特許 6058645 抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6058645

(24)【登録日】2016年12月16日

(45)【発行日】2017年1月11日

(54)【発明の名称】抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20161226BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20161226BHJP

   C07K 16/12 20060101ALI20161226BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20161226BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20161226BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20161226BHJP

   A61P 27/00 20060101ALI20161226BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20161226BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20161226BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20161226BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20161226BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20161226BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N5/10

   C07K16/12

   C07K16/46

   A61K39/395 R

   A61P31/04

   A61P27/00

   A61P11/00

   A61P17/02

   A61P7/00

   A61P19/08

   C12P21/08

【請求項の数】21

【全頁数】108

(21)【出願番号】特願2014-514881(P2014-514881)

(86)(22)【出願日】2012年6月8日

(65)【公表番号】特表2014-519334(P2014-519334A)

(43)【公表日】2014年8月14日

(86)【国際出願番号】US2012041538

(87)【国際公開番号】WO2012170807

(87)【国際公開日】20121213

【審査請求日】2015年5月20日

(31)【優先権主張番号】61/495,460

(32)【優先日】2011年6月10日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/530,461

(32)【優先日】2011年9月2日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/613,317

(32)【優先日】2012年3月20日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】504333972

【氏名又は名称】メディミューン，エルエルシー

(73)【特許権者】

【識別番号】506042265

【氏名又は名称】メディミューン リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100122389

【弁理士】

【氏名又は名称】新井 栄一

(74)【代理人】

【識別番号】100111741

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 夏夫

(74)【代理人】

【識別番号】100169971

【弁理士】

【氏名又は名称】菊田 尚子

(74)【代理人】

【識別番号】100125508

【弁理士】

【氏名又は名称】藤井 愛

(74)【代理人】

【識別番号】100169579

【弁理士】

【氏名又は名称】村林 望

(72)【発明者】

【氏名】ディジャンドメニコ，アントニオ

(72)【発明者】

【氏名】ワーレナー，ポール，ジー．

(72)【発明者】

【氏名】ストーバー，チャールズ，ケー．

(72)【発明者】

【氏名】セルマン，ブレット

(72)【発明者】

【氏名】ギラード，サンドリン

(72)【発明者】

【氏名】ミンター，ラルフ

(72)【発明者】

【氏名】ラスト，スティーブン

(72)【発明者】

【氏名】トミチ，ムラデン

【審査官】 飯室 里美

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００７−５３３２９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／１１５６０６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Mol Microbiol，２０１０年，Vol. 75, No. 4，pp. 827-842

【文献】 免疫学辞典，２００１年，第２版，第１２３頁

【文献】 Mol Microbiol，２００９年，Vol. 73, No. 4，pp. 622-638

【文献】 岡山医誌，１９９０年，Vol. 102，pp. 1267-1273

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ａ６１Ｐ １／００−４３／００

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４、４９／００−４９／０４、５１／００

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、
配列番号１７、１８、１９、２０、２１および２２（Ｃａｍ−００３）、
配列番号２３、２４、２５、２０、２１および２２（Ｃａｍ−００４）、
配列番号２９、３０、３１、３２、３３および３４（ＷａｐＲ−００１）、
配列番号３５、３６、３７、３８、３９および４０（ＷａｐＲ−００２）、
配列番号４１、４２、４３、４４、４５および４６（ＷａｐＲ−００３）、
配列番号４７、４８、４９、５０、５１および５２（ＷａｐＲ−００４）、
配列番号４７、４８、７５、５０、５１および５２（ＷａｐＲ−００４ＲＡＤ）、および
配列番号５９、６０、６１、６２、６３および６４（ＷａｐＲ−０１６）
からなる群から選択されるアミノ酸配列ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、前記単離抗体またはその抗原結合断片。

【請求項2】

シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、以下：
（ａ）配列番号１および配列番号２（Ｃａｍ−００３）；
（ｂ）配列番号３および配列番号２（Ｃａｍ−００４）；
（ｃ）配列番号５および配列番号６（ＷａｐＲ−００１）；
（ｄ）配列番号７および配列番号８（ＷａｐＲ−００２）；
（ｅ）配列番号９および配列番号１０（ＷａｐＲ−００３）；
（ｆ）配列番号１１および配列番号１２（ＷａｐＲ−００４）；
（ｇ）配列番号７４および配列番号１２（ＷａｐＲ−００４ＲＡＤ）；および
（ｈ）配列番号１５および配列番号１６（ＷａｐＲ−０１６）
からなる群から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を含む、前記単離抗体またはその抗原結合断片。

【請求項3】

前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体または完全ヒト抗体である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。

【請求項4】

前記抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ'断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆｖ断片、または単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。

【請求項5】

前記抗体が、以下：
（ａ）ヒトＩｇＡ定常領域；
（ｂ）ヒトＩｇＤ定常領域；
（ｃ）ヒトＩｇＥ定常領域；
（ｄ）ヒトＩｇＧ１定常領域；
（ｅ）ヒトＩｇＧ２定常領域；
（ｆ）ヒトＩｇＧ３定常領域；
（ｇ）ヒトＩｇＧ４定常領域；および
（ｈ）ヒトＩｇＭ定常領域
からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常領域をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。

【請求項6】

前記抗体が、以下：
（ａ）ヒトＩｇカッパ軽鎖定常領域；および
（ｂ）ヒトＩｇラムダ軽鎖定常領域；
からなる群から選択される軽鎖免疫グロブリン定常領域をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。

【請求項7】

異種アミノ酸配列をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項8】

請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離ポリヌクレオチド。

【請求項9】

前記ポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に結合している、請求項８に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項10】

請求項８または９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項11】

請求項８または９に記載のポリヌクレオチドあるいは請求項１０に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。

【請求項12】

前記宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項１１に記載の宿主細胞。

【請求項13】

シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を産生する方法であって、請求項１１または１２のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養すること、および前記抗体またはその抗原結合断片を回収することを含む、前記方法。

【請求項14】

請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。

【請求項15】

医薬として使用するための、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染の予防または治療が必要とされる対象におけるシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染の予防または治療のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項８もしくは９に記載のポリヌクレオチドを含む組成物。

【請求項17】

前記シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染である、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

前記感染は、眼感染、肺感染、火傷感染、創傷感染、皮膚感染、血液感染、骨感染、または前記感染の２つ以上の組合せである、請求項１６または１７に記載の組成物。

【請求項19】

上皮細胞への緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の付着の遮断または予防のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項８もしくは９に記載のポリヌクレオチドを含む組成物。

【請求項20】

緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の食細胞によるオプソニン食菌殺傷（ＯＰＫ）の向上のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項８もしくは９に記載のポリヌクレオチドを含む組成物。

【請求項21】

前記食細胞は、分化ＨＬ−６０細胞またはヒト多形核白血球（ＰＭＮ）である、請求項２０に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子および特にシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染の予防および治療におけるその使用に関する。さらに、本開示は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染を予防および治療するための組成物および方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、易感染性個体内で急性および慢性感染の両方を引き起こすグラム陰性日和見病原体である（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８９（２２）：８３５３−８３５６（２００７））。このことは、部分的には、臨床使用される抗生物質に対する細菌の高い自然耐性に起因し、部分的には、高度に抗生物質耐性のバイオフィルムの形成に起因する（Ｄｒｅｎｋａｒｄ Ｅ．，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ ５：１２１３−１２１９（２００３）；Ｈａｎｃｏｋｃ ＆ Ｓｐｅｅｒｔ，Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ Ｕｐｄａｔｅ ３：２４７−２５５（２０００））。

【0003】

緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、西洋諸国における院内感染の一般的原因である。これは、火傷患者および免疫不全個体において菌血症の原因となる作用物質であることが多い。（Ｌｙｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ ２：１０５１−１０６０（２０００））。これは、特に、人工呼吸器装着患者において院内感染グラム陰性肺炎の最も一般的な原因でもあり（Ｃｒａｖｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｒｅｓｐｉｒ Ｉｎｆｅｃｔ １１：３２−５３（１９９６））、嚢胞性線維症の個体の肺中で最も高頻度に見られる病原体である。（Ｐｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＡＳＭ Ｎｅｗｓ ６：３３９−３４７（１９９８））。重篤な緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染は、全身性になり得、敗血症をもたらす。敗血症は、重度の全身炎症を特徴とし、複数の臓器不全および死亡をもたらすことが多い。

【0004】

シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌエキソ多糖は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の表面に固定されることが報告されており、宿主組織のコロニー化の易化およびバイオフィルム形成の樹立／維持に重要であると考えられている（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｋ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８６，４４６６−４４７５（２００４））。この構造は、マンノースリッチ繰り返し五糖を含む（Ｂｙｒｄ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７３，６２２−６３８（２００９））。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

多剤耐性の増加に起因して、新たなシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）特異的防止および治療剤の同定のための新規方針の開発が当分野において依然として必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0006】

一実施形態は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、上皮細胞への（ａ）緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の付着を阻害し得、（ｂ）緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＯＰＫを促進し得、または（ｃ）上皮細胞への緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の付着を阻害し得、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＯＰＫを促進し得る単離結合分子またはその抗原結合断片を対象とする。

【0007】

ＷａｐＲ−００４、Ｃａｍ−００３、Ｃａｍ−００４、またはＣａｍ−００５の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）領域を含む抗体またはその抗原結合断片と同一のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌエピトープに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片も開示される。

【0008】

シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合し、ＷａｐＲ−００４、Ｃａｍ−００３、Ｃａｍ−００４、またはＣａｍ−００５のＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片によるシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合を競合阻害する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片も開示される。

【0009】

一部の実施形態は以下を含み、本開示は、上記結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、ＷａｐＲ−００４のＶＨおよびＶＬは、配列番号１１および配列番号１２をそれぞれ含み、Ｃａｍ−００３のＶＨおよびＶＬは、配列番号１および配列番号２をそれぞれ含み、Ｃａｍ−００４のＶＨおよびＶＬは、配列番号３および配列番号２をそれぞれ含み、Ｃａｍ−００５のＶＨおよびＶＬは、配列番号４および配列番号２をそれぞれ含む結合分子またはその抗原結合断片を含む。

【0010】

ＷａｐＲ−００１、ＷａｐＲ−００２、またはＷａｐＲ−００３のＶＨおよびＶＬ領域を含む抗体またはその抗原結合断片と同一のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌエピトープに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片も開示される。

【0011】

シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合し、ＷａｐＲ−００１、ＷａｐＲ−００２、またはＷａｐＲ−００３のＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片によるシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合を競合阻害する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片がさらに開示される。

【0012】

一部の実施形態は、上記結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、ＷａｐＲ−００１のＶＨおよびＶＬは、配列番号５および配列番号６をそれぞれ含み、ＷａｐＲ−００２のＶＨおよびＶＬは、配列番号７および配列番号８をそれぞれ含み、ＷａｐＲ−００３のＶＨおよびＶＬは、配列番号９および配列番号１０をそれぞれ含む結合分子またはその抗原結合断片を含む。

【0013】

ＷａｐＲ−０１６のＶＨおよびＶＬ領域を含む抗体またはその抗原結合断片と同一のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌエピトープに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片がさらに提供される。

【0014】

シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合し、ＷａｐＲ−０１６のＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片によるシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合を競合阻害する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片も提供される。

【0015】

一部の実施形態は、上記結合分子、例えば、抗体またはその断片であって、ＷａｐＲ−０１６のＶＨおよびＶＬは、配列番号１５および配列番号１６をそれぞれ含む結合分子またはその断片を含む。

【0016】

抗体ＶＨを含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、ＶＨは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号１５と少なくとも９０％同一または同一のアミノ酸配列を含む単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片も提供される。

【0017】

一部の実施形態は、抗体ＶＬを含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、ＶＬは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、および配列番号１６と少なくとも９０％同一または同一のアミノ酸配列を含む単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を含む。

【0018】

（ａ）それぞれ、配列番号１および配列番号２、（ｂ）それぞれ、配列番号３および配列番号２、（ｃ）それぞれ、配列番号４および配列番号２、（ｄ）それぞれ、配列番号５および配列番号６、（ｅ）それぞれ、配列番号７および配列番号８、（ｆ）それぞれ、配列番号９および配列番号１０、（ｇ）それぞれ、配列番号１１および配列番号１２、（ｈ）それぞれ、配列番号１３および配列番号１４；または（ｉ）ぞれぞれ、配列番号１５および配列番号１６と少なくとも９０％同一または同一のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列をそれぞれ含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｐｓｌに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片も提供される。具体的な実施形態において、上記抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列配列番号１を有するＶＨおよび配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。他の実施形態において、上記抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列配列番号１１を有するＶＨおよび配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。

【0019】

抗体ＶＨを含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、ＶＨは、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４７、配列番号５３、または配列番号５９と同一、または４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一のＶＨ相補性決定領域−１（ＶＨＣＤＲ１）アミノ酸配列を含む単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片も開示される。

【0020】

抗体ＶＨを含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、ＶＨは、配列番号１８、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３６、配列番号４２、配列番号４８、配列番号５４、または配列番号６０と同一、または４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一のＶＨ相補性決定領域−２（ＶＨＣＤＲ２）アミノ酸配列を含む単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片も提供される。

【0021】

抗体ＶＨを含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、ＶＨは、配列番号１９、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３７、配列番号４３、配列番号４９、配列番号５５、または配列番号６１と同一、または４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一のＶＨ相補性決定領域−３（ＶＨＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片がさらに提供される。

【0022】

抗体ＶＬを含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、ＶＬは、配列番号２０、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４４、配列番号５０、配列番号５６、または配列番号６２と同一、または４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一のＶＬ相補性決定領域−１（ＶＬＣＤＲ１）アミノ酸配列を含む単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片も開示される。

【0023】

抗体ＶＬを含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、ＶＬは、配列番号２１、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、または配列番号６３と同一、または４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一のＶＬ相補性決定領域−２（ＶＬＣＤＲ２）アミノ酸配列を含む単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片がさらに提供される。

【0024】

一部の実施形態は、抗体ＶＬを含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、ＶＬは、配列番号２２、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、または配列番号６４と同一、または４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一のＶＬ相補性決定領域−３（ＶＬＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を含む。

【0025】

抗体ＶＨを含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、ＶＨは、配列番号１７、１８、および１９、配列番号２３、２４、および２５、配列番号２６、２７、および２８、配列番号２９、３０、および３１、配列番号３５、３６、および３７、配列番号４１、４２、および４３、配列番号４７、４８、および４９、配列番号５３、５４、および５５、または配列番号５９、６０、および６１とそれぞれ同一、またはＶＨＣＤＲの１つまたは複数における４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片も提供される。

【0026】

一部の実施形態は、抗体ＶＬを含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、ＶＬは、配列番号２０、２１、および２２、配列番号３２、３３、および３４、配列番号３８、３９、および４０、配列番号４４、４５、および４６、配列番号５０、５１、および５２、配列番号５６、５７、および５８、または配列番号６２、６３、および６４とそれぞれ同一、またはＶＨＣＤＲの１つまたは複数における４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を含む。

【0027】

抗体ＶＬを含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、ＶＬは、配列番号２０、２１、および２２、配列番号３２、３３、および３４、配列番号３８、３９，および４０、配列番号４４、４５、および４６、配列番号５０、５１、および５２、配列番号５６、５７、および５８、または配列番号６２、６３、および６４とそれぞれ同一、またはＶＨＣＤＲの１つまたは複数における４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片も開示される。

【0028】

一部の実施形態は、（ａ）上皮細胞への緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の付着を阻害し得、（ｂ）緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＯＰＫを促進し得、または（ｃ）上皮細胞への緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の付着を阻害し得、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＯＰＫを促進し得る上記単離結合分子、例えば、抗体またはその断片を含む。

【0029】

他の実施形態は、上記単離結合分子、例えば、抗体またはその断片であって、上皮細胞への緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）付着の最大阻害は、約５０μｇ／ｍｌ以下、５．０μｇ／ｍｌ以下、もしくは約０．５μｇ／ｍｌ以下の抗体濃度、または約３０μｇ／ｍｌから約０．３μｇ／ｍｌの範囲の抗体濃度、または約１μｇ／ｍｌの抗体濃度、または約０．３μｇ／ｍｌの抗体濃度において達成される単離結合分子、例えば、抗体またはその断片を含む。

【0030】

ある実施形態は、上記単離結合分子、例えば、抗体またはその断片であって、ＯＰＫ ＥＣ５０は、約０．５μｇ／ｍｌ未満、約０．０５μｇ／ｍｌ未満、もしくは約０．００５μｇ／ｍｌ未満であり、またＯＰＫ ＥＣ５０は、約０．００１μｇ／ｍｌから約０．５μｇ／ｍｌの範囲であり、またはＯＰＫ ＥＣ５０は、約０．２μｇ／ｍｌ未満であり、またはＯＰＫ ＥＣ５０は、約０．０２μｇ／ｍｌ未満である単離結合分子、例えば、抗体またはその断片を含む。

【0031】

上記単離結合分子、例えば、抗体またはその断片であって、５×１０^−２Ｍ、１０^−２Ｍ、５×１０^−３Ｍ、１０^−３Ｍ、５×１０^−４Ｍ、１０^−４Ｍ、５×１０^−５Ｍ、１０^−５Ｍ、５×１０^−６Ｍ、１０^−６Ｍ、５×１０^−７Ｍ、１０^−７Ｍ、５×１０^−８Ｍ、１０^−８Ｍ、５×１０^−９Ｍ、１０^−９Ｍ、５×１０^−１０Ｍ、１０^−１０Ｍ、５×１０^−１１Ｍ、１０^−１１Ｍ、５×１０^−１２Ｍ、１０^−１２Ｍ、５×１０^−１３Ｍ、１０^−１３Ｍ、５×１０^−１４Ｍ、１０^−１４Ｍ、５×１０^−１５Ｍ、もしくは１０^−１５Ｍ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする親和性で緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌに特異的に結合し、または、Ｋ_Ｄは、約１×１０^−１０Ｍから約１×１０^−６Ｍの範囲である単離結合分子、例えば、抗体またはその断片も含まれる。一実施形態において、本明細書に記載の単離抗体は、ＯＣＴＥＴ（登録商標）結合アッセイにより測定される約１．１８×１０^−７ＭのＫ_Ｄを特徴とする親和性でシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する。別の実施形態において、本明細書に記載の単離抗体は、ＯＣＴＥＴ（登録商標）結合アッセイにより測定される約１．４４×１０^−７ＭのＫ_Ｄを特徴とする親和性でシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する。

【0032】

種々の実施形態において、上記結合分子は、ヒト化である。

【0033】

種々の実施形態において、上記結合分子は、キメラである。

【0034】

種々の実施形態において、上記結合分子は、完全ヒトである。

【0035】

ある実施形態において、上記結合分子は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）_２断片、またはｓｃＦｖ断片である。

【0036】

ある実施形態において、上記結合分子は、ヒトカッパ定常領域またはヒトラムダ定常領域からなる軽鎖定常領域を含む。

【0037】

ある実施形態において、上記結合分子は、重鎖定常領域またはその断片を含む。さらなる実施形態において、重鎖定常領域またはその断片は、ヒトＩｇＧ１である。

【0038】

ある実施形態において、上記結合分子は、モノクローナル抗体である。

【0039】

一部の実施形態において、上記結合分子、例えば、抗体またはその断片は、抗菌剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生物学的応答改質剤、医薬剤、リンホカイン、異種抗体またはその断片、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、および任意の前記薬剤の２つ以上の組合せからなる群から選択される薬剤にコンジュゲートされている。さらなる実施形態において、検出可能な標識は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、または任意の前記検出可能な標識の２つ以上の組合せからなる群から選択される。

【0040】

追加の実施形態は、上記結合分子、例えば、抗体またはその断片、および担体を含む組成物を含む。

【0041】

ある実施形態は、上記ＶＨをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、上記ＶＬをコードする核酸をさらに含み、ポリヌクレオチドにより発現される結合分子またはその抗原結合断片は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する。一部の実施形態において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、ＶＨおよびＶＬを含むｓｃＦｖ分子をコードし、ヌクレオチド配列配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９または配列番号７０を含む。他の実施形態において、本開示は、上記ＶＬをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、上記ＶＨをコードする核酸をさらに含み、ポリヌクレオチドにより発現される結合分子またはその抗原結合断片は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する。

【0042】

ある実施形態は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、プロモーターと作動可能に会合している。追加の実施形態において、本開示は、そのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。さらなる実施形態において、本開示は、ポリヌクレオチドがプロモーターと作動可能に会合しており、好適な宿主細胞中でシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する上記結合分子、例えば、抗体またはその断片を発現し得るベクターを提供する。

【0043】

一部の実施形態は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する上記結合分子、例えば、抗体またはその断片を産生する方法において、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを含有する宿主細胞を培養すること、および前記抗体、またはその断片を回収することを含む方法を提供する。さらなる実施形態は、上記方法により産生される単離結合分子またはその断片を提供する。

【0044】

一部の実施形態において、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である。

【0045】

さらなる実施形態において、上記結合分子またはその断片、抗体またはその断片、または組成物は、２つ以上、３つ以上、４つ以上、もしくは５つ以上の異なる緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）血清型、または感染患者から単離された緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％に結合する。さらなる実施形態において、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株は、肺、唾液、眼、膿汁、糞便、尿、洞、創傷、皮膚、血液、骨、または膝液の１つまたは複数から単離される。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）血清型は、Ｌｉｕ，Ｐ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３：２５６−２６４（１９８３）により元々記載され、例えば、Ｌｉｕ Ｐ．Ｖ．，Ｗａｎｇ Ｓ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：９２２−９２５（１９９０）により追補された国際抗原分類系（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｔｙｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＩＡＴＳ）に従って分類される。

【0046】

一部の実施形態は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染の予防または治療が必要とされる対象においてシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染を予防または治療する方法であって、対象に有効量の本明細書に記載の結合分子もしくはその断片、抗体もしくはその断片、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を投与することを含む方法を対象とする。さらなる実施形態において、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染である。一部の実施形態において、対象はヒトである。ある実施形態において、感染は眼感染、肺感染、火傷感染、創傷感染、皮膚感染、血液感染、骨感染、または前記感染の２つ以上の組合せである。さらなる実施形態において、対象は、急性肺炎、熱傷、角膜感染、嚢胞性線維症、またはそれらの組合せを罹患する。

【0047】

一部の実施形態は、上皮細胞への緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の付着を遮断または予防する方法であって、上皮細胞および緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の混合物を、本明細書に記載の結合分子もしくはその断片、抗体もしくはその断片、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞と接触させることを含む方法を対象とする。

