特許 6048845 ジフテリア毒素の無毒性突然変異体ＣＲＭ１９７又はその断片を含む融合タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6048845

(24)【登録日】2016年12月2日

(45)【発行日】2016年12月21日

(54)【発明の名称】ジフテリア毒素の無毒性突然変異体ＣＲＭ１９７又はその断片を含む融合タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20161212BHJP

   C07K 14/34 20060101ALI20161212BHJP

   C07K 14/08 20060101ALI20161212BHJP

   C07K 14/11 20060101ALI20161212BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20161212BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20161212BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20161212BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20161212BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20161212BHJP

   A61K 47/42 20060101ALI20161212BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20161212BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20161212BHJP

   A61K 39/145 20060101ALI20161212BHJP

   A61K 47/48 20060101ALI20161212BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20161212BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20161212BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20161212BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20161212BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   C07K14/34ZNA

   C07K14/08

   C07K14/11

   C07K19/00

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61K47/42

   A61K37/02

   A61K39/12

   A61K39/145

   A61K47/48

   A61P31/14

   A61P31/16

   A61P1/16

   A61K39/39

【請求項の数】28

【全頁数】49

(21)【出願番号】特願2014-513045(P2014-513045)

(86)(22)【出願日】2012年6月1日

(65)【公表番号】特表2014-518061(P2014-518061A)

(43)【公表日】2014年7月28日

(86)【国際出願番号】CN2012076378

(87)【国際公開番号】WO2012163289

(87)【国際公開日】20121206

【審査請求日】2015年2月27日

(31)【優先権主張番号】201110145419.2

(32)【優先日】2011年6月1日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】511129557

【氏名又は名称】シャモン ユニヴァーシティー

(73)【特許権者】

【識別番号】513302455

【氏名又は名称】シャモン イノバックス バイオテック カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(74)【代理人】

【識別番号】100148596

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 和弘

(72)【発明者】

【氏名】リ， シャオウェイ

(72)【発明者】

【氏名】ソン， クイリン

(72)【発明者】

【氏名】ヤン， チュンヤン

(72)【発明者】

【氏名】グ， イン

(72)【発明者】

【氏名】ルオ， ウェンシン

(72)【発明者】

【氏名】シャ， ニンシャオ

【審査官】 西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００２−５０２８０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／０２１５６６２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開平０６−２９２５９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平１１−５１４８４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５１８３７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／０１５５９０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００４−５３３２５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／１５１５４４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００５−５２４３８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 BENNETT, M. J. et al. ，"Refined structure of dimeric diphtheria toxin at 2.0 A resolution"，Protein Science，１９９４年，Vol. 3，p. 1444-1463

【文献】 LI, S. W. et al.，"A bacterially expressed particulate hepatitis E vaccine: antigenicity, immunogenicity and protectivity on primates"，Vaccine，２００５年，Vol. 23，p. 2893-2901

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＲＭ１９７の断片及び標的タンパク質を含む融合タンパク質であって、前記ＣＲＭ１９７の断片が、標的タンパク質の免疫原性を増強し、前記ＣＲＭ１９７の断片が、ＣＲＭ１９７のａａ１〜１９０、又はａａ１〜３８９を含む、融合タンパク質。

【請求項2】

前記標的タンパク質が、ＨＥＶキャプシドタンパク質又はその免疫原性断片である、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

前記ＨＥＶキャプシドタンパク質の免疫原性断片が、ＨＥＶ−２３９（ＨＥＶキャプシドタンパク質のａａ３６８〜６０６）、Ｅ２（ＨＥＶキャプシドタンパク質のａａ３９４〜６０６）若しくはＥ２ｓ（ＨＥＶキャプシドタンパク質のａａ４５５〜６０６）を含むか、又はＨＥＶ−２３９（ＨＥＶキャプシドタンパク質のａａ３６８〜６０６）、Ｅ２（ＨＥＶキャプシドタンパク質のａａ３９４〜６０６）若しくはＥ２ｓ（ＨＥＶキャプシドタンパク質のａａ４５５〜６０６）である、請求項２に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

前記標的タンパク質が、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質又はその免疫原性断片である、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

前記Ｍ２タンパク質の免疫原性断片が、Ｍ２ｅ（Ｍ２タンパク質のａａ１〜２４）を含むか、又はＭ２ｅ（Ｍ２タンパク質のａａ１〜２４）である、請求項４に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

前記融合タンパク質において、前記ＣＲＭ１９７の断片が、標的タンパク質のＮ−末端及び／又はＣ−末端に、リンカーを介して又は介さずに、連結されており、並びに／或いは、ＣＲＭ１９７の断片が配列番号２のａａ１〜１９０又はａａ１〜３８９からなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

前記融合タンパク質が、リンカーを介して又は介さずに、連結されている、前記ＣＲＭ１９７の断片及びＨＥＶキャプシドタンパク質若しくはその免疫原性断片を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項8】

前記融合タンパク質が、配列番号８、１０、１２、１４、１６又は１８に記載するアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の融合タンパク質。

【請求項9】

前記融合タンパク質が、リンカーを介して又は介さずに、連結されている、前記ＣＲＭ１９７の断片及びインフルエンザウイルスＭ２タンパク質若しくはその免疫原性断片を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項10】

前記融合タンパク質が、配列番号３６、３８、４２又は４４に記載するアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の融合タンパク質。

【請求項11】

請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。

【請求項12】

請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含むコンストラクト。

【請求項13】

請求項１１に記載のポリヌクレオチド又は請求項１２に記載のコンストラクトを含むベクター。

【請求項14】

請求項１１に記載のポリヌクレオチド、請求項１２に記載のコンストラクト、又は請求項１３に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項15】

請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、並びに場合により、薬学的に許容できる担体及び／又は賦形剤を含む、医薬組成物又はワクチン。

【請求項16】

標的タンパク質により予防又は治療することができる疾患を予防及び／又は治療するための医薬組成物の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。

【請求項17】

前記融合タンパク質が、ＣＲＭ１９７の断片及びＨＥＶキャプシドタンパク質若しくはその免疫原性断片を含み、前記医薬組成物が、ＨＥＶ感染及びＨＥＶ感染に伴う疾患の予防及び／又は治療に使用される、請求項１６に記載の使用。

【請求項18】

前記ＨＥＶ感染に伴う疾患がＥ型肝炎である、請求項１７に記載の使用。

【請求項19】

前記融合タンパク質が、ＣＲＭ１９７の断片及びインフルエンザウイルスＭ２タンパク質若しくはその免疫原性断片を含み、前記医薬組成物が、インフルエンザウイルス感染、及びインフルエンザウイルス感染に伴う疾患の予防及び／又は治療に使用される、請求項１６に記載の使用。

【請求項20】

前記インフルエンザウイルス感染に伴う疾患がインフルエンザである、請求項１９に記載の使用。

【請求項21】

ＨＥＶ感染、及び／又はＨＥＶ感染に伴う疾患を予防及び／又は治療するための融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が、リンカーを介して又は介さずに、連結されている、ＣＲＭ１９７の断片及びＨＥＶキャプシドタンパク質若しくはその免疫原性断片を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項22】

インフルエンザウイルス感染、及びインフルエンザウイルス感染に伴う疾患を予防及び／又は治療するための融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が、リンカーを介して又は介さずに、連結されている、ＣＲＭ１９７の断片及びインフルエンザウイルスＭ２タンパク質若しくはその免疫原性断片を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項23】

標的タンパク質の免疫原性を増強するための方法であって、前記方法が、標的タンパク質の免疫原性を増強する融合タンパク質であり、請求項１に定義されたＣＲＭ１９７の断片、及び前記標的タンパク質を含む融合タンパク質を得るステップを含む、方法。

【請求項24】

前記融合タンパク質が、ＣＲＭ１９７の断片の、標的タンパク質との、リンカーを使用した又は使用しない、融合発現によって得られる、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記標的タンパク質が、ＨＥＶキャプシドタンパク質、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質、又はそれらの免疫原性断片である、請求項２３又は２４に記載の方法。

【請求項26】

標的タンパク質の免疫原性の増強における、請求項１に定義されたＣＲＭ１９７の断片の使用において、前記使用が、ＣＲＭ１９７の断片及び前記標的タンパク質を含む融合タンパク質を得ることを特徴とする、使用。

【請求項27】

前記融合タンパク質が、ＣＲＭ１９７の断片の、標的タンパク質との、リンカーを使用した又は使用しない、融合発現によって得られる、請求項２６に記載の使用。

【請求項28】

前記標的タンパク質が、ＨＥＶキャプシドタンパク質、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質、又はそれらの免疫原性断片である、請求項２６又は２７に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、分子ウイルス学及び免疫学の分野に関する。特に、本発明は、ジフテリア毒素の無毒性突然変異体ＣＲＭ１９７又はその断片を、融合タンパク質中の分子内アジュバントとして使用して、分子内アジュバントに融合させた標的タンパク質（例えば、ＨＥＶキャプシドタンパク質、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質、又はそれらの免疫原性断片）の免疫原性を増強することに関する。また、本発明は、標的タンパク質（例えば、ＨＥＶキャプシドタンパク質、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質、又はそれらの免疫原性断片）の免疫原性を増強するための方法にも関し、当該方法は、ＣＲＭ１９７又はその断片を、標的タンパク質と融合発現させて、融合タンパク質を形成するステップを含む。また、本発明は、ＣＲＭ１９７又はその断片、及び標的タンパク質（例えば、ＨＥＶキャプシドタンパク質、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質、又はそれらの免疫原性断片）を含む融合タンパク質にも関し、前記ＣＲＭ１９７又はその断片が、標的タンパク質の免疫原性を増強する。また、本発明は、融合タンパク質をコードする単離核酸、核酸を含むコンストラクト及びベクター、並びに核酸を含む宿主細胞にも関する。また、本発明は、医薬組成物又はワクチンの製造における融合タンパク質の使用にも関する。

【背景技術】

【0002】

ジフテリア毒素（ＤＴ）は、深く研究されている。構造に関する研究から、ジフテリア毒素は、３つのドメイン、すなわち、Ｎ−末端の触媒ドメインＣ（ａａ１〜１９０、Ｃドメイン）（断片Ａともまた呼ぶ）、中央の膜貫通ドメインＴ（ａａ２０１〜３８４、Ｔドメイン）、及びＣ−末端の受容体結合ドメインＲ（ａａ３８６〜５３５、Ｒドメイン）からなることが示されている（Ｃｈｏｅ Ｓ、Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｍ、Ｆｕｊｉｉ Ｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９２、３５７：２１６〜２２２）。ジフテリア毒素の前者２つのドメインのインターロイキン２（ＩＬ−２）との融合により調製されるＯＮＴＡＫ（ＤＡＢ３８９−ＩＬ−２）が、成人の皮膚Ｔ細胞リンパ腫の治療のためにＦＤＡの承認を得、１９９９年に市販されている。当該事実は、ジフテリア毒素の３つのドメインは、別個に使用することができ、それぞれが、各ドメイン自体の役割を果たすことを示している。

【0003】

ＣＲＭ１９７（交差反応性物質１９７）は、ジフテリア毒素の無毒性突然変異体であり（Ｕｃｈｉｄａ，Ｔ．、Ａ．Ｍ，Ｐａｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ，Ｊｒ．、Ｒ．Ｇｒｅｇｏｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７３、２４８：３８３８〜３８４４）、ＤＴをコードする野生型遺伝子とは、一塩基変異により異なり、結果として、５２位のアミノ酸残基のＧｌｙからＧｌｕへの変化が生じる（Ｇ．Ｇｉａｎｎｉｎｉ、Ｒ．Ｒａｐｐｕｏｌｉ、Ｇ．Ｒａｔｔｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８４、１２：４０６３〜４０７０）。

【0004】

研究により、ＣＲＭ１９７は、野生型ＤＴの構造に類似する構造を有する（すなわち、前記３つのドメインを有する）が、ＣＲＭ１９７の断片Ａは、ＮＡＤに対する結合能力を喪失しており、ＥＦ２に結合することが不可能であり、それによって、天然のＤＴが保有する細胞傷害性を喪失していることが示されており、当該知見は、５２位のアミノ酸残基Ｇｌｙが、ＤＴのＮＡＤへの結合において重要な役割を果たすことを示している（Ｋ．Ｍｏｙｎｅｒ、Ｇ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ、Ａｃｔａ ｐａｔｈ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｓｃａｎｄ ｓｅｃｔ Ｃ、１９８４、９２：１７〜２３）。ＣＲＭ１９７は、細胞傷害性を喪失しているが、野生型ＤＴの免疫原性に匹敵する強力な免疫原性を保持している。したがって、ＣＲＭ１９７は一般に、コンジュゲートワクチンを調製するために、タンパク質担体として使用して、その他のハプテンに架橋結合させる。

【0005】

早くも１９８５年に、Ｐｏｒｔｅｒらは、Ｈｉｂ表面上の多糖を、ＣＲＭ１９７及びＤＴのタンパク質担体それぞれに架橋結合させ、架橋結合物を調製して、ワクチンとなし、免疫原性における架橋結合ワクチンの差を研究した。実験結果は、免疫作用の観点からは、２つの架橋結合ワクチン間に顕著な差がなく、当該架橋結合ワクチンの両方が、乳児において強力な免疫応答及び免疫記憶の発生を刺激することができることを示した（Ｐｏｒｔｅｒ Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｍｉｃｈｅａｌ Ｅ．Ｐｉｃｈｉｃｈｅｒｏ及びＲｉｃｈａｒｄ Ａ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９８５：５２〜５９）。種々のタンパク質に架橋結合させた肺炎球菌コンジュゲートワクチンを比較して、ＣＲＭ１９７をタンパク質担体として使用するワクチンは、動物実験及び臨床治験において良好な免疫作用を示し、ＣＲＭ１９７は、毒性の副作用がなく、安全であることが見出されている（Ｂｌａｃｋ，Ｓ．、Ｈ．Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄら、Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｊ、２０００、１９（３）；１８７〜１９５）。現在、ＣＲＭ１９７をタンパク質担体として使用する肺炎球菌コンジュゲートワクチンは主として、ＰＣＶ７、ＰＣＶ９、ＰＣＶ１３等を指す。臨床治験の結果から、肺炎球菌コンジュゲートワクチンは、２歳未満の小児において良好な免疫原性及び安全性を示すことが示された（Ｂａｒｒｉｃａｒｔｅ，Ａ．、Ｊ．Ｃａｓｔｉｌｌａら、Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ、２００７、４４（１１）：１４３６〜１４４１；Ｍａｄｈｉ，Ｓ．、Ｐ．Ａｄｒｉａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２００７、２５（１３）：２４５１〜２４５７；Ｄｕｇｇａｎ，Ｓ．Ｔ、Ｄｒｕｇｓ、２０１０、７０（１５）：１９７３〜１９８６）。ＣＲＭ１９７を、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓ）の表面上の多糖に架橋結合させることによって、流行性髄膜炎コンジュゲートワクチンを調製することができる。例えば、Ｍｅｎｉｎｇｉｔｅｃ（Ｗｙｅｔｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ）及びＭｅｎｖｅｏ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ）等のＣＲＭ１９７をタンパク質担体として使用するワクチンが、商業的に入手可能になっている。

【0006】

ＣＲＭ１９７は、酵素活性及び細胞傷害性を喪失しているが、依然として、ＤＴの特異的受容体、すなわち、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）に結合することが可能である。当該受容体の発現が一般に、癌性組織において上方調節されることから、ＤＴと同様に、ＣＲＭ１９７もまた、抗腫瘍作用を示す（Ｂｕｚｚｉ，Ｓ．、Ｄ．Ｒｕｂｂｏｌｉら、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、２００４、５３（１１））。また、研究により、ＣＲＭ１９７は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができ、したがって、薬物を脳に送達するための担体として使用することができることも見出された（Ｇａｉｌｌａｒｄ，Ｐ．Ｊ．及びＡ．Ｇ．ｄｅ Ｂｏｅｒ、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、２００６、１１６（２）：６０〜６２）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

ＣＲＭ１９７は、複数の機能を有し、特に、強力な免疫原性を示し、免疫アジュバントとして使用することができることが報告されているが、にもかかわらず、ＣＲＭ１９７を分子内アジュバントとして使用して、融合タンパク質中の分子内アジュバントに融合させた標的タンパク質の免疫原性を増強することができることは報告されていない。本発明は、Ｅ型肝炎キャプシドタンパク質を例として使用し、ＣＲＭ１９７又はその断片が、融合タンパク質中のＣＲＭ１９７又はその断片に融合させたタンパク質の免疫原性を増強することができ、それによって、分子内アジュバントとして使用することができることを初めて実証している。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明においては、別段の記載がない限り、本明細書で使用する科学用語及び技術用語は、当業者が一般に理解する意味を有する。さらに、本明細書において使用する細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、生物化学及び免疫学の実験室操作は、対応する分野で広く使用される日常的な操作である。同時に、本発明をより良好に理解する目的で、関連用語の定義及び説明を以下に示す。

