特許 6061958 ソフトウェア定義式顕微鏡

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6061958

(24)【登録日】2016年12月22日

(45)【発行日】2017年1月18日

(54)【発明の名称】ソフトウェア定義式顕微鏡

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/06 20060101AFI20170106BHJP

【ＦＩ】

   G02B21/06

【請求項の数】19

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2014-559871(P2014-559871)

(86)(22)【出願日】2012年2月29日

(65)【公表番号】特表2015-510150(P2015-510150A)

(43)【公表日】2015年4月2日

(86)【国際出願番号】US2012027152

(87)【国際公開番号】WO2013130077

(87)【国際公開日】20130906

【審査請求日】2015年2月9日

(73)【特許権者】

【識別番号】399117121

【氏名又は名称】アジレント・テクノロジーズ・インク

【氏名又は名称原語表記】ＡＧＩＬＥＮＴ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100099623

【弁理士】

【氏名又は名称】奥山 尚一

(74)【代理人】

【識別番号】100096769

【弁理士】

【氏名又は名称】有原 幸一

(74)【代理人】

【識別番号】100107319

【弁理士】

【氏名又は名称】松島 鉄男

(74)【代理人】

【識別番号】100114591

【弁理士】

【氏名又は名称】河村 英文

(74)【代理人】

【識別番号】100125380

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 綾子

(74)【代理人】

【識別番号】100142996

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 聡二

(74)【代理人】

【識別番号】100154298

【弁理士】

【氏名又は名称】角田 恭子

(74)【代理人】

【識別番号】100166268

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 祐

(74)【代理人】

【識別番号】100170379

【弁理士】

【氏名又は名称】徳本 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100161001

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 篤司

(74)【代理人】

【識別番号】100179154

【弁理士】

【氏名又は名称】児玉 真衣

(74)【代理人】

【識別番号】100180231

【弁理士】

【氏名又は名称】水島 亜希子

(74)【代理人】

【識別番号】100184424

【弁理士】

【氏名又は名称】増屋 徹

(72)【発明者】

【氏名】メルテルマイアー，マヌエル

(72)【発明者】

【氏名】デュドネ，マイケル

【審査官】 越河 勉

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００６−２７５６８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−１７１０２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００８／０２１２１８０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００６／１０４１８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００５−５０８５２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００３／００８６１４５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２００３−１２１７４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００３／００３０９０２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２０１１−１２８５８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 欧州特許第０２３２５６８３（ＥＰ，Ｂ１）

【文献】 特表２０００−５０２４７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第０６２４３１９７（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】 特開昭６１−１５６２１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−２１２８００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−１５４２９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−１５２５６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１２／０３２９２４７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開平１１−１０１９４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００２／０１５４３９８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２００５−２９２５３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６１−１０３１１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０３−２６５８１９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 欧州特許第００４４６９４９（ＥＰ，Ｂ１）

【文献】 特開平０７−０４３６３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０４−０９３９１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５１７２９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００６／０１７１０２１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２０１１−０６４８９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／０６９２２０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０２０１３６６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２００３−０５９０９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００３／００３９１９６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開平０５−１００１０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０５−１６４５２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−０４５２０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 欧州特許第０１８６５３５３（ＥＰ，Ｂ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００４／０１９６５５０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００３／０１２０３２５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２００４−１７０９３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００４／００８４４２６（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０２Ｂ ２１／０６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

照明源から第１の波長の光を受取り、前記第１の波長の光を通すダイクロイックリフレクターを通して対物レンズ内に光を伝達するように前記光を処理する第１の照明空間光変調器（第１の照明ＳＬＭ）であって、該第１の照明ＳＬＭは、第１の反射基板と、該第１の反射基板上に配置された複数の第１のクリアピクセルを有し、該複数の第１のクリアピクセルの各々は、該各第１のクリアピクセルに連結された電極に制御電圧を印加することにより、該各第１のクリアピクセルの屈折率を変化することができる、第１の照明ＳＬＭと、
前記対物レンズから光を受取り、カメラ上に画像を形成する結像システムと、
グラフィカルユーザインプット（ＧＵＩ）を有し、前記画像をユーザに見せ、前記第１の照明ＳＬＭを制御して、前記ユーザからのコマンドに応答して前記光の前記処理を変更するコントローラと
を備え、前記コントローラは、前記第１の照明ＳＬＭのアライメント誤差及び／又は集束要件を補正するように、前記第１の照明ＳＬＭをプログラムすることができる顕微鏡。