【0048】

緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＯＰＫを促進する方法であって、食細胞および緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の混合物を、本明細書に記載の結合分子もしくはその断片、抗体もしくはその断片、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞と接触させることを含む方法も開示される。さらなる実施形態において、食細胞は、分化ＨＬ−６０細胞またはヒト多形核白血球（ＰＭＮ）である。
本発明はまた、以下を含む。
[項目１]
シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片であって、（ａ）上皮細胞への緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の付着を阻害し得、（ｂ）緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のオプソニン食菌殺傷（ＯＰＫ）を促進し得、または（ｃ）上皮細胞への緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の付着を阻害し得、かつ緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＯＰＫを促進し得る、前記単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目２]
抗体またはその抗原結合断片を含む、項目１に記載の結合分子またはその断片。
[項目３]
ＷａｐＲ−００４、Ｃａｍ−００３、Ｃａｍ−００４、またはＣａｍ−００５の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）領域を含む抗体またはその抗原結合断片と同一のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌエピトープに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目４]
シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合し、ＷａｐＲ−００４、Ｃａｍ−００３、Ｃａｍ−００４、またはＣａｍ−００５のＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片によるシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合を競合阻害する、単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目５]
前記ＷａｐＲ−００４のＶＨおよびＶＬは、配列番号１１および配列番号１２をそれぞれ含み、前記Ｃａｍ−００３のＶＨおよびＶＬは、配列番号１および配列番号２をそれぞれ含み、前記Ｃａｍ−００４のＶＨおよびＶＬは、配列番号３および配列番号２をそれぞれ含み、前記Ｃａｍ−００５のＶＨおよびＶＬは、配列番号４および配列番号２をそれぞれ含む、項目３または４に記載の結合分子またはその断片。
[項目６]
ＷａｐＲ−００１、ＷａｐＲ−００２、またはＷａｐＲ−００３のＶＨおよびＶＬ領域を含む抗体またはその抗原結合断片と同一のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌエピトープに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目７]
シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合し、ＷａｐＲ−００１、ＷａｐＲ−００２、またはＷａｐＲ−００３のＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片によるシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合を競合阻害する、単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目８]
前記ＷａｐＲ−００１のＶＨおよびＶＬは、配列番号５および配列番号６をそれぞれ含み、前記ＷａｐＲ−００２のＶＨおよびＶＬは、配列番号７および配列番号８をそれぞれ含み、前記ＷａｐＲ−００３のＶＨおよびＶＬは、配列番号９および配列番号１０をそれぞれ含む、項目６または７に記載の結合分子またはその断片。
[項目９]
ＷａｐＲ−０１６のＶＨおよびＶＬ領域を含む抗体またはその抗原結合断片と同一のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌエピトープに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目１０]
シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合し、ＷａｐＲ−０１６のＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片によるシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合を競合阻害する、単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目１１]
前記ＷａｐＲ−０１６のＶＨおよびＶＬは、配列番号１５および配列番号１６をそれぞれ含む、項目９または１０に記載の結合分子またはその断片。
[項目１２]
抗体ＶＨを含む、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号１５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、前記単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目１３]
前記ＶＨは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号１５を含む、項目１２に記載の結合分子またはその断片。
[項目１４]
抗体ＶＬを含む、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片であって、前記ＶＬは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、および配列番号１６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、前記単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目１５]
前記ＶＬは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、および配列番号１６を含む、項目１４に記載の結合分子またはその断片。
[項目１６]
抗体またはその抗原結合断片を含む、項目３〜１５のいずれか１項に記載の結合分子またはその断片。
[項目１７]
（ａ）それぞれ、配列番号１および配列番号２、
（ｂ）それぞれ、配列番号３および配列番号２、
（ｃ）それぞれ、配列番号４および配列番号２、
（ｄ）それぞれ、配列番号５および配列番号６、
（ｅ）それぞれ、配列番号７および配列番号８、
（ｆ）それぞれ、配列番号９および配列番号１０、
（ｇ）それぞれ、配列番号１１および配列番号１２、
（ｈ）それぞれ、配列番号１３および配列番号１４、または
（ｉ）ぞれぞれ、配列番号１５および配列番号１６、
と少なくとも９０％同一のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
[項目１８]
（ａ）それぞれ、配列番号１および配列番号２、
（ｂ）それぞれ、配列番号３および配列番号２、
（ｃ）それぞれ、配列番号４および配列番号２、
（ｄ）それぞれ、配列番号５および配列番号６、
（ｅ）それぞれ、配列番号７および配列番号８、
（ｆ）それぞれ、配列番号９および配列番号１０、
（ｇ）それぞれ、配列番号１１および配列番号１２、
（ｈ）それぞれ、配列番号１３および配列番号１４、または
（ｉ）ぞれぞれ、配列番号１５および配列番号１６、
のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む、項目１７に記載の抗体またはその断片。
[項目１９]
抗体ＶＨを含む、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨは、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４７、配列番号５３、または配列番号５９と同一、または４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一のＶＨ相補性決定領域−１（ＶＨＣＤＲ１）アミノ酸配列を含む、前記単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目２０]
抗体ＶＨを含む、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨは、配列番号１８、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３６、配列番号４２、配列番号４８、配列番号５４、または配列番号６０と同一、または４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一のＶＨ相補性決定領域−２（ＶＨＣＤＲ２）アミノ酸配列を含む、前記単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目２１]
抗体ＶＨを含む、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨは、配列番号１９、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３７、配列番号４３、配列番号４９、配列番号５５、または配列番号６１と同一、または４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一のＶＨ相補性決定領域−３（ＶＨＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む、前記単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目２２]
抗体ＶＬを含む、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片であって、前記ＶＬは、配列番号２０、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４４、配列番号５０、配列番号５６、または配列番号６２と同一、または４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一のＶＬ相補性決定領域−１（ＶＬＣＤＲ１）アミノ酸配列を含む、前記単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目２３]
抗体ＶＬを含む、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片であって、前記ＶＬは、配列番号２１、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５７、または配列番号６３と同一、または４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一のＶＬ相補性決定領域−２（ＶＬＣＤＲ２）アミノ酸配列を含む、前記単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目２４]
抗体ＶＬを含む、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片であって、前記ＶＬは、配列番号２２、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４６、配列番号５２、配列番号５８、または配列番号６４と同一、または４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一のＶＬ相補性決定領域−３（ＶＬＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む、前記単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目２５]
抗体ＶＨを含む、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片であって、前記ＶＨは、配列番号１７、１８および１９、配列番号２３、２４および２５、配列番号２６、２７および２８、配列番号２９、３０および３１、配列番号３５、３６および３７、配列番号４１、４２および４３、配列番号４７、４８および４９、配列番号５３、５４および５５、または配列番号５９、６０および６１とそれぞれ同一、またはＶＨＣＤＲの１つまたは複数における４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、およびＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、前記単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目２６]
抗体ＶＬを含む、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子またはその抗原結合断片であって、前記ＶＬは、配列番号２０、２１および２２、配列番号３２、３３および３４、配列番号３８、３９および４０、配列番号４４、４５および４６、配列番号５０、５１および５２、配列番号５６、５７および５８、または配列番号６２、６３および６４とそれぞれ同一、またはＶＨＣＤＲの１つまたは複数における４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、前記単離結合分子またはその抗原結合断片。
[項目２７]
前記結合分子またはその断片が抗体またはその抗原結合断片を含む、項目１９〜２６のいずれか１項に記載の結合分子。
[項目２８]
ＶＨおよびＶＬを含む、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１７、１８、１９、２０、２１および２２、配列番号２３、２４、２５、２０、２１および２２、配列番号２６、２７、２８、２０、２１および２２、配列番号２９、３０、３１、３２、３３および３４、配列番号３５、３６、３７、３８、３９および４０、配列番号４１、４２、４３、４４、４５および４６、配列番号４７、４８、４９、５０、５１および５２、配列番号５３、５４、５５、５６、５７および５８、または配列番号５９、６０、６１、６２、６３および６４とそれぞれ同一、または１つまたは複数のＣＤＲにおける４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、前記単離抗体またはその抗原結合断片。
[項目２９]
（ａ）上皮細胞への緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の付着を阻害し得、（ｂ）緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＯＰＫを促進し得、または（ｃ）上皮細胞への緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の付着を阻害し得、かつ緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＯＰＫを促進し得る、項目２、１６〜１８、２７、または２８のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
[項目３０]
上皮細胞への緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）付着の最大阻害は、約５０μｇ／ｍｌ以下、５．０μｇ／ｍｌ以下、または約０．５μｇ／ｍｌ以下の抗体濃度において達成される、項目２９に記載の抗体またはその断片。
[項目３１]
上皮細胞への緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）付着の最大阻害は、約３０μｇ／ｍｌから約０．３μｇ／ｍｌの範囲の抗体濃度において達成される、項目２９に記載の抗体またはその断片。
[項目３２]
ＯＰＫ ＥＣ５０は、約０．５μｇ／ｍｌ未満、約０．０５μｇ／ｍｌ未満、または約０．００５μｇ／ｍｌ未満である、項目２９に記載の抗体またはその断片。
[項目３３]
ＯＰＫ ＥＣ５０は、約０．００１μｇ／ｍｌから約０．５μｇ／ｍｌの範囲である、項目２９に記載の抗体またはその断片。
[項目３４]
５×１０^-2Ｍ、１０^-2Ｍ、５×１０^-3Ｍ、１０^-3Ｍ、５×１０^-4Ｍ、１０^-4Ｍ、５×１０^-5Ｍ、１０^-5Ｍ、５×１０^-6Ｍ、１０^-6Ｍ、５×１０^-7Ｍ、１０^-7Ｍ、５×１０^-8Ｍ、１０^-8Ｍ、５×１０^-9Ｍ、１０^-9Ｍ、５×１０^-10Ｍ、１０^-10Ｍ、５×１０^-11Ｍ、１０^-11Ｍ、５×１０^-12Ｍ、１０^-12Ｍ、５×１０^-13Ｍ、１０^-13Ｍ、５×１０^-14Ｍ、１０^-14Ｍ、５×１０^-15Ｍ、または１０^-15Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）を特徴とする親和性で緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌに特異的に結合する、項目２、１６〜１８、または２７〜３３のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
[項目３５]
親和性は、約１×１０^-10Ｍから約１×１０^-6Ｍの範囲の解離定数（Ｋ_D）を特徴とする、項目２、１６〜１８、または２７〜３５のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
[項目３６]
ヒト化である、項目２、１６〜１８、または２７〜３５のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
[項目３７]
キメラである、項目２、１６〜１８、または２７〜３５のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
[項目３８]
完全ヒトである、項目２、１６〜１８、または２７〜３５のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
[項目３９]
Ｆａｂ断片である、項目２、１６〜１８、または２７〜３５のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
[項目４０]
Ｆａｂ'断片である、項目２、１６〜１８、または２７〜３５のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
[項目４１]
Ｆ（ａｂ）２断片である、項目２、１６〜１８、または２７〜３５のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
[項目４２]
単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片である、項目２、１６〜１８、または２７〜３５のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
[項目４３]
ヒトカッパ定常領域およびヒトラムダ定常領域からなる群から選択される軽鎖定常領域を含む、項目２、１６〜１８、または２７〜４１のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
[項目４４]
重鎖定常領域またはその断片を含む、項目２、１６〜１８、または２７〜４１のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
[項目４５]
前記重鎖定常領域またはその断片は、ヒトＩｇＧ１である、項目４４に記載の抗体またはその断片。
[項目４６]
モノクローナルである、項目２、１６〜１８、または２７〜４５のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
[項目４７]
配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＨおよび配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、項目１８に記載の抗体またはその断片。
[項目４８]
ヒトカッパ軽鎖定常領域またはその断片およびヒトＩｇＧ１重鎖定常領域またはその断片をさらに含む、項目４７に記載の抗体またはその断片。
[項目４９]
ＯＣＴＥＴ（登録商標）結合アッセイにより測定される、約１．１８×１０^-7ＭのＫ_Dを特徴とする親和性で緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に特異的に結合する、項目４７または４８に記載の抗体またはその断片。
[項目５０]
上皮細胞への付着の最大阻害は、約０．３μｇ／ｍｌの抗体濃度において達成される、項目４７〜４９のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
[項目５１]
ＯＰＫ ＥＣ５０は、約０．０２μｇ／ｍｌ未満である、項目４７〜５０のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
[項目５２]
配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨおよび配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、項目１８に記載の抗体またはその断片。
[項目５３]
ヒトラムダ軽鎖定常領域またはその断片およびヒトＩｇＧ１重鎖定常領域またはその断片をさらに含む、項目５２に記載の抗体またはその断片。
[項目５４]
ＯＣＴＥＴ（登録商標）結合アッセイにより測定される、約１．４４×１０^-7ＭのＫ_Dを特徴とする親和性で緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に特異的に結合する、項目５１または５２に記載の抗体またはその断片。
[項目５５]
上皮細胞への付着の最大阻害は、約１．０μｇ／ｍｌの抗体濃度において達成される、項目５１〜５４のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
[項目５６]
ＯＰＫ ＥＣ５０は、約０．２μｇ／ｍｌ未満である、項目５２〜５５のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
[項目５７]
前記抗体が、抗菌剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生物学的応答改質剤、医薬剤、リンホカイン、異種抗体またはその断片、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、および任意の前記薬剤の２つ以上の組合せからなる群から選択される薬剤にコンジュゲートされている、項目２、１６〜１８、または２７〜５６のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
[項目５８]
前記検出可能な標識は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、または任意の前記検出可能な標識の２つ以上の組合せからなる群から選択される、項目５７に記載の抗体またはその断片。
[項目５９]
項目２、１６〜１８または２７〜５８のいずれか１項に記載の抗体またはその断片と担体とを含む組成物。
[項目６０]
項目３〜１３、１６〜２１、２５、または２７〜５９のいずれか１項に記載のＶＨをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチド。
[項目６１]
項目３〜１１、１４〜１８、２２〜２４、または２６〜５９のいずれか１項に記載のＶＬをコードする核酸をさらに含み、前記ポリヌクレオチドにより発現される結合分子またはその抗原結合断片は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する、項目６０に記載のポリヌクレオチド。
[項目６２]
配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、または配列番号７０のヌクレオチド配列を含む、ＶＨおよびＶＬを含むｓｃＦｖ分子をコードする、項目６１に記載のポリヌクレオチド。
[項目６３]
項目３〜１１、１４〜１８、２２〜２４、または２６〜５９のいずれか１項に記載のＶＬをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチド。
[項目６４]
項目３〜１３、１６〜２１、２５、または２７〜５９のいずれか１項に記載のＶＨをコードする核酸をさらに含み、前記ポリヌクレオチドにより発現される結合分子またはその抗原結合断片は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する、項目６３に記載のポリヌクレオチド。
[項目６５]
項目６０に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[項目６６]
前記ポリヌクレオチドと作動可能に会合しているプロモーターをさらに含む、項目６５に記載のベクター。
[項目６７]
項目６３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[項目６８]
前記ポリヌクレオチドと作動可能に会合しているプロモーターをさらに含む、項目６７に記載のベクター。
[項目６９]
項目６１、６２、または６４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[項目７０]
前記ポリヌクレオチドと作動可能に会合している１つまたは複数のプロモーターを含み、好適な宿主細胞中でシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する結合分子を発現し得る、項目６９に記載のベクター。
[項目７１]
項目６０〜６４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは項目６５〜７０のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
[項目７２]
シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する結合分子またはその抗原結合断片を産生する方法であって、項目７１に記載の宿主細胞を培養すること、および前記結合分子またはその断片を回収することを含む、前記方法。
[項目７３]
項目７２に記載の方法により産生される、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する結合分子またはその抗原結合断片。
[項目７４]
前記シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である、項目１〜１６もしくは１９〜２７のいずれか１項に記載の結合分子もしくはその断片、項目２、１６〜１８、もしくは２７〜５８のいずれか１項に記載の抗体もしくはその断片、項目５９に記載の組成物、項目６０〜６４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、項目６５〜７０のいずれか１項に記載のベクター、または項目７１に記載の宿主細胞。
[項目７５]
２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上の異なる緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）血清型に結合する、項目７４に記載の結合分子もしくはその断片、抗体もしくはその断片、または組成物。
[項目７６]
感染患者から単離された緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％に結合する、項目７４または７５に記載の結合分子もしくはその断片、抗体もしくはその断片、または組成物。
[項目７７]
前記緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株は、肺、唾液、眼、膿汁、糞便、尿、洞、創傷、皮膚、血液、骨、または膝液の１つまたは複数から単離される、項目７６に記載の結合分子もしくはその断片、抗体もしくはその断片、または組成物。
[項目７８]
シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染の予防または治療が必要とされる対象においてシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染を予防または治療する方法であって、前記対象に有効量の項目１〜１６もしくは１９〜２７のいずれか１項に記載の結合分子もしくはその断片、項目２、１６〜１８、もしくは２７〜５８のいずれか１項に記載の抗体もしくはその断片、項目５９に記載の組成物、項目６０〜６４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、項目６５〜７０のいずれか１項に記載のベクター、または項目７１に記載の宿主細胞を投与することを含む、前記方法。
[項目７９]
前記シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染である、項目７８に記載の方法。
[項目８０]
前記対象は、ヒトである、項目７８または７９に記載の方法。
[項目８１]
前記感染は、眼感染、肺感染、火傷感染、創傷感染、皮膚感染、血液感染、骨感染、または前記感染の２つ以上の組合せである、項目７８〜８０のいずれか１項に記載の方法。
[項目８２]
前記対象は、急性肺炎、熱傷、角膜感染、嚢胞性線維症、またはそれらの組合せを罹患する、項目７８〜８１のいずれか１項に記載の方法。
[項目８３]
上皮細胞への緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の付着を遮断または予防する方法であって、上皮細胞および緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の混合物を、項目１〜１６もしくは１９〜２７のいずれか１項に記載の結合分子もしくはその断片、項目２、１６〜１８、もしくは２７〜５８のいずれか１項に記載の抗体もしくはその断片、項目５９に記載の組成物、項目６０〜６４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、項目６５〜７０のいずれか１項に記載のベクター、または項目７１に記載の宿主細胞と接触させることを含む、前記方法。
[項目８４]
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＯＰＫを向上させる方法であって、食細胞および緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の混合物を、項目１〜１６もしくは１９〜２７のいずれか１項に記載の結合分子もしくはその断片、項目２、１６〜１８、もしくは２７〜５８のいずれか１項に記載の抗体もしくはその断片、項目５９に記載の組成物、項目６０〜６４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、項目６５〜７０のいずれか１項に記載のベクター、または項目７１に記載の宿主細胞と接触させることを含む、前記方法。
[項目８５]
前記食細胞は、分化ＨＬ−６０細胞またはヒト多形核白血球（ＰＭＮ）である、項目８４に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0049】

【図1-1】ヒト抗体ファージライブラリーを用いる表現型全細胞スクリーニングは、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）機能的活性特異的抗体を同定した。（Ａ）完全抗体選択方針の概要。（Ｂ）緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に最近曝露された患者から抗体可変領域遺伝子を単離する方法を記載するフローダイヤグラム。（Ｃ）クローニングされた抗体レパートリーのサイズおよび多様性を示すｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーの特徴。（Ｄ）懸濁液中の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）３０６４ΔＷａｐＲ（^１）または緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１ ＭｅｘＡＢ ＯｐｒＭΔＷａｐＲ（^２）に基づき選択する場合の患者抗体ライブラリーまたはナイーブ抗体ライブラリーのいずれかを効率的に使用するファージディスプレイ選択効率の比較。バーは、それぞれの選択ラウンドにおけるアウトプット力価（ＣＦＵ）を示し、円は、重複ＶＨＣＤＲ３配列の比率、クローン濃縮の指標を示す。（Ｅ）緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の複数の株への結合を試験するためのファージディスプレイからのｓｃＦＶのＥＬＩＳＡスクリーン。ＥＬＩＳＡデータ（４５０ｎｍにおける吸光度）を選択からの８つの個々のファージ−ｓｃＦｖおよび１つの無関連ファージ−ｓｃＦｖについて示す。（Ｆ）緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）特異的抗体とユニークな緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）血清型からの代表株とのＦＡＣＳ結合。それぞれの試験抗体について、ヒトＩｇＧ陰性対照抗体を陰影ピークとして示す。

【図1-2】図１−１の続きである。

【図1-3】図１−２の続きである。

【図2-1】緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＯＰＫを促進する特異的ｍＡｂの評価。（Ａ）ファージパニングに由来する精製モノクローナル抗体の希釈物を用いる発光緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）血清型Ｏ５株（ＰＡＯ１．ｌｕｘ）を用いるオプソニン食菌アッセイ。（Ｂ）ファージパニングに由来する精製ＷａｐＲ−００４およびＣａｍ−００３モノクローナル抗体の希釈物を用いる発光緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）血清型Ｏ１１株（９８８２−８０．ｌｕｘ）を用いるオプソニン食菌アッセイ。ＡおよびＢの両方において、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）抗原に結合しないアイソタイプ適合ヒトモノクローナル抗体Ｒ３４７を陰性対照として使用した。（Ａ、Ｂ）結果は、それぞれの抗体について実施された３つの独立実験からの代表データである。（Ｃ〜Ｄ）：緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のオプソニン食菌殺傷（ＯＰＫ）を促進するＣａｍ−００３の評価。（Ｃ）臨床関連Ｏ抗原血清型からの代表的な非ムコイド株（６２９４（Ｏ６ ＥｘｏＵ⁻）、６０７７（Ｏ１１ ＥｘｏＵ^＋）、９８８２−８０．ｌｕｘ（Ｏ１１ ＥｘｏＵ⁻）、３３３５６（Ｏ９ ＥｘｏＵ⁻）、２４１０．ｌｕｘ（Ｏ６）および６２０６．ｌｕｘ（Ｏ１１ ＥｘｏＵ^＋））を用いるオプソニン食菌アッセイ。（Ｄ）発光するようにエンジニアリングされた代表的なムコイド株（Ａ００４．ｌｕｘ、Ａ０１０．ｌｕｘおよびＡ０１５．ｌｕｘ）を用いるオプソニン食菌アッセイ。線は平均殺傷パーセントを表し、エラーバーは標準偏差を表す。殺傷パーセントは、抗体の不存在下でのアッセイランにおいて得られた結果に対して計算した。（Ｃ、Ｄ）Ｒ３４７対照をそれぞれの株についての個々のアッセイ内で使用した。簡易性のため、Ｒ３４７対照は、図中に含めなかった。結果は、それぞれの株について実施された３つの独立実験からの代表データである。

【図2-2】図２−１の続きである。

【図3-1】表現型スクリーニングに由来する抗体の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌエキソ多糖標的の同定。抗体の反応性は、示された緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株によりコートされたプレート上で間接ＥＬＩＳＡにより測定した：（Ａ）野生型ＰＡＯ１、ＰＡＯ１ΔｗｂｐＬ、ＰＡＯ１ΔｒｍｌＣおよびＰＡＯ１ΔｇａｌＵ。（Ｂ）ＰＡＯ１ΔｐｓｌＡ。Ｇｅｎｗａｙ抗体は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外膜タンパク質に特異的であり、陽性対照として使用した。（Ｃ）ＰＡＯ１およびＰＡＯ１ΔｐｓｌＡへのＣａｍ−００３のＦＡＣＳ結合分析。Ｃａｍ−００３を、黒色実線および明確なピークにより示し；アイソタイプ適合非緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）特異的ヒトＩｇＧ１抗体を陰性対照として使用し、灰色線および陰影ピークにより示す。（Ｄ）ＰＡＯ１およびＰＡＯ１ΔｐｓｌＡから精製されたＬＰＳをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解し、外膜へのＯ抗原輸送およびアルギネート産生を欠損する突然変異株ＰＡＯ１ΔｗａｐＲΔａｌｇＤによりワクチン接種させたマウスに由来する抗血清により免疫ブロットした。（Ｅ）ＰＡＯ１のアイソジェニック突然変異体を用いるＣａｍ−００３ＥＬＩＳＡ結合データ。レーン１：ＰＡＯ１ΔｗｂｐＬΔａｌｇＤ；レーン２：ＰＡＯ１ΔｗｂｐＬΔａｌｇＤΔｐｓｌＡ；レーン３：ＰＡＯ１ΔｗｂｐＬΔａｌｇＤΔｐｅｌＡ；レーン４：ＰＡＯ１ΔｗｂｐＬΔａｌｇＤΔｐｓｌＡ＋ｐＵＣＰ；レーン５：ＰＡＯ１ΔｗｂｐＬΔａｌｇＤΔｐｓｌＡ＋ｐＰＷ１４５。ｐＰＷ１４５は、ｐｓｌＡを含有するｐＵＣＰ発現ベクターである。^＊は、Ｃａｍ−００３をＲ３４７結合と比較した場合のマン・ホイットニーＵ検定を使用したＰ＜０．００５を示す。（ＦおよびＧ）Ｃａｍ−００３がＰｓｌを産生し得る株（野生型ＰＡＯ１およびｐｓｌＡ遺伝子によりトランスで補完されたＰＡＯ１ΔｐｓｌＡ）の殺傷のみを媒介することを示すオプソニン食菌アッセイ。（ＨおよびＩ）抗Ｐｓｌ抗体ＷａｐＲ−００１、ＷａｐＲ−００４、およびＷａｐＲ−０１６とＰＡＯ１ΔｗｂｐＬΔａｌｇＤおよびＰＡＯ１ΔｗｂｐＬΔａｌｇＤΔｐｓｌＡとの反応性を示すＥＬＩＳＡデータ。（Ｊ）抗体の反応性は、示された緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株：野生型ＰＡＯ１、ＰＡＯ１ΔｗｂｐＬ、ＰＡＯ１ΔｗｂｐＬΔａｌｇＤ、ＰＡＯ１ΔｒｍｌＣおよびＰＡＯ１ΔｇａｌＵによりコートされたプレート上で間接ＥＬＩＳＡにより測定した。Ｒ３４７を全ての実験において陰性対照として使用した。（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ）。それぞれのパネルは、３つの独立実験からの代表データセットである。（Ｋ）ＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標）ＯＣＴＥＴ（登録商標）３８４装置上で計測された全緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細胞から単離された濃縮Ｐｓｌの抗Ｐｓｌ抗体捕捉。Ｒ３４７を陰性対照として使用した。結果は、３つの独立実験からの代表データである。

【図3-2】図３−１の続きである。

【図3-3】図３−２の続きである。

【図3-4】図３−３の続きである。

【図3-5】図３−４の続きである。

【図3-6】図３−５の続きである。

【図3-7】図３−６の続きである。

【図4】抗ＰｓｌｍＡｂは、Ａ５４９細胞への発光緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株ＰＡＯ１．ｌｕｘの細胞付着を阻害する。対数増殖期ＰＡＯ１．ｌｕｘをＡ５４９細胞のコンフルエント単層に１０のＭＯＩにおいて添加し、次いで繰り返し洗浄して未結合緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を除去した後にＲＬＵを分析した。結果は、それぞれの抗体濃度についてデュプリケートで実施された３つの独立実験を代表するものである。

【図5-1】インビボ継代した緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株は、Ｐｓｌの発現を維持／増加させる。Ｃａｍ−００３抗体を黒色実線および明確なピークにより示し；ヒトＩｇＧ陰性対照抗体を灰色線および陰影ピークにより示す。（Ａ）陽性対照については、Ｃａｍ−００３を一晩培養物から対数増殖期に成長させた株（約５×１０^８／ｍｌ）への結合についてアッセイした。（Ｂ）それぞれの株についての接種材料は、細胞叢に成長させた一晩ＴＳＡプレートから５×１０^８ＣＦＵ／ｍｌに調製し、フローサイトメトリーによりＣａｍ−００３に対する反応性について試験した。（Ｃ）腹腔内チャレンジ４時間後、細菌をマウスから腹腔洗浄により回収し、フローサイトメトリーによりＣａｍ−００３を用いてＰｓｌの存在についてアッセイした。（Ｄ）鼻腔内チャレンジ４時間後および（Ｅ）２４時間後、細菌をマウスから気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）により回収し、フローサイトメトリーによりＣａｍ−００３を用いてＰｓｌの存在についてアッセイした。それぞれのフローサイトメトリーパネルは、５つの独立実験からの代表データセットである。（Ｆ〜Ｕ）ユニークな緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）血清型（Ｆ）ＰＡＯ１（Ｏ５）、（Ｇ）２１３５（Ｏ１）、（Ｈ）２５３１（Ｏ１）、（Ｉ）２４１０（Ｏ６）、（Ｊ）２７６４（Ｏ１１）、（Ｋ）２７５７（Ｏ１１）、（Ｌ）３３３５６（Ｏ９）、（Ｍ）３３３４８（Ｏ１）、（Ｎ）３０３９（ＮＴ）、（Ｏ）３０６１（ＮＴ）、（Ｐ）３０６４（ＮＴ）、（Ｑ）１９６６０（ＮＴ）、（Ｒ）９８８２−８０（Ｏ１１）、（Ｓ）６０７３（Ｏ１１）、（Ｔ）６０７７（Ｏ１１）および（Ｕ）６２０６（Ｏ１１）からの代表株への緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）特異的抗体（Ｃａｍ−００３、Ｃａｍ−００４およびＣａｍ−００５）の結合。Ｃａｍ−００３、Ｃａｍ−００４、およびＣａｍ−００５抗体を灰色線および明確なピークにより示し；ヒトＩｇＧ陰性対照抗体を黒色実線および陰影ピークにより示す。

【図5-2】図５−１の続きである。

【図5-3】図５−２の続きである。

【図5-4】図５−３の続きである。

【図5-5】図５−４の続きである。

【図5-6】図５−５の続きである。

【図5-7】図５−６の続きである。

【図5-8】図５−７の続きである。

【図6-1】緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）急性肺炎モデルにおける抗Ｐｓｌモノクローナル抗体Ｃａｍ−００３またはＷａｐＲ−００４により処理された動物についての生存率。（Ａ〜Ｄ）動物を、Ｃａｍ−００３により４５、１５、および５ｍｇ／ｋｇにおいて、およびＲ３４７により４５ｍｇ／ｋｇにおいてまたはＰＢＳにより２４時間処理してから（Ａ）ＰＡＯ１（１．６×１０^７ＣＦＵ）、（Ｂ）３３３５６（３×１０^７ＣＦＵ）、（Ｃ）６２９４（７×１０^６ＣＦＵ）、（Ｄ）６０７７（１×１０^６ＣＦＵ）により鼻腔内感染させた。（Ｅ〜Ｆ）動物を、ＷａｐＲ−００４により５および１ｍｇ／ｋｇにおいて示されるとおり処理し、次いで６０７７により（Ｅ）（８×１０^５ＣＦＵ）、または（Ｆ）（６×１０^５ＣＦＵ）において感染させた。動物を７２時間（Ａ〜Ｄ）までまたは１２０時間（Ｅ〜Ｆ）についての生存率について慎重にモニタリングした。（Ｇ）動物を、Ｃａｍ−００３により１５ｍｇ／ｋｇもしくは５ｍｇ／ｋｇにおいて、またはＲ３４７により１５ｍｇ／ｋｇにおいて２４時間処理してからＰＡＯ１（４．４×１０^７ＣＦＵ）により鼻腔内感染させ、Ｃａｍ−００３により１５ｍｇ／ｋｇにおいて２４時間処理してからＰＡＯ１ΔｐｓｌＡ（３×１０^７ＣＦＵ）により鼻腔内感染させた。全ての実験において、ＰＢＳおよびＲ３４７は陰性対照として機能した。結果は、カプラン・マイヤー生存曲線として表し；生存率の差をＣａｍ−００３対Ｒ３４７についてログランク検定により計算した。（Ａ）Ｃａｍ−００３（４５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＜０．０００１；１５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．０００３；５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００３３）。（Ｂ）Ｃａｍ−００３（４５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００１２；１５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００１２；５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．０３７３）。（Ｃ）Ｃａｍ−００３（４５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．０００７；１５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００１９；５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．０２１２）。（Ｄ）Ｃａｍ−００３（４５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＜０．０００１；１５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＜０．０００１；５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．０００１）。結果は、少なくとも２つの独立実験を代表するものである。（Ｅ）［Ｃａｍ−００３（５ｍｇ／ｋｇ）対Ｒ３４７（５ｍｇ／ｋｇ）：Ｐ＝０．０２；Ｃａｍ−００３（１ｍｇ／ｋｇ）対Ｒ３４７（５ｍｇ／ｋｇ）：Ｐ＝０．４８４８；ＷａｐＲ−００４（５ｍｇ／ｋｇ）対Ｒ３４７（５ｍｇ／ｋｇ）：Ｐ＜０．０００１；ＷａｐＲ−００４（１ｍｇ／ｋｇ）対Ｒ３４７（５ｍｇ／ｋｇ）：Ｐ＝０．０８８６；ＷａｐＲ−００４（５ｍｇ／ｋｇ）対Ｃａｍ−００３（５ｍｇ／ｋｇ）：Ｐ＝０．００１７；ＷａｐＲ−００４（１ｍｇ／ｋｇ）対Ｃａｍ−００３（１ｍｇ／ｋｇ）：Ｐ＝０．２４６８；Ｒ３４７（５ｍｇ／ｋｇ）対ＰＢＳ：Ｐ＝０．６６７６］（Ｆ）［Ｃａｍ−００３（５ｍｇ／ｋｇ）対Ｒ３４７（５ｍｇ／ｋｇ）：Ｐ＝０．０００４；Ｃａｍ−００３（１ｍｇ／ｋｇ）対Ｒ３４７（５ｍｇ／ｋｇ）：Ｐ＜０．０００１；ＷａｐＲ−００４（５ｍｇ／ｋｇ）対Ｒ３４７（５ｍｇ／ｋｇ）：Ｐ＜０．０００１；ＷａｐＲ−００４（１ｍｇ／ｋｇ）対Ｒ３４７（５ｍｇ／ｋｇ）：Ｐ＜０．０００１；ＷａｐＲ−００４（５ｍｇ／ｋｇ）対Ｃａｍ−００３（５ｍｇ／ｋｇ）：Ｐ＝０．０００２；ＷａｐＲ−００４（１ｍｇ／ｋｇ）対Ｃａｍ−００３（１ｍｇ／ｋｇ）：Ｐ＝０．２６２８；Ｒ３４７（５ｍｇ／ｋｇ）対ＰＢＳ：Ｐ＝０．６６７６。（Ｇ）Ｃａｍ−００３（１５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００２８；５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００２８）］。結果は、５つの独立実験を代表するものである。