【0009】

本発明によれば、用語「ＣＲＭ１９７」は、ジフテリア毒素の無毒性突然変異体を指し、当該突然変異体は、野生型ジフテリア毒素とは、５２位のアミノ酸残基のＧｌｙからＧｌｕへの変化によって異なる（Ｇ．Ｇｉａｎｎｉｎｉ、Ｒ．Ｒａｐｐｕｏｌｉ、Ｇ．Ｒａｔｔｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８４、１２：４０６３〜４０７０）。ジフテリア毒素は、当業者に周知であり（例えば、Ｃｈｏｅ Ｓ、Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｍ、Ｆｕｊｉｉ Ｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９２、３５７：２１６〜２２２を参照されたい）、ジフテリア毒素のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＶ７０４８６．１を参照することにより見出すことができる。

【0010】

本発明においては、ＣＲＭ１９７の例示的なアミノ酸配列を、配列番号２に記載する。したがって、本発明においては、ＣＲＭ１９７の配列が関与する場合、当該配列は、配列番号２に記載の配列として記載される。例えば、表現「ＣＲＭ１９７の１位〜１９０位のアミノ酸残基」では、１位〜１９０位のアミノ酸残基は、配列番号２の１位〜１９０位のアミノ酸残基を指す。しかし、当業者であれば、（これらに限定されないが、置換、欠失及び／又は付加を含めた）突然変異又は変異が、ＣＲＭ１９７の生物学的特性に影響を及ぼすことなく、配列番号２中に天然に存在する場合又は人工的に導入される場合があることを理解する。したがって、本発明においては、用語「ＣＲＭ１９７」は、配列番号２に記載するポリペプチド、及びその天然の又は人工的なバリアントを含めた、全てのそのようなポリペプチド及びバリアントを含むことを意図し、バリアントは、ＣＲＭ１９７の生物学的特性を保持する、言い換えれば、強力な免疫原性を示し、細胞傷害性は示さない。さらに、ＣＲＭ１９７の配列断片を記載する場合、ＣＲＭ１９７の配列断片は、配列番号２に記載するポリペプチドの配列断片のみならず、当該ポリペプチドの天然の又は人工的なバリアントの対応する配列断片も含む。例えば、表現「ＣＲＭ１９７の１位〜１９０位のアミノ酸残基」は、配列番号２の１位〜１９０位のアミノ酸残基、及び配列番号２に記載するポリペプチドの（天然の又は人工的な）バリアントの対応する断片を含むことを意図する。

【0011】

本発明によれば、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）のキャプシドタンパク質は、ＨＥＶのＯＲＦ２がコードするタンパク質を指す。ＨＥＶのＯＲＦ２の配列は、当技術分野で周知である（例えば、ＤＤＢＪ受託番号Ｄ１１０９２を参照されたい）。本発明においては、ＨＥＶのＯＲＦ２の配列が関与する場合、当該配列は、ＤＤＢＪ受託番号Ｄ１１０９２に記載の配列として記載される。例えば、表現「ＨＥＶのＯＲＦ２がコードするポリペプチドの３６８位〜６０６位のアミノ酸残基」では、３６８位〜６０６位のアミノ酸残基は、Ｄ１１０９２がコードするポリペプチドの３６８位〜６０６位のアミノ酸残基を指す。しかし、当業者であれば、（これらに限定されないが、置換、欠失及び／又は付加を含めた）突然変異又は変異が、当該キャプシドタンパク質の生物学的特性（例として、抗原性及び免疫原性）に影響を及ぼすことなく、ＨＥＶのＯＲＦ２又はＨＥＶのＯＲＦ２がコードするポリペプチド中に天然に存在する場合又は人工的に導入される場合があることを理解する。したがって、本発明においては、用語「ＨＥＶのＯＲＦ２」は、Ｄ１１０９２に記載の配列、及び当該配列の天然の又は人工的なバリアントを含めた、全てのそのようなポリペプチド及びバリアントを含むことを意図する。さらに、ＨＥＶのＯＲＦ２（又はＨＥＶのＯＲＦ２がコードするポリペプチド）の配列断片を記載する場合、当該配列断片は、Ｄ１１０９２（又はＤ１１０９２がコードするポリペプチド）の配列断片のみならず、Ｄ１１０９２（又はＤ１１０９２がコードするポリペプチド）の天然の又は人工的なバリアントの対応する配列断片も含む。例えば、表現「ＨＥＶのＯＲＦ２がコードするポリペプチドの３６８位〜６０６位のアミノ酸残基」は、Ｄ１１０９２がコードするポリペプチドの３６８位〜６０６位のアミノ酸残基、及びＤ１１０９２がコードするポリペプチドの（天然の又は人工的な）バリアントの対応する断片を含むことを意図する。ＨＥＶキャプシドタンパク質（Ｄ１１０９２のＯＲＦ２がコードするポリペプチド）の例示的なアミノ酸配列を、配列番号３１に記載する。

【0012】

本発明によれば、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質は、Ａ型若しくはＢ型のインフルエンザウイルスのゲノムの第７セグメントがコードするタンパク質、又はＣ型インフルエンザウイルスのゲノムの第６セグメントがコードするタンパク質を指す。インフルエンザウイルスＭ２タンパク質の例示的なアミノ酸配列を、配列番号３２に記載する。

【0013】

本発明によれば、表現「対応する配列断片」又は「対応する断片」は、配列を最適なアラインメントに付す、すなわち、配列を整列させて、同一性の最も高いパーセントを得る場合に、配列の等しい位置に位置する断片を指す。

【0014】

本発明によれば、タンパク質／ポリペプチドの背景で使用する場合、用語「バリアント」は、タンパク質であって、アミノ酸配列が、参照するタンパク質／ポリペプチド（例えば、本発明のＣＲＭ１９７）とは１つ若しくは複数（例えば、１〜１０若しくは１〜５若しくは１〜３個）のアミノ酸により異なる（例として、保存的アミノ酸置換）か又は参照するタンパク質／ポリペプチド（例えば、本発明のＣＲＭ１９７）に対して少なくとも６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有し、参照するタンパク質／ポリペプチドの不可欠な特徴を保持するタンパク質を指す。本発明においては、ＣＲＭ１９７の不可欠な特徴は、細胞傷害性のない、強力な免疫原性を指すことができ、ＨＥＶキャプシドタンパク質及びインフルエンザウイルスＭ２タンパク質の不可欠な特徴は、当該タンパク質の抗原性及び／又は免疫原性を指すことができる。

【0015】

本発明によれば、用語「同一性」は、２つのポリペプチド間又は２つの核酸間の一致する程度を指す。比較するための２つの配列が、特定の部位において同じ塩基又はアミノ酸の単量体サブユニットを有する場合（例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれが特定の部位においてアデニンを有する場合又は２つのポリペプチドのそれぞれが特定の部位においてリジンを有する場合）に、当該２つの分子は、当該部位において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、（２つの配列が共有する同一の部位の数／比較するための部位の総数）×１００の関数である。例えば、２つの配列の１０個の部位のうち６個が一致する場合、これら２つの配列は、６０％の同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列：ＣＴＧＡＣＴ及びＣＡＧＧＴＴは、５０％の同一性を共有する（６個の部位のうち３個が一致する）。一般に、２つの配列の比較は、最大の同一性もたらすように実施する。そのようなアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３、１９７０）の方法に基づくコンピュータプログラム、例として、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を使用することによって実施することができる。２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４：１１〜１７（１９８８））のアルゴリズムを使用して決定することができ、当該アルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれており、ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを使用する。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４４〜４５３（１９７０））のアルゴリズムを使用して決定することができ、当該アルゴリズムは、ＧＣＧソフトウエアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて利用可能）中のＧＡＰプログラム中に組み込まれており、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２行列又はＰＡＭ２５０行列のいずれか、並びに１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップ加重及び１、２、３、４、５又は６の長さ加重を使用する。

【0016】

本発明において使用する場合、用語「保存的置換」は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの不可欠な特徴に対する負の影響も変化ももたらさないであろうアミノ酸置換を指す。例えば、保存的置換は、当技術分野で公知の標準的な技法、例として、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介型変異誘発により導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似する側鎖を有する別のアミノ酸残基、例えば、対応するアミノ酸残基に物理的又は機能的に類似する（例として、類似するサイズ、形状、電荷、共有結合又は水素結合を形成する能力を含めた、化学的特性等を有する）残基で置換される置換を含む。当技術分野では、類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが定義されている。これらのファミリーは、アルカリ性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン及びヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、無電荷の極性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例として、スレオニン、バリン、イソロイシン）、並びに芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖のファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。アミノ酸の保存的置換を同定するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３２：１１８０〜１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１２（１０）：８７９〜８８４（１９９９）；及びＢｕｒｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｅｔ ＵＳＡ、９４：４１２〜４１７（１９９７）を参照されたい。これらは、参照により本明細書に組み込まれている）。

【0017】

本発明によれば、用語「免疫原性」は、生物中で特異的抗体又は感作リンパ球の形成を刺激する能力を指す。免疫原性は、抗原が、特定の免疫細胞を刺激して、免疫細胞を活性化させ、増殖させ、分化させ、その結果、免疫学的エフェクター物質、例として、抗体及び感作リンパ球が最終的に生成される特性を指すのみならず、生物を、抗原を用いて刺激すると、生物の免疫系において、抗体又は感作Ｔリンパ球が形成され得る特異的な免疫応答も指す。免疫原性は、抗原の最も重要な特性である。抗原が宿主において免疫応答の発生を首尾よく誘発することができるかどうかは、抗原の特性、宿主の反応性及び免疫化の手段の３つの要因に依存する。

【0018】

本発明によれば、用語「免疫原性断片」は、ポリペプチド断片であって、当該ポリペプチド断片の誘導源のタンパク質の免疫原性を少なくとも部分的に保持するようなポリペプチド断片を指す。例えば、ＨＥＶキャプシドタンパク質の免疫原性断片は、免疫原性を少なくとも部分的に保持するＨＥＶキャプシドタンパク質の断片、例えば、本発明に記載するＨＥＶ−２３９、Ｅ２又はＥ２ｓを指す（Ｌｉら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２８０（５）：３４００〜３４０６（２００５）；Ｌｉら、ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、５（８）：ｅ１０００５３７（２００９）を参照されたい）。インフルエンザウイルスＭ２タンパク質の免疫原性断片は、免疫原性を少なくとも部分的に保持するＭ２タンパク質の断片、例えば、本発明に記載するＭ２ｅを指す（Ｆｉｅｒｓ Ｗら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２７（４５）：６２８０〜６２８３（２００９）を参照されたい）。

【0019】

本発明によれば、ＨＥＶ−２３９（又は手短に、２３９）は、ＨＥＶのＯＲＦ２がコードするポリペプチドの３６８位〜６０６位のアミノ酸残基からなるポリペプチド（すなわち、ＨＥＶキャプシドタンパク質）を指し、Ｅ２は、ＨＥＶのＯＲＦ２がコードするポリペプチドの３９４位〜６０６位のアミノ酸残基からなるポリペプチドを指し、Ｅ２ｓは、ＨＥＶのＯＲＦ２がコードするポリペプチドの４５５位〜６０６位のアミノ酸残基からなるポリペプチドを指す。

【0020】

本発明によれば、用語「Ｍ２ｅ」は、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質の１位〜２４位のアミノ酸残基からなるポリペプチドを指す。

【0021】

本発明においては、用語「ポリペプチド」と「タンパク質」とは、同じ意味を有し、互換的に使用することができる。さらに、本発明においては、アミノ酸は一般に、当技術分野で周知の１文字コード及び３文字コードにより示す。例えば、アラニンは、Ａ又はＡｌａにより示すことができる。

【0022】

本発明によれば、用語「イー・コライ（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系」は、イー・コライ（菌株）及びベクターからなる発現系を指し、イー・コライ（株）は、これらに限定されないが、ＧＩ６９８、ＥＲ２５６６、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＢＬＲ（ＤＥ３）等を含めて、市場に出ている。

【0023】

本発明によれば、用語「ベクター」は、核酸ビヒクルであって、当該核酸ビヒクル中にポリヌクレオチドが挿入され得る核酸ビヒクルを指す。ベクターにより、当該ベクター中に挿入されたポリヌクレオチドがコードするタンパク質の発現が可能になる場合、ベクターは、発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、宿主細胞中に、形質転換、形質導入又はトランスフェクションにより導入され、担持する遺伝物質エレメントを宿主細胞中で発現させることができる。これらに限定されないが、プラスミド、ファージ、コスミド等を含めて、ベクターは、当業者に周知である。

【0024】

本発明によれば、用語「クロマトグラフィー」には、これに限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、カチオン交換クロマトグラフィー）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー（例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、ゲルろ過クロマトグラフィー（ゲル排除クロマトグラフィー）、及び親和性クロマトグラフィーが含まれる。

【0025】

本発明によれば、用語「薬学的に許容できる担体及び／又は賦形剤」は、これらに限定されないが、ｐＨ調節剤、界面活性剤、アジュバント及びイオン強度増強剤を含めて、対象及び活性成分と薬理学的及び／又は生理学的に適合性であり、当技術分野で周知である担体及び／又は賦形剤を指す（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ編、１９版、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５を参照されたい）。例えば、ｐＨ調節剤として、これに限定されないが、リン酸緩衝剤が挙げられ、界面活性剤として、これらに限定されないが、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、又は非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−８０）が挙げられ、イオン強度増強剤として、これに限定されないが、塩化ナトリウムが挙げられる。

【0026】

本発明によれば、用語「アジュバント」は、抗原と一緒に生物に送達されるか又は前もって生物に送達されると、生物中で、抗原に対する免疫応答を増強すること又は免疫応答のタイプを変化させることができる非特異的な免疫賦活薬を指す。これらに限定されないが、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントのアジュバント（例えば、フロイントの完全アジュバント及びフロイントの不完全アジュバント）、コリネバクテリウム・パルバム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、リポ多糖、サイトカイン等を含めて、多様なアジュバントがある。現在、フロイントのアジュバントが、動物実験で最も一般的に使用されているアジュバントである。水酸化アルミニウムアジュバントは、臨床治験でより一般的に使用されている。

【0027】

本発明によれば、用語「分子内アジュバント」は、標的タンパク質（すなわち、抗原）との融合タンパク質を形成し、抗原と同じ分子（すなわち、アジュバント及び抗原を含む融合タンパク質）中に存在し、抗原のアジュバントとして作用して、抗原の免疫原性を増強するようなアジュバントを指す。具体的には、分子内アジュバントは、アジュバントであって、当該アジュバントに融合し、当該アジュバントと共に発現する標的タンパク質（抗原）の免疫原性を増強することが可能なアジュバントであり、ポリペプチド断片を一般に指す。本発明においては、分子内アジュバントは、とりわけ、ジフテリア毒素の無毒性突然変異体ＣＲＭ１９７又はその断片を指す。

【0028】

融合タンパク質を、２つ以上のタンパク質の融合発現により形成するための技法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９；及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９５を参照されたい）。一般に、２つ以上のタンパク質をコードするＤＮＡ断片を、組換えＤＮＡ技法によりフレーム中に一緒に連結し、融合タンパク質をタンパク質発現により得る。場合により、２つ以上のタンパク質の融合発現において、リンカーを使用しても又は使用しなくてもよい。

【0029】

本発明によれば、用語「リンカー」は、２つの分子（例えば、タンパク質）を連結するための短いペプチドを指す。一般に、融合タンパク質、例として、標的タンパク質１−リンカー−標的タンパク質２を、短いペプチドをコードするポリヌクレオチドを、２つの標的タンパク質をコードする２つのＤＮＡ断片の間に（例えば、ＰＣＲ増幅又はリガーゼにより）導入して、それぞれを連結し、連結されたＤＮＡ断片をタンパク質発現させることによって得る。当業者に周知であるように、リンカーとして、これらに限定されないが、柔軟な連結ペプチド、例として、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、及び（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）_３が挙げられる。

【0030】

本発明によれば、用語「有効量」は、予想される効果を達成する又は少なくとも部分的に達成するのに十分である量を指す。例えば、疾患（例として、ＨＥＶ感染又はインフルエンザウイルス感染）を予防するための有効量は、疾患（例として、ＨＥＶ感染又はインフルエンザウイルス感染）の発症を予防する、抑制する又は遅延させるための有効量を指す。疾患を治療するための有効量は、疾患を有する患者において疾患及び疾患の合併症を治癒させる又は少なくとも部分的に遮断するための有効量を指す。そのような有効量の決定は、当業者の能力のうちである。例えば、治療に使用するための有効量は、治療しようとする疾患の重症度、患者の免疫系の一般的な状況、患者の一般的な状態、例として、年齢、体重及び性別、薬物の投与手段、同時に使用する追加の療法等に依存する。

【0031】

本発明は、ＣＲＭ１９７又はその断片を、標的タンパク質（例えば、ＨＥＶキャプシドタンパク質、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質、又はそれらの免疫原性断片）と融合発現させると、ＣＲＭ１９７又はその断片が、標的タンパク質の免疫原性を顕著に増強するという本発明者らの驚くべき発見に少なくとも部分的に基づく。具体的には、標的タンパク質との融合発現により、ＣＲＭ１９７又はその断片を分子内アジュバントとして使用して、標的タンパク質の免疫原性を増強することができる。

【0032】

したがって、一態様では、本発明は、ＣＲＭ１９７又はその断片、及び標的タンパク質を含む融合タンパク質に関し、前記ＣＲＭ１９７又はその断片が、標的タンパク質の免疫原性を増強する。

