特許 6059546 糖化タンパク質測定用試薬組成物及び糖化タンパク質測定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6059546

(24)【登録日】2016年12月16日

(45)【発行日】2017年1月11日

(54)【発明の名称】糖化タンパク質測定用試薬組成物及び糖化タンパク質測定方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/26 20060101AFI20161226BHJP

   C12Q 1/37 20060101ALI20161226BHJP

   C12Q 1/28 20060101ALI20161226BHJP

   G01N 21/77 20060101ALI20161226BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/26

   C12Q1/37

   C12Q1/28

   G01N21/77 B

【請求項の数】12

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2013-24571(P2013-24571)

(22)【出願日】2013年2月12日

(65)【公開番号】特開2014-150772(P2014-150772A)

(43)【公開日】2014年8月25日

【審査請求日】2015年8月18日

(73)【特許権者】

【識別番号】000141897

【氏名又は名称】アークレイ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000040

【氏名又は名称】特許業務法人池内・佐藤アンドパートナーズ

(72)【発明者】

【氏名】石川 一輝

(72)【発明者】

【氏名】稲村 範郎

【審査官】 北村 悠美子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００８−２０１９６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／０９３７２２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／１１６５７５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００９−１５９９８９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００−１／７０

Ｇ０１Ｎ ２１／７５−２１／８３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

糖化タンパク質測定用試薬キットであって、
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）、水、タール色素、及び多価アルコールを含む第一試薬と、
プロテアーゼを含む第二試薬とを含む、糖化タンパク質測定用試薬キット。

【請求項2】

タール色素が、アゾ色素である、請求項１記載の糖化タンパク質測定用試薬キット。

【請求項3】

アゾ色素がタートラジンである、請求項２記載の糖化タンパク質測定用試薬キット。

【請求項4】

多価アルコールの分子内ヒドロキシル基数が２個である、請求項１から３のいずれかに記載の糖化タンパク質測定用試薬キット。

【請求項5】

多価アルコールが、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１から４のいずれかに記載の糖化タンパク質測定用試薬キット。

【請求項6】

試薬組成物中の多価アルコールの含有量が、０．５重量％以上１０重量％以下である、請求項１から５のいずれかに記載の糖化タンパク質測定用試薬キット。

【請求項7】

糖化タンパク質測定自動分析装置で用いるための、請求項１から６のいずれかに記載の糖化タンパク質測定用試薬キット。

【請求項8】

前記第二試薬は、さらに、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）及び発色剤の少なくとも一方を含む、請求項１から７のいずれかに記載の糖化タンパク質測定用試薬キット。

【請求項9】

さらに、標準試料を含む、請求項１から８のいずれかに記載の糖化タンパク質測定用試薬キット。

【請求項10】

フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）、水、及びタートラジンを含む糖化タンパク質測定用試薬組成物の析出防止剤として多価アルコールの使用。

【請求項11】

前記糖化タンパク質測定用試薬組成物が、プロテアーゼをさらに含む、請求項１０記載の利用

【請求項12】

下記工程（１）〜（４）を行うことを含む、糖化タンパク質の測定方法。
工程（１）：フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）、水、タール色素、及び多価アルコールを含む第一試薬と、測定対象試料とを混合する工程。
工程（２）：第一試薬と測定対象試料とを混合した混合液に、さらに、プロテアーゼ、及び発色剤を含む第二試薬を混合する工程。
工程（３）：工程（１）の混合液を光学測定するか、或いは、工程（２）の混合後速やかに混合液を光学測定する工程。
工程（４）：工程（２）の混合液を一定時間後に光学測定する工程。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、糖化タンパク質測定用試薬組成物、糖化タンパク質測定用試薬キット、及び、糖化タンパク質の測定方法に関する。

【背景技術】

【0002】

アゾ色素は、フェノチアジン誘導体色素の吸収スペクトルをシフトさせるシフト剤、及び発色剤などの光により分解する化合物に対する保護剤として使用されることがある。引用文献１は、フェノチアジン誘導体色素を用いて糖化タンパク質（ＨｂＡ１ｃ）を測定する方法を開示するが、この中で、アゾ色素であるタートラジンを使用してフェノチアジン誘導体色素の吸収スペクトルを長波長側にシフトさせることを開示する。

【0003】

糖化タンパク質やＨｂＡ１ｃの酵素法による測定は、自動分析装置で行われることが多い。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】WO2008-093722号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

酵素法で糖化タンパク質等の測定を行う自動分析装置は、一般に、複数の反応セルを備え、これらの反応セル内で反応を行い、光学的測定を行う。したがって、反応セルが汚れた場合には反応セルの洗浄や交換といったメンテナンスの手間や費用が必要となる。

【0006】

しかしながら、糖化タンパク質測定の試薬には、自動分析装置の反応セル上面で析出物が生じるものがあり、この析出物による反応セルの汚れが自動分析装置のメンテナンスの回数や費用の増加をもたらすという問題点が見出された。

【0007】

そこで、本開示は、一態様において、自動分析装置の反応セル上面での析出物の発生を抑制できる糖化タンパク質の測定に用いる試薬組成物を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本開示は、一態様において、糖化タンパク質測定用試薬組成物であって、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）又はプロテアーゼ、水、タール色素、及び多価アルコールを含む試薬組成物に関する。

【0009】

本開示は、その他の態様において、糖化タンパク質測定用試薬キットであって、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）又はプロテアーゼ、水、タール色素、及び多価アルコールを含む試薬組成物である第一試薬と、水を含む第二試薬を含む糖化タンパク質測定用試薬キットに関する。ここで、第二試薬は、さらに、第一試薬がＦＡＯＤを含む場合プロテアーゼを含み、第一試薬がプロテアーゼを含む場合ＦＡＯＤを含む。

【0010】

本開示は、その他の態様において、下記工程（１）〜（４）を行うことを含む糖化タンパク質の測定方法に関する。
工程（１）：フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）又はプロテアーゼ、水、タール色素、及び多価アルコールを含む試薬組成物である第一試薬と、測定対象試料とを混合する工程。
工程（２）：第一試薬と測定対象試料とを混合した混合液に、さらに、水を含む第二試薬を混合する工程。ここで、第二試薬は、さらに、第一試薬がＦＡＯＤを含む場合プロテアーゼを含み、第一試薬がプロテアーゼを含む場合ＦＡＯＤを含み、第一試薬と第二試薬の一方が発色剤を含む。
工程（３）：工程（１）の混合液を光学測定するか、或いは、工程（２）の混合後速やかに混合液を光学測定する工程。
工程（４）：工程（２）の混合液を一定時間後に光学測定する工程。