【図6-2】図６−１の続きである。

【図6-3】図６−２の続きである。

【図6-4】図６−３の続きである。

【図7-1】抗Ｐｓｌモノクローナル抗体Ｃａｍ−００３およびＷａｐＲ−００４は、急性肺炎の誘導後の臓器負荷を低減させる。マウスをＣａｍ−００３抗体により２４時間処理してから（Ａ）ＰＡＯ１（１．１×１０^７ＣＦＵ）、（Ｂ）３３３５６（１×１０^７ＣＦＵ）、（Ｃ）６２９４（６．２５×１０^６ＣＦＵ）（Ｄ）６０７７（１×１０^６ＣＦＵ）により感染させ、ＷａｐＲ−００４抗体により２４時間処理してから（Ｅ）６２９４（約１×１０^７ＣＦＵ）、および（Ｆ）６２０６（約１×１０^６ＣＦＵ）により感染させた。感染２４時間後、動物を安楽死させ、次いで生存ＣＦＵの同定のために臓器を摘出した。生存ＣＦＵの差は、Ｃａｍ−００３またはＷａｐＲ−００４対Ｒ３４７についてマン・ホイットニーＵ検定により決定した。（Ａ）肺：Ｃａｍ−００３（４５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００１５；１５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００２１；５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００１５）；脾臓：Ｃａｍ−００３（４５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．０１２０；１５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．０３６７）；腎臓：Ｃａｍ−００３（４５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００９２；１５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００５６）；（Ｂ）肺：Ｃａｍ−００３（４５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００１０；１５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＜０．０００１；５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００４５）；（Ｃ）肺：Ｃａｍ−００３（４５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．０００３；１５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００３９；５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００６８）；脾臓：Ｃａｍ−００３（４５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００５７；１５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．０２３０；５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００１２）；（Ｄ）肺：Ｃａｍ−００３（４５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．０００５；１５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．０００３；５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．０００７）；脾臓：Ｃａｍ−００３（４５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００１５；１５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００８９；５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００８９）；腎臓：Ｃａｍ−００３（４５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．０１９１；１５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．０３５５；５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００２１）。（Ｅ）肺：ＷａｐＲ−００４（１５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００１１；５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．０００４；１ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．０００２）；脾臓：ＷａｐＲ−００４（１５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＜０．０００１；５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００１４；１ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＜０．０００１）；Ｆ）肺：ＷａｐＲ−００４（１５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＜０．０００１；５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．０００６；１ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００７９）；脾臓：ＷａｐＲ−００４（１５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００５９；５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．０２６１；１ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．００４７）；腎臓：ＷａｐＲ−００４（１５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．０２０８；５ｍｇ／ｋｇ−Ｐ＝０．０２６８。

【図7-2】図７−１の続きである。

【図7-3】図７−２の続きである。

【図8-1】抗Ｐｓｌモノクローナル抗体Ｃａｍ−００３およびＷａｐＲ−００４は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）角膜炎モデルおよび熱損傷モデルにおいて活性である。マウスを対照ＩｇＧ１抗体またはＣａｍ−００３により４５ｍｇ／ｋｇ（Ａ、Ｂ）もしくは１５ｍｇ／ｋｇ（Ｃ、Ｄ）においてまたはＰＢＳまたは対照ＩｇＧ１抗体またはＣａｍ−００３により４５ｍｇ／ｋｇにおいてまたはＷａｐＲ−００４により４５ｍｇ／ｋｇもしくは１５ｍｇ／ｋｇもしくは５ｍｇ／ｋｇ（Ｆ、Ｇ）において２４時間処理してから６０７７（Ｏ１１−細胞毒性−２×１０^６ＣＦＵ）により感染させた。感染直前、３つの１ｍｍの擦り傷をそれぞれの動物の左角膜上に作り、次いで５μｌの接種材料中の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を局所塗布した。感染２４時間後、角膜病理学的スコアを計算し、次いで生存ＣＦＵの測定のために眼を摘出した。病理学的スコアおよび生存ＣＦＵの差は、マン・ホイットニーＵ検定により決定した。（Ａ）Ｐ＝０．０００１、（Ｂ）Ｐ＜０．０００１、（Ｃ）Ｐ＝０．０００３、（Ｄ）Ｐ＝０．００１５。（Ｆ）および（Ｇ）Ｃａｍ−００３（４５ｍｇ／ｋｇ）対ＷａｐＲ−００４（４５ｍｇ／ｋｇ）：Ｐ＝０．０１８；Ｃａｍ−００３（４５ｍｇ／ｋｇ）対ＷａｐＲ−００４（１５ｍｇ／ｋｇ）：Ｐ＝０．００２５；ＷａｐＲ−００４（４５ｍｇ／ｋｇ）対ＷａｐＲ−００４（１５ｍｇ／ｋｇ）：Ｐ＝０．１３３１；ＷａｐＲ−００４（５ｍｇ／ｋｇ）対対照：Ｐ＜０．０００１。結果は、５つの独立実験を代表するものである。（Ｅ）６０７７感染（２×１０^５ＣＦＵ）後の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）熱損傷モデルにおけるＣａｍ−００３およびＲ３４７処理ＣＦ−１マウスからの生存率分析（ログランク：Ｒ３４７対Ｃａｍ−００３ １５ｍｇ／ｋｇ、Ｐ＝０．００９４；Ｒ３４７対Ｃａｍ−００３ ５ｍｇ／ｋｇ、Ｐ＝０．００１７）。結果は、少なくとも３つの独立実験を代表するものである。（ｎ）は、それぞれの群の動物数を指す。

【図8-2】図８−１の続きである。

【図9-1】Ｃａｍ−００３Ｆｃ突然変異抗体、Ｃａｍ−００３−ＴＭは、ＯＰＫおよびインビボ効力を縮小させたが、抗細胞付着活性を維持した。（Ａ）Ｃａｍ−００３およびＦｃγ受容体とのＦｃ相互作用を妨げるＦｃドメイン中の突然変異を保有するＣａｍ−００３−ＴＭ（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６４，７００−７０４（２００８））を用いるＰＡＯ１．ｌｕｘ ＯＰＫアッセイ。Ｒ３４７を陰性対照として使用した。結果は、３つの独立実験からの代表データである。（Ｂ）Ｃａｍ−００３およびＣａｍ−００３−ＴＭを用いるＰＡＯ１細胞付着アッセイ。結果は、２つの独立実験からの代表データである。（Ｃ〜Ｅ）Ｃａｍ−００３対Ｃａｍ−００３−ＴＭの効力を比較する急性肺炎モデル。Ｃａｍ−００３対Ｃａｍ−００３−ＴＭの効力を比較する（Ｃ）１．２２×１０^６（Ｄ）２．３５×１０^５または（Ｅ）１．０７×１０^６を接種されたＢＡＬＢ／ｃマウスを使用する緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株６０７７急性肺炎モデル。マウスを抗体により２４時間処理してからチャレンジした。（Ｃ〜Ｅ）１０匹のマウスをそれぞれの群に使用した。結果は、２つの独立実験からの代表データである。

【図9-2】図９−１の続きである。

【図10A】抗Ｐｓｌモノクローナル抗体についてのエピトープマッピングおよびその相対結合親和性の同定。エピトープマッピングは、競合ＥＬＩＳＡにより実施し、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株ＰＡＯ１の一晩培養物の上澄みに由来するＰｓｌを用いるＯＣＴＥＴ（登録商標）フローシステムを使用して確認した。相対結合親和性は、ＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標）ＯＣＴＥＴ（登録商標）３８４装置上で計測した。細胞付着が最大で阻害された抗体濃度およびそれぞれの抗体についてのＯＰＫ ＥＣ５０値も示す。Ｂ．ＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標）ＯＣＴＥＴ（登録商標）３８４装置上で計測された種々のＷａｐＲ−００４突然変異体の相対結合親和性。それぞれの突然変異体についてのＯＰＫ ＥＣ５０値も示す。

【図10B】図１０Ａの続きである。

【図11-1】緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＯＰＫアッセイにおけるＷａｐＲ−００４（Ｗ４）突然変異体クローンの評価。（Ａ〜Ｍ）ｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマットの異なるＷ４突然変異体クローンの希釈物を用いる発光緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）血清型Ｏ５株（ＰＡＯ１．ｌｕｘ）を用いるオプソニン食菌アッセイ。一部の例において、Ｗ４ＩｇＧ１をアッセイに含め、Ｗ４−ＩｇＧ１として示した。Ｗ４−ＲＡＤ−ＣａｍおよびＷ４−ＲＡＤ−ＧＢは、本明細書に記載の同一のＷａｐＲ−００４ＲＡＤ配列を表す。「Ｗ４−ＲＡＤ」は、ＷａｐＲ−００４ＲＡＤの略称であり、パネルＤからＭのＷ４−ＲＡＤ−ＣａｍおよびＷ４−ＲＡＤ−ＧＢの名称は、ＷａｐＲ−００４ＲＡＤの２つの異なる調製物を表す。全ての実験において、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）抗原に結合しないヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体Ｒ３４７を陰性対照として使用した。

【図11-2】図１１−１の続きである。

【図11-3】図１１−２の続きである。

【図11-4】図１１−３の続きである。

【図12】単一リンカーのコンジュゲーションを優先するように決定された条件下でヘテロ二官能性ＳＭ−ＰＥＧ_１２リンカー（Ｐｉｅｒｃｅ）をＰＭＢ上の第１級アミンにコンジュゲートしたｍＡｂへのポリミキシンＢ（ＰＭＢ）の部位特異的コンジュゲーションの方法。コンジュゲーション効率および試料中のレベル遊離ＰＭＢリンカーは、ＵＰＬＣおよび質量分析により測定した。

【図13】ＰＭＢ−ｍＡｂ部位特異的コンジュゲート。開発された部位特異的コンジュゲーション法を使用して、ＰＭＢを、Ｆｃ領域中にエンジニアリングされた１つ（ＳＭ、ＮＤ１０）、２つ（ＤＭ、ＮＤ１０／１９）または３つ（ＴＭ、ＮＤ４／１０／１９）のシステインのいずれかを有するＣＡＭ−００３およびＡ７（ｈＩｇＧ１対照ｌ）ｍＡｂバリアントにコンジュゲートした。Ａ：Ｃａｍ−００３およびＡ７Ｆｃ領域突然変異残基。Ｂ：ＰＭＢ−ｍＡｂコンジュゲート中のＰＭＢの平均数（単一突然変異体（ＳＭ）＞二重突然変異体１（ＤＭ１）＞二重突然変異体２（ＤＭ２））。

【図14】野生型緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１細胞へのＰＭＢ−ｍＡｂコンジュゲート結合のＦＡＣＳ分析による評価。Ａ：Ｃａｍ−００３（Ｃａｍ−００３−ＳＭ−ＰＭＢ、Ｃａｍ−００３−ＤＭ１−ＰＭＢ、Ｃａｍ−００３−ＤＭ２−ＰＭＢ、モック−コンジュゲート野生型Ｃａｍ−００３（Ｃａｍ−００３−モック−ＰＭＢ））。Ｂ：Ａ７対照コンジュゲート（Ａ７−ＳＭ−ＰＭＢ、Ａ７−ＤＭ１−ＰＭＢ、Ａ７−ＤＭ２−ＰＭＢ、モック−コンジュゲート野生型Ａ７（Ａ７−モック−ＰＭＢ））。Ｒ３４７を全ての実験において陰性対照として使用した。

【図15】Ａ：緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１野生型株およびＢ：Ｐｓｌ標的を発現しないΔｐｓｌＡ緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株に対するＰＭＢ−ｍＡｂコンジュゲートのＯＰＫ活性。

【図16】ＰＭＢ−ｍＡｂコンジュゲートによる緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＬＰＳの中和。Ａ：ＰＭＢ−Ｃａｍ−００３コンジュゲートおよびモック−コンジュゲート野生型Ｃａｍ−００３ならびにＢ：ＰＭＢ−Ａ７コンジュゲートおよびモック−コンジュゲート野生型Ａ７。

【図17】ＬＰＳの炎症促進効果を中和し、グラム陰性ＭＤＲ感染の治療に使用することができる環式抗菌リポペプチドのポリミキシンを示す構造（コリスチン／ポリミキシンＥ）。ポリミキシンは、ＬＰＳ中の負荷電リピドＡとの相互作用を媒介し、その炎症促進活性を中和する５つの正荷電ジアモン酪酸（ｄｉａｍｏｎｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）（円）を有する。

【図18】ウサギ補体の存在下でのヒトＨＬ−６０好中球細胞系によるＯＰＫ活性を、細菌ルシフェラーゼを発現する緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株ＰＡＯ１を使用して評価した。Ａ：ＣＡＭ−００３−ＰＭＢコンジュゲートによる殺傷％。Ｂ：Ａ７−ＰＭＢコンジュゲートによる殺傷％。

【図19】Ａ．４５ｍｇ／ｋｇのＣＡＭ−ＴＭ−ＰＭＢコンジュゲートを投与したＣ５７Ｂｌ／６マウスの生存パーセント。Ｂ：４５ｍｇ／ｋｇのＡ７−ＴＭ−ＰＭＢコンジュゲートを投与したＣ５７Ｂｌ／６マウスの生存パーセント。

【図20】Ａ．４５ｍｇ／ｋｇの１５ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇのＣＡＭ−ＴＭ−ＰＭＢコンジュゲートを投与したＣ５７Ｂｌ／６マウスの生存パーセント。Ｂ．４５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇのＡ７−ＴＭ−ＰＭＢコンジュゲートを投与したＣ５７Ｂｌ／６マウスの生存パーセント。

【図21】ｍＡｂまたはＰＭＢ−ｍＡｂコンジュゲートを腹腔内投与したＣ５７Ｂｌ／６マウスの生存パーセント。Ａ：１０ｍｇ／ｋｇ。Ｂ：１ｍｇ／ｋｇ。Ｃ：０．１ｍｇ／ｋｇ。

【発明を実施するための形態】

【0050】

Ｉ．定義
用語「ａ」または「ａｎ」で修飾された実体は、その実体の１つまたは複数を指し、例えば、「シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する結合分子」は、「シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する１つまたは複数の結合分子を表すと理解されることに留意すべきである。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用することができる。

【0051】

本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、単数形「ポリペプチド」および複数形「ポリペプチド」を包含するものとし、アミド結合（ペプチド結合としても公知）により直鎖状に結合しているモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の１つまたは複数の鎖を指し、規定の長さの生成物を指さない。したがって、２つ以上のアミノ酸の１つまたは複数の鎖を指すために使用されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、それらの用語のいずれにも代えて、またはそれらの用語と互換的に使用することができる。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの発現後修飾、例として、限定されるものではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解開裂、または非天然に生じたアミノ酸による修飾の生成物も指すものとする。ポリペプチドは、天然生物学的資源に由来し得、または組換え技術により産生することができるが、指定される核酸配列から必ずしも翻訳されない。これは、任意の様式、例として化学合成により生成することができる。

【0052】

本明細書に開示のポリペプチドは、約３アミノ酸以上、５アミノ酸以上、１０アミノ酸以上、２０アミノ酸以上、２５アミノ酸以上、５０アミノ酸以上、７５アミノ酸以上、１００アミノ酸以上、２００アミノ酸以上、５００アミノ酸以上、１０００アミノ酸以上、または２０００アミノ酸以上のサイズであり得る。ポリペプチドは、定義された３次元構造を有し得るが、それらは、そのような構造を必ずしも有さない。定義された３次元構造を有するポリペプチドは、フォールドと称され、定義された３次元構造を有さないが、多数の異なる立体構造を採り得るポリペプチドは、アンフォールドと称される。本明細書において使用される糖タンパク質という用語は、アミノ酸残基、例えば、セリン残基またはアスパラギン残基の酸素含有または窒素含有側鎖を介してタンパク質に付着している少なくとも１つの炭水化物部分に結合しているタンパク質を指す。

【0053】

「単離」ポリペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、その天然環境中に存在しないポリペプチドを意図する。特定のレベルの精製は要求されない。例えば、単離ポリペプチドは、そのネイティブまたは天然環境から取り出すことができる。宿主細胞中で発現された組換え産生ポリペプチドおよびタンパク質は、本明細書に開示の単離とみなされ、任意の好適な技術により分離、分別、または部分的もしくは実質的に精製されたネイティブまたは組換えポリペプチドと同様である。

【0054】

本明細書に開示の他のポリペプチドは、上記ポリペプチドの断片、誘導体、アナログ、またはバリアント、およびそれらの任意の組合せである。用語「断片」、「バリアント」、「誘導体」および「アナログ」には、例えば、本明細書に開示のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する結合分子、抗体を指す場合、対応するネイティブ抗体またはポリペプチドの抗原結合特性の少なくとも一部を保持する任意のポリペプチドが含まれる。ポリペプチドの断片には、本明細書の他箇所で考察される特異的抗体断片に加え、例えば、タンパク質分解断片、および欠失断片が含まれる。本明細書に開示のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する結合分子、例えば抗体のバリアントには、上記の断片、およびアミノ酸置換、欠失、または挿入に起因して変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。バリアントは、天然に生じ得、または非天然に生じ得る。非天然に生じるバリアントは、当分野において公知の突然変異導入技術を使用して産生することができる。バリアントポリペプチドは、保存または非保存アミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。本明細書に開示のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する結合分子、例えば、抗体の誘導体は、ネイティブポリペプチド上に見出されない追加の特徴を示すように変化させたポリペプチドである。例には、融合タンパク質が含まれる。バリアントポリペプチドは、本明細書において「ポリペプチドアナログ」と称することもできる。本明細書において使用される、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する結合分子、例えば、抗体の「誘導体」は、側鎖官能基の反応により化学的に誘導体化された１つまたは複数の残基を有する対象のポリペプチドを指す。「誘導体」として、２０種の標準的なアミノ酸の１つまたは複数の天然に生じるアミノ酸誘導体を含有するペプチドも含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンは、プロリンに代えて用いることができ；５−ヒドロキシリジンは、リジンに代えて用いることができ；３−メチルヒスチジンは、ヒスチジンに代えて用いることができ；ホモセリンは、セリンに代えて用いることができ；オルニチンは、リジンに代えて用いることができる。

【0055】

用語「ポリヌクレオチド」は、単数形の核酸および複数形の核酸を包含するものとし、単離核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、慣用のホスホジエステル結合または非慣用結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）中に見出されるもの）を含み得る。用語「核酸」は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つまたは複数の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。「単離」核酸またはポリヌクレオチドは、そのネイティブ環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクター中に含有されるシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する結合分子、例えば、抗体をコードする組換えポリヌクレオチドは、本明細書に開示の単離とみなされる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞中で維持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の精製された（部分的または実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離ＲＮＡ分子には、ポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物が含まれる。単離ポリヌクレオチドまたは核酸には、さらに合成により産生されたそのような分子が含まれる。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、調節エレメント、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターであり得、またはそれらを含み得る。

【0056】

本明細書において使用される「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、それは、コード領域の一部とみなすことができるが、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどはコード領域の一部でない。２つ以上のコード領域が、単一ポリヌクレオチド構築物中、例えば、単一ベクター上に、または別個のポリヌクレオチド構築物中、例えば別個の（異なる）ベクター上に存在し得る。さらに、任意のベクターは、単一コード領域を含有し得、または２つ以上のコード領域を含み得、例えば、単一ベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別個にコードし得る。さらに、ベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体をコードする核酸に融合されておりまたは融合されていない異種コード領域をコードし得る。異種コード領域には、限定されるものではないが、特殊化エレメントまたはモチーフ、例えば分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインが含まれる。

【0057】

ある実施形態において、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１つまたは複数のコード領域と作動可能に会合しているプロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御エレメントを含み得る。作動可能な会合は、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドについてのコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響または制御下に配置するように１つまたは複数の調節配列と会合している場合である。２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域およびそれと会合しているプロモーター）は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合および２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が遺伝子産物の発現を指向する発現調節配列の能力もＤＮＡテンプレートの転写される能力も妨害しない場合、「作動可能に会合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらし得る場合、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に会合している。プロモーターは、所定の細胞中でのみＤＮＡの実質的な転写を指向する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーターに加え、他の転写制御エレメントは、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルが細胞特異的転写を指向するためにポリヌクレオチドと作動可能に会合していてよい。好適なプロモーターおよび他の転写制御領域は、本明細書に開示される。

【0058】

種々の転写制御領域は、当業者に公知である。これらには、限定されるものではないが、脊椎動物において機能する転写制御領域、例えば、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス（イントロンＡと連携する前初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）、およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）からのプロモーターおよびエンハンサーセグメントが含まれる。他の転写制御領域には、脊椎動物遺伝子に由来するもの、例えば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ−グロビンならびに真核細胞中で遺伝子発現を制御し得る他の配列が含まれる。追加の好適な転写制御領域には、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーならびにリンホカイン誘導プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンにより誘導可能なプロモーター）が含まれる。

【0059】

同様に、種々の翻訳制御エレメントは、当業者に公知である。これらには、限定されるものではないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、ならびにピコルナウイルスに由来するエレメント（特に、内部リボソーム進入部位、またはＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも称される）が含まれる。

【0060】

他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態であり得る。

【0061】

ポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本明細書に開示のポリヌクレオチド、例えば、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を指向する分泌またはシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と会合していてよい。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞により分泌されるタンパク質は、粗面小胞体を越える成長タンパク質鎖の輸送が開始されると成熟タンパク質から開裂されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞により分泌されるポリペプチドが一般に、ポリペプチドの分泌または「成熟」形態を産生するために完全または「全長」ポリペプチドから開裂されるポリペプチドのＮ末端に融合しているシグナルペプチドを有することに精通している。ある実施形態において、ネイティブシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチド、または作動可能に会合しているポリペプチドの分泌を指向する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、またはその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列により置換することができる。

【0062】

ある結合分子、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体が本明細書に開示される。特に全長サイズ抗体、例えば天然に生じる抗体を指さない場合、用語「結合分子」は、全長サイズ抗体およびそのような抗体の抗原結合断片、バリアント、アナログ、または誘導体、例えば、天然に生じる抗体または免疫グロブリン分子またはエンジニアリングされた抗体分子または抗体分子と同様の様式で抗原に結合する断片を包含する。

【0063】

本明細書において使用される用語「結合分子」は、最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の非限定的な例は、抗体または抗原特異的結合を保持するその断片である。

【0064】

用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、本明細書において互換的に使用することができる。抗体（または本明細書に開示のその断片、バリアント、もしくは誘導体は、少なくとも重鎖の可変ドメインならびに少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は、比較的十分に理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）参照。

【0065】

以下により詳細に考察されるとおり、用語「免疫グロブリン」は、生化学的に区別することができる種々の広いクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、それらは一部のサブクラス（例えば、γ１〜γ４）を有することを認識する。抗体の「クラス」をＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ ＩｇＧ、またはＩｇＥとしてそれぞれ決定するのはこの鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１などは、十分に特性決定されており、機能的特殊化を付与することが公知である。これらのクラスおよびアイソタイプのそれぞれの改変バージョンは、本開示に照らして当業者に容易に認識可能であり、したがって本開示の範囲内である。

【0066】

軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。それぞれの重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖と結合していてよい。一般に、軽鎖および重鎖は、互いに共有結合しており、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞または遺伝子エンジニアリングされた宿主細胞のいずれかにより生成された場合、２つの重鎖の「テール」部分が共有ジスルフィド結合または非共有結合により互いに結合している。重鎖において、アミノ酸配列は、Ｙ形状のフォーク型末端におけるＮ末端からそれぞれの鎖の下方部におけるＣ末端に及ぶ。

【0067】

軽鎖および重鎖の両方は、構造および機能ホモロジーの領域に分割される。用語「定常」および「可変」は、機能的に使用される。これに関して、軽（ＶＬ）鎖および重（ＶＨ）鎖部分の両方の可変ドメインが抗原認識および特異性を決定することが認識される。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、重要な生物学的特性、例えば、分泌、経胎盤移動、Ｆｃ受容体結合、補体結合などを付与する。慣習により、定常領域ドメインの番号付与は、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠くなるにつれて増加する。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域であり；ＣＨ３およびＣＬドメインは、実際には、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端をそれぞれ含む。

【0068】

上記のとおり、可変領域は、結合分子が抗原上のエピトープを選択的に認識し、それに特異的に結合することを可能とする。すなわち、結合分子、例えば、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットは、組み合わさって３次元抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この４元結合分子構造は、Ｙのそれぞれのアームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＬ鎖のそれぞれの３つのＣＤＲにより定義される。

【0069】

天然に生じる抗体において、それぞれの抗原結合ドメイン中に存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体が水性環境中でその３次元形状を取るため、抗原結合ドメインを形成するように特異的に位置しているアミノ酸の短い不連続配列である。抗原結合ドメイン中のアミノ酸の残部は、「フレームワーク」領域と称され、より小さい分子内変動性を示す。フレームワーク領域は、概して、β−シート立体構造を採用し、ＣＤＲは、このβ−シート構造を接続し、一部の場合、その一部を形成するループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖内非共有相互作用による正確な配向におけるＣＤＲの位置決めを提供する足場を形成するように作用する。位置決めされたＣＤＲにより形成された抗原結合ドメインは、免疫反応抗原上のエピトープに対する表面相補性を定義する。この相補性表面は、抗体のそのコグネートエピトープへの非共有結合を促進する。ＣＤＲおよびフレームワーク領域をそれぞれ含むアミノ酸は、任意の所与の重鎖または軽鎖可変領域について当業者により容易に同定することができる。それというのも、それらは既に定義されているためである（参照により全体として本明細書に組み込まれる“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）；およびＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）参照）。

【0070】

当分野の範囲内で使用および／または許容される用語の２つ以上の定義が存在する場合、本明細書において使用される用語の定義は、特に明確に逆の記載がない限り全てのそのような意味を含むものとする。具体例は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される不連続抗原結合部位を説明するための用語「相補性決定領域」（ＣＤＲ）の使用である。この特定の領域は、参照により本明細書に組み込まれるＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）およびＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）により記載されており、これらの定義は、互いを比較した場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにも関わらず、抗体またはそのバリアントのＣＤＲを指すためのいずれの定義の適用も、本明細書において定義および使用される用語の範囲内であるものとする。上記の参照文献のそれぞれにより定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として表１に以下に記載する。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列およびサイズに応じて変動する。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮してどの残基が特定のＣＤＲを含むかを定型的に決定することができる。

【0071】

【表1】

【0072】

Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．は、あらゆる抗体に適用可能な可変ドメイン配列についての番号付与系も定義した。当業者は、配列自体を越えるいかなる実験データにも依存することなく「Ｋａｂａｔ番号付与」のこの系をあらゆる可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書において使用される「Ｋａｂａｔ番号付与」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）により記載される番号付与系を指す。特に記載のない限り、本明細書に開示のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体中の規定のアミノ酸残基位置の番号付与への言及は、Ｋａｂａｔ番号付与系に従う。

【0073】

結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体には、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生された断片が含まれる。ｓｃＦｖ分子は、当分野において公知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号明細書に記載されている。本開示により包含される免疫グロブリンまたは抗体分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスの免疫グロブリン分子のものであり得る。

【0074】

「特異的に結合する」は、一般に、結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体が、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、および結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間の一部の相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、結合分子は、それがその抗原結合ドメインを介してランダムの無関連なエピトープに結合するよりも容易にそのエピトープに結合する場合、エピトープに「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、本明細書において、ある結合分子があるエピトープに結合する相対親和性を特定するために使用される。例えば、結合分子「Ａ」は、所与のエピトープについて結合分子「Ｂ」よりも高い特異性を有するとみなすことができ、または結合分子「Ａ」は、それが関連エピトープ「Ｄ」について有するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言うことができる。

【0075】

「優先的に結合する」は、抗体がエピトープに、それが関連、類似、同種、または相似エピトープに結合するよりも容易に特異的に結合することを意味する。したがって、所与のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、そのような抗体が関連エピトープと交差反応し得るとしても、関連エピトープよりもそのエピトープに結合する可能性が高い。

【0076】

非限定的な例として、結合分子、例えば、抗体は第１のエピトープに、それが前記第１のエピトープに第２のエピトープについての抗体のＫ_Ｄ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）で結合する場合、優先的に結合するとみなすことができる。別の非限定的な例において、結合分子、例えば、抗体は、第１の抗原に、それが第１のエピトープに第２のエピトープについての抗体のＫ_Ｄよりも少なくとも１桁小さい親和性で結合する場合、優先的に結合するとみなすことができる。別の非限定的な例において、結合分子は、第１のエピトープに、それが第１のエピトープに第２のエピトープについての抗体のＫ_Ｄよりも少なくとも２桁小さい親和性で結合する場合、優先的に結合するとみなすことができる。

【0077】

別の非限定的な例において、結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、第１のエピトープに、それが第１のエピトープに第２のエピトープについての抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも小さいオフ速度（ｏｆｆ ｒａｔｅ）（ｋ（ｏｆｆ））で結合する場合、優先的に結合するとみなすことができる。別の限定的な例において、結合分子は、第１のエピトープに、それが第１のエピトープに第２のエピトープについての抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも１桁小さい親和性で結合する場合、優先的に結合するとみなすことができる。別の非限定的な例において、結合分子は、第１のエピトープに、それが第１のエピトープに第２のエピトープについての抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも２桁小さい親和性で結合する場合、優先的に結合するとみなすことができる。

【0078】

本明細書に開示の結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、５×１０^−２秒^−１、１０^−２秒^−１、５×ｌ０^−３秒^−１または１０^−３秒^−１以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ）で本明細書に開示の標的抗原、例えば、多糖またはその断片もしくはバリアントに結合すると言うことができる。本明細書に開示の結合分子は、５×１０^−４秒^−１、１０^−４秒^−１、５×１０^−５秒^−１、または１０^−５秒^−１５×１０^−６秒^−１、１０^−６秒^−１、５×１０^−７秒^−１または１０^−７秒^−１以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））で標的抗原、例えば、多糖に結合すると言うことができる。