【請求項2】

前記コントローラは、前記ＧＵＩ上でユーザによって指定されるサンプルの領域を選択的に照明する、請求項１に記載の顕微鏡。

【請求項3】

前記コントローラは、前記第１の照明ＳＬＭに、１つの照明モードでフレネルレンズをエミュレートさせる、請求項１に記載の顕微鏡。

【請求項4】

前記コントローラは、前記第１の照明ＳＬＭに、１つの照明モードでフレネルプリズムをエミュレートさせる、請求項１に記載の顕微鏡。

【請求項5】

前記光源は複数の光源を備え、前記コントローラは、前記カメラからの前記画像を利用して前記光源のアライメント誤差を修正する、請求項１に記載の顕微鏡。

【請求項6】

前記対物レンズは、後焦点面と前記対物レンズの中心を通るレンズ軸とを有し、前記コントローラは、前記第１の照明ＳＬＭに、前記後焦点面上で前記レンズ軸からオフセットした位置に前記光を集束させるレンズをエミュレートさせる、請求項１に記載の顕微鏡。

【請求項7】

前記コントローラは、前記顕微鏡によって観察されるサンプルが、前記ＧＵＩを用いて前記ユーザによって選択される複数のパターンのうちの１つのパターンで照明されるように、前記光を処理する、請求項１に記載の顕微鏡。

【請求項8】

前記コントローラは、前記サンプルの第１の視野の第１の画像を前記カメラが受取るように前記光を処理し、前記第１の画像は前記ＧＵＩ上に表示される、請求項７に記載の顕微鏡。

【請求項9】

前記コントローラは、前記第１の画像を参照して前記ＧＵＩを通して入力されるロケーションにおける前記第１の視野の副視野に前記光が集中されるように前記光を処理し、前記副視野は前記第１の視野より小さい、請求項８に記載の顕微鏡。

【請求項10】

さらに、第２の反射基板と、該第２の反射基板上に配置された複数の第２のクリアピクセルを有し、該複数の第２のクリアピクセルの各々は、該各第２のクリアピクセルに連結された電極に制御電圧を印加することにより、該各第２のクリアピクセルの屈折率を変化することができる第２の照明ＳＬＭを備え、前記第２の照明ＳＬＭは、前記第１の照明ＳＬＭからずらされており、前記第１の照明ＳＬＭによって処理された光を受取り、
前記コントローラは、前記第２の照明ＳＬＭのアライメント誤差及び／又は集束要件を補正するように、前記第２の照明ＳＬＭをプログラムすることができ、前記コントローラは、前記第１の照明ＳＬＭ及び第２の照明ＳＬＭの一方が、前記レンズ軸からオフセットした位置で前記後焦点面上に前記光を集束させるように位置決めされ、前記第１の照明ＳＬＭ及び第２の照明ＳＬＭの他方が、前記対物レンズの後焦点面に共役な平面上に実質的に位置決めされる、請求項６に記載の顕微鏡。

【請求項11】

前記結像システムは、前記コントローラによって制御される結像ＳＬＭであって、第３の反射基板と、該第３の反射基板上に配置された複数の第３のクリアピクセルを有し、該複数の第３のクリアピクセルの各々は、該各第３のクリアピクセルに連結された電極に制御電圧を印加することにより、該各第３のクリアピクセルの屈折率を変化することができる、結像ＳＬＭを備え、前記コントローラは、前記結像ＳＬＭのアライメント誤差及び／又は集束要件を補正するように、前記結像ＳＬＭをプログラムすることができ、前記結像ＳＬＭは前記ダイクロイックリフレクターからの光を前記カメラ上に結像する、請求項１に記載の顕微鏡。

【請求項12】

前記コントローラは、前記結像ＳＬＭに前記対物レンズの収差を修正させる、請求項１１に記載の顕微鏡。

【請求項13】

さらに偏光ビーム分割アセンブリを備え、前記偏光ビーム分割アセンブリは、前記ダイクロイックリフレクターから光を受取り、前記光を分割し、それにより第１の偏光の光が前記結像ＳＬＭの第１の領域内で前記結像ＳＬＭに衝突し、直交偏光の光が偏光回転アセンブリを通過し、前記第１の領域とは離れている第２の領域内で前記結像ＳＬＭに衝突する、請求項１１に記載の顕微鏡。

【請求項14】

さらに偏光ビーム分割アセンブリを備え、前記偏光ビーム分割アセンブリは、前記ダイクロイックリフレクターから光を受取り、前記光を分割し、それにより、第１の偏光の光が前記結像ＳＬＭに衝突し、直交偏光の光が前記カメラ上に結像される、請求項１１に記載の顕微鏡。

【請求項15】

前記コントローラは、前記結像ＳＬＭに、前記結像ＳＬＭに衝突する前記光から第１の画像を前記カメラ上の前記第１の領域内に形成させ、また、前記結像ＳＬＭに衝突する前記光から第２の画像を前記第２の領域内に形成させ、前記第１の画像は、前記カメラにおいても前記第２の画像から離れている請求項１３に記載の顕微鏡。