【発明の効果】

【0011】

本開示によれば、一態様において、自動分析装置の反応セル上面での析出物の発生を抑制できる糖化タンパク質測定用試薬組成物、糖化タンパク質測定用試薬キット、又は、糖化タンパク質測定方法を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】図１は、自動分析装置の反応セルにおける析出物の発生の有無を確認した結果の写真の一例である。

【図2】図２は、実施例１〜１０の反応試薬組成物を用いて様々な濃度のＨｂＡ１ｃ試料を測定した場合のＨｂＡ１ｃ（ＪＤＳ）値と、比較例１を用いた場合のＨｂＡ１ｃ（ＪＤＳ）値との差（ΔＪＤＳ％）を示すグラフの一例である。

【図3】図３は、実施例１〜１０及び比較例１の反応試薬組成物を用いてＨｂ濃度が中濃度（９０μmol/L）の試料を測定した場合のＨｂＡ１ｃ（ＪＤＳ）値と、低又は高濃度の試料を測定した場合のＨｂＡ１ｃ（ＪＤＳ）値との差を示すグラフの一例である

【図4】図４は、３７℃７日間保存の前（初期）と後（３７℃７日）の比較例１及び２の試薬組成物を用いてＨｂＡ１ｃ濃度の測定したときの反応タイムコースの吸光度測定（波長７００ｎｍ）の結果の一例を示す。

【図5】図５は、３７℃７日間保存の前（初期）と後（３７℃７日）の実施例１１及び１２の試薬組成物を用いてＨｂＡ１ｃ濃度の測定したときの反応タイムコースの吸光度測定（波長７００ｎｍ）の結果の一例を示す。

【図6】図６は、３７℃７日間保存の前（初期）と後（３７℃７日）の実施例１３及び１４の試薬組成物を用いてＨｂＡ１ｃ濃度の測定したときの反応タイムコースの吸光度測定（波長７００ｎｍ）の結果の一例を示す。

【図7】図７は、３７℃７日間保存の前（初期）と後（３７℃７日）の実施例１５〜１７の試薬組成物を用いてＨｂＡ１ｃ濃度の測定したときの反応タイムコースの吸光度測定（波長７００ｎｍ）の結果の一例を示す。

【図8】図８は、３７℃７日間保存の前（初期）と後（３７℃７日）の実施例１８の試薬組成物を用いてＨｂＡ１ｃ濃度の測定したときの反応タイムコースの吸光度測定（波長７００ｎｍ）の結果の一例を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本開示は、一態様において、タール色素を用いる酵素反応系で糖化タンパク質を測定する自動分析装置において、自動分析装置の反応セル上面で析出物が生じてセルが汚染される場合がある、という課題を見出したことに基づく。

【0014】

前記析出物の詳細な組成はまだ明らかではないが、前記析出物には少なくとも前記試薬中の色素が含まれる。本開示は、一態様において、前記析出物が、前記試薬に多価アルコールを含有させることで抑制できるという知見に基づく。したがって、本開示は、一態様において、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）又はプロテアーゼ、水、タール色素、及び多価アルコールを含む試薬組成物に関する（以下、「本開示の試薬組成物」ともいう）。本開示の試薬組成物は、一又は複数の実施形態において、ＦＡＯＤとプロテアーゼの２成分を同時に含有しない。

【0015】

［多価アルコール］
本開示の試薬組成物は、析出物の発生を抑制する観点から、多価アルコールを含有する。同様の観点から、多価アルコールとしては、分子内ヒドロキシル基の数が２〜４であるものが好ましく、２〜３がより好ましく、２がさらに好ましい。多価アルコールは、限定されない一又は複数の実施形態において、グリセリン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール＃２００、ポリエチレングリコール＃３００、ポリエチレングリコール＃４００、ポリエチレングリコール＃６００、又はこれらの組み合わせが挙げられる。

【0016】

また、測定対象試料中のヘモグロビン濃度の影響を受けにくいという観点から、多価アルコールとして、平均重量分子量が２００未満のものが好ましく、より好ましくは１９０以下、さらに好ましくは、１５０以下である。多価アルコールの分子量の下限は特に限定されないが、例えば、５０以上である。したがって、析出物の発生を抑制する観点、及び、測定対象試料中のヘモグロビン濃度の影響を受けにくいという観点から、多価アルコールは、限定されない一又は複数の実施形態において、グリセリン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、又はこれらの組み合わせが挙げられる。

【0017】

さらに、多価アルコールの添加の有無で測定結果が大きく変動すると測定精度が低下する恐れがある。よって、多価アルコールの添加が測定結果に与える測定値の変化は、抑制されることは好ましい。測定値に与える多価アルコールの影響を抑制する観点、及び、析出物の発生を抑制する観点から、多価アルコールは、限定されない一又は複数の実施形態において、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール＃２００、ポリエチレングリコール＃４００、ポリエチレングリコール＃６００又はこれらの組み合わせが挙げられる。

【0018】

よって、析出物の発生を抑制する観点、測定対象試料中のヘモグロビン濃度の影響を受けにくいという観点、及び、測定値に与える多価アルコールの影響を抑制する観点から、多価アルコールは、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、又はこれらの組み合わせが挙げられる。

【0019】

さらにまた、本開示の試薬組成物に含まれるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）が耐熱安定性を有する場合、その耐熱安定性を大きく阻害しないことが好ましい。析出物の発生を抑制する観点、測定対象試料中のヘモグロビン濃度の影響を受けにくいという観点、測定値に与える多価アルコールの影響を抑制する観点、及び、ＦＡＯＤの耐熱安定性の維持の観点から、多価アルコールは、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、又はこれらの組み合わせが挙げられる。

【0020】

本開示の試薬組成物における多価アルコールの含有量は、限定されない一又は複数の実施形態において、析出物の発生を抑制する観点から、０．１重量％以上が好ましく、より好ましくは０．５重量％以上、さらに好ましくは０．８重量％以上、さらにより好ましくは０．９重量％以上である。本開示の試薬組成物における多価アルコールの含有量は、限定されない一又は複数の実施形態において、測定値に与える多価アルコールの影響を抑制する観点から、１０重量％以下、７重量％以下、５重量％以下、又は４重量％以下である。