【0033】

好ましい実施形態では、ＣＲＭ１９７の断片は、例えば、ＣＲＭ１９７の触媒ドメインＣ（ａａ１〜１９０、本出願においては、断片Ａともまた呼ぶ）、膜貫通ドメインＴ（ａａ２０１〜３８４）、及び／又は受容体結合ドメインＲ（ａａ３８６〜５３５）を含む。例えば、ＣＲＭ１９７の断片は、断片Ａ、又は断片Ａ及び膜貫通ドメインＴを含むことができる。

【0034】

別の好ましい実施形態では、ＣＲＭ１９７の断片は、ＣＲＭ１９７のａａ１〜１９０を含み、例えば、ＣＲＭ１９７のａａ１〜３８９を含む。別の好ましい実施形態では、ＣＲＭ１９７の断片は、ＣＲＭ１９７のａａ１〜１９０又はａａ１〜３８９からなる。本出願においては、ＣＲＭ１９７の例示的なアミノ酸配列を、配列番号２に記載し、対応するヌクレオチド配列を、配列番号１に記載する。

【0035】

好ましい実施形態では、標的タンパク質は、ＨＥＶキャプシドタンパク質、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質、又はそれらの免疫原性断片であり得る。別の好ましい実施形態では、ＨＥＶキャプシドタンパク質の免疫原性断片は、例えば、ＨＥＶ−２３９（ＨＥＶキャプシドタンパク質のａａ３６８〜６０６）、Ｅ２（ＨＥＶキャプシドタンパク質のａａ３９４〜６０６）、若しくはＥ２ｓ（ＨＥＶキャプシドタンパク質のａａ４５５〜６０６）等を含むことができ、又は例えば、ＨＥＶ−２３９（ＨＥＶキャプシドタンパク質のａａ３６８〜６０６）、Ｅ２（ＨＥＶキャプシドタンパク質のａａ３９４〜６０６）、若しくはＥ２ｓ（ＨＥＶキャプシドタンパク質のａａ４５５〜６０６）等であり得る。別の好ましい実施形態では、Ｍ２タンパク質の免疫原性断片は、例えば、Ｍ２ｅ（Ｍ２タンパク質のａａ１〜２４）を含むことができ、又は例えば、Ｍ２ｅ（Ｍ２タンパク質のａａ１〜２４）であり得る。

【0036】

好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質において、ＣＲＭ１９７又はその断片を、標的タンパク質のＮ−末端及び／又はＣ−末端に、場合によりリンカーを介して連結することができる。これらに限定されないが、柔軟な連結ペプチド、例として、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、及び（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）_３等を含めて、２つのペプチド断片を連結するためのリンカーは、当技術分野で周知である。そのようなリンカーは、当技術分野で周知であり、当該リンカーの選択は、当業者の能力のうちである。

【0037】

好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＣＲＭ１９７又はその断片、及びＨＥＶキャプシドタンパク質又はその免疫原性断片を含むことができ、両者を一緒に、場合によりリンカーを介して連結する。例えば、本発明の融合タンパク質は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６又は１８に記載するアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。

【0038】

好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＣＲＭ１９７又はその断片、及びインフルエンザウイルスＭ２タンパク質又はその免疫原性断片を含むことができ、両者を一緒に、場合によりリンカーを介して連結する。例えば、本発明の融合タンパク質は、配列番号３４、３６、３８、４０、４２又は４４に記載するアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。

【0039】

本発明の融合タンパク質において、ＣＲＭ１９７又はその断片は、驚くべきことに、ＣＲＭ１９７又はその断片に（場合によりリンカーを介して）融合させた標的タンパク質（例として、ＨＥＶキャプシドタンパク質、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質、又はそれらの免疫原性断片）の免疫原性を顕著に増強し、したがって、分子内アジュバントとして使用することができる。

【0040】

別の態様では、本発明は、上記に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供し、また、ポリヌクレオチドを含むコンストラクトも提供する。

【0041】

別の態様では、本発明は、ベクターであって、上記に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はポリヌクレオチドを含むコンストラクトを含むベクターを提供する。本発明のベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり得る。

【0042】

好ましい実施形態では、本発明のベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ等であり得る。

【0043】

別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、コンストラクト又はベクターを含む宿主細胞又は生物を提供する。前記宿主細胞として、これらに限定されないが、原核細胞、例として、イー・コライ細胞、並びに真核細胞、例として、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞（例として、哺乳動物細胞、例えば、マウス細胞、ヒト細胞等）が挙げられる。本発明の細胞は、細胞株、例として、２９３Ｔ細胞であり得る。ある実施形態では、生物は、植物又は動物である。

【0044】

別の態様では、また、本発明は、本発明の融合タンパク質、並びに場合により、薬学的に許容できる担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物又はワクチンにも関する。融合タンパク質中で使用する標的タンパク質に応じて、本発明の医薬組成物又はワクチンは、種々の疾患（すなわち、標的タンパク質により予防又は治療することができる疾患）の予防及び／又は治療に有用であり得る。例えば、使用する標的タンパク質が、ＨＥＶキャプシドタンパク質又はその免疫原性断片である場合、本発明の医薬組成物を使用して、ＨＥＶ感染、及びＨＥＶ感染に伴う疾患、例として、Ｅ型肝炎を予防及び／又は治療することができる。使用する標的タンパク質が、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質又はその免疫原性断片である場合、本発明の医薬組成物を使用して、インフルエンザウイルス感染、及びインフルエンザウイルス感染に伴う疾患、例として、インフルエンザを予防及び／又は治療することができる。

【0045】

別の態様では、また、本発明は、標的タンパク質により予防又は治療することができる疾患を予防及び／又は治療するための医薬組成物の製造における、本発明の融合タンパク質の使用にも関する。融合タンパク質中で使用する標的タンパク質に応じて、本発明の医薬組成物を使用して、種々の疾患を予防及び／又は治療することができる。例えば、使用する標的タンパク質が、ＨＥＶキャプシドタンパク質又はその免疫原性断片である場合、本発明の医薬組成物を使用して、ＨＥＶ感染、及びＨＥＶ感染に伴う疾患、例として、Ｅ型肝炎を予防及び／又は治療することができる。使用する標的タンパク質が、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質又はその免疫原性断片である場合、本発明の医薬組成物を使用して、インフルエンザウイルス感染、及びインフルエンザウイルス感染に伴う疾患、例として、インフルエンザを予防及び／又は治療することができる。

【0046】

別の態様では、また、本発明は、ＨＥＶ感染、及び／又はＨＥＶ感染に伴う疾患、例として、Ｅ型肝炎を予防及び／又は治療するための方法であって、当該方法が、有効量の本発明の融合タンパク質又は融合タンパク質を含む医薬組成物を投与するステップを含み、融合タンパク質が、一緒に、場合によりリンカーを介して連結されているＣＲＭ１９７又はその断片及びＨＥＶキャプシドタンパク質又はその免疫原性断片を含む、方法にも関する。

【0047】

別の態様では、また、本発明は、インフルエンザウイルス感染、及びインフルエンザウイルス感染に伴う疾患、例として、インフルエンザを予防及び／又は治療するための方法であって、当該方法が、有効量の本発明の融合タンパク質又は融合タンパク質を含む医薬組成物を投与するステップを含み、融合タンパク質が、一緒に、場合によりリンカーを介して連結されているＣＲＭ１９７又はその断片及びインフルエンザウイルスＭ２タンパク質又はその免疫原性断片を含む、方法にも関する。

【0048】

別の態様では、本発明は、標的タンパク質の免疫原性を増強するための方法を提供し、当該方法は、標的タンパク質の免疫原性を増強するような融合タンパク質であり、上記に記載のＣＲＭ１９７又はその断片、及び標的タンパク質を含む融合タンパク質を得るステップを含む。

【0049】

好ましい実施形態では、融合タンパク質を、ＣＲＭ１９７又はその断片の、標的タンパク質との、場合によりリンカーを使用する融合発現によって得ることができる。好ましい実施形態では、標的タンパク質は、上記したＨＥＶキャプシドタンパク質、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質、又はそれらの免疫原性断片である。

【0050】

したがって、ある実施形態では、本発明は、ＨＥＶキャプシドタンパク質又はその免疫原性断片の免疫原性を増強するための方法を提供し、当該方法は、ＨＥＶキャプシドタンパク質又はその免疫原性断片の免疫原性を増強するような融合タンパク質であり、ＣＲＭ１９７又はその断片及びＨＥＶキャプシドタンパク質又はその免疫原性断片を含む融合タンパク質を得るステップを含む。好ましい実施形態では、融合タンパク質を、ＣＲＭ１９７又はその断片の、ＨＥＶキャプシドタンパク質又はその免疫原性断片との、場合によりリンカーを使用する融合発現によって得ることができる。

【0051】

別の実施形態では、本発明は、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質又はその免疫原性断片の免疫原性を増強するための方法を提供し、当該方法は、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質又はその免疫原性断片の免疫原性を増強するような融合タンパク質であり、ＣＲＭ１９７又はその断片及びインフルエンザウイルスＭ２タンパク質又はその免疫原性断片を含む融合タンパク質を得るステップを含む。好ましい実施形態では、融合タンパク質を、ＣＲＭ１９７又はその断片の、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質又はその免疫原性断片との、場合によりリンカーを使用する融合発現によって得ることができる。

【0052】

別の態様では、本発明は、標的タンパク質の免疫原性の増強におけるＣＲＭ１９７又はその断片の使用に関し、当該使用は、ＣＲＭ１９７又はその断片及び標的タンパク質を含む融合タンパク質を得ることを特徴とする。

【0053】

好ましい実施形態では、融合タンパク質を、ＣＲＭ１９７又はその断片の、標的タンパク質との、場合によりリンカーを使用する融合発現によって得ることができる。好ましい実施形態では、標的タンパク質は、ＨＥＶキャプシドタンパク質、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質、又はそれらの免疫原性断片である。

【0054】

したがって、ある実施形態では、本発明は、ＨＥＶキャプシドタンパク質又はその免疫原性断片の免疫原性の増強における、ＣＲＭ１９７又はその断片の使用に関し、当該使用は、ＣＲＭ１９７又はその断片及びＨＥＶキャプシドタンパク質又はその免疫原性断片を含む融合タンパク質を得ることを特徴とする。好ましい実施形態では、融合タンパク質を、ＣＲＭ１９７又はその断片の、ＨＥＶキャプシドタンパク質又はその免疫原性断片との、場合によりリンカーを使用する融合発現によって得ることができる。

【0055】

別の実施形態では、本発明は、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質又はその免疫原性断片の免疫原性の増強における、ＣＲＭ１９７又はその断片の使用に関し、当該使用は、ＣＲＭ１９７又はその断片及びインフルエンザウイルスＭ２タンパク質又はその免疫原性断片を含む融合タンパク質を得ることを特徴とする。好ましい実施形態では、融合タンパク質を、ＣＲＭ１９７又はその断片の、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質又はその免疫原性断片との、場合によりリンカーを使用する融合発現によって得ることができる。

【発明の効果】

【0056】

本発明は、ＣＲＭ１９７及びその断片を、標的タンパク質の免疫原性を増強するために、分子内アジュバントとして使用することができることを初めて実証している。したがって、本発明は、ＣＲＭ１９７及びその断片の新規の使用を提供し、標的タンパク質の免疫原性を増強するための新規の方法を提供する。

【0057】

さらに、本発明の融合タンパク質は、標的タンパク質単独と比較してより強力な免疫原性を示すことから、本発明は、医薬又はワクチンの製造に新しい選択肢を提供し、対応する疾患のより有効な治療及び予防を達成することもできる。

【0058】

例えば、ＣＲＭ１９７（又はその断片）及びＨＥＶキャプシドタンパク質（又はその免疫原性断片）を含む本発明の融合タンパク質は、ＨＥＶキャプシドタンパク質（又はその免疫原性断片）単独と比較してより強力な免疫原性を示し、したがって、融合タンパク質は、医薬組成物の製造に有用であり得、ＨＥＶ感染、及びＨＥＶ感染に伴う疾患、例として、Ｅ型肝炎をより有効に予防及び治療することができる。

【0059】

例えば、ＣＲＭ１９７（又はその断片）及びインフルエンザウイルスＭ２タンパク質（又はその免疫原性断片）を含む本発明の融合タンパク質は、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質（又はその免疫原性断片）単独と比較してより強力な免疫原性を示し、したがって、融合タンパク質は、医薬組成物の製造に有用であり得、インフルエンザウイルス感染、及びインフルエンザウイルス感染に伴う疾患、例として、インフルエンザをより有効に予防及び治療することができる。例えば、Ｍ２ｅタンパク質を、ＣＲＭ１９７（又はその断片）のＮ−末端に融合させる場合、こうして形成した融合タンパク質は、四量体又はその他のポリマー配置を形成することができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、防御モノクローナル抗体Ｏ１９（Ｆｕら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００９、３８５：２１８〜２２６を参照されたい）との良好な反応性を示し（図１２Ｂを参照されたい）、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、良好な免疫原性を示す（図１４を参照されたい）。したがって、こうして形成した融合タンパク質は、一般的なインフルエンザワクチンを開発するのに有用である。

【0060】

配列情報の説明
本発明に関与する配列の情報を、以下の表に示す。

【表1】

【0061】

本発明の実施形態を、図面及び実施例を参照することにより、詳細にさらに記載する。しかし、以下の図面及び実施例の意図は、本発明の範囲の定義ではなく、本発明の例証に過ぎないことを当業者であれば理解するであろう。以下の図面及び好ましい実施形態の詳細な描写に従うと、本発明の種々の目的及び利点が、当業者に明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0062】

【図1】実施例２において構築した融合タンパク質のクローン設計を示す図である。使用するリンカー（リンカー、また、本出願においては、略してＬとも呼ぶ）は、配列がＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧである１５個のアミノ酸残基からなる柔軟な断片である。使用するＣＲＭ１９７は、配列を配列番号２に記載する５３５個のアミノ酸を含んだ。３８９は、ＣＲＭ１９７の１位〜３８９位のアミノ酸残基（ａａ１〜３８９）を含むポリペプチドを指す。Ａは、ＣＲＭ１９７の１位〜１９０位のアミノ酸残基（ａａ１〜１９０）を含むポリペプチドを指す。Ｅ２は、ＨＥＶキャプシドタンパク質の３９４位〜６０６位のアミノ酸残基（ａａ３９４〜６０６）を含むポリペプチドを指す。Ｅ２ｓは、ＨＥＶキャプシドタンパク質の４５５位〜６０６位のアミノ酸残基（ａａ４５５〜６０６）を含むポリペプチドを指す。

【図2A】実施例２において構築した融合タンパク質の発現、精製及び再生のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。図２Ａにおいて使用した試料は、超音波処理した後に、破壊した細菌を遠心分離することによって得た沈殿物（すなわち、封入体）である。図２Ｂにおいて使用した試料は、４Ｍ尿素で溶解させた上清である。図２Ｃで使用した試料は、８Ｍ尿素で溶解させた上清であり、図２Ｄで使用した試料は、ＰＢＳ中で再生させたタンパク質である。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー；レーン１：ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｅ２；レーン２：ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｅ２ｓ；レーン３：３８９−Ｌ−Ｅ２；レーン４：３８９−Ｌ−Ｅ２ｓ；レーン５：３８９−Ｅ２ｓ；レーン６：Ａ−Ｌ−Ｅ２；レーン７：Ａ−Ｌ−Ｅ２ｓ；レーン８：Ａ−Ｅ２ｓ。結果から、構築した融合タンパク質は全て、封入体中で発現させることができ、Ａ−Ｌ−Ｅ２及びＡ−Ｌ−Ｅ２ｓは、４Ｍ尿素及び８Ｍ尿素中に溶解し、一方、その他の融合タンパク質は、８Ｍ尿素中にのみ溶解することが示された。さらにまた、結果から、透析及び再生の後に、約８０％の純度の融合タンパク質が得られることも示された。

【図2B】実施例２において構築した融合タンパク質の発現、精製及び再生のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。図２Ａにおいて使用した試料は、超音波処理した後に、破壊した細菌を遠心分離することによって得た沈殿物（すなわち、封入体）である。図２Ｂにおいて使用した試料は、４Ｍ尿素で溶解させた上清である。図２Ｃで使用した試料は、８Ｍ尿素で溶解させた上清であり、図２Ｄで使用した試料は、ＰＢＳ中で再生させたタンパク質である。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー；レーン１：ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｅ２；レーン２：ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｅ２ｓ；レーン３：３８９−Ｌ−Ｅ２；レーン４：３８９−Ｌ−Ｅ２ｓ；レーン５：３８９−Ｅ２ｓ；レーン６：Ａ−Ｌ−Ｅ２；レーン７：Ａ−Ｌ−Ｅ２ｓ；レーン８：Ａ−Ｅ２ｓ。結果から、構築した融合タンパク質は全て、封入体中で発現させることができ、Ａ−Ｌ−Ｅ２及びＡ−Ｌ−Ｅ２ｓは、４Ｍ尿素及び８Ｍ尿素中に溶解し、一方、その他の融合タンパク質は、８Ｍ尿素中にのみ溶解することが示された。さらにまた、結果から、透析及び再生の後に、約８０％の純度の融合タンパク質が得られることも示された。

