特許 6057297 核酸構築物、核酸−蛋白質複合体、及びその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6057297

(24)【登録日】2016年12月16日

(45)【発行日】2017年1月11日

(54)【発明の名称】核酸構築物、核酸−蛋白質複合体、及びその利用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20161226BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20161226BHJP

   C12N 15/115 20100101ALI20161226BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20161226BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C07K19/00

   C12N15/00 H

   C12Q1/68 Z

【請求項の数】18

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2013-516421(P2013-516421)

(86)(22)【出願日】2012年5月23日

(86)【国際出願番号】JP2012063221

(87)【国際公開番号】WO2012161227

(87)【国際公開日】20121129

【審査請求日】2015年5月19日

(31)【優先権主張番号】特願2011-115166(P2011-115166)

(32)【優先日】2011年5月23日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度独立行政法人科学技術振興機構、「創発的機能制御性ペプチドアプタマーの創成」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】503359821

【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100100549

【弁理士】

【氏名又は名称】川口 嘉之

(74)【代理人】

【識別番号】100126505

【弁理士】

【氏名又は名称】佐貫 伸一

(72)【発明者】

【氏名】和田 章

(72)【発明者】

【氏名】長田 裕之

【審査官】 福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００７−０２９０６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, 2008, vol.101, no.5, pp.1102 - 1107

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

５’−非翻訳領域およびコード領域を含む核酸構築物であって、前記コード領域が提示対象ポリペプチドをコードする配列、第一の核酸結合性ポリペプチドをコードする配列および第二の核酸結合性ポリペプチドをコードする配列を含み、前記５’−非翻訳領域が第一の核酸結合性ポリペプチドに結合可能な第一の配列と、第二の核酸結合性ポリペプチドに結合可能な第二の配列とを含み、翻訳系に導入されたときに、前記核酸構築物のコード領域から翻訳される融合蛋白質が、前記第一の核酸結合性ポリペプチドと前記第一の配列との結合および前記第二の核酸結合性ポリペプチドと前記第二の配列との結合によって、前記核酸構築物に対応するRNAと複合体を形成する、核酸構築物。

【請求項2】

第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドがboxB-associating peptide （Bap）およびCv-associating peptide （Cvap）ダイマーであり、第一の配列および第二の配列がboxB配列およびCv配列である、請求項１に記載の核酸構築物。

【請求項3】

第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドがBapおよびhuman
immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) regulator of viral expression (Rev)のaptamer I (apI)配列またはaptamer II (apII)配列への結合ドメインであり、第一の配列および第二の配列がboxB配列およびapI配列またはapII配列である、請求項１に記載の核酸構築物。

【請求項4】

第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドがBapおよびbovine immunodeficiency virus (BIV) trans-activator protein (Tat)のBIV trans-activation response element (TAR)配列への結合ドメインであり、第一の配列および第二の配列がboxB配列およびBIV TAR配列である、請求項１に記載の核酸構築物。

【請求項5】

前記５’−非翻訳領域がboxB配列、Cv配列およびリボソーム結合配列を含み、前記コード領域が、読み枠を合わせて連結された、提示対象ポリペプチドコード配列、Bapコード配列、Cvapダイマーコード配列およびスペーサーコード配列を含む、請求項２に記載の核酸構築物。

【請求項6】

前記５’−非翻訳領域がboxB配列、apI配列またはapII配列、およびリボソーム結合配
列を含み、前記コード領域が、読み枠を合わせて連結された、提示対象ポリペプチドコード配列、Bapコード配列、Revコード配列およびスペーサーコード配列を含む、請求項３に記載の核酸構築物。

【請求項7】

前記５’−非翻訳領域がboxB配列、BIV TAR配列およびリボソーム結合配列を含み、前記コード領域が、読み枠を合わせて連結された、提示対象ポリペプチドコード配列、Bapコード配列、BIV Tatコード配列およびスペーサーコード配列を含む、請求項４に記載の核酸構築物。

【請求項8】

前記５’−非翻訳領域がリボソーム結合配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項9】

提示対象ポリペプチドコード配列がランダムポリペプチドをコードする配列である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項10】

５’−非翻訳領域およびコード領域を含む核酸構築物と、
前記コード領域から翻訳される融合蛋白質とを含む核酸−蛋白質複合体であって、
前記コード領域が、提示対象ポリペプチドをコードする配列、第一の核酸結合性ポリペプチドをコードする配列及び第二の核酸結合性ポリペプチドをコードする配列を含み、
前記５’−非翻訳領域が、第一の核酸結合性ポリペプチドに結合可能な第一の配列と、第二の核酸結合性ポリペプチドに結合可能な第二の配列とを含み、前記第一の核酸結合性ポリペプチドと前記第一の配列との結合および前記第二の核酸結合性ポリペプチドと前記第二の配列との結合によって形成される、
核酸−蛋白質複合体。

【請求項11】

リボソームを含まない、請求項１０に記載の核酸−蛋白質複合体。

【請求項12】

第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドがBapおよびCvapダイマーであり、第一の配列および第二の配列がboxB配列およびCv配列である、請求項１０または１１に記載の核酸−蛋白質複合体。

【請求項13】

提示対象ポリペプチドコード配列がランダムポリペプチドをコードする配列である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の核酸−蛋白質複合体。

【請求項14】

請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸構築物を翻訳系に導入して前記コード領域にコードされる融合蛋白質を発現させ、第一の核酸結合性ポリペプチドと前記第一の配列との結合および前記第二の核酸結合性ポリペプチドと前記第二の配列との結合を介して該融合蛋白質と核酸構築物に対応するRNAとの複合体を形成させることにより、提示対象ポリペプチドを核酸構築物に対応するRNA上に提示させることを特徴とする、ポリペプチドを核酸上に提示させる方法。

【請求項15】

融合蛋白質と核酸構築物に対応するRNAとの複合体を形成させた後、リボソームを核酸構築物から解離させる工程を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

標的物質に結合するポリペプチド配列を選択する方法であって、次の工程（１）〜（３）を繰り返すことを特徴とする方法。
（１）請求項９に記載の核酸構築物からランダムポリペプチドと第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドとの融合蛋白質を発現させ、核酸構築物に対応するRNA上にランダムポリペプチドライブラリーを提示する工程；
（２）標的物質に前記ライブラリーを接触させる工程；および
（３）標的物質に結合するポリペプチド配列を含む融合蛋白質を選択し、選択された融合蛋白質をコードする核酸配列を増幅する工程。

【請求項17】

前記工程（１）と（２）の間に、リボソームを核酸構築物から解離させる工程を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、ポリペプチドを核酸上に提示させるためのキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ポリペプチドをそれをコードする核酸配列と対応付けて発現させることのできる核酸構築物、それを含むキット並びにそれを用いたポリペプチドの核酸上での提示方法および標的物質に結合するポリペプチド配列の選択方法に関する。

【背景技術】

【0002】

「ペプチドアプタマー」とは、ある標的分子に対して特異的に結合する人工ペプチドの総称である。現在、「抗体」と類似の結合機能を発現する小さなペプチドアプタマーは、化学・生物科学研究における分子検出用プローブや生体機能の阻害剤などとして注目されている。さらに、医療分野においては、抗体医薬に替わる次世代の分子標的薬としても期待されている。

【0003】

近年、ペプチドアプタマーを創出する手法としては、ファージディスプレイ法が主に利用されてきた。この手法では、ファージの外殻蛋白質の一部に提示した約10⁹種類のペプチドライブラリーから、標的分子に対して特異的に結合するペプチドアプタマーを選択する戦略をとる。しかし、解決されていない問題点も数多く残されている。例えば、（１）ペプチドアプタマーの選択過程において、大腸菌とファージの生活環を利用するため、それらの生命活動に悪影響を与えるペプチドは自動的に排除されてしまう。それゆえ、目的の機能を有するペプチドアプタマーが全く得られない現象が頻繁に起こる。また、（２）細胞内では、20種類のアミノ酸をコードする各コドンの出現頻度には偏りがあり、理論的に設計・合成したペプチドライブラリーと実際に利用しているライブラリーの多様性には大きなギャップが生じていることが懸念されている。さらに、（３）この手法で選択したペプチドアプタマーは、ファージの外殻蛋白質から切り離した状態では、標的分子に対する結合性が低下もしくは消失してしまう現象が多々起こる。なぜなら、ペプチドアプタマーとファージ由来の蛋白質が融合した状態にあることが、標的分子に対する結合性の発現と維持に必要不可欠であるからであり、ファージディスプレイ法を利用する場合には、避けては通れぬ大きな問題となっている。それゆえ、上記の問題を回避するためには、生細胞を利用するのではなく、細胞内の翻訳反応だけを利用して、ペプチドライブラリーもしくはプロテインライブラリーを構築する必要性がある。そして、そのライブラリーの中から、目的の標的分子に対して特異的に結合性するペプチドアプタマーを効率的に選択する「試験管内ディスプレイ法」の開発が必要不可欠である。

