許文献11】Nakamura et al, J. Exp. Med. 194:629-644, 2001

【非特許文献12】Baecher-Allan et al, J. Immunol. 167:1245-1253, 2001

【非特許文献13】Stephens et al, Eur. J. Immunol. 31:1247-1254, 2001

【非特許文献14】Taams et al, Eur. J. Immunol. 31:1122-1131, 2001

【非特許文献15】Koenecke et al., Eur J Immunol. 39):3091-3096, 2009

【非特許文献16】Dejaco et al., Immunology, 117: 289-300, 2005

【非特許文献17】Suri-Payer et al., J. Immunol., 160: 1212-1218, 1998

【非特許文献18】McHugh et al., J. Immunol., 168: 5979-5983, 2002

【非特許文献19】Bassuny et al., Immunogenetics ,55: 149-156, 2003

【非特許文献20】Mottet et al., J. Immunol., 170: 3939-3943, 2003

【非特許文献21】Sakaguchi et al., Nature, 426: 454-460, 1995

【非特許文献22】Tang et al., J. Exp. Med., 199: 1455-1465, 2004

【非特許文献23】Trenado et al., J. Clin.Invest., 112: 1688-1696, 2002

【非特許文献24】Van Maurik J. Immunol. 169: 5401-5404, 2002

【非特許文献25】Gregori et al., J Immunol. 167: 1945-1953, 2001

【非特許文献26】Wang et al., Immunity 20: 107-118, 2004

【非特許文献27】Curiel et al., Nat. Med., 10: 942-949, 2004

【非特許文献28】Jones et al., Cancer Immun. 22;2:1, 2002

【非特許文献29】Goforth et al., Cancer Immunol Immunother. 2008

【非特許文献30】Robb et al., J Exp Med 154: 1455-1474, 1981

【非特許文献31】Zola et al., Immunol Cell Biol., 67: 233-237, 1989

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0020】

Ｔｒｅｇ細胞の除去が、例えば、自己抗原、または、非自己抗原に対する免疫反応を改善する魅力的な方法を提供することが先の考察から明らかであるであろう。しかしながら、上で考察したように、Ｔｒｅｇ細胞を除去することを可能にするマーカーが不十分であることがこれらの細胞を標的とする治療戦略を妨げてきた。例えば、細胞表面マーカーＣＤ２５はＴｒｅｇ細胞でよく発現し、そして、これらの細胞を単離する、または、標的とするために伝統的に使用されてきたが、一方、このタンパク質はまた、活性型Ｂ細胞、いくつかの胸腺細胞、骨髄前駆細胞、および、オリゴデンドロサイトに加えて他のＴ細胞集団（例えば、活性型Ｔ細胞）で発現する（例えば、Ｒｏｂｂら，１９８１年、および、Ｚｏｌａら，１９８９年を参照のこと）。したがって、例えば、診断目的で、予後予測目的で、治療目的で、および／または、予防目的でＴｒｅｇ細胞の検出と単離、または、Ｔｒｅｇ細胞の除去と破壊を可能にする新規のマーカー、好ましくは、細胞表面マーカーが当該分野において必要である。

【課題を解決するための手段】

【0021】

本発明をもたらした研究において、本発明者らはＴｒｅｇ細胞の新しい細胞表面マーカーを同定しようと努めた。本発明者らは、ヘルパーＴ細胞のようなその他のＴ細胞と比較してＴｒｅｇ細胞で発現が上昇するペプチダーゼインヒビター１６（ＰＩ１６）を同定した。本発明者らはまた、ＰＩ１６の発現がＴｒｅｇ細胞転写因子ＦｏｘＰ３と相関することを明らかにした。これらのデータに基づき、ＰＩ１６はＴｒｅｇ細胞のバイオマーカーであると本発明者らは結論した。本発明者らは次にＰＩ１６に結合できるタンパク質を作製した。例えば、本発明者らは、一連のモノクローナル抗体を作製し、そのうちの１つは細胞表面のＰＩ１６に結合し、そして、Ｔｒｅｇ細胞の細胞表面マーカーを発現する細胞集団を単離する能力を持つことを明らかにした。このモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをＣＲＣＢＴ−０２−００１と名付ける。このモノクローナル抗体、および、このモノクローナル抗体の結合を競合的に阻害するタンパク質は、細胞、例えば、Ｔｒｅｇ細胞、好ましくはメモリーｎＴｒｅｇ細胞、または、休止メモリーｎＴｒｅｇ細胞のようなｎＴｒｅｇ細胞の同定、または、単離、ＰＩ１６関連症状（例えば、Ｔｒｅｇ細胞関連症状）の診断、または、予後予測、ならびに、ＰＩ１６、および／または、Ｔｒｅｇ細胞関連症状の治療を含む様々な用途に有用である。

【0022】

したがって、本発明は、ペプチダーゼインヒビター１６（ＰＩ１６）に結合する能力がある少なくとも１つの抗体（例えば、モノクローナル抗体）の可変領域を含む単離されたタンパク質を提供し、このタンパク質は、ＰＴＡ−１０６８５の受託番号でＡＴＣＣに寄託されたＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマが産生する抗体のＰＩ１６への結合を競合的に阻害することもできる。

【0023】

１つの例において、前記タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマが産生する抗体が結合するエピトープと重複するエピトープに結合する。あるいは、そのタンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマが産生する抗体と同じエピトープに結合する。

【0024】

１つの例において、前記タンパク質は、例えば、配列番号１のＣ末端２１アミノ酸を含む膜結合型のＰＩ１６に結合する。

【0025】

１つの例において、前記タンパク質は、配列番号３２、または、配列番号３８に記載の配列を含有するエピトープに特異的に結合する。

【0026】

１つの例において、前記タンパク質は、配列番号３３〜３７、配列番号３９、および、その混合物から成る群より選択される配列に含まれるエピトープに特異的に結合する。

【0027】

１つの例において、前記タンパク質は、配列番号３２〜３９、および、その混合物からなる群より選択される配列からなるペプチドに特異的に結合する。

【0028】

１つの例において、前記タンパク質は、ＰＩ１６中の立体構造的エピトープに結合する。例えば、立体構造的エピトープはＰＩ１６内のジスルフィド結合に依存している。例えば、前記タンパク質が結合する立体構造的エピトープはジスルフィド結合を欠くＰＩ１６、例えば、還元型のＰＩ１６には存在しない。

【0029】

１つの例において、前記タンパク質は還元型のＰＩ１６に実質的に結合しない。例えば、前記タンパク質は還元型のＰＩ１６に検出できるほど結合することはない。

【0030】

１つの例において、前記タンパク質はグリコシル化ＰＩ１６、または、脱グリコシル化ＰＩ１６に結合する。例えば、前記タンパク質はＮ−グリコシル化ＰＩ１６、または、非Ｎ−グリコシル化ＰＩ１６に結合する。

【0031】

１つの例において、前記タンパク質は少なくとも約５ｎＭ、例えば、少なくとも約４ｎＭ、例えば、少なくとも約３ｎＭの親和性（ＫＤ）でＰＩ１６に結合する。

【0032】

１つの例において、前記タンパク質は、少なくとも約１．２５ｎＭの親和性（ＫＤ）でＰＩ１６に結合する。１つの例において、Ｆｃに融合したＰＩ１６の細胞外領域を固定化し、前記タンパク質（例えば、Ｆａｂ）の固定化タンパク質への結合を表面プラズモン共鳴を用いて評価することでＫＤを評価する。

【0033】

１つの例において、前記タンパク質は、少なくとも約２．５６ｎＭの親和性（ＫＤ）でＰＩ１６に結合する。１つの例において、前記タンパク質を固定化し、Ｆｃに融合したＰＩ１６の細胞外領域の固定化タンパク質への結合を表面プラズモン共鳴を用いて評価することでＫＤを評価する。

【0034】

１つの例において、前記タンパク質は１ｎＭと３ｎＭの間の、例えば、約１．１ｎＭと２．７ｎＭの間の、例えば、約１．２ｎＭと２．６ｎＭの間の、例えば、約１．２５ｎＭと２．５６ｎＭの間の親和性（ＫＤ）を有する。

【0035】

１つの例において、前記タンパク質は、少なくとも約２ｘ１０^５の、例えば、約２．４ｘ１０^５の、例えば、約２．６ｘ１０^５の、例えば、約２．８ｘ１０^５の、例えば、少なくとも約２．９７ｘ１０^５のＫａを有する。１つの例において、Ｆｃに融合したＰＩ１６の細胞外領域を固定化し、前記タンパク質（例えば、Ｆａｂ）の固定化タンパク質への結合を表面プラズモン共鳴を用いて評価することでＫａを評価する。

【0036】

１つの例において、前記タンパク質は少なくとも約５ｘ１０^４の、例えば、少なくとも約５．２ｘ１０４の、例えば、少なくとも約５．３ｘ１０^４の、例えば、少なくとも約５．５ｘ１０^４の、例えば、少なくとも約５．７ｘ１０^４の、例えば、少なくとも約５．８２ｘ１０^４のＫａを有する。１つの例において、前記タンパク質を固定化し、Ｆｃに融合したＰＩ１６の細胞外領域の固定化タンパク質への結合を表面プラズモン共鳴を用いて評価することでＫａを評価する。

【0037】

１つの例において、前記タンパク質は少なくとも約４．５ｘ１０^−４、例えば、少なくとも約４．２ｘ１０^−４、例えば、少なくとも約４．０ｘ１０^−４、例えば、少なくとも約３．８ｘ１０^−４、例えば、少なくとも約３．７２ｘ１０^−４のＫｄを有する。１つの例において、Ｆｃに融合したＰＩ１６の細胞外領域を固定化し、前記タンパク質（例えば、Ｆａｂ）の固定化タンパク質への結合を表面プラズモン共鳴を用いて評価することでＫｄを評価する。

【0038】

１つの例において、前記タンパク質は少なくとも約２．５ｘ１０^−４、例えば、少なくとも約２．２ｘ１０^−４、例えば、少なくとも約２．０ｘ１０^−４、例えば、少なくとも約１．８ｘ１０^−４、例えば、少なくとも約１．４９ｘ１０^−４のＫｄを有する。１つの例において、前記タンパク質を固定化し、Ｆｃに融合したＰＩ１６の細胞外領域の固定化タンパク質への結合を表面プラズモン共鳴を用いて評価することでＫｄを評価する。

【0039】

１つの例において、前記タンパク質はマウスＰＩ１６に検出できるほど結合することはない。

【0040】

１つの例において、前記タンパク質はヒトＰＩ１６に結合する。

【0041】

１つの例において、本発明のタンパク質の可変領域は抗体重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）、または、抗体軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）である。

【0042】

あるいは、前記タンパク質は少なくとも２つの可変領域を含み、その可変領域のうちの１つは抗体重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）であり、もう１つの可変領域は抗体軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）である。例えば、そのタンパク質は、Ｖ_ＬがＶ_Ｈに結合して抗原結合部位を形成するＦｖを含む。抗原結合部位を形成するＶ_ＬとＶ_Ｈは単一のポリペプチド鎖に（例えば、ｓｃＦｖに）、または、異なるポリペプチド鎖に（例えば、抗体、または、二重特異性抗体に）存在することができる。

【0043】

前記タンパク質は抗体、例えば、モノクローナル抗体であることが好ましい。１つの例において、そのタンパク質は、任意の例に従い、本明細書において考察される抗体重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）、または、抗体軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む抗体である。

【0044】

本発明の１つの例において、可変領域はヒト可変領域である。例えば、本発明の抗体はヒトの抗体であり得る。

【0045】

別の例において、可変領域は非ヒト可変領域である、または、その可変領域は非ヒト可変領域の３つの相補性決定領域を含むものである。例えば、そのタンパク質はキメラタンパク質、もしくは、キメラ抗体、脱免疫化タンパク質、もしくは、脱免疫化抗体、または、ヒト化タンパク質、もしくは、ヒト化抗体であり得る。

【0046】

１つの例において、非ヒト可変領域は、受託番号ＰＴＡ−１０６８５でＡＴＣＣに寄託されたＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマが産生する抗体に由来する。

【0047】

１つの例において、前記タンパク質は、配列番号８に記載の配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ、および、配列番号１０に記載の配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む。任意の公知の方法であって、例えば、本明細書に記載される方法に従って、ＣＤＲの特質を決定する。１つの例において、ＣＤＲは図２１で示される配列を含む。

【0048】

１つの例において、前記タンパク質は、配列番号８に記載の配列に少なくとも約８０％、または、８５％、または、９０％、または、９１％、または、９２％、または、９３％、または、９４％、または、９５％、または、９６％、または、９７％、または、９８％、または、９９％同一である配列を含む重鎖可変領域を含み、および、配列番号１０に記載の配列に少なくとも約８０％、または、８５％、または、９０％、または、９１％、または、９２％、または、９３％、または、９４％、または、９５％、または、９６％、または、９７％、または、９８％、または、９９％同一な配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0049】

１つの例において、前記タンパク質は、配列番号８に記載の配列を含む重鎖可変領域を含み、および、配列番号１０に記載の配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0050】

配列番号８に記載の重鎖可変領域、および／または、配列番号１０に記載の軽鎖可変領域と受託番号ＰＴＡ−１０６８５でＡＴＣＣに寄託されたＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマが産生する抗体のその（それらの）領域の配列との間に相違がある場合、ＣＲＣＢＴ−０２−００１が産生する抗体の配列が優先する。

【0051】

本発明はまた受託番号ＰＴＡ−１０６８５でＡＴＣＣに寄託されたＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマが産生する抗体である単離されたタンパク質を提供する。

【0052】

１つの例において、本発明のタンパク質はＴｒｅｇ細胞の機能を阻害する、または、妨害する。

【0053】

別の例において、本発明のタンパク質はＴｒｅｇ細胞の機能を活性化する、または、強化する。

【0054】

本発明のいくつかの例において、前記タンパク質はそのタンパク質と複合体化する化合物を有する。化合物の例は、放射性同位体、検出可能な標識物質、治療用化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象中で前記タンパク質の半減期を増加させる化合物、および、それらのうちの２つ以上の混合物からなる群より選択される。

【0055】

本発明は本発明のタンパク質、および、薬剤的に許容可能な担体を含む組成物をさらに提供する。

【0056】

本発明はまた本発明のタンパク質を固定化する固形担体、または、半固形担体を提供する。

【0057】

本発明は本発明のタンパク質をコードする単離された核酸をさらに提供する。受託番号ＰＴＡ−１０６８５でＡＴＣＣに寄託されたＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマが産生する抗体のＶ_Ｈをコードする核酸の例は配列番号８に記載の配列を含む。受託番号ＰＴＡ−１０６８５でＡＴＣＣに寄託されたＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマが産生する抗体のＶ_Ｌをコードする核酸の例は配列番号１０に記載の配列を含む。１つの例において、その核酸は発現コンストラクト中のプロモーターに機能的に結合する。

【0058】

本発明は本発明のタンパク質を発現する単離された細胞をさらに提供する。例えば、その細胞は本発明の核酸、および／または、本発明の発現コンストラクトを含む。

【0059】

あるいは、前記細胞はハイブリドーマ、例えば、受託番号ＰＴＡ−１０６８５でＡＴＣＣに寄託されたＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマである。

【0060】

本発明は、本発明のタンパク質を製造する方法であって、本発明の核酸、および／または、本発明の発現コンストラクトを細胞、または、無細胞系で発現させることを含む方法をさらに提供する。１つの例において、その方法は、前記タンパク質が発現するように受託番号ＰＴＡ−１０６８５でＡＴＣＣに寄託されたＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマを培養することを含む。いくつかの形態において、その方法は前記タンパク質を単離することをさらに含む。

【0061】

本発明は、試料中のＰＩ１６、または、ＰＩ１６発現細胞を検出する方法であって、もしあれば、試料中のＰＩ１６に本発明のタンパク質が結合するように、本発明のいずれか１つのタンパク質、または、本発明の組成物、または、本発明の固形担体、もしくは、半固形担体と試料を接触させることを含み、結合したタンパク質を検出する方法をさらに提供する。

【0062】

１つの例において、前記方法は、
（ｉ）もしあれば、試料中のＰＩ１６に本発明のタンパク質が結合するように、試料をそのタンパク質と接触させること、
（ｉｉ）もしあれば、試料中のＰＩ１６に他のタンパク質が結合するように、本発明のタンパク質が結合するのとは異なるＰＩ１６中のエピトープに結合する別のタンパク質に試料を接触させること、
および、結合したタンパク質のうちの１つ、または、他方、または、両方を検出することを含む。

【0063】

１つの例において、本発明のタンパク質、または、その他のタンパク質は固形担体、または、半固形担体に固定化される。

【0064】

１つの例において、前記方法は、ＰＩ１６発現細胞がＣＤ４、および／または、ＣＤ２５、および／または、ＣＤ１２７を発現するかどうか判定することをさらに含む。１つの例において、前記細胞はＴｒｅｇ細胞である。前記細胞はｎＴｒｅｇ細胞であることが好ましい。

【0065】

別の例において、前記細胞は、ＣＤ４５ＲＯ、および／もしくは、ＣＤ２７、および／もしくは、ＣＤ９５、および／もしくは、ＣＣＲ６ ＨＬＡＤＲ、および／もしくは、ＣＣＲ４、および／もしくは、ＣＬＡを発現する、ならびに／または、低レベルのＣＤ４５ＲＡ、および／もしくは、ＣＤ１４６、および／もしくは、ＣＸＣＲ５、および／もしくは、ＣＤ６９を発現する。例えば、前記細胞はメモリーＴ細胞、好ましくはメモリーＴｒｅｇ細胞（例えば、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＨＬＡＤＲ、ＣＣＲ４、および、ＣＣＲ６を発現し、ならびに、低レベルのＣＤ１２７を発現し（すなわちＣＤ１２７⁻であり）、低レベルのＣＤ４５ＲＡを発現し（すなわちＣＤ４５ＲＡ⁻であり）、低レベルのＣＤ１４６を発現し（すなわちＣＤ１４６⁻であり）、低レベルのＣＤ６９を発現し（すなわちＣＤ６９⁻であり）、および、低レベルのＣＸＣＲ５を発現する（すなわちＣＸＣＲ５⁻である）細胞）である。別の例において、前記細胞はメモリーＴ細胞、好ましくは、メモリーＴｒｅｇ細胞（例えば、ＣＤ４、および／もしくは、ＣＤ２５、ならびに／または、低レベルのＣＤ１２７、および／もしくは、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞）である。

【0066】

本発明の１つの好ましい形態において、前記細胞はメモリーｎＴｒｅｇ細胞、好ましくは休止ｎＴｒｅｇ細胞、または、非活性型ｎＴｒｅｇ細胞である。

【0067】

１つの例において、前記方法は、ＣＬＡを発現する細胞を検出することをさらに含む。ＣＬＡの発現は、その細胞が。例えば、炎症性皮膚病（例えば、乾癬）の治療のために、皮膚へ移動する能力を持つ、または、皮膚に選択的に移動することを示している。

【0068】

１つの例において、前記方法は、Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域のメチル化のレベルを検出することをさらに含み、その方法では、低減されたレベルのメチル化、または、メチル化が検出されないことは、その細胞がＴｒｅｇ細胞であることを示す。核酸のメチル化のレベルを測定する方法（例えば、バイサルファイト処理後のメチル化特異的ＰＣＲ、または、制限酵素消化、および／または、シークエンシング）は当業者に明らかであり、および／または、本明細書に記載される。

【0069】

本発明はまた内在性制御性Ｔ（ｎＴｒｅｇ）細胞を誘導性Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）細胞から区別する方法でを提供し、その方法は、本発明のタンパク質が試料中のＰＩ１６を発現するＴｒｅｇ細胞に結合するようにＴｒｅｇ細胞を含む試料を本発明のタンパク質、または、本発明の組成物、または、本発明の固形担体、もしくは、半固形担体と接触させること、およびＰＩ１６を発現するＴｒｅｇ細胞を検出することを含み、ＰＩ１６を発現するＴｒｅｇ細胞はｎＴｒｅｇ細胞である。

【0070】

１つの例において、前記方法は、ＣＤ４、および／もしくは、ＣＤ２５を発現し、ならびに／または、低レベルのＣＤ１２７を発現するＰＩ１６発現細胞を検出することをさらに含む。

【0071】

１つの例において、前記方法は、ＣＤ４５ＲＯ、および／または、ＣＤ４５ＲＡ、および／または、ＣＤ２７、および／または、ＣＤ９５、および／または、ＣＣＲ６、および／または、ＣＣＲ４、および／または、ＣＤ１４６、および／または、ＣＸＣＲ５、および／または、ＣＤ３９、および／または、ＣＤ７３、および／または、ＣＤ６９、および／または、ＨＬＡＤＲ、および／または、ＣＣＲ５、および／または、ＣＸＣＲ３、および／または、ＣＸＣＲ４、および／または、ＣＬＡを発現するＰＩ１６発現細胞を検出することをさらに含む。

【0072】

１つの例において、前記方法は、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＨＬＡＤＲ、ＣＬＡ、ＣＣＲ４、および、ＣＣＲ６を発現し、ならびに、低レベルのＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１４６、ＣＤ６９、および、ＣＸＣＲ５を発現する細胞を検出することをさらに含む。

【0073】

１つの例において、前記方法は、ＬＲＲＣ３２、ＣＤ３３、ＴＩＧＩＴ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＴＧＡＭ、ＮＰＡＬ２、ＣＤ８８、ＩＦＮＧＲ２、および、ＰＥＲＰからなる群より選択される１つ以上のタンパク質の上昇したレベルを検出することをさらに含む。

【0074】

１つの例において、前記方法は、ＣＤ２７４、ＬＡＳＳ６、ＡＣＶＲ２、ＣＤ２００Ｒ１、ＣＤ８２、ＣＹＢＲＤ１、ＣＹＳＬＴＲ１、ＧＰＲ１７４、ＮＫＧ７、ＣＤ９、ＬＲＲＮ３、ＮＲＰ２、ＧＰＲ１８３、ＩＥＲ３、ＴＭＥＭ２００Ａ、ＬＰＣＡＴ２、および、ＩＴＧＡ１からなる群より選択される１つ以上のタンパク質の減少したレベルを検出することをさらに含む。

【0075】

本発明は、細胞を単離する方法をさらに提供し、その方法は、本発明の方法を実行して細胞を検出し、検出された細胞を単離すること、または、本発明の方法を実行してｎＴｒｅｇ細胞を区別し、区別されたｎＴｒｅｇ細胞を単離することを含む。

【0076】

本発明は、ＰＩ１６を発現する細胞を濃縮した細胞集団を作製する方法をされに提供し、その方法は、本発明のタンパク質が試料中のＰＩ１６発現細胞と結合するようにＰＩ１６発現細胞を含む細胞集団を本発明のタンパク質、または、本発明の組成物、または、本発明の固形担体、もしくは、半固形担体と接触させること、およびそのタンパク質が結合した細胞を選択することを含む。１つの例において、濃縮された細胞はＴｒｅｇ細胞、例えば、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７⁻である細胞である。いくつかの形態において、前記方法は単離された細胞を培養することをさらに含む。

【0077】

前記細胞を単離する方法は、薬剤的に許容可能な担体とその細胞を製剤し、それによって医薬組成物を製造することをさらに含むことができる。

【0078】

本発明はまた、任意の例に従い、本明細書に記載される方法により単離された細胞、または、任意の例に従い、本明細書に記載される方法により作製された細胞集団を提供する。

【0079】

１つの例において、前記細胞、もしくは、細胞集団は内在性制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞であり、または、その集団ではｎＴｒｅｇ細胞が濃縮されている。

【0080】

１つの例において、ｎＴｒｅｇ細胞は、ＰＩ１６を発現しないＴｒｅｇ細胞よりも、炎症性サイトカインへの曝露後の免疫反応を抑制する、より高い能力を有する。

【0081】

１つの例において、ｎＴｒｅｇ細胞は、対象中の炎症部位での免疫反応を抑制するより高い能力を有する。

【0082】

１つの例において、ｎＴｒｅｇ細胞は、誘導性Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）細胞よりも、炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１、および、ＩＬ−６への曝露後の免疫反応を抑制する、より高い能力を有する。

【0083】

本開示はまた、ＰＩ１６、ならびに、ＣＬＡ、ＨＬＡＤＲ、および、ＣＣＲ４からなる群より選択される１つ以上のタンパク質を発現する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞が濃縮した細胞集団を提供する。

【0084】

１つの例において、前記細胞はＣＣＲ４、および／または、ＣＣＲ６を発現する。

【0085】

１つの例において、前記細胞は、ＣＤ４、および、ＣＤ２５、ならびに、所望により低レベルの、または、検出できないレベルのＣＤ１２７をさらに発現する。

【0086】

１つの例において、前記細胞はＣＤ２７、および／または、ＣＤ９５、および／または、ＣＣＲ６をさらに発現する。

【0087】

１つの例において、前記細胞は低レベルのＣＤ４５ＲＡを発現し（すなわちＣＤ４５ＲＡ⁻であり）、低レベルのＣＤ１４６を発現し（すなわちＣＤ１４６⁻であり）、および、低レベルのＣＸＣＲ５を発現する（すなわちＣＸＣＲ５⁻である）。

【0088】

１つの例において、前記細胞は対象中の炎症部位に移動する能力を持つ。１つの例において、前記細胞は炎症部位に優先的に移動する。１つの例において、前記細胞はＴ_Ｈ１７介在性炎症部位に優先的に移動する。

【0089】

１つの例において、前記細胞は対象中の皮膚（例えば、皮膚の炎症部位）に移動する能力を持つ。１つの例において、前記細胞は皮膚（例えば、皮膚の炎症部位）に優先的に移動する。１つの例において、前記細胞はＴ_Ｈ１７介在性皮膚炎の部位に優先的に移動する。

【0090】

本開示はまた、受託番号ＰＴＡ−１０６８５でＡＴＣＣに寄託されたＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマが産生する抗体と反応する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞が濃縮した細胞集団を提供する。

【0091】

本発明はまた対象の症状を診断する、および／または、予後予測する方法を提供し、その方法は、本発明の方法を実行して対象由来の試料中のＰＩ１６、または、ＰＩ１６発現細胞を検出することを含み、その方法においてＰＩ１６、または、ＰＩ１６発現細胞の検出、または、未検出がその症状の診断に役立つ、または、その症状の予後予測に役立つ。

【0092】

１つの例において、前記方法は、
（ｉ）試料、または、その一部の中のＰＩ１６、または、ＰＩ１６発現細胞の量を測定する、または、推定すること、
（ｉｉ）正常な対象、および／または、健康な対象に由来する試料中のＰＩ１６、または、ＰＩ１６発現細胞の量を比較すること、
を含み、正常な対象、および／または、健康な対象に由来する試料中のＰＩ１６、または、ＰＩ１６発現細胞の量と比較して上昇した、または、減少した（ｉ）でのＰＩ１６、または、ＰＩ１６発現細胞の量は、その対象がその症状を患っていることを示す。

【0093】

別の例において、本発明は、ある症状の治療の効力をモニターする方法であって、
（ｉ）本発明の方法を実行して試料、または、その一部の中のＰＩ１６、または、ＰＩ１６発現細胞の量を測定、または、推定すること、
（ｉｉ）対照の対象に由来する試料の中のＰＩ１６、または、ＰＩ１６発現細胞の量を比較すること
を含む方法を提供し、その方法において、
（ａ） 対照試料は正常な、または、健康な対象に由来し、そして、対照試料中のＰＩ１６、または、ＰＩ１６発現細胞の量と比較して類似の（ｉ）のＰＩ１６、または、ＰＩ１６発現細胞の量は、その対象がその症状の治療に応答していることを示す、
（ｂ） 対照試料は正常な、または、健康な対象に由来し、そして、対照試料中のＰＩ１６、または、ＰＩ１６発現細胞の量と比較して上昇した、または、減少した（ｉ）のＰＩ１６、または、ＰＩ１６発現細胞の量は、その対象がその症状の治療に応答していないことを示す、
（ｃ） 対照試料は以前の時点の対象（例えば、治療開始前）に由来し、そして、対照試料中のＰＩ１６、または、ＰＩ１６発現細胞の量と比較して類似の（ｉ）のＰＩ１６、または、ＰＩ１６発現細胞の量は、その対象がその症状の治療に応答していないことを示す、または、
（ｄ） 対照試料は以前の時点の対象（例えば、治療開始前）に由来し、そして、対照試料中のＰＩ１６、または、ＰＩ１６発現細胞の量と比較して上昇した、または、減少した（ｉ）のＰＩ１６、または、ＰＩ１６発現細胞の量は、その対象がその症状の治療に応答していることを示す。

【0094】

好ましい例において、前記症状はＴｒｅｇ細胞関連症状である。例えば、
（ｉ）Ｔｒｅｇ細胞関連症状は、試料中のＰＩ１６発現Ｔｒｅｇ細胞レベルの低減、または、ＰＩ１６レベルの低減を検出することにより診断される／予後予測される自己免疫疾患である、
（ｉｉ）Ｔｒｅｇ細胞関連症状は、試料中のＰＩ１６発現Ｔｒｅｇ細胞レベルの上昇、または、ＰＩ１６レベルの上昇を検出することにより診断される／予後予測される炎症である、または、
（ｉｉｉ）Ｔｒｅｇ細胞関連症状は、試料中のＰＩ１６発現Ｔｒｅｇ細胞レベルの上昇、または、ＰＩ１６レベルの上昇を検出することにより診断される／予後予測される癌である。

【0095】

１つの例において、Ｔｒｅｇ細胞関連症状は、炎症部位に由来する試料中のＰＩ１６発現Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージの変化を検出することにより診断される／予後予測される炎症である。その細胞のパーセンテージの変化はレベルの上昇、または、レベルの減少である可能性があり、好ましくは、レベルの減少である。この点について、ＰＩ１６発現Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージがＰＩ１６⁻Ｔｒｅｇ細胞に対するＰＩ１６^＋Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージとして表されることが好ましい。

【0096】

１つの例において、Ｔｒｅｇ細胞関連症状は、炎症部位に由来する試料中のＰＩ１６⁻Ｔｒｅｇ細胞に対するＰＩ１６^＋Ｔｒｅｇ細胞の割合の変化を検出することにより診断される／予後予測される炎症である。その細胞の割合の変化はレベルの上昇（ＰＩ１６⁻Ｔｒｅｇ細胞に対するＰＩ１６^＋Ｔｒｅｇ細胞の数の増加）、または、レベルの減少（ＰＩ１６⁻Ｔｒｅｇ細胞に対するＰＩ１６^＋Ｔｒｅｇ細胞の数の減少）である可能性があり、好ましくは、レベルの減少である。

【0097】

１つの例において、炎症部位は滑液を含む。１つの例において、炎症は関節炎である。１つの例において、炎症は若年性特発性関節炎である。

【0098】

本発明のタンパク質はまた、インビボでＰＩ１６、または、ＰＩ１６発現細胞を検出する画像化方法を容易にする。したがって、本発明はまたＰＩ１６発現細胞関連症状の位置を特定し、および／または、その症状を検出し、および／または、その症状を診断し、および／または、その症状の予後予測をする方法であって、インビボで本発明のタンパク質に結合した化合物を検出することを含む方法を提供し、その方法において、結合した化合物の検出がその症状の位置を特定し、および／または、その症状を検出し、および／または、その症状を診断し、および／または、その症状の予後予測をする。

【0099】

１つの例において、本発明は、ＰＩ１６発現細胞関連症状の位置を特定し、および／または、その症状を検出し、および／または、その症状を診断し、および／または、その症状の予後予測をする方法であって、
（ｉ）もしあれば、ＰＩ１６発現細胞に本発明のタンパク質が結合するように、化合物（例えば、検出可能な標識物質）と複合体化した本発明のタンパク質を対象に投与すること、および、
（ｉｉ）そのタンパク質に結合する化合物をインビボで検出し、結合する化合物の検出がその症状の位置を特定し、および／または、その症状を検出し、および／または、その症状を診断し、および／または、その症状の予後予測をすること
を含む方法を提供する。

【0100】

１つの例において、前記方法は本明細書に記載される診断方法／予後予測方法／位置特定方法／検出方法の結果を、紙上で、または、機械可読形式で提供することをさらに含む。

【0101】

本発明はまたある症状を治療する、または、予防する方法であって、本明細書に記載される診断方法、または、予後予測方法の結果を得ること、および、適切な治療化合物、または、予防化合物を投与することを含む方法を提供する。例えば、その症状が癌であるとき、その化合物は化学療法化合物であり得、または、その症状が自己免疫症状であるとき、その化合物は抗炎症薬、および、抗ＴＮＦ化合物、抗ＣＤ２０化合物などであり得る。

【0102】

本発明はまたある症状を治療、または、予防する方法であって、本発明のタンパク質、または、本発明の組成物、または、本発明の固形担体、もしくは、半固形担体、または、本発明の方法により単離された細胞、または、本発明の細胞集団をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。

【0103】

１つの例において、その方法は制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の数、もしくは、活性の低減に関連する症状を治療し、もしくは、抑制し、および／または、免疫抑制を誘導し、および／または、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、もしくは、ヘルパーＴ細胞の活性を対象中で低下させ、そして、その方法は、
（ｉ）本発明の方法を実行することでＴｒｅｇ細胞が濃縮した集団を単離すること、または、本発明の細胞集団を得ること、および、
（ｉｉ） （ｉ）の細胞を対象に投与すること
を含む。

【0104】

１つの例において、前記方法はＴｒｅｇ細胞機能を活性化する、または、強化する本発明のタンパク質を投与することを含む。

【0105】

別の例において、前記方法は制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の数、もしくは、活性の低減に関連する症状を治療し、もしくは、予防し、および／または、免疫抑制を誘導し、および／または、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、もしくは、ヘルパーＴ細胞の活性を対象中で低下させ、そして、その方法は本発明の固形担体、もしくは、半固形担体を対象内のある部位に投与する、または、移植することを含み、そのタンパク質がＴｒｅｇ細胞に結合し、そして、その部位にその細胞を固定化する。１つの例において、その固形担体、または、半固形担体は、投与、または、移植の前にＴｒｅｇ細胞をその上に固定化させる。

【0106】

例えば、前記対象は自己免疫疾患を患っている、もしくは、自己免疫疾患を発生する危険にある、および／または、前記対象は移植を受ける予定である、もしくは、受けるところである、もしくは、受けたところである。

【0107】

別の例において、前記症状は対象の免疫系の制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞介在による抑制に関連し、および、前記方法はその対象に本発明のタンパク質、または、本発明の組成物、または、本発明の固形担体、もしくは、半固形担体を投与することを含む。

【0108】

例えば、前記対象は癌を患っており、そして、前記タンパク質、または、組成物、または、固形担体、もしくは、半固形担体の投与がその対象中のＴｒｅｇ細胞の数、および／または、活性を低減し、そして、その対象の免疫系がより効率的に癌に応答することを可能にする。１つの例において、前記タンパク質はＴｒｅｇ細胞を殺し、および／または、Ｔｒｅｇ細胞に毒性化合物を送達し、および／またはＴｒｅｇ細胞の機能を阻害する。

【0109】

別の例において、本発明は、ある症状を治療する、または、予防する方法であって、前記タンパク質がＰＩ１６を発現する細胞に結合するように対象の血液を本発明の固形担体、もしくは、半固形担体に接触させることを含み、そして、その血液からその細胞を除去する方法を提供する。そのような方法は対象の血液からＴｒｅｇ細胞を取り除くこと、および、免疫反応を誘導すること、または、免疫反応が起こることを可能にすることに有用である。この例において、固形担体、もしくは、半固形担体は、例えば、除去療法に使用される担体であることができる。処理された血液が対象に戻されることが好ましい。

【0110】

本発明はまた対象中の免疫反応を調節する方法であって、本発明のタンパク質、または、本発明の組成物、または、本発明の固形担体、もしくは、半固形担体、または、本発明の方法により単離された細胞、または、本発明の細胞集団をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。

【0111】

１つの例において、前段落の方法は対象において免疫反応を誘導し、刺激し、または、促進するための方法であり、そして、その方法は本発明のタンパク質、または、本発明の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む。

【0112】

別の例において、前記方法は、対象の血液を本発明の固形担体、もしくは、半固形担体に接触させることを含み、前記タンパク質が制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞に結合し、そして、血液からその細胞を除去する。

【0113】

１つの例において、免疫反応は抗体の産生、および／または、細胞傷害性Ｔ細胞介在性免疫反応である。

【0114】

対象で免疫反応を誘導する、刺激する、または、促進する方法の１つの例において、前記タンパク質は免疫原性化合物を含む組成物の投与の前に、または、投与と同時に投与される。

【0115】

別の例において、前記方法は、本発明の方法によって単離されたＴｒｅｇ細胞を投与して、それによって免疫反応を抑制する、または、妨害することを含む。１つの例において、Ｔｒｅｇ細胞を細胞または組織とともに、例えば、骨髄とともに投与して、それによって移植片対宿主反応、または、宿主対移植片反応を低減させる、または、防止する。Ｔｒｅｇ細胞は、前記対象、または、別の対象、好ましくは、健康な対象のＴｒｅｇ細胞であり得る。

【0116】

本発明はまた化合物をＰＩ１６発現細胞に送達する方法であって、化合物と複合体化している本発明のタンパク質とその細胞を接触させることを含む方法を提供する。１つの例において、対象にそのタンパク質を投与することでその細胞をインビボで接触させる。

【0117】

本発明はまた本発明のタンパク質、または、本発明の組成物、または、本発明の固形担体、もしくは、半固形担体、または、本発明の方法を実行することにより単離された細胞、または、本発明の細胞集団の医薬品での利用を提供する。

【0118】

例えば、本発明は、ＰＩ１６の発現に関連する症状の治療用医薬の製造における前記タンパク質、組成物固形担体、もしくは、半固形担体、または、細胞の利用を提供する。１つの例において、その症状はＴｒｅｇ細胞関連症状である。

【0119】

１つの例において、前記医薬は本発明の方法を実行することにより単離された細胞を含み、および、それは自己免疫疾患の治療用であり、および／または、前記対象は移植を受ける予定である、もしくは、受けるところである、もしくは、受けたところである。

【0120】

１つの例において、前記医薬は前記タンパク質、または、前記組成物を含み、そして、前記症状は対象の免疫系のＴｒｅｇ細胞介在性抑制と関連する。

【0121】

本発明はまた対象の免疫系を調節する医薬の製造における本発明のタンパク質、または、本発明の組成物、または、本発明の固形担体、もしくは、半固形担体、または、本発明の方法を実行することにより単離された細胞の利用を提供する。

【0122】

本発明者らはまた、ＰＩ１６発現Ｔｒｅｇ細胞は、Ｔ_Ｈ１７細胞によっても発現されるケモカイン受容体、例えば、ＣＣＲ４、および／または、ＣＣＲ６を発現し、ならびに、ＣＣＲ４、および／または、ＣＣＲ６のリガンドに応答して移動することを示した。したがって、これらの細胞はＴ_Ｈ１７細胞と同じ部位に移動し、炎症反応を抑制するので、このことがＰＩ１６発現Ｔｒｅｇ細胞をＴ_Ｈ１７介在性症状の治療に特に有益なものとする。

【0123】

したがって、本開示はまたＰＩ１６を発現する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を投与することを含むＴ_Ｈ１７介在性症状を治療する方法を提供する。

【0124】

１つの例において、前記Ｔｒｅｇ細胞はＣＣＲ４、および／または、ＣＣＲ６をさらに発現する。

【0125】

１つの例において、前記Ｔｒｅｇ細胞は全身に投与され、そして、Ｔ_Ｈ１７介在性症状の部位に移動する。

【0126】

本発明者らはまた、ＰＩ１６を発現するＴｒｅｇ細胞（例えば、ＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体を用いて単離したＴｒｅｇ細胞）はＣＬＡを発現することを示した。このことは、その細胞は皮膚に移動することができることを、または、優先的に皮膚に移動することを示している。したがって、本開示はまたＰＩ１６を発現する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を投与することを含む皮膚病を治療する方法を提供する。