【図2C】実施例２において構築した融合タンパク質の発現、精製及び再生のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。図２Ａにおいて使用した試料は、超音波処理した後に、破壊した細菌を遠心分離することによって得た沈殿物（すなわち、封入体）である。図２Ｂにおいて使用した試料は、４Ｍ尿素で溶解させた上清である。図２Ｃで使用した試料は、８Ｍ尿素で溶解させた上清であり、図２Ｄで使用した試料は、ＰＢＳ中で再生させたタンパク質である。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー；レーン１：ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｅ２；レーン２：ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｅ２ｓ；レーン３：３８９−Ｌ−Ｅ２；レーン４：３８９−Ｌ−Ｅ２ｓ；レーン５：３８９−Ｅ２ｓ；レーン６：Ａ−Ｌ−Ｅ２；レーン７：Ａ−Ｌ−Ｅ２ｓ；レーン８：Ａ−Ｅ２ｓ。結果から、構築した融合タンパク質は全て、封入体中で発現させることができ、Ａ−Ｌ−Ｅ２及びＡ−Ｌ−Ｅ２ｓは、４Ｍ尿素及び８Ｍ尿素中に溶解し、一方、その他の融合タンパク質は、８Ｍ尿素中にのみ溶解することが示された。さらにまた、結果から、透析及び再生の後に、約８０％の純度の融合タンパク質が得られることも示された。

【図2D】実施例２において構築した融合タンパク質の発現、精製及び再生のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。図２Ａにおいて使用した試料は、超音波処理した後に、破壊した細菌を遠心分離することによって得た沈殿物（すなわち、封入体）である。図２Ｂにおいて使用した試料は、４Ｍ尿素で溶解させた上清である。図２Ｃで使用した試料は、８Ｍ尿素で溶解させた上清であり、図２Ｄで使用した試料は、ＰＢＳ中で再生させたタンパク質である。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー；レーン１：ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｅ２；レーン２：ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｅ２ｓ；レーン３：３８９−Ｌ−Ｅ２；レーン４：３８９−Ｌ−Ｅ２ｓ；レーン５：３８９−Ｅ２ｓ；レーン６：Ａ−Ｌ−Ｅ２；レーン７：Ａ−Ｌ−Ｅ２ｓ；レーン８：Ａ−Ｅ２ｓ。結果から、構築した融合タンパク質は全て、封入体中で発現させることができ、Ａ−Ｌ−Ｅ２及びＡ−Ｌ−Ｅ２ｓは、４Ｍ尿素及び８Ｍ尿素中に溶解し、一方、その他の融合タンパク質は、８Ｍ尿素中にのみ溶解することが示された。さらにまた、結果から、透析及び再生の後に、約８０％の純度の融合タンパク質が得られることも示された。

【図3】クロマトグラフィーにより精製した融合タンパク質Ａ−Ｌ−Ｅ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。レーン１は、クロマトグラフィーによる精製の後に、ＰＢＳに再生したＡ−Ｌ−Ｅ２を指す。レーン２は、沸騰水中で１０分間沸騰させた、Ａ−Ｌ−Ｅ２のレーン１の試料を指す。結果から、二段階クロマトグラフィーの後に、Ａ−Ｌ−Ｅ２は９０％超の純度に達することができることが示された。

【図4】実施例２において構築した融合タンパク質及びＨＥＶ中和モノクローナル抗体８Ｃ１１を使用したウエスタンブロッティングの結果を示す図である。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー；レーン１：対照タンパク質ＨＥＶ−２３９；レーン２：対照タンパク質Ｅ２、レーン３：ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｅ２；レーン４：ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｅ２ｓ；レーン５：３８９−Ｌ−Ｅ２；レーン６：３８９−Ｌ−Ｅ２ｓ；レーン７：３８９−Ｅ２ｓ；レーン８：Ａ−Ｌ−Ｅ２；レーン９：Ａ−Ｌ−Ｅ２ｓ；レーン１０：Ａ−Ｅ２ｓ。結果から、試験した融合タンパク質は全て、ＨＥＶに特異的な中和モノクローナル抗体８Ｃ１１との顕著な反応性を有することが示された。

【図5A】実施例２において構築した融合タンパク質及びＨＥＶに特異的なモノクローナル抗体を使用した間接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。横座標は、ＥＬＩＳＡのためのＨＥＶに特異的なモノクローナル抗体又はＣＲＭ１９７ポリクローナル抗血清を指し、縦座標は、ＥＬＩＳＡにより同じ抗体希釈度で決定したＯＤの値を指す。図５Ａは、Ｅ２を含む融合タンパク質のＥＬＩＳＡの結果を示し、図５Ｂは、Ｅ２ｓを含む融合タンパク質のＥＬＩＳＡの結果を示す。結果から、Ｅ２ｓタンパク質のＣＲＭ１９７又はその断片との融合の後に、Ｅ２ｓタンパク質のＨＥＶに特異的なモノクローナル抗体との反応性は顕著に増強し、Ａ−Ｌ−Ｅ２ｓ及びＡ−Ｅ２Ｓの反応性が最も顕著に増強され、Ｅ２タンパク質のＣＲＭ１９７又はその断片との融合の後に、Ｅ２タンパク質のＨＥＶに特異的なモノクローナル抗体との反応性は、保持されるか又は増強されることが示された。

【図5B】実施例２において構築した融合タンパク質及びＨＥＶに特異的なモノクローナル抗体を使用した間接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。横座標は、ＥＬＩＳＡのためのＨＥＶに特異的なモノクローナル抗体又はＣＲＭ１９７ポリクローナル抗血清を指し、縦座標は、ＥＬＩＳＡにより同じ抗体希釈度で決定したＯＤの値を指す。図５Ａは、Ｅ２を含む融合タンパク質のＥＬＩＳＡの結果を示し、図５Ｂは、Ｅ２ｓを含む融合タンパク質のＥＬＩＳＡの結果を示す。結果から、Ｅ２ｓタンパク質のＣＲＭ１９７又はその断片との融合の後に、Ｅ２ｓタンパク質のＨＥＶに特異的なモノクローナル抗体との反応性は顕著に増強し、Ａ−Ｌ−Ｅ２ｓ及びＡ−Ｅ２Ｓの反応性が最も顕著に増強され、Ｅ２タンパク質のＣＲＭ１９７又はその断片との融合の後に、Ｅ２タンパク質のＨＥＶに特異的なモノクローナル抗体との反応性は、保持されるか又は増強されることが示された。

【図6】タンパク質のＡ−Ｌ−Ｅ２、ＨＥＶ−２３９又はＥ２、及びＨＥＶに特異的なモノクローナル抗体を使用した間接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。カットオフ値を、陰性の値の平均の３倍と定義する。結果から、Ａ−Ｌ−Ｅ２のＨＥＶに特異的なモノクローナル抗体との反応性は、ＨＥＶ−２３９及びＥ２の反応性に匹敵することが示された。

【図7】融合タンパク質Ａ−Ｌ−Ｅ２の沈降速度（ＳＶ）の解析の結果を示すグラフである。結果から、融合タンパク質Ａ−Ｌ−Ｅ２は、主として二量体の形態で存在し、四量体が少量存在することが示された。

【図8A】実施例２において構築した融合タンパク質とＨＥＶ−２３９との間の免疫原性の比較を示すグラフである。一次免疫化を第０週に実施し、追加免疫化を、第２及び４週に実施し、用量は、一次免疫化及び追加免疫化の両方について、５μｇ又は０．５μｇであった。図８Ａは、５μｇ用量群の免疫血清の抗体価の比較結果を示し、図８Ｂは、０．５μｇ用量群の免疫血清の抗体価の比較結果を示す。結果から、マウス血清中のＨＥＶに対する血清転換が、５μｇ用量群及び０．５μｇ用量群において、第４週に生じ、抗体価は、第５又は６週に、最も高い値に達することが示された。特に、５μｇ用量群では、Ａ−Ｌ−Ｅ２を使用する場合に、最も高い抗体価が得られ、抗体価は、第６週に１０^６に達し、融合タンパク質が誘発した抗体価は、ＨＥＶ−２３９が誘発した抗体価よりも高いか又はＨＥＶ−２３９が誘発した抗体価に匹敵した。０．５μｇ用量群では、融合タンパク質の抗体価は、ＨＥＶ−２３９の抗体価よりも顕著に高く、Ａ−Ｌ−Ｅ２タンパク質が誘発した抗体価は、第５週に１０^６に達した。さらに、５μｇ用量群においても０．５μｇ用量群においても、Ｅ２及びＥ２ｓを使用した場合、免疫血清中の血清転換は生じなかった。上記の結果から見られるように、実施例２において構築した融合タンパク質の免疫原性は、抗原タンパク質（Ｅ２及びＥ２ｓ）単独よりも顕著に高く、当該結果は、本発明のＣＲＭ１９７又はその断片は、ＣＲＭ１９７又はその断片と融合させた抗原タンパク質の免疫原性を顕著に増強し、分子内アジュバントとして使用することが可能であることを示した。

【図8B】実施例２において構築した融合タンパク質とＨＥＶ−２３９との間の免疫原性の比較を示すグラフである。一次免疫化を第０週に実施し、追加免疫化を、第２及び４週に実施し、用量は、一次免疫化及び追加免疫化の両方について、５μｇ又は０．５μｇであった。図８Ａは、５μｇ用量群の免疫血清の抗体価の比較結果を示し、図８Ｂは、０．５μｇ用量群の免疫血清の抗体価の比較結果を示す。結果から、マウス血清中のＨＥＶに対する血清転換が、５μｇ用量群及び０．５μｇ用量群において、第４週に生じ、抗体価は、第５又は６週に、最も高い値に達することが示された。特に、５μｇ用量群では、Ａ−Ｌ−Ｅ２を使用する場合に、最も高い抗体価が得られ、抗体価は、第６週に１０^６に達し、融合タンパク質が誘発した抗体価は、ＨＥＶ−２３９が誘発した抗体価よりも高いか又はＨＥＶ−２３９が誘発した抗体価に匹敵した。０．５μｇ用量群では、融合タンパク質の抗体価は、ＨＥＶ−２３９の抗体価よりも顕著に高く、Ａ−Ｌ−Ｅ２タンパク質が誘発した抗体価は、第５週に１０^６に達した。さらに、５μｇ用量群においても０．５μｇ用量群においても、Ｅ２及びＥ２ｓを使用した場合、免疫血清中の血清転換は生じなかった。上記の結果から見られるように、実施例２において構築した融合タンパク質の免疫原性は、抗原タンパク質（Ｅ２及びＥ２ｓ）単独よりも顕著に高く、当該結果は、本発明のＣＲＭ１９７又はその断片は、ＣＲＭ１９７又はその断片と融合させた抗原タンパク質の免疫原性を顕著に増強し、分子内アジュバントとして使用することが可能であることを示した。

【図9】実施例６において構築した融合タンパク質のクローン設計を示す図である。使用するリンカー（リンカー、また、本出願においては、略してＬとも呼ぶ）は、配列がＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである１０個のアミノ酸残基からなる柔軟な断片である。使用するＣＲＭ１９７は、配列を配列番号２に記載する５３５個のアミノ酸を含んだ。３８９は、ＣＲＭ１９７の１位〜３８９位のアミノ酸残基（ａａ１〜３８９）を含むポリペプチドを指す。Ａは、ＣＲＭ１９７の１位〜１９０位のアミノ酸残基（ａａ１〜１９０）を含むポリペプチドを指す。Ｍ２は、配列を配列番号３２に記載するインフルエンザウイルスＭ２タンパク質を指す。Ｍ２ｅは、インフルエンザウイルスＭ２タンパク質の１位〜２４位のアミノ酸残基（ａａ１〜２４）を含むポリペプチドを指す。

【図10A】実施例６において構築した融合タンパク質の発現、精製及び再生のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー。図１０Ａは、超音波処理した後に、破壊した細菌を遠心分離することによって得た沈殿物（すなわち、封入体）及び上清である試料を使用した。レーン１：ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅを用いて形質転換した細菌から得られた封入体。レーン２：ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅを用いて形質転換した細菌から得られた上清。レーン３：３８９−Ｌ−Ｍ２ｅを用いて形質転換した細菌から得られた封入体。レーン４：３８９−Ｌ−Ｍ２ｅを用いて形質転換した細菌から得られた上清。レーン５：Ａ−Ｌ−Ｍ２ｅを用いて形質転換した細菌から得られた封入体。レーン６：Ａ−Ｌ−Ｍ２ｅを用いて形質転換した細菌から得られた上清。

【図10B】実施例６において構築した融合タンパク質の発現、精製及び再生のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー。図１０Ｂは、超音波処理した後に、破壊した細菌を遠心分離することによって得た沈殿物（すなわち、封入体）及び上清である試料を使用した。レーン１：Ｍ２ｅ−Ｌ−Ａを用いて形質転換した細菌から得られた封入体。レーン２：Ｍ２ｅ−Ｌ−Ａを用いて形質転換した細菌から得られた上清。レーン３：Ｍ２ｅ−Ｌ−３８９を用いて形質転換した細菌から得られた封入体。レーン４：Ｍ２ｅ−Ｌ−３８９を用いて形質転換した細菌から得られた上清。レーン５：Ｍ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７を用いて形質転換した細菌から得られた封入体。レーン６：Ｍ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７を用いて形質転換した細菌から得られた上清。

【図10C】実施例６において構築した融合タンパク質の発現、精製及び再生のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー。図１０Ｃは、単離し、ＰＢＳ中で再生した融合タンパク質である試料を使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の間に、β−メルカプトエタノールを使用せず、タンパク質試料を（１０分間の）沸騰により処理する場合又は処理しない場合を設けた。レーン１：沸騰により処理しなかったＡ−Ｌ−Ｍ２ｅタンパク質。レーン２：沸騰により処理したＡ−Ｌ−Ｍ２ｅタンパク質。レーン３：沸騰により処理しなかった３８９−Ｌ−Ｍ２ｅタンパク質。レーン４：沸騰により処理した３８９−Ｌ−Ｍ２ｅタンパク質。レーン５：沸騰により処理しなかったＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅタンパク質。レーン６：沸騰により処理したＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅタンパク質。

【図10D】実施例６において構築した融合タンパク質の発現、精製及び再生のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー。図１０Ｄは、単離し、ＰＢＳ中で再生した融合タンパク質である試料を使用し、β−メルカプトエタノールを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の間に使用し、タンパク質試料を（１０分間の）沸騰により処理する場合又は処理しない場合を設けた。レーン１：沸騰により処理しなかったＡ−Ｌ−Ｍ２ｅタンパク質。レーン２：沸騰により処理したＡ−Ｌ−Ｍ２ｅタンパク質。レーン３：沸騰により処理しなかった３８９−Ｌ−Ｍ２ｅタンパク質。レーン４：沸騰により処理した３８９−Ｌ−Ｍ２ｅタンパク質。レーン５：沸騰により処理しなかったＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅタンパク質。レーン６：沸騰により処理したＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅタンパク質。

【図10E】実施例６において構築した融合タンパク質の発現、精製及び再生のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー。図１０Ｅは、単離し、ＰＢＳ中で再生した融合タンパク質である試料を使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の間に、β−メルカプトエタノールを使用せず、タンパク質試料を（１０分間の）沸騰により処理する場合又は処理しない場合を設けた。レーン１：沸騰により処理しなかったＭ２ｅ−Ｌ−Ａタンパク質。レーン２：沸騰により処理したＭ２ｅ−Ｌ−Ａタンパク質。レーン３：沸騰により処理しなかったＭ２ｅ−Ｌ−３８９タンパク質。レーン４：沸騰により処理したＭ２ｅ−Ｌ−３８９タンパク質。レーン５：沸騰により処理しなかったＭ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７タンパク質。レーン６：沸騰により処理したＭ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７タンパク質。

【図10F】実施例６において構築した融合タンパク質の発現、精製及び再生のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー。図１０Ｆは、単離し、ＰＢＳ中で再生した融合タンパク質である試料を使用した。β−メルカプトエタノールを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の間に使用し、タンパク質試料を（１０分間の）沸騰により処理する場合又は処理しない場合を設けた。レーン１：沸騰により処理しなかったＭ２ｅ−Ｌ−Ａタンパク質。レーン２：沸騰により処理したＭ２ｅ−Ｌ−Ａタンパク質。レーン３：沸騰により処理しなかったＭ２ｅ−Ｌ−３８９タンパク質。レーン４：沸騰により処理したＭ２ｅ−Ｌ−３８９タンパク質。レーン５：沸騰により処理しなかったＭ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７タンパク質。レーン６：沸騰により処理したＭ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７タンパク質。図１０Ａ〜１０Ｆに示す結果から、構築した融合タンパク質は全て、封入体中で発現させることができ、精製及び再生の後に、約８０％の純度を有する融合タンパク質を得ることができることが示された。

【図11A】実施例６において構築した融合タンパク質と、抗Ｍ２ｅモノクローナル抗体５Ｄ１及びＣＲＭ１９７モノクローナル抗体１Ｅ６とを使用したウエスタンブロッティングの結果を示す図である。図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ及び１１Ｄのレーン１〜６が示す試料は、図１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ及び１０Ｆのレーン１〜６が示す試料それぞれに対応し、抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体５Ｄ１を使用した。図１１Ｅ、１１Ｆ、１１Ｇ及び１１Ｈのレーン１〜６が示す試料は、図１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ及び１０Ｆのレーン１〜６が示す試料それぞれに対応し、ＣＲＭ１９７に特異的なモノクローナル抗体１Ｅ６を使用した。結果から、試験した融合タンパク質は全て、抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体５Ｄ１及びＣＲＭ１９７に特異的なモノクローナル抗体１Ｅ６との顕著な反応性を有することが示された。