【0004】

そのような試験管内ディスプレイ法として、リボソームディスプレイ法（特許文献１−４、非特許文献１）がある。リボソームディスプレイ法は、mRNAディスプレイ法に比べて、研究の用途に応じて様々な大きさのペプチド(プロテイン)ライブラリーを設計・利用できること、さらに、それらライブラリーの中から目的のペプチドアプタマーを迅速かつ簡便なプロセスで選択・同定することができるため、将来の受託化・キット化、ロボットによる自動化を視野に入れて研究を展開できる。しかし、ペプチドアプタマーの選択プロセスで利用するペプチド-リボソーム-mRNA複合体は極めて不安定であるため、目的とするペプチドアプタマーを同定することができないこともしばしば起こる。それゆえ、この原理・条件・技術を自在に扱える研究者の数は世界的に見ても極めて少ないのが現状である。

【0005】

ペプチド-リボソーム-mRNA複合体の安定性を増加させるため、非特許文献２ではmRNAの５’−非翻訳領域にCv配列を組み込み、発現させるポリペプチドにCvapダイマーを含ませてリボソームディスプレイを行う技術が開示されている（非特許文献２）。しかし、リボソームディスプレイの効率を上げるためにさらなる改善が求められていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特許第3127158号公報

【特許文献2】特表2001-521395号公報

【特許文献3】特表2002-500514号公報

【特許文献4】国際公開第01/75097号パンフレット

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Proc Natl Acad Sci U S A, vol.94, p.4937-4942, 1997

【非特許文献2】Biotechnologyand Bioengineering vol. 101, No. 5, December 1, 2008

【発明の概要】

【0008】

本発明の課題は、ポリペプチドとそれをコードする配列を含む核酸との複合体を安定に効率よく形成させ、それにより、ポリペプチドとそれをコードする配列との対応付けや標的物質に結合するポリペプチドのスクリーニングを効率よく行うことのできる技術を提供することである。

【0009】

そこで、これら問題を解決するため鋭意検討を行った結果、本発明者は、mRNAの5' 端に導入した２つの小さなRNAモチーフに特異的に結合するペプチドおよび蛋白質を導入したテンプレートを新たに構築し、試験管内の翻訳反応と同時に、それらが親和的に分子内会合することで複合体を安定化させることに成功した。さらに、その複合体からリボソームを解離させた新たな複合体を合成し、それを利用したペプチド選択実験を行うこと（安定架橋型リボソームディスプレイ法）にも成功し、これらの成功に基づいて本発明を完成させた。

【0010】

すなわち、本発明は以下を提供する。
[１] ５’−非翻訳領域およびコード領域を含む核酸構築物であって、前記コード領域が提示対象ポリペプチドをコードする配列、第一の核酸結合性ポリペプチドをコードする配列および第二の核酸結合性ポリペプチドをコードする配列を含み、前記５’−非翻訳領域が第一の核酸結合性ポリペプチドに結合可能な第一の配列と、第二の核酸結合性ポリペプチドに結合可能な第二の配列とを含み、翻訳系に導入されたときに、前記核酸構築物のコード領域から翻訳される融合蛋白質が、前記第一の核酸結合性ポリペプチドと前記第一の配列との結合および前記第二の核酸結合性ポリペプチドと前記第二の配列との結合によって、前記核酸構築物に対応するRNAと複合体を形成する、核酸構築物。
[２]第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドがboxB-associating peptide （Bap）およびCv-associating peptide （Cvap）ダイマーであり、第一の配列および第二の配列がboxB配列およびCv配列である、[１]に記載の核酸構築物。
[３]第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドがBapおよびRevであり、第一の配列および第二の配列がboxB配列およびapI配列またはapII配列である、[１]に記載の核酸構築物。
[４]第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドがBapおよびBIV Tatであり、第一の配列および第二の配列がboxB配列およびBIV TAR配列である、[１]に記載の核酸構築物。
[５]前記５’−非翻訳領域がboxB配列、Cv配列およびリボソーム結合配列を含み、前記コード領域が、読み枠を合わせて連結された、提示対象ポリペプチドコード配列、Bapコード配列、Cvapダイマーコード配列およびスペーサーコード配列を含む、[２]に記載の核酸構築物。
[６]前記５’−非翻訳領域がboxB配列、apI配列またはapII配列、およびリボソーム結合配列を含み、前記コード領域が、読み枠を合わせて連結された、提示対象ポリペプチドコード配列、Bapコード配列、Revコード配列およびスペーサーコード配列を含む、[３]に記載の核酸構築物。
[７]前記５’−非翻訳領域がboxB配列、BIV TAR配列およびリボソーム結合配列を含み、前記コード領域が、読み枠を合わせて連結された、提示対象ポリペプチドコード配列、Bapコード配列、BIV Tatコード配列およびスペーサーコード配列を含む、[４]に記載の核酸構築物。
[８]前記５’−非翻訳領域がリボソーム結合配列を含む、[１]〜[４]のいずれかに記載の核酸構築物。
[９]提示対象ポリペプチドコード配列がランダムポリペプチドをコードする配列である、[１]〜[８]のいずれかに記載の核酸構築物。
[１０]５’−非翻訳領域およびコード領域を含む核酸構築物と、
前記コード領域から翻訳される融合蛋白質とを含む核酸−蛋白質複合体であって、前記コード領域が、提示対象ポリペプチドをコードする配列、第一の核酸結合性ポリペプチドをコードする配列及び第二の核酸結合性ポリペプチドをコードする配列を含み、
前記５’−非翻訳領域が、第一の核酸結合性ポリペプチドに結合可能な第一の配列と、第二の核酸結合性ポリペプチドに結合可能な第二の配列とを含み、
前記第一の核酸結合性ポリペプチドと前記第一の配列との結合および前記第二の核酸結合性ポリペプチドと前記第二の配列との結合によって形成される、
核酸−蛋白質複合体。
[１１] リボソームを含まない、[１０]に記載の核酸−蛋白質複合体。
[１２]第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドがBapおよびCvapダイマーであり、第一の配列および第二の配列がboxB配列およびCv配列である、[１０]または[１１]に記載の核酸−蛋白質複合体。
[１３]提示対象ポリペプチドコード配列がランダムポリペプチドをコードする配列である、[１０]〜[１２]のいずれかに記載の核酸−蛋白質複合体。
[１４] [１]〜[９]のいずれかに記載の核酸構築物を翻訳系に導入して前記コード領域にコードされる融合蛋白質を発現させ、第一の核酸結合性ポリペプチドと前記第一の配列との結合および前記第二の核酸結合性ポリペプチドと前記第二の配列との結合を介して該融合蛋白質と核酸構築物に対応するRNAとの複合体を形成させることにより、提示対象ポリペプチドを核酸構築物上に提示させることを特徴とする、ポリペプチドを核酸上に提示させる方法。
[１５]融合蛋白質と核酸構築物に対応するRNAとの複合体を形成させた後、リボソームを核酸構築物から解離させる工程を含む、[１４]に記載の方法。
[１６]標的物質に結合するポリペプチド配列を選択する方法であって、次の工程（１）〜（３）を繰り返すことを特徴とする方法。
（１）[９]に記載の核酸構築物からランダムポリペプチドと第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドとの融合蛋白質を発現させ、核酸構築物に対応するRNA上にランダムポリペプチドライブラリーを提示する工程；
（２）標的物質に前記ライブラリーを接触させる工程；および
（３）標的物質に結合するポリペプチド配列を含む融合蛋白質を選択し、選択された融合蛋白質をコードする核酸配列を増幅する工程。
[１７]前記工程（１）と（２）の間に、リボソームを核酸構築物から解離させる工程を含む、[１６]に記載の方法。
[１８] [１]〜[９]のいずれかに記載の核酸構築物を含む、ポリペプチドを核酸上に提示させるためのキット。

