特許 6062470 同位体修飾化合物およびフードサプリメントとしてのそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6062470

(24)【登録日】2016年12月22日

(45)【発行日】2017年1月18日

(54)【発明の名称】同位体修飾化合物およびフードサプリメントとしてのそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 51/00 20060101AFI20170106BHJP

   A23L 33/175 20160101ALI20170106BHJP

   A23L 33/13 20160101ALI20170106BHJP

   A23L 33/115 20160101ALI20170106BHJP

   C07H 19/173 20060101ALI20170106BHJP

   C07C 255/28 20060101ALN20170106BHJP

   C07C 253/16 20060101ALN20170106BHJP

   C07C 229/26 20060101ALN20170106BHJP

   C07C 227/14 20060101ALN20170106BHJP

   C07C 279/14 20060101ALN20170106BHJP

   C07C 277/08 20060101ALN20170106BHJP

   C07C 57/12 20060101ALN20170106BHJP

   C07C 51/347 20060101ALN20170106BHJP

   C07B 61/00 20060101ALN20170106BHJP

【ＦＩ】

   A61K43/00

   A23L33/175

   A23L33/13

   A23L33/115

   C07H19/173

   !C07C255/28

   !C07C253/16

   !C07C229/26

   !C07C227/14

   !C07C279/14

   !C07C277/08

   !C07C57/12

   !C07C51/347

   !C07B61/00 300

【請求項の数】14

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2015-45737(P2015-45737)

(22)【出願日】2015年3月9日

(62)【分割の表示】特願2008-557833(P2008-557833)の分割

【原出願日】2007年3月8日

(65)【公開番号】特開2015-146811(P2015-146811A)

(43)【公開日】2015年8月20日

【審査請求日】2015年4月7日

(31)【優先権主張番号】0604647.8

(32)【優先日】2006年3月8日

(33)【優先権主張国】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】510247526

【氏名又は名称】レトロトップ、 インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＴＲＯＴＯＰＥ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100123788

【弁理士】

【氏名又は名称】宮崎 昭夫

(74)【代理人】

【識別番号】100127454

【弁理士】

【氏名又は名称】緒方 雅昭

(72)【発明者】

【氏名】シュシェピノヴ、 ミカイル シャーグジェイヴィッヒ

【審査官】 澤田 浩平

(56)【参考文献】

【文献】 de Sain-van der Velden,M.G. et al，Increased VLDL in nephrotic patients results from a decreased catabolism while increased LDL results from increased synthesis.，Kidney Int.，１９９８年 ４月，Vol.53, No.4，p.994-1001

【文献】 Mattison,L.K. et al.，Rapid identification of dihydropyrimidine dehydrogenase deficiency by using a novel 2-13C-uracil breath test.，Clin. Cancer Res.，２００４年 ４月１５日，Vol.10, No.8，p.2652-8

【文献】 Geboes,K.P. et al.，Validation of a new test meal for a protein digestion breath test in humans.，J. Nutr.，２００４年 ４月，Vol.134, No.4，p.806-10

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ３１／００，５１／００，Ａ２３Ｌ３３／００

ＣＡＰｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

^２Ｈまたは^１３Ｃから選択される少なくとも一つの同位体により、同位体修飾が施されている、同位体修飾成分を高含有量含んでなる、生物体中における酸化的損傷を低減させる用途で使用される、治療用組成物であって、
前記同位体修飾成分は、^２Ｈまたは^１３Ｃから選択される少なくとも一つの同位体により、同位体修飾が施されている、同位体修飾アミノ酸、同位体修飾核酸塩基または同位体修飾脂肪酸であり、
該同位体修飾成分は、生物体による摂取または吸収に引き続き、生物体中において、生体内の身体構成物質中に取り込まれた際、その化学的同一性を保持することができ、該身体構成物質を、活性酸素種または活性窒素種が介在する分解プロセスに対して、より耐性にすることができ、
該同位体修飾成分中の前記同位体の量は、その天然における存在レベルを超えている
ことを特徴とする、治療用組成物。

【請求項2】

前記治療用組成物は、食品であり、
該食品は、ヒトの消費、ならびに、治療における使用に適している
ことを特徴とする、請求項１に記載の治療用組成物。

【請求項3】

前記治療用組成物は、錠剤である
ことを特徴とする、請求項１に記載の治療用組成物。

【請求項4】

前記治療用組成物は、注射可能な組成物である
ことを特徴とする、請求項1に記載の治療用組成物。

【請求項5】

前記同位体修飾成分は、アミノ酸側鎖上に、^２Ｈまたは^１３Ｃから選択される少なくとも一つの同位体による、同位体修飾が施されている、同位体修飾アミノ酸である
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の治療用組成物。

【請求項6】

前記同位体修飾アミノ酸は、同位体修飾タンパク質中に含まれ、
前記同位体修飾核酸塩基は、同位体修飾核酸中に含まれ、または、
前記同位体修飾脂肪酸は、同位体修飾脂質中に含まれている
ことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の治療用組成物。

【請求項7】

前記同位体修飾成分中では、前記^２Ｈが、その酸化感応性水素（^１Ｈ）を置換している
ことを特徴とする、請求項６に記載の治療用組成物。

【請求項8】

前記同位体修飾成分は、必須栄養成分である
ことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の治療用組成物。

【請求項9】

前記同位体修飾成分は、

【化1】

からなる群から選択される同位体修飾アミノ酸；
であり、前記同位体修飾核酸塩基が

【化2】

からなる群から選択される同位体修飾核酸塩基；または、
同位体修飾リノール酸である、同位体修飾脂肪酸のいずれかである
ことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の治療用組成物。

【請求項10】

前記生物体が、動物またはヒトである
ことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の治療用組成物。

【請求項11】

前記酸化的損傷には、活性酸素種または活性窒素種が介在している
ことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の治療用組成物。

【請求項12】

前記同位体修飾成分は、同位体修飾アミノ酸である
ことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の治療用組成物。

