特許 6058560 抗ウイルス性組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6058560

(24)【登録日】2016年12月16日

(45)【発行日】2017年1月11日

(54)【発明の名称】抗ウイルス性組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/60 20060101AFI20161226BHJP

   A61P 31/22 20060101ALI20161226BHJP

   A61K 31/7034 20060101ALI20161226BHJP

   A61K 31/352 20060101ALI20161226BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/60

   A61P31/22

   A61K31/7034

   A61K31/352

【請求項の数】25

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2013-554029(P2013-554029)

(86)(22)【出願日】2012年2月13日

(65)【公表番号】特表2014-505720(P2014-505720A)

(43)【公表日】2014年3月6日

(86)【国際出願番号】IB2012050631

(87)【国際公開番号】WO2012110932

(87)【国際公開日】20120823

【審査請求日】2015年1月5日

(31)【優先権主張番号】61/442,883

(32)【優先日】2011年2月15日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】510012474

【氏名又は名称】ピラマル エンタープライジーズ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000947

【氏名又は名称】特許業務法人あーく特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】トーマス・ベッキー・マリー

(72)【発明者】

【氏名】サクラニ・アルビンド

(72)【発明者】

【氏名】カプール・ナターシャ

(72)【発明者】

【氏名】エノーズ・アルノ・アパブー

(72)【発明者】

【氏名】サワント・サティッシュ・ナムデオ

(72)【発明者】

【氏名】カウシク・リチュ

(72)【発明者】

【氏名】ボウミック・ルパ

(72)【発明者】

【氏名】マラニ・アシッシュ

【審査官】 春田 由香

(56)【参考文献】

【文献】 Marslin G, et al.，Anti-Ulcer (Ulcer-Preventive) Activity of Ficus arnottiana Miq.(Moraceae) Leaf Methanolic Extract，American Journal of Pharmacology and Toxicology，２００９年，Vol.4, No.3，p.89-93

【文献】 Mazumder PM, et al.，Hypoglycaemic effect of Ficus arnottiana Miq. bark extracts on streptozotocin induced diabetes in rats，Natural Product Radiance，２００９年，Vol.8, No.5，p.478-482

【文献】 Maregesi SM, et al.，Screening of some Tanzanian medicinal plants from Bunda district for antibacterial, antifungal and antiviral activities，Journal of Ethnopharmacology，２００８年，Vol.119, No.1，p.58-66

【文献】 Yarmolinsky L，Antiviral activity of ethanol extracts of Ficus binjamina and Lilium candidum in vitro，New Biotechnology，２００９年１２月，Vol.26, No.6，p.307-313

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８

Ａ６１Ｋ ３１／００−３１／８０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、アセトン、酢酸エチル、ジクロロメタン、水、または、これらの混合物から選択された溶媒中において１：８〜１：１０の重量／体積比で、３０℃〜５０℃で３時間〜１２時間攪拌することによって、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物の粉砕した１つ以上の茎、皮または小枝から抽出物を調製するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において得られた抽出物を濃縮するステップと、
（ｃ）随意的に、ステップ（ｂ）において得られた抽出物を、高真空下（０．０１〜５ｍｍＨｇ）で乾燥させるステップと、
（ｄ）随意的に、ステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）において得られた抽出物を溶媒分離によって濃縮するステップと、
（ｅ）ステップ（ｂ）、ステップ（ｃ）、または、ステップ（ｄ）において得られた抽出物を薬学的に許容可能な担体と混合し、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）により引き起こされるウイルス感染症の予防または治療のための治療用剤として調合するステップとを含む、組成物の調製プロセス。

【請求項2】

Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの上記抽出物が該植物の茎から得られる、請求項１に記載のプロセス。

【請求項3】

Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの上記抽出物が該植物の皮から得られる、請求項１に記載のプロセス。

【請求項4】

Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの上記抽出物が該植物の小枝から得られる、請求項１に記載のプロセス。

【請求項5】

上記溶媒がメタノールと水との混合物である、請求項１に記載のプロセス。

【請求項6】

ステップ（ｄ）において、溶媒分離するために使用される上記溶媒が水、石油エーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、メタノール、アセトン、アセトニトリル、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、または、これらの混合物から選択される、請求項１に記載のプロセス。

【請求項7】

単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）によって引き起こされるウイルス感染症の予防または治療のために、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物の１つ以上の茎、皮または小枝からの治療上有効な量の単離抽出物を包含する組成物。

【請求項8】

上記ＨＳＶがＨＳＶ−１である、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

上記ＨＳＶがＨＳＶ−２である、請求項７に記載の組成物。

【請求項10】

Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物の１つ以上の茎、皮または小枝からの単離抽出物と薬学的に許容可能な担体とを、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）によって引き起こされるウイルス感染症の予防または治療のための治療薬を製造する用途に用いる使用方法。

【請求項11】

Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの上記抽出物が１つ以上の生物活性マーカーを含有する、請求項１０に記載の使用方法。

【請求項12】

上記生物活性マーカーがフロリジンもしくは５，７，４’−トリヒドロキシフラボン、または、これらの混合物である、請求項１１に記載の使用方法。

【請求項13】

上記生物活性マーカーがフロリジンである、請求項１２に記載の使用方法。

【請求項14】

上記生物活性マーカーが５，７，４’−トリヒドロキシフラボンである、請求項１２に記載の使用方法。

【請求項15】

上記治療薬が、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの上記抽出物を５％〜５０％（ｗ／ｗ）含有する、請求項１０に記載の使用方法。

【請求項16】

上記ＨＳＶがＨＳＶ−１である、請求項１０に記載の使用方法。

【請求項17】

上記ＨＳＶがＨＳＶ−２である、請求項１０に記載の使用方法。

【請求項18】

Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの上記抽出物が該植物の茎から得られる、請求項７に記載の組成物。

【請求項19】

Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの上記抽出物が該植物の皮から得られる、請求項７に記載の組成物。

【請求項20】

Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの上記抽出物が該植物の小枝から得られる、請求項７に記載の組成物。

【請求項21】

Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの上記抽出物を５％〜５０％（ｗ／ｗ）含有する、請求項７に記載の組成物。

【請求項22】

Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの上記抽出物が１つ以上の生物活性マーカーを含有する、請求項７に記載の組成物。

【請求項23】

上記生物活性マーカーがフロリジンもしくは５，７，４’−トリヒドロキシフラボン、または、これらの混合物である、請求項２２に記載の組成物。

【請求項24】

経口投与用または局所投与用として調合される、請求項７に記載の組成物。

【請求項25】

クリーム、ゲル、または、軟膏の形態で局所投与用として調合される、請求項２４に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗ウイルス活性を有するＦｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの抽出物を包含する組成物に関する。本発明は、該組成物の調製プロセスにも関し、さらに、ウイルス感染症、具体的には単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ； ＨＳＶ）によって引き起こされるウイルス感染症の治療において使用するための組成物にも関する。

【背景技術】

【0002】

ウイルスは、生命を脅かしたり死に至らしめたりする多数のヒト疾患の病原である。特に懸念されるのは、例えば、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型、７型、および８型（ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、および、ＨＨＶ−８）などの各種ヘルペスウイルスである。

【0003】

単純ヘルペスは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）によって引き起こされるウイルス性疾患である。ＨＳＶ−１は一般に、熱の華または発熱疱疹として知られる顔面の疱疹に関連する。ＨＳＶ−１感染は概ね中咽頭の粘膜において発生し、三叉神経節がコロニー化されて不顕性ウイルスを内包するようになる。ＨＳＶ−２は、ＨＳＶ−１に比べて性器ヘルペスに関連することが多い。ＨＳＶ−２は通常性交によって伝染し、肛門、直腸、上部消化管において、さらに、仙骨神経節での播種をともなって生殖器部において発生する。いずれのウイルスも、接触部位によっては、これとは反対にそれぞれ生殖器の粘膜または口の粘膜に感染することもある。いずれのウイルスも中枢神経系に侵襲して増殖し、後根神経節において潜伏感染を確立する能力を有する。

【0004】

免疫不全患者、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した患者においては、ＨＳＶによって引き起こされる疾患が生命を脅かす可能性がある。一次感染の後、ＨＳＶは宿主の生涯にわたって宿主において生存し続けるので、ＨＳＶ感染は生涯感染症であると考えられている（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００２，１８６，Ｓ７１−Ｓ７７）。

【0005】

疱疹を治療するために使用される抗ウイルス薬をいくつか挙げると、アシクロビル、バラシクロビル、ファムシクロビル、ペンシクロビルなどがある。ここに列挙した抗ウイルス薬の中では、アシクロビルが、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２によって引き起こされるウイルス感染症の治療に使用される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａは、インドおよびスリランカにおいて広く分布しており、気根を有しない中程度の大きさの落葉樹である。この植物は、伝統的なアーユルベーダ系医学によれば、皮膚疾患、炎症、下痢、糖尿病、灼熱感、ハンセン病、疥癬、および、創傷に対して有用である（Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｒａｄｉａｎｃｅ，２００９，８（５），４７８−４８２）。

【0007】

ウイルス感染症、具体的にはヘルペス感染症の予防および治療のための効果的な組成物および方法に対する必要性は依然存在している。ヘルペス感染症の発生率および重症度は、攻撃的な化学療法計画、臓器移植の拡大、および、ＨＩＶ感染の発生率の増加によって、発生する免疫不全患者数が増加していることが原因となって増加している。

【0008】

我々の知る限りにおいて、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの抽出物を含有する、ウイルス感染症を治療することを目的とする治療薬についての報告は一切存在しない。

【課題を解決するための手段】

【0009】

〔発明の概要〕
本発明は、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの治療上有効な量の単離抽出物を、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて包含する組成物に関する。

【0010】

また、本発明は、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの抽出物および単離済み抽出物を有効成分として包含する組成物の調製プロセスにも関する。

【0011】

また、本発明は、上記組成物の抗ウイルス活性にも関する。

【0012】

本発明の一態様において、上記組成物の抗ウイルス活性は抗ＨＳＶ活性である。本発明は一態様において、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）によって引き起こされるウイルス感染症の予防および治療において使用するための、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの治療上有効な量の単離抽出物と薬学的に許容可能な担体とを包含する組成物に関する。

【0013】

さらに、本発明は、被験体において単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）によって引き起こされるウイルス感染症の治療方法であって、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの治療上有効な量の単離抽出物を薬学的に許容可能な担体と組み合わせて包含する組成物を被験体に投与することを含む方法にも関する。

【0014】

また、本発明は、コンドームなどの障壁具とともに併用してウイルス感染症の予防において使用するための、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの治療上有効な量の単離抽出物と薬学的に許容可能な担体とを包含する組成物にも関する。

【0015】

本発明には、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）によって引き起こされるウイルス感染症の予防および治療において使用するための、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの治療上有効な量の単離抽出物を薬学的に許容可能な担体と組み合わせて包含する組成物が含まれる。

【0016】

さらに、本発明には、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物の単離抽出物を、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）によって引き起こされるウイルス感染症の治療のための治療薬を製造する用途に用いる使用方法が含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１は、ＨＰＬＣによって分析した、実施例４の試料２３のクロマトグラムを示している。このクロマトグラムは、生物活性マーカー（ＢＭ）のピークを２つ、具体的にはＢＭ−１のピークおよびＢＭ−２のピークを示している。

【図2】図２は、ＨＰＬＣによって分析した、実施例６の調合物ＩＢのクロマトグラムを示している。このクロマトグラムは、生物活性マーカー（ＢＭ）のピークを２つ、具体的には、ＢＭ−１のピークおよびＢＭ−２のピークを示している。