【0011】

本発明の方法によれば、ポリペプチドとそれをコードする配列を含む核酸との複合体を安定に効率よく形成させ、それにより、ポリペプチドとそれをコードする配列との対応付けや標的物質に結合するポリペプチドのスクリーニングを効率よく行うことができる。
また、本発明の方法によれば、ペプチド-リボソーム-RNA複合体形成後にリボソームを除去しても、ポリペプチドとそれをコードする配列を含む核酸との複合体が維持されるため、リボソームディスプレイ法のもう一つの問題であった「複合体のリボソームと標的分子との立体障害」を完全に解消することができる。これにより、リボソームへの非特異的結合が除けるとともに、これまでに選択できなかったより強力な標的結合性を有するペプチドアプタマーの選択が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】従来のリボソームディスプレイ法に利用する複合体(1)と安定架橋型リボソームディスプレイ法に利用する新規複合体(2)の模式図。Psはスペーサー配列を示す。(3)は複合体(2)を用いて発現させたFLAGペプチドが抗FLAG抗体により選択され、それをコードする配列が特異的に増幅できたことを示す電気泳動写真である。

【図2】実施例２の（Ａ）DNAテンプレート1-S、（Ｂ）DNAテンプレート2-S、（Ｃ）DNAテンプレート3-S、（Ｄ）DNAテンプレート4-SからmRNAを転写し、翻訳を行ってペプチド-リボソーム-mRNA複合体を形成させた後にリボソームを解離させたときのペプチド-mRNA複合体の模式図。

【図3】安定架橋型リボソームディスプレイ法及び安定架橋型ディスプレイ法を利用してFLAGペプチド選択実験を行うための操作スキームを示す図。

【図4】安定架橋型リボソームディスプレイ法及び安定架橋型ディスプレイ法に利用する各複合体を合成するためのプラスミドDNAとそれを基にして調製した各種DNAテンプレートの配列と説明。

【図5】安定架橋型ディスプレイ法に利用する各複合体を形成させるための各蛋白質（実施例２の配列番号１０，１２，１４，１６）が試験管内で発現するかどうかをWestern blottingで確認した図(写真)。

【図6】図２の各複合体を利用して、FLAGペプチド選択実験を行った結果を示す図（写真）(A)18サイクル、(B)２１サイクル。

【図7】図４のプラスミドIIに様々な大きさのポリペプチドや蛋白質を導入し、図４の5-Xのテンプレートとして調製した後、それら蛋白質の試験管内での発現をWestern blottingにより確認した結果を示す図（写真）。

【図8】RNAモチーフ-ペプチド架橋構造体。

【図9】RNAモチーフ-ペプチド架橋構造体の形成を示す電気泳動写真（レーン１：TRM4のみ、レーン２：TRM4＋TP3（0.25eq.）、レーン３：TRM4＋TP3（0.5eq.）、レーン４：TRM4＋TP3（1eq.）、レーン５：TRM4＋TP4（0.25eq.）、レーン６：TRM4＋TP4（0.5eq.）、レーン７：TRM4＋TP4（1eq.））。

【発明を実施するための形態】

【0013】

＜核酸構築物＞
本発明の核酸構築物は５’−非翻訳領域およびコード領域を含み、コード領域は提示対象ポリペプチドをコードする配列、第一の核酸結合性ポリペプチドをコードする配列および第二の核酸結合性ポリペプチドをコードする配列を含み、５’−非翻訳領域は第一の核酸結合性ポリペプチドに結合可能な第一の配列と、第二の核酸結合性ポリペプチドに結合可能な第二の配列とを含む。
そして、本発明の核酸構築物は、翻訳系に導入されたときに、前記コード領域から翻訳される融合蛋白質が、該融合蛋白質に含まれる第一の核酸結合性ポリペプチドと第二の核酸結合性ポリペプチドがそれぞれ５’−非翻訳領域の第一の配列および第二の配列に結合することによって、核酸構築物に対応するRNAと複合体を形成する。

【0014】

ここで、第一の核酸結合性ポリペプチドと第一の配列の組み合わせおよび第二の核酸結合性ポリペプチドと第二の配列の組み合わせとしては、安定な核酸-ポリペプチド結合を形成できる組み合わせであればよく、公知の核酸配列-核酸結合性ポリペプチドを使用することができ、具体的には、boxB-associating peptide （Bap）とboxB配列、Cv-associating peptide （Cvap）とCv配列などが例示される。この中ではBapとboxB配列、CvapとCv配列が好ましい。第一の核酸結合性ポリペプチドと第一の配列の組み合わせおよび第二の核酸結合性ポリペプチドと第二の配列の組み合わせは同じ組み合わせでもよいが、異なる組み合わせの方が好ましい。

【0015】

ここで、boxB配列とはλファージのboxB配列のことであり（Lazinski, D., Grzadzielska, E., and Das, A. Cell 1989, 59, 207-218.; Legault, P., Li, J., Mogridge, J., Kay, L.E., and Greenblatt, J. Cell 1998,93, 289-299.）、本発明の核酸構築物に含まれるboxB配列としては、配列番号５の塩基番号２０〜３５で示される配列（RNAの場合はTをUに読み換える：配列番号３８）が挙げられる。ただし、Bapが結合することができる限り、この配列において１〜数個（例えば、２，３個）の塩基が置換、欠失または付加されてもよい。

【0016】

Cv配列とはC-variant RNAのことであり（Nucleic Acids Research Supplement No. 1 99-100）、本発明の核酸構築物に含まれるCv配列としては、配列番号５の塩基番号４１〜５９で示される配列（RNAの場合はTをUに読み換える）が挙げられる。ただし、Cvapが結合することができる限り、この配列において１〜数個（例えば、２，３個）の塩基が置換、欠失または付加されてもよい。

【0017】

５’−非翻訳領域においては、第一の配列と第二の配列の順番はどちらが５’側でもよく、これらの一方または両方が複数存在してもよい。
第一の配列と第二の配列の間は３〜１５塩基であることが蛋白質-RNA複合体の安定化の面から好ましい。
そして、５’−非翻訳領域においては、第一の配列と第二の配列の後にリボソーム結合配列（RBS）が存在することが好ましい。その場合、第一の配列と第二の配列のうち３’側に存在する配列とリボソーム結合配列との間隔は３０〜４０塩基であることがリボソームの結合しやすさの面から好ましい。
リボソーム結合配列としては、Shine-Dalgarno（SD）配列が挙げられ、例えば、配列番号５の塩基番号９２〜９７の配列が例示される。

【0018】

コード領域に含まれるBapコード配列とは、Bapをコードする配列のことであり（Legault, P., Li, J., Mogridge, J., Kay, L.E., and Greenblatt, J. Cell 1998,93, 289-299.; Austin, R. J., Xia, T., Ren, J., Takahashi, T. T., and Roberts, R.W. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 10966-10967）、その配列としては、配列番号６のアミノ酸番号２３〜４５（配列番号３３）をコードする配列が例示され、より具体的には、配列番号５の塩基番号１７２〜２４０で示される配列が挙げられる。ただし、前記boxB配列に結合することができる限り、配列番号３３のアミノ酸配列において１〜数個（例えば、２，３個）のアミノ酸が置換、欠失または付加されてもよい。

【0019】

コード領域に含まれるCvapダイマーコード配列とは、Cvapをコードする配列（Rowsell,S., Stonehouse, N. J., Convery, M. A., Adams, C. J., Ellington, A. D., Hirao, I., Peabody, D. S., Stockley, P. G., and Phillips, SE. Nat. Struct. Biol. 1998, 5, 970-975.; Wada, A., Sawata, S. Y., and Ito, Y. Biotechnol. Bioeng. 2008, 101, 1102-1107.）を2つ含む配列のことである。
Cvapコード配列としては、配列番号６のアミノ酸番号７０〜１９９をコードする配列が例示され、より具体的には、配列番号５の塩基番号３１３〜７０２で示される配列が挙げられる。ただし、前記Cv配列に結合することができる限り、配列番号６のアミノ酸番号７０〜１９９のアミノ酸配列において１〜数個（例えば、２〜５個、もしくは２〜１０個）のアミノ酸が置換、欠失または付加されてもよい。
CvapはダイマーでCv配列に結合することが知られているので、コード領域には前記Cvapコード配列が２つ含まれる必要がある。Cvapダイマーコード配列はCvapコード配列が連続して２つつながったものでもよいが、間にリンカーコード配列を介してCvapコード配列が２つつながった配列でもよい。

