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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6048405
(24)【登録日】2016年12月2日
(45)【発行日】2016年12月21日
(54)【発明の名称】アナライト量の測定方法およびＳＰＦＳ用装置
(51)【国際特許分類】
G01N 33/543 20060101AFI20161212BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20161212BHJP
G01N 37/00 20060101ALI20161212BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20161212BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20161212BHJP
【ＦＩ】
G01N33/543 595
G01N33/543 575
G01N33/53 S
G01N37/00 101
G01N33/574 B
G01N33/543 525U
G01N21/64 F
【請求項の数】10
【全頁数】19
(21)【出願番号】特願2013-525727(P2013-525727)
(86)(22)【出願日】2012年7月24日
(86)【国際出願番号】JP2012068710
(87)【国際公開番号】WO2013015282
(87)【国際公開日】20130131
【審査請求日】2014年12月11日
(31)【優先権主張番号】特願2011-165498(P2011-165498)
(32)【優先日】2011年7月28日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000001270
【氏名又は名称】コニカミノルタ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001070
【氏名又は名称】特許業務法人ＳＳＩＮＰＡＴ
(72)【発明者】
【氏名】井出 陽一
(72)【発明者】
【氏名】金子 智典
(72)【発明者】
【氏名】二宮 英隆
【審査官】
三木 隆
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１０／１３４５９２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１０／１００８６２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特表２００１−５１６８７９（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２０１０／１２３０７３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特開平０４−１３０２７４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開平０８−２７１４３１（ＪＰ，Ａ）
【文献】
欧州特許出願公開第０１４３５２６２（ＥＰ，Ａ１）
【文献】
特開２０１３−７６６６６（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｇ０１Ｎ ３３／５４３
Ｇ０１Ｎ ２１／６４
Ｇ０１Ｎ ３３／５３
Ｇ０１Ｎ ３３／５７４
Ｇ０１Ｎ ３７／００
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
表面プラズモン励起増強蛍光分光法〔ＳＰＦＳ〕を用いたサンドイッチアッセイにおいて、蛍光色素により標識されたレクチンを二次抗体として用い、前記レクチンはアナライトとの結合において解離速度定数〔ｋd〕１.０×１０-6〜１.０×１０-3（Ｓ-1）および／または解離定数〔ＫD〕１０-6 Ｍ以上を有し、前記レクチンとアナライトとの反応を、ＳＰＦＳによる蛍光量の測定と同時に実施することを特徴とするアナライト量の測定方法。
【請求項2】
上記アッセイが流路内で実施され、かつ、その送液の流量が１００μＬ／分以上１０,０００μＬ／分以下である請求項１に記載の測定方法。
【請求項3】
上記流路に供する検体量が、５μＬ以上１,０００μＬ以下である請求項２に記載の測定方法。
【請求項4】
上記アナライトが、腫瘍マーカーである請求項１〜３のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項5】
上記アッセイで用いる固相一次抗体が、３次元構造を有する固相化層の中および外面に固定化された抗体である請求項１〜４のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項6】
上記固相化層が、
グルコース、カルボキシメチル化グルコース、ならびに、
ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される単量体
からなる群より選択される少なくとも１種の単量体から構成される高分子を含む請求項５に記載の測定方法。
グルコース、カルボキシメチル化グルコース、ならびに、
ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される単量体
からなる群より選択される少なくとも１種の単量体から構成される高分子を含む請求項５に記載の測定方法。
【請求項7】
その一方の表面にリガンドを固定化したプラズモンセンサであって、アナライトが該リガンドに結合し、さらに蛍光色素により標識されたレクチンがアナライトに結合したプラズモンセンサを含んでなるＳＰＦＳ用装置であって、前記レクチンはアナライトとの結合において解離速度定数〔ｋd〕１.０×１０-6〜１.０×１０-3（Ｓ-1）および／または解離定数〔ＫD〕１０-6 Ｍ以上を有し、前記レクチンとアナライトとの反応をＳＰＦＳによる蛍光量の測定と同時に実施する手段を備えたＳＰＦＳ用装置。
【請求項8】
上記アナライトが、腫瘍マーカーである請求項７に記載のＳＰＦＳ用装置。
【請求項9】
上記リガンドが、３次元構造を有する固相化層の中および外面に固定化された抗体である請求項７または８に記載のＳＰＦＳ用装置。
【請求項10】
上記固相化層が、
グルコース、カルボキシメチル化グルコース、ならびに、
ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される単量体
からなる群より選択される少なくとも１種の単量体から構成される高分子を含む請求項９に記載のＳＰＦＳ用装置。
グルコース、カルボキシメチル化グルコース、ならびに、
ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される単量体
からなる群より選択される少なくとも１種の単量体から構成される高分子を含む請求項９に記載のＳＰＦＳ用装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法〔ＳＰＦＳ〕を用いたサンドイッチアッセイにおいて、アナライト量を測定する方法に関する。さらに詳細には、本発明は、ＳＰＦＳを用いたサンドイッチアッセイにおいて、蛍光標識レクチンを二次抗体として用いる、アナライト量を測定する方法および該測定方法に用いるＳＰＦＳ用装置に関する。【背景技術】