【0021】

［タール色素］
本開示の試薬組成物は、タール色素を含有する。糖化タンパク質測定試薬において、タール色素は一般にフェノチアジン誘導体色素の吸収スペクトルのシフト剤、及び発色剤などの光により分解する化合物に対する保護剤として使用することを目的として含有されることがある（特許文献１）。しかしながら、本開示において、タール色素を含有する目的はこれに限定されない。

【0022】

タール色素を用いる酵素反応系で糖化タンパク質を測定する自動分析装置の反応セル上面で生み出す析出物には、少なくともタール色素が含まれる。ただし、前記析出物の詳細な組成は未だ明らかではない。

【0023】

本開示の試薬組成物に使用されるタール色素としては、限定されない一又は複数の実施形態において、アゾ色素である。アゾ色素としては、限定されない一又は複数の実施形態において、下記式（Ｉ）で表される化合物が挙げられる。
Ｒ¹−Ｎ＝Ｎ−Ｒ² （Ｉ）
前記式（Ｉ）において、Ｒ¹は、

【化1】

Ｒ²は、

【化2】

Ｒ¹及びＲ²において、
Ｘは、水素、ハロゲン、ナトリウム又はカリウムであり、
Ｙは、水素又はＳＯ₃Ｘであり、
各Ｘは同一でも異なっていても良く、各Ｙは同一でも異なっていてもよく、
Ｚは、水素、メチル基又はメトキシ基であり、各Ｚは同一でも異なっていてもよい。

【0024】

前記式（Ｉ）で表されるアゾ色素物質の限定されない一又は複数の実施形態として、５−ヒドロキシ−１−（４−スルホフェニル）−４−（４−スルホフェニルアゾ）ピラゾール−３−カルボン酸又はその塩（例えば、三ナトリウム塩）、６−ヒドロキシ−５−（４−スルホフェニルアゾ）−２−ナフタレンスルホン酸又はその塩（例えば、二ナトリウム塩）、３−ヒドロキシ−４−（４−スルホナフチルアゾ）−２，７−ナフタレンジスルホン酸（「３−ヒドロキシ−４−［（スルホナトナフタレン−１−イル）ジアゼニル］ナフタレン−２，７−ジスルホン酸」ともいう）又はその塩（例えば、三ナトリウム塩）、７−ヒドロキシ−８−（４−スルホナフチルアゾ）−１，３−ナフタレンジスルホン酸もしくはその塩（例えば、三ナトリウム塩）又は水和物（例えば、１１／２水和物）等が挙げられる。これらの塩や水和物としては、例えば、市販品であるタートラジン（黄色４号）、黄色５号、赤色２号、赤色４０号、赤色１０２号等が挙げられる。これらの色素物質は、食用であってもよいし、非食用であってもよい。

【0025】

本開示の試薬組成物に含まれるタール色素は、一種類であってもよく二種類以上であってもよい。本開示の試薬組成物におけるタール色素の含有量は、限定されない一又は複数の実施形態において、反応系に含まれるフェノチアジン誘導体色素１モルに対して、１〜１０００モル、２〜２００モル、又は、４〜１００モルである。また、本開示の試薬組成物におけるタール色素の含有量は、限定されない一又は複数の実施形態において、反応液に添加する発色剤の量に応じて決定でき、発色剤１モルに対して、０．１〜１０００モル、１〜５００モル、又は４〜３００モルである。また、反応系におけるタール色素の最終濃度は、限定されない一又は複数の実施形態において、１×１０^-7〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、２×１０^-7〜０．０５ｍｏｌ／Ｌ、又は、５×１０^-7〜０．０３ｍｏｌ／Ｌである。

【0026】

［ＦＡＯＤ］
本開示の試薬組成物に含まれうるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）は、糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを酸化的加水分解する酵素をいい、糖化タンパク質の検出に従来使用され或いは今後開発され使用されるものを含む。ＦＡＯＤの基質としては、限定されない一又は複数の実施形態において、フルクトシルバリン、フルクトシルリジン、及び／又はフルクトシルバリルヒスチジンが挙げられる。ＦＡＯＤとしては、限定されない一又は複数の実施形態において、商品名ＦＰＯＸ-ＣＥ（キッコーマン社製）、耐熱性が付与された商品名ＦＰＯＸ-ＣＥＴ（キッコーマン社製）、商品名ＦＰＯＸ−ＥＥ（キッコーマン社製）、商品名ＦＯＤ（旭化成社製）等が挙げられる。

【0027】

本開示の試薬組成物におけるＦＡＯＤの含有量は、限定されない一又は複数の実施形態において、０．１〜１０．０Ｕ／ｍｌ、０．２〜８．０Ｕ／ｍｌ、０．５〜５．０Ｕ／ｍｌ、０．６〜３．０Ｕ／ｍｌである。本開示において、ＦＡＯＤの酵素単位「Ｕ」は、フルクトシルバリンを基質として１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成する量を１Ｕとする。

【0028】

［プロテアーゼ］
本開示の試薬組成物に含まれうるプロテアーゼとしては、測定対象試料中のヘモグロビン（及び糖化ヘモグロビン）のβ鎖Ｎ末端バリンや、前記Ｎ末端バリンを含むペプチド（β鎖Ｎ末端ペプチド）を切り出すことができるものであって、糖化タンパク質の検出に従来使用され或いは今後開発され使用されるものを含む。

【0029】

前記プロテアーゼとしては、限定されない一又は複数の実施形態において、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来プロテアーゼ等が使用できる。前記プロテアーゼは、限定されない一又は複数の実施形態において、測定感度及び精度を向上する観点から、好ましくはエンドプロテアーゼである。限定されない一又は複数の実施形態において、市販品として、メタロプロテアーゼ（商品名、アークレイ社製）、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ（商品名、天野エンザイム社製）、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ（商品名、天野エンザイム社製）、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ（商品名、天野エンザイム社製）、ペプチダーゼＲ（商品名、天野エンザイム社製）、パパインＭ−４０（商品名、天野エンザイム社製）、プロテアーゼＮ（商品名、フルカ社製）、プロテアーゼＮ「アマノ」（商品名、天野製薬社製）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来メタロプロテイナーゼ（商品名、トヨチーム東洋紡社製）等が挙げられる。