【0127】

１つの例において、前記Ｔｒｅｇ細胞はＣＣＲ４、および／または、ＣＣＲ６をさらに発現する。

【0128】

１つの例において、前記Ｔｒｅｇ細胞は全身に投与され、そして、皮膚病の部位に移動する。

【0129】

１つの例において、前記皮膚病は炎症性皮膚病、例えば、Ｔ_Ｈ１７介在性皮膚病である。

【0130】

本発明者らはまた、ＰＩ１６発現Ｔｒｅｇ細胞は炎症性サイトカインに曝露された後にエフェクターＴ細胞を抑制する活性を維持し、一方、ＰＩ１６⁻ｉＴｒｅｇ細胞はその活性を維持しないことを明らかにした。したがって、炎症反応を起こしている部位にＰＩ１６発現Ｔｒｅｇ細胞を直接投与して治療上の利益をもたらすことができる。

【0131】

したがって、本開示はまた、炎症部位にＰＩ１６を発現する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を投与することを含む炎症の治療方法を提供する。

【0132】

１つの例において、前記炎症部位はインターロイキン（ＩＬ）１β、および／または、ＩＬ６の発現を特徴とする。

【0133】

１つの例において、前記炎症は若年性特発性関節炎である。

【0134】

対象に投与するのに適切な細胞は、ＰＩ１６発現Ｔｒｅｇ細胞が濃縮した細胞集団を含む。１つの例において、その細胞集団は、受託番号ＰＴＡ−１０６８５でＡＴＣＣに寄託されたＣＲＣＢＴ−０２−００１と反応するＴｒｅｇ細胞が濃縮された細胞集団である。

【0135】

本発明者らはまた、炎症部位で、例えば、若年性特発性関節炎でＰＩ１６発現Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージが減少し、一方、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋＋ＣＤ１２７⁻Ｔｒｅｇ細胞の総数は上昇することを示した。

【0136】

したがって、本開示はまた、Ｔｒｅｇ細胞関連炎症の診断方法であって、炎症部位に由来する試料中のＰＩ１６発現Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージを検出することを含む方法を提供し、その方法においてＰＩ１６発現Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージの減少は前記症状の指標である。この点について、ＰＩ１６発現Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージがＰＩ１６⁻Ｔｒｅｇ細胞に対するＰＩ１６^＋Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージとして表されることが好ましい。

【0137】

別の例において、本開示は、Ｔｒｅｇ細胞関連炎症を診断する方法であって、炎症部位に由来する試料中のＰＩ１６⁻Ｔｒｅｇ細胞に対するＰＩ１６^＋Ｔｒｅｇ細胞の割合を判定することを含む方法を提供し、その方法においてＰＩ１６⁻Ｔｒｅｇ細胞に対して減少したＰＩ１６^＋Ｔｒｅｇ細胞の割合は前記症状の指標である。

【0138】

１つの例において、前記炎症部位は滑液である。

【0139】

１つの例において、前記症状は関節炎である。

【0140】

１つの例において、前記症状は若年性特発性関節炎である。

【0141】

診断方法の１例において、ＰＩ１６発現Ｔｒｅｇ細胞のレベルは、前記対象の血流、および／または、正常な、もしくは、健康な対象の血流におけるレベルと比較して低下する。

【0142】

本発明はまた内在性制御性Ｔ（ｎＴｒｅｇ）細胞を誘導性Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）細胞と区別する方法であって、ＬＲＲＣ３２、ＣＤ３３、ＴＩＧＩＴ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＴＧＡＭ、ＮＰＡＬ２、ＣＤ８８、ＩＦＮＧＲ２、および、ＰＥＲＰからなる群より選択される１つ以上のタンパク質の発現レベルが上昇したＴｒｅｇ細胞を検出することを含む方法を提供し、その方法においてそのタンパク質の発現レベルが上昇したＴｒｅｇ細胞はｎＴｒｅｇ細胞である。

【0143】

本発明はまた内在性制御性Ｔ（ｎＴｒｅｇ）細胞を誘導性Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）細胞と区別する方法であって、ＣＤ２７４、ＬＡＳＳ６、ＡＣＶＲ２、ＣＤ２００Ｒ１、ＣＤ８２、ＣＹＢＲＤ１、ＣＹＳＬＴＲ１、ＧＰＲ１７４、ＮＫＧ７、ＣＤ９、ＬＲＲＮ３、ＮＲＰ２、ＧＰＲ１８３、ＩＥＲ３、ＴＭＥＭ２００Ａ、ＬＰＣＡＴ２、ＩＴＧＡ１からなる群より選択される１つ以上のタンパク質の発現レベルが減少したＴｒｅｇ細胞を検出することを含む方法を提供し、その方法においてそのタンパク質の発現レベルが減少したＴｒｅｇ細胞はｎＴｒｅｇ細胞である。

【0144】

１つの例において、前記の上昇した、または、減少した発現レベルはｉＴｒｅｇ細胞、または、ＣＤ２５⁻細胞の発現レベルに関連がある。

【0145】

本発明はまた誘導性制御性Ｔ（ｉＴｒｅｇ）細胞を内在性Ｔｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）細胞と区別する方法であって、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ８８、ＩＦＮＧＲ２、ＰＥＲＰ、ＬＡＳＳ６、ＧＰＲ１７４、ＮＫＧ７、ＣＤ９、ＬＲＲＮ３、ＭＲＰ２、ＧＰＲ１８３、ＩＥＲ３、ＴＭＥＭ２００Ａ、ＬＰＣＡＴ２、および、ＩＴＧＡ１からなる群より選択される１つ以上のタンパク質の発現レベルが上昇したＴｒｅｇ細胞を検出することを含む方法を提供し、その方法においてそのタンパク質の発現レベルが上昇したＴｒｅｇ細胞はｉＴｒｅｇ細胞である。

【0146】

本発明はまた誘導性制御性Ｔ（ｉＴｒｅｇ）細胞を内在性Ｔｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）細胞と区別する方法であって、ＬＲＲＣ３２、ＣＤ３３、ＩＬ１Ｒ１、ＩＴＧＡＭ、ＮＰＡＬ２、ＣＤ２７４、ＣＤ８２、および、ＣＹＢＲＤ１からなる群より選択される１つ以上のタンパク質の発現レベルが減少したＴｒｅｇ細胞を検出することを含む方法を提供し、その方法においてそのタンパク質の発現レベルが減少したＴｒｅｇ細胞はｉＴｒｅｇ細胞である。

【0147】

１つの例において、前記の上昇した、または、減少した発現レベルはＣＤ２５⁻細胞の発現レベルに関連がある。

【0148】

本発明はまた免疫グロブリンＦｃ領域に融合したＰＩ１６の細胞外ドメインを含む単離されたタンパク質を提供する。例えば、ＰＩ１６の細胞外ドメインは抗体、例えば、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合した。１つの例においてＰＩ１６の細胞外ドメインは配列番号４０に記載の配列を含む、または、それから成る。

【図面の簡単な説明】

【0149】

【図1】ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）（配列番号１）、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（配列番号２）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｖｉｇｅｎｉｃｕｓ）（配列番号３）、および、チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）（配列番号４）由来のＰＩ１６タンパク質のアミノ酸配列の配列アラインメントである。星印は同一のアミノ酸を示す。“：”、および、“．”は保存されたアミノ酸残基を示す。

【図2】ＣＤ２５抗体、または、ＦｏｘＰ３抗体とＰＩ１６ポリクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）による新しく単離された成体のＣＤ４^＋Ｔ細胞の染色を示す一連の図表による説明である。ＣＤ２５とＰＩ１６の染色は、ＣＤ２５陽性、もしくは、陰性、または、ＰＩ１６陽性、もしくは、陰性を表す囲みを有する左側のパネルに示される。右側のパネルは、各囲みに含まれる細胞集団のＦｏｘＰ３発現レベルを示す。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＰＩ１６^＋細胞は最も高レベルのＦｏｘＰ３発現を示し、一方、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＰＩ１６⁻細胞はより低い平均発現レベルを示すことが結果により明らかである。ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻細胞はＦｏｘＰ３⁻である。

【図3】誘導性Ｔｒｅｇ細胞（ｉＴｒｅｇ細胞）におけるＰＩ１６の発現を示す一連の図表による説明である。組換えヒトＴＧＦβ−１とＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞増殖刺激ビーズの存在下、ビーズを取り除く前に全部で８日間、臍帯血ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻細胞を培養し、そして、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３、および、ＰＩ１６の発現を分析した。誘導性Ｔｒｅｇ細胞はＦｏｘＰ３を発現した。しかし、誘導性Ｔｒｅｇ細胞はＰＩ１６について陽性ではなく、これは、ＰＩ１６が誘導性Ｔｒｅｇ細胞ではなく内在性Ｔｒｅｇ細胞のマーカーとして機能する可能性を示唆する。

【図4】ＰＩ１６発現細胞での免疫前（上段右のパネル）、および、免疫後（下段右のパネル）のマウスの血清のそれらの細胞への反応性を示す一連の図表による説明である。血清抗体の結合をフローサイトメトリーにより解析した。マウスＩｇＧアイソタイプを負の対照として用い（上段左のパネル）、マウスＰＩ１６ポリクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）を正の対照として用いた（下段左のパネル）。

【図5】ハイブリドーマ細胞培養上清のＣＤ３^＋リンパ球に対するスクリーニングを示す一連の図表による説明である。Ｘ６３上清をＩｇＧ対照として用いた（上段左のパネル）。Ａｂｎｏｖａ社のマウスＰＩ１６ポリクローナル抗体（ＰＩ１６ポリクローナル抗体）を正の対照として用いた（上段右のパネル）。ウェルＰ１Ｇ５（Ｐ１ ５Ｇ）のハイブリドーマは正の対照と同様の染色を示し（下段中央のパネル）、そして、二つのその他のハイブリドーマ（Ｐ１ Ｅ２、および、Ｐ１ Ｆ３）は異なる染色を示した（それぞれ下段左、および、下段右のパネル）。

【図6】ハイブリドーマＰ１Ｇ５のサブクローンの細胞培養上清の反応性を示す一連の図表による説明である。Ｘ６３上清をＩｇＧ対照として用いた（左上のパネル）。Ａｂｎｏｖａ社のマウスＰＩ１６ポリクローナル抗体（ＰＩ１６ポリクローナル抗体）を正の対照として用いた（上段右のパネル）。サブクローンＰ２Ｂ３（ＣＲＣＢＴ−０２−００１と名付ける。下段右のパネル）は正の対照と同様の染色を示し、一方、サブクローンＰ１Ｂ７はＰ２Ｂ３と同様の染色を示し、および、Ｐ１Ｇ８はＰＩ１６への反応性について陰性である（下段左、および、下段中央のパネル）。

【図7】ＣＲＣＢＴ−０２−００１の上清（Ｐ１Ｇ５ Ｐ２Ｂ３、右のパネル）、Ａｂｎｏｖａ社のＰＩ１６ポリクローナル抗体（ＰＩ１６ポリクローナル抗体）（中央のパネル）、および、Ｘ６３負の対照（左のパネル）による安定的なＰＩ１６形質移入ＮＩＨ３Ｔ３細胞（下段のパネル）、および、非形質移入ＮＩＨ３Ｔ３細胞（上段のパネル）の染色の比較を示す一連の図表による説明である。

【図8】非形質移入対照（Ａ、Ｂ、および、Ｃ）、および、Ｖ５エピトープ融合ＰＩ１６を発現する安定的な形質移入ＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ａ’、Ｂ’、および、Ｃ’）について抗体の免疫反応性を示す一連の顕微鏡写真である。ＣＲＣＢＴ−０２−００１細胞培養上清（Ａ、および、Ａ’）、抗Ｖ５抗体（Ｂ、および、Ｂ’）、および、Ａｂｎｏｖａ社のＰＩ１６マウスポリクローナル抗体（Ｃ、および、Ｃ’）、その次にビオチン化ウマ抗マウス抗体とインキュベートして細胞を染色した。次に、その細胞をストレプトアビジンＡＦ４８８複合体（緑色）、および、ＤＡＰＩ（青色）とインキュベートして視覚化した（ＤＡＰＩは細胞核を染色する。）。パネルＡ’は原形質膜に沿った緑色蛍光の蓄積を示し、ＣＲＣＢＴ−０２−００１の細胞表面染色を確認する。パネルＢ’に見られるＶ５タグの染色により、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の形質移入が成功したことを確認する。パネルＣ’は対照としてＰＩ１６ポリクローナル抗体の細胞表面染色を示す。

【図9】ＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体、および、ＰＩ１６ポリクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）は安定的なＰＩ１６形質移入ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＰＩ１６形質移入細胞細胞溶解物）に結合するが、非形質移入ＮＩＨ３Ｔ３細胞（非形質移入細胞細胞溶解物）には結合しないことを証明するスロットブロットの結果を示す写真による説明である。両方の抗体はまた安定的なＰＩ１６形質移入ＮＩＨ３Ｔ３細胞の上清（ＰＩ１６形質移入細胞上清）に結合する。このことは、形質移入細胞がＰＩ１６をその細胞表面から分泌する、または、放出することを示唆する。ＣＲＣＢＴ−０２−００１はＡｂｎｏｖａ社の組換えタンパク質（組換えタンパク質、Ａｂｎｏｖａ）に結合しない。これらの結果は、ＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体とＰＩ１６ポリクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）の両方がＰＩ１６に結合することを示唆する。ＣＲＣＢＴ−０２−００１モノクローナル抗体がＡｂｎｏｖａ社の組換えＰＩ１６タンパク質に結合できなかったことは、そのモノクローナル抗体は、無細胞系で産生されたＰＩ１６にではなく、細胞（例えば、哺乳類細胞）により産生されたＰＩ１６に選択的に結合することができることを示唆する。

【図10】Ｔｒｅｇ細胞表面マーカー（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^{ｂｒｉｇｈｔ}ＣＤ１２７⁻）に基づいて単離された細胞集団中の（ＣＲＣＢＴ−０２−００１上清、または、ＰＩ１６ポリクローナル抗体を用いて同定された）ＰＩ１６陽性細胞の割合を示す一連の図表による説明である。ＣＲＣＢＴ−０２−００１の上清を用いて単離された細胞を下段のパネルに示し、ＰＩ１６ポリクローナル抗体を用いて単離された細胞を上段のパネルに示す。この図は、ＣＲＣＢＴ−０２−００１の上清は、前記ポリクローナル抗体（７．９％）よりも、より特定のＣＤ４^＋細胞集団（２．８％）に結合することを示す。ＣＲＣＢＴ−０２−００１上清もまた、ＰＩ１６ポリクローナル抗体よりも、大きい割合のＴｒｅｇ細胞の表現型を発現する細胞を特定する。

【図11】末梢血リンパ球の様々な集団のＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体との免疫反応性を示す一連の図表による説明である。パネルＡは後の解析に用いるリンパ球を特定するために使用したゲートを示す（全てのＰＢＭＣが含まれる。白色の楕円はリンパ球を示す。）。パネルＢは、ＣＲＣＢＴ−０２−００１の上清はＣＤ４^＋Ｔ細胞（リンパ球のみが解析された。）に結合することを示す。パネルＣは、ＣＲＣＢＴ−０２−００１の上清はＣＤ８^＋Ｔ細胞（リンパ球のみが解析された。）にほとんど結合しないことを示す。パネルＤは、ＣＲＣＢＴ−０２−００１の上清は少数のＢ細胞（リンパ球のみが解析された。）に結合することを示す。パネルＥは、大多数のＣＲＣＢＴ−０２−００１陽性ＣＤ４^＋Ｔ細胞はメモリー表現型（ＣＤ４５ＲＡ陰性）を有することを示す（全てのＣＤ４^＋Ｔ細胞が解析された。）。パネルＦは、ＣＲＣＢＴ−０２−００１陽性ＣＤ４^＋Ｔ細胞の約４分の３がＣＤ２７も発現することを示す（全てのＣＤ４^＋Ｔ細胞が解析された。）。パネルＧは、少数のＣＲＣＢＴ−０２−００１陽性細胞のみがエフェクターメモリー細胞サブセット（ＣＤ４５ＲＡ陰性／ＣＤ２７陰性）に属することを示す（全てのＣＤ４^＋ＣＲＣＢＴ−０２−００１^＋細胞が含まれる。）。パネルＨは、大多数のＣＲＣＢＴ−０２−００１陽性ＣＤ４^＋Ｔ細胞がＣＤ２５を発現することを示す（全てのＣＤ４^＋Ｔ細胞が解析された。）。パネルＩは、ＣＤ４^＋／ＣＲＣＢＴ−００２−００１陽性細胞の約４分の３がＣＤ１２７を発現することを示す（全てのＣＤ４^＋Ｔ細胞が解析された。）。パネルＪは、全てのＣＤ４^＋ＣＲＣＢＴ−００２−００１陽性細胞のうち約２０％の細胞がＣＤ２５^＋ＣＤ１２７⁻のＴｒｅｇ細胞表現型を示すことを示す（全てのＣＤ４^＋ＣＲＣＢＴ−０２−００１^＋細胞が解析に含まれる。）。

【図12】抗ＰＩ１６モノクローナル抗体ＣＲＣＢＴ−０２−００１を用いることで示される、ＣＤ４陽性リンパ球のＴｒｅｇ細胞サブセット、および、ヘルパーＴ細胞サブセットの細胞表面ＰＩ１６の発現を示す一連の図表による説明を含む。ＣＤ４陽性リンパ球のみを示している。パネル「Ａ」は、ＣＤ１２７陽性ヘルパーＴ細胞（上段右のパネル）よりもＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ／ＣＤ１２７ｄｉｍ Ｔｒｅｇ細胞（上段中央のパネル）において、高い割合で細胞表面にＰＩ１６が存在することを示す。パネル「Ｂ」は、ＰＩ１６陰性サブセット（下段右のパネル）よりもＣＤ４陽性リンパ球のＰＩ１６陽性サブセット（下段中央のパネル）がＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ／ＣＤ１２７ｄｉｍ Ｔｒｅｇ細胞を大きな割合で含有することを示す。一つの代表的な実験をｎ＞１００で示す。

【図13】ＣＤ２５、および、ＰＩ１６（ＣＲＣＢＴ−０２−００１）の共発現を用いて定義されたＣＤ４陽性リンパ球のサブセットのナイーブ／メモリー表現型の発現を示す一連の図表による説明である。ＣＤ４陽性リンパ球のみを示している。ＣＤ２５陰性ＰＩ１６陰性、ＣＤ２５陽性ＰＩ１６陰性、ＣＤ２５陰性ＰＩ１６陽性、および、ＣＤ２５陽性ＰＩ１６陽性を含む四象限が図の左側に示される。各象限におけるＣＤ４５ＲＡ、および／または、ＣＤ４５ＲＯの細胞表面上の発現もまた図示される。ＣＤ２５、および、ＰＩ１６の共発現（ＣＤ２５陽性／ＰＩ１６陽性画分）がメモリー表現型（ＣＤ４５ＲＡ陰性／ＣＤ４５ＲＯ陽性）を有するＴｒｅｇ細胞のサブセットを特定する。

【図14】新しく単離された成体のＣＤ４^＋Ｔ細胞のＣＤ２５抗体、または、ＦｏｘＰ３抗体とＣＲＣＢＴ−０２−００１の上清による染色を示す一連の図表による説明である。ＣＤ２５抗体とＣＲＣＢＴ−０２−００１分泌抗体の染色は、ＣＤ２５陽性、もしくは、陰性、または、ＣＲＣＢＴ−０２−００１分泌抗体陽性、もしくは、陰性を表す囲みを有する左側のパネルに示される。右側のパネルは、各囲みに含まれる細胞集団のＦｏｘＰ３発現レベルを示す。ＣＤ２５陽性／ＰＩ１６陽性Ｔｒｅｇ細胞画分に含まれる細胞（太線、平均蛍光強度；１４５７）はＣＤ２５陽性／ＰＩ１６陰性Ｔｒｅｇ細胞画分に含まれる細胞（破線、平均蛍光強度；１０６２）よりも高レベルでＦｏｘＰ３を発現する。ＣＤ２５陰性／ＰＩ１６陽性集団（細線、平均蛍光強度；６１２）、および、ＣＤ２５陰性／ＰＩ１６陰性集団（点線、平均蛍光強度；４８０）ではＦｏｘＰ３染色は最も低いレベルであった。一つの代表的な実験をｎ＞５０で示す。

【図15】Ｍｉｙａｒａら（２００９年）によって説明されるゲーティング戦略を用いて分割された６画分のナイーブ、および、メモリーＴｒｅｇ細胞によるＰＩ１６、および、ＦｏｘＰ３の発現を示す一連の図表による説明を含む。ＣＤ４陽性リンパ球のみを示している。図の右側のパネルに示すように、ＣＤ４５ＲＡ、および、ＣＤ２５の発現を用いてＣＤ４陽性リンパ球の画分（画分１から画分６）を定義した。これらの画分の各々における細胞のＰＩ１６（ＣＲＣＢＴ−０２−００１）、および、ＦｏｘＰ３の発現が、標識されたように示される。各画分において、ＰＩ１６^＋、および、ＰＩ１６⁻細胞は同様のレベルのＦｏｘＰ３を発現し、最も高いレベルのＦｏｘＰ３発現はメモリーＴｒｅｇ細胞（画分２）で見られた。一つの代表的な実験をｎ＝３で示す。

【図16】ＣＲＣＢＴ−０２−００１モノクローナル抗体によるメモリーＴｒｅｇ細胞の検出を示す一連の図表による説明である。ＣＤ４^＋細胞をＣＲＣＢＴ−０２−００１モノクローナル抗体、および、ＣＤ４５ＲＡ（上段のパネル）またはＣＤ４５Ｒ０（下段のパネル）のどちらかに対する抗体を用いて標識した。メモリーＴ細胞（ＣＤ４５Ｒ０^＋ＣＤ４５ＲＡ^{−／ｌｏｗ}）がＰＩ１６を発現することを結果は示している。

【図17】ＣＤ２５、および、ＰＩ１６の共発現を用いて定義されるＣＤ４陽性リンパ球のサブセットにおけるＴ_Ｈ１／Ｔ_Ｈ２／Ｔ_Ｈ１７サイトメトリックビーズアレイを用いて測定されるサイトカインの発現プロファイルを示す図表による説明である。図１４に示されるゲートを用いて４つの集団の細胞を分別した。グラフは、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて３日間刺激した後に単離された細胞集団によって分泌された各サイトカインの濃度を示す。エラーバーは３回繰り返した実験の標準誤差を示す。

【図18】ＣＤ２５、および、ＰＩ１６（ＣＲＣＢＴ−０２−００１）の共発現を用いて定義されるメモリーＣＤ４陽性リンパ球のサブセットのケモカイン受容体ＣＣＲ４、および、ＣＣＲ６の発現を示す一連の図表による説明を含む。ＣＤ４陽性リンパ球のみを示している。図１４に示されるように４つのサブセットのＣＤ４陽性リンパ球を定義し、そして、ＣＤ４５ＲＯの発現により各々のメモリー画分を同定した。パネル「Ａ」は、ＣＤ２５、および、ＰＩ１６の共発現を用いて定義した４つのサブセットのＣＤ４５ＲＯ、および、ＣＣＲ４の発現を示す。パネル「Ｂ」は、ＣＤ２５、および、ＰＩ１６の共発現を用いて定義した４つのサブセットのＣＤ４５ＲＯ、および、ＣＣＲ６の発現を示す。一つの代表的な実験をｎ＝３で示す。

【図19】刺激されなかった末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（上二段のパネル）、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣ（１８時間）（中央二段のパネル）、および、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体刺激ＰＢＭＣ（３日）（下二段のパネル）に対するＣＲＣＢＴ−０２−００１の上清の免疫反応性を示す一連の図表による説明である。ＩｇＧ１対照としてＸ６３上清を用いた。全てのリンパ球（Ｐ１）を解析に含め、および、ＣＤ４^＋／ＣＤ２５^＋細胞（Ｐ２）を解析した。ＣＤ２５の発現は刺激中に上昇し、一方、ＣＲＣＢＴ−０２−００１の免疫反応性は減少する。

【図20】ＣＲＣＢＴ−０２−００１上清を用いたＰＩ１６発現のスロットブロット解析の結果を示す写真による説明である。刺激を受けたＰＢＭＣ、および、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＰＩ１６^＋細胞の細胞溶解物、および、上清をＣＲＣＢＴ−０２−００１の上清とインキュベートした。１００μｌ ｓ／ｎ ＳＥＢ ｓｔｉｍは、ＰＢＭＣを一晩、ＳＥＢで刺激して、上清を回収し、および、希釈せずに１００μｌの上清を用いたことを意味する。２００μｌ ｓ／ｎ ＳＥＢ ｓｔｉｍは、希釈せずに２００μｌの上清を用いたこと以外は１００μｌ ｓ／ｎ ＳＥＢ ｓｔｉｍと同じことを意味する。ＰＩ１６ ｔｒａｎｓｆ． ＮＩＨ３Ｔ３は、ＰＩ１６で形質移入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞を調製し、および、全細胞溶解物を調製し、１００倍希釈したものを使用したことを意味する。Ｕｎｔｒａｎｓｆ． ＮＩＨ３Ｔ３は、非形質移入ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＲＩＰＡ緩衝液に溶解し、遠心し、および、１００倍に希釈して抽出液を使用したことを意味する。ＰＩ１６ ｔｒａｎｓｆ． ＮＩＨ３Ｔ３（ｏｌｄ）は、全細胞溶解物を先達って調製したことを意味する。ＣＤ４ ｅｘｔｒａｃｔは、ＣＤ４細胞をＲＩＰＡ緩衝液に溶解し、遠心し、および、１００倍に希釈して抽出液を使用したことを意味する。ＣＤ２５⁻／ｉｎｄｕｃｅｄは、ＴＧＦβとＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで７日間ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻細胞を刺激し、および、４８時間細胞を休息させたことを意味する。細胞をＮＰ４０緩衝液に溶解し、遠心し、および、希釈せずに抽出液を使用した。ＣＤ２５^＋／ｉｎｄｕｃｅｄは、ＣＤ２５⁻／ｉｎｄｕｃｅｄのようにＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞を処理したことを意味する。ＣＤ２５^＋／ｃｏｎｔｒｏｌは、ＴＧＦβ無しで７日間ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激し、および、４８時間細胞を休息させたことを意味する。細胞をＮＰ４０緩衝液に溶解し、遠心し、および、希釈せずに抽出液を使用した。ＣＤ２５⁻／ｃｏｎｔｒｏｌは、ＣＤ２５^＋／ｃｏｎｔｒｏｌのようにＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻細胞を処理したことを意味する。ＰＩ１６^＋ ｕｎｓｔｉｍ ｓ／ｎ は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＰＩ１６^＋細胞を分別し、および、刺激することなく４日間細胞を培養したことを意味する。上清を回収し、および、希釈せずに使用した。ＰＩ１６^＋ ｓｔｉｍ ｓ／ｎは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＰＩ１６^＋細胞を分別し、および、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで４日間細胞を刺激したことを意味する。上清を回収し、および、希釈せずに使用した。

【図21】太字で強調した、ある技術で決定したＣＤＲを含むＣＲＣＢＴ−０２−００１のＶ_Ｈ、および、Ｖ_Ｌのアミノ酸配列を示す図である。

【図22A】増殖させた臍帯血Ｔｒｅｇ細胞であって、ＣＲＣＢＴ−０２−００１を用いてＰＩ１６の発現に基づいて分別した細胞を用いる代表的なチミジン取り込みサプレッサー試験の結果を示す２つの図表による説明を含む。右側のグラフはＰＩ１６^＋Ｔｒｅｇ細胞を用いた結果を図示する。左側のグラフはＰＩ１６⁻Ｔｒｅｇ細胞を用いた結果を図示する。エフェクター細胞に対するＴｒｅｇ細胞の数の割合がＸ軸に示される。

【図22B】チミジン取り込みサプレッサー試験の結果のまとめ（ｎ＝６）を示す図表による説明である。エフェクター細胞に対するＴｒｅｇ細胞の数の割合がＸ軸に示される。ＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体を用いて単離されたＴｒｅｇ細胞（ＰＩ−１６^＋）、および、ＰＩ−１６⁻Ｔｒｅｇ細胞はエフェクター細胞の増殖を抑制する。

【図23A】増殖させた臍帯血Ｔｒｅｇ細胞であって、ＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体を用いてＰＩ１６の発現に基づいて分別した細胞を使用する代表的なＣＦＳＥサプレッサー試験の結果を示す一連の図表による説明を含む。上段の２枚のパネルは負の対照（左）、および、正の対照（右）を示す。左側の下から４枚のパネルでＰＩ１６^＋細胞を用いた結果を示し、および、右側の下から４枚のパネルでＰＩ１６⁻細胞を用いた結果を示す。

【図23B】増殖させた臍帯血由来細胞から単離したＴｒｅｇ細胞を用いるＣＦＳＥサプレッサー試験の結果のまとめ（ｎ＝６）を示す図表による説明である。エフェクター細胞に対するＴｒｅｇ細胞の数の割合がＸ軸に示される。ＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体を用いて単離されたＴｒｅｇ細胞（ＰＩ−１６^＋）、および、ＰＩ−１６⁻Ｔｒｅｇ細胞はエフェクター細胞の増殖を抑制する。

【図23C】新しく採取した成体の血液からＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体を用いてＰＩ１６の発現に基づいて分別したＴｒｅｇ細胞を使用する代表的なＣＦＳＥサプレッサー試験の結果を示す一連の図表による説明を含む。図の左側に実験に用いた細胞集団の結果を示し、エフェクター細胞に対するＴｒｅｇ細胞の割合を図の上に示す。対照実験の結果は図の最も右側に含まれる（負の対照、上段、および、正の対照、下段）。

【図23D】図２３Ｄは、新しく採取した成体の末梢血由来のＴｒｅｇ細胞を用いるＣＦＳＥサプレッサー試験の累積結果（ｎ＝４）を示す図表による説明である。エフェクター細胞に対するＴｒｅｇ細胞の数の割合がＸ軸に示される。ＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体を用いて単離されたＴｒｅｇ細胞（ＰＩ−１６^＋）、および、ＰＩ−１６⁻Ｔｒｅｇ細胞はエフェクター細胞の増殖を抑制する。

【図24A】増殖させた臍帯血由来細胞から単離したＴｒｅｇ細胞であって、ＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体を用いてＰＩ１６の発現に基づいて分別した細胞を使用する代表的なＣＤ１５４サプレッサー試験の結果を示す一連の図表による説明を含む。図の左側に実験に用いた細胞集団の結果を示し、および、エフェクター細胞に対するＴｒｅｇ細胞の割合を各グラフの上に示す。

【図24B】増殖された臍帯血由来細胞から単離されたＴｒｅｇ細胞を用いるＣＤ１５４サプレッサー試験の累積結果（ｎ＝４）を示す図表による説明である。エフェクター細胞に対するＴｒｅｇ細胞の数の割合がＸ軸に示される。ＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体を用いて単離されたＴｒｅｇ細胞（ＰＩ−１６^＋）、および、ＰＩ−１６⁻Ｔｒｅｇ細胞はエフェクター細胞の増殖を抑制する。

【図25A】増殖させた臍帯ｎＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４^＋Ｃ２５^＋）、ｉＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＴＧＦ−Ｂ処理細胞、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＴＧＦＢ処理ＡＴＲＡ処理細胞、および、ＣＤ４^＋Ｃ２５⁻ＡＴＲＡ処理細胞）において（示される）ＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、および、ＰＩ１６の染色を示す代表的なフローサイトメトリーのデータを示す一連の図表による説明を含む。増殖させたｎＴｒｅｇ細胞、および、ｉＴｒｅｇ細胞の両方が高レベルのＣＤ４、ＣＤ２５、および、Ｆｏｘｐ３を発現した。しかしながら、ｎＴｒｅｇ細胞のみが著しいレベルのＰＩ１６を発現した。

【図25B】増殖させた臍帯由来の（ｎ＝７、上段のパネル）、および、成体由来の（ｎ＝７、下段のパネル）ｎＴｒｅｇ細胞（ＣＤ２５^＋）、および、ｉＴｒｅｇ細胞（ＣＤ２５⁻細胞、ＣＤ２５⁻ＴＧＦ−Ｂ処理細胞、ＣＤ２５⁻ＴＧＦＢ処理ＡＴＲＡ処理細胞、および、Ｃ２５⁻ＡＴＲＡ処理細胞）についてのフローサイトメトリーの累積結果を示す一連の図表による説明を含む。臍帯、および、成体において、ｎＴｒｅｇ細胞はｉＴｒｅｇ細胞よりもかなり高いレベルのＰＩ１６を発現した。

【図26A】増殖させた臍帯ｎＴｒｅｇ細胞、および、ｉＴｒｅｇ細胞でのリアルタイムＰＣＲで測定したＰＩ１６発現を示す図表による説明である（ｎ＝６）。ＣＤ２５⁻細胞に対するＣｔ値をｉＴｒｅｇ細胞とｎＴｒｅｇ細胞集団の両方について推定した。

【図26B】新しく単離された成体の末梢血のＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体を用いて単離されたＰＩ１６^＋、および、ＰＩ１６⁻Ｔｒｅｇ細胞から抽出されたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲデータ（ｎ＝３）を示す図表による説明である。ＰＩ−１６⁻Ｔｒｅｇ細胞でＦｏｘｐ３が発現する一方、タンパク質レベルでＰＩ１６を発現している細胞のみがＰＩ１６メッセージを発現する。

【図27A】臍帯血から増殖させたｉＴｒｅｇ細胞と比較した、臍帯血から増殖させたｎＴｒｅｇ細胞における（グラフの左側に示される）いくつかの遺伝子の発現レベルを比較する低密度アレイ解析の結果を示す図表による説明である。

【図27B】ＣＤ２５⁻細胞と比較したｎＴｒｅｇ細胞における（グラフの左側に示される）いくつかの遺伝子の発現レベルを比較する、または、ＣＤ２５⁻細胞と比較したｉＴｒｅｇ細胞における前記遺伝子の発現レベルを比較する低密度アレイ解析の結果を示す図表による説明である。全ての細胞を臍帯血から増殖させた。

【図28】ＦＯＸＰ３遺伝子のイントロン１のＴＳＤＲのバイサルファイトシークエンシングによるメチル化解析の結果を示す図表による説明である。新しい３体の雄の新鮮なドナーのリンパ球はＣＤ４陽性ＣＤ２５^{ｔｏｐ ２％}について分別され、そして、さらにＣＲＣ−ＢＴ−０２−００１抗体を用いて選別された。

【図29A】通常の細胞培養条件下での（黒棒）、ならびに、ＩＬ−１β、および、ＩＬ−６に曝露した後の（白棒）、ＰＩ１６^＋ｎＴｒｅｇ細胞のチミジン取り込み（上段のパネル）、および、ＣＦＳＥサプレッサー試験（下段のパネル）によって測定される抑制能力を示す一連の図表による説明を含む。エフェクター細胞に対するＴｒｅｇ細胞の割合がＸ軸に示される。

【図29B】通常の細胞培養条件の下での（黒棒）、ならびに、ＩＬ−１β、および、ＩＬ−６に曝露した後の（白棒）、ＰＩ１６⁻ｎＴｒｅｇ細胞のチミジン取り込みサプレッサー試験（上段のパネル）、および、ＣＦＳＥサプレッサー試験（下段のパネル）により測定される抑制能力を示す一連の図表による説明を含む。エフェクター細胞に対するＴｒｅｇ細胞の割合がＸ軸に示される。

【図29C】通常の細胞培養条件の下での（黒棒）、ならびに、ＩＬ−１β、および、ＩＬ−６に曝露した後の（白棒）、ＰＩ１６⁻ｉＴｒｅｇ細胞のチミジン取り込み（上段のパネル）、および、ＣＦＳＥサプレッサー試験（下段のパネル）により測定される抑制能力を示す一連の図表による説明を含む。エフェクター細胞に対するＴｒｅｇ細胞の割合がＸ軸に示される。

【図30】図１４と同じゲーティング戦略を用いて示される、ＣＤ２５、および、ＰＩ１６の発現レベルに基づいて選択される様々な細胞集団におけるＨＬＡＤＲの発現を示す図表による説明である。

【図31】若年性特発性関節炎の患者におけるＴｒｅｇ細胞の解析を示す一連の図表による説明を含む。成体由来のＰＢＭＣ（ＡＢ ＰＢ）、および、若年性特発性関節炎の患者由来のＰＢＭＣ（ＪＩＡ ＰＢ）、および、若年性特発性関節炎の患者由来のＳＦＭＣ（ＪＩＡ ＳＦ）をＴｒｅｇ細胞カクテル（ＣＤ４抗体、ＣＤ２５抗体、ＣＤ１２７抗体）、および、ＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体を用いて染色し、ならびに、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩで解析した。上段のパネルはＣＤ４^＋／ＣＤ２５^＋＋／ＣＤ１２７⁻についてのゲート（Ｔｒｅｇ細胞ゲート）でリンパ球を区分したときの結果を示し、および、ＣＤ４^＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す（ｎ＝９）。下段のパネルは、Ｔｒｅｇ細胞ゲート内のＰＩ１６陽性細胞のパーセンテージを示す。＊ｐ（確率）＜０．０５（ｎ＝１１）。

【図32】各グラフの上に示されるＣＤ２５、および、ＰＩ１６の発現レベルに基づいて選択される様々な細胞集団でのＣＬＡの発現を示す一連の図表による説明を含む。

【図33A】健康な成体のＰＢＭＣに由来するＣＤ４^＋ＣＤ２５^{ｂｒｉｇｈｔ}ＣＲＣＢＴ−０２−００１^＋細胞の、ＣＣＲ４、および、ＣＣＲ６のリガンドであるＣＣＬ１７、および、ＣＣＬ２０に応答して移動する能力を示す図表による説明である。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^{ｂｒｉｇｈｔ}ＣＲＣＢＴ−０２−００１細胞はＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、および、ＣＣＬ１７／ＣＣＬ２０リガンドの組合せに向かって移動するが、培地だけに向かって移動することはない。

【図33B】図３３Ｂは、正常な幼体からのＰＢＭＣ（左側のパネル）、若年性特発性関節炎を患う対象からのＰＢＭＣ（ＪＩＡ、中央のパネル）、および、ＪＩＡを患う対象からの滑液単核球細胞（ＳＦＭＣ）に由来するＣＤ４^＋ＣＤ２５^{ｂｒｉｇｈｔ}ＣＲＣＢＴ−０２−００１^＋細胞の、ＣＣＲ４、および、ＣＣＲ６のリガンドであるＣＣＬ１７、および、ＣＣＬ２０に応答して移動する能力を示す一連の図表による説明を含む。健康な対象、および、ＪＩＡを患う対象からのＰＢＭＣに由来するＣＤ４^＋ＣＤ２５^{ｂｒｉｇｈｔ}ＣＲＣＢＴ−０２−００１細胞はＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、および、ＣＣＬ１７／ＣＣＬ２０リガンドの組合せに向かって移動し、一方、ＪＩＡを患う対象からのＳＦＭＣに由来する細胞は移動しなかった。

【図34A】天然型ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質、および、還元型アルキル化ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質に結合するＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体の結合レベル（天然型ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質への結合のパーセントとして結合レベルを表す。）を示す図表による説明である。ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質の還元型アルキル化（還元型）はＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体の結合をほぼ完全に消失させた。Ｆｃ部分を検出する対照抗体は天然型ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質（非還元型）、および、還元型アルキル化ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質（還元型）を認識した。このことは、還元型アルキル化ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質の完全性がその酸化還元状態と独立して保持されていることを示す。

【図34B】ＣＲＣＢＴ−０２−００１抗ＰＩ１６モノクローナル抗体が、ジスルフィド結合依存的な方法でＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質を認識することを示す一連の写真による説明のコピーを含む。左側のパネルは、天然型非還元型ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質（レーン１）、および、還元型アルキル化ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質（レーン２）のＳＤＳ ＰＡＧＥ解析を示す。４〜１２％ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をクマシーブリリアントブルーで染色した。各レーンに約１μｇのＰＩ１６を負荷した。中央のパネルは、ＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体とＨＲＰ標識抗マウス免疫複合体で探索した天然型ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質、および、還元型アルキル化ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質のウェスタンブロット解析を示す。それぞれ、レーン１〜３は、２００ｎｇ、６７ｎｇ、および、２２ｎｇの天然型ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質に相当し、および、レーン４〜６は同じ濃度の還元型アルキル化ＰＩ１６に相当する。右側のパネルは、抗原の存在を確認するためにウェスタンブロットをＨＲＰ複合体化抗ヒトＦｃで再探索したときに得られた結果を示し、レーン１〜３は天然型ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質に相当し、および、レーン４〜６は還元型アルキル化ＰＩ１６に相当する。

