特許 6050811 アルミニウムアジュバントを含むＨＰＶワクチン製剤およびその産生方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6050811

(24)【登録日】2016年12月2日

(45)【発行日】2016年12月21日

(54)【発明の名称】アルミニウムアジュバントを含むＨＰＶワクチン製剤およびその産生方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/12 20060101AFI20161212BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20161212BHJP

   A61K 47/10 20060101ALI20161212BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20161212BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20161212BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20161212BHJP

   A61K 47/34 20060101ALI20161212BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20161212BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/12

   A61K39/39

   A61K47/10

   A61K47/02

   A61K47/26

   A61K47/22

   A61K47/34

   A61K9/19

【請求項の数】22

【全頁数】41

(21)【出願番号】特願2014-517197(P2014-517197)

(86)(22)【出願日】2012年6月22日

(65)【公表番号】特表2014-520160(P2014-520160A)

(43)【公表日】2014年8月21日

(86)【国際出願番号】US2012043694

(87)【国際公開番号】WO2012177970

(87)【国際公開日】20121227

【審査請求日】2015年5月18日

(31)【優先権主張番号】61/500,829

(32)【優先日】2011年6月24日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】596129215

【氏名又は名称】メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション

【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】230105223

【弁護士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】バンバニ，アクヒレシユ

(72)【発明者】

【氏名】チンタラ，ラメシユ，ブイ

【審査官】 中尾 忍

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５２０８７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５０２７４７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ９／１９

Ａ６１Ｋ ３９／３９

Ａ６１Ｋ ４７／０２

Ａ６１Ｋ ４７／１０

Ａ６１Ｋ ４７／２２

Ａ６１Ｋ ４７／２６

Ａ６１Ｋ ４７／３４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）治療的に有効な量のアルミニウムアジュバント上に吸着された少なくとも１のＨＰＶ型のＨＰＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、ここでＨＰＶ型の該ＶＬＰは１０〜２００ｍｃｇ／ｍｌの濃度で存在し、且つ、該ＶＬＰは、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３およびＨＰＶ８２から成る群より選択される、
および
ｂ）１％ないし１０％ｗ／ｖマンニトールおよび０．５％ないし１０％ｗ／ｖショ糖を含み、更に
ｃ）任意の塩
を含んでいてもよい、凍結乾燥または凍結ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ワクチン製剤であって、
ここで、該製剤は、凍結乾燥または凍結‐融解プロセスストレス後に２５℃で１ヶ月間安定である、製剤。

【請求項2】

０．１５Ｍないし０．３２Ｍ ＮａＣｌをさらに含む請求項１の製剤。

【請求項3】

５ｍＭないし２０ｍＭヒスチジンをさらに含む請求項１又は２に記載の製剤。

【請求項4】

ポリソルベート２０およびポリソルベート８０から成る群より選択される界面活性剤の０．０１％ｗ／ｖないし０．０３％ｗ／ｖ濃度をさらに含む請求項１〜３のいずれか一項の製剤。

【請求項5】

該界面活性剤が０．０１％ｗ／ｖの濃度で存在するポリソルベート８０である請求項４の製剤。

【請求項6】

マンニトールが４％ないし７％ｗ／ｖの濃度で存在し、かつショ糖が１％ないし５％ｗ／ｖの濃度で存在する請求項１〜５のいずれか一項の製剤。

【請求項7】

該アルミニウムアジュバントが水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびアルミニウムヒドロキシホスファートから成る群より選択される請求項６の製剤。

【請求項8】

該ＨＰＶ ＶＬＰがＨＰＶ６、１１、１６および１８型由来である請求項７の製剤。

【請求項9】

３１、３３、４５、５２および５８型から成る群より選択される少なくとも１の追加のＨＰＶ型のＨＰＶ ＶＬＰをさらに含む請求項８の製剤。

【請求項10】

該製剤が凍結乾燥されている請求項１〜９のいずれか一項の製剤。

【請求項11】

該製剤が凍結されている請求項１〜９のいずれか一項の製剤。

【請求項12】

該製剤が凍結乾燥または凍結‐融解プロセスストレス後に、２５℃で３か月間安定である請求項１〜９のいずれか一項の製剤。

【請求項13】

該製剤が凍結乾燥または凍結‐融解プロセスストレス後に、２５℃で６か月間または３７℃で３０日間安定である請求項１２の製剤。

【請求項14】

該製剤が凍結乾燥または凍結‐融解プロセスストレス後に、３７℃で３か月間安定である請求項１〜９のいずれか一項の製剤。

【請求項15】

該製剤が凍結乾燥または凍結‐融解プロセスストレス後に、２〜８℃で６か月間にわたり安定である請求項１〜９のいずれか一項の製剤。

【請求項16】

（ａ）（ｉ）アルミニウム塩アジュバント上に吸着された少なくとも１のＨＰＶ型のＨＰＶ ＶＬＰであって、ここで該少なくとも１のＨＰＶ型のＶＬＰは１０〜２００ｍｃｇ／ｍｌの濃度で存在しており、および該ＶＬＰはＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３およびＨＰＶ８２から成る群より選択される、（ｉｉ）１％ないし１０％ｗ／ｖマンニトール、および（ｉｉｉ）５％ないし１０％ｗ／ｖショ糖を含む液体ＨＰＶワクチン製剤を調製すること、
（ｂ）該液体製剤を凍結して凍結製剤を製造すること、および
（ｃ）該凍結製剤を乾燥させて凍結乾燥ＨＰＶワクチン製剤を提供すること、を含む安定な凍結乾燥ＨＰＶワクチン製剤を製造する方法であって、
ここで、該製剤は、凍結乾燥後に２５℃で１ヶ月間安定である、方法。

【請求項17】

該液体製剤が５ｍＭないし２０ｍＭヒスチジンをさらに含む請求項１６の方法。

【請求項18】

該液体製剤が５０ｍＭないし３５０ｍＭ ＮａＣｌをさらに含む請求項１７の方法。

【請求項19】

該液体製剤が０．００５％ないし０．０３％ｗ／ｖの濃度で存在するポリソルベート８０をさらに含む請求項１８の方法。

【請求項20】

該液体製剤がＨＰＶ１６および１８型のＨＰＶ ＶＬＰを含む請求項１９の方法。

【請求項21】

該液体製剤がＨＰＶ６および１１型のＨＰＶ ＶＬＰをさらに含む請求項２０の方法。

【請求項22】

（ａ）（ｉ）アルミニウム塩アジュバント上に吸着された少なくとも１のＨＰＶ型のＨＰＶ ＶＬＰであって、ここで該少なくとも１のＨＰＶ型のＶＬＰは１０〜２００ｍｃｇ／ｍｌの濃度で存在しており、および該ＶＬＰはＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３およびＨＰＶ８２から成る群より選択される、（ｉｉ）１％ないし１０％ｗ／ｖマンニトール、ならびに（ｉｉｉ）５％ないし１０％ｗ／ｖショ糖を含む液体ＨＰＶワクチン製剤を調製すること、ならびに
（ｂ）凍結製剤を製造するために該液体製剤を凍結すること、を含む安定な凍結ＨＰＶワクチン製剤を製造する方法であって、
ここで、該製剤は、凍結‐融解プロセスストレス後に２５℃で１ヶ月間安定である、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、凍結および／または凍結乾燥の後に増強された抗原安定性を示す、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原製剤を提供する。より具体的に本発明は、アルミニウム塩アジュバントに結合されたＨＰＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む安定なＨＰＶワクチン製剤およびその産生方法を提供する。
本特許出願は、２０１１年６月２４日出願の米国仮特許出願第６１／５００，８２９号の権利を主張し、その開示内容は内容全体が参照され本明細書において援用される。

【背景技術】

【0002】

アジュバントとして既知であり、目的の抗原に対する免疫応答を増強し得る化合物とのワクチンの共投与が広範に研究されてきた。目的の抗原に対する免疫応答を増強することに加えて、いくつかのアジュバントは、所望の免疫応答を誘発すのに必要な抗原量を減少させるために、または持続性の免疫応答を誘導すること、あるいは、疾病からの防護を提供することを目的とした臨床投与計画において、必要とされる注射回数を減少させるために使用され得る。

【0003】

アルミニウムに基づく化合物は、アジュバント活性を有することが６０年以上前に特定された（総説としては、Ｌｉｎｄｂｌａｄ，Ｅ．Ｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８２：４９７−５０５（２００４）；Ｂａｙｌｏｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：Ｓ１８−Ｓ２３（２００２）を参照されたい）。アルミニウムアジュバントは、適切な投与量で使用される場合には一般的に安全であるとみなされる。部分的にはその低コストおよびヒト患者における使用の長い歴史のために、アルミニウム塩アジュバントは、ヒトワクチンにおいて使用される最も普及したアジュバントである。

【0004】

アルミニウム塩でアジュバン化されたワクチンは、典型的には加熱または凍結等の温度変化に極めて敏感である液剤として製剤化される。アルミニウム塩を含有するワクチンの凍結は、アルミニウム塩の物理的構造に不可逆的な損傷を引き起こし、その損傷はアジュバント粒子の凝集から生じる。これはアジュバント活性の低下、そして最後にワクチン効力の低下をもたらす。このため、当該ワクチン製剤は、狭い温度範囲、好ましくは２℃と８℃の間に維持されなければならず、そのことがワクチンの輸送および保存の間の堅牢なコールドチェーン（低温流通体系）を要求する。コールドチェーンの保守管理は、特に開発途上国において経済的に常に実行可能であるとは限らない。加えて、アルミニウム塩でアジュバント化されたワクチンの偶発的な凍結は、開発途上国および先進国の双方における共通の問題である（Ｃｌａｐｐら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１００（２）：３８８−４０１（２０１１）；Ｍａｔｔｈｉａｓら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２５（２０）：３９８０−８６（２００７））。凍結ワクチンの積み荷は、莫大なコストで廃棄されるに違いない。また懸念されることは、以前に凍結された低効力のワクチンが患者に不注意に与えられて、低下した効果をもたらしてしまう可能性である。

【0005】

いくつかの方法が、アルミニウム塩を含有するアジュバントについて適切な温度に維持する問題を扱うために提案された。一つの有望な解決法は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールまたはグリセリン等の製剤成分の添加により凍結を防止することである（Ｂｒａｕｎ，Ｌ．Ｊ．ら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２７：４６０９−４６１４（２００９）；Ｂｒａｕｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２７：７２−７９（２００９））。Ｂｒａｕｎらは、上掲書、プロピレングリコールが、濃度が低すぎて凍結を防止することができない濃度においてさえも、特定のワクチンにおける凍結‐誘導されたアジュバント凝集を防止し得ることを示した。

【0006】

液体ワクチン製剤に代わる凍結‐乾燥ワクチン製剤の使用は、ワクチンの輸送および保存に関連するいくつかの問題点を軽減し得るが、しかし凍結乾燥のプロセスもまたアジュバント粒子の凝集および効力の低下に関連する（Ｍａａら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９２（２）：３１９−３３２（２００３））。Ｃｌａｕｓｅｉら（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９７：２０４９−６１（２００８））およびＲａｎｄｏｌｐｈら（ＷＯ ２００８／１１８６９１）は、凍結および凍結乾燥の間のアルミニウムアジュバントの凝集が製剤への高濃度のトレハロース（例えば、１５％）の添加により軽減し得ることを示した。Ｗｏｌｆｆら（Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ＆ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ａ：Ｐｈｙｓｉｏｃｈｅｍ Ｅｎｇ．Ａｓｐｅｃｔｓ ３３０：１１６−１２６（２００８））もまた、アルミニウムを含有するワクチンを低温ストレスから防護するための高濃度のトレハロースの使用を示唆する。またＷｏｌｆｆらによって候補として提案されたアルミニウムアジュバントの凝集を防止するための製剤成分は、ＰＶＰ Ｋ２５（ポリビニルピロリドンＫ２５）、ＨＥＳ（ヒドロキシエチルデンプン）４５０および２００、ショ糖およびソルビトールであった。Ｍｉｚｕｎｏら（欧州特許第０１３０６１９Ｂ１号）は、少なくとも１のショ糖および少なくとも１のコロイド状物質と組み合わせた少なくとも１のアミノ酸またはその塩の使用を提案する。

【0007】

該製剤が凍結または凍結乾燥の際にその物理的および免学的特性を維持することができて、ワクチンの抗原がアルミニウムアジュバント上に吸着されている液体ワクチン製剤を開発することは有用であろう。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、増強された抗原安定性を示すヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原製剤を提供する。より具体的に本発明は、アルミニウム塩アジュバント上に吸着され、しかもショ糖およびマンニトールおよび任意の塩との組合せをさらに含む少なくとも１のＨＰＶ型のＨＰＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む安定なＨＰＶワクチン製剤を提供する。本発明のワクチン製剤は、凍結‐融解および凍結‐乾燥後に安定である。また、アルミニウム塩アジュバント、ショ糖およびマンニトール上に吸着された、少なくとも１のＨＰＶ型のＨＰＶ ＶＬＰを含む凍結乾燥および凍結ＨＰＶワクチン製剤も提供する。

【0009】

本発明はまた、該製剤が、（ａ）アルミニウムアジュバント上に吸着された少なくとも１のＨＰＶ型のＨＰＶ ＶＬＰ（ここで各ＨＰＶ型のＶＬＰは１０〜２００ｍｃｇ／ｍｌの濃度で存在し、ＶＬＰはＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３およびＨＰＶ８２から成る群から選択されており）、および（ｂ）約１％ないし約１０％ｗ／ｖマンニトールおよび約０．５％ないし約１０％ショ糖を含む、上記のＨＰＶ製剤にも関する。本発明の製剤はまた、制限されるものではないが塩、ヒスチジンおよび界面活性剤を含む追加の成分も含み得る。本発明はまた、本明細書に記載の通り凍結または凍結‐乾燥ＨＰＶワクチンも提供する。

【0010】

本発明の安定なワクチン製剤を作成する方法もまた提供する。その為に本発明は、（ａ）（ｉ）アルミニウム塩アジュバント上に吸着された少なくとも１のＨＰＶ型のＨＰＶ ＶＬＰ（ここで少なくとも１のＨＰＶ型のＶＬＰは１０〜２００ｍｃｇ／ｍｌの濃度で存在し、ＶＬＰはＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３およびＨＰＶ８２から成る群より選択されており）、（ｉｉ）約１％ないし約１０％ｗ／ｖマンニトール、および（ｉｉｉ）約０．５％ないし約１０％ショ糖を含む、液体ＨＰＶワクチン製剤を製剤化すること、ならびに（ｂ）凍結されたワクチン製剤を産生するために液体製剤を凍結することを含む安定な凍結されたＨＰＶワクチン製剤を産生するための方法を提供する。本発明の方法の追加の実施形態は、凍結された製剤が凍結乾燥製剤を産生するために乾燥されて提供される。

【0011】

本明細書全体にわたっておよび添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈から明らかでない限り、複数形への言及が含まれる。

【0012】

本明細書および添付の特許請求の範囲全体にわたって用いる場合、以下の定義および略語が適用される。

【0013】

用語「ＳＷＦＩ」は、注射用滅菌水を表す。

【0014】

用語「ＢＷＦＩ」は、注射用静菌水を表し、抗菌防腐剤を含む滅菌水である。

【0015】

用語「ＡＰＩ」は、活性医薬成分、例えばＨＰＶ ＶＬＰを表し、それは、生物学的に活性（即ち適切な免疫応答を誘導することが可能）であり、それを必要とする人間または動物に体し治療的または予防的な恩恵を与える、本明細書で開示される製剤の一成分である。本明細書で用いられる場合、ＡＰＩはワクチン活性成分である。

【0016】

用語「製剤」は、１または複数の追加成分と一緒に、活性医薬成分または活性生物学的成分を含有する組成物を表す。用語「製剤」は、本明細著で用語「医薬組成物」、「ワクチン組成物」および「ワクチン製剤」と同じ意味で使用される。製剤は、液体または個体（例えば、凍結乾燥品）であってよい。適切な方法で含有され得る追加の成分には、薬学的に許容可能な賦形剤、添加剤、希釈剤、緩衝剤、糖、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）、キレート剤、界面活性剤、ポリオール、増量剤、安定剤、リオプロテクタント、可溶化剤、乳化剤、塩、アジュバント、浸透圧増強剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール、ソルビトール）、送達媒体および抗菌防腐剤が含まれる。

【0017】

医薬品用の許容可能な製剤成分は、投与量および用いる濃度において受容者に対し無毒である。典型的には、「製剤」はＡＰＩの服用一回分であり、それを必要とするただ一人の患者または動物に送達され得る。用語「多用量」は、ＡＰＩの２用量以上を含有し、患者に対し２回以上投与され得る製剤を表す。多用量製剤は、典型的には抗菌防腐剤を含む。用語「製剤」は、本明細書において用語「組成物」、「生物学的成分」および「医薬組成物」と同じ意味で用いられる。

【0018】

用語「ケーキ」は、液体製剤が本明細書に記載の通り凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｏｒ ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）されたときに生じる乾燥したペレットを表す。ケーキの外観は、凍結乾燥プロセスの凍結乾燥製剤の特性への強い影響を部分的に示している。本明細書で用いられる場合、「乾燥ケーキ」は、約２０％以下の残留水分を含むケーキを表す。本発明のいくつかの実施形態において、乾燥ケーキの水分含量は、１５％以下、１０％以下または５％以下である。別の実施形態において、乾燥ケーキの水分含量は、約０．１％ないし約１０％、約０．１％ないし約６％、約０．５％ないし約１０％または０．５％ないし約６％の範囲内である。