【請求項13】

前記同位体修飾成分は、同位体修飾脂肪酸である
ことを特徴とする、請求項１に記載の治療用組成物。

【請求項14】

前記同位体修飾成分は、同位体修飾リノール酸である
ことを特徴とする、請求項１に記載の治療用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、同位体修飾化合物およびフードサプリメントとしてのそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
加齢に関する現今の定説は、細胞機構における不可逆的変化ならびに呼吸プロセスの一部として細胞に通常存在するフリーラジカルおよび他の活性酸素種（ＲＯＳ）または活性窒素種（ＲＮＳ）の有害な作用に対する代謝プロセスの低下した効率が原因であるとする。ＲＯＳおよびＲＮＳは、ＤＮＡ、タンパク質、脂質および他の細胞構成成分を酸化／ニトロ化する。これらのうち、アルギニン、リシン、スレオニン、トリプトファンおよびプロリンを対応するカルボニル化合物に変換するタンパク質酸化は、特定の閾値数のアミノ酸残基が酸化された後ではプロテアーゼにより修復することができない。

【0003】

損傷を受けたタンパク質は、触媒活性または構造活性を失うが、プロテアーゼは重度にカルボニル化されたストランドを分解することができないので、損傷を受けた種は蓄積、凝集し、細胞輸送を詰まらせる。このさび様のプロセスは、次第にすべての細胞機構を破壊し、すべてを遅らせ、最終的に細胞死を引き起こす。

【0004】

加齢とは別に、いくつかの例を挙げると、アルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、白内障、関節炎、慢性腎不全、急性呼吸器症候群、嚢胞性線維症、糖尿病、乾癬および敗血症などの多くの疾患は、増加したタンパク質カルボニル化と関係がある。典型的に、タンパク質カルボニルの生理的レベルはタンパク質１ｍｇあたり約１ｎｍｏｌであるが、病的レベルでは８ｎｍｏｌ／ｍｇ以上になる。

【0005】

タンパク質の酸化的損傷のプロセスに関与する２つの分子、すなわち酸化物質およびその基質に関して、酸化物質は、抗酸化物質（ビタミン、グルタチオン、ペプチドまたは酵素）の数を増加させることにより酸化物質を中和するかまたは除去することを目的とする多くの研究の対象物である。基質、例えばカルボニルに変換されるアミノ酸（ＡＡ）残基は、あまり注目されていない。

【0006】

カルボニル化に対して脆弱なすべてのアミノ酸残基(プロリンを除く)の１つの共通した特徴は、それらが脊椎動物で合成されず、摂取するべきである(例えば食物で摂取する)必須アミノ酸残基の群に属するということである。この群には、フェニルアラニン、バリン、トリプトファン、スレオニン、イソロイシン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リシンおよびロイシンが含まれる（アルギニンは５歳までの子供に必須である）。

【0007】

ＲＯＳによるＡｒｇおよびＬｙｓ両方の酸化は、アミノアジピン酸セミアルデヒドをもたらし、ヒドロキシル基によるω−水素の順次置換を介して進む。Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、ＰｈｅおよびＨｉｓの酸化を図１に示す。これらアミノ酸がポリペプチド／タンパク質の一部である場合、側鎖は同じ変換を受ける。ＲＯＳによる酸化を受ける他の必須アミノ酸には、Ｌｅｕ(５−ヒドロキシロイシン)、Ｖａｌ(３−ヒドロキシバリン)およびＩｌｅ(いくつかの生成物)が含まれる。

【0008】

必須アミノ酸に影響を及ぼす他のタイプの酸化的損傷は、活性窒素種(ＲＮＳ)を含む。例を図２に示す。

【0009】

タンパク質にとって有害であるさらにもう１つのプロセスは、ＲＯＳによるペプチド結合切断であり、この前に酸素フリーラジカル媒介タンパク質酸化が生じる。水素原子が、ポリペプチド鎖のＣ_α原子から引き抜かれ、次いでアルコキシル基の形成を導く。これにより、ヒドロキシルタンパク質誘導体、または（１）ジアミドまたは（２）α−アミド化経路によるペプチド結合切断のいずれかが導かれる。これを図３に例示する。

【0010】

核酸は通常、食事のうちの必須成分として考えられないが、これもＲＯＳにより損傷される。ミトコンドリアの機能にとって特に重要な例は、図４に示した８−オキシ−Ｇの形成である。これは核ゲノムほどには効率的に維持、修復されないミトコンドリアゲノムにおける突然変異を導き、細胞における呼吸プロセスの効率に有害な結果をもたらす。分解の別の原因は放射線である。

【0011】

化学的および生化学的反応の機序および律速段階を解明するときに、動的同位体効果が広く使用されている。Ｃ−^１Ｈ結合の切断を伴う反応の速度は、ＨおよびＤ同位体の質量において２倍の違いがあるため、典型的には対応するＣ−^２Ｈ（^２Ｈ＝Ｄ＝重水素）結合の切断より５〜１０倍速い。トリチウム（^３ＨまたはＴ）の場合、水素より３倍重いため反応速度における差はさらに大きいが、この同位体は不安定である。Ｃ−Ｈ結合の第２の構成成分である炭素原子もまたより重い^１３Ｃ同位体に置換されうるが、^１３Ｃは^１２Ｃよりわずかに重いだけであるので、結合切断速度の減少は非常に小さい。Ｐａｒｋら、ＪＡＣＳ(２００６)１２８：１８６８〜７２を参照のこと。

【0012】

酸化物質による水素の引き抜きは、通常、プロセスの律速段階であるので、酸化反応は同位体効果についてのよい例である。Ｄａｍｇａａｒｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ(１９８１)２０：５６６２〜６９は以下を例示する：肝臓のアルコールデヒドロゲナーゼ(ＡＤＨ)による(１−Ｒ)[１−^２Ｈ_２]−および(１−Ｒ)[１−^３Ｈ_２]−エタノールのアセトアルデヒドへの酸化についてのＶ／Ｋにおける動的同位体効果は、ｐＨ６で測定すると、３(Ｄ(Ｖ／Ｋ))および６．５(Ｔ(Ｖ／Ｋ))であり、ｐＨ９でそれぞれ１．５および２．５に減少した。予測より遅い速度は、代替経路として非ＡＤＨ系の別個の役割を裏付けるものである。灌流したラット肝臓におけるｉｎ ｖｉｖｏ実験(Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔら、Ｐｈａｒｍ.＆Ｔｏｘ.(１９８９)６５：５５〜６２（非特許文献１）に報告されるように)は、２．８９の平均Ｄ(Ｖ／Ｋ)値を与えた。そのため、すべての場合において重水素化エタノールの酸化は、大幅に遅くなった。