【図34C】ジスルフィド結合依存的な方法でＣＲＣＢＴ−０２−００１抗ＰＩ１６モノクローナル抗体がＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質を認識することを示す一連の写真による説明のコピーを含む。左側のパネルは、組換え非還元型ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質（レーン１）、および、還元型アルキル化ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質（レーン２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。４〜１２％ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をクマシーブリリアントブルーで染色した。各レーンに約１μｇのＰＩ１６を負荷した。左から中央のパネルは、１０，０００倍希釈したＨＲＰ複合体化抗ヒトＦｃＩｇＧで探索した天然型ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質、および、還元型アルキル化ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質（それぞれ、レーン１、および、レーン２）のウェスタンブロット解析の結果を示す。各レーンに約２００ｎｇの組換えＰＩ１６を負荷した。右側のパネルは、２．５μｇ／ｍｌのＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体、および、ＨＲＰ複合体化抗マウスＩｇＧで探索した非還元型ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質、および、還元型アルキル化ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質（それぞれ、レーン１、および、レーン２）のウェスタンブロット解析の結果を示す。各レーンに約２００ｎｇのＰＩ１６を負荷した。

【図35】天然型ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質、および、脱グリコシル化ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質へのＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体の結合レベル（天然型ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質への結合のパーセントとして結合レベルを表す。）を示す図表による説明である。ＰＮＧａｓｅＦでのＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質の処理はＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体の結合に対して測定可能な影響を持たなかった。対照抗体である抗Ｆｃ抗体は融合タンパク質のＣ末端を認識する。このことは、脱グリコシル化ＰＩ１６の完全性が保持されていることを示す。

【図36】Ｎ末端ＣＡＰドメインを含有するＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質の断片に結合するＣＲＣＢＴ−０２−００１の結合を示す図表による説明である。加熱処理の後、ＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質の明確な分解産物が観察され、および、ＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体はそれでも約３５ｋＤａの断片を認識した。

【図37】ファージに提示されるＰＩ１６遺伝子の無作為断片ライブラリーの構築を示す２つの写真による説明のコピーを含む。左側のパネルは、最適に分布したサイズの断片を作成するためにＤＮａｓｅＩで消化したＰＩ１６コーディングＤＮＡの臭化エチジウムで染色したアガロースゲルを示す。右側のパネルは、無作為に選択したクローンのＰＩ１６コーディングＤＮＡ断片を意味するＰＣＲ増幅産物を表す臭化エチジウムで染色したアガロースゲルを示す。代表的な断片のサイズは図の下に示される。

【図38A】ファージに提示されたＰＩ１６断片ライブラリーの遺伝子断片をＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体に対する特異性で選択したパニングの結果を示す図表による説明である。ラウンド３から選択された５つの遺伝子断片（４、７、１０、１２、および、１５）がＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体と強固に結合し、そして、アイソタイプ対照ｍＡｂ（ＩＣ）に結合しないことを表すＥＬＩＳＡの結果が示される。

【図38B】図３８Ａにおいて表される断片への９Ｅ１０抗Ｍｙｃ抗体の結合を示す図表による説明であり、シグナルはファージでのインフレーム遺伝子断片の発現に対応する。

【図39】ファージのパニング中に単離されたＰＩ１６遺伝子断片の相対的なサイズを示す２つの図表による説明を含む。ラウンド０（パニング前）、および、ラウンド２、および、ラウンド３でファージクローンを同定した。番号を振ったクローンを、図３８での結合について解析した。ＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体に対する強固な結合を示した「＊」で印をつけたＰＩ１６断片のみを３回のパニングの後に単離した。

【図40A】ＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体に結合するラウンド３のパニングからのＰＩ１６遺伝子断片の配列とヒトＰＩ１６のアミノ酸配列（配列番号１）の配列アラインメントを示す図表による説明である。示されている断片は、クローン１５（配列番号３３）、クローン１２（配列番号３４）、クローン１０（配列番号３５）、クローン７（配列番号３６）、および、クローン４（配列番号３７）である。前記クローンの配列はＰＩ１６のＮ末端部分（ＣＡＰドメイン）と部分的に重なることがその結果により示される。

【図40B】ラウンド３のクローン４、７、１２、１０、および、１５（配列番号３８）の一致領域（１６アミノ酸）の配列を示す。これはＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体の最小結合領域である。前記クローンの配列のヒトＰＩ１６に対する位置を表す図を配列の下に示す。

【図40C】ヒトＰＩ１６の配列（配列番号１）の中にあるラウンド３のクローン４、７、１２、１０、および、１５（配列番号３８）の一致領域（１６アミノ酸）の配列を示す。また、ＣＡＰドメインとヒンジ領域の境界を示す。

【図41】ヒトＰＩ１６のペプチド断片、または、負の対照ペプチドへのＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体の結合を示す図表による説明である。別のアイソタイプ対照抗体（ＩＣ）を対照として使用した。ペプチドでコートされたウェルに加えられた抗体の濃度を図の右側に示す。

【図42】３つの異なる濃度（５０ｎＭ、２５ｎＭ、および、１２．５ｎＭ）でＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質に結合するＰＩ１６ Ｆａｂ断片についての結合曲線（Ｋ_ａ）、および、解離曲線（Ｋ_ｄ）を示す図表による説明である。

【図43】４つの異なる濃度（５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、および、６．２５ｎＭ）のＰＩ１６−Ｆｃ融合タンパク質でＰＩ１６ ｍＡｂに結合するＰＩ１６−ｆｃ融合タンパク質についての結合曲線（Ｋ_ａ）、および、解離曲線（Ｋ_ｄ）を示す図表による説明である。

【発明を実施するための形態】

【0150】

配列表の解説
配列番号１はヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＰＩ１６のアミノ酸配列である。
配列番号２はマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＰＩ１６のアミノ酸配列である。
配列番号３はラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｖｉｇｅｎｉｃｕｓ）ＰＩ１６のアミノ酸配列である。
配列番号４はチンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）ＰＩ１６のアミノ酸配列である。
配列番号５はヒトＰＩ１６オープンリーディングフレームを増幅するためのオリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号６はヒトＰＩ１６オープンリーディングフレームを増幅するためのオリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号７はハイブリドーマＣＲＣＢＴ−０２−００１で産生される抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号８はハイブリドーマＣＲＣＢＴ−０２−００１で産生される抗体の重鎖をコードするアミノ酸配列である。
配列番号９はハイブリドーマＣＲＣＢＴ−０２−００１で産生される抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１０はハイブリドーマＣＲＣＢＴ−０２−００１で産生される抗体の重鎖をコードするアミノ酸配列である。
配列番号１１はマウス免疫グロブリン軽鎖をコードする配列をクローニングするためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１２はマウス免疫グロブリン軽鎖をコードする配列をクローニングするためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１３はマウス免疫グロブリン重鎖をコードする配列をクローニングするためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１４はマウス免疫グロブリン重鎖をコードする配列をクローニングするためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１５はマウス免疫グロブリン重鎖をコードする配列をクローニングするためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１６はマウス免疫グロブリン重鎖をコードする配列をクローニングするためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１７はマウス免疫グロブリン重鎖をコードする配列をクローニングするためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１８はマウス免疫グロブリン重鎖をコードする配列をクローニングするためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１９はＦｏｘＰ３の領域を増幅するプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２０はＦｏｘＰ３の領域を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２１はＰＩ１６の領域を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２２はＰＩ１６の領域を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２３はＲＰＬ１３ａの領域を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２４はＲＰＬ１３ａの領域を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２５はＰＩ１６の２８〜４４３アミノ酸をコードする核酸を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２６はＰＩ１６の２８〜４４３アミノ酸をコードする核酸を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２７はＰＩ１６のペプチド断片のアミノ酸配列である。
配列番号２８はＴＳＤＲを増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２９はＴＳＤＲを増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号３０はＭ１３ユニバーサル順方向プライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号３１はＭ１３ユニバーサル逆方向プライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号３２はＣＲＣＢＴ−０２−００１抗体が結合するヒトＰＩ１６のペプチド断片のアミノ酸配列である。
配列番号３３はファージクローン１５が発現するＰＩ１６の断片のアミノ酸配列である。
配列番号３４はファージクローン１２が発現するＰＩ１６の断片のアミノ酸配列である。
配列番号３５はファージクローン１０が発現するＰＩ１６の断片のアミノ酸配列である。
配列番号３６はファージクローン７が発現するＰＩ１６の断片のアミノ酸配列である。
配列番号３７はファージクローン４が発現するＰＩ１６の断片のアミノ酸配列である。
配列番号３８はファージクローン１５、１２、１０、７、および、４の配列の重複領域のアミノ酸配列である。
配列番号３９はファージクローン４、および、７に共通のヒトＰＩ１６のペプチド断片のアミノ酸配列である。
配列番号４０はヒトＰＩ１６外部ドメインのアミノ酸配列である。

【0151】

全般的な説明
この明細書を通して、特に記述のない限り、または、文脈から必要とされない限り、１つのステップ、１つの組成物、１群のステップ、または、１群の組成物への言及は、単数の、および、複数の（すなわち、１つ以上の）それらのステップ、組成物、群のステップ、または、群の組成物を包含すると理解されるものとする。

【0152】

当業者は、本明細書に記載される本発明は具体的に記載されているもの以外に変形と改変の余地があること理解するであろう。本発明はそのような変形と改変の全てを含むと理解されるものとする。本発明はまたこの明細書で言及される、または、示されるステップ、特徴、組成物、および、化合物の全てを個々に、または、まとめて含み、そして、前記のステップ、または、特徴のありとあらゆる組合せ、または、任意の２つ以上の前記のステップ、または、特徴を含む。

【0153】

本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態によってその範囲が限定されるものではなく、具体的な実施形態は例示の目的のみで用いられることを意図している。同等の機能を持つ製品、組成物、および、方法は明らかに本明細書に記載される発明の範囲に入る。

【0154】

本明細書に記載のどの実施形態も、特に記載のない限り、その他のどの実施形態にも必要な変更を加えて適用されると理解されるものとする。

【0155】

特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、および、科学用語は（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、および、生化学における）当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有すると理解されるものとする。

【0156】

特に示されない限り、本発明で使用される組換えタンパク質技術、細胞培養技術、および、免疫学的技術は当業者に周知の標準的技法である。そのような技術は、様々な文献、例えば、Ｐｅｒｂａｌ（１９８４年）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、Ｂｒｏｗｎ（１９９１年）、ＧｌｏｖｅｒおよびＨａｍｅｓ（１９９５年、および、１９９６年）、ならびに、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８８年、現時点までの全ての最新情報を含む）、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，（１９８８年）、Ｃｏｌｉｇａｎら（現時点までの全ての最新情報を含む）、ならびに、Ｚｏｌａ（１９８７年）を通して記述され、および、説明されている。

【0157】

本明細書における可変領域、および、その部分、免疫グロブリン、抗体、および、その断片の叙述と定義をＫａｂａｔ，１９８７年および／もしくは１９９１年、Ｂｏｒｋら，１９９４年、ならびに／または、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，１９８７年および／もしくは１９８９年、または、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら，１９９７年での議論によってさらに明確にすることができる。

【0158】

「および／または」という用語、例えば、「Ｘ、および／または、Ｙ」は、「Ｘ、および、Ｙ」か「Ｘ、または、Ｙ」のどちらかを意味すると理解され、両方、または、どちらかを明示的に意味するものとして理解されるものとする。

【0159】

この明細書を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という言葉、または、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、または、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形形態は、明示された要素、完全体、または、ステップ、要素の群、複数の完全体、または、ステップの包含を意味するが、他の要素、完全体、または、ステップ、要素の群、複数の完全体、または、ステップの排除を意味しないと理解されるであろう。

【0160】

本明細書で使用される「由来する」という用語は、特定された完全体を特定の出所から、必ずしもその出所から直接というわけではないが、得ることができることを意味すると理解されるものとする。

【0161】

定義選集
当業者は、「抗体」は、少なくとも１つの可変領域に含有される抗原結合部位によって１つの抗原、または、少数の近縁の抗原（例えば、ＰＩ１６）に特異的に結合する能力を持つ免疫タンパク質を含むことを理解するであろう。この用語は４本鎖抗体（例えば、２本の軽鎖、および、２本の重鎖）、組換え、または、修飾抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫化抗体、半抗体、二重特異性抗体）、ならびに、ドメイン抗体、および、重鎖のみ抗体のような単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ類抗体、または、軟骨魚類免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲｓ））を含む。抗体は一般的に定常ドメインを含み、それらのドメインが並べられて定常領域、または、定常断片、または、結晶化可能断片（Ｆｃ）になることができる。好ましい形態の抗体はその基本単位として４本鎖構造を含む。完全長の抗体は、共有結合で連結した２本の重鎖（約５０〜７０ｋＤ）と２本の軽鎖（約２３ｋＤずつ）を含む。軽鎖は可変領域と定常ドメインを一般に含み、そして、哺乳類ではκ軽鎖かλ軽鎖のどちらかである。重鎖は可変領域、および、１つの、または、２つの定常ドメイン、および、その定常ドメインとヒンジ領域で連結されたその他の定常ドメインを一般に含む。哺乳類の重鎖は、α、δ、ε、γ、または、μのうちのどれかである。各軽鎖はまた重鎖のうちの１本と共有結合する。例えば、２本の重鎖、ならびに、重鎖、および、軽鎖は、鎖間ジスルフィド結合と非共有結合性相互作用によって１つにまとめられる。鎖間ジスルフィド結合の数は様々な種類の抗体の間で変わることができる。各鎖はＮ末端可変領域（Ｖ_Ｈ、または、Ｖ_Ｌ、それぞれ長さが約１１０アミノ酸である。）と１つ以上の定常ドメインをＣ末端に持つ。軽鎖の定常ドメイン（長さが約１１０アミノ酸であるＣ_Ｌ）は重鎖の第１定常ドメイン（長さが約３３０〜４４０アミノ酸のＣ_Ｈ）と整列し、ジスルフィド結合で結合する。軽鎖可変領域は重鎖の可変領域と整列する。抗体の重鎖は２つ以上のその他のＣ_Ｈドメイン（例えば、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３など）を含むことができ、そして、Ｃ_Ｈ１定常ドメインとＣｍ定常ドメインの間に特定することができるヒンジ領域を含むことができる。抗体は、どのようなタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、および、ＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、および、ＩｇＡ_２）、または、サブクラスでもあり得る。抗体はネズミ科（マウス、または、ラット）抗体、または、霊長類（好ましくは、ヒト）抗体であることが好ましい。

【0162】

本明細書で使用される「可変領域」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を持ち、好ましくは、ＣＤＲｓ、すなわち、ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２、および、ＣＤＲ３、および、ＦＲのアミノ酸配列を含む、本明細書で定義される抗体の軽鎖、および／または、重鎖の部分を意味する。可変領域が３つ、または、４つのＦＲ（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および、所望によりＦＲ４）を３つのＣＤＲとともに含むことが好ましい。Ｖ_Ｈは重鎖の可変領域を意味する。Ｖ_Ｌは軽鎖の可変領域を意味する。本発明の実行にあたって、Ｋａｂａｔ（１９８７年、および、１９９１年）、または、その他の付番方式、例えば、Ｃｌｏｔｈｉａ、および、Ｌｅｓｋの超可変ループ付番方式（１９８７年および／もしくは１９８９年、ならびに／または、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら，１９９７年）に従ってＣＤＲとＦＲに割り当てられたアミノ酸位置を定義することができる。例えば、Ｋａｂａｔの付番方式によれば、Ｖ_ＨのＦＲｓとＣＤＲｓの位置は次のように残基１〜２５、または、１〜３０（ＦＲｌ）、３１〜２５（ＣＤＲ１）、３６〜４９（ＦＲ２）、５０〜６５（ＣＤＲ２）、６６〜９４（ＦＲ３）、９５〜１０２（ＣＤＲ３）、および、１０３〜１１３（ＦＲ４）とＫａｂａｔの付番方式に従って番号を付けて示される。１つの例において、Ｖ_Ｈは、前記重鎖と複数の（好ましくは、３つの、または、４つの）定常ドメインを含む抗体に由来する、または、定常断片（Ｆｃ）に結合する。好ましくは、Ｖ_Ｌは、次のように残基１〜２３（ＦＲｌ）、２４〜３４（ＣＤＲ１）、３５〜４９（ＦＲ２）、５０〜５６（ＣＤＲ２）、５７〜８８（ＦＲ３）、８９〜９７（ＣＤＲ３）、および、９８〜１０７（ＦＲ４）とＫａｂａｔの付番方式に従って番号を付けて位置を示されるＦＲとＣＤＲを含む。１つの例において、Ｖ_Ｌは、１つの定常ドメインに結合した前記Ｖ_Ｌおよび／または定常断片（Ｆｃ）に結合しない前記Ｖ_Ｌを含む抗体に由来する。

【0163】

本明細書で使用される「相補性決定領域」（ＣＤＲ、すなわちＣＤＲｌ、ＣＤＲ２、および、ＣＤＲ３と同義）という用語は、その存在が抗原の結合に必要な抗体可変ドメインのアミノ酸残基を意味する。各可変ドメインは、典型的には、ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２、および、ＣＤＲ３として特定される３つのＣＤＲ領域を有する。各相補性決定領域はＫａｂａｔら（１９９１年）によって定義される「相補性決定領域」のアミノ酸残基、および／または、Ｃｈｏｔｈｉａ、および、Ｌｅｓｋ（１９８７年）の「超可変ループ」のアミノ酸残基、または、ＩＭＧＴ付番方式（Ｌｅ Ｆｒａｎｃら，２００３年）を含む全ての公知の付番技法、または、それらの組合せのアミノ酸残基を含むことができる。例えば、重鎖可変領域では、ＣＤＲＨ１は残基３１〜３５の間にあり、ＣＤＲＨ２は残基５０〜６５の間にあり、および、ＣＤＲＨ３は残基９５〜１０２の間にある。軽鎖において、ＣＤＲＬ１は残基２４〜３４の間にあり、ＣＤＲＬ２は残基５０〜５６の間にあり、および、ＣＤＲＬ３は残基８９〜９７の間にある。これらのＣＤＲｓはまた、多数の挿入、例えば、Ｋａｂａｔ（１９８７年および／または１９９１年）に記載される挿入を含むことができる。

【0164】

「フレームワーク領域（これ以降、ＦＲ）」はＣＤＲ残基以外のそれら可変ドメイン残基である。

【0165】

本明細書で使用される「Ｆｖ」という用語は、複数のポリペプチドから成るにせよ、または、単数のポリペプチドから成るにせよ、Ｖ_ＬとＶ_Ｈが結合して抗原結合部位を有する複合体を形成する、すなわち、抗原に特異的に結合する能力を有する任意のタンパク質を意味すると理解されるものとする。抗原結合部位を形成するＶ_ＨとＶ_Ｌは１つのポリペプチド鎖、または、異なるポリペプチド鎖の中にあり得る。さらに、本発明のＦｖは（ならびに、本発明の任意のタンパク質は）、同じ抗原に結合することができる、または、できない複数の抗原結合部位を有することができる。この用語は、抗体、ならびに、組換え技術を用いて作製されたそのような断片に対応するタンパク質に直接由来する断片を包含すると理解されるものとする。いくつかの例、例えば、ドメイン抗体、または、単一ドメイン抗体では、Ｖ_Ｈは重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）１に結合せず、および／または、Ｖ_Ｌは軽鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）に結合しない。例となるＦｖ含有ポリペプチド、または、Ｆｖ含有タンパク質は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、または、高次複合体、または、定常領域、もしくは、そのドメイン、例えば、Ｃ_Ｈ２、もしくは、Ｃ_Ｈ３ドメイン、に結合する先述の例のいずれか、例えば、ミニ抗体を含む。「Ｆａｂ断片」は免疫グロブリンの一価抗原結合断片から成り、そして、酵素パパインで抗体全体を消化して軽鎖全体と重鎖の一部からなる断片を作り出すことで作製され得る、または、組換え技術を用いて作製され得る。抗体の「Ｆａｂ’断片」は、抗体全体をペプシンで処理し、引き続いて還元処理し、軽鎖全体、および、Ｖ_Ｈと１つの定常ドメインを含む重鎖の一部から成る分子を作り出すことで得ることができる。この方法で処理された１つの抗体から２つのＦａｂ’断片を得る。Ｆａｂ’断片はまた組換え技術で作製されることができる。抗体の「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２本のジスルフィド結合によって１つにまとめられた２つのＦａｂ’断片でできた二量体から成る。そして、抗体全体を酵素ペプシンで処理し、次に還元処理しないことでＦ（ａｂ’）２断片を得る。「Ｆａｂ_２」断片は、例えば、ロイシンジッパー、または、Ｃ_Ｈ３ドメインを用いて結合された２つのＦａｂ断片を含む組換え断片である。「単鎖Ｆｖ」、または、「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域、および、重鎖の可変領域が適切で柔軟なポリペプチドリンカーによって共有結合で結合されている抗体の可変領域断片（Ｆｖ）を含有する組換え分子である。この用語の範囲内にあるタンパク質を含むＦｖの例についての詳細な考察は本明細書において以下に提供される。

【0166】

本明細書で使用される「抗原結合部位」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を有するタンパク質によって作られる構造を意味すると理解されるものとする。抗原結合部位は一連の連続するアミノ酸、または、単一ポリペプチド鎖の形状のアミノ酸である必要もない。例えば、２本の異なるポリペプチド鎖から作製されるＦｖでは、抗原結合部位は、抗原と相互作用し、および、常にというわけではないが、一般に各可変領域につき１つ以上のＣＤＲｓを有するＶ_ＬとＶ_Ｈの一連の領域からなる。

【0167】

本明細書で使用される「定常領域」という用語は（ＣＲ、または、結晶化可能断片、または、Ｆｃと同義）、少なくとも１つの定常ドメインを含み、ならびに、一般に（必ずというわけではないが）グリコシル化されており、ならびに、１つ以上のＦ受容体、および／または、（例えば、エフェクター機能を与える）補体カスケードの構成要素に結合する抗体の一部分を意味する。重鎖定常領域はα、δ、ε、γ、または、μの５つのアイソタイプのいずれかより選択されることができる。さらに、（重鎖のＩｇＧサブクラスのような）様々なサブクラスの重鎖が様々なエフェクター機能の原因であり、したがって、望ましい重鎖定常領域を選択することにより、望ましいエフェクター機能を有するタンパク質を作製することができる。好ましい重鎖定常領域はγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、および、γ３（ＩｇＧ３）である。

【0168】

「定常ドメイン」は、抗体／同じ種類の抗体、例えば、ＩｇＧ、または、ＩｇＭ、または、ＩｇＥにおいて非常に類似した配列を持つ抗体中のドメインである。抗体の定常領域は一般に複数の定常ドメインを含み、例えば、γ重鎖、α重鎖、および、δ重鎖の定常領域は３つの定常ドメインを含み、そして、γ重鎖、α重鎖、および、δ重鎖のＦｃは２つの定常ドメインを含む。μ重鎖、および、ε重鎖の定常領域は４つの定常ドメインを含み、そして、Ｆｃ領域は２つの定常ドメインを含む。

【0169】

「単離された」という用語は、タンパク質がその天然環境から実質的に取り除かれること、例えば、タンパク質が異種性の環境中にあることを意味し、および／または、タンパク質に夾雑する物質が実質的に無いこと、例えば、夾雑する物質が少なくとも約７０％、もしくは、７５％、もしくは、８０％、もしくは、８５％、もしくは、９０％、もしくは、９５％、もしくは、９６％、もしくは、９７％、もしくは、９８％、もしくは、９９％無いことを意味する。

【0170】

「タンパク質」という用語は、１本のポリペプチド鎖すなわち、ペプチド結合で連結した一連の連続するアミノ酸、または、共有結合で、もしくは、非共有結合で互いに連結する一連のポリペプチド鎖（すなわち、ポリペプチド複合体）を含むと理解されるものとする。例えば、前記の一連のポリペプチド鎖は、適切な化学結合、または、ジスルフィド結合を用いて共有結合で連結されることができる。非共有結合の例は、水素結合、イオン性結合、ファンデルワールス力、および、疎水性相互作用を含む。本発明で考えられている非共有結合は、例えば、ある形状の二重特異性抗体、または、三重特異性抗体、または、四重特異性抗体、または、ＦｖにおけるＶ_ＨとＶ_Ｌの間の相互作用である。

【0171】

「ポリペプチド鎖」という用語は、ペプチド結合で連結する一連の連続するアミノ酸を意味することを前段落から意味すると理解されるであろう。

【0172】

本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、本発明のタンパク質が特定の抗原、または、特定の複数の抗原、または、前記のものを発現する細胞と、別の抗原、または、細胞と反応する、または、結合するよりも頻繁に、急速に、長い時間反応する、または、結合することを意味すると理解されるものとする。例えば、ある抗原に特異的に結合するタンパク質は、そのタンパク質がその他の抗原に結合するよりも高い親和性で、より強い結合力で、より容易に、および／または、より長い時間、その抗原に結合する。例えば、第１の抗原に特異的に結合するタンパク質は第２の抗原に特異的に結合することができる、または、できないということもまたこの定義を読むことにより理解される。それ故、「特異的な結合」は排他的な結合、または、別の抗原の検出限界以下の結合を必ずしも必要とせず、「選択的な結合」という用語がこのことを意味する。一般に、必ずというわけではないが、結合と言えば特異的結合を意味し、そして、各用語は他方の用語を明示的にに裏付けると理解されるものとする。

【0173】

本明細書で使用される「実質的に結合しない」という表現は、タンパク質が、そのタンパク質が結合すると知られている抗原に結合するレベルの２０％、または、１５％、または、１０％、または、９％、または、８％、または、７％、または、６％、または、５％、または、４％、または、３％、または、２％を超えるレベルで、ある抗原に結合することがないことを意味すると理解されるものとする。１つの例において、結合は、ウェスタンブロッティング、および／または、ＦＡＣＳ、および／または、ＥＬＩＳＡ、および／または、（例えば、粒子、例えば、ファージの表面上の抗体可変領域による）抗体パニング、および／または、ＢＩＡｃｏｒｅ解析によって検出される。例えば、本発明のタンパク質は、正しく折りたたまれ、ジスルフィド結合で結合したＰＩ１６に結合するレベルの２０％以下、または、１５％以下、または、１０％以下のレベルで還元型アルキル化ＰＩ１６に結合する。

【0174】

本明細書で使用される「検出できるほど結合しない」という表現は、バックグラウンドを有意に超えるレベルで抗原にタンパク質が結合しないことを、例えば、バックグラウンドよりも１０％未満、または、８％、または、６％、または、５％高いレベルでＰＩ１６に結合することを意味すると理解されるものとする。ある抗体の場合、その抗体はアイソタイプ対照抗体よりも１０％未満、または、８％、または、６％、または、５％高いレベルで抗原に結合する。１つの例において、結合は、ウェスタンブロッティング、および／または、ＦＡＣＳ、および／または、ＥＬＩＳＡ、および／または、（例えば、粒子、例えば、ファージの表面上の抗体可変領域による）抗体パニング、および／または、ＢＩＡｃｏｒｅ解析によって検出される。

【0175】

本明細書で使用される「ある配列を含むエピトープに特異的に結合する」という用語は、タンパク質が列挙された配列内の１つ以上の残基に結合する、または、その残基と接触することを意味すると理解されるであろう。その用語は、結合に関わるＰＩ１６のその他の成分を排除するものではない。例えば、本明細書に例示されるタンパク質はある配列に結合するが、しかしながら、結合した配列の外側にあるＰＩ１６中のジスルフィド結合の存在が結合に影響を与える。１つの例において、そのタンパク質はＰＩ１６中の他のどんなエピトープにも結合しない。

【0176】

本明細書で使用される「ある配列に含有されるエピトープ」という用語は、列挙された配列内にタンパク質が結合する配列が含有されることを意味すると理解されるであろう。その用語は、結合に関わるＰＩ１６のその他の要素を排除しない。例えば、本明細書に例示されるタンパク質はある配列に結合するが、しかしながら、結合した配列の外側にあるＰＩ１６中のジスルフィド結合の存在がその結合に影響を与える。１つの例において、そのタンパク質はＰＩ１６中の他のどんなエピトープにも結合しない。

【0177】

「エピトープはＰＩ１６内のジスルフィド結合の形成に依存している。」という表現は、ＰＩ１６がジスルフィド結合を含むとき、あるタンパク質が結合するが、しかしながら、それは、ＰＩ１６がジスルフィド結合を含まないとき（例えば、還元化された、および／または、アルキル化されたとき）、実質的に結合しないエピトープを意味すると理解されるであろう。

【0178】

本明細書で使用される「還元型」という用語は、ジスルフィド結合を壊すように処理されたタンパク質、および／または、タンパク質中のスルフヒドリル（ＳＨ）基の酸化を還元するように処理されたタンパク質を意味すると理解されるものとする。

【0179】

本明細書で使用される「ＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマ」という用語は、受託番号ＰＴＡ−１０６８５でＡＴＣＣに寄託された米国標準培養コレクション（ＡＴＣＣ）という名称のハイブリドーマを意味すると理解されるものとする。本明細書のいくつかの場合において、ＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマによって分泌される抗体はＣＲＣＢＴ−０２−００１と称される。

【0180】

本明細書で使用される「ペプチダーゼインヒビター１６」、または、「ＰＩ１６」（高システイン分泌タンパク質９、ＣＲＩＳＰ９、ＰＳＰ９６結合タンパク質、または、ＰＳＰＢＰと同義）は、前立腺分泌タンパク質（ＰＳＰ）９４と相互作用する高システイン分泌タンパク質（ＣＲＩＳＰ）ファミリーのタンパク質を意味すると理解されるであろう。ＰＩ１６の例はＲｅｅｖｅｓら（２００５年）に記載される。ヒトＰＩ１６の配列の例は配列番号１に示される。マウスＰＩ１６の配列の例は配列番号２に示される。ラットＰＩ１６の配列の例は配列番号３に示される。チンパンジーＰＩ１６の配列の例は配列番号４に示される。図１に示される配列アラインメントにおいて明らかにされるように、ヒト、マウス、ラット、および、チンパンジーのＰＩ１６という最も多様な配列は５２％の配列同一性を共有する。したがって、「ＰＩ１６」という用語と関連の用語は、配列番号１〜４の１つ以上に記載の配列と少なくとも約５２％同一の配列を含むタンパク質を包含する。好ましくは、ＰＩ１６はヒトＰＩ１６である。

【0181】

本明細書で使用される、「エピトープ」（「抗原決定基」と同義）は、ＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマが産生する抗体が結合するＰＩ１６の領域を意味すると理解されるものとする。この用語は、その抗体が接触する特定の残基、または、構造に必ずしも限定されない。例えば、この用語は、その抗体が接触する数アミノ酸に及ぶ領域、および／または、この領域の外側の５〜１０アミノ酸、または、２〜５アミノ酸、または、１〜３アミノ酸を含む。ある例において、前記エピトープはＰＩ１６の一連の連続するアミノ酸である。しかしながら、あるエピトープはまた、ＰＩ１６が折りたたまれるときに互いに近接する一連の非連続的なアミノ酸、すなわち、「立体構造的エピトープ」を含むことができる。当業者はまた、「エピトープ」という用語はペプチド、または、ポリペプチドに限定されないということを理解するであろう。前記のものを含むエピトープ、または、ペプチド、または、ポリペプチドを、そのエピトープに対する抗体を作成するために動物に投与することができる。

【0182】

「競合的に阻害する」という用語は、ＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマによって産生されるＰＩ１６に対する抗体の結合を本発明のタンパク質が低減させる、または、妨害することを意味すると理解されるものとする。ＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマによって産生される抗体の結合をそのタンパク質が完全に阻害する必要はなく、むしろ、統計学的に有意な量まで、例えば、少なくとも約１０％、または、２０％、または、３０％、または、４０％、または、５０％、または、６０％、または、７０％、または、８０％、または、９０％、または、９５％まで結合を低減する必要があるだけであると上述のことから明らかであるだろう。結合の阻害を競合的に測定する方法は当該分野において公知であり、および／または、本明細書に記載される。例えば、前記タンパク質が存在する状態で、または、存在しない状態で前記抗体はＰＩ１６に曝露される。前記タンパク質が存在しない状態よりも、前記タンパク質が存在する状態で少ない抗体が結合するとき、前記タンパク質は抗体の結合を競合的に阻害したと考えられる。前記タンパク質と抗体が実質的に同時にＰＩ１６に曝露されることが好ましい。

【0183】

２つのエピトープの関係において「重複する」という表現で、１つのエピトープに結合する抗体が、他方のエピトープに結合する抗体の結合を競合的に阻害することを可能にするほどに十分な数のアミノ酸残基を２つのエピトープが共有することを意味すると理解されるものとする。例えば、本発明は、ＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマによって産生される抗体がそのエピトープに結合するのを阻害するのに十分な数の残基を共有するあるエピトープと結合するタンパク質を包含する。

【0184】

本明細書で使用される、「Ｔｒｅｇ」、または、「制御性Ｔ細胞」という用語は、Ｔｒｅｇ細胞以外のＴ細胞の活性を低減させる、もしくは、抑制する能力を持ち、および／または、Ｔ細胞を殺す能力を持つ、少なくともＣＤ４、および／または、ＣＤ２５を発現するＴ細胞を意味すると理解されるものとする。この用語は、低レベルのＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、および、ＩＬ−１を産生し、そして、免疫系の活性化を抑制するように作用するＴ細胞を含む。制御性Ｔ細胞は、活性化シグナルによって（例えば、抗原、および、抗原提示細胞、またはＭＨＣについて抗原を模倣するシグナルによって、例えば、抗ＣＤ３抗体、および、抗ＣＤ２８抗体によって）培養液中で刺激を受けたＴ_Ｈ１、Ｔ_Ｈ２、または、ナイーブＴ細胞の増殖とサイトカイン産生を活発に抑制する。１つの例において、Ｔｒｅｇ細胞はＦｏｘＰ３を発現する（しかしながら、ある細胞がＴｒｅｇ細胞であるか、または、そうではないか決定するためにＦｏｘＰ３の発現を検出することは必要ではない。）。この用語はまた変異型のＴｒｅｇ細胞、例えば、Ｔｒｅｇ細胞に由来するが、表現型のレベルで、または、機能のレベルで、または、構造的なレベルで少なくとも１つの差異を示す細胞を包含する。例えば、治療用タンパク質、すなわち、Ｔｒｅｇ細胞の機能を変化させる、または、強化するタンパク質を発現するように変異体、または、変異型が作り変えられている可能性がある。そのような変化は、自然突然変異的に生じる、または、（例えば、細胞株の作成を達成するために）細胞が意図的に癌化される、または、形質移入されるときのように、指向された操作の結果として生じる可能性がある。

【0185】

「Ｔｒｅｇ細胞の活性」という用語は、免疫反応、例えば、（本明細書に記載されるもののような）混合リンパ球反応を用いて評価される、および／または、本明細書に記載されるインビボアッセイを用いて評価される免疫反応を抑制する、または、低減させる能力を含む。この用語はまた、ある細胞の抗炎症性サイトカイン、例えば、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、および、ＩＬ−１０を分泌する能力を包含する。Ｔｒｅｇ細胞の別の活性はＦｏｘＰ３の発現である。

【0186】

「Ｔｒｅｇ細胞関連症状」という用語は、Ｔｒｅｇ細胞の数、および／または、活性の調節が有益な作用をもたらすことができる任意の疾病、または、疾患、または、病状を包含すると理解されるものとする。この用語は対象の免疫系の制御性Ｔ細胞介在性抑制に関連する症状、例えば、（例えば、ヘルパーＴ細胞、または、ＣＴＬ細胞、または、Ｔ_Ｈ１７細胞、または、１つ以上のＴ細胞によって調節されるその他の細胞による）過剰な免疫反応に関連する、または、それが原因の症状を包含する。したがって、この用語は炎症、および／または、自己免疫症状を包含する。Ｔｒｅｇ細胞関連症状の例として、神経系の炎症性疾患（例えば、多発性硬化症）、または、粘膜炎症性疾患（例えば、炎症性腸疾患、喘息、または、扁桃炎）、または、炎症性皮膚疾患（例えば、皮膚炎、乾癬、または、接触過敏症）、または、自己免疫性関節炎（例えば、リウマチ性関節炎）が挙げられる。好ましいＴｒｅｇ細胞関連症状として、リウマチ性関節炎が挙げられる。ある実施形態において、炎症性疾患はアレルギー性炎症性疾患である。Ｔｒｅｇ細胞関連症状のその他の例として、Ｔｒｅｇ細胞の過剰な数、および／または、活性を特徴とする症状が挙げられる。例えば、移植片に対する免疫反応、または、移植片対宿主病、または、宿主対移植片病もまたＴｒｅｇ細胞関連症状である。この用語はまた、癌を含み、例えば、その癌では、Ｔｒｅｇ細胞が癌細胞に対する免疫細胞の活性を抑制し、それによってその疾患が発生することが可能になる。

【0187】

本明細書で使用される「Ｔ_Ｈ１７介在性症状」という用語は、Ｔ_Ｈ１７細胞の過剰な数、または、活性によって特徴づけられる、または、それが原因の任意の症状を意味すると理解されるものとする。Ｔ_Ｈ１７細胞は、ＩＬ１７を発現するＣＤ４^＋Ｔ細胞であることを当業者は理解するであろう。Ｔ_Ｈ１７細胞はまた、一般にＣＣＲ６、および／または、ＣＣＲ４を発現する。Ｔ_Ｈ１７介在性症状の例として、自己免疫／炎症（例えば、乾癬、炎症性腸疾患、関節炎（例えば、リウマチ性関節炎）、多発性硬化症、および、炎症性腸疾患（例えば、クローン病））、および、移植片対宿主病が挙げられる。

【0188】

本明細書で使用される「優先的に移動する」という用語は、対象中の特定の部位（例えば、炎症部位、および／または、皮膚に）に、対象中のその他の細胞よりも速く、または、高濃度で、好ましくは、ＰＩ１６（および、所望によりＣＣＲ６，および／または、ＣＣＲ４）を発現しないＴｒｅｇ細胞よりも速く、または、高濃度で移動する細胞を意味する。

【0189】

本明細書で使用される「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、または、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、特定の疾患、または、症状の少なくとも１つの症状の発生を止める、または、妨げるのに十分な治療上有効量の本発明のタンパク質を投与することを含む。

【0190】

本明細書で使用される「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、または、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、特定の疾患、または、症状の少なくとも１つの症状を低減させる、または、除去するのに十分な治療上有効量の本明細書に記載のタンパク質を投与することを含む。

【0191】

本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒトを含む任意の動物、好ましくは哺乳類を意味すると理解されるものとする。対象の例にヒト、霊長類、家畜（例えば、ヒツジ、ウシ、ロバ、ブタ）、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕らえられた野生の動物（例えば、キツネ、シカ）が含まれるが、これらに限定されない。前記動物はヒト、または、霊長類であることが好ましい。前記動物はヒトであることがさらに好ましい。

【0192】

「試料」という用語は、列挙された試料（例えば、血液試料）、および、その任意の画分（例えば、血漿、血清、または、白血球層）、または、それに由来する細胞（例えば、末梢血単核球細胞）、または、その加工された形状を包含すると理解されるものとする。