【図3】図３は、ＨＳＶ−１に対する実施例４の試料２３の感染前の阻害活性を、アシクロビルの阻害活性と比較して示している。

【図4】図４は、ＨＳＶ−２に対する実施例４の試料２３の感染前の阻害活性を、アシクロビルの阻害活性と比較して示している。

【図5】図５は、ＨＳＶ−１の吸着に対する実施例４の試料２３の阻害効果を、アシクロビルの阻害効果と比較して示している。

【図6】図６は、ＨＳＶ−２の吸着に対する実施例４の試料２３の阻害効果を、アシクロビルの阻害効果と比較して示している。

【図7】図７は、ＨＳＶ−１の侵入に対する実施例４の試料２３の阻害活性を、アシクロビルの阻害活性と比較して示している。

【図8】図８は、ＨＳＶ−２の侵入に対する実施例４の試料２３の阻害活性を、アシクロビルの阻害活性と比較して示している。

【図9】図９は、ＨＳＶ−１に対する実施例４の試料２３の殺ウイルス効果を、アシクロビルの殺ウイルス効果と比較して示している。

【図10】図１０は、ＨＳＶ−２に対する実施例４の試料２３の殺ウイルス効果を、アシクロビルの殺ウイルス効果と比較して示している。

【発明を実施するための形態】

【0018】

〔発明の詳細な説明〕
本発明の詳細な説明に入る前に、本発明は特定の実施形態に限定されるものではないことが理解されなければならない。さらに、本明細書において使用する用語は特定の実施形態のみを説明することを目的としているのであって、限定することを意図していないことも理解されなければならない。

【0019】

本明細書および請求項において使用しているように、明らかに文脈と矛盾することがないかぎり、「ａ」、「ａｎ」、および、「ｔｈｅ」という単数形には複数形に対する言及が含まれる。

【0020】

特記しないかぎり、本明細書において使用する技術用語および科学用語は、すべて、本発明が属する分野の当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。

【0021】

本明細書において使用する「治療する」または「治療」という用語には、予防的治療および対症治療が含まれる。

【0022】

「Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａ」という用語には、例えば、「Ｆｉｃｕｓ ｐｏｐｕｌｉｆｏｌｉａ」、「Ｕｒｏｓｔｉｇｍａ ａｒｎｏｔｔｉａｎｕｍ」、および、「Ｕｒｏｓｔｉｇｍａ ｃｏｒｄｉｆｏｌｉｕｍ」などの異名も含まれる。

【0023】

本明細書において言及する「抽出物」または「単離抽出物」は、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物中に存在する化合物の混合物、または、該植物から得られる画分の混合物を意味する。このような化合物または画分は、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物の粉砕した全体またはその部分（例えば、茎（皮の付いた茎）、皮無しの茎、皮、小枝など）から、適切な溶媒を用いて抽出することによって得られる。また、この抽出ステップに続いて、随意的に濃縮ステップが実施されてもかまわない。「抽出物」および「単離抽出物」という用語は、互換的に使用され得る。

【0024】

本明細書において言及する「抗ウイルス薬」とは、ウイルス感染症、具体的には単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型、７型、および８型（ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、および、ＨＨＶ−８）などの各種単純ヘルペスウイルスによって引き起こされるウイルス感染症を治療するために特異的に使用される種類の治療薬を指す。

【0025】

本明細書において言及する「組成物」とは、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの治療上有効な量の抽出物または単離抽出物を、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて包含するハーブ性組成物または薬学的組成物を指す。なお、「組成物」という用語は広い意味で解釈されるべきであって、本用語には、例えば意図する指示事項についてラベルを付して医薬品として販売されるのか、店頭で販売されるのか、あるいは生薬として販売されるのかにかかわらず、治療効果を達成することを目的とする任意の組成物が含まれる。

【0026】

本明細書では、「治療上有効な量」という用語は、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの抽出物の、所望の治療上の反応をもたらす量を意味する。この治療上の反応とは、例えば、ウイルス感染症の緩和、治療、防止、または、ウイルス感染症に関連するもしくはウイルス感染症（具体的にはＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２）によって引き起こされる各種の皮膚病変、でき物、熱の華、疱疹、疣贅、しこり、腫れ物、面皰、発疹や潰瘍などの各症状の緩和、治療、防止などである。

【0027】

「薬学的に許容可能」とは、担体、希釈液、賦形剤、および／または、塩が、調合物に包含される他の成分に対して融和性を有していなければならず、該調合物の服用者にとって有害であってはならないことを意味する。

【0028】

本明細書では、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、任意の種類の無毒で不活性な固体、半固体、希釈液（例えば水）、カプセル化物質、製剤補助制を意味する。薬学的に許容可能な担体として作用する物質の非限定的な例をいくつか挙げると、ラクトースやグルコース、ショ糖などの糖；トウモロコシのデンプンやジャガイモのデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；麦芽；ゼラチン；タルク；さらに、ラウリル硫酸ナトリウムやステアリン酸マグネシウムなどのその他の無毒で融和性を有する潤滑剤；さらに、着色剤；放出剤；コーティング剤；甘味剤、香料添加剤、および、芳香剤；フェノリップ（ｐｈｅｎｏｌｉｐ）、メチルパラベン、ブチルパラベン、プロピルパラベンなどの防腐剤；抗酸化剤；蜜蝋、カルナウバ蝋、硬蝋、黄蝋、セチルエステルなどの油またはワックス；モノステアリン酸グリセリンなどの乳化剤；パラフィン、ラノリンアルコール、白色ワセリン、黄色ワセリン、羊毛アルコール、ワセリン（ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ ｊｅｌｌｙ）、石油ワックスなどのワセリン；プロピレングリコール、メチルグリコール、メチルエチレングリコールなどのグリコール；カルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標） ９７４Ｐ）などのカルボマー；セトステリル（ｃｅｔｏｓｔｅｒｙｌ）アルコールなどのポリオキシエチレンアルキルエーテル；トリエタノールアミンなどの可塑剤などがある。溶媒および親水性ゲル化剤も、組成物中において調合者の判断次第で存在可能である。

【0029】

本明細書で使用する「生物活性マーカー」という用語は、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物の全体またはその部分（例えば、茎（皮の付いた茎）、皮無しの茎、皮、小枝など）からの抽出物中に存在する生物学的活性を有する化学物質を指す。Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物の茎の抽出物から単離される生物活性マーカーは、抗ウイルス活性を示す。

【0030】

本明細書で使用する「被験体」という用語は、動物、具体的には哺乳動物、さらに具体的にはヒトを指す。本明細書で使用する「哺乳動物」という用語は、皮膚が毛で覆われていることと、雌において幼生に栄養を与えるために乳を生成する乳腺を有することとを特徴とする、ヒトを含めた哺乳綱の温血脊椎動物を指す。哺乳動物という用語には、例えば、ネコ、イヌ、ウサギ、クマ、キツネ、オオカミ、サル、シカ、マウス、ブタ、ヒトなどの動物が含まれる。

【0031】

Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物は、インドおよびスリランカにおいて広く分布する種である。この植物の全体またはその部分（例えば、茎、皮無しの茎、皮、小枝など）を、ベルガウム（Ｂｅｌｇａｕｍ）、コラープル（Ｋｏｌｈａｐｕｒ）、ゴア（Ｇｏａ）などのインドのマハラシュトラ州およびその周辺の各地で収集した。収集したばかりの該植物またはその一部を乾燥させた。分類学によって特定するために、開花中および結果中の押し葉標本を収集し、インドのムンバイのゴレガオン（Ｇｏｒｅｇａｏｎ）に所在するＰｉｒａｍａｌ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ社（旧Ｐｉｒａｍａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）の植物標本部門に寄託した。形態形質にもとづいて、この押し葉標本をＦｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａであると特定した。本発明において得られ、使用される抽出物は、インドのマハラシュトラ州において生育するＦｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物から得られる抽出物に限定されるものではなく、他の地域において生育する任意のＦｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａ植物から得られるものであってかまわない。

【0032】

本発明は、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物の粉砕した全体または１つ以上の部分を溶媒中において攪拌し、続いて、得られた抽出物を濃縮し、さらに随意的にこの抽出物を溶媒分離（ｓｏｌｖｅｎｔ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）によって濃縮することによって調製される、該植物の全体または１つ以上の部分からの単離抽出物に関する。使用可能な植物の部分としては、皮の付いた茎、皮無しの茎、皮、葉、小枝、根、花、花部、種子、果実などが挙げられる。使用される植物の部分は、茎（皮の付いた茎）、皮無しの茎、皮、および、小枝から選択されることが好ましい。

【0033】

また、本発明は、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物の全体または１つ以上の部分からの治療上有効な量の単離抽出物を、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて包含する組成物にも関する。

【0034】

また、本発明は、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの抽出物の調製プロセス、および、この抽出物を有効成分として包含する組成物の調製プロセスにも関する。

【0035】

上記組成物の調製プロセスは、
（ａ）溶媒中において１：８〜１：１０の重量／体積比で、３０℃〜５０℃で３時間〜１２時間攪拌することによって、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物の粉砕した全体または１つ以上の部分から抽出物を調製するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において得られた抽出物を濃縮するステップと、
（ｃ）随意的に、ステップ（ｂ）において得られた抽出物を、高真空下（０．０１〜５ｍｍＨｇ）で乾燥させるステップと、
（ｄ）随意的に、ステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）において得られた抽出物を溶媒分離によって濃縮するステップと、
（ｅ）ステップ（ｂ）、ステップ（ｃ）、または、ステップ（ｄ）において得られた抽出物を薬学的に許容可能な担体と混合し、上記組成物を得るステップとを含む。

【0036】

本発明の一態様において、ステップ（ｂ）、ステップ（ｃ）、または、ステップ（ｄ）において得られた抽出物は、薬学的に許容可能な担体を用いずに使用されてもかまわない。

【0037】

本発明の別の態様において、上記植物の部分は、茎、皮、皮無しの茎、および、小枝から選択される。

【0038】

一実施形態において、本発明の組成物は、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物の茎からの抽出物を包含する。これに応じて、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物の茎からの抽出物を包含する組成物の調製プロセスが提供される。この調製プロセスは、
（ａ）溶媒中において１：８〜１：１０の重量／体積比で、３０℃〜５０℃で３時間〜１２時間攪拌することによって、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物の茎からの抽出物を調製するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において得られた抽出物を濃縮するステップと、
（ｃ）随意的に、ステップ（ｂ）において得られた抽出物を、高真空下（０．０１〜５ｍｍＨｇ）で乾燥させるステップと、
（ｄ）随意的に、ステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）において得られた抽出物を溶媒分離によって濃縮するステップと、
（ｅ）ステップ（ｂ）、ステップ（ｃ）、または、ステップ（ｄ）において得られた抽出物を薬学的に許容可能な担体と混合し、治療用剤として調合するステップとを含む。

【0039】

本発明の一態様において、ステップ（ｂ）、ステップ（ｃ）、または、ステップ（ｄ）において得られた抽出物は、薬学的に許容可能な担体を用いずに使用されてもかまわない。

【0040】

Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物の上記全体または１つ以上の部分は、粉砕されてもかまわない。また、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物の上記全体または１つ以上の部分は、粗く粉砕されても、粉末になるまで粉砕されても、または、これ以外の種類の生地になるように粉砕されてもかまわない。

【0041】

本発明の一実施形態において、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物の粉砕した全体または１つ以上の部分を抽出するための上記溶媒は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、アセトン、酢酸エチル、ジクロロメタン、水、または、これらの混合物から選択され、好ましくはメタノールと水との混合物である。

【0042】

本発明の一実施形態において、上記溶媒抽出物は濃縮前に濾過される。

【0043】

本発明の一実施形態において、上記溶媒抽出物の濃縮は、（ｉ）３０℃〜５０℃での減圧下（１５０〜６００ｍｍＨｇ）における蒸留法、（ｉｉ）凍結乾燥法、および、（ｉｉｉ）噴霧乾燥法から選択される１つ以上の方法を用いて行われて、抽出物が得られる。

【0044】

本発明の一実施形態において、溶媒分離によって抽出物を濃縮するための上記溶媒は、水、石油エーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、メタノール、アセトン、アセトニトリル、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、および、ブタノール、または、これらの混合物から選択される。