【0013】

同位体標識された物質は、診断の目的で動物、またヒトにも投与された。Ｇｒｅｇｇら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ(１９７３)１３：７５５〜８２は、消化可能な炭素画分が８０原子％の^１３Ｃを含む食餌の、離乳マウスへの投与を開示している。添加物は、^１３Ｃ標識した酢酸であった。組織検査では、明らかに高い同位体濃縮に起因する異常は見られなかった。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0014】

【非特許文献1】Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔら、Ｐｈａｒｍ．＆Ｔｏｘ．（１９８９）６５：５５−６２

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、ＰｈｅおよびＨｉｓの酸化を示す図である。

【図2】必須アミノ酸に影響を及ぼす他のタイプの酸化的損傷を示す、活性窒素種を含む例を示す図である。

【図3】ペプチド結合切断を示す図である。

【図4】８−オキシ−Ｇの形成を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

発明の概要
本発明は、摂取された場合、機能的に通常の身体構成物質に等価であるが、分解／有害なプロセス(例えば、ＲＯＳおよびＲＮＳまたは放射線により媒介されるプロセス)に対してより耐性を有する、身体構成物質(例えば、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物など)の形成を生じるクラスの化合物を合成するために、同位体置換を使用できる、という事実に基づいている。そのため、本発明によれば、栄養組成物は、少なくとも１つの変換可能なＨ原子が^２Ｈであり、かつ／または少なくとも１つのＣ原子が^１３Ｃである必須栄養素を含む栄養組成物を含む。

【0017】

本発明において使用するための化合物は、身体構成物質に取り込まれた場合、そのような身体構成物質を分解プロセスに対してより耐性にさせる安定な同位体を含むことを除いて、通常の栄養素または食物の構成成分と同じである。これらは、天然の生体分子の好ましい機能を保護するための方法を提供し、本方法は、生体分子に取り込まれるように化合物を供給することを含み、その際、損傷または望まない化学的変化に対して保護する特性を生体分子に与える。

【0018】

本発明において使用するための化合物は、化学的に合成することができ、生物体により消化される場合、化合物の機能的生体分子への取り込みをもたらすように代謝され、この化合物の取り込みは、この化合物を含まない等価な生体分子の場合に比べ、損傷を与える分子変化に対してより高い度合いの耐性を有する生体分子を生じる。そのような化合物は、天然の生体分子の前駆成分の擬態物として働きうる。これらは必須アミノ酸を擬態しうる。生物体は、典型的には植物、微生物、動物またはヒトである。

【0019】

本発明において使用するための化合物は、典型的にはＰ４５０の経路の酵素により分解されない。そのため、それを必須とする対象物に蓄積しうる。

【0020】

図面の説明
図１から４は各々必須栄養素を分解する反応を示す。

【0021】

発明の説明
本発明は、必須サプリメントが酸化、窒素化などの不可逆的化学変換を受け、老化または疾患の発現を導きうる、という事実に関する。必須食品成分は、生物体(例えば、哺乳動物、霊長類またはヒト)によりデノボ合成することができず、そのため食餌で供給される必要がある。本明細書の目的のために、核酸は必須であるが、条件付きで必須と記載されることがより適切でありうる。条件付きで必須な栄養素は、特定の条件下、食餌で供給される必要がある。

【0022】

ヒトに関しては１０のアミノ酸、すなわちＰｈｅ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、ＬｙｓおよびＡｒｇ(５歳まで)が必須である。プリンおよびピリミジンヌクレオシドは条件付きで必須である。必須脂肪酸は、ω−３およびω−６であるが、一価不飽和オレイン酸は一般に非必須である。

【0023】

本発明によれば、加齢／疾患などの提議される望ましくない影響は、減速することができる。摂取される化合物は、化学的同一性を保持しつつ望まれない反応を遅らせるために、修飾されるべきである。これは、最も活性の炭素原子、または図１〜４に例示されるようなＲＯＳ／ＲＮＳによる損傷を受けることが公知の部位で、重水素による酸化／酸化的置換中に引き抜きを受ける水素原子を置換することによって、１つの実施形態において達成されることができ、これは同位体効果が反応速度を減速させることに起因する。炭素の置換は反応速度の減少をそれほど増すわけではないので、Ｈ原子置換の代わりの炭素の置換、またはＨ原子置換に加え炭素の置換は、より高い程度の置換を必要とすることがある（ＤはＨの２倍の重量であり、^１３Ｃは^１２Ｃより１０％未満重い）。

【0024】

調製方法の部分に依存して、本発明において使用するための化合物は、部分的または全面的な同位体置換を含みうる。例えば、重水素は、例えば官能基に隣接するＯＨまたはＣＨ_２である、化学的に交換可能であると考えられる１つまたは２つの水素原子のみで置換されうる。部分的^１３Ｃ置換ではなく全^１３Ｃ置換がより効果的に達成されることが多い。

【0025】

本発明の好ましい実施形態において、これらアミノ酸のフラグメントが他の構造を構成するために使用される場合、他の代謝プロセスの減速のリスクを最小限にするために、酸化感応性の水素(またはそれのみ)が重水素で置換されるはずである。特別な場合において、酸化に対する耐性をさらに増加させるために、Ｈ−Ｃ結合の^１Ｈおよび^１２Ｃ両方を^２Ｈおよび^１３Ｃで置換することができる。同位体の可能性のある負の効果(例えば、同位体で保護されたアミノ酸のフラグメントを利用する生化学反応の望ましくない減速)を最小限にするために、好ましくはアミノ酸の最感応性の部分のみを誘導体化するべきである(例えば、ＬｙｓおよびＡｒｇのω原子)。このタイプの好ましい化合物は

【0026】

【化1】

【0027】

である。

【0028】

酸化ストレスが非常に高度であり、脆弱部位を保護することから受ける恩恵が、他の代謝経路を減速することによる潜在的な損傷作用(いくつかの疾患と同様に)より大きい場合、以下に例示した式で表されるより高度に同位体で保護されたアミノ酸を使用しうる。