【0030】

前記プロテアーゼとしては、限定されない一又は複数の実施形態において、測定感度及び精度を向上する観点から、β鎖Ｎ末端に特異的に作用してＮ末端ペプチドの切断を触媒するプロテアーゼ（例えば、特開２０００−３００２９４号公報、特開２００４−３４４０５２号公報等）が好ましい。また、β鎖Ｎ末端バリンの切断を触媒するプロテアーゼとしては、例えば、国際公開第２０００／５０５７９号パンフレット（日本国特許３６６８８０１）、国際公開第２０００／６１７３２号パンフレット、特開２００２−３１５６００号公報等に開示されているプロテアーゼが挙げられる。

【0031】

本開示の試薬組成物におけるプロテアーゼの含有量は、限定されない一又は複数の実施形態において、５００〜８０００Ｕ／ｍｌ、６００〜７０００Ｕ／ｍｌ、７００〜５０００Ｕ／ｍｌ、８００〜４０００Ｕ／ｍｌである。本開示において、プロテアーゼの活性「Ｕ」は、１分間に１マイクロモルのチロシンに相当する２７５ｎｍの吸光度の増加を与える酵素量を１Ｕとする。

【0032】

［水］
本開示の試薬組成物は、水溶液であり、水を含む。水は、蒸留水、イオン交換水、又は超純水等が使用され得る。

【0033】

［その他の成分］
本開示の試薬組成物は、その他の成分として、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）又は発色剤を含有しうる。本開示の試薬組成物は、一又は複数の実施形態において、ＰＯＤと発色剤の２成分を同時に含有しない。したがって、本開示の試薬組成物は、限定されない一又は複数の実施形態において、水、タール色素、及び多価アルコールに加えて下記表１の組み合わせの成分を含む実施形態１〜４が挙げられる。

【表1】

【0034】

本開示の試薬組成物は、一又は複数の実施形態において、さらに、亜硝酸又はその塩、緩衝液又は緩衝剤、及び界面活性剤の１つ以上を含有しうる。また、本開示の試薬組成物が発色剤を含む場合、さらに発色剤安定化剤を含有しうる。

【0035】

［ＰＯＤ］
本開示の試薬組成物に含まれうるペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）は、ＦＡＯＤが反応することで生成された過酸化水素を基質として分解するとともに発色剤を酸化することで過酸化水素の測定を可能とするものが使用でき、糖化タンパク質の検出に従来使用され或いは今後開発され使用されるものを含む。

【0036】

本開示の試薬組成物におけるＰＯＤの含有量は、限定されない一又は複数の実施形態において、０．５〜１００Ｕ／ｍｌ、１．０〜８０Ｕ／ｍｌ、２．０〜５０Ｕ／ｍｌ、又は３．０〜２０Ｕ／ｍｌである。本開示において、ＰＯＤの活性「Ｕ」は、２０秒間に１ミリグラムのプルプロガリンを生成できる量を１プルプロガリンＵとする。

【0037】

［発色剤］
本開示の試薬組成物に含まれうる発色剤としては、反応系の過酸化水素とＰＯＤとの反応に応じて発色、変色、消失するものであって、糖化タンパク質の検出に従来使用され或いは今後開発され使用されるものを含む。発色剤は、１つの化合物であってもよく、二種類以上の化合物の組み合わせであってもよい。本開示の試薬組成物における発色剤は、限定されない一又は複数の実施形態において、フェノチアジン骨格を有する酸化発色剤、酸化還元反応によりフェノチアジン誘導体色素を生成する発色剤、又は、フェノチアジン誘導体色素が挙げられる。

【0038】

フェノチアジン誘導体色素は、限定されない一又は複数の実施形態において、下記化学式で表されるメチレンブルー、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、トルイジンブルーＯ、１，９−ジメチル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩、メチレングリーン等が挙げられる。

【化3】

【0039】

酸化還元反応によりフェノチアジン誘導体色素を生成する発色剤は、限定されない一又は複数の実施形態において、酸化又は還元によってフェノチアジン誘導体色素を遊離（脱離
）する発色剤（化合物）が挙げられる。

【0040】

酸化によりフェノチアジン誘導体色素であるメチレンブルーを遊離する発色剤（化合物）としては、限定されない一又は複数の実施形態において、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩（例えば、商品名ＤＡ−６７、和光純薬社製）、１０−（アセチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩、特公平４−２７８３９号記載の１０−（フェニルカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン又はその塩等が挙げられる。また、特公昭６０−３３４７９号記載の化合物Ｎｏ．II−４〜９、II−１０である、１０−（３−（メチルカルボキシアミノ）−ヘキサメチル−アミノ）−フェノチアジン、１０−（３−（メチルカルボキシアミノ）−４−メチル−フェニル）−アミノ）−フェノチアジン、１０−（（３−（メチルカルボキシアミノメチル）−フェニル）−メチルアミノ）−フェノチアジン、１０−（１−ナフタレンアミノ）−フェノチアジン、１０−（メチル）−フェノチアジン、１０−（フェニルアミノ）−フェノチアジン、１０−（メチルアミノ）−フェノチアジンや、これらの塩も挙げられる。中でも、水溶性が高いという観点から、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩が好ましい。

【0041】

また、フェノチアジン誘導体色素であるメチレンブルーを生成する発色剤としては、この他に、例えば、ロイコメチレンブルー等のロイコ化合物が挙げられる。ロイコメチレンブルーは、無色の化合物（還元型）であり、酸化によってメチレンブルー（酸化型）となる。このため、ロイコメチレンブルーは、例えば、酸化物質を検出するための基質として使用できる。本発明においては、例えば、前記反応系に発色剤としてロイコメチレンブルーを添加し、ロイコメチレンブルーと前記反応系における酸化物質との酸化還元反応により、メチレンブルーを生成させ、これを吸光度測定すればよい。また、メチレンブルー以外のフェノチアジン誘導体色素を生成する発色剤としては、各種フェノチアジン誘導体色素のロイコ体等が挙げられる。

【0042】

本開示の試薬組成物における発色剤の含有量は、限定されない一又は複数の実施形態において、０．００１〜０．１００ｍｇ／ｍｌ、０．００３〜０．０８０ｍｇ／ｍｌ、０．００６〜０．０５０ｍｇ／ｍｌ、又は、０．００８〜０．０３０ｍｇ／ｍｌである。