【0045】

本発明の一態様において、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物の全体または１つ以上の部分からの抽出物から、１つ以上の生物活性マーカーが単離される。

【0046】

本発明の一実施形態では、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの抽出物中において、２つの生物活性マーカーが特定される。これらの生物活性マーカーは該抽出物から単離され、具体的にはフロリジンおよび５，７，４’−トリヒドロキシフラボンであると特定される。

【0047】

本発明の別の一実施形態では、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの抽出物を包含する組成物から、２つの生物活性マーカーが単離される。これらの生物活性マーカーは、フロリジンおよび５，７，４’−トリヒドロキシフラボンであると特定される。

【0048】

これに応じて、一態様において、本発明は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）によって引き起こされるウイルス感染症の予防および治療において使用するための、１つ以上の生物活性マーカーを含有する、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの治療上有効な量の抽出物を包含する組成物に関する。

【0049】

一実施形態において、上記抽出物中に含有される生物活性マーカーは、フロリジンおよび５，７，４’−トリヒドロキシフラボン、または、これらの混合物である。

【0050】

一実施形態において、本発明は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）によって引き起こされるウイルス感染症の治療において使用するための、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの抽出物から単離される生物活性マーカーであって、このＨＳＶがＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２であってもよく、フロリジン、５，７，４’−トリヒドロキシフラボン、または、これらの混合物から選択される生物活性マーカーに関する。

【0051】

また、本発明は、被験体において単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）によって引き起こされるウイルス感染症の治療方法であって、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの治療上有効な量の単離抽出物を包含する組成物を被験体に投与することを含む治療方法にも関する。

【0052】

また、本発明は、被験体においてＨＳＶによって引き起こされるウイルス感染症の治療方法であって、このＨＳＶがＨＳＶ−１であって、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの治療上有効な量の単離抽出物を包含する組成物を被験体に投与することを含む治療方法にも関する。

【0053】

さらに、本発明は、被験体においてＨＳＶによって引き起こされるウイルス感染症の治療方法であって、このＨＳＶがＨＳＶ−２であって、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの治療上有効な量の単離抽出物を包含する組成物を被験体に投与することを含む治療方法にも関する。

【0054】

さらに、本発明は、ＨＳＶによって引き起こされるウイルス感染症の予防および治療において使用するための、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの治療上有効な量の単離抽出物を薬学的に許容可能な担体と組み合わせて包含する組成物にも関する。

【0055】

さらに、本発明は、ＨＳＶによって引き起こされるウイルス感染症の予防および治療において使用するための、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの治療上有効な量の単離抽出物を薬学的に許容可能な担体と組み合わせて包含する組成物であって、このＨＳＶがＨＳＶ−１である組成物にも関する。

【0056】

さらに、本発明は、ＨＳＶによって引き起こされるウイルス感染症の予防および治療において使用するための、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの治療上有効な量の単離抽出物を薬学的に許容可能な担体と組み合わせて包含する組成物であって、このＨＳＶがＨＳＶ−２である組成物にも関連する。

【0057】

また、本発明は、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの治療上有効な量の単離抽出物を薬学的に許容可能な担体と組み合わせて、ウイルス感染症の治療のための治療薬を製造する用途に用いる使用方法にも関する。

【0058】

本発明の一態様において、治療対象または使用対象となる被験体は哺乳動物であって、具体的にはウイルスによって引き起こされる感染症に罹っていると診断されたヒトである。さらに具体的には、治療対象となる哺乳動物は、ＨＳＶによって引き起こされる感染症に罹っていると診断されたヒトである。

【0059】

本発明の別の一態様において、治療対象となる被験体は哺乳動物であって、具体的にはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染していると診断された、ＨＳＶ−１との同時感染に対する予防措置として上記組成物が投与されるヒトである。

【0060】

本発明のさらに別の一態様において、治療対象となる被験体は哺乳動物であって、具体的にはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染していると診断された、ＨＳＶ−２との同時感染に対する予防措置として上記組成物が投与されるヒトである。

【0061】

本発明のさらに別の一態様において、治療対象となる哺乳動物は、性感染症（ＳＴＩ）に対する予防措置として上記組成物が投与されるヒトである。

【0062】

本発明の別の一態様において、治療対象となる被験体は哺乳動物であって、具体的にはＨＳＶによって引き起こされる回帰感染症に罹っていると診断されたヒトである。

【0063】

本発明において、本発明の組成物を、例えば、アシクロビル、ファムシクロビル、ガンシクロビル、イムノビル、インジナビル、または、オセルタミビルなどの別の抗ウイルス薬と組み合わせて使用してもかまわない。

【0064】

本発明の一態様において、ウイルス感染症の治療方法は、上述の組成物を以下に記載するものを含めた公知の投与経路によって投与することを含む。

【0065】

上記組成物は、例えば、丸剤、錠剤、コーティングされた錠剤、カプセル、顆粒、溶液、エリキシル剤、シロップなどの形態で経口的に投与されてもかまわない。

【0066】

本発明によれば、経口投与用に調合された組成物（経口用調合物）は、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの上記抽出物を約５重量％〜約９９重量％包含する。この経口用調合物は、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの上記抽出物を、例えば、糖、デンプン、潤滑剤などの従来のベースとよく混合することによって調製される。

【0067】

上記組成物は局所投与または経皮投与されてもかまわない。本発明の局所投与用組成物としては、皮膚への局所適用または経皮適用に適した調合物、粘膜への投与に適した調合物、コンドームなどの障壁具とともに併用する投与に適した調合物などが挙げられる。上記組成物を調合して、さまざまな生成物の種類を生成してもかまわない。このさまざまな生成物の種類としては、ローション、クリーム、ゲル、ステック、パッチ、膣坐薬、ペッサリー、スプレー、軟膏などが挙げられるが、これらの例に限定されるものではない。

【0068】

本発明によれば、局所適用または経皮適用のために調合された組成物は、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの上記抽出物を約５重量％〜約９９重量％、好ましくは５重量％〜５０重量％包含する。上記局所投与用調合物または経皮投与用調合物は、Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの抽出物を、例えば油、ワックス、グリコールなどの従来のベースと混合することによって調製される。

【0069】

Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの上記抽出物は、ある具体的な患者に対して所望の治療上の反応を達成することができ、かつ、その患者にとって有毒性を有していたり重篤な副作用を引き起こしたりすることがない効果的な量で、本発明の組成物中に包含されている。この効果的な量は、使用する本発明の抽出物の効力、投与経路、投与時刻、使用する具体的な組成物の排泄速度、治療期間、治療を受ける患者の年齢、性別、体重、病状、体調、既往歴などの、医療分野において周知の因子を含めた種々の因子に依存する。

【0070】

Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの抽出物の効力は、以下の実施例において詳細に記載する生物検定によって確認した。これらの実施例は、本明細書において例示を目的として提示されるものにすぎないのであって、本発明の技術的範囲を限定することを意図とするものではない。

【実施例】

【0071】

（注意： 実験プロトコールで使用した水は脱塩水である）
〔実施例１〕
Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａからのジクロロメタン（ＤＣＭ）およびメタノール（１：１）抽出物の調製
Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａの収集したばかりの茎を、除湿器を用いて乾燥させ、粉砕した。４０℃±５℃で維持した水浴中に設置した丸底フラスコ中で、等速で攪拌しながら、この粗く粉砕した物質（１５０ｇ）を１５００ｍＬのＤＣＭ／メタノール（１：１）に３時間浸した。抽出物を濾過した。残留物を４０℃±５℃で１５００ｍＬのＤＣＭ／メタノール（１：１）に３時間浸し、抽出物を濾過した。これらの抽出物を混ぜ合わせ、ロータリーエバポレーターを真空ラインと併用して（約５００ｍｍＨｇ）４５℃で濃縮して、５．０ｇの粗抽出物を得た（試料１とする）。

【0072】

茎、皮、皮無しの茎、小枝などの植物の他の部分からのＤＣＭ／メタノール（１：１）抽出物を、茎の場合と同じ手順で調製した。各抽出物の収率を次に示す。
（ｉ）５０ｇの皮からは２．５ｇの抽出物が得られた（試料２とする）。
（ｉｉ）５０ｇの皮無しの茎からは２．０ｇ抽出物が得られた（試料３とする）。
（ｉｉｉ）３００ｇの小枝からは１６．３ｇの抽出物が得られた（試料４とする）。

【0073】

〔実施例２〕
実施例１の試料１、試料２、試料３、試料４の濃縮
ステップ１
試料１（１ｇ）を３０ｍＬの水／メタノール（９：１）中において室温（２５℃±５℃）で懸濁および超音波処理して溶解させ、３０ｍＬの石油エーテルを用いて３回続けて溶媒分離した（６０℃〜８０℃）。ロータリーエバポレーターを真空ラインと併用して石油エーテルの層を濃縮して、０．５ｇの石油エーテル画分を得た（試料５とする）。

【0074】

ステップ２
ステップ１から得られた水性濾液を、３０ｍＬのクロロホルムを用いて３回続けて溶媒分離した。ロータリーエバポレーターを真空ラインと併用してクロロホルム層を濃縮して、０．１０ｇのクロロホルム画分を得た（試料６とする）。

【0075】

ステップ３
次に、ステップ２から得られた水層を、３０ｍＬの酢酸エチルを用いて３回続けて溶媒分離した。ロータリーエバポレーターを真空ラインと併用して酢酸エチル層を濃縮して、０．０７ｇの酢酸エチル画分を得た（試料７とする）。

【0076】

ステップ４
次に、ステップ３から得られた水層を、ロータリーエバポレーターを真空ラインと併用して濃縮して残留有機溶剤を除去して凍結乾燥し、０．２４ｇの水性画分を得た（試料８とする）。

【0077】

茎、皮、皮無しの茎、小枝などの植物の他の部分からの抽出物の濃縮を、茎からの抽出物の場合と同じ方法で実施した。各抽出物の収率を次に示す。
（ｉ）１ｇの試料２を濃縮すると、０．０６ｇの石油エーテル画分（試料９とする）と、０．１６ｇのクロロホルム画分（試料１０とする）と、０．０７ｇの酢酸エチル画分（試料１１とする）と、０．２４ｇの水性画分（試料１２とする）とが得られた。
（ｉｉ）１ｇの試料３を濃縮すると、０．２１ｇの石油エーテル画分（試料１３とする）と、０．１９ｇのクロロホルム画分（試料１４とする）と、０．２９ｇの酢酸エチル画分（試料１５とする）と、０．２８ｇの水性画分（試料１６とする）とが得られた。
（ｉｉｉ）１ｇの試料４を濃縮すると、０．６４ｇの石油エーテル画分（試料１７とする）と、０．１５ｇのクロロホルム画分（試料１８とする）と、０．０３ｇの酢酸エチル画分（試料１９とする）と、０．０８ｇの水性画分（試料２０とする）とが得られた。

【0078】

〔実施例３〕
Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からのメタノール抽出物の調製
Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａの収集したばかりの茎を乾燥させ、粉砕した。４０℃±５℃で維持した水浴中に設置した丸底フラスコ中で、攪拌しながら、この粗く粉砕した物質（５０ｇ）を５００ｍＬのメタノールに３時間浸した。抽出物を濾過した。残留物を４０℃±５℃で５００ｍＬのメタノールに３時間浸し、抽出物を濾過した。これらの抽出物を混ぜ合わせ、ロータリーエバポレーターを真空ラインと併用して濃縮して、２．０６ｇの抽出物を得た（試料２１とする）。

【0079】

Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物の小枝のメタノール抽出物を、茎の場合と同じ手順で調製した。５０ｇの小枝から、３．９５ｇの抽出物が得られた（試料２２とする）。

