特許 6050654 グリセルアルデヒド由来終末糖化産物（ＡＧＥ）認識アプタマー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6050654

(24)【登録日】2016年12月2日

(45)【発行日】2016年12月21日

(54)【発明の名称】グリセルアルデヒド由来終末糖化産物（ＡＧＥ）認識アプタマー

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/115 20100101AFI20161212BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20161212BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20161212BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 HZNA

   C12N15/00 A

   G01N33/53 V

【請求項の数】6

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2012-240930(P2012-240930)

(22)【出願日】2012年10月31日

(65)【公開番号】特開2014-90669(P2014-90669A)

(43)【公開日】2014年5月19日

【審査請求日】2015年9月16日

(73)【特許権者】

【識別番号】899000079

【氏名又は名称】学校法人慶應義塾

(73)【特許権者】

【識別番号】599045903

【氏名又は名称】学校法人 久留米大学

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100111741

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 夏夫

(72)【発明者】

【氏名】井上 浩義

(72)【発明者】

【氏名】東元 祐一郎

【審査官】 小倉 梢

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／０７０６２１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Microvasc. Res.，２００７年，Vol. 74，p. 65-69

【文献】 J. Nucleic Acids，２０１２年１０月 ８日，Vol. 2012，Article ID 156482

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００ − １５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

グリセルアルデヒド由来終末糖化産物（AGE）を認識し結合するDNAアプタマーであって、ヌクレオチド間が部分的にホスホロチオエート化されている、以下の配列番号８、１１及び１３のいずれかに示される塩基配列[配列中、＊はその部分のヌクレオチド間がホスホロチオエート化されていることを示す]からなる少なくとも35塩基からなり、35％以上のヌクレオチド間がホスホロチオエート化されており、アデニンの5’側及びチミンの5’側のヌクレオチド間のすべてがホスホロチオエート化されており、塩基中のシトシン含有率が少なくとも35％であるか、又は塩基中のグアニン含有率が少なくとも32％である、DNAアプタマー。

【請求項2】

血清アルブミンに結合しない、請求項１記載のDNAアプタマー。

【請求項3】

表面プラズモン共鳴法で測定したグリセルアルデヒド由来終末糖化産物（AGE）との解離定数が１×10^-9Ｍ以下である、請求項１又は２に記載のDNAアプタマー。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれか１項に記載のDNAアプタマーを含む、グリセルアルデヒド由来終末糖化産物（AGE)を検出するための試薬。

【請求項5】

請求項１〜３のいずれか１項に記載のDNAアプタマーを含む、グリセルアルデヒド由来終末糖化産物（AGE)が関与する疾患を検出するための試薬。

【請求項6】

グリセルアルデヒド由来終末糖化産物（AGE)が関与する疾患が糖尿病合併症である、請求項５に記載の試薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は終末糖化産物（Advanced Glycation End-products; AGEs）を特異的に認識するDNAアプタマーに関する。本発明のDNAアプタマーはヌクレオチド間がホスホロチオエート化（S化）されている。

【背景技術】

【0002】

高齢化の進展あるいは、QOL改善の希求が高まる中で、生体内での糖化作用が注目されている。糖化とは、L.C.Maillardが1912年に発見した、タンパク質と還元糖(グルコース、フルクトースなど)の混合溶液の過熱による非酵素的な褐色反応であり、発見者の名を取って、メイラード反応とも呼ばれている。食品の加工・調理、貯蔵中にメイラード反応は進行し、アミノ酸の減少など、食品の劣化の指標となる一方、食品の着色や香り付けなどに寄与している。

【0003】

この糖化作用は近年、生体内、特に加齢、糖尿病、神経変性疾患、動脈硬化などに関連していることが明らかになり、医学面で注目されている。生体内では、血中に大量に存在するアルブミン、更には代謝回転が比較的長いコラーゲンやエラスチンなどは徐々にグルコースなどと糖化反応が起こる。生体内ではタンパク質と還元糖により、シッフ塩基が生成する。このシッフ塩基に酸などが関与すると比較的安定なアマドリ化合物となる。糖尿病において、血糖コントロールの指標となるヘモグロビンA1C(HbA1C)は、ヘモグロビンの末端がアマドリ化したもので、前日の食物栄養学的影響を受ける血糖値とは異なり、１ヶ月前程度の血糖コントロールを反映する。また、活性酸素産生にも関与している。これに対して糖化反応の後期段階(不可逆反応)で生成した物質を終末糖化産物(Advanced G1ycation End-products; AGEs)と呼ばれる。糖化反応によって生成する物質は、すべてAGEsと呼ばれるため、構造によって特定されるものではない。したがって、AGEsは体内に存在するタンパク質と還元糖の種類の積、またはその代謝物の数だけ種類が存在する。