【0002】
生体の生命機能を担う主役であるタンパク質が、細胞社会の中において秩序正しく機能を発揮するためには、糖鎖修飾をはじめとする翻訳後修飾が極めて重要な役割を担っている。生体内の殆どのタンパク質は糖鎖による修飾を受けており、タンパク質に付加した糖鎖がウイルスの感染、原虫の寄生、感染、毒素の結合、ホルモンの結合、受精、発生分化、タンパク質の安定性、がん細胞転移、アポトーシスなど、生命現象の様々な場で重要な役割を果たしていることが近年次々と明らかになってきた。【0003】
糖鎖機能の解析のためには、まずその糖鎖の構造解析が欠かせない。今後も糖鎖構造解析法の重要性は増すことが予想される。しかし糖鎖の構造解析は多大な時間と労力、経験を要することから、従来の手法に基づき完全な構造決定を目指すのではなく、より簡便に、高速、高感度、かつ高精度に多彩な糖鎖構造の特徴を抽出し、相互識別できるシステム開発が期待されていた。【0004】
糖鎖と糖鎖に相互作用を示すタンパク質（代表的にはレクチン）の間の結合は抗原抗体反応の一般的な解離定数（ＫD＝10-8以下）等に比べて、一般的に弱い相互作用であることが知られており、これらの解離定数〔ＫD〕は10-6 Ｍかそれ以上であることが多い。また糖鎖と糖鎖に相互作用を示すタンパク質間の相互作用は比較的速い解離−会合反応から成り立っていることが知られており、結果的に一般的なタンパク質間相互作用や相補的ヌクレオチド断片間の相互作用に比べ、洗浄操作などにより解離側に平衡が傾きやすい。例えば、レクチンを糖タンパク質固定化カラム等にて精製を行う際にも、レクチンの結合が弱い場合は洗浄操作中にレクチンがカラム外に流出してしまう現象がしばしば観察される。【0005】
特許文献１には、レクチンと糖鎖の相互作用を利用するマイクロアレイ分析であって、エバネッセント励起方式（マイクロアレイスキャナー装置）により蛍光を検出する糖鎖解析手法が記載されている。エバネッセント光（局在場光）は、励起光をガラス内部で全反射させた際に界面からの高さ200〜300ｎｍ（励起波長の半分程度）の範囲にしみ出す微弱光であり、上記範囲よりも遠い位置にある、ブラウン運動をしている（捕捉されていない）プローブ等を標識する蛍光物質をほとんど励起することなく、レクチンと糖鎖の相互作用により上記範囲内に捕捉されたプローブ等を標識する蛍光物質を選択的に観察することができる。そのためのより具体的な態様としては、図４（特許文献１の図９）のＡおよびＢのように、スライドグラス上にレクチンを固定化し、これに蛍光標識糖鎖プローブまたは蛍光標識糖タンパク質を結合させる態様や、同図のＥのように、スライドグラス上に抗体を固定化し、これに糖タンパク質を結合させた後、蛍光標識レクチンを結合させる態様（サンドイッチアッセイ）などが記載されている。【0006】
しかしながら、エバネッセント波（局在場光）で励起できる蛍光量は微弱であり、大量の標識糖鎖が基板上のレクチンに結合しないと蛍光シグナルとして認識されないという問題がある。特に、疾患の診断に重要とされる糖鎖は血中に微量しか存在しないことから、疾患の診断という側面では、エバネッセント波を用いる測定方法では検出感度が充分ではなく正確な診断を行うには困難な場合がある。また、特許文献１の技術は、複数のレクチンを固定化するマイクロアレイ形式で反応を進めることから、定量性が充分に発揮できないという問題も残存している。【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】国際公開第２００５／０６４３３３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
従来、解離速度定数の大きいレクチンを用いた糖鎖の相互作用の解析には、ＢＩＡＣＯＲＥをはじめとした流路を利用した、ノンラベルの（蛍光標識を用いない）手法である表面プラズモン共鳴〔ＳＰＲ〕が利用されてきた。しかしながら、そのような解析には、高アフィニティな（結合力の強い）レクチンと高濃度のアナライトとが必要となることから、血中の微量糖鎖の定量測定には解析能力が不足していた。【0009】
また、特許文献１に記載の、局在場光を利用した糖鎖解析手法は、流路を利用する形式ではなくマイクロアレイ形式であって、定量性がないために複数糖鎖のプロファイル解析に利用は止まるものである。このうち、レクチンを固定化した態様（ＡおよびＢ）は、目的とするアナライト（単一の糖脂質、糖タンパク質など）以外の物質とも反応してしまうという問題もある。すなわち、レクチンを固定化した基板に生体成分（血液、体液等）をアプライすると、レクチンと特異的に結合する糖鎖を有する糖脂質や糖タンパクであれば、アナライト以外の物質も固定化されたレクチンに吸着するため、感度や定量性に著しく欠ける測定系になる場合がある。【0010】
一方、レクチンを固定化せずに蛍光標識レクチンとして用いる態様（Ｅ）は、一般記載として例示されてはいるが、実施例において実際にこの態様を用いた測定は行われておらず、測定能力の検証や実用性の裏付けは行われていない。【0011】
すなわち、感度と非特異的反応の問題を解決し、血中の微量糖鎖の定量測定を可能とする技術はこれまで存在しなかったと言える。【0012】
そこで、本発明は、微量なアナライト（特に糖鎖を有するもの）の量を高精度で測定できる方法および該測定方法に用いる装置を提供することを課題とする。【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明者らは、糖鎖等に対するレクチンのように解離速度定数が大きい物質を固定化された一次抗体ではなく（蛍光標識した）二次抗体として用いることは、流路系で行われる従来のノンラベルのＳＰＲ等の測定手法や、特許文献１に記載のような増強されない局在場光を用いる測定手法では、解離定数が大きく結合量が不充分となることなどから、定量的な測定が困難で実用的でないが、増強された局在場光を用いるため高感度化されたＳＰＦＳでは、解離定数が大きいにもかかわらず充分に定量的な測定を行うことが可能であったこと、および、解離速度定数が大きいために反ってリガンドプローブ（すなわちレクチン）の非特異的吸着が抑制されるという利点が生まれ、洗浄液を流下させる工程が必ずしも必要なく、リアルタイム計測できることを見出し、本発明を完成するに至った。【0014】
すなわち、本発明に係るアナライト量の測定方法は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法〔ＳＰＦＳ〕を用いたサンドイッチアッセイにおいて、蛍光色素により標識されたレクチンを二次抗体として用いることを特徴とする。【0015】
上記アッセイは流路内で実施され、かつ、その送液の流量は１００μＬ／分以上１０,０００μＬ／分以下であることが好ましい。【0016】
上記アナライトは、各種疾病を検出するためのマーカーであることが好ましく、腫瘍マーカーであることがより好ましい。【0017】
本発明は、上記レクチンとアナライトとの反応を、ＳＰＦＳによる蛍光量の測定と同時に実施することができる。【0018】