【0080】

〔実施例４〕
Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からのメタノール／水（１：１）抽出物の調製
Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａの収集したばかりの茎を乾燥させ、粉砕した。４０℃±５℃で維持した水浴中に設置した丸底フラスコ中で、等速で攪拌しながら、この粗く粉砕した物質（１００ｇ）を１Ｌのメタノール／水（１：１）に３時間浸した。抽出物を濾過した。残留物を４０℃±５℃で８００ｍＬのメタノール／水（１：１）に３時間浸し、抽出物を濾過した。これらの抽出物を混ぜ合わせ、ロータリーエバポレーターを真空ラインと併用して濃縮して凍結乾燥し、５．６７ｇのハイドロメタノール抽出物を得た（試料２３とする）。

【0081】

Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物の小枝からのハイドロメタノール抽出物を、茎の場合と同じ手順で調製した。５０ｇの小枝から４．０３ｇの抽出物が得られた（試料２４とする）。

【0082】

〔実施例５〕
Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物からの水抽出物の調製
Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａの収集したばかりの茎を乾燥させ、粉砕した。４５℃±５℃で維持した水浴中に設置した丸底フラスコ中で、等速で攪拌しながら、この粗く粉砕した物質（５０ｇ）を５００ｍＬの水に３時間浸した。抽出物を濾過して凍結乾燥し、１．０４ｇの抽出物を得た（試料２５とする）。

【0083】

Ｆｉｃｕｓ ａｒｎｏｔｔｉａｎａという植物の小枝からの水抽出物を、茎の場合と同じ手順で調製した。５０ｇの小枝から１．１１ｇの抽出物が得られた（試料２６とする）。

【0084】

〔実施例６〕
調合物の調製
クリームの調製の一般的な手順
わずかに加熱した適切なガラス／ステンレス鋼製容器内において、必要量のメチルパラベンおよびプロピルパラベンを、プロピレングリコールおよび水に溶解させた（表１を参照）。実施例４の試料２３を該容器に加え、機械的な攪拌機を用いて溶解／分散させた。温度は６０℃〜７５℃で維持した。等速で攪拌しながら、この溶液にモノステアリン酸グリセリンおよびプロピレングリコールを加えた。蜜蝋、白色軟質パラフィン、および、モノステアリン酸グリセリンを融解させて、等速で攪拌しながら上記容器に加えた。温度を室温までゆっくりと下げた。

【0085】

表１：調合物ＩＡ、調合物ＩＢ、調合物ＩＣ

【0086】

【表1】

【0087】

〔実施例７〕
分析的分析
第１部 実施例４の試料２３の評価
実施例４の試料２３（１００ｍｇ）を１ｍＬのメタノール／水（１：１）に溶解させ、１ｍＬの０．０４ＭのＫＭｎＯ₄で処理し、室温で１５分間保存した。この混合物を希釈液（メタノール／水（１：１））で希釈し、０．４５μのポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）製フィルタで濾過し、濾液をＨＰＬＣによって分析した。

【0088】

分析に際するＨＰＬＣの諸条件
カラム： Ｕｎｉｓｐｈｅｒｅ ａｑｕａ Ｃ１８型、１５０×４．６ｍｍ、３μｍ
移動相Ａ： ０．１％のトリフルオロ酢酸
移動相Ｂ： アセトニトリル
勾配： 時間（分）／％Ａ： ０／９０、２５／６０、３０／２０、３５／２０、３６／９０、４０／９０
作動時間： ４０分
濃度： １０ｍｇ／ｍＬ
希釈液： メタノール／水（１：１）
波長： ２７０ｎｍ

【0089】

結果
図１は、実施例４の試料２３の分析用クロマトグラムを示している。このクロマトグラムは、保持時間１４．３および２１．８においてＢＭ１（生物活性マーカー１）およびＢＭ２（生物活性マーカー２）の２つの生物活性マーカーのピークを示す。いずれの生物活性マーカーも抗ウイルス活性を示した。ＢＭ１およびＢＭ２を単離し、第３部に記載するように精製した。

【0090】

第２部
実施例６の調合物ＩＢの評価
実施例６の調合物ＩＢ（１ｇ）を１５ｍＬのメタノール／水（１：１）に溶解させ、６０℃で２０分間加熱した。この結果得られた溶液を上記希釈液で２０ｍＬまで希釈し、０．４５μのポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）製フィルタで濾過し、濾液をＨＰＬＣによって分析した。

【0091】

分析に際するＨＰＬＣの諸条件
カラム： Ｕｎｉｓｐｈｅｒｅ ａｑｕａ Ｃ１８型、１５０×４．６ｍｍ、３μｍ
移動相Ａ： ０．１％のトリフルオロ酢酸
移動相Ｂ： アセトニトリル
勾配： 時間（分）／％Ａ： ０／９０、２５／６０、３０／２０、３５／２０、３６／９０、４０／９０
作動時間： ４０分
濃度： ５０ｍｇ／ｍＬ
希釈液： メタノール／水（１：１）
波長： ２７０ｎｍ

【0092】

結果
図２は、実施例６の調合物ＩＢの分析用クロマトグラムを示している。このクロマトグラムは、保持時間１４．３および２１．８においてＢＭ１およびＢＭ２の２つの生物活性マーカーのピークを示す。いずれの生物活性マーカーも抗ウイルス活性を示した。ＢＭ１およびＢＭ２を単離し、第３部に記載するように精製した。

【0093】

第３部
生物活性マーカーの単離
実施例４の試料２３（８５．０ｇ）を１．６Ｌのメタノールに溶解させ、１０分間超音波処理し、３０分間放置して沈殿させた。上清をデカントし濾過して、濾液１を得た。不溶性部は２００ｍＬのメタノールで洗浄し、上清は濾過して濾液２を得た。濾液１および濾液２をロータリーエバポレーターにプールして乾燥させ、２６．１８ｇの試料を得た。得られた試料のうち１３．０ｇを３６ｍＬのメタノール／水（７５：２５； ｖ：ｖ）に溶解させ、超音波処理および遠心分離した。上清をＬＨ−２０型カラム（５×８０ｃｍ）に仕込み、メタノール：水（７５：２５； ｖ：ｖ）で溶出させた。同じ試料の１３．０ｇの別のバッチを、上述の手順で処理した。どちらの画分も収集して、ＨＰＬＣによって分析した。

【0094】

分析に際するＨＰＬＣの諸条件
カラム： Ｕｎｉｓｐｈｅｒｅ、Ｃ１８型、２５０×４．６ｍｍ、５μｍ
移動相Ａ： ０．１％のトリフルオロ酢酸
移動相Ｂ： アセトニトリル
勾配： 時間（分）／％Ａ： ０／９０、３０／２０、３５／２０、３６／９０、４０／９０
作動時間： ４０分
注入体積： １０μＬ
波長： ２７０ｎｍ

【0095】

２つのＬＨ−２０型カラムから得られた各画分をプールし、真空下４０℃で乾燥するまで濃縮し、１００ｍｇの生物活性マーカー１と１３５ｍｇの生物活性マーカー２とを得た。生物活性マーカー１および生物活性マーカー２の乾燥試料をそれぞれ別々にＣ−１８フラッシュクロマトグラフィーにかけて、さらに精製した。

【0096】

フラッシュクロマトグラフィーの際のクロマトグラフィーの諸条件
カラム： Ｒｅｄｉｓｅｐ Ｃ１８型、１４×２ｃｍ
移動相Ａ： ０．１％のトリフルオロ酢酸
移動相Ｂ： アセトニトリル
勾配： 時間（分）／％Ａ： ０／９０、３０／２０、３５／２０、３６／９０、４０／９０
流量： ３０ｍＬ／分
波長： ２７０ｎｍ

【0097】

生物活性マーカー１
フラッシュクロマトグラフィーの各画分をＨＰＬＣによってモニタリングした。生物活性マーカー１を含む画分をプールし、真空下４０℃で乾燥するまで蒸発させて、３０ｍｇの半純粋（ｓｅｍｉｐｕｒｅ）な生物活性マーカー１を得た。これを、シリカ系カラムを用いた半分取ＨＰＬＣによってさらに精製し、５．３ｍｇの生物活性マーカー１を得た。実施例４の試料２３中に、生物活性マーカー１は０．０２％〜０．８％の範囲で存在する。

【0098】

シリカ系カラムを用いた半分取ＨＰＬＣの際のクロマトグラフィーの諸条件
カラム： Ｇｒａｃｅ Ｓｉｌｉｃａ社製、５μ（２５０×１０ｍｍ）
移動相： メタノール／ジクロロメタン（１０：９０）； ｖ：ｖ
流量： ５ｍＬ／分
波長： ２７０ｎｍ
試料濃度： ２０ｍｇ／ｍＬ

【0099】

質量分析およびＮＭＲ分析によるデータにもとづいて、生物活性マーカー１はフロリジンであると特定した。フロリジンの分子式はＣ₂₁Ｈ₂₄Ｏ₁₀であり、分子量は４３６．４１である。

【0100】

生物活性マーカー２
フラッシュクロマトグラフィーの各画分をＨＰＬＣによってモニタリングした。各画分から生物活性マーカー２の結晶が得られた。これらの結晶をデカンテーションによって分離して乾燥させ、２０ｍｇの生物活性マーカー２を得た。質量分析およびＮＭＲ分析によるデータにもとづいて、生物活性マーカー２は５，７，４’−トリヒドロキシフラボンであると特定した。５，７，４’−トリヒドロキシフラボンの分子式はＣ₁₅Ｈ₁₀Ｏ₅であり、分子量は２７０．０５である。実施例４の試料２３中に、生物活性マーカー２は０．０１％〜０．１％の範囲で存在する。

【0101】

生物学的評価
インビトロ抗ウイルスアッセイ
〔実施例８〕
ウイルスストックの調製
使用物質
細胞株： ベロ（アフリカミドリザルの腎細胞株の腎臓の上皮細胞、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）ＣＣＬ−８１）
ウイルス： ＨＳＶ−１（ＡＴＣＣ株であるＶＲ−１４９３、および、インド、ピューンのＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙから入手した臨床株）
： ＨＳＶ−２（ＡＴＣＣ株であるＶＲ−７３４、および、インド、ピューンのＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙから入手した臨床株）
培地： Ｄｕｌｂｅｃｃｏ社、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、米国、Ｃａｔ．番号： １２４３０）
血清： ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、米国、Ｃａｔ．番号： １６０００−０４４）
トリプシン−ＥＤＴＡ溶液： ０．２５％のトリプシン−エチレンジアミン四酢酸（トリプシン−ＥＤＴＡ、Ｇｉｂｃｏ、米国、Ｃａｔ．番号： ２５２００）
標準化合物： アシクロビル（Ｍｅｄｉｃｏｒｐ社、インド、ハイデラバード）
プラスチック器具： 組織培養フラスコ、２５ｃｍ²（Ｎｕｎｃ社、米国、Ｃａｔ．番号： １５６３６７）
： 組織培養フラスコ、７５ｃｍ²（Ｎｕｎｃ社、米国、Ｃａｔ．番号： １５６４９９）
： 遠心管、１５ｍＬ（Ｎｕｎｃ社、米国、Ｃａｔ．番号： ３６６０６０）
： 遠心管、５０ｍＬ（Ｎｕｎｃ社、米国、Ｃａｔ．番号： ３７３６８７）
： ９６ウェルの平底プレート（Ｎｕｎｃ社、米国、Ｃａｔ．番号： １６７００８）
染色剤： クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ社、米国、Ｃａｔ．番号：Ｃ３８８６−２５Ｇ）
抗菌性／抗真菌性混合物： ３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（Ｇｉｂｃｏ、米国、Ｃａｔ．番号： １５２４０）
（ＭＴＴ）試薬： （Ｔｒｅｖｉｇｅｎ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州、Ｃａｔ．番号： ４８９０−２５−０１）
洗浄剤： （Ｔｒｅｖｉｇｅｎ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州、Ｃａｔ．番号： ４８９０−２５−０２）

【0102】

ステップ１
細胞株の維持
Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，６７，２４−３０に記載されているようにして、細胞株を維持した。なお、この文献に記載の手順については参照によって本明細書に引用されるものとする。