【0193】

本明細書で使用される、細胞集団について「濃縮された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」、または、「濃縮する（ｅｎｒｉｃｈ）」という用語は、Ｔｒｅｇ細胞の数、または、パーセンテージが天然の細胞集団における細胞数、または、パーセンテージよりも大きいことを意味すると理解されるものとする。例えば、Ｔｒｅｇ細胞が濃縮された集団は、前記細胞の少なくとも約０．０２％、または、前記細胞の少なくとも約０．０５％、または、前記細胞の少なくとも約０．１％、または、前記細胞の少なくとも約０．２％、または、前記細胞の少なくとも約０．５％、または、前記細胞の少なくとも約０．５％、または、前記細胞の少なくとも約０．８％、または、前記細胞の少なくとも約１％、または、前記細胞の少なくとも約２％、または、前記細胞の少なくとも約３％、または、前記細胞の少なくとも約４％、または、前記細胞の少なくとも約５％、または、前記細胞の少なくとも約１０％、または、前記細胞の少なくとも約１５％、または、前記細胞の少なくとも約２０％、または、前記細胞の少なくとも約２５％、または、前記細胞の少なくとも約３０％、または、前記細胞の少なくとも約４０％、または、前記細胞の少なくとも約５０％、または、前記細胞の少なくとも約６０％、または、前記細胞の少なくとも約７０％、または、前記細胞の少なくとも約８０％、または、前記細胞の少なくとも約８５％、または、前記細胞の少なくとも約９０％、または、前記細胞の少なくとも約９５％、または、前記細胞の少なくとも約９７％、または、前記細胞の少なくとも約９８％、または、前記細胞の少なくとも約９９％から成る。

【0194】

ＰＩ１６ポリペプチド
好ましいポリペプチドＰＩ１６は配列番号１〜４のいずれか１つ以上に少なくとも約５２％の配列同一性を示す配列を含む。配列同一性の程度は少なくとも約５３％、または、５５％、または、６０％、または、６２％、または、７０％、または、７５％、または、８０％、または、８５％、または、９０％、または、９５％、または、９９％であることが好ましい。当業者に知られることになるであろうが、インシリコ解析を含む標準的な技法を用いて、例えば、ＢＬＡＳＴを用いて前記核酸、および／または、タンパク質の天然の変異型、および／または、変異体を同定することが可能である。

【0195】

核酸、または、ポリペプチドのパーセント同一性は、ギャップクリエーションペナルティー（ｇａｐ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）＝５、および、ギャップエクステンションペナルティー（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）＝０．３を用いるＧＡＰ解析（ＧＣＧプログラム）（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０年）で決定される。クエリー配列の長さが少なくとも５０残基であり、そして、ＧＡＰ解析が少なくとも５０残基の領域にわたって２つの配列を整列させる。クエリー配列の長さが少なくとも１００残基であり、そして、ＧＡＰ解析が少なくとも１００残基の領域にわたって２つの配列を整列させることがさらにずっと好ましい。２つの配列がその全長にわたって整列することが最も好ましい。

【0196】

可変領域含有タンパク質
本発明は、抗体ＣＤＲを含むタンパク質であって、ＰＩ１６に結合し、そして、ＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマによって産生される抗体のＰＩ１６への結合を競合的に阻害するタンパク質を含む任意のタンパク質を企図する。

【0197】

本発明はまた、少なくとも３つの抗体ＣＤＲｓを含む（および、いくつかの実施形態において、６つの抗体ＣＤＲｓを含む）任意のタンパク質であって、ＰＩ１６に結合し、そして、ＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマによって産生される抗体のＰＩ１６への結合を競合的に阻害するタンパク質を提供する。

【0198】

本発明は、ＰＩ１６に結合し、そして、ＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマによって産生される抗体のＰＩ１６への結合を競合的に阻害する抗体可変領域を含む任意のタンパク質を企図する。抗体可変領域の例は、モノクローナル抗体、および、その修飾型（例えば、ヒト化抗体）、および、ラクダ類免疫グロブリン、および、ＩｇＮＡＲのような重鎖抗体の可変領域である。

【0199】

抗体
抗体を作成する方法は当該分野において公知であり、ならびに／または、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）、もしくは、Ｚｏｌａ（１９８７年）に記載される。一般的に、そのような方法では、ＰＩ１６タンパク質、または、免疫原性断片、または、そのエピトープ、または、前記のものを発現し、および、提示する細胞（すなわち、免疫原）は、所望により任意の適切な、または、望ましい担体、アジュバント、または、薬剤的に許容可能な賦形剤と製剤されて、非ヒト動物対象、例えば、マウス、ニワトリ、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウマ、ウシ、ヤギ、または、ブタに投与される。前記免疫原は鼻腔内投与経路で、筋肉内投与経路で、皮下投与経路で、静脈内投与経路で、皮内投与経路で、腹腔内投与経路で、または、その他の公知の投与経路で投与されることができる。

【0200】

免疫後に様々な時点で免疫した動物の血液試料を採取することによりポリクローナル抗体の産生をモニターすることができる。望ましい抗体の力価を達成することが必要である場合、１回以上の免疫を行うことができる。適切な力価に達するまで、追加免疫と力価測定のステップが繰り返される。望ましいレベルの免疫原性が得られたとき、免疫した動物から採血し、そして、血清が単離され、保存される、および／または、モノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）を作成するためにその動物を使用する。

【0201】

モノクローナル抗体が好ましい。「モノクローナル抗体」、または、「ＭＡｂ」という用語は同じ抗原に、好ましくは、その抗原内の同じエピトープに結合する能力を持つ均一な抗体の集団を意味する。この用語は、抗体の出所、または、抗体の作製方法に関して限定的であることを意図するものではない。

【0202】

Ｍａｂｓの作製について、例えば、米国特許第４，１９６，２６５号、または、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）、または、Ｚｏｌａ（１９８７年）に例示される技法のような多くの公知の技術のうちのいずれか１つを用いることができる。

【0203】

例えば、抗体産生細胞を刺激するのに十分な条件で、効果量のタンパク質、または、免疫原性断片、または、そのエピトープ、または、前記のものを発現する細胞で適切な動物を免疫する。ウサギ、マウス、および、ラットのようなげっ歯類動物が好ましい動物であり、マウスが最も好ましい。（例えば、国際公開第２００２／０６６６３０号、Ｌｏｎｂｅｒｇら，１９９４年、Ｔｏｍｉｚｕｋａら，２０００年、および、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，２００７年に記載される）ヒト免疫グロブリンタンパク質を発現し、および、好ましくは、ネズミ科免疫グロブリンタンパク質を発現しないように遺伝子操作されたマウスもまた本発明の抗体を作成するために好ましい。

【0204】

免疫の次に、抗体、特にＢリンパ球（Ｂ細胞）を産生する可能性がある体細胞を、ＭＡｂ作成プロトコルにおいて使用するために選択する。これらの細胞は脾臓、扁桃、もしくは、リンパ節の生体検査材料から、または、末梢血試料から得ることができる。次に、免疫した動物のＢ細胞を、一般に免疫原で免疫した動物と同種の動物に由来する不死化骨髄腫細胞と融合する。細胞膜の融合を促進する（化学的、または、電気的な）１つの作動因子、または、複数の作動因子の存在下で前記細胞種の混合物をインキュベートしてＢ細胞と不死化細胞の細胞を融合する。センダイウィルスを用いる融合方法がＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５年）、ならびに、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７６年）によって記述されている。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、３７％（体積／体積）ＰＥＧを用いる方法がＧｅｆｔｅｒら（１９７７年）によって詳述されている。電気的融合促進方法の使用もまた適切である。

【0205】

組織培養培地中にヌクレオチドの新規合成を妨げる薬剤を含む選択培地でハイブリッド細胞を培養して増殖させた。好ましい薬剤の例はアミノプテリン、メトトレキサート、および、アザセリンである。

【0206】

例えば、フローサイトメトリー、および／または、免疫組織化学、および／または、免疫アッセイ（例えば、放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫アッセイなど）で増殖したハイブリドーマを抗体特異性、および／または、力価についての機能選択に供する。本発明はまた、例えば、本明細書に例示される抗体産生細胞のサブクローニングを企図する。

【0207】

あるいは、ＭＡｂを分泌する細胞株を作成するために（例えば、Ｌａｒｇａｅｓｐａｄａら，１９９６年、および、Ｋｕｍａｒら，１９９９年に記載されるように）ＡＢＬ−ＭＹＣ技術（ＮｅｏＣｌｏｎｅ、マジソン、ウィスコンシン州 ５３７１３、米国）を用いる。

【0208】

米国特許第６，３００，０６４号、欧州特許第０３６８６８４号、および／または、米国特許第５，８８５，７９３号に記載されるように、ディスプレイライブラリー、例えば、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングして抗体を作製、または、単離することもできる。

【0209】

キメラ抗体、および、キメラタンパク質
１つの例において、本発明の抗体はキメラ抗体である。「キメラ抗体」という用語は、重鎖、および／または、軽鎖の一部分が、特定の種（例えば、マウスのようなネズミ科動物）に由来する抗体に対応する配列と同一であり、もしくは、相同であり、または、特定の抗体クラス、もしくは、サブクラスに属し、一方、その鎖の残りの部分は別の種（例えば、ヒトのような霊長類）由来の抗体に対応する配列と同一であり、もしくは、相同であり、または、別の抗体のクラス、もしくは、サブクラスに属する抗体を意味し、ならびに、望ましい生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片を意味する。典型的には、キメラ抗体は、主としてヒトのドメインを用いる抗体を作製するために、げっ歯類動物の、または、ウサギの可変領域とヒト定常領域を利用する。キメラ抗体の作製方法は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、および、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，１９８４年に記載される。

【0210】

本発明はまたキメラタンパク質、例えば、ある種、または、抗体サブタイプの可変領域が別の種、または、抗体サブタイプのタンパク質のある領域に融合するキメラタンパク質を含む。例えば、本発明は、ある種の１つの定常ドメインに融合した別の種の可変領域を含むタンパク質を企図する。

【0211】

ヒト化、および、ヒト抗体／タンパク質
本発明の抗体、または、タンパク質はヒト化抗体、もしくは、ヒト抗体、または、ヒト化タンパク質、もしくは、ヒトタンパク質であり得る。

【0212】

「ヒト化抗体」という用語は、キメラ分子であって、組換え技術を用いて一般に調製され、ヒトではない種の抗体に由来する抗原結合部位、または、可変領域、ならびに、前記分子の残りの抗体構造にヒト抗体の構造、および／もしくは、配列に基づく抗体構造を有するキメラ分子を意味すると理解されるものとする。その抗原結合部位は、ヒト抗体の可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域に融合した非ヒト抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、および、ヒト抗体由来の残りの領域を含むことが好ましい。抗原結合部位は野生型であり得るし、または、１つ以上のアミノ酸置換によって修飾され得る。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、受容側抗体にも移入されるＣＤＲ配列、または、フレームワーク配列にも見られない残基を含むことができる。

【0213】

非ヒト抗体、または、その部分（例えば、可変領域）をヒト化する方法は当該技術分野において公知である。米国特許第５，２２５，５３９号、または、米国特許第ＵＳ５，５８５，０８９号の方法に従い、げっ歯類のＣＤＲ、または、ＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することでヒト化を本質的に行うことができる。抗体をヒト化するその他の方法を排除することはない。

【0214】

抗体分子、および、結合タンパク質との関連で本明細書において使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト、例えば、ヒト生殖系列細胞、または、体細胞に見られる配列由来の、または、配列に対応する可変抗体領域（例えば、Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、ＣＤＲ、および、ＦＲ領域）、および、所望により定常抗体領域を有する抗体を意味する。「ヒト」抗体という用語はヒト配列にコードされないアミノ酸残基、例えば、無作為突然変異、または、インビトロで部位特異的突然変異（特に、保存的置換を含む突然変異、または、前記抗体の少数の残基、例えば、前記抗体の１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは、５つの残基、好ましくは、例えば、前記抗体の１つ以上のＣＤＲを構成する１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは、５つの残基の突然変異）を含むことができる。実際には、これらの「ヒト抗体」をヒトが産生する必要はなく、むしろ、組換え技術を用いてそれらを作製することができ、ならびに／または、（例えば、上述したような）ヒト抗体の定常領域、および／もしくは、可変領域をコードする核酸を含む形質導入動物（例えば、マウス）からそれらを単離することができる。（例えば、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，１９９１年、Ｍａｒｋｓら，１９９１年、米国特許第５，８８５，７９３号に記述される）ファージディスプレイライブラリーを含む当該分野に公知の様々な技術を用いてヒト抗体を作製することもできる。

【0215】

選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体を「ガイデッドセレクション」と呼ばれる技術を用いて作成することもできる。この取り組みにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を導くために用いる（Ｊｅｓｐｅｒｓら，１９８８年）。

【0216】

本発明のヒトタンパク質はヒト抗体の可変領域を含む。

【0217】

脱免疫化抗体、および、脱免疫化タンパク質
本発明はまた脱免疫化抗体、および、脱免疫化タンパク質を企図する。脱免疫化抗体、および、脱免疫化タンパク質は１つ以上のエピトープ、例えば、Ｂ細胞エピトープ、または、Ｔ細胞エピトープを除去させて（すなわち、変異させて）、それによって対象がその抗体、または、タンパク質に対して免疫反応を生じる可能性を低減させる。脱免疫化抗体、および、脱免疫化タンパク質の作製方法は当該技術分野において公知であり、および、例えば、国際公開第００／３４３１７号、国際公開第２００４／１０８１５８号、および、国際公開第２００４／０６４７２４号に記載される。

【0218】

適切な変異を導入する方法、ならびに、その結果生じるタンパク質を発現させ、および、検定する方法は、本明細書における解説に基づき当業者に明らかであるだろう。

【0219】

重鎖抗体
重鎖抗体は、それらが重鎖を含むが、軽鎖を含まない限りにおいて、多くのその他の形態をとる抗体と構造的に異なる。したがって、これらの免疫グロブリンはまた「重鎖のみ抗体」とも称される。例えば、ラクダ類、および、軟骨魚類（ＩｇＮＡＲとも呼ばれる）で重鎖免疫グロブリンが見られる。

【0220】

天然重鎖抗体に存在する可変領域は、それらを通常の４本鎖抗体に存在する（「Ｖ_Ｈドメイン」と称される）重鎖可変用域、および、通常の４本鎖抗体に存在する（「Ｖ_Ｌドメイン」と称される）軽鎖可変領域と区別するために、一般にラクダ類抗体では「Ｖ_ＨＨドメイン」、および、ＩｇＮＡＲではＶ−ＮＡＲと称される。

【0221】

ラクダ類の重鎖抗体、および、その可変領域、ならびに、その作製、および／または、単離、および／または、利用の方法の一般的な解説は、特に次の引用文献、国際公開第９４／０４６７８号、国際公開第９７／４９８０５号、および、国際公開第９７／４９８０５号に見られる。

【0222】

軟骨魚類の重鎖免疫グロブリン、および、その可変領域、ならびに、その作製、および／または、単離、および／または、利用の方法の一般的な解説は、特に国際公開第２００５／１１８６２９号、Ｓｈａｏら（２００７年）、ならびに／または、ＤｏｏｌｅｙおよびＦｌａｊｎｉｋ（２００６年）に見られる。

【0223】

可変領域含有タンパク質
単一ドメイン抗体
いくつかの例において、本発明のタンパク質は単一ドメイン抗体である（それは「ドメイン抗体」、または、「ｄＡｂ」という用語と互換的に使用される）。単一ドメイン抗体はある抗体の重鎖可変ドメインの全部、または、一部分を含む一本鎖ポリペプチドである。ある実施形態において、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、ウォルサム、マサチューセッツ州、例えば、米国特許第６，２４８，５１６号、国際公開第９０／０５１４４号、国際公開第２００３／００２６０９号、および／または、国際公開第２００４／０５８８２０号を参照のこと。）。

【0224】

二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体
抗体可変領域を含む好ましいタンパク質の例は二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、および、国際公開第９８／０４４００１号、および、国際公開第９４／００７９２１号に記載されるもののような高次タンパク質複合体である。

【0225】

例えば、二重特異性抗体は、２本の結合したポリペプチド鎖を含むタンパク質であり、各ポリペプチド鎖は構造Ｖ_Ｌ−Ｘ−Ｖ_Ｈ、または、Ｖ_Ｈ−Ｘ−Ｖ_Ｌを含み、Ｖ_Ｌは抗体軽鎖可変領域であり、Ｖ_Ｈは抗体重鎖可変領域であり、Ｘは一本鎖ポリペプチド中のＶ_Ｈ、および、Ｖ_Ｌが結合する（もしくは、Ｆｖを形成する）ことを可能にするには不十分な残基を含むリンカーであり、または、Ｘは存在せず、および、１つのポリペプチド鎖のＶ_Ｈは他方のポリペプチド鎖のＶ_Ｌに結合して抗原結合部位を形成する、すなわち、１つ以上の抗原に特異的に結合する能力を持つＦｖ分子を形成する。各ポリペプチド鎖においてＶ_Ｌ、および、Ｖ_Ｈは同じであることができ、または、各ポリペプチド鎖においてＶ_Ｌ、および、Ｖ_Ｈは、二特異的な（すなわち、異なる特異性を持つ２つのＦｖｓを含む）二重特異性抗体を形成するように、異なっていることができる。

【0226】

当業者は二重特異性抗体、三重特異性抗体、および／または、四重特異性抗体、ならびに、その作製方法を理解するであろう。二重特異性抗体、三重特異性抗体、および／または、四重特異性抗体について記述する文献の例として、国際公開第９４／０７９２１号、国際公開第９８／４４００１号、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３年）、ＨｕｄｓｏｎおよびＫｏｒｔｔ（１９９９年）、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ（２００５年）、ならびに、それらで引用される文献が挙げられる。

【0227】

単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片
当業者は、ｓｃＦｖが一本鎖ポリペプチド中にＶ_Ｈ領域、および、Ｖ_Ｌ領域を含むことを理解するであろう。そのポリペプチド鎖が、ｓｃＦｖが抗原結合にとって望ましい構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをＶ_Ｈ、および、Ｖ_Ｌの間にさらに含む（すなわち、一本鎖ポリペプチドのＶ_Ｈ、および、Ｖ_Ｌが互いに結合してＦｖを形成するために、）ことが好ましい。例えば、そのリンカーは、ｓｃＦｖにとってより好ましいリンカーのうちの１つである（グリシン_４セリン）_３を有する１２アミノ酸より多いアミノ酸残基を含む。

【0228】

本発明はまたジスルフィド結合で安定化されたＦｖ（または、ｄｉＦｖ、もしくは、ｄｓＦｖ）を考慮し、そのＦｖでは１つのシステイン残基がＶ_ＨのＦＲ、および、Ｖ_ＬのＦＲに導入され、ならびに、そのシステイン残基がジスルフィド結合によって連結されて安定的なＦｖを生じる（例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら，１９９３年を参照のこと。）。

【0229】

代わりに、または、加えて、本発明は、二量体型ｓｃＦｖ、すなわち、非共有結合、または、共有結合で、例えば、（例えば、Ｆｏｓ、または、Ｊｕｎ由来の）ロイシンジッパードメインにより連結された２つのｓｃＦｖ分子を含むタンパク質（例えば、ＫｒｕｉｆおよびＬｏｇｔｅｎｂｅｒｇ，１９９６年を参照のこと。）を提供する。あるいは、十分な長さのペプチドリンカーで２つのｓｃＦｖを連結して、例えば、米国特許第２００６０２６３３６７号に記載されるように、両方のｓｃＦｖが抗原を形成し、および、抗原に結合するのを可能にする。

【0230】

ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４年）を参照のこと。

【0231】

ミニ抗体
当業者は、ミニ抗体はある抗体のＣ_Ｈ２ドメイン、および／または、Ｃ_Ｈ３ドメインに融合したある抗体のＶ_Ｈドメイン、および、Ｖ_Ｌドメインを含むことを理解するであろう。所望により、そのミニ抗体はＶ_Ｈ、および、Ｖ_Ｌの間にヒンジ領域を含んでいてよく、時には、この立体構造はＦｌｅｘミニ抗体（Ｈｕら，１９９６年）と称される。ミニ抗体はＣ_Ｈ１、または、Ｃ_Ｌを含まない。Ｖ_Ｈドメイン、および、Ｖ_Ｌドメインが抗体のヒンジ領域、および、Ｃ_Ｈ３ドメインに融合することが好ましい。前記ミニ抗体の可変領域の少なくとも１つは本発明の方法でＰＩ１６に結合する。ミニ抗体の例、および、その製造方法は、例えば、国際公開第９４／０９８１７号に記載される。

【0232】

その他の可変領域含有タンパク質
本発明はまたその他の可変領域含有タンパク質、例えば、
（ｉ）米国特許第５，７３１，１６８号に記載の「鍵と鍵穴」二特異性タンパク質、
（ｉｉ）例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に記載のヘテロ複合体タンパク質、
（ｉｉｉ）例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、または、Ｂｒｅｎｎａｎ（１９８５年）に記載の化学架橋剤を用いて作製したヘテロ複合体タンパク質、
（ｉｖ）Ｓｈａｌａｂｙ（１９９２年）に記載のＦａｂ’−ＳＨ断片、
（ｖ）単鎖Ｆａｂ（例えば、Ｈｕｓｔら，２００７年）、または、
（ｖｉ）（例えば、欧州特許第１９９３０３０２８９４号に記載の）Ｆａｂ_３
を企図する。

【0233】

定常領域融合体
本発明は、可変領域、および、定常領域（例えば、Ｆｃ）、または、そのドメイン、例えば、Ｃ_Ｈ２ドメイン、および／または、Ｃ_Ｈ３ドメインを含むタンパク質を包含する。当業者は、本明細書における開示、および、本明細書において考察される引用文献に基づいて、定常領域、および、定常ドメインという用語の意味を理解するであろう。

【0234】

本発明のタンパク質の作製に有用である定常ドメイン配列を数多くの異なる出所から得ることができる。いくつかの例において、前記タンパク質の定常ドメイン、または、その一部分はヒト抗体に由来する。さらに、定常ドメイン、または、その一部分は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、および、ＩｇＥを含む任意の抗体クラス、ならびに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および、ＩｇＧ４を含む任意の抗体アイソタイプに由来することができる。好ましい例において、ヒトＩｇＧ１アイソタイプが使用される。

【0235】

様々な定常ドメイン遺伝子配列（例えば、ヒト定常ドメイン遺伝子配列）は公に利用可能な寄託物の形で入手可能であり、または、その配列は公に利用可能なデータベースから入手可能である。特定のエフェクター機能を持つ（または、特定のエフェクター機能を欠く）、または、免疫原性を低下させるために特定の修飾を有する定常ドメインを選択することができる。

【0236】

本明細書で使用される「エフェクター機能」という用語は、Ｆｃ領域、または、その一部分（例えば、Ｃ_Ｈ２ドメイン）が免疫系のタンパク質、および／または、細胞に結合し、そして、様々な生物学的作用を媒介する機能上の能力を意味する。エフェクター機能は抗原依存的、または、非抗原依存的であり得る。「抗原依存性エフェクター機能」は、ある抗体の対応する抗原への結合に引き続いて通常誘導されるエフェクター機能を意味する。典型的な抗原依存性エフェクター機能には、補体依存性細胞毒性、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、抗体依存性Ｔ細胞介在細胞毒性（ＡＤＣＣ）、炎症メディエーターの放出、免疫系細胞活性化の調節、胎盤通過、および、抗体産生の制御が挙げられる。

【0237】

本明細書で使用される「非抗原依存性エフェクター機能」という用語は、免疫グロブリンがその対応する抗原に結合しているかに関わらず、それによって誘導され得るエフェクター機能を意味する。典型的な非抗原依存性エフェクター機能には、抗体の細胞輸送、循環半減期、および、排除速度、ならびに、精製の容易化が挙げられる。

【0238】

１つの例において、本発明のタンパク質変異体は、あるいは、より定常領域ドメインが部分的に、または、完全に欠質されている合成変異型定常領域（「ドメイン欠質型定常領域」）を含む。本発明はまた、エフェクター機能を変化した、例えば、エフェクター機能を改善した、または、低減させた修飾型Ｆｃ領域、または、部分を包含する。多くのそのような修飾型Ｆｃ領域は当該技術分野において公知であり、および、例えば、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０６３８１５号、または、国際公開第２００５／０４７３２７号に記載される。

【0239】

親和性成熟
さらなる例において、現有の抗体、例えば、ＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマによって分泌される抗体、または、そのヒト化型は親和性成熟を受けて、高くなった親和性でＰＩ１６に結合する能力を有する抗体を産生する。例えば、Ｖ_Ｌ、および／または、Ｖ_Ｈをコードする配列を単離し、ならびに、１つ以上のアミノ酸置換を導入してＣＤＲをコードする領域（例えば、Ｖ_Ｌ、および／または、Ｖ_ＨのＣＤＲ３をコードする領域）に突然変異を起こさせる。次に、その結果生じた変異型タンパク質をＰＩ１６への結合について、例えば、競合アッセイでスクリーニングにかける。

【0240】

本発明に従うタンパク質は可溶性分泌タンパク質であり得る、または、細胞、もしくは、粒子（例えば、ファージ、または、その他のウィルス、リボソーム、または、胞子）の表面上に融合タンパク質として提示されることができる。ファージディスプレイ法の例は、例えば、米国特許第５，８２１，０４７号、米国特許第６，２４８，５１６号、および、米国特許第６，１９０，９０８号に記載される。標的抗原、例えば、ＰＩ１６への結合に十分な立体構造を持つ提示されたタンパク質を同定するために、これらの方法を用いて作製されるファージディスプレイ粒子を次にスクリーニングされる。

【0241】

タンパク質の作製
１つの例において、本発明のタンパク質は、そのタンパク質を産生するのに十分な条件で、例えば、本明細書に記載される、および／または、当該技術分野において公知である条件の下で本発明のハイブリドーマを培養することで、作製される。

【0242】

組換え発現
組換えタンパク質の場合、前記のものをコードする核酸を発現ベクターに組み込むことが好ましく、そのベクターは次に宿主細胞、好ましくは、ジスルフィド架橋、または、ジスルフィド結合を生じることができる細胞、例えば、大腸菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または、哺乳類細胞、例えば、本来は免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または、骨髄腫細胞に、組換え宿主細胞でタンパク質の合成を得るために形質移入される。免疫グロブリンをコードするＤＮＡの細菌での組換え発現についての総説には、Ｓｋｅｒｒａら（１９９３年）、および、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９２年）が挙げられる。これらの目的を達成するための分子クローニング技術は当該技術分野において公知であり、および、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、または、Ｓａｍｂｒｏｏｋにおいて記載される。様々なクローニング方法、および、インビトロ増幅方法が組換え核酸の構築に適切である。組換え抗体の作製方法がまた当該技術分野において公知である。米国特許第４，８１６，５６７号、および、Ｑｕｅｅｎら（１９８９年）を参照のこと。

【0243】

単離に引き続いて、本発明のタンパク質をコードする核酸をさらなるクローニングのために（ＤＮＡの増幅のために）、または、無細胞系、もしくは、細胞での発現のために発現コンストラクト、または、複製可能なベクターに挿入することが好ましい。その核酸がプロモーターに機能的に結合することが好ましい、

【0244】

本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、その最も広い文脈で理解されるものとし、ならびに、例えば、発生刺激、および／もしくは、外部刺激に応答して、または、組織特異的な様式で核酸の発現を変化させるその他の調節要素（例えば、上流域活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー、および、サイレンサー）と共に、または、それら調節要素無しで正確な転写開始に必要なＴＡＴＡボックス、または、転写開始エレメントを含むゲノム遺伝子の転写調節性配列を含む。本明細書において、「プロモーター」という用語はまた、それに機能的に結合する核酸が発現するようにし、発現を活性化し、または、発現を増大させる組換え核酸、合成核酸、もしくは、融合核酸、または、派生物を説明するために用いられる。好ましいプロモーターは、前記核酸の発現をさらに増大するため、ならびに／または、空間的発現、および／もしくは、時間的発現を変化させるために１つ以上の特定の調節要素のコピーをさらに含有することができる。

【0245】

本明細書で使用される「〜に機能的に結合する」という用語は、ある核酸について、その核酸があるプロモーターによって制御されるようにそのプロモーターが位置することを意味する。

【0246】

無細胞発現系がまた本発明よって企図される。例えば、本発明のタンパク質をコードする核酸は適切なプロモーター、例えば、Ｔ７プロモーターに機能的に結合し、そして、その結果生じる発現コンストラクトを転写、および、翻訳に十分な条件に曝す。インビトロ発現、または、無細胞発現に典型的な発現ベクターが説明されてきており、および、ＴＮＴ Ｔ７システム、および、ＴＮＴ Ｔ３システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＥＸＰ１−ＤＥＳＴベクター、および、ｐＥＸＰ２−ＤＥＳＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むが、これらに限定されない。

【0247】

細胞での発現のために多くのベクターが利用可能である。ベクター要素は一般に、シグナル配列、（例えば、本明細書で提供される情報に由来する）本発明のタンパク質をコードする配列、エンハンサー要素、プロモーター、および、転写終結配列うちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。当業者はタンパク質の発現に適切な配列を理解するであろう。例えば、シグナル配列の例には、原核生物分泌シグナル（例えば、ｐｅｌＢシグナル、アルカリホスファターゼシグナル、ペニシリナーゼシグナル、Ｉｐｐシグナル、または、熱安定性エンテロトキシンＩＩシグナル）、酵母分泌シグナル（例えば、インベルターゼリーダー配列、α因子リーダー配列、または、酸ホスファターゼリーダー配列）、または、哺乳類動物分泌シグナル（例えば、ヘルペスシンプレックスｇＤシグナル）が含まれる。

【0248】

プロモーターの例には、原核生物で活性があるプロモーター（例えば、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼプロモーター、および、乳糖プロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、および、ｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーター）が挙げられる。

【0249】

哺乳類細胞で活性があるプロモーターの例には、サイトメガロウィルス最初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）、ヒト伸長因子１αプロモーター（ＥＦ１）、核内低分子ＲＮＡプロモーター（Ｕ１ａ、および、Ｕ１ｂ）、αミオシン重鎖プロモーター、シミアンウィルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、トリ肉腫ウィルスプロモーター（ＲＳＶ）、アデノウィルス主要後期プロモーター、βアクチンプロモーター、ＣＭＶエンハンサー／βアクチンプロモーターを含むハイブリッド調節要素、または、免疫グロブリンプロモーター、もしくは、その活性断片が含まれる。有用な哺乳類動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０で形質変換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）、ヒト胚性腎臓細胞株（２９３細胞、または、懸濁培養での増殖に適したサブクローンされた２９３細胞）、ハムスター幼体腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）、または、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）である。

【0250】

例えば、ピチア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、出芽酵母、および、分裂酵母を含む群より選択される酵母細胞のような酵母細胞での発現に適した典型的なプロモーターには、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ｎｍｔプロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、または、ＴＥＦ１プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。

【0251】

前記のものを含む核酸分子、または、遺伝子コンストラクトを発現のために細胞に導入する方法は当業者に公知である。所与の細胞に用いられる技術は公知の成功した技術による。細胞に組換えＤＮＡを導入する方法には、数ある中でも、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥデキストラン介在性形質移入、リポソームが介在する形質移入、例えば、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ、メリーランド州、米国）、および／または、セルフェクチン（Ｇｉｂｃｏ、メリーランド州、米国）を使用することが介在する形質移入、ＰＥＧ介在性ＤＮＡ取り込み、電気穿孔法、および、例えば、ＤＮＡ被覆タングステン粒子、または、ＤＮＡ被覆金粒子（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州、米国）を用いることによる微小粒子銃法が含まれる。

【0252】

本発明のタンパク質を作製するために使用する宿主細胞は、使用される細胞種に応じて、様々な培地で培養されることができる。ハムＦｌ０（Ｓｉｇｍａ）、最小基本培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍ））、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍ）、および、ダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍ）のような市販の培地が哺乳類細胞の培養に適している。本明細書において議論されるその他の細胞種の培養のための培地は当該技術分野において公知である。

【0253】

タンパク質の単離
本発明のタンパク質は単離されることが好ましい。

【0254】

本発明のタンパク質の精製方法は当該技術分野において公知であり、および／または、本明細書に記載される。

【0255】

組換え技術を使用するとき、本発明のタンパク質は細胞内に、周辺質の空間に産生される、または、培地中に直接分泌されることができる。そのタンパク質が細胞内に産生されるとき、第１ステップとして、特定の破片、宿主細胞か溶解された細胞の断片のどちらかが、例えば、遠心分離、または、限外濾過によって除去される。そのタンパク質が培地中に分泌される場合、そのような発現系の上清は一般に、まず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、アミコン、または、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅのペリコン限外濾過ユニットを用いて濃縮される。タンパク質分解を阻害するためにＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害剤を前述のステップのいずれのステップにも含むことができ、および、外来性の汚染菌の増殖を防ぐため抗生物質を含むことができる。

【0256】

前記細胞から調製されるタンパク質を、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、親和性クロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、または、プロテインＧクロマトグラフィー）、または、上述のものの任意の組合せを用いて精製することができる。これらの方法は当該技術分野において公知であり、および、例えば、国際公開第９９／５７１３４号、または、Ｚｏｒａ（１９９７年）に記載される。

【0257】

当業者はまた、精製、または、検出を容易にするためにタグ、例えば、ポリヒスチジンタグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグ、または、インフルエンザウィルスヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、または、シミアンウィルス５（Ｖ５）タグ、または、ＦＬＡＧタグ、または、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを含むように本発明のタンパク質を改変することができるを理解するであろう。そのタグはヘキサヒスチジンタグであることが好ましい。その結果生じたタンパク質は次に当該技術分野において公知である方法を用いて、例えば、親和性精製を用いて精製される。例えば、ヘキサヒスチジンタグを含むタンパク質は、そのタンパク質を含む試料を固形担体、または、半固形担体に固定化された、ヘキサヒスチジンタグと特異的に結合するニトリロ三酢酸ニッケル（Ｎｉ−ＮＴＡ）に接触させ、結合していないタンパク質を除去するために試料を洗浄し、および、その後、結合したタンパク質を溶出することによって精製される。代わりに、または、加えて、タグに結合するリガンド、または、抗体が親和性精製方法で用いられる。

【0258】

複合体
本発明はまた任意の実施形態に従う本明細書に記載されるタンパク質の複合体を提供する。タンパク質が複合体化することができる化合物の例は、放射性同位体、検出可能な標識物質、治療用化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象中で前記タンパク質の半減期を増加させる化合物、および、その混合物を含む群より選択される。治療薬剤の例には、抗血管新生剤、抗新血管形成薬剤、および／もしくは、その他の抗血管形成薬剤、抗増殖薬剤、アポトーシス促進薬剤、化学療法薬剤、または、治療用核酸が含まれるが、これらに限定されない。

【0259】

毒素には、細胞に有害な（例えば、細胞を殺す）任意の薬剤が含まれる。当該技術分野において公知であるこれらの部類の薬剤、および、その作用機序の解説については、Ｇｏｏｄｍａｎら（１９９０年）を参照のこと。免疫グロブリン−免疫毒複合体の調製に関する追加の技術は、例えば、Ｖｉｔｅｔｔａ（１９９３年）、および、米国特許第５，１９４，５９４号に提供される。毒素の例として、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の）エクソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、および、ＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、および、トリコテセン系が挙げられる。例えば、国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。

【0260】

本発明の免疫複合体を形成するのに適した化学療法剤には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デ−ヒドロテストステロン、グルココルチコイド類、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、および、ピューロマイシン、抗代謝薬類（例えば、メトトレキサート、６‐メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５‐フルオロウラシル、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、クラドリビン）、アルキル化剤類（例えば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）、クロラムブチル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、および、他のプラチナ派生物、例えば、カルボプラチン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ））が挙げられる。

【0261】

１つの例において、任意の実施形態に従う本明細書に記載されるタンパク質は、例えば、本明細書に記載される抗体、または、それに由来するタンパク質のような本発明の別のタンパク質、または、抗体可変領域を含むタンパク質を包含する別のタンパク質と複合体化する、または、結合する。他のタンパク質が排除されることはない。さらなるタンパク質は当業者に明らかであろう。そして、その他のタンパク質には、数ある中でも例えば、免疫調節因子、または、半減期延長タンパク質、もしくは、ペプチド、または、血清アルブミンに結合するタンパク質が含まれる。

【0262】

血清アルブミン結合ペプチド、または、タンパク質の例は、米国特許第２００６０２２８３６４号、または、米国特許第２００８０２６０７５７号に記載される。

【0263】

放射性複合体化タンパク質の作製のために様々な放射性核種が利用可能である。^１３Ｃ、^１５Ｎ、^２Ｈ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、^９９Ｔｃ、^４３Ｋ、^５２Ｆｅ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^１１１Ｉｎ等のような（例えば、診断目的に適切な）低エネルギー放射性核種が例に含まれるが、これらに限定されない。その放射性核種は、投与から画像化部位への局在化まで時間が経過した後の放射活性、または、検出を可能にするのに適した半減期を有するγ線放出核種、光子放出核種、または、陽電子放出核種であることが好ましい。本発明はまた、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１２３Ｉ、^１１１Ｉｎ、^１０５Ｒｈ、^１５３Ｓｍ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^１６６Ｈｏ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、および、^１８８Ｒｅのような（例えば、治療目的の）高エネルギー放射性核種を包含する。これらの同位体は、典型的に、短飛程の高エネルギーα粒子、または、β粒子を発生する。そのような放射性核種は近傍にある細胞、例えば、前記複合体が付着した、または、入り込んだ新生物細胞を殺す。それらは、それらが局在していない細胞にはほとんど、または、全く作用を持たず、および、本質的に非免疫原性である。あるいは、本来は安定な同位体の熱照射、例えば、ホウ素中性子捕捉療法（Ｇｕａｎら，１９９８年）のような熱照射によって高エネルギー同位体を作成することができる。

【0264】

別の実施形態において、前記タンパク質は細胞プレターゲティングに用いる（ストレプトアビジンのような）「受容体」と複合体化し、その複合体は患者に投与され、引き続いて、除去剤を用いて血流から結合していない複合体が除去され、そして、治療薬剤（例えば、放射性ヌクレオチド）と複合体化している「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。

【0265】

当該技術分野において公知であるさらなる非タンパク質性部分を含有するように、本発明のタンパク質を修飾することができる。そのタンパク質の誘導体化に適した部分は生理的に許容できる高分子であることが好ましく、水溶性高分子であることが好ましい。そのような高分子は本発明のタンパク質の安定性の増大、および／または、（例えば、腎臓による）排除の低減、および／または、免疫原性の低減に有用である。水溶性高分子の非限定的な例にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、または、プロプロピレングリコール（ＰＰＧ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0266】

１つの例において、任意の実施形態に従う本明細書に記載されるタンパク質は検出、および／または、単離を容易にする１つ以上の検出可能なマーカーを含む。例えば、前記化合物は、例えば、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、塩化ダンシル、ローダミン、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、および、シアニンダイ類Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、および、Ｃｙ７、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）のような蛍光標識を含む。これらの蛍光物質の最大吸光波長、および、最大発光波長は、それぞれ、ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ、５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ、５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ、５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ、６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ、７０３ｎｍ）、および、Ｃｙ７（７５５ｎｍ、７７８ｎｍ）である。

【0267】

代わりに、または、加えて、任意の実施形態に従う本明細書に記載されるタンパク質は、例えば、（例えば、米国特許第６，３０６，６１０号に記載される）蛍光量子ドットで標識される。

【0268】

代わりに、または、加えて、前記タンパク質は、例えば、鉄、鋼、ニッケル、コバルト、希土類、ネオジム−鉄−ホウ素、鉄−クロム−コバルト、ニッケル−鉄−コバルト−プラチナ、または、ストロンチウムフェライトのような磁性、または、常磁性化合物で標識される。

【0269】

固定化タンパク質
１つの例において、タンパク質は固形の、または、半固形の基材に固定化される。「固定化」という用語は、タンパク質を、例えば、国際公開第９９／５６１２６号、または、国際公開第０２／２６２９２号に記載の特定の基材に固定化する様々な方法、および、技術を含むと理解されるものとする。例えば、固定化はタンパク質を安定化するように役立つことができ、その結果、特に保存の間に、または、１回分使用している間に、生物学的、化学的、または、物理的曝露によってタンパク質の活性が低下することがない、または、不利に改変されることがない。

【0270】

例えば、Ｔｒｅｇ細胞を捕捉するように、および／または、基材に植え付けたＴｒｅｇ細胞を保持するように、対象への移植を可能にする基材にタンパク質を固定化することができる。

【0271】

あるいは、試料、好ましくは、血液試料を前記基材と、例えば、連続的に反応させる。

【0272】

本発明の趣旨において、３つの基本的な方法が固定化のために用いられ得る。タンパク質を基材に固定化する様々な方法は当該技術分野において公知であり、および、架橋、担体への結合、半透過性基材内での保持を含む。