【0004】

近年、１本鎖DNAや１本鎖RNAが特定の立体構造をとり、低分子やタンパク質等の種々の化合物を認識して結合して、抗体のような機能を発揮し得ることが報告されている（非特許文献１及び非特許文献２を参照）。このような分子をアプタマーと称し、ランダムな配列の中から特定のアプタマーを選別する方法として、SELEX法が報告されている（非特許文献１を参照）。

【0005】

AGEの中でもグリセルアルデヒド由来AGEは、AGEレセプター（RAGE)と結合し、RAGEを介して糖尿病性網膜症や糖尿病性腎症などの糖尿病血管合併症の発症や伸展に関与している、最も細胞毒性が強いAGEであり、該グリセルアルデヒド由来AGEを認識する１本鎖DNAを用いたアプタマーについて報告されている（特許文献１を参照）。また、グリセルアルデヒド由来AGEを認識するアプタマーを用いた、グリセルアルデヒド由来AGEを検出する方法について報告されている（特許文献２を参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】国際公開第WO2006/080262号国際公開パンフレット

【特許文献2】特開2008-224453号公報

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ellington A.D. et al., Nature, 1990年，346巻，818-822頁

【非特許文献2】Tuerk C. et al., Science, 1990年，249巻，505-510頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、多種存在する終末糖化産物（AGEs）の中で、最も細胞毒性が強いグリセルアルデヒド(G1yceraldehyde）由来AGEを認識する、特異性が向上したDNAアプタマーの提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

アプタマーとしてRNAとDNAが存在するが、この両者の間に本質的な違いは存在しない。ただし、DNAアプタマーの方が化学的に安定であるという特徴を持つ一方で、RNAアプタマーの方が、結合力が高く、研究・診断・治療等に用いるためにはRNAアプタマーが望ましいと言われている。本発明では、DNAアプタマーの安定性を保持したまま、RNAアプタマーに近い特異性を有したグリセルアルデヒド由来終末糖化産物（AGE）認識DNAアプタマーを見出した。

【0010】

本発明者らは、グリセルアルデヒド由来AGEs認識DNAアプタマーの作成を、（１）一本鎖ランダムオリゴDNAの作成、（２）グリセルアルデヒド由来AGE及びHSAの担体ビーズヘの結合、（３）SELEX法、（４）形質転換・大腸菌培養、（５）各種アプタマーの合成、並びに（６）結合能力の確認(ELISA法、表面プラズモン共鳴法、Pericyteアポトーシス実験)により行い、得られたDNAアプタマーの特性を検討した。本発明者らは、SELEX法で選択した最終的なデオキシヌクレオチドに、架橋する、チオ化する、アンカーを導入するなどの従来の安定化方法とは異なり、SELEX法の段階で、ヌクレオチド間がホスホロチオエート化(S化)された二本鎖DNAライブラリーを用いることによって、安定性を当初より担保したまま、結合特異性の高いDNAアプタマーの創成に成功し、本発明を完成させるに至った。