【0103】

ＡＴＣＣから得られたベロ細胞株を、完全増殖培地、つまり、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と１×の抗菌性／抗真菌性混合物とを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ社のＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）において増殖させた。継代培養には、細胞の単層を仕込んだＴ−２５組織培養フラスコを選択した。フラスコのＤＭＥＭを除去し、血清を含まないＤＭＥＭで短時間洗浄して、トリプシンインヒビターを包含する微量な血清をすべて除去した。１ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液をフラスコに加えて、細胞の単層が分散するまで（通常、３〜５分間以内）倒立顕微鏡で観察した。ただちに１４ｍＬの完全増殖培地を加え、ピペットを使用して細胞を穏やかに吸引した。３つの別々のＴ−２５組織培養フラスコに５ｍＬの細胞懸濁液をそれぞれ加えることによっても１：３の継代培養比が得られた。フラスコを５％のＣＯ₂下において３７℃で維持した。

【0104】

ステップ２
ウイルス（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）の増殖
Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，６７，２４−３０に記載されているようにして、ウイルスを増殖させた。なお、この文献に記載の手順については参照によって本明細書に引用されるものとする。

【0105】

ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２をベロ細胞において増殖させた。簡潔に記載すると、ベロ細胞を、１０％のＦＢＳ、ペニシリン、および、ストレプトマイシン（完全培地）を補充したＤＭＥＭ中において、５％のＣＯ₂下において３７℃で生育させた。細胞の培養密度が８０〜９０％に達したら、得られた単層をそのままのＤＭＥＭを用いて洗浄し、適切なウイルス希釈液に感染させた。５％のＣＯ₂下において３７℃で１時間、ウイルスを単層に吸着させた。１時間後に、ウイルスの接種材料を除去し、２％のＦＢＳを補充した１０ｍＬのＤＭＥＭを加え、細胞の単層が完全に破壊されるまで、フラスコをさらに４８時間インキュベートした。フラスコを１日に２回顕微鏡で観察して、細胞変性効果（ＣＰＥ）が見られるかどうかを確認した。ＣＰＥとは細胞形態における変化であり、例えば、ウイルスによって引き起こされる、細胞の珠化や拡大、融合細胞や封入体の形成などである。インキュベーションを４８時間行った後、次に、フラスコを２〜３回の凍結解凍サイクルに付し、細胞を完全に溶解させて、ウイルスを培地中へ放出させた。細胞片を、１０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離を１０分間行うことによって除去した。得られた上清を部分標本として−８０℃で保存した。ウイルスストックのタイターを以下の方法で決定した。

【0106】

ステップ３（Ａ）
細胞変性効果（ＣＰＥ）アッセイによるウイルスのタイターの決定
Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，２００６，１２：４０７８−４０８１に記載されているようにして、アッセイを行った。なお、この文献に記載の手順については参照によって本明細書に引用されるものとする。

【0107】

ウイルスのタイターをＣＰＥアッセイによって決定して、組織培養感染量５０（ＴＣＩＤ₅₀）で表わした。（ステップ１で得られた）ベロ細胞を、２×１０⁴個／１００μＬ／ウェルの細胞密度で９６ウェルのプレートに播種し、次に、５％のＣＯ₂下において３７℃で２４時間インキュベートして、８０〜９０％の培養密度を得た。（ステップ２で得られた）ウイルスストックを維持培地（２％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ）中において段階希釈（１０^-1〜１０^-8）した。増殖培地を培養プレートから除去し、各ウイルス希釈液１００μＬを使用してベロ細胞を感染させた。ベロ細胞を維持培地のみと組み合わせたものを細胞コントロールとした。感染後、培養プレートを、ＣＯ₂恒温器中で３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベーションを４８時間行った後、ウイルス希釈液を播種したウェル中において倒立顕微鏡でＣＰＥを調べた。ウイルスコントロールが最大ＣＰＥを示したときに、培地を除去し、感染済み単層を固定し、ホルマリン（１０％）およびクリスタルバイオレット（１％）を含有する溶液を用いて３０分間染色した。この３０分の経過時に、染色液を吸引除去し、過剰な染色液をすべて洗い流すまで、蒸留水を用いてプレートを洗浄した。このプレートを一晩放置して乾燥させた。Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．，１９３８，２７，４９３−４９７に記載されているようにして、ウイルスのタイター（ＴＣＩＤ₅₀）を算出した。ＴＣＩＤ₅₀とは、播種済み培養物の５０％においてＣＰＥを発生させる投与量を表わすものである。

【0108】

結果
ＣＰＥアッセイによって決定したＨＳＶ−１のウイルスのタイターは、５．８８×１０⁶ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬであった。

【0109】

ＣＰＥアッセイによって決定したＨＳＶ−２のウイルスのタイターは、１．５８×１０⁷ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬであった。

【0110】

ステップ３（Ｂ）
プラークアッセイによるウイルスのタイターの決定
Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，２００５，６７（１）：２４−３０に記載されているようにして、アッセイを行った。なお、この文献に記載の手順については参照によって本明細書に引用されるものとする。

【0111】

ウイルスのタイターをプラークアッセイによっても決定して、１ｍＬ当たりのプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍＬ）で表わした。（ステップ１で得られた）ベロ細胞をトリプシン化して勘定し、２×１０⁵個／ｍＬ／ウェルの細胞密度で２４ウェルのプレートに播種し、５％のＣＯ₂下において３７℃で２４時間インキュベートして、８０〜９０％の培養密度を得た。ウイルス（ステップ２で得られたウイルスストック）の段階希釈液を、維持培地（２％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ）を用いて１０^-2〜１０^-7の範囲で調製した。増殖培地をプレートから除去し、細胞を溢れさせないように注意しながら、各ウイルス希釈液０．２ｍＬを各ウェルに加えた。感染済み単層を５％のＣＯ₂下において３７℃で、１５分ごとに振りながら１時間インキュベートした。インキュベーションの期間後、体積が１ｍＬの１％ＣＭＣを各ウェルに加え、プレートを４８時間インキュベートし、その後、細胞を固定し、ホルマリン（１０％）およびクリスタルバイオレット（１％）を含有する溶液を用いて３０分間染色した。この３０分の経過時に、染色液を吸引除去し、過剰な染色液をすべて洗い流すまで、蒸留水を用いてプレートを洗浄した。これらのプレートを一晩放置して乾燥させた。プラークを勘定し、ウイルスのタイターを推定して１ｍＬ当たりのプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍＬ）で表わした。

【0112】

ウイルスのタイター ＝
（生成されたプラークの個数 × ウイルスの希釈度 × 接種材料の体積）

【0113】

結果
プラークアッセイによって決定したＨＳＶ−１のウイルスのタイターは、２．１×１０⁸ｐｆｕ／ｍＬであった。

【0114】

プラークアッセイによって決定したＨＳＶ−２のウイルスのタイターは、１．６５×１０⁷ｐｆｕ／ｍＬであった。

【0115】

〔実施例９〕
ＣＰＥ阻害アッセイ（クリスタルバイオレット染色法）により、一次抗ウイルススクリーニング検査を実施した
このアッセイは、ウイルスの生殖周期のどの段階においても活性を示す薬剤（この場合には抽出物）を検出するために設計した。Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｍｅｄ． Ｒｅｓ．，２００４，１２０：２４−２９に記載されているようにして、アッセイを行った。なお、この文献に記載の手順については参照によって本明細書に引用されるものとする。

【0116】

（実施例８のステップ１で得られた）ベロ細胞を、９６ウェルのプレートにおいて１×１０⁴個／ウェルの細胞密度で増殖させ、ＣＯ₂恒温器中で３７℃で２４時間インキュベートして、単層を形成した。試料１〜２６を、５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの濃度（２％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭを用いて、２０ｍｇ／ｍＬの抽出物のＤＭＳＯストックを５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬまで希釈した）で最終的な培養物の体積を２００μＬ／ウェルとなるように加えることによって、試験を行った。例えば、ベロ細胞のみ（細胞コントロール）、ベロ細胞とウイルス（ウイルスコントロール）、ベロ細胞とウイルスと標準化合物であるアシクロビル（市販の抗ウイルス薬）などの、適切なコントロールを含めた。ＨＳＶ−１に対しては１２．５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、３．１２５μｇ／ｍＬ、１．５μｇ／ｍＬ、および、０．７８μｇ／ｍＬ、また、ＨＳＶ−２に対しては２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、および、３．１２５μｇ／ｍＬの濃度（２％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭを用いて、２０ｍｇ／ｍＬのアシクロビルのＤＭＳＯストックを１００μｇ／ｍＬまで希釈した）で、アシクロビルに対して試験を行った。最大感度が得られるように、また、例えば吸着や侵入などの初期の増殖ステップの有望な阻害剤についての暫定的な理解が得られるように、アッセイの対象となる抽出物を感染の１時間前に加えた。１時間後に、実施例８ステップ２で得られたウイルスストックを用いて、１ウェル当たり１００μＬの適切なウイルス投与量に（ＨＳＶ−１は１０⁴ＴＣＩＤ₅₀の感染効率（ＭＯＩ）で、ＨＳＶ−２は１０³ＴＣＩＤ₅₀のＭＯＩで）細胞を感染させた。維持培地（２％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ）を用いて、感染細胞をさらに４８〜５０時間インキュベートした。ウイルスコントロールが最大ＣＰＥを示したときに、培地を吸引して細胞を０．８５％の生理食塩水で洗浄し、続いて、０．１％のクリスタルバイオレット溶液を用いて３０分間染色した。染色液を吸引除去し、過剰な染色液をすべて洗い流すまで、蒸留水を用いてプレートを洗い流した。これらのプレートを２４時間放置して乾燥させた。プラークを染色した後に、ＣＰＥを視覚的および顕微鏡で評価し、コントロールと比較してＣＰＥ阻害の割合（％）によって段階分けした。得られた結果を表２に示す。

【0117】

【表2】

【0118】

アシクロビルについて得られた結果を表３に示す。

【0119】

【表3】

【0120】

上記表２および表３において使用した記号の意味を次に記す。

【0121】

記号 ＣＰＥ阻害率（％） 記号 ＣＰＥ阻害率（％）
ｎｄ 実施せず − ０〜１０％
＋ １１〜２５％ ＋＋ ２６〜５０％
＋＋＋ ５１〜７５％ ＋＋＋＋ ７６〜１００％

【0122】

〔実施例１０〕
ＣＰＥ阻害アッセイ、ＭＴＴ法
ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のいずれについても投与量に対する良好な反応性を示した抽出物について、ＩＣ₅₀を決定した。ＩＣ₅₀はＣＰＥ阻害アッセイ（ＭＴＴ法）によって推定した。

【0123】

このアッセイは、ウイルスの生殖周期のどの段階においても作用する薬剤（この場合には抽出物）を検出するために設計した。Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，２００６，１２：４０７８−４０８１に記載されているようにして、アッセイを行った。なお、この文献に記載の手順については参照によって本明細書に引用されるものとする。

【0124】

このアッセイは、クリスタルバイオレット染色液を用いて細胞を染色することはせずに３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを実施したこと以外は、実施例９にＣＰＥ阻害アッセイ染色法について記載したように実施した。９６ウェルの平底プレートに入れた（実施例８のステップ１で得られる）ベロ細胞を、実施例１の試料１またはアシクロビルを含有する維持培地（２％のＦＢＳを用いて補充したＤＭＥＭ）を用いて１時間処理した。次に、（実施例８のステップ２で得られるウイルスストックを用いて）細胞を、１００ＴＣＩＤ₅₀のＭＯＩでウイルスに感染させた。３７℃で４８時間インキュベインキュベートした後に、ＭＴＴアッセイによって生細胞を測定した（９６ウェルのプレートのＥＬＩＳＡ読み取り装置を使用することによって、５７０ｎｍでの吸光度を測定した）。（ウイルスおよびコントロールで処理した）ベロ細胞の算出生存率（％）に対する試料濃度（μｇ／ｍＬ）のグラフを作成することによってデータを分析することによって、細胞増殖の変化が数量化できた。次式にしたがって、抗ウイルス活性を決定した。