【0043】

［亜硝酸又はその塩］
本開示の試薬組成物に含まれうる亜硝酸又はその塩は、ヘモグロビンを変性させるために使用され得る。亜硝酸塩としては、限定されない一又は複数の実施形態において、亜硝酸カリウム、亜硝酸アミル、亜硝酸ブチル、亜硝酸ナトリウム等が挙げられる。本開示の試薬組成物における亜硝酸又は亜硝酸塩としては、０．０５〜３．００ｍｇ／ｍｌ、０．１０〜１．５０ｍｇ／ｍｌ、又は０．１５〜０．７５ｍｇ／ｍｌである。

【0044】

［緩衝液又は緩衝剤］
本開示の試薬組成物に含まれうる緩衝液又は緩衝剤は、限定されない一又は複数の実施形態において、Ｔｒｉｓ (Tris(hydroxymethyl)amino-methane) 緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＭＥＳ (2-Morpholinoehanesulfonic acid) 緩衝液、ＭＥＳ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ (3-Moropholinopropanesulfonic acid) 緩衝液、ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ＡＤＡ (N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid) 緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ＰＩＰＥＳ (Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)) 緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ (2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid) 緩衝液、ＴＡＰＳ (N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid) 緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、グリシンアミド緩衝液等が挙げられる。上記緩衝液の濃度は、限定されない一又は複数の実施形態において、１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、又は、５〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。

【0045】

［界面活性剤］
本開示の試薬組成物に含まれうる界面活性剤は、限定されない一又は複数の実施形態において、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド）、６−シクロヘキシルヘキシル−β−Ｄ−マルトシド、スクロースモノラウレート（β−Ｄ−フルクトピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシドモノドデカノエート）、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトシド（ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド）、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド（ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド）、５−シクロヘキシルペンチル−β−Ｄ−マルトシド、ウンデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシル−α−Ｄ−マルトシド、ヘキサデシル−β−Ｄ−マルトシド、及び、３−オキサトリデシル−α−Ｄ−マンノシド等が挙げられる。上記界面活性剤の濃度は、限定されない一又は複数の実施形態において、発色剤と界面活性剤のモル比が、１：１〜１：１００，０００の範囲であることが好ましく、より好ましくは、１：２〜１：５０，０００の範囲である。

【0046】

［ｐＨ］
本開示の試薬組成物のｐＨは、酵素活性の維持及び/又は効率化の観点から、５．０〜９．０が好ましく、より好ましくは５．５〜８．５、より好ましくは６．０〜８．０である。

【0047】

本開示の試薬組成物に含まれうる発色剤安定化剤は、限定されない一又は複数の実施形態において、マルトシル−β−シクロデキストリン、グルコシル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、モノアミノ−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、グルクロニルグルコシル−β−シクロデキストリン、ヘプタキス（２，６−ジ−Ｏ−メチル）−β−シクロデキストリン、トリ−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン、サクシニル−β−シクロデキストリン、スルホプロピル−β−シクロデキストリン、サクシニルヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、トリアセチル−β−シクロデキストリン等が挙げられる。発色剤安定化剤の濃度は、特に制限はされないが、発色剤と発色剤安定化剤のモル比が例えば、１：１〜１：１００，０００の範囲であることが好ましく、より好ましくは、１：２〜１：５０，０００の範囲である。

【0048】

［本開示の試薬組成物の調製方法］
本開示の試薬組成物の調製方法は、水又は緩衝液に上述した成分を添加混合することで調製できる。本開示の試薬組成物は、溶液の状態であってもよく、粉末、例えば、凍結乾燥粉末であってもよい。

【0049】

［第２の試薬組成物］
本開示の試薬組成物のみでは、糖化タンパク質を測定することは難しい。糖化タンパク質を測定する場合、第２の試薬組成物として、水を含む試薬組成物を使用することが好ましい（以下、「本開示の第２の試薬組成物」ともいう）。本開示の第２の試薬組成物は、本開示の試薬組成物がＦＡＯＤを含む場合プロテアーゼを含み、本開示の試薬組成物がプロテアーゼを含む場合ＦＡＯＤを含む。

【0050】

［第２の試薬組成物の水、ＦＡＯＤ、及びプロテアーゼ］
本開示の第２の試薬組成物は、水溶液であり、水を含む。水は、蒸留水、イオン交換水、又は超純水等が使用され得る。本開示の第２の試薬組成物に含まれうるＦＡＯＤ及びプロテアーゼは、本開示の試薬組成物に含まれ得る上述の物が使用できる。

【0051】

［第２の試薬組成物のその他の成分］
本開示の第２の試薬組成物は、その他の成分として、タール色素、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）又は発色剤の少なくとも１つを含有しうる。本開示の第２の試薬組成物は、一又は複数の実施形態において、ＰＯＤと発色剤の２成分を同時に含有しない。したがって、本開示の試薬組成物と本開示の第２の試薬組成物は、限定されない一又は複数の実施形態において、下記表２の組み合わせの成分を含む実施形態１〜４が挙げられる。なお、表２において、本開示の試薬組成物の成分は、水、タール色素、及び多価アルコールに加えて含有する成分を示し、本開示の第２の試薬組成物は、水に加えて含有する成分を示す。

【表2】

【0052】

本開示の第２の試薬組成物は、一又は複数の実施形態において、その他の成分として、さらに、緩衝液又は緩衝剤、界面活性剤を含有しうる。また、本開示の第２の試薬組成物が発色剤を含む場合、本開示の第２の試薬組成物はさらに発色剤安定化剤を含有しうる。

【0053】

本開示の第２の試薬組成物に含まれうる緩衝液又は緩衝剤、及び、発色剤安定化剤は、限定されない一又は複数の実施形態において、本開示の試薬組成物に含まれ得る上述の物が使用できる。

【0054】

本開示の第２の試薬組成物に含まれうる界面活性剤は、限定されない一又は複数の実施形態において、ベンゼトニウム、ステアリルトリメチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、ベンザルコニウム、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、ミリスチルトリメチルアンモニウム、ラウリルトリメチルアンモニウム、ドデシルトリメチルアンモニウム、およびココナットアミンアセテート等が挙げられる。上記界面活性剤の濃度は、特に制限はされないが、前記発色剤と安定化剤のモル比が例えば、例えば、１：１〜１：１００，０００の範囲であることが好ましく、より好ましくは、１：２〜１：５０，０００の範囲である。