【0273】

基材の例に、多孔性ゲル、酸化アルミニウム、ベントナイト、アガロース、デンプン、ナイロン、または、ポリアクリルアミドが含まれる。

【0274】

本発明のタンパク質の活性試験
競合的結合の決定
ＣＲＣＢＴ−０２−００１により分泌される抗体の結合を競合的に阻害するタンパク質の測定試験は、当業者に明らかであろう。例えば、ＣＲＣＢＴ−０２−００１により分泌される抗体を、検出可能な標識、例えば蛍光標識または放射性標識と複合体化する。次いで、標識抗体および試験用タンパク質を混合してＰＩ１６もしくはそのエピトープと接触またはこれらを発現する細胞と接触させる。次いで標識抗体レベルを測定し、タンパク質の非存在下で標識抗体をＰＩ１６、エピトープ、または細胞と接触させた場合に測定されたレベルと比較する。試験用タンパク質存在下での標識抗体レベルが、非存在下と比較して減少している場合、タンパク質がＣＲＣＢＴ−０２−００１により分泌される抗体の結合を競合的に阻害している。

【0275】

任意で、試験用タンパク質をＣＲＣＢＴ−０２−００１により分泌される抗体とは異なる標識と複合体化する。これにより、試験用タンパク質のタンパク質、エピトープ、または細胞に対する結合レベルを検出することができる。

【0276】

別の例において、タンパク質のエピトープがＣＲＣＢＴ−０２−００１により分泌される抗体と結合したエピトープと同じ、または重複しているかどうかを、タンパク質のエピトープをマッピングして決定する。エピトープマッピングの方法は、当業者に明らかであろう。例えば、ＰＩ１６配列に及ぶ一連の重複ペプチド例えば１０〜１５アミノ酸を含むペプチドを産生する。次いで、タンパク質を各ペプチドと接触させて、タンパク質が結合したペプチドを決定する。これにより、タンパク質が結合したエピトープを含むペプチドの測定が可能となる。複数の非近接ペプチドがタンパク質と結合している場合、タンパク質は立体構造エピトープに結合している。

【0277】

あるいは、またはさらに、ＰＩ１６中のアミノ酸残基を、例えばアラニン系統的変異導入法（alanine scanning mutagenesis）により突然変異させ、タンパク質の結合を減少させるまたは防ぐ突然変異体を決定する。任意のタンパク質の結合を減少させるまたは防ぐ突然変異株体は、タンパク質により結合されたエピトープ内にある可能性が高い。

【0278】

あるいは、またはさらに、タンパク質はＣＲＣＢＴ−０２−００１により分泌される抗体が結合するエピトープを用いて産生し、したがってタンパク質は同じエピトープに結合する可能性が高い。

【0279】

任意で、ＰＩ１６またはそのエピトープに関するタンパク質の解離定数（Ｋｄ）。本発明のＰＩ１６結合タンパク質に関する「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、放射性標識ＰＩ１６結合試験（ＲＩＡ）により測定されるものの一例である。この試験は、非標識ＰＩ１６の滴定系列の存在下でタンパク質と放射性ＰＩ１６の最小濃度の平衡を保たせる。非結合ＰＩ１６を除去するための洗浄に続いて、タンパク質のＫｄを示す放射能量を測定する。別の例によると、ＫｄまたはＫｄ値を、ＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）を用いてＰＩ１６を固定する表面プラズモン共鳴試験を用いることにより測定する。好ましくは、ＣＲＣＢＴ−０２−００１により分泌される抗体と同様のＫｄまたはこれより高いＫｄを有するタンパク質が選択され、これらのタンパク質はＰＩ１６への結合と競合する可能性が高い。

【0280】

インビトロ機能試験
本発明のタンパク質を用いて単離された細胞のＴｒｅｇ活性への効果または本発明のタンパク質の効果を測定するインビトロの例示的方法は、例えば、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）または混合リンパ球培養（ＭＬＣ）である。そのような方法は、細胞混合物例えば本明細書に記載の方法により単離されたＴｒｅｇ細胞とアロタイプが異なるＴ細胞を一緒に培養することを含む。次いでＴｒｅｇ活性を測定するため数種類の計測が行われることができ、例えば細胞増殖を標準的手法、例えば、^１３Ｈチミジン取り込み試験（Ｔｒｅｇ細胞の不活性状態を示す活性Ｔ細胞の増殖を示す）；および／またはＴｒｅｇ細胞またはＴｒｅｇの活性もしくは不活性を示し得る他のＴ細胞のいずれかによるサイトカイン分泌試験を用いて計測する。そのような方法は、制御能力をもつＴｒｅｇ細胞を同定するおよび／またはＴｒｅｇ活性を誘発する／増強するもしくは抑制する／防止する化合物を同定するのに有用である。例示的なＭＬＲについてはＷａｎｇら，２００８年に記載される。

【0281】

あるいは、またはさらに、タンパク質のＴｒｅｇ細胞への効果を測定するインビトロな方法は、５，６−カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）サプレッサー試験、例えば実施例において本明細書に記載の方法である。そのような試験では、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻細胞をＣＦＳＥで標識化する。次いで、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻のＣＦＳＥ標識Ｔ細胞を、本発明に従って単離された様々な量の細胞の存在下で、照射ＰＢＭＣで培養する。十分な時間の後、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の増殖をフローサイトメトリにより試験する。各ＣＦＳＥシグナルピークは１つの分裂周期を表す。Ｔｒｅｇ細胞の細胞増殖抑制能を、制御性細胞集団が存在しないＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞のＣＦＳＥシグナルピークと比較することにより評価する。例示的なＣＦＳＥサプレッサー試験についてはVenkenら，(2007年)に記載されている。

【0282】

さらなる例において、本発明に従って単離されたＴｒｅｇ細胞をエフェクタＴ細胞の存在下で培養し、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）を発現するエフェクタＴ細胞（ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻）数を測定する。Ｔｒｅｇ細胞非存在下でのＣＤ１５４^＋細胞数と比較してＣＤ１５４を発現する細胞（すなわち活性化Ｔ細胞）数を減少させる細胞は、Ｔｒｅｇ活性を有すると考えられる。この試験については、以下でより詳細に記載する。

【0283】

あるいは、またはさらに、Ｔｒｅｇ細胞を本明細書に記載のように単離し、試験用化合物の存在下または非存在下で培養し、活性化させる。次いでＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−βの分泌を標準的な方法、例えばＥＬＩＳＡまたはＦＬＩＳＡを用いて評価する。

【0284】

本発明のタンパク質の転移細胞に対する活性を評価する例示的方法は、例えばマトリゲルでの細胞遊走アッセイまたはコロニー形成である。遊走アッセイでは、ＰＩ１６を発現する転移細胞集団を細胞培養装置のチャンバ内に、すなわち液体伝達内に、転移細胞を誘引する化合物（化学誘引物質）を含む別のチャンバと共に留置する。この２つのチャンバは膜、例えば、対象に見られる細胞外マトリックスを模倣した膜により分離されている。膜を介した一方のチャンバから別のチャンバへの細胞遊走量が、タンパク質の存在下または非存在下で評価され、（タンパク質を含有しない）対照試料と比較して遊走量が減少したタンパク質は、転移を阻害すると考えられる。例示的方法についてはAlbiniら，(1987年)およびRepesh,(1989年)に記載されている。

【0285】

本発明のタンパク質の心筋細胞に対する活性を評価する例示的方法は、ＰＩ１６を過剰発現する心筋細胞集団をタンパク質と接触させることである。ＰＩ１６の過剰発現は心筋細胞の発育不全を誘発する（または成長を防止する）。したがって結果として心筋細胞を拡大させて心筋細胞にＰＩ１６を過剰発現させるタンパク質は、心疾患の治療に有用であると考えられる。

【0286】

当業者に明らかであるように、スクリーニング方法は、細胞死、細胞増殖および／または細胞生存のレベルの検出が関与し得る。そのような方法は当業者に公知である。

【0287】

ある実施形態では、タンパク質活性での細胞死を、例えばアポトーシスなどの細胞死に関連する細胞成分の検出方法を用いて、（例えば、細胞を殺す化合物を単離するため）評価する。細胞における細胞死の検出方法は当業者に公知である。例えば、ＡＰＯＰＴＥＳＴ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈから入手可能）は細胞をアポトーシス初期に染色し、細胞試料を固定する必要がない。この方法は、アポトーシスを起こしている細胞に特徴的な細胞膜再構成を検出するアネキシンＶ抗体を利用する。この方法により染色されたアポトーシスを起こした細胞は、次いで固定したアネキシンＶ抗体を用いて、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、ＥＬＩＳＡのいずれかにより、または接着とパニングにより分別され得る。あるいは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ビオチン化ＵＴＰニックエンドラベル化（ＴＵＮＥＬ）試験を用いて細胞死のレベルを測定する。ＴＵＮＥＬ試験は酵素の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いてアポトーシスの際に生じる３’−ＯＨ ＤＮＡ末端を標識し、ヌクレオチドをビオチン化する。次いでビオチン化ヌクレオチドを、検出可能なマーカーと複合体化されたストレプトアビジンを用いることにより検出する。ＴＵＮＥＬ染色キットは、例えば、Ｉｎｔｅｒｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｕｒｃｈａｓｅ、ニューヨーク州から入手可能である。Ｔｒｅｇ細胞を選択的に殺す化合物を同定および／または単離するために、そのような試験を他の細胞、例えばヘルパーＴ細胞および／またはＣＴＬにより実施することができる。

【0288】

あるいは、細胞生存率または細胞代謝を検出および／または評価することができる。例として、非蛍光性レザズリンを、本発明のタンパク質存在下で培養した細胞に添加する。生存細胞はレザズリンを、例えば顕微鏡または蛍光プレートリーダーを用いて容易に検出できる赤色蛍光レゾルフィンに還元する。この細胞生存率マーカーは細菌から高等真核細胞まで種々の異なる細胞型に有用である。細胞生存率分析キットは例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡから入手可能である。細胞生存率に関する他の試験として、例えば、生細胞内での水溶性テトラゾリウムＧＬＴ００８（ＷＳＴ−８）のホルマザン塩への還元を検出する試験（Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、細胞内エステラーゼにより蛍光性カルセインに変換する細胞透過性カルセイン−アセトキシメチル（カルセインＡＭ）による生細胞の染色、３′−｛１−［（フェニルアミノ）カルボニル］−３，４−テトラゾリウム｝−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）ベンゼンスルホン酸水和物］（ＸＴＴ）のホルマザン塩への還元検出（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）、または（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）ＰＥＳ：フェナジンエトスルファート（ＭＴＳ）のホルマザン塩への還元（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。

【0289】

インビボ機能試験
本発明のタンパク質は、Ｔｒｅｇ機能および／またはＴｒｅｇ数（例えば、Ｔｒｅｇ細胞を殺すことによる）を抑制するその機能を試験し、本発明のタンパク質を試験対象に投与し、Ｔｒｅｇ細胞の細胞数を標準的手法または本明細書に記載の方法を用いて検出／単離し得る。未治療対象由来のＴｒｅｇ細胞数と比較した際のＴｒｅｇ細胞数の減少は、そのタンパク質がＴｒｅｇ数を減少させることを示す。

【0290】

あるいは、またはさらに、タンパク質を、腫瘍細胞投与の際に、投与前に、または投与後に試験対象に投与する。次いで、結果として生じる任意の腫瘍の存在／非存在および／またはそのサイズを評価し、タンパク質ではなく腫瘍細胞を投与した対象と比較する。腫瘍サイズを減少させおよび／または腫瘍形成を防止するタンパク質は、Ｔｒｅｇ機能を減少させ、また腫瘍細胞への免疫応答を引き起こすことができると考えられる。例示的な方法についてはJonesら，(2002年)により記載されている。

【0291】

別の例において、本発明の試験用タンパク質を、免疫原性化合物を含む組成物の投与の際または投与前に投与する。次いで、免疫応答を、免疫原性化合物に対して、例えば、抗体応答（例えば、ＥＬＩＳＡ／ＦＬＩＳＡにより）またはＴ細胞応答（例えば、ＥＬＩＳＰＯＴまたはＦｌｕｏｒｏｓｐｏｔ）に対して計測する。あるいは、またはさらに、免疫原性化合物および組成物を、免疫応答により治療可能な症状、例えば感染または腫瘍に罹患しているまたは発症した対象に投与する。良好なモデルは、当業者に公知および／または本明細書に記載されている。

【0292】

別の例において、本発明のタンパク質を使用して単離された細胞集団を、細胞をＴｒｅｇ細胞に関連する症状の動物モデルに投与することにより、決定する。例えば、細胞を、例えば骨髄破壊の結果によりＴｒｅｇ細胞が欠如した動物または、例えば（Asano(1996年); Suri-Payer(1998年)；およびMcHugh(2002年)に記載されたＦｏｘＰ３発現が欠如したマウスに投与する。自己免疫応答を抑制する、防止する、減少させる、または遅延させる細胞は、制御性Ｔ細胞機能を有すると考えられる。

【0293】

あるいは、またはさらに、任意の実施形態に従った本明細書に記載の方法により単離された細胞を、（自己免疫疾患を誘発する）ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻の移入の際、移入前、または移入後に、例えばSakaguchiら，(1995年)に記載のようにヌードマウスに投与する。自己免疫応答を抑制する、防止する、減少させる、または遅延させる細胞は、制御性Ｔ細胞機能を有すると考えられる。

【0294】

単離細胞はまた、糖尿病を抑制する、防止する、治療する、または遅延させる能力を試験するためのＮＯＤマウス（例えば、Tangら，(2004年)に記載）におよび／またはＧＶＨＤのマウスモデルに（例えばTrenado(2002年)に記載）および／または乾癬のマウスモデルに（例えばWang ら， 2008に記載）および／または関節リュウマチのモデル、例えば、マウスのＳＫＧ株に（Sakaguchiら，1995年）、ラット２型コラーゲン関節炎モデル、マウス２型コラーゲン関節炎モデルもしくは数種において関節炎モデルを誘発する抗原（Bendele, 2001年）および／または多発性硬化症のモデル（例えば、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ；BradlおよびLinington, 1996年)）および／または炎症性気道疾患（例えばＯＶＡチャレンジまたはゴキブリ抗原チャレンジ（Chenら，2007年; Lukacsら，2001年）および／または炎症性腸疾患のモデル（例えば、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発大腸炎もしくは大腸炎のＭｕｃ２欠損マウスモデル（Van der Sluisら，2006年）もしくは大腸炎のＣＤ４５Ｒｂ養子移入モデル（例えば、 Kanai ら，2006年)）に投与し得る。上記列挙したモデルのそれぞれを、好ましくは照射されヒト造血細胞により再生した造血系をもつマウスを用いて産生し、これにより「ヒト化」モデルを得る。これらのモデルはまた、Ｔｒｅｇ機能を増強または増大させる能力について、化合物を試験するのに有用である。

【0295】

さらなる例において、本発明のタンパク質の効果を、転移モデルに関し評価する。例えば、転移細胞を、マウスの例えば静脈内または腹腔内、または肺などの臓器の近傍に接種し、臓器（例えば肺）で成長する腫瘍数を評価する。細胞を、例えば蛍光色素で標識化して検出を容易することができる。臓器で成長する腫瘍数が、タンパク質により治療してきた動物での腫瘍数と比較して減少している本発明のタンパク質は、転移を減少させると考えられる。例示的手法については、Price(1990年);およびKerbel(1998年)に記載されている。

【0296】

医薬組成物および治療方法
本発明のタンパク質（活性成分と同義語）は、非経口、局所、経口、もしくは局所投与、エアロゾル投与、または経皮投与用の医薬組成物、予防的治療用の医薬組成物、または療法的治療用の医薬組成物に製剤するのに有用である。医薬組成物を、投与方法に依存して様々な単位剤形で投与し得る。例えば、経口投与に適する単位剤形として、粉末、錠剤、丸剤、カプセル剤、およびトローチ剤が挙げられる。本発明の医薬組成物は、経口投与される場合、消化から保護すべきであることが認識される。これは、典型的には、ある組成物で化合物を錯化して酸加水分解および酵素加水分解に耐性を与えるか、またはリポソームなどの適切な耐性をもつ担体に化合物をパッケージングすることにより、達成される。タンパク質を消化から保護する手段は、当業者に公知である。

【0297】

本発明の医薬組成物は特に、静脈内投与または臓器もしくは関節の体腔もしくは管腔への投与などの非経口投与に有用である。投与用の組成物は通常、薬剤的に許容可能な担体、好ましくは水性担体中に溶解した本発明のタンパク質の溶液を含む。様々な水性担体、例えば緩衝食塩水などが使用され得る。組成物は、生理的条件に近づけるのに必要な薬剤的に許容可能な補助物質、例えばｐＨ調整剤や緩衝剤、毒性調整剤など、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有することができる。これらの製剤での本発明の化合物濃度は多種多様であてよく、また液量、粘度、体重などに基づいて、選択した特定の投与モードと患者の必要性に従って選択され得る。例示的な担体として、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。混合油やオレイン酸エチルなどの非水賦形剤もまた使用することができる。リポソームもまた、担体として使用することができる。賦形剤は、等張性および化学安定性を増強する少量の添加剤、例えば緩衝液や保存料を含有することができる。

【0298】

本発明のタンパク質は、非経口投与用に製剤され得、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、または例えば腫瘍部位もしくは疾病部位への蠕動投与および直接的点滴注入（腔内投与）などの他のそのような経路を介する注入用に製剤され得る。活性成分として本発明の化合物を含有する水溶性組成物の調製は、当業者に公知であろう。

【0299】

本発明による好適な医薬組成物は、一般に本発明のタンパク質を許容できる薬学的希釈剤または賦形剤、例えば滅菌水溶液と混合した量で、使用目的によって様々な最終濃度にする量を含む。調製手法は一般にRemington’s Pharmaceutical Sciences, 16th Ed. Mack Publishing Company, 1980年、（引用により本明細書に援用される）など、当技術分野で公知である。

【0300】

製剤後、本発明の化合物を、剤形に適合する方法で、および治療効果／予防効果がある量で投与し得る。本発明の化合物の好適な用量は、特定の化合物、治療すべき症状および／または治療を受ける対象により様々であり得る。例えば最適以下の用量で開始して、最適なまたは有効な用量を決定するために徐々に用量を変更していくことにより好適な用量を決定することは、当業者の能力の範囲内である。

【0301】

ＰＩ１６はまた、腫瘍転移、心拍停止に続く心筋細胞肥大の減少または予防に関与することが示されている。したがって、本発明はさらに対象での転移を治療する方法を提供し、前記方法は本発明のタンパク質を転移に苦しむまたは転移を起こしやすい対象に投与することを含む。１つの例において、対象は乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌に罹患している。好ましくは、対象は乳癌またはその転移を罹患している。

【0302】

本発明はまた、心機能障害を治療する方法を提供し、前記方法は、本発明のタンパク質を心機能障害または心機能障害を起こしやすい対象に投与することを含む。あるいは、またはさらに、本発明は心臓機能を改善する方法を提供し、前記方法は投与を必要とする対象に本発明のタンパク質を投与することを含む。あるいは、本発明は、対象にて心筋細胞肥大を誘導する方法を提供し、前記方法は投与を必要とする対象に本発明のタンパク質を投与することを含む。

【0303】

細胞の単離または濃縮
本発明はまた、ＰＩ１６発現に基づく細胞の検出および／または単離を企図する。

【0304】

１つの例において、細胞はＴｒｅｇ細胞、例えばｎＴｒｅｇ細胞、好ましくはメモリーｎＴｒｅｇ細胞、好ましくは、休止メモリーｎＴｒｅｇ細胞である。

【0305】

１つの例において、方法は、別のマーカー、例えばＴｒｅｇ細胞のマーカーを検出することを含む。例示的なさらなるタンパク質または核酸としては、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ６２リガンド（ＣＤ６２Ｌ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、グルココルチコイド誘発性腫瘍壊死因子レセプター（ＧＩＴＲ）、膜結合型ＴＧＦ−β、ＣＤ１９６（ＣＣＲ６）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、α_４β_７インテグリンまたはα_４β_１インテグリンが挙げられる。さらに好ましいタンパク質または核酸はＣＤ４および／またはＣＤ２５である。好ましくは、ＣＤ２５を高いレベルで発現する。

【0306】

別の例において、Ｔｒｅｇ細胞を検出または単離する方法はさらに、非Ｔｒｅｇ細胞により発現される核酸またはタンパク質の低レベルまたは検出不可能な発現を検出することを含む。例示的な核酸および／またはタンパク質としては、ＣＤ１９および／またはＣＤ２０および／またはＣＤ１４および／またはＣＤ５６および／またはＣＤ１２７が挙げられる。好ましくは、本発明はＣＤ１２７（ＣＤ１２７^ｎｅｇ）を検出可能に発現しない、または低レベルのＣＤ１２７（ＣＤ１２７^ｌｏ）を発現する細胞を検出または単離することを含む。

【0307】

本明細書に使用される用語「正の発現」または「＋」は、アイソタイプ対照化合物、例えば抗体を用いて検出した場合のバックグラウンドのレベルを上回る発現を意味するものとする。

【0308】

本明細書に使用される用語「アイソタイプ対照化合物」は、化合物、好ましくは、タンパク質の発現を検出するために使用されるものと同様のアイソタイプであるが、タンパク質の特異性に関連せずにタンパク質の発現を検出するために使用される化合物と同じ検出可能部分と複合体化する抗体を意味するものとする。そのような対照は、特異的結合から非特異的な「バックグラウンド」結合を識別するのに役に立つ。

【0309】

「高い」レベルまたは「ハイ」レベルな発現に対する言及は、ＦＡＣＳ解析を用いて測定した場合に、列挙したマーカー（例えば、ＰＩ１６）を最も高いレベルで発現する細胞集団のうち、細胞の５０％、好ましくは４０％、３０％、またはより好ましくは２０％、より好ましくは細胞の１０％を意味する。

【0310】

本明細書に使用される用語「負の発現」または「−」は、アイソタイプ対照化合物、例えば抗体を用いて検出した場合のバックグラウンドのレベルと同等か下回る発現を意味するものとする。

【0311】

例えばＣＤ１２７発現との関連において「低い」レベルまたは「ロー」レベルな発現に対する言及は、細胞集団の列挙した核酸またはタンパク質発現が最も低いレベルである細胞が５０％または６０％または７０％または８０％または９０％であることを意味するものとする。

【0312】

所望の細胞を濃縮する一つの例示的な手法は、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）または磁気を利用するその他の細胞分離方法、例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）である。従来のＭＡＣＳ手順はMiltenyiら，(1990年)により記載されている。この手順では、細胞を、細胞表面マーカーまたはタンパク質に結合する抗体または他の化合物に結合する電磁ビーズで標識し、その細胞を、常磁性分離カラムを通過させるかまたは別の形状の磁場に曝露させる。分離カラムを強力な磁石に置き、これによりカラム内に磁場を形成する。磁気標識された細胞をカラムに捕捉し；すなわち細胞は通過しない。次いで、捕捉細胞をカラムから溶出する。

【0313】

本発明の細胞を、ＭＡＣＳを用いて好適な試料から濃縮して、好適なタンパク質を発現する細胞を分離し得る。試料をタンパク質に結合する免疫磁性ビーズと共にインキュベートする。インキュベーション後に、試料を洗浄して再懸濁して磁場を通過させて免疫磁性ビーズに結合した細胞を取り除き、タンパク質に結合した細胞を回収する。これらの技術は、陰性選択、例えばＴｒｅｇ細胞の場合の好ましくないマーカーを発現する細胞、ＣＤ８の除去に同様に適用される。

【0314】

別の例において、タンパク質または細胞表面マーカーに結合する化合物を固体表面上に固定して、細胞集団を固体表面と接触させる。洗浄して未結合細胞を取り除いた後、化合物に結合した細胞を回収し、例えば溶出することにより、化合物と結合するタンパク質を発現する細胞について単離および濃縮する。あるいは、所望であれば化合物に結合しない細胞を回収することができる。

【0315】

好ましい例において、細胞を、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いて単離または濃縮し得る。ＦＡＣＳは、粒子例えば細胞を粒子の蛍光特性に基づき分離する、例えばKamarch, 1987年に記載の公知の方法である。一般にこの方法は、細胞集団が１以上のタンパク質または細胞表面マーカーと結合することができる化合物と接触することを伴い、このうち区別可能なマーカーに結合する化合物は、様々な蛍光部分、例えば蛍光体で標識化される。流れが速い狭小の液体の流れの中心に細胞が乗って移動する。この流れは、細胞が細胞の寸法に関連して細胞同士が分離しているように配置されている。振動膜により、細胞にストリームが生じ、個々の液滴に分解する。その系を調整し、１以上の細胞を液滴にする確率が低くなるようにする。ストリームが液滴に分解する直前に、その流れを蛍光測定位置に貫通させ、そこで各細胞対象の蛍光特性、例えば標識化合物が対象と結合しているか否かを測定する。荷電リングをストリームが液滴に分解する点に配置する。電荷を蛍光強度測定の直前にリング上に配置し、ストリームから分解されたとき、対立する電荷を液滴上で捕捉する。次いで、荷電した液滴が静電偏向系を通り抜けて液滴を、その電荷例えば標識化合物が細胞と結合している場合は一方の容器に、そうでない場合は別の容器に移す。いくつかの系では、電荷が直接ストリームに印加され、分解した液滴はそのストリームと同じサインの電荷を保持する。次いで、液滴分離後にストリームを中性に戻す。

【0316】

細胞培養
単離後、本発明の細胞を標準の細胞培養条件下で維持し得る。例えば細胞は、ダルベッコ最少必須培地（ＤＭＥＭ）、または当技術分野で公知の、例えば上記のその他の適する細胞培養培地で維持し得る。他の適する培地として、例えば、ＭＣＤＢ、最少必須培地（ＭＥＭ）、ＩＭＤＭ、およびＲＰＭＩが挙げられる。

【0317】

細胞培養を、好ましくは加湿インキュベータにて約３７℃でインキュベートする。細胞培養条件は本発明の細胞により大幅に異なり得る。好ましくは、細胞を細胞増殖に好適な環境、例えば、空気中に５％Ｏ_２、１０％ＣＯ_２、８５％Ｎ_２または１０％ＣＯ_２を含む環境で維持する。

【0318】

１つの例において、Ｔｒｅｇ細胞を、任意でＩＬ−２および／またはＴＧＦ−βの存在下で増殖を促進するために抗ＣＤ３抗体の存在下で増殖させる。１つの例において、細胞をビーズ（例えば、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体で被覆された鉄デキストラン磁気ビーズ−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）の存在下で培養する。抗ＣＤ２８抗体は例において低増殖性Ｔｒｅｇ細胞の増強活性と成長に関する信号をもたらす。低い比率（抗ＣＤ２８と比較して低い抗ＣＤ３）のビーズにより増殖したＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ははるかに安定性があり、従来のＴ細胞による異常増殖が起こりにくい。ビーズは磁気カラムによる培養細胞の通過により容易に除去できる。細胞選別の必要はない。

【0319】

Ｔｒｅｇ細胞をまた、Ｔ細胞および／またはＩＬ−１０の生存率を高め、制御性Ｔ細胞および／またはＩＬ−１５の産生に部分的に関与し、ＩＬ−２と共に相乗作用を与えてＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞の増殖を誘発することが示されているサイトカイン、例えばＩＬ−４および／またはＩＬ−７の存在下で培養し得る。

【0320】

いくつかの例において、自己ＣＤ４^＋Ｔ細胞を支持細胞として使用する。あるいは、ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅの培養は例えばＩＬ−２と共に上記のビーズを用いて実施し得る。さらに培養拡大を宿主ＡＰＣ例えばＤＣにより、またはそれなしで達成し得る。

【0321】

細胞組成物
１つの例において、本発明にしたがって単離された細胞（例えば、Ｔｒｅｇ細胞および／またはその子孫細胞）は、組成物の形態で投与される。好ましくは、そのような組成物は、薬剤的に許容可能な担体を含む。

【0322】

好適な本発明のための担体としては従来使用される担体が挙げられ、例えば水、生理食塩水、水性デキストロース、ラクトース、リンゲル液、緩衝液、ヒアルロナン、およびグリコール類が、特に（等張である場合の）溶液に関しては好ましい液体担体である。好適な医薬担体としてはまた、スターチ、セルロース、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。

【0323】

別の例において、担体は、例えば細胞を成長または懸濁させる媒体組成物である。好ましくは、そのような媒体組成物は、投与された対象にいかなる副作用も誘発しない。

【0324】

好ましい担体は、細胞の生存性および／または細胞活性例えばＴｒｅｇ関連症状を減少させる、防止する、もしくは遅延させるための細胞能力に不都合な影響を与えない。

【0325】

１つの例において、担体は細胞および／または可溶性因子を好適なｐＨで維持する緩衝作用をもたらし、これにより生物活性を発揮する。例えば、担体または無効成分はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ＰＢＳは、細胞や因子との相互作用が最小限であり、また細胞や因子の迅速な遊離を可能にするため、魅力あるの担体または無効成分である。そのような場合、本発明の組成物は、血流にまたは組織もしくは組織の周辺や近傍内に例えば注入により直接適用するために、液体として作製することができる。

【0326】

本発明に従って単離された細胞（例えば、Ｔｒｅｇ細胞および／またはその子孫細胞）はまた、受容者適合性であり受容者に有害でない産物に分解する足場内に組み込まれるか埋め込まれることができるそのような。例示的な足場としては、ポリグリコール酸の骨格（例えばVacantiら，1988年; Cimaら，1991年; Vacantiら，1991年に記載された）；またはポリ酸無水物、ポリオルトエステル類、および、ポリ乳酸などの合成高分子が挙げられる。

【0327】

好ましくは、組成物は、有効量または治療有効量もしくは予防有効量の細胞を含む。例えば、組成物は、細胞を約１ｘ１０^５細胞／ｋｇから約１ｘ１０^９細胞／ｋｇまたは約１ｘ１０^６細胞／ｋｇから約１ｘ１０^８細胞／ｋｇまたは約１ｘ１０^６細胞／ｋｇから約１ｘ１０^７細胞／ｋｇ含む。投与する細胞の正確な量は、様々な要因、例えば患者の年齢、体重、および性別、ならびに治療または防止する症状の範囲と重症度に依る。

【0328】

本発明の細胞組成物は、任意の周知方法により対象の全身にまたは局所部位に投与され得る。

【0329】

免疫応答の刺激または増強
本明細書の基づき当業者に明らかであるように、本発明はまた、対象でＴｒｅｇ細胞を減少または枯渇させることにより対象での免疫応答を増強する方法を企図する。１つの例において、対象でのＴｒｅｇ細胞を減少または激減させることは、例えば、腫瘍に対しおよび／または病原体に対し（例えば、免疫原性組成物の投与なしに）免疫応答を十分に誘発する。別の例において、対象に免疫応答を誘発する方法は、対象でのＴｒｅｇ細胞を減少または激減させること、および免疫原性化合物を含む組成物を投与することを含む。

【0330】

本明細書に使用される、用語「免疫原性化合物」は、対象に取り込まれた場合に免疫応答を引き起こす（免疫状態を作る）任意の物質または有機体を意味する。いくつかの実施形態では、免疫原をワクチン形態での治療枠で使用し得る。本明細書に使用される場合、特定の定めがないかぎり用語「増強した免疫応答」は免疫原を本発明のタンパク質と組み合わせて投与した場合に、当技術分野でのまたは本明細書に記載の任意の標準的手法を用いて測定された、投与を受けた対象での免疫応答、好ましくはＴ細胞応答および／または抗体応答が本発明の化合物を投与されていない対象と比較して増加していることを意味する。

【0331】

本発明の方法で使用される免疫原性化合物は、癌抗原または腫瘍抗原であり得る。当業者に知られる任意の癌または腫瘍抗原は、本発明の免疫原性組成物に応じて使用されることができ、免疫原性組成物として、これに限定されないが、ＫＳ１／４汎腫瘍性抗原（PerezおよびWalker, 1990年）、悪性卵巣腫瘍抗原（ＣＡ１２５）（Yuら, 1991年）、前立腺酸性リン酸塩（Tailorら, 1990年）、前立腺特異的抗原（HenttuおよびVihko, 1989年）、黒色腫関連抗原ｐ９７（Estinら, 1989年）、黒色腫抗原ｇｐ７５（Vijayasardahlら, 1990年）、高分子量黒色腫抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）（Nataliら, 1987年）、前立腺特異的膜抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）（Foon et al, 1994）、ＴＡＧ−７２（Yokataら, 1982年）、ＣＯ１７−１Ａ（Ragnhammarら, 1993年）；ヒトＢ−リンパ腫抗原−ＣＤ２０（Reffら, 1994年）、ＧＤ２（Salehら, 1993年）、ガングリオシドＧＭ２（Livingstonら，1994年）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＨＥＲ２抗原が挙げられる。さらなる腫瘍抗原は、例えばNovellinoら，2005に記載されている。

【0332】

別の例において、免疫原は癌細胞またはその溶解物である。

【0333】

１つの例において癌は乳癌である。

【0334】

別の例において、癌は脳腫瘍、例えば、神経膠腫である。

【0335】

さらなる例において、癌は胃癌である。

【0336】

別の例において、癌は前立腺癌である。

【0337】

別の例において、癌は黒色腫である。

【0338】

別の例において、癌はリンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫である。

【0339】

本発明の方法で使用される免疫原はまた、感染症薬剤であることができ、感染症薬剤としてはこれに限定されないが、インフルエンザウイルス血球凝集素（Genbank Accession No. JO2132; Air, 1981年）、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（Itohら, 1986年）、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質および／もしくはＢ型肝炎ウイルス表面抗原またはそれらのフラグメントもしくは誘導体（例えば英国特許第２０３４３２３号明細書を参照のこと）が挙げられる。

【0340】

１つの例において、免疫原性化合物はポリペプチド抗原をコードするＤＮＡである。

【0341】

１つの例において、免疫原性組成物はさらにアジュバントを含む。アジュバントは、抗原免疫原性を向上させる分子および調製物である。好適なアジュバントとしては、サイトカインなどの全ての許容できる免疫刺激化合物、毒素、または合成組成物が挙げられる。多くの場合好ましいアジュバントの例としては、これに限定されないが、完全フロインドアジュバント（死滅結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含有する免疫応答の非特異的刺激剤）、不完全フロインドアジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。

【0342】

抑制および免疫応答
本発明はまた、対象において、Ｔｒｅｇ細胞数またはＴｒｅｇ活性の減少に関連する症状を治療または予防する、および／または免疫抑制を誘発するおよび／またはＣＴＬもしくはヘルパーＴ細胞活性を減少させる方法を提供し、前記方法は：
（ｉ）本明細書に記載の方法を任意の実施形態にしたがって実施することによりＴｒｅｇ細胞集団を単離すること；および
（ｉｉ）対象に（ｉ）の細胞を投与すること、を含む。

【0343】

別の例において、方法は、Ｔｒｅｇ機能を活性化する本発明のタンパク質を投与することを含む（例えば、本明細書に記載の方法を用いて評価される）。

【0344】

別の例において、方法は、固形または半固形担体を移植することを含み、固形または半固形担体には本発明のタンパク質が固定され、また任意でＴｒｅｇ細胞が結合している。

【0345】

１つの例において、対象は、Ｔｒｅｇ数および／またはＴｒｅｇ活性の減少に関連する症状に罹患しているかまたはその発症の危険性があり、および／または対象はＣＴＬもしくはヘルパーＴ細胞活性の減少を必要とし（例えば、対象は自己免疫疾患に罹患しているか発症の危険性がある）、および／または対象は免疫抑制（例えば、移植を受けているもしくは受けようとしている、または移植片対宿主病に罹患している）を必要とする。ある症状に罹患している対象を決定する方法は、本明細書の記載に基づき当業者に明らかであろう。

【0346】

１つの例において、対象は１型糖尿病に罹患している。

【0347】

別の例において、対象は多発性硬化症に罹患している。

【0348】

さらなる例において、対象は炎症性腸疾患に罹患している。

【0349】

好ましい例において、対象は関節炎例えば関節リュウマチに罹患している。

【0350】

さらなる例において、細胞は移植片（例えば細胞移植片または組織移植片または臓器移植片）を用いて投与され、これにより移植片対宿主または宿主対移植片の免疫応答を抑制または減少させる。

【0351】

治療用にＴｒｅｇ細胞を同定および／または単離および／または培養および／または製剤する方法は、本明細書に記載されている。

【0352】

診断検査／予後予測試験
本発明がＰＩ１６発現に関する症状、特にＴｒｅｇ関連症状を診断／予後予測する様々な方法を提供することは、本明細書の記載から明らかであろう。ＰＩ１６は転移、前立腺癌、および心拍停止において脱制御されていることが示されている。したがって、本発明の方法は、転移を診断または予後予測する方法（例えば、乳癌転移）に準用することを理解されるべきであり、ＰＩ１６またはＰＩ１６発現細胞レベルの増加は転移を示す。本発明の方法は、心臓肥大または心拍停止を診断または予後予測する方法に準用することを理解されるべきであり、ＰＩ１６またはＰＩ１６発現細胞レベルの増加は、心臓肥大または心拍停止を示す。本発明の方法は、前立腺癌を診断または予後予測する方法に準用することを理解されるべきであり、ＰＩ１６またはＰＩ１６発現細胞レベルの増加は、前立腺癌を示す。

【0353】

タンパク質検出試験
本発明の一例は、ＰＩ１６またはこれを発現する細胞の有無を検出する。タンパク質または細胞の量、レベル、または有無は、当業者が周知の様々な技術、例えば、フローサイトメトリ、免疫組織化学的検査、免疫蛍光検査、免疫ブロット法、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、質量分析法（タンデム質量分析法、例えばＬＣ ＭＳ／ＭＳなど）、バイオセンサ技術、エバネセント光ファイバ技術（evanescent fiber-optics technology）、またはタンパク質技術チップからなる群から選択される技術のいずれかを用いて測定される。

【0354】

一実施形態ではタンパク質の量またはレベルを測定するために使用される試験法は半定量分析である。

【0355】

別の実施形態では、タンパク質の量またはレベルを測定するために使用される試験法は定量分析である。

【0356】

好ましくは、タンパク質は、イムノアッセイにより検出される。好ましくは、免疫組織化学的検査、免疫蛍光検査、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光結合免疫吸着測定法（ＦＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、バイオセンサ試験、タンパク質チップアッセイ、および免疫染色（例えば免疫蛍光検査）からなる群から選択される試験を用い、好ましくは、検出方法はフローサイトメトリ法であり、例えばＴｒｅｇ細胞数の検出は当技術分野に知られているおよび／または本明細書に記載の蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いる。

【0357】

標準的な固相ＥＬＩＳＡまたはＦＬＩＳＡ形式は特に様々な試料由来のタンパク質濃度を測定する際に有用である。

【0358】

一形態では、ＥＬＩＳＡまたはＦＬＩＳＡは、本発明のタンパク質またはＰＩ１６の異なるエピトープに結合するタンパク質を固体マトリックス、例えば、薄膜、ポリスチレンもしくはポリカーボネートマイクロウェル、ポリスチレンもしくはポリカーボネート製ディップスティック、またはガラスサポート上で固定化することを含む。次いで、試料を固定したタンパク質と物理的に関係をもたせ、ＰＩ１６を結合または「捕捉（捕捉する）」する。次いで、結合したＰＩ１６を異なるＰＩ１６のエピトープ（例えば本発明のタンパク質）に結合する第２の標識化合物を用いて検出する。あるいは第２の（検出）抗体に結合する第３の標識抗体を用い得る。

【0359】

別の形態では、本発明のタンパク質を用いて、ＰＩ１６を発現する細胞を捕捉する。次いで、異なるタンパク質に結合する第２のタンパク質を用いて、この細胞を検出する。例えば、Ｔｒｅｇ細胞の場合、第２のタンパク質はＣＤ４またはＣＤ２５に結合し得る。当然、第２のタンパク質に結合する第３のタンパク質を検出試薬として使用し得る。

【0360】

本明細書に記載の試験形式がハイスループットフォーマット、例えばMendozaら，1999に記載されているスクリーニングフォーマットまたはマイクロアレイの自動化などに適していることは、当業者に明らかであろう。さらにまた、上記試験の変形が、例えば競合ＥＬＩＳＡなどが、当業者には明らかであろう。