【0020】

また、第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドがboxB-associating peptide （Bap）およびRev（TRQARRNRRRRWRERQR：配列番号３４）であり、第一の配列および第二の配列がboxB配列およびapI配列（5’-GGCUGGACUCGUACUUCGGUACUGGAGAAACAGCC-3’：配列番号３９）またはapII（5’-GGUGUCUUGGAGUGCUGAUCGGACACC-3’:配列番号４０）配列であってもよい。

【0021】

また、第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドがboxB-associating peptide （Bap）およびBIV Tat（SGPRPRGTRGKGRRIRR：配列番号３５）であり、第一の配列および第二の配列がboxB配列およびBIV TAR配列（5’-GCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGC-3’：配列番号４１）であってもよい。

【0022】

Revの配列としては、配列番号３４が例示されるが、前記apIまたはapII配列に結合することができる限り、配列番号３４のアミノ酸配列において１〜数個（例えば、２，３個）のアミノ酸が置換、欠失または付加されてもよい。
BIV Tatの配列としては、配列番号３５が例示されるが、前記BIV TAR配列に結合することができる限り、配列番号３５のアミノ酸配列において１〜数個（例えば、２，３個）のアミノ酸が置換、欠失または付加されてもよい。
その他の例示するポリペプチド各配列においても、標的配列に結合できる限り、１〜数個（例えば、２，３個）のアミノ酸が置換、欠失または付加されてもよい。

【0023】

核酸結合性ポリペプチドとしては上記のものに限定されず、核酸配列に結合できるものであればよいが、ペプチド配列中のRとKの総数が6個以上であるポリペプチド、あるいは、ペプチド配列中のRの数が7個以上であるポリペプチドを使用することが好ましい。
また、ペプチド配列中に、RXR配列（Xは任意のアミノ酸）、RX₁X₂R配列（配列番号４２、X₁,X₂は任意のアミノ酸）、RR配列の1種以上、より好ましくは２種以上、特に好ましくは３種全てが存在するポリペプチドを使用することが好ましい。
また、ペプチド配列中に、RXR配列、RX₁X₂R配列（配列番号４２、X₁,X₂は任意のアミノ酸）、RRXRR配列（配列番号４３、Xは任意のアミノ酸）の1種以上、より好ましくは２種以上、特に好ましくは３種全てが存在するポリペプチドを使用することも好ましい。

【0024】

第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドとして、上記のような２種類のポリペプチドを選択して用いればよいが、他の具体的な例として、下記が挙げられる。
・HIV-1 Tat：GRKKRRQRRR (10 mer)（配列番号４４）
・JDV Tat：GRRKKRGTRGKGRKIHY (17 mer) （配列番号４５）
・λ N：MDAQTRRRERRAEKQAQWKAAN (22 mer) （配列番号４６）
・λ N mutant：GNARTRRRERRAEKQAQWKAAN (22 mer) （配列番号４７）
・P22 N：NAKTRRHERRRKLAIER (17 mer) （配列番号４８）
・φ21N：TAKTRYKARRAELIAERR (18 mer) （配列番号４９）
・BMV Gag：KMTRAQRRAAARRNRWTAR (19 mer) （配列番号５０）
・CCMV Gag：KLTRAQRRAAARKNKRNTR (19 mer) （配列番号５１）
・Spuma Gag：TRALRRQLAER (11 mer) （配列番号５２）
・Yeast PRP6：TRRNKRNRIQEQLNRK (16 mer) （配列番号５３）
・Human U2AF：SQMTRQARRLYV (12 mer) （配列番号５４）
・HTLV-II Rex：TRRQRTRRARRNR (13 mer) （配列番号５５）
・FHV coat：RRRRNRTRRNRRRVR (15 mer) （配列番号５６）
・S3：RRVAFRRIVRKAITRAQRR (19 mer) （配列番号５７）
・S7：KTKLERRNK (9 mer) （配列番号５８）
・S28：RKLRVHRRNNR (11 mer) （配列番号５９）
・L16：RRAMSRKFRRNSK (13 mer) （配列番号６０）
・L35：RAKKTRALRR (10 mer) （配列番号６１）
このうち、HIV-1 TatはHIV-1 TAR（5’-CCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGG-3’：配列番号６２）に結合し、JDV TatはJDV TAR（5’-GCUCUGGAUAGCUGACAGCUCCGAGC-3’：配列番号６３）に結合する。

【0025】

核酸結合性ポリペプチドが結合する配列としては、上記のようなポリペプチドが結合できる配列であれば特に制限されないが、ステムループを形成する配列が好ましく、ループの長さが３〜１０塩基、好ましくは３〜８塩基、より好ましくは３〜７塩基のステムループを形成する配列が望ましい。
例えば、上記で例示した配列に加え、下記のような配列が挙げられる。
・P22 boxB：5’-GCGCUGACAAAGCGC-3’ (15 mer) （配列番号６４）
・HIV-1 RRE：5’-GGUCUGGGCGCAGCGCAAGCUGACGGUACAGGCC-3’ (34 mer) （配列番号６５）
ただし、核酸結合性ポリペプチドが結合することができる限り、これらの配列において１〜数個（例えば、２，３個）の塩基が置換、欠失または付加されてもよい。

【0026】

コード領域において、第一の核酸結合性ポリペプチドコード配列と第二の核酸結合性ポリペプチドコード配列の順序は、５’−非翻訳領域における第一の配列と第二の配列の順序に依存し、５’−非翻訳領域において第一の配列（例えばboxB配列）が先（５’側）であれば、コード領域において第一の核酸結合性ポリペプチドコード配列（例えばBapコード配列）を先（５’側）に配置し、第二の配列（例えばCv配列）が先（５’側）であれば、コード領域において第二の核酸結合性ポリペプチドコード配列（例えばCvapダイマーコード配列）を先（５’側）に配置する。
第一の核酸結合性ポリペプチドコード配列と第二の核酸結合性ポリペプチドコード配列の間隔は60〜75塩基であることが蛋白質-RNA複合体の安定化の面から好ましい。

【0027】

コード領域においては、第一の核酸結合性ポリペプチドコード配列と第二の核酸結合性ポリペプチドコード配列の前（５’側）に、提示対象ポリペプチドコード配列を配置させ、これらを、読み枠を合わせて配置させることが好ましい。
ここで、提示対象ポリペプチドコード配列は、既知の配列でもランダム配列でもよい。また、長さも特に制限はなく、短いペプチドでも、蛋白質でもよい。

【0028】

提示させる配列既知のポリペプチドの種類は特に制限されないが、酵素、抗体、シグナル伝達因子、チャネル、細胞増殖因子、転写因子、接着因子、受容体などが例示される。なお、機能未知の蛋白質でもよい。
その由来は特に制限されず、ヒトを含む哺乳動物、植物、ウイルス、酵母、あるいは細菌など、あらゆる生物に由来する天然の配列を持つポリペプチドを用いることができる。あるいは、前記天然ポリペプチドの一部や、アミノ酸配列を改変した変異ポリペプチドを提示対象ポリペプチドとして利用することもできる。更に、人工的に設計されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを提示対象ポリペプチドとすることもできる。

【0029】

ポリペプチドコード配列をランダム配列とする場合、任意のアミノ酸がランダムに配列したランダムポリペプチドをコードする配列とするのが好ましい。ランダムポリペプチドは、通常、５〜１００残基、好ましくは５〜５０残基、より好ましくは５〜２０残基程度の長さからなるランダムなアミノ酸配列を有する。アミノ酸は天然のものでも非天然のものでもよく、これらが混合されたものでもよい。より簡便にはランダムポリペプチドは天然の20アミノ酸から選ばれるアミノ酸の一種類以上から構成される。