【0079】

本明細書に開示の結合分子、例えば、抗体または抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、１０^３Ｍ^−１秒^−１、５×１０^３Ｍ^−１秒^−１、１０^４Ｍ^−１秒^−１または５×１０^４Ｍ^−１秒^−１以上のオン速度（ｋ（ｏｎ））で標的抗原、例えば、多糖に結合すると言うことができる。本明細書に開示の結合分子は、１０^５Ｍ^−１秒^−１、５×１０^５Ｍ^−１秒^−１、１０^６Ｍ^−１秒^−１、または５×１０^６Ｍ^−１秒^−１または１０^７Ｍ^−１秒^−１以上のオン速度（ｏｎ ｒａｔｅ）（ｋ（ｏｎ））で標的抗原、例えば、多糖に結合すると言うことができる。

【0080】

結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、それがある程度、エピトープへの参照抗体または抗原結合断片の結合を遮断する程度にそれがそのエピトープに優先的に結合する場合、所与のエピトープへの参照抗体または抗原結合断片の結合を競合阻害すると言われる。競合阻害は、当分野において公知の任意の方法、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイにより測定することができる。結合分子は、所与のエピトープへの参照抗体または抗原結合断片の結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％だけ競合阻害すると言うことができる。

【0081】

本明細書において使用される用語「親和性」は、個々のエピトープと免疫グロブリン分子のＣＤＲとの結合の強さの尺度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）の２７−２８ページ参照。本明細書において使用される用語「アビディティー」は、免疫グロブリンの集団と抗原との複合体の総合安定性、すなわち、抗原との免疫グロブリン混合物の機能的組合せ強度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗの２９−３４ページ参照。アビディティーは、集団における個々の免疫グロブリン分子と規定のエピトープとの親和性、ならびにさらには免疫グロブリンおよび抗原の価数の両方に関する。例えば、２価モノクローナル抗体と高度に反復するエピトープ構造を有する抗原、例えば、ポリマーとの相互作用は、高いアビディティーの１つである。

【0082】

本明細書に開示の結合分子またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、それらの交差反応性に関して記載または規定することもできる。本明細書において使用される用語「交差反応性」は、１つの抗原に特異的な結合分子、例えば抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体の、第２の抗原と反応する能力を指し；２つの異なる抗原物質間の関連性の尺度である。したがって、結合分子は、それがその形成を誘導したもの以外のエピトープに結合する場合、交差反応性である。交差反応性エピトープは、一般に、誘導エピトープと同一の相補性構造特徴の多くを含有し、一部の場合、実際に元のものよりも良好に適合し得る。

【0083】

結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、抗原に対するそれらの結合親和性に関して記載または規定することもできる。例えば、結合分子は、５×１０^−２Ｍ、１０^−２Ｍ、５×１０^−３Ｍ、１０^−３Ｍ、５×１０^−４Ｍ、１０^−４Ｍ、５×１０^−５Ｍ、１０^−５Ｍ、５×１０^−６Ｍ、１０^−６Ｍ、５×１０^−７Ｍ、１０^−７Ｍ、５×１０^−８Ｍ、１０^−８Ｍ、５×１０^−９Ｍ、１０^−９Ｍ、５×１０^−１０Ｍ、１０^−１０Ｍ、５×１０^−１１Ｍ、１０^−１１Ｍ、５×１０^−１２Ｍ、１０^−１２Ｍ、５×１０^−１３Ｍ、１０^−１３Ｍ、５×１０^−１４Ｍ、１０^−１４Ｍ、５×１０^−１５Ｍ、または１０^−１５Ｍ以下の解離定数またはＫ_Ｄで抗原に結合し得る。

【0084】

単鎖抗体を含む抗体断片は、可変領域を単独でまたは以下のものの全部または一部との組合せで含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン。可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインとの任意の組合せも含む抗原結合断片も含まれる。本明細書に開示の結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片は、任意の動物起源、例として鳥類および哺乳動物からのものであり得る。抗体は、ヒト、ネズミ、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリ抗体であり得る。別の実施形態において、可変領域は、コンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）起源（例えば、サメから）であり得る。本明細書において使用される「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、下記のおよび例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，９３９，５９８号明細書に記載のヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１つまたは複数のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体が含まれる。

【0085】

本明細書において使用される用語「重鎖部分」には、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。重鎖部分を含む結合分子、例えば、抗体は、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中央部、および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそのバリアントもしくは断片の少なくとも１つを含む。例えば、結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含み得る。別の実施形態において、結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本開示において使用される結合分子は、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部分を欠損し得る（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）。上記のとおり、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）は、それらのアミノ酸配列が天然に生じる免疫グロブリン分子から変動するように改変することができることが当業者により理解される。

【0086】

本明細書に開示の結合分子、例えば、抗体の重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子から由来してよい。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメインおよびＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例において、重鎖部分は、部分的にはＩｇＧ１分子に由来し、部分的にはＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例において、重鎖部分は、部分的にはＩｇＧ１分子に由来し、部分的にはＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含み得る。

【0087】

本明細書において使用される用語「軽鎖部分」には、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。軽鎖部分は、ＶＬまたはＣＬドメインの少なくとも１つを含む。

【0088】

本明細書に開示の結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、それらが認識または特異的に結合する抗原、例えば、標的多糖のエピトープまたは部分に関して記載または規定することができる。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的多糖の部分は、「エピトープ」または「抗原決定基」である。標的抗原、例えば、多糖は、単一エピトープを含み得るが、典型的には、少なくとも２つのエピトープを含み、抗原のサイズ、立体構造、およびタイプに応じて任意数のエピトープを含み得る。

【0089】

上記のとおり、種々の免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および３次元形状は周知である。本明細書において使用される用語「ＶＨドメイン」には、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインが含まれ、用語「ＣＨ１ドメイン」には、免疫グロブリン重鎖の第１（ほとんどはアミノ末端）の定常領域ドメインが含まれる。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣接しており、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端である。

【0090】

本明細書において使用される用語「ＣＨ２ドメイン」には、例えば、慣用の番号付与スキームを使用して抗体の約残基２４４から残基３６０に及ぶ重鎖分子の部分が含まれる（残基２４４から３６０、Ｋａｂａｔ番号付与系；および残基２３１〜３４０、ＥＵ番号付与系；前掲のＫａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．参照。ＣＨ２ドメインは、それが別のドメインと密接に対合しないという点でユニークである。むしろ、２つのＮ結合分枝炭水化物鎖が、インタクトなネイティブＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に介入される。ＣＨ３ドメインがＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインからＣ末端に及び、約１０８残基を含むことも十分に立証されている。

【0091】

本明細書において使用される用語「ヒンジ領域」には、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに連結させる重鎖分子の部分が含まれる。このヒンジ領域は、約２５残基を含み、フレキシブルであり、したがって２つのＮ末端抗原結合領域が独立して移動することを可能とする。ヒンジ領域は、３つの区別されるドメイン：上部、中央部、および下部ヒンジドメイン（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３（１９９８））に下位分類することができる。

【0092】

本明細書において使用される用語「ジスルフィド結合」には、２つの硫黄原子間に形成される共有結合が含まれる。アミノ酸システインは、第２のチオール基とのジスルフィド結合または架橋を形成し得るチオール基を含む。ほとんどの天然に生じるＩｇＧ分子において、ＣＨ１およびＣＬ領域はジスルフィド結合により結合しており、２つの重鎖は、Ｋａｂａｔ番号付与系を使用して２３９および２４２（２２６または２２９位、ＥＵ番号付与系）に対応する位置において２つのジスルフィド結合により結合している。

【0093】

本明細書において使用される用語「キメラ抗体」は、免疫反応領域または部位が第１の種から得られまたはそれに由来し、定常領域（インタクト、部分的または改変されていてよい）が第２の種から得られる任意の抗体を意味するものとする。一部の実施形態において、標的結合領域または部位は非ヒト資源（例えば、マウスまたは霊長類）を形成し、定常領域はヒトである。

【0094】

本明細書において使用される用語「エンジニアリングされた抗体」は、重鎖および軽鎖のいずれかまたは両方の可変ドメインが、既知の特異性の抗体からの１つまたは複数のＣＤＲの少なくとも部分的な置換により、ならびに必要により、部分的なフレームワーク領域置換および配列変化により変化した抗体を指す。ＣＤＲはフレームワーク領域が由来する抗体と同一のクラスまたはさらにはサブクラスの抗体に由来し得るが、ＣＤＲは異なるクラスの抗体、好ましくは、異なる種からの抗体に由来することが想定される。既知の特異性の非ヒト抗体からの１つまたは複数の「ドナー」ＣＤＲがヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域中にグラフトされたエンジニアリングされた抗体は、本明細書において「ヒト化抗体」と称される。ＣＤＲの全てをドナー可変領域からの完全なＣＤＲにより置き換えてある可変ドメインの抗原結合能を別のものに移すことは必要でないことがある。むしろ、標的結合部位の活性を維持するために必要な残基を移すことのみが必要であることがある。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書、米国特許第５，６９３，７６１号明細書、米国特許第５，６９３，７６２号明細書、および米国特許第６，１８０，３７０号明細書に記載の説明を考慮すると、それは定型実験の実施により、または機能的エンジニアリングもしくはヒト化抗体を得るための試行錯誤試験により、当業者の能力の十分範囲内である。

【0095】

本明細書において使用される用語「適切にフォールドされたポリペプチド」には、ポリペプチドを含む機能ドメインの全てが明確に活性であるポリペプチド（例えば、抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ抗体）が含まれる。本明細書において使用される用語「不適切にフォールドされたポリペプチド」には、ポリペプチドの機能ドメインの少なくとも１つが活性でないポリペプチドが含まれる。一実施形態において、適切にフォールドされたポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合により結合しているポリペプチド鎖を含み、逆に、不適切にフォールドされたポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合により結合していないポリペプチド鎖を含む。

【0096】

本明細書において使用される用語「エンジニアリングされた」には、合成手段による（例えば、組換え技術、インビトロペプチド合成、ペプチドの酵素もしくは化学カップリングまたはそれらの技術のいくつかの組合せによる核酸またはポリペプチド分子の操作が含まれる。

【0097】

本明細書において使用される用語「結合している」、「融合している」または「融合」は、互換的に使用される。これらの用語は、あらゆる手段、例として化学コンジュゲーションまたは組換え手段によるさらに２つのエレメントまたは構成成分の連結を指す。「インフレーム融合」は、元のＯＲＦの正確な翻訳リーディングフレームを維持する様式で連続するより長いＯＲＦを形成するための２つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の連結を指す。したがって、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦ（セグメントが通常、天然では連結されていない）によりコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含有する単一タンパク質である。リーディングフレームはこうして融合セグメント全体にわたり連続的とされるが、セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列により物理的または空間的に分離することができる。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドはインフレームで融合することができるが、「融合」ＣＤＲが連続ポリペプチドの一部として同時翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域または追加のＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドにより分離することができる。

【0098】

ポリペプチドに関して、「直鎖配列」または「配列」は、配列中で互いに隣接する残基がポリペプチドの１次構造中で連続する、アミノからカルボキシ末端方向におけるポリペプチド中のアミノ酸の順序である。

【0099】

本明細書において使用される用語「発現」は、遺伝子が生化学物質、例えば、ポリペプチドを産生するプロセスを指す。このプロセスには、細胞内の遺伝子の機能的存在の任意の顕在化、例として、限定されるものではないが、遺伝子ノックダウンならびに一過的発現および安定的発現の両方が含まれる。それには、限定されるものではないが、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写、およびそのようなｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が含まれる。最終所望産物が生化学物質である場合、発現には、その生化学物質および任意の前駆体の作出が含まれる。遺伝子の発現は、「遺伝子産物」を産生する。本明細書において使用される遺伝子産物は、遺伝子の転写により産生される核酸、例えば、メッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれでもよい。本明細書に記載の遺伝子産物には、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化を有する核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク質分解開裂などを有するポリペプチドがさらに含まれる。

【0100】

本明細書において使用される用語「治療する」または「治療」は、目的が含む所望な生理学的変化、感染、または障害を予防または遅滞（縮減）させることである療法的治療および防止的または予防的措置の両方を指す。利益または所望の臨床結果には、限定されるものではないが、検出可能か検出不能かにかかわらず、症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）、対象における感染原因物質、例えば緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のクリアランスまたは低減、疾患進行の遅延または遅滞、疾患状態の改善または緩和、および寛解（一部または完全を問わない）が含まれる。「治療」は、治療を受けない場合に予期される生存率と比較した生存率の延長も意味し得る。治療を必要とする者には、既に感染、病態、または障害を有する者ならびに病態または障害を有しやすい者または病態もしくは障害を予防すべき者、例えば、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染を受けやすい火傷患者または免疫抑制患者が含まれる。

【0101】

「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後診断、または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、家畜動物、農場動物、および動物園、競技、または愛玩動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、ウシ、クマなどが含まれる。

【0102】

本明細書において使用される「抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ抗体の投与から利益を受ける対象」および「治療を必要とする動物」のような語句には、例えば、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌの検出（例えば、診断手順のため）に使用される抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ抗体の投与から、および／または抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ抗体による治療、すなわち、疾患の緩和または予防から利益を受ける対象、例えば、哺乳動物が含まれる。本明細書により詳細に記載されるとおり、抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ抗体は、未コンジュゲート形態で使用することができ、または例えば、薬物、プロドラッグ、もしくは同位体にコンジュゲートすることができる。

【0103】

ＩＩ．結合分子
一実施形態は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、（ａ）上皮細胞への緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の付着を阻害し得、（ｂ）緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のオプソニン食菌殺傷（ＯＰＫ）を促進、媒介、もしくは向上し得、または（ｃ）上皮細胞への緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の付着を阻害し得、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＯＰＫを促進、媒介、もしくは向上し得る単離結合分子またはその抗原結合断片を対象とする。ある実施形態において、上記結合分子またはその断片は、抗体またはその抗原結合断片、例えばＣａｍ−００３またはＷａｐＲ−００４であり得る。

【0104】

本明細書において使用される用語「抗原結合ドメイン」には、抗原上のエピトープ（例えば、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌのエピトープ）に特異的に結合する部位が含まれる。抗体の抗原結合ドメインは、典型的には、免疫グロブリン重鎖可変領域の少なくとも一部および免疫グロブリン軽鎖可変領域の少なくとも一部を含む。これらの可変領域により形成される結合部位が、抗体の特異性を決定する。

【0105】

本開示は、より具体的には、ＷａｐＲ−００４、Ｃａｍ−００３、Ｃａｍ−００４、またはＣａｍ−００５の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）領域を含む抗体またはその抗原結合断片と同一のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌエピトープに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を対象とする。

【0106】

さらに、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合し、ＷａｐＲ−００４、Ｃａｍ−００３、Ｃａｍ−００４、またはＣａｍ−００５のＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片によるシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合を競合阻害する単離結合分子、例えば、抗体またはその断片が含まれる。

【0107】

一実施形態は、ＷａｐＲ−００１、ＷａｐＲ−００２、またはＷａｐＲ−００３のＶＨおよびＶＬ領域を含む抗体またはその抗原結合断片と同一のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌエピトープに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を対象とする。

【0108】

シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合し、ＷａｐＲ−００１、ＷａｐＲ−００２、またはＷａｐＲ−００３のＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片によるシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合を競合阻害する単離結合分子、例えば、抗体またはその断片も含まれる。

【0109】

シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合し、ＷａｐＲ−０１６のＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片によるシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合を競合阻害する単離結合分子、例えば、抗体またはその断片がさらに含まれる。

【0110】

シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合し、ＷａｐＲ１６のＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片によるシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合を競合阻害する単離結合分子、例えば、抗体またはその断片も含まれる。

【0111】

抗体を作製する方法は、当分野において周知であり、本明細書に記載される。シグナル配列を有さないシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌの種々の断片または全長シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに対する抗体を産生したら、本明細書に記載のエピトープマッピングプロトコルおよび当分野において公知の方法（例えば、 “Ｃｈａｐｔｅｒ １１−Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｖ．２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９６）に記載の二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）により抗体または抗原結合断片が結合するシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌのアミノ酸、またはエピトープを決定することが決定できる。追加のエピトープマッピングプロトコルは、Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）に見出すことができ、それらは両方とも参照により全体として本明細書に組み込まれる。エピトープマッピングは、市販の手段（すなわち、ＰｒｏｔｏＰＲＯＢＥ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））により実施することもできる。

【0112】

ある態様において、本開示は、前記参照モノクローナル抗体についてのＫ_Ｄ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする親和性でシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体を対象とする。

【0113】

ある実施形態において、本明細書に開示の抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、Ｐｓｌの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合し、すなわち、そのようなエピトープに、それが無関連またはランダムエピトープに結合するよりも容易に結合し；Ｐｓｌの少なくとも１つのエピトープに優先的に結合し、すなわち、そのようなエピトープに、それが関連、類似、同種、または相似エピトープに結合するよりも容易に結合し；Ｐｓｌのあるエピトープに特異的または優先的にそれ自体結合する参照抗体の結合を競合阻害し；または約５×１０^−２Ｍ、約１０^−２Ｍ、約５×１０^−３Ｍ、約１０^−３Ｍ、約５×１０^−４Ｍ、約１０^−４Ｍ、約５×１０^−５Ｍ、約１０^−５Ｍ、約５×１０^−６Ｍ、約１０^−６Ｍ、約５×１０^−７Ｍ、約１０^−７Ｍ、約５×１０^−８Ｍ、約１０^−８Ｍ，約５×１０^−９Ｍ，約１０^−９Ｍ、約５×１０^−１０Ｍ、約１０^−１０Ｍ、約５×１０^−１１Ｍ、約１０^−１１Ｍ、約５×１０^−１２Ｍ、約１０^−１２Ｍ、約５×１０^−１３Ｍ、約１０^−１３Ｍ、約５×１０^−１４Ｍ、約１０^−１４Ｍ、約５×１０^−１５Ｍ、または約１０^−１５Ｍ未満の解離定数Ｋ_Ｄを特徴とする親和性でＰｓｌの少なくとも１つのエピトープに結合する。

【0114】

結合解離定数に関して使用される用語「約」は、抗体親和性を計測するために利用される方法における固有のバリエーションの程度を許容する。例えば、使用される装置類の精度のレベル、計測される試料の数に基づく標準誤差、および丸め誤差に応じて、用語「約１０^−２Ｍ」は、例えば、０．０５Ｍから０．００５Ｍを含み得る。

【0115】

具体的な実施形態において、結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、５×１０^−２秒^−１、１０^−２秒^−１、５×ｌ０^−３秒^−１または１０^−３秒^−１以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））でシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに結合する。あるいは、抗体、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、５×１０^−４秒^−１、１０^−４秒^−１、５×１０^−５秒^−１、または１０^−５秒^−１ ５×１０^−６秒^−１、１０^−６秒、^−１５×１０^−７秒^−１または１０^−７秒^−１以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））でシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに結合する。

【0116】

他の実施形態において、本明細書に開示の結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、１０^３Ｍ^−１秒^−１、５×１０^３Ｍ^−１秒^−１、１０^４Ｍ^−１秒^−１または５×１０^４Ｍ^−１秒^−１以上のオン速度（ｋ（ｏｎ））でシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに結合する。あるいは、本明細書に開示の結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、１０^５Ｍ^−１秒^−１、５×１０^５Ｍ^−１秒^−１、１０^６Ｍ^−１秒^−１、または５×１０６Ｍ^−１秒^−１または１０^７Ｍ^−１秒^−１以上のオン速度（ｋ（ｏｎ））でシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに結合する。

【0117】

種々の実施形態において、本明細書に記載の抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のオプソニン食菌殺傷を促進し、または上皮細胞へのシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）結合を阻害する。本明細書に記載のある実施形態において、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ標的は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌである。他の実施形態において、本明細書に記載のある結合分子は、それらの資源にかかわらず構造的に関連する多糖分子に結合し得る。そのようなＰｓｌ様分子は、緑膿菌（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌと同一でありまたは十分な構造関連性を有して開示される結合分子の１つまたは複数による特異的認識を可能とすることが予期される。例えば、本明細書に記載のある結合分子は、他の細菌種により産生されるＰｓｌ様分子、例えば、他のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、例えば、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、またはシュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）により産生されるＰｓｌ様分子に結合し得る。あるいは、本明細書に記載のある結合分子は、合成により、またはＰｓｌ様分子を産生するように遺伝子改変された宿主細胞により産生されるＰｓｌ様分子に結合し得る。

【0118】

特に記載のない限り、結合分子、例えば、抗体への言及において本明細書において使用される「その断片」は、抗原結合断片、すなわち、抗原に特異的に結合する抗体の一部分を指す。

【0119】

抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、１つまたは複数のエフェクター機能を媒介する定常領域を含み得る。例えば、抗体定常領域への補体のＣ１構成成分の結合は、補体系を活性化し得る。補体の活性化は、病原体のオプソニン化および溶解において重要である。補体の活性化は、炎症応答も刺激し、自己免疫過敏にも関与し得る。さらに、抗体は、Ｆｃ領域を介して種々の細胞上の受容体に結合し、抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体結合部位が細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。異なるクラスの抗体、例としてＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（イプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）およびＩｇＭ（ミュー受容体）に特異的な多数のＦｃ受容体が存在する。細胞表面上のＦｃ受容体への抗体の結合は、多数の重要および多様な生物学的応答、例として、抗体コートされた粒子の飲込みおよび破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体コートされた標的細胞の溶解（抗体依存性細胞媒介性細胞毒性、またはＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症メディエーターの放出、胎盤通過および免疫グロブリン産生の制御を誘発する。

【0120】

したがって、本明細書に開示のある実施形態は、定常領域ドメインの１つまたは複数の少なくとも一部分が所望の生化学的特徴、例えば、ほぼ同一の免疫原性の完全な未変化抗体と比較してエフェクター機能の低減、非共有結合ダイマー化能、腫瘍の部位における局在化能の増加、血清半減期の低減、または血清半減期の増加を提供するように欠失され、そうでなければ変化した抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体を含む。例えば、本明細書に記載のある結合分子は、免疫グロブリン重鎖と類似のポリペプチド鎖を含むが、１つまたは複数の重鎖ドメインの少なくとも一部分を欠くドメイン欠失抗体である。例えば、ある抗体において、改変抗体の定常領域の１つのドメイン全体が欠失され、例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部が欠失される。

【0121】

抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体または抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体の改変形態は、当分野において公知の技術を使用して完全前駆体または親抗体から作製することができる。例示的な技術を本明細書の他箇所に考察する。

【0122】

ある実施形態において、抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片の可変領域および定常領域の両方は、完全ヒトである。完全ヒト抗体は、当分野において公知のおよび本明細書に記載の技術を使用して作製することができる。例えば、特異的抗原に対する完全ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してそのような抗体を産生するように改変されたが、内在性遺伝子座が損なわれたトランスジェニック動物に抗原を投与することにより調製することができる。そのような抗体を作製するために使用することができる例示的な技術は、米国特許第６，１５０，５８４号明細書、米国特許第６，４５８，５９２号明細書、米国特許第６，４２０，１４０号明細書に記載されている。他の技術は、当分野において公知である。完全ヒト抗体は、同様に、種々のディスプレイ技術、例えば、本明細書の他箇所により詳細に記載されるファージディスプレイ系または他のウイルスディスプレイ系により産生することができる。

【0123】

本明細書に開示の抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、当分野において公知の技術を使用して作製または製造することができる。ある実施形態において、結合分子またはその断片は、「組換え産生」することができ、すなわち、組換えＤＮＡ技術を使用して産生される。抗体分子またはその断片を作製するための例示的な技術は、本明細書の他箇所により詳細に考察される。

【0124】

本明細書に記載のある抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体において、Ｆｃ部分は、当分野において公知の技術を使用してエフェクター機能を減少させるように突然変異させることができる。例えば、定常領域ドメインの欠失または不活性化（点突然変異または他の手段を介する）は、循環改変抗体のＦｃ受容体結合を低減させ得、それにより腫瘍局在化を増加させる。他の場合、定常領域改変は補体結合を抑え、したがって血清半減期およびコンジュゲート細胞毒素の非特異的会合を低減させ得る。抗原特異性および抗体フレキシビリティーの増加に起因して局在の向上を可能とする定常領域のさらに他の改変を使用してジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を改変することができる。得られる生理学的プロファイル、バイオアベイラビリティーおよび改変の他の生化学的効果、例えば、局在化、生体分布および血清半減期は、周知の免疫学的技術を使用して過度の実験なしで容易に計測および定量することができる。

【0125】

ある実施形態において、抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、治療すべき動物において、例えば、ヒトにおいて有害な免疫応答を誘発しない。一実施形態において、抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、当分野において認識される技術を使用してそれらの免疫原性を低減させるように改変される。例えば、抗体は、ヒト化、脱免疫化することができ、またはキメラ抗体を作製することができる。これらのタイプの抗体は、親抗体の抗原結合特性を保持し、または実質的に保持するが、ヒトにおいて免疫原性がより小さい非ヒト抗体、典型的には、ネズミまたは霊長類抗体に由来する。このことは、種々の方法、例として、（ａ）非ヒト可変ドメイン全体をヒト定常領域上にグラフト化してキメラ抗体を生成すること；（ｂ）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つまたは複数の少なくとも一部を、クリティカルなフレームワーク残基を保持してまたは保持せずにヒトフレームワークおよび定常領域中にグラフト化すること；または（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によりヒト様セクションによりそれらを覆うことにより達成することができる。そのような方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１６９−２１７（１９９４）、ならびに米国特許第５，５８５，０８９号明細書、米国特許第５，６９３，７６１号明細書、米国特許第５，６９３，７６２号明細書、および米国特許第６，１９０，３７０号明細書に開示されており、それらの全ては参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【0126】

脱免疫化を使用して抗体の免疫原性を減少させることもできる。本明細書において使用される用語「脱免疫化」には、Ｔ細胞エピトープを改変するための抗体の変化が含まれる（例えば、国際公開第９８５２９７６Ａ１号パンフレット、国際公開第００３４３１７Ａ２号パンフレット参照）。例えば、出発抗体からのＶＨおよびＶＬ配列を分析し、相補性決定領域（ＣＤＲ）および配列内の他のキー残基に関してエピトープの局在を示すそれぞれのＶ領域からヒトＴ細胞エピトープを「マッピング」する。Ｔ細胞エピトープマップからの個々のＴ細胞エピトープを分析して最終抗体の活性の変化が低リスクな代替アミノ酸置換を同定する。アミノ酸置換の組合せを含む一連の代替ＶＨおよびＶＬ配列を設計し、続いてこれらの配列を本明細書に開示の一連の結合ポリペプチド、例えば、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ特異的抗体またはその抗原結合断片中に取り込み、次いで機能について試験する。次いで、改変ＶおよびヒトＣ領域を含む完全な重鎖および軽鎖遺伝子を発現ベクター中にクローニングし、後続のプラスミドを完全抗体の産生のために細胞系中に導入する。次いで、抗体を適切な生化学および生物学的アッセイにおいて比較し、最適なバリアントを同定する。

【0127】

抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、当分野において公知の任意の好適な方法により生成することができる。対象の抗原に対するポリクローナル抗体は、当分野において周知の種々の手順により産生することができる。例えば、抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ抗体またはその抗原結合断片は、種々の宿主動物、例として、限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラット、ニワトリ、ハムスター、ヤギ、ロバなどに投与して抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導することができる。種々のアジュバントを使用して宿主種に応じて免疫学的応答を増加させることができ、それには、限定されるものではないが、フロイント（完全および不完全）、ミネラルゲル、例えば、水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・バルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が含まれる。そのようなアジュバントも当分野において周知である。

【0128】

モノクローナル抗体は、当分野において公知の広範な技術、例として、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術の使用、またはそれらの組合せを使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、例として当分野において公知のものおよび例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．（１９８８）に教示されるものを使用して産生することができる。

【0129】

抗体または抗体断片（例えば、抗原結合部位）をコードするＤＮＡは、抗体ライブラリー、例えば、ファージディスプレイライブラリーに由来していてもよい。特に、そのようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはネズミ）から発現される抗原結合ドメインをディスプレイするために利用することができる。対象の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原により、例えば、標識抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を使用して選択または同定することができる。これらの方法において使用されるファージは、典型的には、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｖ ＯＥ ＤＡＢ（軽鎖または重鎖からの個々のＦｖ領域）またはファージ遺伝子ＩＩＩもしくは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質に組換え融合されたジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現されるｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む糸状ファージである。例示的な方法は、例えば、欧州特許第３６８６８４Ｂ１号明細書；米国特許第５，９６９，１０８号明細書、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄ Ｃｈａｍｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：３７１（２０００）；Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１（２００２）；Ｈｕｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：２６８２（２００１）；Ｌｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：１０６３（２００２）に記載されており、それらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの刊行物（例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３（１９９２））は、鎖シャフリングによる高親和性ヒト抗体の産生、ならびに大ファージライブラリーの構築のための方針としてのコンビナトリアル感染およびインビボ組換えを記載している。別の実施形態において、リボソームディスプレイを使用してバクテリオファージをディスプレイプラットフォームとして置き換えることができる（例えば、Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７（２０００）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：３７５０（２００１）；またはＩｒｖｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：３１（２００１）参照）。さらに別の実施形態において、細胞表面ライブラリーを抗体についてスクリーニングすることができる（Ｂｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１０７０１（２０００）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４３：２１１（２０００））。そのような手順は、モノクローナル抗体の単離および後続のクローニングのための慣習的なハイブリドーマ技術の代替手段を提供する。