【0029】

【化2】

【0030】

そのような誘導体は、図１〜４に例示される悪影響からの保護を与える。

【0031】

すべての脊椎動物は必須アミノ酸を合成する能力を欠いており、必須アミノ酸または脂肪酸の外部からの供給を必要とするので、重水素化／重水素化および^１３Ｃ修飾アミノ酸をヒトの食物供給源に与える痛みのない方法が見込まれる。アミノ酸に関して、プロセスの一例は、必須アミノ酸欠損酵母／藻類／細菌などを作ることであり、これらを適切な同位体「保護された」培地／基質で培養し、次いで得られたバイオマスを魚または家畜に与える。次いで魚または家畜は食物連鎖中に通常の方法で導入されうる。別の例は、直接的な錠剤／サプリメントをベースにした送達である。

【0032】

食物の非必須成分は、生物体により生成されうる化合物(例えば、核酸塩基)である。しかし、これらが食物として摂取される場合、いくつかの非必須成分は他の化合物の前駆体として消化／使用されるが、特定の画分は直接代謝プロセスで利用され(例えば、核酸(ＮＡ)塩基)ＤＮＡに取り込まれる。そのため、例として、食物で供給されるいくつかのＮＡ塩基は、以下に例示した式で表されるように同位体保護されうる。

【0033】

【化3】

【0034】

そのような種類は、ＤＮＡへの取り込みにおける酸化に強い。言い換えれば、ミトコンドリアＤＮＡを含むＤＮＡの酸化速度は低減されうる。

【0035】

必須および非必須の両成分は消化器系を介して与えられ、加齢プロセスおよび種々の疾患と関連する有害な変化を減速させる望ましい効果をもたらす。それにもかかわらず、消化管を介する以外の方法、例えば静脈内送達が想定されうる。任意の送達システムの重要な様態は、身体的／生物化学的成分に取り込まれる同位体改変した化合物を得ることである。

【0036】

本発明の組成物は、任意のフードサプリメントのように提供されうる。典型的には、同位体標識した必須成分に加え、１つまたは複数の栄養素を含む。これは、植物性物質、微生物物質または動物性物質を含んでもよい。組成物は通常の食品、錠剤もしくは他の固体医薬あるいは注射可能なまたは他の液体であってもよい。

【0037】

この組成物は、標識された化合物に加え、未修飾の化合物を含みうる。標識化合物は、典型的には大量に存在し、天然に存在しうるより確実に多い。

【0038】

本発明において使用するための化合物は、公知の手順または当業者により適切に改変されうる手順により調製されうる。例えば、Ｌｙｓの重水素化類似体である２,６−ジアミノヘキサン酸−６,６−Ｄ_２は、標準的な手段に従うＤ_２中での水素化分解により、前駆体のニトリルから合成されうる。

【0039】

【化4】

【0040】

Ａｒｇの重水素化類似体である２−アミノ−５−グアニジノペンタン酸−５,５−Ｄ_２は、対応するニトリルから合成されうる。

【0041】

【化5】

【0042】

Ｌｙｓに関する上記と同様の方法で、水素化分解により得られたオルニチン−Ｄ_２を水に溶解し、等量の０．５Ｍ Ｏ−メチルイソ尿素と混合し、ＮａＯＨでｐＨ１０．５に調整した。４〜５時間後、反応を停止するために１％ＴＦＡを添加した。この化合物は、ＲＰ ＨＰＬＣ(緩衝液は、Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ；Ｂ：０．１％ＴＦＡ／(８０％ＭｅＣＮ／２０％Ｈ_２Ｏ)であった)により、０〜６５％Ｂで４０分にわたり精製した。Ｋｉｍｍｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ.(１９６７)、１１：５８４〜５８９およびＢｏｎｅｔｔｏら、Ａｎａｌ.Ｃｈｅｍ.(１９９７)、６９：１３１５〜１３１９を参照のこと。

【0043】

シアノ−アミノ酸はアミノ酸の前駆体である。シアノ−アミノ酸の合成は、種々の前駆体から始まるいくつかの経路で実施しうる。アルコール類(Ｄａｖｉｓ ＆ Ｕｎｔｃｈ、Ｊ.Ｏｒｇ.Ｃｈｅｍ.(１９８１)；４６：２９８５〜２９８７)、アミン類(Ｍｉｈａｉｌｏｖｉｃら、Ｔｅｔ.Ｌｅｔｔ.(１９６５)４６１〜４６４)、アミド類(Ｙａｍａｔｏ ＆ Ｓｕｇａｓａｗａ、Ｔｅｔ.Ｌｅｔｔ.(１９７０)４３８３〜４３８４)およびグリシン(Ｂｅｌｏｋｏｎら、ＪＡＣＳ(１９８５)１０７：４２５２〜４２５９)はすべてそのような合成における出発物質として働きうる。いくつかの方法は、^１３Ｃおよび^２Ｈ置換した化合物両方を生成しうるが、他の方法は重水素化のみに適合する。

【0044】

重水素化は、重水素ガス(例えば、Ｗｈｉｔｅら、ＪＡＣＳ(１９９４)１１６：１８３１〜１８３８に記載されるように)または別の重水素化物(例えば、ＮａＢＤ_４(Ｓａｔｏｈら、Ｔｅｔ.Ｌｅｔ.(１９６９)４５５５〜４５５８))を使用して実施しうる。これら方法間の選択は、アベイラビリティおよび対応する重水素誘導体の価格をベースになされるべきである。いくつかの試験されたストラテジーを詳細に以下に記載する。

【0045】

本発明のために必須脂肪酸内で保護されるべき部位は、１,４−ジエン系のメチレン基(「ビス−アリル」部位)である。これらは最も活性であり、種々の方法を使用して容易に誘導体化されうる。この部位の臭素化に続いて^２Ｈ_２による還元は、同時に１つの水素の置換を生じる。両方を置換するために、この手順は２回繰り返すべきである。より魅力的な方法は、重水中での直接的な１段階の置換でありうる。そのような交換の一例を、デオキシグアノシンの８−重水素化として以下(実施例６)に提供する。

