特許 6049691 表皮におけるペプチジルアルギニンデイミナーゼ１および／または３アクチベーター化合物およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6049691

(24)【登録日】2016年12月2日

(45)【発行日】2016年12月21日

(54)【発明の名称】表皮におけるペプチジルアルギニンデイミナーゼ１および／または３アクチベーター化合物およびその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 8/49 20060101AFI20161212BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20161212BHJP

   A61K 31/522 20060101ALI20161212BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20161212BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20161212BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20161212BHJP

【ＦＩ】

   A61K8/49

   A61Q19/00

   A61K31/522

   A61P17/16

   A61P17/06

   A61P37/08

【請求項の数】9

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2014-504305(P2014-504305)

(86)(22)【出願日】2012年4月11日

(65)【公表番号】特表2014-510773(P2014-510773A)

(43)【公表日】2014年5月1日

(86)【国際出願番号】EP2012056596

(87)【国際公開番号】WO2012140095

(87)【国際公開日】20121018

【審査請求日】2015年4月10日

(31)【優先権主張番号】1153135

(32)【優先日】2011年4月11日

(33)【優先権主張国】FR

(73)【特許権者】

【識別番号】500166231

【氏名又は名称】ピエール、ファブレ、デルモ‐コスメティーク

【氏名又は名称原語表記】ＰＩＥＲＲＥ ＦＡＢＲＥ ＤＥＲＭＯ−ＣＯＳＭＥＴＩＱＵＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100117787

【弁理士】

【氏名又は名称】勝沼 宏仁

(74)【代理人】

【識別番号】100091487

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 行孝

(74)【代理人】

【識別番号】100107342

【弁理士】

【氏名又は名称】横田 修孝

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(72)【発明者】

【氏名】エレーヌ、デュプラン

(72)【発明者】

【氏名】シルビー、ドヌ−マリオン

(72)【発明者】

【氏名】ステファヌ、プワニー

(72)【発明者】

【氏名】マリー−クレール、メシャン

(72)【発明者】

【氏名】ギー、セール

(72)【発明者】

【氏名】ミシェル、シモン

【審査官】 小出 直也

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０８−２９１０１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５０８８５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５００３９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００２−０８０３２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−３３５６３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−３１４３６７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−２１３６９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００２／０１５０５９７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 英国特許出願公開第０２２２１３９１（ＧＢ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ８／００− ９／７２

Ａ６１Ｋ３１／３３−３３／４４

Ａ６１Ｋ４７／００−４７／４８

Ａ６１Ｐ １／００−４３／００

Ａ６１Ｑ １／００−９０／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アセフィリンまたはその塩を含む、皮膚の表皮角質層を保湿するための剤。

【請求項2】

表皮におけるフィラグリンの脱イミノ化を促進することを意図する、請求項１に記載の剤。

【請求項3】

角質層におけるＮＭＦ（天然保湿因子）の産生を促進することを意図する、請求項１に記載の剤。

【請求項4】

任意の形態の乾燥皮膚を改善すること、表皮バリア機能を強化すること、および老化皮膚の徴候を予防すること、からなる群から選択される１つまたは複数を意図する、請求項１に記載の剤。

【請求項5】

トランス−ウロカニン酸の自然産生を促進すること、および紫外線から皮膚を保護することを意図する、請求項１に記載の剤。

【請求項6】

アセフィリンまたはその塩がカフェインおよび／またはテオブロミンと組み合わせられる、請求項１に記載の剤。

【請求項7】

アセフィリンまたはその塩を必須有効成分として含む化粧用組成物を皮膚に適用することを含んでなる、皮膚の表皮角質層を保湿する化粧方法。

【請求項8】

アセフィリンまたはその塩を必須有効成分として含み、カフェインおよび／またはテオブロミンを任意成分として含む、乾皮症、魚鱗癬、乾癬、アトピー性皮膚炎、過角化症、および水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症からなる群から選択される皮膚疾患の症例における乾燥皮膚の治療のための医薬組成物。

【請求項9】

アセフィリンまたはその塩が、前記組成物の総重量の０．５重量％〜３重量％の間に相当する、請求項８に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アセフィリンまたはその塩を含む、ペプチジルアルギニンデイミナーゼＩ型（すなわちＰＡＤ１）および／またはペプチジルアルギニンデイミナーゼＩＩＩ型（すなわちＰＡＤ３）を活性化し得る分子の分野、ならびに化粧品および治療薬の分野における前記分子のあらゆる適用に関する。

【0002】

より詳しくは、本発明は、皮膚用保湿剤としてのアセフィリンまたはその塩の化粧的使用に関する。

【0003】

本発明はさらに、乾皮症、魚鱗癬、乾癬、アトピー性皮膚炎、過角化症、および水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症などの皮膚疾患の症例において乾燥皮膚を処置するための、アセフィリンまたはその塩を含む皮膚用組成物の使用に関する。

【0004】

皮膚は、最も深層の皮下組織、真皮および表皮の３つのコンパートメントから構成される。表皮は、機械的、化学的および生物学的傷害から身体を保護し、皮膚に含まれる水の蒸発を制限することにより水分損失を防ぎ、紫外線の一部を吸収することにより光保護に関与する、角化したマルピーギ上皮である。これらの生命維持に必要な機能は、「表皮バリア機能」と総称される。

【0005】

表皮は、主としてケラチノサイトから構成される。これらは基底層で増殖した後、ベクトル化された分化のプログラムを受けて有棘層、次いで顆粒層を連続的に構成する。最後に、角化の間に、ケラチノサイトは死滅し、角質細胞となる。この角質細胞の蓄積が、角質層(horny layer)または上皮角質層(stratum corneum)と呼ばれる、表皮の最外層を形成する。上皮角質層は、その機械抵抗、その水密性およびその抗微生物ペプチドおよびウロカニン酸含量のために、表皮バリア機能を主要に担う。

【0006】

角質細胞は核およびその他の細胞オルガネラを欠いている。角質細胞は、原形質膜に取って代わっている抵抗性のあるタンパク質殻、すなわち角化膜に取り囲まれた、主としてケラチンとフィラグリンを含有する線維マトリックスから構成される。角質細胞は、新たな結合構造、コルネオデスモゾーム(corneodesmosome)によって互いに接続されている。多数のプロテアーゼおよびプロテアーゼインヒビターによって極めて精密に制御されるプロセスである落屑(desquamation)の間に、コルネオデスモゾームのタンパク質分解の後にほとんどの表在性角質細胞が皮膚から剥離する。