【請求項16】

前記コントローラは、前記結像ＳＬＭに、前記顕微鏡を用いて観察されるサンプルのスペクトル強調画像を生成するフレネルプリズムをエミュレートさせる、請求項１１に記載の顕微鏡。

【請求項17】

前記対物レンズ及び前記結像ＳＬＭは、前記サンプル内の焦点深度で特徴づけられ、前記コントローラは、前記結像ＳＬＭに前記焦点深度を変更させる、請求項１１に記載の顕微鏡。

【請求項18】

前記コントローラは、前記結像ＳＬＭに中心セクションが閉鎖されているレンズをエミュレートさせる、請求項１１に記載の顕微鏡。

【請求項19】

前記レンズは超解像デジレンズである、請求項１８に記載の顕微鏡。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

強力なレーザ及び感度の高いカメラ等の蛍光顕微鏡の進歩により、現在、生体細胞内の単一の色素分子の検出が可能になっている。色素は、細胞の成分に直接結合するか、又は、細胞成分に結合する標的分子に付着する。しかし、従来の顕微鏡におけるこうした単一分子の結像を実施することは、かなりの難題を呈する。

【0002】

照明源は、サンプル上の目的のエリアを単に照明することを超えて、いくつかの特徴を提供しなければならない。数ミリ秒以内に単一の色素分子から十分に強い信号（数百〜数千の光子）を収集するために、１ｋＷ／ｃｍ^２より大きい照明強度が必要とされる。しかし、典型的なレーザ光源が生成するのは、１００ｍＷ未満である。このパワーの一部だけを対物レンズを通して投影することができる。したがって、照明することができる最大エリアは、径が１００ミクロン未満である。実際には、好ましくは大きなエリアが照明され、目的の細胞が見出される。そして、より強い局所化照明が、目的の細胞の周りのより小さなエリア内で使用されて、目的の細胞の画像が形成されることができる速度を増加させ、その時に結像されていない周囲の細胞に対する光誘導性のダメージを減少させる。したがって、照明光スポットのサイズ、ロケーション、及び強度が可変でなければならない。

【0003】

さらに、照明源の波長は、問題の色素に応じて変動する必要がある場合がある。サンプルが異なる励起波長を有する複数の色素を含む場合、照明源は、同じ画像を取得する間に、複数の波長を提供する必要がある場合がある。

【0004】

単一分子検出によって生じる問題に加えて、幾つかの画像形成モードにおいて、照明光がサンプルに衝突する角度もまた、制御されなければならない。例えば、１つの照明モードにおいて、入射光は、サンプルがその上に配置されるスライドとサンプルとの間の境界に、照明光が境界から全反射されることを保証する角度で衝突しなければならない。この照明方法は、ガラスに近接する小さな体積が励起されることをもたらし、画像の信号対雑音比を改善する。

【0005】

最後に、異なる照明パターンが、異なる結像モードについて必要とされる。ストライプ、円、リング、又はスポットからなるパターンでサンプルが照明されるモードが、結像モードに応じて必要とされる場合がある。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、照明源から第１の波長の光を受取り、第１の波長の光を通すダイクロイックリフレクターを通して対物レンズ内に光を伝達するように、その光を処理する、第１の照明空間光変調器（ＳＬＭ：spatial light modulator）を有する顕微鏡を含んでいる。顕微鏡はまた、対物レンズから光を受取り、カメラ上に画像を形成する結像システムと、グラフィカルユーザインプットを有し、画像をユーザに表示し、第１の照明ＳＬＭを制御して、ユーザからのコマンドに応答して光の処理を変更する、コントローラとを含む。照明ＳＬＭは、従来の顕微鏡の照明光学トレイン内の１つ若しくは複数のレンズ又はプリズムによって通常実施されることになる機能を提供するように制御される。さらに、コントローラは、照明ＳＬＭを利用して、カメラ画像を使用することによって第１の波長の光を生成する光源内のアライメント誤差を補正し、それにより、ＳＬＭのプログラミングを最適化することができる。結像システムは、コントローラによって制御される結像ＳＬＭを含むことができ、結像ＳＬＭは、ダイクロイックリフレクターからの光をカメラ上に結像する。コントローラは、結像ＳＬＭを利用して、対物レンズの収差を補正し、対物レンズからの光の偏光依存性処理を実施することができる。コントローラはまた、結像ＳＬＭを利用して、対物レンズによって観察されるオブジェクトについて向上したスペクトル情報を有する画像を生成することができる。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】本発明による顕微鏡の一実施形態を示す図である。

