特許 6055957 アシルカルニチン組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6055957

(24)【登録日】2016年12月9日

(45)【発行日】2016年12月27日

(54)【発明の名称】アシルカルニチン組成物

(51)【国際特許分類】

   C07C 227/44 20060101AFI20161219BHJP

   C07C 229/22 20060101ALI20161219BHJP

   G01N 27/62 20060101ALN20161219BHJP

   G01N 33/50 20060101ALN20161219BHJP

【ＦＩ】

   C07C227/44

   C07C229/22

   !G01N27/62 V

   !G01N33/50 R

   !G01N33/50 Z

【請求項の数】7

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2016-511929(P2016-511929)

(86)(22)【出願日】2015年3月31日

(86)【国際出願番号】JP2015060110

(87)【国際公開番号】WO2015152234

(87)【国際公開日】20151008

【審査請求日】2016年7月4日

(31)【優先権主張番号】特願2014-74163(P2014-74163)

(32)【優先日】2014年3月31日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2014-252820(P2014-252820)

(32)【優先日】2014年12月15日

(33)【優先権主張国】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】390037327

【氏名又は名称】積水メディカル株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000774

【氏名又は名称】特許業務法人 もえぎ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】城下 友義

(72)【発明者】

【氏名】大山 直子

(72)【発明者】

【氏名】井手野 晃

(72)【発明者】

【氏名】大原 利成

【審査官】 山本 昌広

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０３２７８５８４（ＣＮ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／１５７９４５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 中国特許出願公開第１０２５６５２５１（ＣＮ，Ａ）

【文献】 Emily H. Smith; Dietrich Matern，Acylcarnitine Analysis by Tandem Mass Spectrometry，Current Protocols in Human Genetics 17.8.1-17.8.20，２０１０年

【文献】 Aiping Liu; Marzia Pasquali，Acidified acetonitrile and methanol extractions for quantitativeanalysis of acylcarnitines in plasma by stable isotope dilutiontandem mass spectrometry，Journal of Chromatography B，２００５年，Vol.827, No.2，P.193-198

【文献】 山口清次，液体サンプル中のアシルカルニチンの安定性について，厚生労働科学研究費補助金成育疾患克服等次世代育成基盤研究事業 タンデムマス導入による新生児マススクリーニング耐性の整備と質的向上に関する研究 平成２３年度総括・分担研究報告書，厚生労働科学研究成果データベース閲覧システム，２０１２年１２月２８日，P.40-43，<URL: http://mhlw-grants.niph.go.jp/niph/search/NIDD00.do?resrchNum=201117010A>

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｃ ２２７／４４

Ｃ０７Ｃ ２２９／２２

Ｇ０１Ｎ ２７／６２

Ｇ０１Ｎ ３３／５０

ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アシルカルニチン液状組成物の保存安定化方法であって、
有機酸を含有するが水を含まない炭素数１〜５のアルコール中に少なくとも１種類以上の式１の化合物を溶解する工程を含む前記保存安定化方法。
式１：（ＣＨ_３）_３Ｎ⁺ＣＨ_２ＣＨ（ＯＲ^１）ＣＨ_２ＣＯＯ^-
ただし、式１中、Ｒ^１は水素原子、又は炭素数２〜３０の飽和もしくは不飽和の脂肪酸残基を表し、該脂肪酸残基に結合する水素原子は、酸素原子又はヒドロキシ基で置換されていてもよい。

【請求項2】

４５℃で２４時間保管したときに、質量分析計による測定値から算出されるアシルカルニチンの残存率が８０％〜１２０％である、請求項１に記載の保存安定化方法。

【請求項3】

炭素数１〜５のアルコールが、メタノール、エタノール及びイソプロパノールからなる群から選ばれる少なくとも１以上である請求項１又は２に記載の保存安定化方法。

【請求項4】

有機酸が、１価から３価のカルボン酸からなる群から選ばれる少なくとも１以上である請求項１〜３のいずれかに記載の保存安定化方法。

【請求項5】

カルボン酸が、ギ酸、酢酸、シュウ酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、酪酸及び乳酸からなる群から選ばれる少なくとも１以上である請求項４に記載の保存安定化方法。