【0361】

代替的な実施形態では、ポリペプチドは、当技術分野で公知の方法、例えば、免疫組織化学的検査または免疫蛍光検査などを用いて細胞内または細胞上にて検出される。免疫蛍光検査を用いる方法が、定量的または少なくとも半定量的であるので好ましい。染色した細胞の蛍光強度を定量化する方法は、当業者に公知であり、例えばCuello, 1984年に記載されている。

【0362】

バイオセンサ装置は一般に電極表面を、装置に組み込まれた素子を試験基質（基質）と組み合わせて測定する電流またはインビーダンスと組み合わせて利用する（例えば米国特許第５，５６７，３０１号などに記載される）。本発明のタンパク質をバイオセンサ装置とこの装置に接触した生体試料の表面に取り込む。バイオセンサ装置により検出した電流またはインビーダンスの変化が前記タンパク質と結合するタンパク質を示す。当技術分野で公知のバイオセンサのなかにはまた、表面プラズモン共鳴に頼りタンパク質の相互作用を検出するものもあり、これにより、表面プラズモン共鳴の反射面の変化がタンパク質のリガンドまたは抗体への結合を示す（米国特許第５，４８５，２７７号および米国特許第５，４９２，８４０号）。

【0363】

バイオセンサは、そのようなシステムをマイクロまたはナノスケールに適応させることが容易であるので、ハイスループット解析の際に特に使用される。さらにまた、そのようなシステムは好都合に適応されて数種類の検出試薬が組み込まれ、単一のバイオセンサ単位で診断試薬を多重化することができる。これにより、少量の体液で数種類のタンパク質またはペプチドを同時に検出することができる。

【0364】

画像検査方法
前述から、当業者に明らかであるように、本発明はまた、本発明のタンパク質を用いた画像検査方法を企図する。画像検査では、タンパク質を一般に検出可能な標識と複合体化するが、前記検出可能な標識は画像検査により検出可能な信号を発し得る任意の分子または薬剤であり得る。しかし、本発明のタンパク質に特異的に結合する二次標識化合物もまた使用することができる。例示的な検出可能な標識としては、タンパク質、放射性同位体、蛍光体、可視発光蛍光体、赤外線発光蛍光体、金属、強磁性体、電磁放射体、特異的な核磁気共鳴（ＭＲ）の分光学的特徴をもつ物質、Ｘ線吸収またはＸ線反射物質、または音変換物質（sound altering substance）が挙げられる。

【0365】

本発明のタンパク質（および使用するなら二次標識化合物）は、全身にまたは局所の臓器もしくは組織（もしくは癌の場合は腫瘍）に投与され画像化し得、その後画像処理される。一般には、タンパク質は、腫瘍、組織、または臓器の所望の光学イメージングをなし得るのに効果的な用量で投与される。そのような用量は、使用される特定のタンパク質、画像化する状態、画像処理する組織または臓器、使用される画像処理装置などに依存して、大幅に変化し得る。

【0366】

本発明のいくつかの例において、タンパク質は、これに限定されないが、腫瘍の画像化、臓器の断層画像化、臓器機能の監視、冠動脈造影、蛍光内視鏡検査、レーザー誘導手術、光音響法、および音響蛍光法（sonofluorescence method）など様々な生物医学的応用での組織および臓器のインビボ光学造影剤として使用される。

【0367】

画像検査方法の例としては、核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、ＭＲ、Ｘ線撮影、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波、プラナー像のガンマ線カメラ映像、単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）、他の核医学に基づくイメージング、可視光を用いた光学イメージング、ルシフェラーゼを用いた光学イメージング、蛍光体を用いた光学イメージング、他の光学イメージング、近赤外光を用いた画像化、または赤外光を用いた画像化が挙げられる。

【0368】

いくつかの例において、造影剤は、ヒト例えば本明細書に記載のモデルに使用する前に、インビトロまたはインビボ試験を用いて検査される。

【0369】

試料
本発明の方法が、インビボに基づくスクリーニングとしてよりむしろ単離組織試料でのインビトロで実施される範囲において、用語「試料」は、これに限定されないが、体液（例えば、血液または滑液または髄液）、細胞物質（例えば組織の吸引物（組織吸引物））、組織生検標本、または外科的標本などの動物由来の生体物質の任意の試料を意味することを理解すべきである。好ましくは、試料はＴｒｅｇ細胞を含むか、またはＴｒｅｇ細胞を含む可能性が高い。

【0370】

本発明の方法にしたがって使用される試料は、直接使用されることができるか、または使用前に何らかの処理を必要とし得る。例えば、生検試料または外科的試料は、使用前に均質化または細胞分散の他の形式を必要とすることができる。さらにまた、生体試料が液体形態でないに限りでは、（そのような形式が必要とされるまたは所望される場合）緩衝液などの試薬を添加して試料を動態化する必要があり得る。

【0371】

上記説明から明らかなように、そのような試験は、例えば定量化するために好適な対照例えば正常もしくは健常な個体または典型的な個体群を使用する必要があり得る。

【0372】

本明細書に使用される用語「正常な個体」は、対象が、その対象のＰＩ１６発現細胞例えば対象由来の試料でのＴｒｅｇ細胞が異常な数でないという前提で選択されることを意味するものとする。

【0373】

「健常な個体」は、症状例えばＴｒｅｇ関連症状に罹患していると診断されていないおよび／またはその症状を発症する危険性がない個体である。

【0374】

あるいは、またはさらに、好適な対照試料は、ある症状の罹患が知られていない対象の典型的な個体群に関し試験されるマーカー測定を含む対照用データセットである。

【0375】

一実施形態では、基準試料は試験において含まれない。むしろ好適な基準試料は、典型的な個体群から以前産生した既存のデータセットに由来する。試験用試料の処理、分析および／または試験から得られるデータは、次いで試料個体群のために得られたデータと比較される。

【0376】

キット
本発明はまた、本発明の検出／単離／診断／予知／治療／予防方法で用いる、本発明の化合物を含む治療／／予防／診断キットを提供する。そのようなキットは、一般に好適な容器手段内に本発明のタンパク質を収容し得る。キットはまた、例えば検出／単離／診断／画像検査または併用療法のための他の化合物を収容することができる。例えばそのようなキットは、様々な抗炎症薬および／または化学療法薬もしくは放射線治療薬；血管新生阻害剤；抗腫瘍細胞抗体；および／または抗腫瘍血管系もしくは抗間質腫瘍免疫毒素、またはコアグリガンドまたはワクチンのうちいずれか１つまたはそれ以上を含むことができる。

【0377】

１つの例において、キットはＰＩ１６の検出用であり、またさらに検出を容易にする試薬（検出可能な標識および／または検出可能な標識の基質）を含む。そのようなキットはさらに陽性対照を含むことができる。

【0378】

別の例において、キットは、細胞または細胞個体群の単離用である。そのようなキットでは、本発明のタンパク質を、ＦＡＣＳを容易にするために検出可能な標識で標識化することができる。タンパク質をまた、ＭＡＣＳを容易にするために磁性粒子または常磁性粒子により標識化することができる。タンパク質をまた、単離を容易にするために固形または半固形基質上に固定することができる。

【0379】

さらなる例において、キットは病状の治療または予防用である。そのようなキットでは、タンパク質を溶液としてまたは凍結乾燥形態（任意で再懸濁用溶液とともに）で供与することができる。タンパク質を、治療化合物と複合体化することが可能であり、またはキットがタンパク質と複合体化するための治療化合物を含むことができる。上記説明のように、キットはまた、さらなる治療化合物または予防化合物を含むことができる。

【0380】

微生物寄託詳細
ＣＲＣＢＴ−０２−００１という名称のハイブリドーマを、２０１０年２月２４日に、寄託番号ＰＴＡ１０６８５で米国標準培養コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託した。

【0381】

これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約およびその下位の規則に従い行った。これにより、寄託日から３０年間にわたり生存培養の維持が保証される。本生物は、培養物の子孫の永続的および非制限的入手を保証するブタペスト条約の条件のしたがいＡＴＣＣにより利用可能となる。

【0382】

本出願の譲渡人は、好適な条件下で培養した際に寄託培養物が死滅または消失、または損なわれた場合、直ちに通知し生存可能な同じ培養物の標本と置き換えることに同意している。寄託株の入手可能性は、政府の権限下でその特許法に準拠して付与された特許権に違反し本発明を実行する権利と解釈されるべきではない。

【実施例】

【0383】

以下の非制限的な実施例で、本発明をさらに説明する。
実施例１ Ｔｒｅｇ細胞でのＰＩ１６の同定
１．１ 材料および方法
１．１．１ 臍帯血Ｔ細胞集団の単離およびインビトロ増殖および特性解析

【0384】

臍帯血を、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ，Ｙｏｕｔｈ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅが定める母体インフォームド・コンセント（informed maternal consent）により得た。単核細胞（ＭＮＣ）を、抗凝血剤を含有する採血バッグ（Ｆｅｎｗｅｌｌ）中の分娩後の臍帯血から単離した。臍帯血ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋（Ｔｒｅｇ）およびＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻（ヘルパーＴ）細胞を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＭＮＣから単離した。各細胞型の純度をＣＤ４およびＣＤ２５の発現のために２色フローサイトメトリにより常に９０％超にした。Ｔ細胞集団（２４穴プレートにて１ｘ１０^６細胞／穴）の生体外での増殖を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５％熱不活性化ヒトプール血清（Ｌｏｎｚａ）、２ｍＭ ｌ−グルタミン、および５００Ｕ／ｍｌ組み換えヒトインターロイキン−２（ｒｈＩＬ２；Ｒ＆Ｄｒｅｓｅａｒｃｈ）を補充したＸ−Ｖｉｖｏ１５培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔｉｃｋｅｒ）にて、細胞比が３：１のビーズであるＤｙｎａｂｅａｄ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞増殖刺激ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ＃１１１−４１Ｄ）の存在下で行った。細胞を８日間Ｄｙｎａｂｅａｄｓの存在下で増殖し、その後ビーズの磁気除去を行い、１００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ２を除く上記成分を補充したＸ−Ｖｉｖｏ１５培地で培養した。使用当日、増殖した細胞の表現型について、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒのＥｐｉｃｓ Ｅｌｉｔｅ ＥＳＰフローサイトメータでの３色フローサイトメトリによるＦｏｘＰ３（ＦｏｘＰ３−Ａｌｅｘａ ４８８、ＢＤクローン２５９Ｄ／Ｃ７；ヒトＦｏｘＰ３緩衝液セット、ＢＤ カタログ番号５６００９８）の細胞内検出と組み合わせた、ＣＤ４（ＰＥｃｙ５、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ クローンＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ２５（ＰＥ、ＢＤ クローンＭ−Ａ２５１）、およびＣＤ１２７（ＰＥ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ クローンｅｂｉｏＲＤＲ７３）の表面発現の特性解析を行った。
１．１．２ ＲＮＡの調製および発現アレイ

【0385】

差次的発現解析をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトＥｘｏｎ１．０ＳＴ試験を用いて実施した。総ＲＮＡを、およそ６０時間静止させ次いで８日間の増殖手順の後に、賦形剤（ＤＭＳＯ）またはイオノマイシン処理（２時間）のいずれかを行った増殖ＣＤ４^＋２５⁻（ヘルパーＴ）およびＣＤ４^＋２５^＋（Ｔｒｅｇ）細胞より単離した。低分子量ＲＮＡを含む総ＲＮＡを、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒおよびｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて単離した。ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトＥｘｏｎ１．０ＳＴアレイへの標識化とハイブリダイゼーションを、Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｊｏｈｎ Ｃｕｒｔｉｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）にて基本的に製造業者のプロトコルに従って行い、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いてＲＮＡ品質の試験を行った。

【0386】

１．１．３ ＲＮＡ発現アレイデータ正規化
プローブ標識データを、ＲＭＡモデル（Irizarryら，2003年）を用いて、プローブレベルモデル化（probe-level modelling）（Bolstadら，2003年）を用いたＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ ｃｅｎｔｒｉｃ ｃｄｆ（Daiら，2004年）のｖ１１．０に基づき得られた最終転写レベル予想で、処理した。全処理を、統計ソフトウェアＲ（R Development Core Team）を用いて、ａｒｏｍａ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘフレームワーク（Bengtssonら，2006年、ならびに、BengtssonおよびHossjer, 2006年）のもとで行った。各試験に関するハイブリダイゼーション品質を、偽像（pseudo-image）プロット、ＮＵＳＥ、ＲＬＥ（Bolstadら，2001年）およびプローブレベルデータのヒストグラムを用いて評価した。Ｌｏｅｓｓ正規化後、個体ドナー中のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞対ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ヘルパーＴ細胞のｆｏｕｒ ｗａｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎの静止処理と刺激処理とのログ比（Log fold-change）を推定した。最終の発現解析をアレイレベル重量（array level weight）およびＲ ｐａｃｋａｇｅ ｌｉｍｍａ（Smythら，2005年、ならびに、WettenhallおよびSmyth, 2004年）を用いて行った。各項の生Ｐ値を全体的に調整し、ＦＤＲの推定値（HochbergおよびBenjamini, 1990年）を得た。

【0387】

１．１．４ 半定量的リアルタイムＰＣＲ
発現アレイ解析により同定された別々に制御される標的遺伝子の検証を、５つの別個のドナーからの増殖したＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋およびＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻細胞より単離したＲＮＡで行った。増殖、刺激、およびＲＮＡ単離条件は、発現アレイ実験で使用されるものと同じであった。無作為にプライミングされたｃＤＮＡを、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて総ＲＮＡから調製した。ｃＤＮＡを、１．２５Ｕｎｉｔｓ ＦａｓｔＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭの各プライマー、２００μＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、１．１ｘ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１ｘ ＦａｓｔＴａｑ ＰＣＲ緩衝液からなる２５μｌのｑＰＣＲ反応物中にて使用した。ｑＰＣＲに関する遺伝子特異的プライマー対をプライマーバンク（WangおよびSeed Nucleic Acids Res 31: e154, 2003年)から選択した。ＲＰＬ１３ａに特異的なプライマーセットを内部対照として用いた。サイクル条件は９４℃で５０秒、６０℃で２５秒、および７２℃で５０秒を４０サイクルであり、その後Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ６０００ＰＣＲｍａｃｈｉｎｅ（Corbet Research）を用いた融解曲線を作製した。結果を、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ６０００、Ｑ−ｇｅｎｅソフトウェア（Mullerら，2002年）およびＲを用いて解析した。

【0388】

１．１．５ 細胞表面分子発現の検証
表面分子解析について、成人末梢血ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＴｒｅｇまたはＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻ヘルパーＴ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ビーズ細胞比、１：１）および１００Ｕ／ｍｌのＩＬ２の存在下で新たに単離または単離および一晩刺激し、その後、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３およびＰＩ１６に対する抗体を用いた４色フローサイトメトリを行った。

【0389】

１．２ 結果
１．２．１ ヒト臍帯血Ｔｒｅｇの単離および検証
発現プロファイリング検査のための十分なヒトＴｒｅｇを産生するため、ヒト臍帯血から単離したおよそ１ｘ１０^６のＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｈｉ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いてインビトロで増殖させた。生体外での１ラウンドの増殖後、臍帯血Ｔｒｅｇの１００倍から２００倍の増殖が常に得られた。これらの細胞は増殖においてＴｒｅｇ表現型を維持し、増殖した細胞の９０％超がＣＤ４^＋、ＣＤ２５^ｈｉ、およびＦｏｘＰ３陽性に染色した。これらの細胞はまたＣＤ１２７^ｄｉｍであった。増殖後、細胞が不適合ドナーの混合白血球抑制試験でＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻細胞の増殖をインビトロで確実に抑制することができたことから、細胞は制御機能を保持していた。増殖した機能的なＴｒｅｇ細胞を発現プロファイリング実験に用いた。

【0390】

１．２．２ 静止および活性化Ｔｒｅｇ細胞での差次的遺伝子発現
発現プロファイリングを、単離およびインビトロで増殖した臍帯血Ｔｒｅｇで実施した。４ウェイＴｒｅｇ遺伝子発現アレイ実験を考案してＴｒｅｇおよび適合ヘルパーＴ細胞の刺激または静止状態での発現プロファイルを明らかにした。この４ウェイ比較はＴｒｅｇの内因性発現パターンを有する遺伝子、Ｔｒｅｇ特異的活性サインの一因となる遺伝子、およびＴ細胞活性化に通常応答することが示される遺伝子を同定した。全体で、１８５１遺伝子がＴｒｅｇのヘルパーＴと比較した作用に有意差を示すとみなされ、さらに７４６遺伝子が細胞型両方での活性化に同様の応答を示した。同定された遺伝子の１つであるＰＩ１６は静止および活性化ヒトＴｒｅｇ細胞の両方においてかなりの割合で発現した。

【0391】

Ｔｒｅｇアレイでの遺伝子発現プロファイルを確実にするため、遺伝子特異的な半定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施した。ＰＩ１６を含む差次的に発現した候補遺伝子のグループを選択し、Ｔｒｅｇ対ヘルパーＴ細胞の５つの生物学的複製でのその発現を検査した。定量的ＲＴ−ＰＣＲおよび低密度アレイによりＰＩ１６の差次的発現が確実なものとなり、またその結果はアレイ解析で同定した遺伝子の作用と比較的に一致していた。

【0392】

１．２．３ Ｔｒｅｇ上のＰＩ１６細胞表面分子解析
上記説明したアレイデータを解析して、Ｔｒｅｇ細胞を同定するためのＦｏｘＰ３発現の代わりとなるものとして使用され得るバイオマーカーを同定した。これらのデータより、ＰＩ１６をそのようなバイオマーカーの１つとして同定した。ＣＤ２５陽性成人ＣＤ４^＋細胞をＰＩ１６とＦｏｘＰ３の共発現について抗ＰＩ１６ポリクローナル抗体を用いてスクリーニングし、ＰＩ１６がＦｏｘＰ３と正の相関を有することが見いだされた（図２）。

【0393】

ＰＩ１６の発現をまたＴＧＦb誘導性Ｔｒｅｇにて試験を行った（ｉＴｒｅｇ；図３）。ＴＧＦbは実質的にＣＤ２５およびＦｏｘＰ３発現を上方制御したが、ＰＩ１６は一過的に誘発したこれらの細胞では実質的に発現されず、ＰＩ１６発現が内在性Ｔｒｅｇと誘導性Ｔｒｅｇとを区別し得ることを示唆している。

【0394】

実施例２ ＰＩ１６に対する抗体の作製および特性解析
２．１ 材料および方法
２．１．１ 末梢血単核細胞単離
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を全血（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ、Ｙｏｕｔｈ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｓｏｕｔｈ Ａｕｓｔｒａｌｉａの研究所倫理審査委員会からの倫理的許可に準拠してインフォームド・コンセントにより健常者から得られた）からＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ，オスロ）上での密度遠心法により単離し、ＰＢＳ−アジ化物で２回洗浄した。血液を、ヘパリンリチウム抗凝血剤を用いて収集した。

【0395】

２．１．２ ＰＩ１６発現細胞の産生
ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６の完全長ＰＩ１６コード配列を含む構築物を、Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｔｈｅｒｍｏ，ＭＨＳ１０１０−７０８２９３）より購入した。Ｇａｔｅｗａｙ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に適合する挿入物を産生するため、ＰＩ１６コード配列を本ベクターから次のプライマーを用いて増幅した：ＰＩ１６−Ｆ：５’−ｇｇｇｇａｃａａｇｔｔｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔｇｃｃａｃｃＡＴＧＣＡＣＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＧＴＴ−３’（配列番号５）（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿１５３３７０のヌクレオチド３２９〜３４７に対応する）およびＰＩ１６−Ｒ：５’−ｇｇｇｇａｃｃａｃｔｔｔｇｔａｃａａｇａａａｇｃｔｇｇｇｔｃＧＡＡＧＡＴＴＣＣＡＧＣＣＡＡＣＡＣＣＡ−３’（配列番号６）（参照配列のヌクレオチド１６９８〜１７１７の逆方向配列および相補配列）。プライマーの大文字部はＰＩ１６コード配列に特異的であるが、プライマーの下線部はＧａｔｅｗａｙ ｖｅｃｔｏｒのためのアダプターである。ＰＣＲ産物を精製し、およびＧａｔｅｗａｙ ｖｅｃｔｏｒ ｐＤＯＮＲ２０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化して「エントリークローン」ｐＤＯＮＲ２０１／ＰＩ１６を作製した。クローン挿入物の同一性を、ｐＤＯＮＲ２０１／ＰＩ１６をＧａｔｅｗａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌに記載の順方向および逆方向配列プライマーを用いて配列決定することにより、確かめた。ＰＩ１６挿入物をｐＤＯＮＲ２０１ベクターからｐＤＥＳＴ４０ベクターまで、Ｇａｔｅｗａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌに記載の手順を用いて転写した。複数の単一コロニーを単離し、ＰＣＲによりスクリーニングして、挿入物が存在することを確認した。ｐＤＥＳＴ４０／ＰＩ１６構築物のプラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ−Ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製した。

【0396】

免疫化のため、ｐＤＥＳＴ４０／ＰＩ１６ベクターを用いて一過的な形質移入Ｌ９２９マウス線維芽細胞（ＡＴＣＣ）および安定的な形質移入ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ）を産生した。細胞を２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｇｉｂｃｏ）、０．５Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｓｉｇｍａ）、０．５μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、および１０％のＦＣＳ（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を補充したＤＭＥＭ培地中に維持した。２０μｇのプラスミドＤＮＡ、２０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｕｌのＰＬＵＳ試薬の混合物を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭを用いて４０００μｌにした。この混合物を用いて半集密性（６０〜８０％の集密性）Ｌ９２９およびＮＩＨ３Ｔ３細胞をＴ７５フラスコ（７５ｃｍ^２）中で形質移入した。６時間後、形質移入混合物を取り除き、ＤＭＥＭと置き換えた。ｐＤＥＳＴ４０／ＰＩ１６プラスミドを含有する形質移入細胞を、Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５００μｇ／ｍｌの濃度で培養培地に添加することにより選択した。安定的な形質移入細胞を産生するため、ＰＩ１６発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞を３回選別した（ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。

【0397】

２．１．３ 免疫化およびハイブリドーマ産生
ＰＩ１６タンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するため、６〜８週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＰＩ１６タンパク質を発現するＬ９２９細胞により免疫化した。非免疫性血清試料を全マウスから取り出し第１回目の免疫化を行った。マウス２匹でのグループのいくつかを、５００ｕｌのＰＢＳ中の５０００万細胞を皮下注射することにより最初に免疫化した。４週間後、マウスを５００ｕｌのＰＢＳ中の５０００万細胞を皮下注射することにより追加免疫した。２回目の注射後６日間検査出血を行い、以下に記載の反応性についてスクリーニングを行った。１４日後、マウスを５００ｕｌのＰＢＳ中の５０００万細胞により最終の追加免疫に処し、および４日後に殺して脾臓をハイブリドーマの調製のために回収した。

【0398】

融合のため、ＳＰ２／０骨髄腫細胞をＡＴＣＣから得た。ハイブリドーマ細胞をMacardleおよびBailey(2006年)の指示に従って、１０^８マウス脾臓細胞および１０^７ＳＰ２／０骨髄腫細胞（比率１０：１）を用いて産生した。

【0399】

選択したウェルからのハイブリドーマ細胞を、ＰＢＭＣおよびＰＩ１６−形質移入ＮＩＨ３Ｔ３細胞上にてスクリーニングし、ＡＣＤＵを備えたＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩセルソータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて単一細胞ソーティングにより増殖およびクローン化した。選別した細胞から生じるコロニーを再びフローサイトメトリによりスクリーニングした。

【0400】

市販のＰＩ１６ポリクローナル抗体が末梢血の区別可能な染色パターンを示したので、フローサイトメトリを用いて、末梢血リンパ球の同じ画分と反応する抗体のためのハイブリドーマコロニーをスクリーニングした。染色は以下に記載のように行った。選択したウェルからのハイブリドーマ細胞を単一細胞ソーティングにより増殖および再クローン化した。選別した細胞から生じるコロニーを、親ハイブリドーマと同様のＰＢＭＣとの反応性を持つ抗体の発現に関し、フローサイトメトリによりスクリーニングした。ＣＲＣＢＴ−０２−００１ハイブリドーマがポリクローナルＰＩ１６抗体と同様の反応性を持つモノクローナル抗体を発現するとみなされた。

【0401】

２．１．４ フローサイトメトリ
ＣＲＣＢＴ−０２−００１の反応性解析を、ｔｈｒｅｅ−ｓｔｅｐ「高感度」染色プロトコル（Mavrangelosら，2004年）を用いて末梢血の単核細胞（ＰＢＭＣ）およびＰＩ１６−形質移入ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対して実施した。末梢血単核球を全血（健常者より採取）からＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ、オスロ）上での密度遠心法により単離し、ＰＢＳ−アジ化物（Ｓｉｇｍａ）で２回洗浄した。血液を、ヘパリンリチウム抗凝血剤を用いて収集した。

【0402】

ＰＩ１６完全長組み換えタンパク質に対して産生したマウスのポリクローナル抗体をＡｂｎｏｖａ社（台北、台湾）より購入した。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ１２７、ＦｏｘＰ３、ＣＤ１５４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ７３、ＣＤ９５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＬＡ、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４に対するモノクローナル抗体の染色用緩衝液、Ｔｒｅｇカクテル（ＣＤ４−ＡＰＣ、ＣＤ１２７−ＦＩＴＣおよびＣＤ２５−ＰＥ／Ｃｙ７の最適化した混合物）および蛍光体−ストレプトアビジン複合体をＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州）より得た。ＣＤ３９に対するモノクローナル抗体をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）により、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇをＶＥＣＴＯＲ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、カリフォルニア州）により、および正常マウス血清をＤａｋｏ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）により購入した。

【0403】

ＰＩ１６発現をＰＢＭＣにより特性解析する多重パラメータフローサイトメトリ実験を、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩセルソータを用いて行った。複合体化していない抗体を用いた実験を、ｔｈｒｅｅ−ｓｔｅｐ「高感度」染色プロトコルを用いて、基本的にはZolaら，(1990年)に記載のように実施した。簡単には、ＰＢＭＣを複合体化していない一次抗体と３０分間氷上でインキュベートし、洗浄した。ビオチン化ウマ抗マウスＩｇ試薬を添加して、３０分間氷上でインキュベートした。洗浄後、正常マウス血清を添加し（抗マウスＩｇ試薬での遊離型Ｉｇ−結合部位を阻害するため）、１０分間インキュベートし、その後、蛍光体−ストレプトアビジン複合体検出試薬と直接複合体化する任意の抗体を添加した。マウスＩｇのインキュベーションと最終試薬の添加の間に洗浄は行わなかった。細胞を上記のようにインキュベートし、２回洗浄した。細胞内抗原に対する抗体を用いる実験では、上記のような表面染色をまず行い、次いで細胞を製造者の指示に従って透過処理および染色を行った。

【0404】

２．１．５ 免疫蛍光検査によるＣＲＣＢＴ−０２−００１の表面染色の検証
細胞を８−ウェルのチャンバースライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、イリノイ州）上で培養し、ＰＢＳで洗浄し、２％パラホルムアルデヒド溶液（ｐＨ７．４）で１５分間固定し、その後洗浄し、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳ中で透過処理を行った。ＰＢＳ中で１％ウシ血清により３０分間ブロッキングした後、細胞を一次抗体、いずれのマウス対照ＩｇＧ（１μｇ／ｍｌ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州）、ＩｇＧ１対照Ｘ−６３（ニート、１００μｌ／ウェル）（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）、ＰＩ１６マウスポリクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）（Ａｂｎｏｖａ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）、マウス抗Ｖ５抗体（１：３００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｓｂａｄ、カリフォルニア州）およびＣＲＣＢＴ−０２−００１培養上清（ｎｅａｔ、１００μｌ／ウェル）（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）を用いて１時間、室温で免疫染色を行った。次いで、細胞を洗浄して、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（１：５０）（ＶＥＣＴＯＲ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、カリフォルニア州）によりインキュベートし、その後ストレプトアビジンＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ４８８複合体（１：５００）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン州）により１時間、室温で標識化した。最後に、細胞を核染色のためＤＡＰＩ 溶液と共にインキュベートし、封入剤（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、カリフォルニア州）により封入して顕微鏡検査のために調製した。画像を、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ドイツ）により、ライフサイエンス用顕微鏡のためのＯｌｙｍｐｕｓ細胞^ＦＩｍａｇｉｎｇソフトウェアを搭載するＯｌｙｍｐｕｓ ＤＰ−７２カメラを用いて取得した。

【0405】

２．１．６ ＰＢＭＣの刺激
ＰＢＭＣを、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｇｉｂｃｏ）、０．５Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｓｉｇｍａ）、０．５μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、および１０％ＦＣＳ（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。細胞を９６Ｕ−ウェル培養皿（０．５−１ｘ１０^６／ウェル）中でブドウ状球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）エンテロトキシンＢ（Ｓｉｇｍａ；１μｇ／ｍｌ）により１８時間、または製造者（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞増殖刺激ビーズ、Ｄｙｎａｌ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従って固定された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体により３日間刺激した。刺激後、細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄し、およびフローサイトメトリにより分析した。

【0406】

２．１．７ 抗体サブクラスの決定
マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ＣＲＣＢＴ−０２−００１のサブクラスを製造業者の指示に基本的に従って決定した。

【0407】

２．１．８ ＣＲＣＢＴ−０２−００１により分泌される抗体の精製
ＣＲＣＢＴ−０２−００１を、１０％ＦＣＳ、０．５Ｕペニシリン／ｍｌ、０．５μｇストレプトマイシン／ｍｌ、および２００ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ−１６４０中で成長させた。上清を５００ｘｇで遠心分離し、０．４５μｍ、次いで０．２２μｍのシリンジフィルタ（Ｍｉｌｌｅｘ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過する前に細胞残屑およびサイズの大きい物質を除去した。

【0408】

精製を、ＢｉｏＬｏｇｉｃＬＰクロマトグラフィ装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて行い、カラム（５ｍｌＰｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ｇアガロースを用いたＢｉｏＲａｄ）を１０カラム体積超のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１ｍＬ／分で洗浄した。ＣＲＣＢＴ−０２−００１上清をカラム上に２回１ｍＬ／分で適用した。通過画分をその後の解析のために回収した。カラムをＰＢＳ（ｐＨ７．４）により基準ＵＶ吸光度まで洗浄した。結合ＩｇＧを溶出するため、０．１ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．８）（Ａｍｒｅｓｃｏ）をカラム上に、１ｍｌ／分にて２０〜４０カラム体積に０％〜１００％の勾配で適用した。溶出した抗体を、回収した画分の体積の２０％に等しくなるように１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．４）でチューブに回収した。回収する画分を、読み出し部分からＵＶピーク内に認めた。次いで、選択した画分をプールし、体積を測定し、少量の試料をさらに分析した。残余試料をＧＥスピンカラム１００ｋＤａ ＭＷＣＯ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、脱塩／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中への緩衝液交換を行った。次いで抗体を定量し、最終ＰＢＳ体積で１〜２ｍｇ／ｍｌまで１％ＢＳＡおよび０．０５％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を用いて希釈した。

【0409】

２．１．９ ＣＲＣＢＴ−０２−００１の増殖および細胞生存効果
ＰＢＭＣを、上記のように１８時間および３日間刺激した。ＣＲＣＢＴ−０２−００１から分泌された精製（アジド遊離）抗体を２μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌおよび１０ｕｇ／ｍｌ、ならびに未精製ＣＲＣＢＴ−０２−００１−含有上清（無血清および血清含有）を培地に培養物に添加した。さらに精製ＩｇＧ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ２８ ｍＡｂおよびＣＤ４９ｄ ｍＡｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および培地を陰性対照として添加した。ＳＥＢおよびＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを陽性対照として添加した。刺激された細胞を、活性化マーカー、ＣＤ２５およびＣＤ６９のために（上記のように）染色した。細胞死を決定するため、細胞を取得する前に７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）にて１５分間インキュベートしておき、その後フローサイトメトリにより解析した。

【0410】

ＣＲＣＢＴ−０２−００１から分泌される固定された抗体が増殖および細胞生存に対するいかなる効果を持つかどうかを検査するため、２μｇ／ｍｌ、５μ／ｍｌおよび１０μ／ｍｌの精製抗体（無アジ化物）を一晩培地中でインキュベートし、培地を廃棄して、ＰＢＭＣを添加した。１日後および３日後に細胞を採取して、アポトーシスおよび活性化マーカーのために染色した。

【0411】

２．１．１０ スロットブロット
１００μｌの試料（表示のように）を、真空下で各スロットのニトロセルロース膜（Ｐｒｏｔｒａｎ；Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）上に負荷した。負荷後、ブロットを、３％スキムミルク粉末（Ｄｉｐｌｏｍａ）のＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（ブロッキングバッファー）により、１時間、室温にてブロッキングした。一次Ａｂ（ＣＲＣＢＴ−０２−００１から分泌された、または、Ａｂｎｏｖａ社のポリクローナルＰＩ１６抗体）をブロッキングバッファー中にて２倍に希釈し、プラットホーム型振とう器で１時間、室温でインキュベートした。ブロットを３ｘ５分間、ＰＢＳ ｔｗｅｅｎで洗浄した。ブロッキングバッファー中の１／１０００希釈ビオチン化ウマ抗マウス（ＶＥＣＴＯＲ）を添加して、ｒｏｃｋｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ上で１時間、室温でインキュベートした。ブロットを３ｘ５分間ＰＢＳ ｔｗｅｅｎで洗浄した。１／１０００希釈ＳＡ：ＨＲＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のブロッキングバッファーを添加して、ｒｏｃｋｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ上で１時間、室温でインキュベートした。ブロットを３ｘ５分間、ＰＢＳ ｔｗｅｅｎで洗浄した。ＥＣＬ溶液ＡおよびＢの適当量（膜表面を覆うほどの量；ＥＣＬ Ａｄｖａｎｃｅウエスタンブロットキット、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加し、一定で振とうしながら１分間インキュベートした。ブロットを１５秒のＵＶ曝露後すぐにＧ：Ｂｏｘ（Ｓｙｎｇｅｎｅ）にて読み取った。

【0412】

２．１．１１ サイトカイン分泌の特性解析
ＰＩ１６およびＣＤ２５を用いて特定したＣＤ４陽性細胞から分泌されたサイトカインのプロファイルを同定するため、Ｔ_Ｈ１／Ｔ_Ｈ２／Ｔ_Ｈ１７Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞上清中のサイトカインＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１７Ａ、ＴＮＦａｌｐｈａ、ＩＦＮｇａｍｍａのレベルを測定し、続いてインビトロで刺激した。ＣＤ４陽性リンパ球を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ ＣＤ４^＋Ｔ細胞濃縮キットを用いて軟膜から単離し、ＣＤ２５およびＰＩ１６に対する抗体により染色した。ＣＤ２５およびＰＩ１６により特定した４つのＣＤ４陽性サブセットを、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩセルソータを用いて無菌条件下で選別した。

【0413】

細胞を刺激するため、５．０ｘ１０^５の選別細胞集団を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｄｅｒ ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により３日間インキュベートした。非刺激対照細胞をビーズなしでインキュベートした。インキュベーション後、上清を回収して、Ｔ_Ｈ１／Ｔ_Ｈ２／Ｔ_Ｈ１７ＣＢＡキットを用いて製造者の指示に従ってサイトカインについて試験を行った。各サブセットについて、サイトカイン濃度を、非刺激細胞の濃度値を刺激細胞の濃度値から減算することにより算出した。

【0414】

２．１．１２ ＣＲＣＢＴ−０２−００１の配列決定
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｄｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いてＣＲＣＢＴ−０２−００１ハイブリドーマ細胞から単離した。ＲＴ−ＰＣＲをｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造者の指示に従い実施した。簡潔に述べると、１μｇのｍＲＮＡをｃＤＮＡ合成のテンプレートとして使用し、Zang et al、2005に記載のように縮重プライマーによりマウス可変軽鎖および重鎖を増幅した。

【0415】

軽鎖を、１０ｐＭの５’−ＧＧＧＡＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＳＡＣＭＣＡＲＷＣＴＭＣＡ−３’（配列番号１１）および５’−ＧＧＴＧＣＡＴＧＣＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣ−３’（配列番号１２）、それぞれ順方向および逆方向プライマーを用いて増幅した。重鎖を、等モル濃度（１０ｐＭ最終濃度）の以下の順方向プライマー：

【表2】

【0416】

２．２ 結果
ヒト ＰＩ１６（Ａｂｎｏｖａ）に対するマウスポリクローナル抗体を、多色フローサイトメトリに用いた（図２）。この抗体は、およそ１８％のリンパ球を染色し、その大部分がＣＤ４陽性でもあった。ＰＩ１６がＴｒｅｇ細胞により発現されることを確実にするため、細胞を、ＰＩ１６抗体に加えてＣＤ４、ＣＤ２５およびＦｏｘＰ３に対する抗体により染色した。図２に示すように、ＣＤ２５^{ｂｒｉｇｈｔ}ＰＩ１６^＋細胞の５０％超がまた、ＦｏｘＰ３を発現した。

【0417】

ポリクローナル抗体の使用による特異的事象を避けるため、ヒトＰＩ１６タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体を産生した。ヒトおよびマウスアミノ酸配列の比較（図１）により、免疫応答を誘発する十分な分化が存在する可能性があることが示された。

【0418】

マウスを、ＰＩ１６を発現するＬ９２９細胞により免疫化し、フローサイトメトリを用いて抗体産生のためのスクリーニングを行った（図４）。ＰＩ１６発現Ｌ９２９細胞に反応性の抗体を産生するマウスを、ハイブリドーマ産生のために選択した。

【0419】

融合後、ハイブリドーマ培養上清を、フローサイトメトリを用いてスクリーニングしてＰＩ１６発現Ｌ９２９細胞への結合を検出した。図５に示すように、ハイブリドーマウェルＰ１Ｇ５（Ｐ１ ５Ｇ）での細胞が、以前検査したポリクローナル抗体と同じ様式でＣ３^＋細胞を染色する抗体を分泌した。

【0420】

次いで、Ｐ１Ｇ５を単一細胞ソーティングにより再クローン化し、フローサイトメトリによりＣＤ４^＋Ｔ細胞への結合を検査した。図６に示すように、クローンＰ１Ｇ５−Ｐ２Ｂ３は、以前検査したポリクローナル抗体と同じ様式を示したが、一方でクローンＰ１Ｇ５−Ｐ１Ｂ７およびＰ１Ｇ５−Ｐ１Ｇ８は同じ様式でなかった。Ｐ１Ｇ５−Ｐ２Ｂ３を増殖のため選択し、ＣＲＣＢＴ−０２−００１と称した。ＣＲＣＢＴ−０２−００１はマウスＩｇＧ１κであると判断される。

【0421】

ＰＩ１６発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いてＣＲＣＢＴ−０２−００１により産生されたハイブリドーマ培養上清の反応性を確証し、以前検査した市販のポリクローナル抗体の反応性ちと比較した。図７に示すように、ポリクローナル抗体およびハイブリドーマ上清は、同じ染色様式であることが立証された。

【0422】

ＣＲＣＢＴ−０２−００１上清により検出されたＰＩ１６の細胞内局在性を確認にするため、非形質移入または安定的形質移入ＮＩＨ３Ｔ３細胞をチャンバースライドにて成長させた。図８に示すようにＣＲＣＢＴ−０２−００１の上清が細胞膜に貯留し、細胞の表面染色を立証した。図８はまた、ＣＲＣＢＴ−０２−００１上清（図８Ａ’）の形質移入細胞表面への染色が市販の抗ＰＩ１６ポリクローナル抗体（図８Ｃ’）より強い事を示す。