【図2】光学要素を置換するように位相変調ＳＬＭを使用する一方法を示す図である。

【図3】異なる波長の２つの単色光源を有する光源を示す図である。

【図4】本発明による顕微鏡で使用する光源の別の実施形態を示す図である。

【図5】ＧＵＩ上で表示されるカメラ画像において見られるスライドの視野を示す図である。

【図6】全内部反射結像モードが従来の顕微鏡において実施される方法を示す図である。

【図7】本発明による顕微鏡内のＳＬＭが利用されて、可動フォーカスレンズを必要とすることなく軸外集束を提供することができる態様を示す図である。

【図8】図８Ａおよび図８Ｂは、本発明の一実施形態による顕微鏡で使用する入力光学チェーンの別の実施形態を示す図である。

【図9A】本発明の１つの実施形態による放出光処理光学部品の一部分を示す図である。

【図9B】本発明の１つの実施形態による放出光処理光学部品の一部分を示す図である。

【図10】図１０Ａは、従来のデジレンズ（ｄａｉｓｙ ｌｅｎｓ）の回折パターンを示す図である。図１０Ｂは、超解像デジレンズの回折パターンを示す図である。

【図11】ＳＬＭがプリズムパターンを提供するようにプログラムされるときの、顕微鏡の視野内の１つの蛍光スポットを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0008】

本発明がその利点を提供する態様は、図１を参照してより容易に理解されることができ、図１は、本発明による顕微鏡の一実施形態を示す。顕微鏡２０は、スライド２５’上に目的の細胞を含むサンプル２５の画像を形成する。サンプルは、グラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）２９を介して顕微鏡２０のユーザと通信するコントローラ２８によって制御される複数の離散的な波長の光源を含み得る光源２１によって照明される。光源２１からの光は、ＳＬＭ２２によって処理され、ＳＬＭ２２は、光源２１からの光の位相を、光がＳＬＭ２２に衝突するロケーションに応じて異なる程度に変更する。ＳＬＭ２２は、以下でより詳細に論じられるであろう。ＳＬＭ２２からの処理済みの光は、サンプル上に光を集束させる対物レンズ２４内に結像される。オプションのテレスコープ３２は、ＳＬＭ２２から出力される光ビームのサイズを減少させ、それにより、光ビームは、対物レンズ２４の入力アパーチャによって収容される。

【0009】

ダイクロイックリフレクター２３は入射波長の光を通す。ＳＬＭ２６はまた、ＳＬＭ２６に入射する光の位相を変更する。ＳＬＭ２６によって処理された光は、その出力がコントローラ２８に入力されるカメラ２７上に結像される。画像は、ＳＬＭ２２及び２６によって提供される処理を調整するために使用される種々の制御パラメータをユーザが通信することを可能にする態様でＧＵＩ２９上に表示される。

【0010】

上記で述べたように、光源２１の出力は、位相変調ＳＬＭであるＳＬＭ２２によって処理される。ここで、位相変調ＳＬＭを示す図２を参照されたい。ＳＬＭ４０は、反射基板４２上のクリアピクセル４１のアレイとみなすことができる。各ピクセルの屈折率は、各ピクセルに連結されたピクセル内の電極に適切な制御電圧を印加することによって、個々に変化し得る。この構成のＳＬＭは、個々のピクセルを制御する制御回路部及び電極を含むシリコン基板上に液晶材料を堆積させることによって実施することができる。このタイプのＳＬＭは、商業的に入手可能であり、したがって、本明細書では詳細には論じない。本検討のために、ピクセルを通過する光の観点から、３の屈折率及び１ユニットの厚さを有するピクセルが、１．５の屈折率及び２ユニットの厚さを有するピクセルと同じ作用を光に対して有することを留意することで十分である。したがって、こうしたＳＬＭは、４３で示すフレネルレンズをエミュレートすることができ、次に、レンズ４４と実質的に同じ態様で光を処理する。

【0011】

同様に、位相変調ＳＬＭは、光ビームを向け直し、広スペクトル光源をその成分波長に分離するプリズムをエミュレートすることができる。単一のＳＬＭが、原理上、複数のレンズ及びプリズムを有する光学アセンブリをシミュレートすることができることは留意されるべきである。所望の光学処理が与えられると、等価な位相シフトパターンを、ＳＬＭに対する入力として導出することができる。

【0012】

ＳＬＭはまた、光学的分解能の限界内で、レンズの焦点面においてほぼ任意の強度分布を生成するのに使用することができる。ＳＬＭは、レンズ面と共役に配置され、ＳＬＭから反射される光はレンズを通過する。レンズの焦点面における強度分布は、ＳＬＭ上の位相パターンのフーリエ変換であることになる。所望の強度分布に基づいてＳＬＭ設定を計算する公表されている幾つかの方法が存在する。