【0007】

生理学的には、角質層は１０％〜１５％の水を含有する。この保湿は、どんな外部水分条件であっても維持されなければならず、表皮バリアおよび落屑に不可欠である。実際に、この保湿は、角質細胞の内部においても（プロテアーゼ、トランスグルタミナーゼ、ＰＡＤなど）、外部においても（プロテアーゼ、リパーゼ、グリコシダーゼなど）多数の酵素の活性を可能とする。この保湿は、上皮角質層が機械的ストレス後でもその弾力性と保全性を保持することを可能とする可塑化効果も有する。

【0008】

「乾燥」皮膚または乾皮症に特徴的な角質層の保湿の低下は、こわばった感触で、手触りが悪く、鱗状となり、持続的な表面の亀裂や鱗屑が見られる。分子レベルでは、この保湿の低下は、ａ）デスモゾーム成分（角質デスモシン、デスモゾームカドヘリン、およびプラークタンパク質）の分解の低下、ならびに角質細胞表面全体および角質層の高さにわたる角質デスモゾームの保持を誘導して過角化症を招き、かつ、ｂ）細胞間脂質および角膜エンベロープの成熟の変化を誘導する。

【0009】

乾皮症は、いずれの解剖学的領域でも、例えば、特定の気候条件下（寒冷、風、乾燥、空気が冷たく乾燥している空調の効いた建物と高温多湿の外部との急でかつ繰り返しの行き来）、心的ストレスおよび化学因子（アルコール、有機溶媒、洗剤など；例えば、特定の石鹸での繰り返しの洗浄）または物理的因子（紫外線）の影響下など、極めて多様な状況でも起こり得る。乾皮症はまた、新生児で、水性媒体である羊水から空気中への急激な移行の結果として、および高齢者では季節に応じて見られることがある。しかし、乾皮症は、太陽に曝されることによっても誘発され得る。

【0010】

多くの皮膚疾患はまた、表皮バリアの障害および角質層の乾燥、すなわち、魚鱗癬、特に、尋常性魚鱗癬（ＯＭＩＭ １４６７００）、アトピー性皮膚炎（ＯＭＩＭ ６０５８０３）、乾癬（ＯＭＩＭ １７７９００）も引き起こし得る。

【0011】

角質層の保湿は、角質細胞の最外層が環境の乾燥作用に対抗することによって保湿することを可能とする天然保湿因子（ＮＭＦ）によって確保される。角質層の乾燥重量の最大２０％に相当し得るＮＭＦの組成を下記に示す。

【0012】

遊離アミノ酸および誘導体 ５２．０
（ピロリドンカルボン酸を含む １２．０）
ラクテート １２．０
糖、有機酸、ペプチド ８．５
尿素 ７．０
塩化物 ６．０
ナトリウム ５．０
カリウム ４．０
カルシウム、マグネシウム、ホスフェート ３．５
アンモニア、尿酸、グルコサミン １．５
シトレート、フォルメート ０．５

【0013】

これらの構成要素の５０％を超えるものが遊離アミノ酸および特定のそれらの誘導体に対応する。特に、ＮＭＦの最大１２％を占め得る自然発生的グルタミン誘導体であるピロリドンカルボン酸は、吸湿性の主要な役割を果たす。ヒスチジンからヒスチダーゼにより形成されるウロカニン酸は、紫外Ｂの一部を吸収する。

【0014】

これらのアミノ酸は全て、顆粒ケラチノサイトにより大型（４００ｋＤａ）の前駆体プロフィラグリンの形態で合成される、大きさ３７ｋＤａの塩基性タンパク質フィラグリンの分解から直接生じる。ケラトヒアリン顆粒のこの必須成分は、フィラグリン１０〜１２個のサブユニット（個体による）の繰り返しによって形成され、それぞれ３２７アミノ酸長で、７アミノ酸の結合ペプチドにより互いに結合されている。角化の間、プロフィラグリンは切断されて塩基性のフィラグリンサブユニットとなる。これらは合体して中間体ケラチン微細線維（Ｋ１およびＫ１０）となり、それらの凝集および角質細胞内線維マトリックスの形成を促進する。その後、角質層では、フィラグリンが脱イミン化され、中間体微細線維からのその解離がもたらされる。次に、フィラグリンはカルパインＩ、カスパーゼ１４およびブレオマイシンヒドロラーゼによって完全に分解されて、ＮＭＦのアミノ酸構成要素を生じ得る。従って、このフィラグリンの脱イミノ化は、角質層の保湿および表皮バリア機能の維持において不可欠な、にもかかわらず限定的な工程である。

【0015】

脱イミノ化、またはシトルリン化は、カルシウム依存性酵素ファミリーＰＡＤ（Ｅ．Ｃ．３．５．３．１５）により触媒される翻訳後修飾である。これはアルギニル残基（正電荷を有する）のシトルリル残基（中性）への変換を含む。ヒト第１染色体の短腕の１ｐ３５−３６座に分類される５つの異なる遺伝子（ＰＡＤＩと呼ばれる）によりコードされる５つのＰＡＤアイソタイプが存在する。それらはＰＡＤ１、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、ＰＡＤ４およびＰＡＤ６である。ＰＡＤ２は遍在性であるが、他のアイソタイプは、分析した組織に依存するより限定された様式で発現される。特に、ＰＡＤ１、ＰＡＤ２およびＰＡＤ３は正常なヒト表皮にだけ検出される。生化学的および物理化学的考察に基づけば、また、それらは角質細胞内線維マトリックスにフィラグリンとともに局在するので、ＰＡＤ１とＰＡＤ３はフィラグリンの脱イミノ化を担うアイソタイプであることが示されている。従って、ＮＭＦアミノ酸の産生に作用させたい場合に標的とすべきはこれらのアイソタイプである。

【0016】

さらに、ＮＭＦの産生は、適応機構にしたがって外部水分レベルに応じたフィラグリンの異化作用によって調節される。例えば、ラットの胚発生の最終日には、フィラグリンが角質層の高さ全体にわたって蓄積する。誕生数時間後、フィラグリンは、成体の皮膚に見られるものと同じ輪郭で、外側の部分がタンパク質分解される。新生ラットを８０％を超える相対湿度中で維持すると、この分解プロセスの活性化が妨げられ、タンパク質合成の実行は起こらない。同様に、ヘアレスマウスを加湿環境から通常環境に移した場合には、遊離アミノ酸のレベルおよび皮膚表面のコンダクタンス（保湿を反映する）は３日で元に戻る。

【0017】

乾燥皮膚を軽減するため、角質層の保湿を改善するため、および乾皮症または魚鱗癬を治療するためには、吸湿性の活性剤を含有する化粧用および医薬処方の、皮膚への局所適用が用いられる。これらの処方は、例えば、尿素または乳酸、ＮＭＦの他の成分を含有する。一般に、ヒドロキシ酸は、それらの保湿特性および「アンチエージング」特性のために化粧品工業にとって最大の化合物種の１つとなっているが、最もよく知られ、最もよく用いられる保湿剤は間違いなくグリセロールである。