上記アッセイで用いる固相一次抗体は、３次元構造を有する固相化層の中および外面に固定化された抗体が好ましく、該固相化層は、グルコース、カルボキシメチル化グルコース、ならびに、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される単量体からなる群より選択される少なくとも１種の単量体から構成される高分子を含むことが好ましい。【0019】
上記流路に供する検体量は、５μＬ以上１,０００μＬ以下であることが好ましい。【0020】
また、本発明のＳＰＦＳ用装置は、その一方の表面にリガンドを固定化したプラズモンセンサであって、アナライトが該リガンドに結合し、さらに蛍光色素により標識されたレクチンがアナライトに結合したプラズモンセンサを含んでなることを特徴とする。【0021】
本発明のＳＰＦＳ用装置において、上記アナライトは、腫瘍マーカーであることが好ましく、上記リガンドは、３次元構造を有する固相化層の中および外面に固定化された抗体が好ましい。該固相化層は、グルコース、カルボキシメチル化グルコース、ならびに、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される単量体からなる群より選択される少なくとも１種の単量体から構成される高分子を含むことが好ましい。【発明の効果】
【0022】
本発明は、ＳＰＦＳを用いることで、従来の全反射系では実現不可能な増強電場を作り出し、抗体と「解離速度定数が高いリガンドプローブ」とで捕捉した微量な糖鎖を認識できるアナライト量の測定方法を提供することができる。【0023】
本発明において、「解離速度定数が高いリガンドプローブ」であるレクチンを固相ではなく、標識レクチンとして使用することで、レクチンの非特異的反応を懸念することなく、血中での微量糖鎖の認識が可能となる。【0024】
また、本発明の測定方法を流路内で実施することで、アッセイシグナルとアッセイブランクとの分離が可能となり、結合した微量糖鎖の認識力が高まる。さらに、一連の工程を迅速・簡便に行うことができる。【0025】
ＳＰＦＳにおける一般的な洗浄後の蛍光測定では、捕捉したアナライトの解離に伴うシグナル低下、迅速診断が困難となる等の問題が生じているが、本発明はリアルタイム計測が可能であることから、高感度かつ迅速に処理できる。【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】図１は、実施例１の（1-3）リアルタイム測定の結果を示すものであり、ＳＰＦＳにおける蛍光標識レクチンの結合反応をリアルタイムでモニタリングかつ検出し、蛍光標識レクチンの添加濃度ごとにプロットしたグラフである。蛍光標識レクチン添加開始から洗浄直前までに反応量が経時的に増加しており、洗浄後に急速に反応量が低下していることがわかり、微量の結合についても洗浄前の反応量を測定することで定量化が可能なことを示している。
【図2】図２は、解離速度定数の大きいレクチンを用いた場合の従来法（ＥＬＩＳＡ；比較例１）とＳＰＦＳ（実施例１）とを比較した結果を示したものである。解離速度定数の大きいレクチンでかつ蛍光標識レクチンの洗浄後であっても、微量糖鎖の検出がＳＰＦＳでは可能であることがわかる。
【発明を実施するための形態】
【0027】
以下、本発明のアナライト量を測定する方法および該測定方法に用いるＳＰＦＳ用装置について具体的に説明する。【0028】
＜測定方法＞本発明に係るアナライト量の測定方法は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法〔ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy〕を用いたサンドイッチアッセイにおいて、蛍光色素により標識されたレクチン、好ましくは解離速度定数〔ｋd〕が１.０×１０-6 〜１.０×１０-3（Ｓ-1）である該レクチンを二次抗体として用いることを特徴とする。
【0029】
本発明において、解離速度定数とは、複合体における安定性の指標としても用いられ、複合体が１秒間に解離する割合を数値化したものである。単位はＳ-1、すなわち１/秒であり、“ｋd”と表示される。本発明において、解離速度定数は、アナライトとプローブ（またはリガンド）との複合体が解離する割合を示す。また、サンドイッチアッセイとは、従来通り、固相一次抗体（リガンド）とアナライトと二次抗体（プローブ）とが組み合わされて初めてアナライトを検出できるアッセイであり、この二次抗体は、蛍光色素等の光学的に検出できる物質によって標識されている。【0030】
本発明において、解離速度定数は、下記キャプチャー法により室温で測定したものを用いる。【0031】
キャプチャー法とは、リガンドに対して親和性を有する分子をセンサーチップ等に固定化（キャプチャー）する方法である。例えば、リガンドがタグ（ＧＳＴ，Ｆｌａｇ，Ｆｃなど）を有する場合、そのタグに対する抗体（キャプチャー分子）を「Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ5」（Ｂｉａｃｏｒｅライフサイエンス社製）にアミンカップリングで固定化し、次に、リガンドを添加して抗原・抗体反応により、一時的に固定化（キャプチャー）する。その後、アナライトを添加して相互作用を測定し、リガンドごと再生する。【0032】
本発明において、「蛍光色素により標識されたレクチン」を、単に「標識レクチン」、「蛍光標識レクチン」や「蛍光標識されたレクチン」とも記載する。【0033】
本発明の測定方法を流路内で実施する場合、本発明は、アナライトと蛍光標識レクチンとの反応後にこの蛍光標識レクチンを洗浄することなく、アナライトと蛍光標識レクチンとの反応途中〜反応直後であってもＳＰＦＳにより蛍光量（蛍光強度）を測定することができる。すなわち、本発明は、アナライトと蛍光標識レクチンとの反応を、ＳＰＦＳによる蛍光量の測定と同時に実施することができる。これは、レクチンの解離速度定数が大きいため非特異的吸着が抑制され、そして蛍光を検出する際、ＳＰＦＳによる増強電場が界面からの高さ200〜300ｎｍ（励起波長の半分程度）の範囲にしか及ばず、ブラウン運動をしている蛍光標識レクチンの蛍光色素をほとんど励起することなく、結合反応に預かる蛍光標識レクチンを選択的に観察することができるからである。【0034】
本発明において、ＳＰＦＳを用いたサンドイッチアッセイを実施する際に、透明支持体と、透明支持体の一方の表面に形成された金属膜と、該金属膜の、透明支持体とは接していないもう一方の表面に形成された自己組織化単分子膜〔ＳＡＭ〕と、該ＳＡＭの、該金属膜とは接していないもう一方の表面に固定化されたリガンドとを含むプラズモンセンサを用いることが好ましい。さらに好ましくは、図３に示すように、透明支持体と上記金属膜と上記ＳＡＭと上記リガンドとに加えて３次元構造を有する固相化層とを含むプラズモンセンサを用いることであって、該固相化層は該ＳＡＭの該金属膜とは接していないもう一方の表面に形成され、該リガンドは該固相化層の中および外面に固定化されている。【0035】
本発明の測定方法は、このようなプラズモンセンサを用い、工程(ｉ)として、糖鎖を有するアナライトを含有する検体をプラズモンセンサに接触させた後、リガンドに結合した該アナライト以外の検体に含有される成分を洗浄し；工程(ii)として、蛍光色素が標識されたレクチンを、工程(ｉ)を経て得られたプラズモンセンサに接触させ；工程(iii)として、透明支持体の、上記金属膜を形成していないもう一方の表面からレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定し、その結果から検体中に含有されるアナライト量を算出する、上記工程(ｉ)〜(iii)を含むことが好ましい。【0036】