【0125】

【数1】

【0126】

上記式中、
（ＯＤ_T）_HSVは、ＨＳＶ感染細胞においてある濃度の抽出物を用いて測定した吸光度である。
（ＯＤＣ）_HSVは、コントロールである無処置のＨＳＶ感染細胞について測定した吸光度を指す。
（ＯＤＣ）_mockは、コントロールである無処置のモック感染細胞について測定した吸光度を指す。

【0127】

ＩＣ₅₀値を、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の最大細胞変性効果の半分を阻害するために必要な濃度として、このデータから算出した。

【0128】

結果
ＨＳＶ−１に対する実施例１の試料１のＩＣ₅₀値は、１５．４８μｇ／ｍＬであった。

【0129】

ＨＳＶ−２に対する実施例１の試料１のＩＣ₅₀値は、１７μｇ／ｍＬであった。

【0130】

〔実施例１１〕
細胞毒性試験
Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，２００６，１２：４０７８−４０８１に記載されているようにして、アッセイを行った。なお、この文献に記載の手順については参照によって本明細書に引用されるものとする。

【0131】

観察された抗ウイルス効果が、細胞生存率に対する一般的な効果原因から生じたのかどうかを評価するために、毒性分析を実施した。毒性分析のための（実施例８のステップ１で得られた）ベロ細胞を９６ウェルのプレートにおいて培養し、ウイルスを加えない抗ウイルスの評価に使用したのと同じスケジュールで抽出物を用いて処理した。ＭＴＴ染料を用いて、生細胞をアッセイした。実施例１の試料１の中毒作用を、植物抽出物の非存在下で観察した生細胞を基準とした植物抽出物の存在下における生細胞の減少の割合（％）として算出した。次式を使用した。

【0132】

【数2】

【0133】

上記式中、
Ａは、ＥＬＩＳＡ読み取り装置で測定した吸光度を表わす。

【0134】

このデータから、５０％細胞毒性濃度（ＣＣ₅₀）を算出した。

【0135】

選択指数（ＳＩ）は治療係数とも称され、これをＣＣ₅₀とＩＣ₅₀との比として評価した。得られた結果を表５に示す。実施例１の試料１が自身の毒性レベルを超える十分な抗ウイルス活性を有するかどうかを判断するために、ＳＩをＣＣ₅₀／ＩＣ₅₀にしたがって算出した。

【0136】

本研究では、５を超えるＳＩ値を、抽出物に対して効果があるとみなした。得られた結果を表４に示す。

【0137】

【表4】

【0138】

＊実施例１０から得られたＩＣ₅₀値

【0139】

〔実施例１２〕
感染後の異なる時点におけるＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の増殖に対する実施例４の試料２３の効果の評価
この研究の目的は、実施例４の試料２３によって阻害されるＨＳＶ−１／ＨＳＶ−２の増殖段階を決定することである。抗ウイルス薬の候補は、例えば、吸着、融合、脱外被、逆転写、統合、核酸合成、成熟などの増殖サイクルの任意の段階において特異的にウイルスを阻害し、目標とする可能性がある（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９８，ｖｏｌ １０，３８７−４０５）。これらの各段階は、１時間（吸着開始）から２４時間（１つのＨＳＶ増殖サイクルの完了）にわたる、ウイルスの生涯過程における異なる時点で発生する。ウイルスの生涯過程の吸着段階とは、ヘルペスウイルスが宿主細胞に取り付く初期の段階であって、ウイルス上のｇＣおよびｇＤ（貯蔵糖タンパク質）と細胞表面レセプター（例えばヘパリン硫酸塩）との相互作用をともなう。ウイルスの生涯過程における取り付き段階は、ウイルスが細胞と密接に関連することを可能にする安定した取り付き段階である。吸着段階および取り付き段階に続くウイルスの生涯過程の段階は、感染後の段階として知られている。

【0140】

ベロ細胞を、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ増殖培地において２．２×１０⁴個／ウェルの細胞密度で９６ウェルの平底プレートに播種した。２０〜２４時間後に、培養密度の高い単層を、１００μＬ／ウェルの１：１０⁴ウイルス希釈液（ＨＳＶ−１臨床株）（ＴＣＩＤ₅₀は５．８８×１０⁶／ｍＬ）またはＨＳＶ−２（ＴＣＩＤ₅₀は２．４３×１０⁶／ｍＬ）の１：１０³希釈液に感染させて、プレートを５％のＣＯ₂下において３７℃で１時間インキュベートした。実施例４の試料２３とアシクロビルとの２倍段階希釈液を２％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭの維持培地において調製して、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００、２００、および４００μｇ／ｍＬの８つの濃度を得た。さらに、感染から０、１、３、５、７、１６、および、２４時間後に、３組について、各希釈液を１ウェル当たり１００μＬ加えた。０時間後に、実施例４の試料２３およびアシクロビルの希釈液をウイルスと同時に加えた。ウイルスコントロール（ウイルス希釈液と維持培地）および細胞コントロール（維持培地のみ）については、維持培地を各ウェルに加えた。プレートを３７℃で４８〜５０時間さらにインキュベートした。インキュベーションに続いて、プレートの内容物を捨て、プレートをＤＭＥＭを用いて１回洗浄した。このプレートに、２％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ維持培地において調製したＭＴＴ試薬の１：１０希釈液を１００μＬ／ウェル加え、紫色の染料が見えてくるまで４時間インキュベートした。次に、１ウェル当たり１００μＬの洗浄剤を加えた。プレートを、３７℃の５％のＣＯ₂恒温器内に一晩放置した。インキュベーション後にプレートカバーを外して、ミクロプレート式プレート読み取り装置（ＢＩＯ−ＴＥＫ、Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴ社）を用いて、各ウェルにおいて５７０ｎｍで吸光度を測定した。

【0141】

ＨＳＶ−１型単純ヘルペスウイルスに関連する研究のための観察結果
●吸着段階に対応する０時間後に、５０μｇ／ｍＬでは５２％の抗ウイルス活性、１００μｇ／ｍＬでは７７％の抗ウイルス活性、２００μｇ／ｍＬでは６４％の抗ウイルス活性が観察された。
●取り付き段階に対応する感染後１時間で、１００μｇ／ｍＬでは８０％の抗ウイルス効果、２００μｇ／ｍＬでは６４％の抗ウイルス効果が観察された。
●増殖開始に対応する感染後３時間で、１００μｇ／ｍＬでは９０％の抗ウイルス効果、２００μｇ／ｍＬでは７０％の抗ウイルス効果が観察された。
●ＨＳＶウイルスＤＮＡ合成に対応する感染後５時間で、１００μｇ／ｍＬでは８３％の抗ウイルス効果、２００μｇ／ｍＬでは６８％の抗ウイルス効果が観察された。
●ＨＳＶウイルスＤＮＡ合成の後期の各段階に対応する感染後７時間で、１００μｇ／ｍＬでは７７％の抗ウイルス効果、２００μｇ／ｍＬでは７３％の抗ウイルス効果が観察された。
●増殖の最大効率に対応する感染後１６時間で、１００μｇ／ｍＬでは７５％の抗ウイルス効果、２００μｇ／ｍＬでは７１％の抗ウイルス効果が観察された。
●ＨＳＶウイルス粒子の放出（増殖後に起こる、宿主細胞からの成熟したウイルス粒子の放出）に対応する感染後２４時間で、１００μｇ／ｍＬでは３６％の抗ウイルス効果、２００μｇ／ｍＬでは３７％の抗ウイルス効果が観察された。

【0142】

アシクロビルは、０〜７時間後に３．１２５〜２００μｇ／ｍＬのすべての濃縮においてＨＳＶ−１に対する強力な抗ウイルス効果を示した。この活性は、増殖およびウイルス粒子放出の後期の各段階に対応する１６〜２４時間後に約１７％まで大幅に減少した。したがって、この研究の結果は、アシクロビルがＨＳＶ−１増殖の後期の各段階では効果的でないことを示唆している。

【0143】

結論
ＨＳＶ−１に対する実施例４の試料２３の抗ウイルス活性は、上記のように感染後３時間でピークに達した。また、この活性は感染後０〜１６時間では強力であったが、感染後２４時間では大幅に低下した。

【0144】

ＨＳＶ−２型単純ヘルペスウイルスに関連する研究のための観察結果
●吸着段階に対応する０時間後に、５０μｇ／ｍＬでは７７％の抗ウイルス活性、１００μｇ／ｍＬでは７６％の抗ウイルス活性、２００μｇ／ｍＬでは５１％の抗ウイルス活性が観察された。
●取り付き段階に対応する感染後１時間で、１００μｇ／ｍＬでは６６％の抗ウイルス効果、２００μｇ／ｍＬでは５２％の抗ウイルス効果が観察された。
●増殖開始に対応する感染後３時間で、１００μｇ／ｍＬでは７４％の抗ウイルス効果、２００μｇ／ｍＬでは５５％の抗ウイルス効果が観察された。
●ＨＳＶウイルスＤＮＡ合成に対応する感染後５時間で、１００μｇ／ｍＬでは７９％の抗ウイルス効果、２００μｇ／ｍＬでは６３％の抗ウイルス効果が観察された。
●ＨＳＶウイルスＤＮＡ合成の後期の各段階に対応する感染後７時間で、１００μｇ／ｍＬでは８３％の抗ウイルス効果、２００μｇ／ｍＬでは６７％の抗ウイルス効果が観察された。
●増殖の最大効率およびウイルス粒子放出の開始に対応する感染後１６時間で、１００μｇ／ｍＬでは８３％の抗ウイルス効果、２００μｇ／ｍＬでは６７％の抗ウイルス効果が観察された。
●感染後２４時間では、抗ウイルス効果が観察されなかった。

【0145】

アシクロビルは、０〜７時間後に３．１２５〜２００μｇ／ｍＬのすべての濃縮においてＨＳＶ−２に対する強力な抗ウイルス効果を示した。この活性は、増殖およびウイルス粒子放出の後期の各段階に対応する感染後１６〜２４時間では存在しない。したがって、この研究の結果は、アシクロビルがＨＳＶ−２増殖の後期の各段階では効果的でないことを示唆している。

【0146】

結論
ＨＳＶ−２に対する実施例４の試料２３の抗ウイルス活性は、感染後７〜１６時間でピークに達した。また、この活性は感染後０〜１６時間には強力であった。

【0147】

〔実施例１３〕
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）に対する、感染前の実施例４の試料２３の抗ウイルス活性の評価
ヘルペスウイルスが標的細胞に侵入するためには、自身が持つ脂質膜からなる外被を、細胞が持つ脂質膜と融合させなければならない。この複雑なウイルス侵入メカニズムは、少なくとも３種類の貯蔵糖タンパク質（ｇＣ、ｇＢ、および、ｇＤ）と、該タンパク質の持つ、例えばネクチンやヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）などの細胞表面レセプターを結合させる能力とによって媒介される（Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，２００８，６５，１６５３−１６６８）。この前処理アッセイの目的は、ベロ細胞に吸着または侵入するために必要な、例えば上記糖タンパク質などのウイルス粒子の外被の構造、または、例えばヘパラン硫酸（ＨＳ）などの細胞表面レセプターの構造と相互作用することによって、実施例４の試料２３がウイルス阻害を引き起こすことができるかどうかを確認することである。