【請求項6】

有機酸の体積濃度が、０．００５％（ｖ／ｖ）〜５％（ｖ／ｖ）である請求項１〜５のいずれかに記載の保存安定化方法。

【請求項7】

アシルカルニチンが同位体標識されている請求項１〜６のいずれかに記載の保存安定化方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アシルカルニチン組成物に関する。より詳しくは、アシルカルニチンを、長期間、安定に保存することが可能な組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

アシルカルニチンは、生体内において脂肪酸がミトコンドリア内膜へ運搬される場合に、脂肪酸とカルニチンとが結合して生成される化合物である。より詳しくは、ミトコンドリア外膜に存在するカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩの作用によりアシルＣｏＡとカルニチンからアシルカルニチンが生成される。
尚、アシルカルニチンは、その脂肪酸部分の炭素鎖長、不飽和結合の有無と数、炭素鎖に結合する水素原子の酸素原子又はヒドロキシ基への置換などにより、アセチルカルニチン、プロピオニルカルニチン、ステアロイルカルニチン、オレイルカルニチン、リノレイルカルニチン、マロニルカルニチン、３−ヒドロキシカルニチンなどに細分化されるが、本明細書中においては、それらを総称してアシルカルニチンと記述する。本明細書においては脂肪酸が結合していない遊離カルニチンについても、アシルカルニチンに含めるものとする。

【0003】

特に、医療の分野においては代謝異常の評価を行うために、血液や尿などの生体試料中のアシルカルニチンを分析することは極めて有用であり、例えば新生児を対象とした先天性代謝異常スクリーニングにおいて分析項目とされている。

【0004】

特許文献１には、質量分析計を用いて血漿中のアシルカルニチンを測定し、アシルカルニチンのプロファイルを得ることで、脂肪酸酸化障害（ＭＣＡＤ、ＶＬＣＡＤ、ＳＣＡＤ、ＭＡＤ、ＬＣＨＡＤ、及びＣＰＴＩＩ）に加え、一部の有機酸血症（プロピオン酸血症、メチルマロン酸血症、イソ吉草酸血症、１型グルタル酸血症、３−メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症、β−ケトチオラーゼ欠損症など）の診断に利用できると記載されている。

【0005】

一般的に、質量分析計を用いてアシルカルニチンを定量的に測定する場合には、標準物質としてアシルカルニチンを、内部標準物質として同位体標識されたアシルカルニチンを使用する方法が挙げられる。これら標準物質及び内部標準物質は、試薬メーカーから個別に購入するか、あるいは非特許文献１に示されるＮｅｏＢａｓｅ非誘導体化ＭＳＭＳキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）のようなキットを購入することにより入手可能である。しかしながら、これら標準物質及び内部標準物質は凍結乾燥品であり、使用前に適切な溶液を添加して完全に溶解させる工程が必要であった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特許第４８３８１２９号公報

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】「３０４０−００１０ ＮｅｏＢａｓｅ非誘導体化ＭＳＭＳキット取扱説明書（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）」

【非特許文献2】「液体サンプル中のアシルカルニチンの安定性について」平成２３年度厚生労働科学研究費補助金 （成育疾患克服等次世代育成基盤研究事業）「タンデムマス導入による新生児マススクリーニング体制の整備と質的向上に関する研究」 平成２３年度総括・分担研究報告書 山口清次ら、４０―４３頁 厚生労働省 ２０１２年

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

標準物質及び内部標準物質の溶解の工程を簡略化する一般的な方法として、いくつかのメーカーから、あらかじめ溶液に調製された試薬が市販されている。例えば和光純薬工業株式会社からは、２００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ−グルタミン溶液（×１００）、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（×１００）などのアミノ酸溶液が販売されている。

【0009】

しかしながら、非特許文献１に示されるように、アシルカルニチンの溶液状態での安定性は、２℃〜８℃保存で３０日間であり、アシルカルニチン溶液は１ヶ月を超える期間の保存安定性を有していないことが記載されている。
非特許文献２では、より詳細にアシルカルニチン溶液の安定性の検討がなされている。冷蔵（４℃）保管のｐＨ８．０緩衝液中では長鎖アシルカルニチンの分解が、常温（２１℃）保管の健常者血清中では短鎖から長鎖まで多くのアシルカルニチンの分解が認められた結果、アシルカルニチン分析に用いられる全ての検体（ろ紙血、血清、尿）について冷凍（−３０℃）保管を推奨している。
すなわち、溶液状態でのアシルカルニチンの保存安定性の問題から、アシルカルニチン溶液は市販されていない。そのため測定者から、アシルカルニチンを溶解する作業が不要で、かつ長期間の保存安定性を有する、標準物質用試薬及び内部標準用試薬として利用可能なアシルカルニチン組成物が求められていた。
以上より、本発明は溶液状態で扱い易く、長期間の保存安定性を有するアシルカルニチン組成物を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、アシルカルニチンを、有機酸を含有する有機溶媒によって溶解することで、アシルカルニチンを溶液状態で長期間、安定に保存できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