【0130】

ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面上でディスプレイされる。例えば、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列は、動物ｃＤＮＡライブラリー（例えば、リンパ組織のヒトまたはネズミｃＤＮＡライブラリー）または合成ｃＤＮＡライブラリーから増幅される。ある実施形態において、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡは、ＰＣＲによりｓｃＦｖリンカーにより一緒に連結させ、ファージミドベクター（例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ６またはｐＣｏｍｂ３ＨＳＳ）中にクローニングする。ベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中にエレクトロポレートし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をヘルパーファージにより感染させる。これらの方法において使用されるファージは、典型的には、糸状ファージ、例として、ｆｄおよびＭ１３であり、ＶＨまたはＶＬ領域を通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組換え融合させる。対象の抗原（すなわち、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ）に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原により、例えば、標識抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を使用して選択または同定することができる。

【0131】

抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の追加の例には、Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８７：９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号明細書；ＰＣＴ公開国際公開第９０／０２８０９号パンフレット；国際公開第９１／１０７３７号パンフレット；国際公開第９２／０１０４７号パンフレット；国際公開第９２／１８６１９号パンフレット；国際公開第９３／１１２３６号パンフレット；国際公開第９５／１５９８２号パンフレット；国際公開第９５／２０４０１号パンフレット；および米国特許第５，６９８，４２６号明細書；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；米国特許第５，４０３，４８４号明細書；米国特許第５，５８０，７１７号明細書；米国特許第５，４２７，９０８号明細書；米国特許第５，７５０，７５３号明細書；米国特許第５，８２１，０４７号明細書；米国特許第５，５７１，６９８号明細書；米国特許第５，４２７，９０８号明細書；米国特許第５，５１６，６３７号明細書；米国特許第５，７８０，２２５号明細書；米国特許第５，６５８，７２７号明細書；米国特許第５，７３３，７４３号明細書および米国特許第５，９６９，１０８号明細書に開示のものが含まれ、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【0132】

上記参照文献および下記実施例において記載されるとおり、ファージ選択後、ファージからの領域をコードする抗体を単離し、使用して完全抗体、例として、ヒト抗体、または任意の他の所望の抗原結合断片を生成し、任意の所望の宿主、例として哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌中で発現させることができる。例えば、当分野において公知の方法、例えば、ＰＣＴ公開国際公開第９２／２２３２４号パンフレット；Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，ＡＪＲＩ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（前記参照文献は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）に開示のものを使用してＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）_２断片を組換え産生する技術も用いることができる。

【0133】

単鎖Ｆｖおよび抗体を産生するために使用することができる技術の例には、米国特許第４，９４６，７７８号明細書および米国特許第５，２５８，４９８号明細書；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；およびＳｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載のものが含まれる。ある実施形態、例えば、治療投与において、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を使用することができる。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えば、ネズミモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体である。キメラ抗体を産生する方法は、当分野において公知である。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２（１９８９）；米国特許第５，８０７，７１５号明細書；米国特許第４，８１６，５６７号明細書；および米国特許第４，８１６３９７号明細書参照。ヒト化抗体は、非ヒト種からの１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する所望抗原に結合する非ヒト種抗体からの抗体分子である。ヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基は、抗原結合を変化、好ましくは、改善させるためにＣＤＲドナー抗体からの対応する残基により置換されることが多い。これらのフレームワーク置換は、当分野において周知の方法により、例えば、ＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用をモデリングして抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定し、配列比較して特定の位置において特殊なフレームワーク残基を同定することにより同定される。（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＱｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号明細書；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）参照）。抗体は、当分野において公知の種々の技術、例として、例えばＣＤＲグラフト化（欧州特許第２３９，４００号明細書；ＰＣＴ公開国際公開第９１／０９９６７号パンフレット；米国特許第５，２２５，５３９号明細書；米国特許第５，５３０，１０１号明細書；および米国特許第５，５８５，０８９号明細書）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号明細書；欧州特許第５１９，５９６号明細書；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３（１９９４））および鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号明細書）を使用してヒト化することができる。

【0134】

完全ヒト抗体は、ヒト患者の療法的治療に特に望ましい。ヒト抗体は、当分野において公知の種々の方法、例として、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用する上記ファージディスプレイ法により作製することができる。それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第４，４４４，８８７号明細書および米国特許第４，７１６，１１１号明細書；ならびにＰＣＴ公開国際公開第９８／４６６４５号パンフレット、国際公開第９８／５０４３３号パンフレット、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、国際公開第９８／１６６５４号パンフレット、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、国際公開第９６／３３７３５号パンフレット、および国際公開第９１／１０７４１号パンフレットも参照。

【0135】

ヒト抗体は、機能的内因性免疫グロブリンを発現し得ないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを使用して産生することもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体をランダムにまたは相同組換えによりマウス胚性幹細胞中に導入することができる。さらに、種々の会社は、上記と同様の技術を使用して選択抗原に対して指向されたトランスジェニックマウスにおいて産生されたヒト抗体の提供に参画し得る。

【0136】

選択エピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイド選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と称される技術を使用して生成することができる。このアプローチにおいて、選択非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を使用して同一エピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドする（Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８）。米国特許第５，５６５，３３２号明細書も参照）。

【0137】

別の実施形態において、所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用の手順を使用して容易に単離および配列決定することができる（例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブの使用による）。単離およびサブクローニングされたハイブリドーマ細胞または単離ファージは、例えば、そのようなＤＮＡの資源として機能し得る。ＤＮＡを単離したら、発現ベクター中に配置し、次いで他では免疫グロブリンを産生しない原核または真核宿主細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞中に形質移入することができる。より特定すると、単離ＤＮＡ（本明細書に記載のとおり合成であり得る）を使用して、参照により本明細書に組み込まれるＮｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，６５８，５７０号明細書、１９９５年１月２５日出願に記載のとおり抗体を製造するために定常および可変領域配列をクローニングすることができる。所望の抗体を発現する形質転換細胞は、比較的大量に成長させて免疫グロブリンの臨床および市販供給品を提供することができる。

【0138】

一実施形態において、単離結合分子、例えば、抗体は、抗体分子の少なくとも１つの重鎖または軽鎖ＣＤＲを含む。別の実施形態において、単離結合分子は、１つまたは複数の抗体分子からの少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、単離結合分子は、１つまたは複数の抗体分子からの少なくとも３つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、単離結合分子は、１つまたは複数の抗体分子からの少なくとも４つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、単離結合分子は、１つまたは複数の抗体分子からの少なくとも５つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本明細書の単離結合分子は、１つまたは複数の抗体分子からの少なくとも６つのＣＤＲを含む。

【0139】

具体的な実施形態において、重鎖および／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を調査して相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を、当分野において周知の方法により、例えば、他の重鎖および軽鎖可変領域の既知アミノ酸配列を比較して配列超可変性の領域を決定することにより同定することができる。定型的なＤＮＡ技術を使用して、ＣＤＲの１つまたは複数をフレームワーク領域内、例えば、ヒトフレームワーク領域中に挿入して非ヒト抗体をヒト化することができる。フレームワーク領域は、天然に生じるものまたはコンセンサスフレームワーク領域、好ましくは、ヒトフレームワーク領域であり得る（例えば、ヒトフレームワーク領域の列記についてＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）参照）。フレームワーク領域およびＣＤＲの組合せにより生成されたポリヌクレオチドは、所望の抗原、例えば、Ｐｓｌの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードする。１つまたは複数のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内に作製することができ、アミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、そのような方法を使用して鎖内ジスルフィド結合に関与する１つまたは複数の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を作製して１つまたは複数の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を生成することができる。ポリヌクレオチドに対する他の変化は、本開示により包含され、当業者の能力の範囲内である。

【0140】

結合分子またはその断片がシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する本明細書に記載の抗体分子（例えば、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域）のバリアント（誘導体を含む）を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる結合分子も提供される。当業者に公知の標準的な技術、例として、限定されるものではないが、アミノ酸置換をもたらす部位特異的突然変異導入およびＰＣＲ媒介突然変異導入を使用してシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する結合分子またはその断片をコードするヌクレオチド配列中に突然変異を導入することができる。バリアント（誘導体を含む）は、参照ＶＨ領域、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、またはＶＬＣＤＲ３に対して５０未満のアミノ酸置換、４０未満のアミノ酸置換、３０未満のアミノ酸置換、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換、または２未満のアミノ酸置換を含むポリペプチドをコードする。「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基により置き換えられたものである。類似の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。あるいは、突然変異は、コード配列の全部または一部に沿って、例えば飽和突然変異導入によりランダムに導入することができ、得られた突然変異体を生物学的活性についてスクリーニングして活性（例えば、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合能）を保持する突然変異体を同定することができる。

【0141】

例えば、抗体分子のフレームワーク領域中にのみ、またはＣＤＲ領域中にのみ突然変異を導入することが可能である。導入される突然変異は、サイレントまたは中立ミスセンス突然変異であり得、すなわち、抗体の抗原結合能に対して影響を有さずまたはほとんど有さない。これらのタイプの突然変異は、コドン使用頻度を最適化するためまたはハイブリドーマの抗体産生を改善するために有用であり得る。あるいは、非中立ミスセンス突然変異は、抗体の抗原結合能を変化させ得る。ほとんどのサイレントおよび中立ミスセンス突然変異の局在は、フレームワーク領域中である可能性が高い一方、ほとんどの非中立ミスセンス突然変異の局在は、ＣＤＲ中である可能性が高いが、これらは絶対要件ではない。当業者は、所望の特性、例えば、不変の抗原結合活性または変化した結合活性（例えば、抗原結合活性の改善または抗体特異性の変化）を有する突然変異体分子を設計および試験することができる。突然変異導入後、コードされるタンパク質は定型的に発現させることができ、コードされるタンパク質の機能的および／または生物学的活性（例えば、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌの少なくとも１つのエピトープに結合する能力）は、本明細書に記載の技術を使用してまたは当分野において公知の定型的改変技術により測定することができる。

【0142】

ＩＩＩ．抗体ポリペプチド
本開示はさらに、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を構成する単離ポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象とする。本明細書に開示の結合分子、例えば、抗体またはその断片は、ポリペプチド、例えば、例えば免疫グロブリン分子に由来するＰｓｌ特異的抗原結合領域をコードするアミノ酸配列を含む。指定のタンパク質「に由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、ポリペプチドの起源を指す。ある場合、特定の出発ポリペプチドまたはアミノ酸配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、出発配列、または少なくとも１０〜２０アミノ酸、少なくとも２０〜３０アミノ酸、少なくとも３０〜５０アミノ酸からなりもしくは他では起源を出発配列中に有すると当業者に同定可能であるその一部分と本質的に同一のアミノ酸配列を有する。

【0143】

表２に示す配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号７４の１つまたは複数と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列を含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片も開示される。

【0144】

さらに、表２に示す配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号７４の１つまたは複数と同一、または１、２、３、４、５つ以上のアミノ酸置換を除いて同一のＶＨアミノ酸配列を含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片が開示される。

【0145】

一部の実施形態は、ＶＨを含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、ＶＨのＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２またはＶＨＣＤＲ３領域の１つまたは複数は、表２に示す配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号７４の１つまたは複数の１つまたは複数の参照重鎖ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２またはＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一の単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を含む。

【0146】

さらに、ＶＨを含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、ＶＨのＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２またはＶＨＣＤＲ３領域の１つまたは複数は、表２に示す配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号７４の１つまたは複数の１つまたは複数の参照重鎖ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２および／またはＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列と同一、または４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一の単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片が開示される。したがって、この実施形態によれば、ＶＨは、表３に示すＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、またはＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列の１つまたは複数と同一または４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、またはＶＨＣＤＲ３の１つまたは複数を含む。

【0147】

表２に示す配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６の１つまたは複数と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一の免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列を含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片も開示される。

【0148】

一部の実施形態は、表２に示す配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６の１つまたは複数と同一、または１、２、３、４、５つ以上のアミノ酸置換を除いて同一のＶＬアミノ酸配列を含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片を開示する。

【0149】

ＶＬを含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、ＶＬのＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２またはＶＬＣＤＲ３領域の１つまたは複数は、表２に示す配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６の１つまたは複数の１つまたは複数の参照軽鎖ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２またはＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一である単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片も提供される。

【0150】

さらに、ＶＬを含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片であって、ＶＬのＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２またはＶＬＣＤＲ３領域の１つまたは複数は、表２に示す配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６の１つまたは複数の１つまたは複数の参照重鎖ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２および／またはＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列と同一、または４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一である単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片が提供される。したがって、この実施形態によれば、ＶＬは、表３に示すＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、またはＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列の１つまたは複数と同一、または４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、またはＶＬＣＤＲ３の１つまたは複数を含む。

【0151】

他の実施形態において、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）それぞれ、配列番号１および配列番号２、（ｂ）それぞれ、配列番号３および配列番号２、（ｃ）それぞれ、配列番号４および配列番号２、（ｄ）それぞれ、配列番号５および配列番号６、（ｅ）それぞれ、配列番号７および配列番号８、（ｆ）それぞれ、配列番号９および配列番号１０、（ｇ）それぞれ、配列番号１１および配列番号１２、（ｈ）それぞれ、配列番号１３および配列番号１４；（ｉ）それぞれ、配列番号１５および配列番号１６または（ｊ）それぞれ、配列番号７４および配列番号１２と少なくとも８０％、８５％、９０％ ９５％または１００％同一のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる。ある実施形態において、上記抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列配列番号１１を有するＶＨおよび配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。一部の実施形態において、上記抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列配列番号１を有するＶＨおよび配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。他の実施形態において、上記抗体またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列配列番号１１を有するＶＨおよび配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＬを含む。

【0152】

ある実施形態において、本明細書に記載の単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、５×１０^−２Ｍ、１０^−２Ｍ、５×１０^−３Ｍ、１０^−３Ｍ、５×１０^−４Ｍ、１０^−４Ｍ、５×１０^−５Ｍ、１０^−５Ｍ、５×１０^−６Ｍ、１０^−６Ｍ、５×１０^−７Ｍ、１０^−７Ｍ、５×１０^−８Ｍ、１０^−８Ｍ、５×１０^−９Ｍ、１０^−９Ｍ、５×１０^−１０Ｍ、１０^−１０Ｍ、５×１０^−１１Ｍ、１０^−１１Ｍ、５×１０^−１２Ｍ、１０^−１２Ｍ、５×１０^−１３Ｍ、１０^−１３Ｍ、５×１０^−１４Ｍ、１０^−１４Ｍ、５×１０^−１５Ｍ、または１０^−１５Ｍ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする親和性でシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する。

【0153】

具体的な実施形態において、本明細書に記載の単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、約１×１０^−１０から約１×１０^−６Ｍの範囲の解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする親和性でシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する。一実施形態において、本明細書に記載の単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に記載のＯＣＴＥＴ（登録商標）結合アッセイにより測定される約１．１８×１０^−７ＭのＫ_Ｄを特徴とする親和性でシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する。別の実施形態において、本明細書に記載の単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に記載のＯＣＴＥＴ（登録商標）結合アッセイにより測定される約１．４４×１０^−７ＭのＫ_Ｄを特徴とする親和性でシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する。

【0154】

一部の実施形態は、（ａ）上皮細胞への緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の付着を阻害し得、（ｂ）緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＯＰＫを促進し得、または（ｃ）上皮細胞への緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の付着を阻害し得、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＯＰＫを促進し得る上記単離結合分子、例えば、抗体またはその断片を含む。

【0155】

一部の実施形態において、上記単離結合分子、例えば、抗体またはその断片において、上皮細胞への緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）付着の最大阻害は、約５０μｇ／ｍｌ以下、５．０μｇ／ｍｌ以下、もしくは約０．５μｇ／ｍｌ以下の抗体濃度、または約３０μｇ／ｍｌから約０．３μｇ／ｍｌの範囲の抗体濃度、または約１μｇ／ｍｌの抗体濃度、または約０．３μｇ／ｍｌの抗体濃度において達成される単離結合分子、例えば、抗体またはその断片。

【0156】

ある実施形態は、上記単離結合分子、例えば、抗体またはその断片において、ＯＰＫ ＥＣ５０は、約０．５μｇ／ｍｌ未満、約０．０５μｇ／ｍｌ未満、もしくは約０．００５μｇ／ｍｌ未満であり、またＯＰＫ ＥＣ５０は、約０．００１μｇ／ｍｌから約０．５μｇ／ｍｌの範囲であり、またはＯＰＫ ＥＣ５０は、約０．０２μｇ／ｍｌから約０．０８μｇ／ｍｌの範囲であり、またはＯＰＫ ＥＣ５０は、約０．００２μｇ／ｍｌから約０．０１μｇ／ｍｌの範囲であり、またはＯＰＫ ＥＣ５０は、約０．２μｇ／ｍｌ未満であり、またはＯＰＫ ＥＣ５０は、約０．０２μｇ／ｍｌ未満である単離結合分子、例えば、抗体またはその断片を含む。ある実施形態において、本明細書に記載の抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、モノクローナル抗体ＷａｐＲ−００４、ＷａｐＲ−００４ＲＡＤ、Ｃａｍ−００３、Ｃａｍ−００４、もしくはＣａｍ−００５と同一のＰｓｌエピトープに特異的に結合し、またはそのようなモノクローナル抗体をシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌへの結合から競合阻害する。ＷａｐＲ−００４ＲＡＤは、配列番号１１のＶＨアミノ酸配列のアミノ酸置換Ｇ９８Ａを除いてＷａｐＲ−００４と同一である。

【0157】

一部の実施形態は、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５；または配列番号１４６の１つまたは複数と同一、または１、２、３、４、５つ以上のアミノ酸置換を除いて同一のｓｃＦｖ−Ｆｃ分子アミノ酸配列を含むＷａｐＲ−００４（Ｗ４）突然変異体を含む。

【0158】

他の実施形態は、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５；または配列番号１４６の１つまたは複数と少なくとも８０％、８５％、９０％ ９５％または１００％同一のｓｃＦｖ−Ｆｃ分子アミノ酸配列を含むＷａｐＲ−００４（Ｗ４）突然変異体を含む。

【0159】

一部の実施形態において、本明細書に記載の抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、モノクローナル抗体ＷａｐＲ−００１、ＷａｐＲ−００２、もしくはＷａｐＲ−００３と同一のエピトープに特異的に結合し、またはそのようなモノクローナル抗体をシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌへの結合から競合阻害する。

【0160】

ある実施形態において、本明細書に記載の抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、モノクローナル抗体ＷａｐＲ−０１６と同一のエピトープに特異的に結合し、またはそのようなモノクローナル抗体をシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌへの結合から競合阻害する。

【0161】

【表2】

【0162】

【表3】

【0163】

本明細書に記載の任意の抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、追加のポリペプチド、例えば、コードされるポリペプチドの分泌を指向させるためのシグナルペプチド、本明細書に記載の抗体定常領域、または本明細書に記載の他の異種ポリペプチドをさらに含み得る。さらに、本明細書の結合分子またはその断片は、他箇所に記載のポリペプチド断片を含む。さらに、本明細書に記載の抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、本明細書に記載の融合ポリペプチド、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、または他の誘導体であり得る。

【0164】

また、本明細書の他箇所により詳細に記載されるとおり、本開示は、本明細書に記載の抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体を含む組成物を含む。

【0165】

本明細書に記載の抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、それらが由来した天然に生じる結合ポリペプチドからのそれらのアミノ酸配列において変動するように改変することができることも当業者により理解される。例えば、設計されたタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、類似であり得、例えば、出発配列とある同一性パーセントを有し、例えば、それは出発配列と６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であり得る。

【0166】

２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の用語「配列同一性パーセント」は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入しなければならない付加または欠失（すなわち、ギャップ）を考慮して比較ウインドウにわたり配列により共有される同一合致位置の数を指す。合致位置は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が標的および参照配列の両方に提供される任意の位置である。標的配列中に提供されるギャップは、ヌクレオチドでもアミノ酸でもないためカウントされない。同様に、参照配列中に提供されるギャップは、参照配列からのヌクレオチドでもアミノ酸でもなく標的配列のヌクレオチドまたはアミノ酸がカウントされるためカウントされない。

【0167】

配列同一性の割合は、同一のアミノ酸残基または核酸塩基が両方の配列中に生じる位置の数を決定して合致位置の数をもたらし、合致位置の数を比較のウインドウ中の位置の総数により割り、結果に１００を掛けて配列同一性の割合をもたらすことにより計算される。２つの配列間の配列の比較および配列同一性パーセントの決定は、オンライン使用およびダウンロードの両方について容易に入手可能なソフトウエアを使用して達成することができる。好適なソフトウエアプログラムは、種々の供給源から入手可能であり、タンパク質およびヌクレオチド配列の両方のアラインメントについて入手可能である。配列同一性パーセントを決定するための１つの好適なプログラムは、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ＢＬＡＳＴウエブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なプログラムのＢＬＡＳＴパッケージソフトの一部ｂｌ２ｓｅｑである。ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して２つの配列間の比較を実行する。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用される一方、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。他の好適なプログラムは、例えば、バイオインフォマティクスプログラムのＥＭＢＯＳＳパッケージソフトの一部Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒであり、さらに欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＥＢＩ）、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａから入手可能である。

【0168】

ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列とアラインする単一ポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域は、それら自体の配列同一性パーセントをそれぞれ有し得る。配列同一性パーセント値は、最近傍の小数第１位に丸められることに留意される。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、および８０．１４は、８０．１に丸められる一方、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、および８０．１９は、８０．２に丸められる。長さ値は常に整数であることも留意される。

【0169】

当業者は、配列同一性パーセントの計算のための配列アラインメントの生成は、専ら１次配列データにより実行される２元配列−配列比較に限定されないことを認識する。配列アラインメントは、複数の配列アラインメントに由来し得る。複数の配列アラインメントを生成するための１つの好適なプログラムはＣｌｕｓｔａｌＷ２であり、ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇから入手可能である。別の好適なプログラムはＭＵＳＣＬＥであり、ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅ／から入手可能である。ＣｌｕｓｔａｌＷ２およびＭＵＳＣＬＥは、例えば、ＥＢＩからも代替的に入手可能である。

【0170】

配列アラインメントは、配列データを異種源からのデータ、例えば、構造データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能データ（例えば、突然変異の局在）、または系統発生学的データと統合することにより生成することができることも認識される。異種データを統合して複数の配列アラインメントを生成する好適なプログラムはＴ−Ｃｏｆｆｅｅであり、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇから入手可能であり、代替的に例えば、ＥＢＩからも入手可能である。配列同一性パーセントを計算するために使用される最終アラインメントは、自動または手動のいずれかでキュレートすることができることも認識される。

【0171】

任意の特定のポリペプチドが別のポリペプチドと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であるかどうかは、当分野において公知の方法およびコンピュータプログラム／ソフトウエア、例えば、限定されるものではないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ(登録商標)，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）を使用して決定することもできる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを使用して２つの配列間の相同性の最良のセグメントを見出す。特定の配列が、例えば参照配列と９５％同一かどうかを決定するためにＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、パラメーターは、無論、同一性の割合が参照ポリペプチド配列の全長にわたり計算され、参照配列中のアミノ酸の総数の５％までの相同性のギャップが許容されるように設定される。

【0172】

さらに、「非必須」アミノ酸領域における保存置換または変化に導くヌクレオチドまたはアミノ酸置換、欠失、または挿入を作製することができる。例えば、設計されたタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、１つまたは複数の個々のアミノ酸置換、挿入、または欠失、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０以上の個々のアミノ酸置換、挿入、または欠失を除いて出発配列と同一であり得る。ある実施形態において、設計されたタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、出発配列に対して１から５、１から１０、１から１５、または１から２０の個々のアミノ酸置換、挿入、または欠失を有する。

【0173】

本明細書に記載の抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、融合タンパク質を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなり得る。融合タンパク質は、例えば、少なくとも１つの標的結合部位、および少なくとも１つの異種部分、すなわち、天然で自然に結合しない部分を有する免疫グロブリン抗原結合ドメインを含むキメラ分子である。アミノ酸配列は、通常、融合ポリペプチドに一緒になる別個のタンパク質中に存在し得、またはそれらは通常、同一タンパク質中に存在し得るが、融合ポリペプチド中の新たな配置で配置される。融合タンパク質は、例えば、化学合成により、またはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを作出および翻訳することにより作出することができる。

【0174】

ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または他の部分に適用される用語「異種」は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または他の部分が比較されている実体の残部から区別される実体に由来することを意味する。非限定的な例において、結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体に融合すべき「異種ポリペプチド」は、同一種の非免疫グロブリンポリペプチド、または異なる種の免疫グロブリンもしくは非免疫グロブリンポリペプチドに由来する。

【0175】

ＩＶ．融合タンパク質および抗体コンジュゲート
一部の実施形態において、抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、コンジュゲート形態で複数回投与することができる。さらに別の実施形態において、抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、未コンジュゲート形態で投与し、次いでコンジュゲート形態で投与することができ、またはその逆で投与することができる。

【0176】

具体的な実施形態において、抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、１つまたは複数の抗菌剤、例えば、ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）にコンジュゲートすることができる。ＰＭＢは、多剤耐性グラム陰性感染の治療について承認された小分子リポペプチド抗生物質である。ＰＭＢは、その殺菌活性に加え、リポ多糖（ＬＰＳ）に結合し、その炎症促進効果を中和する。（Ｄｉｘｏｎ，Ｒ．Ａ．＆ Ｃｈｏｐｒａ，Ｉ．Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ １８，５５７−５６３（１９８６））。ＬＰＳは、炎症およびグラム陰性敗血症の発症に顕著に寄与すると考えられている。（Ｇｕｉｄｅｔ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｓｔ １０６，１１９４−１２０１（１９９４））。循環からＬＰＳを中和および／またはクリアランスする治療は、敗血症の発症を予防または遅延させ、臨床アウトカムを改善する潜在性を有する。ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）は、多剤耐性グラム陰性感染の治療について承認されたリポペプチド抗生物質である。ＰＭＢは、その殺菌活性に加え、ＬＰＳに結合し、その炎症促進効果を中和する。担体分子へのＰＭＢのコンジュゲートは、内毒素血症および感染の動物モデルにおいてＬＰＳを中和し、保護を媒介することが示されている。（Ｄｒａｂｉｃｋ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４２，５８３−５８８（１９９８））。１つまたは複数のＰＭＢ分子を、本開示のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＦｃ領域中に導入されたシステイン残基に付着する方法も開示される。例えば、Ｃａｍ−００３−ＰＭＢコンジュゲートは、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）への特異的なｍＡｂ媒介結合を保持し、ＯＰＫ活性も保持した。さらに、ｍＡｂ−ＰＭＢコンジュゲートは、インビトロでＬＰＳに結合し、それを中和した。

【0177】

ある実施形態において、本明細書に記載の抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、抗体と通常会合していない異種アミノ酸配列または１つまたは複数の他の部分（例えば、抗菌剤、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、脂質、生物学的応答改質剤、医薬剤、リンホカイン、異種抗体またはその断片、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、および任意の前記薬剤の２つ以上の組合せ）を含み得る。さらなる実施形態において、抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、または任意の前記検出可能な標識の２つ以上の組合せからなる群から選択される検出可能な標識を含み得る。

【0178】

Ｖ．結合分子をコードするポリヌクレオチド
本明細書に記載の抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードする核酸分子も、本明細書において提供される。

【0179】

一実施形態は、表２に示す配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号７４の１つまたは複数と少なくとも８０％、８５％、９０％ ９５％または１００％同一の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列をコードする核酸を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。

【0180】

別の実施形態は、表２に示す配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号７４の１つまたは複数と同一、または１、２、３、４、５つ以上のアミノ酸置換を除いて同一のＶＨアミノ酸配列をコードする核酸を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。

【0181】

さらなる実施形態は、ＶＨをコードする核酸を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドであって、ＶＨのＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２またはＶＨＣＤＲ３領域の１つまたは複数は、表２に示す配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号７４の１つまたは複数の１つまたは複数の参照重鎖ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２および／またはＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列と同一、または４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一の単離ポリヌクレオチドを提供する。

【0182】

別の実施形態は、ＶＨを含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドであって、ＶＨのＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２またはＶＨＣＤＲ３領域の１つまたは複数は、表２に示す配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号７４の１つまたは複数の１つまたは複数の参照重鎖ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２および／またはＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列と同一、または４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一の単離ポリヌクレオチドを提供する。