【0013】

ＳＬＭは、原理上、かなり抑えたコストで、顕微鏡を含む非ＳＬＭ内で使用される従来の光学アセンブリによって提供される入力光処理と同じ入力光処理を提供することができる。従来の入力光学トレインは、入力光の波長が特定の用途に応じて変化する場合があるため、色消しレンズ及び要素を利用しなければならない構成要素について構築されなければならない。さらに、要素のアライメント公差は、エンドユーザがアライメントを容易に変更できないため小さい。

【0014】

ＳＬＭは、光源の波長が変更されるときに、シミュレートされるレンズの有効焦点長を電子的に変更することができる。さらに、ＳＬＭは、他の固定光学要素に関連して、電子的に、レンズの位置を「移動させる（move）」又はリフレクターの角度を変更することができる。したがって、これらのパラメータは、自動的に又はユーザからの入力に応答して、実験のセットアップ及び実行中に変更することができる。

【0015】

例えば、顕微鏡の視野内の照明スポットの位置及びサイズが、ＳＬＭ上のピクセルのパターンを調整するソフトウェアを使用して制御されて、カメラから見られる視野内で所望のビーム形状及びサイズを提供することができる。光源２１が、レーザ等の複数の単色光源から構築される場合を考える。通常、レーザが顕微鏡の視野内で同じ形状を有するスポットを同じロケーションに生成することを、実験は必要とする。個々の光源のアライメントは、従来の顕微鏡においてかなりの難題を呈する。その理由は、アライメントが、アライメント誤差を補正することができる、ある形態の機械的アセンブリによって制御されなければならないからである。

【0016】

ここで、異なる波長の２つの単色光源を有する光源５０を示す図３を参照されたい。光源の一方だけが任意の所与の時間にアクティブであり、光源の一方がアライメントがずれている場合を考える。５１及び５２で示す２つの光源からの光は、ダイクロイックリフレクター５３及びミラー５４の助けを借りて結合される。理想的には、各光源は、５７に示す方向に光ビームを生成する。アライメント誤差のため、光源５２からの光は、５６に示すようにミスアライン状態である。ミスアライメントはＳＬＭ５５によって補正される。光源５２がアクティブであるとき、視野内において結果として生じるスポットの位置は、図１に示すカメラ２７によって測定される。ＳＬＭプログラムは、プリズム並びにリフレクターをエミュレートするようＳＬＭをプログラムすることによって、スポットが所望のロケーションになるように設定される。プリズムはミスアライメントを補正する。光源５１がアクティブであるとき、ＳＬＭは、単純なリフレクターであるようにプログラムされる。上記で述べたように、ＳＬＭはまた、プリズムと協同してレンズをエミュレートすることができ、したがって、ビームが集束される場合、ＳＬＭはまた、所望のレンズエミュレーションを提供することができる。さらに、各光源からの光が単色であるため、ＳＬＭは、その波長に関して適切に動作するプリズム及び／又はレンズを提供するようにプログラムされることができ、したがって、高価な色消しレンズは必要とされない。

【0017】

この配置構成はまた、照明スポットの位置を変更することなく、光が１つの波長から別の波長に高速に切換えられる実験を可能にする。サンプルが１つの波長で刺激され、次いで第２の波長で観察される実験に容易に対応できる。

【0018】

複数の光源が一度に動作される場合、各光源がそれ自身のＳＬＭを有する配置構成を利用することができる。ここで、本発明による顕微鏡で使用する光源の別の実施形態を示す図４を参照されたい。光源６０は、いくつかの単色光源を有し、そのうち、光源６１及び６２が典型的である。各光源は、６５及び６６で示すように、対応するＳＬＭを有する。ＳＬＭは、カメラ上のスポットを観測し、スポットが所望の位置にあり、かつ、所望の形状を有するまでＳＬＭプログラムを補正することによって、関連する光源についてアライメント誤差及び任意の集束要件を補正するようにプログラムされる。個々の光源によって生成される光ビームは、その後、リフレクター６３及び６４等のダイクロイックリフレクターを使用して結合される。

【0019】

顕微鏡の視野内の照明スポットのロケーション、サイズ、及び形状を制御する能力は、本発明に係る顕微鏡が、より効率的な態様で、かつ、従来の顕微鏡と比較して低減されたコストを有する構成要素によって動作することを可能にする。

【0020】

従来の顕微鏡では、ユーザは、最初に、低倍率対物レンズを通して視野を検査し、対象の細胞を含んでいるであろう対象の領域にステージをシフトさせる。次いで、ユーザは、対象の細胞を見出すように高倍率に切換える。その後、ユーザは、対象の細胞をモータのついたｘ−ｙステージによって中心に配置し、それにより、対象の細胞が視野の中心にあり、照明が適切に高いレベルになり、所望の測定が実施される。ユーザは、その後、光学系をカメラに切換えて、所望の測定を行う。精密ステージのコストは相当なものである。さらに、対象の細胞を中心に配置するプロセスは時間がかかる。