【0019】

用語「再構成時間」は、生じた再構成液体製剤が澄明化しケーキが溶解されるように、乾燥凍結乾燥製剤（ケーキ）を再水和するために必要とされる時間を表す。

【0020】

用語「治療的に有効な量」は、ヒトまたは動物において所望の治療効果を生み出すのに十分な活性成分（即ち、治療的タンパク質または抗体）の量、例えば、疾病またはその症状の発症および進行を治療し、治癒し、防止しまたは阻害するために必要な量、および／または症状を回復しまたは疾病の軽減を引き起こすために必要な量を表す。当該治療的に有効な量は、活性成分の構造および効力ならびに投与計画様式に依存して変動し得る。当業者は、所定の抗体またはタンパク質の治療的に有効な量を容易に決定し得る。

【0021】

用語「治療」は、治療的処置および予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）対策の双方を表す。治療を必要とする者たちには、治療を必要とする障害または症状を既に有するヒトおよび動物、ならびに障害にかかり易い者たちまたは障害の防止が必要とされる者たち等の個体が含まれる。本明細書で用いられる場合、「治療」にはまた、障害にかかる可能性の低減、罹患患者における障害の重篤度の低減、ならびに障害またはその症状の軽減の誘導が含まれる。

【0022】

「薬学的に許容可能な担体」は、全身投与において安全に使用され得る液体充填剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。投与の個々の経路に依存して、当該技術分野で周知の種々の薬学的に許容可能な担体が使用され得る。これらの担体は、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝生理食塩水を含むリン酸緩衝溶液、乳化剤、等張性生理食塩水およびパイロジェン（発熱性物質）除去水を含む一群より選択し得る。特に、薬学的に許容可能な担体は、例えば、緩衝液、注射用滅菌水、通常の生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水、ショ糖、ヒスチジン、塩およびポリソルベート等の種々の成分を含有し得る。例えば、「生理学的に許容可能」、「希釈剤」または「賦形剤」は、同じ意味で使用され得る。

【0023】

本明細書で用いられる追加の略語には、下記が含まれる。ＦＡＰ＝凍結水性産物、ｆｏｒｍ．＝製剤；Ｆ／Ｔ＝凍結‐融解；１Ｘ Ｎｏｒｍａｌ Ｆ／Ｔ＝１Ｘ通常凍結‐融解、実施例１に記載の通り、３Ｘ Ｎｏｒｍａｌ Ｆ／Ｔ＝３Ｘ通常凍結‐融解、実施例１に記載の通り、１Ｘ Ｆｌａｓｈ Ｆ／Ｔ＝瞬間凍結融解、実施例１に記載の通り（明細書ではＦ／Ｔ ＦＦ １Ｘとも表される）、Ｈｉｓ＝ヒスチジン；ＨＰＶ＝ヒトパピローマウイルス；ｈｒ．＝時間；ｌｙｏ＝文脈により凍結乾燥、または凍結乾燥された；ｍｉｎ．＝分；ｍＭ＝ミリモル；ＰＳ２０＝ポリソルベート２０；ＰＳ８０＝ポリソルベート８０；ｒｅｃｏｎ．＝再構成；ｓｅｃ．＝秒；ＤＬＳ＝動的光散乱；ＮａＣｌ＝塩化ナトリウム；ｖｏｌ．＝容量；ＶＬＰ＝ウイルス様粒子；ＷＦＩ＝注射用水；ｗ／ｖ＝容量当たりの重量。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】図１は、本明細書記載の凍結‐融解および凍結乾燥の研究において使用された緩衝液の組成を示す。示す通り、６種類の緩衝液（緩衝液Ａから緩衝液Ｆ）および異なる塩含量（０、１５０および３２０ｍＭの塩化ナトリウム）を含む各緩衝液の３つの変種が存在して、１８種類の異なる緩衝液組成物（Ｂ‐１からＢ‐１８）がもたらされた。記載された賦形剤に加えて、緩衝液の各々は、１０ｍＭヒスチジンおよび０．０１％ポリソルベート８０（ｐＨ６．２）を含有した。

【図2A】図２は、各試験緩衝液（緩衝液Ａから緩衝液Ｆ）の塩化ナトリウム濃度および凍結融解条件の関数としての、４価の試験製剤におけるＨＰＶ型の各々に対するインビトロ抗原性のデータのプロットを示す。実施例２を参照されたい。プロットは、ＨＰＶ６型（パネルＡ）、ＨＰＶ１１型（パネルＢ）、ＨＰＶ１６型（パネルＣ）およびＨＰＶ１８型（パネルＤ）について示す。ＨＰＶワクチン製剤は、実施例１に記載の通り、液体窒素吹付を１回使用する急速瞬間凍結（「Ｆ／Ｔ ＦＦ １Ｘ」）か、または１回（「Ｆ／Ｔ １Ｘ」）か３回（「Ｆ／Ｔ ３Ｘ」）の通常凍結を実施した。

【図2B】図２は、各試験緩衝液（緩衝液Ａから緩衝液Ｆ）の塩化ナトリウム濃度および凍結融解条件の関数としての、４価の試験製剤におけるＨＰＶ型の各々に対するインビトロ抗原性のデータのプロットを示す。実施例２を参照されたい。プロットは、ＨＰＶ６型（パネルＡ）、ＨＰＶ１１型（パネルＢ）、ＨＰＶ１６型（パネルＣ）およびＨＰＶ１８型（パネルＤ）について示す。ＨＰＶワクチン製剤は、実施例１に記載の通り、液体窒素吹付を１回使用する急速瞬間凍結（「Ｆ／Ｔ ＦＦ １Ｘ」）か、または１回（「Ｆ／Ｔ １Ｘ」）か３回（「Ｆ／Ｔ ３Ｘ」）の通常凍結を実施した。

【図2C】図２は、各試験緩衝液（緩衝液Ａから緩衝液Ｆ）の塩化ナトリウム濃度および凍結融解条件の関数としての、４価の試験製剤におけるＨＰＶ型の各々に対するインビトロ抗原性のデータのプロットを示す。実施例２を参照されたい。プロットは、ＨＰＶ６型（パネルＡ）、ＨＰＶ１１型（パネルＢ）、ＨＰＶ１６型（パネルＣ）およびＨＰＶ１８型（パネルＤ）について示す。ＨＰＶワクチン製剤は、実施例１に記載の通り、液体窒素吹付を１回使用する急速瞬間凍結（「Ｆ／Ｔ ＦＦ １Ｘ」）か、または１回（「Ｆ／Ｔ １Ｘ」）か３回（「Ｆ／Ｔ ３Ｘ」）の通常凍結を実施した。

【図2D】図２は、各試験緩衝液（緩衝液Ａから緩衝液Ｆ）の塩化ナトリウム濃度および凍結融解条件の関数としての、４価の試験製剤におけるＨＰＶ型の各々に対するインビトロ抗原性のデータのプロットを示す。実施例２を参照されたい。プロットは、ＨＰＶ６型（パネルＡ）、ＨＰＶ１１型（パネルＢ）、ＨＰＶ１６型（パネルＣ）およびＨＰＶ１８型（パネルＤ）について示す。ＨＰＶワクチン製剤は、実施例１に記載の通り、液体窒素吹付を１回使用する急速瞬間凍結（「Ｆ／Ｔ ＦＦ １Ｘ」）か、または１回（「Ｆ／Ｔ １Ｘ」）か３回（「Ｆ／Ｔ ３Ｘ」）の通常凍結を実施した。

【図3A】図３は、凍結乾燥後の、塩化ナトリウム濃度の関数としての、４価の試験製剤におけるＨＰＶ型の各々に対するインビトロ抗原性のデータのプロットを示す。実施例２を参照されたい。結果は、緩衝液Ａから緩衝液Ｆを含む４価ＨＰＶ製剤におけるＨＰＶ６型（パネルＡ）、ＨＰＶ１１型（パネルＢ）、ＨＰＶ１６型（パネルＣ）およびＨＰＶ１８型（パネルＤ）について示す。組成物の各々は、実施例１に記載の通り、液体窒素吹付を使用する瞬間冷凍（「Ｌｙｏ ＦＦ」）かまたは予備冷却した凍結乾燥棚（「Ｌｙｏ ＰＣ」）を使用する瞬間冷凍によって凍結処理したものに関し凍結乾燥を実施した。

【図3B】図３は、凍結乾燥後の、塩化ナトリウム濃度の関数としての、４価の試験製剤におけるＨＰＶ型の各々に対するインビトロ抗原性のデータのプロットを示す。実施例２を参照されたい。結果は、緩衝液Ａから緩衝液Ｆを含む４価ＨＰＶ製剤におけるＨＰＶ６型（パネルＡ）、ＨＰＶ１１型（パネルＢ）、ＨＰＶ１６型（パネルＣ）およびＨＰＶ１８型（パネルＤ）について示す。組成物の各々は、実施例１に記載の通り、液体窒素吹付を使用する瞬間冷凍（「Ｌｙｏ ＦＦ」）かまたは予備冷却した凍結乾燥棚（「Ｌｙｏ ＰＣ」）を使用する瞬間冷凍によって凍結処理したものに関し凍結乾燥を実施した。

【図3C】図３は、凍結乾燥後の、塩化ナトリウム濃度の関数としての、４価の試験製剤におけるＨＰＶ型の各々に対するインビトロ抗原性のデータのプロットを示す。実施例２を参照されたい。結果は、緩衝液Ａから緩衝液Ｆを含む４価ＨＰＶ製剤におけるＨＰＶ６型（パネルＡ）、ＨＰＶ１１型（パネルＢ）、ＨＰＶ１６型（パネルＣ）およびＨＰＶ１８型（パネルＤ）について示す。組成物の各々は、実施例１に記載の通り、液体窒素吹付を使用する瞬間冷凍（「Ｌｙｏ ＦＦ」）かまたは予備冷却した凍結乾燥棚（「Ｌｙｏ ＰＣ」）を使用する瞬間冷凍によって凍結処理したものに関し凍結乾燥を実施した。

【図3D】図３は、凍結乾燥後の、塩化ナトリウム濃度の関数としての、４価の試験製剤におけるＨＰＶ型の各々に対するインビトロ抗原性のデータのプロットを示す。実施例２を参照されたい。結果は、緩衝液Ａから緩衝液Ｆを含む４価ＨＰＶ製剤におけるＨＰＶ６型（パネルＡ）、ＨＰＶ１１型（パネルＢ）、ＨＰＶ１６型（パネルＣ）およびＨＰＶ１８型（パネルＤ）について示す。組成物の各々は、実施例１に記載の通り、液体窒素吹付を使用する瞬間冷凍（「Ｌｙｏ ＦＦ」）かまたは予備冷却した凍結乾燥棚（「Ｌｙｏ ＰＣ」）を使用する瞬間冷凍によって凍結処理したものに関し凍結乾燥を実施した。

【図4A】図４は、４５℃で１か月間保存後の、種々の緩衝液組成物における塩化ナトリウム濃度および凍結乾燥条件の関数としての、ＨＰＶ型の各々に対するインビトロ抗原性のプロットを示す。また、４５℃で１か月間保存されたそれぞれの凍結乾燥されなかった液体製剤も含む。示したデータは、４５℃で１か月間保存後の、図２に示したものと同一条件下での、同一の試験製剤に対するものである。

【図4B】図４は、４５℃で１か月間保存後の、種々の緩衝液組成物における塩化ナトリウム濃度および凍結乾燥条件の関数としての、ＨＰＶ型の各々に対するインビトロ抗原性のプロットを示す。また、４５℃で１か月間保存されたそれぞれの凍結乾燥されなかった液体製剤も含む。示したデータは、４５℃で１か月間保存後の、図２に示したものと同一条件下での、同一の試験製剤に対するものである。

【図4C】図４は、４５℃で１か月間保存後の、種々の緩衝液組成物における塩化ナトリウム濃度および凍結乾燥条件の関数としての、ＨＰＶ型の各々に対するインビトロ抗原性のプロットを示す。また、４５℃で１か月間保存されたそれぞれの凍結乾燥されなかった液体製剤も含む。示したデータは、４５℃で１か月間保存後の、図２に示したものと同一条件下での、同一の試験製剤に対するものである。

【図4D】図４は、４５℃で１か月間保存後の、種々の緩衝液組成物における塩化ナトリウム濃度および凍結乾燥条件の関数としての、ＨＰＶ型の各々に対するインビトロ抗原性のプロットを示す。また、４５℃で１か月間保存されたそれぞれの凍結乾燥されなかった液体製剤も含む。示したデータは、４５℃で１か月間保存後の、図２に示したものと同一条件下での、同一の試験製剤に対するものである。

【図5】図５は、０、１５０または３２０ｍＭの塩化ナトリウムを有する緩衝液Ａから緩衝液ＦにおけるＨＰＶ４価試験製剤の浸透圧測定値（ｍＯｓｍ／ｋｇ（重量オスモル濃度））のプロットを示す。実施例３を参照されたい。

【図6】図６は、凍結融解および凍結乾燥条件後の、塩化ナトリウム濃度の関数としての、種々の緩衝液中のＨＰＶ４価試験製剤の各々に対する粒度測定値（Ｚ−平均、ｎｍ）のプロットを示す。全てのプロットに対し、示された結果は、緩衝液Ａ（白いひし形）、緩衝液Ｂ（白い四角形）、緩衝液Ｃ（黒い三角形）、緩衝液Ｄ（黒いｘ）、緩衝液Ｅ（白い三角形）および緩衝液Ｆ（黒い円）を表す。凍結融解（「Ｆ／Ｔ １Ｘ」）、凍結融解３Ｘ（「Ｆ／Ｔ ３Ｘ」）、瞬間凍結（「Ｆ／Ｔ １Ｘ ＦＦ」）、瞬間凍結によって凍結処理したものの凍結乾燥（「Ｌｙｏ ＦＦ」）および予備冷却した凍結乾燥棚を使用した凍結乾燥（「Ｌｙｏ ＰＣ」）の後の試験製剤に対する結果を示す。凍結融解も凍結乾燥もされなかった対照製剤に対しても結果を示す。実施例４を参照されたい。

【図7】図７は、０、１５０または３２０ｍＭ塩化ナトリウムを含む種々の緩衝液（緩衝液Ａから緩衝液Ｆ）における凍結乾燥４価ＨＰＶ製剤に対するケーキの外観を示す。製剤は、瞬間凍結法により凍結乾燥し（「瞬間凍結」）または予備冷却した凍結乾燥棚の上で凍結乾燥した（「予備冷却」）。示した結果は、Ｔ＝０時点での各試験製剤の３個のバイアルの平均を表す。また、４５℃で１か月間保存後の同一の製剤のケーキ外観も示す。乾燥ケーキに対する品質特性の記載については、実施例１、表２を参照されたい。実施例５も参照されたい。

【図8】図８は、注射用滅菌水添加後の、０、１５０または３２０ｍＭ塩化ナトリウムを含む種々の緩衝液（緩衝液Ａから緩衝液Ｆ）における、凍結乾燥４価ＨＰＶ製剤に対する再構成時間を示す。製剤は、瞬間凍結により凍結乾燥（「瞬間凍結」）または予備冷却した凍結乾燥棚の上で凍結乾燥した（「予備冷却」）。示した結果は、各試験製剤の２個のバイアルに対するものである。また４５℃で１か月間保存後の同一の製剤に対する注射用滅菌水添加後の再構成時間も示す。実施例５を参照されたい。

【図9】図９は、注射用滅菌水添加後の、０、１５０または３２０ｍＭ塩化ナトリウムを含む種々の緩衝液（緩衝液‐Ａから緩衝液‐Ｆ）における、凍結乾燥４価ＨＰＶ製剤に対する振盪試験時間を示す。製剤は、瞬間凍結により凍結乾燥（「瞬間凍結」）または予備冷却した凍結乾燥棚の上で凍結乾燥した（「予備冷却」）。示した結果は、各試験製剤の３個のバイアルに対するものである。実施例５を参照されたい。

【図10A】図１０は、−７０℃で種々の時点における保存後の、４価試験製剤（緩衝液‐Ｂから緩衝液‐Ｄ）におけるＨＰＶ１６型（パネルＡ）および１８型（パネルＢ）に対するインビトロ抗原性を示す。試験製剤は、実施例１に記載の通り、凍結‐融解（Ｆ／Ｔ）または凍結乾燥プロセス（ＬＹＯ）を受けた後に保存された。Ｂｉａｃｏｒｅの効力（％）は、保存期間の関数として示す。実施例１および６を参照されたい。

【図10B】図１０は、−７０℃で種々の時点における保存後の、４価試験製剤（緩衝液‐Ｂから緩衝液‐Ｄ）におけるＨＰＶ１６型（パネルＡ）および１８型（パネルＢ）に対するインビトロ抗原性を示す。試験製剤は、実施例１に記載の通り、凍結‐融解（Ｆ／Ｔ）または凍結乾燥プロセス（ＬＹＯ）を受けた後に保存された。Ｂｉａｃｏｒｅの効力（％）は、保存期間の関数として示す。実施例１および６を参照されたい。

【図11A】図１１は、２５℃で種々の時点での保存後の、４価試験製剤（緩衝液‐Ｂから緩衝液‐Ｄ）における、ＨＰＶ１６型（パネルＡ）および１８型（パネルＢ）に対するインビトロ抗原性を示す。試験製剤は、凍結‐融解または凍結乾燥プロセスを受けた後に保存した。実施例６を参照されたい。

【図11B】図１１は、２５℃で種々の時点での保存後の、４価試験製剤（緩衝液‐Ｂから緩衝液‐Ｄ）における、ＨＰＶ１６型（パネルＡ）および１８型（パネルＢ）に対するインビトロ抗原性を示す。試験製剤は、凍結‐融解または凍結乾燥プロセスを受けた後に保存した。実施例６を参照されたい。