【0011】

非特許文献２には、ｐＨ６．０〜８．０の中性バッファーにおいて、ｐＨ８．０ではアシルカルニチンの加水分解が増大することが示唆されているが、酸性の水溶液中でアシルカルニチンが安定であるとの知見は得られていない。さらに、有機溶媒中でのアシルカルニチンの安定性には言及されていない。

【0012】

本発明者らは、アシルカルニチンを有機溶媒に溶解し、有機酸を添加することで、溶液中のアシルカルニチンの保存安定性を飛躍的に高めることを発見した。さらに、上記有機酸として、質量分析で汎用されるものを使用することにより、質量分析計へ影響を及ぼすことのないアシルカルニチン組成物を完成させた。

【0013】

本発明は以下の内容に関する。
＜１＞アシルカルニチン組成物であって、
有機酸を含有する有機溶媒中に少なくとも１種類以上の式１の化合物が溶解していることを特徴とするアシルカルニチン組成物。
式１：（ＣＨ_３）_３Ｎ⁺ＣＨ_２ＣＨ（ＯＲ^１）ＣＨ_２ＣＯＯ^-
ただし、式１中、Ｒ^１は水素原子、又は炭素数２〜３０の飽和もしくは不飽和の脂肪酸残基を表し、該脂肪酸残基に結合する水素原子は、酸素原子又はヒドロキシ基で置換されていてもよい。
＜２＞有機溶媒が、炭素数１〜５の有機溶媒である前記＜１＞に記載のアシルカルニチン組成物。
＜３＞有機溶媒が、炭素数１〜５のアルコール及びアセトニトリルからなる群より選ばれる少なくとも１以上である前記＜１＞または＜２＞に記載のアシルカルニチン組成物。
＜４＞炭素数１〜５のアルコールが、メタノール、エタノール及びイソプロパノールからなる群より選ばれる少なくとも１以上である前記＜３＞に記載のアシルカルニチン組成物。
＜５＞有機酸が、１価から３価のカルボン酸からなる群より選ばれる少なくとも１以上である前記＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載のアシルカルニチン組成物。
＜６＞カルボン酸が、ギ酸、酢酸、シュウ酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、酪酸及び乳酸からなる群より選ばれる少なくとも１以上である前記＜５＞に記載のアシルカルニチン組成物。
＜７＞有機酸の体積濃度が、０．００５％（ｖ／ｖ）〜５％（ｖ／ｖ）である前記＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載のアシルカルニチン組成物。
＜８＞アシルカルニチンが同位体標識されている前記＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載のアシルカルニチン組成物。
＜９＞４５℃で２４時間保管したときに、質量分析計による測定値から算出されるアシルカルニチンの残存率が８０％〜１２０％である、前記＜1＞〜＜８＞のいずれかに記載のアシルカルニチン組成物。
＜１０＞前記＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載のアシルカルニチン組成物を使用する、質量分析計によるアシルカルニチンの測定方法。
＜１１＞質量分析計による、先天性代謝異常スクリーニングの診断における前記＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載のアシルカルニチン組成物の使用。
＜１２＞前記＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載のアシルカルニチン組成物を含むキット。
＜１３＞有機酸、有機溶媒及び少なくとも１種類以上の式１のアシルカルニチン化合物を含むキット。
式１：（ＣＨ_３）_３Ｎ⁺ＣＨ_２ＣＨ（ＯＲ^１）ＣＨ_２ＣＯＯ^-
ただし、式１中、Ｒ^１は水素原子、又は炭素数２〜３０の飽和もしくは不飽和の脂肪酸残基を表し、該脂肪酸残基に結合する水素原子は、酸素原子又はヒドロキシ基で置換されていてもよい。