【0018】

どんな処方がすでに開発されていたとしても、乾燥皮膚の症状を改善するために化粧品工業および／または薬局方に有用な新たな活性剤を提案することが明らかに必要である。本発明の目標は、正確には、角質層の自然保湿を促進するために、ＰＡＤ１およびＰＡＤ３に作用し得る新たな化合物を使用することによってＮＭＦの産生を促進することである。これは、身体または顔の皮膚、唇、睫毛、眉、毛髪、頭皮または爪用のケアおよび／またはメイクアップ製品；日焼けまたはセルフタンニング製品；特に毛髪のカラー、コンディショニングおよび／またはケアのための毛髪製品の分野で特に有利な適用を見出すことができる。

【0019】

実際に、有意な研究の後に、本出願者は、驚くべきことに、また、予期しないことに、単独または組み合わせて使用されるアセフィリンまたはその塩、カフェインおよびテオブロミンが、角質層の自然保湿を促進するために、ＰＡＤ１および／またはＰＡＤ３の活性を増強する能力、特に、それらの生理学的基質フィラグリンを脱イミン化するそれらの能力を有することを見出した。これらの分子の化学式を下記に示す。

【化1】

２−（１，３−ジメチル−２，６−ジオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−７（６Ｈ）−イル）酢酸

【化2】

１，３，７−トリメチル−１Ｈ−プリン−２，６（３Ｈ，７Ｈ）−ジオン

【化3】

３，７−ジメチル−１Ｈ−プリン−２，６（３Ｈ，７Ｈ）−ジオン

【0020】

脱イミノ化反応は一連の５段階に分けられることが示唆されている。
ｉ）酵素の活性部位のＣｙｓのチオール基による、ペプチジル−Ｌ−アルギニンのＣζに対する求核攻撃；
ｉｉ）活性部位のＡｓｐと基質との間の水素結合および塩結合の形成；
ｉｉｉ）ペプチジル−Ｌ−アルギニンのＣζとΝη２の間の結合の切断およびアンモニアの遊離；
ｉｖ）第２の求核攻撃（この際は水分子による）；かつ
ｖ）前の反応の結果として形成された付加物の加水分解および最終脱イミノ化産物であるペプチジル−Ｌ−シトルリンの遊離

【0021】

よって、本発明は、ＰＡＤ１またはＰＡＤ３により触媒されるこれら５工程の反応のいずれか一つを単独でまたは他のものと組み合わせて用いられる、上記の活性剤による活性化に関する。

【0022】

乾癬および水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症（ＯＭＩＭ １１３８００）などのいくつかの病態は、臨床レベルで脱イミノ化の欠乏を特徴とする。同様に、本発明者らは、アトピー性皮膚炎患者の角質層における脱イミン化タンパク質の検出の低下を示した（下記の実施例３参照）。しかしながら、アトピー性皮膚炎などの乾癬患者の上皮角質層では、病変のある領域と病変のない領域の両方で、対照と同等のレベルでＰＡＤが発現される。

【0023】

よって、本発明は、皮膚用保湿剤としての、アセフィリンまたはその塩、カフェイン、テオブロミンおよびそれらの混合物から選択されるＰＡＤ１および／またはＰＡＤ３アクチベーター化合物を含む組成物の化粧的使用に関する。

【0024】

より詳しくは、前記組成物は、表皮においてフィラグリンの脱イミノ化を促進することを意図する。

【0025】

本発明による組成物はまた、角質層においてＮＭＦ（天然保湿因子）の産生を促進することも意図する。

【0026】

よって、これらのＰＡＤ１および／またはＰＡＤ３アクチベーターは、角質層においてＮＭＦの産生を促進するため、ならびに表皮、特に角質層の保湿、任意の形態の乾燥皮膚の改善、または表皮バリア機能の強化、および老化皮膚の徴候の予防におけるそれらの使用のために選択された。

【0027】

本発明の活性剤はいずれの起源であってもよく、すなわち、コーヒーまたはカカオの木などの植物から単離することができ、それらが任意の起源の微生物によって天然には産生されなくても前記微生物によって産生可能であり、または化学合成によって得ることもできる。

【0028】

本発明に関して「アセフィリン塩」という表現は、有機または無機アセフィリン塩を意味する。

【0029】

本発明に従って使用可能な有機塩としては、従来技術ＦＲ２６３９５４１に記載されているものが挙げられうる。好ましくは、それはトリエタノールアミン塩であろう。

【0030】

無機アセフィリン塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩またはリチウム塩が挙げられうる。

【0031】

本発明の特定の実施態様によれば、アセフィリン塩は、アセフィリンを含む組成物における中和剤としての有機または無機塩基の添加により形成される。好ましくは、有機塩基はトリエタノールアミンであり、無機塩基はＮａＯＨである。

【0032】

本発明はまた、上記で定義されたような少なくとも１種類のＰＡＤ１および／またはＰＡＤ３アクチベーター、特にはアセフィリンまたはその塩を単独でまたはカフェインおよび／またはテオブロミンと組み合わせて、少なくとも１種類の薬学的もしくは化粧学的に許容可能な賦形剤と組み合わせて含有する、医薬および／または化粧用組成物に関する。

【0033】

この組成物は、優先的には天然または合成起源であり得、より優先的には合成起源であり得る。

【0034】

好ましくは、本組成物中に存在するアセフィリンは、医薬組成物の場合には組成物の総重量の０．５重量％〜３重量％の間、化粧用組成物の場合には組成物の総重量の０．１重量％〜１重量％の間に相当しうる。

【0035】

優先的には、使用するＰＡＤ１および／またはＰＡＤ３アクチベーター化合物はアセフィリンまたはその塩でありうる。

【0036】

本発明の特定の実施態様によれば、アセフィリンまたはその塩は、カフェインおよび／またはテオブロミンと組み合わされる。

【0037】

ＰＡＤ１および／またはＰＡＤ３酵素に対してそのアクチベーター効果を与えるアセフィリンまたはその塩は、角質層内のフィラグリンの分解、従って、ＮＭＦ、特に、グルタミン由来ピロリドンカルボン酸（ＰＣＡ）を含んでなるアミノ酸の産生の増大を可能としうる。この酸のアッセイ量の増加は、これらの化合物の保湿活性を示す。