【0011】

すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] グリセルアルデヒド由来終末糖化産物（AGE）を認識し結合するDNAアプタマーであって、少なくとも35塩基からなり、ヌクレオチド間が部分的にホスホロチオエート化されている、DNAアプタマー。
[２] 35％以上のヌクレオチド間がホスホロチオエート化されている、[１]のDNAアプタマー。
[３] アデニンの5’側及びチミンの5’側のヌクレオチド間のすべてがホスホロチオエート化されている、[１]又は[２]のDNAアプタマー。
[４] 塩基中のシトシン含有率が少なくとも35％であるか、又は塩基中のグアニン含有率が少なくとも32％である、[１]〜[３]のいずれかのDNAアプタマー。
[５] 血清アルブミンに結合しない、[１]〜[４]のいずれかのDNAアプタマー。
[６] 50〜120塩基からなる、[１]〜[６]のいずれかのDNAアプタマー。
[７] 表面プラズモン共鳴法で測定したグリセルアルデヒド由来終末糖化産物（AGE）との解離定数が１×10^-9Ｍ以下である、[１]〜[７]のいずれかのDNAアプタマー。
[８] 以下の配列番号５〜１５のいずれかの配列[配列中、＊はその部分のヌクレオチド間がホスホロチオエート化されていることを示す]からなる塩基配列を含む、[１]〜[７]のいずれかのDNAアプタマー。

[９] 以下の配列番号８、１１及び１３のいずれかの配列[配列中、＊はその部分のヌクレオチド間がホスホロチオエート化されていることを示す]からなる塩基配列を含む、[１]〜[７]のいずれかのDNAアプタマー。

[１０] [１]〜[９]のいずれかのDNAアプタマーを含む、グリセルアルデヒド由来終末糖化産物（AGE)を検出するための試薬。
[１１] [１]〜[９]のいずれかのDNAアプタマーを含む、グリセルアルデヒド由来終末糖化産物（AGE)が関与する疾患を検出するための試薬。
[１２] グリセルアルデヒド由来終末糖化産物（AGE)が関与する疾患が糖尿病合併症である、[１１]の試薬。
[１３] [１]〜[９]のいずれかのDNAアプタマーを含む、抗グリセルアルデヒド由来終末糖化産物（AGE)剤。
[１４] SELEX法により部分的にホスホロチオエート化されたDNAアプタマーを製造する方法であって、鋳型DNAからPCRによりヌクレオチド間がホスホロチオエート化された二本鎖DNAライブラリーを得て、該二本鎖DNAライブラリーよりSELEX法で用いる一本鎖DNAライブラリーを得ることを含む、部分的にホスホロチオエート化されたDNAアプタマーを製造する方法。
[１５] 鋳型DNAからPCRによりヌクレオチド間がホスホロチオエート化された二本鎖DNAライブラリーを得るときに、基質としてα-Ｓ-デオキシチミジン三リン酸、α-Ｓ-デオキシシチジン三リン酸、α-Ｓ-デオキシアデノシン三リン酸又はα-Ｓ-デオキシグアノシン三リン酸を用いる、[１４]の部分的にホスホロチオエート化されたDNAアプタマーを製造する方法。

【発明の効果】

【0012】

本発明のグリセルアルデヒド由来終末糖化産物（AGE）を認識するDNAアプタマーは、ヌクレオチド間がホスホロチオエート化（S化）されているため安定であり、従来技術によるDNAアプタマーに比して、グリセルアルデヒド由来AGEに対してより高い結合特異性を有する。本発明のDNAアプタマーは、グリセルアルデヒド由来AGEの検出に用いることができ、また、グリセルアルデヒド由来AGEが関与する疾患の検出に用いることができる。さらに、グリセルアルデヒド由来AGEとRAGEの結合を阻止することができ、グリセルアルデヒド由来AGEが関与する疾患の予防又は治療剤として用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】１１種類のグリセルアルデヒド由来AGE特異的DNAアプタマーの配列を示す図である。

【図2】本発明のグリセルアルデヒド由来AGE認識RNAアプタマーの、ELISAで測定したグリセルアルデヒド由来AGEとの結合性を示す図である。

【図3】本発明のグリセルアルデヒド由来AGE認識RNAアプタマーの、表面プラズモン共鳴法結合試験で得られた結合解離曲線を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0015】

本発明のDNAアプタマーは高い特異性でグリセルアルデヒド由来終末糖化産物（AGE)を認識し結合する。一方、本発明のDNAアプタマーは血清アルブミンには結合しない。