【発明の効果】

【0014】

本発明によれば、アシルカルニチンを溶解する作業を必要としない、長期間の保存安定性を有するアシルカルニチン組成物が提供される。本発明のアシルカルニチン組成物は、先天性代謝異常スクリーニング等の臨床検査に有用である。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】参考例１で得られた、メタノール中のアセチルカルニチン（Ｃ２）安定同位体の安定性予測のプロット

【図2】実施例１で得られた、０．１％ギ酸含有メタノール及び各種有機溶媒中におけるアセチルカルニチン（Ｃ２）安定同位体の安定性のグラフ

【図3】実施例２で得られた、１％ギ酸含有メタノール及び各種有機溶媒中におけるアセチルカルニチン（Ｃ２）安定同位体の安定性のグラフ

【図4】実施例３で得られた、メタノール及び１％ギ酸含有エタノール中におけるアシルカルニチン（Ｃ０〜Ｃ１８）安定同位体の安定性のグラフ

【図5】実施例４で得られた、１％ギ酸含有アセトニトリル及び各種有機溶媒中におけるアセチルカルニチン（Ｃ２）安定同位体の安定性のグラフ

【図6】実施例５で得られた、各濃度のギ酸含有エタノール中におけるアセチルカルニチン（Ｃ２）安定同位体の安定性のグラフ

【図7】実施例６で得られた、各濃度の酢酸含有エタノール中におけるアセチルカルニチン（Ｃ２）安定同位体の安定性のグラフ

【図8】実施例７で得られた、各濃度の乳酸含有エタノール中におけるアセチルカルニチン（Ｃ２）安定同位体の安定性のグラフ

【図9】実施例８で得られた、各濃度のシュウ酸含有エタノール中におけるアセチルカルニチン（Ｃ２）安定同位体の安定性のグラフ

【図10】実施例９で得られた、各濃度のクエン酸含有エタノール中におけるアセチルカルニチン（Ｃ２）安定同位体の安定性のグラフ

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明において、アシルカルニチンとは、式１で表される化合物群をいう。
式１：（ＣＨ_３）_３Ｎ⁺ＣＨ_２ＣＨ（ＯＲ^１）ＣＨ_２ＣＯＯ^-
（式１中、Ｒ^１は水素原子、又は炭素数２〜３０の飽和もしくは不飽和の脂肪酸残基を表し、該脂肪酸残基に結合する水素原子は、酸素原子又はヒドロキシ基で置換されていてもよい。）

【0017】

飽和又は不飽和の脂肪酸残基としては、表１に記載のものが挙げられ、これらのうち、炭素数２〜１８の脂肪酸残基が、好適に使用される。先天性代謝異常スクリーニングなど臨床での評価項目に使用される主なアシルカルニチンを表２に示す。

【0018】

【表1】

【0019】

【表2】

【0020】

本明細書において、「アシルカルニチン」とは同位体標識されたアシルカルニチンを含むものとする。本発明によれば、同位体標識されたアシルカルニチンについても同様の保存安定性を有する。例えば、安定同位体で標識されたアシルカルニチン（以下、アシルカルニチン安定同位体ともいう。）として^２Ｈ９−カルニチン、^２Ｈ３−アセチルカルニチン、^２Ｈ３−プロピオニルカルニチン、^２Ｈ３−ブチリルカルニチン、^２Ｈ９−イソ吉草酸カルニチン、^２Ｈ３−オクタノイルカルニチン、^２Ｈ９−ミリストイルカルニチン、及び^２Ｈ３−パルミトイルカルニチンなどが例示できる。同位体標識の例として重水素標識を挙げたが、放射性同位体による標識や、炭素、窒素、酸素など他の元素による標識など、重水素標識に限らない。さらには、置換する原子数、置換する位置についても、例示したアシルカルニチン安定同位体に限らない。

【0021】

本発明で使用される有機溶媒としては、生化学で汎用されるものであれば特に制限されない。炭素数の異なるアシルカルニチンの混合物を効率よく溶解する点や，取り扱いや入手のし易さから、炭素数１〜５の有機溶媒が好ましく、炭素数１〜５のアルコール及びアセトニトリルがより好ましく、メタノール、エタノール、イソプロパノールがさらに好ましい。アシルカルニチンは加水分解することから、溶媒には水を含まないことが好ましい。
なお、本発明の有機溶媒は、後述する有機酸である場合も含まれるものとする。