【0055】

［本開示の第２の試薬組成物のｐＨ］
本開示の第２の試薬組成物のｐＨは、酵素活性の維持及び/又は効率化の観点から、５．０〜９．０が好ましく、より好ましくは５．５〜８．５、より好ましくは６．０〜８．０である。

【0056】

［本開示の第２の試薬組成物の調製方法］
本開示の第２の試薬組成物の調製方法は、水又は緩衝液に上述した成分を添加混合することで調製できる。本開示の第２の試薬組成物は、溶液の状態であってもよく、粉末、例えば、凍結乾燥粉末であってもよい。

【0057】

［糖化タンパク質の測定方法］
本開示の試薬組成物及び本開示の第２の試薬組成物を用いて検体中の糖化タンパク質を測定する方法の限定されない一又は複数の実施形態は以下のようになる。
工程（１）：本開示の試薬組成物と、測定対象試料とを混合する工程。
工程（２）：本開示の試薬組成物と測定対象試料とを混合した混合液に、さらに、本開示の第２の試薬組成物を混合する工程。
工程（３）：工程（１）の混合液を光学測定するか、或いは、工程（２）の混合後速やかに混合液を光学測定する工程。
工程（４）：工程（２）の混合液を一定時間後に光学測定する工程。

【0058】

より具体的には、限定されない下記実施形態１及び２が挙げられる。
実施形態１
工程（１）：本開示の試薬組成物と測定対象試料とを混合する
工程（２）：一定時間後に工程（１）の混合液を光学測定する。
工程（３）：工程（２）後にさらに本開示の第２の試薬組成物を混合する。
工程（４）：一定時間後に工程（３）後の混合液を光学測定する。
実施形態２
工程（１）：本開示の試薬組成物と測定対象試料とを混合する
工程（２）：一定時間後に工程（１）後にさらに本開示の第２の試薬組成物を混合する。
工程（３）：工程（２）の実施後に速やかに混合液を光学測定する。
工程（４）：一定時間後に工程（３）後の混合液を光学測定する。

【0059】

工程（１）の前に、検体から測定対象試料を調製してもよい。検体は、限定されない一又は複数の実施形態において、糖化タンパク質を含みうるものであって、全血、血漿、血清、血球等の血液試料、尿、髄液等の生体試料や、飲料水、食品類等が挙げられる。測定目的の糖化タンパク質が血球内成分の場合には、例えば、血球や血球を含む全血を溶血処理して測定対象試料を調製できる。溶血方法は、特に制限されず、例えば、浸透圧差を利用する方法、超音波による方法、界面活性剤処理方法等が使用できる。浸透圧差を利用する場合、全血（または血球）に対して、例えば、２〜１００倍体積量の精製水を添加して溶血させればよい。或いは、測定対象試料は、限定されない一又は複数の実施形態において、検体そのものであってもよい。

【0060】

実施形態１の工程（２）と工程（４）で得られた光学的測定値の差、及び実施形態２の工程（３）と工程（４）で得られた光学的測定値の差から、糖化タンパク質量を算出できる。算出は、限定されない一又は複数の実施形態において、糖化量が既知の標準試料と光学的測定値との関係をプロットした検量線を用いることによって行える。標準試料は、１種類又は２種類以上である。光学的測定としては、限定されない一又は複数の実施形態において、吸光度測定、反射光測定等が挙げられる。実施形態１及び２の工程（２）における「一定時間」とは、限定されない一又は複数の実施形態において、１〜６０分、１〜１０分又は２〜５分である。実施形態１及び２の工程（４）における「一定時間」とは、限定されない一又は複数の実施形態において、１〜２０分、１〜１０分又は２〜５分である。また、実施形態１及び２の工程（１）〜（４）は、限定されない一又は複数の実施形態において、１５〜４５℃、２５〜４０℃、３０〜４０℃、又は３５〜３７℃の温度条件下で行われうる。

【0061】

測定目的となる糖化タンパク質は、限定されない一又は複数の実施形態において、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミン、ＨｂＡ１ｃなどが挙げられる。

【0062】

本開示の糖化タンパク質の測定方法は、その他の一又は複数の実施形態において、さらに測定対象試料中のタンパク質量（糖化タンパク質と非糖化タンパク質の合計量）を測定することを含みうる。このタンパク質量の測定は、本開示の第２の試薬組成物を混合する前又は後に測定することで達成できる。例えば、糖化タンパク質の測定方法の前記実施形態１においては、工程（２）と同時、工程（２）の前後、工程（４）と同時、又は工程（４）の前後に測定できる。糖化タンパク質の測定方法の前記実施形態１においては、工程（２）の前、工程（３）と同時、工程（４）と同時、又は工程（４）の前後に測定できる。

【0063】

本開示の試薬組成物を用いた糖化タンパク質の測定方法であれば、限定されない一又は複数の実施形態において、自動分析装置の反応セルにおける析出物の発生を抑制できる。よって、本開示は、一態様において、下記工程（１）〜（４）を行う自動分析装置を使用する糖化タンパク質の測定方法（以下、「本開示の測定方法」ともいう）に関する。
工程（１）：本開示の試薬組成物である第一試薬と、測定対象試料とを混合する工程。
工程（２）：第一試薬と測定対象試料とを混合した混合液に、さらに、本開示の第２の試薬組成物である第二試薬を混合する工程。
工程（３）：工程（１）の混合液を光学測定するか、或いは、工程（２）の混合後速やかに混合液を光学測定する工程。
工程（４）：工程（２）の混合液を一定時間後に光学測定する工程。

【0064】

［自動分析装置］
自動分析装置としては、糖化タンパク質の検出に従来使用され或いは今後開発され使用されるものが挙げられる。限定されない一又は複数の実施形態において、自動分析装置は、下記手段１〜４を備える。
測定手段１
手段（１）：本開示の試薬組成物と測定対象試料とを混合する
手段（２）：手段（１）の混合液を光学測定する。
手段（３）：手段（２）後にさらに本開示の第２の試薬組成物を混合する。
手段（４）：手段（３）後の混合液を光学測定する。
測定手段２
手段（１）：本開示の試薬組成物と測定対象試料とを混合する
手段（２）：一定時間後に手段（１）後にさらに本開示の第２の試薬組成物を混合する。
手段（３）：手段（２）の実施後に速やかに混合液を光学測定する。
手段（４）：一定時間後に手段（３）後の混合液を光学測定する。