【0021】

本発明の一実施形態に係る顕微鏡では、ユーザは、カメラ出力及び高倍率の対物レンズを観察することによってこれらの動作の全てを実施する。カメラは、対象の任意のサブエリアに対するデジタルズームを可能にするのに十分な解像度を有する。ＳＬＭは、カメラ上でユーザによって観察されることができるエリア全体を照明するようにプログラムされる。ユーザは、マウス又はＧＵＩの一部である他のポインティングデバイスを使用して対象の細胞を選択する。ＳＬＭは、その後、ユーザによって指示されるロケーションに合うようにスポットのサイズ及び位置を変更する。ここで、光の全てがユーザによって指示される領域内に集中するため、照明強度は実質的により高く、より高速な結像をもたらす。さらに、顕微鏡ステージの必要とされる精度は、実質的に低減される。その理由は、位置の微調整が、ユーザが対象の細胞を中心に配置しなければならない固定視野によってではなく、ユーザによって選択されるカメラ視野のエリアによって提供されるからである。

【0022】

試料上のスポットの形状を制御するとともにロケーションを移動させるＳＬＭの能力は、対象のオブジェクトのより効率的な照明及び対象の測定に干渉する可能性のある近くのオブジェクトを回避することを可能にする。ここで、ＧＵＩ上で表示されるカメラ画像において見られるスライドの視野を示す図５を参照されたい。画像は、視野７８内のオブジェクトの全てを照明するように設定された照明スポットサイズで撮影される。例示的な細胞は７１及び７２で示される。ユーザは、７３〜７５で示すように、照明されるべき副視野の境界をマーク付けすることによって高い強度で照明されるべきエリアを選択することができる。ユーザはまた、照明副視野の形状を指定することができる。形状は、正方形、長方形、又は円形等の形状の所定のメニューから選択することができる。さらに、７６で示す境界等の或る特定の自由形式の形状を設けることができる。対象のオブジェクトの境界により密接に一致する形状を選択することによって、光が必要とされる場所に光が集中し、背景光が低減される。

【0023】

その後、ユーザは、選択された副視野のうちの１つが、指定された波長でより高い照明を受けることを指示する。コントローラは、スポットのロケーション及び境界をＳＬＭに適用されるパターンに変換し、カメラは画像を記録する。この後者のフェーズ中に、ユーザによって指示されたエリアだけが照明される。所定の形状の場合、パターンをコントローラに記憶することができる。より自由形式のパターンの場合、コントローラは、必要とされるＳＬＭパターンを計算する必要があることになる。知られているロケーションで知られているスポットサイズを生成するＳＬＭパターンを決定するコンピュータプログラムは、当技術分野で知られており、したがって、本明細書では詳細に論じない。

【0024】

幾つかの実験では、試料が配置されるスライドの底面に照明光が衝突する角度は臨界（critical）である。例えば、全内部反射結像では、ガラスと試料含有流体との屈折率の差によって、ガラスと試料との間の界面で光が反射するような角度で照明光がスライドに衝突する。この配置構成は、試料内にエバネッセント電界を生じ、エバネッセント電界は結像するように試料を励起する。結果得られる画像は、より従来的な照明で撮影される画像より高いコントラストを有する。この実験的配置構成を提供するのに、スライドは、臨界角度より大きい角度で、光の平行ビームによって照明されなければならない。

【0025】

ここで、全内部反射結像モードが従来の顕微鏡において実施される態様を示す図６を参照されたい。サンプル８８は、エバネッセント電界領域８７を生成するために下から照明されるスライド８４上に搭載される。照明システムは、レーザからの平行光ビームを対物レンズ８３の後焦点面８２上に集束させる別個のフォーカスレンズ８１を必要とする。この配置構成で、対物レンズを出る光は平行ビームであることになる。対物レンズの軸に対する平行ビームの角度は、対物レンズの軸８８に対する後焦点面８２内の焦点の変位によって決定される。この変位は、フォーカスレンズ８１が矢印８６によって示すように横方向に移動されることを必要とする。この配置構成のコストは相当なものである。第１に、幾つかの異なる励起波長のうちの任意の励起波長が必要とされる場合があるため、フォーカスレンズ８１は色消しレンズである必要がある。第２に、フォーカスレンズ８１は、その位置が容易に調整でき、また、従来の照明が所望されるときに取外すことができる可動マウントに搭載されなければならない。