【0016】

本発明のDNAアプタマーは、少なくとも35塩基からなり、好ましくは少なくとも50塩基からなる。また、最大塩基長は120塩基である。

【0017】

本発明のDNAアプタマーはヌクレオチド間が部分的にホスホロチオエート化されている。ここで、ヌクレオチド間がホスホロチオエート化されているとは、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合のリン酸基の酸素原子の1個が硫黄原子で置換されていることをいう。部分的にホスホロチオエート化されているとは、DNAアプタマーの少なくとも35％、好ましくは50％がホスホロチオエート化されていることをいう。また、好ましくはアデニン（A)及びチミン（T)の5’側のホスホジエステル結合においてホスホロチオエート化されており、さらに好ましくはすべてのアデニン（A)及びチミン（T)の5’側のホスホジエステル結合においてホスホロチオエート化されている。

【0018】

本発明のDNAアプタマーを構成する塩基中には、シトシン（C)またはグアニン（G)のいずれか一方を多く含むことが好ましい。シトシンが多い場合は、シトシン含有率は少なくとも35％、好ましくは少なくとも40％、さらに好ましくは少なくとも50％である。また、グアニンが多い場合は、塩基中のグアニン含有率は、少なくとも32％、好ましくは少なくとも35％、さらに好ましくは少なくとも40％である。このような塩基含有率であることにより、DNAアプタマーはグリセルアルデヒド由来AGEに結合しやすくなる。

【0019】

なお、ヌクレオチド間がホスホロチオエート化されている場合、そのヌクレオチド間の結合をホスホロチオエート結合という。また、本発明において、ホスホロチオエート化をS化と呼ぶ。

【0020】

本発明のDNAアプタマーは、グリセルアルデヒド由来AGEとの結合特異性が高く、表面プラズモン共鳴法で解離定数（Kd)を測定した場合、解離定数は、１×10^-9Ｍ以下であり、好ましくは7×10^-10Ｍ以下である。

【0021】

本発明のDNAアプタマーは、具体的には、配列番号５〜１５で表される塩基配列からなる。図１に各塩基配列において、ホスホロチオエート化されている部分を示す。図１中塩基の間の＊で示す箇所のヌクレオチド間がホスホロチオエート化されている。この中でも図１の配列番号８、１１又は１３で表される塩基配列からなるDNAアプタマーが好ましい。図１の配列番号８、１１及び１３で表される塩基配列からなるDNAアプタマーの表面プラズモン共鳴法で測定したグリセルアルデヒド由来終末糖化産物（AGE）との解離定数（Kd)は、それぞれ、5.98×10^-10Ｍ、3.46×10^-10Ｍ及び5.67×10^-10Ｍである。

【0022】

本発明のDNAアプタマーは、ビオチン、ジゴキシゲニン等の修飾物質で修飾されていてもよい。図１の配列番号１６〜２６で表される配列がビオチンで修飾されたビオチン化DNAアプタマーであり、図１の配列番号２７〜３７で表される配列がジゴキシゲニンで修飾されたジゴキシゲニン化DNAアプタマーである。ビオチン化、ジゴキシゲニン化等の修飾は公知の方法で行うことができる。

【0023】

本発明のグリセルアルデヒド由来AGEを認識するDNAアプタマーは、アプタマーを得るための一般的な方法であるSELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)法によって得ることができる。SELEX法による合成は、Ellington A.D. et al., Nature, 1990年，346巻，818-822頁等の記載に従って行うことができる。具体的には以下の方法で行う。