【図12A】図１２は、３７℃で種々の時点での保存後の、４価試験製剤（緩衝液‐Ｂから緩衝液‐Ｄ）におけるＨＰＶ型の各々に対するインビトロ抗原性を示す。試験製剤は、凍結融解または凍結乾燥プロセスを受けた後に保存した。実施例６を参照されたい。プロットは、ＨＰＶ６型（パネルＡ）、ＨＰＶ１１型（パネルＢ）、ＨＰＶ１６型（パネルＣ）およびＨＰＶ１８型（パネルＤ）を示す。

【図12B】図１２は、３７℃で種々の時点での保存後の、４価試験製剤（緩衝液‐Ｂから緩衝液‐Ｄ）におけるＨＰＶ型の各々に対するインビトロ抗原性を示す。試験製剤は、凍結融解または凍結乾燥プロセスを受けた後に保存した。実施例６を参照されたい。プロットは、ＨＰＶ６型（パネルＡ）、ＨＰＶ１１型（パネルＢ）、ＨＰＶ１６型（パネルＣ）およびＨＰＶ１８型（パネルＤ）を示す。

【図12C】図１２は、３７℃で種々の時点での保存後の、４価試験製剤（緩衝液‐Ｂから緩衝液‐Ｄ）におけるＨＰＶ型の各々に対するインビトロ抗原性を示す。試験製剤は、凍結融解または凍結乾燥プロセスを受けた後に保存した。実施例６を参照されたい。プロットは、ＨＰＶ６型（パネルＡ）、ＨＰＶ１１型（パネルＢ）、ＨＰＶ１６型（パネルＣ）およびＨＰＶ１８型（パネルＤ）を示す。

【図12D】図１２は、３７℃で種々の時点での保存後の、４価試験製剤（緩衝液‐Ｂから緩衝液‐Ｄ）におけるＨＰＶ型の各々に対するインビトロ抗原性を示す。試験製剤は、凍結融解または凍結乾燥プロセスを受けた後に保存した。実施例６を参照されたい。プロットは、ＨＰＶ６型（パネルＡ）、ＨＰＶ１１型（パネルＢ）、ＨＰＶ１６型（パネルＣ）およびＨＰＶ１８型（パネルＤ）を示す。

【図13A】図１３は、種々の保存温度で数か月間保存後の、凍結乾燥４価ＨＰＶ製剤（緩衝液Ｂから緩衝液Ｄ）に対するケーキ外観を示す。示した結果は、各試験製剤の３個のバイアルの平均を表す。乾燥ケーキについての品質特性の記載に対しては実施例１、表２を参照されたい。実施例１０も参照されたい。データは、２〜８℃（パネルＡ）、２５℃（パネルＢ）、３７℃（パネルＣ）および−７０℃（パネルＤ）での保存について示す。

【図13B】図１３は、種々の保存温度で数か月間保存後の、凍結乾燥４価ＨＰＶ製剤（緩衝液Ｂから緩衝液Ｄ）に対するケーキ外観を示す。示した結果は、各試験製剤の３個のバイアルの平均を表す。乾燥ケーキについての品質特性の記載に対しては実施例１、表２を参照されたい。実施例１０も参照されたい。データは、２〜８℃（パネルＡ）、２５℃（パネルＢ）、３７℃（パネルＣ）および−７０℃（パネルＤ）での保存について示す。

【図13C】図１３は、種々の保存温度で数か月間保存後の、凍結乾燥４価ＨＰＶ製剤（緩衝液Ｂから緩衝液Ｄ）に対するケーキ外観を示す。示した結果は、各試験製剤の３個のバイアルの平均を表す。乾燥ケーキについての品質特性の記載に対しては実施例１、表２を参照されたい。実施例１０も参照されたい。データは、２〜８℃（パネルＡ）、２５℃（パネルＢ）、３７℃（パネルＣ）および−７０℃（パネルＤ）での保存について示す。

【図13D】図１３は、種々の保存温度で数か月間保存後の、凍結乾燥４価ＨＰＶ製剤（緩衝液Ｂから緩衝液Ｄ）に対するケーキ外観を示す。示した結果は、各試験製剤の３個のバイアルの平均を表す。乾燥ケーキについての品質特性の記載に対しては実施例１、表２を参照されたい。実施例１０も参照されたい。データは、２〜８℃（パネルＡ）、２５℃（パネルＢ）、３７℃（パネルＣ）および−７０℃（パネルＤ）での保存について示す。

【図14A】図１４は、種々の保存温度で数か月間保存後の、凍結乾燥１Ｘ ＭＡＡ製剤（緩衝液Ｂから緩衝液Ｄ）に対するケーキ外観を示す。示した結果は、各試験製剤の３個のバイアルの平均を表す。乾燥ケーキに対する品質特性の記載については実施例１、表２を参照されたい。実施例１０も参照されたい。データは、２〜８℃（パネルＡ）、２５℃（パネルＢ）、３７℃（パネルＣ）および−７０℃（パネルＤ）での保存について示す。

【図14B】図１４は、種々の保存温度で数か月間保存後の、凍結乾燥１Ｘ ＭＡＡ製剤（緩衝液Ｂから緩衝液Ｄ）に対するケーキ外観を示す。示した結果は、各試験製剤の３個のバイアルの平均を表す。乾燥ケーキに対する品質特性の記載については実施例１、表２を参照されたい。実施例１０も参照されたい。データは、２〜８℃（パネルＡ）、２５℃（パネルＢ）、３７℃（パネルＣ）および−７０℃（パネルＤ）での保存について示す。

【図14C】図１４は、種々の保存温度で数か月間保存後の、凍結乾燥１Ｘ ＭＡＡ製剤（緩衝液Ｂから緩衝液Ｄ）に対するケーキ外観を示す。示した結果は、各試験製剤の３個のバイアルの平均を表す。乾燥ケーキに対する品質特性の記載については実施例１、表２を参照されたい。実施例１０も参照されたい。データは、２〜８℃（パネルＡ）、２５℃（パネルＢ）、３７℃（パネルＣ）および−７０℃（パネルＤ）での保存について示す。

【図14D】図１４は、種々の保存温度で数か月間保存後の、凍結乾燥１Ｘ ＭＡＡ製剤（緩衝液Ｂから緩衝液Ｄ）に対するケーキ外観を示す。示した結果は、各試験製剤の３個のバイアルの平均を表す。乾燥ケーキに対する品質特性の記載については実施例１、表２を参照されたい。実施例１０も参照されたい。データは、２〜８℃（パネルＡ）、２５℃（パネルＢ）、３７℃（パネルＣ）および−７０℃（パネルＤ）での保存について示す。

【図15A】図１５は、種々の保存温度で数か月間保存後の、凍結乾燥４価ＨＰＶ製剤（緩衝液Ｂから緩衝液Ｄ）に対する振盪試験時間を示す。示した結果は、各試験製剤の３個のバイアルに対するものである。実施例１０を参照されたい。データは、２〜８℃（パネルＡ）、２５℃（パネルＢ）、３７℃（パネルＣ）および−７０℃（パネルＤ）での保存について示す。

【図15B】図１５は、種々の保存温度で数か月間保存後の、凍結乾燥４価ＨＰＶ製剤（緩衝液Ｂから緩衝液Ｄ）に対する振盪試験時間を示す。示した結果は、各試験製剤の３個のバイアルに対するものである。実施例１０を参照されたい。データは、２〜８℃（パネルＡ）、２５℃（パネルＢ）、３７℃（パネルＣ）および−７０℃（パネルＤ）での保存について示す。

【図15C】図１５は、種々の保存温度で数か月間保存後の、凍結乾燥４価ＨＰＶ製剤（緩衝液Ｂから緩衝液Ｄ）に対する振盪試験時間を示す。示した結果は、各試験製剤の３個のバイアルに対するものである。実施例１０を参照されたい。データは、２〜８℃（パネルＡ）、２５℃（パネルＢ）、３７℃（パネルＣ）および−７０℃（パネルＤ）での保存について示す。

【図15D】図１５は、種々の保存温度で数か月間保存後の、凍結乾燥４価ＨＰＶ製剤（緩衝液Ｂから緩衝液Ｄ）に対する振盪試験時間を示す。示した結果は、各試験製剤の３個のバイアルに対するものである。実施例１０を参照されたい。データは、２〜８℃（パネルＡ）、２５℃（パネルＢ）、３７℃（パネルＣ）および−７０℃（パネルＤ）での保存について示す。

【発明を実施するための形態】

【0025】

ワクチン製剤は、通常アルミニウムアジュバントを含有し、それは抗原に対する免疫応答を増強するために使用される。アルミニウムアジュバント化ワクチンは、加熱または凍結等の温度変化に極めて敏感である。上記の低下した効力および／または有効性の問題を回避するために、免疫学的に活性であるアルミニウム塩アジュバントを含む熱的に安定なワクチン製剤を産生する方法に対する要請がある。その為に本発明は、アルミニウム塩アジュバント上に吸着した少なくとも１の抗原およびマンニトールとショ糖の組み合せを含む、安定な液体および凍結固体および凍結‐乾燥ワクチン製剤を提供する。本発明の好ましい態様において、抗原はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。

【0026】

上述の通り、本発明は、（ａ）アルミニウムアジュバント上に吸着されている少なくとも１のＨＰＶ型のＨＰＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）、および（ｂ）マンニトールとショ糖を含有する緩衝液を含む、ヒトパピローマウイルスワクチン製剤を提供する。ワクチン製剤は、非イオン性界面活性剤および／またはＮａＣｌ等の任意の塩を含む。

【0027】

本発明による液体ＨＰＶワクチン製剤は、（１）凍結および融解、（２）液体製剤の凍結‐乾燥、（３）乾燥製剤の再構成、ならびに（４）室温または高温で１か月以上保存後の乾燥製剤の再構成の際に、その物理的および免疫学的特性を保持することが可能である。従って、本発明は、本明細書を通して種々の実施形態において記載される通り、凍結された、凍結‐乾燥されたまたは再構成されたＨＰＶワクチン製剤を提供する。

【0028】

本発明のこの態様の好ましい実施形態においてＨＰＶワクチン製剤は、（ａ）アルミニウムアジュバント上に吸着した少なくとも１のＨＰＶ型のＨＰＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）（ここで各ＨＰＶ型の該ＶＬＰは１０〜２００ｍｃｇ／ｍｌの濃度で存在し、しかも該ＶＬＰは、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３およびＨＰＶ８２から成る群より選択されている）、（ｂ）約１％ないし約１０％ｗ／ｖマンニトール、ならびに（ｃ）約０．５％ないし約１０％ショ糖を含む。追加の実施形態において、ＨＰＶワクチンは非イオン性の界面活性剤をさらに含む。さらなる実施形態において、ワクチン製剤は、前述の任意の実施形態に定義された成分を含み、しかも一種の塩をさらに含む。

【0029】

本発明の追加の実施形態は、上で定義したＨＰＶ製剤を提供し、ここで製剤中に存在するマンニトールの量は約４％ないし約１０％であり、ショ糖の量は約１％ないし約５％である。

【0030】

本発明のこの態様のさらなる実施形態が提供され、ここで製剤は前述の任意の製剤において定義された成分を含み、さらに約５ｍＭないし約１００ｍＭヒスチジンを含む。好ましい実施形態において、製剤は１０ｍＭヒスチジンを含む。

【0031】

追加の実施形態において、本発明は、前述の任意の実施形態において定義されたＨＰＶワクチン製剤に関し、ここで製剤は加えて界面活性剤を含む。本発明の代表的な実施形態において、ワクチン製剤は、約０．００１％ないし約０．０４％の界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、界面活性剤はＰＳ２０またはＰＳ８０である。

【0032】

本発明のこの態様のさらにもう一つの実施形態において、ＨＰＶワクチン製剤は、（ａ）アルミニウム塩アジュバント上に吸着された少なくとも１のＨＰＶ型のＨＰＶ ＶＬＰ（ここで少なくとも１のＨＰＶ型のＨＰＶ ＶＬＰは１０〜２００ｍｃｇ／ｍｌの濃度で存在し、ＶＬＰはＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３およびＨＰＶ８２から成る群より選択されている）、（ｂ）約５％ないし約６％ｗ／ｖマンニトール、および（ｃ）約２％ないし約４％ショ糖を含む。さらなる実施形態において、ワクチン製剤は、約１０ｍＭヒスチジン、約０．３ないし約０．３５Ｍ ＮａＣｌおよび／または０．０１％ＰＳ８０をさらに含む。

【0033】

製剤成分
前述の通り本発明に従って、マンニトールとショ糖の組み合せは、アルミニウムアジュバント化ワクチン製剤を凍結、融解または凍結‐乾燥によって誘発されるストレスから防護することが明らかにされた。その為に本発明は、例えば、ＨＰＶ ＶＬＰワクチン製剤等のワクチン製剤を提供し、ここで製剤成分は前述の任意の実施形態に定義された通りであり、マンニトールは以下の任意の量、約１％ないし約１０％ｗ／ｖ、約２％ないし約１０％ｗ／ｖ、約３％ないし約１０％ｗ／ｖ、約４％ないし約１０％ｗ／ｖ、約５％ないし約１０％ｗ／ｖ、約１％ないし約９％ｗ／ｖ、約２％ないし約９％ｗ／ｖ、約３％ないし約９％ｗ／ｖ、約４％ないし約９％ｗ／ｖ、約５％ないし約９％ｗ／ｖ、約１％ないし約８％ｗ／ｖ、約２％ないし約８％ｗ／ｖ、約３％ないし約８％ｗ／ｖ、約４％ないし約８％ｗ／ｖ、約５％ないし約８％ｗ／ｖ、約１％ないし約７％ｗ／ｖ、約２％ないし約７％ｗ／ｖ、約３％ないし約７％ｗ／ｖ、約４％ないし約７％ｗ／ｖ、約１％ないし約６％ｗ／ｖ、約２％ないし約６％ｗ／ｖ、約３％ないし約６％ｗ／ｖまたは約４％ないし約６％ｗ／ｖで存在する。本発明の別の実施形態において、ワクチン製剤成分は前述の任意の実施形態に定義された通りであり、マンニトールの量は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％ｗ／ｖである。好ましい実施形態において、組成物は４％、５％または６％ｗ／ｖのマンニトールを含む。

【0034】

本発明のさらなる実施形態において、ＨＰＶワクチン製剤は前述の任意の実施形態に定義された通りの成分、およびショ糖を含み、ショ糖は以下の任意の量、約０．５％ないし約１０％ｗ／ｖ、約１％ないし約１０％ｗ／ｖ、約２％ないし約１０％ｗ／ｖ、約３％ないし約１０％ｗ／ｖ、約４％ないし約１０％ｗ／ｖ、約０．５％ないし約９％ｗ／ｖ、約１％ないし約９％ｗ／ｖ、約２％ないし約９％ｗ／ｖ、約３％ないし約９％ｗ／ｖ、約４％ないし約９％ｗ／ｖ、約１％ないし約８％ｗ／ｖ、約２％ないし約８％ｗ／ｖ、約３％ないし約８％ｗ／ｖ、約４％ないし約８％ｗ／ｖ、約１％ないし約７％ｗ／ｖ、約２％ないし約７％ｗ／ｖ、約３％ないし約７％ｗ／ｖ、約４％ないし約７％ｗ／ｖ、約１％ないし約６％ｗ／ｖ、約２％ないし約６％ｗ／ｖ、約３％ないし約６％ｗ／ｖ、約４％ないし約６％ｗ／ｖのショ糖である。別の実施形態において、ワクチン組成物は、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％ｗ／ｖのショ糖を含む。好ましい実施形態において、組成物は２％、３％、４％または５％ｗ／ｖのショ糖を含む。

【0035】

本発明の特定の実施形態において、ＨＰＶワクチン製剤は前述の任意の実施形態または以下に記載した任意の実施形態に定義された通りの成分を含み、および約５ｍＭないし１００ｍＭヒスチジンをさらに含む。追加の実施形態において、組成物におけるヒスチジン濃度は、約５ｍＭないし約９０ｍＭ、約５ｍＭないし約８０ｍＭ、約５ｍＭないし約７５ｍＭ、約５ｍＭないし約６０ｍＭ、約５ｍＭないし約５０ｍＭ、約１０ｍＭないし約９０ｍＭ、約１０ｍＭないし約７５ｍＭ、約１０ｍＭないし約６０ｍＭ、約１０ｍＭないし約５０ｍＭ、約２０ｍＭないし約９０ｍＭ、約２０ｍＭないし約７５ｍＭ、約２０ｍＭないし約６０ｍＭまたは約２０ｍＭないし約５０ｍＭである。別の実施形態において、ワクチン製剤は約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭまたは約５０ｍＭヒスチジンを含む。好ましい実施形態において、ワクチン製剤は約１０ｍＭヒスチジンを含む。

【0036】

本明細書に記載されるワクチン組成物のいずれも、任意に界面活性剤を含み得る。界面活性剤は、精製、濾過、凍結‐乾燥、輸送、保存および配送等の処理条件の間に、凝集を減少および／または防止するために、またはタンパク質の損傷を防止および／または阻害するために、添加し得る。本発明の製剤において有用な界面活性剤には、これらに限られるものではないが、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、ポリソルベート４０（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート）、ポリソルベート６０（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート）およびポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート）を含むポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（Ｕｎｉｑｕｅｍａ Ａｍｅｒｉｃａｓ ＬＬＣ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）の商品名で販売されている）；ポリオキシエチレンアルキルエーテル、例えば、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８（Ｕｎｉｑｕｅｍａ Ａｍｅｒｉｃａｓ ＬＬＣ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）およびＢｒｉｊ（登録商標）３５；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）およびＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４；ＮＰ４０；Ｓｐａｎ２０、Ｓｐａｎ４０、Ｓｐａｎ６０、Ｓｐａｎ６５、Ｓｐａｎ８０およびＳｐａｎ８５；エチレンとプロピレングリコールの共重合体（例えば、非イオン性界面活性剤のｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）シリーズ、例えば、ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）１０Ｒ５、ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８、ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７、ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ３８、ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ４４、ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ６２（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．，Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））；ならびにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が含まれる。