【0038】

優先的には、本発明による組成物は局所投与されうる。

【0039】

優先的には、本発明による組成物は、揮発性または不揮発性の、炭素、炭化水素、フッ素および／またはシリコーンを含有する無機物(mineral)、動物、植物または合成起源の油および／または溶媒から選択される少なくとも１種類の化合物を単独または混合物として含み得る、少なくとも１つの液体脂肪相を含みうる。

【0040】

好ましい実施態様によれば、本発明による組成物は、優先的には、身体もしくは顔の皮膚、唇、睫毛、眉、毛髪、頭皮または爪用のケアおよび／またはメイクアップ製品；日焼けまたはセルフタンニング製品；特に毛髪のカラー、コンディショニングおよび／またはケアのための毛髪製品の形態で提供されうる。

【0041】

よって、本発明の別の面では、これらの脱イミノ化異常を予防および／もしくは治療するため、ならびに／または角質層の保湿を促進するため、および任意の形態の乾燥皮膚病態の症状を改善するために単独でまたは組み合わせて使用される上記の活性剤の治療的使用に関する。

【0042】

本発明に関して、「乾燥皮膚病態」は、皮膚病態に直接関連するか、または前記病態の皮膚科処置から起こる、いずれのタイプの乾燥皮膚も意味する。

【0043】

本発明の特定の実施態様において、カフェインが本組成物中の唯一の治療有効成分として用いられうる。

【0044】

本発明の別の好ましい実施態様において、テオブロミンが本組成物中の唯一の治療有効成分として用いられうる。

【0045】

本発明による組成物は、皮膚、特に、角質層の保湿；任意の形態の乾燥皮膚の改善；表皮バリア機能の強化および老化皮膚の徴候の予防を可能とする。

【0046】

皮膚の保湿は、表皮の水分バランスの改善または維持を意味する。

【0047】

任意の形態の乾燥皮膚の改善は、特に、角質層の水分不足、表面に存在する、薄すぎる、そしてもはや皮膚を保護しない皮脂膜、皮脂の欠如を特徴とする、表皮の保湿のいずれの改善も意味する。

【0048】

老化皮膚は、真皮に対する影響および組織の弾力性の低下に加えて、バリア機能の弱化を意味する。水分損失はわずかであり、ほとんど増加しないにもかかわらず、臨床経験では、乾燥皮膚に苦しむ高齢者が、良好な健康状態の若者よりも頻繁であることを示した。第１に、これは脂質関門の変化によって説明される。表皮バリアも、よりたやすく変化し、修復がより遅い。Ｒａｍａｎ分光法により、上皮角質層の保水力およびＮＭＦの量は、主として最も表面にある層において、年齢とともに低下することを示すことが可能となった。

【0049】

紫外線Ｂは、それらが誘発するＤＮＡ損傷、従ってそれらの有意な突然変異誘発能のために、皮膚癌の発生の主要な原因の１つである。紫外線Ｂの大部分はメラニンによって吸収されるが、第一の光保護バリアは、ＮＭＦの成分であるトランス−ウロカニン酸によって確保され、その平均レベルは約５μｇ／ｃｍ^２皮膚である。これは比較的有効な天然サンスクリーンであり、１９７０年代と１９８０年代に多くの化粧品に加えられた。上皮角質層では、トランス−ウロカニン酸は、ほとんどのＮＭＦアミノ酸と同様に、フィラグリンの異化作用に由来する。

【0050】

よって、本発明はまた、トランス−ウロカニン酸の自然産生を促進すること、および紫外線から皮膚を保護することを目的とする表皮の保湿のための、単独でまたは組み合わせて使用される上記活性剤の化粧的使用に関する。

【0051】

本発明は優先的には、皮膚障害の治療および予防、乾皮症、魚鱗癬、乾癬、アトピー性皮膚炎、過角化症、および水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症の治療において使用するための組成物に関する。

【0052】

本発明の特定の実施態様において、本発明における医薬組成物は、皮膚障害の治療および予防、乾皮症、魚鱗癬、過角化症、および水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症の治療における治療的使用のための、アセフィリンまたはその塩とカフェインおよび／またはテオブロミンの組合せから構成される少なくとも１種類のＰＡＤ１および／またはＰＡＤ３アクチベーター化合物と、少なくとも１種類の許容可能な医薬または化粧用賦形剤とを含有する。

【0053】

本発明はまた、ケラチン物質、特に、身体または顔の皮膚、唇、爪、毛髪および／または睫毛の化粧的処置方法であって、本発明による化粧用組成物を前記物質に適用することを含んでなる方法に関する。

【0054】

本発明に関して、種々の生化学分析法が、フィラグリンを脱イミン化するそれらの特定の能力に照らしてＰＡＤ１およびＰＡＤ３の触媒活性を調節するいくつかの分子を選択することを可能とした。これらの結果は、下記に相当する添付の図面で示される。

【図面の簡単な説明】

【0055】

【図1】精製された組換えタンパク質の分析。 精製後、ＰＡＤ１、ＰＡＤ３および組換えヒトフィラグリン（Ｆｉｌ−Ｈｉｓ）を、示されているように、ＳＤＳの存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、クーマシーブルーで染色するか、または免疫検出した。抗フィラグリンモノクローナル抗体ＡＨＦ１１は、約４５ｋＤａの非脱イミン化Ｆｉｌ−Ｈｉｓを検出する。見掛けの分子量を左にｋＤａで示す。

【図2】ＰＡＤ１による組換えヒトフィラグリン（Ｆｉｌ−Ｈｉｓ）の脱イミノ化の速度論。 ＰＡＤ１とともインキュベートした後、Ｆｉｌ−Ｈｉｓを、抗フィラグリンモノクローナル抗体ＡＨＦ１１により免疫検出した。見掛けの分子量を左にｋＤａで示し、インキュベーション時間を図の上に分で示す。ＰＡＤ１によるＦｉｌ−Ｈｉｓの脱イミノ化が、その移動が４５ｋＤａから６６ｋＤａに向かっての漸進的変化を引き起こすことに留意されたい。

【図3】ストレプトマイシンの存在下または非存在下でのＰＡＤ１による組換えヒトフィラグリン（Ｆｉｌ−Ｈｉｓ）の脱イミノ化。 ＰＡＤ１とともにインキュベートした後、示されているように、５ｍＭストレプトマイシン（ｓｔｒ）の存在下または溶媒である１％ジメチルスルホキシド（ｄ）の存在下で、Ｆｉｌ−Ｈｉｓを抗フィラグリンモノクローナル抗体ＡＨＦ１１、または抗シトルリン抗体ＡＭＣにより免疫検出した。見掛けの分子量を左にｋＤａで示し、インキュベーション時間を図の上に分で示す。ＰＡＤ１はストレプトマイシンにより阻害され、これはこの分子の存在下でインキュベーションを行う場合に、溶媒単独の存在下で行われるインキュベーションに比べてＡＭＣによる免疫検出強度が低いためであることに留意されたい。