【0024】

まず、任意の２つのプライマー配列で挟まれた適当な長さのランダム配列を含むテンプレートDNAを合成する。本発明においては、ランダム配列の長さは、35塩基〜120塩基が好ましい。テンプレートDNA配列の例として、90塩基からなる配列番号１に表すDNAが挙げられる。このテンプレートDNAをPCR(Polymerase Chain Reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）で増幅して、二本鎖DNAライブラリーを得る。この際、ヌクレオチド間をホスホロチオエート化する。PCRによりDNAを合成するときに、デオキシリボヌクレオシドトリリン酸のα位のリン原子に結合した酸素を硫黄に置換したものを基質として用いることによってホスホロチオエート結合を導入することができる。このような基質としては、α-Ｓ-デオキシチミジン三リン酸、α-Ｓ-デオキシシチジン三リン酸、α-Ｓ-デオキシアデノシン三リン酸及びα-Ｓ-デオキシグアノシン三リン酸等を例示することができる。DNAを増幅するときに、デオキシヌクレオシド三リン酸に代えてα-Ｓ-デオキシヌクレオオシド三リン酸を基質とすることにより、合成されたオリゴヌクレオチドはホスホロチオエート化される。具体的には、例えば、アデニン（A)及びチミン（T)の5’側のホスホジエステル結合においてホスホロチオエート化する場合、ホスホロチオエート化するためには、PCRを行う際にデオキシアデノシン三リン酸の代わりにデオキシアデノシン三リン酸類似体である2’-デオキシアデノシン-5’-O-(1-チオ三リン酸）、Sp-異性体(Sp-dATP-α-5)及びチミジン三リン酸の代わりにチミジン三リン酸類似体である2’-デオキシチミジン-5’-O-(1-チオ三リン酸）、Sp-異性体(Sp-dTTP-α-5)を添加すればよい。また、ホスホロチオエート化は、固相ホスホルアミダイト(Phosphoramidite)法でDNAを合成するときに、ヨウ素水等による酸化工程に代えて適当なＳ化試薬（ホスホロチオエート化試薬）を用いて酸化処理を行うことにより通常のリン酸ジエステル結合の代わりにホスホロチオエート結合をオリゴヌクレオチドに導入することができる。Ｓ化試薬としては、テトラエチルチウラムジスルフィド（TETD）やBeaucage試薬等が挙げられる。

【0025】

得られたホスホロチオエート化された二本鎖DNAライブラリーより一本鎖DNAライブラリーを得て、SELEX法用のDNAライブラリーを得る。次いで、このDNAライブラリーを標的物質であるグリセルアルデヒド由来AGEと結合させる。この際、グリセルアルデヒド由来AGEは、樹脂ビーズ等の担体に固相化させて用いればよい。

【0026】

次いで、結合しなかったDNAを除去し、結合したDNAを抽出する。抽出は、例えば、フェノール・クロロホルムを用いて行うことができる。抽出により回収したDNAを精製し、再度上記プライマー配列を用いてPCRにより増幅する。DNAの精製は、例えばエタノール沈殿法により行うことができる。

【0027】

PCR増幅、グリセルアルデヒド由来AGEへ結合するDNAの回収を５〜15ラウンド繰り返し行うことにより、グリセルアルデヒド由来AGEへの特異性が高い、部分的にホスホロチオエート化されたDANアプタマーを得ることができる。

【0028】

本発明においては、さらに、得られたDNAアプタマーを大腸菌を用いてクローニングする。クローニングは、得られたDNAアプタマーをクローニングベクターに導入し、大腸菌を形質転換して行う。クローニングしたDNAアプタマーについて配列を決定する。

【0029】

一旦配列決定されたDNAアプタマーは、配列情報に基づいて化学合成により合成することができる。

【0030】

得られたDNAアプタマーのグリセルアルデヒド由来AGEとの結合性は、グリセルアルデヒド由来AGEを固相化したマイクロタイタープレートを用いたELISA等により検定することができる。この際、DNAアプタマーをビオチンやジゴキシゲニンで標識して用いればよい。標識は公知の方法で行うことができる。最終的には、酵素や蛍光物質で標識したアビジン、抗ビオチン抗体、抗ジゴキシゲニン抗体等を用いてグリセルアルデヒド由来AGEとDNAアプタマーとの結合を検出することができる。また、表面プラズモン共鳴法によっても結合性を検定することができ、解離定数を決定することができる。さらに、周皮細胞（pericyte)アポトーシス試験により得られたDNAアプタマーを評価することができる。周皮細胞アポトーシス試験は、ウシ周皮細胞を用いて行うことができ、ウシ周皮細胞を、屠殺後のウシから取り出して、周皮細胞を、グリセルアルデヒド由来AGEとDNAアプタマーと共に培養し、DNAアプタマーにより周皮細胞のアポトーシスが阻害されるかどうかを検定すればよい。