（蛍光色素で標識されたレクチン）本発明で用いるレクチンは、好ましくは解離速度定数〔ｋd〕が１.０×１０-6 〜１.０×１０-3（Ｓ-1）であり、蛍光色素により標識されている。
【0037】
レクチンとしては、動・植物、真菌、細菌、ウイルスなどから得られる様々な分子家系に属するレクチン、すなわち、細菌を含むすべての生物界で見出されるリシンＢ鎖関連の「Ｒ型レクチン」；真核生物全般に存在し糖タンパク質のフォールディングに関与する「カルネキシン・カルレティキュリン」、多細胞動物に広く存在し、「セレクチン」、「コレクチン」等代表的なレクチンを多く含むカルシウム要求性の「Ｃ型レクチン」；動物界に広く分布しガラクトースに特異性を示す「ガレクチン」；植物豆科で大きな家系を形成する「豆科レクチン」およびこれと構造類似性を有し動物細胞内輸送に関わる「Ｌ型レクチン」；リソソーム酵素の細胞内輸送に関わるマンノース6-リン酸結合性の「Ｐ型レクチン」；グリコサミノグリカンをはじめとする酸性糖鎖に結合する「アネキシン」；免疫グロブリン超家系に属し「シグレック」を含む「Ｉ型レクチン」などが挙げられる。【0038】
その他のレクチンとしては、ＡＡＬ（ヒイロチャワンタケレクチン）、ＡＣＡ（センニンコクレクチン）、ＢＰＬ（ムラサキモクワンジュレクチン）、ＣｏｎＡ（タチナタマメレクチン）、ＤＢＡ（Ｈｏｒｓｅｇｒａｍレクチン）、ＤＳＡ（ヨウシュチョウセンアサガオレクチン）、ＥＣＡ（デイゴマメレクチン）、ＥＥＬ（Ｓｐｉｎｄｌｅ Ｔｒｅｅレクチン）、ＧＮＡ（ユキノハナレクチン）、ＧＳＬ Ｉ（グリフォニアマメレクチン）、ＧＳＬ ＩＩ（グリフォニアマメレクチン）、ＨＨＬ（アマリリスレクチン）、ジャカリン（ジャックフルーツレクチン）、ＬＢＡ（リママメレクチン）、ＬＣＡ（レンズマメレクチン）、ＬＥＬ（トマトレクチン）、ＬＴＬ（ロータスマメレクチン）、ＭＰＡ（アメリカハリグワレクチン）、ＮＰＡ（ラッパズイセンレクチン）、ＰＨＡ−Ｅ（インゲンマメレクチン）、ＰＨＡ−Ｌ（インゲンマメレクチン）、ＰＮＡ（ピーナッツレクチン）、ＰＳＡ（エンドウレクチン）、ＰＴＬ−Ｉ（シカクマメレクチン）、ＰＴＬ−ＩＩ（シカクマメレクチン）、ＰＷＭ（ヨウシュヤマゴボウレクチン）ＲＣＡ１２０（ヒママメレクチン）、ＳＢＡ（ダイズレクチン）、ＳＪＡ（エンジュレクチン）、ＳＮＡ（セイヨウニワトコレクチン）、ＳＳＡ（ニホンニワトコレクチン）、ＳＴＬ（ジャガイモレクチン）、ＴＪＡ−Ｉ（キカラスウリレクチン）、ＴＪＡ−ＩＩ（キカラスウリレクチン）、ＵＤＡ（Ｃｏｍｍｏｎ Ｓｔｉｎｇｉｎｇ Ｎｅｔｔｌｅレクチン）、ＵＥＡ Ｉ（ハリエニシダレクチン）、ＶＦＡ（ソラマメレクチン）、ＶＶＡ（ヘアリーベッチレクチン）、ＷＦＡ（フジレクチン）、ＷＧＡ（パンコムギレクチン）などを挙げることができる。【0039】
（蛍光色素）レクチンを標識する蛍光色素とは、本発明において、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
【0040】
本発明で用いられる蛍光色素は、金属膜による吸光に起因する消光を受けない限りにおいて、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計〔ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ〕よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。【0041】
このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６,４０６,２９７号、同第６,２２１,６０４号、同第５,９９４,０６３号、同第５,８０８,０４４号、同第５,８８０,２８７号、同第５,５５６,９５９号および同第５,１３５,７１７号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。【0042】
これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表１に示す。【0043】
【表1】
【0044】
また、蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えばＥｕ、Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素も、本願発明に用いられる蛍光色素となりうる。希土類錯体は、一般的に励起波長（310〜340ｎｍ程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で615ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で545ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ3+ が挙げられる。【0045】
本発明においては、後述する蛍光測定を行う際に、金属膜に含まれる金属による吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。例えば、金属膜として金を用いる場合には、金膜による吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が600ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。したがって、この場合には、Ｃｙ5、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）647等近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが特に望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。一方、金属膜として銀を用いる場合には、最大蛍光波長が400ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。【0046】
これら蛍光色素は一種単独でも二種以上併用してもよい。【0047】
蛍光色素により標識されたレクチンの作製方法としては、例えば、まず蛍光色素にカルボキシル基を付与し、該カルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基とレクチンが有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；イソチオシアネートおよびアミノ基をそれぞれ有するレクチンおよび蛍光色素を反応させ固定化する方法；スルホニルハライドおよびアミノ基をそれぞれ有するレクチンおよび蛍光色素を反応させ固定化する方法；ヨードアセトアミドおよびチオール基をそれぞれ有するレクチンおよび蛍光色素を反応させ固定化する方法；ビオチン化された蛍光色素とストレプトアビジン化されたレクチン（あるいは、ストレプトアビジン化された蛍光色素とビオチン化されたレクチン）とを反応させ固定化する方法などが挙げられる。【0048】