【0037】

本発明の代表的な実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８およびＴｒｉｔｏｎ（登録商標）から成る群より選択される非イオン性界面活性剤である。いくつかの好ましい実施形態において、界面活性剤はポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。

【0038】

本発明の製剤中に含められるべき界面活性剤の量は、所望の機能を果たすのに十分な量、即ち、タンパク質の凝集を防止するために、微粒子の形成を防止または阻害するために、ＢＷＦＩ（注射用静菌水）等の希釈液の添加後の凍結乾燥若しくは凍結製剤または再構成製剤の凝集の量を許容可能なレベルまで減少させるために、再構成を容易とするためにまたは輸送および／または処理の間の安定性の優位性を提供するために必要とされる最小限の量である。界面活性剤は、典型的には約０．００１％ないし約０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）の濃度で存在する。本発明のこの態様の好ましい実施形態において、界面活性剤は製剤中に（凍結乾燥前）約０．００５％ないし約０．４％の量で存在し、より好ましい実施形態において、界面活性剤は約０．０１％ないし約０．３％の量で存在する。特定の好ましい実施形態において、界面活性剤は約０．０１％の量で存在する。

【0039】

本発明の代表的な実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８およびＴｒｉｔｏｎ（登録商標）から成る群より選択される非イオン性界面活性剤である。いくつかの好ましい実施形態において、界面活性剤はポリソルベート２０またはポリソルベート８０である。特に好ましい実施形態において、ＨＰＶワクチン製剤は約０．０１％のＰＳ８０を含む。

【0040】

また本発明は、前述の任意の実施形態において定義された成分を含み、さらに製剤のイオン強度の制御に寄与し得る塩を含むワクチン製剤も含む。本発明のＨＰＶワクチン製剤において使用し得る塩には、限定されるものではないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４，リン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムが含まれる。塩は、製剤中に約０．１０Ｍないし１Ｍの濃度で存在すべきである。しかしながら、高塩製剤の非経口注射の実際的制限より、非常に高い濃度は好まれない。代わりに、より中程度の濃度、例えば、０．１５〜０．３２ＭのＮａＣｌを有する約０．１５Ｍないし約０．５Ｍのより生理学的な濃度が好まれる。本発明の別の実施形態において、ＨＰＶワクチン製剤は塩を含まない。

【0041】

本発明のワクチン組成物のｐＨは、前述の任意の実施形態または以下に述べる実施形態に記載の通り、好ましくは約５．５ないし約７．５の範囲にある。本発明の特定の実施形態において、組成物のｐＨは、約５．５、約５．７５、約６．０、約６．１、約６．２、約６．２５、約６．３、約６．４、約６．５、約６．７５、約７．０、約７．２５または約７．５である。追加の実施形態において、ｐＨは、約５．５ないし約７．０、約５．５ないし約６．５、約６．０ないし約７．５、約６．０ないし約７．０、約６．５ないし約７．０、約６．０ないし約６．５、約６．０ないし約６．９、約６．２ないし約６．７５または約６．０ないし約６．７５である。

【0042】

場合によっては、同一のバイアル中にワクチンの２用量以上を含む多用量ＨＰＶワクチン製剤を提供することが望ましいかもしれない。もしも多用量製剤が望まれるならば、細菌や糸状菌等の微生物を殺菌しまたはその増殖を防止するために抗菌防腐剤が使用されるべきである。抗菌防腐剤を含む多用量ワクチン製剤は、最初の採取が不注意に微生物汚染を誘発したという懸念を抱かずにワクチンの複数回の容量をバイアルから採取することを可能とすることを含む、単回容量製剤に優るいくつかの利点を提供する（Ｍｅｙｅｒら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９６（１２）：３１５５−３１６７（２００７））。本発明のＨＰＶワクチン製剤における使用に対する好ましい抗菌防腐剤には、ｍ−クレゾール、フェノールおよびベンジルアルコールから成る群より選択される抗菌防腐剤が含まれる（Ｂｒｙａｎら，米国特許第７，７０９，０１０を参照されたい）。

【0043】

本発明の製剤は、好ましくは室温以下の温度で少なくとも１か月間安定である。製剤の安定性は、凍結または凍結乾燥の前後および／または保存状態後のＡＰＩ（活性医薬成分）の生物物理学的特性（例えば、凝集は、動的光散乱（ＤＬＳ）を使用する粒子測定法を使用して）および結合親和性（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅを使用する力価アッセイ）を測定するために使用される種々の方法によって試験される。本発明のいくつかの実施形態において、凍結乾燥または凍結‐融解プロセスのストレスの後、製剤は室温または室温以下（例えば、２０〜２５℃）で１か月、３か月、６か月または６か月を超えて安定である。さらなる実施形態において、製剤は室温より低い温度（例えば、−７０℃または２〜８℃）に保存されたとき、６か月間、６か月を超えてまたは１年を超えて安定である。さらに他の実施形態において、凍結乾燥または凍結‐融解プロセスのストレス後に、３７℃で1か月または３か月を超えて安定である。好ましい実施形態において、本発明の製剤はワクチンバイアルモニター（ＶＶＭ）カテゴリーにおけるＶＶＭ３０である（即ち、２５℃において１９３日間または３７℃において３０日間安定である）。ＶＶＭシステムに関する解説書を参照されたい。

【0044】

本明細書で、本発明の製剤におけるマンニトールとショ糖の組み合せが、ＨＰＶ ＶＬＰワクチン組成物に凍結乾燥または凍結‐融解手順の後に、−７０℃または２〜８℃で６か月以上の安定性を維持することを可能にすることが示される。また、マンニトールとショ糖の組み合せを含む本発明の製剤が、凍結乾燥後、２５℃で＞６か月または３７℃で＞３か月の間、その力価を保持することも示される。

【0045】

本発明の製剤は、限定されるものではないが、アジュバント（ＡＰＩ（ＨＰＶ ＶＬＰ）に対する患者の免疫系の免疫応答を増強するために添加され得る）、
緩衝剤、安定剤、可溶化剤、浸透張力調節剤、キレート剤、デキストラン、デキストラン硫酸、デキストランＴ４０、ジエタノールアミン、グアニジン、塩化カルシウム、クエン酸ナトリウム、アルブミン、ゼラチン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、脂質およびヘパリンを含む、追加の成分および薬学的に許容可能な担体を更に含んでもよい。当業者は、どの追加の賦形剤が所望のワクチン製剤において含まれるべきか、製剤におけるその機能、ならびに計画された投与方式、投与量および製剤の所期の保存期間および温度等の他の要因に依存して、容易に決定することができる。当業者は、追加の賦形剤の量が変動し得ることを認知しており、ヒトまたは動物への投与に対して安全でもありかつ所望の機能に関して効果的でもある、適切な量を容易に決定することが可能である。

【0046】

ＨＰＶウイルス様粒子
８０を超えるＨＰＶの型が現在まで同定され、その多くは良性増殖性疣贅ないし子宮頚部の悪性癌に及ぶ病理と関連づけられている（総説として、ＭｃＭｕｒｒａｙら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．８２（１）：１５−３３（２００１）を参照されたい）。ＨＰＶ６型およびＨＰＶ１１型は「低リスク群」と呼ばれ、
良性疣贅、非悪性尖圭コンジローマおよび／または性器粘膜または呼吸器粘膜の低悪性度変異形成に最も一般的に関連しているＨＰＶ型である。性器疣贅の約９０％は、この２のＨＰＶ型によって引き起こされる。対照的に、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８は、子宮頚部、膣、外陰および肛門管の発生部位内癌および浸潤性癌と最も頻繁に関連しているので、「高リスク群」ＨＰＶ型と呼ばれる。子宮頸癌の７０％以上は、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の感染により引き起こされる。余り広まっていない発癌型ＨＰＶ３１、３３、４５、５２および５８と合わせるとこれらの型は、子宮頸癌の９０％以上の原因となる（Ｓｃｈｉｆｆｍａｎら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８５（１２）：９５８−６４（１９９３））。

【0047】

パピローマウイルスは、８個までの初期遺伝子（Ｅ１〜Ｅ７）および２個の後期遺伝子（Ｌ１〜Ｌ２）をコードする小型（５０〜６０ｎｍ）、非外包性、正二十面体のＤＮＡウイルスである。Ｌ１タンパク質は主要カプシドタンパク質であり、５５〜６０ｋＤａの分子量を有する。酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞または細菌におけるＬ１タンパク質またはＬ１およびＬ２タンパク質の組合せの発現は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の自己集合をもたらす（総説としては、ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＲｏｄｅｎの，Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｌａｃｅｙ編，Ｌｅｅｄｓ，ＵＫ：Ｌｅｅｄｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｐｐ１０１−１２（１９９６）を参照されたい）。ＶＬＰは形態学的に真正ビリオンに類似しており、動物またはヒトに投与されると中和抗体の高力価を誘導しうる。ＶＬＰは潜在的発癌性ウイルスゲノムを含有しないので、それらは、ＨＰＶワクチン開発における生きたウイルスの使用に代わる安全な代替法を提供する（総説としては、ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＨｉｄｅｓｈｅｉｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９：６７−７４（２０００）を参照されたい）。この理由により、Ｌ１およびＬ２遺伝子は、ＨＰＶ感染および疾病に対する予防用および治療用ワクチンの開発のための免疫学的標的として確認されてきた。

【0048】

従って本発明のワクチン組成物は、少なくとも１のＨＰＶ型の組換えＬ１または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質から構成されたＨＰＶ ＶＬＰを含む。ＨＰＶ Ｌ１またはＨＰＶ Ｌ１＋Ｌ２タンパク質は、適したプロモーターおよび他の適切な転写制御因子を含有する発現ベクターへのＬ１またはＬ１＋Ｌ２ ＤＮＡの分子クローニングによって組換え的に発現されることが可能であり、組換えタンパク質を産生するために原核または真核宿主細胞内に導入される。そのような操作のための技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９））によって十分に記載されており、これを参照して本明細書で援用する。Ｌ１タンパク質が宿主細胞内において組換え的に発現されるときに、ＶＬＰは自己集合し得る。

【0049】

本発明の組換えＨＰＶ Ｌ１タンパク質は、自然界に見出され得る任意の完全長Ｌ１タンパク質配列、またはＶＬＰへ自己集合し得る任意の変異型または切断型Ｌ１タンパク質であってよい。本発明において使用するためのＬ１タンパク質配列は、選択されたＨＰＶ型を含有する１または複数の臨床サンプルからＤＮＡを単離し、ＨＰＶ Ｌ１ ＤＮＡ配列の配列を決定し、遺伝暗号を用いてＤＮＡ配列をアミノ酸配列に翻訳することにより決定され得る。本発明における使用に適した多数の代表的なＬ１配列が文献中に見出され得る。例えば、米国特許第５，８２０，８７０号、７，２５０，１７０号、７，２７６，２４３号および５，４３７，９５１号；Ｋｉｒｉｉら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８５（１）：４２４−４２７（１９９１））を参照されたい。さらに、本発明の組成物および製剤において有用であるＬ１タンパク質には、必ずしも限定されるものものではないが、これらの変異がＶＬＰを形成可能なＬ１タンパク質またはタンパク質フラグメントを提供するところの、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断を含む生物学的活性フラグメントおよび／またはＨＰＶ Ｌ１配列の変異型が含まれる。例えば、国際公開ＷＯ ２００６／１１４３１２および米国特許第６，５９９，５０８号を参照されたい。

【0050】

組換えＨＰＶ Ｌ１または組換えＬ１＋Ｌ２の発現、およびそれに続くＶＬＰの自己集合のための適切な宿主細胞には、これに限定されるものではないが、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞または細菌が含まれる。本発明の代表的な実施形態において、ＶＬＰは、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クリベロミセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クリベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）からなる群より選択される１の酵母の酵母細胞において産生される。酵母細胞におけるＨＰＶ ＶＬＰの発現は、費用効果的であり発酵における大規模増殖に容易に適合化されるという利点を提供する。

【0051】

本発明にはまた、例えば、必ずしもこれに限定されるものではないが、当該変異がタンパク質またはタンパク質フラグメントに対し治療または予防の利用を提供し、ＨＰＶ ＶＬＰワクチン開発にとって有用であるような、アミノ酸置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断を含む、生物学的に活性なフラグメントおよび／またはＨＰＶ Ｌ１またはＬ２タンパク質の変異体を含むＨＰＶ ＶＬＰ等のＨＰＶ ＶＬＰの変異形を含む製剤も含有される。ＨＰＶ Ｌ１タンパク質のいずれの当該変異形もＶＬＰを形成し、ヒト患者に投与されたときに所望のＨＰＶ型に対する免疫応答を惹起する能力があるべきである。

【0052】

加えて、当業者は、本明細書に記載の製剤に包含させるのにＶＬＰを自己集合させるために使用される、Ｌ１またはＬ１＋Ｌ２タンパク質が、完全長の野生型ＨＰＶ Ｌ１またはＬ２ポリペプチドによってコードされ得る、または既知の野生型配列のフラグメントまたは変異体によってコードされうることを認識するであろう。ＨＰＶ Ｌ１またはＬ２タンパク質を発現するｍＲＮＡをコードする野生型のポリヌクレオチド配列は、当技術分野において入手可能である。いずれの変異体のポリヌクレオチドも、ヒトに投与されたときに対象のＨＰＶ型に対する免疫応答を惹起し得るＶＬＰを形成する能力を含む、ＨＰＶ Ｌ１またはＬ２タンパク質の薬学的な特性を少なくとも実質的に模倣するタンパク質またはタンパク質断片のいずれかをコードする。いずれの当該ポリヌクレオチドも、必ずしもこれに限定されるものではないが、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断を含む。

【0053】

本発明の特定の実施形態において、少なくとも１のＨＰＶ型のＶＬＰには、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３およびＨＰＶ８２から成る群より選択されるＨＰＶ型が含まれる。しかし、病態または障害に関連するいずれのＨＰＶ型も、本明細書で提供する製剤に包含させるのに適している。本発明のいくつかの実施形態において、組成物は、例えば、ＨＰＶ１６、１８、３１、４５型等のただ一つのＨＰＶ型、または上記の任意のＨＰＶ型、または病態に関連する任意の他のＨＰＶ型のＶＬＰを含む１価ワクチン製剤である。別の実施形態において、製剤は２価であり、例えば、１６および１８型のＨＰＶ ＶＬＰを含む製剤である。別の実施形態において、製剤は３価、４価、５価、６価、７価、８価、９価または１０価である。いくつかの好ましい実施形態において、製剤は４価であり、例えば、ＨＰＶ６、１１、１６および１８型のＶＬＰを含む製剤である。別の好ましい実施形態において、製剤は、ＨＰＶ６、１１、１６、１８、３１、３３、４５、５２および５８型のＶＬＰを含む。

【0054】

本発明の製剤に包含させる各ＨＰＶ型のウイルス様粒子の量は、治療的に有効な量であり、発現される遺伝子産物の免疫原性に依存する。一般に、免疫学的または予防的に有効な用量には、ＶＬＰの約１０μｇないし約１００μｇ、好ましくは、約２０μｇないし８０μｇが含まれる。

【0055】

本発明の製剤中に包含させるＨＰＶ ＶＬＰの濃度は、様々であるが、しかし一般に、製剤に含まれる各ＨＰＶ ＶＬＰ型に対し約２０μｇ／ｍＬないし約２００μｇ／ｍＬの濃度が好まれる。より好ましくは、ＨＰＶ ＶＬＰの濃度は、製剤における各ＨＰＶ型に対し約４０μｇ／ｍＬないし約１６０μｇ／ｍＬである。

【0056】

アルミニウム塩アジュバント
上述の通り、アルミニウムは、共投与された抗原に対する免疫応答を刺激することが昔から示されてきた。本発明のワクチン製剤は、アルミニウムアジュバントに吸着される。本明細書で提供する組成物のアルミニウムアジュバントは、アルミニウム沈降物の形態ではないことが好ましい。アルミニウム沈降ワクチンは、標的抗原に対する免疫応答を増強するが、しかし非常に不均一な製剤であることが示されており、一貫した結果が観察されなかった（Ｌｉｎｄｂｌａｄ Ｅ．Ｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８２：４９７−５０５（２００４）を参照されたい）。対照的に、アルミニウム吸着ワクチンは、標準化された方法で予備調製されることが可能であり、これは、ヒトへの投与にとってワクチン製剤の必須の特性である。さらに、アルミニウムアジュバント上への所望の抗原の物理的吸着は、おそらく一つには注射部位からのより遅い消失を可能にすることによりまたは抗原提示細胞による抗原のより効率的な取り込みを可能にすることにより、アジュバント機能において重要な役割を担うと考えられている。

【0057】

本発明のアルミニウムアジュバントは、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）_３）、リン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ_４）、アルミニウムヒドロキシホスファート、アモルファスアルミニウムヒドロキシホスファートスルファート（ＡＡＨＳ）、またはいわゆる「ミョウバン」（ＫＡｌ（ＳＯ_４）・１２Ｈ_２Ｏ）の形態でありうる（Ｋｌｅｉｎら，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｂｙ（２７）Ａｌ ＭＡＳ ＮＭＲ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８９（３）：３１１−２１（２０００）を参照されたい）。本明細書で提供する本発明の代表的な実施形態において、アルミニウムアジュバントはアルミニウムヒドロキシホスファートまたはＡＡＨＳである。これらの実施形態において、アルミニウムアジュバントは、アルミニウム（Ａｌ）に対するホスファート（ＰＯ_４）の約０．１ないし約１．３のモル比でホスファートおよびアルミニウムを含むのが好ましい。本発明のこの態様の好ましい別の実施形態において、アルミニウムに対するホスファートの比は、０．１ないし０．７０の範囲内である。アルミニウムアジュバントは、約０．２ないし約０．５（ＰＯ_４／Ａｌ）のモル比で存在するホスファートとアルミニウムを含むのがより好ましい。本発明のこの態様の別の実施形態において、アルミニウムアジュバントは水酸化アルミニウムである。