【0148】

ベロ細胞を、２４ウェルのプレート上に１．８×１０⁵個／ウェルの細胞密度で播種した。これらのプレートを、５％のＣＯ₂下において３７℃で２０〜２４時間インキュベートした。実施例４の試料２３の２倍段階希釈液とアシクロビルとを、いずれも３．１２５〜４００μｇ／ｍＬの濃度範囲で適切なウェル（２００μＬ／ウェル）に加えたものを２組用意し、５％のＣＯ₂下において３７℃で１時間インキュベートした。１時間後に、これらの希釈を吸引除去し、ベロ細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次に、２．１×１０⁸ｐｆｕ／ｍＬのタイターで２００μＬ／ウェルのＨＳＶ−１ウイルス懸濁液を用いて、または、１．６５×１０⁷ｐｆｕ／ｍＬのタイターでＨＳＶ−２ウイルス懸濁液を用いて感染させた。ウイルスを５％のＣＯ₂下において３７℃で１時間吸着させ、続いて、ＰＢＳで洗浄した。次に、１ｍＬの重層液（１％のカルボキシメチルセルロース ＋ ２％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ）を各ウェルに加え、各プレートをさらに５％のＣＯ₂下において３７℃で４９時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、各プレートを０．８５％の生理食塩水で洗浄し、０．１３％のクリスタルバイオレットで染色した。ウイルスのプラークを勘定し、実施例４の抽出物の試料２３のＩＣ₅₀値を算出した。

【0149】

結果
図３は、ＨＳＶ−１に対する６３〜８８％の阻害率が示唆するように、実施例４の試料２３が２００〜４００μｇ／ｍＬにおいて有意な阻害活性を有することを示している。実施例４の試料２３のＩＣ₅₀値を算出すると、ＨＳＶ−１に対して１７１．２５μｇ／ｍＬであった。ＨＳＶ−１に対する実施例４の試料２３の観察された阻害効果は、アシクロビルが３．１２５〜４００μｇ／ｍＬの濃度範囲で示した１０〜４０％という弱い阻害効果と比較すると強力であった。

【0150】

図４は、２００〜４００μｇ／ｍＬにおいてＨＳＶ−２に対する実施例４の試料２３の阻害率が６０〜８６％であることを示している。実施例４の試料２３のＩＣ₅₀値を算出すると、ＨＳＶ−２に対して２０２．５μｇ／ｍＬであった。アシクロビルは、３．１２５〜４００μｇ／ｍＬの濃度範囲でＨＳＶ−２に対して１０〜２０％という弱い阻害効果を示した。

【0151】

結論
実施例４の試料２３を用いた前処理によって、ウイルスとの接触後すぐにＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のベロ細胞への侵入（吸着および取り付き）に対して有意な阻害が生じた。これは予防作用を示している。この阻害効果は、アシクロビルの持つ阻害効果に比べて非常に強力であった。

【0152】

〔実施例１４〕
ウイルス吸着アッセイ
ウイルスの生涯過程には、抗ウイルス性生成物となり得る有望な候補が目標とし得る、吸着、融合、脱外被、逆転写、統合、核酸合成、成熟などの多数のステップが存在する。したがって、吸着アッセイの結果は、感染サイクル中の吸着段階においてＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を阻害し、ウイルス上の糖タンパク質Ｃ（ｇＣ）および糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）がヘパラン硫酸（ＨＳ）などの細胞表面レセプターであるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）と相互作用する、実施例４の試料２３の信頼性を確認するために役立つ。

【0153】

ベロ細胞を、２４ウェルの平底プレート上に１．８×１０⁵個／ウェル細胞濃度で播種した。各プレートを、培養密度の高い単層が形成されるまで、５％のＣＯ₂下において３７℃で２０〜２４時間インキュベートした。実施例４の試料２３の２倍段階希釈液およびアシクロビルを、３．１２５〜４００μｇ／ｍＬの範囲の濃度が得られるように調製した。濃度が２．１×１０⁸ｐｆｕ／ｍＬのＨＳＶ−１ウイルスの懸濁液、または、濃度が１．６５×１０⁷ｐｆｕ／ｍＬのＨＳＶ−２ウイルスの懸濁液を調製した。実施例４の試料２３／アシクロビルの各希釈液とＨＳＶ−１ウイルス／ＨＳＶ−２ウイルスの懸濁液とを、等体積ずつ無菌エッペンドルフチューブ中に設置し、これらの混合物を３７℃で１時間インキュベートした。次に、ベロ細胞の単層にこれらの混合物を２００μＬずつ加えて、抽出物の存在下でウイルスを５％のＣＯ₂下において３７℃で１時間吸着させた。次に、各プレートをＰＢＳで１回洗浄して、結合していないウイルス除去し、２％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ維持培地において調製した１ｍＬの重層液（１％のカルボキシメチルセルロース； ＣＭＣ）を各ウェルに加えた。さらに、定期的にモニタリングしながら５％のＣＯ₂下において３７℃で４９時間インキュベートし、続いて、０．８５％の生理食塩水で洗浄し、０．１３％のクリスタル液で染色した。ウイルスのプラークを勘定して、ＩＣ₅₀値を算出した。

【0154】

結果
図５は、実施例４の試料２３が、ＨＳＶ−１ウイルスの吸着に対して１００〜４００μｇ／ｍＬでは１００％の阻害率を達成でき、５０μｇ／ｍＬでは阻害率が６５％まで低下したことを示している。実施例４の試料２３のＩＣ₅₀は、ＨＳＶ−１に対しては４４μｇ／ｍＬである。

【0155】

図６は、実施例４の試料２３が、ＨＳＶ−２ウイルスの吸着に対して５０〜４００μｇ／ｍＬでは１００％の阻害率を達成し、２５μｇ／ｍＬでは阻害率が９２％まで低下したことを示している。

【0156】

実施例４の試料２３のＩＣ₅₀は、ＨＳＶ−２に対しては１５μｇ／ｍＬである。

【0157】

ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に対する実施例４の試料２３の活性は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に対するアシクロビルの活性に比べてわずかに良好であった。実施例４の試料２３は、これが存在するときには、５０〜４００μｇ／ｍＬの濃度範囲においてＨＳＶ−１ウイルスおよびＨＳＶ−２ウイルス感染の吸着段階前および吸着段階中のいずれにおいても効果的であり、また、該濃度において微視的な細胞毒性を有しなかった。

【0158】

〔実施例１５〕
ウイルス侵入アッセイ
ＨＳＶの宿主細胞への侵入は、ウイルス粒子の外被の細胞膜との融合を引き起こす、宿主細胞の表面への初期結合に続くステップであると規定され得る。そのためには、各種糖タンパク質（ｇＢ、ｇＤ、および、ｇＨ／ｇＬ）および細胞表面成分が関与する複数回の相互作用が連続して起こることが必要である（Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，２００８，６５，１６５３−１６６８）。このウイルス侵入アッセイの目的は、実施例４の試料２３が、ＨＳＶ−１ウイルスおよびＨＳＶ−２ウイルスのベロ細胞への侵入を阻害するかどうかをインビトロで確認することである。

【0159】

ベロ細胞を、２４ウェルのプレート上に１．８×１０⁵個／ウェルの細胞密度で播種した。各プレートを５％のＣＯ₂下において３７℃で２０〜２４時間インキュベートした。続く各ステップを４℃で実施するので、ベロ細胞が低温環境に順化できるように、培養密度の高いプレートを実験の開始に先立って４℃の環境内に約半時間置いた。タイターが２．１×１０⁸ｐｆｕ／ｍＬのＨＳＶ−１ウイルスの懸濁液、または、タイターが１．６５×１０⁷ｐｆｕ／ｍＬのＨＳＶ−２ウイルスの懸濁液を調製し、２００μＬを培養密度の高い各単層に加えた。ウイルスが取り付くことができるように、細胞を４℃で２時間インキュベートした。３．１２５〜４００μｇ／ｍＬの濃度範囲の実施例４の試料２３の２倍段階希釈液およびアシクロビルの両方を室温で適切なウェルに加え、各プレートを５％のＣＯ₂下において３７℃で１０分間インキュベートした。次に、実施例４の試料２３の希釈液およびアシクロビルを吸引除去し、細胞の単層をＰＢＳ（ｐＨ値３．７５）で短時間洗浄して、細胞に侵入しなかったウイルス粒子を失活させた。次に、細胞をＰＢＳ（ｐＨ値１１．０）で洗浄して、酸性ｐＨ値環境を中和した。次に、１ｍＬの重層液（２％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ維持培地を溶媒とする１％のＣＭＣ溶液）を各ウェルに加え、各プレートを３７℃で４８〜５０時間インキュベートした。次に各プレートを０．８５％の生理食塩水で洗浄し、０．１３％のクリスタルバイオレットで染色した。プラークを勘定し、実施例４の試料２３のＩＣ₅₀値を算出した。

【0160】

結果
図７は、ＨＳＶ−１ウイルスに対する実施例４の試料２３の阻害率が５０〜４００μｇ／ｍＬにおいて８０〜９５％であるが、これより低い濃度（３．１２５〜２５μｇ／ｍＬ）では低下することを示している。ＨＳＶ−１ウイルスに対する実施例４の試料２３のＩＣ₅₀を算出すると、３０μｇ／ｍＬであった。

【0161】

図８は、ＨＳＶ−２ウイルスに対する実施例４の試料２３の阻害率が２００〜４００μｇ／ｍＬにおいて１００％であるが、１００μｇ／ｍＬでは９０％に、５０μｇ／ｍＬでは７１％に低下することを示している。ＨＳＶ−２ウイルスに対する実施例４の試料２３のＩＣ₅₀を算出すると、３６．１μｇ／ｍＬであった。

【0162】

アシクロビルは、実施例４の試料２３と比較すると、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に対して弱い阻害活性から中程度の阻害活性を示した。

【0163】

結論
上記結果は、ＨＳＶ−１ウイルスおよびＨＳＶ−２ウイルスが宿主であるベロ細胞へ侵入するというステップを強力には阻害しなかったアシクロビルと比較すると、実施例４の試料２３がＨＳＶ−１ウイルスおよびＨＳＶ−２ウイルスのベロ細胞への侵入を強く阻害することができたことを示唆している。

【0164】

〔実施例１６〕
ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に対する実施例４の試料２３の殺ウイルス活性の評価
殺ウイルスアッセイでは、培養細胞に対するウイルス粒子の感染力をブロックするために、抗ウイルス薬の連続的な存在が必要とされることが多い。また、ウイルス／抽出物複合体の希釈液は解離し、感染性ウイルスを放出することがある（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，８６，１９６−２０３）。仮に試料がＩＣ₅₀または他の効果的な濃度においてウイルスの感染力を抑制することができないのであれば、抗ウイルス活性は該試料の殺ウイルス力とは無関連である。この研究の目的は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２に対する実施例４の試料２３の阻害活性が、該試料の持つ抗ウイルス効果または殺ウイルス効果に起因するものであるのかどうかをインビトロで評価することである。

【0165】

ベロ細胞を、２４ウェルの平底プレート上に１．８×１０⁵細胞／ウェルの細胞濃度で播種した。各プレートを、５％のＣＯ₂下において３７℃で２０〜２４時間インキュベートした。実施例４の試料２３の２倍段階希釈液およびアシクロビルを、２５〜４００μｇ／ｍＬの濃度範囲が得られるように調製した。約１０¹⁰ｐｆｕ／ｍＬの濃度のＨＳＶ−１ウイルスの懸濁液、および、１０⁹ｐｆｕ／ｍＬの濃度のＨＳＶ−２ウイルスの懸濁液を調製した。実施例４の試料２３／アシクロビルの各希釈液とＨＳＶ−１ウイルス／ＨＳＶ−２ウイルスの懸濁液とを、等体積ずつ無菌エッペンドルフチューブ中に設置し、これらの混合物を３７℃で１時間インキュベートした。次に、２５〜４００μｇ／ｍＬに対応する０．２５〜４μｇ／ｍＬの最終濃度範囲が得られるように、これらの混合物を１０倍（１：１００）に希釈した。次に、ベロ細胞の単層にこれらの混合物を２００μＬずつ加えて、ウイルスを５％のＣＯ₂下において３７℃で１時間吸着できるようにした。次に、各プレートをＰＢＳで１回洗浄して、結合していないウイルスを除去し、２％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ維持培地において調製した１ｍＬの重層液（１％のカルボキシメチルセルロース； ＣＭＣ）を各ウェルに加えた。さらに、５％のＣＯ₂下において３７℃で４８〜５０時間インキュベーションし、続いて、０．８５％の生理食塩水で洗浄し、０．１３％のクリスタル液で染色した。次にウイルスのプラークを勘定した。