（アナライト）アナライトとしては、糖鎖を有し、かつ、一次抗体に特異的に認識され結合し得る分子または分子断片であって、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）；タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）；アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）；糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）；脂質；またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
【0049】
特に、バイオマーカーとして用いられる多くの腫瘍マーカーは糖鎖に関連する因子であり、本発明におけるアナライトとして好適である。その具体例としては、ＡＦＰ〔αフェトプロテイン〕などのがん胎児性抗原，ＰＳＡ〔前立腺特異抗原〕などの糖タンパク質や、糖鎖抗原と知られているＣＡ19-9などが挙げられる。【0050】
（検体）検体としては、例えば、血液（血清・血漿）、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液が好ましい。
【0051】
（接触）接触は、流路中に循環する送液に検体が含まれ、プラズモンセンサのリガンドが固定化されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、プラズモンセンサと検体とを接触させる態様が好ましい。
【0052】
（流路）流路とは、上述のとおり角筒状または丸筒（管）状のものであって、プラズモンセンサを設置する個所近傍は角筒状構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は丸筒（管）状を有することが好ましい。
【0053】
その材料としては、プラズモンセンサ部または流路天板ではメチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体；ポリエチレン等のポリオレフィンなどからなり、薬液送達部ではシリコーンゴム、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリマーを用いる。【0054】
プラズモンセンサ部においては、検体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、プラズモンセンサ部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に100ｎｍ〜1ｍｍ程度が好ましい。【0055】
流路にプラズモンセンサを固定する方法としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、プラズモンセンサの金属膜が形成されている表面に、流路高さ0.5ｍｍを有するポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートを該プラズモンセンサの金属膜が形成されている部位を囲むようにして圧着し、次に、該ポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートとプラズモンセンサとをビス等の閉め具により固定する方法が好ましい。【0056】
工業的に製造される大規模ロット（工場レベル）では、流路にプラズモンセンサを固定する方法としては、プラスチックの一体成形品にセンサ基板を形成、または別途作製したセンサ基板を固定し、金属膜表面に（好ましくは誘電体からなるスペーサ層）ＳＡＭ、固相化層およびリガンドの固定化を行った後、流路天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。【0057】
（送液）送液としては、検体を希釈した溶媒または緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕、トリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水〔ＨＢＳ〕などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【0058】
送液を循環させる温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常20〜40℃×1〜60分間、好ましくは37℃×5〜15分間である。【0059】
このように本発明の測定方法を流路内で実施する場合、その送液の流速は１００（μＬ／分）以上１０,０００（μＬ／分）以下であることが好ましい。また、上記流路に供する検体量は、５μＬ以上１,０００μＬ以下であることが好ましい。送液の流速および検体量がそれぞれ上記範囲内であると、レクチンの非特異的反応を軽減でき、かつ、レクチンの抗原糖鎖との特異的な結合を確保するという観点から好適である。【0060】
＜プラズモンセンサ＞上述したように、本発明を実施する際にプラズモンセンサを用いることが好ましく、透明支持体と金属膜とＳＡＭと、好ましくは固相化層と、リガンド（上記一次抗体が好ましい。）とを含んでなる。
【0061】
（透明支持体）本発明において、プラズモンセンサの構造を支持する基板として透明支持体が用いられる。本発明において、センサ基板として透明支持体を用いるのは、後述する金属膜への光照射をこの透明支持体を通じて行うからである。
【0062】
本発明で用いられる透明支持体について、本発明の目的が達せられる限り、材質に特に制限はない。例えば、この透明支持体はガラス製であってもよく、また、ポリカーボネート〔ＰＣ〕、シクロオレフィンポリマー〔ＣＯＰ〕などのプラスチック製であってもよい。【0063】
また、ｄ線（588ｎｍ）における屈折率〔ｎd〕が好ましくは1.40〜2.20であり、厚さが好ましくは0.01〜10ｍｍ、より好ましくは0.5〜5ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。【0064】
なお、ガラス製の透明支持体は、市販品として、ショット日本（株）製の「ＢＫ7」（屈折率〔ｎd〕1.52）および「ＬａＳＦＮ9」（屈折率〔ｎd〕1.85）、（株）住田光学ガラス製の「Ｋ−ＰＳＦｎ3」（屈折率〔ｎd〕1.84）、「Ｋ−ＬａＳＦｎ17」（屈折率〔ｎd〕1.88）および「Ｋ−ＬａＳＦｎ22」（屈折率〔ｎd〕1.90）、ならびに（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ10」（屈折率〔ｎd〕1.72）などが、光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。【0065】
透明支持体は、その表面に金属膜を形成する前に、その表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。酸による洗浄処理としては、0.001〜1Ｎの塩酸中に、1〜3時間浸漬することが好ましい。プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製の「ＰＤＣ200」）中に、0.1〜30分間浸漬させる方法が挙げられる。【0066】