【0022】

上記有機溶媒に溶解されるアシルカルニチンの濃度範囲は特に限定されないが、好ましい下限としては、１μｍｏｌ／Ｌが挙げられ、好ましい上限としては、１００μｍｏｌ／Ｌが挙げられるが、７０μｍｏｌ／Ｌ、５０μｍｏｌ／Ｌ、４０μｍｏｌ／Ｌ、３５μｍｏｌ／Ｌが好ましい上限の場合もある。上記アシルカルニチン濃度が１μｍｏｌ／Ｌ未満であると、長期間保存した場合に化学的な分解が進み安定性に悪影響を及ぼす。また、上記アシルカルニチン濃度が１００μｍｏｌ／Ｌを超えると、質量分析に供する場合に、アシルカルニチンを測定に適した濃度にするために複数回の希釈が必要となり、実験操作が煩雑となる。
なお、遊離カルニチンのメタノールへの溶解の上限は約０．４ｇ／ｍＬ（約２．４８ｍｏｌ／Ｌ）であり、アルコールに易溶であることが知られている。

【0023】

本発明で使用される有機酸としては、生化学で汎用されるものであれば特に制限されない。取り扱いや入手のし易さから、１価から３価のカルボン酸が好ましく、ギ酸、酢酸、シュウ酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、酪酸、乳酸などが例示できる。質量分析計での測定に要求される揮発性の観点から、ギ酸、酢酸、シュウ酸、トリフルオロ酢酸が好ましく、腐食性の観点から、ギ酸、酢酸、シュウ酸がさらに好ましい。

【0024】

上記有機酸の濃度範囲は特に制限されないが、体積濃度で示すと、好ましい下限は０．００５％（ｖ／ｖ）であり、０．０１％（ｖ／ｖ）、０．１５％（ｖ／ｖ）、０．２％（ｖ／ｖ）、０．２５％（ｖ／ｖ）、０．３％（ｖ／ｖ）、０．３５％（ｖ／ｖ）、０．４％（ｖ／ｖ）、０．４５％（ｖ／ｖ）が好ましい下限の場合もあり、より好ましい下限は０．５％（ｖ／ｖ）である。
また、好ましい上限は５％（ｖ／ｖ）であり、４．５％（ｖ／ｖ）、４．０％（ｖ／ｖ）、３．５％（ｖ／ｖ）が好ましい上限の場合もあり、より好ましい上限は３％（ｖ／ｖ）である。
有機酸の濃度が下限より低いと、アシルカルニチン組成物の保存安定性の向上が期待できない。有機酸の濃度が上限より高いと，本発明を用いて質量分析計による測定を行う際，有機酸によって機器や測定結果へ悪影響を及ぼす可能性が否定できない。

【0025】

本発明にかかるアシルカルニチン組成物は、質量分析計を用いたアシルカルニチン測定において、標準物質、キャリブレーター、コントロール、内部標準物質などに好適に用いることができる。
本発明の供給の形態としては、アシルカルニチンと有機酸と有機溶媒とを混合したあらかじめ溶液状態にした形態が挙げられる。
また、本発明の別の供給の形態としては、それぞれを別個に用意し、使用時にすべてを混合して溶液状態にする形態、あるいは２つをあらかじめ混合して残りの１つを別個に用意し、使用時にこれらを混合して溶液状態にする形態も挙げられる。
本発明の別の供給の形態として、アシルカルニチンと有機酸との混合物、あるいは、アシルカルニチンと有機酸と有機溶媒とを混合後、有機酸を保持できる多孔性部材または賦形剤を添加し、さらに有機溶媒を除去した組成物など、後から有機溶媒を添加できる形態も取り得る。
本発明のその他の供給の形態として、凍結乾燥されたアシルカルニチンに、有機酸と有機溶媒とをそれぞれ添加する形態、あるいは、多孔性部材に含浸されたアシルカルニチンに、有機酸と有機溶媒との混合物を添加する形態を取り得る。
本発明の別の供給の形態として、アシルカルニチンと有機溶媒とを混合後、後から有機酸を添加できる形態、あるいは、あらかじめ有機溶媒と有機酸と混合後、後からアシルカルニチンへ添加できる形態も採り得る。
前記多孔性部材とは、アシルカルニチンを室温で保存した場合の安定性を損なわないことを限度として、試料抽出液に不溶性で、かつアシルカルニチンを溶液中に溶出可能でかつ乾燥状態で保持できる能力を有していれば制限なく使用することができる。
多孔性部材としては公知のものが使用でき、例えばろ紙、不織布、織布又はシート状発泡体等からなる多孔性部材が挙げられる。材質としては、公知の天然高分子及び合成高分子等が使用でき、例えば、綿、羊毛、セルロース、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリウレタン、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリエステル、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、絹、フィブロイン、リグニン、ヘミセルロース、キチン、エボナイト、ゴム、ガラス、石英及びセラミックス等が挙げられる。これらのうち、天然高分子が好ましく、さらに好ましくはセルロース及び綿であり、特に好ましくはセルロースである。