【0046】

重水素化不飽和脂肪酸の合成のための代替アプローチは、１,４−ジエンの強塩基処理に続き、重水でクエンチングすることをベースにしている。これを実施例７に例示する。

【0047】

すべての主要ヌクレオチド塩基の任意の部位での、すべての主要なタイプの同位体(^２Ｈ_２、^３Ｈ_２、^１３Ｃ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^１８Ｏなど)を用いる置換に関する文献例がある。以下に記載されるのは、プリンの選択的重水素化に関して以前に刊行された研究をベースにした２つの手順である(Ｅｓａｋｉら、Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ(２００５)６６：３６１〜３６９およびＣｈｉｒｉａｃら、Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｃｏｍｐｄ.Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ.(１９９９)４２：３７７〜３８５)。非常に多くの他のプロトコールが、同様に適している。存在する核酸塩基／ヌクレオシドにおいて水素を重水素に交換することはしばしば可能であり、^１３Ｃを取り込む間に塩基が組み立てられるはずである(例えば、Ｆｏｌｅｓｉら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ(２０００)を参照)。

【0048】

本発明における使用に適したいくつかの同位体で「補強された」必須食事性成分の合成は公知である。例えば、６,６−^２Ｈ_２、１,１−^１３Ｃ_２−Ｌ−Ｌｙｓ：Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎら、Ｊ.Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ.(１９９０)３１：１６９３〜１７０１および８−重水素化−デオキシ−グアノシン：Ｔｏｙａｍａら、Ｊ.Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ.(２００２)３３：６９９〜７０８)を参照のこと。

【0049】

本発明における使用に適した、上記の同位体保護成分および他の同位体保護成分を調製するためにも使用されうる、異なる方法の多くの蓄積が存在するため、本発明は、上記の有機合成化学的方法に制限されない。例えば、実施例に開示される方法に加え、一級アミノ基の官能基のＣＮ官能基への変換(結果として起こるα−(Ｎに関して)炭素原子の重水素化のため)に適した他の方法が以下のように使用されうる：
塩化第一銅−ジオキシゲン−ピリジン系に触媒される酸素による直接酸化(Ｎｉｃｏｌａｏｕら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ(１９８６)４５３〜４６１；Ｃａｐｄｅｖｉｅｌｌｅら、Ｔｅｔ.Ｌｅｔｔ.(１９９０)３１：３３０５〜３３０８)
ブロモコハク酸イミドを使用する直接変換(Ｇｏｔｔａｒｄｉ、Ｍｏｎａｔｓｈ.Ｃｈｅｍ.(１９７３)１０４：１６９０〜１６９５)
直接ヨードソベンゼン酸化(Ｍｏｒｉａｒｔｙら、Ｔｅｔ.Ｌｅｔｔ.(１９８８)２９：６９１３〜６９１６)
ジ−トシル誘導体およびヨード誘導体を介する２段階変換(ＤｅＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒら、ＪＡＣＳ(１９６９)９１：２３８４〜２３８５)。

【実施例】

【0050】

以下の実施例１〜９は本発明における使用に適した物質の調製を例示する。

【0051】

（ＭＡ）ＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルは、陽イオンモードでＶｏｙａｇｅｒ Ｅｌｉｔｅ Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｔａｔｉｏｎ(ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｖｅｓｔｅｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ)を使用して得られ；ＦＡＢスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ機器を使用して得られた。分析的薄層クロマトグラフィは、Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０ Ｆ_２５４をプレコートしたアルミニウムプレート(Ｍｅｒｃｋ)または酸化アルミニウム６０ Ｆ_２５４をプレコートしたアルミニウムプレート(Ｍｅｒｃｋ)で実施され、スポットはＵＶ下または規定されたとおりに可視化された。カラムクロマトグラフィはシリカゲル(Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ ０．０４０〜０．０６３ｍｍ)または酸化アルミニウム(Ａｌｄｒｉｃｈ酸化アルミニウム、活性化された、中性、Ｂｒｏｃｋｍａｎｎ Ｉ、１５０メッシュ、５８Å)で実施された。

【0052】

生物学的実験のための試薬は、他に規定されない限り、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから提供された。^１３Ｃ−グルコースは、ＳｉｇｍａおよびＲｅａｋｈｉｍ(ロシア)から提供された。

【0053】

商業的納入業者から入手した試薬は受領後そのまま使用した。すべての溶媒は、Ａｌｄｒｉｃｈから提供され；トリフルオロ酢酸はＰｉｅｒｃｅから提供され；ＨＰＬＣグレードの溶媒は、Ｃｈｉｍｍｅｄ(ロシア)から提供され、さらに精製することなく使用した。(Ｓ)−２−アミノ−５−シアノペンタン酸はＧｅｎｏｌｅｘ(ロシア)から得られた。重水素ガスは、供給源として重水を使用するＧＣ水素供給モジュール(アウトプット６ａｔｍ；Ｈｉｍｅｌｅｃｔｒｏｎｉｋａ、モスクワ、ロシア)による電気分解により作り出された。重水(^２Ｈ_２Ｏ、Ｄ_２Ｏ)、ＮａＢＤ_４およびＮａ^１３ＣＮは、Ｒｅａｋｈｉｍ(ロシア)およびＧａｓ−Ｏｉｌ ＪＳＣ(ロシア)から提供された。ＤＭＦは減圧下新たに蒸留し、窒素下４Å分子ふるいで貯蔵した。ＤＣＭは常に新鮮にＣａＨ_２で蒸留し、使用した。ＴＨＦはＬｉＡｌＨ_４で蒸留した。

【0054】

実施例１ (Ｓ)−２−アミノ−４−シアノ(^１３Ｃ)酪酸(^１３Ｃ−Ａｒｇおよび^１３Ｃ、^２Ｈ_２−Ａｒｇの前駆体)