（金属膜）本発明に係るプラズモンセンサでは、上記透明支持体の一方の表面に金属膜を形成する。この金属膜は、光源からの照射光により表面プラズモン励起を生じ、電場を発生させ、蛍光色素の発光をもたらす役割を有する。
【0067】
上記透明支持体の一方の表面に形成された金属膜としては、金、銀、アルミニウム、銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、金からなることがより好ましい。これらの金属は、その合金の形態であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。【0068】
なお、透明支持体としてガラス製基板を用いる場合には、ガラスと上記金属膜とをより強固に接着するため、あらかじめクロム，ニッケルクロム合金またはチタンの金属膜を形成することが好ましい。【0069】
透明支持体上に金属膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法，電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。金属膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの膜および／または金属膜を形成することが好ましい。【0070】
金属膜の厚さとしては、金：5〜500ｎｍ、銀：5〜500ｎｍ、アルミニウム：5〜500ｎｍ、銅：5〜500ｎｍ、白金：5〜500ｎｍ、およびそれらの合金：5〜500ｎｍが好ましく、クロムの膜の厚さとしては、1〜20ｎｍが好ましい。【0071】
電場増強効果の観点から、金：20〜70ｎｍ、銀：20〜70ｎｍ、アルミニウム：10〜50ｎｍ、銅：20〜70ｎｍ、白金：20〜70ｎｍおよびそれらの合金：10〜70ｎｍがより好ましく、クロムの膜の厚さとしては、1〜3ｎｍがより好ましい。【0072】
金属膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、このような厚さを有する金属膜であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。【0073】
（ＳＡＭ）ＳＡＭ〔Self-Assembled Monolayer；自己組織化単分子膜〕は、リガンド、好ましくは固相化層を固定化する足場として、またプラズモンセンサをサンドイッチアッセイに用いた際に蛍光分子の金属消光を防止する目的で、上記金属膜の、上記透明支持体とは接していないもう一方の表面に形成される。
【0074】
ＳＡＭが含む単分子としては、通常、炭素原子数4〜20程度のカルボキシアルカンチオール（例えば、（株）同仁化学研究所、シグマ アルドリッチ ジャパン（株）などから入手可能）、特に好ましくは10-カルボキシ-1-デカンチオールが用いられる。炭素原子数4〜20のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたＳＡＭの光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。【0075】
このようなＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。具体例として、金属膜がその表面に形成された透明支持体の該膜表面にマスク材からなる層が形成されたものを、10-カルボキシ-1-デカンチオール（（株）同仁化学研究所製）を含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。このように、10-カルボキシ-1-デカンチオールが有するチオール基が、金属と結合し固定化され、金薄膜の表面上で自己組織化し、ＳＡＭを形成する。【0076】
また、ＳＡＭを形成する前に「誘電体からなるスペーサ層」を形成してもよく、この場合、ＳＡＭが含む単分子としては、加水分解でシラノール基〔Ｓｉ-ＯＨ〕を与えるエトキシ基（またはメトキシ基）を有し、他端にアミノ基やグリシジル基、カルボキシル基などの反応基を有するシランカップリング剤であれば特に限定されず、従来公知のシランカップリング剤を用いることができる。【0077】
このようなＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。【0078】
このような「誘電体からなるスペーサ層」の形成に用いられる誘電体としては、光学的に透明な各種無機物、天然または合成ポリマーを用いることもできる。その中で、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素〔ＳｉＯ2〕，二酸化チタン〔ＴｉＯ2〕または酸化アルミニウム〔Ａｌ2Ｏ3〕を含むことが好ましい。【0079】
誘電体からなるスペーサ層の厚さは、通常10ｎｍ〜1ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは30ｎｍ以下、より好ましくは10〜20ｎｍである。一方、電場増強の観点から、好ましくは200ｎｍ〜1ｍｍであり、さらに電場増強の効果の安定性から、400ｎｍ〜1,600ｎｍがより好ましい。【0080】
誘電体からなるスペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、電子線蒸着法、熱蒸着法、ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。【0081】
（固相化層）固相化層は、上記ＳＡＭの、上記金属膜とは接していないもう一方の表面に形成され、３次元構造を有するものである。
【0082】
この「３次元構造」とは、後述するリガンドの固定化を、「センサ基板」表面（およびその近傍）の２次元に限定することなく、該基板表面から遊離した３次元空間にまで広げられる固相化層の構造をいう。【0083】
このような固相化層は、グルコース、カルボキシメチル化グルコース、ならびに、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される単量体からなる群より選択される少なくとも１種の単量体から構成される高分子を含むことが好ましく、デキストランおよびデキストラン誘導体などの親水性高分子ならびにビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される疎水性単量体から構成される疎水性高分子を含むことがより好ましく、カルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕などのデキストランが生体親和性、非特異的な吸着反応の抑制性、高い親水性の観点から特に好適である。【0084】
ＣＭＤの分子量は、1ｋＤa以上5,000ｋＤa以下が好ましく、4ｋＤａ以上1,000ｋＤaがより好ましい。【0085】
固相化層（例えば、デキストランまたはデキストラン誘導体からなるもの）は、その密度として2ｎｇ/ｍｍ2未満を有することが好ましい。固相化層の密度は、用いる高分子の種類に応じて適宜調整することができる。上記高分子が上記ＳＡＭに、このような密度の範囲内で固相化されていると、プラズモンセンサをアッセイ法に用いた場合に、アッセイのシグナルが安定化し、かつ増加するため好適である。なお、Ｂｉａｃｏｒｅライフサイエンス社製「Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ5」の密度は2ｎｇ/ｍｍ2であった。この密度は、このＣＭ5基板および金膜のみの基板を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅライフサイエンス社製のＳＰＲ測定機器により得られた測定シグナルにおいて、平均2000ＲＵを測定した結果、2ｎｇ/ｍｍ2と見積もられたものである。【0086】