【0026】

本発明のアシルカルニチン組成物は、前記質量分析計を用いたアシルカルニチン測定により、先天性代謝異常症のスクリーニングにも使用することができる。

【0027】

本発明のアシルカルニチン組成物は、有機酸、有機溶媒及び少なくとも１種類以上のアシルカルニチン化合物を含む測定キットの形態で提供することもでき、キットには、ほかに、他の検査試薬、検体希釈液、使用説明書などを含むこともできる。他の検査試薬としては、同時に測定されることが予定されるアミノ酸、スクシニルアセトンの検査試薬が挙げられ、具体的にはこれらの内部標準液が挙げられる。

【0028】

〔参考例１〕メタノール中のアセチルカルニチン（Ｃ２）の安定性予測
まず、アシルカルニチンの中で、より不安定なアシルカルニチンを見出すため、表３に示すアシルカルニチン安定同位体について、メタノール溶液中、室温にて、１ヶ月間及び２ヶ月間保存したときの残存率を算出した。アシルカルニチン溶液は、表３に記載の濃度となるよう、アシルカルニチン安定同位体をメタノールに溶解した。アシルカルニチン安定同位体の測定は、以下の条件で実施した。保存直前（用時調製）及び所定期間保存後のアシルカルニチン溶液を測定し、下記式２より得られたピーク面積比から残存率（％）を算出した。
システム：ＬＣ−２０Ａシリーズ（島津製作所社製）及び４０００ＱＴＲＡＰ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）
＜ＬＣ条件＞
移動相：移動相Ａ ０．５％（ｖ／ｖ）ギ酸水溶液
移動相Ｂ ５００ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム水溶液：５００ｍｍｏｌ／Ｌ
水酸化アンモニウム（９：１）／メタノール＝１／９
分析時間：７０分
溶出法：以下のグラジエント条件により溶離液Ｂの混合比率を直線的に増減させた。
０分（溶離液Ｂ ０％）→５分（溶離液Ｂ ０％）
５．１分（溶離液Ｂ ０％）→４０分（溶離液Ｂ １００％）
４０分（溶離液Ｂ １００％）→５５分（溶離液Ｂ １００％）
５５分（溶離液Ｂ １００％）→５５．１分（溶離液Ｂ ０％）
５５．１分（溶離液Ｂ ０％）→７０分（溶離液Ｂ ０％）
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＬＣカラム：Ｓｃｈｅｒｚｏ ＳＳ−Ｃ１８、３μｍ、３．０×１５０ｍｍ（Ｉｍｔａｃｔ社製）
カラム温度：５０℃
試料注入量：５μＬ
＜ＭＳ条件＞
Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍｏｄｅ：ＥＳＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）
Ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ：Ｔｕｒｂｏ ＩｏｎＳｐｒａｙ
Ｓｃａｎ ｔｙｐｅ：ＭＲＭ
Ｐｏｌａｒｉｔｙ：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
Ｑ１／Ｑ３は表３に記載した。
式２：

【0029】

【表3】

【0030】

アシルカルニチンの安定性を予測するため、表３の結果に基づき、最も残存率の低下の見られたアセチルカルニチン（Ｃ２）を指標とすることとした。表３の示す濃度のアセチルカルニチン溶液を、過酷条件を含めた４温度（４５℃、２２℃、４℃、及び−２０℃）において保存する安定性試験を実施し、−２０℃及び４℃における安定期間の予測を行った。尚、評価に供したサンプルに関して，該予測方法では、４５℃で２４時間保存すると４℃保存での約３ヶ月間、−２０℃保存での約５年間に相当することが算出された。
＜予測方法＞ 溶媒：メタノール
評価温度：４５℃、２２℃、４℃、−２０℃
予測方法：アレニウスモデル
得られた結果を図１に示す。