【0166】

結果
図９は、２００〜４００μｇ／ｍＬではＨＳＶ−１に対する実施例４の試料２３の殺ウイルス効果が１００％であり、１００μｇ／ｍＬでは阻害率が９４％であることを示している。アシクロビルは、２５〜４００μｇ／ｍＬの濃度範囲ではＨＳＶ−１に対して０〜３２％の範囲の弱い殺ウイルス効果を示した。

【0167】

図１０は、ＨＳＶ−２に対して実施例４の試料２３が４００μｇ／ｍＬでは１００％の殺ウイルス効果を有し、５０〜２００μｇ／ｍＬでは９２〜９７％の阻害率を有することを示している。アシクロビルは、２５〜４００μｇ／ｍＬの濃度範囲ではＨＳＶ−２に対して１１〜３８％の範囲の弱い殺ウイルス効果を示した。

【0168】

結論
実施例４の試料２３は、アシクロビルと比較すると、ＨＳＶ−１ウイルスおよびＨＳＶ−２ウイルスに対して強力な殺ウイルス効果を示した。

【0169】

インビボにおける抗ウイルスアッセイ
実験で使用する動物は、ＣＰＣＳＥＡ（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｏｎ Ａｎｉｍａｌｓ、インド、タミルナドゥ）が公開する施工中の指針にしたがって収容および飼育した。実験動物を用いる手順は、Ｐｉｒａｍａｌ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ社（インド、ムンバイ、Ｇｏｒｅｇａｏｎ）のＩＡＥＣ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認を受けた。

【0170】

〔実施例１７〕
マウスＨＳＶ−１の帯状疱疹様が広がる感染モデル
Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｊｕｎｅ ２００２，ｐ．１７６６−１７７２に記載されているようにして、アッセイを行った。なお、この文献に記載の手順については参照によって本明細書に引用されるものとする。

【0171】

本研究には、妊娠しておらず出産経験もない６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃ雌マウスを使用した。すべての動物の右中背部の毛を電気バリカンで剃り、ウイルス負荷の直前に、無菌２６ゲージ針を用いて毛を剃った部分の数箇所で水平に乱切した。

【0172】

ウイルス負荷に先立って、各マウスの乱切箇所を７０％のアルコールに浸した綿スワブで清掃し、続いて、無菌ＤＭＥＭに浸した綿製スワブを用いて乱切箇所をきれいにした。次に、該乱切箇所において各マウスを１個体当たり８．２７×１０³ｐｆｕを含有するＨＳＶ−１ウイルスに感染させた。マウスには、感染の１時間後に感染部位において局所投与によって調合物ＩＡ、調合物ＩＢ、調合物ＩＣ／アシクロビル／プラセボを与えた。マウスは、治療間隔を４時間として１日に３回治療した。すべてのグループのすべてのマウスを５日間治療した。（クリームベースの）プラセボおよびアシクロビル（２２５ｍｇ／ｋｇ／日）で処置したマウスをコントロールとし、ウイルス・コントロール・グループには治療を行わなかった。

【0173】

実施例６において説明した以下に記載する調合物について評価した。

【0174】

（ａ） 調合物ＩＡ
（ｂ） 調合物ＩＢ
（ｃ） 調合物ＩＣ
調合物ＩＡ、調合物ＩＢ、および、調合物ＩＣを局所的に１日に３回、５日間にわたって塗布した。１５ｍｇの調合物ＩＡがマウスにおいて評価対象となる２２５ｍｇ／ｋｇの投与量に対応し、１５ｍｇの調合物ＩＢがマウスにおいて評価対象となる４５０ｍｇ／ｋｇの投与量に対応し、１５ｍｇの調合物ＩＣがマウスにおいて評価対象となる６７５ｍｇ／ｋｇの投与量に対応し、２５ｍｇの調合物ＩＢがマウスにおいて評価対象となる７５０ｍｇ／ｋｇ投与量に対応する。

【0175】

マウスは、感染後２１日間、罹患率、死亡率、および、感染部位について毎日評価した。

【0176】

確立された手法である以下の病変評価スケール（ｌｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅ ｓｃａｌｅ）を用いて、ウイルス性疾患の重症度（膣外における疾患の徴候）を定量化した。
０： 顕性感染がない
１： 小胞が形成されている
２： 大きなパッチ状の帯状疱疹が形成されている
３： 培養密度の高い帯状疱疹
４： 後肢の麻痺

【0177】

帯状疱疹様病変とは、三叉神経の幹部または枝部の皮膚分布にそって発生した帯状の一側性皮膚病変を指す。

【0178】

観察結果
どの投与量グループに属するマウスも、感染後２日目までに帯状疱疹様病変の初期の徴候を示し始めた。
１ プラセボによる治療を受けたグループ
（ａ）マウスは感染後６日目までに重度の感染を示し始めた。
（ｂ）すべてのマウスが感染後８日目までに死亡した。
２ アシクロビルによる治療を受けたグループ
（ａ）すべてのマウスが感染後７日目までに帯状疱疹様病変から回復した。
（ｂ）実験期間を通じてマウスは一匹も死亡しなかった。
３ 無処置グループ（感染コントロール）
（ａ）マウスは感染後６日目までに重度の感染を示し始めた。
（ｂ）すべてのマウスが感染後１０日目までに死亡した。
４ 調合物ＩＢによる治療を受けたグループ（７５０ｍｇ／ｋｇ／日）
（ａ）調合物ＩＢ（７５０ｍｇ／ｋｇ／日）による治療を受けたマウスは９０％の生存率を示した。
（ｂ）生き残ったマウスは感染後９日目までに帯状疱疹様病変から回復した。
５ 調合物ＩＣによる治療を受けたグループ（６７５ｍｇ／ｋｇ／日）
（ａ）調合物ＩＣ（６７５ｍｇ／ｋｇ／日）による治療を受けたマウスは８０％の生存率を示した。
（ｂ）生き残ったマウスは感染後１０日目までに帯状疱疹様病変から回復した。
６ 調合物ＩＢによる治療を受けたグループ（４５０ｍｇ／ｋｇ／日）
（ａ）調合物ＩＢ（４５０ｍｇ／ｋｇ／日）による治療を受けたマウスは６０％の生存率を示した。
（ｂ）生き残ったマウスは感染後１０日目までに帯状疱疹様病変から回復した。
７ 調合物ＩＡによる治療を受けたグループ（２２５ｍｇ／ｋｇ／日）
（ａ）調合物ＩＡ（２２５ｍｇ／ｋｇ／日）による治療を受けたマウスは２０％の生存率を示した。死亡したマウスの大部分は感染後８日目以内に死亡した。
（ｂ）生き残ったマウスは感染後９日目までに帯状疱疹様病変から回復した。

【0179】

結果
調合物ＩＢおよび調合物ＩＣは、マウスＨＳＶ−１の帯状疱疹様が広がる感染モデルにおいて、７５０および６７５ｍｇ／ｋｇ／日という比較的高い濃度において良好な抗ウイルス活性を示した。

【0180】

〔実施例１８〕
マウスの膣のＨＳＶ−２感染モデル
Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，６９：７７−８５に記載されているようにして、アッセイ行った。なお、この文献に記載の手順については参照によって本明細書に引用されるものとする。

【0181】

本研究には、妊娠しておらず出産経験もない６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃ雌マウスを使用した。雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを使用してＨＳＶ−２の膣播種を行った。膣内（ＩＶＡＧ）負荷の５日前に、２９ゲージの針を用いて２ｍｇのプロゲステロン（Ｄｅｐｏ−Ｐｒｏｖｅｒａ（登録商標）、ファイザー社、ベルギー）をマウスの背中の上部に皮下注射（ｓｃ）した。負荷日に、１．１４×１０⁵ｐｆｕのＨＳＶ−２をマウスに膣内播種した。ウイルスの膣内投与はマイクロピペットを用いてＤＭＥＭの総体積を２０μＬとして行った。マウスには、感染の３０分後に膣内において局所投与によって調合物ＩＡ、調合物ＩＢ、調合物ＩＣ／アシクロビル／プラセボを与えた。マウスは、治療間隔を４時間として１日に３回治療した。すべてのグループのすべてのマウスを５日間治療した。アシクロビル（２２５ｍｇ／ｋｇ／日）を正のコントロールとして含めた。プラセボ・コントロール・マウスには同時点においてベースクリーム（プラセボ）を塗布し、ウイルス・コントロール・グループには治療を行わなかった。

【0182】

実施例６において説明した以下に記載する調合物について評価した。
（ａ） 調合物ＩＡ
（ｂ） 調合物ＩＢ
（ｃ） 調合物ＩＣ
調合物ＩＡ、調合物ＩＢ、および、調合物ＩＣを局所的に１日に３回、５日間にわたって塗布した。１５ｍｇの調合物ＩＡがマウスにおいて評価対象となる２２５ｍｇ／ｋｇの投与量に対応し、１５ｍｇの調合物ＩＢがマウスにおいて評価対象となる４５０ｍｇ／ｋｇの投与量に対応し、１５ｍｇの調合物ＩＣがマウスにおいて評価対象となる６７５ｍｇ／ｋｇの投与量に対応する。

【0183】

マウスは、感染後２１日間、膣外における疾患の徴候および生存率について毎日評価した。

【0184】

確立された手法である以下の病変評価スケールを用いて、ウイルス性疾患の重症度（膣外における疾患の徴候）を定量化した。
０： 顕性感染がない
１： 単独の丘疹が数箇所、膣外組織の軽微な発赤
２： 単独の丘疹が数箇所、膣外組織の潰瘍および／または焼痂および／または膨化および発赤
３： 膣外組織の複数が融合してできた潰瘍／焼痂、中程度の膨化、および、発赤、周囲の組織への拡大
４： 膣外組織の重篤な発赤をともなう潰瘍および膨化、周囲の組織への拡大、後ろ脚の麻痺

【0185】

観察結果
１ プラセボによる治療を受けたグループ
（ａ）膣外感染の最も早い徴候は７日目に現れた。
（ｂ）マウスの９０％が１４日目までに死亡した。
２ アシクロビルによる治療を受けたグループ
（ａ）膣外疾患の徴候を示したマウスは一匹もいなかった。
（ｂ）実験期間を通じてマウスは一匹も死亡しなかった。
３ 調合物ＩＡによる治療を受けたグループ（２２５ｍｇ／ｋｇ／日）
（ａ）調合物Ｉ（２２５ｍｇ／ｋｇ／日）による治療を受けたマウスは９０％の生存率を示した。
（ｂ）１０匹のマウスのうち１匹に感染後８日目までに臨床的病変が現れた。このマウスその後死亡した。その他のマウスは、どの個体もウイルスに誘発された膣外疾患の特徴的な徴候を実験期間を通じて一切示さなかった。
４ 調合物ＩＢによる治療を受けたグループ（４５０ｍｇ／ｋｇ／日）
（ａ）調合物ＩＢの抽出物（４５０ｍｇ／ｋｇ／日）による治療を受けたマウスは９０％の生存率を示した。
（ｂ）１０匹のマウスのうち２匹に感染後１４日目までに臨床的病変が現れた。このうちの１匹のマウスはその後死亡した。その他のマウスは、どの個体もウイルスに誘発された膣外疾患の特徴的な徴候を実験期間を通じて一切示さなかった。
５ 調合物ＩＣによる治療を受けたグループ（６７５ｍｇ／ｋｇ／日）
（ａ）膣外疾患の徴候を示したマウスは一匹もいなかった。
（ｂ）実験期間を通じてマウスは一匹も死亡しなかった。

【0186】

結果
調合物ＩＡ、調合物ＩＢ、および、調合物ＩＣは、マウスの膣のＨＳＶ−２感染モデルにおいて、２２５、４５０、および、６７５ｍｇ／ｋｇ／日で抗ウイルス活性を示した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】