【図4】カフェインの存在下または非存在下でのＰＡＤ１による組換えヒトフィラグリン（Ｆｉｌ−Ｈｉｓ）の脱イミノ化。 ＰＡＤ１とともにインキュベートした後、示されているように、５０μＭカフェイン（ｃａｆ）の存在下または溶媒である１％ジメチルスルホキシド（ｄ）の存在下で、Ｆｉｌ−Ｈｉｓを抗フィラグリンモノクローナル抗体ＡＨＦ１１、または抗シトルリン抗体ＡＭＣにより免疫検出した。見掛けの分子量を左にｋＤａで示し、インキュベーション時間を図の上に分で示す。ＰＡＤ１はカフェインにより活性化され、これはＦｉｌ−Ｈｉｓがこの分子の存在下で溶媒単独の存在下よりも強く脱イミノ化されるためであることに留意されたい。

【図5】テオブロミンの存在下または非存在下でのＰＡＤ３による組換えヒトフィラグリン（Ｆｉｌ−Ｈｉｓ）の脱イミノ化。 ＰＡＤ３とともにインキュベートした後、示されているように、２００μＭテオブロミン（ｔｈｅｏ）の存在下または溶媒である１％ジメチルスルホキシド（ｄ）の存在下、Ｆｉｌ−Ｈｉｓを抗フィラグリンモノクローナル抗体ＡＨＦ１１、または抗シトルリン抗体ＡＭＣにより免疫検出した。見掛けの分子量を左にｋＤａで示し、インキュベーション時間を図の上に分で示す。ＰＡＤ３はテオブロミンにより活性化されることに留意されたい。

【図6】アセフィリンの存在下または非存在下でのＰＡＤ３による組換えヒトフィラグリン（Ｆｉｌ−Ｈｉｓ）の脱イミノ化。 ＰＡＤ３とともにインキュベートした後、示されているように、終濃度５０μＭ（上）もしくは２００μＭ（下）のアセフィリン（ａｃｅ）の存在下、または溶媒である１％ジメチルスルホキシド（ｄ）の存在下、Ｆｉｌ−Ｈｉｓを、示されているように、抗フィラグリンモノクローナル抗体ＡＨＦ１１、または抗シトルリン抗体ＡＭＣにより免疫検出した。見掛けの分子量を左にｋＤａで示し、インキュベーション時間を図の上に分で示す。ＰＡＤ３はアセフィリンにより活性化される（最高濃度で特に明らか）。

【図7】カフェイン、テオブロミンおよび／またはアセフィリン単独または組合せの存在下でのＰＡＤ１またはＰＡＤ３による組換えヒトフィラグリンの脱イミノ化。 Ｆｉｌ−ＨｉｓをＰＡＤ１の存在下で５分間（Ａ−Ｂ）またはＰＡＤ３の存在下で６０分（Ｃ−Ｄ）インキュベートした。インキュベーション前に、示されているように、３１２．５μＭのカフェイン（Ｃａｆ）、アセフィリン（Ａｃｅ）またはテオブロミン（Ｔｈｅｏ）を単独で（ＡおよびＣ）または組み合わせて（ＢおよびＤ）反応混合物に加えた。インキュベーション後、Ｆｉｌ−Ｈｉｓを抗シトルリン抗体（ＡＭＣ）により免疫検出し、免疫検出強度をＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて定量した。データは、各酵素の活性の、活性剤の非存在下で行った対照（−）に対する相対的パーセンテージとして、ヒストグラムの形で表す。

【図8】正常ヒト皮膚またはアトピー性皮膚炎患者の皮膚の切片に対する免疫組織学により分析されたＰＡＤ１、ＰＡＤ３および脱イミノ化タンパク質。 脱イミノ化タンパク質を、シトルリンの化学修飾後に抗シトルリン（ＡＭＣ）により免疫検出した。陰性対照（Ｎｅｇ）を並行して行った。ＰＡＤ１およびＰＡＤ３を、上記のように抗ＰＡＤ１および抗ＰＡＤ３抗体により免疫検出した（実施例３）。８人の患者（ＤＡ１、２および３）および３人の対照（Ｎｏｒ１）に関して得られた結果の画像を示す［バー＝１５０μｍ］。

【図9】再生表皮の表面に対する、トリエタノールアミン塩またはナトリウム塩の形態でのアセフィリンの局所適用後の、脱イミノ化タンパク質のウエスタンブロットによる分析。 再生表皮を、対照ゲル（１）または３％濃度のアセフィリン（２および３）をトリエタノールアミン塩（２）またはナトリウム塩（３）の形態で含有するゲルで２４時間局所処置した。 Ａ．全タンパク質を電気泳動により分離し、抗シトルリン抗体（ＡＭＣ）および抗アクチン抗体により免疫検出した。実験は３反復で行った（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ）。見掛けの分子量を左にｋＤａで示す。 Ｂ．免疫検出強度をＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて定量した。得られた値をアクチンに対して正規化した。それらを、アセフィリンの不在下で行った対照に対する相対的パーセンテージとして、ヒストグラムの形で示す。 対照ゲルで処置した表皮に比べ、塩形態のアセフィリンを含有するゲルで処置した表皮では、シトルリン化タンパク質の免疫検出強度が大きいことに留意されたい。

【図10】再生表皮の表面に対する、ナトリウム塩の形態でのアセフィリンの局所適用後の脱イミノ化タンパク質の免疫組織学的分析。 非処置正常皮膚（ＡおよびＤ）ならびに対照ゲル（ＢおよびＥ）または３％濃度のアセフィリンをナトリウム塩の形態で含有するゲル（ＣおよびＦ）で２４時間局所処置した再生表皮の凍結切片を、シトルリンの修飾有り（Ａ〜Ｃ）または無し（Ｄ〜Ｆ；陰性対照）の抗シトルリン抗体（ＡＭＣ）で免疫組織学的に分析した［バー＝１５０μｍ］。対照ゲルで処置した再生表皮（Ｂ）に比べ、ナトリウム塩形態のアセフィリンで処置した再生表皮（Ｃ）の角質層の染色強度の増加が示される。