【0055】

【化6】

【0056】

２．１９ｇ(１０ｍｍｏｌ)のＮ−Ｂｏｃ−ホモ−セリン(Ｂａｃｈｅｍ；一晩Ｐ_２Ｏ_５で乾燥した)を、１０ｍｌのアセトニトリル／ジメチルホルムアミド(１：１)の混合物に溶解した。乾燥Ｎａ^１３ＣＮ(Ｇａｓ−Ｏｉｌ ＪＳＣ、ロシア；１ｇ、２当量)およびＮａＩ(１０ｍｇ、触媒)を添加し、この混合物を脱気した。次いで、Ｍｅ_３ＳｉＣｌ(２．５５ｍｌ、２当量)をアルゴン下、室温でシリンジを用いて添加した。この反応混合物を、アルゴン下６０℃で６時間、ＴＬＣ(クロロホルム／メタノール２：１、ヨウ素蒸気で可視化)でモニタリングしながら攪拌した。終了後、反応混合物を室温まで冷却して水(１００ｍｌ)で希釈し、ジエチルエーテル(２×５０ｍｌ)で抽出した。有機相を水(４×５０ｍｌ)およびブライン(５０ｍｌ)で洗浄し、乾燥させ(Ｎａ_２ＳＯ_４)、容器に移して真空で濃縮すると、無色油状物(２．０７ｇ、９１％)が得られた。Ｂｏｃ−ニトリル構造を、マトリクスとしてＨＰＡを用いるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ(Ｖｏｙａｇｅｒ Ｅｌｉｔｅ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)により確認した。実測値：２２９．１１５(ＭＩ)、２３０．１１４(ＭＩ＋Ｈ^＋)、２５２．１０４(ＭＩ＋Ｎａ^＋)。開始物質に関連するピークは検出されなかった。

【0057】

Ｂｏｃ保護基の除去および後処理を、標準的なペプチド合成プロトコールを使用して実施した(ＤＣＭ中５０％ＴＦＡ、３０分、室温)。このニトリル構造をマトリクスとしてＨＰＡを用いるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ(Ｖｏｙａｇｅｒ Ｅｌｉｔｅ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)により確認した。実測値：１２９．０６２(ＭＩ)、１３０．０７０(ＭＩ＋Ｈ^＋)。開始物質に関連するシグナルは検出されなかった。

【0058】

実施例２ (Ｓ)−２−アミノ−４−シアノ−酪酸（^２Ｈ_２−Ａｒｇの前駆体）

【0059】

【化7】

【0060】

４．９３ｇ(２０ｍｍｏｌ)のＮ−Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミン(Ｓｉｇｍａ)を、３０ｍｌの無水ＴＨＦに溶解し、トリフェニルホスフィン(１０．４９ｇ、４０ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ)および４０ｍｌの無水テトラクロロメタンの混合物に、攪拌しながら添加した。この反応混合物を穏やかに加熱しながら、３時間攪拌(ＴＬＣ、クロロホルム／メタノール ２：１で管理下、ヨウ素蒸気で可視化)、冷却し、トリフェニルホスフィンオキシドの沈殿物を濾別した。さらに１５ｍｌのＴＨＦを用いる蒸発および再蒸発で得られた油状物を、３０ｍｌの水で希釈した。水性画分をブラインで飽和、ジエチルエーテル(２×２０ｍｌ)で洗浄し、ｐＨ３．５に硫酸で酸性化した。生成物を酢酸エチル(２×２０ｍｌ)で抽出した。合わせた有機画分を乾燥(ブライン、Ｎａ_２ＳＯ_４)、デカントし、蒸発させると、３．４６ｇ(７６％)の無色油状物が得られた。Ｂｏｃ−ニトリルの構造をマトリクスとしてＨＰＡを用いるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ(Ｖｏｙａｇｅｒ Ｅｌｉｔｅ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)により確認した。実測値：２２８．１１４(ＭＩ)、２２９．１１４(ＭＩ＋Ｈ^＋)、２５１．１０３(ＭＩ＋Ｎａ^＋)。開始物質に関連するピークは検出されなかった。

【0061】

Ｂｏｃ保護基の除去および後処理を、標準的なペプチド合成プロトコールを使用して実施した(ＤＣＭ中５０％ＴＦＡ、３０分、室温)。このニトリル構造をマトリクスとしてＨＰＡを用いるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ(Ｖｏｙａｇｅｒ Ｅｌｉｔｅ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)により確認した。実測値：１２８．０６９(ＭＩ)、１２９．０７５(ＭＩ＋Ｈ^＋)。開始物質に関連するシグナルは検出されなかった。

【0062】

実施例３ Ｌｙｓ−^２Ｈ_２

【0063】

【化8】

【0064】

（Ｓ）−２−アミノ−５−シアノペンタン酸(Ｇｅｎｏｌｅｘ、ロシア；１４．２１ｇ、１００ｍｍｏｌ)を１００ｍｌのメタノールに溶解した。これに(Ａｄｋｉｎｓ Ｈ.ら、Ｏｒｇ.Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ.Ｃｏｌｌ.Ｖｏｌ.III、１９５５、ｐ.１８０)に従って４ｇの合金(３０％Ｎｉ)から調製されたラネーニッケルを添加し、この反応混合物を重水素下(１００ａｔｍ)９０℃で２４時間振盪した。(ＴＬＣ：ｎ−ブタノール−ピリジン−酢酸−水：１５−１０−３−１２；ヨウ素蒸気およびフルオレスカミンで可視化)。この反応混合物を濾過し、真空で蒸発させた。生成物を水−エタノール(３：１；２０ｍｌ)中に再溶解した後、真空で蒸発させ(×４)、次いで酢酸エチルから結晶化すると、１１．５５ｇ(７８％)の重水素化生成物が得られた。重水素化リシンの構造をマトリクスとしてＨＰＡを用いるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ(Ｖｏｙａｇｅｒ Ｅｌｉｔｅ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)により確認した。実測値：１４８．０８８(ＭＩ)、１４９．０８９(ＭＩ＋Ｈ^＋)。

【0065】

実施例４ (５−^１３Ｃ,５,５−^２Ｈ_２)−アルギニン

【0066】

【化9】

【0067】

（Ｓ）−２−アミノ−４−シアノ(^１３Ｃ)−酪酸(１８２ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ)およびＣｏＣｌ_２×６Ｈ_２Ｏ(Ａｌｄｒｉｃｈ、６７０ｍｇ、２．８２ｍｍｏｌ)を、水(６ｍｌ)に溶解し、ＮａＢＤ_４(Ｒｅａｋｈｉｍ、ロシア；５４０ｍｇ、１４．１ｍｍｏｌ)を２０分かけて２回にわけて添加した。このニトリルを３０分還元した(ＴＬＣ：ｎ−ブタノール−ピリジン−酢酸−水：１５−１０−３−１２で管理下；Ｂｏｃ保護したアミノ酸をフルオレスカミン／ＵＶ検出、非保護アミノ酸をヨウ素蒸気で可視化)。