【0423】

モノクローナル抗体が結合するタンパク質を決定するため、スロットブロットを実施した。図９は、ＣＲＣＢＴ−０２−００１上清およびＰＩ１６ポリクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）の両方がＰＩ１６安定トランスフェクタントＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＰＩ１６形質移入細胞溶解物）と結合するが非トランスフェクタントＮＩＨ３Ｔ３細胞（非形質移入細胞溶解物）には結合しないことを実証するスロットブロットを示す。両抗体がまた、ＰＩ１６安定トランスフェクタントＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＰＩ１６形質移入細胞上清）の上清に結合し、これは、形質移入細胞がその表面からＰＩ１６を分泌および放出することを示唆する。ＣＲＣＢＴ−０２−００１はＡｂｎｏｖａ社の組み換えタンパク質（Ａｂｎｏｖａ社由来組換えタンパク質）に結合しない。これらの結果は、ＣＲＣＢＴ−０２−００１およびＰＩ１６ポリクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）の両方がＰＩ１６と結合することを示唆する。ＣＲＣＢＴ−０２−００１モノクローナル抗体がＡｂｎｏｖａ社の（小麦胚芽無細胞系を用いて発現させた）組み換えＰＩ１６タンパク質に結合しないことは、モノクローナル抗体が、ポリクローナル抗体よりも例えば真核細胞などの細胞で産生されたＰＩ１６に対してより選択的であることを示唆する。これらのデータは、モノクローナル抗体が天然哺乳類ＰＩ１６と反応性があり、モノクローナル抗体が天然哺乳類タンパク質、例えば天然ヒトタンパク質と同様のタンパク質を取得する方法で処理および／または組み合わせていないＰＩ１６との交差反応を制限していることを示す。

【0424】

ＣＲＣＢＴ−０２−００１上清がＴｒｅｇ細胞と結合することができることを確認するため、上清を用いてＣＤ４^＋細胞をＣＤ２５とＣＤ１２７の共発現に関して解析した。図１０に示すように、ＣＲＣＢＴ−０２−００１は、市販のポリクローナル抗体より多くのＣＤ４^＋ＣＤ２５^ｈｉＣＤ１２７⁻（Ｔｒｅｇ）細胞を検出した。

【0425】

新鮮ＰＢＭＣ由来の様々なリンパ球サブセットをまた、ＣＲＣＢＴ−０２−００１上清の免疫反応性のために染色した。この染色は、ＰＩ１６発現細胞の大部分がＣＤ４陽性リンパ球（ＣＤ４陽性サブセットのおよそ２０％；図１１Ｂ）であり、残余細胞はＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＣＤ８−ｂｒｉｇｈｔサブセットのおよそ１０％；図１１Ｃ）であることを示した。ごくわずかなＣＤ１９陽性リンパ球Ｂ細胞）がＣＲＣＢＴ−０２−００１上清（図１１Ｄ）と反応する。

【0426】

ＣＲＣＢＴ−０２−００１上清免疫反応性ＣＤ４^＋Ｔ細胞の大部分がメモリー表現型（ＣＤ４５ＲＡ⁻）（図１１Ｅ）をもち、大部分がまたＣＤ２７を発現する（図１１Ｆ）。さらにまた、ＣＲＣＢＴ−０２−００１−免疫反応性細胞のごく一部がエフェクタメモリー細胞サブセットに属している（ＣＤ４５ＲＡ⁻／ＣＤ２７⁻；図１１Ｇ）。

【0427】

ＣＲＣＢＴ−０２−００１上清免疫反応性ＣＤ４^＋Ｔ細胞の大部分はＣＤ２５を発現し（図１１Ｈ）、ＣＤ４^＋／ＣＲＣＢＴ−００２−００１上清陽性細胞の約４分の３がＣＤ１２７を発現する（図１１Ｉ）。なかでもＣＤ４^＋／ＣＲＣＢＴ−００２−００１上清陽性細胞のおよそ２０％がＴｒｅｇ表現型ＣＤ２５^＋／ＣＤ１２７⁻を発現する（図１１Ｊ）。

【0428】

ＰＩ１６の発現をＴｒｅｇ細胞および他のＴ_Ｈ細胞によりさらに特性解析するために、末梢血単核細胞をＣＲＣＢＴ−００２−０１モノクローナル抗体ならびにＣＤ４、ＣＤ２５およびＣＤ１２７に対する抗体で染色し、Seddikiら(2006年)のゲーティング戦略を用いてＣＤ２５−ｂｒｉｇｈｔ／ＣＤ１２７−ｄｉｍ ＴｒｅｇおよびＣＤ１２７陽性Ｔｈ細胞サブセットを同定した（図１２）。染色により、ＰＩ１６がＣＤ４陽性リンパ球のＴｒｅｇとＴｈサブセットの両方のうちごくわずかにより発現され、Ｔｒｅｇのより高い比率がＰＩ１６を発現することが示される。

【0429】

さらなるＰＩ１６陽性Ｔｒｅｇ細胞の特性解析を、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＰＩ１６（ＣＲＣＢＴ−０２−００１）、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯに対するモノクローナル抗体によりリンパ球を染色することにより実施した。ＰＩ１６およびＣＤ２５の両方を発現したＣＤ４陽性リンパ球の大部分がＣＤ４５ＲＯ陽性／ＣＤ４５ＲＡ陰性「メモリー」表現型をもっていた（図１３）。

【0430】

Ｔｒｅｇを転写因子ＦｏｘＰ３の発現により特定する。ＣＤ４、ＣＤ２５、ＰＩ１６（ＣＲＣＢＴ−０２−００１）およびＦｏｘＰ３に対する抗体はまた、ＰＩ１６の有無により特定したＴｒｅｇサブセットによるＦｏｘＰ３の発現を試験するものであった（図１４）。ＦｏｘＰ３発現の高いレベルが、ＰＩ１６陰性／ＣＤ２５陽性画分（ＭＦＩが１０６２）と比較してＰＩ１６陽性／ＣＤ２５陽性画分（個体群は１４５７の蛍光強度（ＭＦＩ）を意味する）で検出された。ＰＩ１６陽性／ＣＤ２５陰性画分（ＭＦＩが６１３）でのＦｏｘＰ３レベルは、ＰＩ１６陰性／ＣＤ２５陰性エフェクタ細胞画分（４８０のＭＦＩ）のバックグラウンドレベルと同様であった。

【0431】

ゲーティング戦略を基本的にはMiyaraら(2009年)に記載のように使用し、ＰＩ１６陽性メモリーＴｒｅｇがまたＦｏｘＰ３転写因子を発現することを示した（図１５）。

【0432】

ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞をさらに、ＣＲＣＢＴ−０２−００１上清とＴｒｅｇサブセットマーカーとの共染色に関しフローサイトメトリにより解析した。この解析の結果を表２に示す。

【表3】

【0433】

ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ３９およびＣＣＲ６を用いた分別染色から、ＰＩ１６陽性Ｔｒｅｇ個体群が、両ＰＩ１６陰性Ｔｒｅｇ個体群からおよび他のＰＩ１６陽性Ｔ_Ｈ細胞から表現型上で区別可能なメモリーＴｒｅｇのサブセットであることが示される。

【0434】

図１６はさらに、メモリーＴｒｅｇ細胞に結合するＣＲＣＢＴ−０２−００１分泌抗体の機能を裏付ける。簡単には、ＣＤ４^＋細胞をＣＲＣＢＴ−０２−００１上清およびＣＤ４５ＲＡかＣＤ４５ＲＯのいずれかに対する抗体で標識化した。ＣＤ４５ＲＡの染色は、メモリー細胞サブセット（ＣＤ４５ＲＯ^＋）に属するＣＤ４５ＲＡ⁻細胞によりメモリー細胞を天然細胞から識別するために広く使用されている。したがって、ＣＲＣＢＴ−０２−００１は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ４５ＲＯ^＋メモリーＴｒｅｇ細胞集団を同定するようだ。

【0435】

Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）を用いて、どのサイトカインがＴ細胞レセプターを介した刺激の後にＰＩ１６発現Ｔｒｅｇにより発現されかを決定した（図１７）。これらの実験により、ＰＩ１６陽性Ｔｒｅｇ細胞のサイトカイン発現プロファイルがＰＩ１６陰性Ｔｒｅｇ細胞と同じであり、ＰＩ１６陽性Ｔ_Ｈ細胞がそのＰＩ１６陰性Ｔ_Ｈ細胞と同じサイトカインを発現することが示される。

【0436】

ＰＩ１６陽性メモリーＴｒｅｇをさらに特性解析するため、ＰＩ１６陽性メモリーＴｒｅｇによる数種類のケモカインレセプターの発現を、ＰＩ１６陰性メモリーＴｒｅｇと他のＰＩ１６陽性メモリーＴ_Ｈ細胞と比較した（表３参照）。ＣＣＲ４およびＣＣＲ６ケモカインレセプターは、ＰＩ１６陰性ＴｒｅｇまたはＴ_Ｈ画分のメモリー要素と比較してメモリーＰＩ１６陽性ＴｒｅｇとメモリーＰＩ１６陽性Ｔ_Ｈ細胞のより高い比率により発現される（図１８）。ケモカインレセプターの差次的発現は、Ｔ_Ｈ細胞サブセットの遊走を予測する、またＴｈ細胞の機能的サブセットを同定するために使用され得る。本明細書に提供されるデータにより、ＰＩ１６陽性メモリーＴｒｅｇにより発現されたケモカインレセプターのプロファイルが、ＰＩ１６陰性メモリーＴｒｅｇおよび他のＰＩ１６陽性Ｔ_Ｈ細胞の両方と異なることが示される。ＣＣＲ４およびＣＣＲ６などのケモカインレセプターの発現から、ＰＩ１６陽性メモリーＴｒｅｇが、Ｔ_Ｈ１７細胞が遊走し得る炎症部位と同じ部位に遊走し得ることが示される。

【表4】

【0437】

図１９に示すようにＣＤ２５の上方制御にもかかわらず、ＰＩ１６に相当する上方制御は存在しない。

【0438】

ＰＢＭＣを一晩および３日間刺激した。ＣＲＣＢＴ−０２−００１から分泌された精製抗体（無アジ化物）を培地に２μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ添加するか、または細胞を固定した抗体と接触させて活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９のために染色した。細胞死を決定するために、細胞を７ＡＡＤと共に１５分間インキュベートし、その後回収してフローサイトメトリにより解析した。結果を表４および５に示す。

【表5】

【表6】

【0439】

表３および４に提示される結果は、ＣＲＣＢＴ−０２−００１はＴｒｅｇ表現型をもつ細胞を、エフェクタ細胞非存在下で殺さないまた分化を起こさないことを示す。これは、この抗体または同抗体のエピトープに結合するタンパク質を使用して細胞に多大な悪影響をもたらすことなくＴｒｅｇ細胞を単離するのに有用である。

【0440】

図２０に示すように、ＣＲＣＢＴ−０２−００１により分泌される抗体は、刺激したＰＢＭＣを含む上清でＰＩ１６を検出し、これはＰＩ１６が刺激後すぐに放出または分泌され得ることを示唆する。ＣＤ４細胞溶解物で検出された信号は存在しなかった。しかしながら、ＰＩ１６はＣＤ４細胞の５％しかないので、この抽出物はＰＩ１６の抽出のために最も希釈しやすかった（１：１００）。ＣＲＣＢＴ−０２−００１は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋刺激および静止細胞溶解物にのみ結合し、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻細胞溶解物とは結合しない抗体を分泌した。ＣＲＣＢＴ−０２−００１分泌抗体は、刺激したＴｒｅｇ（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＰＩ１６^＋）の上清でＰＩ１６を検出し、これはＰＩ１６がＴｒｅｇ細胞刺激後すぐに発散または分泌され得ることを示唆する。

【0441】

ＣＲＣＢＴ−０２−００１により分泌される抗体はまた、ヒトＰＩ１６に結合することが見出されているが、マウスＰＩ１６に検出可能に結合していなかった。

【0442】

ＣＲＣＢＴ−０２−００１の可変領域をコードする核酸配列およびそのコードアミノ酸が推測された。重鎖可変領域をコードする配列を配列番号配列番号７に記載し、またコードアミノ酸を配列番号８に記載する。軽鎖可変領域をコードする配列を配列番号配列番号９に記載し、またコードアミノ酸を配列番号１０に記載する。図２１では、ＣＤＲの配列を強調して示している。Ｖ_ＨのＣＤＲは、Komatsuら，(2003年)により公表されたＡＢ０８９６４８．１との比較により見いだされた。

【0443】

実施例３：ＣＲＣＢＴ−０２−００１を用いて単離されたＴｒｅｇによる免疫応答の抑制
３．１．抑制試験のための新鮮な成人型ＴｒｅｇおよびエフェクタＴサブセットの単離
ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ ＣＤ４^＋Ｔ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、カナダ）を用いてＣＤ４^＋Ｔ細胞をまず濃縮した後、軟膜からＴｒｅｇ細胞を単離した。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^{ｂｒｉｇｈｔ}ＰＩ１６^＋およびＣＤ４^＋ＣＤ２５^{ｂｒｉｇｈｔ}ＰＩ１６⁻を、無菌条件下でＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩセルソータを用いて基本的には実施例２に記載のように選別した。ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻エフェクタ細胞を第２ドナー軟膜から単離し、ｍａｇｎｅｔｉｃ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ−ｓｏｒｔｉｎｇ（ＭＡＣＳ）ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製した。

【0444】

３．１．２．ヒト臍帯ｎＴｒｅｇ細胞およびｉＴｒｅｇ細胞の増殖
ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋およびＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を新鮮臍帯血から抽出しＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ Ｂｅａｄ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ細胞キット（ｃａｔ＃１１３．６３Ｄ）を用いて精製した。単離ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ細胞をＤｙｎａｌ Ｂｅａｄ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（比率３：１）（ｃａｔ＃１１１．４１Ｄ）および５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２のＸ−Ｖｉｖｏ１５完全培地（Ｌｏｎｚａ ｃａｔ＃０４−４１８Ｑ）で７日間インキュベートした。ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞を、Ｔｒｅｇ対照群を示す同じ条件下で増殖した。ｉＴｒｅｇ細胞を、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（３：１ビーズ細胞比）、１０μＭ全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）（Ｓｉｇｍａ）を含有する５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２および５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βによりインキュベートすることにより産生した。全Ｔｒｅｇ細胞サブセットを７日間増殖させた。７日目に、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを取り除き、細胞をさらに７日間、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含むＸ−Ｖｉｖｏ１５完全培地中で静止させた。

【0445】

３．２ チミジン取り込み試験
増殖した臍帯血からのＰＩ１６^＋ｎＴｒｅｇ（ＣＲＣＢＴ−０２−００１^＋）およびＰＩ１６⁻ｎＴｒｅｇ（ＣＲＣＢＴ−０２−００１⁻）を、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）に対する抑制活性について試験した。ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻エフェクタＴ細胞（およそ２ｘ１０^４）を９６ウェルプレートで培養し、１ｘ１０^５照射された（３０Ｇｙ）ＰＢＭＣ存在下で成長させた。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＰＩ１６^＋細胞を、基本的に実施例２に記載のような方法で単離した。細胞を１：１、２：１、４：１、８：１、１６：１、３２：１、６４：１の比率で添加した。細胞を１００ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）モノクローナル抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により活性化した。ウェルを４日目に^３Ｈ−チミジンを用いて培養の最後の１６時間パルス処理した。全時点を３連にて測定した。結果を１分あたりのシンチレーション計数で表した。図２２Ａは、増加した臍帯血からのチミジン試験がそれぞれエフェクタ細胞のＰＩ−１６^＋およびＰＩ−１６⁻ｎＴｒｅｇによる抑制を実証していることを示す。

【0446】

図２２Ｂに示すように、ＣＲＣＢＴ−０２−００１により単離したＰＩ１６^＋Ｔｒｅｇ細胞は、ＰＩ−１６⁻ｎＴｒｅｇ（ｎ＝６）と同じ有効性を伴い１：１から１６：１の比率においてエフェクタ細胞の増殖を抑制する。

【0447】

３．３ ５、６−カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）サプレッサー試験
混合リンパ球反応でのエフェクタ細胞の細胞分裂をまた、ＣＦＳＥ希釈（Venkenら，2009年）により解析した。エフェクタＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻細胞を３．１に記載のように単離し、ＰＢＳ中で１ｍＭ ＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）により１０分間、３７℃で標識化した。２ｘ１０^４ＣＦＳＥ標識エフェクタ細胞を、１：１、２：１、４：１、８：１、１６：１、３２：１のＴｅｆｆｅｃｔｏｒ／Ｔｒｅｇ比率でＴｒｅｇ細胞によりインキュベートした。エフェクタおよびＴｒｅｇ細胞を、９６ウェルＵ−ボトムプレートにおいて、１ｘ１０^５の照射された（３０Ｇｙ）ＰＢＭＣおよび１００ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）モノクローナル抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により２００μｌのｃＲＰＭＩ中でインキュベートした。共培養物をインキュベーションの５日後に採取し、レスポンダー個体群の増殖を、フローサイトメトリにより、細胞分裂に伴うＣＦＳＥ蛍光を希釈することにより可視化した。図２３Ａは増殖臍帯血Ｔｒｅｇを用いた典型的なＣＦＳＥサプレッサー試験を提供する（ＰＩ−１６^＋およびＰＩ−１６⁻）。６つの増殖臍帯血Ｔｒｅｇ（ＰＩ−１６^＋／−）に関する累積結果を図２３Ｂに示す。ＰＩ−１６^＋およびＰＩ−１６⁻Ｔｒｅｇは、正常培養条件下で、同等の効力で抑制する。

【0448】

末梢血から新鮮単離ＰＩ１６発現Ｔｒｅｇ細胞は、刺激ＣＤ２５⁻Ｔエフェクタ細胞の増殖を抑制することができた（図２３Ｃ）。これらのデータは、ＣＲＣＢＴ−０２−００１により単離したＰＩ１６^＋／ＣＤ２５^＋細胞がＰＩ−１６⁻Ｔｒｅｇと同様な抑制能をもつ機能的Ｔｒｅｇ細胞であることを確証する。累積ＣＦＳＥサプレッサー試験の新鮮な成人型ｎＴｒｅｇ（ＰＩ−１６^＋およびＰＩ−１６⁻）における結果は、末梢血から単離したＰＩ−１６^＋Ｔｒｅｇの抑制能力を確証する（ｎ＝４）（図２３Ｄ）。正常細胞培養条件下での、成人血液からのＰＩ−１６^＋およびＰＩ−１６⁻Ｔｒｅｇ間の抑制能の違いはない。

【0449】

３．４ ＣＤ１５４抑制試験
増殖臍帯血由来のＰＩ１６^＋ｎＴｒｅｇ（ＣＲＣＢＴ−０２−００１^＋）およびＰＩ１６⁻ｎＴｒｅｇ（ＣＲＣＢＴ−０２−００１⁻）サブセットを、基本的に実施例２に記載のように単離し、完全Ｘ−Ｖｉｖｏ１５培地（Ｌｏｎｚａ）にて一晩、３７℃で静止し、その後試験に添加した。新たに回収もしくは以前凍結乾燥したＭＡＣＳまたはＦＡＣＳ単離ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻細胞をこの試験でエフェクタ細胞として使用した。新たに回収したＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻エフェクタ細胞は回収の１２時間以内に使用され、凍結乾燥したＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻エフェクタ細胞は、試験に使用する前に完全ＲＰＭＩ培地にて１２〜２０時間、３７℃で静止させる。

【0450】

Ｔｒｅｇ細胞サブセットを、９６ウェルプレートに１：１、２：１、４：１、８：１、１６：１および３２：１のＥｆｆｅｃｔｏｒ／Ｔｒｅｇ細胞比率でプレーティングした。ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻エフェクタ細胞を５ｘ１０^４細胞／５０μｌ／ウェルでプレーティングし、Ｔｒｅｇを５ｘ１０^４細胞／５０μｌ／ウェル（１：１）でプレーティングして、１．５６ｘ１０^３細胞／５０ｕｌ／ウェルまで連続的に希釈した。およそ５ｘ１０^４のＴｒｅｇ単独およびＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻エフェクタ単独（刺激と非刺激の両方）の対照ウェルが含まれた。非刺激ウェルはＣＤ１５４−ＡＰＣ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＢＤ）；１ウェルあたり５μｌ）を含有するカクテルを受け；刺激ウェルはＣＤ１５４⁻ＡＰＣ（１ウェルあたり５ｕｌ）とＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞増殖刺激ビーズ（０．２５：１ビーズ／細胞の比率）を含有するカクテルを受けた。培養物を暗所で７〜８時間、３７℃にてインキュベートした。インキュベーション後、９６ウェルプレートを最大１５時間冷蔵した後、染色した。

【0451】

細胞をＣＤ４（ＦＩＴＣ、ＢＤ）およびＣＤ２５（ＰＥＣｙ７、ＢＤ）の表面発現のために、９６ウェルプレート中室温で３０分間染色し、次いで洗浄した。細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏフローサイトメータでの３色フローサイトメトリにより、ＣＤ１５４発現について解析した。解析の際、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^{ｂｒｉｇｈｔ}）細胞応答はＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻細胞上にｇａｔｉｎｇすることにより除外される。Ｔ細胞活性の抑制を、刺激ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻エフェクタ単独でのＣＤ１５４発現とＴｒｅｇで共培養した刺激ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻エフェクタでのＣＤ１５４発現とを比較することにより評価した（図２４Ａ）。

【0452】

図２４Ｂに示すように、４つの増殖臍帯血試料からのＣＲＣＢＴ−０２−００１を用いて単離したＴｒｅｇ細胞はＣＤ１５４発現を抑制することができ、このことはこれらの細胞がＴ細胞活性化を抑制することを示す。正常細胞培養条件下での、ＰＩ−１６＋およびＰＩ−１６−Ｔｒｅｇ間の抑制能の違いはない。

【0453】

実施例４：ｎＴｒｅｇ細胞およびｉＴｒｅｇ細胞サブセットの特性解析
４．１ 増殖ｎＴｒｅｇおよびｉＴｒｅｇのフローサイトメトリ
ｎＴｒｅｇおよびｉＴｒｅｇ細胞サブセット（基本的に３．１．２に記載）を、７日間の増殖と７日間の低レベルのＩＬ−２での静止後に、多色フローサイトメトリおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより解析した。インビトロで産生したｎＴｒｅｇ細胞およびｉＴｒｅｇ細胞を基本的に実施例２に記載のようにＦＡＣＳ解析によりプロファイル化し、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＰＩ１６およびＦｏｘＰ３の発現を比較した。

【0454】

図２５Ａにより、ｎＴｒｅｇ細胞およびｉＴｒｅｇ細胞の両方が高いレベルのＣＤ４、ＣＤ２５およびＦｏｘＰ３を発現したが増殖ｎＴｒｅｇは増殖臍帯血ｉＴｒｅｇより著しくＰＩ１６を発現したことが示される。これは、７つの増殖臍帯血試料および７つの増殖成人血液試料において確証された（図２５Ｂ、ｎ＝７、ｐ＜０．０５）。

【0455】

４．２ 増殖したｎＴｒｅｇおよびｉＴｒｅｇ定量的リアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡをまた、セクション４．１に記載のＴｒｅｇサブセットより抽出し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施して、ＰＩ１６およびＦｏｘＰ３の相対的発現を調査した。総ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ ドイツ）を用いて抽出し、その後Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡに変換した。半定量的ＲＴ−ＰＣＲをＫＡＰＡ ＳＹＢＲ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｑＰＣＲキット（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、マサチューセッツ州、米国）を用いて３連にて実施した。ＰＣＲ反応をＣｏｒｂｅｔｔリアルタイムＰＣＲ装置（Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ ６０００）にて実施した。６つの個々の実験結果をＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ６０００ソフトウェアを用いて解析し、基準転写物、リボソームタンパク質Ｌ１３ａ（ＲＰＬ１３ａ）の発現へ正規化した。

【0456】

ＲＴ ＰＣＲプライマー配列は次のとおりであった；ＦｏｘＰ３順方向−５’−ＡＴＧＧＣＣＣＡＧＣＧＧＡＴＧＡＧ−３’（配列番号１９）および逆方向５’−ＧＡＡＡＣＡＧＣＡＣＡＴＴＣＣＣＡＧＡＧＴ ＴＣ−３’（配列番号２０）；ＰＩ１６順方向５’−ＧＡＧＡＡＴＣＴＧＴ ＴＣＧＣＣＡＴＣＡＣＡ−３’（配列番号２１）および逆方向５’−ＧＡＡＡＣＡＧＣＡＣＡＴＴＣＣＣＡＧＡＧＴＴＣ−３’（配列番号２２）；およびＲＰＬ１３ａ順方向５’−ＣＧＡＧＧＴＴＧＧ ＣＴＧＧＡＡＧＴＡＣＣ−３’（配列番号２３）および逆方向５’−ＣＴＴＣＴＣＧＧＣＣＴＧＴＴＴＣＣＧＴＡＧ−３’（配列番号２４）。

【0457】

図２６Ａは、ＰＩ１６がｎＴｒｅｇ細胞個体群にてメッセージレベルで発現することを確証する。ｎＴｒｅｇは、ＣＤ２５⁻細胞と比較した場合に、Ｆｏｘｐ３の２．２ ｌｏｇ２ ｆｏｌｄの増加（ｐ＜０．０１）およびＰＩ−１６の４．４８ ｌｏｇ２ ｆｏｌｄの増加（Ｐ＜０．０１）を表す（表６）。ＦＯＸＰ３およびＰＩ１６はｎＴｒｅｇおよびｉＴｒｅｇの両方に存在するが、ＦＯＸＰ３（ｐ＜０．００１）およびＰＩ１６（ｐ＜０．０５）は統計的にｎＴｒｅｇよりｉＴｒｅｇにおいてのほうが少ない（表７）。図２６ＢはＣＲＣＢＴ−０２−００１を用いて単離した３つの新鮮単離成人末梢血ＰＩ１６^＋およびＰＩ１６⁻Ｔｒｅｇから抽出したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲデータを表す。このデータは、細胞表面ＰＩ１６陰性である細胞中に成人血液Ｔｒｅｇ ＰＩ１６が存在しないことを実証する。このことは、区別可能なＴｒｅｇのＰＩ１６^＋サブセットとＣＲＣＢＴ−０２−００１を用いて単離し得るＰＩ１６⁻サブセットが存在することを示唆し重要である。

【表7】

【表8】

【0458】

４．３ ＲＮＡ調製およびＣｕｓｔｏｍ ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度配列による発現解析
総ＲＮＡを、増殖した臍帯血ＣＤ２５⁻ヘルパーＴ、ｎＴｒｅｇ、およびｉＴｒｅｇ細胞（７日間の増殖プロトコル後に７日間静止させた）から単離した。総ＲＮＡをＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒおよびＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて単離した。総ＲＮＡ（２μｇ）をＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｙｔｅｍｓ）を用いてｃＤＮＡに変換した。各ｃＤＮＡ合成反応をＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘと組み合わせて、Ｃｕｓｔｏｍ ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度配列（Ｆｏｒｍａｔ ９６ｂ）の４つの試料液体リザーバに均等にロードした。増幅およびデータ収集を９００ＨＴ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）．で行った。ドナー適合対照ヘルパーＴ、ｎＴｒｅｇ、およびｉＴｒｅｇ試料を同じアレイ上にロードした。ＣｕｓｔｏｍＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度配列を有効なＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現試験を用いて構築した。データをＲＰＬ１３ａへの正規化を伴うΔΔＣＴ法を用いて解析した。比（比）を細胞型間で算出し、Ｔ検定を各遺伝子について実施した。

【0459】

ｎＴｒｅｇとｉＴｒｅｇ（図２７Ａ）、およびｎＴｒｅｇとＣＤ２５（図２７Ｂ）との比較により、ｉＴｒｅｇはＦＯＸＰ３を発現するが、ＰＩ１６またはｎＴｒｅｇでＰＩ１６と共発現する遺伝子のいくつかを発現しないが実証される。このことから、ＰＩ１６がｎＴｒｅｇには強力な代理マーカーであるがｉＴｒｅｇでは代理マーカーではないことが示唆される。

【0460】

４．４ メチル化
ゲノムＤＮＡをＣＲＣＢＴ−０２−００１で標識化された新鮮な成人型Ｔｒｅｇから単離し、また基本的に実施例２に記載のようにＣＤ４^＋ＣＤ２５^{ｂｒｉｇｈｔ}ＰＩ１６^＋およびＣＤ４＋ＣＤ２５^{ｂｒｉｇｈｔ}ＰＩ１６⁻個体群に選別した。両個体群からのＤＮＡをＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ血液Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、次いでＥｐｉＴｅｃｔ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてメチル化解析のためのＤＮＡの変換および清浄化を行った。Ｔｒｅｇ細胞特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）のためのＰＣＲを基本的にBaronら(2007年)に記載のように実施した。ＰＣＲプライマーは以下のとおりである；順方向−５’−ＴＧＴＴＴＧＧＧＧＧＴＡＧＡＧＧＡＴＴＴ−３’（配列番号２８）および逆方向−５’−ＴＡＴＣＡＣＣＣＣＡＣＣＴＡＡＡＣＣＡＡ−３’（配列番号２９）。ＰＣＲ産物をゲル抽出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて清浄化した。次いで、ＰＣＲフラグメントを、配列決定用ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＣＲ４−ＴＯＰＯへクローン化し、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｔｏｐ１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ大腸菌中に形質転換し、アンピシリン寒天プレートにプレーティングした。コロニーを掻き取りアンピシリン含有Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ培地にて一晩培養し、その後ＱｕｉｃｋＬｙｓｅ Ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを単離した。プラスミドＤＮＡを、Ｍ１３ｕｎｉｖｅｒｓａｌ順方向および逆方向プライマー、順方向５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’（配列番号３０）および逆方向５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’（配列番号３１）を適用して配列決定し、その後ＡＢＩ Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、およびＡＢ３７３０ｘｌでのｃａｐｉｌｌｅｔａｒｙ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎを行った。次いで、配列ファイルをＣｐＧモチーフでＧからＡへの変更について解析した。

【0461】

図２８に示すように、ＣＲＣＢＴ−０２−００１を用いて単離したＰＩ１６^＋Ｔｒｅｇは、ＦＯＸＰ３のイントロン１のＴＳＤＲで脱メチル化された表現型を示す。逆に、ＰＩ１６発現に欠けるＴｒｅｇは部分的にメチル化された、誘導性Ｔｒｅｇと一致した表現型である。

【0462】

実施例５： ｎＴｒｅｇおよびｉＴｒｅｇサブセットの機能的特性解析とその後の炎症性サイトカインへの曝露
ＰＩ１６の表面発現に基づき単離した増殖臍帯血Ｔｒｅｇサブセットに、炎症性サイトカインへの曝露後の適合した比較対照個体群への機能的特徴の変化が見られるかを決定するために、ＣＤ２５⁻レスポンダー細胞の抗ＣＤ３ ＯＫＴ３刺激を用いる混合白血球反応試験を用いた。チミジンサプレッサー試験を、実質的に実施例３に記載のように実施した。増殖臍帯血ｎＴｒｅｇ（ＰＩ１６^＋およびＰＩ１６⁻）およびｉＴｒｅｇ（ＰＩ１６⁻）をフローサイトメトリにより単離し、次いで完全Ｘ−ｖｉｖｏ培地にて３日間静止させた。ＰＩ１６^＋、ＰＩ１６⁻ｎＴｒｅｇおよびＰＩ１６⁻ｉＴｒｅｇのサブグループを、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βおよび５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６中で３日間インキュベートした。細胞を十分に洗浄し、その後サプレッサー試験のために細胞を封入した。

【0463】

図２９Ａは、サプレッサー試験に添加前に３日間炎症性サイトカインＩＬ１βおよびＩＬ６への曝露の場合と比較した、正常細胞培養条件下でのＰＩ１６^＋ｎＴｒｅｇ細胞によるエフェクタ細胞の抑制レベルを示す。ＰＩ１６^＋ｎＴｒｅｇの機能をチミジンおよびＣＦＳＥサプレッサー試験により測定した。炎症性環境に曝露した時、抑制は変化せず、これらの細胞は抑制機能を維持した（ｎ＝２）。

【0464】

図２９Ｂは、正常細胞培養条件下とＩＬ１βおよびＩＬ６が存在する炎症状態下とでのＰＩ１６⁻ｎＴｒｅｇの抑制機能を、チミジンおよびＣＦＳＥサプレッサー試験を用いて比較している。ＰＩ１６⁻ｎＴｒｅｇは炎症環境下で抑制能力を維持している（ｎ＝２）。

【0465】

図２９Ｃは同様に、ＴＧＦ−βおよびＡＴＲＡと共に、実質的に実施例３．１．２に記載のように臍帯血から増殖したｉＴｒｅｇ（ＰＩ１６⁻）の機能特性解析を比較している。これらの細胞を、正常細胞培養条件下またはＩＬ１βおよびＩＬ６が存在する炎症状態下のいずれかで、培地にて３日間静止した。抑制機能を、チミジンおよびＣＦＳＥサプレッサー試験を用いて測定した。個体群と異なり、増殖したｉＴｒｅｇは正常条件下では良好に抑制したが、ＩＬ１βおよびＩＬ６への事前の曝露後では全ての抑制機能を失った。

【0466】

これらのデータは、ＰＩ１６^＋Ｔｒｅｇ細胞は、通常炎症部位で見られる炎症性サイトカインへの曝露後であっても抑制活性を保持する強力な（ｒｏｂｕｓｔ）細胞型であることを実証する。ＰＩ１６⁻ｉＴｒｅｇ細胞は炎症性サイトカインの存在下では抑制活性を保持しない。

【0467】

実施例６： ＰＩ１６^＋Ｔｒｅｇ細胞はＨＬＡＤＲを発現する
ＣＤ２５およびＰＩ１６（ＣＲＣＢＴ−０２−００１）の共発現を用いて特定されたメモリーＣＤ４陽性細胞のサブセットによる、ＭＨＣクラス２タンパク質ＨＬＡＤＲの発現を評価した。ＣＤ４陽性リンパ球のサブセットを図１４に示すように特定し、各メモリー画分をＣＤ４５ＲＯの発現により同定した。図３０に提示したデータは、ＰＩ１６陽性Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ２５陽性ＰＩ１６陽性）のより高い比率でＣＤ４陽性Ｔ細胞と抗原提示細胞との抗原特異的同族相互作用に関連するＨＬＡＤＲを発現することを示す。いかなる理論または作用機序に縛られるものではないが、Ｔｒｅｇ細胞によるＨＬＡＤＲの発現により、Ｔｒｅｇ細胞がＣＤ４陽性Ｔ細胞および抗原提示細胞の正常な同族相互作用を妨げ、これによりエフェクタＴ細胞の正常な抗原特異的活性化を混乱させることができる。

【0468】

実施例７： 若年性特発性関節炎でのＰＩ１６＋Ｔｒｅｇ細胞
成人および若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）に罹患する患者からのＰＢＭＣおよびＪＩＡ患者からの滑液をＴｒｅｇカクテル（ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７）およびＣＲＣＢＴ−０２−００１と共に染色し、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩで解析した。

【0469】

図３１に示すように、適合血液試料および成人健常者ドナーからの血液試料と比較して、ＪＩＡに罹患している患者の滑液でのＴｒｅｇで著しい増加がみられる。いっぽうで、適合血液試料および成人健常者ドナーからの血液試料と比較して、炎症関節でのＰＩ１６陽性Ｔｒｅｇで著しい減少がみられる。

【0470】

ＪＩＡ患者の炎症関節でＴｒｅｇ細胞の濃縮が見られるが、これらのＴｒｅｇは末梢でのＴｒｅｇ細胞よりもきわめて少量がＰＩ１６を発現する。いかなる理論または作用機序に縛られるものではないが、本明細書に提示される結果は、健常者ではＰＩ１６陽性Ｔｒｅｇ細胞およびＴ_Ｈ１７細胞がＴ_Ｈ１７免疫応答を制御するＴｒｅｇ細胞と同じ炎症部位に存在し得ることを示す。一方で、ＰＩ１６陽性Ｔｒｅｇ細胞での異常、または該細胞の不足または減少が自己免疫の一因となり得る。

【0471】

いかなる理論または作用機序に縛られるものではないが、本明細書に提示される結果は、健常者ではＰＩ１６陽性Ｔｒｅｇ細胞およびＴ_Ｈ１７細胞がＴ_Ｈ１７免疫応答を制御するＴｒｅｇ細胞と同じ炎症部位に存在することを示す。一方で、ＰＩ１６陽性Ｔｒｅｇ細胞での異常が自己免疫の一因となり得る。

【0472】

実施例８： ＰＩ１６^＋Ｔｒｅｇ細胞はＣＬＡを発現する
規定のメモリーＣＤ４＋細胞サブセットによる、ＣＤ２５とＰＩ１６（ＣＲＣＢＴ−０２−００１）との共発現を用いた皮膚リンパ球抗原（ＣＬＡ）発現を評価した。図３２に示されるデータから、より高い比率のＰＩ１６^＋Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ２５^＋ＰＩ１６^＋）は細胞の皮膚への遊走を伴うＣＬＡを発現する事が示される。いかなる理論または作用機序に縛られるものではないが、ＣＬＡのＰＩ１６^＋Ｔｒｅｇ細胞による発現により、これらの細胞が皮膚の炎症に遊走し得、一方でＰＩ１６⁻Ｔｒｅｇ細胞はＣＬＡを発現せず、皮膚へ遊走し得ない。

【0473】

実施例９： ＣＲＣＢＴ−０２−００１を用いて単離したＰＩ１６発現Ｔｒｅｇ細胞の走化性
９．１ 走化性試験
組み換えヒト胸腺および活性化調節ケモカイン（ＣＣＬ１７、ＣＣＲ４へのリガンド）および組み換えヒトマクロファージ炎症性タンパク質−３アルファ（ＣＣＬ２０、ＣＣＲ６へのリガンド）をＲａｙｂｉｏｔｅｃｈ（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）より購入した。走化性試験を５−μｍ孔（Ｃｏｒｎｉｎｇ）をもつトランスウェルプレートを用いて実施した。ボトムウェルには培地単独、ＣＣＬ１７およびＣＣＬ２０両方の１００ｎｇ／ｍｌのＣＣＬ１７、１００ｎｇ／ｍｌのＣＣＬ２０、または１００ｎｇ／ｍｌのいずれを入れた。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）および滑液単核細胞（ＳＦＭＣ）を標準的な密度勾配遠心法により単離した。アッパーウェルに１ウェルあたり１ｘ１０^６の細胞をロードし、細胞を２時間、３７℃で遊走させた。走化性後、トップおよびボトム（遊走済み）ウェル中の細胞を回収し、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６およびＣＲＣＢＴ−０２−００１に対するモノクローナル抗体で染色した。

【0474】

成人健常者ＰＢＭＣからのＣＤ４^＋ＣＤ２５^{ｂｒｉｇｈｔ}ＣＲＣＢＴ−０２−００１^＋細胞のＣＣＲ４およびＣＣＲ６リガンド、ＣＣＬ１７およびＣＣＬ２０に対する応答での遊走能力を、５μｍ孔Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｓ（商標）を用いて検査した。ＣＤ４＋ＣＤ２５^{ｂｒｉｇｈｔ}ＣＲＣＢＴ−０２−００１細胞はＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０および複合ＣＣＬ１７／ＣＣＬ２０リガンドへ遊走した（図３３Ａ）。

【0475】

若年性特発性関節炎に罹患した対象からのＰＩ１６^＋Ｔｒｅｇの能力ついても評価した。成人健常者と同様に、健常児からのＣＤ４^＋ＣＤ２５^{ｂｒｉｇｈｔ}ＣＲＣＢＴ−０２−００１^＋Ｔｒｅｇ細胞（Ｎｏｒｍａｌ Ｊｕｖｅｎｉｌｅ ＰＢＭＣ）およびＪＩＡ患者からのＣＤ４^＋ＣＤ２５^{ｂｒｉｇｈｔ}ＣＲＣＢＴ−０２−００１^＋Ｔｒｅｇ細胞はリガンドＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０およびＣＣＬ１７およびＣＣＬ２０に遊走することができた（図３３Ｂ）．一方で、ＪＩＡ患者からの滑液単核細胞（ＳＦＭＣｓ）はリガンド、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０およびＣＣＬ１７およびＣＣＬ２０への遊走能力が見られなかった。