【0056】

薬理学的評価
Ａ／組換えヒトフィラグリンを用いたＰＡＤ１および／またはＰＡＤ３活性の評価
方法：
１．組換えヒトフィラグリンの産生および精製
組換えヒトフィラグリンの３２４アミノ酸サブユニット（「ＧｅｎＢａｎｋ」データベース受託番号：ＡＦ０４３３８０）を、大腸菌(Escherichia coli)ＢＬ２１コドンプラス（ＤＥ３＋）−ＲＩＬ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）にて、ｐＥＴ−４１ｂベクター（Ｍｅｒｃｋ、ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｒｄｔ、ドイツ）を用い、ＣＯＯＨ末端において６−ヒスチジンラベルと融合させることによって産生させた。

【0057】

この目的のために、まず、ヒト表皮から抽出したｍＲＮＡからｃＤＮＡを下記のオリゴヌクレオチド対：
5’-CATATGCTATACCAGGTGAGCACTCATG-3’および
5’-CTCGAGCCCTGAACGTCCAGACCGTCC-3’
を用いたＰＣＲにより増幅し、次に、精製し、ｐＣＲＩＩ−Ｔｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にクローニングした。

【0058】

従って、このＰＣＲ産物はＮｄｅＩ部位とＸｈｏＩ部位によって挟み込まれており、これらの２つの付加的制限部位はｐＣＲＩＩ−ＴｏｐｏベクターからｐＥＴ−４１ｂ発現ベクターへのサブクローニングを可能とする。シーケンシングによる確認の後に、フィラグリンサブユニット（以下、Ｆｉｌ−Ｈｉｓと呼ぶ）を生産し、当業者に周知のプロトコールに従うニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。このようにして精製したＦｉｌ−Ｈｉｓ組換えタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）により分析し、ＡＨＦ１１抗フィラグリンモノクローナル抗体により免疫検出した。クーマシーブルー染色により純度をモニタリングし、Ｆｉｌ−Ｈｉｓタンパク質は見掛けの分子量約４５ｋＤを有した（図１参照）。得られた精製画分の濃度を、標準レンジのウシ血清アルブミンを用い、ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、フランス）で測定した（ｍｇ／ｍｌ）。

【0059】

２．活性型組換えヒトＰＡＤ１およびＰＡＤ３の産生
当業者に周知のプロトコールに従って産生および精製されたＰＡＤ１およびＰＡＤ３は高原英成教授（茨城大学、日本）から購入した。前記の精製された活性型組換えヒトＰＡＤ１およびＰＡＤ３の特徴を下表に示す。

【0060】

【表1】

【0061】

各酵素の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後にクーマシーブルー染色により評価した（図１参照）。

【0062】

３．ＰＡＤ１およびＰＡＤ３によるＦｉｌ−Ｈｉｓの脱イミノ化
２５ｎｇのＦｉｌ−Ｈｉｓを、５０℃にて、脱イミノ化バッファー（１０ｍＭ ＣａＣｌ_２、５ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４）中、４０ｍＵのＰＡＤ１またはＰＡＤ３の存在下でインキュベートした。ＰＡＤアイソフォームに応じた様々なインキュベーション時間（一般に、ＰＡＤ１では２〜５分、ＰＡＤ３では６０〜１８０分）の後、サンプルバッファーを加えることにより反応を急冷した。次に、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、１／５０００希釈したＡＨＦ１１抗フィラグリンモノクローナル抗体およびＡＭＣ修飾抗シトルリン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｏｌｌｓｈｅｉｍ、フランス）により免疫検出した。

【0063】

結果：
１．Ｆｉｌ−Ｈｉｓの脱イミノ化の評価
Ｆｉｌ−Ｈｉｓが脱イミノ化されない場合、変性ゲル中でのその見掛けの分子量は約４５ｋＤａである。Ｆｉｌ−Ｈｉｓは、クーマシーブルー染色またはＡＨＦ１１抗体による免疫検出の後、単一のタンパク質バンドの形態で移動する（図１参照）。Ｆｉｌ−Ｈｉｓの脱イミノ化は、４５から約６６ｋＤａまで、その見掛けの分子量に漸進的な増大をもたらす（図２参照）。約６６ｋＤａの形態は完全な脱イミノ化型に相当し、中間型はそれより大きなまたは小さな脱イミノ化型に相当する。従って、Ｆｉｌ−Ｈｉｓの脱イミノ化程度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後のその見掛けの分子量に相当する。

【0064】

Ｆｉｌ−Ｈｉｓは、活性型のＰＡＤとともにインキュベートした後にのみＡＭＣ抗体により免疫検出される。免疫検出強度は、高度に脱イミノ化されているほど大きい（図３参照）。

【0065】

２．ストレプトマイシンはＰＡＤ１を阻害する
フィラグリン移動の変化および／またはＡＭＣ抗体による免疫検出強度の変化により、脱イミノ化反応の開始前に反応混合物に加えた分子によるＰＡＤに対する効果（アクチベーターまたはインヒビター）を評価することが可能となる。例えば、ストレプトマイシンによるＰＡＤ１の阻害は、この方法によって証明することができる（図３参照）。分子量が約６６ｋＤａか、または４５〜約６０ｋＤａの間であるかのいずれかのバンドのＡＭＣ抗体による免疫検出強度は、Ｆｉｌ−Ｈｉｓを５ｍＭストレプトマイシンの存在下でＰＡＤ１とともに３または５分間インキュベートした場合では、溶媒単独（１％ジメチルスルホキシド）の存在下で総て同じ時点でインキュベートした場合に比べて低い。

【0066】

Ｂ／ＰＡＤ１および／またはＰＡＤ３アクチベーター
方法：
活性剤または活性剤の組合せの存在下でのＰＡＤ１またはＰＡＤ３によるＦｉｌ−Ｈｉｓの脱イミノ化
Ｆｉｌ−Ｈｉｓ（２５ｎｇ）の脱イミノ化は、脱イミノ化バッファー（１０ｍＭ ＣａＣｌ_２、５ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４）中、５０℃、４０ｍＵのＰＡＤ１またはＰＡＤ３の存在下で、０、３、５、６０および１８０分間、上記のようにして（段落Ａ．３）行った。終濃度５０、２００および３１２．５μＭとなるように１％ジメチルスルホキシド中の溶液として活性剤、または１％ジメチルスルホキシド単独（対照）または１％ジメチルスルホキシド中にそれぞれ３１２．５μＭとなるように希釈した数種の活性剤の混合物を、酵素を加える前の反応混合物に加えた。ある場合には、活性剤は水に希釈した。インキュベーション後、反応混合物のタンパク質をＡＭＣ抗体により免疫検出した。免疫検出強度を、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いた濃度測定により定量した。