【0031】

〔実施例１〕０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸含有メタノール及び各種有機溶媒中におけるアセチルカルニチン（Ｃ２）安定同位体の安定性
参考例１にて、選択したアシルカルニチンの中で最も残存率の低下が認められたアセチルカルニチン（Ｃ２）について、溶解溶媒の検討を実施した。
＜試験条件＞
溶媒：メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸含有メタノール、５０％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液
保存温度：４５℃
保存時間：２４時間
測定及び残存率の算出は、参考例１と同様に実施した。得られた結果を図２に示す。

【0032】

〔実施例２〕１％ギ酸（ｖ／ｖ）含有メタノール及び各種有機溶媒中におけるアセチルカルニチン（Ｃ２）安定同位体の安定性
実施例１と同様に、アセチルカルニチン（Ｃ２）を用いて、有機酸添加の効果を確認するための検討を実施した。
＜試験条件＞
溶媒：メタノール、１％（ｖ／ｖ）ギ酸含有メタノール、１％（ｖ／ｖ）ギ酸含有エタノール、１％（ｖ／ｖ）ギ酸含有イソプロパノール、ＤＭＦ
保存温度：４５℃
保存時間：２４時間
測定及び残存率の算出は、参考例１と同様に実施した。得られた結果を図３に示す。

【0033】

〔実施例３〕１％（ｖ／ｖ）ギ酸含有エタノール及びメタノール中におけるアシルカルニチン（Ｃ０〜Ｃ１８）安定同位体の安定性
実施例２で検討した１％（ｖ／ｖ）ギ酸含有エタノール及びメタノールに、表３に示すアシルカルニチン（略号：Ｃ０、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ５ＯＨ、Ｃ５ＤＣ、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８）を溶解し、アセチルカルニチン（Ｃ２）以外のアシルカルニチンについても保存安定性を検討した。

【0034】

アシルカルニチンを含む１％（ｖ／ｖ）ギ酸含有エタノール溶液の調製は以下のように行った。
各アシルカルニチン（略号：Ｃ０、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ５ＯＨ、Ｃ５ＤＣ、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８）をそれぞれ表３に示す濃度の１５倍濃い濃度となるように１％（ｖ／ｖ）ギ酸含有エタノールに溶解して、アシルカルニチンを含む１％（ｖ／ｖ）ギ酸含有エタノール溶液（１２種類）を調製した。次に、前記溶液を１００μＬずつ採取、混合し、さらに１％（ｖ／ｖ）ギ酸含有エタノール３００μＬを添加した。前記混合液をよく撹拌し、表３に示す濃度の各アシルカルニチンを含む１％（ｖ／ｖ）ギ酸含有エタノール溶液１５００μＬを調製した。
アシルカルニチンを含むメタノール溶液についても、同様に各アシルカルニチンを表３に示す濃度の１５倍濃い濃度となるようにメタノールに溶解し、前記溶液（１２種類）を１００μＬずつ採取、混合し、さらにメタノール３００μＬを添加した。前記混合液をよく撹拌し、表３に示す濃度の各アシルカルニチンを含むメタノール溶液１５００μＬを調製した。
＜試験条件＞
溶媒：メタノール、１％（ｖ／ｖ）ギ酸含有エタノール
保存温度：４５℃
保存時間：２４時間
測定及び残存率の算出は、参考例１と同様に実施した。得られた結果を図４に示す。

【0035】

実施例１、２、及び３を通じての結果と考察
実施例１（図２）の結果は以下のとおりであった。アセチルカルニチン（Ｃ２）の保存安定性は、５０％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液で最も低く残存率５．４％であり、次いで有機溶媒（メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル）で５６．７％〜６５．９％と残存率の向上が認められ、０．１％ギ酸含有メタノールで８４．８％と大幅な残存率の向上が確認された。

【0036】

実施例２（図３）では、実施例１において０．１％であったギ酸の含有量を１％に増加させた。また、メタノール以外にエタノール、イソプロパノールについてもギ酸を添加した。その結果、アセチルカルニチンの残存率は、０．１％ギ酸含有メタノールで８４．８％（実施例１）、１％（ｖ／ｖ）ギ酸含有メタノールで９７．０％と、ギ酸含有量の増加に伴い残存率も増加した。また、１％ギ酸含有エタノール及び１％（ｖ／ｖ）ギ酸含有イソプロパノールでの残存率はそれぞれ９７．２％、９６．９％と、１％（ｖ／ｖ）ギ酸含有メタノールと同程度の残存率を示した。