【0026】

ここで、可動フォーカスレンズを必要とすることなく所望のフォーカシングを提供するために、本発明に係る顕微鏡内のＳＬＭを利用することができる態様を示す図７を参照されたい。この実施形態では、図１に示すＳＬＭ２２は、対物レンズ８３の後焦点面上の正しい位置にレーザ光８９をフォーカスさせる軸外フォーカスレンズを提供するようにプログラムされる。照明システムが従来のモードで使用されるとき、ＳＬＭは、そのモードの対応するパターンに再プログラムされるだけである。

【0027】

ＳＬＭが、全内部反射モードについて必要とされる狭い焦点を提供できないが、従来の照明について必要とされる照明パターンを依然として提供する場合、第２のＳＬＭが、入力照明チェーン内に設けられてもよい。全内部反射モードの場合、ＳＬＭは、視野内で移動させることができるスポットを照明するように向けられる照明の場合に比べて、対物レンズからより遠くにある必要がある。入力光セクション内で２つの異なる離間したＳＬＭを使用することによって、２つの異なる距離が適応されることができる。

【0028】

ここで、本発明の一実施形態に係る顕微鏡で使用する入力光学チェーンの別の実施形態を示す図８Ａ及び図８Ｂを参照されたい。図８Ａは、従来の照明が所望されるときの入力チェーン処理を示し、図８Ｂは、全内部反射照明が所望されるときの入力チェーン処理を示す。この実施形態では、２つのＳＬＭが利用される。図８Ａを参照すると、入力チェーンはＳＬＭ９１及びＳＬＭ９２を使用する。非内部反射モードで動作するとき、ＳＬＭ９１は、リフレクターとして働くだけであり、ＳＬＭ９２は、試料上に所望の照明パターンを提供するようにプログラムされる。本発明の一態様では、ＳＬＭ９２は、対物レンズの後焦点面８２と実質的に共役である平面上に位置決めされる。図８Ｂを参照すると、全内部反射モードで動作するとき、ＳＬＭ９１は、オフセンタフレネルレンズパターンを提供して、対物レンズ２４の後焦点面上にレーザビームを集束させるのに使用され、ＳＬＭ９３は、単純なリフレクターであるようにプログラムされる。

【0029】

再び図１を参照されたい。本発明の一態様では、放出光パイプはまた、放出経路内にプログラム可能光学部品（ｏｐｔｉｃｓ）を提供するＳＬＭを含む。放出経路内でＳＬＭを使用することは、ＳＬＭが偏光を処理する要件によって複雑化される。レーザ源の偏光が適切にアラインされることが可能なため、これは入力光経路において重大な問題を呈しない。放出経路では、利用可能な光を２分の１に減少させる偏光フィルタによってもたらされる損失を補償するほどに、利用可能な光強度をオフセットすることはできない。

【0030】

ここで、本発明の一実施形態に係る放出光処理光学部品の一部分を示す図９Ａを参照されたい。以下の議論を簡単にするために、図１の要素に類似する機能を果たす顕微鏡１００の要素は、同じ参照符号を与えられている。顕微鏡１００は、光学経路を曲げて、よりコンパクトな装置を提供するミラー１１１を含む。

【0031】

この配置構成では、偏光依存ビームスプリッタ１０１は、サンプルからの光を受取る。偏光依存ビームスプリッタ１０１は、光を、１０２及び１０３に示すように異なる方向に進み、異なる直交偏光を有する２つのビームに分離する。テレスコープ１１０は、対物レンズの出力を偏光依存ビームスプリッタ１０１の入力に整合させる。偏光回転要素１０４は、ビームのうちの一方の偏光を、ＳＬＭ１０５用の所望の偏光に回転させる。このビームは、ビーム１０３がＳＬＭ１０５に衝突する領域１０７から離れているＳＬＭ１０５の領域１０６上に入射する。ＳＬＭ１０５は、互いに隣りに配置される２つの別個のＳＬＭを提供するようにコントローラ１２０によってプログラムされる。それぞれのセクションの出力は、カメラ１１２の異なる領域上に結像されて、異なる偏光を有する光による２つの画像を提供する。代替的に、２つの光ビームは、別の回転要素及び偏光依存ビームスプリッタを使用することによって、処理後に再結合されて、２つの光ビームを分離するのに使用されるプロセスを反転させることができる。

【0032】

図９Ａに示す実施形態では、結像ＳＬＭプロセスにおいて、偏光依存ビームスプリッタによって生成される画像の両者は、ＳＬＭ１０５の異なる部分によって処理される。これは、ＳＬＭ１０５のピクセルを、２つの画像の間で分割し、したがって、それぞれの画像に適用されることが可能なＳＬＭの解像度を減少させる。