【図11B】実施例６において構築した融合タンパク質と、抗Ｍ２ｅモノクローナル抗体５Ｄ１及びＣＲＭ１９７モノクローナル抗体１Ｅ６とを使用したウエスタンブロッティングの結果を示す図である。図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ及び１１Ｄのレーン１〜６が示す試料は、図１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ及び１０Ｆのレーン１〜６が示す試料それぞれに対応し、抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体５Ｄ１を使用した。図１１Ｅ、１１Ｆ、１１Ｇ及び１１Ｈのレーン１〜６が示す試料は、図１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ及び１０Ｆのレーン１〜６が示す試料それぞれに対応し、ＣＲＭ１９７に特異的なモノクローナル抗体１Ｅ６を使用した。結果から、試験した融合タンパク質は全て、抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体５Ｄ１及びＣＲＭ１９７に特異的なモノクローナル抗体１Ｅ６との顕著な反応性を有することが示された。

【図11C】実施例６において構築した融合タンパク質と、抗Ｍ２ｅモノクローナル抗体５Ｄ１及びＣＲＭ１９７モノクローナル抗体１Ｅ６とを使用したウエスタンブロッティングの結果を示す図である。図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ及び１１Ｄのレーン１〜６が示す試料は、図１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ及び１０Ｆのレーン１〜６が示す試料それぞれに対応し、抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体５Ｄ１を使用した。図１１Ｅ、１１Ｆ、１１Ｇ及び１１Ｈのレーン１〜６が示す試料は、図１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ及び１０Ｆのレーン１〜６が示す試料それぞれに対応し、ＣＲＭ１９７に特異的なモノクローナル抗体１Ｅ６を使用した。結果から、試験した融合タンパク質は全て、抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体５Ｄ１及びＣＲＭ１９７に特異的なモノクローナル抗体１Ｅ６との顕著な反応性を有することが示された。

【図11D】実施例６において構築した融合タンパク質と、抗Ｍ２ｅモノクローナル抗体５Ｄ１及びＣＲＭ１９７モノクローナル抗体１Ｅ６とを使用したウエスタンブロッティングの結果を示す図である。図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ及び１１Ｄのレーン１〜６が示す試料は、図１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ及び１０Ｆのレーン１〜６が示す試料それぞれに対応し、抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体５Ｄ１を使用した。図１１Ｅ、１１Ｆ、１１Ｇ及び１１Ｈのレーン１〜６が示す試料は、図１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ及び１０Ｆのレーン１〜６が示す試料それぞれに対応し、ＣＲＭ１９７に特異的なモノクローナル抗体１Ｅ６を使用した。結果から、試験した融合タンパク質は全て、抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体５Ｄ１及びＣＲＭ１９７に特異的なモノクローナル抗体１Ｅ６との顕著な反応性を有することが示された。

【図11E】実施例６において構築した融合タンパク質と、抗Ｍ２ｅモノクローナル抗体５Ｄ１及びＣＲＭ１９７モノクローナル抗体１Ｅ６とを使用したウエスタンブロッティングの結果を示す図である。図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ及び１１Ｄのレーン１〜６が示す試料は、図１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ及び１０Ｆのレーン１〜６が示す試料それぞれに対応し、抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体５Ｄ１を使用した。図１１Ｅ、１１Ｆ、１１Ｇ及び１１Ｈのレーン１〜６が示す試料は、図１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ及び１０Ｆのレーン１〜６が示す試料それぞれに対応し、ＣＲＭ１９７に特異的なモノクローナル抗体１Ｅ６を使用した。結果から、試験した融合タンパク質は全て、抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体５Ｄ１及びＣＲＭ１９７に特異的なモノクローナル抗体１Ｅ６との顕著な反応性を有することが示された。

【図11F】実施例６において構築した融合タンパク質と、抗Ｍ２ｅモノクローナル抗体５Ｄ１及びＣＲＭ１９７モノクローナル抗体１Ｅ６とを使用したウエスタンブロッティングの結果を示す図である。図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ及び１１Ｄのレーン１〜６が示す試料は、図１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ及び１０Ｆのレーン１〜６が示す試料それぞれに対応し、抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体５Ｄ１を使用した。図１１Ｅ、１１Ｆ、１１Ｇ及び１１Ｈのレーン１〜６が示す試料は、図１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ及び１０Ｆのレーン１〜６が示す試料それぞれに対応し、ＣＲＭ１９７に特異的なモノクローナル抗体１Ｅ６を使用した。結果から、試験した融合タンパク質は全て、抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体５Ｄ１及びＣＲＭ１９７に特異的なモノクローナル抗体１Ｅ６との顕著な反応性を有することが示された。

【図11G】実施例６において構築した融合タンパク質と、抗Ｍ２ｅモノクローナル抗体５Ｄ１及びＣＲＭ１９７モノクローナル抗体１Ｅ６とを使用したウエスタンブロッティングの結果を示す図である。図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ及び１１Ｄのレーン１〜６が示す試料は、図１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ及び１０Ｆのレーン１〜６が示す試料それぞれに対応し、抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体５Ｄ１を使用した。図１１Ｅ、１１Ｆ、１１Ｇ及び１１Ｈのレーン１〜６が示す試料は、図１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ及び１０Ｆのレーン１〜６が示す試料それぞれに対応し、ＣＲＭ１９７に特異的なモノクローナル抗体１Ｅ６を使用した。結果から、試験した融合タンパク質は全て、抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体５Ｄ１及びＣＲＭ１９７に特異的なモノクローナル抗体１Ｅ６との顕著な反応性を有することが示された。

【図11H】実施例６において構築した融合タンパク質と、抗Ｍ２ｅモノクローナル抗体５Ｄ１及びＣＲＭ１９７モノクローナル抗体１Ｅ６とを使用したウエスタンブロッティングの結果を示す図である。図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ及び１１Ｄのレーン１〜６が示す試料は、図１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ及び１０Ｆのレーン１〜６が示す試料それぞれに対応し、抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体５Ｄ１を使用した。図１１Ｅ、１１Ｆ、１１Ｇ及び１１Ｈのレーン１〜６が示す試料は、図１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ及び１０Ｆのレーン１〜６が示す試料それぞれに対応し、ＣＲＭ１９７に特異的なモノクローナル抗体１Ｅ６を使用した。結果から、試験した融合タンパク質は全て、抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体５Ｄ１及びＣＲＭ１９７に特異的なモノクローナル抗体１Ｅ６との顕著な反応性を有することが示された。

【図12A】実施例６において構築した融合タンパク質及び種々の抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体を使用した間接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。横座標は、ＥＬＩＳＡのための抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体及び抗ＣＲＭ１９７特異的モノクローナル抗体を指し、縦座標は、ＥＬＩＳＡにより同じ抗体希釈度で決定したＯＤの値を指す。図１２Ａは、Ｍ２ｅをＣＲＭ１９７又はその断片のＣ−末端に融合させた融合タンパク質のＥＬＩＳＡの結果を示し、図１２Ｂは、Ｍ２ｅをＣＲＭ１９７又はその断片のＮ−末端に融合させた融合タンパク質のＥＬＩＳＡの結果を示す。結果から、Ｍ２ｅタンパク質及びＣＲＭ１９７又はその断片を含む融合タンパク質は、Ｍ２ｅタンパク質単独と比較して、種々の抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体との反応性を保持するか又は増強することが示された。

【図12B】実施例６において構築した融合タンパク質及び種々の抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体を使用した間接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。横座標は、ＥＬＩＳＡのための抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体及び抗ＣＲＭ１９７特異的モノクローナル抗体を指し、縦座標は、ＥＬＩＳＡにより同じ抗体希釈度で決定したＯＤの値を指す。図１２Ａは、Ｍ２ｅをＣＲＭ１９７又はその断片のＣ−末端に融合させた融合タンパク質のＥＬＩＳＡの結果を示し、図１２Ｂは、Ｍ２ｅをＣＲＭ１９７又はその断片のＮ−末端に融合させた融合タンパク質のＥＬＩＳＡの結果を示す。結果から、Ｍ２ｅタンパク質及びＣＲＭ１９７又はその断片を含む融合タンパク質は、Ｍ２ｅタンパク質単独と比較して、種々の抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体との反応性を保持するか又は増強することが示された。

【図13A】実施例６において構築した融合タンパク質の沈降速度（ＳＶ）の解析の結果を示すグラフである。図１３Ａ：ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅ；図１３Ｂ：３８９−Ｌ−Ｍ２ｅ；図１３Ｃ：Ａ−Ｌ−Ｍ２ｅ；図１３Ｄ：Ｍ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７；図１３Ｅ：Ｍ２ｅ−Ｌ−３８９；図１３Ｆ：Ｍ２ｅ−Ｌ−Ａ。結果から、融合タンパク質のＡ−Ｌ−Ｍ２ｅ及びＭ２ｅ−Ｌ−Ａは、主として単量体及び四量体の形態で存在し、３８９−Ｌ−Ｍ２ｅは、主として二量体及びポリマーの形態で存在し、Ｍ２ｅ−Ｌ−３８９は、主として単量体及びポリマーの形態で存在し、ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅは、主として二量体及びポリマーの形態で存在し、Ｍ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７は、主として単量体及びポリマーの形態で存在することが示された。

【図13B】実施例６において構築した融合タンパク質の沈降速度（ＳＶ）の解析の結果を示すグラフである。図１３Ａ：ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅ；図１３Ｂ：３８９−Ｌ−Ｍ２ｅ；図１３Ｃ：Ａ−Ｌ−Ｍ２ｅ；図１３Ｄ：Ｍ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７；図１３Ｅ：Ｍ２ｅ−Ｌ−３８９；図１３Ｆ：Ｍ２ｅ−Ｌ−Ａ。結果から、融合タンパク質のＡ−Ｌ−Ｍ２ｅ及びＭ２ｅ−Ｌ−Ａは、主として単量体及び四量体の形態で存在し、３８９−Ｌ−Ｍ２ｅは、主として二量体及びポリマーの形態で存在し、Ｍ２ｅ−Ｌ−３８９は、主として単量体及びポリマーの形態で存在し、ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅは、主として二量体及びポリマーの形態で存在し、Ｍ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７は、主として単量体及びポリマーの形態で存在することが示された。

【図13C】実施例６において構築した融合タンパク質の沈降速度（ＳＶ）の解析の結果を示すグラフである。図１３Ａ：ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅ；図１３Ｂ：３８９−Ｌ−Ｍ２ｅ；図１３Ｃ：Ａ−Ｌ−Ｍ２ｅ；図１３Ｄ：Ｍ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７；図１３Ｅ：Ｍ２ｅ−Ｌ−３８９；図１３Ｆ：Ｍ２ｅ−Ｌ−Ａ。結果から、融合タンパク質のＡ−Ｌ−Ｍ２ｅ及びＭ２ｅ−Ｌ−Ａは、主として単量体及び四量体の形態で存在し、３８９−Ｌ−Ｍ２ｅは、主として二量体及びポリマーの形態で存在し、Ｍ２ｅ−Ｌ−３８９は、主として単量体及びポリマーの形態で存在し、ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅは、主として二量体及びポリマーの形態で存在し、Ｍ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７は、主として単量体及びポリマーの形態で存在することが示された。

【図13D】実施例６において構築した融合タンパク質の沈降速度（ＳＶ）の解析の結果を示すグラフである。図１３Ａ：ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅ；図１３Ｂ：３８９−Ｌ−Ｍ２ｅ；図１３Ｃ：Ａ−Ｌ−Ｍ２ｅ；図１３Ｄ：Ｍ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７；図１３Ｅ：Ｍ２ｅ−Ｌ−３８９；図１３Ｆ：Ｍ２ｅ−Ｌ−Ａ。結果から、融合タンパク質のＡ−Ｌ−Ｍ２ｅ及びＭ２ｅ−Ｌ−Ａは、主として単量体及び四量体の形態で存在し、３８９−Ｌ−Ｍ２ｅは、主として二量体及びポリマーの形態で存在し、Ｍ２ｅ−Ｌ−３８９は、主として単量体及びポリマーの形態で存在し、ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅは、主として二量体及びポリマーの形態で存在し、Ｍ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７は、主として単量体及びポリマーの形態で存在することが示された。

【図13E】実施例６において構築した融合タンパク質の沈降速度（ＳＶ）の解析の結果を示すグラフである。図１３Ａ：ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅ；図１３Ｂ：３８９−Ｌ−Ｍ２ｅ；図１３Ｃ：Ａ−Ｌ−Ｍ２ｅ；図１３Ｄ：Ｍ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７；図１３Ｅ：Ｍ２ｅ−Ｌ−３８９；図１３Ｆ：Ｍ２ｅ−Ｌ−Ａ。結果から、融合タンパク質のＡ−Ｌ−Ｍ２ｅ及びＭ２ｅ−Ｌ−Ａは、主として単量体及び四量体の形態で存在し、３８９−Ｌ−Ｍ２ｅは、主として二量体及びポリマーの形態で存在し、Ｍ２ｅ−Ｌ−３８９は、主として単量体及びポリマーの形態で存在し、ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅは、主として二量体及びポリマーの形態で存在し、Ｍ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７は、主として単量体及びポリマーの形態で存在することが示された。

【図13F】実施例６において構築した融合タンパク質の沈降速度（ＳＶ）の解析の結果を示すグラフである。図１３Ａ：ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅ；図１３Ｂ：３８９−Ｌ−Ｍ２ｅ；図１３Ｃ：Ａ−Ｌ−Ｍ２ｅ；図１３Ｄ：Ｍ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７；図１３Ｅ：Ｍ２ｅ−Ｌ−３８９；図１３Ｆ：Ｍ２ｅ−Ｌ−Ａ。結果から、融合タンパク質のＡ−Ｌ−Ｍ２ｅ及びＭ２ｅ−Ｌ−Ａは、主として単量体及び四量体の形態で存在し、３８９−Ｌ−Ｍ２ｅは、主として二量体及びポリマーの形態で存在し、Ｍ２ｅ−Ｌ−３８９は、主として単量体及びポリマーの形態で存在し、ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅは、主として二量体及びポリマーの形態で存在し、Ｍ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７は、主として単量体及びポリマーの形態で存在することが示された。

【図14A】実施例６において構築した融合タンパク質とＧＳＴ−Ｍ２ｅとの間における免疫原性の比較を示すグラフである。一次免疫化を第０週に実施し、追加免疫化を、第２及び４週に実施し、用量は、一次免疫化及び追加免疫化の両方について、５μｇ又は０．５μｇであった。図１４Ａは、５μｇ用量群の免疫血清の抗体価の比較結果を示し、図１４Ｂは、０．５μｇ用量群の免疫血清の抗体価の比較結果を示す。結果から、第２の追加免疫化後の、融合タンパク質が誘発した抗体価は、５μｇ用量群及び０．５μｇ用量群において、ＧＳＴ−Ｍ２ｅ単独よりも顕著に高いことが示された。上記の結果から見られるように、実施例６において構築した融合タンパク質の免疫原性は、抗原タンパク質（ＧＳＴ−Ｍ２ｅ）単独よりも顕著に高く、当該結果は、本発明のＣＲＭ１９７又はその断片は、（融合タンパク質のＮ−末端又はＣ−末端に位置する物質がない）ＣＲＭ１９７又はその断片と融合させた抗原タンパク質の免疫原性を顕著に増強し、分子内アジュバントとして使用することが可能であることを示した。

【図14B】実施例６において構築した融合タンパク質とＧＳＴ−Ｍ２ｅとの間における免疫原性の比較を示すグラフである。一次免疫化を第０週に実施し、追加免疫化を、第２及び４週に実施し、用量は、一次免疫化及び追加免疫化の両方について、５μｇ又は０．５μｇであった。図１４Ａは、５μｇ用量群の免疫血清の抗体価の比較結果を示し、図１４Ｂは、０．５μｇ用量群の免疫血清の抗体価の比較結果を示す。結果から、第２の追加免疫化後の、融合タンパク質が誘発した抗体価は、５μｇ用量群及び０．５μｇ用量群において、ＧＳＴ−Ｍ２ｅ単独よりも顕著に高いことが示された。上記の結果から見られるように、実施例６において構築した融合タンパク質の免疫原性は、抗原タンパク質（ＧＳＴ−Ｍ２ｅ）単独よりも顕著に高く、当該結果は、本発明のＣＲＭ１９７又はその断片は、（融合タンパク質のＮ−末端又はＣ−末端に位置する物質がない）ＣＲＭ１９７又はその断片と融合させた抗原タンパク質の免疫原性を顕著に増強し、分子内アジュバントとして使用することが可能であることを示した。

【発明を実施するための形態】

【0063】

本発明を、以下の実施例を参照することにより例証する（実施例は、本発明を例証するためだけに使用し、本発明を保護する範囲を限度するものではない）。

【0064】

別段の記載がない限り、本発明において使用する分子生物学的実験方法及び免疫学的アッセイは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９５に記載の方法に実質的に従って実施し、制限エンドヌクレアーゼは、製品の製造者が推奨する条件下で使用する。本発明において使用する、製造者が明示されていない試薬は、当技術分野の従来からある製品であるか、又は商業的に入手可能である。当業者であれば、実施例は、本発明を例証するために使用するが、本発明を保護する範囲を限度するものではないことを理解する。