【0067】

結果：
１．カフェインによるＰＡＤ１の活性化
脱イミノ化前に、Ｆｉｌ−ＨｉｓはＡＨＦ１１抗体により約４５ｋＤａのバンドとして免疫検出されるが、ＡＭＣ抗体によっては検出されない（図４参照）。ＰＡＤ１およびジメチルスルホキシド（最終１％）の存在下で、３分および５分のインキュベーションの後、Ｆｉｌ−ＨｉｓはＰＡＤ１により部分的に脱イミノ化される。つまり、その後、ＡＭＣ抗体により、４５〜約６０ｋＤａの間の大きさの幅広のバンドとして免疫検出される。ＰＡＤ１およびカフェイン（１％ジメチルスルホキシド中、最終５０μＭ）の存在下での３分および５分のインキュベーションの後、この幅広のバンドの免疫検出強度は大きくなり、６６ｋＤａに向かって移動する付加的バンドがＡＭＣ抗体により検出される（図４参照）。この約６６ｋＤａのタンパク質は、完全に脱イミノ化されたＦｉｌ−Ｈｉｓに相当する。この結果を定量的分析により確認したところ、カフェインの存在下でのインキュベーション後の４５および約６６ｋＤａの間のバンドの免疫検出強度おいて、対照に比べて１５１％の増加を示した。

【0068】

超純水に可溶化および希釈したカフェインで行った試験で、匹敵する結果が得られた。

【0069】

従って、カフェインはＰＡＤ１を活性化する。

【0070】

２．テオブロミンによるＰＡＤ３の活性化
脱イミノ化前には、Ｆｉｌ−Ｈｉｓは見掛けの分子量約４５ｋＤａを有し、それはＡＨＦ１１抗体によって免疫検出されるが、ＡＭＣ抗体によっては免疫検出されない（図５参照）。ＰＡＤ３およびジメチルスルホキシド（１％）の存在下で１８０分のインキュベーション後、Ｆｉｌ−ＨｉｓはＰＡＤ３により部分的に脱イミノ化される。つまり、それは次に、ＡＭＣ抗体により、４５〜約６６ｋＤａの間の大きさの幅広のバンドとして免疫検出される。ＰＡＤ３およびテオブロミン（１％ジメチルスルホキシド中２００μＭ）の存在下で１８０分のインキュベーション後、ＡＭＣ抗体により免疫検出されるバンドの強度はより大きくなる（図５参照）。免疫検出強度を定量したところ、１８２％の増加を示した。

【0071】

超純水に可溶化および希釈したテオブロミンで行った試験で、匹敵する結果が得られた。

【0072】

よって、テオブロミンはＰＡＤ３を活性化する。

【0073】

３．アセフィリンによるＰＡＤ３の活性化
脱イミノ化前には、Ｆｉｌ−Ｈｉｓは４５ｋＤａに向けられたＡＨＦ１１抗体によって免疫検出されるが、ＡＭＣ抗体によっては免疫検出されない（図６参照）。ＰＡＤ３およびジメチルスルホキシド（１％）の存在下での１８０分のインキュベーション後、Ｆｉｌ−ＨｉｓはＰＡＤ１により部分的に脱イミノ化される。つまり、それは次に、ＡＭＣ抗体により、４５〜約６０ｋＤａの間の大きさの幅広のバンドおよび約６６ｋＤａのバンドとして免疫検出される。ＰＡＤ３およびアセフィリン（１％ジメチルスルホキシド中２００μＭ）の存在下で１８０分のインキュベーション後、ＡＭＣ抗体により免疫検出されるバンドの強度は、明らかにより強くなる（図６参照）。免疫検出強度の定量によりこの結果を確認したところ、２２５％の増加を示した。

【0074】

超純水に可溶化および希釈したアセフィリンで行った試験で、匹敵する結果が得られた。

【0075】

よって、アセフィリンはＰＡＤ３を活性化する。

【0076】

４．ＰＡＤ１およびＰＡＤ３の活性に対するカフェイン、テオブロミンおよび／またはアセフィリンの混合物の効果の評価
ＰＡＤ１（５分のインキュベーション）およびＰＡＤ３（６０分のインキュベーション）による同様のＦｉｌ−Ｈｉｓ脱イミノ化試験を、３種類の各活性剤（カフェイン、テオブロミンおよびアセフィリン）またはこれらの活性剤のうち２種類もしくは３種類の混合物の存在下で行った。これらの活性剤は超純水に可溶化、次いで希釈した。前記活性剤は本試験では終濃度３１２．５μＭで使用した。ＡＭＣ抗体による免疫検出強度を前記のように定量した（図７参照）。

【0077】

得られた結果により、カフェインによるＰＡＤ１の活性化ならびにテオブロミンおよびアセフィリンによるＰＡＤ３の活性化が確認された。さらに、それらは、用いた３種類の活性剤が個々にＰＡＤ１およびＰＡＤ３を、匹敵する活性化レベルで活性化することを示した（図７Ａおよび７Ｃ参照）。

【0078】

活性剤を２種類または３種類一緒に添加しても阻害作用を誘発しなかった。同レベルのＰＡＤ１の活性化が見られた（図７Ｂ参照）。２種類または３種類の活性剤の添加は、ＰＡＤ３をより顕著に活性化するとさえ思われる（図７Ｄ参照）。

【0079】

よって、単独でまたは組み合わせて使用するカフェイン、テオブロミンおよびアセフィリンは、ＰＡＤ１およびＰＡＤ３を活性化する。

【0080】

Ｃ／アトピー性皮膚炎患者の皮膚の病変表皮の角質層の脱イミノ化タンパク質の検出の減少
方法：
１．皮膚切片
８人のアトピー性皮膚炎患者（トゥールーズ病院の皮膚科の医師によって診断）の病変皮膚および３人の対照の健康な皮膚で直径３ｍｍの生検を行い、ホルモール中で固定し、パラフィンに包埋した。各生検について連続切片（６μｍ）を作製し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔスライドに載せ、連続的なキシレンおよびエタノール浴により脱パラフィンし、その後、再水和させ、ヘマトキシリン−エオジンで染色するか、または免疫組織学により分析した。

【0081】

２．免疫組織学による脱イミノ化タンパク質の検出
脱イミノ化タンパク質を免疫検出するために、皮膚切片を修飾バッファー：０．０１２５％ ＦｅＣｌ_３、２．３Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４、１．５Ｍ Ｈ_３ＰＯ_４、０．２５％ジアセチルモノキシムおよび０．１２５％アンチピリン中、３７℃で３時間インキュベートした。陰性対照は、ジアセチルモノキシムおよびアンチピリンを除くことにより計画的に調製した。水で洗浄した後、これらの切片を、１／５００希釈したＡＭＣ参照抗体とともにインキュベートし、その後、「Ｉｍｐｒｅｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ抗ウサギＩｇ ＰＯ」キットを製造者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）の説明書に従って、ペルオキシダーゼの発色基質としてのジアミノベンジジンの存在下で現像した。最後に、ヘマトキシリンで対比染色を行った。