【0030】

ポリペプチドを全くランダムな配列（アミノ酸残基数ｎ個）にする場合は、A,T,G,Cを３ｎ個ランダムに配列させればよい。ただし、効率よくクローンを翻訳させるためには、終止コドンが出現しないよう、３ｍ番目（ｍ＝１，２，３・・・，ｎ）の塩基がTまたはCになるようにしてもよい。あるいは、特定の複数種類のアミノ酸のみからなるランダム配列になるようコドンを調整してもよい。
例えば、NRYコドンの繰り返しを利用することで、８種類のアミノ酸（Ser, Asn, Gly, Asp, Arg, His, CysまたはTyr）がランダムに出現するペプチド配列を発現させることが
できる。
N = A, G, C, T
R = A, G
Y = C, T
なお、ランダムポリペプチドが非天然のアミノ酸を含む場合は、コドンを公知の手段にしたがって改変すればよい。

【0031】

コード領域において、提示対象ポリペプチドコード配列、第一の核酸結合性ポリペプチドコード配列および第二の核酸結合性ポリペプチドコード配列は読み枠を合わせて連結される。ここで、「読み枠を合わせて連結される」とは、提示対象ポリペプチドと第一の核酸結合性ポリペプチドコード配列と第二の核酸結合性ポリペプチドコード配列が融合蛋白質として翻訳されるように連結されることを意味する。なお、提示対象ポリペプチドと、第一の核酸結合性ポリペプチドコード配と第二の核酸結合性ポリペプチドコード配列は直接連結されてもよいが、提示対象ポリペプチドの自由度を確保するため、リンカーコード配列を介して連結することが好ましい。

【0032】

ランダムポリペプチドなどの提示対象ポリペプチドをコードする配列は人工的に合成し、制限酵素認識配列（実施例ではSfiI認識配列を利用している）を利用したり、ＰＣＲを利用したりして例えばBapコード配列とCvapダイマーコード配列の５’側に遺伝子工学的に連結することができる。ただし、提示対象ポリペプチドをコードする配列と第一の核酸結合性ポリペプチドコード配列と第二の核酸結合性ポリペプチドコード配列を全て人工的に合成してもよい。

【0033】

提示対象ポリペプチドコード配列の５’側に開始コドンATGを存在させることが好ましいが、開始コドンの後にタグペプチド（例えば、FLAG、ポリヒスチジン、GSTなど）を配置した後に提示対象ポリペプチドコード配列を配置してもよい。

【0034】

また、第一の核酸結合性ポリペプチドコード配列と第二の核酸結合性ポリペプチドコード配列の下流（３’側）にはスペーサーコード配列を配置することがポリペプチド（融合蛋白質）-リボソーム-RNA複合体安定性の面から好ましい。
スペーサー配列は１０〜２００アミノ酸の配列とすることが好ましい。スペーサー配列のアミノ酸配列は、提示対象蛋白質と標的物質との結合反応に悪影響を与えない配列であれば特に制限されないが、水溶性が高く、特殊な３次元構造をとらない配列であることが好ましく、具体的には、主にグリシンとセリンを含むいわゆるＧＳリンカーやファージのgeneIIIの部分配列などを用いることができる。

【0035】

コード領域の３’末端には終止コドンを設けてもよいが、リボソームを効率よく係止させるため、コード領域の３’末端には終止コドンを設けないことが好ましい。あるいは、コード領域の３’末端にSecM配列を付加してもよい。SecM配列はSecM stall配列とも呼ばれ、リボソーム内部で翻訳アレストを起こすと報告されている配列である（FXXXXWIXXXXGIRAGP：配列番号３２）。SecMのアレスト配列を導入することで、ポリペプチド（融合蛋白質）-リボソーム-RNA複合体を効率よく維持できるのでリボソームディスプレイに特に有効である。

【0036】

本発明の核酸構築物を翻訳系に導入して得られる、ポリペプチド（融合蛋白質）-リボソーム-RNA複合体の一例の模式図を図１の（２）に示す。「Peptide/protein libraries」と記載されているのが提示対象ポリペプチドであるが、ライブラリーである必要はない。従来のポリペプチド-リボソーム-RNA複合体は図１の（１）のようにリボソームがRNA上で係止することで複合体が維持されるのみであるが、図１の（２）の場合は、BapとboxB、CvapダイマーとCvの相互作用により複合体が安定化される。

【0037】

本発明の核酸構築物はDNAでもRNA（好ましくはmRNA）でもよい。したがって、「核酸構築物に対応するRNA」とは、核酸構築物がRNAの場合は核酸構築物そのもの、DNAの場合は核酸構築物から転写されて得られるRNAを意味する。
DNAの場合は、RNAを転写させるためのプロモーター配列を５’非翻訳領域の上流に付加することが好ましい。
プロモーターは、使用する発現系に応じて適宜、選択することができる。例えば、大腸菌細胞や大腸菌由来の無細胞翻訳系を用いる場合、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター等の大腸菌で機能するプロモーターが例示される。

【0038】

本発明の一例として、配列番号５，９，１１，１３，１５に、プロモーター配列、boxB配列、Cv配列、SD配列、開始コドン、提示対象ポリペプチドコード配列、Bapコード配列、Cvapダイマーコード配列、スペーサーコードする配列を含む核酸構築物を例示した（図２）。
そして、配列番号６，１０，１２，１４，１６にこれらの核酸から翻訳される融合蛋白質のアミノ酸配列を示した。ただし、本発明の核酸構築物とそれにコードされる融合蛋白質はこれらに限定されない。

【0039】

本発明の核酸構築物は、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクターなどに組み込まれてもよい。ベクターの種類は、用いる翻訳系やスクリーニング系にしたがって適宜選択することができる。
上記核酸構築物およびそれを含むベクターはMolecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001）などに記載されている公知の遺伝子学的手法によって作製することができる。

【0040】

＜本発明の核酸構築物を用いてポリペプチドを核酸（RNA）上に提示させる方法＞
上記核酸構築物を翻訳系に導入して前記コード領域にコードされる融合蛋白質を発現させることにより、第一の核酸結合性ポリペプチドと第一の配列との結合および第二の核酸結合性ポリペプチドと第二の配列との結合を介して融合蛋白質と核酸構築物に対応するRNAとの複合体を形成させることができ、提示対象ポリペプチドをRNA上に提示させることができる。

【0041】

翻訳系としては、大腸菌、昆虫、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、ヒト癌等に由来する細胞から得られたリボソームを含む無細胞翻訳系を使用することができる。リボソーム、tRNA、アミノ酸などを添加して再構成された無細胞翻訳系でもよい。市販のものでもよい。
なお、核酸構築物としてDNAを用いる場合は、プロモーターに応じたRNAポリメラーゼを加える。

【0042】

提示対象蛋白質としてランダムペプチドライブラリーを用いる場合、ライブラリーの規模は、通常1×10³以上、好ましくは1×10⁴以上、より好ましくは1×10⁵以上、さらに好ましくは1×10⁶以上である。

【0043】

なお、ポリペプチド-リボソーム-RNA複合体を形成させた後、リボソームをRNAから解離させてもよい。この場合、濃度50 〜 650 mMのEDTA(もしくはEGTA等のMg²⁺イオンをキレートできる配位子)を翻訳系に添加すればよい。EDTAは最初から翻訳系に加えてもよい。リボソームをRNAから解離させることにより、リボソームを含まないポリペプチド-RNA複合体を得ることができる。

【0044】

＜本発明の核酸構築物を用いて標的物質に結合するポリペプチド配列を選択する方法＞
本発明のポリペプチド配列の選択方法では、次の工程（１）〜（３）を繰り返す。
（１）本発明の核酸構築物からランダムポリペプチドと第一の核酸結合性ポリペプチドおよび第二の核酸結合性ポリペプチドとの融合蛋白質を発現させ、核酸構築物に対応するRNA上にランダムポリペプチドライブラリーを提示する工程；
（２）標的物質に前記ライブラリーを接触させる工程；および
（３）標的物質に結合するポリペプチド配列を含む融合蛋白質を選択し、選択された融合蛋白質をコードする核酸配列を増幅する工程。

【0045】

具体的には、本発明の核酸構築物を翻訳系に導入してポリペプチド-RNA複合体を形成させた後、標的物質にランダムポリペプチドライブラリーを接触させ、ランダムポリペプチドライブラリーから標的物質に結合するポリペプチド配列を含む融合蛋白質を選択し、それをコードする核酸構築物を増幅する。