【0058】

本発明のいくつかの実施形態において、アルミニウムアジュバントは、ＡＡＨＳ（本明細書において同じ意味でＭｅｒｃｋアルミニウムアジュバント（ＭＡＡ）とも呼ばれる。）の形態である。ＭＡＡは中性ｐＨにおいて電荷を帯びず、一方、Ａｌ（ＯＨ）_３は正の正味電荷を帯び、ＡｌＰＯ_４は典型的には中性ｐＨにおいて負の正味電荷を帯びている。ＭＡＡは、ＡｌＯＨよりも高いＨＰＶ ＶＬＰへの結合能を有する。加えて、ＭＡＡに吸着されたＶＬＰは、Ａｌ（ＯＨ）_３に吸着されたＶＬＰより大きな体液性免疫応答をマウスにおいて誘導しうる。Ｃａｕｌｆｉｅｌｄら，Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ３：１３９−１４６（２００７）。理論に束縛されるものではないが、アルミニウムアジュバントの正味電荷は、ＶＬＰ抗原へのその結合能に影響を及ぼしうる可能性があり、強く荷電したアジュバントは、中性荷電アジュバントと同じくらい強く抗原に結合することはできない。この理由により、本発明の医薬組成物のアルミニウムアジュバントは、中性ｐＨにおいてゼロ表面電荷点を有することが好ましい。当業者は、中性ｐＨにおけるゼロ表面電荷点を可能にするために緩衝液、塩濃度および／または遊離ホスファートの比率を変更しうるであろう。

【0059】

当業者は、対象のＨＰＶ型に対する免疫応答を増強する上で安全かつ有効である、アルミニウムアジュバントの最適投与量を決定しうるであろう。ＦＤＡ認可ワクチンに含有されるアルミニウムの安全性プロファイル、ならびにアルミニウムの量に関する考察については、Ｂａｙｌｏｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：Ｓ１８−Ｓ２３（２００２）を参照されたい。一般に、アルミニウムアジュバントの有効かつ安全な用量は、１５０ないし６００μｇ／用量（３００ないし１２００μｇ／ｍＬの濃度）と変動する。本発明の製剤および組成物の特定の実施形態において、ワクチンの用量当たり２００ないし３００μｇの間のアルミニウムアジュバントが存在する。本発明の製剤および組成物の別の実施形態において、ワクチンの用量当たり３００ないし５００μｇの間のアルミニウムアジュバントが存在する。

【0060】

作製法
本発明の他の態様において、凍結乾燥プロセスにより引き起こされたストレスに耐性のある凍結乾燥ＨＰＶワクチン製剤を作成するための方法が提供され、ここで該ＨＰＶワクチン製剤は、液体製剤の物理的および／または免疫学的特性を保持することが可能である。従って、本発明は、（ａ）（ｉ）アルミニウム塩アジュバント上に吸着された少なくとも１のＨＰＶ型のＨＰＶ ＶＬＰ（ここで少なくとも１のＨＰＶ型のＨＰＶ ＶＬＰは、１０〜２００μｇ／ｍｌの濃度で存在し、該ＶＬＰはＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３およびＨＰＶ８２から成る群より選ばれている）、（ｉｉ）約１％ないし約１０％ｗ／ｖマンニトール、ならびに（ｉｉｉ）約０．５％ないし約１０％ショ糖を含む液体ＨＰＶワクチン製剤を処方すること、（ｂ）凍結製剤を産生するために液体製剤を凍結すること、ならびに（ｃ）凍結乾燥ＨＰＶワクチン製剤を提供するために凍結製剤を乾燥することを含む安定な凍結乾燥ＨＰＶワクチン製剤を作成する方法を提供する。本発明のこの態様の好ましい実施形態において、マンニトールは約４％ないし約７％ｗ／ｖの範囲の濃度で存在し、ショ糖は約１％ないし約５％ｗ／ｖの濃度で存在する。あるいは、本明細書に記載のＨＰＶワクチン製剤のいずれも、上述の方法において使用し得る。

【0061】

本発明のこの態様のさらなる実施形態において、液体ＨＰＶワクチン製剤は、約１０ｍＭヒスチジン、約０．３０Ｍないし約０．３５Ｍ ＮａＣｌおよび／または０．０１％ＰＳ８０をさらに含む。別の実施形態において、該方法は、（ａ）本発明の第一の態様のいずれかの実施形態において定義された通りの液体ＨＰＶワクチン製剤を処方すること、（ｂ）凍結ＨＰＶワクチン製剤を産生するために該液体製剤を凍結すること、ならびに（ｃ）凍結乾燥（ｌｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｏｒ ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）ワクチン製剤を提供するために該製剤を乾燥することを含む。

【0062】

製剤の凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｉｎｇ）（「ｆｒｅｅ−ｄｒｙｉｎｇ」としても知られる）プロセスは二つの段階、即ち（１）凍結および（２）乾燥を含む。本明細書に開示される方法の凍結ステップは、凍結乾燥プロセスの第一のステップであるが、アモルファスな産物に対してはＴｇ‘（ガラス転位温度）より低い温度でまたは結晶状態の産物に対してはＴｅｕ（共晶溶融温度）より低い温度で、液体製剤の固体への変換に十分な時間だけ実施される。液体製剤を固体に変換するのに要する時間は、一部は製剤を凍結乾燥するために使用される容器における総充填量に依存する。多量の充填量が使用されるとき、液体製剤を固体に変換するために要する時間は、同等の製剤に対して比較的に少量の充填量が使用されるときよりも長いであろう。

【0063】

凍結ステップの最後に、液体製剤に存在する水は氷に変換されて、典型的には水の２０％（ｗ／ｗ）未満が液体として存在する。加えて冷却速度は、氷晶の大きさおよびケーキの構造を決定する。緩慢凍結は、例えば、通常大きな氷晶を有する多孔質なケーキの形成をもたらす。当業者は、本発明の方法を実施するための適切な凍結温度を容易に決定し得る。

【0064】

凍結乾燥プロセスの第二のステップは乾燥からなる。乾燥ステップは、個々の製剤、棚温度、容器施栓およびチャンバー圧力に基づいて最適化し得る。凍結乾燥プロセスに追加のステップを組み入れるのは有利かもしれず、例えば、本発明の凍結乾燥ＨＰＶワクチン製剤を作成するために、予備凍結ステップ、追加の乾燥ステップまたは徐冷（アニーリング）ステップが凍結乾燥サイクルに追加されてもよい。当業者は、本発明の個々の製剤に対し既知の手順に従って凍結乾燥サイクルを最適化し得る（例えば、ＷＯ ２０１１／０１７０７０を参照されたい。）。

【0065】

本発明のこの態様の他の実施形態において、プロセスには、再構成液体製剤を提供するためにワクチン製剤が希釈剤により再構成されるステップがさらに含まれる。本発明の凍結乾燥製剤を再構成するために有用な希釈剤には、安全で安定かつ薬学的に許容可能な担体である任意の液体が含まれる。本発明のいくつかの実施形態において、製剤はＳＷＦＩ（注射用滅菌水）および／またはＢＷＦＩ（注射用静菌水）により再構成される。安定剤、可溶化剤、例えばＮａＣｌ、ＭｇＣｌ_２またはＣａＣｌ_２等の浸透張力調節剤およびその混合物を含有するＳＷＦＩは、本明細書記載の方法においても有用である。

【0066】

本発明の他の態様において、凍結および融解によって引き起こされるストレスに耐性である凍結ＨＰＶワクチン製剤を作成するための方法が提供され、ここで該ＨＰＶワクチン製剤は、液体製剤の物理的および／または免疫学的特性を保持することが可能である。従って、本発明は、（ａ）（ｉ）アルミニウム塩アジュバント上に吸着した少なくとも１のＨＰＶ型のＨＰＶ ＶＬＰ（ここで少なくとも１のＨＰＶ型のＶＬＰは、１０〜２００μｇ／ｍｌの濃度で存在し、ＶＬＰは、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３およびＨＰＶ８２からなる群より選ばれている）、（ｉｉ）約１％ないし約１０％ｗ／ｖマンニトール、および（ｉｉｉ）約０．５％ないし約１０％ショ糖を含む液体ＨＰＶワクチン製剤を処方すること、ならびに（ｂ）凍結製剤を産生するために液体製剤を凍結することを含む安定な凍結ＨＰＶワクチン製剤を作成する方法を提供する。本発明のこの態様の好ましい実施態様において、マンニトールは、約４％ないし約７％ｗ／ｖの範囲の濃度で存在し、ショ糖は、約１％ないし約５％ｗ／ｖの濃度で存在する。別の好ましい実施形態において、マンニトールは、約５％ないし約６％ｗ／ｖの範囲で存在し、ショ糖は、約２％ないし約４％ｗ／ｖの濃度で存在する。あるいは、本明細書記載のＨＰＶワクチン製剤のいずれも上述の方法において使用され得る。

【0067】

本発明のこの態様のさらなる実施形態において、液体ＨＰＶワクチン製剤は、約１０ｍＭヒスチジン、約５０ｍＭないし約３５０ｍＭ ＮａＣｌおよび／または０．０１％ＰＳ８０をさらに含む。別の実施形態において、該方法は、（ａ）本発明の第一の態様の任意の実施形態において定義された液体ＨＰＶワクチン製剤を処方すること、および（ｂ）凍結ＨＰＶワクチン製剤を産生するために液体製剤を凍結することを含む。

【0068】

使用方法
本発明は、また本明細書に開示するＨＰＶを含むワクチン組成物の投与によって、ヒト患者の感染の可能性を防止または低減する方法も提供する。

【0069】

本明細書で提供する特定の実施形態において、患者に投与される医薬組成物は、ＨＰＶ６、１１、１６および１８型のＶＬＰを含む。追加の実施形態において、組成物はＨＰＶ３１、３３、４５、５２および５８型のＶＬＰをさらに含む。他の実施形態において、該組成物は、ＨＰＶ１６型のＨＰＶ ＶＬＰを含み、しかも、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３およびＨＰＶ８２からなる群より選択される少なくとも１の追加のＨＰＶ型のＶＬＰをさらに含む。

【0070】

本発明のワクチン組成物は、最小限の潜在毒性を伴ってＨＰＶ感染の最適な阻害を可能とする適切な投与量で単独で使用し得る。加えて、他の薬剤の共投与または逐次投与も望ましい。

【0071】

本発明の製剤および組成物は、筋肉内注射、皮下注射、皮内導入または皮膚を通した圧入によって患者に投与し得る。他の投与方法、例えば、腹腔内、静脈内または吸入送達等もまた考慮される。本発明の好ましい実施形態において、ワクチンおよび医薬組成物は筋肉内投与によって投与される。

【0072】

本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に開示のＨＰＶ医薬組成物および製剤は、増強された持続的な免疫応答を誘導するために種々の初回免疫／追加免疫の組み合せで患者に投与される。この場合、２の医薬組成物が「初回免疫および追加免疫」投薬計画において投与される。例えば、第一の組成物が１回または複数回投与され、次に予め設定された時間、例えば、２週間、１か月、２か月、６か月または他の適切な間隔の後に、第二の組成物が１回または複数回投与される。

【0073】

好ましくは、臨床投与計画において使用される２以上のＨＰＶ医薬組成物は、同一のＨＰＶ型のＶＬＰまたはＨＰＶ型の組み合わせのＶＬＰを含む。しかしながら、２のワクチン投与を分離する適切な時間の間隔を伴って、２の異なるＨＰＶ医薬組成物が患者に投与される臨床投与計画に従うのも望ましい。例えば、ＨＰＶ１６型および１８型のＶＬＰを含むワクチン組成物は、適切なある時点で投与され得て、予め設定された時間が経過した後に、適切な第二の時点でＨＰＶ３１型、３３型、４５型、５２型および５８型のＶＬＰを含むＨＰＶワクチン組成物によって引き続いて投与され得る。このような場合、２の異なるＨＰＶワクチン組成物の各々は、患者に対し１回、または適切な時間を隔てて２回以上投与され得る。

【0074】

本明細書で言及する全ての刊行物は、本発明に関連して使用され得る方法および材料を記載し開示する目的で参照して援用される。本明細書のいかなるものも、本発明が先行発明のために当該開示に先行する権利を有さないということを承認するものと解釈されてはならない。

【0075】

添付の図を参照して発明の好ましい実施形態を記載したが、本発明はこれらの実施形態そのものに限定されないこと、および種々の変更や改変が、添付の特許請求の範囲で定義された発明の範囲と趣旨から逸脱することなく当業者によって行うことができることを了解されたい。

【0076】

以下の実施例は、本発明を説明するが限定するものではない。

【実施例1】

【0077】

材料と方法
（ａ）試料の調製：ガーダシル（ＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標））（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．Ｉｎｃ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ）として知られるヒトパピローマウイルス４価（６型、１１型、１６型、１８型）組換えワクチンを、本明細書記載の研究において代表的なワクチンとして使用した。ガーダシル（登録商標）は、ＨＰＶ６、１１、１６および１８型の主カプシド（Ｌ１）タンパク質の高度に精製されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）から調製された非感染性の組換え４価ワクチンである。この研究で使用されたガーダシル（登録商標）試料（本明細書で「ＨＰＶ４価ワクチン（ＨＰＶ４−ｖａｌｅｎｔ ｖａｃｃｉｎｅ）」または「ＨＰＶ４価ワクチン（ＨＰＶ ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ ｖａｃｃｉｎｅ）」と表す）は、既述の通り（Ｌｏｗｅ，Ｒ．Ｓ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７６：１１４１−４５（１９９７）；Ｃｏｏｋ，Ｊ．Ｃ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓ Ｐｕｒｉｆ．１７：４７７−８４（１９９９））製造された最終容器ロットから構成した。即ち、型特異的ＨＰＶ Ｌ１タンパク質は、組換えサッカロミセス・セレビシエにおいて別々の発酵によって産生され、ＶＬＰへと自己集合させた。ＶＬＰは、一連の化学的および物理的方法によって精製した。精製した水性ＶＬＰの各々は、予備形成されたＭｅｒｃｋのアルミニウムヒドロキシホスファートスルファートアジュバント（ＭＡＡ）上に個別に吸着した。１価ワクチン成分は、１０ｍＭヒスチジン、０．０１％ポリソルベート８０および０．３３Ｍ塩化ナトリウム中で処方された。４の個々の１価（アジュバント吸着）ワクチンは、ガーダシルの４価の用量を形成するために、ＨＰＶ６、１１、１６および１８型のそれぞれに対し４０、８０、８０および４０μｇ／ｍｌのタンパク質濃度で混合した。

【0078】

長期安定性の研究のために、ＨＰＶ試料は上記の通り調製した。加えて、抗原を有さない１Ｘ ＭＡＡを含む試料を調製した。２Ｘ ＭＡＡ試料を調製するために、緩衝塩類溶液（６．１ｍＭリン酸ナトリウムおよび１２０ｍＭ塩化ナトリウム）および５．４４％硫酸アルミニウムカリウム溶液をタンク中で組み合わせた。アジュバントを沈殿させ２〜８℃において目標のｐＨ７．７〜７．８に調整するために、タンクに１．０Ｎ 水酸化ナトリウムを添加した。ｐＨを調整した溶液は、表示分画分子量（ＭＷＣＯ）２００，０００の膜を通す再循環によって３倍に濃縮し、その後カリウムおよびスルファートイオンの含量を低減するために、目標の生理的食塩水（０．９％ 塩化ナトリウム）の２．１容量に対して透析濾過した。透析濾過後に、アジュバントは、生理的食塩水および１．４％ ホウ酸溶液により目標の９００μｇ／ｍＬ（２Ｘ ＭＡＡ）のアルミニウム濃度に希釈した。２Ｘ ＭＡＡは、この研究において使用される１Ｘ ＭＡＡを調製するために生理的食塩水（０．９％ 塩化ナトリウム）により１：１でさらに希釈した。

【0079】

（ｂ）緩衝液組成。ＭＡＡに結合した四価のＨＰＶ型を含有するＨＰＶワクチン製剤は、沈降／デカントプロセスを使用して１８の緩衝液により緩衝液交換した。全ての緩衝液は、図１に示す通り、異なる賦形剤組成を含む１０ｍＭヒスチジン、０．０１％ポリソルベート８０（ｐＨ６．２）の基礎製剤を有した。

【0080】

緩衝液の識別番号と共に、この研究で使用される緩衝液の簡単な説明を以下に示す（表１）。

【表1】

【0081】

長期安定性の研究のために、ＭＡＡおよび１Ｘ ＭＡＡアジュバントのみに結合した４価ＨＰＶ型を含有するＨＰＶワクチン製剤は、上記緩衝液の５個により緩衝液交換された。（０または３２０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液‐Ｂから緩衝液‐Ｄまで（即ち、緩衝液Ｂ‐１４、Ｂ‐３、Ｂ‐１５、Ｂ‐４およびＢ‐１６）。緩衝液Ｂ‐２は、長期安定性研究において試験しなかった）。

【0082】

（ｃ）凍結融解の研究：緩衝液Ｂ‐１ないしＢ‐１８（参照、表１）を含むＨＰＶワクチン製剤は、液体窒素吹付を使用する−１１５℃で１５分間の急速瞬間凍結（ＦＦ）かまたは−７０℃で１時間の通常の凍結を実施した。瞬間凍結は１回（１Ｘ）（１Ｘ ＦＦ）繰り返し、通常凍結は１回（１Ｘ）および３回（３Ｘ）繰り返した。試験製剤は、０．６ｍｌの充填量で３ｍＬのガラス製バイアルに充填した。凍結ワクチン試料は、雰囲気温度において１時間で融解した。凍結融解サイクル後に、試料の効力を分析し、他の特性アッセイを実施した。