【0031】

本発明のグリセルアルデヒド由来AGEを認識するDNAアプタマーは、グリセルアルデヒド由来AGEの検出に用いることができる。検出は、上記のELISAや表面プラズモン共鳴法等によりグリセルアルデヒド由来AGEとDNAアプタマーの結合を検出することにより行うことができる。本発明は、本発明のDNAアプタマーを含むグリセルアルデヒド由来AGEを検出するための試薬又はキットも包含する。

【0032】

グリセルアルデヒド由来AGEの検出は、グリセルアルデヒド由来AGEが関与する疾患の検出、該疾患を検出するためのデータをとる方法、該疾患の検出を補助する方法等に用いることができる。グリセルアルデヒド由来AGEが関与する疾患としては、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害などの糖尿病合併症、アルツハイマー病などの神経変性疾患、腫瘍等が挙げられる。

【0033】

さらに、本発明のグリセルアルデヒド由来AGEを特異的に認識するDNAアプタマーは、グリセルアルデヒド由来AGEがRAGEに結合するのを阻止することができる。従って、該DNAアプタマーは、グリセルアルデヒド由来AGEがRAGEに結合するのを阻止する抗グリセルアルデヒド由来AGE剤として用いることができる。従って、該DNAアプタマーは、上記のグリセルアルデヒド由来AGEが関与する疾患の予防、治療に用いることができる。本発明は、本発明のグリセルアルデヒド由来AGEを特異的に認識するDNAアプタマーを有効成分として含むグリセルアルデヒド由来AGEが関与する疾患の予防又は治療薬も包含する。

【0034】

該予防又は治療薬は、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤等を含んでいてもよい。担体としては錠剤用の担体、賦形剤としては乳糖、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。また、水性の注射用薬の場合は、生理食塩水、ブドウ糖、その他の補助薬、等張液等などが用いられる。また、アルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤等の溶解補助剤を含んでいてもよい。油性の液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを含んでいてもよい。その投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、数日又は数週間又は数ヶ月おきに１回あたり、DNAとして0.001mg〜100mgを投与すればよい。

【実施例】

【0035】

本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

【0036】

実施例１ 一本鎖ランダムオリゴDNAの作成
40残基のランダム領域とその両側に各25残基のプライマー部位を含む計90残基の一本鎖ランダムオリゴDNAの合成は、（株）オペロンバイオテクノロジー社に依頼した。

【0037】

DNAの合成方法（ホスホアミダイト法）
（１）3’末端のヌクレオチドを、3’水酸基を介してCPG(controlled pore glass)担体に結合したものをカラムに詰めた。
（２）リボースの5’位の保護基であるジメトキシトリチル基をトリクロロ酢酸によって除去した。（Detritylation）
（３）リボースの3’位の水酸基がリン酸シアノエチルアミダイト誘導体である２番目のヌクレオチドを、脱トリチル化された１番目のヌクレオチドの5’水酸基に塩基触媒（テトラゾール）を用いて結合させた。（Coupling）
（４）未反応の5’水酸基を無水酢酸によってアセチル化した。(Capping)
（５）２つのヌクレオチド間の結合を、ヨードを用いて酸化して、3価のリンから5価のリン酸エステルへ変換した。(Oxidation)
（６）（２）〜（５）の操作を目的の鎖長になるまで繰り返す。ランダム部分の配列は、（３）のCoupling反応の際、４種のヌクレオチドアミダイト混合物を使用して行った。
（７）Coupling反応後、カラムからアンモニア処理によってDNAオリゴを切り出し、HPLCによって精製した。
（８）凍結乾燥後、適量の水に溶解し、SELEXライブラリーの鋳型とした。

【0038】

実施例２ グリセルアルデヒド由来AGE及びHSAの担体ビーズへの結合
１．グリセルアルデヒド由来AGEのビーズへの固定化には、PIERCE社のSulfoLink Coupling gel (cat# 20401)を使用し、製品のインストラクションに従って固定化した。
（１）Coupling gelをカラムにとり、coupling buffer (50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 8.5)で平衡化した。
（２）Coupling bufferに溶解したグリセルアルデヒド由来AGEをcoupling gelと混合し、室温で1時間インキュベートした。
（３）反応終了後、coupling bufferでカラムを数回洗浄した。
（４）L-Cysteinをcoupling bufferに溶解し、coupling gelと混合して、室温で30分インキュベートした。
（５）反応終了後、coupling buffer及びPBSでカラムを数回洗浄した。
（６）反応前、反応後の吸光度を測定することによってグリセルアルデヒド由来AGEの固定化量を算出した。
（７）固定化後のgel（ビーズ）は、小分けし、冷暗所に保存した。