【0046】

標的物質に結合したポリペプチドを選択するには、標的ポリペプチドと結合したポリペプチドを、標的ポリペプチドと結合していない多数のポリペプチドの中からスクリーニングする必要がある。これはパニングとよばれる既知の方法に従って行う（Coomber (2002) Method Mol. Biol., vol.178, p.133-145）。パニングの基本的なプロトコルは以下のとおりである。
（I）標的物質にポリペプチドライブラリーを接触させる。
（II）標的ポリペプチドに結合しなかった、ライブラリーに含まれていたその他のポリペプチドを除去する。例えば、洗浄により除去することができる。
（III）除去されなかったポリペプチド、すなわち標的ポリペプチドに特異的に結合していたポリペプチドを回収する。
（IV）必要に応じ（I）から（III）の操作を複数回繰り返す。

【0047】

なお、工程（１）の後でEDTAなどによりポリペプチド-RNA複合体からリボソームを解離させておくと、「複合体のリボソームと標的分子との立体障害」や非特異的結合を解消することができるので好ましい。

【0048】

ポリペプチドライブラリーと標的物質を接触させ、結合を可能にする条件は公知であり（WO95/11922、WO93/03172、WO91/05058）、当業者にとって過度の負担なしに確立することができる。例えば、ビーズ、プレート、カラム等の担体に標的物質を結合させ、ここにポリペプチドとRNAの複合体を含む試料を接触させてもよい。また、標的物質が金属（金属塩や金属酸化物を含む）や含珪素化合物等の場合、ポリペプチドとRNAの複合体を含む試料にこれらの物質を添加することにより接触させることもできる。

【0049】

選択された複合体に含まれるRNAは、例えば、RT-PCRによって増幅することができる。RT-PCRによって、RNAを鋳型としてDNAが合成される。DNAを再びRNAに転写し、複合体の形成のために利用することができる。

【0050】

以上の操作を繰り返すことにより、標的物質に特異的に結合するペプチド配列が濃縮される。配列情報は、得られたRNAの配列を解析することにより同定することができる。

【実施例】

【0051】

以下、実施例を参照して本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の態様に限定されない。

【0052】

実施例1：RNAモチーフに特異的に結合するペプチドおよび蛋白質を導入したテンプレートを利用する「安定架橋型リボソームディスプレイ法」の新規開発
ここでは、安定架橋型リボソームディスプレイ法の開発として、ペプチドライブラリーを翻訳するために利用するmRNAテンプレートの5'端に、二つのRNAモチーフ(boxBとCv)を導入した。さらに、ペプチドライブラリーをコードする配列の下流に、各RNAモチーフに特異的に結合するペプチド(Bap)および蛋白質(Cvapダイマー)をコードする配列を導入した。これにより、mRNAテンプレートの試験管内翻訳により発現したペプチド(Bap)と蛋白質(Cvapダイマー)が、各RNAモチーフと親和的に架橋構造を形成するため、これまでにない安定性を獲得した「ペプチド-Bap-Cvap-リボソーム-mRNA複合体(図１（２）)」を合成することができる。

【0053】

まず、「ペプチド-Bap-Cvap-リボソーム-mRNA複合体」を利用すれば、標的分子結合性ペプチドを選択することが可能であることを証明するため、ビーズに固定化した抗FLAG抗体を標的とした「FLAGペプチド選択実験」を行った(この実験は、ペプチドライブラリーを提示した複合体の中から標的分子結合性ペプチドを選択するモデル実験として、図３の操作スキームに準じて行った)。

【0054】

まず、「ペプチド-Bap-Cvap-リボソーム-mRNA複合体」を合成するためのプラスミドDNA-I（配列番号１：図４）とプラスミドDNA-II(配列番号２：図４)の構築を行った。
プラスミドDNA-I は、SD配列・開始コドン・SfiI制限酵素サイト(1)・SfiI制限酵素サイト(2)・Bap配列・Cvap配列・Ps配列の順に並んだ人工配列を、市販プラスミドのクローニングサイトに導入することで構築した。また、プラスミドDNA-IIは、T7プロモーター配列・SD配列・開始コドン・SfiI制限酵素サイト(1)・SfiI制限酵素サイト(2)・Bap配列・Cvap配列・Ps配列の順に並んだ人工配列を、市販プラスミドのクローニングサイトに導入することで構築した。

【0055】

次に、プラスミドDNA-IIのSfiIサイトにFLAGペプチドを導入したプラスミドDNA-II-FLAG（配列番号８、部分配列は配列番号５）を構築し、それを鋳型にし、プライマーfp4（配列番号２８）とrp3（配列番号３１）を用いたPCRによりDNAテンプレート4-NS(図４：NSは終止コドンがないことを示す)を合成した。

【0056】

そして、そのDNAテンプレート4-NSを利用してT7プロモーターからmRNAテンプレートを合成し、これを無細胞蛋白質合成系(バイオコゥマー社製 PURESYSTEM classic II)の翻訳反応に供することより、「FLAGペプチド-Bap-Cvap-リボソーム-mRNA複合体」を合成した。

【0057】

さらに、下記のペプチド選択実験の手順１に従って、その複合体と、抗FLAG抗体を固定化したビーズ(SIGMA-ALDRICH社製)を混合した後、抗FLAG抗体と特異的に結合した複合体のみをFLAGペプチド(SIGMA-ALDRICH社製)の添加により競合的にビーズから溶出した。そして、それら複合体から回収したmRNAを逆転写して得られたcDNAを鋳型にPCRを行い、そのPCR産物の電気泳動を行った。

【0058】

その結果、目的のFLAGペプチドをコードするmRNAの回収に成功していることが確認できた(図１−（３）)。これにより、「ペプチド-Bap-Cvap-リボソーム-mRNA複合体」を利用した「安定架橋型リボソームディスプレイ法」により、ペプチド選択実験を実行することが可能であることが示された。

【0059】

＜ペプチド選択実験の手順１＞
1. Selection buffer(250μl)と「ペプチド-Bap-Cvap-リボソーム-mRNA複合体」を有する翻訳液(50μl)を混合し、ビーズ(15μl)を添加した後、インキュベート(1 h, 4℃)する。
2. 1で処理したビーズをWashing buffer(300μl)で5回洗浄する。
3. 2で処理したビーズにFLAGペプチド(100μl)を添加し、さらにインキュベート(0.5 h,4℃)する。4. 1000rpm(5 min)でビーズを沈降させた後、上清(100μl)を回収する。
5. 4で回収したmRNAを精製(QIAGEN社製RNeasy kit)し、それをもとに逆転写(TAKARA社製PrimeScript Reverse Transcriptase)を行うことでcDNAを合成する。
6. 5で合成したcDNAを鋳型にしてPCR(TAKARA社製 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase)を行い、そのPCR産物を電気泳動することで、mRNAの回収量を確認する。

Washing buffer : Tris-HCl(50 mM, pH 7.5), NaCl(150 mM), 0.5 % Tween
Selection buffer : Tris-HCl(60 mM, pH 7.5), NaCl(180 mM)
ビーズ : ANTI-FLAG-M2-Affinity Gel (SIGMA-ALDRICH社製)
FLAGペプチド (SIGMA-ALDRICH社製)

【0060】

実施例2：リボソームを解離させた複合体を利用する「安定架橋型ディスプレイ法」の開発
従来、リボソームディスプレイ法によるペプチド選択実験において問題とされてきた「複合体におけるリボソームと標的分子との立体障害」を解消することができれば、これまでに選択できなかったより強力な標的結合性ペプチドの創出が可能となる。
そこで今回、mRNAディスプレイ法とは全く異なる簡便な方法により、リボソームを有さない「ペプチド-mRNA複合体」を合成し、それら利用する新規ディスプレイ法の開発に取り組んだ。

【0061】

ここでは、上記の実施例1で開発した「ペプチド-Bap-Cvap-リボソーム-mRNA複合体」が、分子内架橋構造の形成により安定化していることに着目し、その複合体からリボソームだけを解離した「ペプチド-Bap-Cvap-mRNA複合体」の合成を試みた(図２（D）)。さらに、その「ペプチド-Bap-Cvap-mRNA複合体」を利用したペプチド選択実験の実行と評価により、今回の新たな「安定架橋型ディスプレイ法」の有用性を実証することにした。