【0476】

上記提示したデータは、ＰＩ１６（ＣＲＣＢＴ−０２−００１で検出するこの場合）はケモカインＣＣＬ１７およびＣＣＬ２０への遊走能力をもつ機能的安定なメモリーＴｒｅｇの区別可能なサブセットを同定し、したがって炎症誘発Ｔ_Ｈ１７細胞と同様の炎症部位である可能性が最も高いことを示す。

【0477】

ＪＩＡの場合、炎症関節をＰＩ１６⁻Ｔｒｅｇ細胞中で濃縮する（およびＴ_Ｈ１７細胞中で濃縮する）が、ＰＩ１６^＋Ｔｒｅｇ細胞中では濃縮しない。

【0478】

実施例１０： ＰＩ１６に結合するＣＲＣＢＴ−０２−００１の確証
１０．１ 質量分析を用いたＣＲＣＢＴ−０２−００１と結合したタンパク質の同定
ＣＲＣＢＴ−０２−００１を用いて精製したタンパク質を１０ｍＭ ＤＴＴの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）で１時間、６０℃で還元し、５０ｍＭ ヨードアセトアミドで３０分間、室温でアルキル化し、その後０．５μｇ トリプシンを添加し、タンパク質を２時間、４０℃で消化した。消化物をＲＰカラム（１５０ｍｍｘ１５０μｍＶｙｄａｃ ｅｖｅｒｅｓｔ Ｃ１８）上に接種し、溶離液を２，４α−シアノ桂皮酸飽和溶液と共にＭＡＬＤＩ−ＭＳ ｔａｒｇｅｔ ｐｌａｔｅ上にスポッティングし、放置して乾燥させた。次いで試料を、質量分析法を用いて解析した。

【0479】

１０．２ 結果
質量分析法を用いてまた、ＣＲＣＢＴ−０２−００１がＰＩ１６に結合することを確証した。ＣＲＣＢＴ−０２−００１は、質量２９２６．３１ＤａのＰＩ１６の配列からのペプチドの予測分子量に適合するイオン質量をもつペプチドを含むタンパク質に結合することが認められた。このペプチドはペプチド^８０ＧＥＮＬＦＡＩＴＤＥＧＭＤＶＰＬＡＭＥＥＷＨＨＥＲ^１０５（配列番号２７）の予測質量に対応した。その後ＭＡＬＤＩ−ｔｏｆ／ｔｏｆ−ＭＳ解析でペプチド配列を確かめた。

【0480】

実施例１１： ＣＲＣＢＴ−０２−００１と結合したエピトープのマッピング
１１．１ 手法の概略：
エピトープの特性解析
まず、エピトープが立体（不連続、３−Ｄ構造に依存して）であるか線形（順次的なアミノ酸）であるかを決定する。還元およびアルキル化（Ｒ＆Ａ）ステップを実施して、ＰＩ１６組み換え抗原のジスルフィド結合構造を隠した。ｍＡｂが依然としてＲ＆Ａタンパク質に結合している場合、ジスルフィドは必要なく、エピトープがアミノ酸の線状伸長部内に大部分含まれている可能性が最も高い。

【0481】

エピトープがグリコシル化されているか決定するため、ＰＩ１６を糖タンパク質からアスパラギン結合高マンノースならびにハイブリッドオリゴ糖および複合オリゴ糖を切断する酵素ペプチド−Ｎ４−アセチル−β−グルコサミニル（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）で処理した。ｍＡｂが脱グリコシル化されたＰＩ１６に結合する場合、エピトープはエピトープに結合する糖鎖構造に依らない。

【0482】

ｍＡｂのＰＩ１６への最小結合領域を決定する。
ファージディスプレイ法を用いて、ヒト ＰＩ１６ ＯＲＦを断片化しバクテリオファージ表面でフラグメントを発現させることにより遺伝子フラグメントライブラリ構築した。目的は、パニングと呼ばれる選択処理を用いて、ライブラリから抗体または「エピトープ」としても特定された最小結合断片に結合する遺伝子の最小結合部分を選択することである。

【0483】

１１．２ 方法：
溶解性 Ｆｃ−融合としてのヒトＰＩ１６の細胞外ドメインのクローニング（ＰＩ１６−Ｆｃ）
ヒトＰＩ１６のシグナルペプチド（アミノ酸２８〜４４３）を差し引いた細胞外ドメインをコードするＤＮＡを以下のプライマーを用いて増幅した：
ＰＩ１６＿ｐＦＵＳＥ＿ＥｃｏＲＶＦｎｅｗ：５’ｔｔｇａｔａｔｃａｃｔｃａｃａｇａｔｇａｇｇａｇａａａｃｇｔｔｔｇａｔ３’（配列番号２５）
ＰＩ１６＿ｐＦＵＳＥ＿ＢｇｌＩＩ＿Ｒ：５’ａａａｇａｔｃｔａｃｃｃｔｇａａａａｔａｃａｇｇｔｔｔｔｃａｔｇａｃｃａｇｇｇｃｃｃｇａｇｔｔｃａｇｃｃｃｔ３’（配列番号２６）。

【0484】

５’ＥｃｏＲＶ部位、３’ｔｅｖ−プロテアーゼ切断部位、およびＢｇｌＩＩ部位を添加した。次いで、増幅した配列をベクターｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ２（ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ）中にクローニングし、結果としてＮ末端分泌ペプチド、ＰＩ１６（アミノ酸２８〜４４３）、ｔｅｖプロテアーゼ切断部位およびＣ末端ヒトＦｃ部分を含む構築物を得た。この構築物をＰＩ１６−Ｆｃと称する。

【0485】

ＰＩ１６−Ｆｃの発現および精製
ＰＩ１６−Ｆｃをコードする作製構築物を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従ってＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入した。形質移入して１６時間後で、培養培地を、ＦＣＳを含まない不完全ＤＭＥＭに変更し、細胞を６日間、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。培養上清を０．２２μｍでの無菌濾過により回収した。上清を１／３体積の結合緩衝液（２０ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ７．０／１５０ｍＭ 塩化ナトリウム）で希釈し、２００μｌのＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ＭＢスラリ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、蒸留水および結合緩衝液で前洗浄した）により、４℃で１６時間インキュベートした。混合物を空カラム（Ｅｃｏｎｏ、１．５ｘ１５ｃｍ、ＢＩＯ−ＲＡＤ）に適用し、通過画分を廃棄した。３ｘ１５ｍｌ結合緩衝液で洗浄後、結合タンパク質の溶出を３ｘ０．５ｍｌ ０．１Ｍ グリシン（ｐＨ２．２）を添加することにより実施した。２５μｌの１．５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ１１．０）／０．５ｍｌ溶出画分をすぐに添加し、試料のｐＨを平衡に保った。クマシー染色前のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、タンパク質バンドが、質量スペクトル解析により標的ＰＩ１６−Ｆｃ構築物であることを確かめた全ての溶出画分中に存在することが明らかになった。ＣＲＣＢＴ−０２−００１ｍＡｂは免疫検出試験にて得られた溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン転写後に同じバンドを同様に認識した（データは非表示）。

【0486】

ＣＲＣＢＴ−０２−００１の天然ならびに還元化およびアルキル化（Ｒ＆Ａ）ＰＩ１６−Ｆｃへの結合
精製構築物ＰＩ１６−Ｆｃを用いて、ウエスタンブロット法解析によりＣＲＣＢＴ−０２−００１との結合を解析した。ＣＲＣＢＴ−０２００１エピトープの性質を明らかにするため、精製ＰＩ１６−Ｆｃ試料を、セクション８で先に述べたように還元しアルキル化した。天然およびＲ＆Ａ ＰＩ１６試料を４〜１２％ＮｕＰＡＧＥゲルを用いて分離し、クマシー ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ染色で染色、またはＰＶＤＦ膜上で電気ブロッティングした。膜を５％スキムミルクでブロッキングし、ＣＲＣＢＴ−０２−００１を用いて抗体、続いてペルオキシダーゼ複合体化抗マウスまたは抗ヒト抗体およびＥＣＬを展開した。

【0487】

ＣＲＣＢＴ−０２−００１の天然および脱グリコシル化されたＰＩ１６−Ｆｃへの結合
精製構築物ＰＩ１６−Ｆｃをまた使用してＣＲＣＢＴ−０２−００１への結合が任意のＮ−グリコシル化残基に依存的であるかどうかを解析した。この疑問に取り組むため、精製ＰＩ１６−Ｆｃ試料をＰＮＧａｓｅＦにより以下のように処理した：８μｇ ＰＩ１６−Ｆｃを８０ｎｇのＰＮＧａｓｅＦ（ＳＩＧＭＡ）と共に最終体積３００μｌのＰＢＳ中で３５℃、３時間インキュベートした。同量のＰＩ１６−Ｆｃを含有するが酵素は含まない対照試料を、同じ方法でインキュベートした。処理ＰＮＧａｓｅＦとＰＩ１６−Ｆｃの未処理試料との両方を用いて、並行してＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ｆｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ ９６ウェル）をコート（３μｇ／ｍｌのタンパク質濃度でＰＢＳにて４℃、１６時間）した。その後に、コートしたウェルをＰＢＳで２回洗浄し、５％ミルク粉末のＰＢＳ溶液にて２時間ブロッキングした（全ての洗浄およびブロッキングステップは、特に記載がない限り２００μｌの緩衝液体積を含んだ）。非コート対照ウェルを、これに応じてブロッキングした。ＰＢＳで２回洗浄後、ＣＲＣＢＴ−０２−００１溶液をウェルにＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ濃度で添加し、２２℃、６０分インキュベートした。非コート対照ウェルをＣＲＣＢＴ−０２−００１でこれに応じてインキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、ウェルを抗マウス二次抗体（ＨＲＰ複合体化抗体、ＰＢＳ中１：２０００）と共にインキュベートした。処理／未処理ＰＩ１６−Ｆｃ ＰＮＧａｓｅでコートした対照ウェルを、精製融合タンパク質のＣ末端Ｆｃ部分に対する抗Ｆｃ抗体（ＨＲＰ複合体化抗体、ＰＢＳ中１：４０００で）でプローブ化した。２２℃で１時間３０分インキュベーションを行った後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、各ウェルを１００μｌの基質溶液（１２０ｍＭクエン酸、１ｍＭ ＡＢＴＳ、０．０３％過酸化水素）でプローブ化し、２２℃、３０分間インキュベートした。その後、プレートをプレートリーダーで４１４ｎｍにて読み取った（４連で試料を処理）。

【0488】

バクテリオファージにディスプレイされたヒトＰＩ１６遺伝子フラグメントライブラリの構築およびパニング
本方法の変形（Coleyら，2001年）を用いてＭ１３バクテリオファージ上で発現されるヒトＰＩ１６遺伝子フラグメントライブラリを調製した。ファージミドベクターｐＨＥＮＨ６（Hoogenboomら，1991年）は、ファージ粒子表面上のｐＩＩＩタンパク質と周辺質標的配列およびその機能遺伝子ＩＩＩ配列間のマルチクローニング部位とをコードするＭ１３バクテリオファージ遺伝子ＩＩＩのコピーを含有する。ｄｓＤＮＡのマルチクローニング部位へのライゲーションの結果、遺伝子ＩＩＩ産物に融合した挿入フラグメントが発現し、次いでＭ１３バクテリオファージ表面上に融合タンパク質がディスプレイされる。

【0489】

ヒトＰＩ１６のコード領域に隣接するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、鋳型としてＰＩ１６ＯＲＦＤＮＡを用いたポリメラーゼ連鎖反応により細胞外のリーディングフレームを増幅した。その後ＰＩ１６ＰＣＲ産物をＤＮａｓｅ Ｉで消化し、様々な時点の消化産物をアガロースゲル電気泳動で試験して最適反応条件を決定した。最も広いフラグメントサイズ分布を示す条件を選択し、５μｇのＤＮＡを２０ｎｇのＤＮＡｓｅ Ｉを用いて反応緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｎＣｌ_２、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中にて２時間消化した。反応を、ＥＤＴＡを５０ｍＭの最終濃度になるまで添加することにより終了させ、７０℃、１０分間で熱失活させた。消化したＤＮＡを精製して末端をＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化した。５．４μｇのｐＨＥＮＨ６ファージミドベクターをＰｓｔＩで消化し、その後Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化した。ベクターの再環状化を避けるため、アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理した。次いで、ランダム消化物により産生した平滑末端化したＰＩ１６遺伝子フラグメントを、１：９の比率で挿入するベクターを用いて調製ｐＨＥＮＨ６ベクター中にライゲートした。ライゲート産物をＷｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＲＯＭＥＧＡ）を用いて精製し、電気穿孔法によりＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。

【0490】

形質転換細菌細胞を数回希釈して、遺伝子ライブラリサイズを約１×１０^７個体クローンであると推定した。一方向性のクローニングのため、およそ６クローン中１つがフレーム内にあり（４０％）、ワークライブラリのおよそのサイズは１ｘ１０^６であると推定された。ライブラリでのフラグメントサイズの多様性をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により試験し、個体クローンの配列決定を行った。配列の包含はランダムであると思われた。

【0491】

ライブラリグリセロールストックを２００ｍｌの２ＹＴ培地にて増幅し、実質的にColeyら，2001年に記載されるようにファージ粒子をヘルパーファージによりレスキューした。パニングの３つのラウンドを、イムノチューブ（ＮＵＮＣ ｍａｘｉｓｏｒｐ）を１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ ＣＲＣ−ＢＴ−０２−００１で一晩、４℃でコーティングすることにより実施した。チューブを、５％スキムミルク粉末を含むＰＢＳでブロッキングし、ライブラリ（１０^１１ファージミド粒子）をｍＡｂに結合させた。１時間後、チューブをＰＢＳで洗浄し、ｍＡｂに結合していないファージを取り除き、付着ファージを０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．２）で溶出し、１．５Ｍ ＴＲＩＳ緩衝液で中和させた。溶出ファージをＴＧ１大腸菌細胞中で再感染させ、レスキューし、増幅し、パニングの次のラウンドのために実質的にColeyら，2001年に記載のようにＰＥＧ沈殿を行った。パニングの第２ラウンドのために、ＰＢＳ含有０．１％ ＴＷＥＥＮ２０（ＰＢＳＴ）による２回の洗浄を行い、その後２回のＰＢＳによる洗浄、およびラウンド３にて２回のＰＢＳＴによる洗浄を追加した。ＣＲＣ−ＢＴ−０２−００１ ｍＡｂに結合するＰＩ１６のフラグメントの同一性を明らかにするため、ラウンド３からのクローンをＤＮＡ配列決定し、パニングのより初期のラウンドとクローンを比較した。

【0492】

遺伝子フラグメントの結合がファージ外で生じるかを決定するため、Ｒ３ ４およびＲ３ ７の重複領域からなるビオチン化ペプチドを合成した（ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ、中国）（配列番号３９）。ペプチドをＰＢＳ中で可溶化し、ｎｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）で前コーティングしたマイクロ力価プレートと結合させた。ウェルを洗浄し、モノクローナル抗体ＣＲＣＢＴ−０２−００１をペプチドおよび対照ペプチドとカップリングしたウェルに添加する。対照として、別のアイソタイプコントロール抗体（ＩＣ）をペプチドでコートしたウェルに添加した。抗マウスＨＲＰを用いて結合抗体を検出し、ＴＭＢ基質を用いてＥＬＩＳＡを展開した。

【0493】

１１．３ 結果
ＰＩ１６のＣＲＣＢＴ−０２−００１エピトープはジスルフィド結合の有無に依存する。
ＣＲＣＢＴ−０２−００１ ｍＡｂは結合のためにＰＩ１６抗原内にジスルフィド結合（３Ｄ構造）の存在が必要であるかを評価するため、ヒトＰＩ１６−Ｆｃの還元およびアルキル化を行った。

【0494】

図３４Ａ〜Ｃのデータは、ＣＲＣＢＴ−０２−００１ ｍＡｂは天然ＰＩ１６に結合するがＲ＆Ａ ＰＩ１６には結合しないことを説明している。図３４Ａ〜Ｃは組み換えタンパク質ＰＩ１６−ＦｃのＦｃ部分が検出され得ることを確証し、これはＰＩ１６の完全性がＲ＆Ａ後に保持されていることを確証している。図３４Ａ〜ＣはＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル、およびウエスタンブロット法が、ＣＲＣＢＴ−０２−００１はＲ＆Ａ ＰＩ１６に結合しないことを確証する。

【0495】

ＣＲＣＢＴ−０２−００１の結合は抗原のＮ−グリコシル化状態と無関係である
アスパラギン結合型糖鎖構造を除去するための、ＰＩ１６−ＦｃのＰＮＧａｓｅ Ｆによる脱グリコシル化は、ＣＲＣＢＴ−０２−００１の結合への影響を測定可能に有していなかった。対照抗体（抗ヒトＦｃ）は融合タンパク質のＦｃ部分が認められる（図３５）。このことはＣＲＣＢＴ−０２−００１のエピトープが抗原のＮ−グリコシル化状態に依存していないことを示す。

【0496】

ＰＮＧａｓｅＦ処理および未処理ＰＩ１６−Ｆｃの両方をＳＤＳ ＰＡＧＥおよびＷｅｓｔｅｒｎ ｔｒａｎｓｆｅｒにより解析した。ＰＮＧａｓｅＦ処理後のＰＩ１６−Ｆｃに関し分子量の明確な変化が認められた（マイナス約５ｋＤａ）（データ非表示）。

【0497】

エピトープを狭小化したＰＩ１６に結合するＣＲＣＢＴ−０２−００１の特性解析
精製ＰＩ１６−Ｆｃは試料の熱処理後に区別可能な分解産物を示していた（図３６）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて解析しＣＲＣＢＴ−０２−００１で免疫修飾される際、ＰＩ１６−Ｆｃのフラグメントは、約３５ｋＤａの分子量の抗体を認めた。使用したタンパク質構築物でのＰＩ１６の細胞外ドメインに融合されるＣ末端Ｆｃタグに対する対照抗体抗Ｆｃは、記載した分解産物といかなる結合も示さなかった（データは非表示）。

【0498】

試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに処し、クマシー染色後、対応するタンパク質バンドをゲルから切り取った。トリプシンを含むゲル断片のゲル中消化後、抽出したトリプシンペプチドを解析し、ＰＩ１６のＮ末端ＣＡＰドメインに属するペプチドを、ＭＡＬＤＩ−ｔｏｆ／ｔｏｆ−ＭＳ法を用いて配列決定した：ＰＩ１６ アミノ酸５９〜６８（配列：ＷＤＥＥＬＡＡＦＡＫ（配列番号３２）。

【0499】

これらの結果は、ＰＩ１６のＮ末端ＣＡＰドメインがｍＡｂ ＣＲＣＢＴ−０２−００１の実際の結合部位において関与していることを示す。

【0500】

ランダムなＰＩ１６フラグメントを発現するファージライブラリの産生
ＰＩ１６（アミノ酸２８〜４４３）細胞外ドメインのコード領域を増幅し、ＤＮａｓｅ Ｉで消化した。１２００から１００ｂｐ間のフラグメントをもたらす条件を用いてファージミドベクターｐＨＥＮＨ６中にクローン化したＰＩ１６遺伝子フラグメント（図３７）の混合物を産生し、遺伝子フラグメントライブラリを作製した。無作為に選択したクローンのいくつかは、遺伝子フラグメントの広範囲の分布を示した（図３７）。

【0501】

ｍＡｂ ＣＲＣ−ＢＴ−０２−００１でのＰＩ１６遺伝子フラグメントライブラリのパニング
３ラウンドのパニングを実施してｍＡｂ ＣＲＣ−ＢＴ−０２−００１に結合したＰＩ１６の遺伝子フラグメントを選択した。ＰＩ１６遺伝子フラグメントクローンのｍＡｂへの結合性をＥＬＩＳＡにより解析し、その結果を図３８Ａに示す。ラウンド３（Ｒ３ ４、７、１０、１２＆１５）で選択された、抗ＰＩ１６ ｍＡｂに強力に結合する５つのクローンはＥＬＩＳＡ高シグナルを示し、一方でラウンド２およびラウンド０での非クローンはｍＡｂと結合した。これらの配列は、フレーム外、図４０で示される配列データの概略外であり得る。図３８Ｂに示す９Ｅ１０または抗ｍｙｃシグナルは、ｍｙｃタグが遺伝子フラグメントのＣ末端（遺伝子ＩＩＩのＮ末端）に存在するため、ファージの相対量を反映している。抗ｍｙｃ抗体への高い結合シグナルが、ファージ表面で良好に発現する指標である（図３８Ｂ）。フラグメントのなかには、陽性抗Ｍｙｃシグナルに示されるファージ上で発現するが抗ＰＩ１６ ｍＡｂには結合しないものもあった。

【0502】

個々のクローンをラウンド３にて選択し、ＰＣＲを行い、遺伝子フラグメントを配列決定した。パニングしていないライブラリ（ラウンド０）およびラウンド１において、フラグメントサイズの広範囲の広がりが存在した一方でラウンド３ではフラグメントの多くがごく小さいサイズであった（図３９）。ラウンド３選択ＰＩ１６遺伝子フラグメントの配列同一性を図４０に示す。これらのフラグメントはＣＲＣＢＴ−０１−００１の最小結合領域を示すＰＩ１６配列に重複し、このことは、この領域が、抗体が結合するＰＩ１６のエピトープを形成することを示す。

【0503】

遺伝子フラグメントライブラリからのＣＲＣＢＴ−０２−００１結合性クローンの重複配列を図４０Ｃの下線部に示す。

【0504】

上記提示したデータにより、ＣＲＣＢＴ−０２−００１に関するエピトープは分子内ジスルフィド結合の有無に依存的であるが、Ｎ結合炭水化物に依存的でないことが示される。本データは、ＣＲＣＢＴ−０２−００１に関するエピトープはＮ末端ＣＡＰドメインとファージディスプレイにより同定された短配列、ＲＷＤＥＥＬＡＡＦＡＫＡＹＡＲＱ（配列番号３８）に配置されている（いずれかがエピトープを含むまたは含有する）ことを示唆する。

【0505】

ファージディスプレイにより同定された最小結合領域はシステインまたはジスルフィド結合を含まない。エピトープはファージ外のジスルフィド結合に依存し得る可能性がある。しかしペプチドＬＨＭＲＷＤＥＥＬＡＡＦＦＡＫＡＹＡＲＱＣＶＷＧＨＮＫＥＲ−ビオチン（配列番号３９）が合成され、ｍＡｂ ＣＲＣＢＴ−０２−００１に結合することがＥＬＩＳＡにより示された（図４１）。このペプチドは同定された最小結合領域含む（下線）。このことは、ｍＡｂ ＣＲＣＢＴ−０２−００１が単離の際にＰＩ１６のこの領域に結合するが、全ＰＩ１６抗原中に存在する場合には同族エピトープと反応するために抗原中に存在するさらなる構成成分を必要とすることを実証する。

【0506】

発明者らは、ＣＲＣＢＴ−０２−００１のエピトープが一次配列ＲＷＤＥＥＬＡＡＦＡＫＡＹＡＲＱ内に含まれ、また全ＰＩ１６抗原中に存在する場合にジスルフィド結合が完全であることによりｍＡｂに接触容易性をもたらすことを結論付けている。

【0507】

実施例１２： ＣＲＣＢＴ−０２−００１の親和性
２つの方法を比較してＣＲＣＢＴ−０２−００１の親和性を測定した。解析を、ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｐｒｏｔｅｏｎ ＸＰＲ３６（商標）タンパク質相互作用アレイシステムを用いて、表面プラズモン共鳴に基づき実施した：
方法１：チップに直接抗原ＰＩ１６−Ｆｃをカップリングして分析物ＣＲＣＢＴ−０２−００１Ｆａｂの上に流す方法。
方法２：抗ＰＩ１６Ｍａｂを捕捉し、分析物としてのＰＩ１６−Ｆｃ上に流す抗マウス捕捉方法。

【0508】

１２．１ 方法
方法１：センサーチップにカップリングしたＰＩ１６−ＦｃとＣＲＣＢＴ−０２−００１（Ｆａｂ）との相互作用
ＰｒｏｔｅＯｎセンサーチップ（ＧＬＣ）を、０．２Ｍ Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および０．０５Ｍ スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）の混合物をチップ（１５０μｌ、３０μｌ／分で５分間）に流すことにより活性化した。組み換えＰＩ１６−Ｆｃを、１５０μｌの５０μｇ／ｍＬ溶液を含む１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を３０μｌ／分で流すことにより、垂直方向にチップにカップリングした。次いで、残余活性化カルボキシル基を、１５０μLの１Ｍ エタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を３０μｌ／分で流すことにより、非活性化した。ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０（０．００５％）に希釈した抗ＰＩ１６ Ｆａｂフラグメントを、次の濃度：５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭおよび３．１２５ｎＭでの５つのチャネルで、リガンドに水平方向に通過させた（１００μｌ、１００μｌ／分）接触時間６０秒および解離時間６００秒）。ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０（０．００５％）のみを残余チャネルに通過させた。結合しているセンサグラムを回収して、ラングミュア動態モデルを用いたＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ２．１ ＸＰＲ３６ソフトウェアで解析し、データを適合し親和性定数（ＫＤ）を測定した。

【0509】

方法２：ＣＲＣＢＴ−０２−００１Ｍａｂと抗マウス捕捉試薬を用いたＰＩ１６−Ｆｃとの相互作用
ｐｒｏｔｅＯｎセンサーチップ（ＧＬＭ）を、０．２Ｍ ＥＤＣおよび０．０５Ｍ ｓｕｌｐｈｏ−ＮＨＳの混合物をチップ（１５０μｌ、３０μｌ／分で５分間）に流すことにより活性化した。次いで、ウサギ抗マウスＩｇＧ全分子（Ｓｉｇｍａ Ｍ−７０２３）を、１５０μｌの５０μｇ／ｍＬ溶液を含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を３０μｌ／分で流すことにより、チップに垂直方向にカップリングした。次いで、残余カップリング部位を、１５０μｌの１Ｍ エタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を３０μｌ／分で流すことにより、非活性化した。次いで、マウスモノクローナル抗ＰＩ１６ ＩｇＧを流して、１５０μLの１００μg／ｍＬ ＩｇＧ、２５μｌ／分でセンサーチップのシングルチャンネル上を平行方向に流すことによりカップリングした抗マウスＩｇＧ抗体により捕捉した。次いで、ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０（０．００５％）に希釈した組み換えＰＩ１６−Ｆｃを、次の濃度：５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭおよび３．１２５ｎＭでの５つのチャネルで、ＧＬＭセンサーチップに垂直方向に通過させた（１５０μｌ、２５μｌ／分、接触時間２４０秒および解離時間１２００秒）。ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０（０．００５％）のみを残余チャネルに通過させて、参照用とした。結合しているセンサグラムを回収して、ラングミュア動態モデルを用いたＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ２．１ＸＰＲ３６ソフトウェアで解析し、データを適合し親和性定数（ＫＤ）を測定した。

【0510】

１２．２ 結果
方法１
このカップリング方法を、ＰＩ１６−ＦｃのＧＬＣチップへのカップリングを最適化するための様々なｐＨを用いて実施した。最適カップリングｐＨは４．５であった。結合曲線および解離曲線ならびに親和性測定を、図４２および表８に示すＰＩ１６の３つの希釈により実施した。データは、全体的適合を用いたラングミュア動態モデルに良好に適合した（曲線のすべてが同時に適合した）。

【表9】

【0511】

方法２
公開された方法（Nahsholら，2008年）を用いて、ＰＩ１６ ｍａｂの動態を抗マウス捕捉により測定した。これは比較的穏やかな方法、カップリング方法であり、
結合曲線および解離曲線ならびに親和性測定を、ＰＩ１６−Ｆｃの４種類の希釈で実施した（図４３および表９）。データは、全体的適合を用いたラングミュア動態モデルに良好に適合した（曲線のすべてが同時に適合した）。

【表10】

【0512】

ＣＲＣＢＴ−０２−００１のＰＩ１６−ｆｃへの親和性は方法２を用いて測定された。両方法を用いた親和性（ＫＤ）は同程度の１．２５〜２．５６ｎＭである。

【0513】

実施例１３： ＧＶＨＤの治療
骨髄移植を必要とする対象は放射線治療される。好適な時間に続き、対象は骨髄移植または造血幹細胞の移植を受ける。検査患者では、移植片はさらに実施例２および３に記載のように単離したＴｒｅｇ細胞を含む。次いで、生存率を測定し、Ｔｒｅｇ細胞を受ける対象の生存率が伸びている場合は細胞が機能的であることを示す。

【0514】

実施例１４：自己免疫疾患の治療
自己免疫疾患に罹患する対象に、実施例２および３に記載のように単離した精製Ｔｒｅｇ細胞または担体単独を投与する。自己抗体、サイトカインのレベルおよび自己免疫性症状を測定する。症状の緩和および／または炎症性サイトカインの血清レベルの減少の検出が、単離Ｔｒｅｇ細胞が自己免疫疾患を治療または予防し得ることが示す。

【0515】

例示的な自己免疫疾患は、関節リュウマチである。この疾患の場合、対象に実施例２および３に記載のように単離した精製Ｔｒｅｇ細胞または担体単独を投与する。抗コラーゲン抗体レベル、サイトカインおよび／または関節炎の症状を測定する。関節炎症状の緩和ならびに／またはＴＮＦ−ａｌｐｈａおよび／もしくはＩＬ−６などのサイトカインの血清レベルの減少の検出は、単離Ｔｒｅｇ細胞が関節リュウマチを治療または予防し得ることが示す。

【0516】

実施例１５：糖尿病治療
前糖尿病性の表現型に罹患する対象（症候性１型得糖尿病、および好ましくは自己反応性Ｂおよび／またはＴ細胞で検出されるレベルではないが例えば耐糖能異常）を、実施例２および３に記載のように単離された精製Ｔｒｅｇ細胞または担体単独で処理する。処理後、対象を糖尿病の症状、例えば血糖値の増加、インスリン反応異常、耐糖能異常、または自己抗体レベルなどについて評価する。糖尿病の１以上の症状の発症の防止または遅延は、単離Ｔｒｅｇ細胞が自己免疫性糖尿病を治療し得ることの指標となる。

【0517】

実施例１６ ＣＲＣＢＴ−０２−００１により分泌される抗体の可変領域のクローニングおよび配列決定
メッセンジャーＲＮＡを、ＣＲＣＢＴ−０２−００１ハイブリドーマ細胞から、産生およびオリゴ−ｄＴプライマーを用いて逆転写することにより調製しｃＤＮＡを作製する。別個のＰＣＲ反応のいくつかを、リーダー配列、可変領域および下流配列のいくつかに結合し、これらの配列をコードするｃＤＮＡの増幅を容易にするプライマーにより実施する。ＰＣＲ単位複製配列をアガロースゲル上に分離する。単位複製配列をゲルから単離し、クローニングし、配列決定する。

【0518】

実施例１７ ―ＣＲＣＢＴ−０２−００１により分泌される抗体の可変領域を含むキメラ抗体の作製
ＣＲＣＢＴ−０２−００１により分泌される抗体の可変領域を、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域と融合することにより全抗体に変換する。可変領域を実施例１または１６に記載のクローニングベクターよりＰＣＲ増幅し、抗体配列の直前のリーダー配列により抗体発現ベクター内にインフレームでクローン化する。ベクターでは、軽鎖および重鎖に関する全定常領域のゲノムＤＮＡ配列がすでにベクターにて遺伝子操作されている。発現はヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）早期プロモーター、次いでＳＶ４０ポリアデニル化信号により促進される。可変領域のインフレーム融合により、全抗体の適切な発現が可能となる。設計により、マウス軽鎖および重鎖からのリーダー配列を、抗体オープンリーディングフレームの直前に含む。

【0519】

組み合わせた軽鎖および重鎖プラスミドＤＮＡまたは１：１の混合比の対応する軽鎖および重鎖プラスミドＤＮＡの混合物のいずれかをリポフェクションによりＣＨＯ細胞中に形質移入する。培養培地を採取して、ろ過し、低速Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）遠心分離濃縮器を用いて濃縮する。

【0520】

実施例１８： ＣＲＣＢＴ−０２−００１により分泌される抗体のヒト化
ＣＲＣＢＴ−０２−００１により分泌される抗体のヒト化形態を、基本的に国際公開第９２／２２０１８号に記載のように作製する。簡単には、ＣＲＣＢＴ−０２−００１により分泌される抗体と高い相同性を持つ配列を有するＰＩ１６ヒト抗体の結合親和性を保持するヒト化抗体を作製するために選択され、アクセプター軽鎖および重鎖ヒトフレームワークの両方を得る。

【0521】

本明細書で決定される配列を用いて、コンピュータープログラムＡＢＭＯＤおよびＥＮＣＡＤ（Levitt、1983年およびZilberら，1990年）にて各マウス抗体の可変領域モデルを構築する。このモデルを使用して、アミノ酸と潜在的に相互作用するほどＣＤＲに近い各フレームワークでのアミノ酸を決定する。

【0522】

各ヒト化抗体を設計する際、各位置にて、アミノ酸は、以下の１つ以上のカテゴリ（１）〜（４）に該当する場合を除いては、ヒトアクセプター配列でのアミノ酸と同様であるものを選択した：
カテゴリ１：アミノ酸位置がKabatらにより特定されたＣＤＲ内にある；
カテゴリ２：ヒトアクセプター免疫グロブリンのフレームワーク内でのアミノ酸が異常な場合（すなわち「まれ」であり、本明細書に使用される場合、アミノ酸がその位置で、代表的なデーターバンクでのヒト重鎖（各軽鎖）Ｖ領域配列の約２０％未満であるが通常約１０％未満で生じることを示す）、またその位置でのドナーのアミノ酸がヒト配列に典型的なものである場合（すなわち本明細書に使用される場合「一般的」はアミノ酸が代表的なデーターバンクでの配列の約２５％超であるか通常約５０％超で生じることを示す）、アクセプターよりむしろドナーアミノ酸が選択され得る；
カテゴリ３：ヒト化免疫グロブリン鎖の一次配列での３つのＣＤＲのうち１以上とごく近接する位置において、アクセプターアミノ酸よりむしろドナーアミノ酸が選択され得る。
カテゴリ４：本来のドナー抗体の典型である３次元モデルがＣＤＲ外の特定のアミノ酸がＣＤＲに近接し、またＣＤＲでのアミノ酸と、水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用などにより良い確率の相互作用をもつ。これらのアミノ酸位置で、アクセプター免疫グロブリンアミノ酸よりむしろドナー免疫グロブリンアミノ酸が選択され得る。

【0523】

上記カテゴリのいずれかに該当するマウスドナー配列でのアミノ酸を用いる。

【0524】

ヒト化抗体をコードする遺伝子の構築のために、ヒト化重鎖および軽鎖のタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列を選択し、典型的にはマウス抗体鎖からのシグナルペプチドを含み、一般にマウス配列に見られるコドンを利用する。数種類の縮重コドンを変更して反応部位を作製するか、好ましくない部分を取り除く。ヌクレオチド配列はまた、免疫グロブリン遺伝子の典型的なものとしてスプライスドナーシグナルを含んでいた。重複する合成オリゴヌクレオチドから構築された各遺伝子。各可変ドメイン遺伝子について、交互ストランド上の２対の重複オリゴヌクレオチドは、全コード配列ならびにシグナルペプチドおよびそのスプライスドナーシグナルを包含するように合成される。二重鎖ＤＮＡフラグメントはＫｌｅｎｏｗまたはＴａｑポリメラーゼを用いてまたはオリゴヌクレオチドの各対からの配列を用いて合成され、制限酵素で消化され、ｐＵＣ１８ベクターにライゲートされ、また配列決定する。次いで、各々正確な２つのフラグメント半配列を発現ベクター中に適する方向でライゲートし、完全重鎖および軽鎖遺伝子を作製する。

【0525】

重鎖および軽鎖プラスミドを、リポフェクションによりＣＨＯ細胞内に形質移入させる。

【0526】

培養上清でのヒト抗体の産生を、捕捉試薬としての組み換えＰＩ１６または実施例１もしくは２に記載のＦＡＣＳを用いてＥＬＩＳＡにより試験することにより、クローンをスクリーニングし、抗体を最適に産生されたクローンから精製する。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムに組織培養上清を通すことにより抗体を精製する。結合抗体を酸性溶出緩衝液により溶出し、該緩衝液はＰＤ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通過させることによりＰＢＳに変換する。

【0527】

次いで、対応する抗原を発現する細胞型へのヒト化抗体の結合性を、実施例３に記載のように検査する。

【0528】

実施例１９： ヒト化抗体の親和性成熟
実施例１８に記載のヒト化抗体の可変重鎖および可変軽鎖をコードするＤＮＡを、ＦａｂファージディスプレイベクターまたはｓｃＦｖファージディスプレイベクターにてクローン化する。次いで、クローンＤＮＡを、可変重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域（各ライブラリは＞１０^８機能多様性をもつ）にて無作為に突然変異する。ついで結果としてできた変異株を、標準的なファージディスプレイパニングプロトコル（例えばファージディスプレイ法：A Laboratory Manual, 2001年, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照）を用いて、ＰＩ１６（実施例２に記載）を発現する細胞に対してパニングする。パニングの各後続周期（続くラウンド）において標的細胞濃度を低下させることによりパニングのストリンジェンシーを効果的に上昇させ、これにより、各後続周期にてより増大した高い親和性ファージを濃縮する。ファージＥＬＩＳＡを一次試験として用いて、ファージ結合組み換えＦａｂｓまたはｓｃＦｖのＰＩ１６発現細胞認識能力を測定する。

【0529】

ＰＩ１６発現細胞と結合することができるフラグメントを、発現、産生および特性解析のため、ヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体へ変換する。

【0530】

実施例２０： 競合的結合試験
ＣＲＣＢＴ−０２−００１により産生された抗体を蛍光標識で標識化し、キメラ抗体（実施例１７）、ヒト化抗体（実施例１８）、親和性成熟抗体（実施例１９）、またはナイーブ完全ヒトファージディスプレイライブラリディスプレイｓｃＦｖと１：１の割合で混合した。対照のため、標識ＣＲＣＢＴ−０２−００１を単独で使用した。

【0531】

ＰＩ１６を安定的に発現する（実施例２）ＮＩＨ３Ｔ３細胞のほぼ同等量が、９４ウェルプレートで培養される。細胞は、抗体の存在下で、結合する抗体ために十分な時間培養される。上清は単離され、細胞は洗浄される。細胞に結合したおよび／または上清での蛍光レベルが次いで測定される。

【0532】

細胞に結合した蛍光レベルが減少する抗体および／または上清で蛍光性が増大する抗体は、ＣＲＣＢＴ−０２−００１により分泌される抗体の結合を競合的に阻害すると考えられる。

【0533】

任意の競合的ファージディスプレイｓｃＦｖはヒトアイソタイプＩｇＧ１完全抗体中にて遺伝子操作される。

【0534】

実施例２１：免疫応答の誘発
対象に腫瘍細胞株、例えばＮｅｕｒｏ−２ＡまたはＣＴ２６結腸直腸癌細胞を投与する。細胞投与に続いてまたは投与時点で、対象に実施例２０で同定された競合的抗体を投与する。あるいは、対象を、Ｔｒｅｇ細胞を捕捉するＣＲＣＢＴ−０２−００１により分泌される抗体を用いて白血球除去療法により治療する。対象のサブセットにもまた死滅癌細胞を投与する。腫瘍細胞に対する免疫応答をまたＥＬＩＳＡおよび／またはＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定する。抗体単独または抗体および細胞のワクチンで治療した対象と対比した、抗体治療なしで腫瘍細胞を投与したマウスでの生存率、腫瘍の存在、腫瘍サイズおよび／または腫瘍に対する免疫応答の程度を測定する。細胞および抗体を投与された、または抗体単独もしくは抗体／白血球除去療法に対比して白血球除去療法を受けたマウスでの、生存率または免疫応答のさらなる増加および／または腫瘍の存在またはサイズの減少により、治療がワクチン治療に対するより強力な応答を可能にすることを示す。

【0535】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図23D】

【図24A】

【図24B】

【図25A】

【図25B】

【図26A】

【図26B】

【図27A】

【図27B】

【図28】

【図29A】

【図29B】

【図29C】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33A】

【図33B】

【図34A】

【図34B】

【図34C】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38A】

【図38B】

【図39】

【図40A】

【図40B】

【図40C】

【図41】

【図42】

【図43】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]