固相化層の平均膜厚は、3ｎｍ以上80ｎｍ以下であることが好ましい。この膜厚は原子間力顕微鏡〔ＡＦＭ〕などを用いて測定することができる。固相化層の平均膜厚がこのような範囲内であると、プラズモンセンサをアッセイ法に用いた場合に、アッセイのシグナルが安定化し、かつ増加するため好適である。【0087】
固相化層に含まれる高分子として、カルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕を用いた場合の、ＳＡＭ表面に固定化する方法を具体的に説明する。【0088】
すなわち、好ましくは分子量1ｋＤa以上5,000ｋＤa以下であり、上述したようなカルボキシメチルデキストランを0.01ｍｇ/ｍＬ以上100ｍｇ/ｍＬ以下と、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を0.01ｍＭ以上300ｍＭ以下と、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を0.01ｍＭ以上500ｍＭ以下とを含むＭＥＳ緩衝生理食塩水〔ＭＥＳ〕に、透明支持体と金属膜とＳＡＭとがこの順序で積層された基板を0.2時間以上3.0時間以下浸漬し、ＳＡＭにカルボキシメチルデキストランを固定化することができる。【0089】
得られた固相化層の密度は、反応点数（ＳＡＭの官能基数），反応溶液のイオン強度およびｐＨ，ならびにカルボキシメチルデキストラン分子のカルボキシル基数に対するＷＳＣ濃度によって調整することができる。また固相化層の平均膜厚は、カルボキシメチルデキストランの分子量および反応時間によって調整することができる。【0090】
（リガンド）本発明において、リガンドとは、検体中に含有されるアナライトを特異的に認識し（または、認識され）結合し得る分子または分子断片であって、プラズモンセンサをサンドイッチアッセイに用いた際に、検体中のアナライトを固定（捕捉）する目的で用いられるものである。
【0091】
そのようなリガンドとしては、アナライトを特異的に認識し（または認識され）結合し、かつ、二次抗体としてのレクチンによる糖鎖認識を妨げない分子または分子断片を用いることができるが、たとえば、アナライトとしてのタンパク質、核酸などに対応する抗体やアプタマーを用いることができる。【0092】
例えば、糖タンパク質をアナライトとする場合、リガンドとなる「抗体」の具体例としては、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能）などの抗ガン胎児性抗原〔ＣＥＡ〕に対するモノクローナル抗体，抗ＰＳＡモノクローナル抗体などが挙げられる。また、二次抗体として用いるレクチンが認識する糖鎖部分と重複しないのであれば、たとえば、糖鎖部分をエピトープとする抗ＣＡ19-9モノクローナル抗体（NS19-9）をリガンドとして用いることも可能である。【0093】
なお、本発明において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体，遺伝子組換えにより得られる抗体，および抗体断片を包含する。【0094】
このリガンドの固定化方法としては、例えば、カルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕などの反応性官能基を有する高分子が有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、このように活性エステル化したカルボキシル基と、リガンドが有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；上記ＳＡＭが有するカルボキシル基を、上述のようにしてリガンドが有するアミノ基と脱水反応させ固定化させる方法などが挙げられる。【0095】
なお、検体等がプラズモンセンサに非特異的に吸着することを防止するため、上記リガンドを固定化させた後に、プラズモンセンサの表面を牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕等のブロッキング剤により処理することが好ましい。【0096】
上記固相化層の中および外面に固定化されたリガンドの密度は、1フェムトｍｏｌ/ｃｍ2以上1ナノｍｏｌ/ｃｍ2以下が好ましく、10フェムトｍｏｌ/ｃｍ2以上100ピコｍｏｌ/ｃｍ2以下がより好ましい。リガンドの密度が上記範囲内であると、信号強度が大きくなるため好適である。【0097】
＜ＳＰＦＳ用装置＞本発明のＳＰＦＳ用装置は、その一方の表面にリガンドを固定化したプラズモンセンサであって、アナライトが該リガンドに結合し、さらに、蛍光色素により標識されたレクチンがアナライトに結合したプラズモンセンサを含んでなることを特徴とする。
【0098】
すなわち、本発明のＳＰＦＳ用装置は、本発明の測定方法に用いられ、リガンドとアナライトと蛍光標識レクチンとが反応したプラズモンセンサを含むものである。【0099】
このような装置としては、上記プラズモンセンサ以外に、例えば、レーザ光の光源、各種光学フィルタ、プリズム、カットフィルタ、集光レンズ、表面プラズモン励起増強蛍光〔ＳＰＦＳ〕検出部なども含むものとし、検体液、洗浄液または標識抗体液などを取り扱う際に、上記プラズモンセンサと組み合った送液系を有することが好ましい。送液系としては、例えば、送液ポンプと連結したマイクロ流路デバイスなどでもよい。検出部に使用するセンサとしては、イメージセンサを用いることが好ましく、ＣＣＤイメージセンサやフォトマル等を用いることができる。【0100】
また、表面プラズモン共鳴〔ＳＰＲ〕検出部、すなわちＳＰＲ専用の受光センサとしてのフォトダイオード、ＳＰＲおよびＳＰＦＳの最適角度を調製するための角度可変部（サーボモータで全反射減衰〔ＡＴＲ〕条件を求めるためにフォトダイオードと光源とを同期して、45°〜85°の角度変更を可能とする。分解能は0.01°以上が好ましい。）、ＳＰＦＳ検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。【0101】
光源、光学フィルタ、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部の好ましい態様は上述したものと同様である。【0102】
送液ポンプとしては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ、送り精度が高く脈動が少ないが循環することができないシリンジポンプ、簡易で取り扱い性に優れるが微量送液が困難な場合があるチューブポンプなどが挙げられる。【実施例】
【0103】
次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。【0104】
［実施例１］（ＳＰＦＳを用いたレクチンによる糖鎖検出）（1-1）レクチンの蛍光標識化