【0039】

２．ヒト血清アルブミン（HSA）の担体ビーズへの固体化は、グリセルアルデヒド由来AGEと同様の方法でおこなった。

【0040】

実施例３ SELEX法の実施
（１）[1]で合成した一本鎖ランダムオリゴDNA（配列番号１）を鋳型にして、forwardプライマー（配列番号２）と5’側がビオチン化されたreverse プライマー（配列番号４）を用いてPCR (１サイクル: 98℃, 10秒; 50℃, 10秒; 72℃, 10秒 ×30 サイクル)を行った。この時、ヌクレオチドとして、dCTP, dGTP, Sp-dATP-αS（2’-deoxyadenosine-5’-O-(1-thiotriphosphate), Sp-isomer; Biolog社 CAS#80875-87-2）、Sp-TTP-αS (Sp-dTTP-αS) (Thymidine-5’-O-(1-thiotriphosphate), Sp-isomer; Biolog社 CAS#83199-32-0)）を用いることによって、ヌクレオチド間がホスホロチオエート化(S化)された二本鎖DNAライブラリーを得た。このS化によってDNAのヌクレアーゼ耐性が向上することが知られている。
（２）PCR終了後、Streptavidin Mag Sepharose(GE healthcare, cat#28-9857-38)を加えてBiotin化二本鎖DNAライブラリープールを吸着させた。PBSで洗浄後、0.1M NaOHを加えることによって一本鎖DNAライブラリーを単離した。一本鎖DNAライブラリーをエタノール沈殿によって精製し、SELEX用のDNAライブラリーとした。
（３）SELEX用DNAライブラリーを0.5%のTween 20を含むPBS(PBS-T)に溶かし、98℃で5分加熱後、ただちに冷却した。
（４）DNAライブラリーとグリセルアルデヒド由来AGEを固定化させたビーズとを混合し、室温で30分インキュベートした。
（５）インキュベート後、PBS-Tでビーズを数回洗浄した。
（６）フェノール・クロロホルム抽出によって、グリセルアルデヒド由来AGEビーズに結合したDNAライブラリーを溶出した。
（７）溶出したDNAライブラリーをエタノール沈殿によって精製した。
（８）精製したDNAライブラリーをHSA固定化ビーズと混合し、室温で30分インキュベートした。
（９）素通りした（HSAに結合しなかった）ライブラリーDNAを回収して、エタノール沈殿によって、精製した。
（１０）精製したDNAライブラリーを鋳型にして、（１）〜（９）の操作を10ラウンド繰り返した。

【0041】

実施例４ 形質転換・大腸菌培養
10ラウンド後のDNAライブラリーを鋳型として、forwardとreverse２種類のプライマー（配列番号２及び３）を用いてPCRを行い、アガロースゲル電気泳動によって精製し、グリセルアルデヒド由来AGE特異的DNAライブラリーを得た。このDNAライブラリーをクローニングベクター(Invitrogen社: Zero Blunt(登録商標） TOPO PCR Cloning Kit for Sequencing (cat# K2875J10))へ導入し、クローン化後、配列を決定した。
（１）DNAアプタマー（PCR産物）とクローニングベクター（TOPO vector）とを混合し、室温で5分インキュベートした。
（２）反応終了後、反応液の一部をコンピテントセルに加え、氷冷下で30分インキュベートした。
（３）42℃、30秒ヒートショックした後、氷上で2分間冷却した。
（４）SOC培地を加えて37℃、１時間培養した。
（５）適量を寒天プレート（50μg/mlアンピシリンを含むLB培地）にスプレッドし、37℃で一晩培養した。
（６）無作為に数十個のクローンを選び、アルカリ法によってプラスミドDNAを調製した。
（７）各プラスミドのDNAシークエンス解析を行い、11種のグリセルアルデヒド由来AGE特異的DNAアプタマー（図１に示す配列番号５〜１５）を得た。図１に、１１種類のグリセルアルデヒド由来AGE特異的DNAアプタマーの配列を示す。図１中の配列番号１６〜２６で表される配列は、5’側にビオチンを付加したDNAアプタマーの配列であり、配列番号２７〜３７で表される配列は5’側にジゴキシゲニンを付加したDNAアプタマーの配列である。図１の配列中の＊は、＊の両側の塩基の間のホスホジエステル結合を形成するリン酸基のS化されていることを表す。