【0183】

さらなる実施形態は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的または優先的に結合するポリヌクレオチドによりコードされるＶＨを含む単離結合分子、例えば、抗体または抗原結合断片を提供する。

【0184】

別の実施形態は、表２に示す配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６の１つまたは複数と少なくとも８０％、８５％、９０％ ９５％または１００％同一の免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列をコードする核酸を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。

【0185】

さらなる実施形態は、表２に示す配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６の１つまたは複数と同一、または１、２、３、４、５つ以上のアミノ酸置換を除いて同一のＶＬアミノ酸配列をコードする核酸を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。

【0186】

別の実施形態は、ＶＬをコードする核酸を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドであって、ＶＬのＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２またはＶＬＣＤＲ３領域の１つまたは複数は、表２に示す配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６の１つまたは複数の１つまたは複数の参照軽鎖ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２またはＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一である単離ポリヌクレオチドを提供する。

【0187】

さらなる実施形態は、ＶＬを含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドであって、ＶＬのＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２またはＶＬＣＤＲ３領域の１つまたは複数は、表２に示す配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６の１つまたは複数の１つまたは複数の参照重鎖ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２および／またはＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列と同一、または４、３、２、もしくは１つのアミノ酸置換を除いて同一である単離ポリヌクレオチドを提供する。

【0188】

別の実施形態において、ポリヌクレオチドによりコードされるＶＬを含む単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的または優先的に結合する。

【0189】

一実施形態は、ＶＨおよびＶＬを含むｓｃＦｖ分子をコードする核酸を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドであって、ｓｃＦｖは、表４に示す配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、または配列番号７０の１つまたは複数と少なくとも８０％、８５％、９０％ ９５％または１００％同一である単離ポリヌクレオチドを提供する。

【0190】

【表4】

【0191】

一部の実施形態において、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する上記ポリヌクレオチドの１つまたは複数によりコードされる単離抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）それぞれ、配列番号１および配列番号２、（ｂ）それぞれ、配列番号３および配列番号２、（ｃ）それぞれ、配列番号４および配列番号２、（ｄ）それぞれ、配列番号５および配列番号６、（ｅ）それぞれ、配列番号７および配列番号８、（ｆ）それぞれ、配列番号９および配列番号１０、（ｇ）それぞれ、配列番号１１および配列番号１２、（ｈ）それぞれ、配列番号１３および配列番号１４；（ｉ）それぞれ、配列番号１５および配列番号１６；または（ｊ）それぞれ、配列番号７４および配列番号１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる。

【0192】

ある実施形態において、上記ポリヌクレオチドの１つまたは複数によりコードされる単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、５×１０^−２Ｍ、１０^−２Ｍ、５×１０^−３Ｍ、１０^−３Ｍ、５×１０^−４Ｍ、１０^−４Ｍ、５×１０^−５Ｍ、１０^−５Ｍ、５×１０^−６Ｍ、１０^−６Ｍ、５×１０^−７Ｍ、１０^−７Ｍ、５×１０^−８Ｍ、１０^−８Ｍ、５×１０^−９Ｍ、１０^−９Ｍ、５×１０^−１０Ｍ、１０^−１０Ｍ、５×１０^−１１Ｍ、１０^−１１Ｍ、５×１０^−１２Ｍ、１０^−１２Ｍ、５×１０^−１３Ｍ、１０^−１３Ｍ、５×１０^−１４Ｍ、１０^−１４Ｍ、５×１０^−１５Ｍ、または１０^−１５Ｍ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする親和性でシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する。

【0193】

具体的な実施形態において、上記ポリヌクレオチドの１つまたは複数によりコードされる単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、約１×１０^−１０Ｍから約１×１０^−６Ｍの範囲の解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする親和性でシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する。一実施形態において、上記ポリヌクレオチドの１つまたは複数によりコードされる単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に記載のＯＣＴＥＴ（登録商標）結合アッセイにより測定される約１．１８×１０^−７Ｍの解離定数（Ｋ_Ｄ）を特徴とする親和性でシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する。別の実施形態において、上記ポリヌクレオチドの１つまたは複数によりコードされる単離結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に記載のＯＣＴＥＴ（登録商標）結合アッセイにより測定される約１．４４×１０^−７ＭのＫ_Ｄを特徴とする親和性でシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する。

【0194】

ある実施形態において、上記ポリヌクレオチドの１つまたは複数によりコードされる抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、モノクローナル抗体ＷａｐＲ−００４、ＷａｐＲ−００４ＲＡＤ、Ｃａｍ−００３、Ｃａｍ−００４、もしくはＣａｍ−００５と同一のＰｓｌエピトープに特異的に結合し、またはそのようなモノクローナル抗体をシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌへの結合から競合阻害する。ＷａｐＲ−００４ＲＡＤは、配列番号１１のＶＨアミノ酸配列をコードするＶＨ核酸配列の核酸置換Ｇ２９３Ｃ（配列番号７１の３１７位におけるＶＨコード部分中のヌクレオチドの置換）を除いてＷａｐＲ−００４と同一である。ＷａｐＲ−００４ＲＡＤ ＶＨをコードする核酸配列は配列番号７６として提示する。

【0195】

一部の実施形態は、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５；または配列番号１４６の１つまたは複数と同一、または１、２、３、４、５つ以上のアミノ酸置換を除いて同一のＷ４突然変異体ｓｃＦｖ−Ｆｃ分子アミノ酸配列をコードする核酸を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。

【0196】

他の実施形態は、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５；または配列番号１４６の１つまたは複数と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一のＷ４突然変異体ｓｃＦｖ−Ｆｃ分子アミノ酸配列をコードする核酸を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供する。

【0197】

一実施形態は、Ｗ４突然変異体ｓｃＦｖ−Ｆｃ分子をコードする核酸を含み、本質的にそれからなり、またはそれからなる単離ポリヌクレオチドであって、核酸は、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、または配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４；または配列番号２１５の１つまたは複数と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一である単離ポリヌクレオチドを提供する。

【0198】

他の実施形態において、上記ポリヌクレオチドの１つまたは複数によりコードされる抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、モノクローナル抗体ＷａｐＲ−００１、ＷａｐＲ−００２、もしくはＷａｐＲ−００３と同一のエピトープに特異的に結合し、またはそのようなモノクローナル抗体をシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌへの結合から競合阻害する。

【0199】

ある実施形態において、上記ポリヌクレオチドの１つまたは複数によりコードされる抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、モノクローナル抗体ＷａｐＲ−０１６と同一のエピトープに特異的に結合し、またはそのようなモノクローナル抗体をシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌへの結合から競合阻害する。

【0200】

本開示は、本明細書の他箇所に記載のポリヌクレオチドの断片も含む。さらに、上記の融合ポリヌクレオチド、Ｆａｂ断片、および他の誘導体をコードするポリヌクレオチドも提供される。

【0201】

ポリヌクレオチドは、当分野において公知の任意の方法により産生または製造することができる。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知である場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学合成オリゴヌクレオチドからアセンブルすることができ（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載のとおり）、手短に述べると、抗体をコードする配列の部分を含有する重複オリゴヌクレオチドを合成し、それらのオリゴヌクレオチドをアニールおよびライゲートし、次いでライゲートされたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅を含む。

【0202】

あるいは、抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、好適な資源からの核酸から生成することができる。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンは入手可能でないが、抗体分子の配列が既知の場合、抗体をコードする核酸は、化学合成することができ、または好適な資源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞もしくは例えば抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞から生成されたｃＤＮＡライブラリー、またはそれから単離された核酸、好ましくは、ポリＡ＋ＲＮＡ）から、配列の３’および５’末端にハイブリダイズする合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅により、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングにより、例えば抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定することにより得ることができる。次いで、ＰＣＲにより生成された増幅核酸を、当分野において周知の任意の方法を使用して複製可能なクローニングベクター中にクローニングすることができる。

【0203】

抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を決定したら、そのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作の分野において周知の方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異導入、ＰＣＲなどを使用して操作して（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９８）に記載の技術参照、これらは両方とも参照により全体として本明細書に組み込まれる）、例えば、アミノ酸置換、欠失、および／または挿入を作出するために異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成することができる。

【0204】

抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、未改変ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成することができる。例えば、抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、１本鎖および２本鎖ＤＮＡ、１本鎖および２本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖および２本鎖ＲＮＡ、ならびに１本鎖および２本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、１本鎖またはより典型的には２本鎖または１本鎖および２本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成することができる。さらに、抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む３本鎖領域から構成することができる。抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数の改変塩基または安定性もしくは他の理由のために改変されたＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格も含有し得る。「改変」塩基には、例えば、トリチル化塩基および特殊塩基、例えば、イノシンが含まれる。種々の改変をＤＮＡおよびＲＮＡに作製することができ；したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的改変形態を包含する。

【0205】

免疫グロブリン（例えば、免疫グロブリン重鎖部分または軽鎖部分）に由来するポリペプチドの非天然バリアントをコードする単離ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされるタンパク質中に導入されるように、１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加または欠失を免疫グロブリンのヌクレオチド配列中に導入することにより作出することができる。突然変異は、標準的な技術、例えば、部位特異的突然変異導入およびＰＣＲ媒介突然変異導入により導入することができる。保存アミノ酸置換は、１つまたは複数の非必須アミノ酸残基において作製することができる。

【0206】

ＶＩ．抗体ポリペプチドの発現
周知のとおり、ＲＮＡは、元のハイブリドーマ細胞または他の形質転換細胞から標準的な技術、例えば、グアニジニウムイソチオシアネート抽出および沈殿に続く遠心分離またはクロマトグラフィーにより単離することができる。所望により、ｍＲＮＡは、総ＲＮＡから標準的な技術、例えば、オリゴｄＴセルロース上でのクロマトグラフィーにより単離することができる。好適な技術は、当分野において知られている。

【0207】

一実施形態において、抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、周知の方法に従って逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを使用して同時または別個に作製することができる。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマーによりまたは公開されている重鎖および軽鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づくより特異的なプライマーにより開始することができる。上記のとおり、ＰＣＲを使用して抗体軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離することもできる。この場合、ライブラリーはコンセンサスプライマーまたはより大きい相同プローブ、例えば、マウス定常領域プローブによりスクリーニングすることができる。

【0208】

ＤＮＡ、典型的には、プラスミドＤＮＡは、当分野において公知の技術を使用して細胞から単離し、例えば、組換えＤＮＡ技術に関する上記の参照文献に詳細に記載される標準的な周知技術に従って制限マッピングおよび配列決定することができる。無論、ＤＮＡは、単離プロセスまたは後続の分析の間の任意の時点において本開示による合成物であり得る。

【0209】

本開示の抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体を提供するための単離遺伝子材料の操作後、抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子をコードするポリヌクレオチドは、典型的には、所望量の抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子を産生するために使用することができる宿主細胞中への導入のために発現ベクター中に挿入する。

【0210】

抗体、またはその断片、誘導体もしくはアナログ、例えば、上記標的分子、例えば、Ｐｓｌに結合する抗体の重鎖または軽鎖の組換え発現は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を要求する。本開示の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはその部分（重鎖または軽鎖可変ドメインを含有する）をコードするポリヌクレオチドを得たら、抗体分子産生のためのベクターを当分野において周知の技術を使用する組換えＤＮＡ技術により産生することができる。したがって、本明細書に記載のヌクレオチド配列をコードする抗体を含有するポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を調製する方法が本明細書に記載される。当業者に周知の方法を使用して抗体コード配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。したがって、本開示は、プロモーターに作動可能に結合している本開示の抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含み得（例えば、ＰＣＴ公開国際公開第８６／０５８０７号パンフレット；ＰＣＴ公開国際公開第８９／０１０３６号パンフレット；および米国特許第５，１２２，４６４号明細書参照）、抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖全体の発現のためにそのようなベクター中にクローニングすることができる。

【0211】

用語「ベクター」または「発現ベクター」は、所望遺伝子を宿主細胞中に導入し、および発現させるためのビヒクルとして本開示により使用されるベクターを意味するために本明細書において使用される。当業者に公知のとおり、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスからなる群から容易に選択することができる。一般に、本開示と同等なベクターは、選択マーカー、所望遺伝子のクローニングならびに原核または真核細胞中への進入および／またはその細胞中での複製能を易化するための適切な制限部位を含む。

【0212】

本開示の目的のため、多数の発現ベクター系を用いることができる。例えば、ベクターの１つのクラスは、動物ウイルス、例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルスに由来するＤＮＡエレメントを利用する。他には、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロニック系の使用が含まれる。さらに、ＤＮＡを染色体中に統合させた細胞を、形質移入された宿主細胞の選択を可能とする１つまたは複数のマーカーを導入することにより選択することができる。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）または重金属、例えば、銅耐性を提供し得る。選択可能マーカー遺伝子は、発現させるべきＤＮＡ配列に直接結合させ、または同一の細胞中に同時形質転換により導入することができる。追加のエレメントがｍＲＮＡの最適な合成に必要とされることもある。これらのエレメントには、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルが含まれ得る。

【0213】

一部の実施形態において、クローニングされた可変領域遺伝子を上記の合成重鎖および軽鎖定常領域遺伝子（例えば、ヒト）とともに発現ベクター中に挿入する。無論、真核細胞中で発現を誘発し得る任意の発現ベクターを本開示において使用することができる。好適なベクターの例には、限定されるものではないが、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）、およびプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）が含まれる。一般に、高レベルの免疫グロブリン重鎖および軽鎖を好適に発現するものについての大量の形質転換細胞のスクリーニングは、例えば、ロボットシステムにより実施することができる定型実験である。

【0214】

より一般には、本開示の抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体のモノマーサブユニットをコードするベクターまたはＤＮＡ配列を調製したら、発現ベクターを適切な宿主細胞中に導入することができる。宿主細胞中へのプラスミドの導入は、当業者に周知の種々の技術により達成することができる。これらには、限定されるものではないが、形質移入（電気泳動およびエレクトロポレーションを含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープＤＮＡとの細胞融合、マイクロインジェクション、およびインタクトウイルスによる感染が含まれる。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．“Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ”Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ２４．２，ｐｐ．４７０−４７２（１９８８）参照。典型的には、宿主中へのプラスミド導入は、エレクトロポレーションを介する。発現構築物を保有する宿主細胞は、軽鎖および重鎖の産生に適切な条件下で成長させ、重鎖および／または軽鎖タンパク質合成についてアッセイする。例示的アッセイ技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化細胞ソーター分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが含まれる。

【0215】

発現ベクターを慣用の技術により宿主細胞に移し、次いで形質移入細胞を慣用の技術により培養して本明細書に記載の方法において使用される抗体を産生する。したがって、本開示は、異種プロモーターに作動可能に結合している抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体、またはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。２本鎖抗体の発現についての一部の実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、下記に詳述するとおり免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞中で同時発現させることができる。

【0216】

ある実施形態は、上記ＶＨおよびＶＬをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドにより発現される結合分子またはその抗原結合断片は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する単離ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、表４に示す配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、または配列番号７０の１つまたは複数と少なくとも８０％、８５％、９０％ ９５％または１００％同一のＶＨおよびＶＬを含むｓｃＦｖ分子をコードする。

【0217】

一部の実施形態は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む。さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に会合している。追加の実施形態において、本開示は、そのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。さらなる実施形態において、本開示は、ポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に会合しており、好適な宿主細胞中でシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する結合分子を発現し得るベクターを提供する。

【0218】

シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌに特異的に結合する結合分子またはその断片を産生する方法であって、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを含有する宿主細胞を培養すること、および前記抗体、またはその断片を回収することを含む方法も提供される。さらなる実施形態において、本開示は、上記方法により産生される単離結合分子またはその断片を提供する。

【0219】

本明細書において使用される「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を使用して構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターを保有する細胞を指す。組換え宿主からの抗体の単離方法の記載において、用語「細胞」および「細胞培養物」は、特に明確に記載のない限り、抗体の資源を示すために互換的に使用される。換言すると、「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠沈させた全細胞、または培地および懸濁細胞を両方含有する細胞培養物からのいずれかを意味し得る。

【0220】

種々の宿主発現ベクター系を利用して本明細書に記載の方法において使用される抗体分子を発現させることができる。そのような宿主発現系は、対象のコード配列を産生することができ、続いて精製することができるビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列により形質転換または形質移入された場合、インサイチューで本開示の抗体分子を発現し得る細胞も表す。これらには、限定されるものではないが、微生物、例えば、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ））；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）により感染された昆虫細胞系；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）により感染され、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）により形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含有する組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が含まれる。細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、または真核細胞は、特に完全組換え抗体分子の発現のため、組換え抗体分子の発現に使用される。例えば、ベクター、例えばヒトサイトメガロウイルスからの主要前初期遺伝子プロモーターエレメントと連携する哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）は、抗体のための有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０）。

【0221】

タンパク質発現に使用される宿主細胞系は、哺乳動物起源であることが多く；当業者には、発現させるべき所望の遺伝子産物に最良に適合する特定の宿主細胞系を決定することができる能力があると考えられている。例示的な宿主細胞系には、限定されるものではないが、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）および２９３（ヒト腎臓）が含まれる。宿主細胞系は、典型的には、市販サービス、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、または公開文献から入手可能である。

【0222】

さらに、挿入配列の発現をモジュレートし、または望まれる規定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、開裂）は、タンパク質の機能に重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセッシングおよび修飾についての特徴および規定の機序を有する。適切な細胞系または宿主系を、発現される外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確保するように選択することができる。この目的のため、１次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。

【0223】

組換えタンパク質の長期高収量産生のため、安定的発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定的に発現する細胞系をエンジニアリングすることができる。ウイルス複製起源を含有する発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞を適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）、および選択可能なマーカーにより制御されたＤＮＡにより形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、エンジニアリングされた細胞を強化培地中で１〜２日間成長させることができ、次いで選択培地にスイッチする。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをそれらの染色体中に安定的に統合させ、成長してフォーカスを形成することを可能とし、次いで細胞系中にクローニングおよび拡張することができる。この方法は、有利には、抗体分子を安定的に発現する細胞系をエンジニアリングするために使用することができる。

【0224】

多数の選択系、例として、限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２（１９９２））を使用することができ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２２：８１７ １９８０）遺伝子を、ｔｋ、ｈｇｐｒｔまたはａｐｒｔ細胞中でそれぞれ用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性を以下の遺伝子についての選択をベースとして使用することができる：メトトレキセート耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７（１９８１））；ミコフェノール酸耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ４１８耐性を付与するｎｅｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（Ｍａｙ，１９９３）ならびにハイグロマイシン耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４）。使用することができる組換えＤＮＡ技術の分野において一般に公知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；およびＣｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載されており、それらは参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【0225】

抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅により増加させることができる（概説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３．（１９８７）参照）。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させる。増幅領域が抗体遺伝子と会合するため、抗体の産生も増加する（Ｃｒｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。

【0226】

インビトロ産生は、大量の所望のポリペプチドを与えるためのスケールアップを可能とする。組織培養条件下での哺乳動物培養のための技術は、当分野において公知であり、それには、例えば、エアリフト反応器もしくは連続撹拌反応器中での均一懸濁液培養、または例えば、中空繊維、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジ上での固定化もしくは捕捉細胞培養が含まれる。必要および／または所望により、例えば、合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的生合成の後または本明細書に記載のＨＩＣクロマトグラフィー工程の前またはその後、ポリペプチドの溶液を慣用のクロマトグラフィー法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフィーまたは（免疫）親和性クロマトグラフィーにより精製することができる。

【0227】

本明細書に開示の抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードする構築物は、非哺乳動物細胞、例えば、細菌または酵母または植物細胞中で発現させることもできる。容易に核酸を取り込む細菌には、腸内細菌、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）；バシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、肺炎球菌属（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の株のメンバーが含まれる。異種ポリペプチドは、細菌中で発現される場合、典型的には、封入体の一部になることがさらに認識される。異種ポリペプチドは、単離、精製し、次いで機能分子にアセンブルしなければならない。抗体の４価形態が望ましい場合、次いでサブユニットは４価抗体に自己組織化する（国際公開第０２／０９６９４８Ａ２号パンフレット）。

【0228】

細菌系において、発現される抗体分子に意図される使用に応じて多数の発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、大量のそのようなタンパク質を産生すべき場合、抗体分子の医薬組成物の生成のため、容易に精製することができる高レベルの融合タンパク質産物の発現を指向するベクターが望ましいことがある。そのようなベクターには、限定されるものではないが、融合タンパク質が産生されるように抗体コード配列をベクター中にインフレームでｌａｃＺコード領域と個々にライゲートすることができる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））などが含まれる。ｐＧＥＸベクターを使用して外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させることもできる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、溶解細胞からマトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合に続く遊離グルタチオンの存在下での溶出により容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされる標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から放出させることができるように、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むように設計される。

【0229】

原核生物に加え、真核微生物を使用することもできる。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または一般的なパン酵母が、真核微生物のうちで最も一般に使用されるが、多数の他の株、例えば、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が一般に利用可能である。

【0230】

サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現のため、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０：１５７（１９８０））が一般に使用される。このプラスミドは、トリプトファン中での成長能を欠く酵母の突然変異株、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５：１２（１９７７））のための選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子を既に含有する。次いで、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐｌ傷害の存在は、トリプトファンの不存在下での成長による形質転換の検出に有効な環境を提供する。

【0231】

昆虫系において、キンウワバ科（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を典型的には、ベクターとして使用して外来遺伝子を発現させる。このウイルスは、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中で成長する。抗体コード配列をウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）中に個々にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置することができる。

【0232】

本開示の抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体を組換え発現させたら、それを免疫グロブリン分子の精製についての分野において公知の任意の方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインＡ後の特異的抗原についての親和性によるもの、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差により、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術により精製することができる。本開示の抗体の親和性を増加させる別の方法は、米国特許出願公開第２００２０１２３０５７Ａ１号明細書に開示されている。

【0233】

ＶＩＩ．血清型無差別結合分子の同定
本開示は、優れたまたは所望の治療活性を有する血清型非依存性治療結合分子、例えば、抗体またはその断片を同定するための標的無差別全細胞アプローチを包含する。本方法を利用して感染作用物質、例えば、細菌病原体の不所望な活性をアンタゴナイズ、中和、クリアランス、または遮断し得る結合分子を同定することができる。当分野において公知のとおり、多くの感染作用物質は、それらのドミナント表面抗原の顕著なバリエーションを示し、それらが免疫学的監視を回避することを可能とする。本明細書に記載の同定法は、多くの異なるシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種または他のグラム陰性病原体に共有される抗原を標的化する結合分子を同定し得、したがって複数種からの複数の病原体を標的化し得る治療剤を提供する。例えば、本方法を利用して血清型非依存様式で緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の表面に結合し、細菌病原体に結合した場合、細菌細胞、例えば、細菌病原体、例えば、日和見シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種（例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、およびシュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ））に対するオプソニン食菌（ＯＰＫ）活性を媒介、促進、または向上させ、および／または上皮細胞へのそのような細菌細胞の付着を阻害する一連の結合分子を同定することができる。

【0234】

ある実施形態は、血清型無差別結合分子を同定する方法であって、（ａ）ナイーブおよび／または回復期抗体ライブラリーをファージ中で調製すること、（ｂ）血清型特異的抗体をライブラリーから枯渇パニングにより除去すること、（ｃ）血清型非依存性の全細胞に特異的に結合する抗体についてライブラリーをスクリーニングすること、および（ｄ）得られた抗体を所望の機能特性についてスクリーニングすることを含む方法を開示する。

【0235】

ある実施形態は、ナイーブまたは緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染回復期患者に由来する抗体ファージライブラリーを用いる本明細書に開示の全細胞表現型スクリーニングアプローチを提供する。血清型特異的反応性に対して最初に選択したパニング方針を使用して、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）全細胞に結合する異なるクローンを単離した。選択されたクローンをヒトＩｇＧ１抗体に変換し、血清型分類または組織単離の部位にかかわらず緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）臨床単離物と反応することを確認した（実施例参照）。本明細書に記載の機能活性スクリーンは、抗体が哺乳動物細胞への緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）付着の予防に有効であり、オプソニン食菌（ＯＰＫ）殺傷を濃度依存および血清型非依存様式で媒介することを示した。

【0236】

さらなる実施形態において、上記結合分子もしくはその断片、抗体もしくはその断片、または組成物は、２つ以上、３つ以上、４つ以上、もしくは５つ以上の異なる緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）血清型、または感染患者から単離された緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）血清型の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％に結合する。さらなる実施形態において、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株は、肺、唾液、眼、膿汁、糞便、尿、洞、創傷、皮膚、血液、骨、または膝液の１つまたは複数から単離される。

【0237】

ＶＩＩＩ．抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子を含む医薬組成物
本開示において使用される医薬組成物は、当業者に周知の薬学的に許容可能な担体を含む。非経口投与のための調製物には、無菌水性または非水性液剤、懸濁液、または乳濁液が含まれる。本明細書に開示のある医薬組成物は、許容可能な剤形、例として、例えば、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液または液剤で経口投与することができる。ある医薬組成物は、鼻腔エアゾールまたは吸入により投与することもできる。保存剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤、および不活性ガスなども存在し得る。本明細書に開示の治療方法において使用される好適な配合物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１６ｔｈ ｅｄ．（１９８０）に記載されている。

【0238】

単一剤形を産生するために担体材料と組み合わせることができる抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体の量は、治療される宿主および特定の投与方式に応じて変動する。投与量レジメンは、最適な所望応答（例えば、治療または防止応答）を提供するように調整することもできる。組成物は、化合物に好適な送達または担持系として機能する生体適合性担体材料中に分散した抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体も含み得る。

【0239】

ＩＸ．治療結合分子を使用する治療方法
本明細書に開示の抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体を調製およびそれが必要とされる対象に投与する方法は周知であり、または当業者により容易に決定することができる。抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入によるものまたは局所であり得る。本明細書において使用される非経口という用語には、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、または皮下投与が含まれる。投与に好適な形態は、注射、特に静脈内もしくは動脈内注射または点滴用液剤である。しかしながら、本明細書に教示と同等な他の方法において、本明細書に開示の抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、有害細胞集団、例えば、感染の部位に直接送達することができ、それにより治療剤への疾患組織の曝露を増加させる。例えば、抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子は、眼組織、火傷損傷、または肺組織に直接投与することができる。

【0240】

本明細書に開示の抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染のインビボ治療について薬学的有効量で投与することができる。これに関して、開示結合分子は、活性剤の投与を易化し、安定性を促進するように配合されることが認識される。本出願の目的のため、薬学的有効量は、標的への有効な結合を達成するためおよび利益、例えば、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染の治療、改善、縮減、クリアランス、または予防を達成するために十分な量を意味するものとする。

【0241】

一部の実施形態は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染の予防または治療が必要とされる対象においてシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染を予防または治療する方法であって、対象に有効量の本明細書に記載の結合分子もしくはその断片、抗体もしくはその断片、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を投与することを含む方法を対象とする。さらなる実施形態において、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染である。一部の実施形態において、対象はヒトである。ある実施形態において、感染は眼感染、肺感染、火傷感染、創傷感染、皮膚感染、血液感染、骨感染、または前記感染の２つ以上の組合せである。さらなる実施形態において、対象は、急性肺炎、火傷損傷、角膜感染、嚢胞性線維症、またはそれらの組合せを罹患する。

【0242】

ある実施形態は、上皮細胞への緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の付着を遮断または予防する方法であって、上皮細胞および緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の混合物を、本明細書に記載の結合分子もしくはその断片、抗体もしくはその断片、組成物、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞と接触させることを含む方法を対象とする。

【0243】

緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＯＰＫを向上させる方法であって、食細胞および緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の混合物を、本明細書に記載の結合分子もしくはその断片、抗体もしくはその断片、組成物、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞と接触させることを含む方法も開示される。さらなる実施形態において、食細胞は、分化ＨＬ−６０細胞またはヒト多形核白血球（ＰＭＮ）である。

【0244】

本開示の範囲に従うと、抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体もしくは誘導体は、上記の治療方法に従って治療効果を産生するために十分な量でヒトまたは他の哺乳動物に投与することができる。本明細書に開示の抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、そのようなヒトまたは他の動物に、本開示の抗体を公知の技術に従って慣用の薬学的に許容可能な担体または希釈剤と組み合わせることにより調製された慣用の剤形で投与することができる。

【0245】

シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染の治療のための本開示の組成物の有効用量は、多くの異なる要因、例として、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトか動物か、投与される他の医薬品、および治療が防止的か療法的かに応じて変動する。通常、患者はヒトであるが、非ヒト哺乳動物、例として、トランスジェニック哺乳動物を治療することもできる。治療投与量を当業者に公知の定型方法を使用して力価測定して安全性および効力を最適化することができる。

【0246】

抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、当業者に公知の種々の要因に応じて種々の頻度において複数の場合に投与することができる。あるいは、抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は徐放配合物として投与することができ、この場合、低頻度の投与が要求される。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変動する。