【0083】

長期安定性研究のために、上記のＨＰＶワクチン製剤および１Ｘ ＭＡＡ製剤は、−７０℃で通常凍結し、凍結製剤は−７０℃で約２４時間保存した。試験製剤は、０．６ｍｌの充填量で３ｍＬのガラス製バイアルに充填した。凍結ワクチン試料は、雰囲気温度において１時間で融解した。凍結融解サイクル後にバイアルは、長期安定性研究を受ける前に２〜８℃において１か月間放置した。いくつかの時点において、ＨＰＶ製剤および１Ｘ ＭＡＡ製剤の双方について試料の効力を分析し、他の特性アッセイを実施した。

【0084】

（ｄ）凍結乾燥の研究：緩衝液Ｂ‐１ないしＢ‐１８（参照、表１）を含むＨＰＶ製剤は、液体窒素の吹付を使用する−１１５℃で１５分間の急速瞬間凍結（ＦＦ）かまたは予備冷却凍結乾燥用棚を使用する急速瞬間凍結による凍結処理を伴う凍結乾燥を受けた。ワクチン試料は、０．６ｍｌの充填量で３ｍＬのガラス製バイアルに保持した。凍結ワクチン試料は、標準的な凍結乾燥プロセスパラメータを使用して凍結乾燥を実施した。即ち、試料を凍結乾燥器内で−５０℃に予備冷却した棚上に載せ、棚を−５０℃で１時間保持した。その後、−２０℃で２時間徐冷（アニール）処理を実施した（０．５℃／分の温度勾配）。その後、棚を−５０℃に再冷却し（０．５℃／分の温度勾配）、２．５時間保持した。第一の乾燥は、１００ミリトル（ｍＴｏｒｒ）の圧力下で４８時間、毎分１℃の割合で棚を−２０℃まで加熱することによって行った。第二の乾燥は、１０℃の温度で４時間、０．５℃／分の割合で実施した。凍結乾燥後、バイアルを窒素ガスで充填し、部分真空下で栓をし、取出した。凍結乾燥ワクチン試料は、さらなる分析のために凍結して保存した。

【0085】

長期安定性の研究のために、ＨＰＶワクチン製剤および１Ｘ ＭＡＡ製剤は、予備冷却凍結乾燥棚を使用する凍結処理を伴う凍結乾燥を受けた。ワクチン試料は、上記の通り充填した。凍結ワクチン試料は、上記の標準的な凍結乾燥プロセスパラメータを使用して凍結乾燥した。凍結乾燥ワクチンバイアルは、長期安定性の研究を受けるまで凍結して保存した。

【0086】

（ｅ）加速安定性の研究：安定性の研究は、緩衝液Ｂ‐１ないしＢ‐１８（参照、表１）を含む全ての４価ＨＰＶワクチン製剤に対して加速温度条件下で実施した。種々の製剤緩衝液中の凍結乾燥４価ＨＰＶの試験試料は、それぞれの凍結乾燥していない液体４価ＨＰＶ製剤と共に、４５℃で１か月間の加速温度条件に放置した。この温度は、ＨＰＶ ＶＬＰの不活化速度が非常に温度に敏感であるので選択した。試料は、認証された安定性試験チャンバーに保存した。安定性試験の最後に、試料の外観を分析し、次に再構成後に効力および他の特性研究について評価しした。

【0087】

（ｆ）インビトロ抗原性アッセイ。アルミニウムアジュバントからＨＰＶを遊離するために、クエン酸およびポリソルベート８０を含有する高濃度塩溶液へのＨＰＶアルミニウム製剤の希釈を含むアルミニウム溶解法を開発した。アルミニウム溶解法の後に、ＨＰＶ ＶＬＰ試料は、表面プラズモン共鳴測定装置を使用するインビトロ抗原性アッセイを直接受けた。

【0088】

ＨＰＶ ＶＬＰのインビトロ抗原性は、ＨＰＶ特異的中和抗体に対するＶＬＰの親和性をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００または３０００測定装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で表面プラズモン共鳴法を使用して測定することによって決定した。抗ＨＰＶ抗体は、ＢｉａｃｏｒｅセンサーチップＣＭ５の表面に化学的にカップルしたラット−マウス抗体Ｆｃγに結合することによって固定化した。流動相におけるセンサーチップ表面上の抗体とＨＰＶ ＶＬＰ抗原の相互作用は、抗原に対する抗体の結合によって誘導されるセンサーチップの屈折率変化に基づいて記録される。アルミニウムアジュバント化製剤の研究からのＨＰＶ ＶＬＰ試料は、インビトロ抗原性を決定するために、同じＨＰＶ ＶＬＰの新たに融解した凍結保存溶液（標準試料）と直接比較した。

【0089】

（ｇ）動的光散乱法（ＤＬＳ）。粒度の測定は、雰囲気温度でＤｙｎａＰｒｏ（登録商標）動的光散乱測定装置（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を使用して行った。測定装置は、ポリマーラテックスのサイズ標準物質を使用して較正した。上記のアルミニウム溶解法を使用して得られたＨＰＶ ＶＬＰ試料は、ＤＬＳ測定を直接実施した。溶液中のＶＬＰのブラウン運動による散乱強度の変動に対する自己相関関数の累積解析が、平均拡散係数を与えた（Ｋｏｐｐｅｌ，Ｄ．Ｅ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．３７：４８１４−２０（１９７２））。Ｚ平均液体力学的径の値は、ストークス・アインシュタインの式を使用して平均拡散係数に基づき得られた。抗原粒子の見かけの流体力学サイズは、Ｚ平均流体力学径（Ｄ_ｈ）として記録した。本明細書に報告した全てのデータは、同一試料の５の測定値の平均である。

【0090】

（ｈ）静的光散乱法（ＳＬＳ）。粒度の測定は、雰囲気温度でＭａｌｖｅｒｎ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ２０００静的光散乱測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して行った。粒子サイズを測定するためにレーザー回折法を使用した。測定装置は、ポリマーラテックスのサイズ標準物質を使用して較正した。１Ｘ ＭＡＡ試料は、水で希釈しその後にＳＬＳ測定を実施した。ミクロン（μｍ）での粒子サイズ（０．５）を、散乱方向のファクターとして平均強度分布を回収して、種々の試験条件（それぞれの対照とともにＦ／Ｔ ＦＦ １ＸおよびＬＹＯ）の関数としてプロットした
（ｉ）浸透圧測定。この研究のためにＡｄｖａｎｃｅｄ（登録商標）Ｍｏｄｅｌ ３３００ Ｍｉｃｒｏ−Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ）を使用した。本装置は、氷点効果によって試料の浸透圧を測定するために試料２０μｌを使用する。試料の過冷却は、定位置にある装置のサーミスタプローブへ、試料を含有する特別に設計したディスポーザブルなホルダーを挿入することによって開始した。ソレノイド誘導パルスおよび続いて起こる試料の凍結後に、解放された融解熱がマイクロプロセッサーによって試料の氷点と関連づけられ、浸透圧がデジタル表示装置に示される。測定装置の較正は、２の較正レベル（５０および８５０ ｍＯｓｍ／ｋｇ）の各々において２〜５の試料を実行することによって実施した。内部較正は、許容可能な再現性が確立した後に、測定装置によって自動的に実施された。測定装置の較正後に、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓにより供給された標準試料Ｃｌｉｎｉｔｒｏｌ（登録商標）２９０（２９０ ｍＯｓｍ／ｋｇ）を測定した。ＨＰＶ製剤の試料は、標準試料の後に測定した。

【0091】

（ｊ）乾燥ケーキの外観：製品開発努力の間の所望の医薬エレガンスの促進には、一般的に許容可能な製品外観標準の範囲を確立することが含まれる。乾燥ケーキの性状を評価することには、色調、密度、均一性および収縮、崩壊またはメルトバックの形跡等の物理的性状の記載が必要となる。凍結乾燥ＨＰＶワクチン製剤の外観は、以下に特定する通りの品質性状に基づいて主観的に評価した（表２）。

【表2】

【0092】

（ｋ）再構成時間。再構成速度は、製剤に依存する製品特性である。乾燥ＨＰＶワクチン製剤の再構成時間は、注射用滅菌水の添加の際の均一な懸濁液の存在によって示される、凍結乾燥ケーキの完全な溶解に必要な時間を測定して決定した。凍結乾燥ＨＰＶワクチン製剤の各々に、製剤の賦形剤濃度に基づいて、滅菌ＷＦＩ（注射用水）の約０．５ないし０．６ｍｌを添加した。ＨＰＶ ＶＬＰの所望の濃度を維持するために、再構成後の製剤の終容量は、ほぼ０．６ｍｌに保持した。

【0093】

（ｌ）振盪試験。ワクチン製剤がコールドチェーン行程の間に凍結したかどうかを判定するために、アルミニウム吸着ワクチンに関して振盪試験を実施した。ワクチン製剤の凍結は、ミョウバンの構造を不可逆的に変えて、ワクチンの抗原性を著しく低下させる。ミョウバンに基づくワクチンの凍結は、格子構造の破壊をもたらし、結果としてミョウバン内容物の凝集およびより速い沈降を生じる。沈降のより速い速度は、試験および対照バイアル中の沈降速度を比較しようとする陽性の振盪試験の基礎を形成する。もしも以前に凍結または凍結乾燥されたことが知られた試験バイアルが、以前に凍結または凍結乾燥されなかった対照バイアルのそれと類似の沈降速度を示せば、ワクチンの効力が確認される。もしも対照バイアルに比べて、より速い臨港速度が試験バイアルに対して観察されるならば、該ワクチンは凝集ミョウバンが存在するために使用には安全でないと考えられる。

【0094】

沈降速度を測定するために、試験バイアルおよび対照バイアルを混合してワクチン製剤の均一な懸濁液を得た。混合後、バイアルを放置し、沈降時間を測定した。もしワクチンが均一に混合されなかったならば、または沈殿物／綿状沈殿物がより速い速度で底に定着したならば、試験バイアルが凍結／凍結乾燥され、それによりミョウバン構造が損傷して、その損傷の結果大きな凝集ミョウバン粒子が形成し得たと結論することができる。凍結‐融解または凍結乾燥および再構成された全てのＨＰＶワクチン製剤は、その品質を評価するために振盪試験によって分析した。

【実施例2】

【0095】

インビトロ抗原性
ＨＰＶ ＶＬＰを含む４価ＨＰＶワクチン製剤のインビトロ抗原性は、中和抗体結合アッセイ法（表面プラズモン共鳴法、Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して評価した。抗原の生物活性の分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００およびＢｉａｃｏｒｅ３０００測定装置を使用して測定した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。Ｂｉａｃｏｒｅは、凍結‐融解かまたは凍結乾燥された４価ＨＰＶワクチンの試験製剤に対して実施した。凍結乾燥４価ＨＰＶ製剤は、実施例１に記載の通りアルミニウム溶解に先立って注射用滅菌水で再構成した。ＨＰＶ６、１１、１６および１８型ＶＬＰを含む全ての試験製剤は、溶解緩衝液により希釈し緩衝液Ｂ‐１ないしＢ‐１８に懸濁した。

【0096】

各４価ＨＰＶワクチン製剤におけるＨＰＶ ＶＬＰ抗原の全４型は、Ｂｉａｃｏｒｅ分析によってインビトロ抗原性を分析した。利用したＢｉａｃｏｒｅの条件は、Ｍａｃｈら（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９５：２１９５−２２０６（２００６））に記載されたものに改変を加えたものであった。全ての試料は、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる分析に先立ってアルミニウムアジュバントからＨＰＶ ＶＬＰ抗原を遊離するために、実施例１に記載のアルミニウム溶解法により処理した。アルミニウムアジュバント化研究からのＨＰＶ ＶＬＰ試料は、インビトロ抗原性を測定するために同じＨＰＶ ＶＬＰの凍結保存溶液と直接比較した。新たに融解したＨＰＶ ＶＬＰの凍結保存溶液を、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイの基準品とした。アルミニウム溶解ＨＰＶ試料は、直接使用するかかまたはＢｉａｃｏｒｅ測定の前に各ＨＰＶ型に対して凍結保存溶液の基準品の濃度と釣り合わせるために更に希釈した。試験ＨＰＶ製剤のＢｉａｃｏｒｅのデータは、全ての緩衝液（Ｂ‐１ないしＢ‐１８）由来の凍結融解された製剤および凍結乾燥された製剤の双方は、同じ緩衝液（Ｂ‐１ないしＢ‐１８）中の凍結融解も凍結乾燥もされなかった対照ＨＰＶ製剤と正規化した。報告したＢｉａｃｏｒｅ値は、試料製剤当たり２の測定値の平均であった。

【0097】

１Ｘ凍結‐融解、３Ｘ凍結‐融解および１Ｘ瞬間凍結後のＨＰＶ試験製剤の各々における、各ＨＰＶ型に対する正規化したＢｉａｃｏｒｅのデータを図２に示す。凍結融解プロセスを受けた全ての４価ＨＰＶワクチン製剤は、十分に効力があり、しかもいずれの塩も賦形剤も有さない緩衝液Ｂ‐２（緩衝液Ｂ＋０ｍＭ ＮａＣｌ）の製剤を除き、試験した全ての４のＨＰＶ型に対する標準試料とほとんど同一のＢｉａｃｏｒｅ応答を有した。全てのＨＰＶ型の抗原性に関する強い影響は、塩および賦形剤が存在しない緩衝液Ｂ（Ｂ‐２）に関しては３Ｘ凍結‐融解を実施したときにより著しかった。全てのＨＰＶ型に対する抗原性において、１Ｘ通常凍結‐融解試料と１Ｘ瞬間凍結融解試料の間に有意差はなかった。データより、塩、賦形剤または双方の存在が凍結‐融解に関連するストレスに耐え、ＨＰＶ型の抗原性を保持するために必要であると結論し得る。

【0098】

予備冷却棚または瞬間凍結を使用した凍結乾燥後の、種々のＨＰＶワクチン製剤の各々における各ＨＰＶ型に対する凍結乾燥プロセスの間の正規化したＢｉａｃｏｒｅのデータ（参照、実施例１）を図３に示す。Ｂｉａｃｏｒｅの結果は、いかなる賦形剤も含まない緩衝液‐Ｂ（Ｂ‐２、Ｂ‐８およびＢ‐１４）に対しては全てのＨＰＶ型についての抗原性が低下し、一方、製剤緩衝液の残りについての抗原性が標準試料と同等であることを示した。全てのＨＰＶ型についての抗原性において凍結乾燥の間、予備冷却試料と瞬間凍結試料の間に有意差はなかった。緩衝液Ｂ‐２およびその対応する塩緩衝液（Ｂ‐８およびＢ‐１４）におけるＨＰＶワクチン製剤は、凍結乾燥プロセスに耐え得なかった。抗原性の低下が製剤緩衝液Ｂ（Ｂ‐２、Ｂ‐８およびＢ‐１４）において全てのＨＰＶ型について観察された。抗原性の低下は塩が無いときに（Ｂ‐２）著しく大きく、しかもそれは塩濃度の上昇により改善された。５％マンニトールおよび塩を含む緩衝液（緩衝液Ａ＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ（Ｂ‐７）および緩衝液Ａ＋３２０ｍＭ ＮａＣｌ（Ｂ‐１３））については、１０〜１５％の抗原性の低下が全てのＨＰＶ型に対して観察された。図３から分かるように、製剤中に賦形剤の組み合せを有さなかった緩衝液は、凍結乾燥プロセスに関連するストレスに耐え得なかった。賦形剤であるマンニトールおよびショ糖の組み合せから成る製剤緩衝液ＣおよびＤは、ＨＰＶ ＶＬＰの完全性を維持し得て、それ故に凍結乾燥プロセス後でさえもワクチンの抗原性を保持した。これは、緩衝液‐Ｅ（ショ糖単独）または緩衝液‐Ａ（マンニトール単独）製剤と比較して、共同したこれらの賦形剤のワクチン安定剤としての役割を示唆する。

【0099】

上記の凍結乾燥研究において使用した凍結乾燥４価ＨＰＶワクチン製剤（Ｂ‐１ないしＢ‐１８）は、凍結乾燥ワクチンの保存安定性を評価するために４５℃で１か月間、凍結乾燥した固体形態で保存した。凍結乾燥していない液体４価ＨＰＶワクチン製剤（Ｂ‐１ないしＢ‐１８）は、凍結乾燥ＨＰＶワクチン製剤の保存安定性の評価において、それぞれの対照として使用した。４５℃で１か月保存後に、凍結乾燥製剤は外観について評価し、その後に実施例１に記載の通り注射用滅菌水により再構成した。試験試料は、実施例１に記載の通りＢｉａｃｏｒｅを使用して抗原性を評価した。４５℃で１か月保存後の、種々のＨＰＶワクチン製剤の各々における各ＨＰＶ型についての正規化されたＢｉａｃｏｒｅのデータを図４に示す。種々の緩衝液中の凍結乾燥していない液体４価ＨＰＶ製剤における全てのＨＰＶ型についての抗原性は、４５℃で１か月保存後に約２０〜４０％であったが、ＨＰＶ ＶＬＰ抗原が所定の保存条件下、液体製剤の中で安定でなかったことを示している。これに反して、４５℃で１か月間保存された緩衝液‐Ｃ中の凍結乾燥の双方の型（Ｌｙｏ ＰＣおよびＬｙｏ ＦＦ）の凍結乾燥ＨＰＶ製剤は、凍結乾燥されていない液体のカウンターパートよりも著しく高い抗原性値を示した。製剤中にショ糖のみを含有する凍結乾燥ＨＰＶ製剤、緩衝液‐Ｅ（Ｂ‐５、Ｂ‐１１およびＢ‐１７）は、４５℃で１か月保存後にショ糖の不安定性（分解）のために着色した。分解したショ糖試料が固定化チップへのＨＰＶ抗体の結合を阻害して測定装置の故障を引き起こしていたと信じられており、それ故に図４においてデータ点の幾つかが失われた。結果は、緩衝液Ｃ（Ｂ‐３）およびその対応する塩含有緩衝液（Ｂ‐９およびＢ‐１５）が、４５℃で１か月保存後でさえもＨＰＶ型のほとんどに対してＨＰＶ ＶＬＰの抗原性を８０〜９０％まで保持し得たことを示す。抗原性の低下が塩を含まない緩衝液Ｄについて観察されたが、一方、その対応する塩を含有する緩衝液（Ｂ‐１０およびＢ‐１６）は、４５℃で１か月保存後でさえもＨＰＶ型のほとんどに対する抗原性を保持した。従って、安定性プロファイルに基づいて、マンニトールとショ糖の組合せを含有する緩衝液は、所望の抗原性を有する安定なワクチン製品を提供したと結論付けることができる。