【0065】

自動分析装置は、さらに、測定手段１では手段（２）と手段（４）で得られた光学的測定値の差、及び測定手段１では手段（２）と手段（４）で得られた光学的測定値の差から糖化タンパク質量を算出する手段を備えてもよい。

【0066】

［糖化タンパク質測定用試薬キット］
本開示は、その他の態様において、本開示の試薬組成物である第一試薬と、本開示の第２の試薬組成物である第二試薬とを含む、糖化タンパク質測定用試薬キット（以下、「本開示の試薬キット」ともいう）に関する。本開示の試薬キットと自動分析装置とを用いて、本開示の測定方法を行うことができる。本開示の試薬キットは、さらに、標準試料を含んでもよい。

【0067】

すなわち、本開示は以下の一又は複数の実施形態に関しうる；
［Ａ１］ 糖化タンパク質測定用試薬組成物であって、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）又はプロテアーゼ、水、タール色素、及び多価アルコールを含む試薬組成物。
［Ａ２］ タール色素が、アゾ色素である、［Ａ１］記載の試薬組成物。
［Ａ３］ アゾ色素がタートラジンである、［Ａ２］記載の試薬組成物。
［Ａ４］ 多価アルコールの分子内ヒドロキシル基数が２個である、［Ａ１］から［Ａ３］のいずれかに記載の試薬組成物。
［Ａ５］ 多価アルコールが、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、［Ａ１］から［Ａ４］のいずれかに記載の試薬組成物。
［Ａ６］ 試薬組成物中の多価アルコールの含有量が、０．５重量％以上１０重量％以下である、［Ａ１］から［Ａ５］のいずれかに記載の試薬組成物。
［Ａ７］ 糖化タンパク質測定自動分析装置で用いるための、［Ａ１］から［Ａ６］のいずれかに記載の試薬組成物。
［Ａ８］ さらに、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）又は発色剤を含む、［Ａ１］から［Ａ７］のいずれかに記載の試薬組成物。
［Ａ９］ ［Ａ１］から［Ａ８］のいずれかに記載の試薬組成物である第一試薬と、水を含む第二試薬を含み、第二試薬は、さらに、第一試薬がＦＡＯＤを含む場合プロテアーゼを含み、第一試薬がプロテアーゼを含む場合ＦＡＯＤを含む、糖化タンパク質測定用試薬キット。
［Ａ１０］ 第二試薬が、さらに、タール色素、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）及び発色剤からなる群から選択される少なくとも一つを含む、［Ａ９］に記載の糖化タンパク質測定用試薬キット。
［Ａ１１］ さらに、標準試料を含む、［Ａ９］又は［Ａ１０］に記載の糖化タンパク質測定用試薬キット。
［Ａ１２］ 下記工程（１）〜（４）を行うことを含む、糖化タンパク質の測定方法。
工程（１）：［Ａ１］から［Ａ８］のいずれかに記載の試薬組成物である第一試薬と、測定対象試料とを混合する工程。
工程（２）：第一試薬と測定対象試料とを混合した混合液に、さらに、水を含む第二試薬を混合する工程。ここで、第二試薬は、さらに、第一試薬がＦＡＯＤを含む場合プロテアーゼを含み、第一試薬がプロテアーゼを含む場合ＦＡＯＤを含み、さらに、第一試薬が発色剤を含まない場合発色剤を含む。
工程（３）：工程（１）の混合液を光学測定するか、或いは、工程（２）の混合後速やかに混合液を光学測定する工程。
工程（４）：工程（２）の混合液を一定時間後に光学測定する工程。

【実施例】

【0068】

以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。

【0069】

血中のヘモグロビンＡ１ｃ濃度及び総ヘモグロビン濃度を測定するための試薬組成物の組み合わせとして、下記第１試薬及び第２試薬を準備した。
＜第１試薬＞
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）（商品名：ＦＰＯＸ−ＣＥ、キッコーマン社製）：０．６−３．０ Ｕ／ｍｌ
亜硝酸カリウム：０．１５−０．７５ ｍｇ／ｍｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製）：３−２０ Ｕ／ｍｌ
タートラジン：０．０５−０．３０ ｍｇ／ｍｌ
緩衝液（Ｔｒｉｓ）：２−１０ ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ７．０
＜第２試薬＞
中性プロテアーゼ・・・８００−４０００ Ｕ／ｍｌ
１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（和光純薬社製）・・・０．００８−０．０３ ｍｇ／ｍｌ
緩衝液（Ｔｒｉｓ）：５０−１００ ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ６．５
界面活性剤：０．０５−０．３ ｍｇ／ｍｌ
発色剤安定化剤：１０−３０ ｍｇ／ｍｌ

【0070】

［析出試験］
前記第１試薬に下記表３記載の多価アルコールを２ｗ／ｖ％添加して実施例１〜１０及び比較例１の試薬組成物を作製した。これらの試薬組成物１００μＬを、自動分析装置（商品名：ＪＣＡ−ＭＢ８，日本電子社製）の反応セルに分注し、室温で５時間静置した。その結果の一例を図１に示す。その結果、比較例１の試薬組成物（第１試薬そのもの）では、自動分析装置の反応セル上面の４つのコーナーに色素を含む析出物が発生した。一方で、多価アルコールを添加した実施例１〜１０の試薬組成物では析出物が確認されず、析出物の発生が抑制された。

【0071】

【表3】

【0072】

実施例１〜１０及び比較例１の試薬組成物１００μＬを、自動分析装置（商品名：ＪＣＡ−ＭＢ８，日本電子社製）の反応セルに分注し、室温で５時間静置した。その結果の一例を図１に示す。図１に示すとおり、比較例１の試薬組成物（第１試薬そのもの）では、自動分析装置の反応セル上面の４つのコーナーに色素を含む析出物が発生した。一方で、多価アルコールを添加した実施例１〜１０の試薬組成物では析出物が確認されず、析出物の発生が抑制された。