【0062】

まず、図２に示す4種類の複合体を形成するための人工蛋白質が、5'端にRNAモチーフを導入したmRNAとRNAモチーフを導入していないmRNAから同等に発現できることを確認するため、以下の手順で実験を行った。

【0063】

プラスミドDNA-I（配列番号１）とDNA-II（配列番号２）のSfiIサイトにFLAGペプチド(ペプチドライブラリーモデル)を導入したプラスミドDNA-I-FLAG（配列番号７、部分配列は配列番号３）とDNA-II-FLAG（配列番号８、部分配列は配列番号５）を構築した。そして、下記４種類のＤＮＡを構築した。
（Ａ）プラスミドDNA-I-FLAGを鋳型に、プライマーはfp1（配列番号２５）とrp1（配列番号２９）を用いてPCRによりDNAテンプレート1-S(配列番号９)を増幅した。
（Ｂ）プラスミドDNA-I-FLAGを鋳型に、プライマーはfp2（配列番号２６）とrp1（配列番号２９）を用いてPCRによりDNAテンプレート2-S(配列番号１１)を増幅した。
（Ｃ）プラスミドDNA-I-FLAGを鋳型に、プライマーはfp3（配列番号２７）とrp1（配列番号２９）を用いてPCRによりDNAテンプレート3-S(配列番号１３)を増幅した。
（Ｄ）プラスミドDNA-II-FLAGを鋳型に、プライマーはfp4（配列番号２８）とrp1（配列番号２９）を用いてPCRによりDNAテンプレート4-S(配列番号１５)を増幅した。
プライマーfp1は配列番号３の塩基番号１〜２４の配列を含み、Ｔ７プロモーターを含んでいる。
プライマーfp2は配列番号３の塩基番号１〜２４の配列を含み、Ｔ７プロモーター、boxB配列を含んでいる。
プライマーfp3は配列番号３の塩基番号１〜２４の配列を含み、Ｔ７プロモーター、Cv配列を含んでいる。
プライマーfp4は配列番号５の塩基番号１〜３５の配列を含み、Ｔ７プロモーター、boxB配列、Cv配列を含んでいる。
プライマーrp1は配列番号３の塩基番号１０９４〜１１１３および配列番号５の塩基番号１１５７〜１１７６に相補的な配列を含み、終止コドンを含んでいる。

【0064】

さらに、それらDNAテンプレートからT7プロモーターを利用した試験管内転写により合成した各mRNAテンプレートを、無細胞蛋白質合成系(バイオコゥマー社製 PURESYSTEM classic II)により翻訳することで、「FLAGペプチド-Bap-Cvap融合蛋白質」（配列番号１０，１２，１４，１６）の発現を行った。

【0065】

その結果、抗FLAG抗体-HRP(SIGMA-ALDRICH社製)と化学発光試薬(PIERCE社製)を利用したWestern blotting(図５)において、mRNAの5'端におけるRNAモチーフの導入の有無に関係なく、同程度の蛋白質量が発現していることを確認できた。

【0066】

次に、図２に示す4種類の複合体を利用したFLAGペプチド選択実験を行うため、以下の４種類のＤＮＡテンプレートを構築した（図４−１〜４）。
（Ａ）プラスミドDNA-I-FLAGを鋳型に、プライマーはfp1（配列番号２５）とrp3（配列番号３１）を用いてPCRによりDNAテンプレート1-NS(配列番号９の最後に、taatgaの代わりに配列番号５の１１７７〜１６２６が付加した配列)を増幅した。
（Ｂ）プラスミドDNA-I-FLAGを鋳型に、プライマーはfp2（配列番号２６）とrp3（配列番号３１）を用いてPCRによりDNAテンプレート2-NS(配列番号１１の最後に、taatgaの代わりに配列番号５の１１７７〜１６２６が付加した配列)を増幅した。
（Ｃ）プラスミドDNA-I-FLAGを鋳型に、プライマーはfp3（配列番号２７）とrp3（配列番号３１）を用いてPCRによりDNAテンプレート3-NS(配列番号１３の最後に、taatgaの代わりに配列番号５の１１７７〜１６２６が付加した配列)を増幅した。
（Ｄ）プラスミドDNA-II-FLAGを鋳型に、プライマーはfp4（配列番号２８）とrp3（配列番号３１）を用いてPCRによりDNAテンプレート4-NS(配列番号１５の最後に、taatgaの代わりに配列番号５の１１７７〜１６２６が付加した配列)を増幅した。
プライマーrp3は配列番号３の塩基番号１５４４〜１５６３および配列番号５の塩基番号１６０７〜１６２６に相補的な配列を含み、終止コドンを含んでいない。

【0067】

さらに、それらDNAテンプレートのT7プロモーターを利用した試験管内転写により合成した各mRNAテンプレートを、無細胞蛋白質合成系(バイオコゥマー社製 PURESYSTEM classic II)により翻訳した。そして、下記のペプチド選択実験の手順２にしたがって、EDTA（50 mM）を含有したバッファーと翻訳液を混合することでリボソームをｍRNAから解離させ、図２に示す4種類の複合体を得た。

【0068】

続いて、それら複合体と抗FLAG抗体を固定化したビーズ(SIGMA-ALDRICH社製)を混合した後、抗FLAG抗体と特異的に結合した複合体のみを、FLAGペプチド(SIGMA-ALDRICH社製)の添加により競合的にビーズから溶出した。そして、回収したmRNAを逆転写して得られたcDNAを鋳型にPCRを行い、各実験から得られたPCR産物を電気泳動することでmRNAの回収量を比較した。

【0069】

その結果、図６（A）(18サイクル)の電気泳動では、「ペプチド-Bap-Cvap-mRNA複合体」を利用した場合にのみ、バンドを確認することができた。今回の電気泳動(図６)では、各複合体から回収したFLAGペプチドのmRNA量が多いほど、PCRサイクル数が少ない条件でバンドが確認できることから、図２（D）の「ペプチド-Bap-Cvap-mRNA複合体」が最も安定であると同時に、この複合体を利用すれば、「安定架橋型リボソームディスプレイ(図１−（３）)」と同様のペプチド選択実験を行うことが可能であることが明らかとなった。さらに、図６（B）(21サイクル)の電気泳動では、図２（B）の複合体と図２（C）の複合体を利用した場合においてもバンドを確認することができたことから、これらを用いてもペプチド選択実験が可能であることが示された。

【0070】

＜ペプチド選択実験の手順２＞
1. Selection buffer(250μl)と各複合体を有する翻訳液(50μl)を混合し、ビーズ(15μl)を添加した後、インキュベート(1 h, 4℃)する。
2. 1で処理したビーズをWashing buffer(300μl)で5回洗浄する。
3. 2で処理したビーズにFLAGペプチド(100μl)を添加し、さらにインキュベート(0.5 h,4℃)する。
4. 1000rpm(5 min)でビーズを沈降させた後、上清(100μl)を回収する。
5. 4で回収したmRNAを精製(QIAGEN社製RNeasy kit)し、それをもとに逆転写(TAKARA社製PrimeScript Reverse Transcriptase)を行うことでcDNAを合成する。
6. 5で合成したcDNAを鋳型にしてPCR(TAKARA社製 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase)を行い、そのPCR産物を電気泳動することで、mRNAの回収量を確認する。

Washing buffer : Tris-HCl(50 mM, pH 7.5), NaCl(150 mM), EDTA(50 mM), 0.5 % Tween
Selection buffer : Tris-HCl(60 mM, pH 7.5), NaCl(180 mM), EDTA(60 mM)
ビーズ : ANTI-FLAG-M2-Affinity Gel (SIGMA-ALDRICH社製)
FLAGペプチド (SIGMA-ALDRICH社製)

【0071】

実施例3：「安定架橋型リボソームディスプレイ法」および「安定架橋型ディスプレイ法」における各種ポリペプチド・蛋白質の提示
上記の実験により、「安定架橋型リボソームディスプレイ法」および「安定架橋型ディスプレイ法」を利用して、標的分子に特異的に結合するペプチドの選択実験を行えることが明らかとなった。