【実施例3】

【0100】

浸透圧測定
浸透圧測定は、凍結融解かまたは凍結乾燥プロセスに先立って種々の緩衝液（Ｂ‐１ないしＢ‐１８）中の全ての対照の４価ＨＰＶ製剤に関して実施した。結果は、全ての緩衝液に対して塩濃度の上昇に伴う浸透圧値の増加があることを示す（図５）。浸透圧に対する寄与は、主に賦形剤（マンニトール、ショ糖およびグリシン）および塩（塩化ナトリウム）由来であり、ヒスチジン、ＨＰＶ抗原またはＭＡＡ由来ではない（最小の浸透圧を有する緩衝液Ｂ‐２の事例に示す通りである）。製剤緩衝液Ｂ‐１４中に存在したＨＰＶ４価ワクチン（現行のガーダシル（登録商標）製剤に類似）についての浸透圧は、約５８５ｍＯｓｍであった（図５）。緩衝液Ｂ‐１３ないしＢ‐１８（参照、表１）は、緩衝液Ｂ‐１４を除き、それらの製剤についての高い浸透圧に寄与した高い塩濃度の賦形剤を有した。これに反して、緩衝液Ｂ‐１ないしＢ‐１２（参照、表１）は、緩衝液Ｂ‐９およびＢ‐１０を除き、低い浸透圧値に寄与した低い塩濃度の賦形剤を有した。塩と賦形剤の組合せが、所定のＨＰＶ４価ワクチン製剤の浸透圧を確定するうえで重要な役割を果たす。

【実施例4】

【0101】

粒度測定
粒度測定は、凍結‐融解製剤（実施例１（ｃ）に記載の通り、１Ｘ、３Ｘ通常凍結‐融解サイクルおよび１Ｘ瞬間凍結‐融解サイクル後）、および凍結乾燥製剤（実施例１（ｄ）に記載の通り、瞬間凍結による凍結乾燥または予備冷却凍結乾燥棚による凍結乾燥後）を含む、全ての緩衝液（緩衝液‐Ａないし緩衝液‐Ｆ）由来の全ての４価ＨＰＶワクチン製剤、ならびに凍結融解も凍結乾燥もされなかった同じ緩衝液（緩衝液‐Ａないし緩衝液‐Ｆ）における対照の４価ＨＰＶワクチン製剤に関して実施した。全ての試料は、アルミニウムアジュバントからＨＰＶ ＶＬＰ抗原を遊離するために、粒度測定に先立って実施例１（ｆ）に記載のアルミニウム溶解法により処理した。粒度分布は、アルミニウム溶解後に溶液中に存在する全てのＨＰＶ ＶＬＰの粒度分布の平均測定値である。種々の緩衝液組成物中の全ての４価ＨＰＶ製剤についての粒度分布に相当するｚ平均値を図６に示す。

【0102】

図６に示すように、最大の粒度測定値を示した１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液‐Ｄ（Ｂ‐１０、参照、図１）を除き、粒度は、塩を含まない全ての緩衝液（０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する緩衝液‐Ａないし緩衝液‐Ｆ）中の対照および凍結‐融解（１Ｘ、３Ｘおよび１Ｘ ＦＦ）４価ＨＰＶ製剤の方が、塩を含む緩衝液（１５０または３２０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する緩衝液‐Ａないし緩衝液‐Ｆ）におけるそれらの製剤よりもわずかに大きかった。塩の存在下において、対照の４価ＨＰＶ製剤を含む全ての４価ＨＰＶ製剤は、溶解緩衝液中に存在するＨＰＶ ＶＬＰに対し典型的に予想される８０ないし１００ｎｍの範囲内の粒度分布を有した。評価した種々の試験製剤の間で、賦形剤の組合せ（マンニトールおよびショ糖）を含む緩衝液‐Ｃおよび緩衝液‐Ｄを有する試験製剤は、賦形剤であるマンニトールとショ糖の組み合せを含まなかった製剤と比較して、ＶＬＰの粒度分布に関する限りは、凍結融解条件のストレスによる影響を受けにくかった。

【0103】

凍結乾燥４価ＨＰＶワクチン製剤の場合、ＨＰＶ ＶＬＰについての粒度分布は、該製剤組成物中に賦形剤を含有しないかまたは賦形剤としてマンニトールだけを含有する緩衝液（緩衝液‐Ａおよび緩衝液‐Ｂ、参照、図６）については、凍結乾燥された他の４価ＨＰＶワクチン製剤（緩衝液‐Ｃないし緩衝液‐Ｆ）と比較してより大きく、またそれらのそれぞれの凍結乾燥していない対照の４価ＨＰＶワクチン製剤と比較したときもより大きかった。粒度の増大は、塩化ナトリウムが存在する緩衝液‐Ａおよび緩衝液‐Ｂ中の凍結乾燥４価ＨＰＶワクチン製剤にとって重要である。緩衝液‐Ｃ、緩衝液‐Ｄおよび緩衝液‐Ｆを含む凍結乾燥製剤中のＨＰＶ ＶＬＰの粒度分布は、塩濃度に無関係に８０〜１００ｎｍの通常の範囲内にあって、それぞれの凍結乾燥していない対照の４価ＨＰＶ製剤と同等であった。その賦形剤としてショ糖のみを有した凍結乾燥４価ＨＰＶ製剤（緩衝液‐Ｅ）は、塩化ナトリウムが存在しないＨＰＶ ＶＬＰ（０ｍＭ塩化ナトリウムを有する緩衝液‐Ｅ）に対してはより大きな粒度分布を有し、塩化ナトリウムが存在するＨＰＶ ＶＬＰ（１５０または３２０ｍＭ塩化ナトリウムを有する緩衝液‐Ｅ）に対しては８０〜１００ｎｍの範囲内の通常の粒度分布を有した。

【0104】

全体的に見て、その緩衝液組成物中に塩化ナトリウムを含有しない緩衝液‐Ａ、緩衝液‐Ｂ、緩衝液‐Ｄおよび緩衝液‐Ｅ中の４価ＨＰＶワクチン製剤は、これらの緩衝液がその緩衝液組成物中に界面活性剤を有したときでさえも、凍結融解および凍結乾燥プロセスのストレスに耐え得なかった。界面活性剤は、典型的には凍結融解および凍結乾燥プロセスのストレスを受けているタンパク質の凝集を防止することが知られている（Ｂｈａｍｂｈａｎｉら，Ａｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｖ．１３（１）：３１−３８（２０１０）；Ｃｈａｎｇら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１２：１３２５−３０（１９９６））。これに反して、塩化ナトリウムを含んでも含まなくとも、その緩衝液組成物中に賦形剤の組合せを含有した緩衝液‐Ｃおよび緩衝液‐Ｄ中に存在した４価ＨＰＶワクチン製剤は、凍結融解および凍結乾燥プロセスのストレス条件に対し極めて安定であった。塩化ナトリウムをふくんでも含まなくとも、これらの緩衝液中の賦形剤の組み合せ（マンニトールとショ糖）の存在は、凍結融解および凍結乾燥プロセス条件の間、ＭＡＡに結合されるＨＰＶ ＶＬＰの完全性を保存し得た。

【実施例5】

【0105】

凍結乾燥４価ＨＰＶ製剤の特性
（ａ）乾燥ケーキの外観
全ての凍結乾燥ケーキの外観は、凍結乾燥直後（Ｔ＝０）および４５℃で１か月保存後に写真を撮影した。ケーキの外観は、二人の分析者により視覚化して、ケーキは、形態、色調および他の品質特性に基づいて実施例１の記載の通りに分類した（参照、図２）。概して、全ての４価ＨＰＶ製剤に対して乾燥白色固体ケーキが得られた。図７は、種々の緩衝液中の全ての凍結乾燥ＨＰＶ製剤の外観を、各製剤当たり３個のバイアルに基づいて記述する。エレガントなケーキが緩衝液Ｂ‐１、Ｂ‐３、Ｂ‐４、Ｂ‐６およびＢ‐１３に対し観察され、わずかに崩壊したまたは裂け目ができまたは収縮したケーキがＢ‐７、Ｂ‐８、Ｂ‐９、Ｂ‐１０、Ｂ‐１４、Ｂ‐１５およびＢ‐１６に対し観察された。瞬間凍結かまたは予備冷却棚を使用した凍結乾燥後に、完全に崩壊したケーキが緩衝液Ｂ‐５、Ｂ‐１１、Ｂ‐１２、Ｂ‐１７およびＢ‐１８に対して観察された。加えて、完全に崩壊したケーキが、瞬間凍結を使用した凍結乾燥後の緩衝液Ｂ‐２中の製剤に対して観察された。この研究の結果は、ケーキの外観が製剤の賦形剤に依存したことを示す。ショ糖のみ（Ｂ‐５、Ｂ‐１１およびＢ‐１７）、またはグリシンおよび塩と組み合わせたショ糖（Ｂ‐１２およびＢ‐１８）を含有する製剤において、瞬間凍結かまたは予備冷却棚を使用する凍結乾燥後に、ケーキは完全に崩壊した。ショ糖のみを含む製剤とは異なって、エレガントなケーキは、塩の存在なしで、マンニトールのみまたはマンニトール若しくはグリシンと組み合わせたショ糖を含む製剤に対して観察された。マンニトールとショ糖の組み合せの賦形剤を含有する製剤についてのケーキの品質は、塩濃度の上昇とともに低下した。

【0106】

種々の緩衝液中の全ての凍結乾燥ＨＰＶ製剤の外観は、４５℃で１か月保存後も記録した。結果は、凍結乾燥ケーキの形態または外観が、高温におけるショ糖の不安定性により黄色ないし褐色に変色した緩衝液Ｂ‐５、Ｂ‐１１およびＢ‐１７（緩衝液‐Ｅ）における製剤を除いて、４５℃で１か月保存後に変化しなかったことを示す。ショ糖とマンニトールまたはグリシンの組み合せを含む製剤に対しては、色調の変化は観察されなかった。図７は、４５℃で１か月保存された種々の緩衝液中の全ての凍結乾燥ＨＰＶ製剤の外観を記載する。

【0107】

（ｂ）再構成時間
凍結乾燥４価ＨＰＶワクチン製剤は、含まれる賦形剤の量に基づいて注射用滅菌水（ＷＦＩ）により再構成した。ＷＦＩの量は、各製剤に対して０．５０ないし０．６０ｍｌの範囲で添加した。再構成後の最終容量は約０．６ｍｌであった。再構成時間はストップウォッチを使用して測定し、完全溶解（この場合、均一な懸濁液）に要する時間を凍結乾燥後のＨＰＶワクチン製剤の各々に対して記録した。再構成時間は、凍結乾燥直後に再構成された試料および４５℃で１か月間保存された試料に対して図８に示す。

【0108】

製剤のほとんどは、１５秒未満の速い再構成時間を有したが、一方、ショ糖のみを含有する製剤の緩衝液‐Ｅ（Ｂ‐５、Ｂ‐１１およびＢ‐１７）は９０秒以上の遅い再構成時間を有した。同様の傾向が、４５℃で１か月間保存された試料に対し観察された。ショ糖のみを含有する緩衝液‐Ｅ（Ｂ‐５、Ｂ‐１１およびＢ‐１７）中の製剤は、４５℃で１か月間保存されたとき黄色ないし褐色となった。これらの試料の再構成の際、製剤の黄色ないし褐色は、高温での１か月間の保存の間、ショ糖の分解のためになお保持された。

【0109】

（ｃ）振盪試験
全ての凍結乾燥４価ＨＰＶワクチン製剤の再構成後、ワクチン製剤の品質を検査するために振盪試験を実施した。ミョウバン粒子がバイアルの底に沈降する時間を試験製剤の各々に対し測定した。全ての４価ＨＰＶ製剤についての振盪試験時間を図９に示す。塩以外の賦形剤を含まなかった製剤緩衝液（１５０または３２０ｍＭ塩化ナトリウムを有する緩衝液‐Ｂ）は、ミョウバン粒子が凝集したことを示す速い沈降時間を有した。全ての他の製剤においては、沈降時間は１０〜１５分以上であったが、ミョウバン粒子が凝集しなかったことを示している。４価ＨＰＶワクチン製剤における賦形剤の存在は、凍結融解および凍結乾燥ストレス後でさえも、ミョウバン粒子の凝集を防止する。

【0110】

長期安定性研究（実施例６〜９）
長期安定性研究は、種々の保存温度条件下でＨＰＶおよび１Ｘ ＭＡＡ試験製剤に対して実施した。種々の製剤緩衝液中の凍結融解および凍結乾燥された４価ＨＰＶ試験試料および１Ｘ ＭＡＡ試験試料は、種々の保存温度条件（−７０℃、２〜８℃、２５℃および３７℃）において、Ｔ＝０、Ｔ＝1か月、Ｔ＝２か月、Ｔ＝３か月およびＴ＝６か月の採取時点（研究計画に関して表３を参照されたい）を伴って６か月以上放置した。各安定性時点の終わりに、試料の効力および外観を分析し、他の特性研究を実施した。

【0111】

６か月の時点について、試料は、熱安定性に基づくワクチンバイアルモニター（ＶＶＭ）カテゴリーの決定を可能とするために、１９８日間（＞６か月）の規定時間の時点で保存した。世界保健機関（ＷＨＯ）によって実施されているＶＶＭシステムは、ワクチンの熱に対する規定時間を超えた累積暴露を検知するための方法として、ワクチンバイアル上に化学的な時間‐温度表示ラベルを利用する。ラベルは、ＶＶＭの色調変化に基づいてワクチンがその温度ではもはや効力がなくなる温度に暴露されたかどうか、従って廃棄すべきかどうかを医療従事者が決定することを可能とする。ラベルが色調を変える速度は、ＶＶＭの色調変化速度がワクチンの時間および温度感受性に近似するように、そのＶＶＭカテゴリーに基づいて修正される。

【0112】

ＷＨＯによって定義される通り、ＶＶＭカテゴリーは以下の通りである：ＶＶＭ３０（高い安定性）−２５℃で１９３日間安定、３７℃で３０日間安定；ＶＶＭ１４（中位の安定性）−２５℃で９０日間安定、３７℃で１４日間安定；ＶＶＭ７（普通の安定性）−２５℃で４５日間安定、３７℃で７日間安定；ＶＶＭ２（低い安定性）−３７℃で２日間安定。

【表3】

【実施例6】

【0113】

インビトロ抗原性
４価ＨＰＶワクチン試験製剤のインビトロ抗原性は、中和抗体結合アッセイ法（表面プラズモン共鳴法、Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して評価した。凍結‐融解および凍結乾燥された４価ＨＰＶ試験試料は、種々の緩衝液中のＨＰＶワクチン製剤の保存安定性を評価するために６か月にわたる期間、実施例１に記載の通り−７０℃、２〜８℃、２５℃および３７℃で保存した。抗原の生物活性分析は、長期安定性研究の各時点において実施した。Ｂｉａｃｏｒｅ分析用試料の調製は、実施例２に記載の通りであった。緩衝液‐Ｂないし緩衝液‐Ｄに懸濁されたＨＰＶ６、１１、１６および１８型のＶＬＰを含んだ全ての試験製剤は、溶解緩衝液により希釈した。試験ＨＰＶ製剤のＢｉａｃｏｒｅのデータは、凍結‐融解も凍結乾燥もされなかった同じ緩衝液中の対照のＨＰＶ製剤により正規化した。記載したＢｉａｃｏｒｅ値は、同一製剤当たりの２の測定値の平均であった。

【0114】

正規化したＢｉａｃｏｒｅのデータは、凍結‐融解プロセスを受けその後に−７０℃で６か月以上保存された緩衝液Ｃおよび緩衝液Ｄ中のＨＰＶワクチン製剤が十分に効力があり、試験した全ての４のＨＰＶ型に対する標準試料とほとんど同じＢｉａｃｏｒｅ応答を有したことを示す（ＨＰＶ１６型および１８型に対する代表的なデータについては図１０を参照されたい）。緩衝液Ｂ（緩衝液‐１４）中のＨＰＶワクチン製剤は、全ての４のＨＰＶ型に対して６か月の時点においてわずかな効力の低下を示した。データより、塩、賦形剤および／または双方の存在が、凍結‐融解および保存に関連するストレスに耐えて、ＨＰＶ型の抗原性を保持するために必要とされると結論し得る。