【0073】

［試薬性能試験１］
第１試薬として実施例１〜１０及び比較例１の試薬組成物を用いてＨｂＡ１ｃ値を測定し、試薬性能を確認した。

【0074】

〔測定対象試料〕
下記試料を使用してＨｂＡ１ｃ （ＪＤＳ）値が４〜１４％のリファレンス試料を作成した。また、ＨｂＡ１ｃ （ＪＤＳ）値が同じ（６．５又は７．０％）でヘモグロビン濃度が３０〜１５０μｍｏｌ／Ｌの範囲で異なるリファレンス試料を準備した。
糖尿病検査コントロールＬｅｖｅｌ １−３（リクイチェック（商品名）、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）
−８０℃凍結保存全血Ｈｂ濃度違い３種類
−８０℃凍結保存全血ＨｂＡ１ｃ濃度違い８種類

【0075】

〔ＨｂＡ１ｃ濃度の測定手順〕
測定試料８μＬと実施例１〜１０及び比較例１の試薬組成物（第１試薬）９６μＬを混合し、３７℃、５分で反応する。その後、主波長６９４ｎｍ副波長７５１ｎｍで吸光度を測定し、第２試薬６３μＬを添加する。さらに３７℃、５分間反応させた後、再度、主波長６９４ｎｍ副波長７５１ｎｍで吸光度を測定する。吸光度の差からＨｂＡ１ｃ濃度（ｍｍｏｌ／ｌ）を算出する。
〔総ヘモグロビン濃度の測定手順〕
測定試料８μＬと実施例１〜１０及び比較例１の試薬組成物（第１試薬）８μＬを混合し、３７℃、５分で反応する。その後、主波長５７１ｎｍ副波長６９４ｎｍで吸光度を測定し、その吸光度から総ヘモグロビン濃度（ｍｏｌ／ｌ）を算出する。
〔ＨｂＡ１ｃ（ＪＤＳ）値の算出手順〕
ＨｂＡ１ｃ （ＪＤＳ）値は、以下の式で求めた。その結果の一例を図２及び３に示す。
ＨｂＡ１ｃ （ＮＧＳＰ）値＝０．０９１５ × ＨｂＡ１ｃ濃度（ｍｍｏｌ／ｌ）／総Ｈｂ濃度（ｍｏｌ／ｌ） ＋ ２．１５
ＨｂＡ１ｃ （ＪＤＳ）値＝０．９８０ × ＨｂＡ１ｃ （ＮＧＳＰ）値 − ０．２４５

【0076】

ＨｂＡ１ｃ（ＪＤＳ）値が４〜１４％の試料を実施例１〜１０及び比較例１の試薬組成物を用いて上記手順に従ってＨｂＡ１ｃ（ＪＤＳ）値を測定した。その結果の一例を図２に示す。図２は、実施例１〜１０と比較例１とのＨｂＡ１ｃ（ＪＤＳ）値の差（ΔＪＤＳ％）を示すグラフである。図２に示すとおり、実施例３（ジエチレングリコール）、実施例４（トリエチレングリコール）、実施例８（ポリエチレングリコール＃３００）では、比較例１と比べて高値化する傾向が見られた。

【0077】

ヘモグロビン（Ｈｂ）濃度が低（４５μｍｏｌ／Ｌ）、中（９０μｍｏｌ／Ｌ）、高（１３５μｍｏｌ／Ｌ）の３種類の試料（ＨｂＡ１ｃ （ＪＤＳ）値６．５％）を実施例１〜１０及び比較例１の試薬組成物を用いて上記手順に従ってＨｂＡ１ｃ（ＪＤＳ）値を測定した。その結果の一例を図３に示す。図３は、Ｈｂ濃度が中濃度（９０μｍｏｌ／Ｌ）の試料の測定値と、低又は高濃度の試料の測定値との差を示すグラフである。図３に示すとおり、実施例３（ジエチレングリコール）、実施例４（トリエチレングリコール）、実施例７（ポリエチレングリコール＃２００）、実施例８（ポリエチレングリコール＃３００）、実施例９（ポリエチレングリコール＃４００）、実施例１０（ポリエチレングリコール＃６００）では、Ｈｂ濃度の影響を強く受けた。

【0078】

［試薬性能試験２］
前記第１試薬（比較例１）のＦＡＯＤ（商品名：ＦＰＯＸ−ＣＥ、キッコーマン社製）を耐熱性ＦＡＯＤ（商品名：ＦＰＯＸ−ＣＥＴ、キッコーマン社製）に換えた試薬組成物を調製し、これを比較例２とした。比較例２の組成に、下記表４記載の多価アルコール（エチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、及びグリセリン）を１〜３ｗ／ｖ％添加して実施例１１〜１８及び比較例２の試薬組成物を作製した。

【0079】

【表4】

【0080】

第１試薬として、実施例１１〜１８、及び比較例１〜２の試薬組成物、及び、３７℃で７日間保存した組成物を使用して上述の手順にしたがってＨｂＡ１ｃ（ＪＤＳ）値を算出した。測定試料として、下記４種類の試料を用いた。

【0081】

〔測定試料〕
酵素法ＨｂＡ１測定試薬キャリブレータＬｏｗ及びＨｉｇｈ（アークレイ社製）
（以下、「Ｃａｌ Ｌ」及び「Ｃａｌ Ｈ」とも表記する）
−８０℃凍結保存全血Ｈｂ濃度違い２種類である、ヘモグロビン（Ｈｂ）濃度中（９０μｍｏｌ／Ｌ）および高（１３５μｍｏｌ／Ｌ）検体（以下、それぞれ「ＭＮ」及び「ＭＨ」とも表記する）

【0082】

図４〜８は、３７℃７日間保存の前（初期）と後（３７℃７日）の実施例１１〜１８、及び比較例１〜２の試薬組成物を用いてＨｂＡ１ｃ濃度の測定したときの反応タイムコースの吸光度（波長７００ｎｍ）を示す。また、下記表５は、試料ＭＮ及びＮＨを測定した場合における保存前（初期）と保存後（３７℃７日）におけるＨｂＡ１ｃ（ＪＤＳ）値とその変動値を示す。

【0083】

【表5】

【0084】

図４及び表５に示すとおり、比較例１の試薬組成物は、３７℃７日間の培養後は反応活性が著しく低下していた。一方、比較例２及び実施例１１〜１７は、図４〜７に示すとおり保存前後で反応性に変化は見られず、また、表５に示すとおり反応活性にも影響は見られなかった。実施例１８のグリセリンは、図８に示すとおり反応活性に変化があり、表５に示すとおり測定値も大幅に変化した。

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図1】