【実施例】

【0065】

実施例１．ＣＲＭ１９７遺伝子のクローン
ＡＴＣＣから得たジフテリア・バチルス（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｃ７（β１９７）菌株（ＮＯ５３２８１）から抽出したゲノムＤＮＡを、ＰＣＲ反応のための鋳型として使用し、順方向プライマーが、ＣＲＭ１９７Ｆ（配列番号１９）であり、逆方向プライマーが、ＣＲＭ１９７Ｒ（配列番号２０）であった。ＰＣＲ反応を、ＰＣＲ装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ Ｔ３）中、以下の条件下で実施して、ＣＲＭ１９７をコードする完全長の遺伝子を調製した。

【表2】

【0066】

ＰＣＲ増幅の後に、約１．６ｋｂの長さの生成物を得た。配列決定の後に、増幅生成物（すなわち、ＣＲＭ１９７の完全長の遺伝子）のヌクレオチド配列（配列番号１）を得、配列番号１がコードするアミノ酸配列を、配列番号２に記載した。

【0067】

実施例２．ＣＲＭ１９７又はその断片及びＨＥＶキャプシドタンパク質の断片を含む融合タンパク質の設計及びクローン
実施例では、融合タンパク質を発現するベクターを、例として構築した。構築した種々の例示的な融合タンパク質のクローン設計を、図１に示し、図中、融合タンパク質はそれぞれ、ＣＲＭ１９７又はその断片及びＨＥＶキャプシドタンパク質の断片を、場合によりリンカーを使用して含む。

【0068】

リンカーを含む融合タンパク質のクローン
実施例１で得た増幅生成物（すなわち、ＣＲＭ１９７の完全長の遺伝子）を、鋳型として使用した。順方向プライマーが、ＣＲＭ１９７Ｆ（配列番号１９）であり、当該プライマーの５’末端に、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ部位ＣＡＴ ＡＴＧを導入し、ＡＴＧは、イー・コライ系における開始コドンであった。逆方向プライマーは、ＣＲＭ１９７−リンカーＲ（配列番号２１）、３８９−リンカーＲ（配列番号２２）、及びＡ−リンカーＲ（配列番号２３）であり、それぞれ、当該プライマーの５’末端に、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ部位ＧＧＡ ＴＣＣを導入した。ＰＣＲ反応を、ＰＣＲサーモサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ Ｔ３）中、以下の条件下で実施した。使用したプライマーの配列を、表１に示した。

【表3】

【0069】

増幅生成物はそれぞれ、約１６００ｂｐ、１２００ｂｐ及び６００ｂｐの長さのＤＮＡ断片であった。

【0070】

さらに、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｅ２（Ｌｉら、ＪＢＣ、２００５、２８（５）：３４００〜３４０６）も、鋳型として使用した。順方向プライマーが、Ｅ２Ｆ（配列番号２４）及びＥ２ｓＦ（配列番号２５）であり、それぞれ、当該プライマーの５’末端に、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ部位ＧＧＡ ＴＣＣを導入した。逆方向プライマーが、Ｄｒｐ５９Ｒ（配列番号２６）であり、当該プライマーの５’末端に、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ部位ＧＡＡ ＴＴＣを導入した。ＰＣＲ反応を、ＰＣＲサーモサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ Ｔ３）中、以下の条件下で実施した。

【表4】

【0071】

増幅生成物はそれぞれ、約６００ｂｐ及び４５０ｂｐの長さのＤＮＡ断片であった。

【0072】

上記で得た増幅生成物をそれぞれ、商業的に入手可能なｐＭＤ１８−Ｔベクター（ＴＡＫＡＲＡ Ｃｏ．製）中に連結し、ｐＭＤ１８−Ｔ−ＣＲＭ１９７−Ｌ、ｐＭＤ１８−Ｔ−３８９−Ｌ及びｐＭＤ１８−Ｔ−Ａ−Ｌ、並びにｐＭＤ１８−Ｔ−Ｅ２及びｐＭＤ１８−Ｔ−Ｅ２ｓと名付けた。ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ及びＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ酵素切断により同定して、それぞれ、陽性クローンのｐＭＤ１８−Ｔ−ＣＲＭ１９７−Ｌ、ｐＭＤ１８−Ｔ−３８９−Ｌ、ｐＭＤ１８−Ｔ−Ａ−Ｌ、ｐＭＤ１８−Ｔ−Ｅ２及びｐＭＤ１８−Ｔ−Ｅ２ｓを得た。

【0073】

Ｍ１３（＋）プライマーにより確認すると、目的の正しいヌクレオチド配列が、得られたｐＭＤ１８−Ｔ−ＣＲＭ１９７−Ｌ、ｐＭＤ１８−Ｔ−３８９−Ｌ、ｐＭＤ１８−Ｔ−Ａ−Ｌ、ｐＭＤ１８−Ｔ−Ｅ２及びｐＭＤ１８−Ｔ−Ｅ２ｓのそれぞれ中に挿入されていた。

【0074】

プラスミドのｐＭＤ１８−Ｔ−ＣＲＭ１９７−Ｌ、ｐＭＤ１８−Ｔ−３８９−Ｌ及びｐＭＤ１８−Ｔ−Ａ−Ｌを、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ酵素により消化した。酵素切断により得られた断片を、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ酵素により消化した原核生物発現ベクターｐＴＯ−Ｔ７（Ｌｕｏ Ｗｅｎｘｉｎら、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０００、１６：５３〜５７）中に連結し、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．から購入した）イー・コライＥＲ２５６６中に形質転換した。プラスミドの抽出の後、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ酵素切断により同定して、ＣＲＭ１９７−Ｌ、３８９−Ｌ及びＡ−Ｌが挿入されている、陽性プラスミドのｐＴＯ−Ｔ７−ＣＲＭ１９７−Ｌ、ｐＴＯ−Ｔ７−３８９−Ｌ及びｐＴＯ−Ｔ７−Ａ−Ｌをそれぞれ得た。

【0075】

ｐＴＯ−Ｔ７−ＣＲＭ１９７−Ｌ、ｐＴＯ−Ｔ７−３８９−Ｌ、ｐＴＯ−Ｔ７−Ａ−Ｌ、ｐＭＤ１８−Ｔ−Ｅ２及びｐＭＤ１８−Ｔ−Ｅ２ｓを、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ酵素により消化した。得られたＥ２断片及びＥ２ｓ断片のそれぞれを、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ酵素により消化したベクターのｐＴＯ−Ｔ７−ＣＲＭ１９７−Ｌ、ｐＴＯ−Ｔ７−３８９−Ｌ及びｐＴＯ−Ｔ７−Ａ−Ｌのそれぞれ中に連結した。ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ酵素切断により同定して、ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｅ２（配列番号３、４）、ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｅ２ｓ（配列番号５、６）、３８９−Ｌ−Ｅ２（配列番号７、８）、３８９−Ｌ−Ｅ２ｓ（配列番号９、１０）、Ａ−Ｌ−Ｅ２（配列番号１１、１２）又はＡ−Ｌ−Ｅ２ｓ（配列番号１３、１４）が挿入されている、陽性の発現ベクターのｐＴＯ−Ｔ７−ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｅ２、ｐＴＯ−Ｔ７−ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｅ２ｓ、ｐＴＯ−Ｔ７−３８９−Ｌ−Ｅ２、ｐＴＯ−Ｔ７−３８９−Ｌ−Ｅ２ｓ、ｐＴＯ−Ｔ７−Ａ−Ｌ−Ｅ２及びｐＴＯ−Ｔ７−Ａ−Ｌ−Ｅ２ｓをそれぞれ得た。

【0076】

リンカーを有さない融合タンパク質３８９−Ｅ２ｓ及び融合タンパク質Ａ−Ｅ２ｓのクローン
３８９−Ｅ２ｓ及びＡ−Ｅ２ｓを発現するベクターを、３つのＰＣＲ反応により構築した。第１のＰＣＲ反応のために、ＣＲＭ１９７の完全長の遺伝子を、鋳型として使用した。順方向プライマーが、ＣＲＭ１９７Ｆであり、当該プライマーの５’末端に、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ部位ＣＡＴ ＡＴＧを導入し、ＡＴＧは、イー・コライ系における開始コドンであった。逆方向プライマーがそれぞれ、３８９−Ｅ２ｓＲ（配列番号２７）及びＡ−Ｅ２ｓＲ（配列番号２８）であった。増幅を実施して、融合タンパク質のＮ−末端断片を得た。第２のＰＣＲ反応のために、ＣＲＭ１９７の完全長の遺伝子を、鋳型として使用した。順方向プライマーがそれぞれ、３８９−Ｅ２ｓＦ（配列番号２９）及びＡ−Ｅ２ｓＦ（配列番号３０）であった。逆方向プライマーが、ＤｒＰ５９Ｒであり、当該プライマーの５’末端に、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ部位ＧＡＡ ＴＴＣを導入した。増幅を実施して、融合タンパク質のＣ−末端断片を得た。第１及び第２のＰＣＲ反応を、ＰＣＲサーモサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ Ｔ３）中、以下の条件下で実施した。

【表5】

【0077】

第３のＰＣＲ反応のために、第１及び第２のＰＣＲ反応の増幅生成物を、鋳型として使用し（例えば、３８９−Ｅ２ｓＦ及び３８９−Ｅ２ｓＲをプライマーとして使用することによって得た２つの断片を鋳型として使用して、３８９−Ｅ２ｓの増幅を行った）、ＣＲＭ１９７Ｆ及びＤｒＰ５９Ｒを、プライマーとして使用した。増幅を、ＰＣＲサーモサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ Ｔ３）中、以下の条件下で実施した。

【表6】

【0078】

増幅生成物はそれぞれ、約１６００ｂｐ及び１０００ｂｐの長さのＤＮＡ断片であった。上記で得た増幅生成物をそれぞれ、商業的に入手可能なｐＭＤ１８−Ｔベクター（ＴＡＫＡＲＡ Ｃｏ．製）中に連結した。ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ酵素切断により同定して、陽性クローンのｐＭＤ１８−Ｔ−３８９−Ｅ２ｓ及びｐＭＤ１８−Ｔ−Ａ−Ｅ２ｓを得た。

【0079】

Ｍ１３（＋）プライマーにより確認すると、配列番号１５及び配列番号１７の正しいヌクレオチド配列（当該ヌクレオチド配列はそれぞれ、配列番号１６及び配列番号１８のアミノ酸配列をコードした）がそれぞれ、得られたｐＭＤ１８−Ｔ−３８９−Ｅ２ｓ及びｐＭＤ１８−Ｔ−Ａ−Ｅ２ｓ中に挿入されていた。

【0080】

プラスミドのｐＭＤ１８−Ｔ−３８９−Ｅ２ｓ及びｐＭＤ１８−Ｔ−Ａ−Ｅ２ｓを、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ酵素により消化した。次いで、酵素切断により得られた断片を、ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ酵素により消化した原核生物発現ベクターｐＴＯ−Ｔ７中に連結した（Ｌｕｏ Ｗｅｎｘｉｎら、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０００、１６：５３〜５７）。ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ酵素切断により同定して、３８９−Ｅ２ｓ及びＡ−Ｅ２ｓが挿入されている、陽性プラスミドのｐＴＯ−Ｔ７−３８９−Ｅ２ｓ及びｐＴＯ−Ｔ７−Ａ−Ｅ２ｓをそれぞれ得た。

【0081】

実施例で使用したプライマーの配列を、表１に示した。

【表7】

【0082】

プラスミドのｐＴＯ−Ｔ７−ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｅ２、ｐＴＯ−Ｔ７−ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｅ２ｓ、ｐＴＯ−Ｔ７−３８９−Ｌ−Ｅ２、ｐＴＯ−Ｔ７−３８９−Ｌ−Ｅ２ｓ、ｐＴＯ−Ｔ７−３８９−Ｅ２ｓ、ｐＴＯ−Ｔ７−Ａ−Ｌ−Ｅ２、ｐＴＯ−Ｔ７−Ａ−Ｌ−Ｅ２ｓ及びｐＴＯ−Ｔ７−Ａ−Ｅ２ｓ（０．１５ｍｇ／ｍｌ）の１μＬを、別個に使用して、塩化カルシウム法により調製したコンピテントな（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した）イー・コライＥＲ２５６６の４０μＬを形質転換し、次いで、細菌を、カナマイシン（１００ｍｇ／ｍｌの最終濃度；以下、同じ）を含有する固体ＬＢ培地（ＬＢ培地の構成成分：１０ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌ酵母粉末及び１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ；以下、同じ）上に蒔いた。プレートを、個々のコロニーを明らかに観察することができるようになるまで、３７℃で約１０〜１２時間静止状態でインキュベートした。個々のコロニーを、プレートから、カナマイシンを含有する液体ＬＢ培地の４ｍｌを含有するチューブに移動させた。培養物を、振とうインキュベーター中、１８０ｒｐｍ、３７℃で１０ｈ時間インキュベートし、次いで、１ｍｌの細菌溶液を採取し、−７０℃で保存した。

【0083】

実施例３．実施例２において構築した融合タンパク質の発現及び精製
融合タンパク質の発現及び封入体の精製
−７０℃の極低温フリーザーから取った５μＬの細菌溶液を、カナマイシンを含有する液体ＬＢ培地の５ｍＬに播種し、次いで、ＯＤ６００が約０．５に達するまで、１８０ｒｐｍで振とうしながら、３７℃で培養した。得られた溶液を、カナマイシンを含有するＬＢ培地の５００ｍｌに移動させ、次いで、１８０ｒｐｍで振とうしながら、３７℃で４〜５時間培養した。ＯＤ６００が約１．５に達したら、ＩＰＴＧを添加して、０．４ｍＭの最終濃度を得、細菌を、振とうしながら３７℃で４時間誘発した。

【0084】

誘発後に、遠心分離を８０００ｇで５分間実施して、細菌を収集し、次いで、細菌を、氷浴中で、溶解用溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．２、３００ｍＭ ＮａＣｌ）中に、１ｇの細菌対１０ｍＬの溶解用溶液の比で再懸濁させた。細菌を、超音波処理器（Ｓｏｎｉｃｓ ＶＣＸ７５０ Ｔｙｐｅ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて処理した（条件：作動時間：１５分、パルス：２秒、中断：４秒、アウトプット出力：５５％）。細菌の溶解液を、１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し（以下、同じ）、上清を廃棄し、沈殿物（すなわち、封入体）を残した。同じ体積の２％Ｔｒｉｔｏｎ−１００を使用して、洗浄し、結果として得た混合物を、振動下に３０分間置き、遠心分離し、上清を廃棄した。沈殿物を、緩衝液Ｉ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）中に、振動下で３０分かけて再懸濁させ、遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、沈殿物を、２Ｍ尿素中に、振動下、３７℃で３０分かけて再懸濁させ、遠心分離し、上清及び沈殿物を得た。上清を残し、沈殿物を、同じ体積の４Ｍ尿素中に、振動下、３７℃で３０分かけて再懸濁させ、１２０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離して、上清及び沈殿物を得た。上清（すなわち、４Ｍ尿素で溶解させた上清）を残し、沈殿物を、同じ体積の８Ｍ尿素中に、振動下、３７℃で３０分かけてさらに再懸濁させ、遠心分離し、上清（すなわち、８Ｍ尿素で溶解させた上清）を残した。

【0085】

得られた画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を、図２に示した（クーマシーブリリアントブルー染色を使用して、可視化した。以下、同じ。Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ、２版中の方法を参照されたい）。結果から、融合タンパク質が封入体中で発現し（図２Ａを参照されたい）、ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｅ２、３８９−Ｌ−Ｅ２、Ａ−Ｌ−Ｅ２及びＡ−Ｅ２ｓは、主として４Ｍ尿素中に溶解し（図２Ｂを参照されたい）、ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｅ２ｓ、３８９−Ｌ−Ｅ２ｓ、Ａ−Ｌ−Ｅ２ｓ及び３８９−Ｅ２ｓは、主として８Ｍ尿素中に溶解する（図２Ｃを参照されたい）ことが示された。融合タンパク質を含有する４Ｍ尿素で溶解させた上清又は８Ｍ尿素で溶解させた上清をそれぞれ、ＰＢＳに対して透析して、約８０％の純度を有する融合タンパク質を得た（図２Ｄを参照されたい）。

【0086】

融合タンパク質Ａ−Ｌ−Ｅ２の、アニオン交換クロマトグラフィーによる精製
試料：上記で得た、約８０％の純度を有するＡ−Ｌ−Ｅ２タンパク質の溶液。
機器：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（すなわち、元々は、Ａｍｅｒｓｈａｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃｏ．）製のＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００調製用液体クロマトグラフィーシステム
クロマトグラフィー用の媒体：Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏ．）
カラム体積：１５ｍｍ×２０ｃｍ
緩衝液：２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．７＋４Ｍ尿素
２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．７＋４Ｍ尿素＋１Ｍ ＮａＣｌ
流速：６ｍＬ／分
検出器の波長：２８０ｎｍ
溶出プロトコール：目的のタンパク質を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを用いて溶出し、望まれないタンパク質を、３００ｍＭ ＮａＣｌを用いて溶出し、１５０ｍＭ ＮａＣｌを用いて溶出した画分を収集する。