【0068】

この反応混合物を、酸性化(１Ｍ ＨＣｌ)に続きアセトンでクエンチし、イオン交換で精製した(Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ１２０Ｐ(Ｈ^＋)、Ａｌｄｒｉｃｈ)。このカラムを中性ｐＨまで水で洗浄した。次いでＮＨ_４ＯＨ(０．３Ｍ)でカラムを洗浄した後、蒸発させることにより生成物を回収した。生じたオルニチン−^１３Ｃ,^２Ｈ_２(収率：１５８ｍｇ、８３％；ＨＰＡマトリクスを用いるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ(Ｖｏｙａｇｅｒ Ｅｌｉｔｅ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)、実測値：１３５．０７１(ＭＩ)、１３６．０６８(ＭＩ＋Ｈ^＋)を水に溶解し、等量の０．５Ｍ Ｏ−メチルイソ尿素(Ｋｉｍｍｅｌ、上記参照)と混合し、ＮａＯＨでｐＨ１０．５に調整した。４〜５時間後、反応を停止させるために１％ＴＦＡを添加した(Ｂｏｎｅｔｔｏら、上記参照)。上記化合物をＲＰ ＨＰＬＣ(緩衝液は、Ａ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ；Ｂ：０．１％ＴＦＡ／(８０％ＭｅＣＮ／２０％Ｈ_２Ｏ)であった)により精製し、４０分にわたる０〜６５％Ｂで１４０ｍｇ(６８％)が得られた；ＨＰＡマトリクスを用いるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ(Ｖｏｙａｇｅｒ Ｅｌｉｔｅ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)；実測値：１７７．４０２(ＭＩ)、１７８．６５５(ＭＩ＋Ｈ^＋)。

【0069】

実施例５ （５,５−^２Ｈ_２）−アルギニン

【0070】

【化10】

【0071】

表題化合物を（Ｓ）−２−アミノ−４−シアノ−酪酸(Ｔｅｃｈｎｏｈｉｍ、ロシア)から始まる上記プロトコールを使用して合成した。ＨＰＡマトリクスを用いるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ(Ｖｏｙａｇｅｒ Ｅｌｉｔｅ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)；実測値：１７６．３７７(ＭＩ)、１７７．４５３(ＭＩ＋Ｈ^＋)。

【0072】

実施例６ １１,１１−ジ−重水素化−リノール酸（１８：２）

【0073】

【化11】

【0074】

リノール酸(７ｇ、２５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ)を２５ｍｌの四塩化炭素に溶解し、Ｐ_２Ｏ_５で乾燥させた。Ｎ−ブロモコハク酸イミド(４．４２５ｇ、２５ｍｍｏｌ、一晩Ｐ_２Ｏ_５で乾燥させた)および０．０５ｇＡＩＢＮを添加し、逆コンデンサを備えたフラスコ中の反応混合物を、激しい煮沸に見られるように反応が開始されるまで緩やかに加熱しながら攪拌した(還流が激しすぎる場合、この加熱は低下するはずである)。コハク酸イミドの表面への堆積が停止した場合、加熱をさらに１５分継続した(合計約１時間)。この反応混合物を室温まで冷却、沈殿物を濾別し、ＣＣｌ_４で洗浄した(２×５ｍｌ)。合わせた有機画分を蒸発し、得られた１１−ブロモリノール酸を３０ｍｌイソプロパノール中ＮａＢＤ_４溶液(３９０ｍｇ、１０ｍｍｏｌ)に徐々に添加した。一晩攪拌した後、重水素ガスが発生しなくなるまでＨＣｌの希釈溶液をゆっくり添加した。標準的な後処理により、モノ−重水素化酸を臭素化し、再度還元すると、標的ジ−重水素化誘導体(ｂｐ２３０〜２３１℃／１５ｍｍ、４．４ｇ、６３％)が得られた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ：モノブロモ誘導体、実測値：３５８．２０２、３６０．１９１(二重項、約１：１、ＭＩ)；ジ−重水素化誘導体、実測値：２８２．２５１(ＭＩ)。

【0075】

実施例７

【0076】

【化12】

【0077】

１１,１１−Ｄ_２−リノール酸(１８：２)は、リノール酸をヘキサンに混合した等量のＢｕＬｉ−ｔＢｕＫ(Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ)で処理した後、Ｄ_２Ｏでクエンチすることにより合成した。収率を改善するためにはこの手順を３〜４回繰り返す必要がある。この手順はまた、検出可能量のα−重水素化生成物を生じることが見出された(ＦＡＢ ＭＳ、Ｘｅイオン、チオグリセリン：実測値：２８３．３４(７２；ＭＩ＋１)^＋、２８４．３３(１１；α−モノ重水素化誘導体、ＭＩ＋１)^＋、２８５．３４(１０；α−ジ重水素化誘導体、ＭＩ＋１)^＋；「２８４」および「２８５」のピークの性質をＭＳ／ＭＳを使用して確立した。α部位での置換は一時的なオルト−エステル保護を利用することにより阻止されうる(Ｃｏｒｅｙ ＆Ｒａｊｕ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ.(１９８３)２４：５５７１)が、このステップはこの調製をより高価なものにする。

【0078】

実施例８ デオキシグアノシンからの８−Ｄ−デオキシグアノシン

【0079】

【化13】

【0080】

デオキシグアノシン(２６８ｍｇ、１ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ)を４ｍｌのＤ_２Ｏに溶解した。１０％Ｐｄ／Ｃ(２７ｍｇ、１０ｗｔ％の基質、Ａｌｄｒｉｃｈ)を添加し、この混合物を１６０℃で密閉チューブ中、Ｈ_２雰囲気下で２４時間攪拌した。室温に冷却後、この反応混合物をメンブランフィルター(Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｅｘ(登録商標)−ＬＧ)を使用して濾過した。濾過された触媒を沸騰水(１５０ｍｌ)で洗浄し、合わせた水性画分を真空で蒸発させると、白色固体としてデオキシグアノシド−ｄ(２４６ｍｇ、９２％)が得られた。このヌクレオシドの構造をマトリクスとしてＨＰＡを用いるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ(Ｖｏｙａｇｅｒ Ｅｌｉｔｅ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)により確認した。実測値：２６８．１１２(ＭＩ)。