【0042】

実施例５ 各種アプタマーの合成
（１）SELEX法によって得られた11種のグリセルアルデヒド由来AGE特異的アプタマー(図１に示す配列番号5〜15)をそれぞれ化学合成した。その際、5’側にビオチン（Biotin）を付加したもの（図１に示す配列番号16〜26）、ジゴキシゲニン（Digoxigenin）を付加したもの(図１に示す配列番号27〜37)を合わせて合成した。合成は（株）オペロンバイオテクノロジー社に依頼した。

【0043】

実施例６ ELISA結合試験
（１）Pierce NeutrAvidin(商標）High Binding Capacity Coated 96-Well Plates (Pierce社、cat#15508)をPBS-Tで洗浄した。
（２）Biotin化DNAアプタマー(図１に示す配列番号16〜26)とDigoxigenin化DNAアプタマー(図１に示す配列番号27〜37)をPBS-Tに溶かして、98℃で3分間加温した後、直ちに冷却した。
（３）Biotin化DNAアプタマー(図１に示す配列番号16〜26)をウェル上に添加し、室温で1時間インキュベートした。
（４）PBS-Tで洗浄後、グリセルアルデヒド由来AGEを10 ug/mlの濃度で添加して、室温で30分間インキュベートした。
（５）PBS-Tで洗浄後、Digoxigenin化DNAアプタマー(図１に示す配列番号27〜37)をウェル上に添加し、室温で1時間インキュベートした。
（６）PBS-Tで洗浄後、POD標識ジゴキシゲニン抗体(Roshe社、cat#1207733)を添加して、室温で30分間インキュベートした。
（７）PBS-Tで洗浄後、ナカライテスク社のELISA POD基質 ABTS キット(ナカライテスク社、cat#14351-80)を使って染色し、405 nmの吸光度を測定した。

【0044】

結果を図２に示す。図２に示すように、１１種のDNAアプタマーはいずれもグリセルアルデヒド由来AGEとの結合が認められ、その中でも図１に示す配列番号8、11及び13に表される配列を有するDNAアプタマーの結合性が高かった。

【0045】

実施例７ 表面プラズモン共鳴法結合試験
ELISA結合試験によって強い結合が観察された、DNAアプタマー（図１に示す配列番号8、11及び13）について、表面プラズモン共鳴法によってグリセルアルデヒド由来AGEに対するKd値を計測した。
（１）センサーチップCM5 （GE healthcare, cat# BR-1000-12）にグリセルアルデヒド由来AGEをそれぞれamine coupling kit(GE healthcare, cat # BR-1000-50)を使用して固定化した。
（２）DNAアプタマー（図１に示す配列番号8、11及び13）をそれぞれ、5 nM〜10 nMの濃度で送液し、結合解離曲線を得た。結合解離曲線を図３に示す。
（３）得られた結合解離曲線をBIAevaluation ver3.0（BIAcore社）を使用して解析した。その結果、グリセルアルデヒド由来AGEに対する解離定数（Kd）値は、5.98×10^-10Ｍ（図１に示す配列番号８）、3.46×10^-10Ｍ（図１に示す配列番号１１）、5.67×10^-10Ｍ(図１に示す配列番号１３)であることがわかった。一方、国際公開第WO2006/080262号国際公開パンフレットに記載のグリセルアルデヒド由来AGE認識DNAアプタマーは結合性が低く、解離定数は求められなかった。

【産業上の利用可能性】

【0046】

本発明のDNAアプタマーは、グリセルアルデヒド由来終末糖化産物（AGE)が関与する疾患の検出や予防又は治療に用いることができる。

【配列表フリーテキスト】

【0047】

配列番号１〜１５ 合成

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]