【0087】

融合タンパク質Ａ−Ｌ−Ｅ２の、疎水性相互作用クロマトグラフィーによる精製
機器：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（すなわち、元々は、Ａｍｅｒｓｈａｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃｏ．）製のＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００調製用液体クロマトグラフィーシステム
クロマトグラフィー用の媒体：Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏ．）
カラム体積：１５ｍｍ×２０ｃｍ
緩衝液：２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．７＋４Ｍ尿素＋０．５Ｍ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４
２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．７＋４Ｍ
流速：５ｍＬ／分
検出器の波長：２８０ｎｍ
試料：以前のステップにおいて得た、１５０ｍＭ ＮａＣｌを用いて溶出した画分を、緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．７＋４Ｍ尿素＋０．５Ｍ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）に対して透析し、次いで、試料として使用した。
溶出プロトコール：望まれないタンパク質を、０．３Ｍ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を用いて溶出し、目的のタンパク質を、０．１Ｍ及び０Ｍの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を用いて溶出し、０．１Ｍ及び０Ｍの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を用いて溶出した画分を収集する。

【0088】

０．１Ｍ及び０Ｍの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を用いて溶出した画分を、ＰＢＳ中に透析及び再生し、次いで、１０μｌを取って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行い、電気泳動バンドを、クーマシーブリリアントブルー染色により可視化した。結果から、上記の精製ステップの後に、融合タンパク質Ａ−Ｌ−Ｅ２は、９０％超の純度を有することが示された（図３を参照されたい）。

【0089】

実施例４．実施例２において構築した融合タンパク質の特性の解析
融合タンパク質の抗体との反応性の、ウエスタンブロッティングによる決定
ＨＥＶ中和モノクローナル抗体８Ｃ１１（Ｚｈａｎｇら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２３（２２）：２８８１〜２８９２（２００５）を参照されたい）及び抗ＣＲＭ１９７ポリクローナル抗血清（当該血清は、当技術分野で周知の方法を通して、ＣＲＭ１９７を用いてマウスを免疫化することによって調製し、血清の反応性を、商業的に入手可能なＣＲＭ１９７により確認した）との融合タンパク質の反応性を、ウエスタンブロッティングにより決定した。透析及び再生した試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離の後に、ニトロセルロース膜に移動させて、ブロッティングを行った。５％脱脂粉乳を使用して、膜を２時間ブロックし、次いで、特定の比に希釈したモノクローナル抗体８Ｃ１１を添加し（モノクローナル抗体を１：５００に希釈し、ポリクローナル抗血清を１：１０００に希釈した）、反応を１時間行った。膜を、ＴＮＴ（５０ミリモル／Ｌ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１５０ミリモル／Ｌ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて、各回１０分３回にわたり洗浄した。次いで、ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ（ＫＰＬ製）を添加し、反応を１時間行い、次いで、膜を、ＴＮＴを用いて、各回１０分３回にわたり洗浄した。ＮＢＴ及びＢＣＩＰ（ＰＲＯＴＯＳ製）を使用して、可視化した。融合タンパク質及びＨＥＶ中和モノクローナル抗体８Ｃ１１を使用してウエスタンブロッティングにより決定した結果を、図４に示した。結果から、試験した融合タンパク質は全て、ＨＥＶ中和モノクローナル抗体８Ｃ１１との顕著な反応性を有することが示された。

【0090】

融合タンパク質の種々のＨＥＶ特異的抗体との反応性の、ＥＬＩＳＡによる決定
融合タンパク質並びに対照タンパク質であるＥ２及びＨＥＶ−２３９の、種々のＨＥＶ特異的抗体（Ｇｕ Ｙｉｎｇら、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９（３）：２１７〜２２３（２００３））との反応性を、間接ＥＬＩＳＡにより決定した。透析及び再生した試料を、１×ＰＢＳ（１μｇ／ｍｌ）中に希釈し、次いで、９６ウエルマイクロプレート（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｃｏ．）に１００μｌ／ウエルで添加し、３７℃で２時間インキュベートした。コーティング溶液を廃棄し、プレートを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて１回洗浄し、次いで、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中の２％ゼラチン、５‰カゼイン、１‰プロクリン３００）を、２００μｌ／ウエルで添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ブロッキング溶液を廃棄して、検出を実施し、特定の比に希釈したＨＥＶモノクローナル抗体（Ｅ２ｓ及びＥ２ｓの融合タンパク質を検出する場合、それらを１：１００００に希釈した。Ｅ２及びＥ２の融合タンパク質を検出する場合、それらを１：１０００００に希釈した。Ａ−Ｌ−Ｅ２、２３９及びＥ２タンパク質の反応性を比較する場合、モノクローナル抗体は、１０倍段階希釈に付し、１ｍｇ／ｍｌを、最初の濃度として使用し、ポリクローナル抗体は、その最初の濃度から、同じように希釈に付した）を、１００μｌ／ウエルで添加した。混合物を、３７℃で１〜２時間インキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳＴを用いて５回にわたり洗浄し、次いで、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウス（ＫＰＬ製）（１：５０００）を、１００μｌ／ウエルで添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳＴを用いて５回にわたり洗浄し、次いで、ＨＲＰの基質（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｃｏ．）を、１００μｌ／ウエルで添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。２Ｍ硫酸を５０μｌ／ウエルで添加して、反応を止め、次いで、マイクロプレートリーダー（Ｓｕｎｒｉｓｅ Ｔｙｐｅ、Ｔｅｃａｎ Ｃｏ．製）を使用して、ＯＤ４５０／６２０の値を読み取った。融合タンパク質とモノクローナル抗体とを使用したＥＬＩＳＡの結果を、図５に示す。結果から、Ｅ２ｓタンパク質のＣＲＭ１９７又はその断片との融合の後に、Ｅ２ｓタンパク質のモノクローナル抗体との反応性が顕著に増強され、Ａ−Ｌ−Ｅ２ｓ及びＡ−Ｅ２ｓの反応性が最も顕著に増強され、Ｅ２タンパク質のＣＲＭ１９７又はその断片との融合の後に、Ｅ２タンパク質のＨＥＶに特異的なモノクローナル抗体との反応性は、保持されるか又は増強されることが示された。

【0091】

クロマトグラフィーにより精製した融合タンパク質Ａ−Ｌ−Ｅ２の反応性の解析
二段階クロマトグラフィーにより精製した融合タンパク質Ａ−Ｌ−Ｅ２の反応性を、間接ＥＬＩＳＡにより解析した（以前のステップにおける具体的なプロセスを参照されたい）。ＥＬＩＳＡの結果を、図６に示した。結果から、Ａ−Ｌ−Ｅ２のＨＥＶに特異的なモノクローナル抗体との反応性は、対照タンパク質のＨＥＶ−２３９及びＥ２の反応性に匹敵することが示された。

【0092】

融合タンパク質Ａ−Ｌ−Ｅ２の沈降速度（ＳＶ）の解析
実験で使用する装置は、米国のＢｅｃｋｍａｎ ＸＬ−Ａ解析用超遠心分離機であり、当該遠心分離機には、光学的検出システム、並びにＡｎ−５０Ｔｉ回転子及びＡｎ−６０Ｔｉ回転子が装備されていた。沈降速度（ＳＶ）法（ｃ（ｓ）アルゴリズム、Ｐ．Ｓｃｈｕｃｋら、Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ、７８：１６０６〜１６１９（２０００）を参照されたい）を使用して、融合タンパク質Ａ−Ｌ−Ｅ２の沈降係数を解析した。解析の結果を、図７に示す。結果から、融合タンパク質Ａ−Ｌ−Ｅ２は、主として二量体の形態で存在し、二量体の中には、さらに重合して、四量体を形成することができるものがあることが示された。

【0093】

実施例５．実施例２において構築した融合タンパク質の免疫原性の解析
融合タンパク質が誘発する抗体価
実験で使用したマウスは、雌、６週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスであった。アルミニウムアジュバントを使用することによって、マウスを、実施例３の方法により調製し、ＰＢＳに再生した融合タンパク質並びに対照タンパク質のＨＥＶ−２３９、Ｅ２及びＥ２ｓそれぞれの腹腔内注射により免疫化した。注射体積は１ｍｌであり、２つの投与群（５μｇ用量群又は０．５μｇ用量群）を使用した。一次免疫化を第０週に実施し、追加免疫化を、第２及び４週に実施した。

【0094】

ＨＥＶ−２３９を使用して、プレートをコーティングし、融合タンパク質及び対照タンパク質が誘発した血清中の抗体価を、上記したアッセイに類似する間接ＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。免疫化後３カ月以内の血清抗体価の検出結果を、図８に示した。結果から、マウス血清中の血清転換が、５μｇ用量群及び０．５μｇ用量群の両方において、第４週に生じ、抗体価は、第５又は６週に、最も高い値に達することが示された。特に、５μｇ用量群では、Ａ−Ｌ−Ｅ２を使用する場合に、最も高い抗体価が得られ、抗体価は、第６週に１０^６に達し、融合タンパク質が誘発した抗体価は、ＨＥＶ−２３９タンパク質が誘発した抗体価より高いか又はＨＥＶ−２３９タンパク質が誘発した抗体価に匹敵した。０．５μｇ用量群では、融合タンパク質の抗体価は、ＨＥＶ−２３９の抗体価よりも顕著に高く、Ａ−Ｌ−Ｅ２タンパク質が誘発した抗体価は、第５週に１０^６に達した。さらに、５μｇ用量群においても０．５μｇ用量群においても、Ｅ２及びＥ２ｓを使用した場合、免疫血清中の血清転換は生じなかった。上記の結果から見られるように、構築した融合タンパク質の免疫原性は、抗原タンパク質（Ｅ２及びＥ２ｓ）単独よりも顕著に高く、当該結果は、本発明のＣＲＭ１９７又はその断片は、ＣＲＭ１９７又はその断片と融合させた抗原タンパク質の免疫原性を顕著に増強し、分子内アジュバントとして使用することが可能であることを示した。

【0095】

融合タンパク質Ａ−Ｌ−Ｅ２の有効用量の中央値（ＥＤ５０）に関する検討
実験において、融合タンパク質の免疫原性を、有効用量の中央値（ＥＤ５０）を決定することによって検討した。使用した実験動物は、３〜４週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスであった。Ａ−Ｌ−Ｅ２は、アルミニウムアジュバントと混合し、初回用量は、１μｇ／マウスであり、１：３の段階希釈に付し、結果として、全部で８つの投与群を得た。さらに、ＨＥＶ−２３９（ＨＥＶ組換えワクチン）を、対照として使用し、初回用量は、１．６μｇ／マウスであり、１：４の段階希釈に付し、結果として、全部で４つの投与群も得た。６匹のマウスを、各群で使用した。免疫化を、単回の腹腔内注射により実施した。

【0096】

末梢静脈血を、免疫化の４週間後に採取し、血清を分離し、血清転換率を、上記したＥＬＩＳＡアッセイにより決定した。１００倍希釈した血清のＥＬＩＳＡの値が、カットオフ値（すなわち、陰性の値の平均の３倍）よりも高い場合、血清を陽性とみなした。有効用量の中央値（ＥＤ５０）を、リード−ミュンヒの方法により計算した。融合タンパク質Ａ−Ｌ−Ｅ２の血清転換率を、表２に示し、ＨＥＶ−２３９ワクチンの血清転換率を、表３に示した。

【0097】

【表8】

【0098】

【表9】

【0099】

結果から、ＨＥＶ−２３９のＥＤ５０は、Ａ−Ｌ−Ｅ２のＥＤ５０の１１倍であることが示され、当該結果は、本発明のＣＲＭ１９７又はその断片は、ＣＲＭ１９７又はその断片と融合させた抗原タンパク質の免疫原性を顕著に増強し、分子内アジュバントとして使用することが可能であることを示した。同時に、融合タンパク質Ａ−Ｌ−Ｅ２の免疫原性は、ウイルス様粒子の形態をとるＨＥＶ−２３９ワクチンの免疫原性よりも顕著に高かったことから、融合タンパク質を使用して、Ｅ型肝炎により有効である新しいワクチンを調製することもできるであろう。

【0100】

実施例６．ＣＲＭ１９７又はその断片及びインフルエンザウイルスＭ２ｅタンパク質を含む融合タンパク質の設計及びクローン
実施例では、融合タンパク質を発現するベクターを、例として構築した。構築した例示的な融合タンパク質のクローン設計を、図９に示し、図中、融合タンパク質はそれぞれ、ＣＲＭ１９７又はその断片及びインフルエンザウイルスＭ２ｅタンパク質を、場合によりリンカーを使用して含む。

【0101】

融合タンパク質のクローン
ＣＲＭ１９７又はその断片のＣ−末端に融合させたＭ２ｅ
実施例１で得た増幅生成物（すなわち、ＣＲＭ１９７の完全長の遺伝子）を、鋳型として使用した。順方向プライマーが、ＣＲＭ１９７Ｆ１（配列番号４５）であり、当該プライマーの５’末端に、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ部位ＣＡＴ ＡＴＧを導入し、ＡＴＧは、イー・コライ系における開始コドンであった。逆方向プライマーが、ＣＲＭ１９７−リンカーＲ１（配列番号４６）、３８９−リンカーＲ１（配列番号４７）、及びＡ−リンカーＲ１（配列番号４８）であり、それぞれ、当該プライマーの５’末端に、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ部位ＧＧＡ ＴＣＣを導入した。ＰＣＲ反応を、ＰＣＲサーモサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ Ｔ３）中、以下の条件下で実施した。使用したプライマーの配列を、表４に示した。

【表10】

【0102】

増幅生成物はそれぞれ、約１６００ｂｐ、１２００ｂｐ及び６００ｂｐの長さのＤＮＡ断片であった。

【0103】

さらに、（我々の研究室に保存されている、Ｍ２の完全長の遺伝子を含む）プラスミドＰＨＷ２０００も、鋳型として使用した。順方向プライマーが、Ｍ２ｅＦ１（配列番号４９）であり、当該プライマーの５’末端に、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ ＧＧＡ ＴＣＣを導入した。逆方向プライマーが、Ｍ２ｅＲ（配列番号５０）であり、当該プライマーの５’末端に、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ部位ＧＡＡ ＴＴＣを導入した。ＰＣＲ反応を、ＰＣＲサーモサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ Ｔ３）中、以下の条件下で実施した。使用したプライマーの配列を、表４に示した。

【表11】

【0104】

増幅生成物はそれぞれ、約７０ｂｐの長さのＤＮＡ断片であった。

【0105】

上記で得た増幅生成物をそれぞれ、商業的に入手可能なｐＭＤ１８−Ｔベクター（ＴＡＫＡＲＡ Ｃｏ．製）中に連結し、ｐＭＤ１８−Ｔ−ＣＲＭ１９７−Ｌ１、ｐＭＤ１８−Ｔ−３８９−Ｌ１及びｐＭＤ１８−Ｔ−Ａ−Ｌ１、並びにｐＭＤ１８−Ｔ−Ｍ２ｅと名付けた。ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ及びＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ酵素切断により同定して、それぞれ、陽性クローンのｐＭＤ１８−Ｔ−ＣＲＭ１９７−Ｌ１、ｐＭＤ１８−Ｔ−３８９−Ｌ１、ｐＭＤ１８−Ｔ−Ａ−Ｌ１及びｐＭＤ１８−Ｔ−Ｍ２ｅを得た。

【0106】

Ｍ１３（＋）プライマーにより確認すると、目的の正しいヌクレオチド配列が、得られたプラスミドのｐＭＤ１８−Ｔ−ＣＲＭ１９７−Ｌ１、ｐＭＤ１８−Ｔ−３８９−Ｌ１、ｐＭＤ１８−Ｔ−Ａ−Ｌ１及びｐＭＤ１８−Ｔ−Ｍ２ｅ中に挿入されていた。

【0107】

プラスミドのｐＭＤ１８−Ｔ−ＣＲＭ１９７−Ｌ１、ｐＭＤ１８−Ｔ−３８９−Ｌ１及びｐＭＤ１８−Ｔ−Ａ−Ｌ１を、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ酵素により消化した。酵素切断により得られた断片を、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ酵素により消化した原核生物発現ベクターｐＴＯ−Ｔ７（Ｌｕｏ Ｗｅｎｘｉｎら、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０００、１６：５３〜５７）中に連結し、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．から購入した）イー・コライＥＲ２５６６中に形質転換した。プラスミドの抽出の後、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ酵素切断により同定して、断片のＣＲＭ１９７−Ｌ１、３８９−Ｌ１及びＡ−Ｌ１が挿入されている、陽性プラスミドのｐＴＯ−Ｔ７−ＣＲＭ１９７−Ｌ１、ｐＴＯ−Ｔ７−３８９−Ｌ１及びｐＴＯ−Ｔ７−Ａ−Ｌ１をそれぞれ得た。

【0108】

ｐＴＯ−Ｔ７−ＣＲＭ１９７−Ｌ１、ｐＴＯ−Ｔ７−３８９−Ｌ１、ｐＴＯ−Ｔ７−Ａ−Ｌ１及びｐＭＤ１８−Ｔ−Ｍ２ｅを、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ酵素により消化した。得られたＭ２ｅ断片を、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ酵素により消化したベクターのｐＴＯ−Ｔ７−ＣＲＭ１９７−Ｌ１、ｐＴＯ−Ｔ７−３８９−Ｌ１及びｐＴＯ−Ｔ７−Ａ−Ｌ１のそれぞれ中に連結した。ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ酵素切断により同定して、ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅ（配列番号３３、３４）、３８９−Ｌ−Ｍ２ｅ（配列番号３５、３６）又はＡ−Ｌ−Ｍ２ｅ（配列番号３７、３８）が挿入されている、陽性の発現ベクターのｐＴＯ−Ｔ７−ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅ、ｐＴＯ−Ｔ７−３８９−Ｌ−Ｍ２ｅ及びｐＴＯ−Ｔ７−Ａ−Ｌ−Ｍ２ｅをそれぞれ得た。