ＡＡＬ〔Aleuria aurantia Lectin〕（生化学工業(株)）を、市販のＡｌｅｘａ標識化キット「Alexa Fluor（商標名） 647 タンパク質ラベリングキット」（インビトロゲン社）を用いて蛍光標識化した。手順は該キットに添付のプロトコールに従った。未反応レクチンや未反応酵素等を除去するため、限外濾過膜（日本ミリポア(株)製）を用いて反応物を精製し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ 647標識ＡＡＬ溶液を得た。得られた蛍光標識化レクチンの溶液はタンパク定量後、4℃で保存した。
【0105】
（1-2）プラズモンセンサの作製厚さ1ｍｍのガラス製の透明平面基板「Ｓ−ＬＡＬ10」（(株)オハラ製、屈折率〔ｎd〕＝1.72）を、プラズマドライクリーナー「ＰＤＣ200」（ヤマト科学(株)製）でプラズマ洗浄した。プラズマ洗浄された該基板の片面に、まずクロム膜をスパッタリング法により形成し、さらにその表面に金膜をスパッタリング法により形成した。このクロム膜の厚さは1〜3ｎｍ、金膜の厚さは44〜52ｎｍであった。
【0106】
次いで、このようにして得られた基板を25ｍｇ/ｍＬに調整した10-カルボキシ-1-デカンチオールのエタノール溶液10ｍＬに24時間浸漬し、金膜の表面にＳＡＭを形成した。この基板をエタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで順次洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。【0107】
続いて、分子量50万のカルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕を1ｍｇ/ｍＬと、Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を0.5ｍＭと、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を1ｍＭとを含むＰＢＳにＳＡＭを形成した基板を1時間浸漬し、ＳＡＭにＣＭＤを固定化し、1ＮのＮａＯＨ水溶液に30分間浸漬することで未反応のコハク酸エステルを加水分解させた。【0108】
得られた基板の表面（金膜＋ＳＡＭ＋3次元構造を有する固相化層がこの順で形成されている表面）に、2ｍｍ×14ｍｍの穴を有する厚さ0.5ｍｍのシート状のシリコンゴムスペーサを設け、該表面が流路の内側となるように基板を配置し（ただし、該シリコンゴムスペーサは送液に触れない状態とする。）、流路の外側から基板を覆うように厚さ2ｍｍのポリメチルメタクリレート板を乗せ圧着し、ビスで流路と該ポリメチルメタクリレート板とを固定した。【0109】
送液として超純水を10分間、その後ＰＢＳを20分間、ペリスタポンプにより、室温、流速500μＬ/ｍｉｎで循環させた。続いて、ＮＨＳを50ｍＭと、ＷＳＣを100ｍＭとを含むＰＢＳを5ｍＬ送液し、20分間循環送液させた後に、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（1Ｄ5；2.5ｍｇ/ｍＬ；(株)日本医学臨床検査研究所製）溶液2.5ｍＬを30分間循環送液することで、3次元構造を有する固相化層上に一次抗体を固相化した。最後に重量1％牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水にて、30分間循環送液することで非特異吸着防止処理を行うことで、プラズモンセンサを作製した。【0110】
（1-3）リアルタイム測定工程(a)：送液をＰＢＳに代え、ＡＦＰ濃度を10, 2, 0.5, 0.1ｎｇ/ｍＬと段階希釈を行った溶液を0.5ｍＬ（500μＬ）ずつ添加し、25分間循環させた。
【0111】
洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ20を0.05重量％含むＴＢＳを送液として10分間循環させることによって洗浄した。ここでブランクの蛍光を、光源としてＬＤレーザを用いて、波長635ｎｍのレーザ光を、波長選択性偏光フィルタによりフォトン量を調節し、プリズム（（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ10」（屈折率〔ｎ〕＝1.72））を通して、流路に固定されているプラズモンセンサに照射し、カットフィルタとして蛍光成分以外の波長をカットするカットフィルタ、集光レンズとして20倍の対物レンズを用いてＣＣＤイメージセンサにより検出した。【0112】
工程(b)：（1-1）で得られた蛍光標識化レクチンを1,000ｎｇ/ｍＬ含むＰＢＳを5ｍＬ添加し、20分間循環させ、送液直後から蛍光強度の測定を行い送液時間とＣＣＤにて検出されるシグナルをプロットした。リアルタイム測定の結果を図１に示す。【0113】
洗浄工程：蛍光標識化レクチン溶液からＴｗｅｅｎ20を0.05重量％含むＴＢＳ溶液へと送液を切り替え、切り替え直後から20分間、蛍光標識化レクチンの抗原からの解離反応をＣＣＤにて蛍光シグナルを測定することで観察した。洗浄後のシグナルをプロットした結果を図２に示す。【0114】
［比較例１］（ＥＬＩＳＡ）（2-1）レクチンのビオチン標識化
ＡＡＬ〔Aleuria aurantia Lectin〕（生化学工業(株)）を、市販のビオチン標識化キット（「Biotin Labeling Kit - NH2」(株)同仁化学研究所）を用いてビオチン標識した。手順は該キットに添付のプロトコールに従った。未反応ビオチン化試薬を除去するため、限外濾過膜（日本ミリポア(株)製）を用いて反応物を精製し、ビオチン標識化ＡＡＬの溶液を得た。得られた溶液はタンパク定量後、4℃で保存した。
【0115】
（2-2）ＥＬＩＳＡプレートの作製96穴プレートに5μｇ/Ｌに調整した抗ＡＦＰ抗体（クローン：1Ｄ5）を50μＬ分注し、4℃下で一晩固定化した。その後、96穴プレートから抗体溶液を除去し、1％ＰＢＳ−ＢＳＡ(-)を100μＬ分注し、4℃下で一晩固定化した。
【0116】
（2-3）アッセイ（2-2）の溶液を除去後、任意濃度（0.1, 0.5, 2, 10, 50, 100, 200ｎｇ/ｍＬ）のＡＦＰ抗原を50μＬ分注し、37℃で1時間振とうした。溶液を廃棄しＴｗｅｅｎ20入りＰＢＳ200μＬで洗浄後、10μｇ/ｍＬに調整したビオチン標識化レクチンを加え、37℃で1時間振とうした。溶液を廃棄しＴｗｅｅｎ20入りＰＢＳ200μＬで洗浄後、0.125μｇ/ｍＬのストレプトアビジン−ＨＲＰを50μＬ分注し、37℃で30分間振とうした。溶液を廃棄しＴｗｅｅｎ20入りＰＢＳ200μＬで洗浄後、SuperSignal ELISA Femto Maxmum Sensitivity Substrate（Thermo scientific社製）にて発光させ、プレートリーダ フルオロスキャンアセント（Thermo Fisher Scientific, Inc.（アメリカ））にて測定を行った。得られた結果を図２に示す。
【産業上の利用可能性】
【0117】
本発明のアナライト量の測定方法は、高感度かつ高精度にアナライトを検出することができる方法であるから、例えば、血液中に含まれる極微量の腫瘍マーカーであっても検出することができ、この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。