【0037】

実施例３（図４）では、１％（ｖ／ｖ）ギ酸含有エタノールに、アシルカルニチン（略号：Ｃ０、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ５ＯＨ、Ｃ５ＤＣ、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６，Ｃ１８）を溶解し、アシルカルニチンの脂肪酸の鎖長による安定性の差を検討した。結果として残存率は９４．８％〜１０３．３％であり、短鎖、中鎖、長鎖の脂肪酸の鎖長差による残存率の違いは認められなかった。

【0038】

これら図２、図３、及び図４の結果より、アシルカルニチンの溶液中での保存安定性は、水溶液よりも有機溶媒中に保存する方が安定であり、また、有機溶媒単体に溶解するよりも、有機酸を含有する有機溶媒中のほうが安定であることが示された。また、有機酸の含有量が増加するに従い、アシルカルニチンの保存安定性も向上することが示唆された。アシルカルニチンの有機酸含有有機溶媒中での保存安定性は、アシルカルニチンの脂肪酸の鎖長によって、大きな差は認められなかった。

【0039】

〔実施例４〕１％（ｖ／ｖ）ギ酸含有アセトニトリル中におけるアセチルカルニチン（Ｃ２）安定同位体の保存安定性
実施例１と同様に、アセチルカルニチン（Ｃ２）について、有機溶媒としてアセトニトリルを用いて有機酸添加による保存安定性効果を確認した。比較のために、アセトニトリル、メタノール及びエタノール単独についても試験をして保存安定性効果を確認した。
＜試験条件＞
溶媒：メタノール、エタノール、アセトニトリル、１％（ｖ／ｖ）ギ酸含有アセトニトリル
保存温度：６０℃
保存時間：２４時間
測定及び残存率の算出は、参考例１と同様に実施した。得られた結果を図５に示す。

【0040】

〔実施例５〕ギ酸含有エタノール中におけるアセチルカルニチン（Ｃ２）安定同位体の保存安定性
実施例１と同様に、アセチルカルニチン（Ｃ２）について、各濃度のギ酸をエタノールに添加した溶媒における保存安定性効果を確認した。
＜試験条件＞
溶媒：０．００５％、０．１％、１％、５％（ｖ／ｖ）の各濃度のギ酸含有エタノール 保存温度：６０℃
保存時間：２４時間
測定及び残存率の算出は、参考例１と同様に実施した。得られた結果を図６に示す。

【0041】

〔実施例６〜９〕有機酸含有エタノール中におけるアセチルカルニチン（Ｃ２）安定同位体の保存安定性
有機酸として酢酸、乳酸、シュウ酸及びクエン酸を用いた以外は、実施例５と同様に試験をして、保存安定性効果を確認した。得られた結果を図７〜１０に示す。

【0042】

実施例４の結果と考察
実施例４の結果（図５）より、アセチルカルニチン（Ｃ２）の保存安定性は、有機溶媒単独の溶媒中では低く、アセトニトリル中では２６．２％であったが、これに有機酸を添加した１％（ｖ／ｖ）ギ酸含有アセトニトリル中では、６０℃、２４時間という過酷な条件下でも残存率１００％であり、有機酸添加による残存率の大幅な向上が確認された。
以上から、有機溶媒としてアセトニトリルを用いた場合にも有機酸添加の効果が確認できた。

【0043】

実施例５〜９を通じての結果と考察
実施例５〜９の結果（図６〜１０）より、アセチルカルニチン（Ｃ２）の保存安定性は、有機酸としてギ酸、酢酸、乳酸、シュウ酸、クエン酸を用いて、これを有機溶媒に添加した場合でも高く、各種の有機酸添加による効果を確認することができた。また、添加濃度については、０．００５％〜５％という広い範囲で有機酸添加による保存安定性の向上が確認された。

【産業上の利用可能性】

【0044】

本発明にかかるアシルカルニチン組成物は、質量分析計を用いたアシルカルニチン測定において、標準物質、キャリブレーター、コントロール、内部標準物質などに好適に用いることができ、産業上の利用可能性は大である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】