【0115】

−７０℃で６か月以上保存された凍結乾燥ＨＰＶ製剤のＢｉａｃｏｒｅの結果は、全てのＨＰＶ型についての抗原性が、緩衝液‐Ｃおよび緩衝液‐Ｄ中のＨＰＶ製剤と比較して、Ｔ＝０の時点を含む全ての時点において緩衝液‐Ｂ（緩衝液‐１４）に対して低下したことを示した（ＨＰＶ１６型および１８型に対する代表的なデータについては図１０を参照されたい）。このことは、緩衝液‐１４における凍結融解条件下、−７０℃で６か月保存後に観察された効力低下の増幅と見なすことができる。緩衝液‐１４は塩のみを含むので（即ち、賦形剤を含まない）、凍結乾燥プロセスを耐え得なかった（Ｔ＝０時点における効力低下）。ショ糖とマンニトールを含む試験製剤（緩衝液‐Ｃおよび緩衝液‐Ｄ）中の全てのＨＰＶ型についての抗原性は、標準試料と同じであったが、これらの緩衝液がＨＰＶ ＶＬＰの完全性を維持し得たこと、それ故に凍結乾燥プロセス後に−７０℃で６か月にわたって保存されたとき、ワクチンの抗原性を保持したことを示している。このことは、組み合わせたこれらの賦形剤の所定の試験条件下でのワクチン安定剤としての役割を極めて明瞭にする。

【0116】

凍結‐融解プロセスを受けた全ての４価ＨＰＶワクチン製剤（緩衝液‐Ｂから緩衝液‐Ｄまで）は、緩衝液‐１４を含む製剤を除いて十分に効力があり、２〜８℃で６か月にわたる保存後に試験した全ての４のＨＰＶ型に対する標準試料とほとんど同じＢｉａｃｏｒｅ応答を有した（データ未記載）。効力のわずかな低下が、全てのＨＰＶ型について６か月の時点において凍結‐融解緩衝液‐１４製剤に対し観察された。−７０℃で６か月にわたる保存後に観察されたのと同様である。従って、塩、賦形剤または双方の組み合せを含有する種々の緩衝液中のＨＰＶ抗原の安定性は、凍結‐融解プロセスおよび長期保存によって影響を受けなかった。

【0117】

２〜８℃で６か月以上保存された凍結乾燥ＨＰＶ製剤のＢｉａｃｏｒｅの結果は、緩衝液‐Ｃおよび緩衝液‐Ｄと比較して、全てのＨＰＶ型についての抗原性がＴ＝０を含む全ての時点において、緩衝液‐Ｂ（緩衝液‐１４）について低下したことを示した（データ未記載）。ショ糖およびマンニトールを欠く緩衝液‐１４組成物についての結果は、上述の−７０℃での保存後に得られた結果と類似したが、製剤が安定剤を欠くために凍結乾燥ストレスおよびその後の保存に耐え得なかったという結論を支持する。緩衝液Ｂについて得られた結果と異なり、緩衝液‐Ｃおよび緩衝液‐Ｄを含有する試験製剤中の全てのＨＰＶ型についての抗原性は、標準試料と同じであった。データは、緩衝液‐Ｃおよび緩衝液‐Ｄ中の凍結乾燥試験製剤が２〜８℃で６か月以上の期間、保存安定であったことを示しており、そのことは、緩衝液中の賦形剤であるマンニトールとショ糖の組み合せがＨＰＶ ＶＬＰの完全性を維持し得たことを証明する。この結果は、塩を含むがマンニトールまたはショ糖を含まない緩衝液１４を含む製剤が凍結乾燥ストレスに耐え得なかったことを説明する。

【0118】

凍結‐プロセスを受けその後２５℃で６か月以上保存された全ての４価ＨＰＶワクチン製剤（緩衝液‐Ｂないし緩衝液‐Ｄ）は、十分に効力があり、種々の時点において試験されたＨＰＶ６、１１および１６型に対する標準試料とほとんど同じＢｉａｃｏｒｅ応答を有した（ＨＰＶ１６型およびＨＰＶ１８型についての代表的な結果を図１１に示す）。ＨＰＶ１８の抗原性は、緩衝液‐１５および緩衝液‐１６を含む製剤において３および６か月の時点で低下した。抗原性の低下は、また緩衝液‐３および緩衝液‐４を含有する製剤中のＨＰＶ１８に対しても観察されたが、しかしその低下は、６か月の時点においては緩衝液‐１５および緩衝液‐１６を含有する製剤に対し観察されたよりもかなり小さかった。結果は、上で特定した条件下で、凍結‐融解ＨＰＶ１８型製剤中の賦形剤の存在が特定の期間の熱ストレスに耐え得なかったことを示す。

【0119】

２５℃で６か月以上保存された凍結乾燥ＨＰＶ製剤のＢｉａｃｏｒｅの結果は、緩衝液‐Ｂ（緩衝液‐１４）についての全てのＨＰＶ型についての抗原性が、緩衝液‐Ｃおよび緩衝液‐Ｄ中のＨＰＶ製剤と比較して、Ｔ＝０を含む全ての時点において低下したことを示した（ＨＰＶ１６および１８型についての代表的な結果を図１１に示す）。緩衝液‐Ｂについての抗原性の低下は、Ｔ＝０時点を過ぎると著しかったが、それは２５℃におけるＨＰＶ型の凍結乾燥後の熱的不安定性に起因し得た。緩衝液‐Ｃおよび緩衝液‐Ｄを含む製剤については、抗原性は保持され、種々の時点において全ての４のＨＰＶ型に対する標準試料とほとんど同じＢｉａｃｏｒｅ応答を有した。凍結乾燥ＨＰＶ製剤（緩衝液‐Ｃおよび緩衝液‐Ｄ）に対し観察された２５℃で６か月以上の保存安定性は、緩衝液製剤における賦形剤であるマンニトールとショ糖の組合せが熱的ストレスならびに凍結乾燥ストレスに耐え、従ってＨＰＶ ＶＬＰの完全性を維持し得たことを証明する。Ｂｉａｃｏｒｅの結果は、より高い保存温度下においてより大きな効力低下が観察されており、試験条件下での効力の低下が保存温度によって直接に影響を受けたことを示す。

【0120】

凍結‐融解プロセスを受けた全ての４価ＨＰＶワクチン製剤（緩衝液‐Ｂないし緩衝液‐Ｄ）は、３７℃で１か月の保存後にすべてのＨＰＶ型に対して効力の低下を示した（図１２）。従って結果は、凍結‐融解ＨＰＶ製剤中の賦形剤の存在が３７℃で１か月後の熱的ストレスに耐え得なかったことを示す。３７℃で３か月間保存された凍結乾燥ＨＰＶ製剤のＢｉａｃｏｒｅの結果は、全てのＨＰＶ型についての抗原性が緩衝液‐Ｂ（緩衝液‐１４）に対して、Ｔ＝０を含む全ての時点において低下したことを示した。３か月の時点において、標準試料と比較してほとんど同じＢｉａｃｏｒｅの応答が、緩衝液‐Ｃ（緩衝液‐３および緩衝液‐１５）および緩衝液‐Ｄ（緩衝液‐４）を含む試験製剤中の全てのＨＰＶ型について観察され、抗原性が保持されたことを示している。しかし３か月の時点において、緩衝液‐１６を含む製剤のＨＰＶ型に対して効力の低下が観察された。３７℃で１か月以上の凍結乾燥ＨＰＶ製剤の保存安定性は、製剤緩衝液中の賦形剤であるマンニトールとショ糖の組合せが熱的および凍結乾燥ストレスに耐え得たという結論を支持する。再度、より高い保存温度下においてより大きな効力低下が観察されており、試験条件下での効力低下は保存温度による影響を受けた。一般的に、現在の実験における反応速度は、ＶＶＭ当量（ワクチンバイアルモニター）によって定義されるならば、高い安定性の指標であるＶＶＭ３０カテゴリーに分類されるであろう。

【実施例7】

【0121】

浸透圧測定
２〜８℃で１か月間保存された凍結乾燥ＨＰＶ製剤および凍結乾燥１Ｘ ＭＡＡ製剤の浸透圧は、実施例１に記載の通り測定した。結果は、ＨＰＶおよび１Ｘ ＭＡＡ製剤の双方について、塩を含有する緩衝液（緩衝液１４、緩衝液１５および緩衝液１６）を含む製剤について浸透圧値の増加があったことを示す（データ未記載）。浸透圧に対する寄与は、主として賦形剤（マンニトールおよびショ糖）および塩（塩化ナトリウム）由来であり、ヒスチジン、ＨＰＶ抗原または１Ｘ ＭＡＡアジュバント由来ではない。塩と賦形剤の組合せが、所定のＨＰＶ４価ワクチン製剤の浸透圧を規定するうえで重要な役割を果たす。

【実施例8】

【0122】

粒度測定
静的光散乱
実施例１に記載の通り０かまたは３２０ｍＭ ＮａＣｌ濃度（緩衝液‐Ａないし緩衝液‐Ｆ）を含有する全ての１Ｘ ＭＡＡ製剤についての粒度を測定するために、静的光散乱法を用いた。瞬間凍結‐融解（Ｆ／Ｔ ＦＦ １Ｘ）かまたは凍結乾燥（ＬＹＯ ＦＦ）したこれらの１Ｘ ＭＡＡ製剤に対する粒度を、凍結‐融解も凍結乾燥もされなかった同じ緩衝液（緩衝液‐Ａないし緩衝液‐Ｆ）中の対照製剤と比較した。

【0123】

対照製剤中の１Ｘ ＭＡＡ（塩が含まれても含まれなくても）の粒径は、２５μｍ（データ未記載）のかなり大きい粒径を有した緩衝液‐Ｅ（緩衝液‐５；０ｍＭ塩化ナトリウム）を除いて、約４ないし９μｍであった。１Ｘ ＭＡＡの著しい凝集は、粒度の増大によって説明されるので、凍結‐融解条件および凍結乾燥条件の双方のそれぞれでＭＡＡ凝集を防止する目的で、塩の添加（緩衝液‐５（０ｍＭ塩化ナトリウム）を緩衝液‐１７（３２０ｍＭ塩）と比較されたい）を思いつかせる。また、ＭＡＡ凝集を防止するマンニトールおよびショ糖の賦形剤の組み合せ（緩衝液‐５（ショ糖のみ）を緩衝液‐４および緩衝液‐３（塩不存在下でのショ糖とマンニトールの組み合せ）と比較されたい）の能力も観察された。全ての試験条件下で、塩不存在下における凝集の最少量が６％マンニトールおよび４％ショ糖を含有する製剤に対して観察された。この観察結果は、ショ糖とマンニトールの存在下においてＨＰＶ抗原に対し観察された長期保存安定性の傾向と一致したが、このことはこの組合せを含む製剤の凍結‐融解および凍結乾燥ストレスに耐える能力を示す。

【0124】

動的光散乱
実施例１に記載の通り種々の温度で１か月間保存後、全ての凍結‐融解および凍結乾燥４価ＨＰＶワクチンに関してもまた、粒度を動的光散乱法を用いて測定した。同じ緩衝液（緩衝液‐Ｂないし緩衝液‐Ｄ）中の、凍結‐融解も凍結乾燥もされなかった対照のＨＰＶワクチン製剤に対してもまた粒度を測定した。粒度測定に先立って、アルミニウムアジュバントからＨＰＶ ＶＬＰ抗原を遊離するために、実施例１に記載の通りアルミニウム溶解法により全ての試料を処理した。粒度分布は、アルミニウム溶解後に溶液中に存在する全てのＨＰＶ ＶＬＰの粒度分布の平均測定値である。

【0125】

結果は、種々の温度で１か月間保存された凍結‐融解ＨＰＶ製剤に対する粒度分布が、緩衝液‐１４中で３７℃、１か月間保存されたＨＰＶ製剤に対するのを除いて、凍結‐融解も凍結乾燥もされなかった対照の製剤に匹敵したことを示す（データ未記載）。３７℃で１か月間保存したこの製剤（緩衝液‐１４）に対し大きな粒径が観察されたが、それは凍結‐融解ストレス後のＨＰＶ ＶＬＰの熱的不安定性に起因する可能性があった。このデータは、この製剤が塩以外の賦形剤の欠如による凍結‐融解ストレスに耐え得なかったという結論と一致する。種々の温度で１か月間保存された凍結乾燥ＨＰＶ試験製剤についての粒度は、２〜８℃で１か月間保存された緩衝液‐１４を含むＨＰＶ製剤を除いて、凍結‐融解も凍結乾燥もされなかった対照の製剤に匹敵した。この製剤に対して大きな粒径が観察されたが、このことは、この製剤が凍結乾燥ストレスに耐え得なかったことを示している。評価された種々のＨＰＶ製剤の中で、緩衝液‐Ｃおよび緩衝液‐Ｄを含有するＨＰＶ製剤は、賦形剤の組合せ（マンニトールとショ糖）を含むが、賦形剤であるマンニトールとショ糖の組み合せを含まなかった当該製剤（緩衝液‐Ｂ）と比較すると、ＶＬＰの粒度分布に関する限り凍結‐融解条件のストレスによる影響を受けにくかった。

【0126】

全体的に見て結果は、賦形剤のこの組合せ（マンニトールとショ糖）の存在が、塩化ナトリウムが含まれても含まれなくても、凍結‐融解および凍結乾燥プロセス条件の間、ＭＡＡに結合されたＨＰＶ ＶＬＰの完全性を保ち得たことを示す。

【実施例9】

【0127】

凍結乾燥４価ＨＰＶ製剤および１Ｘ ＭＡＡ製剤の特性
乾燥ケーキの外観
全ての凍結乾燥ケーキの外観は、凍結乾燥後（Ｔ＝０）および種々の温度で安定性研究の経過各時点において写真撮影した。ケーキの外観は、二人の分析者によって視覚化され、形態、色調および他の品質特性に基づいて、ケーキは実施例１の記載の通りに分類された。概して、全ての４価ＨＰＶ製剤ならびに１Ｘ ＭＡＡ製剤に対して乾燥白色固体ケーキが得られた（参照、図１３および図１４）。凍結乾燥ＨＰＶ製剤の各々の外観は、全ての時点および保存温度について、凍結乾燥１Ｘ ＭＡＡ製剤の外観に匹敵した。エレガントなケーキが緩衝液‐３、緩衝液‐４を含有する製剤に対し観察され、わずかに崩壊しまたは裂け目ができまたは収縮したケーキが緩衝液‐１５および緩衝液‐１６を含有する製剤に対し観察された。完全に崩壊したケーキが凍結乾燥後に緩衝液‐１４を含有する製剤に観察された。賦形剤の熱的分解に起因する色調の変化は、製剤のいずれに対しても観察されなかった。この研究の結果は、ケーキの外観が製剤の賦形剤に依存し、保存温度または保存期間に依存しなかったことを示す。マンニトールとショ糖の賦形剤の組み合せを含有した製剤についてのケーキの品質は、塩濃度の上昇にともなって低下した。

【0128】

再構成時間
凍結乾燥４価ＨＰＶワクチン製剤および１Ｘ ＭＡＡ製剤は、存在する賦形剤の量に基づいて滅菌ＷＦＩにより再構成した。ＷＦＩの量は、各製剤に対して０．５０ないし０．６０ｍｌの範囲で添加した。再構成後の最終容量は約０．６ｍｌであった。再構成時間はストップウォッチを使用して測定し、凍結乾燥ＨＰＶワクチン製剤ならびに凍結乾燥１Ｘ ＭＡＡ製剤の各々に対して、完全溶解（この場合、均一な懸濁液）に要する時間を記録した。全ての凍結乾燥ＨＰＶ製剤に対する再構成時間は、全ての時点および保存温度について、全ての凍結乾燥１Ｘ ＭＡＡ製剤に匹敵した（データ未記載）。ほとんど全ての製剤は、保存温度および保存期間にかかわらず６０秒未満の急速な再構成時間を有した。

【0129】

振盪試験
全ての凍結乾燥４価ＨＰＶワクチン製剤および１Ｘ ＭＡＡ製剤の再構成後に、ワクチン／アジュバント製剤の品質を検査するために振盪試験を実施した。凍結‐融解または凍結乾燥された試験製剤の各々に対し、ミョウバン粒子がバイアルの底に沈降する時間を測定した。結果は、塩を含有する全ての４価ＨＰＶ製剤（緩衝液‐１４、緩衝液‐１５および緩衝液‐１６）が塩を有さない製剤よりもより急速な沈降時間を有したことを示し、ミョウバン粒子が凝集したこと示している（参照、図１５）。塩の不存在下にマンニトールとショ糖を含有する全ての４価ＨＰＶ製剤（緩衝液‐３および緩衝液‐４）については、沈降時間は１５分以上であったが、ミョウバン粒子が凝集しなかったことを示している。従って、４価ＨＰＶワクチン製剤中の賦形剤の存在は、凍結融解および凍結乾燥ストレス後でさえもミョウバン粒子の凝集を防止する。保存時間および温度は、振盪試験の結果に関しいかなる顕著な影響も与えなかった。

【0130】

１Ｘ ＭＡＡ製剤に対する振盪試験の結果は、賦形剤および塩を含有した全ての試験製剤が１５分以上の長い沈降時間を有したので、凍結‐融解ストレスがいかなる所定の時点または保存温度においても沈降時間に影響を与えなかったことを示すが、一方、塩のみを含有した製剤（緩衝液‐１４）は、製剤の残りと顕著には異ならないが、わずかに急速な沈降時間を有した（データ未記載）。塩の不存在下にマンニトールとショ糖を含有する凍結乾燥１Ｘ ＭＡＡ製剤（緩衝液‐３および緩衝液‐４）については、沈降時間は１５分以上であったが、ミョウバン粒子が凝集しなかったことを示している。従って、１Ｘ ＭＡＡ中の賦形剤の存在は、凍結乾燥ストレス後のミョウバン粒子の凝集を防止した。保存時間および温度は、振盪試験の結果に関しいかなる顕著な影響も与えなかった。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】