【0081】

実施例９ ８−ブロモデオキシグアノシンからの８−Ｄ−デオキシグアノシン

【0082】

【化14】

【0083】

Ｃｈｉｒｉａｃら(１９９９)４２：３７７〜３８５に記載されるとおりにＰｄＣｌ_２から調製した７％Ｐｄ／Ｃ触媒を、８−ブロモデオキシグアノシン(Ｓｉｇｍａ)およびＮａＯＨの水溶液に添加した。この混合物をＤ_２中(２ａｔｍ)、３０℃で攪拌した。触媒を濾別し、反応混合物を２Ｎ ＨＣｌで中和した。この手順は約８５〜９０％の生成物の収率を提供する。ＮａＢＤ_４のような他の還元物質が使用されうる(Ｄ,Ｄ−リノール酸の合成を参照)。

【0084】

以下の実施例１０〜１２は本発明の有用性を説明する。本発明に関して可能な重同位体置換の範囲を確立するため(１００％軽同位体から１００％重同位体、および上に示されるような化合物を使用する図１〜４に示されるような局所的な部位保護)および生物体に起こりうる大量の重同位体の毒性を試験するために、寿命における重炭素(^１３Ｃ)および特異的に「保護された」生体ポリマーの構成要素(核酸構成要素(ヌクレオシド)、脂質およびアミノ酸)の影響を線虫シノラブディスエレガンス(Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ)で試験した。

【0085】

モデル生物Ｃ.エレガンス(Ｃ.ｅｌｅｇａｎｓ)に関する以前の研究は、ほぼ例外なく細菌性飼料による培養を使用した。そのような培養は、薬物および環境毒性学研究における二次的な関心として細菌性代謝を導入する(特異的な代謝産物欠損細菌株は、線虫の生存期間における特定の必須栄養素の影響を評価するために使用されうる)。Ｃ.エレガンスの無菌培養はこれら問題を回避できるが、いくつかの以前の研究は、無菌増殖がＣ.エレガンスに有害であることを示唆する(Ｓｚｅｗｃｚｙｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０９、４１２９〜４１３９(２００６))。本発明に関して、ＮＧＭおよび無菌飼料の両方を同位体に富んだ栄養価のある成分と組み合わせて使用した。

【0086】

実施例１０
^１３Ｃ_６−グルコース(９９％濃縮；Ｓｉｇｍａ)を大腸菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ)の培養のための炭素飼料源として使用し、対照は^１２Ｃ_６−グルコースを除いて同じであった。Ｃ.エレガンス(Ｎ２、野生型)を、上記のとおりに調製された大腸菌を播種した標準(ペプトン、塩およびコレステロール)培地で培養した。対応する^１３Ｃ−誘導体が入手不可能であったため、大腸菌を除く唯一の炭素含有成分は、^１２Ｃ−コレステロール(Ｓｉｇｍａ；Ｃ．エレガンスに必須であるホルモン前駆体)であった。したがって、線虫を１５〜２５℃の温度範囲で、各プール５０〜１００匹の蠕虫で「重」および「軽」(対照)飼料により培養した。両飼料を与えた動物は正常に成長し、すべての主要な特性は非常に類似していた。

【0087】

生存期間のデータを、確立された手順(Ｌａｒｓｅｎら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３９：１５６７(１９９５))に従って、プリズムソフトウェアパッケージ(ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ)を使用して解析した。「重」飼料における動物は、寿命の約１０％増加(典型的な実験において、２５℃で^１２Ｃ動物において１４日対^１３Ｃを与えた蠕虫において約１５．５日)を有することが見出された。

【0088】

実施例１１
使用した無菌培地の基本構成成分は(Ｌｕ ＆ Ｇｏｅｔｓｃｈ Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ(１９９３)３９：３０３〜３１１)によった。水溶性およびＴＥＡ可溶性成分(ビタミンおよび成長因子)、塩、非必須アミノ酸、核酸置換基、他の成長因子およびエネルギー源を記載のとおりに調製した(２倍の０．５Ｌ)。これに必須アミノ酸：０．９８ｇ Ｌ−(Ｄ_２)−Ａｒｇ(上記参照)；０．２８３ｇ Ｌ−Ｈｙｓ；１．０５ｇ Ｌ−(Ｄ_２)−Ｌｙｓ(下記参照)；０．１８４ｇ Ｌ−Ｔｒｐ；０．３８９ｇ Ｌ−Ｍｅｔ；０．７１７ｇ Ｌ−Ｔｈｒ；１．４３９ｇ Ｌ−Ｌｅｕ；０．８６１ｇ Ｌ−Ｉｌｅ；１．０２ｇ Ｌ−Ｖａｌおよび０．６２３ｇ Ｌ−Ｐｈｅを含む(２倍量として０．５Ｌ)混合物を添加した。残りの成分を添加する前に、この混合物を５５℃で４時間、透明な溶液が形成されるまで攪拌し、次いで室温まで冷却した。

【0089】

Ｃ.エレガンス(Ｎ２、野生型)をこの培地で培養した。対照実験として、線虫を、重水素化アナログの代わりに標準Ｌ−ＡｒｇおよびＬ−Ｌｙｓを含有することを除いて上記のとおりに調製された培地中で、１５〜２５℃の温度範囲で、各プール中５０〜１００匹の蠕虫で培養した。生存期間のデータを、実施例１０に記載したとおりにプリズムソフトウェアを使用して解析した。

【0090】

実施例１２
^１２Ｃ−ＮＧＭ飼料は５,５−ジ−重水素化−アルギニンおよび６,６−ジ−重水素化−リシン、１１,１１−ジ−重水素化−リノール酸(１８：２)ならびに８−Ｄ−デオキシグアノシンを豊富に含んだ。Ｃ.エレガンスを、１ｇ／Ｌの各重水素化化合物の総濃度になるように重水素「補強された」誘導体(上記参照)を添加した、上記のとおりに調製した大腸菌を播種した標準(ペプトン、塩およびコレステロール)培地で培養した。したがって、線虫を「重」および「軽」(対照、非重水素化Ｌ−アルギニン、Ｌ−リシン、リノール酸(１８：２)およびデオキシグアノシンを１ｇ／Ｌの濃度で重水素化アナログの代わりに使用した)飼料で、１５〜２５℃の温度範囲で、各プール中５０〜１００匹の蠕虫で培養した。生存期間のデータを実施例１０に記載したとおりにプリズムソフトウェアパッケージを使用して解析した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】