【0072】

さらに、様々な長さのペプチド(プロテイン)ライブラリーをプラスミドDNA-IIに導入し、目的の機能を発現するペプチド(プロテイン)アプタマーを選択できる汎用的なディスプレイ法として確立するために、プラスミドDNA-IIに各種ポリペプチド・蛋白質を導入し、それらが発現できるかどうかを検証した。

【0073】

まず、プラスミドDNA-II（配列番号２）のSfiIサイトに、ポリヒスチジンタグ(H6)、Human epidermal growth factor (EGF)、FK-binding protein 12 (FKBP12)、Cyclophilin A(CypA)を導入した各種プラスミドDNA-II-H6（配列番号１７）、DNA-II-EGF（配列番号１９）、DNA-II-FKBP12（配列番号２１）、DNA-II-CypA(配列番号２３)を構築した。

【0074】

そして、それらプラスミドDNAを鋳型にし、プライマーfp4（配列番号２８）とrp2（配列番号３０）を用いたPCRによりDNAテンプレート5-H6-FLAG-S、5-EGF-FLAG-S、5-FKBP12-FLAG-S、5-CypA-FLAG-Sを合成した(図４ ５−ＸでＸがH6,EGF,FKBP12またはCypA)。
プライマーrp2は配列番号５の塩基番号１１５７〜１１７６に相補的な配列を含み、FLAGコード配列と終止コドンを含んでいる。

【0075】

さらに、それらDNAテンプレートからT7プロモーターを利用した試験管内転写により合成したmRNAテンプレートを、無細胞蛋白質合成系(バイオコゥマー社製 PURESYSTEM classic II)により翻訳することで、各種蛋白質（配列番号１８，２０，２２，２４）の発現を行った。そして、抗FLAG抗体-HRP(SIGMA-ALDRICH社製)と化学発光試薬(PIERCE社製)を利用したWestern blotting(図７)を行ったところ、各蛋白質の発現を確認することに成功した。
この結果は、プラスミドDNA-IIの利用により、様々なペプチド(プロテイン)ライブラリーを導入した「ペプチド(プロテイン)-Bap-Cvap-mRNA複合体」の合成が可能であり、目的のペプチド(プロテイン)アプタマーの選択実験を行うことが可能であることを示唆している。

【0076】

実施例４：RNAモチーフ-ペプチド架橋構造の新たな創成
安定架橋型リボソーマル複合体の多様化およびコンパクト化の可能性を模索すると共に、RNAモチーフ-ペプチド架橋構造体の多目的利用(例：機能性核酸・核酸医薬などのデリバリー)の潜在性を見出すため、RNAモチーフ-ペプチド架橋構造体(図８)の新たな創成に取り組んだ。ここでは、天然に存在するRNAモチーフ-ペプチド相互作用および人工的に見出されたRNAモチーフ-ペプチド相互作用を規範として、ヘテロなタンデム化RNAモチーフとそれらに結合するタンデム化ペプチドを新規に設計した(図８と表１)。そして、化学的手法により合成した各種RNAモチーフとペプチドを混合した後、電気泳動によるゲルシフトアッセイにより、RNAモチーフ-ペプチド架橋構造体の形成の可否について評価した(今回の実験は、下記の条件と手順に従って実行した)。

【0077】

例えば、タンデム化RNAモチーフ(TRM4：表１)とタンデム化ペプチド(TP3もしくはTP4：表１)を混合したところ、RNAモチーフ-ペプチド架橋構造体の形成を示すバンドシフト(図９：矢印)を確認することができた。さらに、表１に示したすべてのタンデム化RNAモチーフとそれぞれに対応するタンデム化ペプチドとの架橋構造体の形成も電気泳動で確認することができた。これらの結果は、今回合成したタンデム化ペプチドが、定量的にRNAモチーフ-ペプチド架橋構造体を形成することができるだけでなく、実施例１〜３のペプチド(Bap)とタンパク質(Cvap)で構成される融合タンパク質に比べて分子量も小さいため(約1/6)、より取り扱い易い安定型リボソーマル複合体の合成に利用できることを示唆している。また、これらRNAモチーフ-ペプチド架橋構造体を利用したsiRNAやncRNAなどの機能性核酸・核酸医薬のデリバリーへの応用も期待できる。

【0078】

＜RNAモチーフ-ペプチド混合溶液の調製と電気泳動＞
（１）下記サンプルバッファーにより、RNAモチーフ溶液(1μM)を調製する。そして、70℃でインキュベーションした後、室温で放置する。
（２）下記サンプルバッファーにより調製した各種ペプチド溶液(1μM)と上記RNAモチーフ溶液を混合した後、総量10μLにメスアップする(最終のRNAのモル量：4 pmol)。
（３）10% PAGEにより、RNAモチーフとRNAモチーフ-ペプチド架橋構造体を分離した後、ゲルをSYBRGで染色してイメージ像を測定した(例：図９)。
・サンプルバッファー：Tris-acetate (50 mM, pH7.5)、KCl (150 mM)、Tween-20 (0.1 %)、
Mg(AcO)₂(50 mM)、Zn(AcO)₂ (0.1 mM)
・電気泳動バッファー：Tris-acetate (10 mM, pH 7.5)

【0079】

【表1】

【0080】

＜ペプチドの配列＞
Bap : GNARTRRRERRAMERATLPQVLG（配列番号３３）
Rev : TRQARRNRRRRWRERQR（配列番号３４）
BIV Tat : SGPRPRGTRGKGRRIRR（配列番号３５）
GS2 : GGGSGGGS（配列番号３６）
GS3 : GGGSGGGSGGGS（配列番号３７）

【0081】

＜RNAモチーフの配列＞
boxB : GGCCCUGAAAAAGGGCC（配列番号３８）
ap I : GGCUGGACUCGUACUUCGGUACUGGAGAAACAGCC（配列番号３９）
ap II : GGUGUCUUGGAGUGCUGAUCGGACACC（配列番号４０）
BIV TAR : GCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGC（配列番号４１）

【産業上の利用可能性】

【0082】

本発明の核酸構築物及びそれを用いる方法は遺伝子工学やペプチド工学、創薬等の分野で有用である。

【0083】

［配列表の説明］
１．Plasmid DNA-I full塩基配列
２．Plasmid DNA-II full塩基配列
３．Plasmid DNA-I-FLAG partial塩基配列
４．３のアミノ酸配列
５．Plasmid DNA-II-FLAG partial塩基配列
６．５のアミノ酸配列
７．Plasmid DNA-I-FLAG full塩基配列
８．Plasmid DNA-II-FLAG full塩基配列
９．DNA-I-fp1-rp1塩基配列
１０．９のアミノ酸配列
１１．DNA-I-fp2-rp1塩基配列
１２．１１のアミノ酸配列
１３．DNA-I-fp3-rp1塩基配列
１４．１３のアミノ酸配列
１５．DNA-I-fp4-rp1塩基配列
１６．１５のアミノ酸配列
１７．Plasmid DNA-II-H6 full塩基配列
１８．１７のアミノ酸配列
１９．Plasmid DNA-II-EGF full塩基配列
２０．１９のアミノ酸配列
２１．Plasmid DNA-II-FKBP12 full塩基配列
２２．２１のアミノ酸配列
２３．Plasmid DNA-II-CypA full塩基配列
２４．２３のアミノ酸配列
２５．プライマーfp1塩基配列
２６．プライマーfp2塩基配列
２７．プライマーfp3塩基配列
２８．プライマーfp4塩基配列
２９．プライマーrp1塩基配列
３０．プライマーrp2塩基配列
３１．プライマーrp3塩基配列
３２．secMアミノ酸配列
３３．Bap
３４．Rev
３５．BIV Tat
３６．linker 1
３７．linker 2
３８．boxB
３９．apI
４０．apII
４１．BIV TAR
４２．consensus sequence 1
４３．consensus sequence 2
４４．HIV-1 Tat
４５．JDV Tat
４６．λN
４７．λN mutant
４８．P22N
４９．φ21N
５０．BMV Gag
５１．CCMV Gag
５２．Spuma Gag
５３．Yeast PRP6
５４．Human U2AF
５５．HTLV-II Rex
５６．FHV coat
５７．S3
５８．S7
５９．S28
６０．L16
６１．L35
６２．HIV-1 TAR
６３．JDV TAR
６４．P22 boxB
６５．HIV-1 RRE

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]