【0033】

ここで、本発明の別の実施形態に係る放出光処理光学部品の一部分を示す図９Ｂを参照されたい。以下の議論を簡単にするために、図９Ａの要素に類似する機能を果たす顕微鏡１３０の要素は、同じ参照符号を与えられている。顕微鏡１３０は、ＳＬＭ１０５がビーム１０３からの光を処理するのに使用され、ビーム１０２からの光が、ミラー１３１によってカメラ内に反射されるだけである点において、顕微鏡１００と異なる。この配置構成は、カメラ内で２つの並んだ画像、すなわち、ＳＬＭ１０５によって処理されている画像と、そのように処理されていない画像とを提供する。例えば、ＳＬＭ１０５が、対物レンズの焦点深度を変更するのに使用される場合、画像は、従来の画像と、サンプル内の位置のより狭い帯域に制限される画像とを示す。

【0034】

本発明の一態様では、放出経路内のＳＬＭはまた、プログラム可能レンズとして使用されて、球面収差、コマ収差、及び非点収差等の対物レンズの誤差を修正する。修正は、既知のキャリブレーションターゲットについてカメラ画像を解析し、十分な補正が達成されるまで、ＳＬＭパターンを反復的に改善することによって達成される。本発明のこの態様は、より安価な対物レンズが顕微鏡内で使用されることを可能にする。顕微鏡の使用可能な視野は、たとえ良い品質の対物レンズを用いても、上述した光学的不完全性によって制限されることも留意されるべきであり、したがって、本発明のこの態様はまた、より大きな視野を可能にする。

【0035】

本発明の別の態様では、放出経路内のＳＬＭは、対物レンズとＳＬＭとの組合せが「超解像度レンズ（super resolution lens）」をエミュレートするようにプログラムされる。超解像度レンズでは、レンズの中心領域が閉鎖される。これは、画像内に或るアーチファクトを導入するという代償を払って、画像内のより高い空間周波数が強調される画像をもたらす。アーチファクトは、いわゆる超解像度デジレンズを使用することによって、より不都合でなくすることが可能である。従来のデジレンズ及び超解像度デジレンズのフーリエ回折パターンは、図１０Ａ及び図１０Ｂにそれぞれ示される。

【0036】

本発明のプログラム可能レンズの態様はまた、サンプル内の分子の深さに関して蛍光分子を位置特定するのに使用されることができる。ここで、ＳＬＭによって提供される追加の焦点レンズは、ＳＬＭレンズと対物レンズの組合せの焦点距離を変更する。さらに、焦点深度は、スライドの底部から既知の距離にある分子だけが合焦状態になるように減少される。

【0037】

本発明の別の態様では、放出経路内のＳＬＭはまた、画像内の削除点のそれぞれについて分光表示を生成するのに使用される。ＳＬＭは、本発明のこれらの実施形態において、フレネルプリズムパターンを用いてプログラムされる。ここで、ＳＬＭがプリズムパターンを提供するようにプログラムされるときの、顕微鏡の視野内の１つの蛍光スポットを示す図１１を参照されたい。プリズムは、それぞれの点１２１の光を「ストリーク（streak）」１２２に分散させ、ストリーク内の位置は異なる波長に対応する。したがって、カメラは、画像内の照明される点のそれぞれに対応するスペクトルを測定する。蛍光色素のスペクトルがわかっているため、このスペクトルは、既知のスペクトルと背景とを足したものにスペクトルを当てはめることによってＳＮ比（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ ｒａｔｉｏ）を改善するように使用されることができる。

【0038】

２つのＳＬＭパターンが、ＳＬＭ上で２つの並んだパターンとして実装されることができ、カメラ上に並んだ画像をもたらすことが留意されるべきである。その２つのパターンは、異なる焦点距離の２つのレンズを提供することができるため、焦点外れの量は、３次元でオブジェクトを位置付けするのに使用することができる。代替的に、又は組合せて、レンズのうちの１つのレンズは、オリジナル画像とスペクトルを有する画像とを示すように、レンズパターンとともにプリズムパターンを含むことができる。

【0039】

単にソフトウェア変更を通してそれ自身を再構成するシステムの能力は、測定モード間の迅速な変更を可能にする。また、システムは、配備後に、新しい測定モードにアップグレードすることができる。ユーザはまた、ハードウェアに対する修正を実施する必要なしで新しいモード及びプロトコルを設計することができる。

【0040】

本発明の上述した実施形態は、本発明の種々の態様を示すために提供されている。しかし、異なる特定の実施形態で示される本発明の異なる態様が組み合わされて、本発明の他の実施形態を提供することができることは理解されるべきである。さらに、本発明に対する種々の修正は、上述の記載及び添付図面から明らかになるであろう。したがって、本発明は、以下の請求項の範囲によってのみ限定されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図11】

【図10】