【0247】

本開示の組成物は、任意の好適な方法により、例えば、非経口、脳室内、経口、吸入スプレーにより、局所、直腸、鼻腔、バッカル、経膣または植込リザーバーを介して投与することができる。本明細書において使用される用語「非経口」には、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、鞘内、肝内、病巣内および頭蓋内注射または注入技術が含まれる。

【0248】

Ｘ．免疫アッセイ
抗シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｐｓｌ結合分子、例えば、抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、当分野において公知の任意の方法により免疫特異的結合についてアッセイすることができる。使用することができる免疫アッセイには、限定されるものではないが、いくつか例を挙げると、ウエスタンブロットのような技術を使用する競合および非競合アッセイ系、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ免疫アッセイが含まれる。そのようなアッセイは定型的であり、当分野において周知である（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．１（１９９４）参照）。例示的な免疫アッセイを以下に手短に記載する（しかし、限定を意図するものではない）。

【0249】

抗体−抗原相互作用の親和性の計測に利用可能な種々の方法が存在するが、速度定数の測定については比較的少ない。ほとんどの方法は、抗体または抗原のいずれかの標識に依存し、定型的な計測の煩雑化が不可避であり、計測量が不確実になる。抗体親和性は、多数の方法、例として、ＯＣＴＥＴ（登録商標）、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）、ＥＬＩＳＡ、およびＦＡＣＳにより計測することができる。
ＯＣＴＥＴ（登録商標）システムは、９６ウェルプレートフォーマット中のバイオセンサーを使用して速度論的分析を報告する。タンパク質結合および解離イベントは、溶液中のあるタンパク質の、ＦｏｒｔｅＢｉｏバイオセンサー上に固定化された第２のタンパク質への結合を計測することによりモニタリングすることができる。Ｐｓｌへの抗Ｐｓｌ抗体の結合を計測する場合、ＰｓｌをＯＣＴＥＴ（登録商標）チップ上に固定化し、次いで溶液中の抗体の結合を分析する。次いで、固定化Ｐｓｌに対する抗体の会合および解離を装置センサーにより検出する。次いで、データを収集し、親和性曲線フィッティングのためにＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにエクスポートする。

【0250】

ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）上で実施される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、抗体−抗原相互作用の親和性を計測する慣用の方法と比べて多数の利点を提供する：（ｉ）抗体にも抗原にも標識する必要がない；（ｉｉ）抗体を予め精製する必要がなく、細胞培養物上澄みを直接使用することができる；（ｉｉｉ）異なるモノクローナル抗体相互作用の迅速な半定量比較を可能とするリアルタイム計測が可能であり、多くの評価目的に十分である；（ｉｖ）生物特異的表面を、一連の異なるモノクローナル抗体を同一条件下で容易に比較することができるように再生することができる；（ｖ）分析手順を完全自動化し、広範な計測系列を使用者の介在なしで実施することができる。ＢＩＡａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｖｅｒｓｉｏｎ ＡＢ（１９９８年再版）、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）コード番号ＢＲ−１００１−８６；ＢＩＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｖｅｒｓｉｏｎ ＡＢ（１９９８年再版）、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）コード番号ＢＲ−１００１−８４。

【0251】

ＳＰＲベース結合試験は、結合ペアの一方のメンバーをセンサー表面上に固定化することを要求する。固定化された結合パートナーは、リガンドと称される。溶液中の結合パートナーは、分析物と称される。一部の場合、リガンドは、捕捉分子と称される別の固定化分子への結合を介して表面に間接的に付着される。ＳＰＲ応答は、分析物が結合または解離したときの検出器表面における質量濃度の変化を反映する。

【0252】

ＳＰＲに基づき、リアルタイムＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）計測は、相互作用をそれらが生じたときに直接モニタリングする。この技術は速度論的パラメーターの決定に十分適合する。競合親和性ランキングは極端に実施しやすく、速度論および親和性定数の両方をセンサーグラムデータから導くことができる。

【0253】

分析物をリガンド表面にわたり別々のパルスでインジェクトする場合、得られたセンサーグラムを３つの必須相に分割することができる：（ｉ）試料インジェクションの間の分析物とリガンドとの会合；（ｉｉ）分析物結合の速度が複合体からの解離により平衡される試料インジェクションの間の平衡または定常状態；（ｉｉｉ）緩衝液流動間の表面からの分析物の解離。

【0254】

会合および解離相は、分析物−リガンド相互作用（ｋ_ａおよびｋ_ｄ、複合体形成および解離の速度、ｋ_ｄ／ｋ_ａ＝Ｋ_Ｄ）のキネティクスに関する情報を提供する。平衡相は、分析物−リガンド相互作用（Ｋ_Ｄ）の親和性に関する情報を提供する。

【0255】

ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアは、数値積分およびグローバルフィッティングアルゴリズムの両方を使用して曲線フィッティングのための包括的ファシリティーを提供する。データの好適な分析により、相互作用についての分離速度および親和性定数を簡単なＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）調査から得ることができる。この技術により計測可能な親和性の範囲は極めて広く、ｍＭからｐＭに及ぶ。

【0256】

エピトープ特異性は、モノクローナル抗体の重要な特徴である。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によるエピトープマッピングは、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡまたは他の表面吸着法を使用する慣用の技術とは対照的に、抗体の標識も精製も要求せず、いくつかのモノクローナル抗体の配列を使用して多部位特異性試験を可能とする。さらに、大量の分析物を自動的に処理することができる。

【0257】

ペアワイズ結合実験は、２つのＭＡｂの同一抗原に同時に結合する能力を試験する。別個のエピトープに対して指向されたＭＡｂは、独立して結合する一方、同一または密接に関連するエピトープに対して指向されたＭＡｂは、互いの結合を干渉する。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によるこれらの結合実験は、実施が容易である。

【0258】

例えば、第１のＭａｂに結合させるための捕捉分子を使用し、次いで抗原および第２のＭＡｂを連続的に添加することができる。センサーグラムは、１．どれほどの数の抗原が第１のＭａｂに結合するか、２．どの程度、第２のＭＡｂが表面付着抗原に結合するか、３．第２のＭＡｂが結合しない場合、ペアワイズ試験の順序の逆転は結果を変えるかどうかを明らかにする。

【0259】

ペプチド阻害は、エピトープマッピングに使用される別の技術である。この方法は、ペアワイズ抗体結合試験を補完し得、抗原の１次配列が既知の場合、機能的エピトープを構造的特徴と関連づけ得る。ペプチドまたは抗原断片を、固定化抗原への異なるＭＡｂの結合の阻害について試験する。所与のＭＡｂの結合を干渉するペプチドは、そのＭＡｂにより定義されるエピトープと構造的に関連すると想定される。

【0260】

本開示の実施は、特に記載のない限り、当分野の技能の範囲内の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の慣用の技術を用いる。そのような技術は、文献に十分説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：（１９８９）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．，（１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号明細書；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）参照。

【0261】

免疫学の一般原理を記載する標準的な参照文献には、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．，Ｂｒｏｓｔｏｆｆ，Ｊ．ａｎｄ Ｍａｌｅ Ｄ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６^ｔｈ ｅｄ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ（２００１）；Ａｂｂａｓ Ａ．，Ａｂｕｌ，Ａ．ａｎｄ Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ａ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ （２００５）；およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）が含まれる。

【0262】

本開示を目下詳細に記載したが、同一のことは、以下の実施例を参照することによってより明確に理解され、それらの実施例は説明の目的のためにのみ本明細書に含まれ、本開示を限定するものではない。本明細書において参照される全ての特許および刊行物は、参照により全体として明示的に組み込まれる。

【実施例】

【0263】

実施例１
ヒト抗体ファージディスプレイライブラリーの構築およびスクリーニング
本実施例は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）感染に対する新規保護抗原を同定するためのナイーブおよび緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染回復期患者の両方に由来するヒト抗体ファージライブラリーを用いる標的無差別全細胞パニングアプローチを記載する（図１Ａ）。インビトロ機能スクリーンに含まれるアッセイは、オプソニン食菌（ＯＰＫ）殺傷アッセイおよび上皮細胞系Ａ５４９を使用する細胞付着アッセイを含んだ。リード候補物は、優れたインビトロ活性に基づき、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）急性肺炎、角膜炎、および火傷感染モデルにおいて試験した。

【0264】

図１Ｂは、患者抗体ファージディスプレイライブラリーの構築を示す。全血を６人の回復期患者から診断７〜１０日後にプールし、次いでＲＮＡ抽出し、上記のとおりファージライブラリーを構築した（Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４，３０９−３１４（１９９６）；Ｗｒａｍｍｅｒｔ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５３，６６７−６７１（２００８））。図１Ｃは、最終クローニングｓｃＦｖライブラリーが５．４×１０^８個の形質転換体を含有したことを示し、配列決定は、ｓｃＦｖ遺伝子の７９％が全長でありインフレームであることを明らかにした。ＶＨ ＣＤＲ３ループは、エピトープ特異性の決定に重要なことが多く、ライブラリー選択前にアミノ酸レベルにおいて８４％の多様性であった。

【0265】

患者ライブラリーに加え、最大１×１０^１１個の結合メンバーを含有するナイーブヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリー（Ｌｌｏｙｄ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２２，１５９−１６８（２００９））を、抗体単離に使用した（Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４，３０９−３１４（１９９６））。加熱殺傷した緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（１×１０^９）をＩＭＭＵＮＯ（商標）チューブ（Ｎｕｎｃ；ＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標））中に固定化し、次いで上記のとおりファージディスプレイ選択を行い（Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４，３０９−３１４（１９９６））、但しトリエタノールアミン（１００ｎＭ）を溶出緩衝液として使用した。懸濁液中の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に基づく選択のため、加熱殺傷細菌をブロッキングし、次いでブロッキングされたファージを細胞に添加した。洗浄後、溶出させたファージを使用して上記のとおり大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に感染させた（Ｖａｕｇｈａｎ，１９９６）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのファージのレスキューおよびＥＬＩＳＡによる加熱殺傷緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）への結合は、上記のとおり実施した（Ｖａｕｇｈａｎ，１９９６）。

【0266】

全細胞親和性選択方法の開発および評価後、新たな回復期患者ライブラリーおよび既に構築されたナイーブライブラリーの両方（Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４，３０９−３１４（１９９６））を、完全Ｏ抗原を有する緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株３０６４およびＯ抗原の表面発現を欠くアイソジェニックｗａｐＲ突然変異株の懸濁液に対する親和性選択に供した。図１Ｄは、連続患者ライブラリー選択からのアウトプット力価が、ナイーブライブラリーよりも患者ライブラリーについてより大きい速度において増加することが見出されたことを示す（ラウンド３においてそれぞれ１×１０^７対３×１０^５）。さらに、ライブラリーにおけるＶＨ ＣＤＲ３ループ配列の重複（選択の間のクローン濃縮の尺度）も、ラウンド３において患者ライブラリーにおいて８８〜９２％に達し、ナイーブライブラリーにおける１５〜２５％と比較して高いことが見出された（図１Ｄ）。次に、親和性選択からの個々のｓｃＦｖファージを緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）異種血清型株に対する反応性についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした（図１Ｅ）。ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ；ＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標））を、上記のとおり一晩培養物からの緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株によりコートした（ＤｉＧｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２，７０１２−７０２１（２００４））。希釈抗体をブロッキングしたプレートに１時間添加し、洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒト２次抗体により１時間処理し、次いで上記のとおり発色および分析した（Ｕｌｂｒａｎｄｔ，Ｎ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８０，７７９９−７８０６（２００６））。両方のライブラリーを用いる全細胞選択から得られたファージのドミナント種は、血清型特異的反応性をもたらした（データ示さず）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはウシ血清アルブミンへの非特異的結合の不存在下で血清型非依存性結合を示すクローンをさらなる評価のために選択した。

【0267】

ＩｇＧ発現のため、選択抗体のＶＨおよびＶＬ鎖をヒトＩｇＧ１発現ベクター中にクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞中で同時発現させ、上記のとおりプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した（Ｐｅｒｓｉｃ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８７，９−１８（１９９７））。これらの選択血清型非依存的ファージからの可変領域から作製されたヒトＩｇＧ１抗体を、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）特異性について確認し、ＦＡＣＳ分析によりドミナント臨床関連血清型への全細胞結合により後続の分析のために優先順位を付けた（図１Ｆ）。それというのも、この方法は、ＥＬＩＳＡよりもストリンジェントであるためである。フローサイトメトリーをベースとする結合アッセイのため、対数増殖中期の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株をＰＢＳ中に２．０のＯＤ_６５０まで濃縮した。抗体（１０μｇ／ｍＬ）および細菌（約１×１０^７個の細胞）を振とうしながら４℃において１時間インキュベートした後、洗浄した細胞をＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ６４７（登録商標）ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と４℃において０．５時間インキュベートした。洗浄した細胞を、推奨されるとおりＢＡＣＬＩＧＨＴ（商標）緑色細菌染色により染色した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。試料をＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でランさせ、ＢＤ ＦａｃｓＤｉｖａ（ｖ．６．１．３）およびＦｌｏｗＪｏ（ｖ．９．２；ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して分析した。ＦＡＣＳにより結合を示す抗体を、オプソニン食菌殺傷（ＯＰＫ）アッセイにおける機能的活性試験のためにさらに優先順位を付けた。

【0268】

実施例２
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＯＰＫを促進するｍＡｂの評価
本実施例は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＯＰＫを促進する優先順位を付けたヒトＩｇＧ１抗体の評価を記載する。図２Ａは、ＷａｐＲ−００７および陰性対照抗体Ｒ３４７を除き、全ての抗体が発光緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）血清型Ｏ５株（ＰＡＯ１．ｌｕｘ）の濃度依存的殺傷を媒介したことを示す。ＷａｐＲ−００４およびＣａｍ−００３は、優れたＯＰＫ活性を示した。ＯＰＫアッセイは、修正した（ＤｉＧｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２，７０１２−７０２１（２００４））に記載のとおり実施した。手短に述べると、アッセイを、９６ウェルプレート中で０．０２５ｍｌのそれぞれのＯＰＫ構成成分を使用して実施した；緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株；希釈子ウサギ血清；分化ＨＬ−６０細胞；およびモノクローナル抗体。一部のＯＰＫアッセイにおいて、記載（Ｃｈｏｉ，Ｋ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２，４４３−４４８（２００５））のとおり構築した発光緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株を使用した。発光ＯＰＫアッセイは、上記のとおり実施したが、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥＮＶＩＳＩＯＮ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）を測定した。

【0269】

ＷａｐＲ−００４およびＣａｍ−００３抗体が別の臨床関連Ｏ抗原血清型株９８８２−８０．ｌｕｘに対するＯＰＫ活性を媒介する能力を評価した。図２Ｂは、ＷａｐＲ−００４およびＣａｍ−００３ＯＰＫ活性の向上が株９８８２−８０（Ｏ１１）に及ぶことを示す。

【0270】

Ｃａｍ−００３が臨床関連Ｏ抗原血清型からの代表的な非ムコイド株に対しておよび嚢胞性線維症患者に由来したムコイド緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株に対してＯＰＫ活性を媒介する能力を評価した。Ｃａｍ−００３は、試験された全ての非ムコイド臨床単離物の強力なＯＰＫを媒介した（図２Ｃ）。さらに、Ｃａｍ−００３は、試験された全てのムコイド緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）単離物の強力な殺傷を媒介した（図２Ｄ）。

【0271】

さらに、本実施例は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＯＰＫを促進するｓｃＦｖ−ＦｃフォーマットにおけるＷａｐＲ−００４（Ｗ４）突然変異体の評価を記載する。ある突然変異体Ｗａｐ−００４ＲＡＤ（Ｗ４−ＲＡＤ）は、部位特異的突然変異導入を介して特異的に作出してＶＨ中のＲＧＤモチーフを除去した。他のＷ４突然変異体は以下のとおり調製した。ネステッドＰＣＲを記載（Ｒｏｕｘ，Ｋ．Ｈ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ ４，Ｓ１８５−１９４（１９９５））のとおり実施して回復期緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染患者に由来するｓｃＦｖライブラリーから分析のためにＷ４バリアント（体細胞超突然変異に由来）を増幅させた。これは、ＷａｐＲ−００４が由来したライブラリーである。Ｗ４バリアント断片を、当分野において公知の標準的手順を使用してサブクローニングおよび配列決定した。Ｗ４突然変異体軽鎖（ＬＣ）をＷａｐＲ−００４重鎖（ＨＣ）により組み換えてｓｃＦｖ−ＦｃフォーマットのＷ４突然変異体を産生した。さらに、ＷａｐＲ−００４ＲＡＤ重鎖（ＨＣ）突然変異体をｓｃＦｖ−ＦｃフォーマットのＭ７およびＭ８の親ＬＣにより組み換えた。構築物は、当分野において公知の標準的な手順を使用して調製した。図１１（Ａ〜Ｍ）は、陰性対照抗体Ｒ３４７を除き、全てのＷａｐＲ−００４（Ｗ４）突然変異体が発光緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）血清型Ｏ５株（ＰＡＯ１．ｌｕｘ）の濃度依存的殺傷を媒介したことを示す。

【0272】

実施例３
血清型非依存性抗緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）抗体は、Ｐｓｌエキソ多糖を標的化する
本実施例は、表現型スクリーニングに由来する抗緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）抗体の標的の同定を記載する。標的分析は、血清型非依存性抗体がタンパク質または炭水化物抗原を標的化したかどうかを試験するように実施した。ＥＬＩＳＡにおいて、プロテイナーゼＫにより完全に消化されたＰＡＯ１全細胞抽出物への結合の損失は観察されず、このことは反応性が表面接近可能な炭水化物残基を標的化したことを示唆する（データ示さず）。アイソジェニック突然変異体は、Ｏ抗原、アルギネート、およびＬＰＳコア生合成を担う遺伝子において構築した；ｗｂｐＬ（Ｏ抗原欠損）；ｗｂｐＬ／ａｌｇＤ（Ｏ抗原およびアルギネート欠損）；ｒｍｌＣ（Ｏ抗原欠損およびトランケート外部コア）；およびｇａｌＵ（Ｏ抗原欠損およびトランケート内部コア）。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）突然変異体は、Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｈ．Ｐ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６，１１９５−１２０４（１９９２）；Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｈ．Ｄ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５，８３１−８３４（１９９３））により記載されるアレル置換方針に基づき構築した。ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｓ１７．１から緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株ＰＡＯ１中に動員させ；組換え体を記載（Ｈｏａｎｇ，Ｔ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２１２，７７−８６（１９９８））のとおり単離した。遺伝子欠失は、ＰＣＲにより確認した。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）突然変異体は、野生型遺伝子を保有するｐＵＣＰ３０Ｔベース構築物により補完した。抗体の反応性は、間接ＥＬＩＳＡにより上記緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株によりコートしたプレート上で測定した：図３Ａおよび３Ｊは、ｗｂｐＬまたはｗｂｐＬ／ａｌｇＤ二重突然変異体へのＣａｍ−００３結合が影響を受けなかったが、ｒｍｌＣおよびｇａｌＵ突然変異体への結合が消失したことを示す。これらの結果はＬＰＳコアへの結合と一致した一方、ＰＡＯ１から精製されたＬＰＳに対する反応性は観察されなかった。ｒｍｌＣおよびｇａｌＵ遺伝子は、近年、Ｐｓｌエキソ多糖、Ｄ−マンノース、Ｌ−ラムノース、およびＤ−グルコースからなる繰り返し五糖ポリマーの生合成に要求されることが示された。ｐｓｌＡがＰｓｌ生合成に要求されるため、アイソジェニックｐｓｌＡノックアウトＰＡＯ１ΔｐｓｌＡへのＣａｍ−００３結合を試験した（Ｂｙｒｄ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７３，６２２−６３８（２００９））。ＰＡＯ１ΔｐｓｌＡへのＣａｍ−００３の結合は、ＥＬＩＳＡ（図３Ｂ）およびＦＡＣＳ（図３Ｃ）により試験した場合に消失した一方、この突然変異体中のＬＰＳ分子は影響を受けなかった（図３Ｄ）。Ｃａｍ−００３の結合は、ｐｓｌＡにより補完されたＰＡＯ１ΔｗｂｐＬ／ａｌｇＤ／ｐｓｌＡ三重突然変異体においてにおいて回復し（図３Ｅ）、これはＣａｍ−００３がこの突然変異体とは対照的に補完ＰＡＯ１ΔｐｓｌＡに対するオプソニン殺傷を媒介する能力と同様であった（図３Ｆおよび３Ｇ）。Ｐｅｌエキソ多糖突然変異体へのＣａｍ−００３抗体の結合も、影響を受けず、このことはさらに、Ｐｓｌを本発明者らの抗体標的として確認する（図３Ｅ）。結合アッセイは、残留抗体もＰｓｌに結合することを確認した（図３Ｈおよび３Ｉ）。

【0273】

全ての抗体が同一抗原に結合したことを確認するため、上記のとおりＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標）ＯＣＴＥＴ（登録商標）３８４装置を使用してＰｓｌ捕捉結合アッセイを実施した。抗原は、ＰＡＯ１ΔｗｂｐＬ／ａｌｇＤ／ｐｅｌＡ（Ｏ抗原、アルギネートおよびＰｅｌエキソ多糖欠損）から精製されたプロテイナーゼＫ処理濃縮炭水化物であった。個々の抗体をアミノプロピルシランバイオセンサーに結合させ、次いでブロッキングし、濃縮炭水化物抗原を添加した。洗浄して未結合抗原を除去した後、捕捉抗原への未標識ｍＡｂの結合を評価した。全ての結合抗体（Ｃａｍ−００３、Ｃａｍ−００４、Ｃａｍ−００５、ＷａｐＲ−００１、ＷａｐＲ−００２、ＷａｐＲ−００３、ＷａｐＲ−００７およびＷａｐＲ−０１６）は、対照ｍＡｂＲ３４７を除き、Ｃａｍ−００３、ＷａｐＲ−００１、ＷａｐＲ−００２、ＷａｐＲ−００３、およびＷａｐＲ−０１６のそれぞれと反応した抗原を捕捉し得た（図３Ｋ）。Ｃａｍ−００４、Ｃａｍ−００５およびＷａｐＲ−００７の３つ全ての抗体は、Ｃａｍ−００３、ＷａｐＲ−００１、ＷａｐＲ−００２、ＷａｐＲ−００３、およびＷａｐＲ−０１６と強力に反応するために十分なＰｓｌを捕捉したにもかかわらず、捕捉されたＰｓｌに対する最小の反応性がＣａｍ−００４、Ｃａｍ−００５およびＷａｐＲ−００７について観察された（図３Ｋ）。これらの結果は、血清型非依存的に緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に結合した表現型スクリーニングにより得られた全てのｍＡｂが、Ｐｓｌエキソ多糖と会合しているエピトープを標的化したことを示唆する。

【0274】

実施例４
抗ＰｓｌｍＡｂは、培養上皮細胞への緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の付着を遮断する。
本実施例は、抗Ｐｓｌ抗体が上皮細胞との緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）会合を遮断したことを示す。抗Ｐｓｌ抗体を、不透明９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄｅｌｔａ）中で成長させたＡ５４９細胞（腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞系）のコンフルエント単層に添加した。対数増殖期の発光緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１株（ＰＡＯ１．ｌｕｘ）を１０のＭＯＩにおいて添加した。ＰＡＯ１．ｌｕｘをＡ５４９細胞と３７℃において１時間インキュベートした後、Ａ５４９細胞を洗浄し、次いでＬＢ＋０．５％グルコースを添加した。実施例２に記載のＯＰＫアッセイにおいて実施したとおり、３７℃における短時間のインキュベーション後に細菌を定量した。Ａ５４９細胞を有さないウェルからの計測値を使用して非特異的結合について補正した。図４は、Ｃａｍ−００５およびＷａｐＲ−００７を除き、全ての抗体がＡ５４９細胞へのＰＡＯ１．ｌｕｘの会合を用量依存様式で低減させたことを示す。ＯＰＫアッセイにおいて最良に機能したｍＡｂのＷａｐＲ−００４およびＣａｍ−００３（図２Ａ〜Ｂ、および実施例２参照）も、Ａ５４９肺上皮細胞への緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細胞付着の阻害において最も活性であり、陰性対照と比較して最大約８０％の低減を提供した。ＷａｐＲ−０１６は、３番目に活性の抗体であり、ＷａｐＲ−００４およびＣａｍ−００３と同様の阻害活性を示したが、１０倍高い抗体濃度において示した。

【0275】

実施例５
インビボ継代緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株は、Ｐｓｌの発現を維持／増加させる
インビボでのＰｓｌ発現が維持されるかどうかを試験するため、マウスに緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）単離物を腹腔内注射し、次いで注射４時間後に腹腔洗浄により細菌を回収した。Ｐｓｌの存在は、対照抗体およびＣａｍ−００３を用いてフローサイトメトリーにより分析した。それというのも、抗体結合についての条件がよりストリンジェントであり、Ｐｓｌ発現に陽性または陰性である細胞の定量を可能とするためである。エクスビボ結合のため、細菌接種材料（０．１ｍｌ）を、一晩ＴＳＡプレートから調製し、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内送達した。チャレンジ４時間後において、細菌を回収し、ＲＢＣを溶解させ、超音波処理し、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０および１％ＢＳＡを補給したＰＢＳ中で再懸濁させた。実施例１に既に記載したとおり試料を染色し、分析した。図５は、野生型緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株を有する腹腔洗浄後に回収された細菌が、対数増殖期の培養細菌と同等の濃いＣａｍ−００３染色を示したことを示す（図５Ａおよび５Ｃを比較）。インビボ継代野生型細菌は、接種材料と比較して染色の向上を示した（図５Ｂおよび５Ｃを比較）。接種材料内で、Ｐｓｌは株６０７７について検出されず、株ＰＡＯ１（Ｏ５）および６２０６（Ｏ１１−細胞毒性）について最少で検出された。細菌へのＣａｍ−００３の結合は接種材料に関して増加し、このことは、Ｐｓｌ発現がインビボで維持または増加されることを示す。野生型株６０７７、ＰＡＯ１、および６２０６は、インビボ継代後にＰｓｌを発現するが、ｐｓｌＡを欠失する株ＰＡＯ１（ＰＡＯ１ΔｐｓｌＡ）は、Ｃａｍ−００３と反応し得ない。これらの結果は、Ｐｓｌをモノクローナル抗体の標的としてさらに強調する。

【0276】

急性肺炎モデルにおける緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株ＰＡＯ１および６２０６の表面上でのＰｓｌ発現／接近可能性のレベルも評価した。上記のとおり一晩インキュベートされたコンフルエントプレートから調製された細菌をＢＡＬＢ／ｃマウスに鼻腔内投与した。感染４および２４時間後において、細菌を肺から気管支洗浄により回収した。実施例１に既に記載のとおり試料を染色および分析した。濃いＣａｍ−００３染色が、感染４時間後においてＰＡＯ１について観察されたが、この時点において６２０６については最小であった（図５Ｄ）。しかしながら、感染２４時間後においては、株ＰＡＯ１および６２０６の両方について、濃いＣａｍ−００３染色が観察された（図５Ｅ）。

【0277】

ユニークな緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）血清型（ＰＡＯ１（Ｏ５）（図５Ｆ）、２１３５（Ｏ１）（図５Ｇ）、２５３１（Ｏ１）（図５Ｈ）、２４１０（Ｏ６）（図５Ｉ）、２７６４（Ｏ１１）（図５Ｊ）、２７５７（Ｏ１１）（図５Ｋ）、３３３５６（Ｏ９）（図５Ｌ）、３３３４８（Ｏ１）（図５Ｍ）、３０３９（ＮＴ）（図５Ｎ）、３０６１（ＮＴ）（図５Ｏ）、３０６４（ＮＴ）（図５Ｐ）、１９６６０（ＮＴ）（図５Ｑ）、９８８２−８０（Ｏ１１）（図５Ｒ）、６０７３（Ｏ１１）（図５Ｓ）、６０７７（Ｏ１１）（図５Ｔ）および６２０６（Ｏ１１）（図５Ｕ）への代表株への緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）特異的抗体（Ｃａｍ−００３、Ｃａｍ−００４およびＣａｍ−００５）の結合を、概ね上記のとおりフローサイトメトリーにより評価した。

【0278】

実施例６
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）急性肺炎モデルにおける抗Ｐｓｌモノクローナル抗体Ｃａｍ−００３およびＷａｐＲ−００４により処理した動物についての生存率
抗体またはＰＢＳをそれぞれのモデルに感染２４時間前に投与した。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）急性肺炎、角膜炎、および熱傷感染モデルを上記のとおり修正して実施した（ＤｉＧｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４，４６２４−４６２９（２００７））。急性肺炎モデルにおいて、ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を０．０５ｍｌの接種材料中で懸濁させた緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株により感染させた。熱傷モデルにおいて、ＣＦ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）は、９２℃への１０秒間の金属焼印加熱により１０％の総体表面積火傷を受けた。動物を緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株６０７７により示した用量において皮下感染させた。臓器負荷実験のため、急性肺炎をマウスにおいて誘導し、次いでＣＦＵの決定のために肺、脾臓、および腎臓を感染２４時間後に回収した。