【0109】

ＣＲＭ１９７又はその断片のＮ−末端に融合させたＭ２ｅ。
（我々の研究室に保存されている、Ｍ２の完全長の遺伝子を含有する）プラスミドＰＨＷ２０００を、鋳型として使用した。順方向プライマーが、Ｍ２ｅＦ２（配列番号５１）であり、当該プライマーの５’末端に、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ部位ＣＡＴ ＡＴＧを導入し、ＡＴＧは、イー・コライ系における開始コドンであった。逆方向プライマーが、Ｍ２ｅ−リンカーＲ（配列番号５２）であり、当該プライマーの５’末端に、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ ＧＧＡ ＴＣＣを導入した。ＰＣＲ反応を、ＰＣＲサーモサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ Ｔ３）中、以下の条件下で実施した。

【表12】

【0110】

増幅生成物は、約１００ｂｐの長さのＤＮＡ断片であった。

【0111】

さらに、実施例１で得た増幅生成物（すなわち、ＣＲＭ１９７の完全長の遺伝子）を、鋳型として使用した。順方向プライマーが、ＣＲＭ１９７Ｆ２（配列番号５３）であり、当該プライマーの５’末端に、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ ＧＧＡ ＴＣＣを導入した。逆方向プライマーが、ＣＲＭ１９７Ｒ２（配列番号５４）、３８９Ｒ（配列番号５５）及びＡＲ（配列番号５６）であり、当該プライマーの５’末端に、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ部位ＧＡＡ ＴＴＣを導入した。ＰＣＲ反応を、ＰＣＲサーモサイクラー（Ｂｉｏｍｅｔｒａ Ｔ３）中、以下の条件下で実施した。使用したプライマーの配列を、表４に示した。

【表13】

【0112】

増幅生成物はそれぞれ、約１６００ｂｐ、１２００ｂｐ及び６００ｂｐの長さのＤＮＡ断片であった。

【0113】

上記で得た増幅生成物をそれぞれ、商業的に入手可能なｐＭＤ１８−Ｔベクター（ＴＡＫＡＲＡ Ｃｏ．製）中に連結し、それぞれ、ｐＭＤ１８−Ｔ−Ｍ２ｅ−Ｌ、並びにｐＭＤ１８−Ｔ−ＣＲＭ１９７、ｐＭＤ１８−Ｔ−３８９及びｐＭＤ１８−Ｔ−Ａと名付けた。ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ及びＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ酵素切断により同定して、陽性クローンのｐＭＤ１８−Ｔ−ＣＲＭ１９７、ｐＭＤ１８−Ｔ−３８９、ｐＭＤ１８−Ｔ−Ａ及びｐＭＤ１８−Ｔ−Ｍ２ｅ−Ｌをそれぞれ得た。

【0114】

Ｍ１３（＋）プライマーにより確認すると、目的の正しいヌクレオチド配列が、得られたプラスミドのｐＭＤ１８−Ｔ−ＣＲＭ１９７、ｐＭＤ１８−Ｔ−３８９、ｐＭＤ１８−Ｔ−Ａ及びｐＭＤ１８−Ｔ−Ｍ２ｅ−Ｌのそれぞれ中に挿入されていた。

【0115】

プラスミドｐＭＤ１８−Ｔ−Ｍ２ｅ−Ｌを、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ酵素により消化した。次いで、酵素切断により得られた断片を、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ酵素により消化した原核生物発現ベクターｐＴＯ−Ｔ７（Ｌｕｏ Ｗｅｎｘｉｎら、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０００、１６：５３〜５７）中に連結し、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．から購入した）イー・コライＥＲ２５６６中に形質転換した。プラスミドの抽出の後、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ酵素切断により同定して、断片Ｍ２ｅ−Ｌが挿入されている、陽性プラスミドｐＴＯ−Ｔ７−Ｍ２ｅ−Ｌを得た。

【0116】

ｐＴＯ−Ｔ７−Ｍ２ｅ−Ｌ、ｐＭＤ１８−Ｔ−ＣＲＭ１９７、ｐＭＤ１８−Ｔ−３８９及びｐＭＤ１８−Ｔ−Ａを、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ酵素により消化した。得られた断片のＣＲＭ１９７、３８９及びＡをそれぞれ、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ酵素により消化したベクターｐＴＯ−Ｔ７−Ｍ２ｅ−Ｌ中に連結した。ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ酵素切断により同定して、Ｍ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７（配列番号３９、４０）、Ｍ２ｅ−Ｌ−３８９（配列番号４１、４２）及びＭ２ｅ−Ｌ−Ａ（配列番号４３、４４）がそれぞれ挿入されている、陽性の発現ベクターのｐＴＯ−Ｔ７−Ｍ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｍ２ｅ−Ｌ−３８９及びｐＴＯ−Ｔ７−Ｍ２ｅ−Ｌ−Ａを得た。

【0117】

実施例で使用したプライマーの配列を、表４に列挙する。

【表14】

【0118】

プラスミドのｐＴＯ−Ｔ７−ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅ、ｐＴＯ−Ｔ７−３８９−Ｌ−Ｍ２ｅ、ｐＴＯ−Ｔ７−Ａ−Ｌ−Ｍ２ｅ、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｍ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｍ２ｅ−Ｌ−３８９及びｐＴＯ−Ｔ７−Ｍ２ｅ−Ｌ−Ａ（０．１５ｍｇ／ｍｌ）の１μＬを、別個に使用して、塩化カルシウム法により調製したコンピテントな（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した）イー・コライＥＲ２５６６の４０μＬを形質転換し、次いで、細菌を、カナマイシン（１００ｍｇ／ｍｌの最終濃度；以下、同じ）を含有する固体ＬＢ培地（ＬＢ培地の構成成分：１０ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌ酵母粉末及び１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ；以下、同じ）上に蒔いた。プレートを、個々のコロニーを明らかに観察することができるようになるまで、３７℃で約１０〜１２時間静止状態でインキュベートした。個々のコロニーを、プレートから、カナマイシンを含有する液体ＬＢ培地の４ｍｌを含有するチューブに移動させた。培養物を、振とうインキュベーター中、１８０ｒｐｍ、３７℃で１０時間インキュベートし、次いで、１ｍｌの細菌溶液を採取し、−７０℃で保存した。

【0119】

実施例７．実施例６において構築した融合タンパク質の発現、単離及び再生
−７０℃の極低温フリーザーから取った５μＬの細菌溶液を、カナマイシンを含有する液体ＬＢ培地の５ｍＬに播種し、次いで、ＯＤ６００が約０．５に達するまで、１８０ｒｐｍで振とうしながら、３７℃で培養した。得られた溶液を、カナマイシンを含有するＬＢ培地の５００ｍｌに移動させ、次いで、１８０ｒｐｍで振とうしながら、３７℃で４〜５時間培養した。ＯＤ６００が約１．５に達したら、ＩＰＴＧを添加して、０．４ｍＭの最終濃度を得、細菌を、振とうしながら３７℃で４時間誘発した。

【0120】

誘発後に、遠心分離を８０００ｇで５分間実施して、細菌を収集し、次いで、細菌を、氷浴中で、溶解用溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．２、３００ｍＭ ＮａＣｌ）中に、１ｇの細菌対１０ｍＬの溶解用溶液の比で再懸濁させた。細菌を、超音波処理器（Ｓｏｎｉｃｓ ＶＣＸ７５０ Ｔｙｐｅ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて処理した（条件：作動時間：１５分、パルス：２秒、中断：４秒、アウトプット出力：５５％）。細菌の溶解液を、１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し（以下、同じ）、超音波処理による細菌の破壊の後の上清及び沈殿物（すなわち、封入体）をそれぞれ収集した。同じ体積の２％Ｔｒｉｔｏｎ−１００を使用して、沈殿物を洗浄し、結果として得た混合物を、振動下に３０分間置き、遠心分離し、上清を廃棄した。沈殿物を、緩衝液Ｉ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）中に、振動下で３０分かけて再懸濁させ、遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、沈殿物を、２Ｍ尿素中に、振動下、３７℃で３０分かけて再懸濁させ、遠心分離し、上清及び沈殿物を得た。上清を残し、沈殿物を、同じ体積の４Ｍ尿素中に、振動下、３７℃で３０分かけて再懸濁させ、１２０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離して、上清及び沈殿物を得た。上清（すなわち、４Ｍ尿素で溶解させた上清）を残し、沈殿物を、同じ体積の８Ｍ尿素中に、振動下、３７℃で３０分かけてさらに再懸濁させ、遠心分離し、上清（すなわち、８Ｍ尿素で溶解させた上清）を残した。

【0121】

得られた画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した（クーマシーブリリアントブルー染色を使用して、可視化した。以下、同じ。Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ、２版中の方法を参照されたい）。結果から、融合タンパク質が封入体中で発現し（図１０Ａ及び１０Ｂを参照されたい）、ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅ、３８９−Ｌ−Ｍ２ｅ、Ｍ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７及びＭ２ｅ−Ｌ−３８９は、主として８Ｍ尿素中に溶解し、Ａ−Ｌ−Ｍ２ｅ及びＭ２ｅ−Ｌ−Ａは、主として４Ｍ尿素中に溶解することが示された。Ａ−Ｌ−Ｍ２ｅ若しくはＭ２ｅ−Ｌ−Ａを含有する、４Ｍ尿素で溶解させた上清、又はＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅ、３８９−Ｌ−Ｍ２ｅ、Ｍ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７若しくはＭ２ｅ−Ｌ−３８９を含有する、８Ｍ尿素で溶解させた上清をそれぞれ、ＰＢＳに対して透析して、約８０％の純度を有する融合タンパク質を得た（図１０Ｃ〜１０Ｆを参照されたい）。

【0122】

実施例８．実施例６において構築した融合タンパク質の特性の解析
融合タンパク質の抗体との反応性の、ウエスタンブロッティングによる決定
融合タンパク質の、インフルエンザウイルスＭ２ｅモノクローナル抗体５Ｄ１及びＣＲＭ１９７モノクローナル抗体１Ｅ６（実験室で調製した）との反応性を、ウエスタンブロッティングにより決定した。透析及び再生した試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離の後に、ニトロセルロース膜に移動させて、ブロッティングを行った。５％脱脂粉乳を使用して、膜を２時間ブロックし、次いで、１：５００に希釈したモノクローナル抗体５Ｄ１を添加した。反応を１時間行った。次いで、膜を、ＴＮＴ（５０ミリモル／Ｌ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１５０ミリモル／Ｌ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて、各回１０分３回にわたり洗浄した。次いで、ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ（ＫＰＬ製）を添加した。反応を１時間行い、次いで、膜を、ＴＮＴを用いて、各回１０分３回にわたり洗浄した。ＮＢＴ及びＢＣＩＰ（ＰＲＯＴＯＳ製）を使用して、可視化した。融合タンパク質及びインフルエンザウイルスＭ２ｅモノクローナル抗体５Ｄ１（図１１Ａ〜１１Ｄ）又はＣＲＭ１９７モノクローナル抗体１Ｅ６（図１１Ｅ〜１１Ｈ）を使用してウエスタンブロッティングにより決定した結果を、図１１に示した。結果から、試験した融合タンパク質は全て、インフルエンザウイルスＭ２ｅに特異的なモノクローナル抗体５Ｄ１及びＣＲＭ１９７に特異的なモノクローナル抗体１Ｅ６との顕著な反応性を有することが示された。

【0123】

融合タンパク質の種々のＭ２ｅに特異的なモノクローナル抗体及びＣＲＭ１９７に特異的な抗体との反応性の、ＥＬＩＳＡによる決定
融合タンパク質及び対照タンパク質ＧＳＴ−Ｍ２ｅの、種々のＭ２ｅに特異的な抗体、及びＣＲＭ１９７に特異的なモノクローナル抗体１Ｅ６（実験で使用する抗体は、先行技術で公知であり、若しくは商業的に入手可能であるか、又は実験室で調製した）との反応性を、間接ＥＬＩＳＡにより決定した。例えば、Ｏ１９抗体は、先行技術で公知のインフルエンザに対する防御抗体である（Ｆｕら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００９、３８５：２１８〜２２６を参照されたい）。透析及び再生した試料を、１×ＰＢＳ（１μｇ／ｍｌ）中に希釈し、次いで、９６ウエルマイクロプレート（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｃｏ．）に１００μｌ／ウエルで添加し、３７℃で２時間インキュベートした。コーティング溶液を廃棄し、プレートを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて１回洗浄し、次いで、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中の２％ゼラチン、５‰カゼイン、１‰プロクリン３００）を、１８０μｌ／ウエルで添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ブロッキング溶液を廃棄して、検出を実施し、特定の比に希釈した（０．００２ｍｇ／ｍｌを最初の濃度として使用して、２倍勾配による希釈を行った）抗Ｍ２ｅ抗体又はＣＲＭ１９７抗体を、１００μｌ／ウエルで添加した。混合物を、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳＴを用いて５回にわたり洗浄し、次いで、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウス（ＫＰＬ製）（１：５０００）を、１００μｌ／ウエルで添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳＴを用いて５回にわたり洗浄し、次いで、ＨＲＰの基質（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｃｏ．）を、１００μｌ／ウエルで添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。２Ｍ硫酸を５０μｌ／ウエルで添加して、反応を止め、次いで、マイクロプレートリーダー（Ｓｕｎｒｉｓｅ Ｔｙｐｅ、Ｔｅｃａｎ Ｃｏ．製）を使用して、ＯＤ４５０／６２０の値を読み取った。融合タンパク質と抗体とを使用したＥＬＩＳＡの結果を、図１２Ａ及び１２Ｂに示した。結果から、Ｍ２ｅタンパク質単独と比較して、Ｍ２ｅタンパク質のＣＲＭ１９７又はその断片との融合の後に、Ｍ２ｅタンパク質の種々の抗Ｍ２ｅ特異的モノクローナル抗体との反応性は、保持されるか又は増強されることが示された。

【0124】

融合タンパク質の沈降速度（ＳＶ）の解析
実験で使用する装置は、米国のＢｅｃｋｍａｎ ＸＬ−Ａ解析用超遠心分離機であり、当該遠心分離機には、光学的検出システム、並びにＡｎ−５０Ｔｉ回転子及びＡｎ−６０Ｔｉ回転子が装備されていた。沈降速度（ＳＶ）法（ｃ（ｓ）アルゴリズム、Ｐ．Ｓｃｈｕｃｋら、Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ、７８：１６０６〜１６１９（２０００）を参照されたい）を使用して、融合タンパク質の沈降係数を解析した。解析の結果を、図１３Ａ〜１３Ｆに示した。結果から、実施例６において構築した融合タンパク質のうち、Ａ−Ｌ−Ｍ２ｅ及びＭ２ｅ−Ｌ−Ａは、主として単量体及び四量体の形態で存在し、３８９−Ｌ−Ｍ２ｅは、主として二量体及びポリマーの形態で存在し、Ｍ２ｅ−Ｌ−３８９は、主として単量体及びポリマーの形態で存在し、ＣＲＭ１９７−Ｌ−Ｍ２ｅは、主として二量体及びポリマーの形態で存在し、Ｍ２ｅ−Ｌ−ＣＲＭ１９７は、主として単量体及びポリマーの形態で存在することが示された。

【0125】

実施例９．実施例６において構築した融合タンパク質の免疫原性の解析
実験で使用したマウスは、雌、６週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスであった。アルミニウムアジュバントを使用することによって、マウスを、実施例６において構築し、ＰＢＳに再生した融合タンパク質及び対照タンパク質ＧＳＴ−Ｍ２ｅそれぞれの腹腔内注射により免疫化した。注射体積は１ｍｌであり、２つの投与群（５μｇ用量群又は０．５μｇ用量群）を使用した。一次免疫化を第０週に実施し、追加免疫化を、第２及び４週に実施した。

【0126】

ＧＳＴ−Ｍ２ｅを使用して、プレートをコーティングし、融合タンパク質及び対照タンパク質が誘発した血清中の抗体価を、上記したアッセイに類似する間接ＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。免疫化後４カ月以内の血清抗体価の検出結果を、図１４Ａ及び１４Ｂに示した。結果から、第２の追加免疫化後の、構築した融合タンパク質の免疫原性は、抗原タンパク質（ＧＳＴ−Ｍ２ｅ）単独よりも顕著に高いことが示され、当該結果は、本発明のＣＲＭ１９７又はその断片は、（融合タンパク質のＮ−末端及びＣ−末端に位置する物質がない）ＣＲＭ１９７又はその断片と融合させた抗原タンパク質の免疫原性を顕著に増強し、分子内アジュバントとして使用することが可能であることを示した。

【0127】

本発明の特定の実施形態を、詳細に記載してきたが、当業者であれば、本明細書に開示されている教示に従って、種々の改変形態及び変化形態を、一般的に記載する本発明の精神又は範囲から逸脱することなく作製することができ、そのような改変形態及び変化形態は、本発明の範囲に属することを理解するであろう。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びあらゆるその均等物により示される。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3】

【図4】

【図7】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図11F】

【図11G】

【図11H】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図13F】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図8A】

【図8B】

【図14A】

【図14B】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]