【0082】

３．免疫組織学によるＰＡＤ１およびＰＡＤ３の検出
ＰＡＤ１およびＰＡＤ３は、上記のプロトコールに従い、それぞれ１／８０および１／１００に希釈した特異的抗ＰＡＤ１および抗ＰＡＤ３（Ｂ３）抗ペプチド抗体を用いて免疫検出した。ヘマトキシリンで対比染色を行った。陰性対照は、一次抗体を除くことにより調製した。

【0083】

結果：
１．アトピー性皮膚炎患者の表皮における脱イミノ化タンパク質の減少
化学的修飾を受けていなかったサンプルは総て陰性である。対照個体からの皮膚サンプルは、角質層全体および総ての角質細胞層上に、ＡＭＣ抗体による極めて強く、かつ、連続的な染色を示す。他方、アトピー性皮膚炎患者からの皮膚サンプルは、明らかに弱く、かつ、多くの場合角質層の不連続染色を示す（図８参照）。

【0084】

結論として、アトピー性皮膚炎患者の病変表皮のタンパク質の脱イミノ化は、健康な対照に比べて明らかに少ない。

【0085】

２．アトピー性皮膚炎患者の表皮におけるＰＡＤ１および３の発現
採取したアトピー皮膚の総てのサンプルで、ＰＡＤ１は、生きている総ての表皮層のケラチノサイトの細胞質で検出され、最も分化したケラチノサイトで強度はより高い。当業者に周知のように、正常皮膚サンプルでも同じ免疫検出プロフィールが見られる。アトピー皮膚および正常皮膚で得られる染色強度は同じである。

【0086】

正常表皮では、当業者に周知のように、ＰＡＤ３は主として顆粒ケラチノサイトの細胞質で検出される。総ての患者のアトピー表皮では、ＰＡＤ３は、最も分化したケラチノサイトのいくつかの細胞層の細胞質で検出される。この染色強度は正常表皮の染色強度に等しい場合が最も多い（図８参照）。

【0087】

よって、ＰＡＤ１およびＰＡＤ３はアトピー性皮膚炎患者の表皮で広く発現される。従って、従前に見られたタンパク質の脱イミノ化の減少を説明するのはこれらの酵素の不在ではなく、おそらく活性が低いことである。

【0088】

Ｄ／アセフィリン含有ゲルで処置した後の角質層の脱イミノ化タンパク質の増加
方法：
１．再生表皮
大きさ０．３３ｃｍ^２の再生ヒト表皮を、１４日間、気液界面で成長させた。次に、種々の活性剤を含有する５ｍｇ／ｃｍ^２の前処方（pre-formulas）を、ブラシを用いてそれらの表面に均一に塗布した。３７℃、処置時間２４時間で３反復行った。次に、これらの表皮を分割し、半分をＴｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ中で冷凍した後、免疫組織学用に６μｍの凍結切片を作製し、もう半分を、ウエスタンブロットによる分析前に総タンパク質抽出物を調製するために−８０℃で凍結乾燥させた。総タンパク質をサンプルバッファー（０．１７５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８；１２．５％β−メルカプトエタノール、７．５％ＳＤＳ、２５％グリセロール）中で煮沸することにより抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、４〜１５％勾配ゲルにて分離した。

【0089】

２．免疫組織学による脱イミノ化タンパク質の検出
脱イミノ化タンパク質は、上記のように、修飾バッファー中でインキュベートした後に免疫検出した。陰性対照は、修飾無しで計画的に調製した。水で洗浄した後、これらの切片を１／１０００希釈したＡＭＣ抗シトルリン抗体でインキュベートした。最後に、ヘマトキシリンで対比染色を行った。

【0090】

３．ウエスタンブロットによる脱イミノ化タンパク質の検出
遠心分離により明澄化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したタンパク質抽出物を、上記のようなＡＭＣ抗シトルリン抗体または抗アクチン抗体（Ｍｉｌｏｐｏｒｅ、クローンＭＡＢ１５０１）により免疫検出した。免疫検出強度を上記のように定量した。

【0091】

結果：
１．トリエタノールアミン塩またはナトリウム塩形態のアセフィリンで処置した再生表皮における脱イミノ化タンパク質の増加
総ての抽出物で９０〜３０ｋＤａの間の見掛けの分子量を有する脱イミノ化タンパク質が検出される（図９Ａ参照）。それらのうちの１つがフィラグリンである（矢印）。トリエタノールアミン塩またはナトリウム塩形態のアセフィリンを含有する水性ゲルで処置した表皮に相当するレーンでは、水性ゲル単独で処置した表皮に相当するレーンよりも免疫検出強度が高い（約２．５倍）（図９Ａおよび９Ｂ参照）。

【0092】

２．ナトリウム塩形態のアセフィリンで処置した再生表皮の角質層における脱イミノ化タンパク質の増加
化学的修飾を受けていなかったサンプルは総て陰性である（図１０Ｄ、１０Ｅおよび１０Ｆ参照）。再生表皮のサンプルは、ＡＭＣ抗体により、角質層全体に不連続染色を示す。免疫検出強度は、ナトリウム塩形態のアセフィリンによる処置の後に強くなる（図１０参照）。

【0093】

結論として、再生表皮の表面に水性ゲルとして塗布された塩形態のアセフィリンは、角質層のタンパク質、特に、フィラグリンの脱イミノ化を増加させる。
Ｅ．ナトリウム塩形態の３％アセフィリンを含有する水性ゲルの調製例

【0094】

【表2】

手順
工程Ａ：予め７０℃に加熱した水に、撹拌しながら（１３００ｒｐｍ）アセフィリンを分散させ、ＮａＯＨを添加：７０℃
工程Ｂ：フェノキシエタノールを添加し、撹拌しながら（５００ｒｐｍ）ナトロソルをゆっくり撒布し、その後、剪断を高める。

【0095】

次に、撹拌しながら（１３００ｒｐｍで１０分）ＡにＢを加える。冷却し、ホモジナイズする（９００ｒｐｍで１時間）。
最終ｐＨ＝７．１６
肉眼的所見：粘稠、透明、無色のゲル。

【0096】

組成物の例
クリームの形態の本発明による数種の処方物は下記の組成を有する（量は組成物の総重量に対する質量パーセンテージで示す）。

【0097】

有利には、本発明による処方物は、０．５％〜３％の間のアセフィリンまたはその塩を含み、このパーセンテージは所望の保湿能に応じて調節される。
実施例１：

【0098】

【表3】

【0099】

【表4】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】