【0279】

モノクローナル抗体Ｃａｍ−００３およびＷａｐＲ−００４を、臨床疾患と関連する最も高頻度の血清型を表す緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株に対して急性致死肺炎モデルにおいて評価した。図６Ａおよび６Ｃは、対照と比較して株ＰＡＯ１および６２９４により感染させたＣａｍ−００３処理マウスの有意な濃度依存性生存率を示す。図６Ｂおよび６Ｄは、３３３５６および細胞毒性株６０７７によるチャレンジからの完全な保護が、Ｃａｍ−００３により４５および１５ｍｇ／ｋｇにおいて行われた一方、８０および９０％の生存率が５ｍｇ／ｋｇにおいて３３３５６および６０７７についてそれぞれ観察されたことを示す。図６Ｅおよび６Ｆは、株６０７７（Ｏ１１）（８×１０^５ＣＦＵ）（図６Ｅ）、または６０７７（０１１）（６×１０^５ＣＦＵ）（図６Ｆ）を有する急性肺炎モデルにおけるＷａｐＲ−００４処理マウスにおける有意な濃度依存性生存率を示す。図６Ｇは、１２０時間においてＣａｍ−００３が株ＰＡＯ１による感染後１００％の生存率を提供したことを示す。生存率の増加は、ＰＡＯ１急性肺炎試験における陰性対照として使用されたＰｓｌ突然変異株ＰＡＯ１ΔｐｓｌＡに対して確認されず（図６Ｇ）、このことは、Ｐｓｌ発現欠損株に対するＣａｍ−００３活性の欠落を確認する。

【0280】

次に、Ｃａｍ−００３およびＷａｐＲ−００４をそれらの肺における緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）臓器負荷を低減させ、遠位の臓器に拡散する能力について試験し、その後、動物を種々の濃度のＷａｐＲ−００４、Ｃａｍ−００３、または対照抗体によりいくつかの異なる濃度において処理した。Ｃａｍ−００３は、試験された４つ全ての株に対する緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）肺負荷の低減において有効であった。Ｃａｍ−００３は、高病原性細胞毒性株６０７７に対して最も有効であり、低用量が高用量と同様に有効であった（図７Ｄ）。Ｃａｍ−００３は、ＰＡＯ１（図７Ａ）、６２９４（図７Ｃ）、および６０７７（図７Ｄ）により感染させたマウスの脾臓および腎臓への播種の低減における顕著な効果も有した一方、これらの臓器への播種は、３３３５６感染マウスにおいては観察されなかった（図７Ｂ）。図７Ｅおよび７Ｆは、同様に、ＷａｐＲ−００４が６２９４（Ｏ６）および６２０６（Ｏ１１）による急性肺炎の導入後に臓器負荷を低減させたことを示す。具体的には、ＷａｐＲ−００４は、感染マウスにおける脾臓および腎臓への緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）播種の低減において有効であった。

【0281】

実施例７
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）角膜感染モデルにおける抗Ｐｓｌモノクローナル抗体Ｃａｍ−００３およびＷａｐＲ−００４により処理した動物についての生存率
次に、Ｃａｍ−００３およびＷａｐＲ−００４の効力を、病原体の付着および損傷組織のコロニー化能を強調する緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）角膜感染モデルにおいて評価した。図８Ａ〜Ｄおよび８Ｆ〜Ｇは、Ｃａｍ−００３およびＷａｐＲ−００４を受けたマウスが、陰性対照処理動物に観察されたものよりも眼の総ホモジネートにおいて顕著に少ない病原性および細菌カウント数の低減を有したことを示す。図８Ｅは、Ｃａｍ−００３は熱傷モデルにおいて試験した場合でも有効であったことを示し、抗体処理対照と比較して１５および５ｍｇ／ｋｇにおいて顕著な保護を提供する。

【0282】

実施例８
Ｃａｍ−００３Ｆｃ突然変異抗体Ｃａｍ−００３−ＴＭは、縮小したＯＰＫおよびインビボ効力を有するが、抗細胞付着活性を維持する。
二重の作用機序についての潜在性を考慮して、Ｆｃγ受容体との相互作用を低減させるＦｃドメイン中の突然変異を保有するＣａｍ−００３Ｆｃ突然変異抗体Ｃａｍ−００３−ＴＭ（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６４，７００−７０４（２００８））を作出して、保護が抗細胞付着またはＯＰＫ活性とより相関性を示すかどうかを同定した。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）突然変異体を、Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｈ．Ｐ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６，１１９５−１２０４（１９９２）；Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｈ．Ｄ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５，８３１−８３４（１９９３））により記載されるアレル置換方針に基づき構築した。ベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｓ１７．１から緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株ＰＡＯ１中に動員させ；組換え体を記載（Ｈｏａｎｇ，Ｔ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２１２，７７−８６（１９９８））のとおり単離した。遺伝子欠損はＰＣＲにより確認した。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）突然変異体は、野生型遺伝子を保有するｐＵＣＰ３０Ｔベース構築物により補完した。図９Ａは、Ｃａｍ−００３−ＴＭが、Ｃａｍ−００３と比較してＯＰＫ活性の４倍の降下を示したが（それぞれ、０．２４および０．０６のＥＣ_５０）、細胞付着アッセイにおいて有効であったことを示す（図９Ｂ）。図９Ｃは、Ｃａｍ−００３−ＴＭが肺炎に対してもあまり有効でなかったことを示し、このことは、最適なＯＰＫ活性が最適な保護に必要であることを示唆する。ＯＰＫおよび細胞付着アッセイは、それぞれ実施例２および４に既に記載のとおり実施した。マウス急性肺炎モデルにおいて試験した場合、Ｃａｍ−００３−ＴＭは、６０７７の低感染接種材料（２．４×１０^５ＣＦＵ）においてＣａｍ−００３と効力が類似であった（図９Ｄ）。しかしながら、抗体用量のさらなる力価測定に続くより大きい感染接種材料（１．０７×１０^６）によるチャレンジは、Ｃａｍ−００３活性がＣａｍ−００３−ＴＭよりも優れていることを明らかにし、このことは、ＯＰＫ活性が最適なインビボ保護に顕著に寄与することを示唆する（図９Ｅ）。

【0283】

実施例９
抗Ｐｓｌ抗体についてのエピトープマッピングおよび相対親和性
エピトープマッピングを競合ＥＬＩＳＡにより実施し、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株ＰＡＯ１の一晩培養物の上澄みに由来するＰｓｌを用いるＯＣＴＥＴ（登録商標）フローシステムを使用して確認した。競合ＥＬＩＳＡのため、ＥＺ−Ｌｉｎｋスルホ−ＮＨＳ−ビオチンおよびビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抗体をビオチン化した。抗原コートプレートを、未標識抗体と同時インキュベートしたＥＣ_５０のビオチン化抗体により処理した。ＨＲＰ−コンジュゲートストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とインキュベートした後、プレートを上記のとおり発色させた。抗ＰｓｌｍＡｂ間の競合実験は、抗体が少なくとも３つのユニークエピトープを標的化することを決定し、クラス１、２、および３抗体と称した（図１０Ａ）。クラス１および２抗体は、結合について競合しないが、クラス３抗体ＷａｐＲ−０１６は、クラス１および２抗体の結合を部分的に阻害する。

【0284】

抗体親和性は、一晩ＰＡＯ１培養物の上澄みに由来するＰｓｌを使用してＯＣＴＥＴ（登録商標）結合アッセイにより測定した。抗体Ｋ_Ｄは、それぞれの抗体について７つの濃度の結合キネティクスを平均化することにより測定した。親和性計測値は、３８４傾斜底ウェルプレートを使用するＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標）ＯＣＴＥＴ（登録商標）３８４装置により取った。一晩ＰＡＯ１培養物±ｐｓｌＡ遺伝子からの上澄みをＰｓｌ資源として使用した。試料をＯＣＴＥＴ（登録商標）アミノプロピルシラン（ＰＢＳ中で水和）センサー上にロードし、ブロッキングし、次いでいくつかの濃度において抗ＰｓｌｍＡｂ結合、およびＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中への解離を計測した。全ての手順は、記載（Ｗａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６２，１５１−１６０）のとおり実施した。会合および解離生ΔｎＭデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにより曲線フィッティングした。図１０Ａは、上記で特性決定された抗Ｐｓｌ抗体の相対結合親和性を示す。クラス２抗体は、全ての抗Ｐｓｌ抗体のうちで最大の親和性を有した。図１０Ａは、細胞付着およびＯＰＫデータ実験のまとめも示す。図１０Ｂは、Ｗａｐ−００４ＲＡＤ（Ｗ４ＲＡＤ）突然変異体および実施例１に記載のとおり調製された他のＷ４突然変異体の相対結合親和性およびＯＰＫ ＥＣ５０値を示す。

【0285】

実施例１０
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１細胞へのポリミキシンＢ（ＰＭＢ）−ｍＡｂコンジュゲートの結合をＦＡＣＳにより評価した
本実施例において、細菌クリアランスを媒介し得るオプソニンモノクローナル抗体（ｍＡｂ）にコンジュゲートされたＰＭＢを評価してコンジュゲートがｍＡｂの機能性を改善および／または拡張する一方、さらにＰＭＢの毒性を低減させるかどうかを決定した。インビボで強力なオプソニン食菌殺傷（ＯＰＫ）活性および保護を媒介する、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌ表面エキソ多糖を標的化するｍＡｂのＣＡＭ−００３を、コンジュゲート評価のために選択した。

【0286】

本実施例は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１細胞への種々のポリミキシンＢ（ＰＭＢ）−ｍＡｂコンジュゲートの結合を評価する。２段階部位特異的コンジュゲート法（図１２）を使用して、ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）をＦｃ領域中にエンジニアリングされた単一または二重システインを有するＣａｍ−００３およびＡ７（ｈＩｇＧ１対照）ｍＡｂバリアントにコンジュゲートした。Ｃａｍ−００３およびＡ７ｍＡｂＦｃバリアントは、（Ｄｉｍａｓｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３９３（３）：６７２−９２（２００９））に記載のとおり標準的なプロトコルを使用して調製した。ヘテロ二官能性ＳＭ（ＰＥＧ）_１２リンカー（Ｐｉｅｒｃｅ）を最初に、単一リンカーのコンジュゲーションを支持するように決定された条件下で、リンカー中のＮＨＳ基を介してＰＭＢ中の第１級アミンの１つにコンジュゲートした。ポリミキシンＢ硫酸塩（Ｓｉｇｍａ）をＰＢＳ ｐＨ７．２中で２ｍｇ／ｍｌにおいて溶解させ、ＳＭ（ＰＥＧ）_１２リンカーと４：１のＰＭＢリンカー比において反応させた。反応は、室温において３０分間実施し、５０ｍＭのグリシンにより停止させた。ＰＭＢへのＳＭ（ＰＥＧ）_１２リンカーコンジュゲーションの効率は、約２５％であった。次いで、ＰＭＢ−ＰＥＧ_１２の粗製調製物を脱保護ＦｃシステインｍＡｂバリアントと反応させ、ＰＥＧ_１２リンカー中のマレアミドを介してコンジュゲートした（例えば、国際公開第２０１１／００５４８１号パンフレットおよび国際公開第２００９／０９２０１１号パンフレット参照）。ＰＭＢ−ｍＡｂコンジュゲートは、大規模透析により精製した。コンジュゲートを最初に０．７％ＣＨＡＰＳを有する３．３×ＰＢＳ ｐＨ７．２中で４回緩衝液交換して透析し、次いで１×ＰＢＳ ｐＨ７．２中でさらに４回緩衝液交換して透析した。コンジュゲーション効率および試料中のレベル遊離ＰＭＢリンカーは、ＵＰＬＣおよび質量分析により測定した。

【0287】

ＣＡＭ−００３は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌ表面エキソ多糖に特異的であり、複数のインビボモデルにおいて強力なＯＰＫ活性および保護を媒介する。図１３Ａは、Ｃａｍ−００３およびＡ７Ｆｃ領域突然変異残基を示す。ＳＭ（Ａ３３９Ｃ）、ＤＭ１（Ｔ２８９Ｃ／Ａ３３９Ｃ）、ＤＭ２（Ａ３３９Ｃ／Ｓ４４２Ｃ）。ＰＭＢ−ｍＡｂバリアントのコンジュゲーション効率は、精製コンジュゲート中の重鎖の質量分析により測定した（例えば、国際公開第２０１１／００５４８１号パンフレットおよび国際公開第２００９／０９２０１１号パンフレット参照）。全コンジュゲーション効率は７５〜８５％であった。構築物の純度は、遊離ＰＭＢリンカーに対するコンジュゲートに関して＞９５％であった。図１３Ｂは、ＰＭＢ−Ｃａｍ−００３およびＰＭＢ−Ａ７コンジュゲート中のＰＭＢの平均数を示す（二重突然変異体２（ＤＭ２）＞二重突然変異体１（ＤＭ１）＞単一突然変異体（ＳＭ））。Ａ７コンジュゲートは、Ｃａｍ−００３コンジュゲートと比較してより大きいコンジュゲーション効率を示した。精製調製物中の遊離ＰＭＢにより汚染は、無視可能であることが測定された。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１細胞へのＰＭＢ−Ｃａｍ−００３およびＰＭＢ−Ａ７コンジュゲートの結合は、ＦＡＣＳにより評価した。Ｒ３４７を全ての実験において陰性対照として使用した。試料を実施例１に既に記載のとおり染色および分析した。未コンジュゲートまたはモックコンジュゲートＣａｍ−００３と比較したＣａｍ−００３コンジュゲートの結合の有意差は、観察されなかった（図１４Ａ）。Ａ７対照コンジュゲートの結合は、コンジュゲート当たりのＰＭＢ分子の数に比例した（図１４Ｂ）。この分析は、Ｃａｍ−００３へのＰＭＢのコンジュゲーションが全細胞結合に顕著には影響しないことおよびコンジュゲートＰＭＢがおそらくＬＰＳに結合することにより細胞への直接結合を媒介し得ることを示す。

【0288】

実施例１１
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＯＰＫを促進するＰＭＢ−ｍＡｂコンジュゲートの評価
本実施例は、ＰＭＢ−ｍＡｂコンジュゲートの緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＯＰＫを促進する能力を評価する２つの実験系列を記載する。第１の実験（図１５Ａ〜Ｂ）において、ウサギ補体の存在下でのヒトＨＬ−６０好中球細胞系によるコンジュゲート媒介ＯＰＫ活性を、実施例２に記載のとおり細菌ルシフェラーゼを発現する緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株を使用して評価した。Ｒ３４７をこれらの実験において陰性対照として使用した。ＣＡＭ−００３コンジュゲートは強力なＯＰＫ活性を保持したが、それはコンジュゲート当たりのＰＭＢの数に増加に伴い縮小した（ＳＭ＞ＤＭ１＞ＤＭ２）（図１５Ａ）。ＣＡＭ−００３コンジュゲートは、Ｐｓｌ標的を発現しないΔｐｓｌＡ緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株に対するＯＰＫ活性を示さず、このことは、ｍＡｂ媒介結合が殺傷に要求されたことを示す（図１５Ｂ）。第２の実験系列において、ｍＡｂを欠く対照と比べて２時間のインキュベーション後の発光の低減を使用して殺傷％を測定した。図１８Ａは、ＣＡＭ−００３コンジュゲートがＯＰＫ活性を保持したが、それは特にＤＭおよびＴＭ構築物においてコンジュゲート当たりのＰＭＢの数の増加に伴い縮小したことを示す（ＷＴ＞ＳＭ＞ＤＭ＞ＴＭ）。ＣＡＭ−００３コンジュゲートは、Ｐｓｌ標的を発現しないＰＡＯ！ΔｐｓｌＡ株に対するＯＰＫ活性を示さなかった（図示せず）。図１８Ｂは、Ａ７−ＰＭＢコンジュゲートがＯＰＫを媒介しなかったことを示し、このことは、ｍＡｂ媒介結合が殺傷に要求されたことを示す。

【0289】

実施例１２
ＰＭＢ−ｍＡｂコンジュゲートによる緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＬＰＳの中和
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｏ１０ＬＰＳ活性の中和を、ＰＭＢ−ｍＡｂコンジュゲートまたはＰＭＢ単独をＬＰＳと１時間プレインキュベートし、次いでネズミＲＡＷ２６４．７マクロファージを刺激し、ＴＮＦ分泌を定量することにより評価した。ＬＰＳの最終濃度は２ｎｇ／ｍｌであった。ＴＮＦは、ＦＡＣＳベースＢＤ（商標）サイトメトリックビーズアレイ（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ）（ＣＢＡ）法（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により刺激６時間後に定量した。ＬＰＳ中和は、ＬＰＳ最大応答に対するＴＮＦ産生の減少により計測した。モックコンジュゲート野生型Ｃａｍ−００３ではなく、ＰＭＢ−Ｃａｍ−００３コンジュゲートがＬＰＳ中和を示した。中和の効率は、コンジュゲート中のＰＭＢの平均数に正比例した（ＤＭ２＞ＤＭ１＞ＳＭ）（図１６Ａ）。モックコンジュゲート野生型Ａ７ではなく、ＰＭＢ−Ａ７コンジュゲートがＬＰＳ中和を示した（図１６Ｂ）。Ａ７コンジュゲートは、ＣＡＭ−００３コンジュゲートよりも良好な中和を示した。Ａ７コンジュゲートは、おそらくそれらの分子により達成されるコンジュゲーション効率がより大きいことに起因してＣＡＭ−００３コンジュゲートよりも良好な中和を示した。約２つのコンジュゲートＰＭＢ分子／ｍＡｂが、遊離ＰＭＢ分子により中和されるＬＰＳの量を中和するために要求される。

【0290】

実施例１３
ネズミモデルにおけるＣａｍ−００３−ＰＭＢ部位特異的コンジュゲートの評価
Ｃａｍ−００３−ＰＭＢコンジュゲートの効力を、２つのネズミモデルのタイプにおいて評価した：１）内毒素血症（ＬＰＳ）チャレンジモデル、コンジュゲートのＬＰＳをインビボで中和および／または解毒する能力を決定するため；および２）緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）敗血症モデル、Ｃａｍ−００３−ＰＭＢコンジュゲートが、抗体媒介細菌クリアランスに加え、ＰＭＢ媒介ＬＰＳ中和および／またはクリアランスを介して抗体単独と比べて細菌チャレンジに対する改善された保護をもたらすかどうかを評価するため。他の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）チャレンジモデルを使用してＣａｍ−００３−ＰＭＢコンジュゲートの効力を試験することもできる（以下参照）。

【0291】

Ａ．内毒素血症モデル
ＰＭＢは、インビボでＬＰＳに結合し、それを中和し、ＬＰＳチャレンジに対する保護を媒介し得ることが十分確立されている（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ＤＣ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３（１０）：８１３−８１８（１９７６），Ｄｒａｂｉｃｋ，ＪＪ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２（３）：５８３−５８８（１９９８））。内毒素血症モデルにおいて、Ｃａｍ−００３−ＰＭＢコンジュゲートは、それらのＬＰＳチャレンジから動物を保護する能力について評価する。グラム陰性細菌、例として、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製されたＬＰＳを使用して確立された最小致死量（ＬＤ１００）においてマウスをチャレンジする。マウスが比較的ＬＰＳに耐性を示す場合、Ｄ−ガラクトサミンを同時投与することもできる。それというのも、それはＬＰＳに対するマウスの感受性をほぼヒトの感受性まで大幅に増加させるためである（Ｇａｌａｎｏｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．７６（１１）：５９３９−５９４３（１９７９））。そのようなモデルは、ＬＰＳ中和分子、例として、抗体およびポリミキシン−タンパク質コンジュゲートの前臨床効力評価に広く使用されている（Ｂａｉｌａｔ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．６５（２）：８１１−８１４ （１９９７），Ｂｉｒｋｅｎｍｅｉｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．３１８（２）：７６２−７７１（２００６），Ｄｒａｂｉｃｋ，ＪＪ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２（３）：５８３−５８８（１９９８））。Ｃａｍ−００３−ＰＭＢコンジュゲート、対照コンジュゲートおよび未コンジュゲートＣａｍ−００３は、治療または防止的に投与することができ、それらのＬＰＳチャレンジから動物を保護する能力を評価することができる。ＰＭＢコンジュゲートにより媒介される保護の程度は、血清または血漿中で計測される炎症促進サイトカインおよびケモカイン、例として、ＴＮＦ、ＫＣおよびＩＬ−６のレベルと相関させることができる。

【0292】

Ｂ．緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）チャレンジモデル
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染のいくつかのネズミモデルを使用してＣａｍ−００３−ＰＭＢコンジュゲートの保護を媒介する能力を評価することができる。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、マウスに決定されたＬＤ１００用量において腹腔内投与（敗血症モデル）、静脈内投与（菌血症モデル）または鼻腔内投与（肺炎モデル）することができる。これらのモデルは、受動または活性ワクチンの前臨床効力試験に既に使用されている（Ｆｒａｎｋ，ＤＷ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．１８６（１）：６４−７３．（２００２），Ｓｅｃｈｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．６６（５）：１１００−１１０９（２０１１），Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３（３）：１６９−１７５（１９９５），Ｄｕｎｎ，ＤＬ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ ９６（２）：４４０−４４６（１９８４））。

【0293】

内毒素血症モデルと同様に、マウスの固有のＬＰＳ毒性耐性を取り除き、ＰＭＢコンジュゲートのインビボ効力に対するＬＰＳ中和および／またはクリアランスの寄与を評価することができるようにするため、細菌チャレンジ前にマウスをＤ−ガラクトサミンにより感作することが必要なこともある。Ｄ−ガラクトサミンは、おそらく感染の間に減少したＬＰＳに対する感受性を増加させることによりグラム陰性細菌のＬＤ１００を低減させることが実証されている（Ｂｕｃｋｌｉｎ，ＳＥ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．１７２（６）：１５１９−２７（１９９５））。

【0294】

Ｃａｍ−００３−ＰＭＢコンジュゲート、対照コンジュゲートおよび未コンジュゲートＣａｍ−００３は、治療または防止的に投与することができる。コンジュゲートＰＭＢ部分を介して細菌ＬＰＳを中和および／またはクリアランスすることによりＣＡＭ−００３コンジュゲートのＣａｍ−００３単独と比べて増加した保護をもたらす能力を、生存率試験において決定することができる。媒介される細菌クリアランスにおけるＣａｍ−００３−ＰＭＢコンジュゲートの効力は、感染後に血清および臓器、例として、脾臓、腎臓および肺中の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細菌を定量することにより評価することもできる。血清または血漿ＬＰＳレベルを定量してＣａｍ−００３−ＰＭＢコンジュゲートによる細菌クリアランスおよびＬＰＳクリアランスおよび／または中和の程度を評価し、それを未コンジュゲートＣａｍ−００３および対照抗体−ＰＭＢコンジュゲートと比較することもできる。

【0295】

Ｃ．内毒素血症モデルデータ
特に、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（１群当たり１０匹）にｍＡｂまたはＰＭＢ−ｍＡｂコンジュゲートを腹腔内投与して６時間後に緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１０ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）およびＤ−ガラクトサミンによりチャレンジした。ＰＭＢ対照は、腹腔内投与して２時間後に０．２ｍｇ／ｋｇにおいてチャレンジし、典型的には８０〜１００％の保護を提供する。対照マウスに未コンジュゲートＣＡＭ−００３を投与し、全て１８時間以内に死亡した。図１９ＡおよびＢは、４５ｍｇ／ｋｇにおいてＣＡＭ−００３およびＡ７のＤＭおよびＴＭコンジュゲートが９０〜１００％の保護を提供した一方、ＳＭコンジュゲートは保護的でなかったことを示す。

【0296】

ＴＭコンジュゲートは、４５、１５および５ｍｇ／ｋｇにおいて投与した。図２０ＡおよびＢに示されるとおり、保護活性の損失は、５ｍｇ／ｋｇにおいて８０％の保護を保持したＡ７−ＴＭ−ＰＭＢよりもＣＡＭ−００３−ＴＭ−ＰＭＢについて急激であった。これらの差は、インビトロで既に見られたとおり、ｍＡｂのユニーク構造特徴がコンジュゲートＰＭＢのＬＰＳ中和活性に影響し得ることを示唆する。

【0297】

Ｄ．敗血症モデルデータ
Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（１群当たり１０匹）に、ｍＡｂまたはＰＭＢ−ｍＡｂコンジュゲートを腹腔内投与（１０、１および０．１ｍｇ／ｋｇ）して６時間後にＬＤ_{８０−１００}用量の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）株６２９４（４Ｅ７ＣＦＵ）により腹腔内チャレンジした。２つの試験からのデータをこの分析において組み合わせた。生存率を７２時間にわたりモニタリングした。２つの試験の組み合わせたデータを図２１Ａ〜Ｃに示す：Ａ７または緩衝液を投与したほとんどの対照マウスが２４時間までに死亡した。未コンジュゲートＣＡＭ−００３は、５０〜９０％の保護を示した。保護活性は、用量と逆相関することが明らかになった。ＣＡＭ−００３−ＰＭＢコンジュゲートは、１０ｍｇ／ｋｇの高用量において未コンジュゲートｍＡｂよりも良好な保護を付与し、このことは、感染の間に減少したＬＰＳの中和が生存に寄与したことを示唆する。Ａ７−ＤＭ−ＰＭＢ対照コンジュゲートは、１０ｍｇ／ｋｇにおいて５０％の保護活性を示し、このことは、ＬＰＳ中和が生存利益を提供し得ることを示唆する。逆に、コンジュゲートは、０．１ｍｇ／ｋｇの低用量においてＣＡＭ−００３よりも保護的でなく、保護活性はコンジュゲートのインビトロＯＰＫ活性と相関した（ＷＴ＞ＳＭ＞ＤＭ＞ＴＭ）。まとめると、結果は、コンジュゲートＰＭＢがＬＰＳの中和を媒介することによりオプソニン抗体に追加保護活性を付与し、その細菌クリアランス機能を補完し得ることを示す。

【0298】

エンジニアリングＦｃシステイン残基へのＰＭＢの高いコンジュゲート効率は、ＳＭ−ＰＥＧ１２ヘテロ二官能性リンカーを使用して達成された。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｐｓｌエキソ多糖を標的化する強力なオプソニンおよび保護ｍＡｂのＣＡＭ−００３の一連の部位特異的ＰＭＢコンジュゲートをインビトロおよびインビボで評価した。ＣＡＭ−００３−ＰＭＢコンジュゲートは、インビトロＯＰＫ活性を保持した。しかしながら、ＯＰＫ活性は、ｍＡｂ当たりのＰＭＢの平均数の増加により影響を受けた。ＤＭおよびＴＭ ＰＭＢ−ｍＡｂコンジュゲートは、マウス緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）内毒素血症モデルにおける保護を付与し、このことは、ＰＭＢのＬＰＳ中和機能がｍＡｂに対して付与されたことを実証する。ＣＡＭ−００３−ＰＭＢコンジュゲートは、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）敗血症モデルにおいて高用量（１０ｍｇ／ｋｇ）において未コンジュゲートＣＡＭ−００３ｍＡｂよりも大きい保護活性、および低用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）において低減された活性を示した。これらのデータは、コンジュゲートＰＭＢがオプソニンＣＡＭ−００３ｍＡｂにより媒介される細菌クリアランスを補完し、ＬＰＳ中和による保護を改善し得ることを示唆する。敗血症モデルにおけるＣＡＭ−００３−ＰＭＢコンジュゲートによる保護活性の改善は、低用量において損失し、コンジュゲートＰＭＢのレベルが低すぎてＬＰＳを中和することができず、主要な保護方式はｍＡｂ媒介細菌クリアランスである可能性が高い。低用量におけるＣＡＭ−００３−ＰＭＢコンジュゲートの保護活性の損失は、ＰＭＢコンジュゲーションの結果としてのインビトロＯＰＫ活性の低減と一致する。これらの試験は、オプソニンｍＡｂ上のコンジュゲートＰＭＢがＬＰＳ中和活性を付与し、全身性緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染モデルにおける保護活性の増加をもたらし得ることを示す。ＯＰＫ活性への悪影響を低減させるためのコンジュゲーション部位の最適化は、未コンジュゲートオプソニンｍＡｂと比べてＰＭＢコンジュゲートの保護活性をさらに改善し得る。

【0299】

本開示は、記載された具体的な実施形態により範囲を限定するものではなく、それは本開示の個々の態様の単一の説明として意図されるものであり、機能的に均等であるあらゆる組成物または方法が本開示の範囲内である。実際には、本明細書に示され、記載されたものに加えた本開示の種々の改変形態が、上記詳細な説明および添付の図面から当業者に明らかである。そのような改変形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内であるものとする。

【0300】

本明細書に挙げられた全ての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が個別具体的に参照により取り込まれることを示されるかのごとく同程度に参照により本明細書に組み込まれる。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図3-5】

【図3-6】

【図3-7】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図5-4】

【図5-5】

【図5-6】

【図5-7】

【図5-8】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図10A】

【図10B】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図11-4】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]